CN118240883B

CN118240883B - 一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法

Info

Publication number: CN118240883B
Application number: CN202410645382.7A
Authority: CN
Inventors: 杨晓光; 宋振波; 鲍永利; 孙陆果; 刘泽宇; 刘畅
Original assignee: Northeast Normal University
Current assignee: Northeast Normal University
Priority date: 2024-05-23
Filing date: 2024-05-23
Publication date: 2024-07-30
Anticipated expiration: 2044-05-23
Also published as: CN118240883A

Abstract

本发明涉及间充质干细胞技术领域，特别涉及一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法。本发明了建立CD142低表达型脐带间充质干细胞，提高了脐带间充质干细胞中干性维持基因的表达，增强其分化功能，提高其免疫调节功能，并通过体外和动物模型试验，验证了该方法提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的效果，为关节炎等炎症损伤类疾病的治疗提供了新的方案。

Description

一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法

技术领域

本发明涉及间充质干细胞技术领域，特别涉及一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法。

背景技术

关节炎是指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病。我国的关节炎患者有1亿以上，且人数在不断增加。现阶段骨关节炎的主要治疗手段分为药物治疗和手术治疗。药物治疗主要是缓解疼痛、改善功能、延缓疾病发展，但难以逆转疾病进程；手术治疗主要包括关节软骨修复、关节镜清理、截骨术、关节融合术以及关节置换术，但手术治疗相对来说创伤大、费用高。

干细胞移植治疗，是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。干细胞具有自我更新、多向分化潜能，能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、代谢疾病和一些衰老损伤类疾病。

干细胞被认为是替代治疗的理想细胞来源。然而，最早开发的胚胎干细胞受到伦理学和法律的限制，而且存在致瘤性和非预期分化等风险，难以开发成细胞制剂。诱导多能干细胞可以模拟胚胎干细胞的多能性，没有伦理争议，但仍然存在致瘤性和非预期分化等风险。来自于成体间充质干细胞无伦理争议，而且可实现自体移植，因此成为很有吸引力和开发前景的选择。最早使用的间充质干细胞是骨髓间充质干细胞，但由于骨髓组织获取困难，研究人员开始在其他组织中寻找替代来源，在脐带、脂肪、外周血等组织中发现了间充质干细胞。目前，由于获取便利，使用安全可靠，而且取材方便，数量充足，增殖能力强，脐带间充质干细胞被广泛用于细胞疗法治疗疾病。

目前，全球已有21款干细胞治疗产品获批上市，其中10种为间充质干细胞制品。截止2023年底，中国有129个干细胞临床研究通过备案，其中74个为间充质干细胞制品；现有68个干细胞制剂获得IND默示许可，其中43个为间充质干细胞制品。国内已有十余种用于关节炎症及损伤修复相关的干细胞制剂进入临床试验，但仍没有获批上市的产品。

虽然越来越多的间充质干细胞被应用于临床，但间充质干细胞存在一些局限性，间充质干细胞体外扩增能力有限，传代次数增多后，随着细胞衰老和干性下降，细胞的活性也随之下降。间充质干细胞体内归巢缺乏特异性，多向慢性炎症部位聚集，难以有效抵达目标组织。间充质干细胞的生物学效应繁杂，缺乏明确治疗靶点，需要进行具有针对性的调节，以增强其治疗作用。

近年来，有研究者利用细胞因子或化合物对间充质干细胞进行诱导，以调节间充质干细胞的生物学功能，增强其治疗效果。但单纯的诱导培养，不仅使用的细胞因子价格昂贵，而且特定基因或蛋白的调节水平也难以有效控制。随着基因调节和基因编辑技术的进步，一些基因调节型间充质干细胞逐渐被开发出来。基因调节型间充质干细胞，能够稳定传代扩增，可以显著降低制备费用，降低批次间差异。也可以在应用前添加少量细胞因子或化合物，进一步增强间充质干细胞的活性，是更具有开发价值的制备途径。

