KR102063195B1

KR102063195B1 - 핵산 전달의 구획화된 방법 및 이의 조성물 및 용도

Info

Publication number: KR102063195B1
Application number: KR1020147025109A
Authority: KR
Inventors: 호세 구스타보 카브레라 아퀴노; 블란카 안젤리카 세구라 파체코
Original assignee: 글로벌 바이오 테라퓨틱스, 인크.
Priority date: 2012-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2020-01-07
Also published as: SG10201609345QA; MX2014009480A; NZ627992A; JP6188728B2; EP2812012A1; EP3970734A2; EP3970734A3; KR20140146062A; EA201400871A1; EA033803B1; IL233946B; CN110917362A; JP6463421B2; CA2863964C; HK1204770A1; BR112014019431A2; BR112014019431A8; IL233946A0; US20130211380A1; SG11201404741VA

Abstract

본원에서 핵산 분자를 대상체의 구획화된 조직 또는 기관으로 전달하는 방법이 제공된다. 또한 본원에서 핵산 분자를 구획화된 조직 또는 기관의 실질로 전달하기 위한 용도 및 과정이 제공된다. 상기 방법 및 용도는 질환 및 상태의 치료에 사용될 수 있으며 산업적, 농업적 및 수의학적 적용에서 사용될 수 있다. 또한 본원에서 조직 또는 기관의 실질로 투여되기 위해 제형화된 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 또는 기타 재조합 바이러스를 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

핵산 전달의 구획화된 방법 및 이의 조성물 및 용도{Compartmentalized Method of Nucleic Acid Delivery and Compositions and Uses Thereof}

본원에서 핵산 분자를 대상체의 구획화된 조직 또는 기관에 전달하는 방법이 제공된다. 또한 본원에서 핵산 분자를 구획화된 조직 또는 기관의 실질에 전달하기 위한 용도 및 과정이 제공된다. 상기 방법 및 용도는 질환 및 상태의 치료에 사용될 수 있고, 산업적, 농업적 및 수의학적 적용에서 사용될 수 있다. 또한 본원에서 조직 또는 기관의 실질로 투여되기 위해 제형화된 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 또는 기타 재조합 바이러스를 포함하는 조성물이 제공된다.

유전자 치료는 개체 내에서 유전자를 보충 또는 변형하기 위해 핵산 분자가 대상체에 투여되는 치료적 방법이다. 특히, 유전자 치료는 질환의 치료의 목적을 위해 사용된다. 유전자 치료는 유전자의 돌연변이 또는 결실로 인해 발생하는 유전적 질환을 치료하기 위해 필수적인 것으로 간주된다. 단백질을 암호화하는 유전자를 치료가 필요한 대상체 내로 도입하는 다양한 방법이 시도된 바 있으나, 만족할 만한 치료적 효과가 얻어진 사례는 매우 적다. 따라서, 핵산 분자를 유전자 치료 적용을 위해 대상체에게 전달하는 대안적 방법에 대한 필요성이 존재한다.

Fabre 외. (2008) Gene Therapy, 15:452-462

관련된 출원

본 출원은 2012년 2월 7일 출원된, 발명의 명칭이 "핵산 전달의 구획화된 방법 및 이의 조성물 및 용도"인 미국 가출원번호 제61/633,287호의 우선권의 이익을 주장한다.

본 출원은 발명의 명칭이 "핵산 전달의 구획화된 방법 및 이의 조성물 및 용도"이고 상기와 동일자에 출원된 미국 가출원번호 제61/633,287호의 우선권의 이익을 주장하는 미국 특허 출원 일련번호(변호사 도켓 번호 제33809.00551.US01/551호)와 관련되어 있다.

허용되는 경우, 상기 표시된 관련된 출원 각각의 개시는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.

전자적으로 제공되는 서열 목록의 참조에 의한 통합

서열 목록의 전자적 버전이 본원에서 함께 제출되며, 그 내용이 전체로서 본원에 참조로서 통합된다. 전자적 파일은 2013.02.07. 자로 3 킬로바이트 크기, 551seqPC1.txt의 제목으로 생성되었다.

요약

본원에서는 대상체에 핵산 분자를 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 질환 또는 상태를 치료하는 것을 포함하는 유전자 치료 적용에서 뿐 아니라 산업적, 농업적 및 수의학적 적용에서 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 바와 같이, 상기 방법은 a) 숙주의 전신적 순환으로부터 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분을 구획화하는 단계; 및 b) 전달되는 제제를 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 실질로 직접적으로 투여하는 단계로서, 상기 전달되는 제제는 핵산 분자를 포함하고, 이에 의해 상기 전달되는 제제는 구획화된 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 실질 세포로 유입하는 단계를 포함한다.

조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분을 구획화화는 것은 전달되는 제제의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 수행될 수 있다. 일반적으로, 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 구획화는 전달되는 제제의 투여 전에, 전형적으로 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제의 전달 전에 5 분, 4 분, 3 분, 2 분, 1 분 또는 30 초 이하에 개시된다.

상기 제공되는 방법은 조직, 기관 또는 조직 또는 기관의 부분과 전신적 순환 간의 소통을 복구하는 단계를 포함한다. 소통을 복구하는 단계는 일반적으로 전달되는 제제의 투여 후에 미리 결정된 시간이다. 미리 결정된 시간은 투여된 전달되는 제제가 실질 세포로 유입하는데(예컨대 형질도입에 의해) 충분한 기간이며, 소통의 복구에 있어서 20% 이하의 전달되는 제제가 실질 세포로 유입하지 않는다. 예를 들어, 전달되는 제제의 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5% 이하가 실질 세포로 유입하지 않는다. 일부 예에서, 미리 결정된 시간은 투여된 전달되는 제제가 실질 세포로 유입하기에 충분한 기간으로서, 소통의 복구에 있어서 전달되는 제제의 20% 이하가 전신적 순환에 노출된다. 예를 들어, 전달되는 제제의 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5%가 전신적 순환에 노출된다. 전형적으로 본원의 방법에서, 미리 결정된 시간은 적어도 약 1, 2, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 또는 120분이다. 특정 예에서, 미리 결정된 시간은 적어도 약 30분, 및 일반적으로 30분 내지 60분 이하이다.

본원의 방법에서, 구획화된 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 간, 뇌 척수, 췌장, 심장, 피부, 신장, 폐, 혈관, 뼈, 근육, 자궁, 자궁목, 전립선, 요도, 또는 장이다. 특정 예에서, 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 간이다. 예를 들어, 본원의 방법의 예에서, 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 간이며; 미리 결정된 시간은 적어도 약 30분이고, 일반적으로 30분 내지 60분 이하이다. 이러한 예에서, 미리 결정된 시간은 전달되는 제제의 거의 전부, 일반적으로 전달되는 제제의 적어도 80%가 간 실질의 간세포로 유입하는데 충분한 시간이다. 본원의 방법의 예에서, 조직 또는 기관의 부분은 구획화된다. 예를 들어, 간의 부분은 구획화되고 상기 부분은 간의 엽(lobe), 구역(segment), 또는 엽 또는 부분의 부분(portion)이다. 상기 엽 또는 엽의 부분은 오른쪽엽(right lobe), 왼쪽엽(left lobe), 네모엽(quadrate lobe) 및 꼬리엽(caudate lobe) 또는 이의 부분일 수 있다.

본원에서 기술되는 임의의 방법에 있어서, 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관을 구획화하는 것은 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 하나 또는 그 이상의 동맥, 정맥, 도관 및/또는 맥관을 막음으로써 달성되며, 이로써 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관으로의 혈액 공급 및 흐름은 감소되거나 제거된다. 일반적으로, 구획화는 구획화될 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분에 공급하거나 가로지르는 모든 동맥, 정맥, 도관 및/또는 맥관이 차단될 때 달성된다. 동맥, 정맥, 도관 및/또는 맥관의 차단은 수동 압박, 실질 클램프, 동맥 또는 정맥 클램프, 폐쇄 카테터, 스테이플링 장치, 밴드, 압박대 또는 케이블과 같은 장치 또는 기술로써 이루어질 수 있다. 일반적으로, 본원의 방법에서, 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 실질 클램프로 클램핑함으로써 구획화된다. 클램프는 복강경 클램프일 수 있다. 본원의 임의의 방법에서, 전신적 순환으로부터의 조직 또는 기관의 구획화는 또한 조직 또는 기관 또는 이의 부분에서 혈액을 감소 또는 제거시키기 위해 흡인(suction)을 적용하는 것을 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 임의의 방법에서, 전달되는 제제는 비-바이러스 벡터, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 미니서클(minicircle), 나노입자(nanoparticle) 및 핵산 분자를 포함하는 전(whole) 세포일 수 있다. 일 예에서, 전달되는 제제는 비-바이러스 벡터이고 상기 비-바이러스 벡터는 발현 벡터이다. 다른 예에서, 전달되는 제제는 나노입자이고 상기 나노입자는 표적화되거나(tarteted) 방사선표지되어 있다. 추가적인 예에서, 상기 전달되는 제제는 바이러스이다. 전달되는 제제가 바이러스인 본원의 예에서, 상기 전달되는 제제는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(AAV), 레트로바이러스, 백시니아 바이러스 또는 허피스 심플렉스 바이러스이다. 예를 들어, 바이러스는 렌티바이러스인 레트로바이러스일 수 있다. 바이러스는 일반적으로 그것의 게놈(genome)에 대해 이종성(heterologous)인 핵산 분자를 포함하는 재조합 바이러스이다. 바이러스는 복제-결핍성 바이러스일 수 있다. 바이러스는 대상체에서 세포의 핵에서 복제하는 바이러스일 수 있다. 바이러스는 또한 간 간세포(liver hepatocyte)와 같은 비-분열 세포에 감염하는 것들을 포함한다. 일부 예에서, 바이러스는 분열하는 세포에 감염한다. 이러한 예에서, 상기 방법은 세포의 분열을 촉진하는 단계를 포함할 수 있다. 본원의 특정 예에서, 예를 들어 상기 방법의 실행을 위한 표적 기관이 간일 때, 바이러스는 간에 대해 향성(trophism)을 나타내며 간세포로 유입할 수 있는 것이다.

예를 들어, 본원에서 제공되는 방법의 예에서, 바이러스는 이종성 핵산을 그것의 게놈 내에 포함하는 아데노바이러스이고 구획화된 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분에 투여된다. 아데노바이러스는 혈청형 1 내지 혈청형 51(예컨대 1, 2, 4, 5,...51)과 같은 임의의 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 아데노바이러스 타입 2 또는 아데노바이러스 타입 5이다. 본원의 방법에서 사용되는 임의의 아데노바이러스는 E1, E2a, E2b, E3, 또는 E4 코딩 영역의 임의의 하나 또는 그 이상의 결실을 갖는 것들을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스는 E1 코딩 영역에서 결실을 포함한다. 본원의 방법에서 전달되는 제제로서, 상기 바이러스는 핵산 분자를 포함한다.

본원의 임의의 방법에서, 상기 전달되는 제제는 유전자 치료를 위해 대상체에 전달되는 핵산 분자를 포함한다. 일부 예에서, 핵산 분자는 폴리펩티드를 암호화한다. 암호화된 폴리펩티드는 치료적 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 암호화된 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 응집(coagulation) 또는 응고(clotting) 인자, 성장 인자, 항체 또는 항체의 부분, 혈관신생 조절자, 면역조절자, 통증 조절자, 수용체, 수송 단백질, 조절 단백질, 항원 또는 알러젠일 수 있다. 특히, 암호화된 폴리펩티드는 인터류킨(interleukin), 인터페론-α, IFN-β, IFN-ν, 성장 인자 또는 이의 부분, 성장 인자 수용체 또는 이의 부분일 수 있다. 핵산 분자의 예는 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 낭포성 섬유증 막관통 전도 레귤레이터(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CTFR), 갈설파제(galsulfase), 라로니다제(laronidase), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제(N-acetylgalactosamine 6-sulfatase), 페닐알라닌 암모니아 리아제(phenylalanine ammonia lyase), 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 이미글루세라제(imiglucerase), 알글루코시다제 알파 (alglucosidase alpha), 갑상선 자극 호르몬(thyrotropin), 성장 호르몬(growth hormone), 인슐린, 갑상선 호르몬(thyroid hormone), 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 인터류킨 1(interleukin-1, IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, 인터페론(IFN), 종양괴사인자(TNF), IL-12, IL-18, fms-관련 티로신 키나제 3(flt3), 뉴로필린-2(NP2), 골형성 단백질(bone morphogenic protein , BMP), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF), 형질전환 성장 인자 α 및 β(transforming growth factor α and β), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor, FGFR), FGFR 길항제(sFGFR), 형질전환 성장 인자 수용체(transforming growth factor receptor, TGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR), 플라스미노겐 액티베이터(plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), 인자 Ⅷ(facotr Ⅷ), 인자 Ⅸ(factor Ⅸ), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 성장 호르몬(growth hormone), 금속단백질분해효소 트롬보스폰딘 모티프 1(metalloproteinase thrombospondin motifs 1, METH-1), METH-2, 트립토파닐-tRNA 신테타제(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS) 단편, 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein), 프로락틴(prolactin) 단편, 색소 상피 유래 성장 인자(pigment epithelium derived growth factor, PEDF), 바소스타틴(vasostatin), 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 키니노스타틴(kininostatin), 피브리노겐-E(fibrinogen-E) 단편, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 툼스타틴(tumstatin), 캔스타틴(canstatin), 레스틴(restin), 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1, sFlt-1), 가용성 혈관 내피 성장인자 수용체(soluble vascular endothelial growth factor receptor, sFlk), 가용성 뉴로필린 1(soluble Neuropilin 1, sNRP1), 인터페론 감마-유도 단백질 10(IP-10), 혈소판 인자 4(Platelet factor 4, PF-4), 그로-베타(Gro-beta), 가용성 에프린 타입-B 수용체 4(soluble Ephrin type-B receptor 4, sEphB4), 세프린B2(sephrinB2), IGF-1, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK), 카복시펩티다제 G2(carboxypeptidase G2, CPG2), 카복실에스터라제(carboxylesterase, CA), 사이토신 데아미나제(cytosine deaminase, CD), 사이토크롬 P450(cytochrome P450, cyt-450), 데옥시사이티딘 키나제(deoxycytidine kinase, dCK), 니트로리덕타제(nitroreductase, NR), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(purine nucleoside phosphorylase, PNP), 티미딘 포스포릴라제(thymidine phosphorylase, TP), 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제(varicella zoster virus thymidine kinase, VZV-TK), 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase, XGPRT), 아스파르틸글루코사미니다제(Aspartylglucosaminidase), α-갈락토시다제 A(α-Galactosidase A), 팔미토일 단백질 티오에스터라제(Palmitoyl Protein Thioesterase), 트리펩티딜 펩티다제(Tripeptidyl Peptidase), 리소좀 막관통 단백질(Lysosomal transmembrane protein), 시스테인 트랜스포터(cysteine transporter), 산 세라미다제(acid ceramidase), 산 α-L-푸코시다제(acid α-L-fucosidase), 보호적 단백질(protective protein)/카텝신 A(cathepsin A), 산 β-글루코시다제(acid β-glucosidase) 또는 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 산 β-갈락토시다제(acid β-galactosidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), α-L-이두로니다제(α-L-Iduronidase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase), 산 α-만노시다제(acid α-mannosidase), 산 β-만노시다제(acid β-mannosidase), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(N-Acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(N-Acetlylglucosamine-1-phosphotransperase), 산 스핑고미엘리나제(acid-sphingomyelinase), 니이만-픽병, 타입 C1(Niemann-Pick disease, type C1, NPC-1), β-헥소사미니다제 B(β-Hexosaminidase B), 헤파란 N-설파타제(Heparan N-sulfatase), α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-Acetylglucosaminidase, NaGlu), 아세틸-CoA:알파 글루코사미닌드 N-아세틸트랜스퍼라제(Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase), N-아세틸 글루코사민-6-설페이트 설파타제(N-Acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase), β-글루쿠로니다제(β-Glucuronidase), 산 리파아제(acid lipase), 네프릴리신(neprilysin), 인슐린- 분해 효소 인슐리신(insulysin), 티멧 올리고펩티다제(thimet oligopeptidase), 칼빈딘 D28(calbindin D28), 파발부민(parvalbumin), 저산소증 유도 인자 1-알파(hypoxia induced factor 1-alpha, HIF1-alpha), 서투인-2(sirtuin-2, SIRT-2), 생존 운동 뉴런 단백질-1(survival motor neuron-1, SMN-1), SMN-2, 교세포 유래 신경영양 인자(glial cell neurotrophic factor, GDNF), 모양체 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor, CNF), 저밀도 지단백 수용체(LDLR), 지단백 리파아제(lipoprotein lipase, LPL), 알파 1-항 트립신(Alpha-1-Antitrypsin, AAT), UDP-글루쿠로닐-트랜스퍼라제(UDP-glucuronyl-transferase, UGT), UGT1A1, 글루코스-6 포스파타제(glucose-6 phosphatase), 포스포에놀피루베이트-카복시키나제(phosphoenolpyruvate-carboxykinase), 갈락토스-1 포스페이트 유리딜 트랜스퍼라제(galactose-1 phosphate uridyl transferase), 페닐알라닌 히드록실라제(phenylalanine hydroxylase), 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지나제(branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase), 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제(fumarylacetoacetate hydrolase), 메틸말로닐-CoA 뮤타제(methylmalonyl-CoA mutase), 오르니틴 트랜스카바밀라제(ornithine transcarbamylase), 아르지노숙신산 신테타제(argininosuccinic acid synthetase), 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hyposanthine guanine phosphoribosyl transferase), 비오티니다제(biotinidase), 베타-글루코세레브로시다제(beta-glucocerebrosidase), 베타-글루쿠로니다제(beta-gluronidase), 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase) 및 p53을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

다른 예에서, 암호화된 폴리펩티드는 산업적, 수의학적 또는 농업적 적용과 관련된 것일 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 동물에서 근육 생산을 증가시키거나, 동물에서 털(hair) 또는 모(wool) 생산을 증가시키거나, 동물의 성장을 증가시키거나, 또는 영양소 합성 또는 활용과 관련된 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 이러한 예에서, 암호화된 폴리펩티드는 미오스타틴 저해제, 성장 호르몬, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자, 닭 Ski, 세린 트랜스아실라제 또는 o-아세틸세린 설프히드릴라제일 수 있다. 미오스타틴 저해제는 폴리스타틴일 수 있다.

본원에서 제공되는 방법의 예에서, 상기 핵산 분자는 DNA 분자, RNA 분자, 및 앱타머일 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA, 리보자임 및 안티센스 핵산일 수 있다. 이러한 핵산 분자는 또한 대상체에서 치료적 효과를 달성할 수 있으므로 치료적 핵산 분자이다.

본원에서 제공되는 임의의 방법에서, 상기 방법은 또한 선택적으로 전달되는 제제의 투여 전에 실질 조직을 확인하기 위해 조직 또는 기관을 영상화하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방법은 도관, 동맥 또는 맥관의 내강(lumen)으로 전달되는 제제, 및 핵산 분자의 투여를 최소화하기 위해 사용될 수 있다.예를 들어, 자기 공명 영상(MRI), 초음파 검사(초음파), 또는 컴퓨터 단층 촬영(CT)이 수행될 수 있다. 특정 예에서, 도플러(Doppler) 초음파 검사가 본원의 방법의 실시에서 사용될 수 있다.

또한, 본원의 임의의 방법의 실시에 있어서, 기술, 방법 및 시약이 전달되는 제제의 조직 또는 세포의 실질의 세포로의 전달의 효율을 용이하게 하거나 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 전달되는 제제는 실질 세포 내로의 유입을 용이하게 하기 위해 지질, 폴리머 시약 또는 기타 시약과 함께 제형화될 수 있다. 또한 또는 대안적으로, 전달되는 제제는 실질 세포 내로의 유입을 용이하게 하기 위한 물리적 방법, 예를 들어 전기천공, 초음파천공, 압박, 초음파 또는 "유전자 총"의 존재에서 전달될 수 있다.

본원의 방법의 추가적인 예에서, 전달되는 제제의 세포 흡수를 촉진하기 위한 제제가 대상체에 투여될 수 있다. 상기 제제는 전달되는 제제의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 일부 예에서, 상기 제제는 바이러스-특이적 세포 표면 수용체의 전사적 인핸서이다. 예를 들어, 상기 제제는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제이다. 예시적인 HDAC 저해제는, 트리코스타틴 A(trischostatin A), 보리노스탯(vorinostat, SAHA), 베리오노스탯(belionostat, PXD101), LAQ824, 파노비노스탯(panobinostat, LBH589), 엔티노스탯(entinostat, MS-275), C199, 모세티노스탯(mocetinostat, MGCD0103), 로미뎁신(romidepsin, lstodax), 발프론산(valproic acid), PCI-24781, SB939, 레스미노스탯(resminostat), 기비노스탯(givinostat), CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, 케베트린(Kevetrin), 및 트리코스타틴 A(trichostatin A, TSA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원의 방법의 실시에 있어서, 전달되는 제제의 구획화된 조직으로의 전달은 상기 제제의 더 낮은 투여량이 투여될 수 있음을 의미하는데, 이는 투여되는 제제와 발현되는 단백질의 역학이 선형(linear)이기 때문에 추가적으로 조절될 수 있다. 이는 제제가 대부분 정맥내로 전달되는 존재하는 유전자 치료 방법에 대조적인 것이다. 예를 들어, 본원의 방법에 의해 투여되는 제제의 양은 정맥내로 투여되는 동일한 전달되는 제제의 양보다 100배 또는 더 적다. 예를 들어, 전달되는 제제의 양은 정맥내로 투여되는 동일한 전달되는 제제의 양보다 최대 200 배, 500 배, 1000 배, 5000 배, 10000 배 또는 더 적다.

특정한 예에서, 상기 전달되는 제제는 그것의 게놈 내에 이종성 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)이며, 투여되는 전달되는 제제의 양은 약 10 내지 1 x 10¹² 입자, 10 내지 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10³ 내지 1 x 10¹² 입자, 1x 10⁶ 내지 1x 10¹⁰ 입자, 또는 1x 10⁷ 내지 1x 10⁹ 입자; 또는 약 10 내지 1 x 10¹² pfu, 10 내지 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10³ 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 또는 1x 10⁷ 내지 1x 10⁹ pfu 이다. 예를 들어, 투여되는 전달되는 제제의 양은 1 x 10¹² 입자, 1 x 10¹¹ 입자, 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10⁸ 입자, 1 x 10⁷ 입자, 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10⁵ 입자, 1 x 10⁴ 입자, 1 x 10³ 입자 미만이거나; 또는 1 x 10¹² pfu, 1 x 10¹¹ pfu, 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10⁸ pfu, 1 x 10⁷ pfu, 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10⁵ pfu, 1 x 10⁴ pfu, 1 x 10³ pfu 미만이다.

본원에서 제공되는 임의의 방법의 예에서, 전달되는 제제는 구획화된 조직, 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 1 이상의 위치(locus)로 투여될 수 있다. 상기 방법은 또한 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 실질로부터 임의의 세포외 전달된 제제를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 추가적으로 상기 전달되는 제제의 전달되는 제제가 세포에 유입하지 않는 경우 구획화의 제거에 있어서 일어날 수 있는 전신적 순환에 대한 노출을 감소 또는 최소화할 수 있다. 전형적으로, 제거 단계는 조직, 기관 또는 조직 또는 기관의 부분과 전신적 맥관계(vasculature)의 소통을 복구하기 전에 수행될 수 있다. 구획화는 미리 결정된 시간 후에 전신적 순환과의 소통을 복구함으로써 종결된다. 상기 전신적 순환과의 소통 복구 단계는 동맥, 정맥, 도관 및/또는 맥관을 차단하는 데 사용되는 장치 또는 기술을 제거하는 것을 포함한다. 본원의 임의의 방법에서, 본원에서 제공되는 임의의 단계들은 복수 회 반복될 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법의 이어지는 반복에 있어서, 전달되는 제제는 동일한 구획화된 위치 또는 상이한 구획화된 위치로 투여된다.

핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 전달하는 본원에서 제공되는 방법은 그것이 전달되는 세포 내에서 핵산 분자의 기능적인 작용 또는 발현을 야기할 수 있다. 일부 사례에서, 상기 핵산 분자는 조직 내로 세포로부터 분비되는 단백질을 암호화할 수 있는데, 일부 예에서 단백질은 전신적 순환에 도달 또는 접근할 수 있다. 그러므로, 본원에서 제공되는 방법은 다양한 적용에서, 특히 폴리펩티드의 국소적(local) 또는 전신적 발현이 희망되는 적용에 있어서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원의 방법에서, 핵산 분자의 전달은 폴리펩티드의 생산을 달성할 수 있는데, 여기서 상기 전달되는 제제는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 본원의 방법의 실시에 있어서, 상기 폴리펩티드의 발현은 전신적 순환과의 소통을 복구한 후에 적어도 3 월, 4 월, 5 월, 6 월, 7 월, 8 월, 9 월, 10 월, 11 월, 12 월, 18 월, 24 월, 36 월, 48 월, 60 월, 72 월, 84 월, 96 월, 10 년, 15 년 또는 그 이상 동안 유지된다.

그러므로, 본원에서 제공되는 방법의 예에서, 핵산 분자의 전달은 질환 또는 상태의 치료를 달성한다. 상기 질환 또는 상태는 유전적 결핍이거나 또는 비정상적인 세포적 또는 단백질 활성에 의해 야기된 기타 질환 또는 상태일 수 있다. 상기 질환 또는 상태는 선천적 효소 결핍, 선천적 면역 결핍, 암, 레트로바이러스 감염증, 혈우병, 당뇨병, 근이영양증, 심혈관계 장애, 낭포성 섬유증, 신경 퇴행성 장애, 외상, 통증, 겸상 적혈구 빈혈, 자가면역 질환, 염증성 질환, 또는 고혈압일 수 있다. 이러한 질환 또는 상태의 예는 혈우병 A 및 B, 타입 I 당뇨병, 알파-1-항트립신(AAT) 결핍, 혈색소 침착증(hemochromatosis), 윌슨병(Wilson's disease), 크리글러-나자르 증후군 타입 I(Crigler-Najjar syndrome type I), 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍, 타입 Ⅱ, 가족성 고콜레스테롤 혈증, 피브리노겐결여증(afibrinogenemia), 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease, GSD) 타입 Ia, GSD 타입 Ib, GSD 타입 Ⅱ(폼페병, Pompe), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis, MPSI), MPS ⅢA, MPS ⅢB, MPS Ⅶ, 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher's disease), 니이만-픽 증후군(Niemann-Pick syndrome), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 간 섬유증(liver fibrosis), 간 허혈증 재관류 손상(liver ischemia reperfusion injury), 알츠하이머병, 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 갈락토스혈증(galactosemia), 단풍시럽뇨병(maple syrup urine disease), 티로신혈증 타입 1(tyrosinemia type 1), 메틸말론산혈증(methylmalonic acidenia), 시트룰린혈증(citrullinemia), 통풍(Gout) 및 레쉬-니한 증후군(Lesch Nyan syndrome), 슬라이 증후군(Sly syndrome), 젤위거 증후군(Zellweger syndrome), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염증, 중증 복합 면역결핍 질환(severe combined immunodeficiency disease, SCID), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 지단백 리파아제 결핍(lipoprotein lipase deficiency, LPLD), 또는 파킨슨병(Parkinson's Disease)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 방법의 특정 예에서, 상기 대상체는 18세 이하의 인간 아동이다. 일부 예에서, 상기 대상체는 태아이다. 예를 들어, 상기 대상체는 유전적 결핍으로 진단받은 바 있는 대상체일 수 있다.

본원에서 제공되는 임의의 방법에서, 상기 방법은 복강경을 통해 수행될 수 있다.

본원에서 구획화된 조직, 기관 또는 조직 또는 기관의 부분으로의 핵산 분자의 직접적 실질 투여에서 사용하기 위한 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 포함하는 용도 및 조성물이 제공된다. 상기 구획화된 조직, 기관 또는 조직 또는 기관의 부분으로의 핵산 분자의 직접적 실질 투여에서 사용하기 위한 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 포함하는 용도 및 조성물은 질환 또는 상태의 치료를 달성하거나, 대상체 내에서 이종성 핵산을 과생산하거나, 동물에서 근육 생산을 증가시키거나, 동물에서 털 생산을 증가시키거나, 동물에서 모 생산을 증가시키거나, 동물의 성장을 증가시키거나, 또는 동물에서 영양소 합성 또는 활용을 달성할 수 있다.

구획화된 조직 또는 기관의 실질로의 핵산 제제의 전달에서 사용하기 위한 본원에서 제공되는 용도 및 조성물에 있어서, 상기 구획화된 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 간, 뇌 척수, 췌장, 심장, 피부, 신장, 폐, 혈관, 뼈, 근육, 자궁, 자궁목, 전립선, 요도, 및 장 또는 이의 부분일 수 있다. 특히, 상기 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 간이다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 용도 또는 용도를 위한 조성물은 구획화된 간의 부분, 예컨대 간의 엽, 구역 또는 엽 또는 구역의 부분으로의 핵산의 직접적 실질 전달을 위해 사용될 수 있다. 상기 엽 또는 엽의 부분은 오른쪽엽(right lobe), 왼쪽엽(left lobe), 네모엽(quadrate lobe) 및 꼬리엽(caudate lobe) 또는 이의 부분일 수 있다. 상기 구획화된 조직 또는 기관은 상기 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분이 상기 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관에 공급하거나 가로지르는 동맥, 정맥, 도관 및/또는 맥관이 차단됨으로써 전신적 순환으로부터 격리된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분은 실질의 클램프에 의해 전신적 순환으로부터 격리됨으로써 구획화된 것이다.

본원에서 제공되는 구획화된 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 실질로 핵산을 전달하는데 사용하기 위한 용도 및 조성물의 예에서, 상기 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 비-바이러스 벡터, 바이러스, 바이러스-유사 입자, 미니서클, 나노입자 및 핵산 분자를 포함하는 전 세포일 수 있다. 일 예에서, 상기 전달되는 제제는 비-바이러스 벡터이고 상기 비-바이러스 벡터는 발현 벡터이다. 다른 예에서, 상기 전달되는 제제는 나노입자이고 상기 나노입자는 표적화(targeted)되거나 방사선표지(radiolabeled)된다. 추가적인 예에서, 상기 전달되는 제제는 바이러스이다. 예를 들어, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 및 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)이다. 상기 레트로바이러스는 렌티바이러스일 수 있다. 상기 전달되는 제제는 일반적으로 핵산 분자가 그것의 게놈에 대하여 이종성인 재조합 바이러스이다. 일부 예에서, 상기 바이러스는 복제-결핍인 것이다. 다른 예에서, 상기 바이러스는 세포의 핵에서 복제할 수 있다. 본원의 예에서, 상기 바이러스는 비-분열 세포에 감염할 수 있으며, 예를 들어 상기 바이러스는 간에 대해 향성(tropism)을 나타내고 간세포에 유입할 수 있는 것일 수 있다.

본원에서 제공되는 용도를 위한 용도 및 조성물의 예에서, 상기 조성물은 구획화된 기관 또는 조직 또는 기관 또는 조직의 부분으로의 전달에 사용하기 위한 그것의 게놈 내에 이종성 핵산을 포함하는 아데노바이러스인 전달 제제를 포함한다. 아데노바이러스는 임의의 혈청형, 예컨대 혈청형 1 내지 혈청형 51(예컨대 1, 2, 3, 4, 5,...51)일 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 아데노바이러스 타입 2 또는 아데노바이러스 타입 5이다. 본원의 조성물 또는 용도에서 사용하기 위한 임의의 아데노바이러스는 E1, E2a, E2b, E3, 또는 E4 코딩 영역의 임의의 1 또는 그 이상에서 결실(deletion)을 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스는 E1 코딩 영역에서 결실을 포함한다. 본원의 조성물 및 용도에서 전달되는 제제로서, 상기 바이러스는 핵산 분자를 포함하고 상기 핵산 분자는 상기 바이러스 게놈에 대해 이종성이다.

본원에서 제공되는 임의의 용도 또는 조성물에 있어서, 상기 조성물은 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 포함한다. 상기 암호화된 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 응집 또는 응고 인자(coagulation or clotting factor), 성장 인자(growth factor), 항체 또는 이의 부분, 혈관신생 조절자(angiogenesis modulator), 면역조절자(immunomodulator), 통증 조절자(pain modulator), 수용체, 수송 단백질(transporter protein), 조절 단백질(regulatory protein), 항원(antigen) 또는 알러젠(allergen)일 수 있다. 예를 들어, 상기 암호화된 폴리펩티드는 인터류킨, 인터페론, 성장 인자 또는 이의 부분 또는 성장 인자 수용체 또는 이의 부분일 수 있다. 본원의 용도 및 조성물에서 예시적인 핵산 분자는 아데노신 데아미나제, 낭포성 섬유증 막관통 전도 레귤레이터(CFTR), 갈설파제, 라로니다제, N-아세틸갈락토사민 6-설파타제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, 산 알파 글루코시다제, 이미글루세라제, 알글루코시다제 알파, 갑상선 자극 호르몬, 성장 호르몬, 인슐린, 갑상선 호르몬, 에리트로포이에틴(EPO), 인터류킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, 인터페론-α(IFN-α), IFN-β, IFN-ν, 종양괴사인자(TNF), IL-12, IL-18, fms-관련 티로신 키나제 3(flt3), 뉴로필린-2(NP2), 골형성 단백질(BMP), 표피 성장 인자(EGF), 에리트로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 α 및 β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR), FGFR 길항제(sFGFR), 형질전환 성장 인자 수용체(TGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 플라스미노겐 액티베이터, 유로키나제, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 폰 빌레브란트 인자, 성장 호르몬, 금속단백질분해효소 트롬보스폰딘 모티프 1(METH-1), METH-2, 트립토파닐-tRNA 신테타제(TrpRS) 단편, 프롤리페린-관련 단백질, 프로락틴 단편, 색소 상피 유래 인자(PEDF), 바소스타틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 키니노스타틴, 피브리노겐-E 단편, 트롬보스폰딘, 툼스타틴, 캔스타틴, 레스틴, 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1(sFlt-1), 가용성 혈관 내피 성장인자 수용체(sFlk), 가용성 뉴로필린 1(sNRP1), 인터페론 감마-유도 단백질 10(IP-10), 혈소판 인자 4(PF-4), 그로-베타, 가용성 에프린 타입-B 수용체 4(sEphB4), 세프린B2, IGF-1, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK), 카복시펩티다제 G2(CPG2), 카복실에스터라제(CA), 사이토신 데아미나제(CD), 사이토크롬 P450, 데옥시사이티딘 키나제(dCK), 니트로리덕타제(NR), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(PNP), 티미딘 포스포릴라제(TP), 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제(VZV-TK), 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(XGPRT), 아스파르틸글루코사미니다제, α-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막관통 단백질, 시스테인 트랜스포터, 산 세라미다제, 산 α-L-푸코시다제, 보호적 단백질/카텝신 A, 산 β-글루코시다제 또는 글루코세레브로시다제, 산 β-갈락토시다제, 이두로네이트-2-설파타제, α-L-이두로니다제, 갈락토세레브로시다제, 산 α-만노시다제, 산 β-만노시다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, 산 스핑고미엘리나제, 니이만-픽병, 타입 C1(NPC-1), β-헥소사미니다제 B, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제(NaGlu), 아세틸-CoA:알파글루코사미닌드 N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸 글루코사민-6-설페이트 설파타제, β-글루쿠로니다제, 산 리파아제, 네프릴리신, 인슐린-분해 효소 인슐리신, 티멧 올리고펩티다제, 칼빈딘 D28, 파발부민, 저산소증 유도 인자 1-알파(HIF1-alpha), 서투인-2(SIRT-2), 생존 운동 뉴런 단백질-1(SMN-2), SMN-2, 교세포 유래 신경영양 인자(GDNF), 모양체 신경영양 인자(CNF), 저밀도 지단백 수용체(LDLR), 지단백 리파아제(LPL), 알파 1-항 트립신(AAT), UDP-글루쿠로닐-트랜스퍼라제(UGT), UGT1A1, 글루코스-6 포스파타제, 포스포에놀피루베이트-카복시키나제, 갈락토스-1 포스페이트 유리딜 트랜스퍼라제, 페닐알라닌 히드록실라제, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지나제, 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르지노숙신산 신테타제, 아데노신 데아미나제, 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 비오티니다제, 베타-글루코세레브로시다제, 베타-글루쿠로니다제, 포르포빌리노겐 데아미나제(PBDG) 또는 p53을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공되는 용도 또는 조성물의 예에서, 상기 조성물은 동물에서 근육 생산을 증가시키거나, 동물에서 털 생산을 증가시키거나, 동물에서 모 생산을 증가시키거나, 동물의 성장을 증가시키거나, 영양소 합성 또는 활용과 관계된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 포함한다. 예를 들어, 상기 암호화된 폴리펩티드는 미오스타틴 저해제, 성장 호르몬, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자, 닭 Ski, 세린 트랜스아세틸라제 및 o-아세틸세린 설프히드릴라제일 수 있다. 특정한 예에서, 상기 미오스타틴 저해제는 폴리스타틴이다.

본원에서 제공되는 용도 또는 조성물의 예에서, 상기 조성물은 DNA 분자, RNA 분자, 또는 앱타머인 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 포함한다. 핵산 분자는 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA, 리보자임 또는 안티센스 핵산일 수 있다.

또한, 용도 및 상기 용도를 위한 조성물을 위한 본원에서 제공되는 조성물은 전달되는 제제의 조직 또는 기관의 실질의 세포로의 전달을 용이하게 하거나 효율을 증가시키는 제제 또는 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 전달되는 제제는 실질 세포 내로의 유입을 용이하게 하는 지질, 폴리머 시약 또는 기타 제제와 함께 제형화될 수 있다. 상기 용도 또는 조성물이 간으로의 전달을 위한 경우의 예에서, 상기 실질 세포는 간세포일 수 있다. 다른 예에서, 상기 전달되는 제제는 상기 전달되는 제제의 세포 흡수를 촉진하기 위한 제제와 함께 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 전달되는 제제는 바이러스-특이적 세포 표면 수용체의 전사적 인핸서인 제제와 함게 제형화될 수 있다. 이러한 제제의 예에는 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제가 있다. 상기 HDAC 저해제는 트리코스타틴 A(trischostatin A), 보리노스탯(vorinostat, SAHA), 베리오노스탯(belionostat, PXD101), LAQ824, 파노비노스탯(panobinostat, LBH589), 엔티노스탯(entinostat, MS-275), C199, 모세티노스탯(mocetinostat, MGCD0103), 로미뎁신(romidepsin, lstodax), 발프론산(valproic acid), PCI-24781, SB939, 레스미노스탯(resminostat), 기비노스탯(givinostat), CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, 케베트린(Kevetrin), 및 트리코스타틴 A(trichostatin A, TSA)일 수 있다.

본원에서 제공되는 용도 또는 조성물의 임의의 예에서, 상기 조성물 내의 전달되는 제제는 일반적으로 정맥내 투여를 위해 제형화되는 조성물 내의 동일한 전달되는 제제의 양보다 100배 또는 더 적다. 예를 들어, 조성물 내의 전달되는 제제의 양은 정맥내 투여를 위해 제형화되는 조성물 내의 동일한 전달되는 제제의 양보다 200 배, 500 배, 1000 배, 5000 배, 10000 배 또는 더 적다. 특정한 예에서, 상기 용도 또는 조성물은 그것의 게놈 내에 이종성 핵산을 포함하는 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)인 전달되는 제제를 포함하며, 조성물 내의 바이러스의 양은 약 2 x 10³ pfu/ mL 내지 1 x 10¹⁴ pfu/mL, 2 x 10³ pfu/ mL 내지 1 x 10¹² pfu/mL, 2 x 10³ pfu/mL 내지 2 x 10¹¹ pfu/mL, 1 x 10⁴ pfu/mL 내지 5 x 10¹¹ pfu/mL, 1 x 10⁵ pfu/mL 내지 1 x 10¹¹ pfu/mL, 2 x 10⁶ pfu/mL 내지 2 x 10¹⁰ pfu/mL, 또는 1 x 10⁸ 내지 1 x 10¹⁰ pfu/mL; 또는 약 2 x 10³ 입자/ mL 내지 1 x 10¹⁴ 입자/mL, 2 x 10³ 입자/ mL 내지 1 x 10¹² 입자/mL, 2 x 10³ 입자/mL 내지 2 x 10¹¹ 입자/mL, 1 x 10⁴ 입자/mL 내지 5 x 10¹¹ 입자/mL, 1 x 10⁵ 입자/mL 내지 1 x 10¹¹ 입자/mL, 2 x 10⁶ 입자/mL 내지 2 x 10¹⁰ 입자/mL, 또는 1 x 10⁸ 내지 1 x 10¹⁰ 입자/mL이다. 상기 조성물은 약 0.02 mL 내지 100 mL, 0.05 mL 내지 50 mL, 1 mL 내지 10 mL, 0.05 mL 내지 5 mL 또는 0.02 mL 내지 1 mL의 부피로 제공되는 액체 조성물일 수 있다. 본원에서 제공되는 용도를 위한 조성물은 단일 투여량 투여 또는 다중 투여량 투여를 위해 제형화될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 단일 투여량 투여를 위한 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스의 양을 포함할 수 있는데, 이 경우 조성물 내의 상기 아데노바이러스의 양은 약 10 내지 1 x 10¹² 입자, 10 내지 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10³ 내지 1 x 10¹² 입자, 1x 10⁶ 내지 1x 10¹⁰ 입자, 또는 1x 10⁷ 내지 1x 10⁹ 입자; 또는 약 10 내지 1 x 10¹² pfu, 10 내지 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10³ 내지 1 x 10¹² pfu, 1x 10⁶ 내지 1x 10¹⁰ pfu, 또는 1x 10⁷ 내지 1x 10⁹ pfu이다. 예를 들어, 상기 조성물 내의 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스의 양은 1 x 10¹² 입자, 1 x 10¹¹ 입자, 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10⁸ 입자, 1 x 10⁷ 입자, 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10⁵ 입자, 1 x 10⁴ 입자, 1 x 10³ 입자 미만 또는 1 x 10¹² pfu, 1 x 10¹¹ pfu, 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10⁸ pfu, 1 x 10⁷ pfu, 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10⁵ pfu, 1 x 10⁴ pfu, 1 x 10³ pfu 미만이다.

본원의 용도를 위한 용도 또는 조성물의 예에서, 상기 조성물은 인간 환자에 대한 투여를 위해 제형화된다. 상기 조성물은 18세 이하의 아동에 대한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 태아에 대한 투여를 위해 제형화될 수 있다.

본원의 용도를 위한 용도 또는 조성물의 예에서, 구획화된 조직에 대한 직접적 실질 투여에서 사용하기 위한 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제의 용도는 대상체에서 폴리펩티드를 발현하는데 사용될 수 있다. 상기 핵산 분자는 치료적 핵산 분자일 수 있다. 상기 핵산 분자는 치료적 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 따라서, 구획화된 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 실질로의 직접적 전달을 위한 본원의 용도를 위한 용도 또는 조성물은 질환 또는 상태의 치료를 달성할 수 있다. 이러한 질환 및 상태의 예는 선천적 효소 결핍, 선천적 면역 결핍, 암, 바이러스 감염증, 혈우병, 당뇨병, 근이영양증, 심혈관계 장애, 낭포성 섬유증, 신경 퇴행성 장애, 외상, 통증, 겸상 적혈구 빈혈, 자가면역 질환, 염증성 질환, 및 고혈압을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 질환 또는 장애는 혈우병 A 및 B, 타입 I 당뇨병, 알파-1-항트립신(AAT) 결핍, 혈색소 침착증(hemochromatosis), 윌슨병(Wilson's disease), 크리글러-나자르 증후군 타입 I(Crigler-Najjar syndrome type I), 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍, 타입 Ⅱ, 가족성 고콜레스테롤 혈증, 피브리노겐결여증(afibrinogenemia), 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease, GSD) 타입 Ia, GSD 타입 Ib, GSD 타입 Ⅱ(폼페병, Pompe), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis, MPSI), MPS ⅢA, MPS ⅢB, MPS Ⅶ, 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher's disease), 니이만-픽 증후군(Niemann-Pick syndrome), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 간 섬유증(liver fibrosis), 간 허혈증 재관류 손상(liver ischemia reperfusion injury), 알츠하이머병, 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 갈락토스혈증(galactosemia), 단풍시럽뇨병(maple syrup urine disease), 티로신혈증 타입 1(tyrosinemia type 1), 메틸말론산혈증(methylmalonic acidenia), 시트룰린혈증(citrullinemia), 통풍(Gout) 및 레쉬-니한 증후군(Lesch Nyan syndrome), 슬라이 증후군(Sly syndrome), 젤위거 증후군(Zellweger syndrome), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염증, 중증 복합 면역결핍 질환(severe combined immunodeficiency disease, SCID), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 지단백 리파아제 결핍(lipoprotein lipase deficiency, LPLD), 또는 파킨슨병(Parkinson's Disease)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 직접적 실질 투여를 위해 제형화된 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스를 10 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10² pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁸ pfu, 또는 1 x 10⁶ pfu 내지 1 x 10⁹ pfu; 또는 약 10 내지 1 x 10¹² 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10¹² 입자, 1 x 10² 입자 내지 1x 10¹⁰ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10⁸ 입자, 또는 1 x 10⁶ 입자 내지 1 x 10⁹ 입자의 양으로 포함하는 용기가 제공된다. 상기 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스는 일반적으로 그것의 게놈 내에 이종성 핵산 분자를 포함한다. 상기 용기는 멸균되고 밀봉된 것이다. 상기 용기는 시린지 또는 바이알일 수 있다. 상기 용기는 조성물의 주사를 위한 니들을 포함할 수 있다. 상기 용기는 모세관 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 용기는 예를 들어, 전달되는 제제를 실질내로 전달하기 위하여, 간의 글리슨 캡슐(Glisson's capsule)을 투과할 수 있는 모세관 장치를 포함할 수 있다.

본원에서 제공되는 용기의 특정 예에서, 상기 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스를 1 x 10¹² pfu 미만, 및 적어도 약 1 x 10³ pfu, 1 x 10⁴ pfu, 1 x 10⁵ pfu, 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10⁷ pfu, 1 x 10⁸ pfu, 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10¹¹ pfu 또는 그 이상; 또는 1 x 10¹² 입자 미만, 및 적어도 약 1 x 10³ 입자, 1 x 10⁴ 입자, 1 x 10⁵ 입자, 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10⁷ 입자, 1 x 10⁸ 입자, 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10¹¹ 입자 또는 그 이상의 양으로 포함한다.

본원에서 제공되는 예에서, 상기 용기 내의 조성물은 아데노바이러스를 포함하고, 상기 아데노바이러스는 임의의 사용가능하거나 공지의 혈청형일 수 있다. 예를 들어, 상기 아데노바이러스는 혈청형 1 내지 혈청형 51(예컨대 1, 2, 3, 4, 5,...51)이다. 상기 아데노바이러스는 아데노바이러스 타입 2 또는 아데노바이러스 타입 5일 수 있다. 일반적으로 본원의 용기 내에 제공되는 조성물 내의 아데노바이러스는 E1, E2a, E2b, E3, 또는 E4 코딩 영역의 임의의 1 또는 그 이상에서 결실(deletion)을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스는 E1 코딩 영역에서 결실을 포함한다. 이종성 핵산 분자가 1 또는 그 이상의 임의의 결실된 영역 내에 삽입 또는 포함될 수 있다.

본원에서 제공되는 용기의 예에서, 상기 조성물은 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 포함한다. 예를 들어, 바이러스에 있어서, 핵산 분자는 그것의 게놈에 대하여 이종성인 것이다. 일부 예에서, 핵산 분자는 폴리펩티드를 암호화하는 임의의 핵산일 수 있다. 상기 암호화된 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 응집 또는 응고 인자(coagulation or clotting factor), 성장 인자(growth factor), 항체 또는 이의 부분, 혈관신생 조절자(angiogenesis modulator), 면역조절자(immunomodulator), 통증 조절자(pain modulator), 수용체, 수송 단백질(transporter protein), 조절 단백질(regulatory protein), 항원(antigen) 또는 알러젠(allergen)일 수 있다. 예를 들어, 상기 암호화된 폴리펩티드는 인터류킨, 인터페론, 성장 인자 또는 이의 부분 또는 성장 인자 수용체 또는 이의 부분일 수 있다. 본원의 용기 내에 제공되는 조성물 내의 예시적인 핵산 분자는 아데노신 데아미나제, 낭포성 섬유증 막관통 전도 레귤레이터(CFTR), 갈설파제, 라로니다제, N-아세틸갈락토사민 6-설파타제, 페닐알라닌 암모니아 리아제, 산 알파 글루코시다제, 이미글루세라제, 알글루코시다제 알파, 갑상선 자극 호르몬, 성장 호르몬, 인슐린, 갑상선 호르몬, 에리트로포이에틴(EPO), 인터류킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, 인터페론-α(IFN-α), IFN-β, IFN-ν, 종양괴사인자(TNF), IL-12, IL-18, fms-관련 티로신 키나제 3(flt3), 뉴로필린-2(NP2), 골형성 단백질(BMP), 표피 성장 인자(EGF), 에리트로포이에틴(EPO), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자 α 및 β, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR), FGFR 길항제(sFGFR), 형질전환 성장 인자 수용체(TGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGFR), 플라스미노겐 액티베이터, 유로키나제, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 폰 빌레브란트 인자, 성장 호르몬, 금속단백질분해효소 트롬보스폰딘 모티프 1(METH-1), METH-2, 트립토파닐-tRNA 신테타제(TrpRS) 단편, 프롤리페린-관련 단백질, 프로락틴 단편, 색소 상피 유래 인자(PEDF), 바소스타틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 키니노스타틴, 피브리노겐-E 단편, 트롬보스폰딘, 툼스타틴, 캔스타틴, 레스틴, 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1(sFlt-1), 가용성 혈관 내피 성장인자 수용체(sFlk), 가용성 뉴로필린 1(sNRP1), 인터페론 감마-유도 단백질 10(IP-10), 혈소판 인자 4(PF-4), 그로-베타, 가용성 에프린 타입-B 수용체 4(sEphB4), 세프린B2, IGF-1, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(HSV-TK), 카복시펩티다제 G2(CPG2), 카복실에스터라제(CA), 사이토신 데아미나제(CD), 사이토크롬 P450, 데옥시사이티딘 키나제(dCK), 니트로리덕타제(NR), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(PNP), 티미딘 포스포릴라제(TP), 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제(VZV-TK), 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(XGPRT), 아스파르틸글루코사미니다제, α-갈락토시다제 A, 팔미토일 단백질 티오에스터라제, 트리펩티딜 펩티다제, 리소좀 막관통 단백질, 시스테인 트랜스포터, 산 세라미다제, 산 α-L-푸코시다제, 보호적 단백질/카텝신 A, 산 β-글루코시다제 또는 글루코세레브로시다제, 산 β-갈락토시다제, 이두로네이트-2-설파타제, α-L-이두로니다제, 갈락토세레브로시다제, 산 α-만노시다제, 산 β-만노시다제, 아릴설파타제 B, 아릴설파타제 A, N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, 산 스핑고미엘리나제, 니이만-픽병, 타입 C1(NPC-1), β-헥소사미니다제 B, 헤파란 N-설파타제, α-N-아세틸글루코사미니다제(NaGlu), 아세틸-CoA:알파글루코사미닌드 N-아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸 글루코사민-6-설페이트 설파타제, β-글루쿠로니다제, 산 리파아제, 네프릴리신, 인슐린-분해 효소 인슐리신, 티멧 올리고펩티다제, 칼빈딘 D28, 파발부민, 저산소증 유도 인자 1-알파(HIF1-alpha), 서투인-2(SIRT-2), 생존 운동 뉴런 단백질-1(SMN-2), SMN-2, 교세포 유래 신경영양 인자(GDNF), 모양체 신경영양 인자(CNF), 저밀도 지단백 수용체(LDLR), 지단백 리파아제(LPL), 알파 1-항 트립신(AAT), UDP-글루쿠로닐-트랜스퍼라제(UGT), UGT1A1, 글루코스-6 포스파타제, 포스포에놀피루베이트-카복시키나제, 갈락토스-1 포스페이트 유리딜 트랜스퍼라제, 페닐알라닌 히드록실라제, 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지나제, 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, 오르니틴 트랜스카바밀라제, 아르지노숙신산 신테타제, 아데노신 데아미나제, 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, 비오티니다제, 베타-글루코세레브로시다제, 베타-글루쿠로니다제, 포르포빌리노겐 데아미나제(PBDG) 또는 p53을 암호화하는 임의의 것을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

일부 예에서, 본원에서 제공되는 용기 내의 조성물은 동물에서 근육 생산을 증가시키거나, 동물에서 털 생산을 증가시키거나, 동물에서 모 생산을 증가시키거나, 동물의 성장을 증가시키거나, 영양소 합성 또는 활용과 관계된 폴리펩티드를 암호화한다. 상기 암호화된 폴리펩티드는 미오스타틴 저해제, 성장 호르몬, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자, 닭 Ski, 세린 트랜스아세틸라제 및 o-아세틸세린 설프히드릴라제일 수 있다. 특정한 예에서, 상기 미오스타틴 저해제는 폴리스타틴이다.

