JP2022542247A - 不死化幹細胞株の製造方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、不死化遺伝子が導入された幹細胞株であって、細胞治療剤として使用可能になるように増殖が抑制されると同時に、導入遺伝子の発現能が維持される特徴を有する不死化幹細胞株の製造方法およびその用途に関し、本発明の前記不死化幹細胞株は、放射線を照射する過程を経ることによって、細胞の増殖がなされることなく、導入された外来タンパク質の発現が一定レベル以上に維持される特徴を有するので、多様な細胞治療剤など臨床試料として有用に使用できる。【選択図】図１２

Description

本発明は、細胞治療剤として使用可能になるように増殖が抑制されると同時に、導入された遺伝子に対する発現能が維持される不死化幹細胞株を製造する方法およびその用途に関する。

全世界的に細胞を用いた治療方法が開発されており、特に成体幹細胞を用いた細胞治療剤について多くの研究が進行中にある。成体幹細胞である間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）は、骨、軟骨、筋肉、脂肪、線維芽細胞などに分化できる多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞である。前記ＭＳＣは、骨髄、臍帯血、脂肪など多様な成体組織から比較的容易に得ることができる。ＭＳＣは、炎症または損傷部位に移動する特異性があるので、治療薬物を伝達するための伝達体としても大きな長所がある。また、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞のような免疫細胞の機能を抑制したり活性化させて、人体の免疫機能を調節できる。それだけでなく、ＭＳＣは、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で比較的容易に培養できるという長所がある。このような特性によって、ＭＳＣを細胞治療剤として用いるための研究が活発に行われている。

しかしながら、このようなＭＳＣの長所にもかかわらず、細胞治療剤として臨床に使用できる等級のＭＳＣを生産することは次のような問題を有する。第一に、ＭＳＣの増殖に限界があるので、これを大量で生産しにくい。第二に、収得したＭＳＣは、多様な種類の細胞が混合されていて、生産時に同じ効果を維持しにくい。第三に、ＭＳＣのみを用いる場合、治療効果が高くない。最後に、人体に注入されたＭＳＣが体内でがん細胞になる可能性もある。

一方、韓国登録特許第１５８５０３２号公報には、ハイドロゲルで培養した間葉系幹細胞を含有する細胞治療剤を開示している。前記文献には、細胞治療剤として使用するための間葉系幹細胞を分離する工程で前処理過程を短縮してすぐ投与が可能な組成物を提供しているが、上記のような間葉系幹細胞の問題点およびこれを解消するための方案については全く言及していない。したがって、細胞治療剤として使用できる安全かつ効果的な間葉系幹細胞に関する研究が必要である。

これより、本発明者らは、大量生産が可能であり、長期培養中も同じ効果を維持できる幹細胞治療剤を開発するために研究した結果、本発明の不死化遺伝子および外来遺伝子が導入された幹細胞に特定範囲の放射線を照射する場合、導入された外来遺伝子によるタンパク質の発現が安定的に維持され、かつ、幹細胞の増殖が抑制される事実を確認することによって、本発明を完成した。

すなわち、本発明の目的は、不死化遺伝子および外来遺伝子が導入された不死化幹細胞株に放射線を照射する段階を含む、不死化幹細胞株の製作方法および製作された不死化幹細胞株を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記製作された不死化幹細胞を用いた薬剤学的組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明は、不死化遺伝子を導入した幹細胞株を製作する段階と、前記幹細胞株に外来タンパク質をコード化する遺伝子を導入する段階と、前記幹細胞株を凍結保存する段階と、前記凍結した状態の幹細胞株に放射線を照射する段階と、を含む、不死化幹細胞株の製作方法を提供する。

また、本発明は、前記方法によって製作された不死化幹細胞株を細胞治療剤として含む薬剤学的組成物を提供する。

以下、本発明を詳細に説明する。

一態様において、本発明は、
不死化遺伝子を導入した幹細胞株を製作する段階と、
前記幹細胞株に外来タンパク質をコード化する遺伝子を導入する段階と、
前記幹細胞株を凍結保存する段階と、
前記凍結した状態の幹細胞株に放射線を照射する段階と、を含む不死化幹細胞株の製作方法を提供する。