因此，提供一种用于治疗关节炎或炎症疾病的基因调节型干细胞具有重要的现实作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法，解决的技术问题在于提供一种干细胞制剂和其制备方法，以及其在制备炎症调节药物中的应用。本发明在已有研究成果的基础上，针对与间充质干细胞分化衰老、损伤修复和炎症调节功能相关的基因进行研究，建立CD142低表达型脐带间充质干细胞，提高了脐带间充质干细胞中干性维持基因的表达，增强其分化功能，提高其免疫调节功能，并通过体外和动物模型试验，验证了本发明的方法提高脐带间充质干细胞免疫调节能力的效果，为关节炎等炎症损伤类疾病的治疗提供新的方案。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了重组脐带间充质干细胞的制备方法，其为将干涉CD142表达的shRNA导入脐带间充质干细胞获得；

所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 1~3任一所示。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法所述的shRNA的序列为SEQ IDNO: 1。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法所述的shRNA的序列为SEQ IDNO: 2。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法所述的shRNA的序列为SEQ IDNO: 3。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法所述的导入是通过慢病毒转染的方式导入的。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中在将所述shRNA导入所述脐带间充质干细胞后，还包括取IL-10和三七总皂苷诱导所述脐带间充质干细胞的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法所述的IL-10的诱导浓度为5~200ng/mL；所述三七总皂苷的诱导浓度为5~80 μg/mL。

在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法所述的IL-10的诱导浓度为25ng/mL；所述三七总皂苷的诱导浓度为10 μg/mL。

本发明还提供了上述制备方法制得的重组脐带间充质干细胞。

本发明还提供了上述重组脐带间充质干细胞在制备预防或治疗如下任意疾病的制剂中的应用：

i）、炎症性疾病；

ii）、软骨损伤类疾病。

本发明还提供了上述重组脐带间充质干细胞在预防或治疗如下任意疾病中的应用：

i）、炎症性疾病；

ii）、软骨损伤类疾病。

在本发明的一些具体实施方案中，上述应用所述的炎症性疾病为关节炎。

本发明还提供了重组脐带间充质干细胞制剂，其包括复合电解质注射液、人血白蛋白、三七总皂苷、上述制备方法制得的重组脐带间充质干细胞，以及可接受的辅料或助剂。

在本发明的一些具体实施方案中，上述重组脐带间充质干细胞制剂所述的人血白蛋白的浓度为5 mg/mL或10 mg/mL；所述三七总皂苷的浓度为10 μg/mL。

本发明还提供了预防或治疗如下任意疾病的方法：

i）、炎症性疾病；

ii）、软骨损伤类疾病；

所述方法包括：

取上述重组脐带间充质干细胞输入患者；或

取上述重组脐带间充质干细胞制剂输入患者。

本发明的炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法有如下效果：

利用基因编辑和诱导培养的方式，降低脐带间充质干细胞中CD142蛋白的表达，提高间充质干细胞分化能力、免疫调节能力和炎症调节能力，增强脐带间充质干细胞的治疗效果。基因编辑采用慢病毒介导的shRNA进行，具有良好的靶向性，可以建立稳定转染的干细胞系，同时降低转基因的安全风险。在培养体系中加入IL-10和三七总皂苷，能够进一步保证CD142的低表达，持续提高间充质干细胞的活性。在细胞制剂中加入三七总皂苷，能够使细胞制剂在进入体内后仍维持CD142低表达，并起到促进关节炎症或软骨损伤恢复的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示通过慢病毒转染分别将四条sh-RNA链转入人脐带间充干细胞中；Westernblot显示，与空载病毒（Sh-NC）相比，含有shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3链的慢病毒均可敲低人脐带间充质干细胞中的CD142表达，其中ShRNA-1的慢病毒的敲低效果更加显著；

图2A、图2B示流式细胞术检测CD142低表达型间充质干细胞表面标志物的表达；流式图显示，与Sh-NC细胞相比，Sh-CD142细胞的表面阳性标志物和阴性标志物的阳性率没有发生显著性变化；

