WO2017135795A1 - 간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents

간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 Download PDF

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WO2017135795A1
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hgf
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성영철
이순민
김혜연
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    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18541—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant lentiviral vector comprising a gene encoding a hapatocyte growth factor (HGF) protein, and a cell transfected with a lentiviral produced using the vector.
  • HGF hapatocyte growth factor
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the MSC can be obtained relatively easily in various adult tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and fat.
  • MSC has a property of moving to an inflammation or injury site, and thus has a great advantage as a delivery agent for delivering a therapeutic drug.
  • immune cells such as T cells, B cells, dendritic cells and natural killer cells, it is possible to regulate the immune function of the human body.
  • MSC has the advantage that it can be cultured relatively easily in vitro , and researches for using it as a cell therapy are being actively conducted.
  • Korean Patent No. 1585032 discloses a cell therapy containing mesenchymal stem cells cultured in a hydrogel.
  • This document provides a composition which can be directly administered by shortening the pretreatment process in the process of separating the mesenchymal stem cells for use as a cell therapeutic agent.
  • it does not mention at all the problems of the mesenchymal stem cells as described above and a solution for solving them. Therefore, there is a need for a study on mesenchymal stem cells that can be usefully used as a cell therapy.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the recombinant lentivirus or a host cell.
  • the present invention provides a recombinant lentiviral vector comprising a gene encoding the HGF protein.
  • the present invention also provides a recombinant lentivirus comprising a gene encoding HGF protein.
  • the present invention also provides a host cell transfected with the recombinant lentivirus.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of vascular diseases comprising the recombinant lentiviral as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases comprising the host cell as an active ingredient.
  • Host cells transfected with a recombinant lentivirus comprising a gene encoding the HGF protein of the present invention express HGF and maintain a high cell proliferation rate. In addition, it is possible to suppress abnormal differentiation and to block the possibility of tumor formation, thereby increasing safety. Therefore, the host cell expressing the HGF can be usefully used as a cell therapeutic agent.
  • 1 is a graph comparing cell proliferation of immortalized and non-immortalized MSCs:
  • imMSC immortalized MSC
  • MSC unimmortalized MSC
  • Y axis cumulative population doubling level (PDL).
  • FIG. 2 is a schematic of the construction of the gene construct inserted into the pBD-4 lentiviral vector:
  • TRE promoter comprising tetracycline response elements
  • HGF hepatocyte growth factor
  • RSVp RSV promoter
  • Hygro R Gene with resistance to hygromycin.
  • FIG. 3 is a graph confirming the cell proliferation rate of immortalized MSCs transfected with a lentivirus containing the HGF gene:
  • Y axis cumulative cell population doubling.
  • Lane 4 confirms whether HGF is present in the deposited strain BM-34A.
  • Lane 1 is marker, lanes 2 and 3 are BM-34A, lane 4 is negative control, lane 5 is positive control.
  • FIG. 5 is a graph showing the expression rate of HGF protein in BM-34A cell line of three different passages.
  • Figure 6 is a graph showing the PDL value of the BM-34A cells obtained by passage culture.
  • Figure 7 shows the results of analyzing the karyotype of the cells into which the gene is introduced for the BM-34A cell line.
  • the present invention provides a recombinant lentiviral vector comprising a gene encoding a HGF protein.
  • hapatocyte growth factor (HGF) protein, as used herein, is a heparin binding glycoprotein known as a scatter factor or hepatopoietin-A. It is produced by a variety of mesenchymal cells and promotes cell proliferation. In addition, HGF is known to regulate the growth of endothelial cells and the movement of vascular smooth muscle cells, and induce angiogenesis.
  • the HGF protein according to the present invention may be a protein of human origin.
  • the HGF protein is a heterodimeric protein consisting of an ⁇ chain of 69 kDa and a ⁇ chain of 34 kDa, and may include four kringle structures in the ⁇ chain.
  • the HGF protein of the invention may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the HGF protein may have at least about 70%, 80%, 90%, or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the HGF protein may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the base sequence encoding the HGF protein may have at least about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the base sequence of SEQ ID NO: 2.
  • lentiviral vector is a type of retrovirus and is also referred to as a vector in the form of a single stranded RNA in combination with a lentiviral transfer vector.