本発明の不死化幹細胞株は、不死化遺伝子を導入して長期継代培養中も幹細胞の特性を維持でき、大量生産時にも同じ品質を維持することによって、安定的に大量生産が可能であるという特徴を有する。

特に、前記製作過程中、凍結保存された幹細胞株に放射線を照射する段階を導入して、不死化遺伝子が導入された幹細胞が増殖することなく、導入されたタンパク質を長期間安定的に発現させることができるので、細胞治療剤として安全に使用できる。

本発明の不死化幹細胞株は、下記の方法で製造できる。
１）宿主細胞にｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃ遺伝子のような不死化遺伝子を導入する段階と、
２）前記不死化遺伝子が導入された宿主細胞に外来遺伝子を導入する段階。

前記１）段階および２）段階で遺伝子の導入方法は、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶなどの多様な方法を使用でき、レンチウイルスを用いる場合、外来遺伝子を含むレンチウイルスの製造時に、外来遺伝子の発現を調節するための特定プロモーターが含まれたベクターをさらに使用でき、この際、前記プロモーターを含む遺伝子をさらに導入する段階を含んでもよい。

これに限定されるものではないが、本発明の一実施例では、レンチウイルスベクターを用いて細胞内に遺伝子を導入し、この際、ドキシサイクリンまたはテトラサイクリンによって発現が調節されるＴＲＥ ｐｒｏｍｏｔｅｒを用い、このために、細胞にｔＴＡ遺伝子を含むレンチウイルスをさらに感染させた。

本発明の幹細胞は、不死化遺伝子が導入されて、不死化したものである。前記１）段階のように、本発明において「不死化遺伝子」は、ｈＴＥＲＴおよび／またはｃ－Ｍｙｃ遺伝子でありうるが、不死化遺伝子として導入可能な他の遺伝子を制限なしに使用できる。

本発明において使用する用語「ｃ－Ｍｙｃ」とは、ヒトの８番染色体に位置する転写因子をコードする遺伝子を意味する。細胞内遺伝子約１５％の発現を調節するｃ－Ｍｙｃにコードされたタンパク質は、転写調節因子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）であって、前記転写調節因子が過発現する場合、細胞活性および増殖が促進される。本発明において「ｈＴＥＲＴ」は、テロメラーゼ逆転写酵素を意味する。前記テロメラーゼ逆転写酵素は、テロメラーゼのＲＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡを合成して、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド形態を成した後、二重鎖ＤＮＡになって宿主細胞の染色体に挿入される。すると、前記宿主細胞は、テロメアの代わりにテロメラーゼが染色体末端小粒に付着してテロメアを続いて生成することになって、不死化細胞を形成できる。

また、前記段階でさらに含まれ得るｔＴＡは、標的タンパク質の発現を調節できる遺伝子であって、テトラサイクリントランスアクチベーターを意味する。本発明において使用されるＴｅｔ－ｏｆｆシステムは、上記で記述したような方法でテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在の有無によって標的タンパク質の発現を調節できる。

本明細書において前記「外来遺伝子」は、幹細胞内に導入されて、外来タンパク質をコード化できる遺伝子をいう。本発明の前記不死化幹細胞株は、導入された外来遺伝子によってコード化されるタンパク質の発現能を維持する特徴を有する。また、前記外来タンパク質は、その種類に限定されるものではなく、幹細胞内に導入されて発現できるものであれば、制限なしに含まれ得る。好ましくは、前記外来タンパク質は、疾患に対する治療効果を有するタンパク質でありうる。

より具体的に、前記外来タンパク質は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経成長因子（ＢＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、 インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨由来成長因子（ＢＭＰ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、角質細胞成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＫＧＦ）のような成長因子、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＴＮＦ、ＩＦ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦのようなサイトカイン、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドタンパク質（ＴＲＡＩＬ）および／またはシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）のようながん治療遺伝子、またはがん組織を標的化できる特定抗原を認知する抗体、ＣＡＲ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）形態の抗体（ｍｏｎｏ ｏｒ ｂｉ、ｔｒｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ）だけでなく、細胞移動を促進させるケモカイン受容体などが制限なしに含まれ得る。本発明の一実施例では、ＢＤＮＦ、ＴＲＡＩＬおよび／またはＣＤを導入した不死化幹細胞株を製作したが、これらに限定されるものではない。

