WO2017135800A1 - Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents

Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도 Download PDF

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이순민
김혜연
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant lentiviral vector comprising a gene encoding a TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) protein and a cytosine deaminase (CD) protein, and a cell transfected with a lentiviral produced using the vector.
  • TRAIL TNF-related apoptosis-inducing ligand
  • CD cytosine deaminase
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the MSC can be obtained relatively easily in various adult tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and fat.
  • MSC has a property of moving to an inflammation or injury site, and thus has a great advantage as a delivery agent for delivering a therapeutic drug.
  • immune cells such as T cells, B cells, dendritic cells and natural killer cells, it is possible to regulate the immune function of the human body.
  • MSC has the advantage that it can be cultured relatively easily in vitro , and researches for using it as a cell therapy are being actively conducted.
  • Korean Patent No. 1585032 discloses a cell therapy containing mesenchymal stem cells cultured in a hydrogel.
  • This document provides a composition which can be directly administered by shortening the pretreatment process in the process of separating the mesenchymal stem cells for use as a cell therapeutic agent.
  • it does not mention at all the problems of the mesenchymal stem cells as described above and a solution for solving them. Therefore, there is a need for a study on mesenchymal stem cells that can be usefully used as a cell therapy.
  • An object of the present invention is to provide a recombinant lentivirus comprising a gene encoding a TRAIL protein and a CD protein and a host cell transfected with the recombinant lentivirus.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising the recombinant lentivirus or a host cell.
  • the present invention provides a recombinant lentiviral vector comprising a gene encoding a TRAIL protein and a CD protein.
  • the present invention also provides a recombinant lentiviral comprising a gene encoding a TRAIL protein and a CD protein.
  • the present invention also provides a host cell transfected with the recombinant lentivirus.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the recombinant lentivirus as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the host cell as an active ingredient.
  • Host cells transfected with a recombinant lentivirus comprising a gene encoding a TRAIL protein and a CD protein of the present invention express TRAIL protein and CD protein and maintain a high cell proliferation rate.
  • safety is high by inhibiting abnormal differentiation and blocking the possibility of tumor formation. Therefore, the lentiviral or host cell may be usefully used as a cell therapeutic agent.
  • 1 is a graph comparing cell proliferation of immortalized and non-immortalized MSCs:
  • imMSC immortalized MSC
  • MSC unimmortalized MSC
  • Y axis cumulative cell population doubling.
  • FIG. 2 is a schematic of the construction of the gene construct inserted into the pBD-4 lentiviral vector:
  • TRE promoter comprising tetracycline response elements
  • TRAIL TNF-associated apoptosis-inducing ligand
  • IRES internal ribosomal entry site
  • CD CD protein
  • Figure 3 compares the expression of surface antigen proteins CD90, CD44, CD105, CD73, etc., which are inherent in MSCs after genetic manipulation of BM-03 cell line, and the expression of surface antigen proteins of bone marrow-derived MSCs.
  • Figure 4 confirms the multi-differentiation capacity after genetic manipulation of the BM-03 cell line, it was confirmed that the BM-03 cell line can be adipogenic, bone formation, and cartilage formation.
  • Lane 1 is a marker
  • lane 2 is a negative control
  • lane 3 is a positive control
  • lanes 4 to 6 represent BM-03.
  • FIG. 6 is a graph confirming the expression of TRAIL protein by FACS according to the treatment of doxycycline (Dox).
  • FIG. 7 is a graph showing 5FC treatment of mesenchymal stem cells expressing TRAIL protein and CD protein, thereby confirming cell death by FACS.
  • Figure 9 shows the results of analyzing the karyotype of the gene-introduced cells for the BM-03 cell line.
  • the present invention provides a recombinant lentiviral vector comprising a gene encoding a TRAIL protein and a CD protein.
  • TRAIL apoptosis-inducing ligand
  • the TRAIL is one of suicide genes and selectively induces apoptosis of transformed cells. Specifically, TRAIL activates an apoptosis signal transduction system by binding to apoptosis receptor-4 (DR-4), DR-5, decoy receptor or decoy receptor-2 present on the cell surface. TRAIL is not toxic to normal cells and is known to specifically induce apoptosis only in cancer cells.
  • DR-4 apoptosis receptor-4
  • DR-5 decoy receptor or decoy receptor-2
  • TRAIL protein may be a protein of human origin.
  • the TRAIL protein is present in the form of a homotrimer capable of binding to three receptors.
  • the TRAIL protein of the invention may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the TRAIL protein may have at least about 70%, 80%, 90%, or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the TRAIL protein may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence encoding the TRAIL protein may have at least about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • CD protein is a cytosine deaminase protein
  • CD and UPRT uracil phosphoribosyltransferase
  • CD protein may be interchanged with “CD :: UPRT”.
  • Cells expressing the CD protein convert 5FC (5-fluorocytosine) into 5FU (5-fluorouracil), which is highly cytotoxic, inducing apoptosis.
  • 5FC 5-fluorocytosine
  • 5FU 5-fluorouracil
  • the sequence of the gene encoding the CD protein according to the present invention is the FCY1 gene encoding the CDase of Saccharomyces cerevisiae , and FUR ⁇ 1105 encoding the UPRTase which is deleted 35 amino acids from the N-terminus. Codon-optimized sequence of fusion genes. Such sequences may be those described in US Pat. No. 5,338,678, WO 96/16183, and WO 99/54481.
  • the CD protein may be a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the CD protein may have at least about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO.
  • the gene encoding the CD protein may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence encoding the CD protein may have at least about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO.
  • lentiviral vector is a type of retrovirus and is also referred to as a vector in the form of a single stranded RNA in combination with a lentiviral transfer vector.
