KR20210116172A

KR20210116172A - 인간 지방 유래 성체 줄기세포를 이용한 렌티바이러스 벡터 및 항암제 조성물

Info

Publication number: KR20210116172A
Application number: KR1020200094010A
Authority: KR
Inventors: 최성식; 박재우; 박병묵; 박명준
Original assignee: 주식회사 바이블리오테카
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2021-09-27

Abstract

본 발명은 항암효과를 보이는 유전자인 carboxylesterase (CE)와 cytosine deaminase (CD)를 동시에 발현하도록 하는 재조합 벡터, 이 벡터를 이용하여 제조된 유전적으로 재조합된 인간 지방 유래 성체 줄기세포 및 이를 암에 유효성분으로 포함하는 치료용 항암제 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, CE 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 CE단백질 및 CD 단백질을 발현하며, 높은 세포 증식율을 유지함으로써, 비정상적인 분화를 억제하고 종양 형성의 가능성을 차단할 수 있고, 상기 렌티바이러스 또는 숙주세포를 이용한 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 항암제 조성물을 제공할 수 있다.

Description

인간 지방 유래 성체 줄기세포를 이용한 렌티바이러스 벡터 및 항암제 조성물{LENTIVIRAL VECTOR USING HUMAN ADIPOSE DERIVED ADULT STEM CELLS AND ANTICANCER COMPOSITION INCLUDING IT}

본 발명은 인간 지방 유래 성체 줄기세포를 이용한 렌티바이러스 벡터 및 항암제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항암효과를 보이는 유전자인 carboxylesterase (CE)와 cytosine deaminase (CD)를 동시에 발현하도록 하는 재조합 벡터, 이 벡터를 이용하여 제조된 유전적으로 재조합된 인간 지방 유래 성체 줄기세포 및 이를 유효성분으로 포함하는 치료용 항암제 조성물에 관한 것이다.

현재 암 치료 기술인 절제술, 방사선 치료, 항암제를 이용한 암 치료 방법이 계속해서 발달하고 있고 몇몇 암에 있어서는 높은 치료효과를 보이고 있다. 하지만 아직은 재발의 가능성이 높은 등 치료 효과에 한계가 있다. 이 중 암 치료에 일반적으로 사용되는 항암제들은 암세포뿐 아니라 정상 세포들도 같이 사멸시켜 치료받는 환자에게 지연성 설사, 호중구 감소증, 오심, 구토 쇠약, 탈모, 급성 콜린성 증후군 등 다양한 부작용을 유발시킨다(Vanhoefer et al., 2001). 또한 이러한 항암치료 기술은 재발 및 전이의 가능성이 있는 비영구적인 치료방법이기 때문에 좀 더 안전하고, 효과가 좋은 새로운 암 치료 기술이 필요하다.

전 세계적으로 난치병에 대한 줄기세포의 효능을 주목하고 있고 줄기세포를 이용한 치료방법이 많이 개발되고 있고 관련시장은 지속적인 상승 추세를 보이고 있다.

줄기세포는 스스로 증식(self-renewal)이 가능하면서 인간의 몸을 구성하는 다양한 세포로 분화(multipotent)할 수 있는 만능세포로 알려져 있다. 줄기세포는 배아줄기세포, 성체줄기세포와 유도만능줄기세포로 크게 나눌 수 있다.

배아줄기세포(embryonic stem cell)는 다른 줄기세포들에 비해 가장 다양한 세포로 분화가 가능한 장점이 있지만 배아를 파괴한다는 윤리적 문제를 내포하고 있으며 생체 내에 투여했을 때 종양(tumor)을 유발시킨다는 문제가 있다.

또한 유도만능줄기세포는 다능성이 없는 성인의 피부세포와 같은 체세포에 역분화를 일으키는 4가지 특정 유전자를 도입한 후 발현시키거나 역분화를 일으키는 4가지 유전자가 도입된 세포에서 만들어진 역분화 유도 단백질을 추출하여 이를 다시 체세포에 주입함으로써 배아줄기세포와 같은 다능성을 갖는 줄기세포이다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포의 경우와는 달리 배아를 파괴한다는 윤리적 문제가 대두되지 않으며, 환자 본인의 체세포를 줄기세포로 전환시키는 경우 면역 거부 반응 문제도 해결할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 낮은 역분화 효율 문제와 재현성 확보 문제가 지속적으로 제시되고 있을 뿐 아니라, 체세포가 유도만능줄기세포가 되도록 유도할 때 발암유전자를 포함하는 인자를 이용하기 때문에 암 유발 및 세포기능 변화 가능성이 있다는 위험이 있다.