  • the lentiviral vector may be inserted into genomic DNA of a cell to be infected to stably express a gene, and may transfer the gene to dividing cells and non-dividing cells. Since the vector does not induce an immune response in the human body, expression is persistent.
  • a gene of a large size can be delivered as compared with the adenovirus vector which is a viral vector used in the prior art.
  • the lentiviral vector may further include a gene encoding a thymidine kinase (TK) protein.
  • the TK protein is an enzyme that catalyzes thymidylic acid production by binding phosphoric acid at the ⁇ position of ATP to thymidine, thereby transforming thymidine into triphosphate form. Modified thymidine cannot be used for DNA replication and is therefore known to induce death of cells comprising it.
  • the TK protein can be used as long as it is a known sequence.
  • the TK protein may be a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the gene encoding the TK protein may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the recombinant lentiviral vectors of the invention can regulate the expression of genes loaded thereon by a promoter.
  • the promoter may be a cytomegalovirus (CMV), respiratory syncytial virus (RSV), human elongation factor-1 alpha (EF-1 ⁇ ) or tetracycline response elements (TRE) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • EF-1 ⁇ human elongation factor-1 alpha
  • TRE tetracycline response elements
  • the recombinant lentiviral vector can regulate the expression of HGF protein by one promoter.
  • the promoter is operably linked to a gene encoding a protein to be expressed.
  • the HGF protein may be linked to a TRE promoter.
  • the TRE promoter may activate transcription of a gene linked to a promoter by a ttracycline transactivator (tTA) protein.
  • tTA ttracycline transactivator
  • the tTA protein binds to the TRE promoter and activates transcription in the absence of tetracycline or doxycycline, and when present, does not bind to the TRE promoter and thus does not activate transcription.
  • expression of HGF protein can be controlled according to whether tetracycline or doxycycline is added.
  • operably linked means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide so that it can function. That is, operably linked genes encoding a particular protein means that the gene is transcribed into mRNA and translated into the protein by the action of the promoter.
  • the present invention provides a recombinant lentivirus comprising a gene encoding HGF protein.
  • the recombinant lentiviral is transformed into a host cell with the lentiviral vector, packaging plasmid and envelope plasmid of the present invention; And separating the lentivirus from the transformed host cell.
  • packaging plasmid and "envelope plasmid” refer to helper structures (eg, plasmids or isolation) for producing lentiviral from the lentiviral vectors of the present invention for efficient transfection.
  • Nucleic acid Such constructs contain elements useful for preparing and packaging lentiviral vectors in host cells. Such elements include structural proteins such as gag precursors; processing proteins such as pol precursors; Proteases, envelope proteins, and expression and regulatory signals necessary for preparing proteins and producing lentiviral particles in host cells, and the like.
  • the production of recombinant lentiviruses may include Lenti-X Lentiviral Expression System from Clontech Laboratories, a packaging plasmid from Addgene (eg, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, etc.) or envelope plasmid (eg, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG, etc.) can be used.
  • Addgene eg, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, etc.
  • envelope plasmid eg, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG, etc.
  • the present invention also provides a host cell transfected with the recombinant lentivirus.
  • transfection refers to the delivery of a gene loaded into a recombinant lentiviral vector via viral infection.
  • Host cells are human embryonic stem cells (hES), bone marrow stem cells (bone marrow stem cells, BMSC), mesenchymal stem cells (MSC), human neural stem cells (human neural stem cells) stem cells, hNSC), limbal stem cells, or oral mucosal epithelial cells.
  • the host cell may be a mesenchymal stem cell.
  • MSC meenchymal stem cell
  • chondrocytes a multipotent stromal cell that can differentiate into a variety of cells, including bone cells, chondrocytes and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells can be differentiated into cells of specific organs such as bones, cartilage, fat, tendons, nerve tissues, fibroblasts and muscle cells. These cells can be isolated or purified from adipose tissue, bone marrow, peripheral nerve blood, umbilical cord blood, periosteum, dermis, mesoderm-derived tissue and the like.
  • the host cell may be prepared by the following method:
  • hTERT and c-myc are immortalized host cells.
  • other genes known as immortalized genes may be used.
  • the hTERT and c-myc protein may be a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • the genes encoding the hTERT and c-myc proteins may be polynucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • tTA is a gene capable of controlling expression of a target protein, and means tetracycline transactivator.