图3A、图3B、图3C依次示对Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞同时进行成骨、成脂和成软骨分化，成骨分化的拍摄倍数是100×，成脂分化的拍摄倍数是200×，成软骨分化的拍摄倍数是100×，分化21天后，固定细胞并染色；茜素红染色显示，Sh-CD142细胞颜色更深，诱导后形成的钙质结节更多；油红O染色显示，Sh-CD142细胞诱导后形成的脂滴更多；阿利辛蓝染色显示，Sh-CD142细胞诱导后染色颜色更深；

图4A、图4B示将CFSE标记的PBMC，经PHA刺激后分别与Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞共培养96 h，通过流式细胞术来检测MSCs对PBMC增殖的抑制率；结果显示，分别与Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞共培养后，PHA刺激的PBMC的增殖均被抑制，且与Sh-NC细胞相比，Sh-CD142细胞对PBMC增殖的抑制率增加；

图5示对Sh-CD142细胞进行体外软琼脂克隆形成实验，21天后，10×和20×物镜下观察克隆形成大小；结果表明，Hela细胞阳性对照在培养至21天后有明显的集落形成，而Sh-NC和Sh-CD142组培养至21天时均未见集落形成；

图6示分别注射Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞以治疗膝骨关节炎模型大鼠；治疗2周后，取脾，提取脾细胞，流式细胞仪检测脾中M1型巨噬细胞比例；结果显示，与空白组相比，模型组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞比例增加；与模型组大鼠相比，Sh-NC和Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞比例减少；与Sh-NC治疗组大鼠相比，Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞比例进一步减少；

图7示分别注射Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞以治疗膝骨关节炎模型大鼠；治疗2周后，取脾，提取脾细胞，流式细胞仪检测脾中Tregs细胞比例；结果显示，与空白组相比，模型组大鼠脾脏中的Tregs细胞比例减少；与模型组大鼠相比，Sh-NC和Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的Tregs细胞比例增加；与Sh-NC治疗组大鼠相比，Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的Tregs细胞比例进一步增加。

具体实施方式

本发明公开了一种炎症调节能力增强型脐带间充质干细胞及其应用、制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明涉及的名词及对应含义如下：

（1）关节炎（Arthritis）泛指发生在人体关节及其周围组织，由炎症、感染、退化、创伤或其他因素引起的炎性疾病，可分为数十种。我国的关节炎患者有1亿以上，且人数在不断增加。临床表现为关节的红、肿、热、痛、功能障碍及关节畸形，严重者导致关节残疾、影响患者生活质量。据统计我国50岁以上人群中半数患骨关节炎，65岁以上人群中90%女性和80%男性患骨关节炎。我国的患病率为0.34%～0.36%，严重者寿命约缩短10～15年。现阶段骨关节炎的主要治疗手段分为药物治疗和手术治疗。药物治疗主要是缓解疼痛、改善功能、延缓疾病发展，但难以逆转疾病进程；手术治疗主要包括关节软骨修复、关节镜清理、截骨术、关节融合术以及关节置换术，但手术治疗相对来说创伤大、费用高。

（2）干细胞（Stem cell）干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。

（3）胚胎干细胞（Embryonic stem cell，ESCs）是早期胚胎（原肠胚期之前）或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。胚胎干细胞研究在美国一直是一个颇具争议的领域，支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，因为胚胎干细胞可以分化成多种功能的细胞，被认为是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行胚胎干细胞研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时在子宫的生命形式，这有反生命伦理。

（4）诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells），是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。用诱导性多能干细胞治疗人类疾病仍然需要克服许多关键障碍。比如，添加4个“重新编程”基因或取代疾病细胞中有缺陷基因的方法都可能有导致癌症的副作用。诱导多能干细胞与胚胎干细胞一样存在致瘤性或非预期分化的风险。

（5）间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）最先在骨髓中被发现，是起源于中胚层发育早期的具有多能干细胞特点的一类干细胞，具有自我更新能力和多分化潜能。实验证明，间充质干细胞在特定培养环境中能分化为多种系统、器官、组织或者细胞，具有低免疫原性、免疫调节和靶向迁移等优点。近年来间充质干细胞为许多疾病的治疗提供了新的思路及方法，并显示出了一定的疗效。