성체 줄기세포(adult stem cell)는 배아줄기세포보다는 윤리적인 문제가 없고 종양형성 유발이 적은 장점이 있다. 줄기세포에 따라 분리가 어렵거나 불가능한 경우도 있지만 중간엽 줄기세포는 분리가 용이하다. 이 중 인간 지방유래 성체줄기세포는 다른 줄기세포에 비해 특히 배양과 분리가 쉽다. 본 발명에서는 배아줄기세포보다 윤리적 문제가 적고, 생체 내에 투여했을 때 종양을 형성하지 않으며, 인체에 큰 영향을 주지 않으면서 분리와 배양에 용이한 인간 지방 유래 줄기세포(human adipose-derived stem cell)를 이용하였다.

지방조직은 많은 양의 조직 채취가 용이하여 줄기세포를 수확하는데 좋은 조건을 가지고 있으며, 지방유래 줄기세포는 배양시 안정적인 성장과 증식을 보여주고 분화를 유도하였을 때 보통 지방세포, 뼈세포, 연골세포를 포함한 다양한 세포로 분화가 가능하다.

줄기세포는 신체의 염증 또는 손상부위로 이동하는 호밍 특성이 있어, 치료 유전자의 효능을 나타내는데 적합하다. 반면 줄기세포는 특별한 장치를 하지 않으면 체외 증식에는 한계가 있어 대량생산하기가 쉽지 않다는 단점이 있지만, 지방유래 줄기세포는 다량의 지방에서 많은 수의 줄기세포를 확보하기가 쉬워 이를 극복할 수 있다. 또한 많은 연구결과에서 기본적인 줄기세포보다는 치료효능을 보이는 유전자를 강화한 유전자-세포치료제가 더 큰 치료효능을 보이는 결과를 보이고 있다.

carboxyl esterase라는 자살유전자(suicide gene)는 인체에 무해한 전구약물인 CPT-11 (irinotecan)을 세포독성 물질인 SN-38로 전환시키는 효소이다. cytosine deaminase 또한 인체에 무해한 전구약물인 5-FC (5-fluorocytosine)을 세포독성을 지닌 항암물질인 5-FU (5-fluorouracil)로 전환시키는 효소이다.

한국특허공개공보 제20060128073호

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 인간의 지방유래 줄기세포에 CE(carboxyl esterase) 단백질 및 CD(cytosine deaminase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공하는 데에 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 렌티바이러스 벡터를 이용하여 제조된 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, carboxyl esterase(CE) 및 cytosine deaminase(CD) 단백질을 코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.

또한, 상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 및 TRE(tetracycline response elements) 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 벡터가 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 재조합 렌티바이러스 벡터로 숙주세포를 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하여 수득한 재조합 렌티바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, carboxyl esterase(CE) 및 cytosine deaminase(CD) 단백질을 코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 재조합 렌티바이러스로 형질 감염된 숙주세포를 제공한다.

또한, 숙주세포는 골수줄기세포, 중간엽줄기세포 또는 인간지방줄기세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 목적을 달성하기 위하여, 상기의 숙주세포의 배양물(CM)을 유효성분으로 하는 항암제 조성물을 제공한다.

본 발명에 의하면, CE 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 숙주세포는 CE단백질 및 CD 단백질을 발현하며, 높은 세포 증식율을 유지함으로써 비정상적으로 분화하는 것을 억제하고, 이로부터 종양 형성의 가능성을 차단할 수 있고, 상기 렌티바이러스 또는 숙주세포를 이용한 세포치료제로서 유용하게 사용될 수 있는 항암제 조성물을 제공할 수 있다.