도 1A는 분리된 엽 및 각 엽에 대한 혈액 공급을 묘사하는 간의 해부학의 도이다. 간은 전통적으로 4개의 엽으로 나누어진다: 왼쪽 해부학적 엽, 오른쪽 해부학적 엽, 꼬리엽 및 네모엽. 랫트의 간에서, 이러한 해부학적으로 분리된 엽은: 중앙엽(median lobe)(10), 왼쪽 외측엽(left lateral lobe)(11), 오른쪽엽(13), 및 꼬리엽(12)이다. 중앙엽은 횡격막 바로 아래에 위치해 있다. 중앙엽은 엽간 틈새(fissure)를 형성하고 엽을 왼쪽 및 오른쪽 부분으로 나누는 낫인대(faciform ligament)를 통하여 횡격막에 고정되어 있다. 중앙엽은 총 간 질량의 거의 40%를 나타낸다. 왼쪽 외측엽은 중앙엽 아래 및 꼬리엽 위에 위치해 있다. 엽간 인대들은 왼쪽 외측엽을 꼬리엽의 상위 부분과 고정한다. 왼쪽 외측엽은 총 간 질량의 대략적으로 30%를 나타낸다. 오른쪽엽은 대정맥(1)의 오른쪽에 위치해 있으며 2개의 잘 구분된 영역인 오른쪽 상부엽(right superior lobe)과 오른쪽 하부엽(right inferior lobe)을 포함한다. 오른쪽 상부엽은 구형의(spherically) 모양이다. 오른쪽 상부엽의 고정 요소는 간-횡격막 인대이다. 오른쪽 하부엽은 끝부분(tip)이 대정맥을 향해 있는 삼각형 모양을 갖는다. 오른쪽엽은 총 간 질량의 20%를 나타낸다. 꼬리엽은 대정맥의 왼쪽에 왼쪽 외측엽 바로 아래에 위치한다. 꼬리엽은 2개의 부분으로 나뉜다: 위쪽 꼬리 부분(upper caudate portion) 및 아래쪽 꼬리 부분(lower caudate portion). 위쪽 꼬리엽은 엽간 인대를 통하여 왼쪽 외측엽에 그리고 간-위 인대를 통하여 위에 고정된다. 꼬리엽의 아래쪽 부분은 위의 뒤편에 위치하고 있다. 꼬리엽은 총 간 질량의 7%를 나타낸다.
간으로의 혈액의 유입은 간문맥(portal vein)(6) 및 간동맥(hepatic artery)(5)을 통하는데, 간 내로의 유입에 있어서, 상기 간문맥과 간동맥은 오른쪽 및 왼쪽으로 분지하여 다양한 엽들로 공급한다. 제1분지는 오른쪽 하부 간문맥(right inferior portal vein)(7) 및 오른쪽 상부 간문맥(right superior portal vein )(8)으로 진행하여 오른쪽엽에 공급한다. 제2분지는 꼬리 간문맥(caudate portal vein )으로서 왼쪽으로 진행하는데 이는 2개의 정맥: 상부 꼬리 분지(upper caudate branch) 및 하부 꼬리 분지(lower caudate branch)로 갈라진다. 간문맥은 그것의 주된 분기점(bifurcation)으로 진행하여 중앙엽의 오른쪽 부분에 공급하는 오른쪽 중앙 간문맥(right median portal vein )(9) 및 각 상응하는 엽에 공급하는 왼쪽 중앙 간문맥(left median portal vein)(2) 및 왼쪽 외측 간문맥(left lateral portal vein)(3)을 방출하는 왼쪽 간문맥이 된다. 간의 동맥 관개(irrigation)는 간동맥에 의해 제공되는데, 간동맥은 일단 간에 들어가면, 오른쪽 및 왼쪽으로 분지되어 상기 엽들에 공급하고 간문맥과 동일한 분포를 따른다.
도 1B는 간의 기능적/혈관적 특징들에 기초하여 간의 추가적인 분할을 묘사한다. 3개의 주된 간정맥(오른쪽 간정맥(right hepatic vein), 중간 간정맥(middle hepatic vein) 및 왼쪽 간정맥(left hepatic vein))이 인간의 간을 문맥계의 상응하는 분지에 의해 각각 공급받는 4개의 섹션 또는 구역(segment)(오른쪽 뒤쪽 구역(right posterior segment), 오른쪽 앞쪽 구역(right anterior segment), 왼쪽 내측 구역(the left medial segment) 및 왼쪽 외측 구역(left lateral segment)으로 나눈다. 간문맥의 추가적인 분지는 인간의 간을 8개의 해부학적으로 독립적인 하위구역(subsegment)으로 세분하는데, 각 하위구역은 각각 고유의 수출 간정맥계, 수입 간문맥계, 수입 동맥계 및 담즙관계를 가진다. 하위구역 Ⅰ및 Ⅳ 왼쪽 내측 구역(left medial segment)에 상응하고, 구역 Ⅱ 및 Ⅲ는 왼쪽 외측 구역(left lateral segment)에 상응하고, 하위구역 Ⅴ및 Ⅷ은 오른쪽 앞쪽 구역(right anterior segment)에 상응하고, 하위구역 Ⅵ 및 Ⅶ은 오른쪽 뒤쪽 구역(right posterior segment)에 상응한다.
도 2는 정맥내 투여에 의한 대정맥 내로의 투여(도 2A)에 의한 또는 페디클 클램프로 꼬리엽을 통하는 혈액 흐름이 차단된 동안 꼬리엽의 실질 내로의 간질 투여(도 2B)에 의한 재조합 아데노바이러스의 전달에 있어서 루시퍼라제 활성의 비교를 나타낸다(도 2A). 결과는 일시적 구획화에 따라 꼬리엽 내에만 루시퍼라제의 발현을 보여준다.
도 3은 구획화된 방법에 의해 전달될 때 전신적 순환에서 아데노바이러스 DNA의 존재를 나타낸다. 특히, 도 3A는 30분 또는 60분 후 꼬리엽의 혈관적 격리의 종결에 있어서 아데노바이러스 DNA가 부재하나, 7분 또는 15분 후 꼬리엽의 혈관적 격리의 종결에 있어서 아데노바이러스 DNA가 전신적으로 검출되었음을 보여준다. 도 3B는 30분 혈관적 격리(페디클 클램프를 통해)의 개시 및 종결 후 아데노바이러스 DNA 존재의 역학을 보여준다. 결과는 아데노바이러스 주사 후 1, 3 및 5분(클램핑 동안) 및 클램프의 방출 후 1, 3 및 5분(클램프 방출 후)에 아데노바이러스 DNA의 부재를 보여준다.
도 4는 혈관적 격리 동안 랫트의 꼬리엽으로의 재조합 아데노바이러스의 다양한 용량의 실질 투여에 있어서 꼬리엽 내의 루시퍼라제 활성을 보여준다. 파선은 임의의 용량에서 동일한 벡터의 정맥내 주입을 사용하여 달성된 발현의 최대량을 보여준다. 결과는 혈관적 격리가 핵산의 발현을 현저하게 증가시키며 제공되는 바이러스 벡터의 양에 기초하여 용량-의존적 방식으로 단백질 발현의 조절된 수준을 제공한다는 것을 보여준다.
도 5는 혈관적 격리 동안 랫트의 꼬리엽으로의 재조합 아데노바이러스의 실질 투여에 따른 간 유전자 치료의 구획화된 모델에서 최대 1년까지 지속된 꼬리엽에서 루시퍼라제 발현을 보여준다.
도 7은 실질 클램프로 혈액 흐름을 차단한 동안 돼지의 왼쪽 중앙엽의 실질 내로 재조합 아데노바이러스의 전달에 있어서 주사 부위에서 근위, 내측, 및 원위에서 왼쪽 중앙엽(left median lobe(comp; 주사의 부위)), 왼쪽 외측엽(left lateral lobe), 오른쪽 외측엽(right lateral lobe), 및 오른쪽 중앙엽(right median lobe)으로부터의 조직 시료에서의 루시퍼라제 유전자 발현의 비교를 나타낸다. 결과는 주사 부위에서만 루시퍼라제 발현을 보여준다.
도 8은 랫트의 간의 구획화된 꼬리엽으로 알파 태아단백질(alpha fetoprotein, AFP)을 암호화하는 재조합 아데노바이러스의 전달 후 7일에 랫트의 혈청에서 AFP 단백질 수준을 보여준다.

개요

A. 정의

B. 핵산의 전달 및 유전자 치료

1. 기존의 유전자 치료 방법

2. 구획화된 조직 또는 기관으로의 직접적 전달

C. 핵산 전달의 구획화된 방법

1. 조직 또는 기관의 구획화

a. 간(Liver)

b. 기타 기관

2. 전달되는 제제의 투여에 의한 핵산의 전달

a. 전달 방법 및 투여 경로

b. 전달을 용이하게 하기 위한 방법

c. 전달을 위한 투여량 및 요법(Regimen)

3. 구획화의 종결/방출

D. 전달되는 제제

1. 핵산 분자

2. 핵산 분자를 포함하는 비히클(Vehicles) 및 구축물(Constructs)

a. 바이러스 및 바이러스 벡터

i. 아데노바이러스(Adenovirus)

ii. 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus)

iii. 레트로바이러스(Retrovirus)

iv. 렌티바이러스(Lentivirus)

b. 비-바이러스 벡터(Non-Viral Vectors)

나노입자(Nanoparticle)

c. 전 세포(Whole Cell)

3. 예시적인 유전자 치료 제제

E. 조성물, 시스템 및 키트

1. 투여량 제형(Dosage Formulations)

2. 조합(Combinations)

3. 제조품 및 키트

F. 전달, 발현 또는 효율의 평가

1. 전달되는 제제의 모니터링

2. 숙주 독성 및 면역 활성화

G. 적용 및 사용 방법

1. 질환 및 장애의 치료

a. 혈우병 A 및 B(Hemophilia A and B)

b. 가족성 고콜레스테롤혈증(Familial Hypercholesteroloemia)

c. 타입 I 당뇨병(Type I Diabetes Mellitus)

d. 알파-1-항트립신 결핍(Alpha-1-Antitrypsin (AAT) Deficiency)

e. 혈관신생 및 암

f. 자가면역 및 염증성 장애(예컨대 다발성 골수증(Multiple Sclerosis))

g. 급성 간헐성 포르피린증(Acute Intermittent Porphyria (AIP))

h. 산필립포 증후군(Sanfilippo Syndrome, (점액다당류증 타입 Ⅲ, Mucopolysaccharidosis type Ⅲ; MPSⅢ)

i. 지단백 리파아제 결핍(Lipoprotein Lipase Deficiency (LPLD))

2. 단백질 발현 및 생산

3. 수의학적 및 농업적 적용

H. 실시예

A. 정의

달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 전체 공개에 걸쳐 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공개된 출원 및 간행물, Genbank 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 간행된 것들은, 달리 표시되지 않는 한, 전체가 참조로서 통합된다. 본원에서 용어에 대한 복수개의 정의가 있는 경우, 이 섹션의 정의가 우선한다. 참조가 URL 또는 기타 이러한 확인자(identifier) 또는 주소에 대해 만들어지는 경우, 이는 이러한 확인자가 변화할 수 있으며 인터넷상의 특정한 정보가 오고 갈 수 있으나, 등가의(equivalent) 정보가 인터넷을 검색함으로써 발견될 수 있다는 것이 이해된다. 이에 대한 참조는 이러한 정보의 이용가능성 및 공중의 전파를 증거한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "구획화(compartmentalization)" 또는 "구획화된(compartmentalized)", 또는 이의 문법적 변형은, (본원에서 순환적 격리(circulatory isolation) 또는 혈관 격리(vasculature isolation)로도 언급됨) 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분과 관련하여 전신적 순환으로부터 조직 또는 기관 또는 이의 격리를 지칭한다. 상기 격리는 1 또는 그 이상의, 일반적으로 모든, 조직 또는 기관 또는 이의 부분을 가로지르고 전신적 순환으로 흐르거나, 접근하거나, 그렇지 않으면 소통하는 동맥, 정맥, 도관 또는 맥관을 차단하거나 폐쇄함으로써 달성될 수 있다. 조직 또는 기관의 구획화는 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분 또는 영역으로의 혈류의 정지 또는 억제로 특징지어진다. 구획화는 조직 및 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분 또는 영역과 신체의 나머지 부분 간의 전신적 순환을 통한 소통 또는 접근을 방해한다. 구획화는 1 또는 그 이상의 동맥, 정맥, 도관 또는 맥관을, 예컨대 폐쇄 카테터, 밴드, 압박대 또는 클램프를 사용하여 차단하거나 폐쇄하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "조직 또는 기관 또는 이의 부분으로의 혈액 흐름이 감소되거나 제거된다"는 설명, 또는 이와 유사한 언어는, 조직 또는 기관 또는 이의 부분에 공급하거나 가로지르는 동맥, 정맥, 도관 및/또는 맥관으로부터의 혈액 공급 또는 흐름에 있어서의 방해 또는 차단이 있어, 조직 또는 조직의 부분이 혈액 내에 운반되는 물질들에 대한 접근을 박탈당함을 의미한다. 이러한 차단은 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분에 대한 무산소증(anoxia) 또는 허혈증(ischemia)을 야기할 수 있다. 조직 또는 기관으로의 혈액 흐름의 감소 또는 제거를 모니터링하는 것은 당업자의 수준 내이다. 예를 들어, 혈액 흐름의 감소 또는 제거는 조직의 색상; 인디아 잉크(India ink) 또는 기타 보고가능한 염색약을 사용하는 전자 상자성 공명 옥시메트리(electron paramagnetic resonance (EPR) oximetry); 조직 분광학(Tissue Spectroscope (TiSpec))을 사용하여; 관류 자기 공명 영상(perfusion magnetic resonance imaging), 양성자 방출 단층촬영(positron emission tomography), 근적외선 스펙트럼(near-infrared (NIR) spectroscopy), 광학적 도플러 단층촬영(optical Doppler tomography), 초음파 및 기타 당업자에게 알려진 방법에 기초하여 모니터링될 수 있다. 본원의 목적을 위하여, 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분으로의 혈액 흐름은 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화 동안 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 그리고 최대 약 100%까지 감소되어야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "전신적 순환(systemic circulation)" 또는 "일반 순환(general circulation)"은 좌심실로부터의 산소화된 혈액을 신체 조직으로 운반하고, 정맥혈을 우심방으로 되가져 오는 일반 순환을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 기관(organ) 또는 조직(tissue)은 특정한 기능을 수행하는 대상체의 신체의 분화된 부분을 지칭한다. 조직은 일반적으로 함께 군을 이루어 전문화된 기능을 형성하는 전문화된 세포들의 군이다. 예를 들어, 근육 조직은 수축할 수 있는 전문화된 조직이다. 기관은 기능을 수행하는 조직으로 구성된다. 기관의 예는 눈, 귀, 폐, 간, 신장, 심장, 또는 피부를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "조직 또는 기관의 부분(portion of a tissue or organ)"은 대상체의 신체의 조직 또는 기관의 부분을 지칭한다. 상기 부분은 조직 또는 기관의 영역(region), 구역(segment), 엽(lobe), 섹션(section) 또는 기타 부분일 수 있다. 상기 부분은 일반적으로 나머지 조직 또는 기관으로부터 상기 부분의 구획화를 허용하기 위해 상기 조직 또는 기관의 나머지로부터 별도로 동원되거나 분리될 수 있는 것이다. 상기 부분은 또한 제제의 전달을 달성하기에 충분한 부분이다. 구획화 및/또는 제제의 전달을 달성하기에 충분한 조직 또는 기관의 부분의 적절한 크기를 결정하는 것은 당업자의 수준 내이며, 이는 특정한 기관, 구획화를 위해 사용되는 기구, 치료되는 적응증(indication), 투여량, 대상체의 크기 및 기타 파라미터들에 의존적이다. 전형적으로, 조직 또는 기관의 부분은 적어도 약 5 mm³, 10 mm³ 또는 그 이상의 부피를 갖는다. 예를 들어, 상기 부분은 0.5 cm 내지 25 cm 범위의 길이, 0.5 cm 내지 20 cm의 높이(또는 두께) 및/또는 0.5 cm 내지 15 cm의 깊이를 갖는 조직 또는 기관의 임의의 영역일 수 있다. 일 예로서, 간엽 또는 구역의 부분은 5 cm 내지 10 cm의 길이, 1 cm 내지 3 cm의 높이 및 1.5 cm 내지 3 cm의 깊이(끝(tip)으로부터)를 갖는다. 더 작은 영역 또는 부분이 또한 구획화될 수 있는 부분인 한 고려된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 구획화와 관련하여 소통 복구(restoring communication)는 조직 또는 기관 또는 조직 또는 기관의 부분의 구획화가 상기 조직 또는 기관와 전신적 순환의 접근을 복구 또는 재개하기 위해 종결되는 과정을 지칭한다. 이는 조직 또는 기관 또는 이의 부분을 가로지르는 1 또는 그 이상의, 그리고 일반적으로 모든, 동맥, 정맥, 도관 또는 맥관을 차단하거나 폐쇄하는 데 사용된 장치, 장비 또는 과정을 제거함으로써 달성될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 전신적 순환과의 소통의 복구 전에 구획화의 종결과 관련하여 미리 결정된 시간(predetermined time)은 이전에 알려져 있고 조절될 수 있는 제한된 시간을 의미한다. 전형적으로, 미리 결정된 시간은 전달되는 제제의 투여 또는 전달 후에 조직 또는 기관(예컨대 간의 간세포(hepatocyte))의 실질의 세포 내에서 전달되는 제제의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상이 세포내인 시간이다. 일반적으로, 이러한 시간은 구획화의 종결에 의해 소통의 복구에 있어서 전달되는 제제의 10%, 5% 또는 그 미만이 전신적 순환에서 존재하는 시간이다. 이러한 시간은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있으며, 예를 들어, 특정한 표적 기관 및 전달되는 제제의 함수이다. 특정 예에서, 미리 결정된 시간은 구획화의 개시 및/또는 전달되는 제제의 투여 후 적어도 약 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 35 분, 40 분, 45 분, 50 분 또는 60 분이다. 미리 결정된 시간은 세포에 의한 전달되는 제제의 흡수를 증가시키는 방법, 기전 또는 기법에 의해 조절될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 알려져 있으며 본원에 기술된다. 따라서, 일부 예에서, 미리 결정된 시간은 15분 미만, 예컨대 5분 내지 15분일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 실질(parenchyma)은 기관의 특정한 기능을 수행하고 기관의 대부분을 구성하는 조직 및 기관의 관련된 세포를 지칭한다. 그러므로, 실질은 기관의 기능적 조직의 주된 근본이다. 이는 상피 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 이의 관련된 세포들을 포함할 수 있다. 실질은 기질(stroma)과 구별되는데, 기질은 결합조직, 혈관, 신경 및 도관이다. 그러므로, 실질은 결합조직, 혈관, 신경 및 도관을 포함하지 않는다. 예를 들어, 간의 실질은 간세포를 포함하며, 심장의 실질은 미오사이트(myocyte)와 같은 심근세포를 포함하고, 신장의 실질은 네프론(nephron)을 포함한다. 피부의 실질은 표피(epidermis)이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "실질 세포(parenchymal cell)"는 조직 또는 기관의 실질에 포함되거나 조직 또는 기관의 실질을 구성하는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 간세포는 간의 주된 조직의 세포이며, 간 질량의 최대 70-80%를 구성한다. 폐에서, 모든 폐 세포의 75%는 실질에 포함된다. 이는 예를 들어 간질(interstitium)의 섬유아세포(fibroblast) 및 폐포를 따라 존재하는 상피세포, 예컨대 타입 1 및 타입 2 세포(폐세포(pneumocyte)) 및 솔세포(brush cell)를 포함한다. 피부에서, 실질에서 발견되는 세포는 각화세포(keratinocyte)와 같은 표피세포를 포함한다. 당업자는 다양한 조직 및 기관의 실질 그리고 그들의 세포에 대해 잘 알고 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 실질 투여(parenchymal administration)는 조직 또는 기관의 실질에 대한 투여를 지칭한다. 실질에 대한 투여는 전형적으로 주사 또는 모세관 확산에 의한다.

본원에서 사용되는 바와 같이 클램프(clamp)는 구조(structure), 예컨대 기관, 혈관 또는 조직을 압박하는 데 사용되는 장치, 예컨대 외과적 장치를 지칭한다. 클램프는 일반적으로 구조를 압박하기 위해 구조의 반대쪽 편에 압력 또는 힘을 가하기 위해 동원되거나 조정될 수 있는 반대되는 편 또는 부분을 갖는다. 클램프는 톱니 턱(jaw), 잠금 손잡이 및/또는 팽창될 수 있는 벌룬(baloon)을 가질 수 있다. 일반적으로, 클램핑하는 힘 또는 압력은 조정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "실질 클램프(parenchymal clamp)"는 조직 또는 기관의 실질을 압박할 수 있는 클램프를 지칭한다. 실질 클램프는 페디클 클램프(pedicle clamp)를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 복강경 수술(laparoscopic surgery)은 작은 절개(예컨대 0.5 내지 1.5 cm)를 통해 수행되고 복강경을 사용하는 외과 수술을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "전달되는 제제(delivered agent)"는 유전자 치료를 위한 핵산 분자를 포함하고 세포 내로 핵산 분자의 유입 및/또는 이의 발현을 용이하게 하는 제제(agent) 또는 전달자(conduit), 예컨대 비히클, 벡터, 또는 구축물을 지칭한다. 그러므로, 전달되는 제제는 대상체에 투여되고 그 안에 패키징된 핵산 분자를 포함하거나 이와 관련된 실체(entity)이다. 전달되는 제제의 예는 바이러스, 바이러스-유사 입자, 미니-서클, 플라스미드 또는 벡터, 리포좀 및/또는 나노입자를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 전달되는 제제는 숙주 대상체 내로의 전달을 위한 핵산 분자 또는 기타 제제, 예컨대 본원에서 제공되는 비-바이러스 벡터 또는 바이러스와 관련된 지질-기반 또는 기타 폴리머-기반 조성물, 예컨대 리포좀, 미셀 또는 역(reverse) 미셀을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 네이키드 DNA(naked DNA)가 전달되는 제제일 수 있다. 전달되는 제제의 흡수는 전기천공, 초음파천공 또는 "유전자 총"과 같은 다양한 물리적 기법을 사용하여 더욱 증가되거나 용이하게 될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "유전적 치료(genetic therapy)" 또는 "유전자 치료(gene therapy)"는 이러한 치료가 추구되는 장애 또는 질환을 갖는 포유류, 특히 인간의 특정 세포, 표적 세포로 핵산 분자, 예컨대 이종성 DNA를 전달하는 것과 관련된다. DNA는 이종성 DNA가 발현되고 이에 의해 암호화되는 치료적 산물이 생산될 수 있도록 선택된 표적 세포 내로 도입된다. 대안적으로, 이종성 DNA는 치료적 산물을 암호화하는 DNA의 발현을 어떤 방식으로 매개할 수 있고, 어떤 방식으로 직접적 또는 간접적으로 치료적 산물의 발현을 매개하는 산물, 예컨대 펩티드 또는 RNA를 암호화할 수 있다. 유전적 치료는 또한 결함이 있는 유전자를 대체하거나 유전적 치료가 도입되는 포유류 또는 세포에 의해 생산되는 유전자 산물을 보충하기 위해 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 전달하는 데 사용될 수 있다. 도입된 핵산은 포유류 숙주에서 정상적으로 생산되지 않거나 치료적 유효량으로 생산되지 않거나 치료적으로 유용한 시점에 생산되지 않는 치료적 화합물(예컨대 이의 성장 인자 저해제, 또는 종양 괴사 인자 또는 이의 저해제, 예컨대 그것에 대한 수용체)를 암호화할 수 있다. 치료적 산물을 암호화하는 이종성 DNA는 산물 또는 이의 발현을 강화하거나 그렇지 않으면 변화시키기 위해 질환이 있는 숙주의 세포 내로 도입하기 전에 변형될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산 분자는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)과 같은 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 RNA 또는 DNA의 유사체(analog) 또는 유도체(derivative)를 지칭한다. 또한 용어 "핵산"에는 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA(phosphorothioate DNA), 및 기타 이러한 유사체 및 유도체와 같은 핵산의 유사체가 포함된다. 핵산은 유전자 산물, 예컨대 예를 들어 폴리펩티드, 조절 RNA(regulatory RNA), 마이크로 RNA, 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 기능성 RNA(functional RNA)를 암호화할 수 있다. 그러므로, 핵산 분자는 siRNA, 앱타머(aptamer), 리보자임, 상보적 DNA(cDNA), 플라스미드 및 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 DNA를 포함하는 모든 타입 및 크기의 DNA 분자를 포함하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 치료적 핵산(therapeutic nucleic acid)은 치료적 산물을 암호화하거나 치료적 효과를 생산할 수 있는 핵산 분자이다. 상기 산물은 조절 서열(regulatory sequence) 또는 유전자와 같이 핵산일 수 있거나, 치료적 활성 또는 효과를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들어, 치료적 핵산은 리보자임, 안티센스, 이중-가닥 RNA, 단백질을 암호화하는 핵산 및 기타일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 치료적 산물은 치료적 효과를 생산할 수 있는 화합물이다. 상기 화합물은 폴리펩티드, 펩티드, DNA 또는 RNA일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스의 게놈 내에 포함된 핵산과 관련하여 이종성 핵산(heterologous nucleic acid)(외인성 핵산(exogenous nucleic acid) 또는 외래 핵산(foreign nucleic acid)으로도 지칭됨)은 그것이 발현되는 유기체 또는 바이러스에 의해 생체내에서 정상적으로 생산되지 않거나 유기체 또는 바이러스에 의해 생산되지만 상이한 위치에서 생산되거나, 또는 전사, 번역, 또는 기타 조절가능한 생화학적 과정에 영향을 줌으로써 내인성 핵산, 예컨대 DNA의 발현을 변화시키는 매개자(mediator)를 매개하거나 암호화하는 핵산을 지칭한다. 그러므로, 이종성 핵산은 종종 그것이 도입되는 유기체 또는 바이러스에 대해 정상적으로 내인성이 아니다. 이종성 핵산은 동일한 종 또는 다른 종을 포함하는, 동일한 유기체 또는 다른 유기체에서 다른 바이러스로부터의 핵산 분자를 지칭할 수 있다. 그러나 이종성 핵산은 내인적일 수 있으나, 다른 위치로부터 발현되거나 그것의 발현 또는 서열(예컨대 플라스미드)이 변화된 핵산이다. 그러므로, 이종성 핵산은 게놈에서 발견되는 상대 핵산 분자(counterpart nucleic acid molecule), 예컨대 DNA와 같은 정확한 기원 또는 위치에서 존재하지 않는 핵산 분자를 포함한다. 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, 이러한 핵산은 유기체 또는 바이러스에 의해 정상적으로 생산되지 않거나 그것이 발현되는 바이러스와 동일한 방식으로 생산되지 않는 RNA 및 단백질을 암호화한다. 당업자가 핵산이 발현되는 바이러스에 대해 이종성, 외인성 또는 외래로 인식하거나 생각하는 임의의 핵산, 예컨대 DNA는 본원에서 이종성 핵산에 의해 포함된다. 이종성 핵산의 예는 진단적 및/또는 치료적 제제를 포함하여, 외인성 펩티드/단백질을 암호화하는 핵산을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이종성 핵산에 의해 암호화되는 단백질은 상기 이종성 핵산이 도입된 바이러스 내에 발현되거나, 분비되거나, 또는 바이러스의 표면에 발현될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 검출가능한 표지(label) 또는 검출가능한 모이어티(moiety)는 원자, 분자 또는 조성물로서, 상기 원자, 분자, 또는 조성물의 존재는 직접적으로 또는 간접적으로 측정될 수 있는 것을 지칭한다. 검출가능한 표지는 임의의 본원에서 전달되는 제제에 포함되고 사용될 수 있다. 검출가능한 표지는, 예를 들어, 화학발광 모이어티, 생물발광 모이어티, 형광 모이어티, 방사성 핵종(radionuclide), 및 금속을 포함한다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는, 예를 들어, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 금콜로이드(colloidal gold), 철, 가돌리늄(gadolinum), 및 갈륨-67(gallium-67)을 포함한다. 표지를 검출하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 표지는, 예를 들어, 시각적 검사에 의해, 형광 분광계에 의해, 반사율 측정에 의해, 유동 세포계수법에 의해, X-레이에 의해, 자기 공명 영상(MRI) 및 자기 공명 분광계(MRS)와 같은 다양한 자기 공명 방법에 의해 검출될 수 있다. 검출의 방법은 또한 컴퓨터 단층 촬영(CT), 컴퓨터 축 단층 촬영(CAT), 전자빔 컴퓨터 단층 촬영(EBCT), 고해상도 컴퓨터 단층 촬영(HRCT), 하이포사이클로이드형(hypocycloidal) 단층 촬영, 양전자 방출 단층 촬영(PET), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT), 나선형 컴퓨터 단층 촬영, 및 초음파 단층 촬영을 포함하는 임의의 다양한 단층 촬영 방법을 포함한다. 검출가능한 표지의 직접적 검출은, 예컨대 X-레이 또는 MRI에 의해, 예를 들어, 검출가능한 표지 자체의 물리적 현상의 측정, 예컨대 표지 자체의 에너지 또는 입자 방출 또는 흡수를 지칭한다. 간접적 검출은 검출가능한 표지에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 원자, 분자 또는 조성물의 물리적 현상의 측정, 예컨대 검출가능한 표지에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 원자, 분자 또는 조성물의 에너지 또는 입자 방출 또는 흡수를 지칭한다. 간접적 검출의 비-제한적 예에서, 검출가능한 표지는 비오틴(biotin)일 수 있는데, 이는 아비딘(avidin)에 결합함으로써 검출될 수 있다. 비-표지된 아비딘이 비-특이적 결합을 차단하기 위해 전신적으로 투여될 수 있고, 그 다음 표지된 아비딘이 전신적으로 투여될 수 있다. 따라서, 검출가능한 라벨 또는 검출가능한 모이어티의 범주 내에는 결합가능한(bindable) 표지 또는 결합가능한 모이어티가 포함되는데, 이는 원자, 분자 또는 조성물을 지칭하며, 여기에서 원자, 분자, 또는 조성물의 존재는 표지 또는 모이어티가 다른 원자, 분자 또는 조성물에 결합한 결과 검출될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, DNA 구축물은 자연계에서 발견되지 않는 방식으로 결합되고 병렬된 DNA의 조각(segment)을 포함하는 단일 또는 이중 가닥, 선형 또는 환형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간 조작의 결과로서 존재할 수 있으며, 조작된 분자의 클론 및 기타 복제물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터(또는 플라스미드)는 이의 발현 또는 복제를 위해 세포 내로 이종성 핵산을 도입하는 데 사용되는 별개의 요소를 지칭한다. 벡터는 전형적으로 에피솜에(episomal) 남아 있으나, 게놈의 염색체 내로 유전자 또는 이의 부분의 통합을 달성하기 위해 설계될 수 있다. 벡터는 비-바이러스 벡터, 예컨대 비-바이러스 발현 벡터를 포함한다. 또한 인공 염색체, 예컨대 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체인 벡터가 고려된다. 벡터는 또한 "바이러스의 벡터(virus vector)" 또는 "바이러스 벡터(viral vector)"를 포함한다. 이러한 비히클의 선택 및 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 벡터의 발현은 이러한 DNA 단편(fragment)의 발현을 달성할 수 있는 조절 서열(regulatory sequence), 예컨대 프로모터 영역에 작동적으로 연결된 DNA를 발현할 수 있는 벡터를 포함한다. 이러한 부가적인 조각은 프로모터 또는 터미네이터(terminator) 서열을 포함하고, 선택적으로 1 또는 그 이상의 복제 기점, 1 또는 그 이상의 선별 마커(selectable marker), 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 및 이와 유사한 것들을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유래되거나, 양자의 요소를 포함할 수 있다. 따라서, 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내로 도입되면 클로닝된 DNA의 발현을 야기하는, 플라스미드, 파지(phage), 재조합 바이러스 또는 기타 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구축물을 지칭한다. 적절한 발현 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며 진핵세포 및/또는 원핵세포 내에서 복제가능한 것들 및 에피솜에 남아있는 것들 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합되는 것들을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "바이러스"는 숙주 세포 없이 성장 또는 복제할 수 없는 감염성 실체의 큰 군의 임의의 것을 지칭한다. 바이러스는 전형적으로 유전적 물질의 RNA 또는 DNA 코어(core)를 둘러싼 단백질 코트(coat)를 포함하나, 반투과성 막을 포함하지 않으며, 살아있는 세포에서만 성장 및 복제가 가능하다. 바이러스는 예를 들어 바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 벡터가 이러한 입자의 생성을 위해 적절한 세포 또는 세포주 내로 형질도입되었을 때에 형성되는 것들을 포함한다. 야기되는 바이러스 입자는 핵산을 시험관내 또는 생체내에서 세포로 전달하는 것을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 용도를 가진다. 따라서, 바이러스는 바이러스 게놈 내에 패키징된다. 바이러스는 단일 입자, 입자의 스톡(stock) 또는 바이러스 게놈을 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스 벡터는 바이러스 기원의 적어도 하나의 요소를 포함하는 바이러스 벡터 입자 또는 바이러스 내로 패키징될 수 있는 핵산 벡터 구축물을 지칭한다. 본원에서 바이러스 벡터에 대한 언급은 그것이 단백질 코트 내로 패키징되는 경우 바이러스와 상호교환적으로(interchangeably) 사용된다. 바이러스 벡터 입자 또는 바이러스는 시험관내 또는 생체내에서 세포 내로 DNA, RNA 또는 기타 핵산을 전달하는 목적을 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 백시니아 벡터, 렌티바이러스 벡터, 허피스 심플렉스 바이러스 벡터(예컨대 HSV), 배큘로바이러스 벡터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 원숭이 바이러스(SV40) 벡터, 신드비스(Sindbis) 벡터, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 벡터, 파지(phage) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 바이러스 벡터는, 예를 들어 미국 특허 제6,057,155호, 제5,543,328호 및 제5,756,086호에서 기술된다. 바이러스 벡터는 전형적으로 외인성 유전자를(비히클 또는 셔틀(shuttle)로서)을 세포 내로 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동적으로 연결된 조작된 바이러스를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 프로모터, 인핸서, 전사적 및 번역적 정지 부위 및 기타 신호 서열과 같은, 뉴클레오티드의 조절 및 이펙터(effector) 서열과 배열된 핵산에 대해 지칭할 때 작동가능하게(operably) 또는 작동적으로(operatively) 연결된(linked)은 그들이 그들의 의도된 목적을 위해 협력하여 기능하도록 하는, 예컨대 전사가 프로모터에서 개시되고 코딩 조각(segment)을 통해 터미네이터로 진행하도록 하는, DNA와 같은 이러한 핵산과 뉴클레오티드의 이러한 서열 간의 관계를 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 프로모터에 대한 작동적 연결은 이러한 DNA의 전사가 상기 DNA를 특이적으로 인식하고, 이에 결합하고, 전사하는 RNA 폴리머라제에 의해 프로모터로부터 개시되도록 하는 DNA와 프로모터 간의 물리적 관계를 지칭한다. 따라서, 작동적으로 연결된(opertively linked) 또는 작동적으로 관련된(operationally associated)은 DNA와 같은 핵산과 프로모터, 인핸서, 전사적 및 번역적 정지 부위, 및 기타 신호 서열과 같은 뉴클레오티드의 조절 및 이펙터 서열과의 기능적 관계를 지칭한다. 발현 및/또는 전사를 최적화하기 위해, 여분의, 잠재적으로 부적절한, 대안적 번역 개시(즉, 시작(start)) 코돈 또는 전사의 수준 또는 번역의 수준에서 발현을 방해하거나 감소시킬 수 있는 기타 서열을 제거하기 위해 클론의 5' 비번역 부분을 제거, 부가 또는 변화시키는 것이 필요할 수 있다. 또한, 공통(consensus) 리보솜 결합 부위가 시작 코돈의 바로 5' 에 삽입되고 발현을 강화시킬 수 있다(예컨대 Kozak J. Biol. Chem. 266: 19867-19870 (1991) 및 Shine and Delgarno, Nature 254(5495):34-38 (1975) 참조). 이러한 변형의 바람직함(또는 필요성)은 경험적으로 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 안티센스는 관심의 유전자의 메신저 RNA(mRNA)에 상보적이고 그것에 결합하여 불활화시킬 수 있는 핵산(DNA, RNA 또는 화학적 유사체)을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 작은 간섭 RNA(siRNA)는 유전자의 발현을 방해할 수 있는 20-25 뉴클레오티드-길이의 이중 가닥 RNA 분자의 클래스(class)를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 앱타머(aptamer)는 소분자, 단백질, 핵산, 세포 또는 조직과 같은 표적에 결합하는 올리고뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 지칭한다. 앱타머는 조작되고 시험관내 선별 방법에 의해, 예컨대 지수 증식에 의한 리간드의 계통적 진화(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)를 사용함으로써, 표적 분자에 대해 선별될 수 있다. 다양한 표적에 대한 앱타머가 당업자에게 알려져 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 리보자임(ribozyme)은 독특한 헤어핀 또는 해머헤드(hammerhead) 모양을 갖는 활성 중심 및 특이적 서열에서 다른 RNA 분자를 절단하도록 허용하는 독특한 2차 구조를 갖는 RNA 분자를 지칭한다. 리보자임은 천연 리보자임 뿐 아니라 임의의 RNA 분자를 절단하기 위해 조작되거나 설계된 리보자임을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스-유사 입자(virus-like particle, VLP)는 바이러스를 닮았지만 임의의 바이러스 유전적 물질을 포함하지 않는 비-감염성 제제를 지칭한다. 예를 들어, VLP는 바이러스 구조적 단백질(예컨대 엔빌로프(envelope) 또는 캡시드(capsid))의 발현으로부터 조립될 수 있다. VLP는 파보비리대(Parvoviridae)(예컨대 아데노-관련 바이러스), 레트로비리대(Retroviridae)(예컨대 HIV) 및 플라비비리대(Flaviviridae)(예컨대 C형 간염 바이러스)로부터 생산된 것들을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 미니서클(minicircle)은 에피솜에 있고 임의의 박테리아 플라스미드 백본(backbone)이 결여된 환형의 발현 카세트로서 생산되는 작은 환형의 플라스미드 또는 DNA 벡터를 지칭한다. 미니서클은 이종성 핵산 및 PhiC31 인테그라제(integrase)와 같은 부위-특이적 리컴비나제를 사용하는 분자간(cis-) 재조합에 의한 2개의 리컴비나제(recombinase) 표적 부위를 포함하는 부모 박테리아 플라스미드로부터 생성될 수 있다. 두 부위간의 재조합은 미니서클 및 나머지 미니플라스미드를 생성한다. 미니서클은 미니플라스미드와 별도로 회수될 수 있다. 당업자는 미니서클 및 미니서클을 만드는 방법에 대해 잘 알고있다.

용어 "네이키드(naked)" 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 RNA는, 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제형, 리포펙틴(lipofectin) 또는 침전시키는 제제를 포함하는, 세포 내로의 유입을 보조, 촉진, 또는 용이하게 하는 임의의 전달 비히클, 복합체 또는 제제를 포함하지 않는 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스 입자(Virus particle, VP)는 살아있는 것 및 죽은 것을 결합한 바이러스 입자의 총 수를 지칭한다. 바이러스 입자의 수는 정제된 바이러스 스톡으로부터 OD260 어세이를 사용하여 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 플라크 형성 유닛(plaque forming unit, pfu) 또는 감염성 단위(infectious unit, IU)는 감염성인 또는 살아있는 바이러스의 수를 지칭한다. 그것은 따라서 제제 내의 활성 바이러스의 양을 반영한다. pfu는 플라크 형성 어세이 또는 종말점 희석 어세이를 사용하여 결정될 수 있는데, 상기 어세이들은 당업자에게 알려진 표준 어세이들이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "아데노바이러스의 벡터(adenovirus vector)" 또는 "아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)"는 서로 상호교환적으로 사용되며 아데노바이러스 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로 당업자에게 잘 이해된다. 아데노바이러스 벡터는, 완전한 게놈 또는 변형된 게놈을 암호화하는 핵산 또는 세포 내로 전달될 때, 특히 입자로서 패키징될 때 이종성 핵산을 도입하는 데 사용될 수 있는 핵산을 지칭한다. 아데노바이러스 벡터는 네이키드 DNA, 아데노바이러스 캡시드 내에 캡슐화된 DNA, 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태(예컨대 허피스 심플렉스, 및 AAV) 내에 패키징된 DNA, 리포좀 내에 캡슐화된 DNA, 폴리라이신(polylysin)과 복합체를 이루거나, 합성 다가양이온성 분자와 복합체를 이루거나, 트랜스페린(transferrin)과 접합되거나, PEG와 같은 화합물과 복합체를 이루어 면역학적으로 상기 분자를 "마스킹(mask)"하고/하거나 반감기를 증가시키거나, 또는 비-바이러스 단백질에 대해 접합된 DNA를 포함하나 이에 제한되지 않는 몇몇 형태에서 임의의 것일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아데노바이러스" 또는 "아데노바이러스 입자"는, 인간 또는 동물에 감염하는 임의의 아데노바이러스를 포함하고, 모든 군, 하위군, 및 혈청형을 포함하는, 아데노바이러스로서 카테고리화될 수 있는 임의의 그리고 모든 바이러스를 포함하는 데 사용된다. 문맥에 따라 "아데노바이러스"에 관한 언급은 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 몇 개의 하위 군으로 분류된 아데노바이러스의 적어도 51개의 혈청형이 있다. 예를 들어, 하위 군 A는 아데노바이러스 혈청성 12, 18 및 31을 포함한다. 하위군 B는 아데노바이러스 혈청형 3, 7, 11a, 11p, 14, 16, 21, 34, 35 및 50을 포함한다. 하위군 C는 아데노바이러스 혈청형 1, 2, 5, 및 6을 포함한다. 하위군 D는 아데노바이러스 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 19p, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49 및 51을 포함한다. 하위군 E는 아데노바이러스 혈청형 4를 포함한다. 하위군 F는 아데노바이러스 혈청형 40 및 41을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 입자는 벡터 또는 게놈으로 패키징된다. 본원의 목적을 위하여, 바이러스는 전형적으로 이종성 핵산 분자를 그것의 게놈 내에 포함하는 재조합 아데노바이러스이고 아데노바이러스 벡터가 아데노바이러스 캡시드 내에 캡슐화되는 때 형성된다.

인간 또는 동물에 감염하는 임의의 아데노바이러스를 포함하고, 모든 군, 하위군, 및 혈청형을 포함하는, 아데노바이러스로서 카테고리화될 수 있는 임의의 그리고 모든 바이러스가 아데노바이러스 중에 포함된다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "아데노바이러스" 및 "아데노바이러스 입자"는 달리 지시되는 경우를 제외하고 바이러스 자체 및 이의 유도체를 지칭하며, 모든 혈청형 및 하위군 및 천연적으로 발생하는 형태 및 재조합 형태를 포괄한다. 인간 세포에 감염하는 아데노바이러스가 포함된다. 아데노바이러스는 야생형일 수 있거나 당업자에게 알려진 또는 본원에 개시된 다양한 방법에 의해 변형될 수 있다. 이러한 변형은 감염성 바이러스를 만들기 위하여 입자 내에 패키징된 아데노바이러스 게놈에 대한 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 변형은 당업자에게 알려진 결실(deletion), 예컨대 E1a, E1b, E2a, E2b, E3, 또는 E4 코딩 영역의 1 또는 그 이상에 있어서의 결실을 포함한다. 기타 예시적인 변형은 아데노바이러스 게놈의 코딩 영역의 전부의 결실을 포함한다. 이러한 아데노바이러스는 "것리스(gutless)" 아데노바이러스로 알려져 있다. 상기 용어는 또한 복제 조건적 아데노바이러스를 포함하는데, 이는 특정 타입의 세포 또는 조직에서 우선적으로 복제하지만 다른 타입에서는 더 적은 정도로 또는 전혀 복제하지 않는 바이러스이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 분자(targeting molecule)" 또는 "표적 리간드(targeting ligand)"는 단백질, 탄수화물, 지질 또는 기타 이러한 모이어티를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 표면 분자에 결합하는 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 이의 부분을 지칭한다. 표적 리간드는 성장 인자, 사이토카인, 접착 분자(adhesion molecule), 뉴로펩티드(neuropeptide), 단백질 호르몬 및 단일-가닥 항체(scFv)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 나노입자(nanoparticle)는 약 1 내지 1000 나노미터(nm) 사이의 크기, 예컨대 1 내지 100 nm의 현미경적 크기이고 수송 및 성질에 관하여 전 단위(whole unit)로서 행동하는 분자의 전달을 위한 콜로이드성 입자를 지칭한다. 나노입자는 분자가 기질에 걸쳐 흡수되거나, 용해되거나 분산되는 단일체의(monolithic) 나노입자(나노스피어(nanosphere)) 및 분자가 껍질(shell)과 같은 벽에 의해 둘러싸인 수성 또는 유성 코어에 갇힌 나노캡슐을 포함한다. 대안적으로, 상기 분자는 기질의 표면에 또는 기질 내에 공유적으로 부착될 수 있다. 나노입자는 예를 들어, 리포좀, 덴드리머(dendrimer), 폴리머성 미셀, 나노캡슐, 나노스피어(nanosphere) 또는 고체 지질 나노입자를 포함한다. 일반적으로, 나노입자는 천연 또는 합성 폴리머(예컨대 젤라틴, 알부민, 폴리락티드(polylactide), 폴리알킬사이아노아크릴레이트(polyalkylcyanoacrylate)) 또는 고체 지질과 같은 생체적합성이고 생분해될 수 있는 물질로 만들어진다. 나노입자는 바깥쪽에 부착된 표적 분자를 포함하는 것들을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 모이어티에 접합된 화합물(compound conjugated to a moiety)은 모이어티에 결합된 화합물로서, 화합물과 모이어티 간의 결합이 1 또는 그 이상의 공유결합 또는 수소 결합, 또는 정전기성 상호작용과 같은 비-공유적 상호작용으로부터 발생할 수 있는 것들을 포함하는 복합체를 지칭한다. 접합물(conjugate)는 또한 화합물을 모이어티에 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 예시적인 화합물은 나노입자 및 시데로포어(siderophore)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 모이어티는 검출가능한 모이어티 및 치료적 제제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 전달되는 제제, 예컨대 바이러스와 관련하여 향성(tropism)은 섬유 단백질 및/또는 펜톤(penton)과 같은 캡시드 단백질에 의해 상기 입자에 부여되는 선택적인 감염성 또는 결합을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 세포와 관련하여 "유입(entry)", "흡수(uptake)" 또는 "유입하다(enter)"는 전달되는 제제가 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 그러므로, 이러한 용어는 전달되는 제제가 세포내에 위치함을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 형질도입(transduction)은 바이러스에 의한 유전적 물질의 세포 내로의 전달을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 전달되는 핵산 분자와 관련하여 "지속된 (sustained)" 발현이라는 표현은 핵산의 기관 내로의 도입 후 피크 발현의 적어도 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 관찰되는 동안의 기간을 지칭한다. 전형적으로, 암호화된 단백질이 6 월, 7 월, 8 월, 9 월, 10 월, 11 월, 12 월, 16 월, 24 월 또는 그 이상의 길이의 기간에 걸쳐 발현되는 경우 발현은 지속된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 프로모터(promoter)는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 가능하게 하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 의미한다. 프로모터 서열은 통상적으로 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견되나 항상 그런 것은 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 재조합 DNA 방법 사용에 의한 재조합 수단에 의한 생산(production by recombinant means by using recombinant DNA methods)은 클로닝된 DNA에 의해 암호화되는 단백질을 발현하기 위해 잘 알려진 분자 생물학의 방법의 사용을 의미한다.

전반적으로 사용되는 바와 같이, 대상체(subject)는 척추동물, 보다 구체적으로 포유류(예컨대 인간, 말, 고양이, 개, 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 토끼, 랫트, 및 기니피그), 새, 파충류, 양서류, 어류, 및 임의의 기타 동물일 수 있다. 상기 용어는 특정한 나이 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 웅성이든 자성이든, 성체 및 신생 대상체가 포괄되도록 의도된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 환자(patient) 또는 대상체는 상호교환적으로 사용될 수 있으며 치료적 제제가 필요한 대상체를 지칭할 수 있다. 용어 환자 또는 대상체는 인간 또는 수의학적 대상체를 포함한다. 치료적, 산업적, 수의학적 및 농업적(예컨대 육류 생산) 사용이 본원에 개시된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 환자는 인간 대상체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 조성물(composition)은 임의의 혼합물(mixture)을 지칭한다. 조성물은 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 조합물(combination)은 2 또는 그 이상의 물품(item) 간의 임의의 연합을 지칭한다. 조합물은 2 또는 그 이상의 별개의 물품, 예컨대, 2개의 조성물 또는 2개의 집합물(collection)일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2 또는 그 이상의 물품의 단일 혼합물일 수 있으며, 또는 이들의 임의의 변형일 수 있다. 일반적으로 조합의 요소들은 기능적으로 관련되거나 또는 관계되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 키트(kit)는 다른 요소, 예컨대 부가적인 시약 및 조합물 또는 이의 요소의 사용을 위한 지침(instruction)을 선택적으로 포함하는 포장된 조합물이다. 키트는 선택적으로 사용을 위한 지침을 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "질환 또는 장애"는 감염, 후천적 상태, 유전적 상태를 포함하나 이에 제한되지 않는 원인 또는 상태로부터 야기되고, 확인가능한 증상을 특징으로 하는 유기체 내 병리학적 상태를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "핵산에 의해 치료가능한 질환 또는 장애"는 병인론 또는 질환 또는 상태에 관련된 또는 관계된 유전자의 발현을 변화(증가 또는 감소)시키거나, 질환 또는 상태를 완화하는 유전자 산물을 발현하거나, 질환 또는 상태에서 결함이 있거나 결여된 유전자 산물을 교체함으로써, 외인성으로 전달되는 핵산에 의한 치료에 순응하는 임의의 장애 또는 질환을 지칭한다. 따라서, 핵산에 의해 치료가능한 질환 또는 장애는, 예를 들어 결함이 있는 또는 결여된 유전자 산물을 대체하거나 치료적 제제 또는 산물을 외인성으로 투여함으로써 유전적 결핍을 치료하는 것을 포함하는, 공지의 유전자 치료 방법 및 적용을 포괄하는 것으로 의도된다. 당업자는 이러한 질환 및 장애에 대해 잘 알고 있다. 핵산에 의해 치료가능한 예시적인 질환 및 장애가 본원에 기술된다.

본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태를 가진 대상체를 "치료하는 것(treating)"은 대상체의 증상이 치료 후 부분적으로 또는 전체적으로 완화되거나, 또는 정적인 상태로 남는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 치료(therapy) 및/또는 치유를 포괄한다. 예방(prophylaxis)은 잠재적 질환의 방지 및/또는 증상의 악화 또는 질환의 진행의 방지를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 치료(treatment)는 상태, 장애 또는 질환 또는 다른 적응증의 증상이 완화되거나 또는 그렇지 않다면 유리하게 변화되는 임의의 방식을 의미한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 치료적 효과(therapeutic effect)는 질환 또는 상태의 증상을 변화, 전형적으로는 개선하거나 완화하는, 또는 질환 또는 상태를 치유하는 대상체의 치료로부터 야기되는 효과를 의미한다. 치료적으로 유효한 양은 대상체에 투여 후 치료적 효과를 야기하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 치료, 예컨대 약학적 조성물 또는 기타 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 장애의 증상의 완화는, 영구적이든 일시적이든, 지속적이든 한시적이든, 상기 조성물 또는 치료제의 투여에 의한 결과이거나 관련된 것일 수 있는 증상의 임의의 경감을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 방지(prevention) 또는 예방(prophylaxis)은 질환 또는 상태의 발달의 위험이 감소되는 방법을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 유효량은 질환 또는 장애의 증상을 방지, 치유, 완화, 억제 또는 부분적으로 억제하기 위해 필요한 치료제의 양이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단위 용량 형태(unit dose form)는 인간 및동물 대상체에 적합하고 당업계에 알려진 바와 같이 개별적으로 포장된 물리적으로 별개의 단위를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 직접적 투여(direct administration)는 추가적인 희석 없는 투여를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단일 투여랑 제형(single dosage formulation)은 직접적 투여를 위한 제형을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 다중 투여량 제형(multiple dosage formulation)은 반복 투여에 있어서 사용하기 위한 제형을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, "제조품(article of manufacture)"은 만들어지고 판매되는 제품을 의미한다.

본 출원에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장의 제품 내에 포함된 아데노바이러스 입자와 같은 전달되는 제제를 포괄하는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태인 "하나의(a)" "한(an)" 및 "상기(the)"는 문맥상 명백하게 달리 기술되지 않는다면 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "세포외 도메인"을 포함하는 화합물에 대한 언급은 하나 또는 복수의 세포외 도메인을 가지는 화합물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "또는(or)"은 대안만을 지칭하는 것으로 명백히 기술되지 않는 한 "및/또는"을 의미하거나 대안들이 상호 배타적임을 의미하기 위해 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 범위(range) 및 양(amount)은 특정 값 또는 범위의 "약(about)"으로 표현될 수 있다. 약(about)은 또한 정확한 양을 포함한다. 그러므로 "약 5개 염기"는 "약 5개 염기" 및 "5개 염기"를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "선택적인(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 그 다음에 기재되는 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않고, 그 기재가 상기 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 것을 의미하며, 상기 기재는 상기 사건 또는 상황이 발생하는 경우의 예 및 발생하지 않는 경우의 예를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 선택적으로 치환된 기(group)는 상기 기가 비치환되거나 또는 치환된 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 보호적 기(protective group), 아미노산 및 기타 화합물에 대한 약어는, 달리 지시되지 않는 한, 그들의 통상적인 사용법, 인식된 약어, 또는 생화학적 명명법에 대한 IUPAC-IUB 위원회((1972) Biochem. 11:1726)와 일치한다.

제한의 방법으로서가 아니라 개시의 명확성을 위해, 상세한 설명은 하기와 같은 하위섹션으로 나누어진다.

B. 핵산의 전달 및 유전자 치료

본원에서 전달되는 제제(핵산 분자이거나 핵산 분자를 포함하는)를 일반 순환으로부터 기관의 혈관적 격리에 의해 일반적 맥관계로부터 구획화된 기관 또는 기관의 부분으로 대상체에 전달하는 방법이 제공된다. 특히, 본원에서 기관 또는 이의 부분이 일시적으로 구획화된 때(즉 혈관적으로 박탈되거나 격리된) 전달되는 제제(핵산 분자이거나 핵산 분자를 포함하는)의 기관 또는 이의 부분으로의 투여시, 외인성 전달되는 핵산 분자의 발현이 지속되거나 안정적일 수 있다는 발견에 기초한 방법이 제공된다. 또한, 핵산 전달의 구획화된 방법은 종전에 달성된 바 없는 선형 역학적 용량-반응을 달성한다. 전달되는 핵산 분자는 대상체에 대한 치료적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 치료적 핵산일 수 있다. 따라서, 상기 방법은 선택된 폴리펩티드의 생체내에서의 세포 발현을 위해 사용될 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩티드 제제는 폴리펩티드가 대상체에서 장애 또는 상태를 치료하거나 완화하거나 그렇지 않으면 대상체의 삶의 질을 개선하는 치료적 환경에서 유용할 수 있다. 다른 예에서, 폴리펩티드 제제는 육류 생산의 질 또는 양을 개선하는 적용과 같은 농업적 환경에서 유용할 수 있다.

본원에서 기술되는 방법은 전신적으로 바이러스 벡터를 주입할 필요를 제거함으로써(그럼으로써 바이러스혈증 및 면역학적 반응을 감소시킴으로써), 바이러스 벡터의 현저히 감소된 양을 허용하고(그럼으로써 투여 부위에서 괴사를 감소시키고), 전달되는 제제의 양에 대한 조절을 허용하고, 유전자 발현의 양적 조절을 가능하게 하고, 선택된 제제의 지속된 발현을 제공하는, 전통적인 유전자 치료 방법에 대한 몇 가지 장점을 제공한다.

1. 기존의 유전자 치료 방법

생명공학에 있어서 기본적인 도전은 생체내에서 세포로 유전적 정보를 전달하기 위한 접근을 개발하는 것이다. 질환을 치료하는 목적을 위한 또는 생물의학적 조사를 위한 유전적 물질의 체세포로의 목적이 있는 전달은 유전자 치료로 명명된 바 있다. 유전자 치료는 체세포성(somatic) 및 유전성(hereditary) 유전적 질환(genetic disease)을 포함하는 질환의 치료에 있어서 상당한 진전을 약속한다. 성공적이기 위하여, 핵산 분자는 효율적이고 안전한 방식으로 치료적으로 유의성있는 백분율의 영향을 받은 세포로 전달되어야 한다. 전달되는 핵산 분자는 결여되거나 부분적으로 또는 비-기능적인 내인성 유전자를 보상하여, 유익한 기능을 제공하거나 주된 부정적인 내인성 유전자 또는 감염성 유기체의 유전자의 활성을 차단한다.

기존의 유전자 치료 방법은 핵산 분자를 정맥내로 조직 또는 기관으로 전달한다. 비-바이러스 또는 바이러스 벡터를 사용한, 핵산의 정맥내 전달은 그것의 폭넓은 적용을 방해하는 몇 개의 문제에 의해 복잡해진다. 예를 들어, 핵산 벡터의 전신적 전달은 심각한 독성 부작용을 야기하는 면역 반응의 개시, 이식유전자 산물의 중화(예컨대 발현된 단백질에 대한 항체의 생성으로 인해), 핵산 또는 벡터의 감소된 세포 흡수, 반복적인 주입을 요구하는 유전자 발현의 소실 및/또는 일시적인 발현, 대상체의 순환 내로 주사되어야 하는 핵산의 대규모 용량의 필요성, 조직 손상, 치료 동안 표적 기관 내의 상승된 압력, 바이러스혈증, 및/또는 신체 내의 특정한 세포 유형을 표적으로 하는 것의 어려움을 야기할 수 있다. 이러한 문제는 핵산이 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터 내에 전달될 때 더욱 심각해질 수 있다. 또한, 기존의 유전자 치료 방법에서 벡터 용량과 단백질 산출량 간의 상관관계가 부족했다.

예를 들어, 핵산 분자, 예컨대 바이러스를 포함하는 전달되는 제제의 전신적 투여는 면역 세포의 형질도입 및 원치않는 면역 반응의 활성화를 야기할 수 있다. 탐식세포(예컨대 대식세포, 호중구) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함하는, 외래 감염에 대한 1차 방어선과 관련된 선천성 면역 세포는 외래 물질(예컨대 바이러스-기반 벡터)에 대한 노출에 의해 활성화될 수 있다. 선천성 면역 반응의 활성화는 감염된 세포를 살해하고 전-염증성 사이토카인 및 케모카인(예컨대 인터페론, IL-1, IL-6, TNF-α, MIP-2, MIP-1α)을 분비함으로써 감염을 제한하도록 작용한다. 사이토카인 및 세포 반응은 조직 손상, 감염된 세포의 아폽토시스, 수지상세포와 같은 기타 이펙터 세포의 소집 및 적응성 면역 반응의 개시를 야기한다. 혈액 및 조직에 존재하는 미성숙 수지상세포와 같은 항원-제시 세포(APC)는 외래 항원 물질을 인식하고 섭취함으로써 NF-κB를 활성화하는 신호 전달 경로(signal transduction pathway), 염증성 사이토카인 및 케모카인의 분비, 및 MHC 분자 및 공동자극적 분자와 같은 T-세포 활성화 분자의 상향조절을 자극한다.

