WO2021015584A1 - 불사화된 줄기세포주의 제조 방법 및 이의 용도 - Google Patents

불사화된 줄기세포주의 제조 방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2021015584A1
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an immortalized stem cell line in which proliferation is suppressed and the ability to express an introduced gene is maintained so that it can be used as a cell therapy agent, and a use thereof.
  • MSC Mesenchymal stem cells
  • T cells T cells
  • B cells dendritic cells
  • natural killer cells T cells
  • T cells T cells
  • B cells dendritic cells
  • natural killer cells T cells
  • T cells T cells
  • B cells dendritic cells
  • natural killer cells T cells
  • T cells T cells
  • B cells dendritic cells
  • natural killer cells T cells
  • T cells T cells
  • B cells dendritic cells
  • natural killer cells it is possible to regulate the immune function of the human body.
  • MSC has the advantage that it can be cultured relatively easily in vitro . Due to these characteristics, researches for using MSC as a cell therapy are being actively conducted.
  • Korean Patent Registration No. 1585032 discloses a cell therapy containing mesenchymal stem cells cultured in a hydrogel.
  • the document provides a composition that can be administered immediately by shortening the pretreatment process in the process of isolating mesenchymal stem cells for use as a cell therapy, but there are no questions about the problems of the mesenchymal stem cells and methods for solving them. It is not mentioned. Therefore, there is a need for research on safe and effective mesenchymal stem cells that can be used as cell therapy products.
  • the present inventors studied to develop a stem cell therapeutic agent capable of mass production and maintaining the same effect even in long-term culture.
  • a specific range of radiation was applied to the stem cells into which the immortalized gene and foreign gene of the present invention were introduced.
  • the present invention was completed by confirming that the expression of the protein by the introduced foreign gene is stably maintained, but the proliferation of stem cells is suppressed.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing an immortalized stem cell line and the produced immortalized stem cell line, comprising the step of irradiating an immortalized stem cell line into which an immortalized gene and a foreign gene have been introduced. Is to do.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition using the prepared immortalized stem cells.
  • the present invention comprises the steps of producing a stem cell line into which an immortalized gene is introduced; Introducing a gene encoding a foreign protein into the stem cell line; Cryopreserving the stem cell line; And it provides a method for producing an immortalized stem cell line comprising the step of irradiating the stem cell line in the frozen state.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the immortalized stem cell line produced by the above method as a cell therapy.
  • It provides a method for producing an immortalized stem cell line comprising the step of irradiating the stem cell line in the frozen state.
  • the immortalized stem cell line of the present invention is characterized in that it is possible to stably mass-produce by maintaining the same quality even in long-term subculture by introducing an immortalized gene, and maintaining the same quality even in mass production.
  • the introduced protein can be stably expressed for a long period of time without proliferating the stem cell into which the immortalized gene has been introduced, It can be used safely as a cell therapy.
  • the immortalized stem cell line of the present invention can be prepared by the following method.
  • various methods such as plasmid, retrovirus, lentivirus, and AAV may be used as the method of introducing the gene.
  • expression of a foreign gene when producing a lentivirus containing a foreign gene A vector containing a specific promoter for regulating may be additionally used, and in this case, it may include the step of additionally introducing a gene including the promoter.
  • a gene was introduced into a cell using a lentiviral vector, and at this time, a TRE promoter whose expression was regulated with doxycycline or tetracycline was used, and for this purpose, the tTA gene was added to the cell.
  • the containing lentivirus was further infected.
  • the stem cells of the present invention are immortalized by introducing an immortalizing gene.
  • the “immortalized gene” in the present invention may be an hTERT and/or c-Myc gene, but other genes that can be introduced as the immortalized gene may be used without limitation.
  • c-Myc refers to a gene encoding a transcription factor located on chromosome 8 of a person.
  • the protein encoded in c-Myc which regulates the expression of about 15% of genes in cells, is a transcription factor, and when the transcription factor is overexpressed, cell activity and proliferation are promoted.
  • hTERT means telomerase reverse transcriptase.
  • the telomerase reverse transcriptase synthesizes DNA complementary to the RNA template of telomerase, forms an RNA-DNA hybrid form, becomes a double-ring DNA, and is inserted into the chromosome of a host cell. Then, in the host cell, telomerase instead of telomeres attaches to chromosomal telomeres and continues to produce telomeres, thereby creating immortalized cells.
  • tTA which may be additionally included in the above step, is a gene capable of controlling the expression of a target protein, and refers to a tetracycline transactivator.
  • the Tet-off system used in the present invention can control the expression of a target protein according to the presence or absence of tetracycline or doxycycline by the method described above.
  • the "foreign gene” refers to a gene that is introduced into a stem cell and can encode a foreign protein.
  • the immortalized stem cell line of the present invention has a characteristic of maintaining the ability to express proteins encoded by the introduced foreign genes.
  • the foreign protein is not limited to its type, and may be included without limitation as long as it can be introduced into and expressed in stem cells.
  • the foreign protein may be a protein having a therapeutic effect on a disease.
  • the foreign proteins include hepatocyte growth factor (HGF), vascular epithelial growth factor (VEGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived nerve growth factor (BDNF), fibroblast growth factor (FGF) and brain-derived neurotrophic factor (BDNF), insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), platelet-derived growth factor (PDGF), bone-derived growth factor (BMP), colony stimulating factor (CSF), epidermal growth factor (EGF), keratin Growth factors such as Keratinocyte growth factor (KGF), cytokines such as IL-2, IL-4, TNF, IF- ⁇ , G-CSF, and GM-CSF, and TNF-associated apoptosis-inducing ligand protein (TRAIL) and/or a cancer therapy gene such as cytosine deaminase (CD), or an antibody that recognizes a specific antigen capable of targeting cancer tissues, an antibody in the form of a chimeric antigen receptor (CAR) (
  • the immortalized stem cell line of the present invention may be one that expresses BDNF.
  • BDNF Brain-derived neurotrophic factor
  • the immortalized stem cell line of the present invention may be one that expresses BDNF.
  • Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)” protein is the most abundantly distributed neurotrophin in the brain. It is known to promote the growth of neurons and regulate the synthesis, metabolism, release, and activity of neurons of neurotransmitters. In addition, it is known that the BDNF protein is reduced in the prefrontal cortex or hippocampus of a depressed patient, and can treat depression by increasing its concentration.
  • the BDNF protein according to the present invention may be a human-derived protein.
  • the protein may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the BDNF protein may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the BDNF protein may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence encoding the BDNF protein may have about 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the immortalized stem cell line of the present invention may express TRAIL and CD.
  • the "TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)" protein belongs to the type 2 transmembrane cytokine in the TNF family.
  • TRAIL selectively induces apoptosis of transformed cells.
  • TRAIL activates the apoptosis signaling system by binding with apoptosis receptor-4 (DR-4), DR-5, decoy receptor or decoy receptor-2 present on the cell surface.
  • DR-4 apoptosis receptor-4
  • DR-5 apoptosis receptor-5
  • decoy receptor or decoy receptor-2 present on the cell surface.
  • TRAIL is not toxic to normal cells and is known to specifically induce apoptosis only in cancer cells.
  • the TRAIL protein according to the present invention may be a human-derived protein.
  • the TRAIL protein exists in the form of a homotrimer capable of binding to three receptors.
  • the TRAIL protein of the present invention may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the TRAIL protein may have about 70%, 80%, 90%, or 95% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the gene encoding the TRAIL protein may be a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence encoding the TRAIL protein may have about 70%, 80%, 90%, or 95% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • CD protein as used herein is a cytosine deaminase protein, and may be in the form of a "fusion protein in which CD and UPRT (uracil phosphoribosyltransferase) are bound” ,
  • CD protein may be used interchangeably with “CD::UPRT”.
  • the sequence of the gene encoding the CD protein according to the present invention is the FCY1 gene encoding the CDase of Saccharomyces cerevisiae, and the FUR1 ⁇ 105 encoding the UPRTase in which 35 amino acids have been deleted from the N-terminus. It is a sequence that is codon-optimized by fusion of genes. The sequence may be those described in US Patent No.
  • the CD protein may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the CD protein may have about 70%, 80%, 90%, or 95% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the gene encoding the CD protein may be a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the nucleotide sequence encoding the CD protein may have about 70%, 80%, 90%, or 95% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
  • lentiviral vector as used herein is a kind of retrovirus.
  • the vector is also referred to interchangeably as a lentiviral transfer vector.
  • the lentiviral vector is inserted into the genomic DNA of an infection target cell to stably express the gene.
  • the vector can deliver genes to dividing cells and non-dividing cells. Since the vector does not induce an immune response in the human body, its expression is sustained.
  • a gene of a larger size can be delivered.
  • the recombinant lentiviral vector used in the present invention can regulate the expression of a gene loaded thereto by a promoter.
  • the promoter may be a cytomegalovirus (CMV), respiratory syncytial virus (RSV), human elongation factor-1 alpha (EF-1 ⁇ ) or a tetracycline response elements (TRE) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • EF-1 ⁇ human elongation factor-1 alpha
  • TRE tetracycline response elements
  • the recombinant lentiviral vector may regulate the expression of BDNF, TRAIL and CD proteins by one or two or more promoters.
  • the promoter is operably linked to a gene encoding a protein to be expressed.
  • the BDNF, TRAIL and/or CD protein may be preferably linked to a TRE promoter. If the TRE promoter is not used and other types of promoters are used, the doubling time increases as the passage passes, and the expression of foreign proteins significantly decreases as the passage passes, and the cell morphology is changed. I did.
  • the TRE promoter may activate transcription of a gene linked to a promoter by a tTA (tetracycline transactivator) protein.
  • tTA tetracycline transactivator
  • the tTA protein binds to the TRE promoter and activates transcription in the absence of tetracycline or doxycycline.
  • the tTA protein cannot bind to the TRE promoter and thus cannot activate transcription.
  • expression of BDNF, TRAIL and/or CD proteins can be regulated.
  • operably linked means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide such that it can exert its function. That is, the fact that a gene encoding a specific protein is operably linked to a promoter means that the gene can be transcribed into mRNA by the promoter and translated into a protein.
  • the "recombinant lentivirus” comprises the steps of transforming host cells with the lentiviral vector, packaging plasmid, and envelope plasmid of the present invention; And separating the lentivirus from the transformed host cell.
  • packaging plasmid and "envelope plasmid” are plasmids loaded with a gene encoding a protein.
  • these plasmids can provide the necessary helper constructs (eg, plasmids or isolated nucleic acids) to produce the lentivirus.
  • helper constructs eg, plasmids or isolated nucleic acids
  • These constructs contain elements useful for making and packaging lentiviral vectors in host cells.
  • structural proteins such as GAG precursors; processing proteins such as pol precursors; Proteases, envelope proteins, and expression and regulatory signals necessary for producing proteins in host cells and producing lentiviral particles, and the like.
  • lentivirus In the production of recombinant lentivirus, Clontech Laboratories' Lenti-X Lentiviral Expression System, or a packaging plasmid provided by Addgene (e.g., pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, etc.) or an envelope plasmid (e.g., pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG, etc.) can be used.
  • Addgene e.g., pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP, etc.
  • an envelope plasmid e.g., pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG, etc.
  • transduction means transferring a gene loaded in a recombinant lentiviral vector to a host cell through viral infection.
  • the host cells are human embryonic stem cells (hES), bone marrow stem cells (BMSC), mesenchymal stem cells (MSC), human neural stem cells, hNSC), limbal stem cells, or oral mucosal epithelial cells.
  • hES human embryonic stem cells
  • BMSC bone marrow stem cells
  • MSC mesenchymal stem cells
  • hNSC human neural stem cells
  • hNSC human neural stem cells
  • hNSC human neural stem cells
  • hNSC human neural stem cells
  • hNSC human neural stem cells
  • hNSC human neural stem cells
  • the host cell may be a mesenchymal stem cell.
  • meenchymal stem cell refers to a multipotent stromal cell capable of differentiating into various cells including bone cells, chondrocytes and adipocytes.
  • Mesenchymal stem cells can be differentiated into cells of specific organs such as bone, cartilage, fat, tendon, nerve tissue, fibroblasts, and muscle cells. These cells can be isolated or purified from adipose tissue, bone marrow, peripheral nerve blood, umbilical cord blood, periosteum, dermis, mesoderm-derived tissue, and the like.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line is a cell line designed to inhibit the expression of foreign genes by treatment with doxycycline in ex vivo, and to express foreign genes by removal of doxycycline. have.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line was cultured for 48 hours in a doxycycline removal medium (DMEM-low glucose, 10 ng/ml FGF, 10% FBS) under conditions of 37° C. and 5% CO 2
  • a doxycycline removal medium DMEM-low glucose, 10 ng/ml FGF, 10% FBS
  • DMEM-low glucose, 10 ng/ml FGF, 10% FBS a doxycycline removal medium
  • the doxycycline treatment medium from 1X10 5 cells, 4000 times or more, 3000 times or more, 1000 times or more, 500 times or more, 100 times or more, 10 times or more, 3 times or more, preferably 3 to 6000 times, 3 To 5000 times, 3 to 4000 times, 3 to 3000 times, 3 to 2000 times, 3 to 1000 times, 3 to 500 times, 3 to 300 times, 3 to 100 times, 30 to 6000 times, 30 to 4000 times, 30 To 3000-fold, 30-1000-fold, 300-6000-fold, 300
  • the immortalized mesenchymal stem cell line expressing the BDNF of the present invention is prepared in a 12 well plate after monoclonal preparation
  • clones expressing more than 1.5 ng/ml of BDNF were primarily selected by the TRE promoter when cultured for 48 hours.
  • BDNF expression was 0.5 ng. Clones not exceeding /ml were secondarily selected, and then final clone candidates were selected after monoclonal preparation once more.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention expresses the surface antigen proteins CD44 and CD105 proteins even during long-term subculture, thereby maintaining the unique characteristics of mesenchymal stem cells. I can.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention does not change the morphology of the mesenchymal stem cells even when passaged for a long time up to 100 days, so that the characteristics of the mesenchymal stem cells are maintained morphologically It can be a cell line.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention stably proliferates even during long-term subculture, and the doubling time is 5 to 25 hours, 5 to 20 hours, 5 to 15 hours, 10 to 25 hours, 10 to 20 hours or 10 As short as to 15 hours, it may be a cell line capable of mass production within a short time. In one embodiment of the present invention, it was confirmed that the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention stably proliferated even when passaged for a long period of 100 days or longer, and that the Doubling time was short, 14 to 25 hours, and an average of 16 hours.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention is frozen and preserved.
  • the cryopreservation may be performed by a method known in the art, and is not particularly limited thereto.
  • the cryopreserved temperature is not particularly limited, but may range from -70 to -200°C.
  • the cell line was stored in a liquid nitrogen tank, and the cryopreserved state was maintained in a subsequent step.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention is produced, including the step of irradiating radiation before being used as a cell therapy administered to the human body in order to suppress cell proliferation that occurs when introducing an immortalized gene for mass production.
  • the term "irradiation” refers to a mesenchymal irradiated mesenchymal using the principle that the radiation emitted from a radiation source acts on the highly sensitive DNA of mesenchymal stem cells and directly causes effective ionization, thereby cutting the DNA chain. Stem cells lose their ability to proliferate, but are characterized by maintaining the expression of the introduced therapeutic gene during the survival period.
  • radiation may be used without limitation in types such as gamma rays, beta rays, neutron rays, X-rays, electron rays, etc., as long as the radiation can inhibit proliferation of mesenchymal stem cells.
  • the "irradiation dose” of the radiation refers to the amount of positive ion or electron energy generated by the movement of radiation such as X-rays or gamma rays in the air at a certain place. Accordingly, the irradiation dose represents a difference in the dose absorbed by an actual subject depending on the type of irradiation device, the irradiated environment, and the exposure time. Accordingly, the dose of radiation irradiated in the present invention was measured based on “absorption dose”, which is a unit representing the degree to which the energy of radiation is absorbed by the medium to the object. That is, in the present invention, the range was measured by the amount of radiation energy absorbed by the immortalized stem cell line.
  • the BM102 and BM01A cell lines into which BDNF was introduced as the immortalized stem cell line, and the BM03 cell line into which TRAIL and CD were introduced were subjected to a radiation irradiation test, and as a result, radiation above a specific absorbed dose
  • the minimum absorbed dose that the immortalized stem cell line can be used as a cell therapy was measured.