（6）脐带间充质干细胞（Umbilical cord Mesenchymal Stem Cells，UC-MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。由于骨髓间充质干细胞获取困难，研究人员开始在其他组织中寻找替代来源，并在脐带、脂肪、外周血等组织中发现了间充质干细胞。目前，由于获取便利，使用安全可靠，而且取材方便，数量充足，增殖能力强，脐带间充质干细胞被广泛用于细胞疗法治疗疾病。

（7）CD142又名组织因子3（Tissue factor 3），一直被认为是外源性凝血途径的启动剂，在凝血过程中发挥重要作用，但CD142过表达往往会导致血栓形成，而且CD142的胞质结构域能够介导细胞内的信号级联反应。骨髓间充质干细胞的CD142表达量远远小于脐带间充质干细胞。与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞输注后凝血时间更短、凝块形成时间显著减少、纤维蛋白沉积更快，血液相容性更差。

（8）慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒的亚类，是能够高效转染非分裂细胞的病毒。来源于HIV的慢病毒，通过改造，致病基因的完全缺失，使慢病毒转染具有安全性，可以制造无复制能力的慢病毒，用于细胞的基因改造。和逆转录病毒载体相似，慢病毒载体能够整合到受体细胞的基因组，促使转基因在体外细胞稳定地表达。慢病毒载体是整合载体，整合载体基因进入受体基因组可提供持续改善遗传疾病需要的长期转基因表达。

（9）shRNAs（RNA-Short hairpin RNAs）：即短发夹RNA，是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，通过使体内的外源DNA序列转录成siRNA（短干扰RNA），从而抑制靶基因的表达，实现基因表达的负性调控。shRNA技术可以针对特定基因序列的问题，实现通过RNA干扰机制可靶向调控基因，从而调整基因的表达情况，最终实现治疗效果的改善。相对于传统的基因治疗技术，shRNA技术具有以下优势：1、精准性：shRNA技术通过对特定的基因序列进行RNA干扰，使治疗更加精准，可以针对性地调节基因表达。2、高效性：shRNA技术作用的基因多，涵盖面广，可以同时或是连续地作用于多个靶基因，从而保证治疗的效果。3、可控性：shRNA技术采用筛选懂得方式，可以在多个模型中筛选最优的shRNA序列，不断优化治疗效果。

本发明提供了一种基因调节的间充质干细胞，具体而言是一种通过基因调节和诱导培养制备的CD142低表达型脐带间充质干细胞。

在本发明的一些具体实施方案中，CD142低表达型脐带间充质干细胞上述制备方法包括：以慢病毒转染的方式，利用shRNA干涉脐带间充质干细胞中CD142的表达，细胞传代培养过程中添加IL-10和三七总皂苷。

所述shRNA的序列可为下述序列中的一个：

（1）GCGCTTCAGGCACTACAAATATTCAAGAGATATTTGTAGTGCCTGAAGCGCTTTTTT（SEQ IDNO: 1）；

（2）GGGAGCCTCTGTATGAGAACTTTCAAGAGAAGTTCTCATACAGAGGCTCCCTTTTTT（SEQ IDNO: 2）；

（3）GGACTTTAGTCAGAAGGAACATTCAAGAGATGTTCCTTCTGACTAAAGTCCTTTTTT（SEQ IDNO: 3）；

优选（1）号序列。

所述IL-10添加量为5~200 ng/mL，优选25 ng/mL。

三七总皂苷添加量为5~80 μg/mL，优选10 μg/mL。

本发明还提供了制剂配方，包括脐带间充质干细胞制剂中加入复合电解质注射液、人血白蛋白和三七总皂苷。人血白蛋白添加量，优选5 mg/mL或10 mg/mL。三七总皂苷添加量，优选10 μg/mL。