도 1은 불사화된 인간지방줄기세포와 불사화되지 않은 인간지방줄기세포의 세포 증식율을 비교한 그래프이다.
도 2는 pLenti-CECD-Puro 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다.
도 3은 유전자 도입 전후의 VAS1-CECD 세포주의 형태를 비교한 이미지이다.
도 4는 유전자 조작 이후의 인간지방줄기세포가 지닌 고유한 특성인 분비 cytokine/chemokine의 함량의 변화를 비교한 결과이다.
도 5는 VAS1-CECD에 CE 및 CD의 존재 여부 확인 실험결과이다.
도 6은 CE 단백질을 발현하는 인간지방줄기세포에 CPT-11을 처리하여, 이에 의한 세포 사멸을 현미경으로 관찰한 결과 이미지 및 그래프이다.
도 7은 CD 단백질을 발현하는 인간지방줄기세포에 5FC를 처리하여, 이에 의한 세포 사멸을 현미경으로 관찰한 결과 이미지 및 그래프이다.
도 8은 계대 배양하여 수득한 VAS1-CECD 세포의 PDL 값을 측정한 그래프이다.
도 9는 VAS1-CECD 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 핵형을 분석한 결과이다.

본 발명은 CE 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터를 제공한다.

CE 단백질은 carboxyl esterase 단백질로서, 자살 유전자 중 하나이며 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 구체적으로, CE 단백질은 세포독성이 없는 전구약물인 irinotecan(CPT-11)을 세포독성물질인 SN-38로 전환시킨다. SN-38은 DNA topoisomerase I의 활성을 저해하여 세포사멸을 유도한다.

CD 단백질은 cytosine deaminase 단백질로서, 자살 유전자 중 하나이며 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 상기 CD 단백질을 발현하는 세포는, 5FC(5-fluorocytosine)를 세포 독성이 강한 5FU(5-fluorouracil)로 전환시켜 세포사멸을 유도한다. 따라서, CD 단백질이 포함된 렌티바이러스 벡터를 포함하는 세포는, 5FC를 처리하여 이의 사멸을 유도할 수 있다.

본 발명에 따른 CD 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 유전자를 코딩하고 있다.

본 발명에서 사용된 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현 및 전달할 수 있다.

본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터를 포함할 수 있다.

또한 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결되어 단백질로 번역되고 기능도 할 수 있다.

본 발명의 렌티바이러스 벡터에서 하나의 프로모터에서 두 개 이상의 유전자가 전사되도록 연결된 경우, 상기 하나의 전사체로부터 각각의 단백질이 발현될 수 있게 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다. IRES를 이용하여 하나의 프로모터로 복수의 다른 기능을 수행하는 단백질을 생산할 수 있다.

본 발명은 CE 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다. 형질전환 가능한 렌티바이러스는 숙주세포인 패키징 세포를 형질전환하고 패키징 세포에서 렌티바이러스를 분리하여서 얻을 수 있다.

재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 렌티바이러스가 형질감염된 숙주세포를 제공한다. "형질감염(transfection)"은, 바이러스 감염(infection)을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 숙주세포는 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 인간지방줄기세포 (human adipose derived stem cell, hASC)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 숙주세포는 지방줄기세포일 수 있다.

상기 용어 "인간지방줄기세포(human adipose derived stem cell, hASC)"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 인간지방줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직으로부터 분리 또는 정제될 수 있다.

상기 숙주세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:

1) 숙주세포에 v-myc 및 L-myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;

2) 1차 감염된 숙주세포에 CE 유전자 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계.

상기 단계 1)에서 v-myc 및 L-myc은 숙주세포를 불사화시키는 유전자로서, 상기 v-myc 및 L-myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용가능하다.

상기 단계 2)의 2차 감염은 하나의 벡터에 CE 및 CD 유전자를 모두 포함하는 본 발명의 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 CE 및 CD 유전자는 각각의 유전자 컨스트럭트로 제조되어 2개의 렌티바이러스 벡터에 각각 삽입될 수 있다. 즉, CE 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 렌티바이러스 벡터와 CD 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자컨스트럭트가 삽입된 렌티바이러스 벡터가 2차 감염에 사용될 수 있다.

본 발명은 상기 서술한 바와 같은 재조합 렌티바이러스 또는 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 항암제 조성물을 제공한다.

상기 암은 혈액암 및 고형암을 모두 포함하는 일반적인 암을 의미한다. 암의 예로는 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 자궁내막암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 뇌종양, 육종암, 식도암, 소장암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 방광암, 중추신경계 종양 및 척수 종양 등이 있다.

상기 항암제 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 항암제 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1중량% 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 약 90중량% 내지 약 99.99중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0.1중량% 내지 약 20중량%로 포함될 수 있다.

상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.

상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내 투여가 있다.