  • the Tet-off system used in the present invention can regulate the expression of the target protein depending on the presence or absence of tetracycline or doxycycline by the method described above.
  • the lentiviral including the HGF gene is thirdly infected with immortalized MSC to prepare cells expressing the HGF gene.
  • the prepared cells were named as BM-34A, and were deposited with KCTC 13183BP at the Korea Institute of Biotechnology and Biotechnology Center on January 6, 2017.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular diseases comprising a recombinant lentivirus or a host cell as described above as an active ingredient.
  • vascular disease refers to a disease that may be caused by aging or decreased elasticity of blood vessels. Since the recombinant lentivirus or the host cell of the present invention can exhibit angiogenic effects through the expression of HGF, it can be used for the treatment of various vascular diseases.
  • the vascular disease is a disease occurring in coronary artery, cerebrovascular disease, peripheral artery disease, angina pectoris, myocardial infarction, arteriosclerosis, atherosclerosis, nodular periarteritis, ocular arthritis, vascular occlusion, stroke, cerebral hemorrhage, cerebral embolism, cerebral edema and ischemic disease May be selected from the group consisting of diseases.
  • the pharmaceutical composition is a kind of cell therapy, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier, additive, or excipient required for formulation of the pharmaceutical composition.
  • the carrier is commonly used in the manufacture of drugs, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrroli Money, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and combinations thereof.
  • a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and combinations thereof.
  • the carrier may comprise from about 1% to about 99.99% by weight, preferably from about 90% to about 99.99% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention, wherein the pharmaceutically acceptable additive is about 0.1 Weight percent to about 20 weight percent.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and excipient according to a conventional method, or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise a dispersing or stabilizing agent.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating a vascular disease as described above, comprising administering a pharmaceutical composition of the invention to a subject.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the route of administration and dosage of the pharmaceutical composition can be administered to the subject in a variety of ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence of side effects, and the optimal method of administration and dosage can be selected by the skilled person in the appropriate range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effect is known for the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • examples thereof include subcutaneous, eye, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, orbital, intracranial, intracranial, spinal, intraventricular, meninges, There is intranasal, intravenous, intracardiac administration.
  • the administration may be administered one or more times, 1 to 3 times, and specifically, divided into two administrations. In the case of repeated administration, it may be administered at 12 to 48 hours and 24 to 36 hours, and specifically, at 24 hours.
  • the lentiviral may be administered in an amount of 1.0x10 6 to 1.0x10 12 TU, specifically 1.0x10 8 to 1.0x10 10 TU, per adult day.
  • the cells may be administered in an amount of 1.0x10 5 to 1.0x10 11 cells, specifically 1.0x10 7 to 1.0x10 9 cells per day of adult. If the dosage is high, it may be administered several times a day.
  • lentiviral vectors containing immortalized genes c-Myc and hTERT, respectively, were prepared. At this time, the gene construct expressing the tTA protein was inserted together to use the Tet-off system.
  • a pBD lentiviral vector was constructed by replacing an EF promoter with a CMV promoter in an expression cassette of a pWPT vector (Addgene, USA), and further connecting an RSV promoter to a lower portion thereof.
  • the c-Myc gene (SEQ ID NO: 6) and the thymidine kinase (TK) gene (SEQ ID NO: 4) were linked to IRES and inserted so that expression can be controlled by the CMV promoter. .
  • the produced vector was named pBD-1.
  • the hTERT gene (SEQ ID NO: 8) was inserted into the pBD lentiviral vector so that expression could be controlled by the CMV promoter.
  • a gene ZeoR; SEQ ID NO: 14 having resistance to zeomycin was inserted so that expression could be controlled by the RSV promoter.
  • the produced vector was named pBD-2.
  • tTA tetracycline transactivator
  • a lentiviral containing an immortalized gene was produced by the following method.
  • Lenti-X cells (Clontech Laboratories, USA) were incubated in 150 mm dishes using DMEM medium containing 10% fetal calf serum.
  • lentiviral vectors were extracted and quantified from DH5 ⁇ Escherichia coli cells using the EndoFree Plasmin Maxi Kit (Qiagen, USA).