上述CD142低表达型脐带间充质干细胞的治疗适应症包括：

治疗关节炎等炎症性疾病。

治疗软骨损伤类疾病。

如无特殊说明，本发明涉及的原料、试剂、耗材以及仪器皆为普通市售品，均可由市场购得。

本发明涉及的完全培养基为Alpha-MEM基本培养基（品牌厂商：JSBio；货号：6024）+5%血小板裂解物（品牌：SEXTON；货号PL-PR）。

本发明涉及的慢病毒为人源CD142 ShRNA慢病毒，厂家为山东维真生物科技公司。

本发明涉及的IL-10的厂家为近岸蛋白，货号：CX04。

本发明涉及的三七总皂苷的厂家为上海源叶生物科技有限公司，货号：B21102。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

利用慢病毒转染的方式，将CD142的shRNA转入脐带间充质干细胞，降低细胞中CD142的表达，建立稳定的细胞系。在细胞系建成后进行传代培养，细胞使用前，利用IL-10和三七总皂苷对细胞进行进一步的诱导，使细胞保持CD142低表达状态（图1）。

1）脐带间充质干细胞的分离

对供者进行健康筛查，选择无传染性疾病的足月孕妇，待胎儿娩出切断脐带后，取脐带组织，4~8℃冷藏运输至实验室，通过组织贴壁法分离原代的间充质干细胞，并对间充质干细胞进行特征鉴定。细胞扩增后建立种子库，用于后续的基因改造和诱导培养。

2）敲低间充质干细胞CD142

复苏脐带间充质干细胞，在6孔细胞培养板中，以1×10⁵个细胞/孔的密度接种细胞，培养过夜。待细胞融合率达50%时，更换含有慢病毒（MOI=50，空载病毒、ShRNA-1、ShRNA-2、ShRNA-3四种病毒）的完全培养基，放入5% CO₂、37℃的培养箱中培养24 h。24 h后观察细胞状态，细胞密度达85%以上，更换含有1.5 μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基进行细胞筛选。每48 h更换一次含有嘌呤霉素的新鲜培养基。待细胞密度达到85%以上时，加入25 ng/mL的IL-10和10 μg/mL的三七总皂苷，继续培养12 h，之后收集细胞，提取蛋白，利用Westernblot检测CD142敲低情况。

Western blot结果显示，与空载病毒（Sh-NC）相比，经过诱导培养，含有shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3链的慢病毒均可敲低人脐带间充质干细胞中的CD142表达，其中ShRNA-1的慢病毒的敲低效果更加显著，后续实验优选shRNA-1的慢病毒来制备CD142低表达型人脐带间充质干细胞。

此外，还探究了IL-10和三七总皂苷诱导浓度对敲低效果的影响，观察到：当IL-10的诱导浓度为5~200 ng/mL、三七总皂苷的诱导浓度为5~80 μg/mL时，CD142表达被不同程度地敲低，如图1所示。后续实验优选25 ng/mL的IL-10诱导浓度、10 μg/mL的三七总皂苷诱导浓度制备CD142低表达型人脐带间充质干细胞。

实施例2

实施例1所示的CD142基因调节方法不影响间充质干细胞的表型（图2A、图2B）。

CD142敲低后，利用流式细胞术检测了人脐带间充质干细胞表面几种标志物的表达水平。将处于对数期的细胞进行消化、离心并重悬，进行细胞计数，调整细胞浓度为2.5×10⁷/mL。取8个检测管，分别加入100 μL细胞悬液，上标记抗体名称并加入5 μL的流式抗体，4℃避光孵育30 min。30 min后，用PBS洗两遍，300 μL PBS重悬，之后上机检测。

流式细胞术结果显示，Sh-NC组细胞表面阳性标记物CD73、CD90和CD105的阳性率分别为99.955±0.005、99.21±0.22和99.945±0.005；Sh-CD142组细胞表面阳性标记物CD73、CD90和CD105的阳性率分别为99.965±0.035、99.485±0.265和99.96±0.00，均≥95%（表1）。与Sh-NC组细胞相比，Sh-CD142组细胞的表面阳性标志物的阳性率没有发生显著性变化。