  • the absorbed dose in the present invention may be in a range that exceeds at least 80Gy based on the stem cell line into which the radiation has been absorbed, and preferably 81Gy, 82Gy, 83Gy, 84Gy, 85Gy, 86Gy, 87Gy, 88Gy, 89Gy, 90Gy It may be in the range exceeding, more preferably in the range of 80Gy to 400Gy absorbed dose. However, even when irradiated with an absorbed dose exceeding the above range, it was confirmed that the expression of foreign proteins was maintained without proliferation of stem cells.
  • the upper limit of the absorbed dose confirmed above is only a range measured in an experiment, and does not mean that the upper limit is particularly limited.
  • the cell line of the present invention was suitable for use as a clinical sample even when irradiated with radiation of 500 Gy or more in terms of the irradiation dose.
  • the range of the absorbed dose absorbed by the stem cell line satisfies the following range.
  • the irradiation dose is 0 to 100 Gy, 90 to 110% of the irradiation dose;
  • the irradiation dose is 200Gy or more, 60 ⁇ 110% of the irradiation dose.
  • the immortalized stem cell line of the present invention did not form colonies and increased the number of cells, and the amount of expression of the introduced foreign gene was maintained above a certain level. This is the result of confirming the safety of a stem cell line produced to enable mass production by introducing an immortalized gene.
  • the mesenchymal stem cell line produced by the above production process includes a tetracycline response elements (TRE) promoter gene and a gene encoding a brain-derived neurotrophic factor (BDNF) protein.
  • TRE tetracycline response elements
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • the cell line is a mesenchymal stem cell line cultured by removing doxycycline compared to a mesenchymal stem cell line cultured by treatment with doxycycline in ex vivo .
  • An immortalized mesenchymal stem cell line in which the expression pattern is shown as follows is provided:
  • the immortalized mesenchymal stem cell line is an immortalized mesenchymal stem cell line in which BDNF expression is suppressed by treatment with doxycycline in ex vivo, and BDNF is expressed by removal of doxycycline, according to the presence or absence of BDNF expression. (transcriptome) can be changed.
  • RNA means the sum of all expressed RNAs.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention may include the following changes in RNA compared to before and after treatment with doxycycline.
  • the immortalized mesenchymal stem cell line when the immortalized mesenchymal stem cell line is proliferated in a medium to which doxycycline is added, when doxycycline is removed, BDNF is overexpressed, and the group consisting of ANGPTL4, ANGPT1, CEND1, NFASC, GRAP2 and TRIM6 It was confirmed that the expression of any one or more genes selected from was increased, and the expression of the IL2RB, IL6, IL1B or PTGS2 gene was decreased (FIG. 10A).
  • ANGPLT4 angiopoietin like 4
  • ANGPT1 angiopoiein 1
  • IL2RB interleukin 2 receptor subunit beta
  • IL6 interleukin 6
  • IL1B interleukin 1 beta
  • PTGS2 -endoperoxidase synthase 2 is associated with inflammation
  • CEND1 cell cycle and neuronal differentiation 1
  • NFASC neuroofascin
  • GRB2-related adapter protein 2 GRAP2 and tripartite motif containg
  • the expression level of HLF, ROR2, or ICAM1 gene is reduced, CEBPB, EGR2, BMP8A, It was additionally confirmed that the expression levels of the BEX2, KLF4, TNFSF15, PTBP3 or IGFBP2 genes were reduced (FIG. 10B).
  • HLF HLF
  • PAR bZIP transcription factor ROR2 (Receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2)
  • ICAM1 Intracellular adhesion molecule 1
  • CEBPB CCAAT/enhancer binding protein beta
  • EGR2 early growth receptor 2, BMP8A (Bone morphogenetic protein 8a)
  • BEX2 brain expressed X-linked 2
  • KLF4 kruppel like factor 4
  • TNFSF15 TNF superfamily member 15
  • PTBP3 polypyrimidine tract binding protein 3
  • IGFBP2 insulin growth factor binding protein 2
  • the immortalized mesenchymal stem cell line when the immortalized mesenchymal stem cell line is proliferated in a medium to which doxycycline is added and doxycycline is removed, the expression of MiR4444-1, MiR4444-2, and MiR1244-1 increases, and MiR1244- 4, it was additionally confirmed that the expression of MiR319I and MiRLET7D decreased (FIG. 10C).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an immortalized mesenchymal stem cell line prepared by the method as described above.
  • the pharmaceutical composition may be made of a protein expressed from a foreign gene introduced into an immortalized mesenchymal stem cell line as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier is commonly used in the manufacture of drugs, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrroly. Money, cellulose, water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives, and combinations thereof.
  • a pharmaceutically acceptable additive selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweetening agents, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives, and combinations thereof.
  • the carrier may be included in an amount of about 1% to about 99.99% by weight, preferably about 90% to about 99.99% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition of the present invention, and the pharmaceutically acceptable additive is about 0.1 It may be included in weight percent to about 20 weight percent.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in a unit dosage form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and excipient according to a conventional method, or may be prepared by placing it in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may further include a dispersant or a stabilizer.
  • the proliferation rate of C6 cells increases in proportion to the number of BM102 cell lines, so that the BM102 cell line can be used as a cell therapy. It was confirmed that the BDNF can be stably mass-produced to the extent possible, and the BM102 cell line stably expressing BDNF can be used as a cell therapy agent to protect or treat nerve cells (FIG. 22).
  • the BM102 cell line did not have the ability to transform the cells and had no tumorigenicity in vitro (FIG. 21 ).
  • the immortalized mesenchymal stem cell line of the present invention has no tumorigenicity despite being a transformed cell into which BDNF and immortalization genes are introduced, and can exhibit a neuroprotective effect through expression of BDNF, so various central nerves It can be used safely in the treatment of disorders.
  • the neurological diseases include Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), cerebral infarction, chronic brain injury, ischemic brain disease, spinal cord injury, Huntington's disease (HD), Rett's disease (RD), stroke, multiple sclerosis, traumatic brain injury, neonatal hypoxic ischemic encephalopathy, and erectile dysfunction. have.
  • AD Alzheimer's disease
  • PD Parkinson's disease
  • ALS Amyotrophic Lateral Sclerosis
  • cerebral infarction chronic brain injury
  • ischemic brain disease spinal cord injury
  • RD Rett's disease
  • stroke multiple sclerosis
  • traumatic brain injury neonatal hypoxic ischemic encephalopathy
  • erectile dysfunction have.
  • the present invention provides a method for preventing or treating neurological diseases as described above, including the step of administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual.
  • the individual may be a mammal, specifically a human.
  • the administration route and dosage of the pharmaceutical composition may be administered to the subject in various methods and amounts depending on the condition of the patient and the presence or absence of side effects, and the optimal administration method and dosage may be selected in an appropriate range by a person skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with other drugs or physiologically active substances known to have a therapeutic effect on the disease to be treated, or may be formulated in the form of a combination formulation with other drugs.
  • examples thereof include subcutaneous, eye, intraperitoneal, intramuscular, oral, rectal, orbital, brain, intracranial, spinal and spinal cavity, ventricle, and meningeal
  • intra-, intranasal, intravenous, and arterial administration including the carotid artery.
  • the administration may be administered once or more, 2 or more times, 3 or more times, 4 or more times, 1 to 4 times or more, and specifically divided into 2 times. In the case of repeated administration, it may be administered at intervals of 12 to 48 hours, 24 to 36 hours, 1 week, 2 weeks to 4 weeks, and specifically at intervals of 24 hours or 1 week or more.
  • the administration may be administered in an amount of 1.0x10 6 to 1.0x10 12 TU per day, specifically 1.0x10 8 to 1.0x10 10 TU per adult.
  • cells in the case of cells, it may be administered in an amount of 1.0x10 5 to 1.0x10 11 cells, specifically 1.0x10 7 to 1.0x10 9 cells per day for adults. If the dosage is large, it can be administered several times a day.
  • the method of making an immortalized stem cell line of the present invention further includes the step of irradiating the stem cell line into which the immortalized gene and the foreign gene have been introduced, and thus, the possibility of abnormal differentiation and proliferation is low, and thus safety is high and treatment Immortalized stem cell lines in which the expression level of foreign proteins that can be used as components is maintained for a long period can be produced.
  • the immortalized stem cell line produced according to the above production method may be usefully used as a pharmaceutical composition for preventing or treating various diseases.
  • FIG. 1 is a graph comparing the cell proliferation rates of MSCs immortalized by c-Myc (STEM24) and MSCs not immortalized (BM-MSC):
  • Y axis accumulated cell population doubling level (PDL).
  • FIG. 2 is a graph comparing the cell proliferation rates of MSCs immortalized and non-immortalized by introducing c-Myc and hTERT:
  • imMSC immortalized MSC
  • MSC unimmortalized MSC
  • Y axis accumulated cell population doubling number.
  • FIG. 3 is a graph showing the expression level of the BDNF protein according to the presence or absence of doxycycline in the clone whose BDNF protein expression level is confirmed,
  • FIG. 3A shows the expression levels of the clones for selecting BM102 and FIG. 3B, respectively.
  • CD44 and CD105 which are unique characteristics of MSCs after genetic manipulation of the BM102 monoclonal cell line, and the expression of the surface antigen proteins of bone marrow-derived MSCs.
  • FIG. 5 is a graph confirming the proliferation rate while long-term culturing cells of immortalized MSCs transduced with a lentivirus containing the BDNF gene:
  • Y axis accumulated cell population doubling level (PDL).
  • 6 is a graph confirming the cell proliferation rate of BM102 with or without doxycycline treatment during long-term culture.
  • Y axis accumulated cell population doubling level (PDL).
  • FIG. 7 is a view confirming that the morphological characteristics of the cells are maintained for each passage of the BM102 cell line according to the presence or absence of doxycycline treatment.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression level of BDNF protein in the BM102 cell line with or without doxycycline treatment.
  • FIG. 9 is a diagram confirming that the gene was introduced into the BM102 cell line.
  • 10A is a diagram showing changes in the transcriptome of genes known to be related to angiogenesis, inflammation, neurogenesis and immune system processes in the BM102 cell line according to the removal of doxycycline.
  • the increased value of the transcript was indicated as a positive value, and the decreased value was indicated as a negative value.
  • 10B is a diagram showing changes in the transcriptome of genes known to be related to cell differentiation, migration, proliferation, and cell death in the BM102 cell line according to the removal of doxycycline.
  • the increased value of the transcript was indicated as a positive value, and the decreased value was indicated as a negative value.
  • 10C is a diagram showing changes in the transcriptome of micro RNA genes in the BM102 cell line according to the removal of doxycycline. The increased value of the transcript was indicated as a positive value, and the decreased value was indicated as a negative value.
  • FIG. 11 shows the results of measuring the number of cells after irradiation with gamma rays on the BDNF-expressing immortalized stem cell line (BM102).
  • BM102 BDNF-expressing immortalized stem cell line
  • BM102 immortalized stem cell line
  • BM102 immortalized stem cell line
  • FIG. 16 shows the results of measuring the number of cells after irradiation with gamma rays on the BDNF-expressing immortalized stem cell line (BM01A).
  • 17 is a result of confirming the change in cell titer through the BDNF expression level after irradiation with gamma rays on the BDNF-expressing immortalized stem cell line (BM01A).
  • 19 is a result of measuring the number of cells after irradiation with high-level gamma rays on an immortalized stem cell line (BM03) expressing TRAIL and CD.
  • BM03 immortalized stem cell line
  • 21 is a graph confirming that there is no tumorigenicity even after genetic manipulation of the BM102 cell line.
  • 22 is a graph confirming the proliferation rate of C6 cells when co-cultured with BM102 cell line and C6 cells.
  • X axis BM102 cell number
  • Y axis Proliferation rate of C6 cells.
  • the present invention comprises the steps of producing a stem cell line into which the immortalized gene is introduced; Introducing a gene encoding a foreign protein into the stem cell line; Cryopreserving the stem cell line; And it relates to a method for manufacturing an immortalized stem cell line comprising the step of irradiating the stem cell line in the frozen state.
  • the immortalization gene is c-Myc and/or hTERT.
  • the foreign protein is selected from growth factors, cytokines or cancer therapeutic proteins, antibodies and chemokine receptors.
  • the immortalized stem cell line is a human embryonic stem cell (hES), a bone marrow stem cell (BMSC), a mesenchymal stem cell (MSC). ), human neural stem cells (hNSC), limbal stem cells, or oral mucosal epithelial cells.
  • hES human embryonic stem cell
  • BMSC bone marrow stem cell
  • MSC mesenchymal stem cell
  • hNSC human neural stem cells
  • limbal stem cells or oral mucosal epithelial cells.
  • the radiation is irradiated so that the absorbed dose to the stem cell line is at least 80 Gy, and more specifically, the absorbed dose is 80 to 140% of the irradiation dose when the irradiation dose is 0 to 100 Gy; When the irradiation dose is 100 to 200 Gy, 80 to 140% of the irradiation dose; And when the irradiation dose is 200Gy or more, the range of 60 to 140% of the irradiation dose is satisfied.
  • the radiation is selected from the group including gamma rays, beta rays, neutron rays, X-rays, and electron rays.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising an immortalized stem cell line produced by the above method.
  • the pharmaceutical composition is derived from the brain-to include an immortalized stem cell line expressing a new management factor (BDNF).
  • BDNF new management factor
  • the pharmaceutical composition has a preventive or therapeutic effect on neurological diseases
  • the neurological diseases are Alzheimer's disease (AD), Parkinson's disease (PD), and Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), cerebral infarction, chronic brain injury, spinal cord injury, Huntington's disease (HD), Rett's disease (RD), ischemic brain disease, stroke and traumatic brain injury , Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy, and multiple sclerosis.
  • the present invention relates to a use of an immortalized stem cell line produced by the above method as a cell therapeutic agent.
  • the present invention relates to a method of treating a disease by administering to an individual the immortalized stem cell line produced by the above method in a therapeutically effective amount.
  • a lentiviral vector containing the immortalization genes c-Myc and/or hTERT was prepared. At this time, in order to use the Tet-off system, a gene construct expressing the tTA protein was inserted together.
  • a pBD lentiviral vector was constructed by replacing the EF promoter with the CMV promoter in the expression cassette of the pWPT vector (Bioneer synthesis).
  • the c-Myc gene SEQ ID NO: 7 was inserted so that expression could be regulated by the CMV promoter.
  • the constructed vector was named pBD-1.
  • the hTERT gene (SEQ ID NO: 8) was inserted into the pBD lentiviral vector so that the expression can be regulated by the CMV promoter.
  • a gene having resistance to geomycin (ZeoR; SEQ ID NO: 12) was inserted so that expression can be regulated by the RSV promoter.
  • the constructed vector was named pBD-2.
  • tTA tetracycline transactivator gene SEQ ID NO: 9
  • Example 1.2 Production of lentivirus containing immortalized genes
  • a lentivirus containing an immortalized gene was produced in the following manner.
  • lenti-X cells (Clontech Laboratories, USA) were cultured in 150 mm dishes using DMEM medium containing 10% fetal calf serum. Meanwhile, the lentiviral vector was extracted and quantified from DH5 ⁇ E. coli cells using the EndoFree Plasmin Maxi Kit (Qiagen, USA).
  • the cells were dispensed into a 150 mm dish to become 1.2 ⁇ 10 7 cells.
  • 12 ⁇ g of lentiviral vector, 12 ⁇ g of psPAX (Addgene; gag-pol expression, packaging plasmid), and 2.4 ⁇ g of pMD.G plasmid (Addgene; VSVG) Expression, envelope plasmid) mixture was transduced into the cells.
  • Lipofectamine (Invitrogen, USA) and Plus Reagent (Invitrogen, USA) were used. 6 hours after transduction, the medium was exchanged with DMEM containing 10% fetal calf serum. After incubating for an additional 48 hours, the supernatant was collected.
  • the obtained supernatant was mixed with a lenti virus concentration kit (Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, USA), and then incubated at 4° C. overnight. This was centrifuged at 4° C. for 2 hours at 4,000 rpm to obtain a virus, which was resuspended in 0.5 ml of DMEM containing no FBS.
  • a lenti virus concentration kit Li-X concentrator, Clontech Laboratories, USA
  • Immortalized MSCs were prepared using the lentivirus containing the immortalized gene produced in Example 1.2.
  • a bone marrow-derived MSC was prepared in the following manner. Specifically, bone marrow aspirate was obtained from the iliac crest of a healthy donor. This was mixed with 20 IU/ml of heparin in a sterile container to inhibit coagulation. The bone marrow mixture was centrifuged for 7 minutes at 4° C. 739 G, and then the supernatant was removed and mixed with 10 times the volume of sterilized water. This was centrifuged again under the same conditions to obtain a cell pellet.