本発明の不死化幹細胞株は、ＢＤＮＦを発現するものでありうる。「脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）」タンパク質は、脳に最も豊富に分布しているニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）である。これは、神経源（ｎｅｕｒｏｎ）の成長を促進し、神経伝達物質の合成、代謝、遊離および神経源の活性を調節することが知られている。また、ＢＤＮＦタンパク質は、うつ病患者の前頭葉皮質または海馬で減少し、その濃度を増加させてうつ病を治療できることが知られている。

本発明によるＢＤＮＦタンパク質は、ヒト由来タンパク質でありうる。前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。前記ＢＤＮＦタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と約８０％、９０％、９５％または９９％以上の相同性を有することができる。一方、前記ＢＤＮＦタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２の塩基配列でありうる。また、前記ＢＤＮＦタンパク質をコードする塩基配列は、配列番号２の塩基配列と約８０％、９０％、９５％または９９％以上の相同性を有することができる。

また、本発明の不死化幹細胞株は、ＴＲＡＩＬおよびＣＤを発現するものでありうる。「ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＮＦ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ、以下、ＴＲＡＩＬという）」タンパク質は、ＴＮＦファミリーのうちＩＩ型トランスメンブレンサイトカインに属する。前記ＴＲＡＩＬは、自殺遺伝子の一つであって、形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導する。具体的に、ＴＲＡＩＬは、細胞表面に存在する細胞死受容体4－４（ＤＲ－４）、ＤＲ－５、デコイ（ｄｅｃｏｙ）受容体またはデコイ受容体－２と結合してアポトーシスシグナル伝達系を活性化させる。ＴＲＡＩＬは、正常細胞に対しては毒性がなく、がん細胞のみにおいて特異的にアポトーシスを誘導することが知られている。

本発明によるＴＲＡＩＬタンパク質は、ヒト由来タンパク質でありうる。前記ＴＲＡＩＬタンパク質は、３つの受容体に結合できるホモトリマー（ｈｏｍｏｔｒｉｍｅｒ）の形態で存在する。本発明のＴＲＡＩＬタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。前記ＴＲＡＩＬタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と約７０％、８０％、９０％または９５％以上の相同性を有することができる。一方、前記ＴＲＡＩＬタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４の塩基配列を有するポリヌクレオチドでありうる。また、前記ＴＲＡＩＬタンパク質をコードする塩基配列は、配列番号４の塩基配列と約７０％、８０％、９０％または９５％以上の相同性を有することができる。

本明細書において使用される用語「ＣＤタンパク質」は、シトシンデアミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）タンパク質であって、「ＣＤとＵＰＲＴ（ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｕｒａｃｉｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ））が結合した融合タンパク質」の形態であってもよく、本明細書において「ＣＤタンパク質」は、「ＣＤ：：ＵＰＲＴ」と混用可能である。本発明によるＣＤタンパク質をコードする遺伝子の配列は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＤａｓｅをコードするＦＣＹ１遺伝子と、Ｎ末端から３５個のアミノ酸が欠失したＵＰＲＴａｓｅをコードするＦＵＲ１△１０５遺伝子を融合してコドン最適化（ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）した配列である。前記配列は、米国特許第５，３３８，６７８号、国際特許公開ＷＯ９６／１６１８３号および国際特許公開ＷＯ９９／５４４８１号に記載されたものでありうる。一実施例によれば、前記ＣＤタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。また、前記ＣＤタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列と約７０％、８０％、９０％または９５％以上の相同性を有することができる。一方、前記ＣＤタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号６の塩基配列を有するポリヌクレオチドでありうる。また、前記ＣＤタンパク質をコードする塩基配列は、配列番号６の塩基配列と約７０％、８０％、９０％または９５％以上の相同性を有することができる。

本明細書において使用される用語「レンチウイルスベクター」は、レトロウイルスの一種である。前記ベクターは、レンチウイルストランスファーベクターと混用して称されることもある。前記レンチウイルスベクターは、感染対象である細胞のゲノムＤＮＡに挿入されて安定的に遺伝子を発現させる。また、前記ベクターは、分裂細胞および非分裂細胞に遺伝子を伝達できる。前記ベクターは、人体の免疫反応を誘導しないため、発現が持続的である。また、従来に使用されるウイルスベクターであるアデノウイルスベクターに比べて大きいサイズの遺伝子をも伝達可能であるという利点がある。