Sh-NC组细胞表面阴性标记物HLA-DR、CD34、CD45、CD14和CD19的阳性率为0.12±0.05、0.5±0.24、0.015±0.005、0.875±0.515和0.3±0.16；Sh-CD142组细胞表面阴性标记物HLA-DR、CD34、CD45、CD14和CD19的阳性率为0.375±0.285、0.16±0.11、0.04±0.04、0.835±0.725和0.22±0.13，均≤2%（表1）。与Sh-NC组细胞相比，Sh-CD142组细胞的表面阴性标志物的阳性率没有发生显著性变化。综上所述，CD142的调节不会影响间充质干细胞表面标志物的变化。

表1

实施例3

实施例1所示的CD142基因调节方法能够增强其分化功能（图3A示成骨分化、图3B示成脂分化、图3C示成软骨分化）。

1）成骨分化

Sh-NC和Sh-CD142细胞同时进行成骨诱导分化，当细胞密度达到80%时，弃去Sh-NC组和Sh-CD142组细胞的培养基，小心地加入成骨分化培养基，每4天更换一次培养基。分化21天后，细胞可提取RNA以及茜素红染色。

茜素红染色显示，Sh-CD142细胞颜色更深，诱导后形成的钙质结节更多。

RT-qPCR结果显示，与Sh-NC细胞相比，Sh-CD142细胞中RUNX2、Bglap2、SPP1和Sp7等成骨相关基因表达量显著增加，这说明CD142敲低后，人脐带间充质干细胞的成骨分化潜能增强。

2）成脂分化

Sh-NC和Sh-CD142细胞同时进行成脂诱导分化，当细胞密度达到80%时，弃去Sh-NC组和Sh-CD142组细胞的培养基，小心地加入成脂分化培养基，每4天更换一次培养基。分化21天后，细胞可提取RNA以及油红O染色。

油红O染色显示，Sh-CD142细胞诱导后形成的脂滴更多。

RT-qPCR结果显示，与Sh-NC细胞相比，Sh-CD142细胞中PPARG、LPL等成脂相关基因表达量显著增加，这说明CD142敲低后，人脐带间充质干细胞的成脂分化潜能增强。

3）成软骨分化

Sh-NC和Sh-CD142细胞同时进行成软骨诱导分化，将待处理细胞消化、离心，重悬后计数。每10⁶个细胞分至一个15 mL离心管中，700 rpm离心5分钟。弃去培养基，加入1 mL成软骨诱导培养基，离心管盖拧松，于37℃、5% CO₂培养箱中竖直放置。第二天细胞会成球状体。此时将细胞球倒到24孔板中，每4天换一次液。分化21天后，细胞可提取RNA以及阿利辛蓝染色。

阿利辛蓝染色显示，Sh-CD142细胞诱导后染色颜色更深。

RT-qPCR结果显示，与Sh-NC细胞相比，Sh-CD142细胞中SOX9、COL2A1、Aggrecan等成软骨相关基因表达量显著增加，这说明CD142敲低后，人脐带间充质干细胞的成软骨分化潜能增强。综上所述，CD142敲低后，人脐带间充质干细胞的多向分化潜能增强。

实施例4

实施例1所示的CD142基因调节方法，提高免疫调节功能（图4A、图4B）。

间充质干细胞与外周血单个核细胞（PBMC）共培养是检测间充质干细胞体外免疫调节能力的经典方法。植物血凝素（PHA）能够刺激人外周血单个核细胞中淋巴细胞的增殖。将CFSE标记的PBMC，经PHA刺激后分别与Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞共培养96 h，通过流式细胞术来检测MSCs对PBMC增殖的抑制率。

结果显示，外周血单个核细胞（PBMC）分别与Sh-NC细胞和Sh-CD142细胞共培养后，PHA刺激的PBMC的增殖均被抑制，且与Sh-NC细胞相比，Sh-CD142细胞对PBMC增殖的抑制率增加。