  • the obtained pellet was suspended in DMEM-low glucose (11885-084, Gibco, USA) medium containing 20% fetal calf serum and 5 ng/ml b-FGF (100-18B, Peprotech, USA) in a culture flask. It was busy. This was cultured for 24 to 48 hours at 37° C. 5% CO 2 , and then replaced with a new medium. It was subcultured while replacing it with a new medium every 3 to 4 days, and after 2 weeks of culture, the presence of MSC was confirmed using a fluorescence cytometer.
  • the MSC prepared above with the pBD-1 lentivirus produced in Example 1.2 was infected with 100 MOI using Retronectin (Clontech Laboratories, USA).
  • Retronectin Retronectin (Clontech Laboratories, USA).
  • FIG. 1 MSC cells infected with a lentivirus containing the immortalizing gene c-Myc were immortalized by the immortalizing gene, resulting in an increased proliferation rate based on 30 days of culture after infection, and up to 50 days. High growth rate was maintained.
  • the cell proliferation rate rapidly decreased after 20 days of culture.
  • cells infected by the lentivirus containing c-Myc were infected with a pBD-2 lentiviral vector containing hTERT at 100 MOI. After infection, cells infected with pBD-2 lentivirus were selected by adding 500 ⁇ g/ml of geomycin to the culture medium of the stabilized cells.
  • MSC cells infected with a lentivirus containing both c-Myc and hTERT which are immortalization genes, maintained a high cell proliferation rate even after 120 days of culture.
  • the cell proliferation rate rapidly decreased after 40 days of culture.
  • the pBD-1 and/or pBD-2-infected cells were infected with a pBD-3 lentiviral vector containing tTA at 100 MOI. After infection, pBD-3 lentivirus-infected cells were selected by adding 1 ⁇ g/ml puromycin to the culture medium of the stabilized cells.
  • Example 2.1 Construction of a lentivirus containing the BDNF gene
  • the BDNF gene (SEQ ID NO: 2) was inserted into the pBD lentiviral vector prepared in Example 1.1.
  • a lentiviral vector was prepared so that the BDNF gene was expressed using the CMV promoter and the TRE promoter, respectively, and MSCs expressing the BDNF gene were prepared using this.
  • MSCs expressing BDNF changed morphologically during long-term subculture, and the expression rate of BNDF decreased as subculture proceeded.
  • the BNDF gene was inserted into each pBD vector so that expression was regulated by the TRE promoter.
  • the TRE promoter can regulate the expression of a gene linked to the promoter according to the presence or absence of doxycycline.
  • a lentivirus was produced in the same manner as described in Example 1.2.
  • the produced lentivirus was prepared at a concentration of 4.7x10 6 copies/ml (pBD-4) and 1.4x10 12 copies/ml (pBD-5), respectively.
  • Example 2.2 Construction of lentivirus containing TRAIL and CD genes
  • a lentivirus containing TRAIL and CD genes was produced according to the contents described in Korean Patent Registration No. 10-1985271.
  • a TRAIL gene SEQ ID NO: 4
  • a CD gene SEQ ID NO: 6
  • IRES internal ribosome entry site
  • the TRE promoter may control the expression of a gene linked to the promoter according to the presence or absence of doxycycline.
  • the vector into which the TRAIL and CD were inserted was named pBD-6, and using this, a lentivirus was produced in the same manner as described in Example 1.
  • the produced lentivirus was prepared at a concentration of 7.6x10 8 TU/ml.
  • Example 3.1 Construction of MSC transfected with a lentivirus containing the BDNF gene
  • the immortalized MSC prepared in Example 1.3 was infected with a lentivirus containing the BDNF gene produced in Example 2.1 at an MOI of 100 to prepare cells expressing the BDNF gene.
  • the lentivirus was used as the one produced by the pBD-1 vector into which c-Myc was introduced among the immortalized genes.
  • the transduced cells were cultured in a medium to which 2 ⁇ g/ml of doxycycline (doxycycline, 631311, Clontech, USA) was added, thereby inhibiting the expression of BDNF protein during culture.
  • the cells were cultured to form colonies using a clone select imager. After assigning a number for each well inoculated with cells in a 96 well plate, the presence or absence of BDNF protein expression was confirmed with a human BDNF DuoSet ELISA kit (R&D systems, DY248, USA) among 200 clones that confirmed colony formation.
  • a human BDNF DuoSet ELISA kit R&D systems, DY248, USA
  • immortalized MSCs produced by lentivirus into which pBD-4 was introduced are #10, #22, #28, #65, #110, which express a BDNF protein of 1.5 ng/ml or more after removal of doxycycline.
  • #116, #126, #596, #669, and #741 clones were selected. Thereafter, clones #28 and #110 expressing the BDNF protein at 0.5 ng/ml or less during doxycycline treatment were selected (FIG. 3A).
  • the #28 clone showing a stable proliferation pattern and having the best BDNF protein expression level was named BM102 cell line and deposited as a patent strain (Korea Research Institute of Biotechnology, KCTC13876BP).
  • an immortalized MSC infected with a lentivirus into which pBD-1 and pBD-2 were introduced was prepared.
  • the method for manufacturing the cell line was manufactured according to the method described in Korean Patent Registration No. 10-2074336. After virus infection, the cells were stabilized, and then 500 ⁇ g/ml of G418 was added to the culture medium to select cells infected with pBD-5 lentivirus into which both c-Myc and hTERT genes were introduced. The selected cells were cultured in a medium to which 1 ⁇ g/ml of doxycycline (doxycycline, 631311, Clontech, USA) was added, thereby inhibiting the expression of BDNF protein during culture.
  • doxycycline doxycycline, 631311, Clontech, USA
  • the selected cells were cultured to form colonies. #10, #12, #14, #18, #20, expressing BDNF protein among clones #1 to #50 formed by confirming the presence or absence of BDNF protein expression with a human BDNF DuoSet ELISA kit (R&D systems, DY248, USA) Clones #22, #23, #26, #29, and #41 were selected, and clones #14, #22, #23, and #41 that did not express BDNF protein upon treatment with doxycycline were re-selected (FIG. 3B). The cell proliferation ability was confirmed by the same method, and the #41 clone showing a stable proliferation pattern and the highest expression level was named BM-01A cell line.
  • the immortalized MSC prepared in Example 1-3 was infected with a lentivirus containing the TRAIL and CD genes produced in Example 2-2.
  • TRAIL and CD genes were prepared. Infection was carried out in the same manner as described in Examples 1-3. After infection, 1 ⁇ g/ml of doxycycline (doxycycline, 631311, Clontech, USA) was added to the culture medium of the stabilized cells, and the cells were cultured in a state in which the expression of TRAIL and CD was suppressed. After the cells were stabilized, the cells were cultured for 72 hours in a culture medium from which doxycycline was removed to induce the expression of TRAIL and CD, and FACS was performed on the cells to select cells expressing TRAIL on the cell surface.
  • doxycycline doxycycline, 631311, Clontech, USA
  • FACS buffer PBS containing 2% fetal bovine serum
  • FACS LSRFortessa, BD biosciences, USA
  • Monoclonal cells were cultured from the formed colonies to establish a cell line, which was named BM-03.
  • a radiation irradiation step was additionally performed to maintain the expression level of the therapeutic protein without the cells proliferating.
  • the irradiation (absorption) dose was confirmed.
  • the immortalized MSC cell line formulated and stored frozen in a liquid nitrogen tank was transported using a mobile cartridge prepared for irradiation. At this time, the frozen state was maintained using dry ice.
  • the frozen immortalized MSC cell line was irradiated with radiation.
  • radiation irradiation a known method and device was used, and for gamma rays, a low-level gamma-ray irradiation device or a high-level gamma-ray irradiation device (MDS Nordion, Canada) was used, and for X-rays, X-RAD 320 X-RAY IRRADIATOR (Seoul National University fusion Institute of Science and Technology) or RS1800Q (Rad Source technologies, Inc) was used. Even during irradiation, the temperature inside the moving cartridge was maintained at a temperature that could continue to be frozen by dry ice, and the MSC cell line after irradiation was again stored in a liquid nitrogen tank.
  • the radiation absorbed dose was measured for each dose using a separate alanine city meter, and the absorbed dose of the immortalized MSC cell line could be calculated from the result.
  • the irradiated immortalized MSC cell line was thawed for about 2 minutes in a 37°C constant temperature water bath for 3 vials per sample, and then 9 mL of PBS was added and centrifuged for 5 minutes at 4°C and 1,500 rpm. After removing the supernatant, DMEM-low glucose glucose (11885-084, Gibco) containing 10% FBS (16000-044, Gibco, USA) and 10 ng/mL b-FGF (100-18B, Peprotech, USA) , USA) was suspended in a medium. The number of suspended cells was measured with a hematocytometer, and then the experiment was conducted.
  • the expression of the surface antigen protein of the bone marrow-derived MSC before the gene insertion and the BM102 cell line into which the BDNF gene was inserted was analyzed using a human MSC assay kit (Stemflow TM , Cat No562245, BD). The experiment was performed according to the manual included in each kit, and the experimental results are shown in FIG. 4.
  • the BM102 cell line proved that the expression of the surface antigen proteins CD44 and CD105, which are unique characteristics of MSC, is similar to that of bone marrow-derived MSC even after undergoing genetic manipulation to express BDNF.
  • the BM102 cell line stably proliferated for a period of more than 100 days.
  • FIG. 6 it was confirmed that the BM102 cell line cultured for up to 80 days without the addition of doxycycline gradually decreased the cell proliferation rate compared to the BM102 cell line cultured with the addition of doxycycline.
  • Example 3.1 In order to confirm the morphological modification according to the passage of the BM102 cell line established in Experimental Example 2, the proliferation rate of the BM102 cell line was checked and a photograph of the cells was taken under a microscope, and the morphology of the BM102 cell was shown in FIG. 7.
  • the BM102 cell line did not change morphologically even after long-term culture for up to 100 days, and through this, it was found that a phenomenon such as cell aging due to long-term culture was not observed.
  • the BM102 cell line changed morphologically due to the expression of BDNF. This means that the expression of the BDNF protein affects the BM102 cells, thereby changing the cell properties.
  • BDNF protein in the BM102 cells established in Example 3.1. was confirmed by ELISA analysis. Specifically, the expression level of the BDNF protein was confirmed with a human BDNF DuoSet ELISA kit. The experiment was performed according to the manual included in each kit. The expression level of the BDNF protein induced for 48 hours from about 1 ⁇ 10 5 cells in a medium from which doxycycline was removed and a medium from which doxycycline was not removed is shown in FIG. 8 below.
  • Target protein Expression level BDNF 740 ng/10 5 cells
  • PCR was performed to confirm whether the gene was introduced into the BM102 cell line prepared in Example 3.1. Specifically, the BM102 cell line was transferred to a 15 ml tube containing 9 ml PBS, and then cell down at 1,500 rpm for 5 minutes. After completely removing the PBS, the pellet was suspended in 200 ⁇ l PBS in a 1.5 ml tube and then transferred. Thereafter, gDNA was prepared using NucleoSpin® Tissue (MN, 740952.250), a mixture was prepared as shown in Table 2 below, and PCR was performed in the steps of Table 3 below. At this time, 100 ng of BM102 plasmid DNA was added as a positive control and 1 ⁇ l of purified water was added as a negative control. The BM102 plasmid DNA can be separated and purified according to the method described in Korean Patent Application Publication No. 2017-0093748.
  • a 1% (v/v) agarose gel was placed in an electrophoresis kit. 10 ⁇ l of DNA Size Marker was loaded into the first well, and 10 ⁇ l of each was loaded from the next well in the order of a negative control, a positive control, and three BM102 samples. Thereafter, electrophoresis was performed at 100 V for 20 minutes, and a gel photograph was taken and the results are shown in FIG. 9. As a result, as shown in FIG. 9, all three BM102 cell lines were identified as PCR products of the same size (0.6 kb) as the positive control group.
  • transcriptome sequencing was performed to confirm the change in gene expression due to BDNF expression depending on whether or not doxycycline was treated.
  • the nucleotide sequence analysis was requested by Macrogen to obtain the results.
  • the test was performed according to NovaSeq 6000 System User Guide Document #1000000019358 v02 (illumina) using the NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit (illumina), and analysis was performed through the NovaSeq sequencer and 1000000019358 v02 software (illumina).
  • Transcripts that change according to the removal of doxycycline in the BM102 cell line are listed in FIGS. 10A, 10B and 10C.
  • ANGPTL4, ANGPT1, CEND1, NFASC, GRAP2 and TRIM6 genes which are known to be related to angiogenesis, inflammation, neurogenesis, and immune system processes in BM102 cell line, increases according to the removal of doxycycline, and IL2RB , IL6, IL1B and PTGS2 expression was confirmed to decrease.
  • HLF, ROR2, and ICAM1 genes known to be related to cell differentiation, migration, and proliferation in the BM102 cell line decreased according to the removal of doxycycline, and CEBPB, EGR2, BMP8A, and BEX2 known to be related to apoptosis.
  • KLF4, TNFSF15, PTBP3 and IGFBP2 gene expression was confirmed to be reduced.
  • a radiation irradiation test was performed in the same manner as in Example 4 using gamma rays and X-rays, and gamma rays and X-rays were used as the types of radiation.
  • gamma rays were first irradiated with an irradiation dose of 80, 100, 120, and 140 Gy, and then the absorbed dose of the BM102 cell line, colony formation, cell number and titer were checked, and gamma rays were secondarily irradiated with an irradiation dose of 200, 300 Gy. After irradiation, the absorbed dose, colony formation, cell number and titer were each confirmed by the same method.
  • the absorbed dose, colony formation, and potency were confirmed by irradiating each with an irradiation dose of 100, 200, 300, 400, 500Gy first using X-rays, and shown in Table 5 and FIG. 100, 200, 300, 400, and 500Gy were respectively irradiated, and the results are shown in Table 6 and FIG. 12 below.
  • gamma-rays and X-rays were irradiated in the above ranges, respectively, in order to determine whether colonies were formed or not, so that 5x10 5 cells per well in a 6-well plate were dispensed into 12 wells per vial for a total of 2 6-wells. It was dispensed on the plate. The plate was shaken to spread the cells evenly, and the medium was exchanged every 3 or 4 days in a 37°C, 5% CO2 incubator, and the colony was observed with the naked eye using a microscope.
  • the absorbed dose was measured to be 83.1 Gy when irradiated with 100 Gy. At this time, no colonies were formed. That is, even when irradiated with the same irradiation dose, there may be a difference in the absorbed dose, and if the dose absorbed to the cell is 62.5 Gy, it is not suitable for use as a clinical sample, but it can be confirmed that it can be used if it is 83.1 Gy there was. Therefore, it can be predicted that the cell line of the present invention can be used as a clinical sample when radiation in a range exceeding about 80 Gy is absorbed based on the absorbed dose.
  • a cell number measurement test was performed using the inoculated cells.
  • the number of cells was measured on days 14, 28, 42, 56, and 70, respectively, after the day the cell line was thawed. As shown in Table 8 and Fig. 12, 300, It was confirmed that there were no additional proliferating cells during all periods observed in each of the 400 and 500 Gy irradiation groups.
  • the plate was shaken to spread the cells evenly and incubated for 48 hours or 60 hours in a 37°C, 5% CO2 incubator.
  • BDNF BDNF assay kit
  • the irradiation test was performed on the BM01A cell line.
  • the type of radiation to be irradiated was gamma rays, and after first irradiation with gamma rays of 90, 100, 110, and 120 Gy, the absorbed dose, colony formation, cell number and titer were checked, and the irradiation dose 140, 160, 180 Gy After irradiating the second gamma ray, the absorbed dose, colony formation, cell number, and titer were confirmed by the same method. The results are shown in Table 9 below.
  • the BM01A cell line was dispensed at a number of 3 ⁇ 10 5 cells/well in a 6-well plate, and cultured in the same manner as in Experimental Example 7.1, and then colony formation in the medium was confirmed.
  • BM03 cell line which is an immortalized stem cell expressing TRAIL and CD
  • an irradiation test was performed in the same manner as in Experimental Example 7.
  • the irradiation test of the BM03 strain utilized gamma rays, and the results were confirmed by irradiating low-level and high-level gamma rays, respectively.
  • BM03 BM03-P005, 1x10 7 cells/ml/vial
  • irradiation doses 0, 10, 20, 30, 40 , 50, 60, and 70Gy, respectively, and the absorbed dose, colony formation, cell number and titer were confirmed as shown in Table 11 below.