本発明において使用される組換えレンチウイルスベクターは、プロモーターによってこれに乗っている遺伝子の発現を調節できる。前記プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器細胞融合ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト成長因子－１アルファ（ｈｕｍａｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ，ＥＦ－１α）またはＴＲＥ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）プロモーターでありうる。一実施例によれば、組換えレンチウイルスベクターは、１個または２個以上のプロモーターによってＢＤＮＦ、ＴＲＡＩＬおよびＣＤタンパク質の発現を調節できる。前記プロモーターは、発現させようとするタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結される。

本発明の一実施例によれば、前記ＢＤＮＦ、ＴＲＡＩＬおよび／またはＣＤタンパク質は、好ましくは、ＴＲＥプロモーターに連結されてもよい。ＴＲＥプロモーターを使用せずに、他の種類のプロモーターを使用すると、継代が過ぎるほど倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）が増加し、継代が過ぎるほど外来タンパク質の発現量が顕著に減少し、細胞形態が変形されることを確認した。

前記ＴＲＥプロモーターは、ｔＴＡ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）タンパク質によってプロモーターと連結された遺伝子の転写を活性化させることができる。具体的に、ｔＴＡタンパク質は、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）またはドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）が存在しない場合、ＴＲＥプロモーターに結合して転写を活性化させる。その一方で、これらが存在する場合には、ｔＴＡタンパク質がＴＲＥプロモーターに結合しないため、転写を活性化させない。したがって、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在の有無によってＢＤＮＦ、ＴＲＡＩＬおよび／またはＣＤタンパク質の発現を調節できる。

前記用語「作動可能に連結された」は、特定のポリヌクレオチドが当該機能を発揮できるように他のポリヌクレオチドに連結されたことを意味する。すなわち、特定タンパク質をコードする遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されたというのは、当該プロモーターによって遺伝子がｍＲＮＡに転写してタンパク質へと翻訳されうることを意味する。

前記「組換えレンチウイルス」は、本発明のレンチウイルスベクター、パッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）プラスミドおよびエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）プラスミドで宿主細胞を形質転換させる段階と、形質転換した宿主細胞からレンチウイルスを分離する段階を通じて収得できる。

前記用語「パッケージングプラスミド（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄ）」および「エンベローププラスミド（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｌａｓｍｉｄ）」は、タンパク質をコードする遺伝子が乗っているプラスミドである。これらのプラスミドは、レンチウイルスベクター以外に、レンチウイルスを生産するために必要なヘルパー構造物（例えば、プラスミドまたは単離された核酸）を提供できる。このような構造物は、宿主細胞でレンチウイルスベクターを製造し、これをパッケージングするのに有用な要素を含有する。前記要素としては、ＧＡＧ前駆体のような構造タンパク質；ｐｏｌ前駆体のようなプロセッシングタンパク質；プロテアーゼ、外皮タンパク質、および宿主細胞でタンパク質を製造し、レンチウイルス粒子を生産するのに必要な発現および調節シグナルなどを含んでもよい。

組換えレンチウイルスの生産には、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のＬｅｎｔｉ－Ｘ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍや、Ａｄｄｇｅｎｅ社で提供するパッケージングプラスミド（例えば、ｐＲＳＶ－Ｒｅｖ、ｐｓＰＡＸ、ｐＣｌ－ＶＳＶＧ、ｐＮＨＰなど）またはエンベローププラスミド（例えば、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＬＴＲ－Ｇ、ｐＨＥＦ－ＶＳＶＧなど）を使用できる。

前記用語「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ウイルス感染を通じて組換えレンチウイルスベクターに乗っている遺伝子を宿主細胞に伝達することを意味する。

前記宿主細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＥＳ）、骨髄幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）、ヒト神経幹細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＮＳＣ）、角膜上皮幹細胞（ｌｉｍｂａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または口腔粘膜上皮細胞（ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）でありうる。本発明の一実施例によれば、前記宿主細胞は、間葉系幹細胞でありうる。

前記用語「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）」は、骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞を含む多様な細胞に分化できる多分化能間質細胞をいう。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、腱、神経組織、線維芽細胞および筋肉細胞など具体的な臓器の細胞に分化できる。これら細胞は、脂肪組織、骨髄、末梢神経血液、臍帯血、骨膜、真皮、中胚葉由来組織などから分離または精製できる。