实施例5

实施例1所示的CD142基因调节方法，不增加成瘤风险（图5）。

本发明通过体外软琼脂克隆形成实验对CD142低表达型人脐带间充质干细胞的成瘤性进行了评价。将1.5%琼脂与2×完全培养基1:1混合，加入6孔细胞培养板中以制备底层琼脂，37°C孵育30 min使之凝固。取对数生长期细胞制备成单细胞悬液，将0.7%琼脂与2×完全培养基1:1混合，再将细胞悬液加入上述混合液中，混匀后迅速加入6孔板中，每孔5000个细胞。同时设立阳性对照孔（Hela细胞，5000个/孔），室温静置30 min，待上胶凝固后放入37℃，5% CO₂细胞培养箱，培养21天后显微镜下观察克隆大小并拍照，>50个细胞的克隆即为阳性克隆。

结果表明，Hela细胞阳性对照在培养至21天后有明显的集落形成，而Sh-NC和Sh-CD142组培养至21天时均未见集落形成。

实施例6

实施例1获得的间充质干细胞制剂具有更强的免疫调节能力，明显促进巨噬细胞从M1型向M2型转换，有利于炎症恢复（图6）。

利用大鼠构建关节炎模型，并分别使用Sh-NC和Sh-CD142组脐带间充质干细胞对模型大鼠进行治疗，实验结束后处死各组大鼠，取脾。将取出的脾置于有PBS的平皿中，洗去血液，去除脂肪等多余组织。将处理干净的脾转移至新的滤网中，加PBS，在滤网上用注射器将脾轻轻捣碎，液体过滤至无菌平皿中。悬浊液转移至离心管中，离心机后弃上清。加入红细胞裂解液重悬，常温裂解8 min，离心后弃上清，加入PBS洗涤细胞，离心，弃去上清，得到脾细胞沉淀。将脾细胞沉淀悬浮于PBS中，计数，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。在加入100 μL细胞悬液中，加入CD45-FITC、CD11b-APC和CD86-PE流式抗体，常温避光孵育30 min，PBS洗一遍，1000 rpm离心5 min，300 μL PBS重悬，转移至流式管中，利用流式细胞仪检测各组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞的比例变化。

流式图结果显示，与空白组大鼠相比，模型组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞比例增加；与模型组大鼠相比，Sh-NC和Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞比例减少；与Sh-NC治疗组大鼠相比，Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的M1型巨噬细胞比例进一步减少。

实施例7

实施例1获得的间充质干细胞制剂具有更强的免疫调节能力，明显促进提高关节炎模型大鼠体内Treg的比例，有利于炎症恢复（图7）。

利用大鼠构建关节炎模型，并分别使用Sh-NC和Sh-CD142组脐带间充质干细胞对模型大鼠进行治疗，实验结束后处死各组大鼠，取脾。按实施例6所述方法进行脾细胞制备。将脾细胞沉淀悬浮于PBS中，计数并调整细胞浓度为1×10⁷个/mL。在100 μL细胞悬液中，加入CD3-Percp-cy5.5、CD4-APC和CD25-PE流式抗体，常温避光孵育30 min，PBS洗一遍，1000rpm离心5 min，300 μL PBS重悬，转移至流式管中，上机检测。

流式结果显示，与空白组大鼠相比，模型组大鼠脾脏中的Tregs细胞比例减少；与模型组大鼠相比，Sh-NC和Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的Tregs细胞比例增加；与Sh-NC治疗组大鼠相比，Sh-CD142治疗组大鼠脾脏中的Tregs细胞比例进一步增加。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.重组脐带间充质干细胞在制备治疗膝骨关节炎的制剂中的应用；

所述重组脐带间充质干细胞的制备方法为：

将序列如SEQ ID NO: 1~3任一所示shRNA导入脐带间充质干细胞，采用IL-10和三七总皂苷诱导所述脐带间充质干细胞，获得所述重组脐带间充质干细胞；

所述导入为通过慢病毒转染的方式导入；

所述IL-10的诱导浓度为5~200 ng/mL；

所述三七总皂苷的诱导浓度为5~80 μg/mL。