  • a high-level gamma-ray irradiation test was conducted, and after the first test with high-level gamma rays of 0. 30, 40, 60, and 60Gy, a second test was conducted with a dose of 0. 100, 110, 120, and 130Gy.
  • the absorbed dose and colony formation were measured.
  • BM03 (1x10 7 cells/ml/vial) frozen after filling into a vial was conducted using a high-level irradiator of the Advanced Radiation Research Institute of Atomic Energy Research Institute, and the absorbed dose in each test was measured using an Alanine doxymeter. The results were confirmed as shown in Table 12 below.
  • the minimum absorbed dose should be 60 Gy or more.
  • primers that can identify the inserted therapeutic gene TRAIL and CD::UPRT were selected, and the expression of the inserted gene was quantitatively measured through qRT-PCR reaction.
  • glial cells C6, which are known to grow well by BDNF, were co-cultured with the BM102 cell line, and then the increase in the proliferation rate of C6 cells was confirmed in a cell number dependent manner.
  • C6 cells and BM102 cell lines were co-cultured using a trans-well. After inoculating 2x10 3 C6 cells into a 96-well plate in the same manner, the number of co-cultured cells was varied by diluting BM102 cell lines by 1/2 from 1x10 4 cells and inoculating them into a trans-well. After co-culture for 24 hours, the proliferation rate of C6 cells by the BDNF protein expressed in the BM102 cell line was quantified by measuring the absorbance by treating the C6 cell medium with the MTS solution.
  • the BM102 cell line can stably mass-produce BDNF so that it can be used as a cell therapy, and the BM102 cell line stably expressing BDNF can be used as a cell therapy to protect or treat nerve cells.

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Abstract

본 발명은 불사화 유전자가 도입된 줄기세포주로서, 세포 치료제로 사용 가능하도록 증식이 억제됨과 동시에 도입 유전자의 발현능이 유지되는 특징을 가지는 불사화된 줄기세포주의 제조 방법 및 이의 용도에 대한 것으로, 본 발명의 상기 불사화된 줄기세포주는 방사선을 조사하는 과정을 거침으로 인하여, 세포의 증식이 이루어지지 않으면서도 도입된 외래 단백질의 발현이 일정 수준이상 유지되는 특징을 가지므로, 다양한 세포 치료제 등 임상 시료로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

불사화된 줄기세포주의 제조 방법 및 이의 용도
본 발명은 세포 치료제로 사용 가능하도록 증식이 억제됨과 동시에, 도입된 유전자에 대한 발현능이 유지되는 불사화된 줄기세포주를 제조하는 방법 및 이의 용도에 대한 것이다.
전 세계적으로 세포를 이용한 치료 방법이 개발되고 있으며, 특히 성체줄기세포를 이용한 세포치료제에 대해 많은 연구가 진행 중이다. 성체줄기세포인 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem cell; MSC)는 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아 세포 등으로 분화할 수 있는 다능성(multipotent) 세포이다. 상기 MSC는 골수, 제대혈, 지방 등 다양한 성체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증 또는 손상부위로 이동하는 특이성이 있어, 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있다. 또한, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연살해 세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하거나 활성화시켜, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니라, MSC는 시험관 내(in vitro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 특성으로 인해 MSC를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고, 세포 치료제로서 임상에 사용할 수 있는 등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째, MSC 의 증식에는 한계가 있어, 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있어, 생산시 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋째, MSC만을 이용할 경우 치료 효과가 높지 않다. 마지막으로, 인체에 주입된 MSC가 체내에서 암세포로 될 가능성도 있다.
한편, 대한민국 등록특허 제1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서 전처리 과정을 단축하여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있으나, 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라서, 세포 치료제로 사용할 수 있는 안전하고 효과적인 중간엽줄기세포에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 대량 생산이 가능하고, 장기 배양에도 동일한 효과를 유지할 수 있는 줄기세포치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, 본 발명의 불사화 유전자 및 외래 유전자가 도입된 줄기세포에 특정 범위의 방사선을 조사할 경우, 도입된 외래 유전자에 의한 단백질의 발현은 안정적으로 유지되나, 줄기세포의 증식은 억제되는 사실을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 목적은 불사화 유전자 및 외래 유전자가 도입된 불사화된 줄기세포주에, 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법 및 제작된 불사화된 줄기세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 제작된 불사화된 줄기세포를 이용한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 불사화 유전자를 도입한 줄기세포주를 제작하는 단계; 상기 줄기세포주에 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계; 상기 줄기세포주를 동결 보존하는 단계; 및 상기 동결된 상태의 줄기세포주에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주를 세포 치료제로 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
일 측면에서, 본 발명은
불사화 유전자를 도입한 줄기세포주를 제작하는 단계;
상기 줄기세포주에 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계;
상기 줄기세포주를 동결 보존하는 단계; 및
상기 동결된 상태의 줄기세포주에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는 불사화된 줄기세포주의 제작 방법을 제공한다.
본 발명의 불사화된 줄기세포주는 불사화 유전자를 도입하여 장기 계대배양에도 줄기세포의 특성을 유지할 수 있고, 대량 생산에도 동일한 품질을 유지함으로써 안정적으로 대량 생산이 가능하다는 특징을 가진다.
특히, 상기 제작 과정 중, 동결보존된 줄기세포주에 방사선을 조사하는 단계를 도입하여, 불사화 유전자가 도입된 줄기 세포가 증식을 하지 않으면서도, 도입된 단백질을 장기간동안 안정적으로 발현시킬 수 있어, 세포치료제로서 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명의 불사화된 줄기세포주는 하기의 방법으로 제조될 수 있다.
1) 숙주세포에 hTERT 및/또는 c-Myc 유전자와 같은 불사화 유전자를 도입하는 단계;
2) 상기 불사화 유전자가 도입된 숙주세포에 외래유전자를 도입하는 단계.
상기 1)단계 및 2)단계에서 유전자의 도입 방법은 플라스미드, 레트로바이러스, 렌티바이러스, AAV 등의 다양한 방법이 사용될 수 있고, 렌티바이러스를 이용하는 경우 외래유전자를 포함하는 렌티바이러스 제조 시 외래유전자의 발현을 조절하기 위한 특정 프로모터가 포함된 벡터를 추가적으로 사용할 수 있으며, 이 때, 상기 프로모터를 포함하는 유전자를 추가로 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 일 실시예에서는, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 유전자를 도입하였고, 이때 독시사이클린 또는 테트라사이클린으로 발현이 조절되는 TRE promoter를 이용하였으며, 이를 위해 세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 추가로 감염시켰다.
본 발명의 줄기세포는 불사화 유전자가 도입되어, 불사화된 것이다. 상기 1) 단계와 같이, 본 발명에서 “불사화 유전자”는 hTERT 및/또는 c-Myc 유전자일 수 있으나, 불사화 유전자로서 도입 가능한 다른 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "c-Myc"란, 사람의 8번 염색체에 위치한 전사인자를 코딩하는 유전자를 의미한다. 세포 내 유전자 약 15%의 발현을 조절하는 c-Myc에 코딩된 단백질은 전사 조절인자(transcription factor)로, 상기 전사 조절 인자가 과발현될 경우 세포활성 및 증식이 촉진된다. 본 발명에서 “hTERT”는 텔로머라아제 역전사효소를 의미한다. 상기 텔로머라아제 역전사효소는 텔로머라아제의 RNA 주형을 상보적 DNA를 합성하여, RNA-DNA 하이브리드 형태가 이룬 다음, 이중고리의 DNA가 되어 숙주세포의 염색체에 삽입된다. 그러면 상기 숙주세포는 텔로미어 대신 텔로머라아제가 염색체 말단소립에 붙어 텔로미어를 계속 생성하게 되어 불사화된 세포를 만들 수 있다.
또한, 상기 단계에서 추가로 포함될 수 있는 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로, 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
본 명세서에서 상기 “외래 유전자”는, 줄기세포 내에 도입되어, 외래 단백질을 암호화할 수 있는 유전자를 말한다. 본 발명의 상기 불사화된 줄기세포주는 도입된 외래유전자에 의해 암호화되는 단백질의 발현능을 유지하는 특징을 가진다. 또한, 상기 외래 단백질은 그 종류에 제한되는 것은 아니며, 줄기세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 상기 외래 단백질은 질환에 대한 치료 효과를 가지는 단백질일 수 있다.
보다 구체적으로 상기 외래 단백질은 간세포 성장인자(HGF), 혈관 상피 성장인자(VEGF), 신경 성장인자(NGF), 뇌 유래 신경 성장인자(BDNF), 섬유아세포 성장인자(FGF) 뇌 유래 신경영양인자(BDNF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 형질전환 성장인자(TGF), 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 뼈 유래 성장인자(BMP), 콜로니 자극인자(CSF), 표피 성장 인자(EGF), 각질세포 성장 인자(Keratinocyte growth factor, KGF) 와 같은 성장인자, IL-2, IL-4, TNF, IF-γ, G-CSF, GM-CSF와 같은 사이토카인, TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL) 및/또는 시토신 디아미네이즈(CD)와 같은 암 치료 유전자, 또는 암 조직을 표적화할 수 있는 특정 항원을 인지하는 항체, CAR (chimeric antigen receptor) 형태의 항체 (mono or bi, tri-specific)뿐 아니라, 세포 이동을 촉진시키는 케모카인 수용체 등이 제한 없이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 BDNF, TRAIL 및/또는 CD를 도입한 불사화된 줄기세포주를 제작하였으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 불사화된 줄기세포주는 BDNF를 발현하는 것일 수 있다. "뇌유래-신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)" 단백질은 뇌에 가장 풍부하게 분포되어 있는 뉴로트로핀(neurotrophin)이다. 이는 신경원(neuron)의 성장을 촉진하고, 신경전달물질의 합성, 대사, 유리 및 신경원의 활성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한, BDNF 단백질은 우울증 환자의 전두엽 피질 또는 해마에서 감소되고, 이의 농도를 증가시켜 우울증을 치료할 수 있음이 알려져 있다.
본 발명에 따른 BDNF 단백질은 인간 유래의 단백질일 수 있다. 상기 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 BDNF 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 BDNF 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 BDNF 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 염기 서열과 약 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 불사화된 줄기세포주는 TRAIL 및 CD를 발현하는 것 일 수 있다. "TNF-연관 세포사멸-유도 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand, 이하 TRAIL)" 단백질은 TNF 패밀리 중에 제2형 트랜스멤브레인 사이토카인에 속한다. 상기 TRAIL은 자살 유전자 중 하나로써, 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 구체적으로, TRAIL은 세포 표면에 존재하는 세포사멸 수용체-4(DR-4), DR-5, 데코이(decoy) 수용체 또는 데코이 수용체-2와 결합하여 세포사멸 신호 전달계를 활성화시킨다. TRAIL은 정상 세포에 대해서는 독성이 없고, 암세포에서만 특이적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 따른 TRAIL 단백질은 인간 유래의 단백질일 수 있다. 상기 TRAIL 단백질은 세 개의 수용체에 결합할 수 있는 호모트리머(homotrimer) 형태로 존재한다. 본 발명의 TRAIL 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TRAIL 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 TRAIL 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 TRAIL 단백질을 코딩하는 염기 서열은 서열번호 4의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "CD 단백질"은 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase) 단백질로서, "CD와 UPRT(우라실 포스포리보실기 전이효소(uracil phosphoribosyltransferase))가 결합된 융합단백질"의 형태일 수 있으며, 본 명세서에서 "CD 단백질"은 "CD::UPRT"와 혼용될 수 있다. 본 발명에 따른 CD 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 CDase를 코딩하는 FCY1 유전자와, N-말단으로부터 35개의 아미노산이 결실된 UPRTase를 코딩하는 FUR1△105 유전자를 융합하여 코돈 최적화(codon-optimization)된 서열이다. 상기 서열은 미국 특허 제5,338,678호, 국제특허공개 제WO 96/16183호 및 국제특허공개 제WO 99/54481호에 기재된 것일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 상기CD 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 CD 단백질은 서열번호 5의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 한편, 상기 CD 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 CD 단백질을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6의 염기 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이다. 상기 벡터는 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터로 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시킨다. 또한, 상기 벡터는 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
본 발명에서 사용된 재조합 렌티바이러스 벡터는 프로모터에 의해 이에 적재된 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개 또는 2 이상의 프로모터에 의해서 BDNF, TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 BDNF, TRAIL 및/또는 CD 단백질은 바람직하게는 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. TRE 프로모터를 사용하지 않고 다른 종류의 프로모터를 사용하게 되면 계대가 지나갈수록 배가 시간(Doubling time)이 증가하게 되고, 계대가 지나갈수록 외래 단백질의 발현량이 현저하게 감소하며, 세포 형태가 변형되는 것을 확인하였다.
상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycline transactivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독시사이클린(doxycycline)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시킨다. 반면, 이들이 존재하는 경우에는 tTA 단백질이 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 여부에 따라 BDNF, TRAIL 및/또는 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 용어 "작동 가능하게 연결된"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터에 의해 유전자가 mRNA로 전사되어 단백질로 번역될 수 있다는 것을 의미한다.
상기 "재조합 렌티바이러스"는 본 발명의 렌티바이러스 벡터, 패키징 (packaging) 플라스미드 및 엔벨로프(envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질 전환시키는 단계; 및 형질 전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
상기 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid)"는 단백질을 코딩하는 유전자가 적재된 플라스미드 이다. 이들 플라스미드는 렌티바이러스 벡터 이외에, 렌티바이러스를 생산하기 위 해 필요한 헬퍼 구조물(예를 들어, 플라스미드 또는 단리된 핵산)을 제공할 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 GAG 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등)를 사용할 수 있다.
상기 용어 "형질도입(transduction)"은, 바이러스 감염을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 숙주세포에 전달하는 것을 의미한다.
상기 숙주세포는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 숙주세포는 중간엽줄기세포 일 수 있다.
상기 용어 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)"는 골세포, 연골세포 및 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화될 수 있는 다분화능 기질세포를 말한다. 중간엽줄기세포는 뼈, 연골, 지방, 힘줄, 신경조직, 섬유아세 포 및 근육세포 등 구체적인 장기의 세포로 분화될 수 있다. 이들 세포는 지방조직, 골수, 말초신경 혈액, 제대혈, 골막, 진피, 중배엽-유래 조직 등으로부터 분리 또는 정제될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 불사화된 중간엽줄기세포주는 생체 외(Ex vivo)에서 독시사이클린 처리에 의해 외래 유전자의 발현이 억제되고, 독시사이클린 제거에 의해 외래유전자가 발현되도록 제작된 세포주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 불사화된 중간엽줄기세포주는 독시사이클린 제거 배지(DMEM-low glucose, 10ng/ml FGF, 10% FBS)에서 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 48시간 동안 배양하였을 때, 1X105cells로부터 독시사이클린 처리 배지와 비교하여 4000배 이상, 3000배 이상, 1000배 이상, 500배 이상, 100배 이상, 10배 이상, 3배 이상, 바람직하게는 3 내지 6000배, 3 내지 5000배, 3 내지 4000배, 3 내지 3000배, 3 내지 2000배, 3 내지 1000배, 3 내지 500배, 3 내지 300배, 3 내지 100배, 30 내지 6000배, 30 내지 4000배, 30 내지 3000배, 30 내지 1000배, 300 내지 6000배, 300 내지 3000배 또는 300 내지 1000배 이상 증가된 수준으로 BDNF 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 BDNF를 발현하는 불사화된 중간엽줄기세포주는 단클론 조제 후 12 well plate 에서 독시사이클린 제거 후 48시간 배양시 TRE 프로모터에 의해 BDNF 발현이 1.5 ng/㎖ 이상 발현하는 클론들을 1차적으로 선별하였으며, 12 well plate에서 1x105 세포에 독시사이클린 처리하고 48시간 배양시 BDNF 발현이 0.5 ng/㎖을 넘지 않는 클론들을 2차적으로 선별한 후 최종 클론 후보를 한번 더 단클론 조제 후에 선별하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 장기 계대배양 시에도 표면항원 단백질인 CD44 및 CD105 단백질을 발현하여 중간엽줄기세포가 지니고 있는 고유한 특성이 유지되는 세포주 일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 100일까지 장기 계대 배양 시에도 중간엽줄기세포의 형태 변화가 없어서 형태학적으로 중간엽줄기세포의 특성이 유지되는 세포주 일 수 있다.