本発明の一実施例において、前記不死化間葉系幹細胞株は、生体外（Ｅｘ ｖｉｖｏ）でドキシサイクリン処理によって外来遺伝子の発現が抑制され、ドキシサイクリン除去によって外来遺伝子が発現するように製作された細胞株でありうる。

本発明の一実施例において、前記不死化間葉系幹細胞株は、ドキシサイクリン除去培地（ＤＭＥＭ－ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ、１０％ ＦＢＳ）で３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で４８時間培養した場合、１×１０^５ｃｅｌｌｓからドキシサイクリン処理培地と比較して４０００倍以上、３０００倍以上、１０００倍以上、５００倍以上、１００倍以上、１０倍以上、３倍以上、好ましくは、３～６０００倍、３～５０００倍、３～４０００倍、３～３０００倍、３～２０００倍、３～１０００倍、３～５００倍、３～３００倍、３～１００倍、３０～６０００倍、３０～４０００倍、３０～３０００倍、３０～１０００倍、３００～６０００倍、３００～３０００倍または３００～１０００倍以上増加したレベルでＢＤＮＦタンパク質を発現する細胞株でありうる。

本発明の一実施例において、本発明のＢＤＮＦを発現する不死化間葉系幹細胞株は、単クローンの調製後、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅでドキシサイクリン除去後、４８時間培養時、ＴＲＥプロモーターによってＢＤＮＦ発現が１．５ｎｇ／ｍｌ以上発現するクローンを１次選別し、１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで１×１０^５細胞にドキシサイクリン処理し、４８時間培養時、ＢＤＮＦ発現が０．５ｎｇ／ｍｌを超えないクローンを２次選別した後、最終クローン候補をもう一度単クローンの調製後に選別した。

本発明の一実施例において、本発明の不死化間葉系幹細胞株は、長期継代培養時にも、表面抗原タンパク質であるＣＤ４４およびＣＤ１０５タンパク質を発現して、間葉系幹細胞が有する固有な特性が維持される細胞株でありうる。また、本発明の一実施例において、本発明の不死化間葉系幹細胞株は、１００日まで長期継代培養時にも、間葉系幹細胞の形態変化がないため、形態学的に間葉系幹細胞の特性が維持される細胞株でありうる。

本発明の不死化間葉系幹細胞株は、長期継代培養時にも、安定的に増殖し、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）が５～２５時間、５～２０時間、５～１５時間、１０～２５時間、１０～２０時間または１０～１５時間と短いため、短い時間内に大量生産が可能な細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）でありうる。本発明の一実施例では、本発明の不死化間葉系幹細胞株が１００日以上の長期継代培養時にも、安定的に増殖し、倍加時間（Ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉｍｅ）が１４～２５時間、平均１６時間と短いことを確認した。

本発明の不死化間葉系幹細胞株は、製作後、凍結保存される。前記凍結保存は、当該技術分野における公知の方法によって行われてもよく、特にその方式が限定されるものではない。凍結保存される温度は、特に限定されるものではないが、－７０～－２００℃の範囲でありうる。本発明の一実施例では、液体窒素タンクに前記細胞株を保管し、以後の段階でも凍結保存された状態を維持した。

本発明の不死化間葉系幹細胞株は、大量生産のための不死化遺伝子の導入時に発生する細胞増殖を抑制するために、人体に投与される細胞治療剤として使用される前に、放射線を照射する段階を含んで製作される。

本明細書において用語「放射線照射」は、放射線源から放出される放射線が間葉系幹細胞においてイオン化エネルギーが感受性の高いＤＮＡに作用して直接有効な電離を起こしてＤＮＡ鎖が切断される原理を利用して、放射線を照射した間葉系幹細胞は増殖能力を喪失するが、生存期間中に導入された治療遺伝子の発現が維持されることを特徴とする。

本発明において放射線は、間葉系幹細胞の増殖を抑制させることができるものであれば、ガンマ線、ベータ線、中性子線、エックス線、電子線など種類に限定されずに使用できる。