  • the lentiviral vector may be inserted into genomic DNA of a cell to be infected to stably express a gene, and may transfer the gene to dividing cells and non-dividing cells. Since the vector does not induce an immune response in the human body, expression is persistent.
  • a gene of a large size can be delivered as compared to the adenovirus vector, which is a viral vector used in the prior art.
  • the lentiviral vector may further include a gene encoding a thymidine kinase (TK) protein.
  • the TK protein is an enzyme that catalyzes thymidylic acid production by binding phosphoric acid at the ⁇ position of ATP to thymidine, thereby transforming thymidine into triphosphate form. Modified thymidine cannot be used for DNA replication and is therefore known to induce death of cells comprising it.
  • the TK protein can be used as long as it is a known sequence.
  • the TK protein may be a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the gene encoding the TK protein may be a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the recombinant lentiviral vector of the invention may comprise one or two promoters.
  • the promoter may be a cytomegalovirus (CMV), respiratory syncytial virus (RSV), human elongation factor-1 alpha (EF-1 ⁇ ) or tetracycline response elements (TRE) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • EF-1 ⁇ human elongation factor-1 alpha
  • TRE tetracycline response elements
  • the recombinant lentiviral vector can regulate the expression of TRAIL protein and CD protein by one promoter.
  • the promoter may be operably linked to a gene encoding a protein to be expressed.
  • the TRAIL protein and CD protein may be linked to a TRE promoter.
  • the TRE promoter may activate transcription of a gene linked to a promoter by a ttracycline transactivator (tTA) protein.
  • tTA ttracycline transactivator
  • the tTA protein binds to the TRE promoter and activates transcription in the absence of tetracycline or doxycycline, and when present, does not bind to the TRE promoter and thus does not activate transcription.
  • expression of TRAIL protein and CD protein can be regulated by the addition of tetracycline or doxycycline.
  • operably linked means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide so that it can function. That is, operably linked genes encoding a particular protein means that the gene is transcribed into mRNA and translated into the protein by the action of the promoter.
  • an internal ribosome entry site may be included to express each protein from the one transcript.
  • the "internal ribosome entry site” refers to a nucleic acid sequence that functions to allow translation from an intermediate site of the transcript instead of the 5'-cap structure in the process of protein synthesis in eukaryotes.
  • IRES can be used to produce proteins that perform multiple different functions from one transcript.
  • the recombinant lentiviral vector of the present invention may be linked to the TRAIL protein and CD protein by IRES and transcribed into one transcript, and then each protein may be produced therefrom.
  • the present invention provides a recombinant lentiviral comprising a gene encoding a TRAIL protein and a CD protein.
  • the recombinant lentiviral is transformed into a host cell with the lentiviral vector, packaging plasmid and envelope plasmid of the present invention; And separating the lentivirus from the transformed host cell.
  • packaging plasmid and "envelope plasmid” refer to helper structures (eg, plasmids or isolation) for producing lentiviral from the lentiviral vectors of the present invention for efficient transfection.
  • Nucleic acid Such constructs contain elements useful for preparing and packaging lentiviral vectors in host cells. Such elements include structural proteins such as gag precursors; processing proteins such as pol precursors; Proteases, envelope proteins, and expression and regulatory signals necessary for preparing proteins and producing lentiviral particles in host cells, and the like.
  • the production of recombinant lentiviruses may include Lenti-X Lentiviral Expression System from Clontech Laboratories, a packaging plasmid from Addgene (eg, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, etc.) or envelope plasmid (eg, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG, etc.) can be used.
  • Addgene eg, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, etc.
  • envelope plasmid eg, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG, etc.
  • the present invention also provides a host cell transfected with the recombinant lentivirus.
  • transfection refers to the delivery of a gene loaded into a recombinant lentiviral vector via viral infection.
  • Host cells are human embryonic stem cells (hES), bone marrow stem cells (bone marrow stem cells, BMSC), mesenchymal stem cells (MSC), human neural stem cells (human neural stem cells) stem cells, hNSC), limbal stem cells, or oral mucosal epithelial cells.
  • the host cell may be a mesenchymal stem cell.
  • MSC meenchymal stem cell
  • chondrocytes a multipotent stromal cell that can differentiate into a variety of cells, including bone cells, chondrocytes and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells can be differentiated into cells of specific organs such as bones, cartilage, fat, tendons, nerve tissues, fibroblasts and muscle cells. These cells can be isolated or purified from adipose tissue, bone marrow, peripheral nerve blood, umbilical cord blood, periosteum, dermis, mesoderm-derived tissue and the like.
  • the host cell may be prepared by the following method:
  • hTERT and c-myc are immortalized host cells.
  • other genes known as immortalized genes may be used.
  • the hTERT and c-myc protein may be a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • the genes encoding the hTERT and c-myc proteins may be polynucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • tTA is a gene capable of controlling expression of a target protein, and means tetracycline transactivator.
  • the Tet-off system used in the present invention can regulate the expression of the target protein depending on the presence or absence of tetracycline or doxycycline by the method described above.
  • Tertiary infection of step 2) can be carried out using the vector of the present invention comprising both TRAIL and CD genes in one vector.
  • the TRAIL and CD genes may be made of respective gene constructs and inserted into two lentiviral vectors, respectively. That is, a lentiviral vector into which a gene construct prepared to express a gene encoding TRAIL protein is inserted and a lentiviral vector into which a gene construct prepared to express a gene encoding CD protein is expressed in a third infection. Can be used.
  • the cells prepared by the method described above were named BM-03, and deposited on January 6, 2017, with the accession number KCTC 13182BP at the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising the recombinant lentiviral or host cell as described above as an active ingredient.
  • the cancer refers to a general cancer including both blood cancer and solid cancer.