본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 장기 계대배양시에도 안정적으로 증식하고, Doubling time이 5 내지 25시간, 5 내지 20시간, 5 내지 15시간, 10 내지 25시간, 10 내지 20시간 또는 10 내지 15시간으로 짧아, 짧은 시간 내에 대량 생산이 가능한 세포주(cell line) 일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주가 100일 이상의 장기 계대배양시에도 안정적으로 증식하고, Doubling time이 14 내지 25시간, 평균 16시간으로 짧은 것을 확인하였다.
본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 제작 후, 동결 보존된다. 상기 동결 보존은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 특별히 그 방식에 제한되는 것은 아니다. 동결 보존되는 온도는 특별히 제한되는 것은 아니나, -70 내지 -200℃의 범위일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 액체 질소탱크에 상기 세포주를 보관하였으며, 이후 단계에서도 동결 보존된 상태를 유지하였다.
본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 대량 생산을 위한 불사화 유전자 도입 시 발생하는 세포 증식을 억제하기 위하여 인체에 투여되는 세포 치료제로 사용되기 전, 방사선을 조사하는 단계를 포함하여 제작된다.
본 명세서에서 용어 "방사선조사"는 방사선원에서 방출되는 방사선이 중간엽줄기세포에서 이온화 에너지가 감수성이 높은 DNA에 작용하여 직접 유효한 전리를 일으켜서 DNA 사슬이 절단되는 원리를 이용하여, 방사선을 조사한 중간엽줄기세포는 증식 능력을 잃지만, 생존기간 동안 도입된 치료유전자의 발현은 유지되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 방사선은 중간엽줄기세포의 증식을 억제시킬 수 있는 것이라면, 감마선, 베타선, 중성자선, 엑스선, 전자선 등 종류에 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 방사선의 “조사 선량”은 어떤 장소에서의 엑스선이나 감마선 등 방사선이 공기 중에서 이동하면서 만드는 양이온 또는 전자에너지양의 양을 말한다. 따라서 상기 조사 선량은 방사선 조사 기기의 종류, 조사되는 환경 및 피폭 시간 등에 따라 실제 대상체에 흡수되는 선량에 차이를 나타낸다. 따라서 본 발명에서 조사되는 방사선의 선량은, 대상체에 방사선의 에너지가 매질에 흡수된 정도를 나타내는 단위인 “흡수 선량”을 기준으로 측정하였다. 즉 본 발명에서는 불사화된 줄기세포주가 흡수한 방사선 에너지의 양으로 그 범위를 측정하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 불사화된 줄기세포주로서 BDNF가 도입된 BM102, BM01A 세포주와, TRAIL 및 CD가 도입된 BM03 세포주에 대하여, 방사선 조사 시험을 시행하였으며, 그 결과, 특정 흡수 선량 이상의 방사선을 흡수한 세포주에서, 콜로니 생성 및 세포 수의 증가가 이루어지지 않음을 확인함으로써, 상기 불사화된 줄기세포주가 세포 치료제로서 사용될 수 있는 최소 흡수 선량을 측정하였다.
즉, 본 발명에서 흡수 선량은 방사선이 흡수된 줄기세포주를 기준으로, 적어도 80Gy를 초과하는 범위일 수 있으며, 바람직하게는 81Gy, 82Gy, 83Gy, 84Gy, 85Gy, 86Gy, 87Gy, 88Gy, 89Gy, 90Gy를 초과하는 범위일 수 있고, 보다 바람직하게는 80Gy 내지 400Gy의 흡수 선량의 범위일 수 있다. 다만, 상기 범위를 초과하는 흡수 선량으로 조사된 경우에도 줄기세포의 증식이 발생하지 않으면서, 외래 단백질의 발현이 유지되는 것을 확인하였다. 상기 확인한 흡수 선량의 상한은, 실험상 측정된 범위일 뿐, 그 상한이 특별히 제한된다는 의미는 아니다. 본 발명의 일 실시예로부터 확인한 바, 조사 선량의 측면에서 500Gy 이상의 방사선 조사 시에도 본 발명의 세포주는 임상 시료로 사용이 적합하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예로부터, 줄기세포주가 흡수하는 흡수 선량의 범위는 하기의 범위를 만족한다.
조사선량 0 내지 100Gy일 때, 조사선량의 90 내지 110%;
조사선량 100 내지 200Gy일 때, 조사선량의 85~115%; 및
조사선량 200Gy 이상일 때, 조사선량의 60~110%.
상기 범위를 만족하는 경우, 본원 발명의 불사화된 줄기세포주는 콜로니 형성 및 세포 수 증가가 이루어지지 않았으며, 도입된 외래 유전자의 발현양이 일정 수준 이상으로 유지되었다. 이는 불사화 유전자를 도입하여 대량 생산이 가능하도록 제작한 줄기세포주의 안전성을 확인한 결과이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제작 과정에 의해 제작된 중간엽줄기세포주는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터 유전자 및 뇌유래-신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 불사화된 중간엽줄기세포주로서, 상기 세포주는 생체 외(ex vivo)에서 독시사이클린을 처리하여 배양한 중간엽줄기세포주 대비 독시사이클린을 제거하여 배양한 중간엽줄기세포주에서 유전자의 발현양상이 하기와 같이 나타나는 불사화된 중간엽줄기세포주를 제공한다:
BDNF 과발현;
ANGPTL4, ANGPT1, CEND1, NFASC, GRAP2 또는 TRIM6 유전자의 발현량 증가; 및
IL2RB, IL6, IL1B 또는 PTGS2의 발현량 감소.
상기 불사화된 중간엽줄기세포주는 생체 외(Ex vivo)에서 독시사이클린 처리에 의해 BDNF 발현이 억제되고, 독시사이클린 제거에 의해 BDNF가 발현되는 불사화된 중간엽줄기세포주로서, BDNF 발현 유무에 따라 전사체(transcriptome)가 변화될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "전사체(transcriptome)"란 발현된 모든 RNA의 총합을 의미한다. 본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 독시사이클린 처리 전후 대비 다음과 같은 RNA의 변화를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 불사화된 중간엽줄기세포주를 독시사이클린이 첨가된 배지에서 증식시키다가 독시사이클린을 제거하였을 때 BDNF가 과별현되고, ANGPTL4, ANGPT1, CEND1, NFASC, GRAP2 및 TRIM6로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현이 증가되며, IL2RB, IL6, IL1B 또는 PTGS2 유전자의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 10a).
본 발명의 ANGPLT4(angiopoietin like 4) 및 ANGPT1(angiopoiein 1)은 혈관생성 과정에 관련된 것으로 알려져 있고, IL2RB(interleukin 2 receptor subunit beta), IL6(interleukin 6), IL1B(interleukin 1 beta) 및 PTGS2(prostaglndin-endoperoxidase synthase 2)는 염증과 관련되어 있으며, CEND1(cell cycle and neuronal differentiation 1) 및 NFASC(neurofascin)는 신경생성 과정에 관련되어 있고, GRAP2(GRB2-related adaptor protein 2) 및 TRIM6(Tripartite motif containg 6)는 면역시스템과 관련된 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 불사화된 중간엽줄기세포주는 독시사이클린이 첨가된 배지에서 증식시키다가 독시사이클린을 제거하였을 때 HLF, ROR2, 또는 ICAM1 유전자의 발현량이 감소되고, CEBPB, EGR2, BMP8A, BEX2, KLF4, TNFSF15, PTBP3 또는 IGFBP2 유전자의 발현량이 감소되는 것을 추가적으로 확인하였다(도 10b).
본 발명의 HLF (HLF, PAR bZIP transcription factor), ROR2 (Receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2) 및 ICAM1 (Intracellular adhesion molecule 1) 유전자는 세포분화, 이동 및 증식을 조절하는 유전자로 알려져 있다.
또한, CEBPB(CCAAT/enhancer binding protein beta), EGR2(early growth receptor 2, BMP8A(Bone morphogenetic protein 8a), BEX2 (brain expressed X-linked 2), KLF4(kruppel like factor 4), TNFSF15(TNF superfamily member 15), PTBP3 (polypyrimidine tract binding protein 3) 및 IGFBP2(insulin growth factor binding protein 2)는 세포사멸을 조절하는 유전자로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 불사화된 중간엽줄기세포주는 독시사이클린이 첨가된 배지에서 증식시키다가 독시사이클린을 제거하였을 때 MiR4444-1, MiR4444-2, MiR1244-1의 발현이 증가하고, MiR1244-4, MiR319I, MiRLET7D의 발현이 감소하는 것을 추가적으로 확인하였다(도 10c).
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 서술한 바와 같은 방법에 의해 제작된 불사화된 중간엽줄기세포주를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 약제학적 조성물은 불사화된 중간엽줄기세포주에 도입된 외래 유전자로부터 발현하는 단백질을 유효성분으로 하는 것일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 BDNF에 의해 잘 성장하는 것으로 알려진 신경아교세포 C6을 BM102 세포주와 공배양 하였을 때 BM102 세포주의 숫자에 비례하여 C6 세포의 증식률이 증가하는 것으로부터 BM102 세포주가 세포치료제로 사용될 수 있을 정도로 BDNF를 안정적으로 대량 생산할 수 있고, BDNF를 안정적으로 발현하는 BM102 세포주가 신경세포를 보호하거나 치료하는 세포치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 22).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 BM102 세포주가 세포 배양시 형질전환 능력이 없으며 시험관내(in vitro) 종양원성이 없음을 확인하였다(도 21).
이에, 본 발명의 불사화된 중간엽줄기세포주는 BDNF 및 불사화 유전자가 도입된 형질 전환된 세포임에도 불구하고 종양원성이 없고, BDNF의 발현을 통해 신경보호 효과를 나타낼 수 있기 때문에, 다양한 중추신경장애의 치료에 안전하게 사용될 수 있다.
상기 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병 (Parkinson's disease, PD), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뇌경색, 만성 뇌손상(chronic brain injury), 허혈성 뇌질환, 척수손상, 헌팅턴병 (Huntington's disease, HD), 렛트병(Rett's disease, RD), 뇌졸중, 다발성 경화증, 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury), 신생아 허혈성 뇌병증 (Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy) 및 발기부전으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 및 척수강 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내, 경동맥을 포함한 동맥 투여가 있다.
상기 투여는 1회 이상 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 1 내지 4회 이상 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복 투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격, 1주, 2주 내지 4주 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 또는 1주 이상 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 1.0x106 내지 1.0x1012 TU, 구체적으로 1.0x108 내지 1.0x1010 TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1011 cells, 구체적으로 1.0x107 내지 1.0x109 cells의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
본 발명의 불사화된 줄기세포주의 제작 방법은 불사화 유전자 및 외래 유전자가 도입된 줄기세포주에 방사선을 조사하는 단계를 추가로 포함하며, 이에 따라, 비정상적인 분화 및 증식 가능성이 낮아 안전성이 높은 동시에 치료 성분으로 사용 가능한 외래 단백질의 발현양이 장기간 유지되는 불사화된 줄기세포주를 제작할 수 있다. 또한 상기 제작 방법에 따라 제작된 불사화된 줄기세포주는 다양한 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 c-Myc에 의해 불사화된 MSC(STEM24)와 불사화되지 않은 MSC(BM-MSC)의 세포 증식률을 비교한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 2는 c-Myc 및 hTERT가 도입되어 불사화된 MSC와 불사화되지 않은 MSC의 세포 증식율을 비교한 그래프이다:
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수.
도 3은 BDNF 단백질 발현량이 확인된 클론의 독시사이클린 존재 유무에 따른 BDNF 단백질 발현량을 나타낸 그래프로서, 도 3a는 본 발명의 BM102, 도 3b 는 BM01A를 선별하기 위한 클론의 발현량을 각각 나타낸 것이다.
도 4는 BM102 단클론 세포주의 유전자 조작 이후의 MSC가 지닌 고유한 특성인 표면 항원 단백질 CD44와 CD105 등의 발현과 골수 유래 MSC의 표면항원 단백질의 발현을 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질 도입된 불사화된 MSC의 세포를 장기배양하면서 증식률을 확인한 그래프이다:
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 6은 독시사이클린 처리 유무에 따른 BM102의 세포 증식률을 장기배양하면서 확인한 그래프이다.
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 세포집단배가수(population doubling level, PDL).
도 7은 독시사이클린 처리 유무에 따른 BM102 세포주의 각 계대별로 형태학적으로 세포의 특성이 유지되는 것을 확인한 도면이다.
도 8은 독시사이클린 처리 유무에 따른 BM102 세포주의 BDNF 단백질 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 BM102 세포주에 유전자가 도입된 것을 확인한 도면이다.
도 10은 독시사이클린 처리 유무에 따른 BM102 세포주의 전사체를 비교하여 변화하는 유전자를 나타낸 것이다.
도 10a는 독시사이클린 제거에 따라 BM102 세포주에서 혈관생성, 염증, 신경생성 및 면역체계 과정과 관련된 것으로 알려진 유전자들의 전사체 변화를 나타낸 도면이다. 증가된 전사체의 수치는 양의 값으로, 감소한 전사체의 수치는 음의 값으로 나타내었다.
도 10b는 독시사이클린 제거에 따라 BM102 세포주에서 세포분화, 이동, 증식 및 세포 사멸과 관련된 것으로 알려진 유전자들의 전사체 변화를 나타낸 도면이다. 증가된 전사체의 수치는 양의 값으로, 감소한 전사체의 수치는 음의 값으로 나타내었다.
도 10c는 독시사이클린 제거에 따라 BM102 세포주에서 micro RNA 유전자들의 전사체 변화를 나타낸 도면이다. 증가된 전사체의 수치는 양의 값으로, 감소한 전사체의 수치는 음의 값으로 나타내었다.
도 11은 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM102)에 감마선을 조사한 후, 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM102)에 엑스선을 조사한 후, 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM102)에 감마선을 조사한 후 세포 역가 변화를 BDNF 발현량을 통해 확인한 결과이다.
도 14은 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM102)에 엑스선을 조사한 후, 세포 역가 변화를 BDNF 발현량을 통해 확인한 결과(1차) 이다.
도 15는 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM102)에 엑스선을 조사한 후 세포 역가 변화를 BDNF 발현량을 통해 확인한 결과(2차) 이다.
도 16은 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM01A)에 감마선을 조사한 후, 세포 수를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 BDNF 발현 불사화 줄기세포주(BM01A)에 감마선을 조사한 후, 세포 역가 변화를 BDNF 발현량을 통해 확인한 결과이다.
도 18은 TRAIL 및 CD를 발현하는 불사화 줄기세포주(BM03)에 저준위 감마선을 조사한 후, 세포 수를 측정한 결과이다.
도 19는 TRAIL 및 CD를 발현하는 불사화 줄기세포주(BM03)에 고준위 감마선을 조사한 후, 세포 수를 측정한 결과이다.
도 20은 TRAIL 및 CD를 발현하는 불사화 줄기세포주(BM03)에 저준위 감마선을 조사한 후, 세포 역가 변화를 상기 TRAIL 및 CD유전자 발현양을 통해 확인한 결과이다.
도 21은 BM102 세포주의 유전자 조작 후에도 종양원성이 없음을 확인한 그래프이다.
도 22는 BM102 세포주와 C6 세포를 공배양시 C6 세포의 증식률을 확인한 그래프이다.
X축: BM102 세포수; 및
Y축: C6 세포의 증식률.
일 측면에서, 본 발명은 불사화 유전자를 도입한 줄기세포주를 제작하는 단계; 상기 줄기세포주에 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계; 상기 줄기세포주를 동결 보존하는 단계; 및 상기 동결된 상태의 줄기세포주에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법에 대한 것이다.
본 발명의 일 실시양태로서, 상기 불사화 유전자는 c-Myc 및/또는 hTERT이다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 외래 단백질은 성장인자, 사이토카인 또는 암 치료 단백질, 항체 및 케모카인 수용체 중 선택되는 것이다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 불사화된 줄기세포주는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)이다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 방사선은 줄기세포주에 대한 흡수선량이 적어도 80Gy가 되도록 조사되는 것이며, 보다 구체적으로 상기 흡수선량은 조사선량 0 내지 100Gy일 때, 조사선량의 80 내지 140%; 조사선량 100 내지 200Gy일 때, 조사선량의 80 내지 140%; 및 조사선량 200Gy 이상일 때, 조사선량의 60 내지 140% 범위를 만족한다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 방사선은 감마선, 베타선, 중성자선, 엑스선 및 전자선을 포함하는 군으로부터 선택되는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주를 포함하는 약제학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 약제학적 조성물은 뇌유래-신경영양인자(BDNF)를 발현하는 불사화된 줄기세포주를 포함하는 것이다.