本発明において前記放射線の「照射線量」は、任意の場所におけるエックス線やガンマ線など放射線が空気中で移動しながら作るカチオンまたは電子エネルギー量の量をいう。したがって、前記照射線量は、放射線照射器の種類、照射される環境および被爆時間などによって実際被験体に吸収される線量に差異を示す。したがって、本発明において照射される放射線の線量は、被験体に放射線のエネルギーが媒質に吸収された程度を示す単位である「吸収線量」に基づいて測定した。すなわち本発明では、不死化幹細胞株が吸収した放射線エネルギーの量にてその範囲を測定した。

本発明の一実施例では、不死化幹細胞株としてＢＤＮＦが導入されたＢＭ１０２、ＢＭ０１Ａ細胞株と、ＴＲＡＩＬおよびＣＤが導入されたＢＭ０３細胞株に対して、放射線照射試験を実施し、その結果、特定の吸収線量以上の放射線を吸収した細胞株において、コロニー生成および細胞数の増加がなされないことを確認することによって、前記不死化幹細胞株が細胞治療剤として使用できる最小吸収線量を測定した。

すなわち、本発明において吸収線量は、放射線が吸収された幹細胞株を基準として、少なくとも８０Ｇｙを超過する範囲であってもよく、好ましくは、８１Ｇｙ、８２Ｇｙ、８３Ｇｙ、８４Ｇｙ、８５Ｇｙ、８６Ｇｙ、８７Ｇｙ、８８Ｇｙ、８９Ｇｙ、９０Ｇｙを超過する範囲であってもよく、より好ましくは、８０Ｇｙ～４００Ｇｙの吸収線量の範囲であってもよい。ただし、前記範囲を超過する吸収線量で照射された場合にも、幹細胞の増殖が発生せず、外来タンパク質の発現が維持されることを確認した。前記確認した吸収線量の上限は、実験上測定された範囲であり、その上限が特に制限されるという意味ではない。本発明の一実施例から確認したところ、照射線量の観点から、５００Ｇｙ以上の放射線照射時にも、本発明の細胞株は臨床試料への使用に適した。

また、本発明の一実施例において、幹細胞株が吸収する吸収線量の範囲は、下記の範囲を満たす。
照射線量０～１００Ｇｙであるとき、照射線量の９０～１１０％；
照射線量１００～２００Ｇｙであるとき、照射線量の８５～１１５％；および
照射線量２００Ｇｙ以上であるとき、照射線量の６０～１１０％。

前記範囲を満たす場合、本願発明の不死化幹細胞株は、コロニー形成および細胞数の増加がなされず、導入された外来遺伝子の発現量が一定レベル以上に維持された。これは、不死化遺伝子を導入して大量生産が可能になるように製作した幹細胞株の安全性を確認した結果である。

本発明の一実施例において、前記製作過程によって製作された間葉系幹細胞株は、ＴＲＥ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）プロモーター遺伝子および脳由来神経栄養因子（ｂｒａｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ，ＢＤＮＦ）タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えレンチウイルスで形質感染した不死化間葉系幹細胞株であって、前記細胞株は、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）でドキシサイクリンを処理して培養した間葉系幹細胞株と比較してドキシサイクリンを除去して培養した間葉系幹細胞株において遺伝子の発現様相が下記のように現れる不死化間葉系幹細胞株を提供する：
ＢＤＮＦ過発現；
ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴ１、ＣＥＮＤ１、ＮＦＡＳＣ、ＧＲＡＰ２またはＴＲＩＭ６遺伝子の発現量増加；および
ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ６、ＩＬ１ＢまたはＰＴＧＳ２の発現量減少。

前記不死化間葉系幹細胞株は、生体外（Ｅｘ ｖｉｖｏ）でドキシサイクリン処理によってＢＤＮＦ発現が抑制され、ドキシサイクリン除去によってＢＤＮＦが発現する不死化間葉系幹細胞株であって、ＢＤＮＦの発現有無によって転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）が変化可能である。

本明細書において用語「転写産物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）」とは、発現したすべてのＲＮＡの総和を意味する。本発明の不死化間葉系幹細胞株は、ドキシサイクリン処理の前後と比較して次のようなＲＮＡの変化を含んでもよい。

本発明の一実施例において、不死化間葉系幹細胞株をドキシサイクリンが添加された培地で増殖させ、ドキシサイクリンを除去した場合、ＢＤＮＦが過発現し、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴ１、ＣＥＮＤ１、ＮＦＡＳＣ、ＧＲＡＰ２およびＴＲＩＭ６からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の遺伝子の発現が増加し、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ６、ＩＬ１ＢまたはＰＴＧＳ２遺伝子の発現が減少することを確認した（図１０ａ）。