  • the cultured Lenti-X cells were washed with PBS and then 3 ml of TrypLE TM Select CTS TM (Gibco, USA) was added. After leaving the cells for about 5 minutes at 37 °C, it was confirmed that the cells detached. The detached cells were neutralized by adding DMEM medium containing 7 ml of 10% fetal calf serum. Neutralized cells were collected in 50 ml tubes and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and cells were resuspended by adding DMEM culture medium containing 10 ml of 10% fetal calf serum.
  • the suspended cells were counted with a hematocytometer and then aliquoted into 1.2 ⁇ 10 7 cells in a 150 mm dish.
  • 12 ⁇ g lentiviral vector, 12 ⁇ g psPAX (Addgene; gag-pol expression, packaging plasmid) and 2.4 ⁇ g pMD.G plasmid (Addgene; VSVG Expression, envelope plasmid) mixture was transduced into the cells.
  • lipofectamine Invitrogen, USA
  • Plus Reagent Invitrogen, USA
  • the obtained supernatant was mixed with a lentiviral enrichment kit (Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, USA) and then incubated overnight at 4 ° C. This was centrifuged for 2 hours at 4 ° C. and 4,000 rpm to obtain a virus, which was resuspended in 0.5 ml of DMEM without FBS. As a result, was placed in a pBD-1, pBD-2 and pBD-3 lentivirus vector
  • the lentivirus virus respectively 4.0x10 8 TU / ml produced from a concentration of 2.0x10 8 TU / ml and 1.2x10 9 TU / ml.
  • Immortalized MSCs were prepared using a lentivirus comprising an immortalized gene produced in Example 1-2 above.
  • bone marrow-derived MSCs were prepared in the following manner. Specifically, bone marrow aspirate was obtained in the iliac crest of a healthy donor. This was mixed with 20 IU / ml heparin in a sterile container to inhibit coagulation. The bone marrow mixture was centrifuged at 4 ° C., 739 g for 7 minutes, then the supernatant was removed and mixed with 10-fold volume of sterile water. It was centrifuged again under the same conditions to obtain pellets of cells.
  • the obtained pellet was suspended in DMEM-low glucose (11885-084, Gibco, USA) medium containing 20% FBS and 5 ng / ml b-FGF (100-18B, Peprotech, USA) and dispensed into culture flasks. It was. It was incubated for 24 to 48 hours at 37 ° C., 5% CO 2 conditions and then replaced with fresh medium. This was passaged while replacing with fresh medium at intervals of 3 to 4 days, and after 2 weeks of culture, MSC was checked using a fluorescence cell analyzer.
  • the prepared MSCs with pBD-1 lentivirus produced in Example 1-2 were infected with 100 MOI using Retronectin (Retronectin, Clontech Laboratories, USA). Infected cells were infected in the same way with the pBD-2 lentiviral vector at 100 MOI. After infection, 500 ⁇ g / ml geomycin was added to the culture of stabilized cells to select cells infected with pBD-2 lentivirus.
  • the selected cells were infected with pBD-3 lentiviral vector at 100 MOI. After infection, 1 ⁇ g / ml puromycin was added to the culture of stabilized cells to select cells infected with pBD-3 lentivirus.
  • MSCs containing immortalized genes and MSCs not shown are shown in FIG. 1.
  • MSC cells infected with lentiviral, including the immortalized genes c-myc and hTERT maintained a high cell proliferation rate even after 120 days of culture.
  • normal MSC cells showed a rapid decrease in cell proliferation after 40 days of culture.
  • HGF gene (SEQ ID NO: 2) was inserted.
  • the inserted HGF gene was controlled by the TRE promoter.
  • the TRE promoter may regulate the expression of genes linked thereto depending on the presence or absence of doxycycline.
  • HygroR hygromycin resistant gene
  • Lentiviruses were produced in the same manner as described in Example 1-2, using the lentiviral vector comprising the HGF gene prepared in Example 2-1.
  • the lentiviral produced was prepared at a concentration of 3.5 ⁇ 10 8 TU / ml.
  • the immortalized MSC prepared in Example 1-3 was infected with a lentivirus containing the HGF gene produced in Example 2-2, thereby preparing cells expressing the HGF gene. Infection was performed in the same manner as described in Examples 1-3. After infection, 25 ⁇ g / ml of hygromycin was added to the culture of stabilized cells to select cells infected with pBD-4 lentivirus. Selected cells were cultured in a medium to which 2 ⁇ g / ml of doxycycline (631311, Clontech, USA) was added to inhibit the expression of HGF protein during the culture.