결과는 세포성 및 체액성 면역 반응의 활성화이다. 체액성 면역은 항원에 직접적으로 결합하고 불활화할 수 있거나(중화 항체) 면역계의 기타 세포를 활성화하여 항원을 파괴할 수 있는 항체의 생성을 야기할 수 있다. 세포성 면역은 감염된 세포의 표면상의 외래 펩티드를 인식하고 일단 인식되면 외래 항원을 생산하는 임의의 세포를 제거하는 세포독성 T 세포에 의해 매개된다. 따라서, 면역 활성화의 결과는 형질도입된 세포를 제거하는 세포독성 T 세포와 같은 이펙터 세포의 활성화 뿐 아니라, 핵산(예컨대 바이러스 벡터)의 재투여를 방지하는 중화 항체를 생산하는 항체를 분비하는 형질세포의 생성이다. 면역반응의 정점 및 이러한 반응의 정도는 전신적 및 국소적 독성을 유발할 수 있다.

독성은 또한 몇몇 조직 또는 기관이 핵산으로 형질도입됨으로써, 전달이 널리 퍼졌을 때 악화될 수 있다. 이러한 조직 또는 기관이 국소화된 독성을 제한하기 위해 절제될 수 있는 반면, 몇 개의 기관이 복수 개의 형질도입 부위를 갖도록 관련되는 경우에는, 형질도입된 조직의 제거에 의해 임의의 독성 효과를 치료하는 것이 불가능해질 수 있다. 핵산의 전달이 표적 기관의 맥관계에 표적화된 경우라도, 원치않는 면역 반응 및 독성이 발생할 수 있다. 또한, 전체 기관이 독성 효과에 대해 대상이 될 수 있다.

전신적 투여는 세포의 충분한 형질도입 효율을 달성하고 효율적인 유전자 전달을 부여하기 위하여 더 높은 용량을 요구할 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 벡터의 투여와 같은 바이러스 전달을 위해, 간에서의 간세포 형질도입 및 발현과 같은, 조직 부위에서 측정가능하고 재현가능한 세포 형질도입 및 발현을 달성하기 위해 kg 당 10¹⁰-10¹³ 바이러스 입자(virus particle, vp)가, 일반적으로 10¹² 내지 10¹³ vp/kg 가 투여된다. 더 높은 용량에 대한 요구는 간 간세포와 같은 조직 세포에 도달하기 전에 면역 반응에 의해 혈액으로부터 벡터가 제거되기 때문이다. 더 높은 투여량에서, 혈관 및 조직(예컨대 쿠퍼 세포(Kupffer cell))의 탐식세포는 포화되고 더 높은 간세포 형질도입을 허용한다. 또한 핵산의 전신적 전달은 신체 전체에 걸친 전달 및 분포를 야기할 수 있는데, 이는 야기되는 치료제가 표적 위치에서만 요구되는 경우 이상적이지 않다. 이러한 사례에서, 치료적 효율을 달성하기 위해 투여량을 증가시키는 것이 종종 필요하다. 투여량을 증가시키는 것은, 그러나, 원치않는 독성 또는 기타 부작용을 도출할 가능성을 증가시킨다.

다른 사람들이 이러한 문제의 일부를 회피하기 위해 기관 또는 이의 부분에 전달을 국소화시키기 위한 노력을 시도해온 반면, 이러한 문제를 전부 처리하는 데 있어서는 아무도 성공적이지 않았다. 예를 들어, 격리된 정맥내 또는 간정맥 또는 동맥의 폐쇄 후 간동맥 관류에 의해 간으로 바이러스 벡터(예컨대 렌티바이러스 또는 아데노바이러스)의 표적화된 전달의 방법은 간 효소, 사이토카인, 일부 림프구 침윤의 상승 및/또는 비-표적 기관 또는 기관의 부분의 오염을 야기한다(예컨대 미국 특허출원번호 US2008/0025952호, US2010/0010068호 및 US2006/0188482호; Kinoshita 외. (2010) J Surg. Res., 160:47-51 참조). 실질 세포로의 전달을 달성하기 위해 실질 세포를 둘러싼 세포막 내에 "천공(pore)"을 생성하는, 핵산의 정맥내 전달에 의한 간으로의 수력학적 유전자 전달의 방법은, 또한 다른 기관의 오염으로 이어질 수 있다. 이러한 방법은 모든 종에서 효과적이지 않으며 바이러스 벡터에 대해 적용가능한 것으로 아직까지 보여진 바 없다(Fabre 외. (2008) Gene Ther., 15:452-62). 또한, 수력학적 유전자 전달 방법은 효과적이기 위해서는 유출 폐쇄(outflow obstruction)를 요구하는 것으로 보여진 바 있는데, 이러한 공격적 기법은 임상에서 실현가능하지 않다(Sawyer 외. (2010) Gen Ther., 17:560-4). 주로 핵산의 직접적 실질 투여 및 간내 주사에 의존하는 다른 방법들은 또한 상승된 간 효소, 상승된 사이토카인, 및/또는 기타 기관 또는 이의 부분의 오염을 야기할 수 있다(예컨대 Crettaz 외. (2006) Hepatology, 44:623-32; Fumoto 외. (2009) Biol. Pharm. Bull., 32:1298-302 참조).

2. 구획화된 조직 또는 기관으로의 직접적 전달

본원에서 맥관계, 림프 및/또는 도관으로부터의 격리에 의해 구획화된 기관 또는 이의 부분에서 세포로 전달되는 제제의 직접적 투여에 의해 핵산 분자의 구획화된 전달의 방법이 제공된다. 본원의 방법에서, 상기 방법은 1) 전신적 순환과의 소통을 방지 또는 실질적으로 방지함으로써 기관 또는 이의 부분으로 및 기관 또는 이의 부분으로부터의 혈액 흐름을 차단하고; 2) 전달되는 제제를 조직 또는 이의 부분의 조직 실질 세포로 직접적으로 투여하고; 및 3) 선택된 제제의 세포 흡수를 허용하기에 충분한 기간 동안 혈관적 격리를 유지하는 것을 포함한다. 이러한 측면의 효과는 전달되는 제제, 예컨대 바이러스 벡터가 일반 순환에 노출되지 않아서 전신적 면역 반응이 개시되지 않고, 전신적 독성이 회피되고 다른 비-표적화된 기관 또는 조직의 오염이 없음을 의미한다. 또한, 전달되는 제제를 구획화된 조직 또는 기관의 실질 세포에 직접적으로 투여함으로써, 세포 흡수가 최대화된다. 상기 제제의 세포 흡수의 최대화는 조직 또는 기관 구획화의 방출에 있어서, 사실상 전달되는 핵산 분자의 전부가 세포 내에서 이식유전자 발현에 이용가능하며, 전신적 순환 내에서 탈출할 수 있는 전달되는 제제의 양이 감소되거나 제거됨을 의미한다. 따라서, 본원에서 제공되는 방법은 표적 기관 내에서 오직 희망되는 세포의 표적화 및 지속된 길이의 시간 동안 이식유전자 산물의 발현을 허용한다.

상기 방법은 관심의 표적 기관에 대해 적절한 것으로 선택된 시간 동안 구획화된 조직 또는 기관으로의 핵산 전달이 전달되는 핵산의 지속된 발현을 제공한다는 본원의 발견에 기초하는데, 상기 지속된 발현은 당업계에 사용가능한 방법을 사용한 발현보다 훨씬 더 길며; 핵산 분자의 뚜렷한 흡수 및 발현을 유발하기 위해 투여되어야만 하는 전달되는 제제의 양을 감소시키고; 바이러스 벡터 또는 유전적으로 변형된 세포와 같은 전달되는 제제의 전신적 투여와 관련된 부작용을 회피하고; 대상체에 투여되는 전달되는 제제의 양을 조정함으로써 폴리펩티드 발현의 양을 조정할 기회를 최초로 제공한다. 이들은 유전자 치료의 분야에 있어서 새로운 기회를 제공하는 유의성 있는 개선이다.

폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 전달하는 본원의 방법은 폴리펩티드를 직접적으로 투여하는 방법에 대하여 장점을 제공한다. 예를 들어, 야기되는 암호화된 폴리펩티드의 발현이 지속되기 때문에, 대상체로의 핵산 분자의 전달이 치료의 과정에 걸쳐 반복된 주입 또는 주사를 필수적으로 요구하지 않는다. 또한, 본원에 방법에서 대상체 자신의 형질도입된 세포(예컨대 간세포)에 의해 폴리펩티드가 발현되기 때문에, 암호화된 폴리펩티드는 적절하게 후번역적으로 변형된다.

또한, 간과 같은 기관의 개별적인 엽 또는 구역으로의 유전자 전달은 장점을 갖고 있다. 예를 들어, 지역적 전달은 유전자 전달의 임의의 예기치 않은 유해한 효과가 중요치 않거나 표적화된 엽의 제거에 의해 용이하게 치료될 수 있음을 의미한다. 상기 방법에서, 구획화된 전달은 비-표적화된 조직 또는 기관이 내부 대조군으로서 작용하도록 허용한다. 상기 방법은 또는 표적화된 엽의 제거를 제공함으로써 효과에 책임이 있는 표적화된 엽으로의 유전자 전달의 공식적 증거를 제공한다.

상기 방법의 이러한 특징은 이종성 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 전달 제제의 직접적 간 투여로 본원에서 예시된다. 본원의 결과는 투여되는 아데노바이러스의 사실상 전부의 세포 흡수를 허용하기에 충분한 시간 동안 실질 클램핑에 의해 혈관 격리 또는 구획화된 간엽의 간질 실질 세포로의 아데노바이러스의 직접적 투여가 기존의 방법에 대하여 수많은 장점을 나타낸다는 것을 보여준다. 특히, 간 형질도입의 더 높은 효율이 전신적 주사와 비교하여 관찰되었다. 이러한 접근을 사용하여 지속되고 강한 유전자 발현이 면역-억제 없이 달성되고, 높은 수준의 단백질 합성이 관찰되며, 10¹⁰입자, 10⁹입자, 10⁸ 입자,10⁷ 입자, 10⁶ 입자,10⁵ 입자, 10⁴ 입자, 10³ 입자 또는 그 미만과 같이 10¹¹입자 미만의 낮은 용량의 투여되는 바이러스가 표적 엽 또는 영역에서 높은 수준의 이식유전자 발현을 부여하는 데 충분하고 효과적이었다. 특히, 본원의 결과는 단백질 산출량을 절충하지 않고 더 적은 바이러스가 요구됨을 보여준다. 상기 결과는 벡터 용량 및 단백질 산출량 간의 상관관계가 있음을 또한 보여준다. 예를 들어, 구획화로 투여하는 본원의 방법을 사용하여, 더 낮은 양의 바이러스 벡터(예컨대 낮게는 10³입자, 10² 입자 또는 그 미만인 10¹⁰입자 미만)가 투여된 바이러스 벡터의 양과 발현의 양 간의 양성 상관관계로 폴리펩티드 발현을 야기하였다. 또한, 상기 방법의 실시에 의해 바이러스혈증, 염증성 간 반응, 간 사이토카인 발현, 일반적 간손상 및 투여 부위에서의 괴사 및 전신적 독성과 같은 부작용이 관찰되지 않았다. 비-독성 및 장기간 이식유전자 발현을 고려할 때, 이 접근은 인간을 포함하는 포유류 대상체에서 간질환 또는 기타 질환을 치료하기 위해 간에서 이식유전자의 발현을 표적화함으로써 유전자 치료 적용을 위해 사용될 수 있다.

다음 섹션은 본원에서 제공되는 바와 같은 핵산 전달의 구획화된 방법의 단계들, 및 상기 방법을 수행하는 데 사용하기 위한 예시적인 전달 제제 및 조성물을 보다 구체적으로 기술한다. 상기 방법에서 수행될 수 있는 부가적인 단계 또는 대안적인 단계의 기술이 상기 개시되는 방법의 단계의 임의의 특정한 방법 단계 또는 방법 단계의 조합으로 수행되며, 이러한 조합 또는 부분집합이 특히 고려된다는 것이 이해된다. 또한 하기에서 치료적 또는 산업적, 수의학적 또는 농업적 적용을 위해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 발현하는 데 있어 사용하기 위한 구획화된 전달 방법의 방법 및 적용이 기술된다. 표적화된 기관 및 전달되는 제제를 포함하여, 상기 방법에서 사용되는 다양한 단계 및 시약은, 전달되는 제제, 특정한 적용 또는 치료적 적응증 및 특정한 대상체 및 기타 유사한 고려사항에 따라 임의의 순응하는 기관 또는 이의 부분에서 사용을 위해 본원의 기술에 기초하여 당업자에 의해 적응될 수 있다.

C. 핵산 전달의 구획화된 방법

본원에서 (1) 조직, 기관 또는 이의 부분을 맥관계, 림프 및/또는 도관계로부터의 격리 또는 거의 완전한 격리에 의해 구획화하는 단계; (2) 선택된 전달되는 제제를 구획화된 기관 또는 이의 부분으로 직접적으로 투여하는 단계; (3) 격리를 제거, 예컨대 기관 또는 이의 부분으로의 혈관 순환을 복구하기 전에, 전달되는 제제의 투여 다음에 기간 동안 구획화를 유지하는 단계를 포함하는, 선택된 전달되는 제제를 대상체로 투여함으로써 핵산 분자를 전달하는 방법이 제공된다. 상기 방법에서, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화는 전달되는 제제의 10% 미만이 전신적 순환에 노출되고/되거나 기관 또는 이의 부분의 세포에 의해 선택된 전달되는 제제의 80% 이상의 세포 흡수를 허용하기에 충분한 핵산 제제의 투여 다음의 기간 동안 유지된다. 본원에서 제공되는 방법은 조직 또는 기관 또는 이의 부분에서 이식유전자 산물의 지속된 발현을 60일 이상, 90일 이상, 6개월 이상, 9개월 이상, 또는 1년 이상 허용한다.

본원의 방법의 실시에 있어서, 선택적으로, 면역억제제가 면역 반응의 가능성을 최소화 또는 감소시키기 위하여 바이러스 벡터와 같은 전달되는 제제로의 투여 전 및 후에 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포독성 림프구를 억제하는 제제가 투여될 수 있다. 예시적인 면역억제 제제는 사이클로스포린(cyclosporine)(neoral®, Sandimmune®), 프레드니손(prednisone)(Novo Prednisone®, Apo Prednisone®), 아자티오프린(azathioprine)(Imuran®), 타크로리무스(tacrolimus) 또는 FK506 (Prograf®), 마이코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)(CellCept®), 시로리무스(sirolimus)(Rapamune®), OKT3(Muromorab CO3®, Orthoclone®), ATGAM 또는 사이모글로불린(Thymoglobulin)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 면역억제제가 요구되는지 여부를 결정하는 것은 치료하는 의사의 수준 범위 내이다. 효율적인 면역억제 요법이 당업계에서 일상적으로 실시되며, 상기 특정 요법은 예를 들어, 특정한 표적 기관, 특정한 전달되는 제제, 특정한 유전자 치료, 및 치료되는 대상체를 포함하는 인자들에 의존할 것이다.

본원에서 제공되는 핵산을 전달하는 방법은 임의의 포유류 대상체에 수행될 수 있다. 이러한 대상체의 예시는 마우스, 랫트, 소, 돼지, 양, 염소, 말 및 인간을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히, 본원에서 제공되는 방법은 인간 대상체에서 수행될 수 있다. 특히, 상기 방법은 18세 이하의 아동인 인간 대상체, 예컨대 유아(infant), 걸음마기의 아이(toddler) 및 어린 아동(younger childeren)에서 수행될 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 자궁내에서 태아에 대하여 수행될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법이 이식유전자 산물의 지속된 장기간 높은 수준의 발현을 허용하기 때문에, 상기 방법은 결함이 있는 유전자 산물을 교체하기 위한 적용 또는 치료적 제제를 외인성으로 투여하기 위한 적용을 포함하는 의학적 적용; 이식을 위한 기관의 생산; 형질전환 동물(예컨대 바이오리액터(bioreactor))에서 치료적 단백질의 생산; 및 농업적 또는 수의학적 적용 뿐 아니라 산업적 적용을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 적용에서 사용될 수 있다.

본원에서 제공되는 대상체로의 핵산 전달의 구획화된 방법은 1회 수행될 수 있고, 또는 복수 회 수행될 수도 있다. 예를 들어, 본원에서 제공되는 방법은 단백질 생산 프로토콜의 과정에 걸쳐 또는 치료 요법의 과정에 걸쳐 복수 회 수행될 수 있다. 일부 예에서, 본원의 다른 곳에서 기술되는 바와 같이, 상기 방법은 특히 조직 또는 기관 전체에 걸쳐서 형질도입 또는 발현이 높은 수준으로 추구되는 경우 복수의 표적 위치에서 전달을 달성하기 위해 반복된다. 이러한 예에서, 상기 방법은 일반적으로 상기 방법의 첫번째 적용의 분, 시간 또는 일 내에 반복된다. 병리학이 요구한다면 단계적 확대 계획이 부가될 수 있다. 상기 방법이 동일한 표적 위치에 대해 반복되는 경우의 예에서, 조직 또는 기관이 종전의 혈관 격리로부터 회복되기 위하여 충분한 기간이 제공된다. 다른 예에서, 반복될 때, 상기 방법은 종전에 혈관 격리에 대한 대상이 된 바 없는 표적 조직 또는 기관 또는 영역에 적용된다.

상기 방법의 단계의 기술, 및 이의 다양한 예시적인 비-제한적인 구현예가 다음 하위섹션에서 제공된다.

1. 조직 또는 기관의 구획화

본원에서 제공되는 방법의 제1단계로서, 조직, 기관 또는 이의 부분이 맥관계로부터 그것을 격리함으로써 구획화된다. 일부 예에서, 구획화는 또한 도관계 및/또는 림프계로부터 격리에 의해 부가적으로 달성될 수도 있다. 구획화의 개시는 선택된 제제의 투여에 선행하며 상기 선택된 제제의 세포 흡수를 허용하기에 충분한 기간 후까지 기관 또는 이의 부분으로의 혈관적 순환을 복구하기 위해 방출되거나 종결되지 않는다.

임의의 조직 또는 기관 또는 이의 부분이 핵산의 전달을 위한 본원의 구획화된 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 조직 또는 기관은 간, 폐, CNS(뇌 또는 척수), 말초 신경계(예컨대 신경), 췌장, 쓸개, 내분비선(뇌하수체, 부신, 갑상선 등), 심혈관계 기관(예컨대 심장 및 혈관), 피부, 비뇨생식계 기관(신장, 자궁, 자궁목, 전립선, 요도), 호흡계의 기관(예컨대 폐 또는 기도), 뼈, 근육, 및 장을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 당업자가 부가적인 표적 기관 및 이의 엽을 인식할 것이므로, 이 목록은 피로를 유발하기 위한 것이 아니다. 특정 예에서, 본원의 구획화된 방법에서 사용하기 위한 조직 또는 기관 또는 이의 부분은 간 또는 이의 부분이다.

일반적으로, 구획화되는 조직 또는 기관 또는 이의 부분은 충분한 기간 동안 전달되는 제제의 혈관적 격리에 순응하여 전달되는 제제의 10% 미만, 일반적으로 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만이 전신적 순환에 노출되도록 하는 것이다. 일반적으로, 이 미리 결정된 기간은 전달되는 제제의 사실상 전부가 조직 세포에 의해 흡수되는, 예를 들어 전달되는 제제의 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 조직 세포에 의해 흡수되는 기간이다. 조직 세포 흡수를 허용하고 상기 제제의 전신적 순환으로의 방출 또는 노출을 방지하기 위한 미리 결정된 기간은 특정한 기관 또는 이의 부분, 특정한 전달되는 제제 및 조직 세포로의 직접적 전달의 자세한 사항(예컨대 전기천공의 사용)의 함수이다. 전달되는 제제의 10% 미만이 전신적 순환으로 노출되는 요구되는 기간을 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다. 예를 들어 본원에서 제공되는 섹션 F는 전달되는 제제의 전달을 평가하기 위한 예시적 어세이 및 방법을 기술한다. 본원의 특정 예에서, 기관 또는 이의 부분의 구획화는 적어도 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분, 35 분, 40 분, 45 분, 50 분, 55 분 또는 60 분 또는 그 이상 동안 유지된다. 일반적으로, 구획화는 적어도 20분 이상 60분 이하 동안이다. 예를 들어, 기관 또는 이의 부분, 예컨대 간 또는 이의 부분의 구획화는 적어도 30분이고 일반적으로 60분 이하이다. 따라서, 특정한 전달되는 제제에 따라, 구획화는 짧은 기간 동안 기관 조직 또는 이의 부분에 대한 허혈증을 야기할 수 있다. 그러므로, 본원의 방법에서 사용되는 기관 또는 이의 부분은 짧은 허혈증의 기간에 순응하는 것이다.

구획화의 개시는 선택된 제제의 투여에 선행한다. 본원의 방법에서, 구획화는 전달되는 제제의 조직으로의 전달 직전에 개시된다. 예를 들어, 구획화는 전달되는 제제의 전달 5분 이하 전에, 전형적으로 전달되는 제제의 전달 4분, 3분, 2분, 1분 또는 30초 전에 개시된다. 특정 예에서, 혈관적 격리를 달성하는 데 사용되는 장치는 혈관적 격리 후 전달되는 제제의 전달을 보다 빠르게 또는 보다 효율적으로 허용하도록 전달 장치에 적응되거나 변형되거나 또는 호환가능하게 만들어질 수 있다.

대상체의 기관 또는 이의 부분으로 선택된 전달되는 제제를 투여하는 본원에서 제공되는 방법에서, 상기 방법은 기관 또는 이의 부분을 통하는 혈액 흐름을 감소, 차단, 또는 격리하거나 그렇지 않으면 순환과 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 접근 또는 소통을 방해하는 단계를 포함한다. 이는 맥관계, 도관계 및/또는 림프계로부터 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 격리에 의해 달성될 수 있다. 격리는 미리 결정된 시간 동안일 수 있다. 전형적으로, 구획화는 미리 결정된 시간 동안 총 혈관적 배제를 달성하는 방법에 의해 달성된다. 상기 조직 또는 기관 또는 이의 부분은 임의의 수의 방법에 의해 구획화될 수 있다. 일 예에서, 격리는 1 또는 그 이상의 동맥 또는 정맥 클램프, 폐쇄 카테터를 사용하여, 또는 개별적인 정맥 또는 동맥을 밀봉하기 위한 혈관적 스테이플링 장치에 의해 달성될 수 있다. 전형적으로, 혈액 흐름을 차단하기 위해, 기관 또는 이의 부분에 공급하는 동맥 및 정맥 또는 도관이 클램핑된다. 다른 예에서, 혈관적 격리는 조직으로의 혈액 공급 및 흐름을 중단하기 위한 1 또는 그 이상의 실질 또는 페디클 클램프를 사용하여 달성될 수 있다. 단일한 혈액 공급(예컨대 기관 또는 이의 부분에 공급하는 동맥 또는 정맥이 클램핑될 수 있는 페디클 내)을 갖는 상당히 격리된 기관 또는 이의 부분에 대해서는 단일한 클램프 또는 폐쇄 카테터면 충분하다. 복잡한 맥관계 또는 이차적인 순환을 갖는 다른 기관 또는 이의 부분에 있어서, 복수 개의 클램프 또는 폐쇄 카테터가 필요할 수 있다. 맥관계로부터 조직 또는 이의 부분을 격리하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 조직 절제(resection) 및 절단(transection) 과정과 같은 다양한 의학적 과정에서 사용된다.

조직 또는 기관의 구획화를 달성하기 위한 방법은 기관 또는 이의 부분을 통한 혈액 흐름을 차단하기 위한 선택적 또는 비-선택적 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 간과 같은 기관의 엽, 섹션 또는 구역의 선택적 클램핑이 수행될 수 있다. 선택적 클램핑의 이익은, 만약 임의의 허혈성 손상이 있는 경우, 허혈성 손상이 구획화된 선택된 영역에 제한될 수 있다는 것이다(Chouillard 외. (2010) Annals of Surgical Innovation and Research, 4:2).

특정 예에서, 구획화는 실질 압박에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 수동 압박이, 예컨대 손가락 골절 기법(finger fracture technique)을 사용함으로써, 수행될 수 있다. 부가적인 예에서, 압박대, 케이블 또는 밴딩 장치가 기관의 영역 또는 부분에 적용될 수 있다. 다른 예에서, 실질 클램프가 혈관, 동맥, 도관 또는 림프관을 압박하고 조직 또는 기관의 영역, 엽, 섹션 또는 구역으로의 혈액 흐름을 차단하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 클램프는 페디클 클램프 및 기관의 영역 또는 구역을 선택적으로 클램핑할 수 있는 기타 클램프를 포함한다. 혈관적 격리 및 배제 방법에 사용하기 위한 클램프는 당업자에게 잘 알려져 있고 이용가능하다. 이는 Aesculap (Center Valley, PA), Klein Surgical Systems (San Antonio, TX) 또는 Karl Storz (독일)과 같은 제조자로부터의 상업적으로 사용가능한 클램프를 포함한다. 예시적인 클램프는 켈리 클램프(Kelly clamp), 미세-지혈겸자 클램프(micro-serrefine clamp), 불독 클램프(Bulldog clamps), 데바키-사틴스키 클램프(Debakey-Satinsky clamp), 롱마이어 클램프(Longmire clamp), 린 오어 추 간 클램프(Lin or Chu liver clamp), 또는 이노구치 클램프(Inokuchi liver clamp)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 팽창가능한 벌룬 클램프가 또한 이용될 수 있다. 클램프의 선택 및 크기는 특정한 대상체, 대상체의 크기, 사용되는 외과적 방법, 및 본원의 방법에 의해 구획화될 특정한 기관 또는 이의 부분에 의존적이다. 특정한 적용과 호환가능한 클램프를 경험적으로 확인하고 선택하는 것은 당업자의 수준 내이다.

실질 압박의 본원의 예에서, 실질 조직에 적용되는 압력은 혈액 흐름을 정지시키기에 충분하나 둘러싼 조직에 심각한 손상을 유발할 정도로 세지는 않다. 조직 손상 또는 외상을 최소화하면서 기관 또는 이의 부분의 최적의 구획화를 달성하기 위한 이상적인 압력을 결정하는 것은 숙련된 외과의와 같은 당업자의 수준 내이다. 일반적으로, 상기 클램프는 클램프의 원위, 중간부 및 근위 턱(jaw) 위치에 걸쳐 균일한 압력을 달성할 수 있는 것이다. 클램프 및 적용되는 압력은, 또한 둘러싼 맥관계로부터 인접한 조직 영역으로부터 조직 또는 기관의 영역 또는 구역을 구획화할 수 있는 것이어야 한다. 이 구획화는 그것의 적용 동안, 그리고 일반적으로 적어도 최대 30분 내지 60분 동안 유지되어야 한다. 희망되는 경우, 클램프의 힘은 당업계에 알려진 과정을 사용하여, 예컨대 압박 부하 세포 형질도입기, 예를 들어 2.2 버튼 스타일 압박 부하 형질도입기(Interface Advanced Force Measurement; Scottsdale, Az)를 사용하여 결정될 수 있다. 또한, 구획화를 달성하기 위해 요구되는 mmHg로서의 압력(누출 압력(leak pressure))이 콜 파머 디지털 압력 측정 장치(Cole Parmer digital pressure measuring device)(예컨대 Cole-Parmer®; Vernon Hills, IL)와 같은 압력 게이지를 사용하여 생체외 또는 생체내에서 결정될 수 있다.

구획화는 메틸렌 블루 또는 브로모페놀 블루 또는 기타 유사한 염색약과 같은 염색약을 구획화된 표적 영역 또는 구역 내로 주사하고 그 영역에 대한 국재화를 평가함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 클램프의 제거 후에, 클램프가 위치되었던 양 편의 조직이 해부되고 염색약의 존재에 대해 분석될 수 있다. 구획화는 염색약이 격리된 조직의 부분 또는 영역을 투과하지 않는 때 달성된다. 실질 압박의 전 기간 동안 맥관계로부터 격리된 조직의 영역 또는 부분이 있는 한, 염색약의 일부 누출(혈액 흐름을 나타내는)이 클램프의 경계 주위의 말초 영역에서 발생할 수 있다는 것이 이해된다. 이상적으로, 구획화가 달성되면 염색약이 클램프의 경계를 넘어 인접한 조직을 투과하지 않는다. 이는 실시예 6에 예시된다.

클램프 및 폐쇄 카테터에 부가적으로, 흡인(suction)이 기관 또는 이의 부분으로의 혈액 흐름을 감소 또는 제거하기 위해 사용될 수 있다. 추가적인 예에서, 플러싱(flushing)이 혈액을 희석하기 위해 그리고 또한 전달되는 제제의 순환에 대한 노출을 최소화하기 위해 격리된 기관 또는 조직을 관류 또는 부분적으로 관류하는데 사용될 수 있다. 플러싱은 임의의 생리적으로 적절한 용액, 예컨대 식염수를 사용하여 달성될 수 있다. 흡인 또는 플러싱은 전달되는 제제의 투여 또는 전달 전에 수행될 수 있다. 또한, 본원의 방법의 예에서, 일반 순환으로부터 기관 또는 이의 부분의 구획화의 단계는 예컨대 초음파영상, 컴퓨터 단층촬영 또는 자기 공명 영상과 같은 영상화 장치에 의해 보조될 수 있다. 일 예에서, 수술중의 초음파가 혈액 흐름의 차단을 보조하기 위해서 혈관적 패턴 또는 조직 또는 기관의 기타 해부학적 특징의 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다.

일부 예에서, 허혈성 전조건화(ischaemic preconditioning, IP)가 연장된 허혈성 사례를 야기하기 쉽도록 미리 결정된 시간 동안 총 혈관적 격리 전에 수행될 수 있다. 전조건화는 조직 세포에 의한 전달되는 제제의 흡수를 보장하기 위해 본원의 방법의 실시에 있어서 발생할 수 있는 허혈증의 더 긴 기간에 대한 기관 또는 이의 부분의 증가된 내성을 야기한다. 이러한 방법에서, 조직 또는 이의 부분으로의 혈액 흐름은 본원의 방법에서 혈관적 격리 동안 미리 결정된 시간 미만의 길이의 시간이지만, 낮은 수준, 미약한 또는 중등도의 허혈증을 야기하는 시간 동안 차단된다. 예를 들어, 혈액 흐름을 적어도 또는 최대 2 분, 3 분, 5 분, 10 분, 15 분, 20 분, 25 분, 30 분 또는 그 이상 동안 차단함으로써 조직 또는 기관은 전조건화된다. 그리고 나서, 조직 또는 기관은 지속된 허혈증-재관류 손상의 상태를 생산하기 위해 허혈증의 10분 이내에 즉시 재관류된다. 재관류는 적어도 또는 최대 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 12 분, 15 분, 20 분 또는 그 이상이다. 미약한 내지 중등도의 허혈증의 기간 다음에 재관류하는 것으로 특징지어지는 전조건화 직후에, 기관 또는 이의 부분은 전달되는 제제가 본원에 기술되는 바와 같이 조직 세포에 의해 흡수되는 것을 보장하는 데 충분한 미리 결정된 시간 동안 본원의 임의의 방법을 사용하여 구획화의 대상이 된다.

본원의 방법의 다른 예에서, 기관 또는 이의 부분은 저산소증 또는 무산소증에 특히 감작되는 경우, 기관 또는 이의 부분은 기관 또는 이의 부분의 체외에서 일어나는 관류를 제공함으로써 구획화된다. 이 방법은, 예를 들어, 전신적 순환이 유지되는 심장혈관 우회 수술에서 활용된다. 본원의 방법에서, 체외에서 일어나는 관류는 표적 기관 또는 이의 부분에 대해 폐쇄회로에서 혈액 흐름을 유지하도록 작용할 수 있다. 또한, 체외에서 일어나는 관류는 혈액을 산소화하는 것을 포함할 수 있다.

기관 또는 이의 부분의 구획화를 수행하기 위한 혈액 흐름의 차단 방법은 개방형 외과적 과정 또는 복강경 기법을 포함하는 당업계에 알려진 일반적 외과적 과정에 의해 수행될 수 있다.

예를 들어 일반 순환으로부터의 혈관적 격리에 의한, 상기-기술된 기관 구획화의 방법은 임의의 기관 또는 이의 부분에 수행될 수 있다. 이러한 기관의 예는 간, 신장, 췌장, 폐 또는 비장 또는 이의 부분을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 하기 하위섹션은 예시적인 기관의 혈관적 격리의 실시를 예시한다.

a. 간(Liver)

인간 및 다른 동물에서, 간은 적갈색 소엽 기관이다. 간은 분해에 필요한 해독작용(detoxification), 단백질 합성 및 생화학 물질의 생산을 포함하여, 넓은 범위의 기능을 갖는다. 본원의 방법을 사용하여, 간은 여러 가지 이유로 전달되는 제제(delivered agent)의 전달을 표적(target)으로 하는 특히 좋은 기관이다. 그것은 신체에서 가장 큰 기관(전체 체중의 2% 내지 3%)이고, 쉽게 접근가능하고 구획가능한 적어도 하나의 엽(lobe)을 가지고, 매우 느린 세포 회전율을 가지고, 단백질 분비에 능하고, 장시간의 기간 동안 산소결핍(anoxia)과 저산소증(hypoxia)을 견딘다. 또한, 간은 혈청 단백질의 대사과 생산에 그것의 중심적인 역할 때문에 핵산의 전달을 위한 중요한 표적 기관이다. 분비되는(secreted) 또는 세포내(intracellular) 단백질의 간 생산으로부터 도움을 받을 수 있는, 간-특이적 유전자 산물의 결함에 의해 일부 발생하는, 다수의 질환이 알려져 있다. 예를 들어, 이것은 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia), 혈우병(hemophilia), 고셔병(Gaucher's disease) 및 파브리병(Fabry's disease) 및 요소회로질환(urea cycle disorder) 및 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease)을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 이점에도 불구하고, 전달되는 핵산의 장기간의 유전자 발현을 달성할 수 없는 불능에 의해 간으로의 핵산의 표적 되는 전달이 방해된다.

간은 횡격막 바로 아래 복강의 상단 오른쪽 사분면에 위치한다. 그것은 잘 된 혈관구조이다. 그것은 간문맥(portal vein)과 간동맥(hepatic artery)을 통한 이중 구심성(dual afferent) 혈액 유입(inflow)과 상대정맥(superior vena cava)으로 흘러가는 간정맥(hepatic vein)으로 합쳐지는 간정맥을 통한 단일 원심성 혈관 유출(single efferent blood outflow)로 특징지어진다. 이중의(dual) 혈관 유입의 결과는 간문맥에 의한 75% 및 간동맥에 의한 25%로 제공되는 1500 mL/분의 혈류를 일으킨다(Abdalla 외 (2004) Surg. Clin. N. Am., 84:563-585). 도 1, 패널 A는 랫트(rat) 간의 해부학상 조직 및 혈관 조직을 도시한다. 간 문맥이 간에 들어가면, 다양한 엽(lobe)을 제공하기 위해 오른쪽과 왼쪽 분지로 나누어진다. 제1 분지는 오른엽을 공급하기 위해 오른쪽 하부 간문맥(right inferior portal vein) 및 오른쪽 상부 간문맥(right superior portal vein)과 같이 오른쪽으로 생긴다. 제2 분지는 두 개의 혈관: 상부 꼬리모양의 분지(upper caudate branch) 및 하부 꼬리모양의 분지(lower caudate branch)로 갈리는 꼬리모양의 간문맥(caudate portal vein)과 같이 왼쪽으로 생긴다. 중앙엽(median lobe)의 오른쪽 부분을 제공하는 오른쪽 중앙 간문맥(right median portal vein) 및 왼쪽 중앙 간문맥 및 상응하는 엽을 공급하는 왼쪽 측면 간문맥(left lateral portal vein)을 방출하는 왼쪽 간문맥(left portal vein)을 공급하는 간문맥이 그것의 주요한 분기점 상에서 계속된다. 간의 동맥의 관개(arterial irrigation)는 일단 간으로 들어가면, 엽을 제공하는 오른쪽 및 왼쪽으로 갈라지고 간문맥(portal vein)과 같은 분포를 따르는 간의 동맥(hepatic artery)에 의해 제공된다.

전통적인 인간의 육안 해부학(gross anatomy)은 표면 특징에 따라 간을 네 개의 엽(lobe)으로 분할한다. 그것의 전방 측면에서, 낫인대(falciform ligament)는 해부학상의 왼엽, 및 해부학상의 오른엽으로 간을 분할한다. 간이 내장(visceral) 표면으로 뒤집어 질 경우 오른엽 및 왼엽 사이에 두 개의 추가적인 엽이 있고, 이것들은 꼬리엽(caudate lobe) 및 네모엽(quadrate lobe)이다.

간의 기능상/혈관의 특징에 따라 추가의 분할이 가능하다(도 1, 패널 B). 세 개의 주요한 간정맥(오른쪽 간정맥, 중앙 간정맥 및 왼쪽 간정맥)은 인간의 간을 간문맥계(portal system)의 상응하는 분지에 의해 공급되는 각각의 네 개의 섹션(section) 또는 구역(segment)으로 분할한다(오른쪽 뒤쪽 구역(the right posterior segment), 오른쪽 앞쪽의 구역(the right anterior segment), 왼쪽 내측의 구역(the left medial segment) 및 왼쪽 측면의 구역(the left lateral segment). 간문맥의 추가의 분지화(branching)는 그것의 자체 원심성 간정맥 시스템(efferent hepatic venous system), 구심성 문정맥 시스템(afferent portal venous system), 구심성 동맥 시스템(afferent arterial system) 및 담즙관 시스템(biliary duct system)과 함께 여덟 개의 해부학적으로 독립적인 하위구역(subsegment)으로, 인간의 간을 각각 세분한다. 하위구역 I 및 IV는 왼쪽 내측의 구역(left medial segment)에 상응하고, 하위구역 Ⅱ 및 Ⅲ는 왼쪽 측면의 구역(left lateral segment)에 상응하고, 하위구역 V 및 Ⅷ는 오른쪽 앞쪽의 구역(right anterior segment)에 상응하고, 하위구역 Ⅵ 및 Ⅶ는 오른쪽 뒤쪽의 구역(right posterior segment)에 상응한다.

간의 실질(parenchyma)은 소엽(lobule)이라는 작은 단위로 분할되는 간을 통해 격막(septae)을 형성하는 결합 조직 캡슐(글리슨 캡슐(Glisson's capsule)이라 함)로 구성되어 있다. 이 실질은 또한 혈관, 림프관 및 담관에 의해 이송된다. 각각의 소엽은 중심 정맥(central vein)으로부터 바깥쪽으로 두껍게 퍼지는 하나 또는 두 개의 세포들의 무더기(stack) 또는 판(plate)을 형성하는 간세포의 육각형 배열을 포함한다. 세포의 판은 유동(sinusoid) 시스템에 의해 구분된다. 간세포(hepatocyte)는 약 5개월의 평균 수명을 가진다. 이러한 세포는 또한 간 물질(substance)이 상실되었을 때 강력한 재생이 가능하다. 담관 및 간동맥과 간문맥(소엽 사이의 혈관(interlobular vessel))의 말단 분지를 포함하는, 간세동이(portal triad)가 각각의 소엽 정점에 존재한다. 소엽사이의 혈관(interlobular vessel)으로부터 유래하는 혈관은 유동(sinusoid)으로의 주입구 혈관(inlet vessel) 및 중심 정맥을 향한 혈류를 제공하는 소엽의 주변부(periphery) 사방에 분산된다.

본원에 제공되는 방법에서, 간, 또는 엽(lobe), 그들의 영역 또는 구역의 구획화(compartmentalization)는, 전신 순환(general circulation)과의 소통(communication)으로부터, 예컨대 맥관구조(vasculature), 관(ductal) 또는 림프 시스템(lymph system)으로부터의 분리에 의한, 간 또는 엽(lobe) 또는 그들의 구역의 분리에 의해 달성될 수 있다. 구획화를 달성하는 방법은 혈관(vascular) 및/또는 실질 클램핑 절차(parenchymal clamping procedure)를 포함한다. 간 혈관 분리(isolation) 및 폐색(occlusion)을 행하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Buell 외 (2001) Arch. Surg., 136:569-575; Belghiti 외. (1999) Annals of Surgery, 229:369-375; Chowdhury (2010) BSMMUJ., 3:112-119; Chouillard 외 (2010) Annals of Surgical Innovation and Research, 4:2- 12; Chaib 외 (2003) Arq Gastronenterol., 40:131 ; Abdalla 외. (2004) Surg. Clin. N. Am, 84:563-585 참조). 이러한 방법은, 간 혈관 배제(hepatic vascular exclusion), 반측 간 혈관 폐색(hemihepatic vascular occlusion), 페디클 클램핑(pedicle clamping), 구역 혈관 폐색(segmental vascular occlusion), 총 혈관 배제(total vascular exclusion) 및 간 혈관 배제를 대정맥 흐름의 보존(caval flow preservation)과 함께 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

본원에서 제공되는 방법의 예에서, 간의 구역 또는 부분의 구획화는 실질(parenchyma)의 압축을 야기하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 수동 압축, 예컨대 간 실질이 엄지 손가락과 하나의 손가락 사이에 짓눌리는 손가락-파쇄(finger-fracture)가 수행될 수 있다. 다른 예에서, 손가락 사이의 페디클의 압축 또는 페디클에 압력을 전달할 수 있는 클램프 또는 기타 유사한 장치의 사용 중 어느 하나에 의한 페디클 클램핑(pedicle clamping)이 사용된다. 추가 예에서, 구획화는 엽(lobe)에 걸쳐 실질 압축 클램프 또는 폐색 클램프의 배치에 의해 수행될 수 있다. 간 엽의 실질 압축(parenchymal compression)에 사용될 수 있는 예시적인 클램프는 롱마이어-스톰 클램프(Longmire-Storm clamp)(V. 뮬러(Mueller), 스태인리스(Stainliss), 독일, 카탈로그 번호 SU-9080), 린 또는 추 간 클램프(Lin or Chu liver clamp)(필링(Pilling) 번호 604113-61995), 이노쿠치(Inokuchi) 간 클램프(Kanematsu 외 (1984) Jpn. J. Surg., 14:432-3), 도티 클램프(Doty clamp)(특허번호 제3,667,471호) 및 베르니크 클램프(Vernick clamp)(미국 특허번호 제5,203,786호)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 추가의 구역의 혈관 분리(segmental vascular isolation)는 클램프 내에 실질(parenchyma)의 더 적은 부피를 배치함으로써 달성될 수 있다.

일반적으로, 본원의 방법의 실시에 있어서, 간의 영역 또는 부분을 선택적으로 구획화하기 위해 엽(lobe)은 다른 엽(lobe)으로부터 동원될 수 있다. 동원(mobilization)은 실질 압축 또는 클램핑을 허용하기 위해 엽(lobe) 또는 영역에 접근을 허용한다. 간의 부분 또는 영역만을 동원하는 능력은 또한 전달되는 제제의 선택적인 전달을 달성하는 방법이 가능함을 의미한다. 간의 자체-포함된 단위(self-contained unit)로의 구역화되는 해부학(segmented anatomy)으로 인해, 다른 구역(segment)으로의 혈류가 유지되는 동안에, 특정 엽, 구역 또는 이의 부분의 구획화가 달성될 수 있다. 예를 들어, 페디클의 선택적인 클램핑 또는 폐색, 각각의 구역화된 페디클(segmented pedicle), 또는 실질 영역이 영역 또는 구역의 구획화를 달성하도록 수행될 수 있다. 동원(mobilization)은 관련되는 인대(ligament) 및/또는 기타 관련되는 샘(gland)의 분할을 요구할 수 있다. 간의 다양한 엽(lobe) 또는 구역의 동원 또는 분리를 위한 절차 및 기법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 꼬리엽(caudate lobe), 왼엽(left lobe), 또는 왼쪽 중앙 엽(left median lobe)이 모두 상당히 혈관으로(vascularly) 분리될 수 있고 접근 가능하다. 포유류 동물 종 사이의 간 해부학에서 차이는 특정 영역 또는 엽(lobe)이 다른 종보다 하나의 종에서 분리를 더욱 잘 받아들이게 할 수 있다. 당업자는 다른 동물에서 유사한 엽(lobe)을 인식할 것이고, 본원의 방법을 사용하여 구획화(compartmentalizatio)를 위한 동원 또는 분리를 위한 적합한 엽(lobe) 또는 구역(segment)을 식별할 수 있다.

본원의 특정 예에서, 꼬리엽, 왼엽 또는 왼쪽 중앙 엽, 또는 그들의 부분이 구획화될 수 있다. 필요하다면, 맥관구조(vasculature)로부터 적절하게 구획화된 영역으로의 접근을 허용하기 위해 조직 또는 기관의 다른 영역 또는 주변 구조를 손상시키거나 영향을 미침이 없이 그 주변의 부착(attachment)로부터 간 엽 또는 구역의 철회(retraction) 및 해체(dissection)가 수행될 수 있다. 예를 들어, 꼬리엽(caudate lobe)은 구역 IV의 후방에 놓이고 하대정맥(inferior vena cava) 및 간문맥(portal vein)에 밀접하게 관련되어 있다. 꼬리엽의 동원(mobilization)은 위와 간장의 장막(gastrohepatic omentum) 및 등쪽 꼬리-대정맥 인대(dorsal caudate-caval ligament)의 분할에 의해 달성될 수 있다. 간의 왼엽은 왼쪽 삼각 인대(left triangular ligament)를 분할함에 의해 동원될 수 있다. 유사한 절차가 인간 또는 다른 대상체(subject)에서 비슷한 엽을 동원하는데 사용될 수 있다.

일단 간, 이의 영역, 엽 또는 구역이 구획화되면, 전달되는 제제는 하기 추가로 기술하는 바와 같이 구획화된 엽, 영역 또는 구역으로 전달될 수 있다.

b. 기타 기관

본원에서 제공되는 방법은 핵산 또는 암호화되는 폴리펩티드의 표적, 기관과 이의 혈관 구조의 접근 가능성, 치료되는 장애 또는 질환, 암호화되는 폴리펩티드의 천성 및 기타 요인을 포함하는, 다양한 요인에 따라 널리 다양한 기관에 사용될 수 있다. 간뿐만 아니라, 혈관 분리 및 구획화에 영향을 미치는 표적 되는 기관 또는 이들의 부분은 CNS (뇌 또는 척수), 말초 신경계(예를 들어, 신경), 췌장, 담낭, 내분비선(뇌하수체, 부신, 갑상선 등), 심혈관 기관(예를 들어, 심장 및 혈관), 피부, 비뇨기관(신장, 자궁, 자궁 경부, 전립선, 및 요도), 호흡 시스템의 기관(예를 들어, 폐 또는 기도), 뼈, 근육, 및 소장일 수 있다. 이 목록은 당업자가 이들의 추가적인 표적 기관 및 엽을 인식할 것과 같이, 망라하려고 함이 아니다.

피부는 본원의 구획화된 방법을 실시하기 위한 표적 기관이다. 예를 들어, 피부의 각질세포는 유전자 치료에 대한 적합한 표적 세포이고, 이들의 치료는 순환, 및 상처 또는 흉터로 방출될 수 있는 단백질의 생산에 의해 유전적 결함, 전신성 질환에 의해 야기되는 질환 또는 상태에 적절할 수 있다(예를 들어, Meng 외 (1998) J. Clin. Invest., 101 : 1462; Liu 외 (2001) Yonsei Medical Journal, 42:634-645). 피부는 또한 본원의 구획화 방법으로부터 발생할 수 있는 짧은 허혈(ischemia)의 기간에 잘 받아들이는 것으로 나타났다(예를 들어, Willms-Kretschmer and Majno (1969) The American Journal of Pathology, 54:327 참조). 예를 들어, 본원의 방법에서, 구획화는 세포의 도입 또는 전달되는 제제의 세포로의 유입 또는 세포(예를 들어, 각질세포)에 의함에 충분한 시간 기간 동안 유지된다. 예를 들어, 구획화의 시간 기간은 2시간 미만, 일반적으로 적어도 10분, 15분, 20분, 30분 또는 60분일 수 있다.

피부의 구획화는 말초 순환으로부터 피부 절단을 할 수 있는 본원에 기재된 임의의 기술에 의해 수행될 수 있다. 특정 예에서, 클램프가 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 피부의 접힘(fold)이 분리되거나 동원될 수 있고 클램프 사이에 적합할 수 있다. 클램프의 압력이 본원에 기술된 바와 같이 조정될 수 있고 전신 순환으로부터 그러한 분리가 달성될 수 있다(예를 들어, Willms-Kretschmer and Majno (1969) The American Journal of Pathology, 54:327 참조).

폐는 본원의 구획화된 방법의 실시를 위한 표적 기관이다. 폐의 유전자 치료는 암, 천식, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 알파-1-항트립신 결핍(alpha-1-antitrypsin deficiency) 및 호흡 곤란 증후군, 기타 중에서 포함하는 급성 및 만성 질환의 치료를 위해 표적으로 될 수 있다. 본원의 방법에서, 폐를 통해 환기를 유지하면서, 구획화가 일반적으로 폐의 구역 또는 영역에서 수행된다. 예를 들어, 폐의 기관지 구역(bronchial segment)이 구획화될 수 있다. 구획화는 기관지 동맥의 폐색, 혈관 클램프의 사용, 및/또는 기관지의 직접적인 실질 클램핑에 의해 영향을 받을 수 있다.

신장의 유전자 치료는 유전적인 신장 질환(예를 들어, 알포트(Alport) 증후군)을 포함하여 신장 질환을 치료할 수 있다. 예를 들어, 신장 페디클 폐색(renal pedicle occlusion), 예를 들어, 신장 페디클의 클램핑에 의해; 혈관 클램프, 예컨대 긴 곡선 혈관 클램프를 사용하는 신장 실질의 클램핑에 의한 영역의 실질 압축; 또는 신장 케이블 타이(renal cable tie), 지혈대(tourniquet) 또는 밴딩 장치에 의해 신장의 구획화가 달성될 수 있다. 실질 클램핑에 대해, 복강경(laparoscopic) 실질 클팸프가 사용될 수 있고, 세틴스키-(Satinsky-) 또는 데바키-(Debakey-) 스타일을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Toren 외 (2010) Can. Urol. Assoc., 4:E133-E136; Ko 외 (2010) Korean J. Urol, 51 :8-14 및 Joung 외 (2007) Korean J. Urol. , 28:265-269 참조).

2. 전달되는 제제의 투여에 의한 핵산 분자의 전달

본원의 방법에서, 전달되는 제제의 조직 세포로의 직접적 투여에 의해 기관 또는 조직 또는 이들의 부분에서 세포에 핵산이 전달된다. 전달되는 제제는 기관 또는 이들의 부분의 구역화를 개시하기 이전에, 동시적으로, 간헐적으로 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본원의 방법에서, 전달되는 제제는 기관 또는 이들의 부분의 구획화를 개시한 후 즉시, 예컨대 10분 이내 또는 이하 그리고 일반적으로 기관 또는 이들의 부분의 구획화를 개시한 후 5분 이내 투여된다. 예를 들어, 전달되는 제제는 구획화를 개시한 후 30초, 1분, 2분, 3분, 4분 또는 5분, 6분, 7분, 8분, 9분 또는 10분 이하로 대상체에 전달된다.

a. 전달 방법 및 투여 경로

전달되는 제제의 투여에 의한 핵산 분자의 전달은 대상체의 구획화된 기관 또는 이들의 부분, 특히, 그로부터 유전자 발현에 대한 관련 있는 표적 조직 세포로 전달되는 제제의 전달을 할 수 있는 임의의 방법 또는 투여 경로에 의할 수 있다. 예를 들어, 전달은 실질 세포에 직접적이다. 간의 경우, 비-실질 세포가 혈관 내피 세포, 쿠퍼(Kupffer) 세포 및 지지 기질 세포(supporting stromal cell)를 포함하는 반면에, 표적 실질 세포는 간세포이다.

일부 예에서, 전달되는 제제의 환자로의 전달은 직접적일 수 있고, 이 경우 대상체는 전달되는 제제에 직접적으로 노출된다(예를 들어, 생체 내(in vivo) 전달). 예를 들어, 전달되는 제제는 실질(parenchyma) 또는 조직 사이 공간(interstitial space)으로 전달될 수 있다. 다른 예에서, 전달되는 제제의 전달은 간접적일 수 있고, 이 경우 세포는 먼저 시험관 내(in vitro)에서 전달되는 제제로 형질전환되고, 그리고 나서 환자로 이식된다(예를 들어, 생체 외(ex vivo) 전달). 예를 들어, 생체 외(ex vivo) 유전자 치료 방법에 대해, 실질 세포는 생체로부터 제거되고 생체 외(ex vivo)에서 전달되는 제제에 노출될 수 있고, 이어서 구획화된 조직 또는 기관 또는 이들의 부분에 세포의 재이식에 의해 이어질 수 있다.

특정 예에서, 전달되는 제제는 직접 조직 또는 기관 주입에 의해 전달된다. 예를 들어, 전달되는 제제는 조직 또는 기관 실질로, 예컨대 구역화되는 조직 또는 기관, 또는 이들의 부분, 예컨대 근육(근육 내), 간, 뇌, 신장 및 본원에 기술되거나 당업계에 알려진 기타로 실질내(intraparenchymal) 투여에 의해 직접 주사에 의해 전달된다. 실질로 조직 사이(Interstitial) 전달은 전신 전달 방법에 비해 장점이 있다. 핵산의 전신 전달, 예컨대 전달되는 제제의 정맥 내(intravenous) 투여, 문맥 내(intraportal) 투여 및 동맥 내(intra-arterial) 투여는, 전달되는 제제의 전신 순환(general circulation)으로 노출을 증가시킨다. 이것은 비-선택적인 조직 표적화, 감소된 유전자 발현으로 이어지는 세포 흡수의 감소된 또는 낮은 효율, 조직 세포에 의한 흡수를 보장하기 위한 전달되는 제제의 많은 양 또는 투여량의 필요, 면역 세포에 노출 및 원하지 않은 면역 반응의 활성화, 및 전신 전달 방법과 관련된 기타 문제를 야기한다. 본원에서 조직 세포의 구획화(예를 들어, 혈관 배제 및 분리)와 결부된, 조직 사이(Interstitial) 공간으로의 직접적인 주사가 전신 순환(general circulation)으로의 노출을 최소화하는 반면에 조직 세포에 의한 전달되는 제제의 흡수의 빈도 및 효율을 증가시키는 것이 발견된다.

예를 들어, 조직 세포에 의한 전달되는 제제의 흡수의 빈도 및 효율의 증가 이외에, 실질 전달(parenchymal delivery)은 또한 전달되는 제제의 면역 세포에 노출을 피할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자의 간 또는 이의 부분으로의 전달을 위해, 예컨대 간 내 주입(intrahepatic injection)에 의한 전달되는 제제의 직접적인 실질 주사에 의한 조직 사이(interstitial) 전달은, 쿠퍼 세포(Kupfer cell) 섭취(engulfment)를 피할 수 있다(예를 들어, Crettaz 외 (2006) Hepatology, 44:623-632 참조). 간의 식세포의 대식세포인 쿠퍼 세포는, 간의 유동(sinusoid)에 존재하고 따라서 정맥주사로 투여되는 전달되는 제제에 노출된다. 대조적으로, 간의 간 세포(hepatocyte) 조직 세포는 디세강(space of Disse)에 의해 유동(sinusoid)으로부터 분리된다. 따라서, 조직사이 공간(interstitial space)에 있는 간 세포로 전달되는 제제의 직접적인 표적화는 쿠퍼 세포 활성화에 의해 개시될 수 있는 원하지 않은 염증전(proinflammatory) 반응을 피하고, 상주하는 조직 세포에 의한 흡수를 증가시킨다. 유사하게, 다른 기관의 조직 사이 세포로 전달되는 제제의 직접적인 전달이 또한 고려된다. 따라서, 본원의 방법에서, 전달되는 제제 또는 이의 조성물은 조직 실질에 직접 전달된다.