본 발명의 일 실시 양태로서, 상기 약제학적 조성물은 신경질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 것으로, 상기 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뇌경색, 만성 뇌손상(chronic brain injury), 척수손상, 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 렛트병(Rett's disease, RD), 허혈성 뇌질환, 뇌졸중 및 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury), 신생아 허혈성 뇌병증 (Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy), 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주의 세포 치료제로서의 용도에 대한 것이다.
또 다른 측면에서 본 발명은, 상기 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주를 치료적으로 유효한 양으로 개체에 투여하여 질병을 치료하는 방법에 대한 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포(MSC)의 제조
실시예 1.1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 c-Myc 및/또는 hTERT을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-off 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저, pWPT 벡터(Bioneer 합성)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터를 CMV 프로모터로 치환하여 pBD 렌티바이러스 벡터를 제작하였다. 상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자(서열번호 7)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에, hTERT 유전자(서열번호 8)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오마이신(zeomycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(ZeoR; 서열번호 12)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-2로 명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA(tetracycline transactivator) 유전자 서열번호 9)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다, 제작된 벡터는 pBD-3으로 명명하였다.
실시예 1.2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1.1.에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.
먼저, 렌티-X 세포(Clontech Laboratories, 미국)는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150㎜ 디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량 하였다.
상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3 ㎖의 TrypLETM Select CTSTM(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 ㎖ 튜브에 모아서 1,500rpm으로 5분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎖의 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재 현탁 하였다.
현탁된 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150 ㎜ 디쉬에 1.2x107개의 세포가 되도록 분주하였다. 상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터, 12 ㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드) 및 2.4 ㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드) 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 추가 배양한 뒤 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티 바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 혼합한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃ 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심 분리하여 바이러스를 수득하고, 이를 FBS가 포함되지 않은 0.5㎖의 DMEM에 재 현탁 하였다.
실시예 1.3. 불사화된 중간엽줄기세포의 제조
상기 실시예 1.2.에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저, 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 장골능(iliac crest)에서 골수천자액(bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/㎖의 헤파린과 혼합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 4℃ 739 G의 조건으로 7분 동안 원심분리 한 후, 상층액을 제거하고, 10배 부피의 멸균된 물과 혼합하였다. 이를 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛을 20%의 우태아 혈청 및 5ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885- 084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃ 5% CO2 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1.2.에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴(Retronectin, Clontech Laboratories, 미국)을 사용하여 100 MOI 로 감염시켰다. 그 결과, c-myc을 포함하는 MSC 및 그렇지 않은 MSC의 세포 증식률을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 불사화 유전자인 c-Myc을 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 불사화 유전자에 의해 불멸화됨에 따라 감염 후 배양 30일을 기준으로 증식률이 증가하였고, 50일까지 높은 증식률을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 20일 이후에는 세포 증식률이 급격히 감소하였다.
또한 상기 c-Myc을 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 세포에, hTERT를 포함하는 pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 500 ㎍/㎖의 지오마이신을 첨가하여 pBD-2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
이에 대하여, 도 2에서 보듯이, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 모두 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다.
또한, 상기 pBD-1 및/또는 pBD-2가 감염된 세포에 tTA를 포함하는 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
실시예 2. 외래 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
실시예 2.1. BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
상기 실시예 1.1.에서 제작한 pBD 렌티바이러스 벡터에, BDNF 유전자(서열번호 2)를 삽입하였다.
먼저, BDNF 발현에 미치는 프로모터의 영향을 확인하기 위하여 CMV 프로모터 및 TRE 프로모터를 각각 사용하여 BDNF 유전자가 발현되도록 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 BDNF 유전자를 발현하는 MSC를 제조하였다. 그 결과, CMV 프로모터가 적용된 세포주의 경우, 장기 계대배양시 BDNF를 발현하는 MSC가 형태학적으로 변화하고, 계대배양이 진행될수록 BNDF의 발현율이 감소하는 것을 확인하였다.
이에, BNDF 유전자를 TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 각각의 pBD 벡터에 삽입하였다. TRE 프로모터는 독시사이클린의 첨가 유무에 따라 상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
또한 상기 제작된 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터(pBD-4 및 pBD-5)를 이용하여, 상기 실시예 1.2.에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 4.7x106 copies/㎖(pBD-4), 1.4x1012 copies/㎖(pBD-5)의 농도로 각각 준비하였다.
실시예 2.2. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스는 대한민국 등록특허 제 10-1985271호에 기재된 내용에 따라 제작하였다. 상기 실시예 1.1에서 제작된 pBD 렌티바이러스 벡터에, TRAIL 유전자(서열번호 4) 및 CD 유전자(서열번호 6)를 삽입하였다. 이때, 삽입된 TRAIL 및 CD 유전자가 IRES(internal ribosome entry site)로 연결되고, TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. IRES는 리보좀 결합부위로, 5'-캡 구조가 없어도 번역(translation)이 시작될 수 있도록 하여, 하나의 mRNA에서 두 개의 단백질이 발현될 수 있게 한다. 한편, TRE 프로모터는 독시사이클린의 첨가 유무에 따라 상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
상기 TRAIL 및 CD가 삽입된 벡터는 pBD-6으로 명명하였으며, 이를 이용하여, 상기 실시예 1에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 7.6x108 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 3. 외래 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질감염된 불사화된 줄기세포의 제작
실시예 3.1. BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질 감염된 MSC의 제작
3.1.1. BM102 세포주의 제작
상기 실시예 1.3.에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2.1.에서 생산한 BDNF 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 100 MOI 감염시켜, BDNF 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 여기에서 상기 렌티바이러스는 불사화 유전자 중 c-Myc이 도입된 pBD-1 벡터에 의해 생산된 것을 사용하였다. 형질 도입된 세포는 2 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 배양 중에 BDNF 단백질의 발현을 억제시켰다.
Clone select imager를 이용하여 상기 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 96well plate에서 세포를 접종한 well별로 번호를 부여한 후 콜로니 형성을 확인한 200여개의 클론 중 인간 BDNF DuoSet ELISA 키트(R&D systems, DY248, 미국)로 BDNF 단백질 발현 유무를 확인하였다.
상기 세포 중, pBD-4를 도입한 렌티바이러스에 의해 제작된 불사화된 MSC는, 독시사이클린 제거 후 BDNF 단백질을 1.5 ng/㎖ 이상 발현하는 #10, #22, #28, #65, #110, #116, #126, #596, #669 및 #741클론을 선별하였다. 그 후, 독시사이클린 처리시 BDNF 단백질을 0.5 ng/㎖ 이하로 발현하는 #28과 #110클론을 선별하였다(도 3a).
상기 선별된 클론의 세포증식능을 확인한 결과, 안정적인 증식패턴을 보이며 BDNF 단백질 발현량이 가장 우수한 #28 클론을 BM102 세포주라고 명명하고 특허 균주로 기탁하였다 (한국 생명공학연구원, KCTC13876BP).
3.1.2. BM01A 세포주의 제작
또한, 상기 3.1.1과 동일하게, pBD-1과 pBD-2를 도입한 렌티바이러스를 감염시킨 불사화된 MSC를 제작하였다. 상기 세포주의 제조 방법은 대한민국 등록 특허 제10-2074336호에 기재된 방법에 따라 제작하였다. 바이러스 감염 후, 세포를 안정화시킨 후, 배양액에 500 ㎍/㎖의 G418을 첨가하여 c-Myc및 hTERT 유전자가 모두 도입된 pBD-5 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다. 선별된 세포는 1 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 배양 중에 BDNF 단백질의 발현을 억제하였다.
상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 인간 BDNF DuoSet ELISA 키트(R&D systems, DY248, 미국)로 BDNF 단백질 발현 유무를 확인하여 형성된 #1 내지 #50의 클론 중 BDNF 단백질을 발현하는 #10, #12, #14, #18, #20, #22, #23, #26, #29 및 #41 클론을 선별하고, 독시사이클린 처리시 BDNF 단백질을 발현하지 않는 #14, #22, #23 및 #41 클론을 재 선별하였다(도 3b). 동일한 방법으로 세포증식능을 확인하고, 안정적인 증식패턴을 보이며 발현량이 가장 우수한 #41 클론을 BM-01A 세포주로 명명하였다.
실시예 3.2. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스가 형질감염된 MSC의 제조
대한민국 등록특허 제 10-1985271호에 기재된 방법에 따라, 상기 실시예 1-3에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2-2에서 생산한 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시켜, TRAIL 및 CD 유전자를 발현하는 세포를 제조하였다. 감염은 실시예 1-3에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)을 첨가하여, TRAIL 및 CD의 발현을 억제시킨 상태로 배양하였다. 세포가 안정화된 후, 독시사이클린을 제거한 배양 배지에서 72시간 동안 배양하여 TRAIL 및 CD의 발현을 유도시켰고, 상기 세포로 FACS를 수행하여 세포 표면에 TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다.
구체적으로, TRAIL 및 CD유전자를 포함하는 렌티바이러스가 감염된 세포를 FACS 튜브 당 5x105 개가 되도록 분주하고, 이를 4℃에서, 1,500 rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 1 ㎖의 FACS 완충액(2% 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하여 세포를 재현탁하고, 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기의 세척 과정을 1회 더 수행한 뒤, 1 ㎖의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하였다. 재현탁한 세포에 200 ㎕의 FACS 완충액에 0.3 ㎕의 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain(Life Technologies-Molecular Probes, 미국) 및 5 ㎕의 항-TRAIL 항체인 APC anti-human CD253 항체(BioLegend, Cat#. 308210, 미국)를 첨가한 혼합물을 첨가하여, 4℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 상기와 같은 방법으로 세포를 2회 세척하였고, 상층액을 제거하였다. 세척된 세포에 300 ㎕의 고정 완충액(fixing buffer)(2% 포름알데히드 및 1% 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하고, 4℃에서 최소 15분 동안 방치하였다. 상기 세포를 FACS(LSRFortessa, BD biosciences, 미국)기기로 분석하여, TRAIL을 발현하는 세포를 선별하고 콜로니를 형성하도록 배양하였다.
형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-03이라고 명명하였다.
실시예 4. 불사화된 줄기세포주에 대한 방사선 조사 시험
상기 실시예 3에서 제작된 각각의 불사화된 MSC 세포주를 임상 시료로 사용하기 위해, 세포가 증식하지 않으면서도 치료 단백질의 발현양을 유지시키기 위한 방사선 조사 단계를 추가로 시행하였으며, 이를 통해 적합한 방사선 조사(흡수) 선량을 확인하였다.
먼저 제형화하여 액체질소 탱크에서 동결보관중인 불사화된 MSC 세포주를 방사선 조사를 위해 제작된 이동 카트리지를 이용하여 수송하였다. 이때 드라이아이스를 이용하여 냉동 상태를 유지하였다.
상기 동결상태의 불사화된 MSC 세포주에 방사선 조사를 실시하였다. 방사선 조사는 공지된 방법 및 기기를 사용하였으며, 감마선의 경우 저준위 감마선 조사기기 또는 고준위 감마선 조사기기(MDS Nordion, Canada)를 사용하였고, 엑스선의 경우, X-RAD 320 X-RAY IRRADIATOR (서울대학교 융합과학기술원) 또는 RS1800Q (Rad Source technologies,Inc)를 사용하였다. 방사선 조사 중에도 이동 카트리지 내부의 온도는 드라이아이스에 의해 동결 상태를 지속할 수 있는 온도로 유지되었으며, 방사선 조사가 완료된 MSC 세포주는 다시 액체질소 탱크에 보관되었다.
방사선 조사 선량을 확인하기 위하여 방사선 흡수 선량은 별도의 알라닌 도시메타를 이용하여 조사량별로 측정하였으며, 상기 결과값을 통해 불사화된 MSC 세포주의 흡수 선량을 계산할 수 있었다.
상기 방사선 조사가 완료된 불사화된 MSC 세포주는 검체 별로 3바이알씩 37℃ 항온수조에서 약 2분 동안 해동한 뒤, 9 mL의 PBS를 첨가하여 4℃, 1,500 rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리한 후에 상층액을 제거하고 10% FBS(16000-044, Gibco, 미국), 10 ng/mL의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose glucose(11885-084, Gibco, 미국)배지에 현탁하였다. 현탁한 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 이후 실험을 진행하였다.
실험예 1. BM102 세포주에서 표면항원 단백질 발현 확인
유전자를 삽입하기 전의 골수유래 MSC와 BDNF 유전자가 삽입된 BM102 세포주의 표면항원 단백질 발현을 인간 MSC 분석 키트 (StemflowTM, Cat No562245, BD)를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었고, 실험 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 BM102 세포주는 BDNF를 발현시키기 위한 유전자 조작을 거친 후에도 MSC가 지니고 있는 고유한 특성인 표면항원 단백질인 CD44와 CD105의 발현이 골수유래 MSC와 유사함을 증명하였다.
실험예 2. 방사선 조사 전 BM102 세포주의 증식률 확인
상기 실시예 3.1.에서 확립한 BM102 세포주의 증식률을 확인하였다. T175 플라스크에 0.2x106 내지 0.8x106 개의 BM102 세포주를 접종한 후 독시사이클린을 첨가 또는 첨가하지 않고 3일 또는 4일 배양을 진행하며 PDL(Proliferation Doubling Level)과 세포 생존율을 측정하였다. PDL은 "PDL=X+3.222 (logY-logI)" 공식에 의해 계산하였으며, X는 초기 PDL, I는 플라스크에 접종된 초기 세포 수, Y는 최종 세포 수를 나타내었다. 확립된 세포주의 증식률을 도 5 및 도 6에 나타내었다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 BM102 세포주는 100일이 넘는 기간까지 안정적으로 증식하였다. 또한, 도 6에 나타난 바와 같이 독시사이클린을 첨가하지 않고 80일까지 배양한 BM102 세포주는 독시사이클린을 첨가하여 배양한 BM102 세포주 대비 세포 증식률이 점차적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실험예 3. 계대배양에 따른 BM102 세포주의 형태학적 확인
상기 실시예 3.1. 에서 확립한 BM102 세포주의 계대배양에 따른 형태학적 변형을 확인하기 위해 실험예 2.에서 BM102 세포주의 증식률을 확인하며 현미경으로 세포의 사진을 촬영하고, BM102 세포의 형태를 도 7에 나타내었다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 BM102 세포주는 100 일까지 장기 배양을 하여도 형태학적으로 변화가 없는 것을 확인하였고, 이를 통해 장기 배양에 의한 세포 노화와 같은 현상이 관찰되지 않음을 알 수 있었다. 그러나 독시사이클린을 첨가하지 않고 배양했을 경우 BDNF의 발현으로 인해 BM102 세포주가 형태학적으로 변화하는 것을 확인하였다. 이는 BDNF 단백질이 발현됨으로서 BM102 세포에 영향을 미치고 이로 인해 세포의 특성이 변화함을 의미한다.
실험예 4. 방사선 조사 전 BM102 세포주에서 BDNF 단백질의 발현 확인
상기 실시예 3.1.에서 확립한 BM102 세포에서 BDNF 단백질의 발현을 ELISA 분석 방법으로 확인하였다. 구체적으로, BDNF 단백질의 발현 수준은 인간 BDNF DuoSet ELISA 키트로 확인하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었다. 독시사이클린을 제거한 배지와 독시사이클린을 제거하지 않은 배지에서 약 1x105개의 세포로부터 48시간 동안 발현이 유도된 BDNF 단백질의 발현 수준을 하기 도 8에 나타내었다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 독시사이클린이 있는 배지에서는 약 0.2 ng 의 BDNF가 검출된 반면 독시사이클린을 제거한 배지에서는 약 740 ng의 BDNF가 검출되었다.
표적 단백질 발현 수준
BDNF 740 ng/105 cells
그 결과, 상기 표 1과 같이, 방사선을 조사하기 전 BM102 세포주에서는 약 740 ng/105 cells 의 BDNF 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
실험예 5. BM102 세포주에서 BDNF 도입유전자 확인
상기 실시예 3.1.에서 제조한 BM102 세포주에 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위해 PCR을 수행하였다. 구체적으로, 상기 BM102 세포주를 9 ㎖ PBS 가 포함된 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 셀 다운(Cell Down)시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 200 ㎕ PBS로 펠렛을 현탁시킨 후 옮겼다. 그 후, NucleoSpin® Tissue (MN, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 2와 같이 혼합물을 만든 후, 하기 표 3의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때, 양성 대조군으로 100 ng의 BM102 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ㎕의 정제수를 넣었다. 상기 BM102 플라스미드 DNA는 대한민국 공개특허 제2017-0093748호에 기재된 방법에 따라 분리 정제할 수 있다.