本発明のＡＮＧＰＬＴ４（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ ｌｉｋｅ ４）およびＡＮＧＰＴ１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｉｎ １）は、血管生成過程に関連していることが知られており、ＩＬ２ＲＢ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｂｅｔａ）、ＩＬ６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６）、ＩＬ１Ｂ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｂｅｔａ）およびＰＴＧＳ２（ｐｒｏｓｔａｇｌｎｄｉｎ－ｅｎｄｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ２）は、炎症に関連していて、ＣＥＮＤ１（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １）およびＮＦＡＳＣ（ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ）は、神経生成過程に関連していて、ＧＲＡＰ２（ＧＲＢ２－ｒｅｌａｔｅｄ ａｄａｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）およびＴＲＩＭ６（Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｍｏｔｉｆ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ６）は、免疫システムに関連していることが知られている。

本発明の一実施例において、前記不死化間葉系幹細胞株は、ドキシサイクリンが添加された培地で増殖させ、ドキシサイクリンを除去した場合、ＨＬＦ、ＲＯＲ２、またはＩＣＡＭ１遺伝子の発現量が減少し、ＣＥＢＰＢ、ＥＧＲ２、ＢＭＰ８Ａ、ＢＥＸ２、ＫＬＦ４、ＴＮＦＳＦ１５、ＰＴＢＰ３またはＩＧＦＢＰ２遺伝子の発現量が減少することをさらに確認した（図１０ｂ）。

本発明のＨＬＦ（ＨＬＦ、ＰＡＲ ｂＺＩＰ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）、ＲＯＲ２（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｌｉｋｅ ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）およびＩＣＡＭ１（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １）遺伝子は、細胞分化、移動および増殖を調節する遺伝子であることが知られている。

また、ＣＥＢＰＢ（ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔａ）、ＥＧＲ２（ｅａｒｌｙ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、ＢＭＰ８Ａ（Ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ８ａ）、ＢＥＸ２（ｂｒａｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ２）、ＫＬＦ４（ｋｒｕｐｐｅｌ ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）、ＴＮＦＳＦ１５（ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｍｅｍｂｅｒ １５）、ＰＴＢＰ３（ｐｏｌｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｔｒａｃｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ３）およびＩＧＦＢＰ２（ｉｎｓｕｌｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）は、アポトーシスを調節する遺伝子であることが知られている。

本発明の一実施例において、前記不死化間葉系幹細胞株は、ドキシサイクリンが添加された培地で増殖させ、ドキシサイクリンを除去した場合、ＭｉＲ４４４４－１、ＭｉＲ４４４４－２、ＭｉＲ１２４４－１の発現が増加し、ＭｉＲ１２４４－４、ＭｉＲ３１９Ｉ、ＭｉＲＬＥＴ７Ｄの発現が減少することをさらに確認した（図１０ｃ）。

さらに他の態様において、本発明は、上記で記述したような方法によって製作された不死化間葉系幹細胞株を含む薬剤学的組成物を提供する。前記薬剤学的組成物は、不死化間葉系幹細胞株に導入された外来遺伝子から発現するタンパク質を有効成分とするものでありうる。

前記薬剤学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。前記担体は、薬品の製造時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイルなどを含んでもよい。

また、本発明の薬剤学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれる薬学的に許容可能な添加剤をさらに含んでもよい。

前記担体は、本発明の薬剤学的組成物の総重量に基づいて約１重量％～約９９．９９重量％、好ましくは、約９０重量％～約９９．９９重量％で含まれ得、前記薬学的に許容可能な添加剤は、約０．１重量％～約２０重量％で含まれ得る。

前記薬剤学的組成物は、通常の方法によって、薬学的に許容される担体および賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量の形態で製造したり、または多用量容器内に内入させて製造できる。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉末、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。

本発明の一実施例において、ＢＤＮＦによって良好に成長することが知られた神経膠細胞Ｃ６をＢＭ１０２細胞株と共培養した場合、ＢＭ１０２細胞株の数字に比例してＣ６細胞の増殖率が増加することから、ＢＭ１０２細胞株が細胞治療剤として使用できるほどにＢＤＮＦを安定的に大量生産することができ、ＢＤＮＦを安定的に発現するＢＭ１０２細胞株が神経細胞を保護したり治療する細胞治療剤として使用できることを確認した（図２２）。