  • Examples of cancer include gastric cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, rectal cancer, endometrial cancer, Hodgkin's disease, brain tumor , Sarcoma cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, thyroid cancer, prostate cancer, leukemia, lymphoma, bladder cancer, central nervous system tumors and spinal cord tumors.
  • the pharmaceutical composition is a kind of cell therapy agent, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is commonly used in the manufacture of drugs, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrroli Money, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and combinations thereof.
  • a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives and combinations thereof.
  • the carrier may comprise from about 1% to about 99.99% by weight, preferably from about 90% to about 99.99% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention, wherein the pharmaceutically acceptable additive is about 0.1 Weight percent to about 20 weight percent.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in unit dose form by formulating using a pharmaceutically acceptable carrier and excipient according to a conventional method, or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media or in the form of extracts, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may further comprise a dispersing or stabilizing agent.
  • the present invention also provides a method of preventing or treating cancer as described above, comprising administering a pharmaceutical composition of the invention to a subject.
  • the subject may be a mammal, specifically a human.
  • the route of administration and dosage of the pharmaceutical composition can be administered to the subject in a variety of ways and amounts depending on the condition of the patient and the presence of side effects, and the optimal method of administration and dosage can be selected by the skilled person in the appropriate range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances whose therapeutic effect is known for the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • examples thereof include subcutaneous, eye, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, orbital, intracranial, intracranial, spinal, intraventricular, meninges, There is intranasal, intravenous administration.
  • the administration may be administered one or more times, 1 to 3 times, and specifically, divided into two administrations. In the case of repeated administration, it may be administered at 12 to 48 hours and 24 to 36 hours, and specifically, at 24 hours.
  • the lentiviral may be administered in an amount of 1.0x10 6 to 1.0x10 12 TU, specifically 1.0x10 8 to 1.0x10 10 TU, per adult day.
  • the cells may be administered in an amount of 1.0x10 5 to 1.0x10 11 cells, specifically 1.0x10 7 to 1.0x10 9 cells per day of adult. If the dosage is high, it may be administered several times a day.
  • lentiviral vectors containing immortalized genes c-Myc and hTERT, respectively, were prepared. At this time, the gene construct expressing the tTA protein was inserted together to use the Tet-off system.
  • a pBD lentiviral vector was constructed by replacing an EF promoter with a CMV promoter in an expression cassette of a pWPT vector (Addgene, USA), and further connecting an RSV promoter to a lower portion thereof.
  • c-Myc gene SEQ ID NO: 8
  • TK thymidine kinase gene
  • the hTERT gene (SEQ ID NO: 10) was inserted into the pBD lentiviral vector so that expression could be controlled by the CMV promoter.
  • a gene ZeoR; SEQ ID NO: 16 having resistance to zeomycin was inserted so that expression could be regulated by the RSV promoter.
  • the produced vector was named pBD-2.
  • tTA tetracycline transactivator
  • a lentiviral containing an immortalized gene was produced by the following method.
  • Lenti-X cells (Clontech Laboratories, USA) were incubated in 150 mm dishes using DMEM medium containing 10% fetal calf serum.
  • lentiviral vectors were extracted and quantified from DH5 ⁇ Escherichia coli cells using the EndoFree Plasmin Maxi Kit (Qiagen, USA).
  • the cultured Lenti-X cells were washed with PBS and then 3 ml of TrypLE TM Select CTS TM (Gibco, USA) was added. After leaving the cells for about 5 minutes at 37 °C, it was confirmed that the cells detached. The detached cells were neutralized by adding DMEM medium containing 7 ml of 10% fetal calf serum. Neutralized cells were collected in 50 ml tubes and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and cells were resuspended by adding DMEM culture medium containing 10 ml of 10% fetal calf serum.
  • the suspended cells were counted with a hematocytometer and then aliquoted into 1.2 ⁇ 10 7 cells in a 150 mm dish.
  • 12 ⁇ g lentiviral vector, 12 ⁇ g psPAX (Addgene; gag-pol expression, packaging plasmid) and 2.4 ⁇ g pMD.G plasmid (Addgene; VSVG Expression, envelope plasmid) mixture was transduced into the cells.
  • lipofectamine Invitrogen, USA
  • Plus Reagent Invitrogen, USA
  • the obtained supernatant was mixed with a lentiviral enrichment kit (Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, USA) and then incubated overnight at 4 ° C. This was centrifuged for 2 hours at 4 ° C. and 4,000 rpm to obtain a virus, which was resuspended in 0.5 ml of DMEM without FBS. As a result, was placed in a pBD-1, pBD-2 and pBD-3 lentivirus vector
  • the lentivirus virus respectively 4.0x10 8 TU / ml produced from a concentration of 2.0x10 8 TU / ml and 1.2x10 9 TU / ml.
  • Immortalized MSCs were prepared using a lentivirus comprising an immortalized gene produced in Example 1-2 above.
  • bone marrow-derived MSCs were prepared in the following manner. Specifically, bone marrow aspirate was obtained in the iliac crest of a healthy donor. This was mixed with 20 IU / ml heparin in a sterile container to inhibit coagulation. The bone marrow mixture was centrifuged at 4 ° C., 739 g for 7 minutes, then the supernatant was removed and mixed with 10-fold volume of sterile water. It was centrifuged again under the same conditions to obtain pellets of cells.
  • the obtained pellet was suspended in DMEM-low glucose (11885-084, Gibco, USA) medium containing 20% FBS and 5 ng / ml b-FGF (100-18B, Peprotech, USA) and dispensed into culture flasks. It was. It was incubated for 24 to 48 hours at 37 ° C., 5% CO 2 conditions and then replaced with fresh medium. This was passaged while replacing with fresh medium at intervals of 3 to 4 days, and after 2 weeks of culture, MSC was checked using a fluorescence cell analyzer.