정방향 프라이머(서열번호 10) (10 pmol/㎕, 코스모진텍 합성) 1 ㎕
역방향 프라이머(서열번호 11) (10 pmol/㎕, 코스모진텍 합성) 1 ㎕
검체 (100 ng/㎕) 1 ㎕
정제수 17 ㎕
총 부피 20 ㎕
단계 온도 시간 횟수
1 95℃ 5분 1
2 95℃ 30초 35
62℃ 30초
72℃ 40초
3 72℃ 7분 1
4 4℃ 무한정 1
1%(v/v) 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10 ㎕의 DNA Size Marker를 로딩하였고, 다음 웰부터 음성대조군, 양성대조군, 3개의 BM102 검체 순서로 각각 10 ㎕씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분 동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 9에 나타내었다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 BM102 세포주 3개 모두 양성대조군과 동일한 사이즈 (0.6kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
실험예 6. BM102 세포주에서 전사체 변화 확인
상기 실시예 3.1,에서 제조한 BM102 세포주에 독시사이클린 처리 여부에 따른 BDNF 발현에 의한 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해 전사체 염기서열 분석(transcriptome sequencing)을 수행하였다.
염기서열 분석은 마크로젠에 의뢰하여 결과를 확보하였다. 시험은 NovaSeq 6000 S4 Reagent Kit (illumina)을 이용하여 NovaSeq 6000 System User Guide Document #1000000019358 v02 (illumina)에 따라 수행하였으며, NovaSeq sequencer 및 1000000019358 v02 software (illumina)를 통해 분석을 실시하였다. BM102 세포주에서 독시사이클린 제거에 따라 변화하는 전사체는 도 10a, 10b 및 10c에 나열하였다.
그 결과, 도 10a에 나타난 바와 같이 독시사이클린 제거에 따라 BM102 세포주에서 혈관생성, 염증, 신경생성 및 면역체계 과정과 관련된 것으로 알려진 ANGPTL4, ANGPT1, CEND1, NFASC, GRAP2 및 TRIM6 유전자의 발현이 증가하고, IL2RB, IL6, IL1B 및 PTGS2의 발현은 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 도 10b에 나타난 바와 같이 독시사이클린 제거에 따라 BM102 세포주에서 세포분화, 이동 및 증식과 관련된 것으로 알려진 HLF, ROR2, ICAM1 유전자의 발현이 감소하고, 세포 사멸과 관련된 것으로 알려진 CEBPB, EGR2, BMP8A, BEX2, KLF4, TNFSF15, PTBP3 및 IGFBP2 유전자의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
추가적으로, 독시사이클린 제거에 따라 BM102 세포주에서 micro RNA 유전자들의 전사체 변화가 또한 확인되었으며, 구체적으로 MiR4444-1, MiR4444-2, MiR1244-1의 발현이 증가하고, MiR1244-4, MiR319I, MiRLET7D의 발현이 감소하는 것을 확인하였다(도 10c).
실험예 7. BM102 세포주에 대한 방사선 조사 시험
BM102 세포주에 대하여, 감마선 및 엑스선을 이용하여 방사선 조사 시험을 실시예 4와 같은 방법으로 진행하였으며, 조사되는 방사선의 종류는 감마선 및 엑스선을 사용하였다.
먼저, 80, 100, 120, 140Gy의 조사선량으로 감마선을 1차 조사한 후, BM102 세포주의 흡수선량과, 콜로니 형성 여부, 세포 수 및 역가를 확인하였고, 200, 300Gy의 조사선량으로 감마선을 2차 조사한 후, 동일한 방법으로 흡수선량, 콜로니 형성 여부, 세포 수 및 역가를 각각 확인하였다.
그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
　 1차 실험 2차 실험
조사선량 흡수선량 Colony 역가 적/부 흡수선량 Colony 역가 적/부
(Gy) (Gy) 형성여부 ng/5x105/48hrs (Gy) 형성여부 ng/5x105/48hrs
0Gy - - 1259.8 - - - - -
80Gy 79.5 O 960.2 부적합 - - - -
90Gy - - -　 -　 - - - -
100Gy 99.6 X 826.6 적합 - - - -
110Gy - - -　 -　 - - - -
120Gy 121.2 X 963.3 적합 - - - -
130Gy - - -　 -　 - - - -
140Gy 137.6 X 849.9 적합 - - - -
200Gy - - -　 -　 219.7 X 400 이상 적합
300Gy - - -　 -　 322.2 X 400 이상 적합
또한, 엑스선을 이용하여 1차로 100, 200, 300, 400, 500Gy의 조사선량으로 각각 조사하여 흡수 선량, 콜로니 형성 여부 및 역가를 확인하여 표 5 및 도 11에 나타냈으며, 2차로 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500Gy의 조사선량으로 각각 조사하여, 그 결과를 하기의 표 6 및 도 12에 나타내었다.
BM102 엑스선 조사 (1차)
조사선량 흡수선량 Colony 역가 적/부
(Gy) (Gy) 형성여부 ng/105
100Gy 62.5 O 122.4 부적합
300Gy 187.5 X 121.3 적합
400Gy 250 X 120 적합
500Gy 312.5 X 107.7 적합
　 BM102 엑스선 조사 (2차)
조사선량 흡수선량 해동후 Colony 역가 적/부
(Gy) (Gy) 세포생존율 형성여부 ng/105/60hr
0Gy - 96.8 NA 325.1 NA
50Gy 41.3 96.7 X 247.5 적합
100Gy 83.1 95.1 X 252.1 적합
200Gy 155.5 95.6 X 249.4 적합
300Gy 232.1 98.9 X 250.7 적합
400Gy NA* 96.4 X 240.7 적합
500Gy NA* 96.5 X 191.7 적합
실험예 7.1. 방사선 조사된 BM102 세포주의 콜로니 형성 여부
BM102 세포주에 대하여, 감마선 및 엑스선을 상기 범위로 각각 조사 후 콜로니 형성 여부를 확인하기 위해 6-well 플레이트에서 well에 5x105개의 세포가 되도록, 바이알 당 12개 well에 분주하여 총 2개의 6-well 플레이트에 분주하였다. 플레이트를 흔들어 세포가 고루 퍼지도록 해주고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3일 혹은 4일마다 배지를 교환해주며 현미경을 이용하여 콜로니가 형성되는지 육안으로 관찰하였다.
그 결과, 상기 표 4에서 보듯이, 감마선을 조사한 경우, 조사선량 80Gy일 때, 콜로니가 형성되었으며, 그 이상의 범위에서는 콜로니 형성이 이루어지지 않았음을 확인하였다. 콜로니가 형성된 경우, 세포주의 방사선 흡수선량은 79.5Gy로 확인되었으며, 실험상 확인한 최대 흡수 선량은 약 322Gy였다.
또한, 엑스선 조사 결과 콜로니 형성 여부에 대해서도 동일하게 확인하였다. 상기 표 5 및 표 6에서 보듯이, 1차 실험에서 조사 선량이 100Gy인 경우에는 콜로니가 형성되어 임상시료로서 사용이 부적합함을 확인하였으며, 그 이상의 범위에서는 콜로니가 형성되지 않았다. 콜로니가 형성된 경우 세포주의 흡수 선량은 62.5Gy로 확인되었다.
반면, 2차 엑스선 조사 실험에서 확인한 바, 100Gy로 조사한 경우 흡수 선량이 83.1Gy인 것으로 측정되었다. 이 때, 콜로니는 형성되지 않았다. 즉, 동일한 조사 선량으로 조사된 경우라도 하더라도 흡수 선량에는 차이가 있을 수 있으며, 세포에 흡수되는 선량이 62.5Gy인 경우에는 임상 시료로서 사용이 부적합하나, 83.1Gy인 경우에는 사용이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 흡수 선량을 기준으로 약 80Gy 초과 범위 방사선이 흡수될 경우, 본 발명의 세포주는 임상 시료로서 사용이 가능함을 예측할 수 있다.
실험예 7.2. 방사선 조사된 BM102 세포주의 세포 수 측정 결과
상기 콜로니 형성 여부 시험을 위해 접종된 세포를 이용하여 세포 수 측정 시험을 실시하였다. 상기 실험예 7에서 감마선이 조사된 BM102 세포주에 대하여, 세포 해동일을 기준으로 Day 7, 14, 28, 35, 49, 63 일에 각각 부착된 세포를 트립신을 이용하여 탈착시킨 후 트립판 블루(Trypan blue) 염색을 하고 헤마토사이토머(hematocytomer)에서 총 세포 수와 생존 세포 수의 개수를 계수하였다.
그 결과, 아래 표 7 및 도면 11에서 보듯이, 감마선을 이용한 1차 조사 시험 및 2차 조사 시험 모두에서, 63일까지 관찰하였을 때, 방사선 조사 시 세포가 증식하지 않았음을 확인하였다.
Time Item 1차 시험 (Dose) 2차 시험 (Dose)
0Gy 80Gy 100Gy 120Gy 140Gy 200Gy 300Gy
Day0 세포수(x105) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
생존율(%) 91.5 91.9 93.9 93.5 94.9 90.2 93.9
Day7 세포수(x105) 22.75 5.09 3.91 3.19 2.95 4.39 4.55
생존율(%) 93.1 93.9 97.7 98.0 97.6 90.5 91.6
Day14 세포수(x105) 20.13 4.83 3.70 3.06 2.92 4.03 3.69
생존율(%) 84.5 88.2 87.5 90.2 91.8 89.2 89.5
Day21 세포수(x105) - 3.13 3.32 2.88 2.21 3.57 3.45
생존율(%) - 81.3 84.3 83.6 74.1 89.9 88.5
Day28 세포수(x105) - 2.81 2.77 2.44 2.08 3.40 3.37
생존율(%) - 86.8 90.6 89.6 87.2 88.3 89.1
Da35 세포수(x105) - 2.69 2.62 2.53 2.11 2.93 2.88
생존율(%) - 85.6 84.3 87.5 85.9 85.4 84.3
Day49 세포수(x105) - 2.33 2.26 2.14 1.70 2.57 2.56
생존율(%) - 84.8 83.7 83.9 74.6 80.9 79.6
Day63 세포수(x105) - 2.25 2.23 1.98 1.55 2.48 2.47
생존율(%) - 83.2 82.1 81.5 71.6 79.4 78.6
또한, 엑스선을 사용하여 조사 실험을 진행한 세포주에 대하여, 세포주를 해동한 날 이후 14, 28, 42, 56, 70일에 각각 세포 수를 측정한 결과, 아래 표 8, 도면 12과 같이 300, 400, 500Gy 각각의 조사 그룹에서 관찰한 모든 기간 동안 추가로 증식하는 세포가 없음을 확인하였다.
Time Item Dose
100Gy 300Gy 400Gy 500Gy
Day0 세포수(x105) 5.0 5.0 5.0 5.0
생존율(%) 92.5 93.8 94.3 95.5
Day14 세포수(x105) 2.01 1.05 0.71 0.83
생존율(%) 92.0 81.7 88.3 88.5
Day28 세포수(x105) 7.79 0.85 0.74 0.73
생존율(%) 79.9 71.2 63.4 66.9
Day42 세포수(x105) - 0.99 0.89 0.64
생존율(%) - 77.5 71.0 60.7
Day56 세포수(x105) - 0.96 0.94 0.66
생존율(%) - 74.0 76.0 69.7
Day70 세포수(x105) - 0.94 0.85 0.64
생존율(%) - 73.8 74.8 69.9
실험예 7.3. 방사선 조사된 BM102 세포주의 BDNF 발현 확인
상기 실험예 7에서 방사선을 조사한 BM102 세포 일부는 역가 시험을 위해 12-well 플레이트에서 well에 1x105 또는 5x105개의 세포가 되도록, 바이알당 총 1개의 well에 분주하였다. 플레이트를 흔들어 세포가 고루 퍼지도록 해주고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 또는 60시간 배양하였다.
BDNF의 발현양을 측정하기 위해 상기 배양액으로부터 상층액을 수득하고 4℃에서 5,000 rpm으로 5 분간 원심분리 한 뒤 상등액을 200μL씩 4개의 e-tube에 소분하고 -80℃에서 냉동 보관하였다. BDNF 단백질의 발현양은 BDNF 분석 키트(DBD00, R&D systems, 미국)를 이용하여 분석하였다.
감마선을 조사한 BM102 세포주의 경우, 표 4 및 도 13에서 보듯이, 방사선 조사 시에도 BDNF의 발현양이 적정 수준(500 ng/5x105/48hrs) 이상으로 유지되는 것을 확인하였으며, 엑스선을 조사한 경우에는, 표 5 및 도 14 및 도 15에서 확인되는 바와 같이 높은 조사 선량에서도 BDNF의 발현양이 유지되는 것(100 ng/105/48hrs 이상 또는 400 ng/105/60hrs 이상)을 확인하였다.
실험예 8. BM01A 세포주에 대한 방사선 조사 시험
실험예 7과 동일한 방식으로, BM01A 세포주에 대한 방사선 조사 시험을 시행하였다. 조사되는 방사선 종류는 감마선을 사용하였으며, 조사선량 90, 100, 110, 120Gy의 감마선을 1차로 조사한 후, 흡수 선량과, 콜로니 형성 여부, 세포 수 및 역가를 확인하였고, 조사선량 140, 160, 180Gy의 감마선을 2차로 조사한 후, 동일한 방법으로 흡수 선량, 콜로니 형성 여부, 세포 수 및 역가를 각각 확인하였다. 그 결과를 하기 표 9에 기재하였다.
　 1차 실험 2차 실험
조사선량 흡수선량 Colony 역가 적/부 흡수선량 Colony 역가 적/부
(Gy) (Gy) 형성여부 (ng/5x105/48hrs) (Gy) 형성여부 (ng/5x105/48hrs )
0Gy - - 540.7 - - - 611.3 -
90Gy 95.6 X 1238.6 적합 - - - -
100Gy 108 X 896.1 적합 - - - -
110Gy 120.6 X 909 적합 - - - -
120Gy 131.1 X 1063.4 적합 - - - -
140Gy - - - - 154.1 X 1018.3 적합
160Gy - - - - 173.8 X 870 적합
180Gy - - - - 191.4 X 993.4 적합
실험예 2.1. 방사선 조사된 BM01A 세포주의 콜로니 형성 여부
BM01A세포주를 6-well 플레이트에서 3x105cell/well 의 수로 분주하고, 상기 실험예 7.1.과 동일한 방법으로 배양한 후, 배지에서 콜로니 형성 여부를 확인하였다.
그 결과, 상기 표 9에서 보듯이, 조사선량 90 내지 120Gy 및 140 내지 180Gy의 범위에서 모두 콜로니가 형성되지 않았으며, 이를 통해 콜로니가 생성되지 않는 최소 흡수 선량은 95.6Gy, 최대 흡수 선량은 191.4Gy임을 확인하였다.
실험예 8.2. 방사선 조사된 BM01A 세포주의 세포 수 측정 결과
상기 실험예 7.2.와 동일한 방법으로, 감마선이 조사된 BM01A 세포주의 세포 수 측정 실험을 실시하였다.
세포 해동일을 기준으로 Day 7, 14, 28, 35, 42 일에 부착된 세포를 트립신을 이용하여 탈착시킨 후 트립판 블루로 염색을 하고 헤마토사이토머에서 총 세포 수와 생존 세포 수의 개수를 계수하였다.
그 결과, 하기 표 10 및 도 16에서 보듯이, BM01A 세포주에 대해 감마선을 조사한 경우, 42일까지 관찰하였을 때, 세포 수가 증식되지 않았음을 확인하였다.