일반적으로, 전달되는 전달되는 제제는 조성물로 제공된다. 이러한 전달되는 제제 및 조성물의 예시는 각각, 섹션 D 및 E에 기술되어 있다. 전달되는 제제는 약제학적으로 허용가능한 액체 또는 수성 담체(carrier)에서 전달될 수 있다. 전달되는 제제는 조직 또는 기관 또는 이의 부분으로, 니들(needle) 또는 기타 유사한 장치를 사용하여 주입에 의해, 직접 도입될 수 있다. 전달되는 담체(carrier)에서 전달되는 제제의 부피는 약 또는 0.5 mL 내지 100 mL, 예컨대 0.5 mL 내지 50 mL, 1 mL 내지 20 mL, 5 mL 내지 50 mL, 또는 5 mL 내지 20 mL이다.

b. 전달을 용이하게 하기 위한 방법

일반적으로 본원의 방법은 동맥, 정맥 및 기타 관련 혈관, 및 또한 관(duct) 및 림프 시스템으로의 혈관으로의 주사를 피하는 주사 방법을 사용한다. 실질 주입에 의한 전달되는 제제의 전달은 실질 조직 및 세포를 주변 혈관 및 관련되는 구조(architecture)로부터 구별하는 영상(imaging) 기술의 사용에 의해 도움을 받을 수 있다. 영상은 주입 전에 즉시, 주사에 일치하여 및/또는 주사 그 다음에 수행될 수 있다. 이러한 영상 기술은, 자기 공명 영상(MRI), 초음파(ultrasound) 및 도플러 초음파 검사(Doppler sonography)를 포함하는, 초음파 검사(sonography) 기술을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, B-광선(B-glow), 3-D 영상 또는 컬러 도플러(color Doppler)가 사용될 수 있다. 필요하면, 조영제가 영상을 용이하게 하도록 주사될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법은 또한 제제의 혈관 시스템(vascular system) 또는 도관 시스템(ductal system)의 내강(lumen)으로의 도입의 가능성을 최소화하기 위해 사용될 수 있다.

본원에서 제공되는 방법에서, 필요하면, 전달되는 제제의 조직 세포에 의한 흡수는 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 증가 될 수 있다. 세포에 의해 충분한 전달되는 제제의 흡수를 보장하기 위해 필요한 시간이 더 적게 요구되므로 전달되는 제제의 흡수를 향상시키는 절차는 구획화 시간(상술됨)을 줄일 수 있는 것으로 이해된다. 특정 절차에 대한 선택은 당업자에 의해 경험적으로 결정되고 전달되는, 특정 전달되는 제제, 투여 경로(예를 들어, 특정 조직 또는 기관) 및 투여되는 제제의 투여량 또는 양에 의존한다. 일 예에서, 전달되는 제제는 지질, 폴리머 형질전환 시약, 또는 기타 제제와 함께 제형화 될 수 있다. 다른 예에서, 물리적인 방법이 전달을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 전달되는 제제의 전달을 향상시키는 예시적인 물리적 방법은 "유전자 총(gene gun)" 방법, 전기천공법(electroporation), 초음파천공법(sonoporation), 압력 또는 초음파를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 대안적으로 최소한의 조직 손상과 함께 생체 내(in vivo) 유전자 전달을 향상시키기 위해 약제학적 조성물이 펨토초 적외선 레이저(femtosecond infrared laser)(LBGT 기술)를 사용하여 투여될 수 있다.

일 예에서, 전달되는 제제의 흡수, 및 특히 바이러스 또는 바이러스-유사 입자(virus-like particle), 예컨대 아데노바이러스(adenovirus)인 전달되는 제제는, 다양한 제제의 존재에 의해 향상될 수 있다. 예를 들어, 전달되는 제제는 바이러스-특이적인 세포 표면 수용체의 전사 인핸서(transcriptional enhancer)인 제제 또는 화합물로 투여될 수 있다. 이러한 제제 또는 화합물은, 예를 들어, 히스톤 데아세틸라제(histone deacetylase)(HDAC) 저해제를 포함한다. HDAC 저해제는 히드록삼산(hydroxamic acid), 고리 테트라펩타이드(cyclic tetrapeptide), 벤즈아마이드(benzamide), 친전자성 케톤 또는 지방족 산 화합물을 포함한다. 예를 들어, HDAC 저해제는, 트리스코스타틴 A(trischostatin A), 보리노스탯(vorinostat)(S AHA), 베리오노스탯(belionostat)(PXD101), LAQ824, 파노비노스탯(panobinostat)(LBH589), 엔티노스탯(entinostat)(MS-275), C199, 모세티노스탯(mocetinostat)(MGCD0103), 로미뎁신(romidepsin)(lstodax), 발프론산(valproic acid), PCI-24781, SB939, 레스미노스탯(resminostat), 기비노스탯(givinostat), CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, 케베트린(Kevetrin), 또는 트리스코스타틴 A(trichostatin A)(TSA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예시의 HDAC 저해제는 아데노바이러스(adenovirus) 수용체 CAR 및 치료적 이식유전자(transgene)의 전사 인핸서(enhancer)인 발프론산(valproic acid)이다. 연구는 아데노바이러스의 흡수가 발프론산 존재 하에서 증가되는 것을 보여준다(Segura-Pancheco 외 (2007) Genet. Vaccines Ther., 5:10). 이러한 예에서, 바이러스 벡터는 제제와 함께 또는 별도로 제제화된다. 바이러스 벡터가 별도로 제제화되는 예에서, 전사 인핸서 제제 또는 화합물은 전달되는 제제의 전달 전에 전달된다. 전사 인핸서 제제는 약 또는 1 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예를 들어, 약 또는 20 mg/kg 내지 60 mg/kg, 예컨대 40 mg/kg로 투여될 수 있다. 투여량은 총 용량을 달성하기 위해 분할되고 개별적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 투여의 주기는 하루 1번, 2번, 3번, 4번, 또는 5번이 될 수 있다. 투여의 빈도는 적어도 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 2주 동안 날마다(daily) 일 수 있다. 제제는 투여의 임의의 경로로, 예컨대 피하, 정맥 내, 경구 또는 국소로 투여될 수 있다. 특정 예에서, 제제는 직접 실질 투여(parenchymal administration)로 투여된다.

일부 예에서, 전달되는 제제는 전달되는 제제와 결합하거나 복합체로 되고 세포로의 그것의 유입을 매개하는 제제 또는 전달 비히클(vehicle)과 제제화된다. 예시적인 제제는 양이온성 리포좀 및 지질, 지단백(lipoprotein), 합성 폴리머 또는 폴리펩티드, 무기 화합물(mineral compound) 또는 비타민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 폴리머는 폴리양이온 또는 폴리음이온을 포함한다. 예를 들어, 전달되는 제제는 폴리아민, 인산 칼슘 침전, 히스톤 단백질, 프로타민, 폴리에틸렌이민(polyethylenemine), 폴리리신(polylysisne), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리오르니틴(polyornithine), DEAE 덱스트란(dextrane), 폴리브렌(polybrene), 폴리암포라이트 착체(polyampholyte complex), 스페르민(spermine), 스페르미딘(spermidine), 퓨트레신(purtrescine), 인간 혈청 알부민, DNA 결합 단백질, 비히스톤 염색체 단백질, DNA 바이러스로부터 피막 단백질(coat protein) 및 N-치환 글리신(N-substituted glycine)의 폴리머와 함께 제형화 될 수 있다.

예를 들어, 전달되는 제제는 그로부터 유래되는 대상체 또는 세포로 전달 전에 지질에 캡슐화되거나 리포좀에 패키지(package)될 수 있다. 지질 캡슐화(lipid encapsulation)는 일반적으로 핵산을 안정적으로 결합 또는 포획하고 유지할 수 있는 리포좀을 사용하여 완수된다. 지질 제제(lipid preparation)에 대한 응축된 핵산 전달되는 제제의 비율은 달라질 수 있지만 일반적으로 지질의 약 1:1 (DNA mg:지질 마이크로몰) 또는 그 초과일 것이다. 리포좀 제제(Liposomal preparation)는 양이온(양전하), 음이온(음전하) 및 중성 제제(neutral preparation)를 포함한다. 이러한 제제는 당업계에서 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 쉽게 사용가능하다. 예를 들어, 예시적인 양이온성 지질은, N[l-2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리에틸암모니움(N[l-2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethyarnmonium)(DOTMA; 제품 라인 리포펙틴®(Lipofectin®)으로 사용가능함); DDAB/DOPE 및 DOTAP/DOPE를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 음이온 및 중성 리포좀 또한 쉽게 사용가능하고 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline), 콜레스테롤, 포스파티딜 에탄올아민(phosphatidyl ethanolamine), 디올레오일포스파티딜 콜린(dioleoylphosphatidyl choline)(DOPC), 디올레오일포스파티딜 글리세롤(dioleoylphosphatidyl glycerol)(DOPG), 디올레오일포스파티딜 에탄올아민(dioleoylphoshatidyl ethanolamine)(DOPE), 예컨대 상업적으로 사용가능한 제제 아반티 극성 지질(Avanti Polar Lipid)로부터 제조될 수 있다. 리포좀은 다중층 베지클(multilamellar vesicle)(MLV), 작은 단일층 베지클(small unilamellar vesicle)(SUV), 또는 큰 단일층 베지클(large unilamellar vesicle)(LUC)을 포함한다.

일부 예에서, 전달되는 제제는, 제제의 세포 전달을 더 돕고 증가시키기는 관능기 또는 표적 제제, 예를 들어, 표적 되는 세포에서 발현되는 수용체에 결합하는 표적 분자를 포함하는 나노입자일 수 있다. 관능기 또는 표적 제제는 예를 들어, 제제의 연합(association) 또는 세포와의 복합체(complex)를 강화하는 세포 표적 모이어티(targeting moiety)를 포함한다. 세포 표적 모이어티는 단백질, 펩티드, 지질, 스테로이드, 당, 탄수화물, (비-발현) 다중핵산(polynucleic acid) 또는 합성 화합물일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 세포 표적 신호(cell targeting signal)는 수용체에 세포 결합을 향상시키는 리간드를 포함할 수 있다. 이러한 리간드는 인슐린, 성장 인자(예를 들어, EGF 또는 FGF), 트랜스페린(transferrin), RGD 서열을 포함하는 펩티드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 표적 모이어티는 세포 상에 티올기(thiol group), 설프히드릴기(sulfhydryl group) 또는 이황화기(disulfide group)와 반응하는 화학기(chemical group), 엽산, 기타 비타민을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원의 예에서, 주입은 전기천공법(electroporation)에 의해 용이하게 될 수 있다. 전기천공법은 세포에 영구적인 손상을 야기하지 않고 세포막에 일시적인 기공(pore)을 생성하는 펄스화된 전기장(pulsed electric field)의 응용과 관련되고 따라서 외인성 분자의 도입을 허용하는 기술이다. 전기천공법 시스템에 의해 생성되는 전기 펄스를 조정함으로써, 전달되는 제제는 절차 동안 생성되는 세포에서 통로 또는 기공을 통해 자신의 길을 찾을 수 있다. 근육, 간, 피부 및 기타 조직 또는 기관을 포함하는, 전달되는 제제의 생체 내(in vivo) 전달을 위한 전기천공법을 사용하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허번호 제 5,704,908호; 미국 공개번호 제2002/0102729호; Titomirov, A. V., 외 (1991) Biochim Biophys Acta 1088: 131-134; Muramatsu, T., 외 (1997) Biochem Biophys Res Commun 233: 45-49; Suzuki, T., 외 (1998) FEBSLett 425: 436-440; Aihara, H. and Miyazaki, J. (1998) Nat Biotechnol 16: 867- 870; Mir, L. M., 외 (1998) C R Acad Sci Ⅲ 321: 893-899; Rizzuto, G., 외 (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96: 6417-6422; Goto, T., 외 (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:354-359; Somiari, S., 외 (2000) Mol Ther 2:178-187 참조).

전달이 생체 외(ex vivo) 세포로 되는 예에서, 일반적으로 대상체(subject)로부터 분리되는 세포는, 생체 내(in vivo) 전달에 적용가능한 임의의 기술된 방법을 포함하는, 세포로 핵산을 전달하는 당업자에게 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 전달은 덱스트란 매개된 형질감염, 인산 칼슘 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체(protoplast) 융합, 전기천공법, 리포좀으로의 캡슐화 또는 DNA의 직접적인 미세주입(microinjection)을 사용하여 달성될 수 있다. 또한, 바이러스 DNA 전달을 위해, 세포는 바이러스 입자로 형질도입(transduce)될 수 있다. 형질전환(transform)된 세포는 그 다음에 본원의 방법에서 사용되기 위한 전달되는 제제이다. 전달되는 제제 형질전환된 세포의 대상체로 생체 외(ex vivo) 전달 및 재이식을 위한 방법이 당업계에 공지되어 있고 기술된다(예를 들어, 국제공개번호 W093/14778호 참조).

c. 전달을 위한 투여량 및 요법(regimen)

투여되는 전달되는 제제의 양 또는 투여량이 특정 적용에 기초하여 경험적으로 결정될 수 있다. 본원의 방법 때문에, 투여되는, 전달되는 제제, 예를 들어 바이러스, 예컨대 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 또는 기타 바이러스의 양과, 생성되는 이식유전자(transgene) 산물 사이에 직접적인 상관관계가 있도록 용량-반응 속도론(dose-response kinetics)은 선형(linear)이다. 예를 들어, 형질도입된 바이러스의 40 게놈은 단백질의 치료적 양을 생산하기에 충분한 것으로 발견된다(예를 들어, Nathwani 외 (2002) Blood, 100: 1662 참조). 따라서, 본원의 방법에서 암호화된 단백질의 치료학적 양을 제조하도록, 상기 방법은 세포, 예를 들어, 간 간세포의 바이러스의, 바이러스 형질도입에 의한, 충분한 게놈 사본(copy) 수를 달성할 수 있는 바이러스의 더 낮은 양의 투여를 허용한다. 예를 들어, 상기 양은 세포당 바이러스의 40 게놈 또는 그 초과의 바이러스로 세포를 형질도입하는데 충분하다. 본원의 방법은 세포당 게놈 사본 수를 더욱 증가시킬 수 있고, 그렇게 함으로써 기존의 방법보다 더 낮은 투여량으로 산물의 지속적인 발현을 더 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 즉각의 방법을 사용하여, 주입되는 입자의 양, 세포 내 게놈 및 발현된 단백질의 양을 정확하게 연관성을 보여줄 수 있다.

이것은 이 기술 분야에서 기존의 유전자 치료(gene therapy)에 비해 유리하다. 예를 들어, 아데노바이러스의 전달을 위한, 예컨대 간에 전달을 위한, 기존의 방법에서, 고용량이 이식유전자(transgene) 발현을 달성할 수 있지만, 감지할 수 없는 단백질 발현을 야기하는 저용량에서, 간의 형질도입에 대한 비선형 용량 반응이 있다(Rosewell 외 (2011) J. Genet. Syndr. Gene Ther., S5: l-16). 그러나, 고용량은, 또한 면역 활성 및 독성을 개시한다. 따라서, 아데노바이러스 유전자 전달 투여량 수준의 기존의 방법을 사용하는 것은, 독성 치사율(lethality)를 초래하지 않는 수준을 달성하는 동안, 충분한 이식유전자 발현을 달성하기에 요구되는 수준과 균형을 맞추어야 한다. 일반적으로, 기존의 방법에서 충분한 단백질 생산을 달성하기 위해 투여되는 아데노바이러스의 이러한 양은 상대적으로 높고, 킬로그램 당 약 또는 약 1.5 x 10¹²초과 바이러스 입자(vp/kg)와, 일반적으로 킬로그람(kg) 당 적어도 1 x 10¹¹바이러스 입자(vp) (vp/kg) 사이, 예컨대 적어도 5 x 10¹¹ vp/kg 또는 그 초과이다. 예를 들어, 마카크(macaque)에서, 인자 IX를 암호화하는 AAV의 4 x 10¹² vp/kg 용량의 정맥 내로 투여는 인자 IX 활성의 8%를 회복시키는 지연된 발현을 달성하기 위해 필요하다(Nathwani 외 (2002) Blood, 100:1662). 인간 임상 시험은 4 x 10¹¹ vp/kg의 투여량이 단지 수일(며칠)동안 인자 IX 활성의 10%를 바로잡기 위해 요구되고 발현이 단지 2 내지 6 주 동안 지속 되는 것을 보여주었다(Mingozzi 외 (2011) Nature Reviews Genetics, 12:341). 또한, 일반적으로 정맥 내 전달 방법에 의해 주어지는, 이러한 양은 여전히 온화한(mild) 독성, 면역 활성, 및/또는 조직 손상으로 고통받는다.

특히, 본원의 구획화된 방법에서, 투여되는, 전달되는 제제의 용량 또는 양은 치료적 또는 예방 효과를 전달할 수 있도록 생산되는 단백질 산물의 수준이다. 일반적으로, 본원의 방법에서 상기 수준은 적어도 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월, 14 개월, 16 개월, 18 개월, 20 개월, 24 개월, 36 개월, 48 개월, 60 개월, 72 개월, 84 개월, 96 개월, 10 년, 15 년 또는 그 초과 동안 유지된다. 투여되는 전달되는 제제와 생산되는 산물의 양에 선형 관계가 있기 때문에, 이러한 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 투여량을 결정하는데 고려사항은 특정 유전자 치료 및 치료적 산물, 단백질 산물의 반감기, 이식유전자 산물의 발현에 사용되는 프로모터, 특정 전달되는 제제 및 기타 유사한 인자를 포함할 수 있다.

전달되는 제제가 비바이러스 핵산인 경우, DNA 또는 RNA의 유효한 투여량 양은 약 또는 0.005 mg/kg 체중 내지 약 또는 50 mg/kg 체중의 범위이다. 일반적으로, 투여량은 약 또는 0.005 mg/kg 내지 약 또는 20 mg/kg이고 더욱 일반적으로 약 또는 0.05 mg/kg 내지 약 또는 5 mg/kg이다. 예를 들어, 비바이러스 핵산(예를 들어, 플라스미드, 네이키드 DNA(naked DNA), siRNA, shRNA 또는 안티센스 핵산)에 대해, 0.01 mg 내지 2000 mg, 예컨대 0.05 mg 내지 1500 mg, 1 mg 내지 1000 mg, 10 mg 내지 1500 mg, 또는 100 mg 내지 lOOO mg이 전달된다.

전달되는 제제가 바이러스, 예컨대 아데노바이러스 또는 아데노 관련된 바이러스 또는 기타 바이러스에서, 투여량은 일반적으로 바이러스 입자(vp) 또는 플라크 형성 단위(plaque forming unit)(pfu)로 제공되고, 투여량은 일반적으로 1 x 10¹² 총 입자 또는 1 x 10¹² pfu 미만이고, 일반적으로 약 또는 10 내지 1 x 10¹² 입자, 10 내지 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10³ 내지 1 x 10¹² 입자, 예컨대 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 또는 1 x 10⁷내지 1 x 10⁹입자의 범위 또는 약 또는 10 내지 1 x 10¹² pfu, 10 내지 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10³내지 1 x 10¹²pfu, 예컨대 1 x 10⁶내지 1 x 10¹⁰ pfu, 또는 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁹ pfu의 범위이다. 나열된 것보다 더 낮거나 더 높은 용량이 필요할 수도 있다. 임의의 특정 대상체 또는 환자에 대한 특정 투여량 또는 치료 요법이 특정 유전자 치료 및 그것의 치료상의 산물, 특정 화합물 또는 제제의 활성, 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별, 식이, 투여 시간, 배설 비율(rate of excretion), 약물 조합, 질환, 상태 또는 증상의 심각도 및 추이(course), 대상체 또는 환자의 질환, 상태 또는 증상에 대한 기질(disposition), 투여의 방법 및 치료 의사의 판단을 포함하는, 다양한 요인에 따라 의존할 수 있다. 이것은 정확한 투여량을 결정하는 이 기술 분야의 숙련된 치료 의사의 수준 내에 있다.

일반적으로, 본원의 구획화된 방법을 사용하여, 핵산 분자, 예컨대 치료상의 핵산 분자의 최적의 전달을 달성하기 위해 기존의 방법과 비해 전달되는 제제의 현저하게 감소된 양이 투여될 수 있다. 또한, 투여되는 전달되는 제제의 양은 전달되는 제제의 용량과 생산되는 치료상의 산물 사이의 선형 관계로 인해 조절될 수 있다. 본원의 방법을 사용하는 결과는 동일한 전달되는 제제의 정맥 내로 투여에 의해 달성되는 것보다 전달되는 제제의 100 배까지 또는 그 미만이다. 예를 들어, 본원의 방법에서 투여되는 전달되는 제제의 양은 표적 기관 또는 조직으로 정맥 내로 투여되는 전달되는 제제의 동일한 양보다 10 배, 100 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 5000 배, 10000 배까지 또는 그 미만일 수 있다. 특정 전달되는 제제, 핵산 분자, 및 치료되는 질환 또는 상태 기초하여, 본원의 방법에서 투여되는 전달되는 제제의 특정 양을 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다.

당업자는 다양한 질환 또는 장애의 치료에 사용하기 위한 다양한 유전자 치료 벡터 및 제제의 적용에 익숙하다. 정맥 내 전달(또는 기타 투여 방법)에 의한 이 기술 분야의 기존의 프로토콜로 투여되는 제제의 투여량 및 양에 기초하여, 당업자는 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관 또는 이의 부분으로 실질 투여에서 사용을 위해 동일한 벡터 또는 제제의 투여량을 감소시켜서 바꿀 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스, 예컨대 그것의 게놈에 이종성(heterologous) 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노바이러스로 간 표적 된 유전자 치료에 대해, 75 kg의 평균 인간 대상체에 대해 약 1.5 x 10¹¹ vp 내지 4.5 x 10¹³ vp에 상응하는 약 또는 2 x 10⁹내지 6 x 10¹¹ vp/kg의 아데노바이러스의 투여량이, 인간에 투여되고 있고, 독성 및/또는 치사율 또는 비효율적인 간세포 전달에 기인하여 일반적으로 그다지 성공하지 않았다(Brunetti-Pierri 외 (2009) Molecular Therapy, 17:327-333). 본원의 방법에서, 예를 들어, 아데노바이러스, 예컨대 그것의 게놈에 이종성(heterologous) 핵산 분자를 포함하는 재조합 아데노바이러스는, 간 또는 기타 조직 또는 기관 또는 이의 부분에 1 x 10¹² vp 또는 1 x 10¹² pfu 미만으로, 그리고 일반적으로 1 x 10¹⁰ vp 미만 또는 1 x 10¹⁰ pfu 미만으로 투여된다. 예를 들어, 본원의 구획화된 방법을 사용하여, 1 x 10¹² vp 미만, 1 x 10¹¹ vp, 1 x 10¹⁰vp, 1 x 10⁹ vp, 1 x 10⁸vp, 1 x 10⁷vp, 1 x 10⁶ vp, 1 x 10⁵ vp, 1 x 10⁴ vp, 1 x 10³vp 또는 그 미만의 아데노바이러스가 간 표적화된(liver-targeted) 치료 방법으로 투여될 수 있다. 다른 예에서, 본원의 구획화된 방법을 사용하여, 1 x 10¹² pfu 미만, 1 x 10¹¹ pfu, 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10⁸pfu, 1 x 10⁷pfu, 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10⁵pfu, 1 x 10⁴pfu, 1 x 10³pfu 또는 그 미만의 아데노바이러스가 간 표적화된 유전자 치료 방법에 투여될 수 있다. 이러한 예에서, 상기 양은 인간 대상체에 투여되기 위한 것일 수 있다.

그것의 조성물의 제조 및/또는 투여량의 양의 결정의 목적으로 바이러스를 적정농도로 하는 방법은 이 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 역가(titer)는 바이러스 DNA 및 단백질의 농도를 측정하는, OD₂₆₀ 분석에 의해 결정될 수 있다. 성장 배지에서 혈청 및 기타 인자가 흡광도 판독을 방해할 수 있기 때문에, 이러한 분석을 수행하기 위해, 정제된 바이러스의 저장(stock)이 요구된다. 예를 들어, 바이러스는 CsCl 밀도 구배 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용하여 일정한 범위로 나누어져서(banding) 정제될 수 있다. 일반적으로, 바이러스의 희석이 만들어진다. mL당 시각적인 입자 단위(optical particle unit)(opu) 또는 바이러스 입자(viral particle)(vp)가 흡광도로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스에 대해, vp/mL는 OD₂₆₀ 흡광도와 함께 1.1 x 10¹²와 바이러스 희석 인자를 곱하여서 결정된다. OD₂₆₀분석은 살아있는 바이러스와 죽은 바이러스를 구분하지 않는다. 다른 예에서, 역가는 이 기술 분야에 알려진 표준 절차를 사용하여 플라크 분석을 수행함에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 단일 층에서 성장될 수 있는 세포, 예를 들어 293 세포는 적정하게(moderately) 높은 밀도(예를 들어, 약 또는 70% 이상)로 플레이팅(plating)되고 다양한 희석에서 바이러스 저장(stock)으로 감염된다. 세포의 감염 및 형질도입을 허용하기에 충분한 시간 후에, 아가로오스(agarose) 용액이 세포에 첨가된다. 세포의 용해에 의해 형성되는, 플라크(Plaque)는 며칠 동안 볼 수 있고 최대 10일까지 계수될 수 있다(일반적으로 플라크 영역을 구별할 수 있는 염료를 사용함). 역가가 희석 인자에 의해 플라크의 수를 나누어 mL 당 플라크 형성 단위(plaque forming unit)(pfu)로 계산될 수 있다. 추가 예에서, 종점 희석 분석(end-point dilution assay)이 사용될 수 있다. 이 분석은 희석의 더 큰 숫자(일반적으로 10^-3내지 10^-10)가 만들어지는 것을 제외하고는, 플라크 분석과 유사하다. 또한, 플라크를 식별하는 아가로오스 오버레이(agarose overlay) 대신에, 세포의 감염된 플레이트는 현미경으로 수동으로 시각화되어 세포변성 효과(cytopathic effect)(CPE)에 대한 벽(well)을 식별한다. 플레이트의 벽은 스피어만-카버(Spearman-Karber) 방법에 기초하여 종점 희석을 결정하여 획득될 수 있다(수치화될 수 있다).

투여량 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다. 용량의 빈도는 투여되는 제제, 대상체에서 질환 또는 상태의 진행, 및 기타 당업자에게 알려진 고려사항에 의존할 수 있다. 예를 들어, 전달되는 제제 또는 조성물은 1회, 또는 다중 투여 예컨대 적어도 약 또는 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회 또는 8회 투여로 전달될 수 있다. 치료는 또한 단일 표적 좌위(locus), 또는 다중 표적 좌위일 수 있다. 예를 들어, 전달되는 제제의 전달은 표적 부위당 단일 주입일 수 있고, 또는 표적 부위에 반복 주입일 수 있다. 예로서, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)과 같은 폐 질환의 치료에서, 대상체에 충분한 이식유전자 산물 및/또는 기능상의 향상을 달성하기 위해 다중 주입(multiple injection)으로 폐의 적어도 25%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%를 표적으로 하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 다중 주입 부위가 사용된다. 반복 주입은 연속적으로, 예컨대 이전 주사에 이어서 즉시, 또는 수분, 수시간, 수일 또는 수년에 걸쳐 지연되어 수행될 수 있다. 일부 예에서, 전달되는 제제는 특히, 형질도입 또는 발현의 높은 수준이 추구되는, 기관 또는 이의 부분에서 하나 초과의 좌위(locus)에 투여된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 첫 번째 투여 부위에 더하여, 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 다른 부위 또는 좌위에 투여된다. 다른 부위나 좌위는 표적 조직의 동일한 영역 또는 부분에서 첫 번째 부위의 인접한 또는 근처 부위일 수 있고, 여전히 동일한 표적 기관(예를 들어, 간 또는 폐의 다른 엽(lobe) 또는 영역)이나 첫 번째 좌위로부터 제거된 부위일 수 있다.

3. 구획화의 종결/방출

전달되는 제제의 전달 후에, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화가 전달되는 제제의 충분한 흡수를 하용하고/또는 전달되는 제제의 전신 순환(systemic circulation)으로의 노출을 최소화하기에 충분한 시간 기간 동안 유지된다. 예를 들어, 구획화는 전신 순환을 피하는 한편 세포로 전달되는 제제의 유입을 허용하기에 충분한 시간을 위한 것이다. 이 구획화의 효과는 독성 및 면역 활성이 최소화되는 것을 의미한다. 일반적으로, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화는 독성 및 면역 활성(예를 들어, 국소 또는 전신 사이토카인의 발현, 염증성 침윤 예컨대 호중구 및 림프구의 침윤, 및/또는 조직 효소에 의한 평가와 같은)을 제한하거나, 최소화하거나, 피하기 위해 유지된다. 투여되는 특정 전달되는 제제, 표적 조직 또는 기관 또는 이의 부분, 치료되는 대상체 또는 특정 적용을 포함하는 인자에 기초로 하여 구획화를 유지하는 정확한 시간 기간을 경험적으로 결정하는 것은 당업자의 수준 내이다. 면역 활성 및 독성과 관련되는 유전자 발현 및 파라미터(parameter)를 평가하는 방법 및 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 이러한 예시가 섹션 F에 기술된다.

본원의 예에서, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화의 지속(duration)은, 전달되는 제제의 10% 미만, 및 일반적으로 5% 미만, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만이 전신 순환으로 노출되는데 충분한 시간 기간 동안 유지된다. 전달되는 제제 또는 이식유전자 산물의 전신 수준을 평가하는 방법이 섹션 F에 제공된다. 또한, 실시예 2는 전신 순환, 예컨대 말초 혈액에서 전달되는 제제를 검출하는 분석을 예시한다.

본원의 예에서, 조직 기관 또는 이의 부분의 세포에 의해 선택되는 전달되는 제제의 80%, 85%, 90%, 또는 95% 또는 약 또는 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 또는 95% 초과의 세포 흡수를 허용하기 위해 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화의 지속이 유지된다. 예를 들어, 조직 또는 기관 또는 그것의 부분의 구획화의 지속은, 조직 또는 기관의 상주하는 세포(resident cell)에 의해 전달되는 제제의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 세포 내에서 존재하도록 유지된다. 예를 들어, 간으로 전달을 위해, 간 또는 이의 부분의 구획화의 지속은 간 세포에 의해 전달되는 제제의 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상이 세포 내에서 존재하도록 유지된다. 전달되는 제제의 세포 내 존재 및 국소화(localization)를 평가하는 방법이 섹션 F에 기술되어 있다.

본원에서 제공하는 방법은 조직 또는 기관 또는 이의 부분에서 장기간 유전자 발현을 60일 초과, 90일 초과, 6개월 초과, 7개월 초과, 8개월 초과, 9개월 초과, 10개월 초과, 11개월 초과, 12개월 초과, 18개월 초과, 24개월 초과 동안 달성할 수 있다. 일반적으로, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화는 적어도 1년 동안 유전자 산물의 발현을 달성하기에 충분한 시간 기간 동안 유지된다.

특정한 표적 기관 또는 조직 또는 이의 부분, 전달되는 제제, 및 전달에 사용되는 특정 방법을 포함하는 다양한 인자에 따라 구획화의 최적 지속이 달라질 수 있다. 예를 들어, 다른 조직 또는 기관의 상주하는 세포(resident cell)는 전달되는 제제의 세포 내 흡수(intracellular uptake)에 대한 다른 세포 내 이입 능력(endocytic ability)과 동력학(kinetics)을 나타낸다. 세포 내 이입 기능(endocytic function)은 특정 전달되는 제제에 따라 영향받을 수 있거나 다를 수 있다. 예를 들어, 전달되는 제제 즉 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스에 대한, 아데노바이러스 감염의 동력학(kinetics)은, 아데노바이러스 하위그룹 A, C-F에 대한 콕사키에 바이러스 (Coxsackie virus) B Ad 수용체(CAR)인, 그것의 수용체와의 결합 및 상호작용에 의해 개시된다. 일차 수용체에 대한 결합은 관련된 바이러스의 엔도사이토시스(endocytosis)를 매개한다. 형질도입 후(post-transduction) 1분 이내에, 일반적으로 약 2%의 바이러스가 세포 내(intracellular)이다. 분해된 아데노 바이러스는 엔도좀 내용물(endosomal content)의 세포질 내로의 방출에 의해 세포기질로 탈출한다. 형질도입 후 30분 이내 또는 전에, 바이러스의 약 80%가 세포 내이다. 더 분해시, 캡시드(capsid)가 세포질을 통해 이송되어서 마침내 바이러스 DNA를 세포 핵으로 전달한다. 형질도입 후(post-transduction) 60분 이내 또는 전에, 모든 이식유전자(transgene)가 핵으로 전달된다.

조직 또는 세포로 전달되는, 전달되는 제제는 상주하는 세포에 의해 흡수될 수 있는 것으로 이해된다. 필요한 경우, 전달되는 제제는 특정 세포에 의한 유입을 증가시키거나 매개하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, 이 기술 분야에서 아데노바이러스의 섬유 캡소머(fiber capsomer) 변형은 효율적인 바이러스 유입을 위해 세포 표적으로 바이러스 벡터의 부착(attachment)을 허용하는 것으로 공지되어 있다(예를 들어, Campos 외 (2007) Curr. Gene Ther., 7:189-204; Russell WC, (2009) J Gen. Virol, 90:1-20 참조). 또한, 세포 내 흡수의 시간 주기가 흡수를 촉진하는 제제의 사용으로 감소 될 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 제제는 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun), 초음파천공법(sonoporation), 리포플렉스(lipoplex), 폴리플렉스(polyplex), 세제(detergent), 또는 흡수 수용체의 전사를 증가시키는 제제 또는 화합물과의 제형 및 상기 기술된 바와 같이 당업자에게 공지된 기타 방법을 포함한다. 전달되는 제제의 세포, 예컨대 생체 내(in vivo) 조직 또는 기관의 상주하는 세포로의 유입의 동력학(kinetics)은, 당업자에게 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다(예를 들어, 섹션 F 참조).

또한, 혈관 구획화의 최적의 지속은 기관 또는 조직 또는 이의 부분, 및 그 안의 상주하는 세포의, 허혈 상태(ischemic condition)에 대한 내성(tolerance)에 의존할 수 있고, 본원의 방법에서 고려된다. 일부 기관 또는 조직은 다른 것보다 허혈 상태에 덜 내성을 나타낸다. 예를 들어, 간세포는 일반적으로 혈관 분리(vascular isolation)를 겪은 신경(neuron) 또는 심근세포(cardiomyocyte)보다 더 오래 독자 생존 가능하다. 간은 일반적으로 60분까지 동안 또는 초과 동안 혈류의 방해를 견딘다(Abdalla 외 (2004) Surg. Clin. N. Am, 84:563-585). 신장의 경우, 혈관 분리는 사실상 모든 핵산의 조직 세포에 의한 흡수를 허용하는 소정의 시간 동안 수행될 수 있다. 신장은 일반적으로 2시간까지 허혈(ischemia)의 기간을 견디지만, 일반적으로 1시간 이하 또는 30분 이하의 기간을 견딘다(Hoffman 외 (1974) AMA Arch. Surg., 109:550-551; Thompson 외 (2006) J. Urology, 177:471-476). 근육은 4시간까지 허혈(ischemia)을 견딘다(Blaisdell F. W. (2002) Cardiovascular Surgery, 10:620-630). 당업자는 충분한 세포의 흡수를 달성하고, 전신 노출을 최소화하고 가역적이거나 회복할 수 있는 기관 또는 이의 부분에 대한 허혈(ischemia)이 없거나 허용가능한 허혈을 초래하는, 시간 기간을 결정하기 위해 조직 또는 기관을 모니터하고 접근할 수 있다. 예를 들어, 디지털 광 처리(digital light processing)(DLP®) 초분광 영상(hyperspectral imaging)(HSI)이 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 "실시간" 조직의 산소화 맵(oxygenation map)을 구성하는데 사용될 수 있다(Best 외 (2011) Proc. SPIE, 7932, 793202).

특정 예에서, 본원의 방법에서 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화는 15분 초과 동안이다. 예를 들어, 상기 본원에 기술되는 대로 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화를 유지하는 시간 기간은 구획화의 개시 및/또는 전달되는 제제의 투여 다음에 적어도 또는 적어도 약 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 또는 120분 또는 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분, 65분, 70분, 75분, 80분, 85분, 90분, 95분, 100분, 105분, 110분, 115분, 또는 120분까지 동안이다. 흡수 또는 유입을 용이하게 할 수 있는 제제의 존재 하에서 구획화를 유지하는 시간 기간은 15분보다 짧을 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, 본원의 예에서, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화를 유지하는 시간 기간은 적어도 또는 적어도 약 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분 또는 그 이상 또는 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분까지이다. 어떤 양태에서, 구획화는 적어도 약 30분 또는 30분까지 유지된다. 일반적으로, 본원의 임의의 방법에서, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화는 60분보다 길지 않은, 예컨대 15분 초과이나 60분 미만이다.

예를 들어, 간 또는 이의 부분이 본원의 방법에 의해 구획화된 본원의 예에서, 간의 구획화를 유지하는 시간 기간은 구획화 및/또는 전달되는 제제의 투여의 개시 다음에 적어도 또는 적어도 약 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분 또는 60분 또는 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분 또는 60분까지 동안이다. 일반적으로, 본원의 임의의 방법에서, 간 또는 이의 부분의 구획화는 60분보다 길지 않은, 예컨대 적어도 또는 적어도 약 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분이나, 60분 미만 동안이다. 예를 들어, 구획화는 약 또는 15분 내지 60분, 약 15분 내지 50분, 약 15분 내지 40분, 약 15분 내지 30분, 약 20분 내지 60분, 약 20분 내지 40분일 수 있고, 일반적으로 약 또는 대략 30분 동안이다.

본원의 일부 예에서, 본원에서 제공되는 방법은 기관 또는 이의 부분으로부터, 또는 수술 부위로부터, 세포외(extracellular) 전달되는 제제(즉, 투여되는 전달되는 제제의 부분이나 구획된 기관 또는 이의 부분의 세포에 의해 흡수되지 않음)의 제거를 포함한다. 일단 기관 또는 이의 부분에 대한 일단 혈관 순환이 회복되면, 전신 순환(general circulation)에 도달할 전달되는 제제가 거의 없도록, 제거 단계(removal step)가 흡수(absorbing), 흡입(suctioning), 또는 수세(flushing)를 포함할 수 있다. 따라서, 기관 또는 이의 부분에 대한 혈관 순환을 회복하기 전에 제거 단계가 수행된다.

구획화의 기간 후에, 기관 또는 이의 부분에 대한 구획화가 종결된다. 이것은 전신 순환과 함께 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 소통(communication)을 회복함에 의해서 수행된다. 예를 들어, 기관 또는 이의 부분에 대한 혈관 순환을 회복함에 의해 구획화가 종결된다. 혈관 분리의 회복이 조직 또는 이의 부분에 대한 혈류를 차단하는 데 사용되는 장치, 기구 또는 공정의 제거에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 실질 클램프(parenchymal clamp)가 조직으로부터 방출될 수 있다. 다른 예에서, 조직의 영역 또는 부분의 압축이 방출될 수 있다. 근본적인 조직, 혈관, 정맥 또는 동맥, 또는 담관에 손상이 발생하지 않도록 조직 또는 기관 또는 이의 부분에 대한 혈류를 차단하는데 사용되는 장치, 기구 또는 공정을 주의 깊게 제거하는 것은 숙련된 의사의 수준 범위 내이다. 예를 들어, 실질의 클램프의 압력이 조직, 기관 또는 이의 부분에 대한 혈류의 회복을 조절하기 위해 주의 깊게 방출될 수 있다.

D. 전달되는 제제

본원의 방법, 용도 또는 조성물에서 사용을 위한 전달되는 제제는 임의의 원하는 핵산 분자, 또는 임의의 핵산 분자를 포함하는 비히클(vehicle), 구축물(construct) 또는 복합체(complex)일 수 있다. 특히, 전달되는 제제는 핵산 분자이거나 원하는 기능 또는 원하는 기능과 함께 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 전달되는 제제는 DNA (예를 들어, 이중 가닥 원형 또는 선형), RNA, 리보자임(ribozyme), 또는 앱타머(aptamer)일 수 있다. 또한 전달되는 제제는 네이키드 DNA(naked DNA), 마이크로RNA(microRNA), 짧은 간섭 RNA(small interfering RNA), 또는 안티센스 핵산을 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 형태일 수 있다. 전달되는 제제는 이종성 핵산 분자를 포함하는 구축물(construct)로 제공될 수 있다. 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 중 어느 하나로, 세포로의 핵산의 전달을 위한, 당업자에게 공지된 다수의 구축물(constructs)이 있다. 이러한 구축물은 바이러스 기반 전달 시스템 및 비바이러스 기반 전달 시스템을 포함한다. 예를 들어, 전달되는 제제는 나노입자(예를 들어, 표적화된 또는 방사선동위원소로 식별된(radiolabled) 나노입자), 플라스미드 또는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 발현 벡터)로 전달되는 핵산을 포함하는 구축물일 수 있다. 이러한 구축물은 당업계에 널리 공지되어 있고 본원에 기술된 조성물 및 방법과 함께 사용을 위해 쉽게 적응될 수 있다.

사용되는 전달되는 제제의 선택은 표적 조직 또는 기관 좌위(locus)에 의존하는 것으로 이해된다. 표적 조직 또는 기관 세포에 의한 세포 흡수와 호환되는 전달되는 제제 및/또는 전달 방법을 경험적으로 결정하고 식별하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 레트로바이러스-기반 벡터(retrovirus-based vector)는 일반적으로 단지 분열 세포를 활발하게 형질도입하는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 간 세포는 일반적으로, 휴지(quiescent)이고, 따라서 레트로바이러스-기반 벡터의 간 세포로의 전달은 세포 분열을 자극하는 단계를 포함하는 방법의 절차(예를 들어, 부분적인 간절제술(hepatectomy))를 필요로 한다. 반대로, 아데노 바이러스-기반 벡터는 비분열 세포로 전달될 수 있다.

특정 예에서, 본원의 방법에서 사용되는 전달되는 제제는 일반적으로 숙주 게놈으로 통합(integration)되지 않고 복제를 허용하는 서열을 포함하지도 않는 것이다. 게놈으로의 통합의 부재하에, 본원에서 제공되는 구획화된 전달 방법은 도입된 핵산 분자의 지연된 유전자 발현을 6개월 초과 동안, 일반적으로 1년까지 또는 1년 초과 동안 달성한다. 그러나, 원하는 경우, 게놈으로 통합된 핵산이 본원의 방법에서 사용될 수 있다.

1. 핵산 분자

본원의 방법, 용도 또는 조성물에 사용되는 특정 전달되는 제제는 핵산 분자이거나 또는 이를 포함할 수 있고 이에 의해 표적 기관에 존재할 때 또는 혈류로 분비될 때 그것의 전달 및/또는 발현이 유용한 활성 또는 특성을 가져온다. 예를 들어, 핵산 분자의 전달 및/또는 발현은 유전자 산물의 결실 또는 결손(예를 들어, 부분적으로 또는 비기능)의 대체를 가져오거나, 유전자 산물의 과잉 생산을 달성하거나, DNA 백신으로 작용하거나, 원하는 효과 또는 치료상의 활성을 가지는 폴리펩티드는 암호화하거나, 유전자 발현을 억제한다. 예를 들어, 핵산 분자는 원하는 효과 또는 치료상 결과를 위한 폴리펩티드를 암호화하기 위해 선택되는 것일 수 있다. 다른 예에서, 핵산 분자는 유전자 또는 유전자 산물의 핵산-기반(nucleic acid-based) 저해제, 예컨대 유전자의 전사 또는 번역의 저해제이다. 예를 들어, 전달되는 제제는 짧은-간섭 RNA(siRNA) 서열, 안티센스 서열 또는 마이크로-RNA(miRNA) 서열일 수 있다. 추가 예에서, 전달되는 제제는 예방에 대한 단백질(prophylaxic protein)을 예방적으로 전달하는데 사용될 수 있다. 추가의 예에서, 핵산 분자의 전달 및/또는 발현은 농업 적용에 대한 사용을 위해, 예를 들어, 고기 생산을 향상시키기 위해(예를 들어, 미오스타틴(myostatin)의 생산을 차단함으로써) 단백질을 암호화할 수 있다. 특정 적용 또는 치료되는 특정 질환 또는 장애, 예컨대 섹션 G에 기재된 임의의 것에 의존하여, 핵산 분자의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.

핵산 분자는 네이키드 DNA(naked DNA)로서 전달될 수 있거나, 또는 비히클(vehicle) 내 또는 복합체(complex) 또는 구축물(construct)로서 전달될 수 있다. 따라서, 전달되는 제제는 핵산 분자이거나 이를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자는 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 플라스미드, 예컨대 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 핵산 분자는 리포좀에 캡슐화될 수 있다. 핵산 분자는 다른 제제, 예컨대 표적 리간드 또는 다른 모이어티와 복합체화 될 수 있고, 나노입자로 전달될 수 있다.

핵산 분자는 발현을 제어하거나 조절하는 프로모터 내지 인핸서에 의해 구동될 수 있다. 프로모터는 코딩(coding) 영역과 작동가능하게 연결되어 있다. 당업자에게 공지된 임의의 강력한 프로모터는 DNA의 발현을 구동하기 위해 사용될 수 있다. 프로모터는 구성적 프로모터, 예컨대 CMV 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 유도성 또는 조절가능한 프로모터일 수 있다. 특정 양태에서, 유전자 치료의 목적으로 도입되는 핵산 분자는 전사의 적절한 유도인자의 유무를 조절함으로써 핵산의 발현이 조절가능 하도록, 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함한다. 일반적으로 프로모터는, 암호화된 폴리펩티드의 조절되는 발현을 허용하는, 조절되는 프로모터 및 전사 인자 발현 시스템, 예컨대 공개된 테트라사이클린 조절되는 시스템(tetracycline-regulated system) 또는 기타 조절 가능한 시스템(예를 들어, 공개 국제 PCT 출원번호 WO 01/30843호 참조)이다. 다른 프로모터의 예시는, 예컨대 예를 들어, α태아단백질(αfetoprotein), DF3, 티로시나제(tyrosinase), CEA, 계면활성제 단백질 및 ErbB2 프로모터를 포함하는, 미국 특허번호 제5,998,205호에 기술된, 조직 선택적인 프로모터이다. 예시의 조절가능한 프로모터 시스템은 사용가능한 테트-온(Tet-On)(및 테트-오프(Tet-Off)) 시스템이고, 예를 들어, 클론테크(Clontech)(팔로 알토(Palo Alto), CA)로부터 사용가능하다. 이 프로모터 시스템은 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유도체 예컨대, 독시사이클린(doxycycline)에 의해 조절되는 이식유전자의 조절되는 발현을 허용한다. 기타 조절가능한 프로모터 시스템이 공지되어 있다(예를 들어, 리간드 결합 도메인 및 전사 조절 도메인, 예컨대 호르몬 수용체 유래의 것을 포함하는 유전자 스위치를 기술하는 "단일-사슬, 단량체, 리간드 의존적 폴리펩티드 스위치를 사용하는 유전자 발현의 조절" 제목의 미국 공개번호 제2002-0168714호 참조). 다른 사용될 수 있는 적합한 프로모터는 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(adenoviral major late promoter) 및/또는 E3 프로모터; 이종성 프로모터(heterologous promoter), 예컨대 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV) 프로모터; 라우스육종바이러스(Rous Sarcoma Virus)(RSV) 프로모터; 유도가능한 프로모터, 예컨대 MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터(metallothionein promoter); 열 충격 프로모터(heat shock promoter); 알부민 프로모터; 및 ApoAI 프로모터를 포함을 사용하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 예에서, 본원의 방법, 용도 또는 조성물에서 전달되는 제제는 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자이거나 이를 포함한다. 본원의 방법에서 전달되는 제제의 전달시에, 암호화된 폴리펩티드는 생물학적 치료 또는 약물로서 사용될 수 있는 것일 수 있다. 핵산 분자는 임의의 원하는 유전자 산물, 예컨대 사이토카인, 응혈 인자(clotting factor) 또는 응고 인자(coagulation factor), 호르몬, 성장 인자, 효소, 수송 단백질, 조절성 단백질, 수용체, 또는 항원을 암호화할 수 있다. 핵산 분자는 세포 성장, 세포 분화 또는 대사를 조절하는 호르몬 단백질을 암호화할 수 있다. 원하는 치료상 폴리펩티드를 암호화하는 특정 핵산 단백질의 선택은 치료되는 특정 질환 또는 상태에 의존하고, 당업자의 수준 내에 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 치료되는 대상체가 타입 I 당뇨병을 가지는 경우, 인슐린, 대상체가 혈우병(hemophilia)을 가지는 경우 특정 혈액 응혈 인자, 대상체가 파킨슨병(Parkinson's Disease)을 가지는 경우 도파민, 치료될 대상체가 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia)을 가지는 경우 LDL 수용체를 암호화한다. 당업자는 치료되는 대상체의 특정한 필요에 기초하여 필요한 폴리펩티드 및 그것을 암호화하는 핵산을 선택하는 방법을 알 것이다. 예시적인 핵산 분자는 면역조절 단백질(immunomodulatory protein), 효소, 호르몬, 사이토카인, 수용체, 항체 또는 항혈관신생(anti-angiogenic) 제제를 암호화한다. 핵산 분자는 융합 단백질인 단백질을 암호화할 수 있다.

선택되는 핵산 분자는 면역자극성 단백질이거나 또는 면역조절 특성을 나타내는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 이러한 핵산 분자는 사이토카인, 예를 들어, 인터류킨, 인터페론, 과립구 콜로니 자극성 인자(granulocyte colony stimulating factor) 또는 그것의, 예컨대 인터류킨 (IL)-l, IL-2, IL-4, IL-5, IFN-β, IFN-γ, IFN-α, TNF, IL-12, IL-18, 및 flt3를 암호화하는 유전자; 면역 세포와 상호작용을 자극하는 단백질(B7, 분화 클러스터 28(cluster of differentiation 28)(CD28), 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(major histocompatibility complex class I)(MHC class I), MHC 클래스 II, 항원 처리와 관련된 트랜스포터(Transporter associated with antigen processing)(TAP)); 종양 관련된 항원(T-세포 1에 의해 인식되는 흑색종 항원(MART-1)으로부터 유래한 면역원성 폴리펩티드, gplOO(멜라닌세포(Melanocyte) 단백질 pmel-17); 티로시나제, 티로시나제 관련 단백질 1, 티로시나제 관련 단백질 2, 멜라닌세포 자극성 호르몬 수용체, 흑색종 관련된 항원 1(MAGE1), MAGE2, MAGE3, MAGE12, B 흑색종 항원(B melanoma antigen)(BAGE), 암-생식 항원(cancer-germline antigens)(GAGE), 암-고환 항원(cancer-testis antigen NY-ESO-l, β-카테닌(β-catenin), 변이된 흑생종 관련된 항원(Mutated melanoma-associated antigen 1)(MUM-1), 사이클린 의존적 키나제 4(cyclin-dependent kinase 4)(CDK-4), 카스파제 8(caspase 8), 단일클론 항체 Ki-67(KIA)0205에 의해 식별되는 항원, 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen)(HLA)-A2R1701, α-태아단백질(α-fetoprotein), 텔로머라제 촉매 단백질(telomerase catalytic protein), G-250, 뮤신 1(mucin 1)(MUC-1), 암태아성 단백질(carcinoembryonic protein), p53, Her2/neu, 3탄당인산 이성질체화효소(triosephosphate isomerase), 세포 분열 조절 단백질 27(cell division control protein 27)(CDC-27), 저밀도 지질 수용체-GDP-l-푸코오스(low density lipid receptor-GDP-l-fucose):β-d-갈락토시드 2-α-l-푸코실전달효소 융합 단백질(β-d-galactoside 2-α-l-fucosyltransferase fusion protein)(LDLR-FUT), 텔로머라아제 역전사효소(telomerase reverse transcriptase), 및 전립성 특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen)(PSMA)), 억제성 신호를 차단하는 항체(세포독성 T-림프구 항원 4 (CTLA4) 봉쇄)를 암호화하는 cDNA, 케모카인(chemokine)(대식세포 염증성 단백질(MIP1), MIP3, CCR7 리간드, 및 칼레티쿨린(calreticulin)), 및 기타 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

핵산 분자는 성장인자 또는 수용체에 결합하는 이의 부분 또는 성장인자 수용체 또는 리간드가 결합하는 이의 부분인 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 성장인자 또는 성장인자 수용체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Baxley 및 Serra, Curr. Drug Targets 11(9): 1089-102 (2010); Lo, Curr. Mol. Pharmacol. 3(l):37-52 (2010); Barakat 및 Kaiser, Expert Opin. Investig. Drugs 18(5):637-46 (2009); Trojanowska 및 Varga, Curr. Opin. Rheumatol. 19(6):568-73 (2007); Jimeno 및 Hidalgo, Biochim. Biophys. Acta 1766(2):217-29 (2006); Finch 및 Rubin, J. Natl. Cancer Inst. 98(12):812-24 (2006); Lo 외, Breast Cane. Res. Treat. 95(3):21 1-8 (2006); Schilephake, Int. J. Oral Maxillofac. Surg. 31(5):469-84 (2002); George, Urology 60(3 Suppl.1):115-21(2002) 참조. 성장 인자는, 예를 들어, 골 형태형성 단백질(bone morphogenic protein)(BMP), 표피 성장 인자(epidermal growth factor)(EGF), 에리트로포이에틴(erythropoietin)(EPO), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor)(FGF), 과립구 콜로니 자극성 인자(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극성 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor)(GM-CSF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)(HGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor)(IGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor) (PDGF), 형질전환 성장 인자 α및 β(transforming growth factor αand β), 및 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)(VEGF)를 포함한다. 성장 인자 수용체는 예를 들어, 표피 성장 인자 수용체(EGFR), 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR), 또는 형질전환 성장 인자 수용체(TGFR)를 포함한다.

핵산 분자는 단일 사슬 항체 또는 항특발성(anti-idiopathic) 항체를 포함하는, 항체 또는 항체 단편인 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 항체는 이 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Brekke 및 Sandlie, Nat. Rev. Drug. Discov. 2(l):52-62 (2003); Mellstedt, Drugs Today 39(Supl. C): l-16 (2003); Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols; Ed. Dimitrov, A. S., Humana Press, Springer, New York, NY (2009); Zheng 외 (2007) Cell Research, 17:303-306 참조. 암호화된 항체 또는 이의 단편의 비제한적인 예시는, 예를 들어, 항흉선세포 글로불린(anti-thymocyte globulin), 무로모나브(muromonab), 압식시맙(Abciximab), 아달리무맙(Adalimumab), 아렙투주맙(Alemtuzumab), 바시리시맙(Basiliximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세투시맙(Cetuximab), 셀토리주맙(Certolizumab), 다크리주마(Daclizuma), 에쿠리주맙(Eculizumab), 에팔리주맙( Efalizumab), 겜투주맙(Gemtuzumab), 이브리투모맙 튜세탄(Ibritumomab tiuxetan), 인플리시맙(Infliximab), 뮤로모납-CD3(Muromonab-CD3), 나탈리주맙(Natalizumab), 오마리주맙(Omalizumab), 파리비주맙(Palivizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 라니비주맙(Ranibizumab), 리투시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab) 또는 트라스투주맙(Trastuzumab)를 포함한다.

핵산 분자는 폴리펩티드 즉, 효소(예를 들어, 갈설파제(galsulfase), 라로니다제(laronidase), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제(N-acetylgalactosamine 6-sulfatase), 페닐알라닌 암모니아 리아제(phenylalanine ammonia lyase), 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 이미글루세라제(imiglucerase), 알글루코시다제 알파 (alglucosidase alpha), 호르몬(예를 들어, 갑상선 자극 호르몬(thyrotropin), 성장 호르몬(growth hormone), 인슐린, 갑상선 호르몬(thyroid hormone), 에리트로포이에틴(erythropoietin)), 혈관신생 조절자(angiogenesis modulator), 면역조절자(immunomodulator)(데니루킨 디프티톡스(denileukin diftitox); 인터류킨-2(interleukin-2)), 통증 조절자(pain modulator)(예를 들어, NP2), 융합 단백질(fusion protein)(예를 들어, 인슐린유사 성장 인자 2 및 산 알파 글루코시다제(insulinlike growth factor 2 and acid alpha glucosidase)(IGF2-GAA); 아바타셉트(abatacept); 알레파셉트(alefacept); 에타너셉트(etanercept)), 폴리 (ADP-리보오스) 폴리머라제(poly (ADP-ribose) polymerase)(PARP) 저해제, 하이란(hylan) 또는 기타 히알루로난(hyaluronan) 유도체, 또는 알러젠(allergen)(예를 들어, 땅콩 또는 기타 음식 알러젠)이나 이에 제한되지 않는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다.