  • the prepared MSCs with pBD-1 lentivirus produced in Example 1-2 were infected with 100 MOI using Retronectin (Retronectin, Clontech Laboratories, USA). Infected cells were infected in the same way with the pBD-2 lentiviral vector at 100 MOI. After infection, 500 ⁇ g / ml geomycin was added to the culture of stabilized cells to select cells infected with pBD-2 lentivirus.
  • the selected cells were infected with pBD-3 lentiviral vector at 100 MOI. After infection, 1 ⁇ g / ml puromycin was added to the culture of stabilized cells to select cells infected with pBD-3 lentivirus.
  • MSCs containing immortalized genes and MSCs not shown are shown in FIG. 1.
  • MSC cells infected with lentiviral, including the immortalized genes c-myc and hTERT maintained a high cell proliferation rate even after 120 days of culture.
  • normal MSC cells showed a rapid decrease in cell proliferation after 40 days of culture.
  • TRAIL gene SEQ ID NO: 2
  • CD gene SEQ ID NO: 4
  • IRES internal ribosome entry site
  • the produced vector was named pBD-4, and the structure of the gene construct is shown in FIG. 2.
  • Lentiviruses were produced in the same manner as described in Example 1-2 above, using the lentiviral vectors comprising the TRAIL and CD genes prepared in Example 2-1.
  • the lentiviral produced was prepared at a concentration of 7.6 ⁇ 10 8 TU / ml.
  • the immortalized MSC prepared in Example 1-3 was infected with a lentiviral including the TRAIL and CD genes produced in Example 2-2 to prepare cells expressing TRAIL and CD genes. Infection was performed in the same manner as described in Examples 1-3. After infection, 1 ⁇ g / ml of doxycycline (631311, Clontech, USA) was added to the culture of stabilized cells, and cultured in a state of suppressing the expression of TRAIL and CD. After the cells stabilized, the cells were cultured for 72 hours in a culture medium without doxycycline to induce the expression of TRAIL and CD. The cells were subjected to FACS to select cells expressing TRAIL on the cell surface.
  • doxycycline 631311, Clontech, USA
  • lentiviral infected cells including TRAIL and CD genes were dispensed to 5 ⁇ 10 5 cells per FACS tube, which was centrifuged at 4 ° C. and 1,500 rpm for 5 minutes to remove supernatant. To this was added 1 ml of FACS buffer (PBS with 2% fetal bovine serum) to resuspend the cells and centrifuged under the same conditions to remove supernatant. After one more wash procedure, the cells were resuspended in 1 ml FACS buffer.
  • FACS buffer PBS with 2% fetal bovine serum
  • APC anti-human CD253 antibody BioLegend
  • 0.3 ⁇ L of LIVE / DEAD ® Fixable Near-IR Dead Cell Stain (Life Technologies-Molecular Probes, USA) and 5 ⁇ l of anti-TRAIL antibody in 200 ⁇ l FACS buffer in resuspended cells , Cat #. 308210, USA) was added, and the mixture was reacted at 4 ° C for 30 minutes.
  • the cells were washed twice in the same manner as above, and the supernatant was removed.
  • To the washed cells was added 300 ⁇ l of fixing buffer (PBS with 2% formaldehyde and 1% fetal calf serum) and left at 4 ° C. for a minimum of 15 minutes.
  • the cells were analyzed on a FACS (LSRFortessa, BD biosciences, USA) instrument to select cells expressing TRAIL.
  • the selected cells were cultured to form colonies.
  • Cell lines were established by culturing monoclonal cells from the colonies formed and named BM-03.
  • the cell line BM-03 was deposited with KCTC 13182BP at the Korea Institute of Bioscience and Biotechnology as of January 6, 2017.
  • the BM-03 cell line expresses the bone marrow of the surface antigen proteins CD90, CD44, CD105, and CD73, which are unique characteristics of MSC, even after genetic engineering to express TRAIL and CD therapeutic genes. Proved identical to the derived MSC.
  • BM-03 cell lines were seeded in 12-well plates at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 to confirm adipogenesis. After incubation for 2 to 3 days at 37 °C, 5% CO 2 incubator using a normal medium, the adipogenic differentiation medium (StemPro® Adipogenic Differentiation Kit, Thermo fisher Scientific, A10070-01). The medium was changed every 3 to 4 days and incubated for 21 days. When the culture was completed, the oil red O solution staining (Oil Red O solution staining) was confirmed by a microscope.
  • 12-well plates were seeded at a concentration of 5 ⁇ 10 3 cells / cm 2 . After incubation for 2 to 3 days at 37 °C, 5% CO 2 incubator using normal medium (StemPro®) Bone formation differentiation kit, Thermo fisher Scientific, A10072-01). The medium was changed every 3 to 4 days and incubated for 21 days. When the incubation was completed, Alizarin Red S staining was performed under a microscope.
  • the suspension was suspended at a concentration of 1.6x10 7 cells / ml, and 5 ⁇ l of the seed was seeded in 24 wells and incubated for 2 hours.
  • 500 ⁇ l of cartilage differentiation medium (StemPro® Cartilage Differentiation Kit, Thermo fisher Scientific, A10071-01) was added and then replaced at 3 day intervals and incubated for 14 days. After incubation, the medium was aspirated and rinsed with DPBS to remove the pellets. After cryosection, Alcian Blue staining was performed under a microscope. The results are shown in FIG.
  • the BM-03 cell line was found to have multiple differentiation ability (transdifferentiation), which is a unique characteristic of MSC even after genetic manipulation to express TRAIL and CD therapeutic genes.
  • the established cell line, BM-03 sample was thawed in a 37 ° C. water bath for about 1 minute, transferred to a 15 ml tube containing 9 ml PBS, and then celled down at 1,500 rpm for 5 minutes. After complete removal of PBS, pellets were transferred by suspension in 200 ⁇ l PBS in a 1.5 ml tube.