상기 투여는 1회 이상, 1 내지 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여 하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x10⁶ 내지 1.0x10¹² TU, 구체적으로 1.0x10⁸ 내지 1.0x10¹⁰ TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x10⁵ 내지 1.0x10¹¹ cells, 구체적으로 1.0x10⁷ 내지 1.0x10⁹ cells의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

[실시예 1. 불사화된 인간지방줄기세포(ASC)의 제조]

1-1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조

ASC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 v-myc 및 L-myc를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다.

먼저, pLVX 벡터(Takara, 미국)에서 puromycin 선택 유전자를 제거하고 Neomycin 선택유전자를 치환하여서 pLenti-Neo 벡터를 제작하였다.

상기 pLenti-Neo 렌티바이러스 벡터에, v-myc 유전자를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pLenti-v-myc-Neo로 명명하였다.

한편, pLenti-Neo 렌티바이러스 벡터에, L-myc 유전자를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pLenti-L-myc-Neo로 명명하였다.

1-2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산

상기 실시예 1-1에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.

먼저, 렌티-X 패키지 세포(Takara, 미국)인 293T세포를 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150㎜디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다.

상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3㎖의 TrypLE™ Select CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7㎖의 10% FBS이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50㎖ 튜브에 모아서 1,500rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10㎖의 10% FBS가 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 현탁된 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150㎜ 디쉬에 1.2x10⁷개의 세포가 되도록 분주하였다. 상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12㎍의 렌티바이러스 벡터, 12㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드) 및 2.4㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드) 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10% FBS이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 추가 배양한 뒤, 상층액을 모았다.

상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Takara, 미국)와 혼합한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃, 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하고, 이를 FBS가 포함되지 않은 0.5㎖의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과, 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 1.0x10⁸MOI의 농도로 사용하였다.

1-3. 불사화된 인간지방줄기세포의 제조

상기 실시예 1-2에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여, 불사화된 인간지방줄기세포를 제조하였다.

먼저, 인간지방줄기세포를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 지방을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 0.5% collagenase I 과 혼합하여 지방을 분해하였다. 상기 지방 혼합액을 37℃에서 1시간동안 반응한 후 원심분리하여 상층액을 제거하고, phosphate buffered saline(PBS)으로 세척하고 세포의 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 20%의 FBS 및 5ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃, 5% CO² 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기를 사용하여 지방줄기세포인지 여부를 확인하였다.

상기 선별된 세포에 pLenti-v-myc-Neo 렌티바이러스를 100MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1㎍/㎖의 네오마이신을 첨가하여 pLenti-v-myc-Neo 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다. 상기 선별된 세포는 VAS1이라고 명명하였다.

그 결과, 불사화 유전자를 포함하는 인간지방줄기세포(VAS1) 및 그렇지 않은 인간지방줄기세포(ASC)의 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 보이는 바와 같이, 불사화 유전자인 v-myc 및 c-myc을 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 인간지방줄기세포(VAS1)는 배양 12 passage 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면, 정상 인간지방줄기세포(ASC)는 배양 10 passage 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다.

[실시예 2. CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작]

2-1. CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제작

또한 pLenti-Puro 렌티바이러스 벡터에, IRES 유전자를 삽입하여 2개의 유전자를 삽입할 수 있도록 고안하였다. 각각 CE 유전자와 CD유전자를 삽입하여 CMV 프로모터에 의해 두 유전자의 발현이 조절될 수 있도록 하였다. IRES는 리보좀 결합부위로, 5'-캡 구조가 없어도 번역(translation)이 시작될 수 있도록 하여, 하나의 mRNA에서 두 개의 단백질이 발현될 수 있게 한다. 상기 제작된 벡터는 pLenti-CE-CD-Puro로 명명하였고, 벡터 지도는 그 구조를 도 2에 나타내었다.

2-2. CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산

상기 실시예 2-1에서 제작된 CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1-2에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 1x10⁸ MOI의 농도로 준비하였다.

[실시예 3. CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 인간지방줄기세포의 제조]

3-1. CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 인간지방줄기세포의 제조

상기 실시예 1-3에서 제조한 불사화된 인간지방줄기세포에, 상기 실시예 2-2에서 생산한 CE 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시켜, CE 및 CD 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 감염은 실시예 1-3에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pLenti-CE-CD-Puro 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.

상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 VAS1-CECD라고 명명하였다.