예를 들어, 핵산 분자는 인간 에리트로포이에틴(erythropoietin) 또는 이의 변이체(예를 들어, 미국 특허번호 제4,703,008호, 수탁번호 P01588 참조), 인간 G-CSF 또는 이의 변이체(예를 들어, 수탁번호 P09919 참조); 인간 GM-CSF 또는 이의 변이체 (예를 들어, Cantrell 외(1985) Proc. Natl. Acad. Sci, 82:6250-4; 수탁번호 P04141 참조); 플라스미노겐 활성자(plasminogen activator) 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P00750 참조); 유로키나제(urokinase) 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P00749 참조); 인슐린 또는 이의 변이체 (예를 들어, 미국 특허번호 제4,652,525호, 미국 특허번호 제4,431,740호, Groskreutz 외(1994) J. Biol. Chem., 269:6241-5, 수탁번호 P01308 참조); 인터류킨(interleukin) 예컨대 인터류킨-l 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P01583, P01584 참조), 인터류킨-2 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P60568, 미국 특허번호 제4,738,927호 참조), 인터류킨-3 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P08700, 유럽 공개번호 EP275,598호 또는 제282,185호 참조), 인터류킨-4 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P05112 참조), 인터류킨 7 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P13232, 미국 특허번호 제4,965,195호 참조), 인터페론(interferon) 또는 이의 변이체, 인자 VIII(Factor VIII) 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P00451 참조), 인자 IX(Factor IX) 또는 이의 변이체 (예를 들어, P00740 참조), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor) 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P04275 참조), 또는 인간 성장 호르몬 또는 이의 변이체 (예를 들어, 수탁번호 P01241, P01242, 미국 특허번호 제4,342,832호 참조)를 암호화할 수 있다.

관심의 다른 핵산 분자는, 항혈관신생(anti-angiogenic) 또는 자살 단백질(suicide protein)을 암호화하는 것을 포함한다. 항혈관신생 단백질을 예를 들어, METH-1, METH-2, TrpRS 단편, 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein), 프로락틴(prolactin) 단편, PEDF, 바소스타틴(vasostatin), 세포외 기질 단백질의 다양한 단편 및 성장 인자/사이토카인 저해제를 포함한다. 세포외 기질 단백질의 다양한 단편은, 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 키니노스타틴(kininostatin), 피브리노겐-E(fibrinogen-E) 단편, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 툼스타틴(tumstatin), 캔스타틴(canstatin), 및 레스틴(restin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 성장 인자/사이토카인 저해제는 VEGF/VEGFR 길항제, sFlt-1, sFlk, sNRPl, 안지오포이에틴/타이(angiopoietin/tie) 길항제, 에스타이-2(sTie-2), 케모카인(chemokine)(IP-10, PF-4, 그로-베타(Gro-beta), IFN-감마(Mig), IFN, FGF/FGFR 길항제(sFGFR), 에프린/에프(Ephrin/Eph) 길항체(sEphB4 및 세프린B2(sephrinB2)), PDGF, TGF 및 IGF-1을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 자살 단백질은 디프테리아 독소 A(diphtheria toxin A)의 발현과 같이 세포 사멸을 야기할 수 있는 단백질이거나, 또는 상기 세포의 발현이 세포가 어떤 약물에 선택적으로 민감하게 하는, 예를 들어 허피스 심플렉스 티미딘 키나제(herpes simplex thymidine kinase)(HSV-TK)의 발현이 세포를 항바이러스 화합물, 예컨대 아시클로버(acyclovir), 간시클로버(ganciclovir) 및 FIAU(l-(2-디옥시-2-플루오로-β-D-아라비노푸라노실-5-아이오도우라실(l-(2-deoxy-2-fluoro-β-D-arabinofuranosil)-5-iodouracil))에 민감하게 한다. 기타 자살 단백질은 카복시펩티다제 G2(carboxypeptidase G2)(CPG2), 카복실에스터라제(carboxylesterase)(CA), 사이토신 데아미나제(cytosine deaminase)(CD), 사이토크롬 P450(cytochrome P450)(cyt-450) 데옥시사이티딘 키나제(deoxycytidine kinase)(dCK), 니트로리덕타제(nitroreductase)(NR), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(purine nucleoside phosphorylase)(PNP), 티미딘 포스포릴라제(thymidine phosphorylase)(TP), 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제(varicella zoster virus thymidine kinase)(VZV-TK), 및 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase)(XGPRT)를 포함한다. 기타 암호화된 단백질은, 안전 스위치(safety switch)로 유용한, 허피스 심플렉스 티미딘 키나제(herpes simplex thymidine kinase)(HSV-TK)(PCT 공개번호 WO 99/25860호로 공개된, 1997.11.19 제출된 미국 특허출원번호 제08/974,391호 참조), Nos, FasL, 및 sFasR(가용성 Fas 수용체)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본원의 다른 예에서, 핵산 분자는 리소좀 저장 장애(lysosomal storage disorder), 특히 아스파르틸글루코사미니다제(Aspartylglucosaminidase), α-갈락토시다제 A(α-Galactosidase A), 팔미토일 단백질 티오에스터라제(Palmitoyl Protein Thioesterase), 트리펩티딜 펩티다제(Tripeptidyl Peptidase), 리소좀 막관통 단백질(Lysosomal transmembrane protein), 시스테인 수송자(cysteine transporter), 산 세라미다제(acid ceramidase), 산 α-L-푸코시다제(acid α-L-fucosidase), 보호적 단백질(protective protein)/카텝신 A(cathepsin A), 산 β-글루코시다제(acid β-glucosidase) 또는 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 산 β-갈락토시다제(acid β-galactosidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), α-L-이두로니다제(α-L-Iduronidase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase), 산 α-만노시다제(acid α-mannosidase), 산 β-만노시다제(acid β-mannosidase), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(N-Acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(N-Acetlylglucosamine-1-phosphotransperase), 산 스핑고미엘리나제(acid-sphingomyelinase), 니이만-픽병(Niemann-Pick disease), 유형 CI (NPC-1), β-헥소사미니다제 B(β-Hexosaminidase B), 헤파란 N-설파타제(Heparan N-sulfatase), α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-Acetylglucosaminidase)(NaGlu), 아세틸-CoA:α글루코사미닌드 N-아세틸 트랜스퍼라제(Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase), N-아세틸 글루코사민-6-설페이트 설파타제(N-Acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase), β-글루쿠로니다제(β-Glucuronidase), 및 산 리파제(acid lipase)를 포함하나 이에 제한되지 않는 결손이 있는 효소와 관련된 단백질을 암호화하는 것이다. 다양한 리소좀 저장 질환에서 이러한 효소의 역할이 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 미국 공개번호 US2008/0025952호; US20120009268호 참조). 효소의 선택은 특정 리소좀 질환에 의존한다. 관심의 핵산 분자의 비제한적인 예시는 점액다당류증(mucopolysaccharidosis) 장애(예를 들어, 슬라이-증후군(Sly syndrome))을 치료하기 위한 β-글루코로니다제(β-glucoronidase); 후를러 증후군(Hurler Syndrome)을 치료하기 위한 α-L-이두로니다제; 샤이 증후군(Scheie Syndrome) 또는 후를러 샤이 증후군(Hurler-Scheie Syndrome)을 치료하기 위한 α-L-이두로니다제; 헌터 증후군(Hunter's Syndrome)을 치료하기 위한 이두로네이트 설파타제(iduronate sulfatase); 산필립포 증후군 A(Sanfilippo Syndrome A)(MPSIIIA)을 치료하기 위한 헤파린 설파미다제(heparin sulfamidase); 산필립포 증후군 B(Sanfilippo Syndrome B)(MPSIIIB)을 치료하기 위한 α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-Acetylglucosaminidase); 산필립포 증후군 C(Sanfilippo Syndrome C)(MPSIIIC)을 치료하기 위한 아세틸-CoA:α-글루코사미닌드 N-아세틸 트랜스퍼라제(Acetyl-CoA:α-glucosamininde); 산필립포 증후군 D(Sanfilippo Syndrome D)(MPSIIID)를 치료하기 위한 N-아세틸글루코사민-6-설파타제(N-Acetylglucosamine-6-sulfatase); 모르쿠오 증후군 A(Morquio Syndrome A)를 치료하기 위한 갈락토오스-6-설페이트 설파타제(galactose-6-sulfate sulfatase); 모르쿠오 증후군 B(Morquio Syndrome B)을 치료하기 위한 β-갈락토시다제(β-galactosidase); 마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy Syndrome)을 치료하기 위한 N-아세틸갈락토사민-4-설파타제(N-acetylgalactosamine-4-sulfatase); 파브리병(Fabry disease)을 치료하기 위한 α-갈락토시다제(α-galactosidase); 고셔병(Gaucher's disease)을 치료하기 위한 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 또는 글리코겐 저장 장애(glycogen storage disorder)(예를 들어, 폼페병(Pompe disease))을 치료하기 위한 리소좀산 α-글루코시다제(lysosomal acid α-glucosidase)를 암호화하는 임의의 것을 포함한다.

다른 관심의 예시적인 핵산 분자는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)을 치료하기 위한 단백질 예컨대, 메탈로엔도펩티다제(metalloendopeptidase), 예를 들어, 아밀로이드-베타 분해 효소 네프릴리신(neprilysin), 인슐린 분해 효소 인슐리신(insulysin), 또는 티멧 올리고펩티다제(thimet oligopeptidase); 바이러스 감염, 예컨대 인간 면역결핍성 바이러스(HIV)에 의한 감염을 치료하기 위한 항레트로바이러스 제제, 예를 들어, 엔푸버타이드(enfuvirtide)(푸제온®)와 같이 작용하는 단백질 또는 펩티드; 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)(ALS)을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 비제한적으로, 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), 칼빈딘 D28(calbindin D28), 파발부민(parvalbumin), HIF1-알파, SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2, GDNF 또는 모양체 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor)(CNF); 혈우병(hemophilia)을 갖는 대상체에서 결핍되는 단백질, 예컨대, 비제한적으로, 인자 Ⅷ 또는 인자 IX; 타입 I 당뇨병을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 퓨린 분해성(furin-cleavable) 인슐린 유전자; 가족성 고콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia)을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 저밀도 지단백 수용체(LDLR); 지단백 리파제 결핍(lipoprotein lipase deficiency)(LPLD)을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 지단백 리파제(LPL); 알파-1-항트립신(AAT) 결핍을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 AAT; 크리글러-나자르 증후군 타입 I 또는 타입 II(Crigler-Najjar syndrome type I or Type II)을 치료하기 위한 단백질, 예컨대 간 빌리루빈 UDP-글루쿠로닐-트랜스퍼라제(UDP-glucuronyl-transferase) 또는 그것의 기능성 변이체, 예를 들어, UGTlA1 (Gong 외 (2001) Pharmacogentics, 11:357-68); 글리코겐 저장 결핍 타입 1A를 치료하기 위한 단백질, 예컨대 글루코스-6 포스파타제(glucose-6 phosphatase); Pepck 결핍을 치료하기 위한 단백질 예컨대 포스포에놀피루베이트-카복시키나제(phosphoenolpyruvate-carboxykinase); 갈락토스혈증(galactosemia) 관련된 단백질 예컨대 갈락토스-1 포스페이트 유리딜 트랜스퍼라제(galactose-1 phosphate uridyl transferase); 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)과 관련된 단백질 예컨대 페닐알라닌 히드록실라제(phenylalanine hydroxylase), 단풍시럽뇨병(maple syrup urine disease)과 관련된 단백질 예컨대 분지쇄 알파-케토산 데히드로지나제(branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase); 티로신혈증 타입 1(tyrosinemia type 1)과 관련된 단백질 예컨대 퓨마릴아세토아세테이트 히드롤라제(fumarylacetoacetate hydrolase); 메틸말론산혈증(methylmalonic acidenia)을 치료하기 위한 단백질 예컨대 메틸말로닐-CoA 뮤타제(methylmalonyl-CoA mutase); 오르니틴 트랜스카바밀라제(ornithine transcarbamylase) 결핍과 관련된 단백질 예컨대 오르니틴 트랜스카바밀라제; 시트룰린혈증(citrullinemia)과 관련된 단백질 예컨대 아르지노숙신산 신테타제(argininosuccinic acid synthetase); 심각한 복합된 면역결핍성 질환과 관련된 단백질 예컨대 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase); 통풍(Gout) 및 레쉬-니한 증후군(Lesch Nyan syndrome)과 관련된 단백질 예컨대 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hyposanthine guanine phosphoribosyl transferase); 비오티니다제(biotinidase) 결핍과 관련된 단백질 예컨대 비오티니다제; 고셔병(Gaucher's disease)과 관련된 단백질 예컨대 베타-글루코세레브로시다제(beta-glucocerebrosidase); 슬라이 증후군(Sly syndrome)과 관련된 단백질 예컨대 베타-글루로니다제(beta-gluronidase); 젤위거 증후군(Zellweger syndrome)과 관련된 단백질 예컨대 퍼옥시좀 막 단백질 70 kDa; 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria)과 관련된 단백질 예컨대 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase, PBDG); 알파-1 항트립신 결핍(기종(emphysema))과 관련된 단백질 예컨대 알파 1 항트립신, 암과 관련된 단백질 예컨대 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene) 예컨대 p53; 파킨슨 병(Parkinson's disease)을 치료하기 위한 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase)(GAD)를 암호화하는 단백질; 또는 리소좀 저장 질환, 특히 산필립포 증후군(Sanfilippo Syndrome)(점액다당류증 타입 III(Mucopolysaccharidosis type III) MPSIII로도 지칭됨)에서 결핍된 단백질, 예컨대 리소좀 설파미다제(lysosomal sulfamidase), 및 α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-acetylglucosaminidase)(NaGlu)를 암호화하는 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

대안적으로, 치료상의 핵산은 RNA의 수준에서, 예를 들어, 안티센스 메세지(antisense message) 또는 리보자임(ribozyme), 스플라이싱(splicing) 또는 3' 가공(processing) (예를 들어, 폴리아데닐화(polyadenylation))에 영향을 미치는 단백질, 또는 세포 내 다른 유전자의 발현의 수준에 영향을 미치는 단백질을 암호화함에 의해, 예를 들어, mRNA 축적의 변경된 비율, mRNA 수송의 변경, 및/또는 전사후 조절의 변화를 매개함에 의해 그것의 효과를 발휘할 수 있다. 이것들은 RNA, 예컨대 RNAi 및 기타 이중가닥 RNA, 안티센스 및 리보자임을 포함하고 다른 기능(capability) 중에 증식에 필수적인 단백질, 예컨대 구조 단백질을 암호화하는 mRNA, 전사인자, 중합효소(polymerase), 세포독성 단백질을 암호화하는 유전자, 뉴클레아제(nuclease)(예를 들어, RNase A) 또는 프로테아제(예를 들어, 트립신(trypsin), 파파인(papain), 프로티나제 K(proteinase K) 및 카르복시펩티다제(carboxypeptidase))의 조작된 세포질 변이체를 암호화하는 유전자로 향할 수 있다.

예를 들어, 핵산 분자는 유전자 또는 유전자 산물의 핵산-기반 저해제, 예컨대 유전자의 전사 또는 번역의 저해제일 수 있다. 전달되는 제제는 짧은 간섭 RNA(short-interfering RNA)(siRNA) 서열, 안티센스 서열 또는 마이크로-RNA (miRNA) 서열일 수 있다. RNA는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이, 예컨대 19-25 또는 21-25 뉴클레오티드 길이일 수 있다. siRNA-매개된 유전자 침묵(silencing) 방법, 여기서 유전자의 발현 산물이 5' 번역되지 않은(UT) 영역, ORF, 또는 3' UT 영역을 포함하는, 표적 유전자 전사체(transcript)의 뉴클레오티드 구역(segment)(예를 들어, 적어도 19-25 뉴클레오티드 길이 구역)에 상보적인 특이적인 이중 가닥 유래된 siRNA 뉴클레오티드 서열에 의해 표적화됨이 이 기술분야에 공지되어 있다(예를들어, PCT 국제 특허공개번호 WO00/44895호, WO01/75164호, WO01/92513호, 또는 WO01/29058호 참조. siRNA 서열은 일반적으로 정확한 상보성(complementarity)으로 표적 mRNA 내에 고유 서열에 결합하고 표적 mRNA 분자의 분해를 야기한다. siRNA 서열은 mRNA 분자 내 어디든 결합할 수 있다. siRNA에 의해 표적화되는 서열은 관심의 폴리펩티드를 발현하는 유전자, 또는 이러한 유전자의 상류(upstream) 또는 하류(downstream) 조절인자(modulator)를 포함한다. 유전자의 상류 또는 하류 조절인자의 예시는 유전자 프로모터에 결합하는 전사인자, 관심의 폴리펩티드, 및 관심의 폴리펩티드에 영향을 줄 수 있는 조절 경로에 관여하는 폴리펩티드와 상호작용하는 키나제(kinase) 또는 포스파타아제(phosphatase)를 포함한다. miRNA 서열은 일반적으로 정확한 또는 덜 정확한 상보성으로 표적 mRNA 내에 고유 서열에 결합하고 표적 mRNA 분자의 번역 억제를 야기한다. miRNA 서열은 mRNA 서열 내 어디든 결합할 수 있지만, 일반적으로 mRNA 분자의 3' 번역되지 않은 영역 내에 결합한다.

뉴클레오티드 siRNA 또는 miRNA 서열(예를 들어, 21-25 뉴클레오티드 길이)은, 예를 들어, siRNA 또는 miRNA 서열 중 어느 하나를 생성하는 세포의 RNAi 기구(machinery)에 의해 연속하여 처리되는, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 서열, 더 긴 (예를 들어, 60-80 뉴클레오티드) 전구체 서열의 전사에 의한 발현 벡터로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오티드 siRNA 또는 miRNA 서열 (예를 들어, 21-25 뉴클레오티드 길이)은, 예를 들어, 화학적으로 합성될 수 있다. siRNA 또는 miRNA 서열의 화학적 합성은 다마콘 주식회사(Dharmacon,Inc.)(라파예트(Lafayette),CO), 퀴아젠(Qiagen)(발렌시아(Valencia),CA), 및 앰비온(Ambion)(오스틴(Austin),TX)과 같은 기업으로부터 상업적으로 사용가능하다. siRNA 또는 miRNA 분자를 전달하는 방법이 이 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, Oh and Park, Adv. Drug. Deliv. Rev. 61(10):850-62 (2009); Gondi and Rao, J. Cell Physiol. 220(2):285-91 (2009); 및 Whitehead 외. , Nat. Rev. Drug. Discov. 8(2): 129-38 (2009) 참조.

예를 들어, 핵산 분자는 안티센스 핵산 서열일 수 있다. 혼성화 상호작용(hybridization interaction)에 의해, 안티센스 핵산은 세포 또는 병원체의 mRNA 발현을 차단한다. 안티센스 핵산 분자는, 예를 들어, 표적 mRNA 및/또는 표적을 암호화하는 내인성 유전자의 적어도 고유한 부분에 상보적인 RNA를 생성하기 위해 발현 벡터로부터 전사될 수 있다. 특정 세포의 상태 하에서 안티센스 핵산의 혼성화는 전사 및/또는 번역의 저해에 의해 표적 단백질 발현의 저해를 야기한다. 안티센스 핵산의 예시는, 다음의 아이시스(Isis) 제약 주시회사의 제품을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 고콜레스테롤에 대한 미포메르센(mipomersen); 관상동맥 질환, 염증, 및 신장 질환에 대한 ISIS-CRP_RX; 높은 트리글리세리드(triglyceride)에 대한 ISIS-APOCⅢ_Rx; 응혈 장애(clotting disorder)에 대한 ISIS-FXI_Rx; 관상동맥 질환에 대한 BMS-PCSK9_Rx; 타입 2 당뇨병에 대한 ISIS-SGLT2_Rx, ISIS-PTPIB_Rx, ISIS-GCGR_Rx, 및 ISIS-GCCR_Rx; 비만에 대한 ISIS-FGFR4_Rx; 암에 대한 OGX-011 f, LY2181308, ISIS-EIF4E_Rx, OGX-427, ISIS-STAT3_Rx; ALS에 대한 ISIS-SODI_Rx; TTR 아밀로이드증(amyloidosis)에 대한 ISIS-TTR_Rx; 척수성 근위축증(spinal muscular atrophy)에 대한 ISIS-SMN_Rx; CMV 망막염(retinitis)에 대한 비트라빈(Vitravene); 궤양성 대장염(ulcerative colitis)에 대한 알리카포센(Alicaforsen); 심각한 박테리아 감염에 대한 ACHN-490; 다발성 경화증(multiple sclerosis)에 대한 ATL1102; 국소 섬유화(local fibrosis)를 위한 EXC 001; 안 질환에 대한 iCo-007; 및 말단 비대증(acromegaly)에 대한 ATL1103. 본원에서 가르치는 방법을 사용하여 투여될 수 있는 microRNA의 예시는 다음 산타리스 파마(Santaris Pharma) 제품을 포함하나 이에 제한되지 않는다: C형 간염에 대한 미라버센(Miravirsen); 고형 종양에 대한 EZN-2968; 암에 대한 EZN-3042; 안드로젠 수용체(androgen receptor)에 대한 EZN-4176; 높은 콜레스테롤에 대한 SPC 4955 및 SPC 5001. 추가적인 치료상의 마이크로RNA(microRNA)는 암의 치료에 대한 다음의 엠아이알엔에이 치료제 주식회사(Mirna Therapeutics, Inc.) 제품을 포함한다: let-7, miR-34, miR-Rx02, miR-16, miR-Rx-01, miR-Rx-03, miR-Rx-06, 및 miR-Rx-07.

다른 예에서, 핵산 분자는 결함이 있는 세포 RNA를 수선하거나 또는 원하지 않은 세포 또는 병균-암호화된(pathogen-encoded) RNA를 파괴 것 중 어느 하나로 설계된 리보자임(예를 들어, 망치머리(hammerhead) 또는 헤어핀-계(hairpin-based) 리보자임)일 수 있다(예를 들어, Sullenger (1995) Chem. Biol, 2:249-253; Czubayko 외 (1997) Gene Therapy, 4:943-9; Rossi (1997) Ciba Found. Symp., 209: 195-204; James 및 Gibson (1998) Blood, 91 :371-82; Sullenger (1996) Cytokines Mol. Ther., 2:201-5; Hampel (1998) Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol, 58: 1-39; 또는 Curcio 외 (1997) Pharmacol Therapy, 74:317-32 참조).

일부 예에서, 핵산 분자는 검출가능한 폴리펩티드를 암호화한다. 이러한 폴리펩티드의 예시는, 루시퍼라아제(luciferase) 또는 형광 단백질(fluorescent protein), 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 전달되는 제제는 핵산 분자를 포함하는, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스 벡터이다. 이러한 전달되는 제제의 예시는 Ad-CMV-Luc이다(예를 들어, 실시예 1 참조). 이러한 아데노바이러스는 예컨대 이 기술분야에 공지되거나 본원에 상술된 추가의 또는 다른 핵산 분자를 포함하도록 더 변형될 수 있다. 예를 들어, 그 안에 발현되는 루시퍼라아제 이식유전자는 핵산 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함하도록 대체되거나 바꾸어질 수 있다.

2. 핵산 분자를 포함하는 비히클(Vehicles) 및 구축물(Constructs)

핵산 분자는 전달의 벡터, 구축물, 또는 기타 비히클로 제공될 수 있다. 이러한 예시는 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 나노입자 또는 전 세포(whole cell)이다. 이러한 구축물 또는 전달 비히클을 생성하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 당업자에게 널리 공지된 표준 방법을 사용하여 비바이러스 또는 바이러스 벡터로 삽입될 수 있다. 일부 예에서, 통상적인 분자 생물학(routine molecular biology)과 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있다(예를 들어, Ausubel 외, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1998, Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) 참조). 다른 예에서, 그것이 임의의 적절한 조절성 서열(regulatory sequence) 또는 서열들의 제어하에 있도록 핵산 분자가 삽입될 수 있다. 다른 예에서, 핵산 분자는 조절성 요소(regulatory element), 예컨대 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 발현 카세트(cassette)의 부분으로서 삽입될 수 있다. 적절한 조절 요소가 당업자에 의해, 예를 들어, 발현의 원하는 수준을 기초로 선택될 수 있다. 특정 예에서, 조절성 요소는 조직-특이적 세포에 대한 유전자 발현을 제한하기 위해, 조직-특이적 프로모터, 예컨대 간-특이적 프로모터를 포함하도록 선택될 수 있다.

a. 바이러스 및 바이러스 벡터

바이러스는 외인성 핵산 서열이 바이러스 벡터로 삽입되는, 전달되는 제제로서 본원의 방법, 용도, 및 조성물에서 전달되는 제제로서 사용될 수 있다. 바이러스는 그들이 숙주 세포로 바이러스 DNA의 전달에 효율적이고, 그들이 바이러스 부착 단백질(예를 들어, 캡시드(capsid) 또는 당단백질)에 따라 특정 표적 세포에 의해 감염되고 흡수될 수 있고, 그리고 그들이 조작되어 비본질적인 유전자를 제거하고 이종성 핵산 분자를 추가할 수 있기 때문에 생체 내(in vivo)로 핵산 분자를 전달되는데 유용하다. 많은 바이러스 벡터가 당업자에게 공지되어 있다. 본원의 방법에 사용될 수 있는 바이러스의 예시는, 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus), 알파바이러스(alphavirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 헤파데나바이러스(hepadenavirus), 배큘로바이러스(baculovirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus), 파보바이러스(papovavirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 및 파로바이러스(parovirus)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 바이러스는 아데노바이러스이다. 바이러스의 선택은 당업자의 수준 범위 내이고 다수의 인자(factor), 예컨대 바이러스 DNA의 복제 또는 통합(integration)에 대한 요구, 바이러스의 향성(tropism) 및/또는 바이러스의 면역원성(immunogenicity)에 달려있다. 이러한 바이러스 및 그것의 유도체는, 당업자에게 널리 공지되어 있고 사용가능하다. 예를 들어, 많은 것이 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, 록빌(Rockvulle, Md) 또는 상업적 공급업체(예를 들어, 벡터 바이오랩(Vector Biolabs), 필라델피아, PA; 어플라이드 바이오로지컬 머티리얼즈 주식회사(Applied Biological Materials, Inc.), 리치몬드(Richmond), 영국 콜럼비아, 캐나다)로부터 사용 가능하다.

재조합 바이러스의 생성에 사용하기 위한 바이러스 벡터는 복제가능 바이러스(replication-competent virus) 및 복제결손 바이러스(replication-defective virus)를 포함한다. 복제결손 바이러스에서, 바이러스는 일반적으로 바이러스 복제와 관련된 하나 이상의 유전자가 부족하고 감염의 첫 번째 사이클을 넘어 복제할 수 없다. 일부 경우에, 복제결손이 있는 바이러스를 생성하기 위해, 전송 벡터(transfer vector), 패키징 벡터(packaging vector) 또는 헬퍼 바이러스(helper virus)가 필요하다. 예를 들어, 패키징 벡터는 결손 벡터의 패키징을 위한 바이러스 구조 단백질을 제공하는 코스미드(cosmid) 또는 세포주(cell line)로 제공될 수 있다.

본원의 방법에 사용되는 바이러스 벡터는 또한 선택의 이식유전자에 작동가능하게 연결된, 조절성 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서를 포함하는 발현 카세트(cassette)를 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 적합한 프로모터가 사용될 수 있다. 적합한 프로모터 및 인핸서는 선택의 바이러스 벡터에 사용하기 위해 이 기술 분야에서 널리 사용될 수 있다. 일반적으로 프로모터는 구성적 프로모터(constitutive promoter)이다. 예시의 단백질은 CMV 프로모터, 말단절단된(truncated) CMV 프로모터, 인간 혈청 알부민 프로모터 또는 α-1-항트립신 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 프로모터는 전사 억제자로 알려진 결합 부위가 결실되어 있는 말단절단된 CMV 프로모터이다. 다른 예에서, 프로모터는 유도성 프로모터(inducible promoter)이다. 예를 들어, 프로모터는 유도성 에크디손(ecdysone) 프로모터이다. 프로모터의 다른 예는, 예컨대 에스트로겐(estrogen) 및 안드로겐(androgen) 프로모터, 및 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터를 포함한다. 인핸서는 조직 특이적 또는 조직 비특이적 인핸서일 수 있다. 예를 들어, 인핸서는 간 특이적 인핸서 요소이다. 예시의 인핸서 요소는, 인간 혈청 알부민(human serum albumin)(HAS) 인핸서, 인간 프로트로빈(human prothrombin)(HPrT) 인핸서, α-1 마이크로글로불린(microglobulin) 인핸서, 인트론 알도라제 인핸서(intronic aldolase enhancer) 및 아포지단백 E 간 조절 영역(apolipoprotein E hepatic control region)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

i. 아데노바이러스(Adenovirus)

아데노바이러스는 본원의 방법, 용도, 및 조성물에서 관심의 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제로서 사용될 수 있는 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 고전적인 유전학(classical genetics) 및 분자 생물학(molecular biology)의 연구를 통해 잘 특성화된, 약 36 kb 게놈을 가진 핵 DNA 바이러스이다(Horwitz, M. S., "Adenoviridae and Their Replication," in Virology, 2 판, Fields, B. N., 외, eds., Raven Press, New York, 1990). 게놈은 바이러스 단백질의 2개의 시간의 제약을 받는 클래스(temporal class)의 생성을 나타내는, 초기(E1-E4로 알려짐) 및 후기(L1-L5로 알려짐) 전사 유닛으로 분류된다. 이러한 사건 사이의 경계는 바이러스 DNA 복제이다.

아데노바이러스는 호흡기 및 위장관의 상피세포에 대한 천연의 향성(natural tropism)을 나타낸다. 아데노바이러스는 또한 전신 투여 후에 간으로의 바이러스의 제거(clearance)를 발생할 수 있는, 간의 세포, 예컨대 간세포 및 내피 세포를 감염시킬 수 있다. 특히, 본원의 방법에서, 실질로의 직접적인 주입은 간 세포에 의한 선택적인 간 세포 흡수를 용이하게 한다. 바이러스의 표면상에 펜톤(penton) 염기 및 섬유 단백질이 바이러스 향성에 대한 원인이 된다. 아데노바이러스 입자 및 숙주 세포 사이의 다중 상호작용이 효율적인 세포 유입을 촉진하기 위해 필요하다(Nemerow (2000) Virology 274:1-4). 하위그룹 C 아데노바이러스, 예컨대 아데노바이러스 2 및 5 (Ad2 또는 Ad5)에 대해, 바이러스 유입 경로가 잘 특성화될 수 있고, 2개의 분리된 세포 표면 사건과 관련되는 것으로 생각된다. 첫 번째, 아데노바이러스 섬유 노브(knob) 및 콕사키에-아데노바이러스 수용체(coxsackie-adenovirus receptor)(CAR) 사이의 높은 친화성 상호작용이 세포 표면에 아데노바이러스 입자의 부착을 매개한다. 공동 수용체로 작용하는, 세포 표면 인테그린 α_vβ₃ 및 α_vβ₅과 펜톤의 후속 연합(association)이 바이러스 내재화를 가능하게 한다. 폐 상피 세포를 포함하는 많은 인간 조직에서 발현되는 CAR(Bergelson 외., (1997) Science 275: 1320-1323)이, 하위그룹 B를 제외하고(Bergelson 외, (1997) Science 275: 1320-1323; Roelvink 외, (1998) J. Virol. 72: 7909-7915), 대부분의 아데노바이러스 하위 그룹에 대해 세포 수용체로 작용하는 것으로 보인다.

아데노바이러스는 6개의 별개의 하위그룹, A 내지 F로 분류되는 50개 이상의 혈청형(serotype)을 포함한다. 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(ATCC, 록빌(Rockville), Md.) 및 다른 상업적 및 비상업적인 제공업자로부터 사용가능한, 임의의 이들 아데노바이러스 혈청형이 본원의 방법에서 사용될 수 있거나 또는 이 기술분야에 공지된 바와 같이 추가의 변형을 위한 출처(source)로서 사용될 수 있다. 또한, 임의의 다른 출처로부터 이용가능한 아데노바이러스의 임의의 다른 혈청형이 사용될 수 있거나 더 변경될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스는 하위그룹 A (예를 들어, 혈청형 12, 18, 31), 하위그룹 B {예를 들어, 혈청형 3, 7, 11a, 11p, 14, 16, 21, 34, 35, 50), 하위그룹 C (예를 들어, 혈청형 1, 2, 5, 6), 하위그룹 D (예를 들어, 혈청형 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 19p, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, 42-49, 51), 하위그룹 E (예를 들어, 혈청형 4), 하위그룹 F (예를 들어, 혈청형 40, 41), 또는 임의의 다른 아데노바이러스 혈청형일 수 있다. 어떤 양태에서, 아데노바이러스는 하위그룹 C 아데노바이러스이거나 또는 하위그룹 C 아데노바이러스로부터 유래한다. 하위그룹 C 아데노바이러스는, Ad2 및 Ad5을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

아데노바이러스 벡터는 이 기술분야에서 사용가능하고(예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 록빌(Rockville), Md.)로부터 사용가능함), 많은 다른 아데노바이러스 혈청형으로부터의 야생형(wild-type) 아데노바이러스 단백질의 서열이 이 기술분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Roberts 외 (1984) J. Biol. Chem., 259:13968-13975; Chroboczek 외. (1992) Virology, 186:280-285; Sprengel 외. (1994) J. Virol., 68:379-389; Chillon 외. (1999) J. Virol, 73:2537-2540; Davison 외. (1993) J. Mol. Biol, 234:1308-1316; www.binf.gmu.edu/wiki/index.php/Human_Adenovirus_Genome_Sequences_and_Annotations 참조). 아데노바이러스 벡터는 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC) 또는 다른 상업적 또는 비상업적 제공업체로부터, 당업자에게 널리 사용가능하다. ATCC로부터, 아데노바이러스는 ATCC 번호 VR-1 내지 VR-1616로서 사용가능하다. 예를 들어, 야생형 아데노바이러스 타입 2가 VR-846로서 ATCC로부터 사용가능하고 타입 5가 VR-5 및 VR-1082로서 사용가능하다. 임의의 다수의 재조합 또는 변형된 아데노바이러스가 이 분야 및 본원에서 기술된 바와 같이 또는 당업자에게 공지된 적합한 방법에 의해, 상기 혈청형의 임의의 것으로부터 유래하여 생성될 수 있다.

아데노바이러스 벡터는 분열 및 비분열 세포 모두에 대한 향성, 최소의 병원성 잠재력(pathogenic potential), 벡터 스톡(stock)의 제조를 위해 높은 역가로 복제하는 능력, 및 큰 삽입(insert)을 전달하는 잠재력을 포함하는, 유전자 전달 비히클로서 사용하기 위한, 몇 가지 장점을 가진다(예를 들어, Berkner (1992) Curr. Top. Micro. Immunol, 158:39-66; Jolly 외. (1994) Cancer Gene Therapy, 1 :51-64 참조).

예를 들어, 아데노바이러스 벡터는 첫 번째 초기 유전자 영역(E1-E4)에서 적어도 하나의 결실(deletion)을 포함하는 결손 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 아데노바이러스 벡터에 대한 변형은 이 기술분야에 공지된 결실, 예컨대 El, E2a, E2b, E3, 또는 E4 암호 영역의 하나 이상의 결실을 포함한다. 예를 들어, 유전자 치료를 위한 아데노바이러스 벡터는 El, E2a, E2b, E3 및/또는 E4 유전자 대신에 이종성 핵산 분자의 치환에 의해 제조될 수 있다. 결실은 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 부위를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, Ela 영역은 Ela 영역 내의 간편한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 사용하여 결실될 수 있다. 종종, 새로운 바이러스 입자 내로 패키징(packaging)을 위해 필요한 크기를 여전히 만족시키게 하면서 외래의 DNA의 더 큰 부분의 삽입을 허용할 수 있도록 E3의 부분이 제한 엔도뉴클레아제 첨가에 의해 또한 결실된다. 이들 영역의 결실로 인해, 아데노바이러스 벡터의 복제 능력(cloning capacity)이 약 8 kb일 수 있다. 첫 번째 바이러스 초기 유전자 영역, 예컨대 Ela 및 Elb 영역을 포함하는, El에서 적어도 하나의 결실 때문에 이러한 아데노바이러스 벡터는, 일반적으로 복제 결손 아데노바이러스로 언급된다.

초기 유전자, 예컨대 바이러스 El 영역의 결실은, 후속으로 감염된 표적 세포에서 재조합 아데노바이러스가 복제에 대해 결함이 있고 감염된 바이러스 입자를 생성할 수 없게 만든다. 따라서, 초기 유전자-결실된 아데노바이러스 게놈 복제, 예컨대 El-결실된 아데노바이러스 게놈 복제를 허용하도록, 및 바이러스 입자를 생성하도록 손실된 유전자 산물을 제공하는 보완(complementation)의 시스템을 필요로 한다. 예를 들어, El 보완(complementation)은 일반적으로 El을 발현하는 세포주, 예컨대 인간 배아 신장 패키징 세포 주, 즉, 293(수탁번호 CRL-1573로 ATCC 수탁됨)으로 지칭되는 상피 세포주(epithelial cell line)에 의해 제공된다. 세포주 293은 세포주에서 El-결실된 바이러스의 성장을 "지지(support)"하도록 El 유전자 영역 산물을 제공하는, 아데노바이러스의 El 영역을 포함한다(예를 들어, Graham 외, J. Gen. Virol. 36: 59-71, 1977 참조). 또한, 아데노바이러스 E4 영역의 부분을 갖는 결손 아데노바이러스의 생성을 위해 사용할 수 있는 세포주가 보고되었다(예를 들어, 국제 공개번호 WO 96/22378호 참조). E3는 또한 벡터로부터 결실될 수 있지만, 이것은 벡터 생산을 위해 요구되지 않기 때문에, 보완하는 생산자 세포(complementing producer cell)로부터 생략될 수 있다.

벡터로서 복제 결손 바이러스의 사용의 이점은 그들은 초기 감염된 세포 내에서 복제할 수 있지만, 새로운 감염성 바이러스 입자를 형성할 수 없기 때문에, 다른 세포 타입으로 확산 될 수 있는 범위가 제한된다는 것이다. 다중 결손 아데노바이러스 벡터 및 보완하는 세포주도 또한 기술되어 있다(예를 들어, 공개번호 WO 95/34671호, 미국 특허번호 제5,994,106호 참조). 복제 결손 아데노바이러스의 구조가 기술되어 있다(Berkner 외., J. Virol. 61 :1213-20 (1987); Massie 외, Mol. Cell. Biol. 6:2872-83 (1986); Haj-Ahmad 외., J. Virol. 57:267-74 (1986); Davidson 외, J. Virol. 61 :1226-39 (1987); Zhang 외, BioTechniques 15:868-72 (1993); Berkner (1983) Nuc. Acids Res. 11:6003; Ghosh-Choudhury (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:964; Gilardi 외 (1990) FEBS Lett. 267:60; Mittal (1993) Virus Res. 28:67; Yang (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4601; 및 국제 공개된 PCT WO1995/026411).

아데노바이러스 벡터는 또한 모든 바이러스 유전자가 벡터 전파(propagation)에 대해 필요한 ITR 및 Ψ만을 남기고 제거된 "유전자 없는(gutless)" 또는 "유전자가 제거된(gutted)" 벡터를 포함한다. 그들은 벡터의 게놈을 복제하고 패키징하기 위해 필요한 최소한의 시스(cis)-작용 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스의 게놈으로부터 유래하기 때문에 이러한 아데노바이러스 벡터는 슈도아데노바이러스 벡터(pseudoadenoviral vector)(PAV)로 설계된다. PAV 벡터는 복제의 기원을 포함하는 5' 역전된 말단 반복(inverted terminal repeat)(ITR) 및 3' ITR 뉴클레오티드 서열, 및 PAV 게놈의 패키징에 필요한 시스 작용(cis-acting) 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 그들은 적절한 조절성 요소(예를 들어, 프로모터 또는 인핸서)와 함께 하나 이상의 이식유전자를 포함하도록 변형될 수 있다. PAV는 그들이 대부분의 바이러스 암호 서열의 결실을 포함하기 때문에, 8 kb 보다 훨씬 더 큰 크기 및 36 kb 까지 크기의 운반 능력(carrying capacity)을 가진다(예를 들어, 미국 특허번호 제5,882,887호 또는 제5,670,48호; PCT 공개번호 WO96/40955호, W097/25466호, W095/29993호, WO97/00326호; Morral 외. (1998) Hum. Gene Ther., 10:2709-2716, Kochanek 외. (1996) Proc. Natl. Acad. ScL, 93:5731-5736; Parks 외. (1996) Proc. Natl. Acad. ScL, 93:13565-13570; Lieber 외. (1996) J Virol, 70:8944-8960 또는 Fisher 외. (1996) J Virol., 217:11-22 참조).

PAV는 "헬퍼(helper)" 바이러스(예컨대 E1 결실된 아데노바이러스 벡터를 사용함)와 함께, 생성하는 세포의 공동-감염(co-infection)에 의해 성장되며, 여기서 패키징 세포가 유전자 E1 산물을 발현한다. 헬퍼 바이러스는 입자 조립(assembly)에 필요한 바이러스 구조 단백질을 생산하는 것을 포함하여, 없어진(missing) 아데노바이러스 기능을 트랜스-보완(trans-complement)한다. 예를 들어, 헬퍼 아데노바이러스 벡터 게놈 및 유전자 없는(gutless) 아데노바이러스 벡터 게놈이 패키징 세포로 전달된다. 헬퍼 벡터 게놈 및 패키징 세포(packaging cell)는 함께 아데노바이러스 벡터 입자의 패키징을 위한 보완하는 단백질을 제공하는, 표준 세포 유지 또는 성장 상태 하에서 세포가 유지된다. 이러한 유전자 없는(gutless) 아데노바이러스 벡터 입자가 표준 기술에 의해 회복된다. 헬퍼 벡터 게놈은 표준 형질감염(standard transfection) 기술에 의해 플라스미드 또는 유사한 구축물의 형태로 전달될 수 있거나, 게놈을 포함하는 바이러스 입자에 의한 감염을 통해 전달될 수 있다. 이러한 바이러스 입자는 일반적으로 헬퍼 바이러스(Lelper virus)로 지칭된다. 마찬가지로, 유전자 없는(gutless) 아데노바이러스 벡터 게놈은 형질감염 또는 바이러스 감염에 의해 세포로 전달될 수 있다.

아데노바이러스는 또한 이종성 프로모터의 조절 하에서 복제에 필수적인 유데노바이러스의 유전자를 배치(placing)한 결과로, 바이러스가 세포 또는 조직의 특정 유형에서는 복제하지만 다른 유형에서는 복제하지 않는, 복제 조건부의 아데노바이러스를 포함한다(상술함; 또한, 미국 특허번호 제5,998,205호, 미국 특허번호 제5,801,029호 및 US2003-0104625호로 공개되고 국제 PCT 공개번호 WO 2002/067861호에 대응하는, 미국 출원번호 제10/081,969호 참조).

아데노바이러스는 또한 표적하는 리간드에 대한 수용체(단백질, 지질, 탄수화물, 또는 이의 부분)를 발현하는 특정 표적 세포의 감염을 증가시키도록 예를 들어 바이러스의 향성을 변경하도록 표적하는 리간드를 포함하도록 변형된 것을 포함한다. 아데노바이러스 벡터 및 기타의 것이 치료상의 적용을 위한 많은 가능성을 가지나, 그들의 유용성은 아데노바이러스 벡터의 특정 세포 유형으로의 전달을 제한하는, CAR의 광범위한 조직 분포에 의해 제한된다. 또한, 생체 내(in vivo) 특정 세포 상에서 CAR 및/또는 α_V 인테그린 수용체의 부재가 아데노바이러스 벡터에 의해 표적화 될 수 있는 세포 또는 조직 유형을 제한한다. 따라서, 아데노바이러스는 또한 천연의 수용체에 대한 결합을 감소 또는 제거하거나 및/또는 원하는 세포 수용체 또는 조직 특이적 수용체에 대한 표적 리간드를 포함하도록 캡시드(capsid) 단백질, 예컨대 HI 루프(loop), 섬유의 C 말단(terminus), 헥손(hexon)의 L1 루프 또는 펜톤(penton) 염기의 RGD 루프, 또는 캡시드 단백질 IX를 가공함(engineering)으로써 변형된 것을 포함한다(예를 들어, Krasnykh 외. (2000) Mol. Ther., 1:391-405; Wickham 외.(2000) Gene Ther., 7:110-4; Dmitriev 외. (1998) J Virol, 72:9706-12; Mizuguchi 외. (2004) Hum. Gene Ther., 15:1034-44; Wickham 외. (1997) J Virol, 71:8221-9; Curiel (1999) Ann NY Acad. Set, 886:158-71 참조). 캡시드 단백질은 예를 들어, 표적 리간드의 첨가 또는 아데노바이러스 섬유의 다른 유형으로 섬유의 치환에 의해 변형될 수 있다. 표적 리간드는 세포내의 또는 세포상의 모이어티(moiety), 예컨대 세포 표면 단백질, 지질, 탄수화물 또는 다른 모이어티에 결합하는, 임의의 단백질, 또는 이의 부분일 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드는 성장 인자, 부착 분자, 사이토카인, 단백질 호르몬, 신경 펩티드(신경전달물질) 및 단일쇄(single-chain) 항체, 또는 이의 적합한 부분을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 아데노바이러스 벡터는 어댑터 분자(adaptor molecule), 예컨대 항-Ad(anti-Ad) 단일쇄 항체(single-chain antibody)(scFv) 또는 표적 리간드를 가지는 CAR의 세포외 도메인을 포함하는 항체 및 융합 단백질과 접합(conjugate)되거나, 폴리머, 예를 들어, 표적 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 모이어티로 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, Mizuguchi 외. (2004) Hum. Gene Ther., 15:1034-44; Eto 외. (2008) Int. J. Pharm., 354:3-8 참조).

상기 아데노바이러스의 임의의 것, 또는 이 기술분야에 공지된 임의의 것은 본원의 전달되는 제제로서 사용을 위해 원하는 이종성 핵산 분자를 포함하도록 변형될 수 있다. 원하는 이종성 핵산 서열을 포함하는 아데노바이러스는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 제조될 수 있다(Levrero 외, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917; PCT 공개번호 W095/26411호). 특히, 이러한 바이러스는 이종성 DNA 서열을 전달하는 플라스미드(plasmid) 및 아데노바이러스 벡터 사이에 상동성 재조합(homologous recombination)에 의해 제조될 수 있다. 상동성 재조합은 아데노바이러스 벡터 및 플라스미드의 적절한 세포주로의 공동형질감염(cotransfection) 후에 발생할 수 있다. 사용되는 세포주는 일반적으로 형질전환할 수 있는 것이다. 형질감염이 생산자 세포로의 아데노바이러스 입자의 유입을 지시하는 시약의 존재에서 수행될 수 있다. 이러한 시약은, 다양이온(polycation) 및 이기능 시약(bifunctional reagent)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 아데노바이러스가 결손 아데노바이러스인 경우(초기 유전자 또는 섬유 단백질의 결실로 인한), 세포주는 또한 결손 아데노바이러스 게놈 부분을 보완할 수 있는 서열, 예컨대 재조합의 위험을 피하기 위해 통합되는 형태를 포함한다. 보완하는 세포주의 예시는, Ad5 아데노바이러스의 게놈의 왼쪽(left-hand) 부분을 포함하는 인간 배아 신장주 293(human embryonic kidney line 293)(Graham 외, J. Gen. Virol. 36 (1977) 59)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 보완하는 세포는 또한, 예를 들어, 아데노바이러스 El 유전자를 포함하는, PER.C6 세포주의 세포(PER.C6이 사용가능함, 예를 들어, 크루셀(Crucell) 유래, 네덜랜드(Netherlands); ECACC 하에 수탁번호 96022940로 수탁 됨; 또한, Fallaux 외. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1909-1907 참조; 또한, 미국 특허번호 제5,994,128호 참조) 또는 AEl-2a 세포(Gorziglia 외 (1996) J. Virology 70:4173-4178; 및 Von Seggern 외. (1998) J Gen. Virol. 79: 1461-1468 참조)를 포함한다. 그리고나서, 증가된 아데노바이러스는 종래의 분자 생물학 기술에 따라 회복되고 정제된다.

유전자 치료에서 아데노바이러스의 사용을 설명하는 참조문헌은 Vorburger 및 Hunt (2002) The Oncologist, 7:46-59; Breyer 외. (2001) Current Gene Therapy, 1:149-162; Shirakawa (2009) Drugs News Perspectives, 22:140-5; Wang 외. (2005) Gene Therapy and Mol. Biology, 9:291-300; 및 Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다,

ii. 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus)

본원의 방법, 조성물, 및 용도에서 전달되는 제제로 사용을 위한 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다. AAV는 게놈이 4.6 kb 크기를 갖는 단일 가닥 인간 DNA 파보바이러스(parvovirus)이다. AAV 게놈은 2개의 주요한 유전자를 포함한다:렙(rep) 유전자 및 캡(cap) 유전자. 렙(rep) 유전자는 렙 단백질(Rep 76, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40)에 대해 암호화한다. 캡(cap) 단백질은 AAV 바이러스 입자를 형성하는데 반해, 캡 유전자는 복제(replication), 구출(rescue), 전사(transcription) 및 통합(integration)에 대해 암호화한다. AAV가 생산적인 감염을 받게 허용하는(즉, 숙주 세포 내에서 그 자체를 재생산) 필수적인 유전자 산물을 공급하는 아데노바이러스 또는 다른 헬퍼 바이러스(예를 들어, 헤르페스바이러스(herpesviruse))에 대한 그것의 의존도로부터 AAV의 이름이 유래한다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에, AAV는 헬퍼 바이러스, 보통 아데노바이러스와 함께 숙주세포의 중복감염(superinfection)에 의해 구출될 때까지 프로 바이러스(pro virus)로서 숙주 세포의 염색체로 통합(integration)된다(Muzyczka (1992) Curr. Top. Micro. Immunol, 158:97-129).

AAV 바이러스는 세포의 게놈으로 통합될 수 있다. 통합의 기전은 바이러스 복제, 구출, 패키징 및 통합을 위해 필요로 하는 시스 작용(cis-acting) 뉴클레오티드 서열을 포함하는, AAV 게놈의 양말단에서 역전된 말단 반복(inverted terminal repeat)(ITR)의 존재에 의해 매개된다. 헬퍼 바이러스의 부재에서 감염 후에 트랜스(trans)에서 렙(rep) 단백질에 의해 매개되는 ITR의 통합 기능이 AAV 게놈의 세포 내 염색체로 통합을 허용한다. AAV을 위한 통합 부위는 잘 구축되어 있고 인간의 염색체 19에 국소화되어 있다(Kotin 외. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., 87:221 1-2215). 통합 부위의 지식이 숙주 유전자를 활성화시키거나 불활성화시키거나 또는 암호 서열을 방해하는 세포 게놈으로의 무작위 삽입 사건의 위험을 감소시킬 수 있다. AAV는 많은 세포 유형에 대한 향성(tropism)을 나타내는, 그것의 숙주 범위가 넓기 때문에 또한 유전자 치료 적용에 유용한다. AAV는 또한 비분열 및 분열 세포 둘 다를 감염시킬 수 있다.

AAV 벡터는 AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8 또는 AAV-9를 포함하는, 임의의 천연적으로 발생하는 AAV 혈청형으로부터 유래 될 수 있다. 이러한 바이러스는 널리 공지되어 있고 당업자에게 사용가능하다(예를 들어, Grimm 외.(2003) Current Gene Therapy, 3:281-304; Muramatsu 외. (1996) Virol, 221:208-217; Chiorini 외. (1997) J Virol, 71:6823-6833; Chiorini (1999) J Virol, 73:1309-1319; Rutledge 외. (1998) J. Virol, 72:309-319; Xiao 외. (1999) J Virol, 73:3994-4003; Gao 외. (2002) Proc Natl. Acad. Sci, 99:11854-11859; Kotin (1994) Human Gene Therapy, 5:793-801 참조). 다른 혈청형이 또한 공지되어 있고 사용가능하고 AAV-8 내지 AAV-12을 포함한다. 예를 들어, 많은 AAV 벡터는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 사용가능하다(ATCC, 록빌(Rockville), Md.; 예를 들어, VR-197, VR-645, VR-646, VR-680, VR-681, VR-1449, VR-1523, VR-1616 참조). 또한 사용가능한 것은 호환가능한 숙주 세포 및 헬퍼 바이러스이다. AAV 벡터는 또한 AAV-2 벡터 게놈이 다른 AAV 혈청형의 캡시드 내로 교차 패키지(cross-package)되는, "위형(pseudotyped)" AAV 벡터를 포함한다(Burger 외. (2004) Mol. Ther., 10:302- 17; 미국 특허번호 제7,094,604호). 이러한 위형(pseudotyped) AAV 벡터는 AAV-2 유래된 혈청형의 제한, 예컨대 일부 세포, 예컨대 간 또는 근육 세포 형질도입에서의 비효율성을 극복한다.

전신 발현을 달성하는 전달 방법에 따라서, 많은 AAV 벡터는 다중 조직, 예컨대 골격 및 심장 근육에 걸쳐 광범위한 형질도입(transduction)을 나타낸다. 이들은 예를 들어, AAV 혈청형-6, -8 및 -9을 포함한다. 특히, AAV 벡터는 아데노바이러스 관련된 혈청형 9(adeno virus-associated serotype 9)를 포함한다(AAV-9; 젠뱅크 수탁번호 AY530629.1; Gao 외. (2004) J. Virol., 78:6381-6388). AAV-9는 중추 신경계(CNS)를 표적으로 하는 혈액 뇌 관문(blood brain barrier)을 우회할 수 있는 벡터이다(예를 들어, Foust 외 (2009) Nature Biotechnology, 27:59-65, Duque 외 (2009) Mol.Ther., 17:1187-1196). 따라서, 뇌 또는 CNS에 영향을 주거나 관련된 본원의 신경퇴행성 질환 또는 기타 질환의 예에서, AAV-9는 전신적으로 전달을 위한 관심의 단백질을 암호화하는 전달되는 제제로서 사용될 수 있다(예를 들어, 혈액에서 발현을 위한 간 또는 이의 부분으로의 전달).

AAV 벡터는 관심의 이종성 핵산을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 포함한다. 이러한 벡터의 생산을 위한 공정이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, AAV 벡터를 생산하는 표준 접근법은 AAV ITR 서열에 의해 측면에 있는 관심의 핵산 분자를 포함하는 AAV 벡터 게놈으로 숙주세포의 형질감염, 트랜스(trans)에 필요한 AAV 렙(rep) 및 캡(cap) 단백질에 대한 유전자를 암호화하는 플라스미드에 의한 숙주세포의 형질감염, 및 트랜스(trans)에 필요한 비-AAV 헬퍼 기능을 제공하기 위한 헬퍼 바이러스로 형질감염된 세포의 감염을 필요로 한다(Muzyczka (1992) Curr. Top. Micro. Immunol, 158:97-129; 미국 특허번호 제5,139,941호). 헬퍼 바이러스(helper virus)는 아데노바이러스 또는 다른 헬퍼 바이러스일 수 있다. 헬퍼 바이러스 단백질이 AAV 렙(rep) 유전자의 전사를 활성화하고, 렙(rep) 단백질은 그리고 나서 AAV 캡(cap) 유전자의 전사를 활성화시킨다. 캡 단백질은 그리고 나서 AAV 게놈을 바이러스 입자 내로 패키지(package)하기 위해 ITR 서열을 이용한다.

대안적으로, AAV 비리온(virion)의 재조합은, 복제 기능의 출처(source)로 사용될 수 있는 공지된 헬퍼 바이러스 중 하나에 의한 감염과 조합으로, 헬퍼 기능 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용하여 도움받을 수 있다(예를 들어, 미국 특허번호 제5,622,856호 및 제5,139,941호 참조). 마찬가지로, 당업자는 필요한 복제 기능을 제공하기 위한, wt AAV에 의한 감염과 조합으로, 부수적인 기능 유전자를 포함하는 플라스미드를 사용할 수 있다. 삼중 형질감염(triple transfection) 방법은 또한 헬퍼 바이러스를 필요로 하지 않는 방법인, rAAV 비리온(virion)을 생산하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 미국 특허번호 제6,001,650호 참조). 이것은 rAAV 비리온 생산을 위한 3개의 벡터를 사용함에 의해 성취될 수 있다: AAV 헬퍼 기능 벡터, 부수적인 기능 벡터, 및 rAAV 벡터.

유전자 치료에서 AAV 바이러스의 사용을 설명하는 참조문헌은, Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

iii. 레트로바이러스(Retrovirus)

본원의 방법, 조성물 및 용도에서 전달되는 제제로서 사용을 위한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다(예를 들어, Miller (1992) Nature, 357:455-460 참조). 넓은 범위 또는 설치류, 영장류 및 인간의 체세포로의 재배열되지 않는(unrearranged), 단일 사본(copy) 유전자를 전달하는 그들의 능력 때문에 레트로바이러스 벡터는 핵산을 세포로 전달하는데 아주 적합하다. 레트로바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈으로 통합된다. 다른 바이러스 벡터와 달리, 그들은 단지 분열하는 세포를 감염시킨다.