  • GDNA was prepared using NucleoSpin® Tissue (MN, 740952.250) and a mixture was prepared as shown in Table 1, followed by PCR in the steps of Table 2 below. At this time, 100 ng of BM-03 plasmid DNA was added as a positive control and 1 ⁇ l dW was added as a negative control.
  • BM-03 cell lines were seeded with 5 ⁇ 10 5 cells in a T75 flask using a medium containing 2 ⁇ g / ml of doxycycline in DMEM medium containing 10% FBS and no medium. Cells were obtained after incubation for 3 days. After measuring the number of cells, 5x10 5 cells in each group were stained with PE anti-human CD253 (TRAIL) antibody (BioLegend, 308206), PE Mouse IgG1, ⁇ Isotype Control Antibody (BioLegend, 400112). LIVE / DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Thermos Fisher Scientific L34976) antibodies were also used to confirm expression after excluding dead cells.
  • TRAIL PE anti-human CD253
  • TRAIL was not expressed when doxycycline was added, but it was confirmed that TRAIL was expressed in the BM-03 cell line cultured in a medium in which doxycycline was removed.
  • FIG. 7 it was found that when the CD protein is expressed, cells are killed by 5FC. That is, it was observed that cells were killed by expression of the CD protein. Therefore, TRAIL protein and CD protein are expressed in the prepared mesenchymal stem cells, it was confirmed that it is regulated by the Tet-off system.
  • the BM-03 cell line was seeded using a medium containing 2 ⁇ g / ml of doxycycline in a T75 flask with 4 ⁇ 10 5 cell numbers. Cells were obtained by passage 3 or 4 days and the total cell number was measured. The same number of cells were seeded to measure PDL at 3-4 day intervals. PDL values were calculated using Equation 1 below, and the results are shown in FIG. 8. At this time, in Equation 1 below, X represents the initial PDL, I represents the initial cell number seeded in the blood vessel, Y represents the final cell yield, or the end cell growth.
  • BM-03 cell line was analyzed according to a protocol specified by the Korea Institute of Biological Sciences (Korea). The analysis results are shown in FIG. 9.

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Abstract

본 발명은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질감염된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 높은 세포 증식율을 유지하며, TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 과량 발현한다. 따라서, 상기 렌티바이러스가 형질감염된 중간엽줄기세포는 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포 및 이의 용도
본 발명은 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질 및 CD(cytosine deaminase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터, 및 상기 벡터를 이용하여 제조된 렌티바이러스에 의해 형질감염된 세포에 관한 것이다.
전 세계적으로 세포를 이용한 치료 방법이 개발되고 있으며, 특히 줄기세포치료제 시장은 연평균 11.7%의 성장율로 지속적인 상승 추세를 보이고 있다.
성체줄기세포인 중간엽줄기세포(MSC)는 다능성(multipotent) 세포로서, 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아세포 등으로 분화할 수 있다. 또한, 상기 MSC는 골수, 제대혈, 지방 등 다양한 성체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증 또는 손상부위로 이동하는 특성이 있어, 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있다. 또한, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연살해세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하여, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니라, MSC는 시험관 내(in vitro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있어, 이를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고, 세포 치료제로서 임상에 사용할 수 있는 등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째, MSC의 증식에는 한계가 있어, 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있어, 생산시마다 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋째, MSC만을 이용할 경우 치료 효과가 높지 않다.
한편, 대한민국 등록특허 제1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서, 전처리 과정을 단축하여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있다. 그러나, 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라서, 세포 치료제로 유용하게 사용할 수 있는 중간엽줄기세포에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은, TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 및 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 발현하며, 높은 세포 증식율을 유지한다. 또한, 비정상적인 분화를 억제하고 종양 형성의 가능성을 차단하여 안전성이 높다. 따라서, 상기 렌티바이러스 또는 숙주세포는 세포 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 불사화된 MSC와 불사화되지 않은 MSC의 세포 증식율을 비교한 그래프이다:
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수.
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응 요소(tetracycline response elements)를 포함하는 프로모터;
TRAIL: TNF-연관 세포사멸-유도 리간드;
IRES: 내부 리보솜 진입 부위; 및
CD: CD 단백질.
도 3은 BM-03 세포주의 유전자 조작 이후의 MSC가 지닌 고유한 특성인 표면항원 단백질 CD90, CD44, CD105, CD73 등의 발현과 골수유래 MSC의 표면항원 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 BM-03 세포주의 유전자 조작 이후의 다중 분화능을 확인한 것으로, BM-03 세포주가 지방생성, 골형성, 및 연골형성을 할 수 있음을 확인하였다.
도 5는 기탁균주인 BM-03에 TRAIL 및 CD가 존재하는지 여부를 확인한 것이다. 1번 레인은 마커, 2번 레인은 음성대조군, 3번 레인은 양성대조군, 4번 내지 6번 레인은 BM-03을 나타낸다.
도 6은 독시사이클린(Dox)의 처리 유무에 따라 TRAIL 단백질의 발현 여부를 FACS로 확인한 그래프이다.
도 7은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 발현하는 중간엽줄기세포에 5FC를 처리하여, 이에 의한 세포 사멸을 FACS로 확인한 그래프이다.