  • doxycycline 631311, Clontech, USA
  • BM-34A The selected cells were cultured to form colonies.
  • Cells were established by culturing monoclonal cells from the colonies formed and named BM-34A.
  • Cell line BM-34A was deposited with KCTC 13183BP at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology as of January 6, 2017. As a result, the proliferation rate of the established cell line is shown in FIG. As can be seen, BM-34A cell lines stably proliferated.
  • BM-34A sample the established cell line, was thawed for about 1 minute in a 37 ° C constant temperature water bath, transferred to a 15 ml tube containing 9 ml PBS, and then cell-downed at 1,500 rpm for 5 minutes. After complete removal of PBS, pellets were transferred by suspending 200 ⁇ l of PBS in a 1.5 ml tube.
  • GDNA was prepared using NucleoSpin ® Tissue (MN, 740952.250) and a mixture was prepared as shown in Table 1, followed by PCR in the steps of Table 2 below. At this time, 100 ng of BM-34A plasmid DNA was added as a positive control and 1 ⁇ l dW was added as a negative control.
  • both BM-34A cell line specimens confirmed PCR products of the same size (1.0 kb) as the positive control group.
  • HGF protein expressed in the BM-34A cell line established in Example 3-1 was confirmed by ELISA analysis method.
  • the cells were incubated for two days with a culture medium containing no doxycycline.
  • the BM-34A cell line was seeded in 12-well plates with a total volume of 1 ml with 1 ⁇ 10 5 cell count. After 48 hours, about 1 ml of cell culture was obtained and analyzed using human HGF DuoSet ELISA kit (R & D systems, DY294, USA). Experiments were performed according to the manual included in each kit. In order to confirm that there is no change in expression rate for each passage, three different passages of cells were used for analysis. The results of the analysis are shown in FIG. 5, and the expression levels of HGF proteins induced for 24 hours from about 1 ⁇ 10 5 cells in the doxycycline-free medium are shown in Table 3 below.
  • HGF was expressed in the BM-34A cell line cultured in a medium in which doxycycline was removed. As shown in Table 3, about 47.72 ng / ml of the HGF protein in the BM-34A cell line of the present invention. It was confirmed that this is expressed.
  • the BM-34A cell line was seeded using a medium containing 2 ⁇ g / ml of doxycycline in a T75 flask with 4 ⁇ 10 5 cell numbers. Cells were obtained by passage 3 or 4 days and the total cell number was measured. The same number of cells were seeded to measure PDL at 3-4 day intervals. PDL values were calculated using Equation 1 below, and the results are shown in FIG. 6. At this time, in Equation 1, X represents the initial PDL, I represents the initial cell number seeded in the blood vessel, Y represents the final cell yield, or the cell number at the end of the growth phase.

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Abstract

본 발명은 간세포성장인자 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질감염된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스는 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하고, 상기 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 높은 세포 증식율을 유지한다. 따라서, 상기 렌티바이러스가 형질감염되어 HGF를 발현하는 중간엽줄기세포는 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

간세포성장인자를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
본 발명은 HGF(hapatocyte growth factor) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질감염된 세포에 관한 것이다.
전 세계적으로 세포를 이용한 치료 방법이 개발되고 있으며, 특히 줄기세포치료제 시장은 연평균 11.7%의 성장율로 지속적인 상승 추세를 보이고 있다.
성체줄기세포인 중간엽줄기세포(MSC)는 다능성(multipotent) 세포로서, 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, 상기 MSC는 골수, 제대혈, 지방 등 다양한 성체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증 또는 손상부위로 이동하는 특성이 있어, 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있다. 또한, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연살해세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하여, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니라, MSC는 시험관 내(in vitro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있어, 이를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고, 세포 치료제로서 임상에 사용할 수 있는 등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째, MSC의 증식에는 한계가 있어, 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있어, 생산시마다 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋째, MSC만을 이용할 경우 치료 효과가 높지 않다.