레트로바이러스는 바이러스 게놈이 RNA인 RNA 바이러스이다. 숙주 세포가 레트로바이러스로 감염될 때, 게놈의(genomic) RNA는 감염되는 세포의 염색체 DNA로 매우 효율적으로 통합되는, DNA 중간체로 역전사된다. 이 통합된 DNA 중간체는 프로바이러스(provirus)로 언급된다. 오염된 헬퍼 바이러스의 동시에 일어나는(coincident) 생산 없이 캡슐화(encapsulation)를 허용하는 적절한 서열을 포함하는 세포주 내 또는 적절한 헬퍼 바이러스의 존재에서 프로바이러스의 전사 및 감염 바이러스로의 조립(assembly)이 발생한다. 캡슐화를 위한 서열이 적절한 벡터와 함께 공동 형질감염되어 제공되는 경우, 헬퍼 바이러스는 재조합 레트로바이러스의 생산을 위해 필요로 하지않는다.

레트로바이러스 게놈 및 프로바이러스의(proviral) DNA는 3개의 유전자를 가진다: 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열이 측면에 있는, 이엔브이(env), 개그(gag) 및 폴(pol)을 갖는다. 개그(gag) 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드, 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 암호화하고 이엔브이(env) 유전자는 바이러스 외피(envelope) 당단백질을 암호화한다. 폴(pol) 유전자는 바이러스 RNA를 이중가닥 DNA로 전사하는 RNA 지시되는 DNA 중합효소 역전사효소(RNA-directed DNA polymerase reverse transcriptase), 역전사효소에 의해 생산된 DNA를 숙주 염색체 DNA로 통합하는 인테그라제(integrase), 및 암호화된 개그 및 폴 유전자를 처리하는 작용을 하는 프로테아제(protease)를 포함하는 산물을 암호화한다. 5' 및 3' LTR은 전사 및 비리온(virion) RNA의 폴리아데닐화(polyadenylation)를 촉진하는 역할을 한다. LTR은 바이러스 복제에 필요한 모든 다른 시스 작용(cis-acting) 서열을 포함한다.

레트로바이러스 벡터는 Coffin 외. , Retorviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1997)의해 기술된다. 예시적인 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus)(MMLV) 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스(murine stem cell virus)(MSCV)이다. 레트로바이러스 벡터는 복제 능력이 있거나 복제 결손일 수 있다. 일반적으로, 레트로바이러스 벡터는 비리온 복제의 추가적인 라운드(round) 및 패키징(packaging)을 위해 필요한 유전자를 위한 암호 영역이 결실되거나 다른 유전자로 대체되어 복제 결손이다. 따라서, 일단 초기 표적 세포가 감염되면 바이러스는 그들의 일반적인 용균 경로(lytic pathway)를 계속할 수 없다. 이러한 레트로바이러스 벡터, 및 이러한 바이러스(예를 들어, 패키징(packaging) 세포주)를 생산하기 위해 필요한 제제는 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, 클론테크(Clontech)로부터 사용가능한 레트로바이러스 벡터 및 시스템, 예컨대 카탈로그 번호 634401, 631503, 631501, 및 기타, 클론테크 마우트내인 뷰(Clontech, Moutnain View), CA 참조).

복제를 위해 필요한 바이러스 유전자를 전달될 핵산 분자로 대체함으로써 이러한 레트로바이러스 벡터가 전달되는 제제로서 생산될 수 있다. 생성되는 게놈은 그 사이에 원하는 유전자 또는 유전자들과 함께 각각의 말단에 LTR을 포함한다. 레트로바이러스를 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들어, 국제 공개번호 WO05/26411호 참조). 레트로바이러스 벡터는 헬퍼 플라스미드 또는 플라스미드들을 포함하는 패키징 세포주(packaging cell line)에서 생성될 수 있다. 패키징 세포주는 벡터의 캡시드(capsid) 생산 및 비리온 성숙을 위해 필요한 바이러스 단백질을 제공한다(예를 들어, 개그(gag), 폴(pol) 및 이엔브이(env) 유전자). 일반적으로, 벡터 플라스미드 사이의 재조합이 발생할 수 없도록 적어도 2 개의 별개의 헬퍼 플라스미드(각각 개그(gag) 및 폴(pol) 유전자; 및 이엔브이(env) 유전자를 별개로 포함함)가 사용된다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 형질감염의 표준 방법, 예컨대 인산칼슘 매개 형질감염을 사용하여 패키징 세포주로 전달될 수 있다. 패키징 세포주(packaging cell line)는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 상업적으로 사용가능하다. 예시적인 패키징 세포주는 GP2-293 패키징 세포주이다(카탈로그 번호 631505, 631507, 631512, 클론테크(Clontech)). 비리온 산물을 위한 충분한 시간 후에, 바이러스가 수확된다. 원하는 경우, 수확된 바이러스는 두 번째 패키징 세포주를 감염시키기 위해, 예를 들어, 다양한 숙주 향성을 가지는 바이러스를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 최종 결과는 숙주 세포에서 새로운 바이러스가 형성될 수 없도록 관심의 핵산을 포함하나 다른 구조적인 유전자가 결여된 복제하는 능력이 없는(replicative incompetent) 재조합 레트로바이러스이다.

유전자 치료에서 레트로바이러스 벡터의 사용을 설명하는 참조문헌은 다음을 포함한다: Clowes 외, (1994) J Clin. Invest. 93:644-651; Kiem 외, (1994) Blood 83:1467-1473; Salmons 및 Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4:129-141; Grossman 및 Wilson (1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114; Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121; Cassani 외. (2009) Blood, 114:3546-3556.

iv. 렌티바이러스(Lentivirus)

렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위클래스이다. 예시적인 렌티바이러스는 HIV, SIV 및 FIV이다. 다른 레트로바이러스와 달리, 렌티바이러스는 비분열하는 세포의 게놈으로 통합할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 비분열하는 일차적인 간 세포의 게놈으로 통합하여, 일차적인(primary) 간 세포로 유전자를 효율적이고 영구적으로 전달하는 것으로 보고되고 있다(Lewis 및 Emerman (1994) J. Virol., 68:510-6). 렌티바이러스 벡터는 또한 MMLV 레트로바이러스 벡터와 동일한 전사 침묵의 기전(transcription silencing mechanism)을 겪지 않는다. 그들이 핵 수입 기구(nuclear import machinery)와 상호작용하고 핵공(nucleopore)을 통해 바이러스의 사전 통합 복합체(pre-integration complex)의 활성화 수송을 매개하는 여러 비리온 단백질, 예컨대 매트릭스 또는 VPR을 포함하는 핵 친화성 결정요인(karyophilic determinant)을 가진다는 점에서 렌티바이러스는 다른 레트로바이러스와 다르다. 따라서, 숙주 세포의 게놈으로의 렌티바이러스 통합은 세포 분열에 의존하지 않는다.

다른 레트로바이러스와 유사하게, 렌티바이러스는 바이러스 단백질을 암호화하는 주요한 유전자인 개그(gag), 폴(pol) 및 이엔브이(env) 유전자를 포함한다. 또한, 합성의 조절, 바이러스 RNA의 가공 및 다른 복제 기능에 관여하는 다른 부수적인 유전자가 또한 있다(예를 들어, HIV에서 Tat 및 Rev). 이들은 2 개의 긴 말단 반복(long terminal repeat)(LTR) 서열의 측면에 있다. 복제 사이클이 숙주 세포 수용체에 대한 바이러스 당단백질의 결합, 막의 융합, 및 세포로의 바이러스의 유입에 의해 개시된다. 유입되자마자, 바이러스는 코팅되지 않고(uncoated) 사전 통합 복합체(pre-integration complex)(PIC)의 형성을 야기하는 역방향 전사가 발생한다. 이것은 PIC의 형성 및 PIC를 통해 핵 외피(envelope)를 통해 세포의 핵으로 활발하게 들어감에 의해 비분열하는 세포를 감염시키는 렌티바이러스의 능력에서 역할을 하는 다른 부수적인 유전자이다. 일단 프로바이러스(provirus)가 핵의 외피에 들어가면, 그것은 숙주 게놈으로 그 자체가 통합된다.

예시적인 렌티바이러스 벡터는 HIV-1, HIV-2, SIV 또는 FIV를 기초로 한다. 안전한 렌티바이러스 벡터를 생성하기 위해, 여러 플라스미드 벡터, 예를 들어 4 개의 플라스미드 벡터 시스템을 포함하는 패키징 세포주가 생성된다. 예를 들어, 첫 번째 플라스미드는 단지 프로모터, 개그(gag) 및 폴(pol)을 포함하도록 결실된 부수적인 단백질(예를 들어, tat, brf, vpr 및 net) 및 새로운 바이러스의 조립으로 통합될 수 있는 전사된 바이러스 RNA를 허용하는 Psi 패키징(packaging) 서열을 포함하고, 두 번째 플라스미드는 역전사 효소(reverse transcriptase)를 함유하고, 세 번째 플라스미드는 수포성 구내염 바이러스 외피 단백질(Vesicular Stomatitis Virus Envelope Protein)(VSV-G)로 대체된 이엔브이(env) 유전자를 포함하고, 네 번째 플라스미드는 전달되는 핵산 분자로 복제에 필요한 바이러스 유전자를 대체함에 의한 관심의 벡터이다.

이러한 렌티바이러스 벡터, 및 렌티바이러스를 생성하는 시스템 및 방법은 이 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Buchshacher and Wong-Staal (2000) Blood, 95:2499-2504; Blomer 외(1997) J Virol., 71:6641-9; Choi 외. (2001) Stem Cells, 19:236-46; ; 미국 특허번호 제6,218,186호 참조). 렌티바이러스 벡터는 복제 결손이고 복제에 필요한 유전자를 포함하지 않는다. 렌티바이러스를 생성하기 위해, 몇몇의 패키징 플라스미드는 패키징 세포주, 일반적으로 HEK 293의 유도체 또는 다른 유사한 세포주(예를 들어, 293FT 세포, 카탈로그 번호 R700-07, 인비트로겐(Invitrogen), 라이프 테크롤로지(Life Technologies), 칼즈배드(Carlsbad), CA); 293LTV 세포주,카탈로그 번호 LTV-100, 셀 바이오랩 주식회사(Cell Biolabs), Inc., 샌 디에고(San Diego), CA; 렌티-팩(Lenti-Pac) 293Ta 세포주, 카탈로그 번호 CLv-PK-01, 젠코포에이아(GeneCopoeia), 록빌(Rockville), MD)로 형질감염된다. 패키징 플라스미드는 각각 비리온 단백질(예를 들어, 캡시드 및 역전사효소) 및 벡터에 의해 전달되는 핵산 분자(패키징 세포주로 형질감염될 수 있음)를 암호화한다. 비리온내로 패키징되는 단일 가닥 RNA 바이러스 게놈이 전사된다. 렌티바이러스 벡터를 생성하는 방법이 당업자에게 널리 공지되어있다(예를 들어, Naldine 외. (1996) Science, 272:263-267 참조). 바이러스를 생성하기 위한 렌티바이러스 벡터 및 시스템이 상업적으로 사용가능하다(예를 들어, 셀 바이오랩 주식회사(Cell Biolabs, Inc.)로부터 사용가능한 렌티바이러스 발현 벡터 예컨대 pSMPUW 렌티바이러스 벡터 및 이의 유도체 및 렌티바이러스 발현 및 패키징 시스템(Lentiviral Expression and Packaging Systems) 참조).

렌티바이러스 벡터는 유전자 치료 적용에 사용되어 왔다(예를 들어, Manilla 외. (2005) Human Gene Therapy, 16:17-25; Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121 참조). 특히, 렌티바이러스 벡터는 짧은 간섭 RNA (siRNA)의 전달을 위해 사용되어 왔다(Sachdeva 외. (2007) Journal of Medical Virology, 79:118-26).

b. 비-바이러스 벡터(Non-Viral Vectors)

비바이러스 기반(non-viral based) 제제가 본원의 방법, 용도 및 조성물에서 전달되는 제제로 사용될 수 있다. 이들은 비바이러스 발현 벡터를 포함한다. 비바이러스 발현 벡터는 핵산이 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터)에 작동가능하게 연결된, 관심의 핵산, 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산, 안티센스 DNA 또는 siRNA를 포함한다. 적합한 벡터 골격(backbone)은, 예를 들어, 이 기술분야에서 일상적으로 사용되는 것 예컨대 플라스미드, 미니서클(minicircle), 및 인공염색체(예를 들어, 포유류 동물 인공 염색체(mammalian artificial chromosome)(MAC), 박테리아 인공염색체(bacterial artificial chromosome)(BAC), 효모 인공염색체(yeast artificial chromosome)(YAC), 또는 식물 인공염색체(plant artificial chromosome)(PAC)를 포함한다. 수많은 벡터 및 발현 시스템이 노바겐(Novagen)(매디슨(Madison), WI), 클론테크(Clontech)(팔로 알토(Palo Alto), CA), 스트라타겐(Stratagene)(La Jolla, CA), 및 인비트로겐/라이프 테크놀로지(Invitrogen/Life Technologies)(칼스바드(Carlsbad), CA)와 같은 기업으로부터 상업적으로 사용가능하다.

벡터는 일반적으로 암호화하는 영역에 기능적으로 연결된, 하나 이상의 조절 영역을 포함한다. 조절 영역은 제한 없이, 프로모터 서열, 인핸서 서열, SMARS(스캐폴드 매트릭스 부착 영역(scaffold matrix attachment regions)), 절연체(insulator), 반응 요소, 단백질 인지 부위, 유도성 요소, 단백질 결합 서열, 5' 및 3' 비번역 영역(untranslated region)(UTR), 전사 개시 부위, 종결 서열, 폴리아데닐화(polyadenylation) 서열, 및 인트론을 포함한다.

포유류 동물 숙주 세포에서 벡터로부터 전사를 조절하는 프로모터는 다양한 출처(source), 예를 들어, 바이러스 예컨대 폴리오마(polyoma), 시미안 바이러스 40(Simian Virus 40)(SV40)), 아데노바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 및 가장 바람직하게, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)(CMV)의 게놈으로부터, 또는 이종성 포유류 동물 프로모터, 예를 들어 β-액틴(β-actin) 프로모터 또는 EFlα 프로모터로부터, 또는 하이브리드(hybrid) 또는 키메라(chimera) 프로모터(예를 들어, β-액틴 프로모터에 융합된 CMV 프로모터)로부터 얻어질 수 있다. 본원에서 숙주 세포 또는 관련된 종으로부터의 프로모터가 또한 유용하다.

인핸서는 일반적으로 전사 시작 부위로부터 고정되지 않은 거리에서 기능하는 DNA의 서열을 말하고 전사 단위(transcription unit)로 5' 또는 3' 중 어느 하나가 될 수 있다. 뿐만 아니라, 인핸서는 그 자체 암호화 서열(coding sequence) 자체 내뿐만 아니라 인트론 내일 수 있다. 그들은 보통 길이가 10 내지 300 염기쌍(base pair (bp))이고, 그들은 시스(cis)에서 작용한다. 인핸서는 보통 프로모터근처로부터 전사를 증가시키기 위해 기능한다. 인핸서는 또한 전사의 조절을 매개하는 반응 요소를 포함할 수 있다. 많은 인핸서 서열이 포유류 동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, 태아단백질(fetoprotein), 및 인슐린)로부터 알려져 있지만, 일반적으로, 일반적인 발현을 위해 진핵세포 바이러스로부터 인핸서를 사용할 것이다. 예로는 복제 기점(replication origin)의 후기 측면 상에 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후기 측면 상에 폴리오마(polyoma) 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서이다.

프로모터 및/또는 인핸서는 유도될 수 있다(예를 들어, 화학적으로 또는 물리적으로 조절됨). 화학적으로 조절되는 프로모터 및/또는 인핸서는 예를 들어, 알코올, 테트라사이클린, 스테로이드, 또는 금속의 존재에 의해 조절될 수 있다. 물리적으로 조절되는 프로모터 및/또는 인핸서는, 예를 들어, 환경 인자, 예컨대 온도 및 빛에 의해 조절될 수 있다. 선택적으로(임의로)(optionally), 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 영역은 전사되는 전사 단위의 영역의 발현을 극대화하는 구성적 프로모터 및/또는 인핸서로 작용할 수 있다. 특정 벡터, 프로모터 및/또는 인핸서 영역은 세포 유형 특이적 방식으로 활성화될 수 있다. 임의로, 특정 벡터에서, 프로모터 및/또는 인핸서 영역은, 세포 유형과 독립적으로, 모든 진핵세포에서 활성화될 수 있다. 이 유형의 프로모터의 예시는 CMV 프로모터, SV40 프로모터, β-액틴 프로모터, EFlα 프로모터, 및 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR)이다.

벡터는 또한, 예를 들어, 복제의 기점 및/또는 마커를 포함할 수 있다. 마커 유전자는 세포 상에 선택가능한 표현형(예를 들어, 항생제 내성)을 부여할 수 있거나 또는 그렇지 않으면 검출가능할 수 있다. 검출가능한 마커의 예시는 E. coli lacZ 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)(GFP), 및 루시페라아제(luciferase)를 포함한다. 또한, 발현 벡터는 발현된 폴리펩티드의 조작 또는 검출(예를 들어, 위치파악(localization))을 용이하게 하도록 설계된 태그(tag) 서열을 포함할 수 있다. 태그(tag) 서열, 예컨대 GFP, 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)(GST), 폴리히스티딘(polyhistidine), c-myc, 헤마글루티닌(hemagglutinin), 또는 FLAG™ 태그(코닥(Kodak); 뉴 헤븐(New Haven), CT) 서열은 일반적으로 암호화된 폴리펩티드 및 마커를 포함하는, 융합 폴리펩티드로 발현된다. 이러한 태그는 카르복실 또는 아미노 말단 중 어느 하나를 포함하는 암호화된 폴리펩티드 내에 어딘가에 삽입될 수 있다.

특히, 예를 들어 관심의 유전자를 암호화하는 관심의 원하는 핵산분자 안티센스 DNA 또는 siRNA를 포함하는 원하는 핵산 분자 발현 벡터, 또는 다른 핵산 분자는, 전달되는 제제로 사용될 수 있는 네이키드 DNA(naked DNA)로 전달될 수 있다. 본원의 방법에서 네이키드 DNA의 전달 효율성은 당업자에게 널리 공지된 다양한 방법을 사용함에 의해 증가 될 수 있다(예를 들어, Li 및 Huang (2006) Gene Therapy, 13:1313-1319 참조). 이러한 방법은 본원 다른 곳에서 기술되고 당업자에게 알려진, 예를 들어, 예컨대 전기천공법(electroporation), 초음파천공법(sonoporation) 또는 "유전자 총" 접근을 포함한다. 또한, 전달의 효율성은 본원에 기술된 바와 같이 리포좀에서 캡슐화 또는 폴리머와의 복합체화에 의해 증가 될 수 있다. 특정 예에서, 핵산은 나노입자로 전달될 수 있다.

유전자 치료에서 비벡터(non-vector)의 사용을 설명하는 참조문헌은 다음을 포함한다: Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121.

나노입자(Nanoparticle)

비바이러스-기반(non-viral-based) 전달되는 제제는 관심의 세포로 특이적 표적화를 위한 표적화 분자를 포함하는 특정 담체(carrier)로, 핵산 분자가 캡슐화되거나 접합되는 나노입자(일반적으로 3-200 nm)를 포함한다. 유전자 치료를 위한 나노입자의 생성이 이 기술분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, Cho 외. (2008) Clin. Cancer. Res., 14:1310; Jin 외. (2007) Biotechnol. Prog., 23:32-41 참조). 나노입자는 폴리머, 예컨대 폴리머 담체(예를 들어, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리사카라이드(polysaccharide), 폴리(시아노아크릴레이트(poly(cyanoactylate), 폴리(락타이드글리콜라이드공중합체)(poly(lactide-co-glycolide))) 또는 예컨대 폴리(L-글루탐산(PGA), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 폴리에틸렌이민(PEI)으로부터 성장 중합(polymerization) 단계에 의한 것과 같은, 덴드리머(dendrimer)를 생성하기 위한 분지 폴리머(branched polymer)를 사용함에 의해 만들어질 수 있다. 생분해성 폴리머는 예를 들어, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락트산-글리콜산(polylactic-glycolic acid (PLGA)) 또는 폴리(메틸 메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate))(PMMA)를 포함하는 것이 이용될 수 있다. 나노입자의 다른 유형은 다양한 지질 혼합물을 사용하는 리포좀으로서; 산화철을 사용하는 자성 나노입자로서, Si0₂를 사용하는 실리카 나노입자로서, 염화금산(chlorauric acid) 또는 시트르산 나트륨(sodium citrate)을 사용하는 금 나노입자로서 생성될 수 있다. 나노입자 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있다.

표면상에 표적 분자, 예를 들어, 표적화되는 세포에서 발현되는 수용체에 대한 리간드이거나 또는 그렇지 않으면 결합하는 표적분자를 접합시키거나 코팅함에 의해 나노입자가 기능화될 수 있다. 이러한 표적 분자는, 리간드, 항체, 또는 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 이중 리간드(dual-ligand) 접근은 세포에 대한 선택성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 표적 분자의 예시는 성장 인자, 예를 들어, 섬유아세포(fibroblast) 성장 인자 수용체를 표적으로 하는 섬유아세포 성장 인자가 될 수 있다. 표적 분자의 선택은 치료되는 조직 또는 기관을 포함하는, 특정 적용에 의존하고, 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 표적화되는 나노입자는 이 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Franzen (2011) Expert Opin. Drug. Deliv. 8(3):281-98; Faraji and Wipf (2009) Bioorg. Med. Chem. 17(8):2950-62; Sajja 외, (2009) Curr. Drug. Discov. Technol. 6(1):43-51 참조). 특히, 나노입자의 조직 특이적 유전자 전달에 대한 방법이 이 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, Harris 외. (2010) Biomaterials, 31:998- 1006 참조. 예를 들어, 실질 간세포는 아시알로당단백질(asialoglycoprotein) 수용체(ASGP-R) 및 간의 렉틴(lectin)을 발현한다. 따라서, 간 특이적 나노입자는 이 기술분야에 알려져 있고 아시알로당단백질 수용체(ASGP-R) 및 다른 수용체, 예를 들어, 아시알로-퓨틴(asialo-feutin), 아시알로-트랜스페린(asialo-transferrin), 아시알로-세룰로플라스민(asialo-ceruloplasmin), 아시알로-락토페린(asialo-lactoferrin), 아시알로-오로소무코이드(asialo-orosomucoid), 락-BSA(lac-BSA), 헤파토글루불린(hepatoglobulin), 항체 및 갈락토스(galactose)를 인식하는 제제에 의한 기능화를 포함할 수 있다(예를 들어, Pathak 외. (2008) Int. J. Nanomedicine, 3:31-49 참조).

c. 전 세포(Whole Cell)

본원의 방법은 전달되는 제제로서 생체 외(ex vivo) 전달되는 핵산을 포함하는 세포를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 환자 또는 외인성 이종성 핵산이 도입된 공여자로부터 분리된 세포가 본원의 방법에 의해 환자로 직접 전달될 수 있다. 본 방법의 장점은 세포에 대한 면역반응이 혈관 구획화에 의해 감소 되는 것이다. 따라서, 대상체에서 유전적으로 변형된 세포 또는 세포들을 구획화된 기관으로의 세포 또는 이의 부분을 투여하는 방법이 본원에서 제공된다. 상기 방법은 기관 또는 이의 부분을 구획화하고, 구획화된 기관 또는 이의 부분으로 유전적으로 변형된 세포 또는 세포들을 투여하고, 본원에 기술된 바와 같이 유전적으로 변형된 세포 또는 세포들의 투여 후 기간 동안 구획화를 유지하고; 기관 또는 이의 부분의 혈관 순환을 복구하는 것을 포함한다. 전달되는 세포의 양은 원하는 효과, 특정 핵산, 치료되는 대상체 및 다른 유사한 인자에 의존하고, 그리고 당업자에 의해 결정될 수 있다.

핵산이 유전자 치료의 목적으로 도입될 수 있는 세포는 임의의 원하는, 사용가능한 세포 유형을 포괄하고, 상피세포(epithelial cell), 내피세포(endothelial cell), 각질세포(keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast), 근육세포(muscle cell), 간세포(hepatocyte); 혈액세포 예컨대 T 림프구(T lymphocyte), B 림프구(B lymphocyte), 단핵구(monocyte), 대식세포(macrophage), 호중구(neutrophil), 호산구(eosinophil), 거대핵세포(megakaryocyte), 과립구(megakaryocyte); 다양한 줄기세포 또는 전구세포(progenitor cell), 특히, 예를 들어, 골수, 제대혈(umbilical cord blood), 말초혈(peripheral blood), 또는 태아의 간에서 얻어지는, 조혈모세포(hematopoietic stem cell) 또는 전구세포(progenitor cell)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 세포는 다능성(pluripotent) 또는 분화전능성(totipotent) 줄기 세포(유도된 다능성 줄기 세포를 포함함) 또는 배아, 태아, 또는 완전히 분화된 세포일 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 동일한 대상체로부터의 세포일 수 있고 또는 수여자 대상체(recipient subject)와 동일한 또는 다른 종으로부터 세포일 수 있다. 바람직한 예에서, 유전자 치료에 사용되는 세포는 환자에게 자가 조직(autologous)이다. 세포를 유전적으로 변형하고 세포를 이식하는 방법은 이 기술분야에 공지되어 있다.

일반적으로, 핵산은 생성된 재조합 세포의 생체 내(in vivo) 투여 전에 세포 내로 도입된다. 이러한 도입은 형질감염(transfection), 전기천공(electroporation), 미세주입(microinjection), 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체 매재 유전자 전달, 미세세포(microcell) 매개된 유전자 이동, 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion) 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 이 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 실행될 수 있다. 외부 유전자의 세포로 도입을 위한 수많은 기법이 이 기술분야에 공지되어 있고(예를 들어, Loeffler and Behr, Meth. Enzymol. (1993) 217:599-618; Cotten 외, Meth. Enzymol. (1993) 217:618-644; Cline, Pharmac. Ther. (1985) 29:69-92 참조), 수신 세포의 필요한 발달 및 생리적 기능이 방해되지 않는다면 사용될 수 있다. 특정 예에서, 상기 방법은 세포로 핵산의 안정한 이동을 허용하여, 핵산이 세포에 의해 발현가능하고 그것의 유전성이고 세포 자손(progeny)에 의해 표현가능하게 한 것이다.

3. 예시적인 유전자 치료 제제

본원의 방법, 용도 또는 조성물에서 사용하기 위한 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제는 관심의 핵산, 예컨대 당업자에게 알려진 임의의 유전자 치료 제제를 암호화하는 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 치료될 특정 질환 또는 상태에 따라 적절한 유전자 치료 제제를 선택하는 것은 당업자의 수준 내이다. 수백개의 유전자 치료 제제가 임상 시험에 있고, 몇몇은 유럽(예를 들어, 글리베라®(Glybera®), AdLPL) 및 중국(예를 들어, rAd53, 젠디신(Gendicine)®)에서 시장 승인을 받았다(예를 들어, Sheridan (2011) Nature Biotechnology, 29:121 참조).

예를 들어, 예시적인 유전자 치료 벡터는 아데노바이러스- 또는 AAV-기반(based) 치료제를 포함한다. 본원의 방법, 용도 또는 조성물에서 사용을 위한 아데노바이러스-기반 또는 AAV-기반 치료제의 비제한적인 예시는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 예를 들어, 암의 치료에서 사용을 위한, 야생형 인간 종양 억제 단백질 p53을 암호화하는 재조합 아데노바이러스 벡터인(또한, 젠디신®(Gendicine®), 젠카신®(Genkaxin®)으로 알려짐, Qi 외. (2006) Modern Oncology, 14:1295-1297), rAd-p53; 숙주 p53을 불활성하는 ElB 유전자가 결여된 아데노바이러스인(또한, H101 또는 ONYX-015로 지칭됨; 예를 들어, Russell 외. (2012) Nature Biotechnology, 30:658-670 참조), Ad5_dll 520; 예를 들어, 암의 치료에서 사용을 위한, 사이토카인 GM-CSF를 포함하는 아데노바이러스, AD5-D24-GM-CSF (Cerullo 외. (2010) Cancer Res., 70:4297); 예를 들어, 암의 치료를 위한, HSV 티미딘 키나제(thymidine kinase) 유전자를 가진 복제 결핍성(replication deficient) 아데노바이러스인, rAd-HSVtk (세레프로®(Cerepro®)로 개발됨, 아크 세라퓨틱스(Ark Therapeutics), 예를 들어, 미국 특허 6,579,855 참조; 아드반타젠(Advantagene)사에 의해 프로스트어택™(ProstAtak)™으로 개발됨; 국제 PCT 출원번호 WO2005/049094호); 예를 들어, 암의 치료를 위한, 화학방사선 유도성 EGR-1 프로모터의 조절 하에서, 인간 종양 괴사 인자 알파(human tumor necrosis factor alpha)(TNF-α)를 발현하는 복제 결함이 있는 아데노바이러스 벡터인, rAd-TNF-α(티엔에프에라데™(TNFerade™), 젠백(GenVec); Rasmussen 외. (2002) Cancer Gene Ther., 9:951-7; 예를 들어, 혈광신생(angiogenesis) 및 관상 동맥 질환을 치료하는데 사용하기 위한, FGF-4를 암호화하는 아데노바이러스 벡터 혈청형 5인, rAd-FGF4(GENERX, BioDrugs, 2002, 16:75-6; 미국 특허번호 제5,792,453호); 예를 들어, 혈관신생 관련된 질환 및 상태를 치료하는데 사용하기 위한, 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor)(VEGF-D)를 암호화하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 5인, rAd-VEGF-D(트리남®(Trinam®), 아크 세라퓨틱스(Ark Therapeutics); 미국 특허 공개번호 US20120308522호); 예를 들어, 상처의 치료를 위한, PDGF-B를 암호화하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스 5인, rAd-PDGF(Excellarate, GAM501 Tissue Repair Co.; Blume 외. (2011) Wound Repair Regen., 19:302-308); 예를 들어, 암을 치료하기 위한, 사이토메갈로바이러스(CMV) 급-초기 프로모터(cytomegalovirus(CMV) immediate-early promoter)의 지도 하에서 인간 인터페론-베타 유전자를 발현하는 El 및 E3 유전자가 결실된 아데노바이러스 혈청형 5 벡터인, Ad-IFNβ(BG00001 및 H5.110CMVhIFN-베타(beta), 비오겐(Biogen); Sterman 외. (2010) Mol. Ther., 18:852-860); 예를 들어, LPLD 또는 가족성 고킬로마이크론혈증(hyperchylomicronemia)을 가진 대상체의 치료를 위한, 지단백 리파아제 결핍(lipoprotein lipase deficiency)(LPLD) 유전자를 암호화하는 유전자를 포함하는 AAV (알리포겐 티파보벡(alipogene tiparvovec), 글리베라®(Glybera®), 암스테르담 몰레쿨러 세라퓨틱스(Amsterdam Molecular Therapeutics); 예를 들어, 국제 공개번호 WO2010/134806호; WO2001000220호, Yla-Herttuala (2012) Mol. Ther., 20:1831-2 참조); 예를 들어, 급성 간헐성 포르피린증(Acute Intermittent Porphyria)(AIP)을 가진 대상체를 치료하기 위한, 효소 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase)(PBGD)를 암호화하는 유전자를 포함하는 AAV인, AMT-021(예를 들어, 미국 특허공개번호 US2011/0262399호; 유럽 특허공개번호 EP1049487호 참조); CMV 프로모터의 조절 하에서 NaGlu를 암호화하는 유전자를 포함하는 AAV-9인, rAAV9-CMV-hNaGlu(예를 들어, Fu 외. (2011) Mol. Ther., 19:1025-33 참조).

본원의 방법, 용도 및 조성물에서 사용을 위한 다른 예시적인 유전자 치료 제제는 rAd-HlFla(젠자임(Genzyme)/선웨이(Sunway)), V930/V932(머크(Merck)), NLX-P101 (뉴로로직스(Neurologix)), 토카-511(Toca-511)(토카젠(Tocagen), 샌 디에고(San Dieog)), 렌티글로빈(LentiGlobin)(블루벌드 바이오(Bluebird Bio)), 프로새빈(ProSavin)(옥스포드 바이오메디카(Oxford BioMedica)), rAAV-1-CB-hAAT (어플라이드 제네텍 테크롤로지스(Applied Genetic Technologies)), rAAV2-CB-사람 망막 색소 상피세포 특이적 65 달톤 단백질(human retinal pigment epithelium specific 65 dalton protein)(RPE65)(어플라이드 제네텍 테크롤로지스), AMT-101 (암스테르담 몰레큘러(Amsterdam Molecular)), Ad5CMV-p53(아벤티스(Aventis)), CERE-120(세레젠(Ceregene), 샌 디에고), CERE-110(세레젠, 샌 디에고), SERCA-2a (셀라돈(Celladon), 라 욜라(La Jolla)), AAV2-sFLT01(젠자임(Genzyme), tgAAG76 (타게티드 제네틱스(Targeted Genetics), 시애틀), tgAAC94(타게티드 제네틱스, 시애틀), GX-12(제넥신(Genexine), 서울, 한국), SC1B1(스캔셀(ScanCell), 노팅엄(Nottingham), UK), 알로벡틴-7(Allovectin-7)(비칼(Vical), 샌 디에고), VM202 (비로메드(ViroMed), 미네톤카(Minnetonka), MN) 또는 렉신-G(Rexin-G) 나노입자(에페이우스 바이오테크놀로지스(Epeius Biotechnologies), 산 마리노, CA)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

E. 조성물, 시스템 및 키트

본원의 구획화된 방법에 의한 조직 또는 기관 또는 이의 부분으로의 전달에 사용하기 위한 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 본원에서 제공되는 조성물은 생체 내(in vivo) 투여를 위해 적합하다. 상기 조성물은 실질 투여를 위해 제형화된다. 일반적으로, 본원의 조성물은 주사제로 제공된다. 주사제는 통상적인 형태로, 액체 용액 또는 현탁액 중 어느 하나, 주사 전에 용액 또는 액체 현탁액에 적합한 고형 형태, 또는 유탁액(emulsion)으로 제조될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공되는 전달되는 제제 조성물은 액체 형태이다.

조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 주사의 경우, 담체는 일반적으로 액체일 것이다. 특히, 약제학적 담체는 생물학적으로 또는 달리 원하지 않는, 즉, 조성물이 대상체에 원하지 않는 부작용을 유발하지 않고 또는 포함되는 약제학적 조성물의 다른 성분과 해로운 방식으로 상호작용하지 않고 대상체에 투여되는 임의의 담체이다. 담체는 활성 성분의 분해를 최소화하고 대상체에 불리한 부작용을 최소화하도록 선택된다. 예를 들어, 세포에 투여를 위한 약제학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 주사에 의한 전달을 위해 허용가능한 담체이고, 예컨대 세포를 손상시킬 수 있는 세제 또는 다른 화합물을 포함하지 않는다.

적합한 담체 및 그것의 제형이 레밍톤(Remington) The Science and Practice of Pharmacy, 21판, David B. Troy, ed., Lippicott Williams & Wilkins (2005)에 기술되어 있다. 투여를 위한 조성물은 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액(suspension), 및 유탁액(emulsion)을 포함한다. 비수성 용매의 예시는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대 올리브 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르 예컨대 에틸 올레이트(ethyl oleate)이다. 수성 담체는 식염수(saline) 및 완충 매질을 포함하는, 물, 알코올성/수성 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 주사 매질로서, 일반적인 담체는 주사 용액을 위한 통상의 첨가제, 예컨대 안정제, 염 또는 식염수, 및/또는 완충액을 포함한다. 예시의 생리적으로 허용가능한 담체는 멸균 수, 생리식염수, 완충된 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 예를 들어, 예시적인 생리적 담체는 생리 식염수, 포스페이트 완충 식염수, 평형 염용액(balanced salt solution)(BSS), 또는 링거 용액 및 증점 및 가용화 제제, 예컨대 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 및 폴리프로필렌 글리콜 및 그것의 혼합물을 포함하는 용액을 포함한다. 용액의 pH는 일반적으로 약 5 내지 약 8 또는 약 7 내지 7.5이다. 필요한 경우, 제형의 pH는 제제화된 화합물 또는 그것의 전달 형태의 안정성을 향상시키기 위해 약제학적으로 허용가능한 산, 염기 또는 버퍼로 조정될 수 있다.

전달되는 제제(즉 핵산 분자인 또는 핵산 분자를 포함하는)는 조성물에서 유일한 약제학적 활성 성분으로 제제화될 수 있거나 치료되는 특정 질환을 위한 다른 활성 제제와 조합될 수 있다. 선택적으로(optionally), 본원에서 제공되는 조성물에서 다른 의약 제제, 약제학적 제제, 담체, 보조제(adjuvant), 희석제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 임의의 1 이상의 습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대 소듐 라우릴 설페이트(sodium lauryl sulfate) 및 마그네슘 스테아레이트(magnesium sterate), 뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향료(flavoring) 및 방향제, 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 비활성 가스(inert gas)가 또한 조성물에 존재할 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 예시적인 다른 제제 및 부형제는, 예를 들어, 수용성 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드(cysteine hydrochloride), 소듐 바이설페이트(sodium bisulfate), 소듐 메타바이설파이트(sodium metabisulfite), 소듐 설파이트(sodium sulfite); 유용성 항산화제, 예컨대 아스코르빌 팔미테이트(ascorbyl palmitate), 부틸레이트화 하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole)(BHA), 부틸레이트화 하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene) (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트(propyl gallate), α-토코페롤; 및 금속 킬레이팅 제제, 예컨대 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid)(EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산을 포함한다.

조성물은 또한 콜라겐 스폰지를 포함하는 생분해성 지지체로 흡착되는, 또는 리포좀 내인, 서방출 제형으로 제형화 될 수 있다. 서방출 제형은 선택되는 시간의 기간, 예컨대 1개월 또는 약 1개월까지, 몇(several) 투여량이 투여되도록, 다중 투여량(multiple dosage) 투여를 위해 제형화 될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 리포좀은 총 약 2회 내지 약 5회까지 또는 그 이상의 단일 투여량이 한 번의 주사로 투여되도록 제조될 수 있다.

조성물이 신체로부터 급속한 제거에 대해 그들을 보호하는 담체와 함께, 예컨대 시간 방출 제형 또는 코팅으로 제조될 수 있다. 이러한 담체는 조절된 방출 제형, 예컨대, 마이크로캡슐화 전달 시스템, 및 신체 내로 직접 위치될 수 있는 생분해성, 생체적합성 폴리머, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트(ethylene vinyl acetate), 폴리안하이드라이드(polyanhydride), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리오르토에스테르(polyorthoester), 폴리락트산(polylactic acid) 및 다른 유형의 이식물(implant)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 펠렛(pellet), 예컨대 ELVAX 펠렛(에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 수지(ethylene-vinyl acetate copolymer resin))로 투여될 수 있다.

조직-표적화된(tissue-targeted) 리포좀을 포함하는, 리포좀 현탁액이, 또한 약제학적으로 허용가능한 담체로서 적합하다. 예를 들어, 리포좀 제형은 당업자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, Kim 외. (1983) Bioch. Bioph. Acta 728:339- 348; Assil 외.(1987) Arch Ophthalmol. 105:400; 및 미국 특허번호 제4,522,811호 참조). 전달되는 제제는 리포좀 시스템의 수성상으로 캡슐화될 수 있다.

활성 물질은 또한 점탄성 물질(viscoelastic material), 예컨대 약 3 백만 분율의 소디움 히알루로네이트(sodium hyaluronate)의 높은 분자량(MW)의 용액인, 상표 히알론(HEALON)으로 판매되는, 히알루론산(hyaluronic acid)을 포함하는(파마시아(Pharmacia) 주식회사에 의해 제조됨; 예를 들어, 미국 특허번호 제5,292,362호, 제5,282,851호, 제5,273,056호, 제5,229,127호, 제4,517,295호 및 제4,328,803호 참조), 원하는 작용을 손상시키지 않는 다른 활성 물질, 또는 원하는 작용을 보충하거나 다른 작용을 갖는 물질과 혼합될 수 있다. 추가적인 활성 제제가 포함될 수 있다.

1. 투여량 제형(Dosage Formulations)

본원에서 정맥 내 투여되는 동일한 전달되는 제제의 양 미만 또는 100배 미만의 양으로 조직 또는 기관으로 실질 투여를 위해 제형화되는 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 제공된다. 예를 들어, 조직 또는 기관에 실질 투여를 위해 제형화되는 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 조직 또는 기관에 정맥으로 투여되는 동일한 전달되는 제제의 양의 100 배 미만, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 600 배, 700 배, 800 배, 900 배, 1000 배, 5000 배, 10000 배 또는 그 미만의 양으로 제공된다. 상기 조성물은 단일 투여량 제형 또는 다중 투여량 제형으로 제공될 수 있다.

예를 들어, 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노-관련된 바이러스인 전달되는 제제의 양을 포함하여 제공된다. 특히, 아데노바이러스 또는 아데노-관련된 바이러스는 그것의 게놈 안에 적어도 하나의 이종성 핵산 분자, 예컨대 치료적 핵산 분자를 포함하는 것이다. 조성물에서 단일 투여량 투여를 위한 아데노바이러스의 양은 10 pfu 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10²pfu 내지 1 x 10¹⁰, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁹ fu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁸ pfu, 또는 1 x 10⁶ pfu 내지 1 x 10⁹ pfu, 또는 10 입자 내지 1 x 10¹² 입자, 1 x 10² 입자 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10⁸ 입자, 또는 1 x 10⁶ 입자 내지 1 x 10⁹ 입자이다. 일반적으로, 단일 투여량 투여를 위한 조성물에서 아데노바이러스의 양은 10 vp 내지 1 x 10¹² vp, 1 x 10² vp 내지 1 x 10¹⁰ vp, 1 x 10³ vp 내지 1 x 10¹² vp, 1 x 10³ vp 내지 1 x 10¹⁰ vp, 1 x 10³ vp 내지 1 x 10⁹ vp, 1 x 10³ vp 내지 1 x 10⁸ vp, 1 x 10³ vp 내지 1 x 10⁶ vp, 1 x 10⁶ vp 내지 1 x 10¹² vp, 1 x 10⁶ vp 내지 1 x 10¹⁰ vp, 또는 약 1 x 10¹² vp , 1 x 10¹¹ vp, 1 x 10¹⁰ vp, 1 x 10⁹ vp, 1 x 10⁸ vp, 1 x 10⁷ vp, 1 x 10⁶ vp, 1 x 10⁵ vp, 1 x 10⁴ vp, 1 x 10³ vp, 1 x 10² vp, 10 vp 미만이다. 다른 예에서, 단일 투여량 투여를 위한 조성물에서 아데노바이러스의 양은 10 pfu 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10² pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁸ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10⁶ pfu 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10⁶ pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 또는 약 1 x 10¹² pfu, 1 x 10¹¹ pfu, 1 x 10¹⁰pfu, 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10⁸ pfu, 1 x 10⁷pfu, 1 x 10⁶pfu, 1 x 10⁵ pfu, 1 x 10⁴pfu, 1 x 10³pfu, 1 x 10² pfu, 10 pfu 미만이다. 조성물은 10 μL 내지 5 mL, 예컨대 20 μL 내지 1 mL 또는 50 μL 내지 500 μL로 제형화 될 수 있다. 이러한 조성물에서, 아데노바이러스는 실질 투여를 위해 제형화 될 수 있다. 특정 예에서, 아데노바이러스는 간으로 실질 투여를 위해 제형화 될 수 있다.

2. 조합물(Combinations)

실질 투여를 위해 제형화된 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 다른 제제와 조합으로 제공될 수 있다. 다른 제제는 효율을 증가시키거나 실질 세포에 위해 전달되는 제제의 유입을 용이하게 하거나 또는 전달되는 제제로의 면역 반응을 조절하거나 조정하는 제제일 수 있다.

예를 들어, 실질 투여를 위해 제형화되는 전달되는 제제 및 전달되는 제제와 결합하거나 복합체로 되고 그것의 세포로의 유입을 매개하는 제제 또는 전달 비히클을 포함하는 조성물을 포함하는 조합이 본원에서 제공된다. 예시적인 제제는, 양이온성 리포좀 및 지질, 지단백(lipoprotein), 합성 폴리머 또는 폴리펩티드, 무기 화합물 또는 비타민을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 폴리머의 예시는 다가양이온(polycation) 또는 다가음이온(polyanion)을 포함한다. 예를 들어, 전달되는 제제는 폴리아민(polyamine), 칼슘 포스페이트 침전, 히스톤 단백질, 프로타민(protamine), 폴리에틸렌이민(polyethylenemine), 폴리라이신(polylysisne), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리오르니틴(polyornithine), DEAE 덱스트란(dextrane), 폴리브렌(polybrene), 폴리암포라이트 복합체(polyampholyte complex), 스퍼민(spermine), 스퍼미딘(spermidine), 퓨트레신(purtrescine), 인간 혈청 알부민, DNA 결합 단백질, 비-히스톤 염색체 단백질, DNA 바이러스로부터 코트(coat) 단백질 및 N-치환된 글리신의 폴리머와 조합으로서 제공될 수 있다. 제제는 개별적으로 또는 함께 제형화 될 수 있다.

추가의 예에서, 치료학적 이식유전자(transgene)의 발현이 전사 인핸서(transcriptional enhancer), 예컨대 히스톤 데아세틸라제(histone deacetylase)(HDAC) 저해제, 예를 들어, 히드록삼산(hydroxamic acid), 환상 테트라펩티드(cyclic tetrapeptide), 발프론산(valproic acid) 및 기타에 의해 향상될 수 있다. 따라서, 전달되는 제제는 바이러스 특이적 세포 표면 수용체의 전사 인핸서인 제제 또는 화합물과 조합으로 제공될 수 있다. 이러한 제제 또는 화합물은, 예를 들어, 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 저해제를 포함한다. HDAC 저해제는 히드록삼산(hydroxamic acid), 환상 테트라펩티드(cyclic tetrapeptide), 벤즈아미드(benzamide), 전자친화성 케톤(electrophilic ketone) 또는 지방산(aliphatic acid) 화합물의 클래스(class)의 것을 포함한다. 예를 들어, HDAC 저해제는, 트리코스타틴 A(trischostatin A), 보리노스탯(vorinostat)(SAHA), 베리오노스탯(belionostat)(PXD101), LAQ824, 파노비노스탯(panobinostat)(LBH589), 엔티노스탯(entinostat)(MS-275), C199, 모세티노스탯(mocetinostat)(MGCD0103), 로미뎁신(romidepsin)(lstodax), 발프론산(valproic acid), PCI-24781, SB939, 레미노스탯(resminostat), 기비노스탯(givinostat), CUDC-101, AR-42, CHR-2845, CHR-3996, 4SC-202, CG200745, 케베트린(Kevetrin), 또는 트리코스타틴 A(trichostatin A)(TSA)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. HDAC 저해제의 예시는 아데노바이러스 수용체 CAR의 전사 인핸서인, 발프론산(valproic acid)이다. 연구는 발프론산(valproic acid) 존재에서 아데노바이러스 흡수가 증가되는 것을 보여주었다(Segura-Pancheco 외. (2007) Genet. Vaccines Ther., 5:10). 이러한 예에서, 전달되는 제제를 포함하는 조성물은 추가적인 제제 또는 화합물(예를 들어, 전사적 인핸서 제제)와 함께 또는 개별적으로 제형화 된다. 전사적 인핸서 제제는 약 또는 50 mg 내지 8000 mg, 예컨대 약 100 mg 내지 5000 mg, 1000 mg 내지 4000 mg의 양으로 제공될 수 있다. 조합에서 제제 또는 화합물 조성물이 단일 또는 다중 투여량 투여를 위해 제형화 될 수 있다. 추가적인 제제 또는 화합물 조성물이 허용가능하고 당업자에게 알려진 임의의 투여 경로로 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 전사적 인핸서는 경구 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여 또는 실질 투여용으로 제형화 될 수 있다.

추가 예에서, 실질 투여를 위해 제형화되는 전달되는 제제를 포함하는 조성물 및 면역 억제제를 포함하는 조성물을 포함하는 조합이 본원에서 제공된다. 예시적인 면역 억제제는 사이크로스포린(cyclosporine)(네오랄®(neoral®), 산디문®(Sandimmune®)), 프레드니손(prednisone)(노보 프레드니손®(Novo Prednisone®), 아포 프레드니손®(Apo Prednisone®)), 아자티오프린(azathioprine)(이뮤란®(Imuran®)), 타크로리무스(tacrolimus) 또는 FK506(프로그랍®(Prograf®)), 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)(셀셉트®)(CellCept®), 시로리무스(sirolimus)(라파뮨®(Rapamune®)), OKT3(뮤로모랍 C03®(Muromorab C03®), 오소크론®(Orthoclone®)), ATGAM & 사이모글로블린(ATGAM & Thymolobulin)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 예에서, 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 면역 억제제와 함께 또는 개별적으로 제형화된다. 면역 억제제를 포함하는 추가적인 조성물이 허용가능하고 당업자에게 알려진 임의의 투여 경로에 대해 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 면역 억제제는 경구 투여, 정맥 내 투여, 피하 투여 또는 실질 투여용으로 제형화 될 수 있다.

3. 제조품 및 키트

조성물 또는 조합이 저장 및/또는 사용을 위해 포장(package)될 수 있다. 제제를 패키징하는데 사용하기 위한 패키징 재료는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 패키징 재료의 예시는 앰플(ampoule), 병, 튜브, 바이알(vial), 용기(container), 시린지(syringe), 및 선택된 제형 및 실질 투여에 적합한 임의의 패키징 재료를 포함한다. 예를 들어, 조성물 또는 조합이 유리, 플라스틱 또는 다른 적합한 재료로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 또는 단일 용량 바이알로 동봉될 수 있다. 패키징 재료는 실질 투여 목적을 위해 투여를 용이하게 하기 위한 니들(needle) 또는 다른 주사 장치를 포함할 수 있다. 패키지의 선택은 특정 전달되는 제제에 의존한다. 일반적으로, 패키징은 그 안에 포함된 조성물과 비반응성이다. 또한, 조성물 및 패키징 재료가 멸균된다.

예를 들어, 전달되는 제제를 포함하는 조성물이 예컨대 투여 시 전달되는 제제(예를 들어, 바이러스 입자)의 충분한 양이 전달되는 양을 포함하는 용기(container), 예컨대 밀봉된 멸균 바이알 또는 시린지 내에 제공될 수 있다. 조성물에서, 전달되는 제제, 예컨대 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스의 양은, 약 10 pfu 내지 1 x 10¹² pfu, 1 x 10² pfu 내지 1 x 10¹⁰, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10³ pfu 내지 1 x 10⁸ pfu, 또는 1 x 10⁶ pfu 내지 1 x 10⁹pfu; 또는 약 또는 10 입자 내지 1 x 10¹² 입자, 1 x 10² 입자 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10³ 입자 내지 1 x 10⁸ 입자, 또는 1 x 10⁶ 입자 내지 1 x 10⁹입자이다. 용기(container) 내 조성물의 부피는 50 μL 내지 50 mL, 50 μL, 내지 5 mL, 50 μL 내지 500 μL, 100 μL 내지 10 mL, 100 μL 내지 5 mL, 100 μL 내지 2 mL, 100 μL 내지 1 mL, 200 내지 4 mL, 200 μL 내지 2 mL, 1 mL 내지 10 mL 또는 1 mL 내지 2 mL일 수 있다. 예를 들어, 용기(container)가 단일 사용 또는 다회 사용 투여를 위해 제공될 수 있다. 용기(container)에서 제제의 부피는 100 μL 내지 10 mL, 여기서 약 20 내지 5 mL, 예컨대 20 내지 500 μL, 50 내지 150 μL, 100 μL 내지 10 mL 또는 200 μL, 내지 2 mL일 수 있고, 적어도 약 10 내지 10¹⁰ 플라크 형성 단위(plaque forming unit)(pfu) 또는 입자, 예컨대 10²내지 10⁶ 플라크 형성 단위 또는 입자가 이러한 부피 내에서 전달된다.

전달되는 제제를 포함하는 조성물 또는 조합은 패키징 물질, 단일 또는 다중 투여량 투여를 위한 실질 투여를 위해 제형화된 제제의 양, 및 특정 핵산 분자의 전달에서 사용 및/또는 특정 적용에서 사용을 위한 전달되는 제제를 나타내는 라벨을 포함하는 제조품으로 패키지 될 수 있다.

이러한 동봉된(enclosed) 조성물, 조합 및 제조품은 키트로 제공될 수 있다. 특히, 그 안에 동봉된 전달되는 제제 조성물과 함께 앰플, 병, 튜브, 바이알, 용기, 시린지를 포함하는 키트가 제공된다. 키트는 선택적으로 전달되는 제제의 투여를 허용하는 장치 예컨대 시린지, 니들(needle), 또는 다른 주사 장치로 임의로 제공될 수 있다. 조성물은 투여를 위한 물품(item)에 포함될 수 있고 또는 나중에 추가되도록 별도로 제공될 수 있다. 키트는, 투여를 위한 투여량(dosage), 용량 요법(dosing regimen) 및 지침을 포함하는 적용을 위한 지시를, 선택적으로, 포함할 수 있다. 다른 시약이 또한 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는, 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 구획화를 가져오는 장치, 조직 또는 기관의 동원(mobilization)을 가져오기 위한 장치, 구획화를 모니터링하기 위한 타이머(timer) 및 상기 방법의 실시에 사용하기 위한 다른 시약을, 임의로 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 실질 클램프(parenchymal clamp)를 포함할 수 있다.

F. 전달, 발현 또는 효율의 평가

본원에서 구획화된 방법의 사용에서, 전달되는 제제의 전달, 핵산 분자의 발현을 확인 및/또는 달리 상기 방법의 실행을 확인하기 위해 임의의 수의 파라미터가 모니터링(monitoring)되거나 평가될 수 있다. 예를 들어, 전달되는 제제의 세포로의 유입이 모니터링될 수 있고, 실질 또는 전신 순환에서 전달되는 제제의 존재가 평가될 수 있고, 암호화된 폴리펩티드의 발현이 평가될 수 있고, 조직의 독성이 모니터링되거나 평가될 수 있고 그리고/또는 면역 시스템의 활성화가 결정될 수 있다. 당업자는 이러한 방법 및 기법을 잘 알고 있다. 이러한 방법 및 기법이 임의로 수행될 수 있다.

1. 전달되는 제제의 모니터링

예를 들어, 본원의 구획화된 방법을 사용하는 전달되는 제제의 전달 또는 투여시, 대상체에서 전달되는 제제의 존재가 평가되거나 검출될 수 있다. 예를 들어, 본원에 예시된 바와 같이 혈관 분리의 방출 전에, 동안 및 후에 말초혈액에서 전달되는 제제의 전신 방출 또는 발현된 이식유전자 산물을 측정하기 위한 분석이 수행될 수 있다. 일반적으로, 본원의 방법에서, 조직 또는 부분으로 본원의 방법을 사용하여 본원에서 전달되는 제제의 직접적인 투여 후 이식유전자 산물의 10% 미만, 및 일반적으로 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만이 전신 순환에서 검출된다.

전달되는 제제의 검출이 전달되는 제제 또는 핵산 분자의 검출가능한 모이어티(moiety)에 대한 접합 또는 작동가능한 연결에 의해 용이하게 될 수 있다. 검출가능한 모이어티는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 화학발광(chemiluminescent) 모이어티, 생물발광(bioluminescent) 모이어티, 형광 모이어티, 방사성핵종, 및 금속을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 검출가능한 모이어티는 예를 들어, 루시퍼라제(luciferase), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein), 금 콜로이드(colloidal gold), 철, 가돌리늄(gadolinium), 및 갈륨-67(gallium-67) 및 당업자에게 널리 공지된 다른 모이어티를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

전달되는 제제가 조직 또는 체액 시료에서 모니터링 될 수 있다. 예를 들어, 실질 조직이, 그리고 특히 구획화된 영역에서, 수확되고 처리될 수 있고(예를 들어, 균질화(homogenization)에 의함), RNA 또는 DNA가 그로부터 분리되거나 정제될 수 있다. 분석될 수 있는 체액은, 예를 들어, 말초 혈액을 포함한다. 조직 또는 체액으로부터 RNA 및 DNA를 추출하는 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 트리졸®-기반(TRIzol®-based) 방법(예를 들어, 트리아졸®(TRIzol®) 시약, 라이프 테크놀로지(Life Technologies), 칼스배드(Carlsbad), CA)이 일반적으로 생물학적 물질로부터 RNA를 추출하기 위해 사용된다. 예를 들어, PCR 및 당업자에게 공지된 다른 표준 방법을 사용하여 유전자 특이적 프라이머 또는 프로브가 설계될 수 있고 전달되는 제제 또는 핵산 분자가 검출될 수 있다. 이는 PCR이 루시퍼라제에 대한 프라이머를 사용하여 수행되는 본원의 실시예에서 예시된다.