도 8은 계대 배양하여 수득한 BM-03 세포의 PDL 값을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "TNF-연관 세포사멸-유도 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand, 이하 TRAIL)" 단백질은 TNF 패밀리 중에 제2형 트랜스멤브레인 사이토카인에 속한다. 상기 TRAIL은 자살 유전자 중 하나로써, 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 구체적으로, TRAIL은 세포 표면에 존재하는 세포사멸 수용체-4(DR-4), DR-5, 데코이(decoy) 수용체 또는 데코이 수용체-2와 결합하여 세포사멸 신호 전달계를 활성화시킨다. TRAIL은 정상 세포에 대해서는 독성이 없고, 암세포에서만 특이적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 TRAIL 단백질은 인간 유래의 단백질일 수 있다. 상기 TRAIL 단백질은 세 개의 수용체에 결합할 수 있는 호모트리머(homotrimer) 형태로 존재한다. 본 발명의 TRAIL 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TRAIL 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 TRAIL 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 TRAIL 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 2의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CD 단백질"은 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase) 단백질로서, "CD와 UPRT (우라실 포스포리보실기 전이효소(uracil phosphoribosyltransferase))가 결합된 융합단백질의 형태일 수 있으며, 본 명세서에서 "CD 단백질"은 "CD::UPRT"와 혼용될 수 있다.
상기 CD 단백질을 발현하는 세포는, 5FC(5-fluorocytosine)를 세포 독성이 강한 5FU(5-fluorouracil)로 전환시켜 세포사멸을 유도한다. 따라서, CD 단백질이 포함된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포는, 5FC를 처리하여 이의 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명에 따른 CD 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 CDase를 코딩하는 FCY1 유전자와, N-말단으로부터 35개의 아미노산이 결실된 UPRTase를 코딩하는 FUR△1105 유전자를 융합하여 코돈 최적화(codon-optimization)된 서열이다. 상기 서열은 미국 특허 제5,338,678호, 국제특허공개 제WO 96/16183호 및 국제특허공개 제WO 99/54481호에 기재된 것일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 상기 CD 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 CD 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 CD 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 CD 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 4의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이고, 단일가닥 RNA 형태의 벡터로 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터와 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시키며, 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
상기 렌티바이러스 벡터는 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 TK 단백질은 ATP의 γ위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딜산 생성반응을 촉매하는 효소로, 이로 인해 티미딘은 삼인산 형태로 변형된다. 변형된 티미딘은 DNA 복제에 사용될 수 없고, 따라서 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 TK 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 TK 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 TK 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 1 또는 2개의 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개의 프로모터에 의해서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 TRAIL 단백질 및 CD 단백질은 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. 상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycline transactivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독시사이클린(doxycycline)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시키고, 이들이 존재하는 경우에는 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현은 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 여부에 의해 조절될 수 있다.
상기 용어 "작동가능하게 연결된"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터에서 하나의 프로모터에서 두 개 이상의 유전자가 전사되도록 연결된 경우, 상기 하나의 전사체로부터 각각의 단백질이 발현될 수 있게 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다.
상기 "내부 리보솜 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)"는 진핵생물의 단백질 합성과정에서, 5'-캡 구조 대신 전사체의 중간 부위에서부터 번역이 가능하도록 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. IRES를 이용하여 하나의 전사체로부터 복수의 다른 기능을 수행하는 단백질을 생산할 수 있다. 일 실시예에 의하면, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 IRES로 연결하여 하나의 전사체로 전사시킨 후, 이로부터 각각의 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프(envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
상기 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid)"는, 효율적인 형질감염을 위해, 본 발명의 렌티바이러스 벡터로부터 렌티바이러스를 생산하기 위한 헬퍼 구조물(예를 들어, 플라스미드 또는 단리된 핵산)을 제공할 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 gag 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다.
상기 용어 "형질감염(transfection)"은, 바이러스 감염(infection)을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 숙주세포는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 숙주세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
상기 용어 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직, 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피, 중배엽-유래 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
상기 숙주세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 숙주세포에 hTERT 및 c-myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;
2) 1차 감염된 숙주세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계;
3) 2차 감염된 숙주세포에 TRAIL 유전자 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차 감염시키는 단계.
상기 단계 1)에서 hTERT 및 c-myc은 숙주세포를 불사화시키는 유전자로서, 상기 hTERT 및 c-myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 hTERT 및 c-myc 단백질은 각각 서열번호 9 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 hTERT 및 c-myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 10 및 서열번호 8의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 단계 2)에서 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로, 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 단계 2)의 3차 감염은 하나의 벡터에 TRAIL 및 CD 유전자를 모두 포함하는 본 발명의 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 TRAIL 및 CD 유전자는 각각의 유전자 컨스트럭트로 제조되어 2개의 렌티바이러스 벡터에 각각 삽입될 수 있다. 즉, TRAIL 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 렌티바이러스 벡터와 CD 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 렌티바이러스 벡터가 3차 감염에 사용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 세포를 BM-03으로 명명하고, 이를 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13182BP로 기탁하였다.
본 발명은 상기 서술한 바와 같은 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 암은 혈액암 및 고형암을 모두 포함하는 일반적인 암을 의미한다. 암의 예로는 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 자궁내막암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 뇌종양, 육종암, 식도암, 소장암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 방광암, 중추신경계 종양 및 척수 종양 등이 있다.
상기 약학 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내 투여가 있다.
상기 투여는 1회 이상, 1 내지 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x106 내지 1.0x1012 TU, 구체적으로 1.0x108 내지 1.0x1010 TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1011 cells, 구체적으로 1.0x107 내지 1.0x109 cells의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포(MSC)의 제조
1-1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-off 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저, pWPT 벡터(Addgene, 미국)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하고, 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하여 pBD 렌티바이러스 벡터를 제작하였다.
상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자(서열번호 8) 및 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK) 유전자(서열번호 6)를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에, hTERT 유전자(서열번호 10)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오마이신(zeomycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(ZeoR; 서열번호 16)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-2로 명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA(tetracycline transactivator) 유전자(서열번호 12)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신(puromycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(PuroR; 서열번호 14)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-3으로 명명하였다.