한편, 대한민국 등록특허 제1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서, 전처리 과정을 단축하여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있다. 그러나, 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라서, 세포 치료제로 유용하게 사용할 수 있는 중간엽줄기세포에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은, HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 및 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 HGF를 발현하며, 높은 세포 증식율을 유지한다. 또한, 비정상적인 분화를 억제하고 종양 형성의 가능성을 차단할 수 있어 안전성이 높다. 따라서, 상기 HGF를 발현하는 숙주세포는 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 불사화된 MSC와 불사화되지 않은 MSC의 세포 증식율을 비교한 그래프이다:
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응 요소(tetracycline response elements)를 포함하는 프로모터;
HGF: 간세포성장인자;
RSVp: RSV 프로모터; 및
HygroR: 하이그로마이신에 대한 저항성을 갖는 유전자.
도 3은 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 불사화된 MSC의 세포 증식율을 확인한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수.
도 4는 기탁균주인 BM-34A에 HGF가 존재하는지 여부를 확인한 것이다. 1번 레인은 마커, 2번 및 3번 레인은 BM-34A, 4번 레인은 음성대조군, 5번 레인은 양성대조군을 나타낸다.
도 5는 세 개의 다른 패시지(passage)의 BM-34A 세포주에서 HGF 단백질의 발현율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 계대 배양하여 수득한 BM-34A 세포의 PDL 값을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "간세포성장인자(hapatocyte growth factor, 이하 HGF)" 단백질은 분산인자(scatter factor) 또는 헤파토포이에틴-A(hepatopoietin-A)로 알려진 헤파린 결합 당단백질이다. 이는 여러가지 간엽계 세포에 의해 생산되며, 세포의 증식을 촉진시킨다. 또한, HGF는 내피세포(endothelial cell)의 성장 및 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cell)의 이동을 조절하며, 혈관신생(angiogenesis)을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 HGF 단백질은 인간 유래의 단백질일 수 있다. 상기 HGF 단백질은 69 kDa의 α사슬과 34 kDa의 β사슬로 된 헤테로 2합체 단백질로, α사슬에 4개의 크린글(kringle) 구조를 포함할 수 있다. 본 발명의 HGF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 HGF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 HGF 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 HGF 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 2의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이고, 단일가닥 RNA 형태의 벡터로 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터와 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시키며, 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
상기 렌티바이러스 벡터는 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 TK 단백질은 ATP의 γ위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딜산 생성반응을 촉매하는 효소로, 이로 인해 티미딘은 삼인산 형태로 변형된다. 변형된 티미딘은 DNA 복제에 사용될 수 없고, 따라서 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 TK 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 TK 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 TK 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 프로모터에 의해 이에 적재된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개의 프로모터에 의해서 HGF 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된다.
일 실시예에 의하면, 상기 HGF 단백질은 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. 상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycline transactivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독시사이클린(doxycycline)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시키고, 이들이 존재하는 경우에는 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, HGF 단백질의 발현은, 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 여부에 따라 이를 조절할 수 있다.
상기 용어 "작동가능하게 연결된"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 발명은 HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프(envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
상기 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid)"는, 효율적인 형질감염을 위해, 본 발명의 렌티바이러스 벡터로부터 렌티바이러스를 생산하기 위한 헬퍼 구조물(예를 들어, 플라스미드 또는 단리된 핵산)을 제공할 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 gag 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
상기 용어 "형질감염(transfection)"은, 바이러스 감염(infection)을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 숙주세포는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 숙주세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
상기 용어 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직, 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피, 중배엽-유래 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
상기 숙주세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 숙주세포에 hTERT 및 c-myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;
2) 1차 감염된 숙주세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계;
3) 2차 감염된 숙주세포에 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차 감염시키는 단계.
상기 단계 1)에서 hTERT 및 c-myc은 숙주세포를 불사화시키는 유전자로서, 상기 hTERT 및 c-myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 hTERT 및 c-myc 단백질은 각각 서열번호 7 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 hTERT 및 c-myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 8 및 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 단계 2)에서 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로, 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 단계 3)에 해당하는 일 실시예에 의하면, 불사화된 MSC에 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차감염시켜 HGF 유전자를 발현하는 세포를 제조하여 수득하였다. 상기 제조된 세포를 BM-34A로 명명하고, 이를 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13183BP로 기탁하였다.
본 발명은 상기 서술한 바와 같은 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혈관계 질환(vascular disease)"은 혈관의 노화 또는 탄력 저하에 의해 야기될 수 있는 질환을 의미한다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포는 HGF의 발현을 통해 혈관생성 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 다양한 혈관계 질환의 치료에 사용될 수 있다.