조직(예를 들어, 균질화된 시료) 또는 생물학적 유체 시료에서 그것의 검출이 또한 형광계(fluorometer), 광도계(luminometer), 색채 플레이트 리더(colorimetric plate reader), 가이어 계수기(Geiger counter), 액체 섬광 계수기(liquid scintillation counter)를 사용하여 수행될 수 있다. 방법의 선택은 특정 검출가능한 모이어티에 의존하고 당업자의 수준 범위 내이다. 예를 들어, 루시퍼라제(luciferase) 활성이 본원의 실시예에서 예시된 바와 같이 광도계(luminometer)를 사용하여 평가될 수 있다. 또한, 검출은 대상체로부터 생물학적 시료에서 전달되는 제제에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 발현을 검출함으로써 임의로(optionally) 수행된다. 폴리펩티드는 웨스턴 블롯(western blot), 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역형광(immunofluorescence) 또는 ELISA를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 과정을 사용하여 검출될 수 있다.

특정 예에서, 조직 또는 기관으로부터 실질 세포가 또한 분리될 수 있고 전달되는 제제의 세포내 존재에 대해 평가될 수 있다. 특히, 실질 세포의 분리는 일반적으로 트립신(trypsin), 콜라게나제(collagenase) 및/또는 다른 프로테아제(protease)를 사용하는 조직의 효소 분해(소화)에 의한다. 이러한 절차는 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, Somers 외. (2007) DMD, 35:1797-1805; Methods in Cell Biology, vol ⅩⅢ, David M. Prescott ed., Academic Press, 1976; Chapter 4, "Preparation of Isolated Rat Liver Cells", pp 29-83 참조). 예를 들어, 조직은 모든 혈액을 제거하기 위해, 예컨대 인산염 완충 식염수로, 관류(perfuse)될 수 있다. 조직은 가위로 잘게 갈아서 프로테아제를 포함하는 분해 매질에서 분해될 수 있다. 이것은 일반적으로 세포를 수집하기 위해 필터링(filtering) 될 수 있는 세포 현탁액을 야기한다. 임의의 남아있는 프로테아제는 예컨대 소태아혈청(fetal bovine serum)에서 세포의 수집에 의해 불활성화될 수 있다. 세포는 그 다음에 세척되고 특정 세포와 호환(양립)가능하다고 알려진 선택의 세포 배양 배지에서 배양될 수 있다. 세포 생존성이 평가될 수 있고, 새롭게 분리된 세포가 전달되는 제제의 세포내 존재를 위해 분석될 수 있다. 세포 내 제제의 존재가 고정(fixation) 및 세포막의 투과성(permeabilization)에 의해 평가될 수 있다(예를 들어, 상업적으로 사용가능한 시약 예컨대 오르소퍼미어픽스™(ORTHOPermeaFix™)(OPF) 또는 픽스&펌 세포 투과성 키트®(FIX&PERM Cell Permeabilization kit®); 안 데르 그럽 바이오 리서치 GmbH(An Der Grub Bio Research GmbH), 임텍(Imtec)). 세포는 유동 세포계측법(flow cytometry)에 의해, 플레이트 리더 장치(plate reader device)(예를 들어, 형광계(fluorometer), 광도계(luminometer) 또는 색채 플레이트 리더(colorimetric plate reader))를 사용함으로써, 또는 방사능을 평가함으로써 평가될 수 있다. 또한, 원하는 경우, 현미경 방법(microscopy method)이 사용될 수 있다. 또한, 세포 균질액(cell homogenate)이 제조될 수 있고 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석에 사용될 수 있다.

2. 숙주 독성 및 면역 활성화

전달되는 제제의 투여 시에 개시되는 조직 독성 및 면역 반응이 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 독성이 하부 조직 또는 기관 또는 이의 부분의 조직병리학(histopathology)에 의해 평가될 수 있다. 조직 시료는 생검(biopsy)으로 수득될 수 있고 일반적으로, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)을 사용하여, 조직학적 분석을 위해 염색될 수 있다. 세포 비정상(cellular abnormality)이 평가될 수 있다. 예를 들어, 면역 활성화와 관련된, 조직병리학적 분석이 염증성 세포 침윤, 예컨대 림프 또는 호중구 침투를 확인할 수 있다. 구획화되지 않은 동일한 대상체의 동일한 조직 또는 기관의 영역에 대해 비교가 만들어 질 수 있다. 다른 예에서, 본원의 방법에 의해 처리되지 않은 대조군 대상체로부터 조직이 사용될 수 있다.

상향조절된, 존재하는, 또는 조직 또는 기관의 손상(injury)과 관련된 인자 또는 마커(marker)의 발현을 평가함으로써 독성이 또한 모니터링 될 수 있다. 예를 들어, 조직 손상의 생화학적 마커가 평가될 수 있다. 이러한 마커는 당업자에게 공지되어 있고 특정 조직 또는 기관에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 간과 관련하여, 간의 손상(injury) 또는 훼손(damage)과 관련된 공지된 바이오마커는, 예를 들어, 알라닌 전이효소(alanine transferase)(ALT), 아미노 전이효소(aminotransferase)(AST), 알칼리성 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 빌리루빈(bilirubin)을 포함한다. 대상체에서 이러한 마커의 기초 수준이 본원의 절차의 개시 전에 결정될 수 있다. 정상 대조군 대상체가 또한 이러한 효소의 정상 수준의 척도로 사용될 수 있다. 또한, 마커의 수준이 구획화된 조직 또는 기관의 영역 대 구획화되지 않은 영역 사이에서 비교될 수 있다. 일반적으로, 마커 예컨대 ALT의 수준은, 즉 조직 손상 예컨대 간 손상을 나타내는 대조군의 적어도 2배이다.

추가 예에서, 면역 활성화의 다른 마커가 평가될 수 있다. 면역 활성화의 마커는 국소 조직에서 평가될 수 있다. 다른 예에서, 면역 활성화의 마커는 전신 순환에서 평가될 수 있다. 본원의 방법에서, 전달되는 제제의 투여 후에, 면역 활성화의 마커, 예컨대 사이토카인 발현이 대상체의 전신 순환에서 유의성있게 상승하지 않거나 상승되지 않는다. 또한, 전달되는 제제가 투여되는 기관 또는 이의 부분에서 일부가 증가하는 반면, 관찰되는 국소 면역 활성화는 기존의 유전자 치료 방법에서 나타는 것보다 적게 관찰된다. 이러한 마커에서 기초선 값(baseline value)은 정상 대상체 또는 본원의 방법에서 전달되는 제제의 투여 전에 치료되는 대상체로부터 결정될 수 있다. 또한, 구획화의 효과는 구획화된 조직 또는 기관의 부분 대 구획화되지 않는 조직 또는 기관의 부분에서 면역 마커를 비교함으로써 결정될 수 있다.

예를 들어, 전달되는 제제에 대한 중화 항체(neutralizing antibody)의 존재가 평가되거나 결정될 수 있다. 특정 예에서, 바이러스-특이적인(virus-specific) 중화 항체가 검출될 수 있다. 일반적으로, 혈청은 예컨대 본원의 방법과 같이, 바이러스를 투여한 대상체로부터 수집된다. 혈청에서 중화 항체의 존재 및 양을 평가하는 다양한 분석법이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 중화 항체는 플라크 분석(Harvey 외. (1999) J Virol, 73:6729-6742), 인간 혈청의 아데노바이러스 캡시드(capsid) 단백질의 웨스턴 블롯(Western Blot)을 사용하는, 바이러스 기능의 혈청 억제(sera inhibition)(Mandel 외. (1978) Adv. Virus. Res., 23:205-68)에 기초하여 그리고 정량적인 형태학적 기준(Vincent 외. (2001)에 기초하여 검출될 수 있다. 중화 항체의 혈청 수준은 또한 항바이러스 특이적 항체를 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 항-Ad5 항체가 사용될 수 있다(예를 들어, 65H6, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 록포드(Rockford), IL).

다른 예에서, 사이토카인의 발현, 및 특히 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokine)이 평가될 수 있다. 조직 또는 체액(예를 들어, 말초 혈액)이 DNA 또는 RNA를 위해 처리될 수 있다. PCR, 예컨대 RT-PCR이 수행될 수 있다. 사이토카인의 RT-PCR을 위한 시약을 포함하는 다양한 분석법이 상업적으로 사용가능하다(예를 들어, 라이프 테크놀로지(Life Technologies)로부터 태크맨®(TaqMan®) 분석, 칼스배드(Carlsbad), CA). 또한, 관심의 임의의 사이토카인에 대한 프라이머가 설계될 수 있다. 다른 예에서, 효소결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA), 효소 면역분석법(enzyme immunoassay)(EIA) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석법이 사이토카인의 발현을 평가하는데 사용될 수 있다. 사이토카인 및 다른 면역 단백질을 평가하는 시약이 널리 공지되어 있고 상업적으로 사용가능하다. 예를 들어, EIA 및 ELISA 키트가 IL-6, IL-lα, IL-1β, IL-2, TNF-α및 다른 것을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 수많은 사이토카인에 대해 상업적으로 사용가능하다. 이러한 분석에서 사용하기 위한 조직 제제에 대해, 당업자에게 공지된, 조직 균질화 과정이 사용될 수 있다. 조직이 균질화 버퍼에서 균질화되고, 잔해(debris) 및 불용성 물질을 제거하기 위해 원심분리될 수 있고 총 단백질 농도가 결정될 수 있다(예를 들어, 쿠마시(Coomassie) 염색 분석법, BCA 방법, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 사용함). 원심분리된 상등액(supernatant)의 분취량(aliquot)이 웨스턴 블롯을 위해 처리되고, 또는 ELISA-기반 분석(ELISA-based assay)을 위해 희석되고 직접적으로 사용될 수 있다.

G. 적용 및 사용 방법

본원에서 제공되는 구획화된 방법은 이식유전자(transgene) 산물의 지속된(sustained) 그리고 장기간 높은 수준의 발현을 허용한다. 따라서, 상기 방법은 의학의 적용을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 결함이 있는 유전자 산물을 대체하는 적용 또는 치료적 제제의 외인성 투여에 적용; 이식(transplant)을 위한 기관의 생산; 형질전환 동물에서 치료적 단백질의 생산(예를 들어, 생물반응기(bioreactor)); 농업적, 수의학적 및 산업적 적용을 포함하는, 다양한 적용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 선택된 폴리펩티드의 생체 내(in vivo) 세포의 발현에 사용될 수 있다. 일부 예에서, 폴리펩티드 제제는 폴리펩티드가 대상체에서 질환 또는 상태를 치료하거나 개선하거나 또는 그렇지 않으면 대상체에서 삶의 질을 향상시키는 치료적 환경에서 유용할 수 있다. 다른 예에서, 폴리펩티드 제제는 예를 들어, 육류 생산의 질 또는 양을 향상시키는 적용인, 농업적 환경에서 유용할 수 있다.

상기 방법은 유전자 치료 요법을 필요로 하고 본원의 방법에 의한 치료 순응하는 임의의 대상체 또는 환자에서 수행될 수 있다. 이러한 대상체의 예시는, 마우스(mouse), 랫트(rat), 소, 돼지, 양, 염소, 말 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, 유아(infant), 걸음마기의 아동(toddler) 또는 어린 아동을 포함하는, 18세 미만의 아동이 유전적 결함과 관련되는 질환 또는 상태의 치료를 위해 본원에서 고려된다.

본원의 방법의 예시적 적용이 하기와 같이 제공된다. 투여되는 특정 핵산 분자에 따라 다른 적용이 존재하는 것으로 이해된다. 임의의 원하는 적용에 기초하여 관심의 핵산 분자를 선택하는 것은 당업자의 수준 내에 있다. 하기 본원의 기술은 단지 예시를 위한 것이다.

1. 질환 및 장애의 치료

본원에서 제공되는 구획화된 방법을 사용하여 대상체로 핵산 분자의 전달에 의한 질환, 장애 또는 상태의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 치료되는 질환, 장애 또는 상태는 외인성으로 전달되는 핵산 분자에 의한 치료가 잘 받아들여지는 임의의 것이다. 예를 들어, 이러한 질환 또는 상태는 상태와 관련된 유전자의 발현을 감소시키거나 증가시키는 것, 상태와 관련된 유전자 산물의 활성을 감소시키거나 증가시키는 것 또는 그렇지 않으면 상태와 관련된 변화(예를 들어, 질환 또는 상태와 관련된 징후, 증상 또는 효과)에 대응하는 것에 의해 달성되는 치료의 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 유전자 치료가 단일유전자 질환(예를 들어, 혈우병(hemophilia) A 및 B, 타입 I 당뇨병, 알파-1-항트립신(alpha-1-antitrypsin)(AAT), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근이영양증(muscular dystrophy) 및 수많은 기타)을 포함하는, 유전적 결핍과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있거나 또는 질환 또는 상태(예를 들어, 암)를 완화시키는 것과 관련된 치료적 단백질을 암호화함으로써 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.

본원의 이러한 예의 임의의 것에서, 전달되는 제제는 핵산 분자 또는 치료적 핵산이거나 치료적 폴리펩티드를 암호화하는 핵산분자를 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 것은 대상체의 기관 또는 이의 부분을 구획화함; 본원에서 기술하는 대로 핵산 제제의 투여 다음에 미리 결정된 기간 동안 구획화된 기관 또는 이의 부분에 직접적으로 관심의 핵산분자이거나 이를 포함하는 선택된 전달되는 제제를 투여하고; 기관 또는 이의 부분에 혈관 순환을 회복시킴으로써 질환 또는 장애를 가진 대상체를 치료하는 방법이다.

본원에서 제공되는 방법은 널리 다양한 질환 및 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 전달되는 제제, 및 그 안에 핵산분자는 다루어지는 장애 또는 질환, 및 영향 받는 특정 기관에 기초하여 선택된다. 본원의 다른 부분에서 기술한 바와 같이, 당업자는 치료되는 특정 질환 또는 장애에 따라 핵산 분자의 유형을 결정할 수 있다. 또한 예시로, 예를 들어, 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)을 치료하기 위해 CFTR을 암호화하는 핵산, 통증의 치료를 위해 NP2를 암호화하는 핵산, 암의 치료를 위해 혈관신생 저해제(angiogenesis inhibitor) 또는 종양 억제자(tumor suppressor)를 암호화하는 핵산, 당뇨병의 치료를 위해 인슐린 또는 엑센딘-4(exendin-4)를 암호화하는 핵산을 전달하기 위해 구획화되는 방법이 사용된다.

또한, 치료되는 질환 또는 장애를 기초로 구획화하기 위한 특정 조직 또는 기관, 및 투여되는 특정 전달되는 제제가 당업자에게 공지되어 있다. 일부 경우에, 전달되는 제제는 조직 또는 기관 형질도입(transduction)을 나타내지 않고, 따라서 영향 받는 조직 또는 기관으로 직접적으로 전달된다. 다른 경우, 특정 전달되는 제제는 전신 순환에 따른 조직 향성(tropism) 또는 형질도입을 나타내기 위해 선택된다. 예를 들어, AAV-4, AAV-6, AAV-8 및 AAV-9는 폐, 심장, 간, 신장, 골격 및 심장을 포함하는, 복수의 조직에 광범위한 형질도입을 나타내고, 따라서 골격 또는 심장 질환 및 장애의 치료를 달성하는 전신 발현을 위한 전달되는 제제일 수 있다. 다른 예에서, AAV-9는 중추 신경계(CNS)로 형질도입하기 위한 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 우회할 수 있고, 따라서, 신경퇴행성 장애 또는 다른 CNS 질환 및 장애의 치료를 달성하기 위한 전신 발현을 위한 전달되는 제제이다.

특히, 폐는 무엇보다도 암, 천식, 낭포성 섬유증, 알파-1-항트립신 결핍(alpha-1-antitrypsin deficiency) 및 호흡곤란 증후군(respiratory distress syndrome)를 포함하는, 많은 급성 및 만성 질환의 유전자 치료를 위한 중요한 표적 기관이다. 근육은 근이영양증(muscular dystrophy) 또는 사르코-마리에-투스(charcot-Marie-Tooth)(CMT) 질환과 같은 근육 또는 운동 장애(motor disorder)를 치료하기 위한 유전 치료를 위한 표적 기관이다. 뇌는 운동 뉴런 질환(예를 들어, 척수성 근위축증(spinal muscular atrophy)(AMA), 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)(ALS), X-연관된 부신백질이영양증(X-linked adrenoleukodystrophy)(ALD)), 또는 파킨슨병(Parkinson's Disease), 대사성 또는 리소좀 장애 예컨대 산필립포(Sanfilippo) (점액다당류증 타입 Ⅲ (mucopolysaccharaidosis type Ⅲ); MSPⅢ) 또는 카타반병(Canavan disease)을 포함하는, 결실(missing)되거나 또는 결함이 있는 유전자와 관련된 질환 및 상태의 유전자 치료를 위한 중요한 표적 기관이다. 피부는 만성 상처, 비후성 반흔, 비후성 흉터(hypertrophic scar), 켈로이드(keloid), 암, 유전적 질환 및 전신 질환에 대한 유전자 치료를 위한 표적 기관이다. 예를 들어, 성장 인자(예를 들어, PDGF-B, FGF2, VEGF)가 상처 회복(repair)을 위해 피부에 표적화 될 수 있다(Liu 외. (2001) Yonsei Medican Journal, 42:634-645). 간은 혈색소 침착증(hemochromatosis), 혈우병 A 및 B(hemophilia A and B), 알파 1 항트립신 결핍(alpha 1 antitrypsin deficiency), 윌슨병(Wilson's disease), 크리글러-나자르 증후군 타입 I(Crigler-Najjar syndrome type I), 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍(ornithine transcarbamylase deficiency), 타입 Ⅱa 가족성 고콜레스테롤혈증(type Ⅱa familial hypercholesterolemia), 피브리노겐결핍증(afibrinogenemia), 리소좀 저장 질환(lysosomal storage disease), 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 유도된 간염을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 수많은 선천적(inherited), 유전적 및 대사성 간 질환 및 장애의 유전자 치료를 위한 표적 기관이다.

특정 조직 또는 기관에 대한 관심의 핵산을 포함하는 전달되는 제제의 유전자 치료는 전신 발현을 가져올 수 있다. 예를 들어, 간의 세포 기구(cellular machinery)가 많은 양의 단백질을 혈액으로 생산하고 분비할 수 있기 때문에, 간으로 유전자 치료 전달은 전신 질환 또는 상태와 관련된 간 이외(non-liver)를 치료하는데 사용될 수 있다. 따라서, 간의 표적화는 혈액 응고 인자, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 대사 효소 및 항-프로테아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 다양한 질환 및 상태의 치료를 위해 혈액 순환으로 치료상 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 간은 또한 간에서 인슐린을 분비하는 β세포로 간세포를 분화시키는데 사용될 수 있다. 유전자 치료가 간을 표적으로 함으로써 수많은 질환 및 상태를 치료하는 데 사용되어 왔다.(Nakai H., "Hepatic Gene Therapy" pp. 343-370 in Molecular Pathology of Liver Diseases (S.P.S. Monga, ed.). 다른 예에서, 각질세포가 순환 내로 방출될 수 있는 단백질의 많은 양을 생산할 수 있기 때문에 전신 질환이 피부를 표적으로 함으로써 치료될 수 있다. 따라서, 피부의 유전자 치료는 종양성(neoplastic), 바이러스성, 염증성 및 유전성 질환을 치료하기 위한 사이토카인(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨 또는 기타 사이토카인), 호르몬(예를 들어, 인슐린, 성장 호르몬 및 기타 호르몬), 응고 인자 및 기타 단백질을 암호화하는 핵산을 전달하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전적 결함 예컨대 혈우병 B(hemophilia B)는 간질세포로 인자 IX의 전달에 의해 치료될 수 있다.

또한, 투여되는 전달되는 제제의 양은 치료상 핵산 또는 핵산 분자에 의해 암호화되는 치료상 폴리펩티드의 원하는 치료상 투여량을 기초로 조정될 수 있다. 본원에 기술되는 바와 같이, 본원에서 제공되는 구획화된 방법의 사용에 의해, 전달되는 제제의 용량 및 단백질 산출량(output)은 선형이다. 따라서, 전달되는 제제의 특정 투여량은 특정 핵산 분자, 전달되는 제제, 특정 유전적 치료, 전달되는 제제가 투여되는 대상체, 표적 기관 및 이의 부분, 예상되는 흡수, 필요한 치료상의 양, 및 기타 인자를 기초로 경험적으로 결정될 수 있다.

본원의 구획화된 방법에 의한 핵산 분자의 전달에 의해 치료될 수 있는 예시의 질환 또는 장애는, 선천적인(inherited) 효소 결핍(예를 들어, 점액다당류증(mucopolysaccharidosis), 글리코겐 저장 질환, 및 리소좀 저장 질환), 암, 혈우병(hemophilia), 당뇨병(diabete), 근이영양증(muscular dystrophy), 심혈관계 장애(cardiovascular disorder), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 암, 신경 퇴행성 장애(neurodegenerative disorder), 외상(trauma), 통증(pain), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 자가면역 질환(autoimmune disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 선천적 면역 결핍(inherited immune deficiency), 고혈압 및 파킨슨병(Parkinson's Disease)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 질환 또는 상태는 혈우병 A 및 B(hemophilia A and B), 타입 I 당뇨병(type I diabetes mellitus), 알파 1-항트립신(alpha-1-antitrypsin)(AAT) 결핍, 혈색소 침착증(hemochromatosis), 윌슨병(Wilson's disease), 크리글러-나자르 증후군 타입 I(Crigler-Najjar syndrome type I), 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍(ornithine transcarbamylase deficiency), 타입 Ⅱ, 가족성 고콜레스테롤 혈증(familial hypercholesterolemia), 피브리노겐결핍증(afibrinogenemia), 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease)(GSD) 타입 Ia, GSD 타입 Ib, GSD 타입 Ⅱ (폼페병 (Pompe)), 점액다당류증(mucopolysaccharidosis)(MPSl), MPS ⅢA, MPS ⅢB, MPS Ⅶ, 파브리병(Fabry disease), 고셔병(Gaucher's disease), 니이만-픽 증후군(Niemann-Pick syndrome), 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍(ornithine transcarbamylase deficiency)(OTC) 결핍(deficiency), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 간 섬유증(liver fibrosis), 간 허혈증 재관류 손상(liver ischemia reperfusion injury), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis)(ALS), 갈락토스혈증(galactosemia), 페닐케톤뇨증(phenylketonuria), 단풍시럽뇨병(maple syrup urine disease), 티로신혈증 타입 1(tyrosinemia type 1), 메틸말론산혈증(methylmalonic acidemia), 시트룰린혈증(citrullinemia), 통풍(Gout) 및 레쉬 니한 증후군(Lesch Nyan syndrome), 슬라이 증후군(Sly syndrome), 젤위거 증후군(Zellweger syndrome), 중증 복합 면역결핍 질환(severe combined immunodeficiency disease)(SCID), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria), 지단백 리파제 결핍(lipoprotein lipase deficiency)(LPLD), 또는 다발성 경화증(multiple sclerosis) 중에서 선택된다.

간에 대한 예시로, 본원의 방법은, 이 기술분야에서 유전자 치료가 사용되는 임의의 질병을 치료하는 구획화된 간 또는 간의 부분에, 예컨대 섹션 D.1에 임의의 기술된, 임의의 핵산을 포함하는 전달되는 제제의 전달에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원의 방법에서 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는 질환 또는 상태의 전달 및 치료를 위해 간 (또는 다른 조직 또는 기관)이 구획화될 수 있다: 혈우병 A의 치료를 위한 인자 Ⅷ의 전달; 혈우병 B를 치료하기 위한 인자 Ⅸ의 전달; α(알파)1-항트립신(AAT) 결핍을 치료하기 위한 α(알파)1-항트립신(AAT)의 전달; 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease)(GSD) 타입 Ia을 치료하기 위한 글루코스-6-포스페이트-α(glucose-6-phosphate-α)의 전달; GSD 타입 Ib을 치료하기 위한 G6PT의 전달; GSD 타입 Ⅱ(폼페병, Pompe)를 치료하기 위한 산-α-글루코시다제(acid-α-glucosidase)의 전달; 점액다당류증(mucopolysaccharidosis)(MPSI)을 치료하기 위한 α-L-이두로니다제(α-L-iduronidase)의 전달; MPS ⅢA를 치료하기 위한 설파미다제(sulphamidase)의 전달; MPS ⅢB를 치료하기 위한 α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-acetylglucosaminidase)(NaGlu)의 전달; MPS Ⅶ를 치료하기 위한 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase)의 전달; 파브리병(Fabry disease)을 치료하기 위한 α-갈락토시다제 A(α-galactosidase A)의 전달; 고셔병(Gaucher's disease)을 치료하기 위한 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase)의 전달; 니이만-픽 증후군(Niemann-Pick syndrome)을 치료하기 위한 산 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase)의 전달; OTC 결핍을 치료하기 위한 오르니틴 트랜스카바밀라제(transcarbamylase)(OTC)의 전달; 크리글러-나자르 증후군(Crigler-Najjar syndrome)을 치료하기 위한 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1(UDP glucuronosyltransferase 1A1)(UGT1A1); 가족성 고콜레스테롤 혈증(hypercholesterolemia)을 치료하기 위한 LDL 수용체; 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)을 치료하기 위한 페닐알라닌 히드록실라제(phenylalanine hydroxylase); 금속단백질분해효소(metalloprotease)(MMP1 또는 MMP8); 간 섬유증(liver fibrosis)을 치료하기 위한 u-PA, TIMP 길항제 또는 항-HSC 분자; 간 허혈증 재관류 손상(liver ischemia reperfusion injury)을 치료하기 위한 항-ROS 분자; 당뇨병을 치료하기 위한 β 세포 전환분화(transdifferentiation)를 위한 프로인슐린 전구체 또는 전사 인자; B형 간염을 치료하기 위한 바이러스 RNA에 대한 RNAi; C형 간염을 치료하기 위한 바이러스 RNA에 대한 RNAi; 간암을 치료하기 위한 p53; 다발성 경화증(multiple sclerosis)을 치료하기 위한 IFN-β 또는 다른 항염증성 사이토카인; 유도된 간염을 치료하기 위한 인터페론-α; 또는 지단백 리파제 결핍(lipoprotein lipase deficiency)(LPLD)을 치료하기 위한 지단백 리파아제(lipoprotein lipase).

핵산에 의해 암호화되는 치료상의 핵산 또는 치료상의 폴리펩티드로 다루어 질 수 있는 임의의 질환 또는 상태가 기재될 수 있기 때문에, 이 목록은 제한되고자 하는 의도가 아니다. 예시적인 질환 및 상태가 하기에 기술된다.

a. 혈우병 A 및 B

본원의 구획화된 방법 및 물질에 의해 치료될 수 있는 상태의 예시는 혈우병이다. 혈우병의 두 유형, A 및 B가 있다. 혈우병 A를 가진 환자는 인자 Ⅷ로 알려진 단백질이 결여되는 반면에 혈우병 B를 가진 환자는 인자 Ⅸ로 알려진 단백질이 결여된다. 상처를 앓거나 혈관 구조가 손상되는 경우 이들 혈액 응고 인자 중 어느 하나의 낮은 수준 또는 완전한 부재는 출혈을 멈추게 하는 환자의 능력에 심각한 장애를 야기한다. 이는 잠재적인 치명적 결과와 함께 연장된 출혈을 야기한다. 혈우병에 대한 현재의 치료는 혈액 제품 또는 필요한 혈액 인자의 재조합 버전(recombinant version)으로 정기적 수혈을 포함한다. 그러나, 공여자 혈액의 향상된 스크리닝에도 불구하고 혈액 또는 혈액 제품 수혈을 통한 바이러스 감염의 위험이 문제로 남아있다. 또한, 혈액 제품 유래된(blood product-derived) 및 재조합 유래된(recombinant-derived) 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ 치료의 둘 다의 경우, 응고 인자에 대한 활성을 차단하는 항체의 발달이 일부 환자에 대한 치료를 복잡하게 했다. 인자 Ⅷ 또는 인자 Ⅸ 수준에서 보통의(modest) 증가가 혈우병 A 또는 B 각각의 많은 임상 결과를 개선하기에 충분한 것으로 보여졌으므로, 혈우병이 유전자 치료에 대해 이상적인 후보로 여겨져 왔다.

본원의 방법을 사용하여, 인자 Ⅷ에 대한 유전자를 포함하는 전달되는 제제가 혈우병 A를 치료하는데 사용될 수 있다. 다른 예에서, 본원의 방법을 사용하여, 인자 Ⅸ에 대한 유전자를 포함하는 전달되는 제제가 혈우병 B를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 간을, 예를 들어 간의 작은 부분을, 필요한 혈액 응고 인자를 순환으로 영구히 분비할 수 있는, 따라서 잠재적으로 상기 질환의 결과를 개선하는, 새로운(de novo) 내분비샘(endocrine gland)이 되도록 허용한다. 이것은 구획화된 조직 또는 기관, 예를 들어 구획화된 간, 예컨대 간의 작은 부분의 실질(parenchyma)에, 혈액응고 인자를 암호화하는 전달되는 제제의 재조합 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스) 또는 일부 다른 유형의 벡터를 직접적으로 전달하는 본원의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 특정 응고 인자는 근본적인 결핍(underlying deficiency)에 따라 인자 Ⅷ 또는 Ⅸ일 수 있다. 유전적인 정보는 전사 및 형질도입되고 따라서 혈액응고 인자가 합성되어 순환으로 분비되어 혈액 응고 장애/결핍(blood clotting impairment/deficiency)을 바로잡을 수 있다.

b. 가족성 고콜레스테롤혈증(Familial Hypercholesteroloemia)

본원에서 구획화된 방법 및 물질에 의해 치료될 수 있는 상태의 예시는 가족성 고콜레스테롤혈증이다. 가족성 고콜레스테롤혈증은 저밀도 지단백 수용체(low-density lipoprotein receptor)(LDLR) 유전자의 돌연변이에 의한 상염색체 우성 장애(autosomal dominant disorder)이다. 혈장 콜레스테롤을 낮추는 것이 관상 동맥 질환의 위험을 감소시키지만, 가족성 고콜레스테롤혈증을 갖는 환자는 일반적으로 약물 치료에 대해 저조하게 반응한다. 가족성 고콜레스테롤혈증을 갖는 대상체는 저밀도 지단백 수용체를 암호화하는 핵산을 투여함으로써 치료될 수 있다(예를 들어, Grossman 외. (1995) Nat. Med., 1:1148-1154; Shichiri 외. (2003) Gene Ther., 10:827-31 ; Yang 외. (1994) Immunity, 1:433-442; Yang 외. (1995) J. Virol, 69:2004-2015; Yang 외. (2004) Biochem. J, 379:89-97 참조). 마찬가지로, 본원에서 구획화된 방법을 사용하여, LDLR에 대한 유전자를 포함하는 전달되는 제제가 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하는데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, 구획화된 간, 예컨대 간의 작은 부분에, LDLR을 암호화하는 전달되는 제제의 재조합 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스) 또는 일부 다른 유형의 벡터를 구획화된 조직 또는 기관의 실질(parenchyma)에, 직접 전달함으로써 본원의 방법을 사용하여 달성될 수 있다.

c. 타입 I 당뇨병(Type I Diabetes Mellitus)

본원에서 구획화된 방법 및 물질에 의해 치료될 수 있는 상태의 또 다른 예시는 타입 I 당뇨병이다. 타입 I 당뇨병은 인슐린 생산의 실패로부터 발생하고, 이것은 다시 혈당 수준에 현저한 증가를 초래한다. 또한, 지속되는 높은 혈당 수준은 환자의 삶의 질과 수명을 심하게 줄어들게 하는 심각한 결과를 초래한다. 당뇨병은 현재 치료법이 없는 만성 질환이다.

당뇨병의 일부 병리학적 효과의 완화가 본원의 방법을 사용하여 인슐린 수준을 부분적으로 회복시킴에 의해 달성될 수 있다. 본원의 구획화된 방법을 사용하여, 인슐린에 대한 유전자를 포함하는 전달되는 제제가 당뇨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관, 예를 들어 구획화된 간, 예컨대 환자의 간의 작은 부분의 실질(parenchyma)로, 인슐린 유전자를 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 바이러스 벡터 또는 다른 벡터)를 직접 전달함에 의해 달성될 수 있다. 이는 형질도입되는 간 세포에 의한 인슐린의 안정한, 장기간의, 합성 및 분비를 야기한다.

d. 알파-1-항트립신(Alpha-1-Antitrypsin)(AAT) 결핍

본원에서 구획화된 방법 및 물질에 의해 치료될 수 있는 상태의 또 다른 예시는 통상적인 단일유전자(monogenic) 폐 질환 알파-1-항트립신(AAT) 결핍이다. AAT는 간에서 생산되고 순환으로 분비되어 폐로의 길을 찾는데, 폐에서 AAT는 폐포 벽의 엘라스틴(elastin) 섬유 및 다른 결합 조직의 구성요소를 호중구(neutrophil) 엘라스타제(elastase)에 의한 분해로부터 보호한다. AAT 결핍은 폐기종(emphysema)으로 인한 환자의 사망으로 이어질 수 있다. AAT를 암호화하는 유전자가 분리될 수 있고 재조합 인간 AAT 단백질의 외인성 투여는 현재 치료의 하나의 형태를 나타낸다.

다수의 연구는 또한 유전자 치료에 기초한 치료상의 접근의 개발을 향한 전망을 보여주었다. 유전자 치료 방법은, 예를 들어, AAT를 발현하는 골격근 세포 또는 간 세포의 형질도입을 포함한다(Song 외. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci, 95:14384-14388; Song 외. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci, 98:4084-8; Song 외. (2001) Gene Ther., 8:1299-1306; Song 외. (2004) Hepatology, 40:918-24; Zhang 외. (2003) Gene Therapy, 10:2148-52; Ferkol 외. (1998) Am. J Respir. Cell Mol. Biol, 18:591-601).

본원의 방법을 사용하여, AAT에 대한 유전자를 포함하는 전달되는 제제가 AAT 결핍을 치료하는데 사용될 수 있다 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관(예를 들어, 예컨대 근육 또는 간, 예를 들어, 간의 작은 부분)의 의 실질(parenchyma)로 AAT를 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 비바이러스 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스)를 직접 전달함으로써 달성될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 벡터로 AAT를 암호화하고 조직 기관의 부분을 형질도입하는 핵산 서열의 통합(incorporation)에 의해, AAT의 안정한 장기간 발현이 달성될 수 있고 잠재적으로 폐기종을 해결할 수 있다.

e. 혈관신생 및 암

본원에서 구획화된 방법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태의 예시는 혈관신생(angiogenesis)이다. 혈관신생은 새로운 모세혈관이 기존의 맥관구조(vasculature)로부터 생성되는 과정이다. 그것은 혈관내피 세포의 증식(proliferation) 및 이주(migration)가 관여하는 복잡한 과정이다. 혈관신생은 생식(reproduction), 배아 발생(embryonic development) 및 상처 회복(wound repair)에 근본적인 역할을 한다. 그러나, 조절되지 않는 혈관신생은 많은 질환, 예컨대 고형 종양 성장 및 전이, 관절염, 당뇨병, 및 실명의 일부 형태의 진행에 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 혈관신생은 성장하는 종양에 공급하고 전이(metastasis)를 촉진하는 종양으로의 혈액 공급의 형성으로 인해 암의 성장 및 확산에 중요한 역할을 한다. 따라서, 항혈관신생 제제는 혈관신생이 중요한 역할을 하는 암 및 다른 질환을 치료하는데 사용될 수 있다.

혈관신생은 전-혈관신생 성장 인자(pro-angiogenic growth factor) 예컨대 VEGF, FGF 및 PDGF 및 항혈관신생 인자 예컨대 엔도스타틴(endostatin) 및 안지오스타틴(angiostatin) 사이의 복잡한 상호작용에 의해 조절된다. 이들 두 그룹의 인자(factor) 사이의 불균형은 병리학적 혈관신생을 생성한다. 연구의 여러 계통은 암을 가진 환자로의 항혈관신생 인자, 예컨대 엔도스타틴 또는 안지오스타틴의 주입(infusion)이, 이들 두 힘(force) 사이의 균형을 회복하고, 비정상적인 혈관신생을 막고 따라서 종양 성장 및 전이를 막을 수 있음을 제안했다.

본원의 방법을 사용하여, 항혈관신생 인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 혈관신생 질환 및 상태, 예컨대 암, 관절염, 당뇨병 및 실명을 치료하는데 사용될 수 있다. 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관(예를 들어, 예컨대 간, 예를 들어, 간의 작은 부분)의 실질로 항혈관신생 인자, 예컨대 엔도스타틴 또는 안지오스타틴을 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 비바이러스 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스)를 직접 전달함에 의해 달성될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 벡터로 항혈관신생 인자를 암호화하고 조직 기관의 부분을 형질도입하는 핵산 서열의 통합(incorporation)에 의해, 항혈관신생 제제의 안정한 장기간 발현이 달성될 수 있고 잠재적으로 폐기종을 해결할 수 있다.

f. 자가면역 및 염증성 장애(예를 들어, 다발성 경화증(Multiple Sclerosis))

본원에서 구획화된 방법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태의 예시는 자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 다발성 경화증(multiple sclerosis)(MS), 류마티스성 관절염, 골관절염, 당뇨병, 크론병(Crohn's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogrens syndrome), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근염(myostitis) 및 루푸스(lupus)이다. 예를 들어, MS는 뇌 및 척수의 축삭(axon) 주위의 지방의 미엘린 수초(fatty myelin sheath)가 손상되는 중추 신경계(CNS)의 자가면역 염증성 질환이다. 그 결과 축삭이 더 이상 신호를 전도할 수 없다.

유전자 치료에 의한 자가면역 염증성 질환, 예컨대 MS 및 다른 상태의 치료는, 사이토카인, 사이토카인 길항제, 항-T 세포 단일클론항체(monoclonal antibody), 신호 전달(signal transduction)의 저해제를 사용하여 면역 활성화를 표적으로 한다. 예를 들어, 항염증성 유전자는 면역 반응을 하향 조절(down-modulate)하기 위해 도입될 수 있다(Neumann 외. (2005) Gene Therapy and Molecular Biology, 9:61-76). 예시적인 항염증성 유전자는 사이토카인 또는 다른 면역조절성(immunomodulatory) 제제 예컨대, 인터류킨-4, 인터류킨-10, 형질전환 성장 인자 b(transforming growth factor b), 인터페론-베타(IFNβ), 인터류킨-1 수용체 알파(IL-lRα), 가용성 TNF 수용체(sTNF-R), 가용성 인터류킨-1 수용체(sIL-lR) 또는 가용성 인터페론-감마 수용체(sIFNγR)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 인타페론 베타로의 치료는 MS에 대해 승인되었다(Kieseier 외. (2007) Exp. Neurol, 203:1-4). 또한, 바이러스 및 비바이러스성 유전자 치료 접근에 더하여, MS의 치료는 치료되는 표적 대상체로부터 수확된, 항염증성 사이토카인(예를 들어, IFN-β, IL-10 또는 IL-4)을 발현하도록 조작된, 그리고 나서 유전자 산물의 전달을 위해 숙주 대상체로 재도입되는, 세포(예를 들어, 수지상 세포 또는 T 세포)의 사용을 포함한다.

본원의 방법을 사용하여, 항염증성 유전자 또는 사이토카인을 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제가 자가면역 및 염증성 장애, 예컨대 다발성 경화증(multiple sclerosis)(MS), 류마티스성 관절염, 골관절염, 당뇨병, 크론병(Crohn's disease), 쇼그렌 증후군(Sjogrens syndrome), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 근염(myostitis) 및 루푸스(lupus)를 치료하는데 사용되기 위해 사용될 수 있다. 특정 예에서, 항염증성 유전자 또는 사이토카인(예를 들어, IFN-β, IL-10 또는 IL-4)을 암호화하는 핵산을 암호화하는 전달되는 제제는 MS를 치료하는데 사용된다. 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관(예를 들어, 예컨대 간, 예를 들어, 간의 작은 부분)의 실질로 항염증성 유전자 또는 사이토카인(예를 들어, IFN-β, IL-10 또는 IL-4)을 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 비바이러스 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스, 또는 전 세포(whole cell))를 직접 전달함으로써 달성될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 벡터로 항염증성 유전자 또는 사이토카인을 암호화하고 조직 기관의 부분을 형질도입하는 핵산 서열의 통합(incorporation)에 의해, 항염증성 제제의 안정한 장기간 발현이 달성될 수 있다.

g. 급성 간헐성 포르피린증(Acute Intermittent Porphyria)(AIP))

본원에서 구획화된 방법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 상태의 예시는 급성 간헐성 포르피린증(AIP)이다. AIP는 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase)(PBGD), 헴(heme) 합성 경로의 세 번째 효소의 결핍으로 특징화되는 선천성 대사 질환이다. 유전 형질(genetic trait)을 물려받은 사람에서 효소 활성은 정상의 ~50%이다. 상기 질환은 상염색체 우성 방식으로 물려받고 가장 일반적인 급성 포르피리증이다. 비록 모든 인종에서 발생하지만 북 유럽, 주로 스웨덴, 영국 및 아일랜드에 가장 널리 퍼져있다. 미국 및 기타 국가에서 추정되는 유병률(prevalence)은 5/100,000이고 북부 스웨덴에서 60-100/100,000 만큼 높다. PBGD 유전자에서 225개 초과의 돌연변이가 지금까지 기술되어 있다. 지배적인 임상적 특징은, 복부 통증 및 신경내장(neurovisceral) 및 순환의 장애를 포함하는, 신경계의 기능장애로 인한 급성 간헐성 발발(acute intermittent attack)이다. 복부 통증은 85-95%의 경우로 보고되었고 신경학적 변화에 선행하거나 관련되는, 가장 일반적인 특징이다. AIP가 인식되지 않고 해로운 약물, 예컨대 발발을 촉발할 수 있는 간 시토크롬 P450 효소에 의해 대사되는 약물이 철회되지 않는(not withdrawn) 경우, 호흡기 및 연수(bulbar) 마비 및 사망이 발생할 수 있다. 갑작스런 사망이 또한 심장 부정맥의 결과로 발생할 수 있다. 원발성 간암(Primary liver cancer) 및 신장 기능 장애가 때때로 또한 발생한다.

PBGD 돌연변이를 물려받은 대상체의 높은 비율은 포르피린성 증상을 발생시키지 않는다, 즉 임상 표현율(clinical penetrance)이 매우 낮다. AIP 보유자(carrier)에서 임상적 증상은 급성 발발(acute attack)을 유발하는 약물 또는 다른 촉발 요인으로 인한 헴(heme) 합성의 증가 된 수요에 따른 결과로 포르피린 전구체 델타-아미노레불린산(delta-aminolevulinic acid)(ALA) 및 포르포빌리노겐(porphobilinogen)(PBG)의 증가 된 생산 및 배설과 관련이 있다. 이들 상태에서 PBDG 결핍은 GPA 합성을 제한하고 결과적으로 ALA 합성효소(ALA synthetase) (ALAS1)의 헴 매개된 억압(heme-mediated repression)이 손상된다. 간이 과량의 포르피린 전구체의 주요한 근원이라는 것을 나타내는 증거가 있다. 반복되는 포르피린성 위기(porphyric crise)가 발생하기 쉬운 대상체에서 발발(attack) 사이에 이들 화합물이 상승 되어 남아있고 위기 동안에 더 증가 된다. 시간의 긴 기간 동안 질환이 불활성 상태로 남아 있는 경우 그들은 정상으로 감소할 수 있다.

급성 발발(acute attack)은 일반적으로 사춘기(puberty) 이후에 발생하고 잠복해 있는(latent) 사람에서 내분비 요인 및 스테로이드 호르몬 및 약물, 영양상의 요인, 제한된 탄수화물 및 칼로리 섭취량, 흡연, 스테로이드 호르몬 및 경구 피임약, 납 중독, 병발 감염(intercurrent infection), 수술 및 정신적인 스트레스를 포함하는 다양한 환경적 요인에 의해 유도된다. 약물은 급성 발발을 촉발하는 가장 중요한 요인 중에 있고 안전한 약물의 목록이 www.drugs-porphyria.com에서 사용가능하다. 흡연, 에탄올 및 CYP450에 의해 대사되는 약물이, 간의 헴(heme) 수요를 크게 증가시키고 포르피린 전구체의 생산을 증가시키고 급성 발발(acute attack)을 촉발하는, ALAS1의 유도를 야기한다. 또한, ALAS1은 금식(fasting)하는 동안 간에서 유도되는, 퍼옥시좀 증식자 활성화 수용체 γ 공활성체 la(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator lα)(PGClα)에 의해 양성으로(positively) 조절된다. 촉발하는 인자 중에 스테로이드 호르몬이 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 사춘기 전에 이러한 질환이 거의 나타나지 않고 경구 피임약이 PBGD 결핍을 가지는 일부 여성에서 발발(attack)을 악화시킬 수 있다는 사실에 의해 이러한 개념이 지지 된다. 또한 여성(80%)이 남성(20%)보다 더 자주 영향을 받는다.

급성 발발(Acute attack)은 글루코스 및 헤민(hemin)(노르모생(Normosang), 올판 유럽(Orphan Europe))의 주입으로 치료된다. 글루코스는 PGC-1α에 의해 매개되는 ALAS1의 유도를 길항(antagonize)하는 것으로 보인다. 헤민(hemin)은 조절성 헴 풀(regulatory heme pool)을 회복시키고 간의 ALAS1 유도를 억제한다. 일부 여성은 성선자극호르몬 방출 호르몬(gonadotropin-releasing hormone)(GnRH) 유사체에 의해 예방될 수 있는 월경 전의 발발(premenstrual attack)이 생길 수 있다. 일부 환자는 재발성 급성 발발(recurrent acute attack)을 나타내고 상당한, 장애를 입은 신경학적 장애를 나타낸다. 진행성 신경학적 손상(advanced neurologic damage) 및 아급성 및 급성 증상은 일반적으로 헴 치료에 일반적으로 무반응이다. 이것은 3명의 환자에서 지금까지, 동종(allogeneic) 간 이식에 의해서만 치료될 수 있고, 신경독성 ALA 및 PBG의 축적을 막는, 생명을 위협하는 상태이다. 그럼에도 불구하고 간 이식은 호환가능한 기증자(donor)의 제한된 효용(availability), 및 상당한 이환율(morbidity) 및 사망률(mortality)을 갖는다.

유전자 대체 치료는 특히 PBGD 결핍을 제외하고 간 기능이 완전히 정상인 환자에서, 간 이식에 대한 대안이다. PBGD의 포르피린성 마우스(mouse)로의 아데노바이러스 벡터 매개된 유전자 전달은 PBGD의 일시적인 간의 발현의 결과로 단기간 치료학적 유효성을 보였다(Johansson, 2004, Mol. Ther. 10(2):337-43). 유전자 치료를 암호화하는 유전자의 아데노바이러스 및 아데노-관련된 바이러스-매개된 유전자 치료는 또한 암스테르담 몰레쿨러 세라퓨틱스(Amsterdam Molecular Therapeutics) 및 다른 회사에 의해 개발 중에 있다(예를 들어, 미국 공개번호 US2011/0262399호 및 유럽 특허번호 EP1049487호 참조).

본원의 방법을 사용하여, PBDG를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제가 급성 간헐성 포르피린증(Acute Intermittent Porphyria)(AIP)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관(예를 들어, 예컨대 간, 예를 들어, 간의 작은 부분)의 실질로 PBDG를 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 비바이러스 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스, 또는 전 세포(whole cell))를 직접 전달함에 의해 달성될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 벡터로 PBDG를 암호화하고 조직 기관의 부분을 형질도입하는 핵산 서열의 통합(incorporation)에 의해, AIP 치료를 위한 PBDG의 안정한 장기간 발현이 달성될 수 있다.

h. 산필립포 증후군(Sanfilippo Syndrome)

본원에서 구획화된 방법 및 물질에 의해 치료될 수 있는 상태의 예시는 산필립포 증후군이다. 산필립포 증후군 또는 점액다당류증 타입 Ⅲ( Mucopolysaccharidosis type Ⅲ)는 헤파란황산(heparan sulfate)의 부분적으로 분해된 올리고당의 축적의 결과를 야기하는 상염색체 열성 결함(autosomal recessive defect)인 리소좀 저장 질환(lysosomal storage disease)이다. 그것은 약 70,000 출생 중 1로 발생한다. 산필립포 증후군은 유아기(early childhood)에서 학습 능력의 감소, 지연된 또는 왜소한 성장, 지연된 발달 및 악화되고 있는 정신상태와 관련된다. 4개의 하위 유형의 산필립포 증후군이 있다: 산필립포 타입 A (MPSⅢA)는 헤파란 N-설파타제(heparan N-sulfatase) 효소가 상실되거나(missing) 변이되었을 때(altered) 발생한다; 산필립포 타입 B (MPSⅢB)는 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-N-acetylglucosaminidase)(NaGlu)가 상실, 변이 또는 충분히 생산되지 않을 때 발생한다; 산필립포 C (MPSⅢC)는 효소 아세틸-CoA알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제(acetyl-CoAlpha-glucosaminide acetyltransferase)가 상실, 변이 또는 충분히 생산되지 않을 때 발생한다; 그리고 산필립포 타입 D (MPSⅢD)는 효소 N-아세틸글루코사민 6-설파타제(N-acetylglucosamine 6-sulfatase)가 상실, 변이 또는 충분히 생산되지 않을 때 발생한다. 예를 들어, 산필립포 타입 B는 효소 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-N-acetylglusosaminidase)의 결핍을 야기하는, NaGlu 유전자에서 돌연변이에 의해 발생한다.

산필립포 증후군, 예컨대 MPS ⅢA, ⅢB, ⅢC 또는 ⅢD의 치료는, 상실되거나 결함이 있는 유전자의 전달에 의해 달성될 수 있다. 전달은 중추 신경계(CNS)에 직접 할 수 있다. 전달은 또한 혈액뇌관문(blood brain barrier)을 통과하는 효율적인 CNS 전달을 달성하는 전달 방법, 예컨대 맥관구조(vasculature)로부터 혈액뇌관문을 통과할 수 있는 아데노-관련된 바이러스 혈청형(serotype)에 의해 달성될 수 있다. 이러한 혈청형의 예시는 AAV9이다 (예를 들어, Fu 외. (2011) Mol. Ther., 19:1025-33 참조).

본원의 방법을 사용하여, 헤파란 N-설파타제(heparan N-sulfatase)를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 MPSⅢA를 치료하기 위해 사용될 수 있고, 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-N-acetylglusaminidase)(NaGlu)를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 MPSⅢB를 치료하기 위해 사용될 수 있고, 아세틸-CoA알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제(acetyl-CoAlpha- glucosaminide acetyltransferase)를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 MPSⅢC를 치료하기 위해 사용될 수 있고, 또는 N-아세틸글루코사민 6-설파타제(N-acetylglusocsamine 6-sulfatase)를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 MPSⅢD를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관(예를 들어, 예컨대 간, 예를 들어, 간의 작은 부분; 또는 뇌에 직접적)의 실질로 특정 MPSⅢ 장애에 대한 상실된 또는 결함이 있는 효소를 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 비바이러스 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스, 또는 전 세포(whole cell))를 직접 전달함에 의해 달성될 수 있다. 특정 예에서, 전달되는 제제는 혈액뇌관문을 통과하는 전달을 달성할 수 있도록 상실 또는 결함이 있는 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 아데노바이러스 관련된 9 (예를 들어, rAAV9-hNAGLU)이다. 본원의 방법을 사용하여 벡터로의 결실 또는 결함이 있는 효소를 암호화하고 조직 기관의 부분을 형질도입하는 핵산 서열의 통합(incorporation)에 의해, MPSⅢ(산필립포 증후군)의 치료를 위한 CNS에서 상실 또는 결함이 있는 효소의 안정한 장기간 발현이 달성될 수 있다.

i. 지단백 리파제 결핍(Lipoprotein Lipase Deficiency (LPLD))

본원의 구획화된 방법 및 물질에 의해 치료될 수 있는 상태의 예시는 지단백 리파제 결핍(LPLD; 또한 타입 1 고지혈증, 원발성 고지혈증(primary hyperlipoproteinemia) 또는 가족성 고지혈증으로 알려짐)이다. LPLD는 지단백 리파제(LPL)를 암호화하는 유전자에서 변이(alteration)에 의해 발생한다. LPL의 부재 또는 결함이 있는 LPL에서, 혈중 지방 수준은 장쇄 지방산의 대사의 결함으로 인해 증가한다. LPLD와 관련된 증상은, 예를 들어, 복부 통증 및 췌장염을 포함한다. LPLD은 또한 대상체가 조기 발병 당뇨병 및 동맥경화증에 걸리기 쉽게 할 수 있는 높은 혈중 트리글리세리드(triglyceride) 수준과 관련된다.

유전자 치료가 LPLD를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, LPL 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노-관련된 바이러스(adeno-associated virus)(AAV)는 LPLD의 치료를 위한 골격근 전달에 대해 유럽에서 승인되었다(글리베라®(Glybera®)로 시판됨).

본원의 방법을 사용하여, LPL를 암호화하는 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 지단백 리파제 결핍(LPLD)을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 본원의 방법을 사용하여 구획화된 조직 또는 기관(예를 들어, 예컨대 간, 예를 들어, 간의 작은 부분; 또는 골격근)의 실질로 LPL를 암호화하는 전달되는 제제(예를 들어, 비바이러스 또는 바이러스 벡터 예컨대 아데노바이러스, 또는 전 세포(whole cell))를 직접 전달함에 의해 달성될 수 있다. 본원의 방법을 사용하여 벡터로 LPL를 암호화하고 조직 기관의 부분을 형질도입하는 핵산 서열의 통합(incorporation)에 의해, LPLD 치료를 위한 LPL의 안정한 장기간 발현이 달성될 수 있다.

2. 단백질 발현 및 생산

본원에서 제공되는 것은 동물에서 폴리펩티드를 제조하는 방법이다. 치료상 단백질 또는 영양 보충제를 포함하는, 동물에서 단백질의 치료상 생산은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 산물 예컨대 조직 플라스미노겐 활성인자(tissue plasminogen activator), (t-PA), 인슐린, 성장 호르몬 및 응고 인자가 동물, 예컨대 소, 양 또는 염소에서 생산되고 있다 (예를 들어, Mercier J.C. (1987) Exploiting New Technologies in Animal Breeding, p. 122-131, Oxford University Press; Lillico 외. (2005) Drug Discovery Today, 10:191-196; Echelard 외. (2006) Biopharm International, 19:36; Prather 외. (2003) Theriogenology, 59:115-123 참조). 관심의 산물을 발현하는 바이러스 벡터를 사용하는 곤충 세포에의 유전자 산물의 생산이 또한 기술되었다(예를 들어, 미국 공개번호 US2011/0119777호 참조)

예컨대 본원에 기술된 임의의 것 또는 이 기술분야에 공지된, 동물에서, 단백질을 생산하는 방법은, 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제를 생산 동물의 구획화된 기관 또는 이의 부분에 투여하는 단계, 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 생산 동물을 유지하는 단계, 및 생산 동물(예를 들어, 생산동물의 혈액 또는 다른 생물학적 유체로부터)로부터 발현된 폴리펩티드를 분리하는 단계를 포함한다. 암호화된 폴리펩티드는 제조될 원하는 임의의 단백질, 특히, 임의의 치료상 단백질 또는 영양 보충제로 사용될 수 있는 단백질이 될 수 있다. 예시적인 이러한 단백질은 응고 인자(예를 들어, 인자 Ⅷ, 인자 Ⅸ, 피브리노겐 혈액 응혈 인자), 락토페린(lactoferrin), 헤모글로빈, 인간 단백질 C, 알파-1-항트립신, 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA), 낭포성 섬유증 막 관통 전도 레귤레이터(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), 인슐린, 성장 호르몬, 사이토카인, 단일클론 항체, 백신(예를 들어, 항원), 콜레스테롤 산화효소(cholesterol oxidase) 및 기타를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

폴리펩티드는 생산 동물로부터 생물학적 시료로부터 분리될 수 있다. 생물학적 샘플은 혈액, 요(urine), 젖(milk), 혈장, 타액, 또는 기타 유사한 시료가 될 수 있다. 특정 예에서, 단백질 산물은 젖내에 나타나고 그로부터 사용되거나 분리될 수 있다. 생산 동물은 토끼, 랫트(rat), 마우스(mouse), 염소, 말, 양, 닭, 암탉, 돼지, 또는 소 동물이 될 수 있다. 상기 방법은 특히 큰 동물 예컨대 돼지 및 소에서, 전달되는 제제가 폴리펩티드의 많은 양을 생산하기 위해 크기를 조정할 수 있기 때문에 현재 생산 방법에 대한 장점을 제공한다. 또한, 상술한 바와 같이, 폴리펩티드는 생산 동물의 세포에 의해 번역 후 변경(예를 들어, 글리코실화)될 수 있다.