1-2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1-1에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.
먼저, 렌티-X 세포(Clontech Laboratories, 미국)는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 ㎜ 디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다.
상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3 ㎖의 TrypLE™ Select CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 ㎖ 튜브에 모아서 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 현탁된 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150 ㎜ 디쉬에 1.2x107개의 세포가 되도록 분주하였다. 상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터, 12 ㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드) 및 2.4 ㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드) 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 추가 배양한 뒤, 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 혼합한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하고, 이를 FBS가 포함되지 않은 0.5 ㎖의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과, pBD-1, pBD-2 및 pBD-3 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0x108 TU/㎖, 2.0x108 TU/㎖ 및 1.2x109 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
1-3. 불사화된 중간엽줄기세포의 제조
상기 실시예 1-2에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여, 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저, 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 장골능(iliac crest)에서 골수천자액(bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/㎖의 헤파린과 혼합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 4℃, 739 g의 조건으로 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 10배 부피의 멸균된 물과 혼합하였다. 이를 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 20%의 FBS 및 5 ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO2 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1-2에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴(Retronectin, Clontech Laboratories, 미국)을 사용하여 100 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포에 동일한 방법으로, pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 500 ㎍/㎖의 지오마이신을 첨가하여 pBD-2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포에 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
그 결과, 불사화 유전자를 포함하는 MSC 및 그렇지 않은 MSC의 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 보이는 바와 같이, 불사화 유전자인 c-myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다.
실시예 2. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
2-1. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제작
상기 제작된 pBD 렌티바이러스 벡터에, TRAIL 유전자(서열번호 2) 및 CD 유전자(서열번호 4)를 삽입하였다. 이때, 삽입된 TRAIL 및 CD 유전자가 IRES(internal ribosome entry site)로 연결되고, TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. IRES는 리보좀 결합부위로, 5'-캡 구조가 없어도 번역(translation)이 시작될 수 있도록 하여, 하나의 mRNA에서 두 개의 단백질이 발현될 수 있게 한다. 한편, TRE 프로모터는 독시사이클린의 첨가 유무에 따라 상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
상기 제작된 벡터는 pBD-4로 명명하였고, 그 유전자 컨스트럭트의 구조를 도 2에 나타내었다.
2-2. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 2-1에서 제작된 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1-2에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 7.6x108 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 3. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
3-1. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
상기 실시예 1-3에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2-2에서 생산한 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시켜, TRAIL 및 CD 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 감염은 실시예 1-3에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)을 첨가하여, TRAIL 및 CD의 발현을 억제시킨 상태로 배양하였다. 세포가 안정화된 후, 독시사이클린을 제거한 배양 배지에서 72시간 동안 배양하여 TRAIL 및 CD의 발현을 유도시켰고, 상기 세포로 FACS를 수행하여 세포 표면에 TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다.
구체적으로, TRAIL 및 CD유전자를 포함하는 렌티바이러스가 감염된 세포를 FACS 튜브 당 5x105개가 되도록 분주하고, 이를 4℃에서, 1,500 rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 1 ㎖의 FACS 완충액(2% 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하여 세포를 재현탁하고, 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기의 세척 과정을 1회 더 수행한 뒤, 1 ㎖의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하였다. 재현탁한 세포에 200 ㎕의 FACS 완충액에 0.3 ㎕의 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain(Life Technologies-Molecular Probes, 미국) 및 5 ㎕의 항-TRAIL 항체인 APC anti-human CD253 항체(BioLegend, Cat#. 308210, 미국)를 첨가한 혼합물을 첨가하여, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 상기와 같은 방법으로 세포를 2회 세척하였고, 상층액을 제거하였다. 세척된 세포에 300 ㎕의 고정 완충액(fixing buffer)(2% 포름알데히드 및 1% 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하고, 4℃에서 최소 15분 동안 방치하였다. 상기 세포를 FACS(LSRFortessa, BD biosciences, 미국)기기로 분석하여, TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-03이라고 명명하였다. 세포주 BM-03은 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13182BP로 기탁하였다.
3-2. 확립된 세포주에서 표면항원 단백질 발현 확인
유전자를 삽입하기 전의 골수유래 MSC와 TRAIL 및 CD 유전자가 삽입된 BM-03 세포주의 표면항원 단백질 발현을 인간 MSC 분석 키트 (StemflowTM, Cat No 562245, BD)을 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었고, 실험 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나는 바와 같이, BM-03 세포주는 TRAIL과 CD 치료유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작을 거친 후에도 MSC가 지니고 있는 고유한 특성인 표면항원 단백질인 CD90, CD44, CD105, 및 CD73의 발현이 골수유래 MSC와 동일함을 증명하였다.
3-3. BM-03 세포주의 분화능 확인
지방생성 확인을 위해 BM-03 세포주를 12-웰 플레이트에 1x104 cells/cm2의 농도로 시딩(seeding)하였다. 일반배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤, 지방생성 분화 배지(StemPro® 지방생성 분화 키트, Thermo fisher Scientific, A10070-01)로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일마다 교체해주며 21일간 배양하였다. 배양이 완료되면 오일 레드 오 용액 염색(Oil Red O solution staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다.
골형성 확인을 위해 12-웰 플레이트에 5x103 cells/cm2의 농도로 시딩하였다. 일반배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤 골 형성 분화 배지(StemPro® 골 형성 분화 키트, Thermo fisher Scientific, A10072-01)으로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일 마다 교체해주며 21일간 배양하였다. 배양이 완료되면 알리자린 레드 에스 염색(Alizarin Red S staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다.