상기 혈관계 질환은 관상동맥, 뇌혈관, 말초동맥질환 등에서 발생하는 질환으로, 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 결절성 동맥주위염, 고안동맥염, 혈관폐색, 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌색전, 뇌부종 및 허혈성 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적 조성물의 제형에 필요한 약학적으로 허용 가능한 담체, 첨가제 또는 부형제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 혈관계 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내, 심장 내 투여가 있다.
상기 투여는 1회 이상, 1 내지 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x106 내지 1.0x1012 TU, 구체적으로 1.0x108 내지 1.0x1010 TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1011 cells, 구체적으로 1.0x107 내지 1.0x109 cells의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포(MSC)의 제조
1-1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-off 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저, pWPT 벡터(Addgene, 미국)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하고, 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하여 pBD 렌티바이러스 벡터를 제작하였다.
상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자(서열번호 6) 및 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 유전자(서열번호 4)를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에, hTERT 유전자(서열번호 8)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오마이신(zeomycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(ZeoR; 서열번호 14)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-2로 명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA(tetracycline transactivator) 유전자(서열번호 10)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신(puromycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(PuroR; 서열번호 12)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-3로 명명하였다.
1-2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1-1에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.
먼저, 렌티-X 세포(Clontech Laboratories, 미국)는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 ㎜ 디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다.
상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3 ㎖의 TrypLE™ Select CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 ㎖ 튜브에 모아서 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 현탁된 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150 ㎜ 디쉬에 1.2x107개의 세포가 되도록 분주하였다. 상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터, 12 ㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드) 및 2.4 ㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드) 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 추가 배양한 뒤, 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 혼합한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하고, 이를 FBS가 포함되지 않은 0.5 ㎖의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과, pBD-1, pBD-2 및 pBD-3 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0x108 TU/㎖, 2.0x108 TU/㎖ 및 1.2x109 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
1-3. 불사화된 중간엽줄기세포의 제조
상기 실시예 1-2에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여, 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저, 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 장골능(iliac crest)에서 골수천자액(bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/㎖의 헤파린과 혼합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 4℃, 739 g의 조건으로 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 10배 부피의 멸균된 물과 혼합하였다. 이를 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 20%의 FBS 및 5 ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1-2에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴(Retronectin, Clontech Laboratories, 미국)을 사용하여 100 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포에 동일한 방법으로, pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 500 ㎍/㎖의 지오마이신을 첨가하여 pBD-2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포에 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
그 결과, 불사화 유전자를 포함하는 MSC 및 그렇지 않은 MSC의 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 보이는 바와 같이, 불사화 유전자인 c-myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다.
실시예 2. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
2-1. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제작
상기 제작된 pBD 렌티바이러스 벡터에, HGF 유전자(서열번호 2)를 삽입하였다. 이때, 삽입된 HGF 유전자는 TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. TRE 프로모터는 독시사이클린의 첨가 유무에 따라 이와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
여기에, 하이그로마이신(hygromycin) 저항성을 갖는 유전자(HygroR)(서열번호 16)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-4로 명명하였고, 그 유전자 컨스트럭트의 구조를 도 2에 나타내었다.
2-2. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 2-1에서 제작된 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1-2에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 3.5x108 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 3. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
3-1. HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
상기 실시예 1-3에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2-2에서 생산한 HGF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시켜, HGF 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 감염은 실시예 1-3에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 25 ㎍/㎖의 하이그로마이신을 첨가하여 pBD-4 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다. 선별된 세포는 2 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 배양중에 HGF 단백질의 발현을 억제시켰다.
상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-34A라고 명명하였다. 세포주 BM-34A는 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13183BP로 기탁하였다. 그 결과, 확립된 세포주의 증식율을 도 3에 나타내었다. 보이는 바와 같이 BM-34A 세포주는 안정적으로 증식하였다.
3-2. BM-34A 세포주의 도입유전자 확인 시험
상기 확립된 세포주인 BM-34A 검체를 37℃ 항온수조에서 약 1분간 해동하고 9 ㎖ PBS가 포함된 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 셀 다운(Cell Down) 시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 200 ㎕의 PBS로 펠렛을 현탁하여 옮겼다. NucleoSpin® Tissue (MN, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 1과 같이 혼합물을 만든 후, 하기 표 2의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때, 양성대조군으로 100 ng의 BM-34A 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ㎕의 dW를 넣었다.