3. 농업적 및 수의학적 적용

본원에서 제공되는 방법은 동물에서 유전자 치료 적용, 및 특히 수의학적, 농업적 또는 산업상의 적용을 위해 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 본원의 방법에서 전달을 위한 전달되는 제제는 동물에서 생산성의 증가에 영향을 미치고 및/또는 동물에서 질환을 조절하는 핵산 분자를 포함한다. 동물에서의 적용은, 원하는 특성을 갖는 동물로 변경 또는 생산, 동물의 품질(예를 들어, 근육, 젖, 모)을 증가, 질환에 대한 저항성을 증가, 또는 산업상의 적용을 위한 산물(예를 들어, 실크)의 생산하는 적용을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 유전자 치료 적용은 동물에서 털 생산의 증가, 동물에서 모(wool) 생산의 증가, 동물에서 성장의 증가, 또는 영양 합성 또는 이용을 조절하는 것을 포함한다. 이러한 예에서, 핵산 분자는 동물에서 근육 생산을 증가시키는 단백질, 동물에서 털 생산을 증가시키는 단백질, 동물에서 모 생산을 증가시키는 단백질, 동물에서 성장을 증가시키는 단백질, 또는 영양 합성 또는 이용에 관여하는 단백질을 암호화한다.

이러한 적용은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 핵산을 포함하는 전달되는 제제, 예를 들어, 성장 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀(somatotropin))을 암호화하는 핵산 또는 성장 호르몬(예를 들어, IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자 또는 닭 Ski(chicken Ski)(cSki)을 매개하는 제제의 투여에 의해, 동물에서 근육 생산을 증가시키기 위해 동물에 투여될 수 있다(예를 들어, Lee (1997) Theriogenology, 47:225; Palmiter 외. (1982) Nature, 300:611-615 참조). 다른 예에서, 핵산 분자는 육류 생산에 유용할 수 있는, 마이오스타틴(myostatin) 저해제일 수 있거나 암호화할 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 마이오스타틴의 그것의 수용체에 대한 결합을 저해하는 폴리스타틴(follistatin)을 암호화할 수 있고, 그렇게 함으로써 더 큰 근육의 발달을 초래한다.

다른 예에서, 동물의 품질, 그로부터 산물이, 향상될 수 있다. 이러한 예에서, 동물의 전체 품질의 향상은 농업적 적용(예를 들어, 젖, 계란 또는 육류의 이용)을 도울 수 있다. 일 예에서, 핵산을 포함하는 전달되는 제제는 젖 생산을 증가시키거나 또는 젖의 품질을 증가시키기 위해 동물에 투여될 수 있다(예를 들어, Mercier J.C. (1987) Exploiting New Technologies in Animal Breeding, p. 122-131, Oxford University Press 참조). 또한, 동물의 젖은 또한 예를 들어, 인간의 소비를 위해, 젖의 품질을 증가시키거나 또는 향상시키기 위한 유전자 치료 방법에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 락토페린(lactoferrin)이 소의 젖에서 발현되도록 조작되어 아기나 노인에게 더욱 영양적으로 균형잡힌 산물을 제공할 수 있다(예를 들어, van Berkel 외. (2002) Nat. Biotech., 20:484-487 참조). 또한, 동물에서 젖은 유방염(mastitis)을 유발하는 박테리아의 성장을 저해함에 의해 향상될 수 있다(예를 들어, Maga 외. (2006) Foodborne Pathog. Dis., 3:384-392). 다른 예에서, 동물은 지방산 불포화효소(desaturase) 유전자를 발현하도록 조작하여(예를 들어, Saeki 외. (2004) Proc. Natl. Acad. Set, 101 :6361-6366 참조), 오메가-3 지방산이 풍부하도록 하거나(예를 들어, Lai 외. (2006) Nature Biotechnology, 24:435-436 참조); 베타-카제인(beta-casein) 및 카파-카제인(kappa-casein)을 더 높은 수준으로 갖는 젖을 생산하거나(예를 들어, Brophy 외. (2003) Nature Biotechnology, 21:157-162 참조), 또는 저-인(low-phosphorous) 비료를 생산하는 타액 피타아제(phytase)를 발현한다(예를 들어, Golovan 외. (2001) Nature Biotechnology, 19:741-745 참조). 추가 예에서, 핵산 분자는 영양소 활용을 향상시킬 수 있는, 아미노산 생합성 또는 글리옥실산 회로(glyoxylate cycle) 유전자에 관여된 것을 포함한다. 예를 들어, 전달되는 제제는 세린 트랜스아세틸라제(serine transacetylase) 및 o-아세틸세린 설프히드리라제(o-acetylserine sulphydrylase)를 암호화하는 핵산 분자 예컨대 cysE 및 cssK를 포함하는 것이 투여될 수 있다.

추가적인 예에서, 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제가 동물의 질병에 대한 저항(내성)을 증가시키도록 동물에 투여될 수 있다. 예를 들어, 동물은 프리온(prion) 단백질이 결여되도록 생산될 수 있다(Richt 외. (2007) Nature Biotechnology, 25:132-138). 다른 예에서, 동물은 박테리아 감염 예컨대 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 의한 감염에 저항할 수 있도록(내성을 가지도록) 조작될 수 있다(Wall 외. (2005) Nature Biotechnology, 23:445-451).

추가 실시예에서, 핵산 분자는 동물에서 털의 성장을 증가시키거나 또는 모 생산을 증가시키는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 이러한 측면의 특정 예에서, 동물은 양(sheep) 또는 어린 양(lamb) 또는 털 또는 모의 생산에 적합한 털을 포함하는 다른 동물이다. 예를 들어 모 합성에서 제한 아미노산인, 시스테인(cysteine)을 암호화하는 핵산; 케라틴(keratin)을 암호화하는 핵산분자, 또는 모 모낭(follicle) 또는 피부에서 성장 인자(예를 들어, ECF 또는 IGF-1)를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 전달되는 제제의 투여에 의해 모 합성이 증가 될 수 있다. 동물은 또한 예를 들어, 실크(silk)를 생산하는 거미의 유전자를 동물, 예컨대 염소에 조작함으로써 실크를 생산하도록, 산업상 적용을 위해 조작될 수 있다(예를 들어, Lazaris 외. (2002) Science, 295:472-476 참조).

H. 실시예

하기 실시예는 예시적 목적으로 포함되며 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1

꼬리엽으로의 아데노바이러스 형질도입의 구획화

실질 클램프(parenchymal clamp)를 사용하여 맥관계로부터 격리에 의하여 구획화된 꼬리엽으로 아데노바이러스가 주사되었다. Ad-CMV-Luc라고 명명된 상기 아데노바이러스는 Daivd T. Curiel(앨러배마 주립 대학, 예컨대 Bass 외. (1995) Cancer Gene Ther., 2:97-104; 국제 PCT 출원 공개번호 WO1995/026411호 참조)로부터 제공되었다. Ad-CMV-Luc는 인간 아데노바이러스 타입 5로부터 유래되었고 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터에 의해 유도되는 루시퍼라제 유전자를 암호화한다. 특히, 아데노바이러스 형질도입 분석을 위해, 상기 아데노바이러스는 E1 영역을 결실시킴으로써 복제 결핍으로 만들어졌다. 이 결실된 E1 영역 내로, 리포터 유전자 루시퍼라제(Adluc)가 클로닝되었고 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터(rAd-CMV-루시퍼라제 또는 Ad.CMV.Luc로 명명됨)에 의해 유도되도록 구축되었다.

특히, 간의 꼬리엽으로 구획화될 수 있는 아데노바이러스 형질도입의 정도를 결정하기 위하여, 10마리의 랫트가 소디움 펜토바비탈(sodium pentobarbital)(Abbot Laboratories, Chicago, Il)의 복강내(i.p.) 주사(50 mg/kg)로 안락사되었다. 각 랫트는 그 후 앙와위(supine position)로 놓였고, 복부는 면도되었고, 복강이 칼돌기로부터 배꼽 부위까지 3 cm 배쪽 정중선 절개에 따라 노출되었다. 엽간(interlobular) 및 간-위 인대(hepato-gastric ligaments)를 절단하여, 꼬리엽의 상부가 위치가 확인되고 해부되었다. 꼬리엽의 페디클(pedicle)이 확인되었고 10 mm 미세-지혈겸자(serrefine)를 사용하여 (Fine Science Tools-USA Inc., Foster City, CA) 클램핑되었다.

일단 꼬리엽이 클램핑된 후, 1 ml 시린지(Becton & Dickinson Corp., Franklin, NJ) 내의 50 ㎕ 포스페이트-완충 식염수(PBS) 내의 1×10⁹ pfu 재조합 Ad.CMV.Luc가 5마리의 랫트의 꼬리엽의 실질에 주사되었다. 대조군으로서 또 다른 5마리의 랫트에 총 부피 100 ㎕의 PBS 내의 1×10⁹ pfu 재조합 Ad.CMV.Luc가 대정맥에 주사되었다. 클램프는 30분 동안 유지되었다. 랫트는 5-0 바이크릴(Vicryl) (Ethicon Inc., Somerville, NJ)로 2개 면(근육 및 피부)으로 봉합되고 회복되도록 허용되었다.

수술 후 72시간에, 랫트는 소디움 펜토바비탈의 복강내 과다 투여로 안락사되었다. 간이 수확되고 간의 꼬리엽, 오른쪽 외측엽, 왼쪽 외측엽, 및 중앙엽이 분리되고 조직병리학적 평가, 루시퍼라제 활성 어세이, 및 뉴클레오티드(DNA 및 RNA) 추출을 위해 처리되었다.

DNA 추출을 위해: 10 mg 조직이 100 mM NaCl,10 mM Tris×Cl, pH 8, 0.5% SDS, 0.1 mg/ml 프로티나제 K(proteinase K)의 용액 400 ㎕에 위치되었고, 세포 단백질 대부분이 분해될 때 까지 배양되었다. 소화물은 연속적인 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출에 의해 탈단백질화되었고, DNA는 에탄올 침전에 의해 회수되고, 건조되고 TE pH 8 완충액에 재현탁되었다.

포르말린-고정된 조직은 파라핀-포매되었고 일상적인(routine) 조직병리학을 위해 사용되었다. 조직병리학을 위해, 포르말린-고정된, 파라핀-포매된 조직 블록이 5 ㎛로 절편화되었고, 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었고 공인 병리학자에 의해 현미경적으로 검사되었다.

루시퍼라제 활성 어세이를 위해, 해부된 엽들은 500 ㎕의 용해 완충액(Lysis buffer)(Luciferase assay system, Promega, Madison, WI) 내의 용해 기질 D(Lysing Matrix D)(MP Biomedicals)를 사용하여 Fast Prep 24, 시료 준비 시스템(Sample Preparation System)(MP Biomedicals)을 사용함으로써 균질화되었다. 20 마이크로리터의 상등액이 100 ㎕의 루시퍼라제 어세이 시약에 첨가되었고 광자(photon)를 측정하기 위해 10 초 동안 발광측정기(luminometer)(Biotk, USA)를 사용하여 루시퍼라제 활성의 측정을 위해 사용되었다. 간 추출물의 단백질 농도가 단백질 어세이 키트(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 브래드포드 법에 의해 결정되었다. 루시퍼라제 활성은 간의 서로 다른 엽 간의 비교 및 통계적 분석을 위해 균질물 내의 총 단백질에 대해 정규화되었다(총 단백질의 그램 당 상대적인 빛 단위(rlu/g)).

결과

간 염증의 조직학적 분석이 수행되었다. 구획화 및 간 염증에 대한 정맥내 수혈의 효과를 비교하기 위하여, 72시간에 수득된 간 절편이 호중구 침윤의 징후(sign)에 대해 분석되었다. 정맥내 대조군으로부터의 시료에 대해 수행된 간 조직학은 특히 문맥 주위 영역에 강한 소상 간세포 괴사(focal hepatocellular necrosis)를 보였다. 이러한 소상 괴사 부위는 호중구로 침윤되어 있었다. 간세포 괴사, 비실질 세포 또는 침윤된 염증세포는 구획화된 동물들로부터 수득된 조직에서는 완전히 부재했다.

루시퍼라제 활성에 대해서, 결과는 아데노바이러스의 정맥내 주입을 받은 대조군 동물들로부터 회수된 모든 엽에서 유사한 수준의 루시퍼라제 활성이 측정되었다는 것을 보여준다. 대조적으로, 클램핑 후 꼬리엽 내로 아데노바이러스 주사를 받은 동물들은 간의 어떤 다른 엽보다 10³배 이상 더 큰 루시퍼라제 활성을 나타내었는데, 이는 아데노바이러스 형질도입이 주사된 조직에 제한되었고 둘러싼 조직은 벡터에 대한 노출을 면함을 나타낸다. 결과는 도 2에 나타내었다.

실시예 2

전신적 방출을 최소화하기 위한 클램프 지속의 결정

A. 클램프 방출 후의 전신적 바이러스 발현

주사된 조직에 대한 아데노바이러스의 구획화를 달성하기 위한 클램핑 시간의 최적의 길이를 결정하기 위하여, 외과적 과정이 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었고, 그 후 1 mL 인슐린 시린지를 사용하여 꼬리엽의 실질 내로 50 ㎕의 총 부피에 현탁된 1×10⁹ pfu의 Ad.CMV.Luc이 주사되었다. 아데노바이러스 주사 후에 7, 15, 30, 및 60분에 페디클로부터 미세-지혈겸자 클램프가 방출되었다(시점당 n=6). 클램프 방출 1분 후에, 200 ㎕의 말초 혈액이 대정맥으로부터 수집되었고 PCR을 위해 처리되었다. 루시퍼라제 유전자는 다음 프라이머를 사용하여 증폭되었다: 20 ㎕의 총 반응 부피 내에 센스 5'-ATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3' (서열번호 1) 및 안티센스 5'-AAAACCGGGAGGTAGATGAGATGT-3' (서열번호 2). PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분 연장(elongation)을 25 싸이클.

결과는 도 3, 패널 A에 나타내었다. 아데노바이러스 DNA(루시퍼라제)는 클램프 시간의 7분 후에 말초 혈액에서 검출가능했다. 클램프 시간을 15분으로 증가시키는 것은 혈액 내에서 검출되는 아데노바이러스 DNA를 클램프 시간의 7분 후에 관찰되는 것의 약 절반까지 감소시켰다. 아데노바이러스 DNA는 클램프 시간의 30 및 60분 후에 말초 혈액에서 검출이 불가능했는데, 이는 적어도 30분의 클램프 지속이 주사된 조직에 대한 아데노바이러스의 제한을 촉진한다는 것을 나타낸다.

B. 클램프 방출 중 및 후의 아데노바이러스 DNA의 전신적 존재

클램프 시간의 30분 후에 말초 혈액에서의 아데노바이러스 DNA의 존재를 평가하는 상기 결과를 확인하기 위하여, 30분의 클램프 시간 도중 및 후에 말초 혈액에서 아데노바이러스 존재를 측정하기 위해 시간 경과 연구가 수행되었다(n=3). 특히, 일단 꼬리엽이 클램핑되면, 실시예 1의 외과적 과정이 수행되고, 그 후 1 ㎖의 인슐린 시린지를 사용하여 50 ㎕의 총 부피에 현탁된 1×10⁹ pfu의 Ad.CMV.Luc이 꼬리엽의 실질 내로 주사되었다. 그리고 나서, 100 ㎕의 혈액이 아데노 바이러스 주사 후(클램핑 중에) 1, 3, 및 5 분에, 그리고 클램프의 방출 후 1, 3, 및 5분에(클램프 방출 후)에 대정맥으로부터 채혈되었다. 클램프는 30분간 유지되었다. 혈액 시료는 상기 기술된 바와 같이 PCR에 의해 루시퍼라제 유전자를 증폭함으로써 아데노바이러스 DNA의 존재에 대해 분석되었다. 10 마이크로리터의 Ad.CMV.Luc 아데노바이러스가 양성 대조군(C＋)으로 사용되었다.

결과는 도 3, 패널 B에 나타내었다. 아데노바이러스 DNA는 시험된 임의의 시점에서의 혈액에서 검출가능하지 않았으나, 양성 대조군 시료에서 검출되었다. 이러한 결과는 클램프 과정이 주사된 아데노바이러스가 클램프가 위치되어 있는 동안 혈류로 유입하는 것을 방지한다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 또한 클램프 제거 후 최대 5분까지 혈액내에서 바이러스의 검출이 불가능한 양에 의해 증거되는 바와 같이 30분의 클램프 시간이 바이러스의 주사된 조직 세포 내로의 형질도입에 충분하다는 것을 확인한다.

실시예 3

이식유전자 발현의 용량-반응 역학

단백질 발현과 아데노바이러스 투여 간의 관계를 결정하기 위해서, 용량 반응 곡선이 생성되었다. 실시예 1에 기술된 외과적 및 클램핑 과정 후에(n=6/용량 군). 각 군은 이전에 기술된 바와 같이 50 ㎕의 PBS 내의 1 x 10³, 1 x 10⁶, 1 x 10⁹, 또는 1 x 10¹² pfu의 Ad.CMV.Luc의 주사를 받았다. 대조군 랫트는 외과적 과정에 따랐고 총 부피 100 ㎕ PBS 내의 상응하는 아데노바이러스 용량이 대정맥 내로 직접적으로 주사되었다(n=6/투여량 군). 주사 후에, 랫트는 실시예 1에 기술된 바와 같이 봉합되고 회복되도록 허용되었다. 수술 후 72시간에, 랫트는 실시예 1에 기술된 바와 같이 안락사되었고, 실시예 1에 기술된 바와 같이 간의 꼬리엽이 수확되고 루시퍼라제 활성 어세이를 위해 처리되었다. 루시퍼라제 활성이 시료 내에 존재하는 합성된 루시퍼라제 단백질의 양에 비례하기 때문에, 이 측정기준은 합성된 이식유전자 단백질의 척도로서 사용되었다.

결과는 도 4에 기재하였다. 루시퍼라제 활성/발현은 증가된 벡터 투여량과 선형으로 증가하는데, 10³ pfu의 아데노바이러스를 받은 조직으로부터 약 2.5 x 10² rlu/g 의 단백질에서 10¹²pfu의 주사를 받은 조직에 대한 5 x 10⁹ rlu/g 초과의 단백질의 범위에 이른다. 이러한 결과는 벡터 용량과 단백질 산출량 간에 상관관계가 있다는 것을 보여준다.

실시예 4

이식유전자 발현의 지속

형질전환 발현의 지속가능성이 아데노바이러스 투여 후 진행되는 시점에서 이식유전자 발현(루시퍼라제 활성)을 측정함으로써 결정되었다. 이를 위하여, 랫트(n=6/시점)가 실시예 1에 기술된 바와 같은 외과적 과정에 대한 대상이 되었고, 꼬리엽이 클램핑된 후에, 실시예 1에 기재된 프로토콜에 따라 50 ㎕의 PBS 내의 1 x 10⁹ pfu의 Ad.CMV.Luc이 각 동물의 꼬리엽 내로 주사되었다. 대조군 랫트(n=5)는 실험군과 같은 외과적 과정에 따랐으나, 100 ㎕의 PBS 내의 1 x 10⁹ pfu의 Ad.CMV.Luc의 정맥내(IV) 주사를 대정맥 내로 받았다. 아데노바이러스 투여 후에, 랫트는 실시예 1에 기술된 바와 같이 봉합되었고 회복되도록 허용되었다. 5마리의 랫트가 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 아데노바이러스 주사 후 30, 60, 90, 120, 150, 180, 및 365 일 후에 시점마다 안락사되었다. 그 후 실시에 1에 기술된 바와 같이 간의 꼬리엽이 수확되고 루시퍼라제 활성을 분석하기 위해 처리되었다.

결과는 도 5에 나타내었다. 30일차에, 평균적으로 대략 10³rlu/g의 단백질이 꼬리엽 추출물에서 검출되었다. 루시퍼라제 활성은 아데노바이러스 투여 후 30 내지 90일 사이에 100배 초과로 증가하였다(~10³ rlu/g의 단백질 내지 ~10⁵ rlu/g의 단백질). 아데노바이러스 형질도입 후 120일 차에, 단백질 발현은 형질도입 후에 30일차에 관찰된 것의 약 절반으로 떨어졌다(~500 rlu/g의 단백질). 그 후 발현은 형질도입 후 150일차에 10⁴ rlu/g 초과의 단백질로 다시 올랐다. 단백질 발현의 이 수준은 주사 후 180일차에 유지되었고 아데노바이러스 형질도입 후 1년차(365일차)에 약간 떨어졌다. 이러한 결과는 적어도 형질도입 후 1년 동안의 유지된 이식유전자 발현을 나타낸다.

실시예 5

사이토카인 mRNA 발현

아데노바이러스의 구획화된 꼬리엽으로의 전달에 있어서의 간 내에 유도된 사이토카인 발현 수준 및 아데노바이러스의 대정맥으로의 전달에 있어서 말초 혈액 내에서 유도된 사이토카인 발현 수준이 결정되었다. 간단히, 일단 꼬리엽이 클램핑되면, 실시예 1에 기술된 외과적 과정이 50 ㎕의 포스페이트 완충 식염수(PBS) 내의 1 x 10⁹ pfu의 재조합 Ad.CMV.Luc이 실시예 1에 기술된 바와 같이 꼬리엽의 실질로 주사되었다. 대조군으로서, 동물은 실시예 1에 기술된 바와 같이 총 부피 50 ㎕의 PBS 내의 1 x 10⁹ pfu의 Ad.CMV.Luc이 대정맥으로 주사되었다.

과정 후 72시간에 동물들은 소디움 펜토바비탈의 복강내 투여로 안락사되엇다. 간이 수확되고 꼬리엽, 간의 오른쪽 외측엽, 왼쪽 외측엽 및 중앙엽이 분리되었다. 총 RNA가 제조자의 프로토콜에 따라 트리졸 키트(Trizol kit)(Gibco/Life Technologies)를 사용하여 추출되었다. 총 RNA의 1 ㎍가 역전사를 위해 사용되었는데, 역전사는 제조자의 지침에 따라 RNA PCR 키트(Applied Biosystems, Branchburg NJ)로 수행되었다. 종양 괴사 인자 알파(TNFα) mRNA 검출을 위해, 다음 프라이머가 사용되었다: 20 ㎕의 총 반응 부피 내에 센스 5'-ACTCCCAGAAAAGCAAGCAA-3'(서열번호 3) 및 안티센스 5'-CGAGCAGGAATGAGAAGAGG-3' (서열번호 4). PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분 연장을 25 싸이클. 형질전환 성장인자 베타(transforming growth factor beta, TGFβ)에 대하여, 다음 프라이머가 사용되었다: 20 ㎕의 총 반응 부피 내에 센스 5'-ATACGCCTGAGTGGCTGTCT-3' (서열번호 5) 및 안티센스 5'-TGGGACTGATCCCATTGATT-3' (서열번호 6). PCR 조건은: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃ 7분 연장을 25 싸이클. 인터페론 감마(IFNγ)에 대하여, 다음 프라이머가 사용되었다: 20 ㎕의 총 반응 부피 내에 센스 5'-GCCCTCTCTGGCTGTTACTTG-3' (서열번호 7) 및 안티센스 5'-CTGATGGCCTGGTTGTCTTT-3' (서열번호 8). PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분 연장을 25 싸이클. 인터류킨 6(interleukin 6, IL-6)에 대하여, 하기 프라이머가 사용되었다: 20 ㎕의 총 반응 부피 내에 센스 5'-CCGGAGAGGAGACTTCACAG-3' (서열번호 9) 및 안티센스 5'-ACAGTGCATCATCGCTGTTC-3' (SEQ ID NO:10). PCR 조건은 94℃에서 5분, 그 다음 30초 동안 94℃를 25 싸이클, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃ 연장에서 7분. 베타-액틴(beta-actin)에 대한 PCR 프라이머는 내부 대조군으로서 사용되었고, 다음과 같다: 20 ㎕의 총 반응 부피 내에 센스 5'TGAAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3'(서열번호 11) 및 안티센스 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG-3'(서열번호 12). PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분 연장을 25 싸이클.

상기 결과는 아데노바이러스의 대정맥으로의 전달이 모든 간엽에서 TNFα와 IFNγ의 검출을 야기한 반면, TGFβ 및 IL-6는 오른쪽 외측엽을 제외한 모든 엽에서 검출되었음을 보여준다. 대조적으로, 아데노바이러스의 구획화된 꼬리엽으로의 전달은 꼬리엽에서 TGFβ 및 IFNγ의 검출을 야기했고 꼬리엽에서 TNFα의 낮은 수준의 발현을 야기했다. 기타 엽들에서 이러한 사이토카인의 발현은 검출되지 않았다. IL-6는 어떤 엽에서도 검출되지 않았다. 따라서, 상기 결과는 낮은 간의 사이토카인 발현을 보여준다.

실시예 6

돼지 사체 간에서의 생체외 클램핑 연구

예비적인 생체외 연구가 돼지 간에서 수행되었다. 돼지는 크기, 체중 및 인간을 매우 닮은 육안해부학을 고려하여 동물 모델로서 선택되었다. 신선한 전체/완전한 간이 지역의 도축장으로부터 수득되었다. 복강경 장치를 사용하여, 왼쪽 중앙엽이 클램핑되고 5 ml의 브로모페놀 블루가 실질 내로 주사되었다. 30분 후에, 클램프가 제거되고 클램프가 위치되었던 양 편의 조직이 해부되고 청색 염색약의 존재에 대하여 분석되었다. 주사에 대해 근위 조직 편에서 클램핑 경계에서 청색 염색약이 관찰된 반면, 청색 염색약은 주사 부위에서 원위인 클램핑 경계의 가장자리에서조직을 투과하지 않았다. 그러므로, 클램핑 장치는 용액을 장치의 원위 편으로 전달하는 것을 방지함으로써 염색약을 구획화할 수 있었다.

실시예 7

돼지에서의 아데노바이러스 형질도입의 구획화

실시예 1에서 기술된 과정은 그 다음에 실시예 6에서 기술된 클램핑 장치를 사용하여 돼지에서 시험되었다. 돼지는 12시간 낮/밤 주기로 표준 조건 하에서 수용되었고 물과 음식이 자유식이로 제공되었다. 돼지는 전신 마취 하에서 위치되었고, 복부의 무균 세척(클리닝) 후에, 5 cm의 칼돌기-하 내측 절개가 이루어졌다. 간의 왼쪽 중앙엽이 그 후 위치가 확인되고 노출되었고, 실시예 5에 기술된 외과적 클램프가 왼쪽 중앙엽의 원위에 위치되었다. 그 다음 rAd-CMV-루시퍼라제의 감염성 바이러스 입자 1×10⁹ 개를 포함하는 500 ㎕의 포스페이트 완충 용액(PBS)이 인슐린 시린지를 사용하여 격리된 왼쪽 중앙엽의 실질 내로 주사되었다.

30분의 시간이 흐른 후에, 클램프가 제거되고, 복강이 2 면으로 봉합되었고, 동물은 회복되도록 허용되었다. 수술 72시간 후에, 동물은 안락사되었고 간이 수확되었다. 조직 시료는 주사 부위, 주사 부위에 대해 근위, 내측, 및 원위에서 왼쪽 외측엽, 오른쪽 외측엽, 및 오른쪽 중앙엽이 취해졌다. 조직 시료는 루시퍼라제 활성 및 바이러스 DNA 네스티드 중합효소 연쇄 반응(viral DNA nested polymerase chain reaction, PCR) 분석에 사용하기 위해 동결되었다.

아데노바이러스 형질도입의 구획화는 조직 시료 내에서 평가되었다. 간단히, 조직 시료는 균질화되었고, 루시퍼라제 활성 어세이가 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행되었다. 결과는 도 7에 기재하였다. 배경 루시퍼라제 활성이 오른쪽 외측엽, 오른쪽 중앙엽 및 왼쪽 외측엽으로부터의 모든 시료로부터의 엽에서 관찰되었다. 대조적으로, 주사 부위로부터 측정된 루시퍼라제 활성은 임의의 다른 시료들보다 대략 20배 더 높았다. 이러한 결과는 루시퍼라제 활성이 주사된, 클램핑된 조직에 제한됨을 나타내며, 아데노바이러스 형질도입이 돼지에서 구획화된다는 결론을 뒷받침한다.

아데노바이러스의 구획화된 형질도입을 확인하기 위하여, 조직 시료는 네스티드 PCR(nested-PCR)에 의해 추가적으로 분석되었다. PCR의 최초 수행은 루시퍼라제 유전자를 특이적인 프라이머를 사용하여 50 싸이클 동안 증폭함으로써 수행되었다. 10 마이크로리터의 Ad.CMV.Luc 아데노바이러스가 양성 대조군으로서 사용되었고 플라스미드 pcDNA3(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)가 음성 대조군으로서 사용되었다. 최초 산물은 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석되었다. 결과는 아데노바이러스-주사된 조직으로부터는 증폭된 양성 대조군에 대해 관찰된 것과 비슷한 크기의 밴드를 보였으나, 임의의 다른 조직 시료 또는 음성 대조군 시료에서는 그렇지 않았다. 두번째 PCR 시행은, 최초 PCR 산물과 네스티드 프라이머를 사용하여 총 20 ㎕의 총 반응 부피 내의 센스 5'-CAACTGCATAAGGCTATGAAGAGA-3'(서열번호 13) 및 안티센스 5'- ATTTGTATTCAGCCCATATCGTTT-3'(서열번호 14) 프라이머로 수행되었다. PCR 조건은: 94℃에서 5분, 그 다음 94℃에서 30초, 53℃에서 30초, 및 72℃에서 30초 및 72℃에서 7분 연장을 25 싸이클. 아가로스 젤 전기영동에 의한 분석에서, 루시퍼라제 유전자에 상응하는 뚜렷한 밴드가 주사된 조직 및 양성 대조군 시료에서 존재했고 기타 조직 및 음성 대조군 시료에서는 완전히 부재했다. 주사된, 클램핑된 조직에서 바이러스 DNA 서열이 존재했으나 인접한 조직 어떤 것에서도 존재하지 않았다는 것은 바이러스 형질도입의 성공적인 구획화를 가리킨다.

실시예 8

구획화된 간엽으로의 전달에 따른 혈액 내에서의 가용성 리포터 단백질 발현

가용성 단백질이 혈액 내에서 발현되고 검출될 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 가용성 단백질을 발현하는 아데노바이러스가 실질 클램프를 사용하여 구획화된 랫트의 꼬리엽 내로 주사되었다. Ad-ALB-AFP로 명명된 상기 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 타입 5로부터 유래되었고 랫트 알부민 프로모터 서열에 의해 유도되는 랫트 알파 태아단백질(alpah fetoprotein, AFP) 유전자를 암호화한다(Herbomel 외. (1989) Molecular and Cellular Biology, 9:4750-4758; Tronche 외. (1989) Molecular and Cellular Biology, 9:4759-4766). 아데노바이러스는 E1 영역을 결실시킴으로써 복제 결핍성으로 만들어졌다. 이 결실된 E1 영역 내로, 리포터 유전자 알파 태아단백질(AFP)이 클로닝되고 간에 대한 특이성을 위하여 랫트 알부민(ALB) 프로모터에 의해 유도되도록 구축되었다. ALB 프로모터의 조절 하에 랫트 AFP를 암호화하는 pUC57 플라스미드는 Genscript (Piscataway, NJ)에 의해 합성되었다. pUC57 플라스미드로부터의 AFP 발현 카세트는 듀얼-베이직 아데노바이러스 셔틀 벡터(Dual-Basic adenoviral shuttle vector) 내로 서브클로닝되었고 Ad5 (DE1/DE3) 벡터(Vector Biolabs, Philadelphia, PA)로 재조합되었다. 아데노바이러스는 HEK293 세포로 패키징되었고 세슘 클로라이드(cesium chloride) 초원심분리로 정제되었다. ALB-AFP 바이러스가 50 ㎕의 총 부피 내의 3.25×10⁹로 투여되었다. 주사 후 5일차에, 동물은 희생되었고 간이 수확되었다.

구획화가 실시예 1에 기술된 과정과 유사하게 수행되었다. 간단히, 8마리의 랫트가 60 mg/kg의 케타민-HCl(ketamine-HCl) 및 10 mg/kg의 자일라진-HCl(Xylazine-HCl)(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL)의 복강내 주사로 안락사되었다. 그 다음 각 랫트가 앙와위로 위치되었고 복부가 면도되고 복강이 칼돌기로부터 배꼽 부위까지 3 cm 배쪽 정중선을 따라 노출되었다. 꼬리엽의 상부가 위치되고 엽간 및 간-위 인대를 잘라냄으로써 해부되었다. 꼬리엽의 페디클이 확인되고 10 mm 미세-지혈겸자를 사용하여 클램핑되었다(Fine Science Tools-USA Inc., Foster City, CA).

일단 꼬리엽이 클램핑되고, 1 mL 시린지(Becton Dickinson Corp., Franklin, NJ) 내의 50 ㎕ 포스페이트-완충 식염수(PBS) 내의 3.75×10⁹ pfu의 재조합 Ad.ALB-AFP가 6마리의 랫트의 꼬리엽의 실질 내로 주사되었다. 또 다른 2마리의 랫트가 비-주사 대조군으로서 사용되었다. 클램프는 30분간 유지되었다. 그 후 랫트는 2면(근육 및 피부)으로 5-0 바이크릴(Ethicon, Inc., Somerville, NJ)을 사용하여 봉합되었고 회복되도록 허용되었다.

수술 후 7일차에, 1 mL의 말초 혈액이 대정맥으로부터 수집되었다. 혈액은 혈청 분리 튜브(Becton Dickinson Corp., Franklin, NJ)를 사용하여 수집되었고 시료는 1000 g로 15분 동안 원심분리되기 전에 30분 동안 응고되도록 허용되었다. 혈청이 제거되고, 소분되고 시료는 -20℃에서 보관되었다. AFP는 랫트 알파-태아단백질, AFP ELISA 키트 (Cusabio Biotech Co., Ltd., Wuhan China)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 검출되었다.

결과는 도 8에 나타내었다. 결과는 바이러스가 주사되지 않은 대조군 랫트의 혈액 내에서 AFP의 검출을 보여준다. 결과는 Ad.ALB-AFP가 주사된 랫트가 대조군 동물보다 더 높은 혈청 내 AFP를 갖는 것을 보여준다. 그러므로, 결과는 가용성 단백질을 발현하는 아데노바이러스의 간의 구획화된 엽 내로의 주사가 혈액 내에서 검출가능한 가용성 단백질의 발현을 야기한다는 것을 보여준다.

변형이 당업자에게 자명하므로, 본 발명이 첨부된 청구항의 범위에 의해서만 한정되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> GLOBAL BIO THERAPEUTICS USA INC. Jose Gustavo Cabrera Aquino Blanca Angelica Segura Pacheco <120> COMPARTMENTALIZED METHOD OF NUCLEIC ACID DELIVERY AND COMPOSITIONS AND USES THEREOF <130> 33809.00551.WO02/551PC <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> 61/633,287 <151> 2012-02-07 <160> 14 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luciferase primer - sense <400> 1 atggaagacg ccaaaaacat aaag 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Luciferase primer - antisense <400> 2 aaaaccggga ggtagatgag atgt 24 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha primer - sense <400> 3 actcccagaa aagcaagcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF alpha primer - antisense <400> 4 cgagcaggaa tgagaagagg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF beta primer - sense <400> 5 atacgcctga gtggctgtct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGF beta primer - antisense <400> 6 tgggactgat cccattgatt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN gamma primer - sense <400> 7 gccctctctg gctgttactt g 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IFN gamma primer - antisense <400> 8 ctgatggcct ggttgtcttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer - sense <400> 9 ccggagagga gacttcacag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 primer - antisense <400> 10 acagtgcatc atcgctgttc 20 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin primer - sense <400> 11 tgaagatcaa gatcattgct cctcc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin primer - antisense <400> 12 ctagaagcat ttgcggtgga cgatg 25 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second (nested) Luciferase primer - sense <400> 13 caactgcata aggctatgaa gaga 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Second (nested) Luciferase primer - antisense <400> 14 atttgtattc agcccatatc gttt 24

Claims

관절염(arthritis), 만성 통증(chronic pain), HIV-관련 AIDS(HIV-related AIDS), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis), 재발협착증(restenosis), 선천적 효소 결핍(inherited enzyme deficiency), 선천적 면역 결핍(inherited immune deficiency), 암(cancer), 레트로바이러스 감염증(retrovirus infection), 혈우병(hemophilia), 당뇨병(diabetes), 근이영양증(muscular dystrophy), 심혈관계 장애(cardiovascular disorder), 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 신경 퇴행성 장애(neurodegenerative disorder), 외상(trauma), 통증(pain), 겸상 적혈구 빈혈(sickle cell anemia), 자가면역 질환(autoimmune disease), 염증성 질환(inflammatory disease), 및 고혈압(hypertension) 중으로부터 선택되는 질환 또는 상태를 치료하기 위한,
폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 전달 제제(delivery agent)를 함유하는 약제학적 조성물로서:
상기 전달 제제는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 또는 바이러스 벡터이고;
상기 조성물은 투여된 바이러스 또는 바이러스 벡터의 흡수를 위해 투여 후 적어도 25분에서 1시간까지 동안 구획화된 조직, 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분의 실질(parenchyma) 내로 희석시키지 않고 투여하기 위한 단일 투여량(single dosage)으로 제형화되며;
상기 조직 또는 기관의 부분은 상기 조성물의 투여를 위한 구획화에 충분한 크기이고;
상기 구획화된 조직 또는 기관 또는 이의 부분에서 상기 실질은 결합 조직, 혈관, 신경 또는 도관을 포함하지 않으며; 및
상기 구획화된 조직 또는 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분은 상기 조직, 기관 또는 이의 부분을 클램핑(clamping)함으로써 전신적 순환으로부터 격리된 조직 또는 기관이며, 상기 조직 또는 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분을 공급하거나 가로지르는 동맥, 정맥, 도관 및 맥관으로부터 선택되는 하나 이상이 차단되어 상기 조성물이 실질로(parenchymally) 투여될 때 상기 조직 또는 기관 또는 이의 부분으로의 혈액 공급 및 흐름이 감소되거나 제거된 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조직, 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분의 실질은 적어도 30분에서 1시간까지 동안 구획화되는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 분자는 질환 또는 상태의 치료를 달성하거나, 대상체 내에서 이종성 폴리펩티드를 과생산하거나, 동물에서 근육 생산을 증가시키거나, 동물의 성장을 증가시키거나, 또는 동물에서 영양소 합성 또는 활용을 달성하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 효소, 호르몬, 응집 또는 응고 인자(coagulation or clotting factor), 사이토카인(cytokine), 성장 인자(growth factor) 또는 이의 활성 부분, 항체 또는 이의 항원 부분, 혈관신생 조절자(angiogenesis modulator), 면역조절자(immunomodulator), 통증 조절자(pain modulator), 수용체 또는 이의 활성 부분, 수송 단백질(transporter protein), 조절 단백질(regulatory protein), 항원(antigen) 및 알러젠(allergen) 중으로부터 선택된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase), 낭포성 섬유증 막관통 전도 레귤레이터(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CTFR), 갈설파제(galsulfase), 라로니다제(laronidase), N-아세틸갈락토사민 6-설파타제(N-acetylgalactosamine 6-sulfatase), 페닐알라닌 암모니아 리아제(phenylalanine ammonia lyase), 산 알파 글루코시다제(acid alpha glucosidase), 이미글루세라제(imiglucerase), 알글루코시다제 알파 (alglucosidase alpha), 갑상선 자극 호르몬(thyrotropin), 성장 호르몬(growth hormone), 인슐린, 갑상선 호르몬(thyroid hormone), 에리트로포이에틴(erythropoietin, EPO), 인터류킨 1(interleukin-1, IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-7, 인터페론(IFN), 종양괴사인자(TNF), IL-12, IL-18, fms-관련 티로신 키나제 3(flt3), 뉴로필린-2(NP2), 골형성 단백질(bone morphogenic protein , BMP), 표피 성장 인자(epidermal growth factor, EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor, FGF), 과립구 콜로니 자극 인자(granulocyte colony stimulating factor, G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, HGF), 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor, PDGF), 형질전환 성장 인자 α 및 β(transforming growth factor α and β), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor, FGFR), 형질전환 성장 인자 수용체(transforming growth factor receptor, TGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR), 플라스미노겐 액티베이터(plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), 인자 Ⅷ(facotr Ⅷ), 인자 Ⅸ(factor Ⅸ), 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand factor), 금속단백질분해효소 트롬보스폰딘 모티프 1(metalloproteinase thrombospondin motifs 1, METH-1), METH-2, 트립토파닐-tRNA 신테타제(tryptophanyl-tRNA synthetase, TrpRS) 단편, 프롤리페린-관련 단백질(proliferin-related protein), 프로락틴(prolactin) 단편, 색소 상피 유래 성장 인자(pigment epithelium derived growth factor, PEDF), 바소스타틴(vasostatin), 안지오스타틴(angiostatin), 엔도스타틴(endostatin), 키니노스타틴(kininostatin), 피브리노겐-E(fibrinogen-E) 단편, 트롬보스폰딘(thrombospondin), 툼스타틴(tumstatin), 캔스타틴(canstatin), 레스틴(restin), 가용성 fms-유사 티로신 키나제-1(soluble fms-like tyrosine kinase-1, sFlt-1), 가용성 혈관 내피 성장인자 수용체(soluble vascular endothelial growth factor receptor, sFlk), 가용성 뉴로필린 1(soluble Neuropilin 1, sNRP1), 인터페론 감마-유도 단백질 10(IP-10), 혈소판 인자 4(Platelet factor 4, PF-4), 그로-베타(Gro-beta), 가용성 에프린 타입-B 수용체 4(soluble Ephrin type-B receptor 4, sEphB4), 세프린B2(sephrinB2), TGF, IGF-1, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK), 카복시펩티다제 G2(carboxypeptidase G2, CPG2), 카복실에스터라제(carboxylesterase, CA), 사이토신 데아미나제(cytosine deaminase, CD), 사이토크롬 P450(cytochrome P450, cyt-450), 데옥시사이티딘 키나제(deoxycytidine kinase, dCK), 니트로리덕타제(nitroreductase, NR), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제(purine nucleoside phosphorylase, PNP), 티미딘 포스포릴라제(thymidine phosphorylase, TP), 수두 대상 포진 바이러스 티미딘 키나제(varicella zoster virus thymidine kinase, VZV-TK), 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(xanthine-guanine phosphoribosyl transferase, XGPRT), 아스파르틸글루코사미니다제(Aspartylglucosaminidase), α-갈락토시다제 A(α-Galactosidase A), 팔미토일 단백질 티오에스터라제(Palmitoyl Protein Thioesterase), 트리펩티딜 펩티다제(Tripeptidyl Peptidase), 리소좀 막관통 단백질(Lysosomal transmembrane protein), 시스테인 트랜스포터(cysteine transporter), 산 세라미다제(acid ceramidase), 산 α-L-푸코시다제(acid α-L-fucosidase), 보호적 단백질(protective protein)/카텝신 A(cathepsin A), 산 β-글루코시다제(acid β-glucosidase) 또는 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 산 β-갈락토시다제(acid β-galactosidase), 이두로네이트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), α-L-이두로니다제(α-L-Iduronidase), 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase), 산 α-만노시다제(acid α-mannosidase), 산 β-만노시다제(acid β-mannosidase), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), N-아세틸갈락토사민-6-설페이트 설파타제(N-Acetylgalactosamine-6-sulfate sulfatase), N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제(N-Acetlylglucosamine-1-phosphotransperase), 산 스핑고미엘리나제(acid-sphingomyelinase), β-헥소사미니다제 B(β-Hexosaminidase B), 헤파란 N-설파타제(Heparan N-sulfatase), α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-Acetylglucosaminidase), 아세틸-CoA:알파 글루코사미닌드 N-아세틸트랜스퍼라제(Acetyl-CoA:αglucosamininde N-acetyltransferase), N-아세틸 글루코사민-6-설페이트 설파타제(N-Acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase), β-글루쿠로니다제(β-Glucuronidase), 산 리파아제(acid lipase), 네프릴리신(neprilysin), 인슐린- 분해 효소 인슐리신(insulysin), 티멧 올리고펩티다제(thimet oligopeptidase), 칼빈딘 D28(calbindin D28), 파발부민(parvalbumin), 저산소증 유도 인자 1-알파(hypoxia induced factor 1-alpha, HIF1-alpha), 서투인-2(sirtuin-2, SIRT-2), 생존 운동 뉴런 단백질-1(survival motor neuron protein-1, SMN-1), SMN-2, 교세포 유래 신경영양 인자(glial cell neurotrophic factor, GDNF), 모양체 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor, CNF), 저밀도 지단백 수용체(LDLR), 지단백 리파아제(lipoprotein lipase, LPL), 알파 1-항 트립신(Alpha-1-Antitrypsin, AAT), UDP-글루쿠로닐-트랜스퍼라제(UDP-glucuronyl-transferase, UGT), UGT1A1, 글루코스-6 포스파타제(glucose-6 phosphatase), 포스포에놀피루베이트-카복시키나제(phosphoenolpyruvate-carboxykinase), 갈락토스-1 포스페이트 유리딜 트랜스퍼라제(galactose-1 phosphate uridyl transferase), 페닐알라닌 히드록실라제(phenylalanine hydroxylase), 분지쇄 알파-케토산 데하이드로지나제(branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase), 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제(fumarylacetoacetate hydrolase), 메틸말로닐-CoA 뮤타제(methylmalonyl-CoA mutase), 오르니틴 트랜스카바밀라제(ornithine transcarbamylase), 아르지노숙신산 신테타제(argininosuccinic acid synthetase), 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase), 비오티니다제(biotinidase), 베타-글루코세레브로시다제(beta-glucocerebrosidase), 포르포빌리노겐 데아미나제(porphobilinogen deaminase) 및 p53 중으로부터 선택된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 분자는 혈우병 A를 치료하기 위한 인자 VIII; 혈우병 B를 치료하기 위한 인자 IX; 타입 I 당뇨병을 치료하기 위한 인슐린 유전자; 알파-1-항트립신(AAT) 결핍을 치료하기 위한 알파-1-항트립신(AAT); 혈색소 침착증(hemochromatosis)을 치료하기 위한 혈색소 침착증 단백질(HFE); 윌슨병(Wilson's disease)을 치료하기 위한 구리 수송성 ATPase 2; 크리글러-나자르 증후군 타입 I(Crigler-Najjar syndrome type I)을 치료하기 위한 UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 1A1(UDP glucuronosyltransferase 1A1, UGT1A1); 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍, 타입 II를 치료하기 위한 오르니틴 트랜스카바밀라제(ornithine transcarbamylase, OTC); 가족성 고콜레스테롤혈증을 치료하기 위한 저밀도 지단백 수용체(LDLR); 피브리노겐결핍증(afibrinogenemia)을 치료하기 위한 피브리노겐 알파(FGA), 베타(FGB) 또는 감마(FGG); 글리코겐 저장 질환(glycogen storage disease, GSD) 타입 Ia를 치료하기 위한 글루코스-6-포스페이트-α(glucose-6-phosphate-α); GSD 타입 Ib을 치료하기 위한 G6PT; GSD 타입 II(폼페병, Pompe)을 치료하기 위한 산-α-글루코시다제(acid-α-glucosidase); 점액다당류증(mucopolysaccharidosis, MPSI)을 치료하기 위한 α-L-이두로니다제(α-L-iduronidase); MPS IIIA를 치료하기 위한 설파미다제(sulphamidase); MPS IIIB를 치료하기 위한 α-N-아세틸글루코사미니다제(α-N-acetylglucosaminidase, NaGlu); MPS VII를 치료하기 위한 β-글루쿠로니다제(β-glucuronidase); 파브리병(Fabry disease)을 치료하기 위한 α-갈락토시다제 A(α-galactosidase A); 고셔병(Gaucher's disease)을 치료하기 위한 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase); 니이만-픽 증후군(Niemann-Pick syndrome)을 치료하기 위한 산 스핑고미엘리나제(acid sphingomyelinase); 페닐케톤뇨증(phenylketonuria)을 치료하기 위한 페닐알라닌 히드록실라제(phenylalanine hydroxylase); 간 섬유증(liver fibrosis)을 치료하기 위한 TIMP 길항제 또는 항-HSC 분자; 간 허혈증 재관류 손상(liver ischemia reperfusion injury)을 치료하기 위한 항-ROS 분자; 알츠하이머병을 치료하기 위한 아밀로이드-베타 분해 효소 네프릴리신(neprilysin), 인슐린-분해 효소 인슐리신(insulysin), 또는 티멧 올리고펩티다제(thimet oligopeptidase); 근육위축가쪽경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)을 치료하기 위한 인슐린 성장 인자-1(IGF-1), 칼빈딘 D28(calbindin D28), 파발부민(parvalbumin), 저산소증 유도 인자 1-알파(HIF1-alpha), 서투인-2(SIRT-2), 생존 운동 뉴런 단백질-1(SMN-1), SMN-2, 교세포 유래 신경영양 인자(GDNF) 또는 모양체 신경영양 인자(ciliary neurotrophic factor, CNF); 갈락토스혈증(galactosemia)을 치료하기 위한 갈락토스-1 포스페이트 유리딜 트랜스퍼라제(galactose-1 phosphate uridyl transferase); 단풍시럽뇨병(maple syrup urine disease)을 치료하기 위한 분지쇄 알파-케토산 데히드로지나제(branched chain alpha-ketoacid dehydrogenase); 티로신혈증 타입 I(tyrosinemia type I)을 치료하기 위한 푸마릴아세토아세테이트 히드롤라제(fumarylacetoacetate hydrolase); 메틸말론산혈증(methylmalonic acidemia)을 치료하기 위한 메틸말로닐-CoA 뮤타제(methylmalonyl-CoA mutase); 시트룰린혈증(citrullinemia)을 치료하기 위한 아르지노숙신산 신테타제(argininosuccinic acid synthetase); 통풍(Gout) 및 레쉬-니한 증후군(Lesch Nyhan syndrome)을 치료하기 위한 하이포산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase); 슬라이 증후군(Sly syndrome)을 치료하기 위한 베타-글루쿠로니다제(beta-glucuronidase); 젤위거 증후군(Zellweger syndrome)을 치료하기 위한 퍼옥시좀 막 단백질 70 kDa; 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염증을 치료하기 위한 엔푸버타이드(enfuvirtide); 중증 복합 면역결핍 질환(severe combined immunodeficiency disease, SCID)을 치료하기 위한 아데노신 데아미나제(adenosine deaminase, ADA); 낭포성 섬유증(cystic fibrosis)을 치료하기 위한 CFTR; 급성 간헐성 포르피린증(acute intermittent porphyria)을 치료하기 위한 포르포빌리노겐 데아미나제 (porphobilinogen deaminase, PBDG); 다발성 경화증(multiple sclerosis)을 치료하기 위한 인터페론-베타; 지단백 리파아제 결핍(lipoprotein lipase deficiency, LPLD)을 치료하기 위한 지단백 리파아제(lipoprotein lipase); 암을 치료하기 위한 p53; 및 파킨슨병(Parkinson's Disease)을 치료하기 위한 글루탐산 데카복실라제(glutamic acid decarboxylase, GAD) 중으로부터 선택된 폴리펩티드를 암호화하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 구획화된 조직 또는 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분은 조직을 통한 혈액 공급과 흐름을 차단하도록 실질적으로(parenchymally) 클램핑된 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조직 또는 기관, 또는 조직 또는 기관의 부분은 간, 뇌, 척수, 췌장, 심장, 피부, 신장, 폐, 혈관, 뼈, 근육, 자궁, 자궁목, 전립선, 요도, 및 장(intestine) 중으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 구획화된 기관, 조직 또는 이의 부분은 구획화된 간 또는 간의 부분인 것인 약제학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 구획화된 간의 부분은 엽(lobe), 엽의 구역(segment) 또는 부분 및 간의 구역 중으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제10항에 있어서,
상기 엽 또는 엽의 부분은 오른쪽엽(right lobe), 왼쪽엽(left lobe), 네모엽(quadrate lobe) 및 꼬리엽(caudate lobe) 및 이의 부분 중으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 또는 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV), 레트로바이러스(retrovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 및 허피스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 또는 바이러스 벡터 중으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 또는 바이러스 벡터는 핵산 분자를 포함하는 아데노바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 벡터이고, 여기에서 상기 핵산 분자는 바이러스 게놈에 대해 이종성인(heterologous) 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 바이러스 또는 바이러스 벡터는 아데노바이러스이고, 상기 아데노바이러스의 혈청형은 아데노바이러스 타입 2 또는 아데노바이러스 타입 5인 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 분자는 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA, 리보자임(ribozyme) 및 안티센스 핵산 중으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
실질 세포(parenchymal cell)에의 유입을 용이하게 하기 위해 지질(lipid), 폴리머 시약 또는 기타 제제와 함께 제형화되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
바이러스 또는 바이러스 벡터의 세포 흡수를 촉진시키는 제제와 함께 제형화되는 약제학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 세포 흡수를 촉진시키는 제제는 바이러스-특이적 세포 표면 수용체의 전사적 인핸서(transcriptional enhancer)인 것인 약제학적 조성물.
제17항에 있어서,
상기 세포 흡수를 촉진시키는 제제는 히스톤 데아세틸라제(hisonte deacetylase, HDAC) 저해제인 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 그것의 게놈 내에 이종성 핵산 분자를 포함하는 바이러스 또는 아데노바이러스 또는 아데노-관련 벡터를 포함하며, 이는 단일 투여량 투여를 위한 것이고; 및
상기 조성물에서 아데노바이러스의 양은 1 x 10⁶ 내지 1 x 10¹⁰ 입자, 또는 1 x 10⁷ 내지 1 x 10⁹ 입자; 또는 1 x 10¹² 입자, 1 x 10¹¹ 입자, 1 x 10¹⁰ 입자, 1 x 10⁹ 입자, 1 x 10⁸ 입자, 1 x 10⁷ 입자, 1 x 10⁶ 입자, 1 x 10⁵ 입자 또는 1 x 10⁴ 입자 미만; 또는 1 x 10¹² pfu, 1 x 10¹¹ pfu, 1 x 10¹⁰ pfu, 1 x 10⁹ pfu, 1 x 10⁸ pfu, 1 x 10⁷ pfu, 1 x 10⁶ pfu, 1 x 10⁵ pfu, 또는 1 x 10⁴ pfu 미만인 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
성인 인간 또는 18세 이하의 인간 아동, 또는 태아(fetus)에 대한 투여를 위한 단일 투여량 분량(single dosage amount)으로 제형화되는 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 핵산 분자는 동물에서 근육 생산을 증가시키거나, 동물의 털(hair) 성장을 증가시키거나, 동물에서 모(wool) 생산을 증가시키거나, 동물의 성장을 증가시키는 폴리펩티드 또는 영양소 합성 또는 활용과 관련된 폴리펩티드를 암호화하는 것인 약제학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리펩티드는
미오스타틴 저해제(myostatin inhibitor)인, 동물에서 근육 생산을 증가시키는 폴리펩티드;
성장 호르몬(growth hormone), IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자(growth hromone releasing facor) 또는 닭 Ski(chicken Ski)인, 동물에서 성장을 증가시키는 폴리펩티드; 및
세린 트랜스아세틸라제(serine transacetylase) 및 o-아세틸세린 설프히드릴라제(o-acetylserine sulphydrylase)인, 영양소 합성 또는 활용과 관련된 폴리펩티드;
중으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제23항에 있어서,
상기 폴리펩티드는 근육 생산을 증가시키며, 폴리스타틴인 미오스타틴 저해제인 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자에 의해 치료가능한 질환 또는 상태는 당뇨병인 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 인슐린을 암호화하는 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자에 의해 치료가능한 질환 또는 상태는 혈우병인 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 인자 VIII를 암호화하는 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 분자는 인자 IX를 암호화하는 것인 약제학적 조성물.
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