Time Item 1차 시험 (Dose) 2차 시험 (Dose)
0Gy 90Gy 100Gy 110Gy 120Gy 0Gy 140Gy 160Gy 180Gy
Day0 세포수(x105) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
생존율(%) 92.9 99.7 99.0 99.4 87.7 90.2 91.0 89.4 92.7
Day7 세포수(x105) 9.44 1.66 1.57 1.32 1.70 24.03 2.44 2.42 2.86
생존율(%) 88.8 89.5 88.5 75.0 87.1 86.1 71.7 73.0 75.2
Day14 세포수(x105) 　- 1.18 0.89 1.14 0.98 　- 0.62 0.85 1.04
생존율(%) 　- 46.4 48.3 56.3 53.1 　- 26.3 29.7 36.0
Day21 세포수(x105) - 0.23 0.30 0.22 0.23 - 0.14 0.08 0.11
생존율(%) - 39.7 38.6 29.2 29.0 - 3.6 2.5 3.5
Day28 세포수(x105) - 0.14 0.08 0.09 0.08 - 0.04 0.07 0.05
생존율(%) - 26.8 13.4 16.4 12.6 - 1.9 2.9 2.7
Da35 세포수(x105) - 0.04 0.06 0.03 0.04 - 0.03 0.03 0.02
생존율(%) - 6.3 12.0 4.9 5.9 - 4.0 3.7 2.3
Day42 세포수(x105) - 0.01 0.02 0.01 0.02 - 0.01 0.03 0.02
생존율(%) - 3.2 4.2 2.1 3.8 - 0.6 2.3 1.6
실험예 8.3. 방사선 조사된 BM01A 세포주의 BDNF 발현량 확인
상기 실험예 8에서 방사선 조사된 BM01A 세포주의 역가 시험을 위해, 실험예 7.3.과 동일한 방법으로 세포를 배양 및 냉동 보관하였다. BM01A의 BDNF 발현량은 BDNF 분석 키트(DY248, R&D systems, 미국)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 표 9 및 도면 17에서 보듯이, 감마선 조사 시, 조사하지 않은 경우와 비교하여 BDNF의 발현양이 높은 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.
실험예 9. BM03 세포주에 대한 방사선 조사 시험
TRAIL 및 CD를 발현하는 불사화된 줄기세포인 BM03 세포주에 대하여, 실험예 7과 동일한 방식으로 방사선 조사 시험을 시행하였다. BM03 균주의 방사선 조사 시험은 감마선을 활용하였으며, 저준위 및 고준위 감마선을 각각 조사하여 그 결과를 확인하였다.
저준위 감마선은 바이알에 충전 이후 동결된 BM03 (BM03-P005, 1x107 cells/ml/vial)를 원자력 첨단방사선 연구소에서 저준위조사기 이용하여 방사선 조사를 실시하였으며, 조사선량 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70Gy로 각각 조사하여 아래 표 11과 같이 흡수 선량, 콜로니 형성 여부, 세포 수 및 역가를 확인하였다.
저준위　 1차 실험
조사선량 흡수선량* Colony형성여부 역가 (5x10(a+2)) 적/부
TRAIL (a) CD::UPRT (a)
(Gy) (Gy) Day 0 Day 2 Day 7 Day 14 Day 0 Day 2 Day 7 Day 14
0Gy (0Gy) - 8.92 9.26 8.82 9.20 8.64 9.17 8.66 9.08 -
10Gy 10Gy O 8.62 9.34 8.76 8.98 8.38 9.20 8.61 8.81 부적합
20Gy 20Gy O 8.65 9.19 8.60 8.85 8.40 9.06 8.43 8.71 부적합
30Gy 30Gy O 9.13 9.13 8.81 8.45 8.73 9.01 8.71 8.45 부적합
40Gy 40Gy O 8.79 8.93 8.62 8.35 8.63 8.78 8.50 8.23 부적합
50Gy 50Gy O 8.60 8.71 8.76 8.46 8.40 8.70 8.68 8.41 부적합
60Gy 60Gy X 8.65 8.94 9.04 8.59 8.42 8.96 8.96 8.53 부적합
70Gy 70Gy X 9.06 9.12 8.94 8.58 8.75 9.13 8.78 8.56 적합
또한 동일한 방법으로, 고준위 감마선의 조사 시험을 시행하였으며, 고준위 감마선은 0. 30, 40, 60, 60Gy로 1차 시험 후, 0. 100, 110, 120, 130Gy의 선량으로 2차 시험을 시행하여 흡수선량, 콜로니 형성 여부를 측정하였다. 바이알에 충전 후 동결된 BM03(1x107 cells/ml/vial)을 원자력연구원의 첨단방사선연구소의 고준위 조사기를 이용하여 실시하였고, 각각의 시험에서 흡수선량은 Alanine doxymeter를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 12과 같이 확인하였다.
고준위　 1차 실험 2차 실험
조사선량 흡수선량 Colony 적/부 흡수선량 Colony 적/부
(Gy) (Gy) 형성여부 (Gy) 형성여부
0Gy - - - - - -
30Gy 31.8 O 부적합 - - -
40Gy 40.4 O 부적합 - - -
50Gy 52.2 O 부적합 - - -
60Gy 61.2 O 부적합 - - -
100Gy - - - 100 X 적합
110Gy - - - 110 X 적합
120Gy - - - 120 X 적합
130Gy - - - 130 X 적합
실험예 9.1. 방사선 조사된 BM03 세포주의 콜로니 형성 여부
상기 실험예 9의 BM03 세포에 대한 콜로니 형성 여부를 확인하기 위하여, 상기 실험예 7.1.과 동일한 방식으로 세포주의 콜로니 형성 여부를 확인하였다. 상기 실험예 9에서, 저준위 감마선이 조사된 BM03 및 고준위 감마선이 조사된 BM03에 대하여 콜로니 형성 여부를 확인한 결과, 상기 표 11 및 표 12에서 보듯이, 저준위 감마선 조사 시, 특히 50Gy 이하의 조사선량에서 콜로니가 형성되었고, 고준위 감마선 조사 시에는 60Gy 이하의 조사선량에서 콜로니가 형성되어 임상 시료로서 사용하기에 부적합함을 확인하였다. 그러나, 저준위 감마선의 경우 70Gy 이상, 고준위 감마선의 경우 100Gy 이상에서는 콜로니가 형성되지 않았음을 확인하였다.
실험예 9.2. 방사선 조사된 BM03 세포주의 세포 수 측정
실험예 9.1.에서 배양되는 세포에 대하여, 저준위 감마선이 조사된 BM03 세포주의 경우, 세포 해동일로부터 각각 2, 7, 14, 28, 35, 42, 49일에 부착된 세포의 수를 계수하여 배양된 세포 수의 증가 여부를 확인하였다.
그 결과 하기 표 13 및 도 18에서 보듯이, 10Gy 조사 그룹에서는 Day 7부터 접종 수보다 많은 세포 수가 확인되었으며, 20Gy 조사 그룹에서는 Day 14, 30및 40Gy 조사 그룹에서는 Day 21, 50Gy 조사 그룹에서는 Day 35에 접종 수보다 많은 세포 수가 확인되었다. 또한, 60Gy 조사 그룹에서는 접종 수보다 적은 수의 세포가 유지되었으나 Day 42 부터는 세포 수가 증가하였고, 70Gy에서는 생존 세포 수는 지속적으로 감소하였다. 이는 저준위 감마선의 조사선량 및 흡수선량이 60Gy 이하인 경우, 세포가 증식할 가능성이 있음을 보여주는 것이다.
Time Item Dose
0Gy 10Gy 20Gy 30Gy 40Gy 50Gy 60Gy 70Gy
Day0(접종) 생존세포수(x105) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
생존율(%) 89.9 89.1 93.6 92.0 93.6 92.0 90.8 90.6
Day2 생존세포수(x105) 8.0 3.2 2.6 2.6 2.8 2.6 2.6 2.4
생존율(%) 84.3 70.0 52.5 60.8 55.5 56.6 47.2 49.8
Day7 생존세포수(x105) 14.3 6.5 2.8 2.0 2.2 1.9 1.8 2.1
생존율(%) 93.1 91.2 75.8 79.8 81.7 86.2 86.3 78.0
Day14 생존세포수(x105) 21.6 18.4 12.3 4.4 2.1 1.1 1.1 1.1
생존율(%) 92.0 94.4 90.5 78.6 73.8 59.2 63.2 70.8
Day21 생존세포수(x105) 10.4 18.4 17.6 14.6 9.1 1.9 1.1 0.7
생존율(%) 86.7 91.8 92.9 86.1 86.9 67.4 62.3 69.8
Day28 생존세포수(x105) - - - 17.3 8.1 2.3 0.4 0.6
생존율(%) - - - 93.8 86.0 88.7 74.6 73.0
Day35 생존세포수(x105) - - - - - 6.0 0.3 0.3
생존율(%) - - - - - 79.8 61.3 47.9
Day42 생존세포수(x105) - - - - - 3.0 2.1 0.1
생존율(%) - - - - - 35.4 66.9 68.1
Day49 생존세포수(x105) - - - - - 6.0 2.7 0.1
생존율(%) - - - - - 68.9 49.3 16.3
또한 동일한 방법으로 고준위 감마선 조사된 BM03 세포주의 경우, 세포 해동일로부터 7, 14, 21, 28일(1차), 및 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 63(2차)일 째 부착된 세포 수를 계수하였다.
그 결과 하기 표 14 및 도 19에서 볼 수 있듯이, 1차 실험에서 30 Gy, 40 Gy 조사 그룹에서는 Day 14부터 접종 수보다 많은 세포 수가 확인되었으며, 50 Gy 조사 그룹에서는 Day 21, 60 Gy 조사 그룹에서는 Day 28에 접종 수보다 많은 세포 수가 확인되었다, 그러나, 2차 시험 결과 100, 110, 120, 130Gy 조사 그룹에서 63일까지 관찰하였을 때 증식하는 세포는 없음을 확인하였다.
이와 같은 결과로부터, BM03 세포주의 경우, 최소 흡수선량이 60Gy 이상이어야 함을 알 수 있다.
TIME ITEM Dose(1차 실험) Dose(2차 실험)
0Gy 30Gy 40Gy 50Gy 60Gy 0Gy 100Gy 110Gy 120Gy 130Gy
Day0 세포수(x105) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
생존율(%) 84.23 86.18 86.58 87.33 92.52 82.0 72.5 85.4 84.5 85.2
Day7 세포수(x105) 25.08 1.43 1.08 1.01 1.42 9.69 0.98 0.98 0.80 0.93
생존율(%) 93.75 83.64 80.17 85.41 97.92 90.9 71.8 66.1 75.7 77.1
Day14 세포수(x105) 14.92 15.17 6.91 1.97 0.83 11.50 0.76 0.80 0.84 0.96
생존율(%) 89.8 88.0 88.3 79.8 67.0 93.7 72.5 77.8 68.9 71.0
Day21 세포수(x105) 10.58 15.17 11.08 11.42 3.50 - 0.78 0.62 0.61 0.58
생존율(%) 88.2 90.6 85.7 87.0 83.9 - 77.8 77.4 74.1 67.1
Day28 세포수(x105) 　- - - 12.67 10.50 - 0.42 0.46 0.37 0.32
생존율(%) 　- - - 95.0 90.0 - 57.2 69.0 56.7 68.1
Day35 세포수(x105) - 0.39 0.23 0.27 0.28
생존율(%) - 79.7 61.0 68.0 58.3
Day42 세포수(x105) - 0.33 0.36 0.31 0.25
생존율(%) - 63.7 71.4 79.7 66.8
Day49 세포수(x105) - 0.25 0.15 0.23 0.16
생존율(%) - 59.6 61.8 50.5 59.4
Day63 세포수(x105) - 0.08 0.07 0.09 0.13
생존율(%) - 44.3 41.7 60.5 62.3
실험예 9.3. 방사선 조사된 BM03 세포주의 유전자 발현량 확인
방사선 조사 이후 세포의 역가의 변화를 측정하기 위해서 삽입된 치료 유전자 TRAIL과 CD::UPRT를 확인할 수 있는 프라이머를 선정한 후 qRT-PCR 반응을 통해 삽입된 유전자의 발현을 정량적으로 측정하였다.
해동 직후, 2일, 7일, 14일간 배양한 세포를 각각 수확한 후 Trizol을 이용하여 RNA를 추출하고, 5X Prime Script RT Master Mix(Takara)를 이용하여 RNA 1ug에서 cDNA를 합성하였으며 TRAIL과 CD 각각에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머를 이용하여 RT-qPCR을 수행하였다.
그 결과, 도 20에서 보듯이, 저준위 감마선 조사된 BM03 세포주에서 발현되는 치료유전자 TRAIL 및 CD의 발현량은 유의미한 차이가 발견되지 않았다. 고준위 감마선 조사 시에도, 생존 세포가 존재할 때, 방사선 조사선량에 따른 역가의 변화가 거의 없었음을 확인하였다.
실험예 10. 시험관 내( in vitro ) BM102 세포주의 종양원성 확인
CytoSelectTM 96-well Cell Transformation Assay를 이용해 연한천겔 (Soft Agar Gels)에서 골수유래 MSC, BM102 세포주, 양성대조군 (HeLa) 및 음성대조군 (NIH3T3)에서 비부착 증식 (Anchorage-independent Growth)에 의한 콜로니 형성 유무를 확인하였고, MTS 용액으로 염색하여 흡광도를 측정함으로써 세포 형질 전환에 의한 종양 형성 여부를 정량화하였다.
그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 양성대조군에서 세포 형질전환에 의한 콜로니가 형성되었으며, 음성대조군, 골수유래 MSC 및 BM102 세포주는 콜로니가 형성되지 않은 것으로부터 BM102 세포주는 세포배양시 형질전환 능력이 없으며 시험관내(in vitro) 종양원성이 없음을 확인할 수 있었다.
실험예 11. 시험관 내( in vitro ) BM102 세포주의 신경세포 보호 및 치료 효과 확인
BM102 세포주의 신경세포 보호 및 치료 효과를 확인하기 위하여, BDNF에 의해 잘 성장하는 것으로 알려진 신경아교세포 C6을 BM102 세포주와 공배양 한 후 C6 세포의 증식률 증가를 세포수 의존적으로 확인하였다.
구체적으로, C6 세포와 BM102 세포주를 trans-well을 이용하여 공배양 하였다. C6 세포를 동일하게 2x103개씩 96-well plate에 접종한 후, BM102 세포주는 1x104개로부터 1/2씩 희석하여 trans-well에 접종하는 방식으로 공배양하는 세포수를 달리하였다. 24시간 공배양 후, 배양중인 C6 세포 배지에 MTS 용액을 처리하여 흡광도를 측정함으로써 BM102 세포주에서 발현하는 BDNF 단백질에 의한 C6 세포의 증식률을 정량화하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이 BM102 세포주의 숫자에 비례하여 증가하게 되는 BDNF 분비량에 의해 직접적인 접촉이 없이도 C6 세포의 증식률이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, BM102 세포주가 세포치료제로 사용될 수 있을 정도로 BDNF를 안정적으로 대량 생산할 수 있고, BDNF를 안정적으로 발현하는 BM102 세포주가 신경세포를 보호하거나 치료하는 세포치료제로 사용될 수 있음을 확인하였다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13876BP
수탁일자 : 20190702
Figure PCTKR2020009769-appb-I000001

Claims (13)

  1. 불사화 유전자를 도입한 줄기세포주를 제작하는 단계;
    상기 줄기세포주에 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 도입하는 단계;
    상기 줄기세포주를 동결 보존하는 단계; 및
    상기 동결된 상태의 줄기세포주에 방사선을 조사하는 단계를 포함하는, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 불사화 유전자는 c-Myc 및/또는 hTERT인 것인, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 외래 단백질은 성장인자, 사이토카인 또는 암 치료 단백질, 항체 및 케모카인 수용체 중 선택되는 것인, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 불사화된 줄기세포주는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)인 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방사선은 줄기세포주에 대한 흡수선량이 적어도 80Gy가 되도록 조사되는 것인 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 줄기세포주에 대한 흡수선량은 방사선 조사 선량에 대하여, 하기의 범위를 만족하는 것인, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
    조사선량 0 내지 100Gy일 때, 조사선량의 80 내지 140%;
    조사선량 100 내지 200Gy일 때, 조사선량의 80 내지 140%; 및
    조사선량 200Gy 이상일 때, 조사선량의 60 내지 140%.
  7. 제1항에 있어서, 상기 방사선은 감마선, 베타선, 중성자선, 엑스선 및 전자선을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 불사화된 줄기세포주의 제작 방법.
  8. 제1항의 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주를 포함하는 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 뇌유래-신경영양인자(BDNF)를 발현하는 불사화된 줄기세포주를 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 신경질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 루게릭병(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS), 뇌경색, 만성 뇌손상(chronic brain injury), 척수손상, 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 렛트병(Rett's disease, RD), 허혈성 뇌질환, 뇌졸중 및 외상성 뇌손상(Traumatic brain injury), 신생아 허혈성 뇌병증 (Neonatal Hypoxic ischemic encephalopathy), 다발성 경화증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제1항의 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주의 세포 치료제로서의 용도.
  13. 제1항의 방법에 의해 제작된 불사화된 줄기세포주를 치료적으로 유효한 양으로 개체에 투여하여 질병을 치료하는 방법.
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