3-2. 확립된 세포주에서 표면항원 단백질 발현 확인

유전자를 삽입하기 전의 인간지방줄기세포와 CE 및 CD 유전자가 삽입된 VAS1-CECD 세포주의 형태는 기존 VAS1과 거의 변화가 없었고, 도 3에 세포 사진을 나타내었다. 그리고 VAS1-CECD 세포주의 분비 단백질 발현을 VAS1과 비교 분석하였다. 실험은 Cytokine profiling kit (R&D Systems, 미국)를 이용하여 제조사의 방법을 그대로 사용하여 수행하였다. 실험 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타나는 바와 같이, VAS1-CECD 세포주는 CE와 CD 치료유전자를 발현시키기 위한 유전자 조작을 거친 후에도 지방줄기세포가 지니고 있는 고유한 분비 단백질인 cytokine/chemokine의 함량이 거의 변하지 않고, 인간지방줄기세포와 동일함을 증명하였다.

3-3. VAS1-CECD 세포주의 CE 및 CD 도입유전자 발현 확인

상기 확립된 세포주인 VAS1-CECD에서 RNeasy mini kit(Qiagen, 독일)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 50ng의 cDNA를 검체로 사용하였고 양성대조군으로 100ng의 VAS1-CECD 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1㎕의 dW를 넣어 PCR을 수행해 CE와 CD 유전자의 발현을 확인하였다.

1% 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰부터 음성대조군, VAS1, VAS1-CECD 검체 (3개) 순서로 각각 10㎕씩 로딩하였다. 이후 100V로 20분동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 5에 나타내었다.(1번 레인: 음성대조군; 2번 레인: VAS1; 3번 레인: VAS1-CECD)

도 5에 나타난 바와 같이, VAS1-CECD 세포주 검체에서만 CE 및 CD PCR 프로덕트를 확인하였다.

3-4. 확립된 세포주에서 CE 및 CD 단백질의 발현 확인

상기 실시예 3-1에서 확립된 VAS1-CECD 세포주에서 구체적으로, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에 5-FC(5-fluorocytosine, Sigma)를 100㎍/㎖의 농도와 CPT-11(irinotecan)을 1uM로 첨가한 뒤, 48시간 후에 세포의 사멸을 관찰하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 정상세포에는 영향을 미치지 못하는 농도의 CPT-11을 처리하였을 때 (VAS1, 좌측), 같은 농도에서 VAS1-CECD 세포를 처리한 군(우측)에서는 세포 사멸이 관찰되었다. 또한, 도 7에서도 정상세포(VAS1)와는 달리 CD 단백질이 발현되는 VAS1-CECD 군(우측)에서만 5-FC에 의해 세포가 사멸하는 것을 알 수 있었다. 즉, CE 및 CD 단백질의 발현에 의해 세포가 사멸되는 것을 관찰하였다.

3-5. 세포의 PDL (Population doubling level) 분석

VAS1-CECD 세포주를 4x10⁴ 세포 수로 시딩하였다. 4일 정도 계대 배양하여 세포를 수득하였고 총 세포수를 측정하였다. 같은 수의 세포를 시딩하여 4일 간격으로 cell counter를 이용하여 세포수를 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 장기 계대 배양으로 안정된 성장을 보여주고 있음을 확인하였다.

3-6. 세포의 핵형 분석

VAS1-CECD 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 karyotype을 분석하였다. 분석 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 유전자가 이입된 VAS1-CECD 세포주의 염색체에서 이상 여부는 관찰되지 않았으며 정상 핵형으로 분석되었다.

Claims

carboxyl esterase(CE) 및 cytosine deaminase(CD) 단백질을 코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개 이상의 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
제2항에 있어서,
상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 및 TRE(tetracycline response elements) 프로모터로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
제3항에 있어서,
상기 벡터가 내부 리보솜 진입 부위(IRES)를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 렌티바이러스 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 렌티바이러스 벡터로 숙주세포를 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하여 수득한 재조합 렌티바이러스.
carboxyl esterase(CE) 및 cytosine deaminase(CD) 단백질을 코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
제6항의 재조합 렌티바이러스로 형질 감염된 숙주세포.
제7항에 있어서,
상기 숙주세포는 골수줄기세포, 중간엽줄기세포 또는 인간지방줄기세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제6항의 재조합 렌티바이러스를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물.
제7항 또는 제8항의 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 항암제 조성물.
제7항 또는 제8항의 숙주세포의 배양물(CM)을 유효성분으로 하는 항암제 조성물.