연골형성 확인을 위해 1.6x107 cells/㎖의 농도로 현탁하여 그 중 5 ㎕를 24웰에 시딩한 뒤 2시간 동안 배양하였다. 연골형성 분화 배지 (StemPro® 연골형성 분화 키트, Thermo fisher Scientific, A10071-01) 500 ㎕를 첨가한 뒤 3일 간격으로 교체해주며 14일간 배양하였다. 배양 후 배지를 빨아들이고 DPBS로 헹구어 펠렛을 떼어내었다. 동결절편 과정(Cryosection)을 거쳐 알시안 블루 염색(Alcian Blue staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주는 TRAIL과 CD 치료유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작을 거친 후에도 MSC가 지니고 있는 고유한 특성인 다중 분화능 (transdifferentiation)을 지니고 있음을 확인하였다.
3-4. BM-03 세포주의 도입유전자 확인 시험
상기 확립된 세포주인 BM-03 검체를 37℃ 항온수조에서 약 1분간 해동하고 9 ㎖ PBS가 포함된 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 셀 다운(Cell Down)시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 200 ㎕ PBS로 펠렛을 현탁하여 옮겼다. NucleoSpin® Tissue (MN, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 1과 같이 혼합물을 만든 후, 하기 표 2의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때, 양성대조군으로 100 ng의 BM-03 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ㎕의 dW를 넣었다.
Forward primer(서열번호 17) (10 pmol/㎕, GX535) 1 ㎕
Reverse primer(서열번호 18) (10 pmol/㎕, GX534) 1 ㎕
검체 (100 ng/㎕) 1 ㎕
dW 17 ㎕
Total volume 20 ㎕
Step Temperature Time Cycle
1st 95℃ 5min 1
2nd 95℃ 45sec 35
58℃ 45sec
72℃ 1min
3rd 72℃ 7min 1
4th 4℃ Indefinitely 1
1% 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10 ㎕의 DNA Size Marker를 로딩하였고, 다음 웰부터 음성대조군, 양성대조군, BM03 검체 (3개) 순서로 각각 10 ㎕씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주 검체 3개 모두 양성대조군과 동일한 사이즈 (1.2kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
3-5. 확립된 세포주에서 TRAIL 및 CD 단백질의 발현 확인
상기 실시예 3-1에서 확립된 BM-03 세포주에서 상기 3-1과 동일한 방법으로 TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 유도한 뒤, FACS를 수행하여 독시사이클린의 유무에 따른 TRAIL의 발현을 확인하였다. 이후 TRAIL의 발현이 확인된 세포주에서 CD 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 독시사이클린 2 ㎍/㎖이 들어간 배지와 들어가지 않은 배지를 이용하여 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 5x105 세포 수로 시딩하였다. 3일동안 배양한 뒤 세포를 수득하였다. 세포 수를 측정한 뒤 각 그룹 당 5x105 세포를 PE anti-human CD253(TRAIL) 항체 (BioLegend, 308206), PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody (BioLegend, 400112)를 이용하여 염색하였다. 또한 죽은 세포들을 배제한 후 발현을 확인하기 위해 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Thermos Fisher Scientific L34976) 항체를 이용하였다. FACS (LSRFortessa, BD Biosciences)기기로 분석하였다. 동일한 방법으로 세포를 배양한 후 독시사이클린을 제거하여 CD발현을 유도하였다. 여기에 5-FC(5-fluorocytosine, Sigma)를 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 뒤, 48시간 후에 세포의 사멸을 관찰하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 독시사이클린을 첨가하였을 때는 TRAIL이 발현되지 않았으나, 독시사이클린이 제거된 배지에서 배양한 BM-03 세포주에서는 TRAIL이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, CD 단백질이 발현하면, 5FC에 의해 세포가 사멸하는 것을 알 수 있었다. 즉, CD 단백질의 발현에 의해 세포가 사멸되는 것을 관찰하였다. 따라서, 제조된 중간엽줄기세포에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질이 발현되고, 이는 Tet-off 시스템에 의해 조절되는 것을 확인하였다.
3-6. 세포의 PDL (Population doubling level) 분석
BM-03 세포주를 4x105 세포 수로 하여 T75 플라스크에 2 ㎍/㎖의 독시사이클린이 포함된 배지를 이용하여 시딩하였다. 3일 또는 4일 정도 계대 배양하여 세포를 수득하였고 총 세포수를 측정하였다. 같은 수의 세포를 시딩하여 3일 내지 4일 간격으로 PDL을 측정하였다. PDL 값은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이때, 하기 수학식 1에서 X는 초기 PDL, I는 혈관에 시드된 초기 세포 수, Y는 최종 세포수율, 또는 성장기 말의 세포 수를 나타낸다.
Figure PCTKR2017001308-appb-M000001
도 8에 나타난 바와 같이, 장기 계대 배양으로 안정된 성장을 보여주고 있음을 확인하였다.
3-7. 세포의 핵형 분석
BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 이원생명과학연구원(한국)에 분석 의뢰하여 정해진 프로토콜에 따라 수행되었다. 분석 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체에서 이상 여부는 관찰되지 않았으며 정상 핵형으로 분석되었다.
[기탁증]
[규칙 제26조에 의한 보정 20.02.2017]　
Figure WO-DOC-TABLE-170

Claims (13)

  1. TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL), 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TRAIL 단백질이 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 CD 단백질이 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 벡터가 1 또는 2개의 프로모터를 포함하는 것인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 벡터가 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 것인, 재조합 렌티바이러스 벡터.
  7. TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 렌티바이러스는 제1항의 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및
    형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득되는 것인, 재조합 렌티바이러스.
  9. 제7항의 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 숙주세포는 중간엽줄기세포인, 형질감염된 숙주세포.
  11. 제7항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 암이 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 자궁내막암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 뇌종양, 육종암, 식도암, 소장암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 방광암, 중추신경계 종양 및 척수 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약학 조성물.
  13. 제9항의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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