Forward primer(서열번호 17) (10 pmol/㎕, BM163) 1 ㎕
Reverse primer(서열번호 18) (10 pmol/㎕, BM151) 1 ㎕
검체 (100 ng/㎕) 1 ㎕
dW 17 ㎕
Total volume 20 ㎕
Step Temperature Time Cycle
1st 95℃ 5min 1
2nd 95℃ 45sec 35
60℃ 45sec
72℃ 1min
3rd 72℃ 7min 1
4th 4℃ Indefinitely 1
1% 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10 ㎕의 DNA Size Marker를 로딩하였고, 다음 웰부터 BM-34A 검체(2개), 음성대조군, 양성대조군의 순서로 각각 10 ㎕씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, BM-34A 세포주 검체 2개 모두 양성대조군과 동일한 사이즈 (1.0kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
3-3. 확립된 세포주에서 HGF 단백질의 발현 확인
상기 실시예 3-1에서 확립된 BM-34A 세포주에서 HGF 단백질의 발현을 ELISA 분석 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 독시사이클린이 포함되지 않은 배양액으로 이틀동안 배양하였다. BM-34A 세포주를 12-웰 플레이트에 1X105 세포 수로 총 부피가 1 ㎖가 되도록 시딩(seeding)하였다. 48시간 후, 약 1 ㎖의 세포 배양액을 수득하여 인간 HGF DuoSet ELISA 키트 (R&D systems, DY294, USA)를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었다. 각 계대별로 발현율의 변함이 없는지 확인하기 위해, 세 개의 다른 패시지(passage)의 세포를 이용하여 분석하였다. 그 분석 결과를 도 5에 나타내었으며, 독시사이클린을 제거한 배지에서 약 1x105개의 세포로부터 24시간 동안 발현이 유도된 HGF 단백질의 발현 수준을 하기 표 3에 나타내었다.
표적 단백질 발현 수준
HGF 47.72 ng/㎖
도 5에 나타난 바와 같이, 독시사이클린이 제거된 배지에서 배양한 BM-34A 세포주에서 HGF가 발현되는 것을 확인하였으며, 상기 표 3과 같이, 본 발명의 BM-34A 세포주에서 약 47.72 ng/㎖의 HGF 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
3-4. 세포의 PDL (Population doubling level) 분석
BM-34A 세포주를 4x105 세포 수로 하여 T75 플라스크에 2 ㎍/㎖의 독시사이클린이 포함된 배지를 이용하여 시딩하였다. 3일 또는 4일 정도 계대 배양하여 세포를 수득하였고 총 세포수를 측정하였다. 같은 수의 세포를 시딩하여 3 내지 4일 간격으로 PDL을 측정하였다. PDL 값은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 하기 수학식 1에서 X는 초기 PDL, I는 혈관에 시드된 초기 세포 수, Y는 최종 세포수율, 또는 성장기 말의 세포 수를 나타낸다.
Figure PCTKR2017001301-appb-M000001
도 6에 나타난 바와 같이, 장기 계대 배양시에도 안정된 성장을 보여주고 있음을 확인하였다.
3-5. 세포의 핵형 분석
BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 이원생명과학연구원(한국)에 분석 의뢰하여 정해진 프로토콜에 따라 수행되었다. 분석 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, BM-34A 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체에서 이상 여부는 관찰되지 않았으며 정상 핵형으로 분석되었다.
[기탁증]
[규칙 제26조에 의한 보정 23.02.2017]　
Figure WO-DOC-FIGURE-154

Claims (11)

  1. 간세포성장인자(hapatocyte growth factor, HGF) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 HGF 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 벡터가 프로모터를 포함하는 것인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  5. HGF 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 렌티바이러스는 제1항의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및
    형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득되는 것인, 재조합 렌티바이러스.
  7. 제5항의 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 숙주세포는 중간엽줄기세포인, 형질감염된 숙주세포.
  9. 제5항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 혈관계 질환이 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 결절성 동맥주위염, 고안동맥염, 혈관폐색, 뇌졸중, 뇌출혈, 뇌색전, 뇌부종 및 허혈성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  11. 제7항의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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