また、本発明の一実施例では、ＢＭ１０２細胞株が細胞培養時に形質転換能力がなく、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）腫瘍原性がないことを確認した（図２１）。

これより、本発明の不死化間葉系幹細胞株は、ＢＤＮＦおよび不死化遺伝子が導入された形質転換された細胞であるにもかかわらず、腫瘍原性がなく、ＢＤＮＦの発現を通じて神経保護効果を示すことができるので、多様な中枢神経障害の治療に安全に使用できる。

前記神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、ルーゲリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、脳梗塞、慢性脳損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、虚血性脳疾患、脊髄損傷、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）、レット病（Ｒｅｔｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＤ）、脳卒中、多発性硬化症、外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、新生児虚血性脳症（Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）および勃起不全からなる群から選ばれ得る。

また、本発明は、本発明の薬剤学的組成物を個体に投与する段階を含む、上記で記述したような神経疾患を予防または治療する方法を提供する。

前記個体は、哺乳動物、具体的に、ヒトでありうる。前記薬剤学的組成物の投与経路および投与量は、患者の状態および副作用の有無によって多様な方法および量で被験体に投与でき、最適な投与方法および投与量は、通常の技術者が適切な範囲で選択できる。また、前記薬剤学的組成物は、治療しようとする疾患に対して治療効果が公知となった他の薬物または生理学的活性物質と併用して投与したり、他の薬物との組み合わせ製剤の形態で剤形化できる。

前記薬剤学的組成物を非経口的に投与する場合、その例としては、皮下、眼、腹腔内、筋肉内、口腔、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内（ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ）、脊椎および髄腔内、脳室内、髓腔内、鼻内、静脈内、頚動脈を含む動脈投与がある。

前記投与は、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、１～４回以上投与でき、具体的に２回に分けて投与できる。これを反復投与する場合には、１２～４８時間、２４～３６時間隔、１週間、２週間～４週間の間隔で投与でき、具体的には、２４時間または１週間以上の間隔で投与できる。前記投与は、レンチウイルスの場合、成人を基準として１日に１．０×１０^６～１．０×１０^１２ ＴＵ、具体的に、１．０×１０^８～１．０×１０^１０ ＴＵの量で投与できる。一方、細胞の場合、成人を基準として１日に１．０×１０^５～１．０×１０^１１ ｃｅｌｌｓ、具体的に１．０×１０^７～１．０×１０^９ ｃｅｌｌｓの量で投与できる。投与量が多い場合には、１日に数回にわたって投与できる。

本発明の不死化幹細胞株の製作方法は、不死化遺伝子および外来遺伝子が導入された幹細胞株に放射線を照射する段階をさらに含み、これによって、異常分化および増殖の可能性が低いため、安全性が高いと同時に、治療成分として使用可能な外来タンパク質の発現量が長期間維持される不死化幹細胞株を製作できる。また、前記製作方法によって製作された不死化幹細胞株は、多様な疾患の予防または治療用薬剤学的組成物に有用に活用可能である。

図１は、ｃ－Ｍｙｃによって不死化したＭＳＣ（ＳＴＥＭ２４）と不死化しないＭＳＣ（ＢＭ－ＭＳＣ）の細胞増殖率を比較したグラフである： Ｘ軸：培養期間；および Ｙ軸：累積細胞集団倍加数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）。 図２は、ｃ－ＭｙｃおよびｈＴＥＲＴが導入されて不死化したＭＳＣと不死化しないＭＳＣの細胞増殖率を比較したグラフである： ｉｍＭＳＣ：不死化ＭＳＣ； ＭＳＣ：不死化しないＭＳＣ； Ｘ軸：培養期間；および Ｙ軸：累積細胞集団倍加数。 図３ａは、ＢＤＮＦタンパク質発現量が確認されたクローンのドキシサイクリンの存在の有無によるＢＤＮＦタンパク質発現量を示すグラフであり、図３ａは、本発明のＢＭ１０２、を選別するためのクローンの発現量を示す図である。 図３ｂは、ＢＤＮＦタンパク質発現量が確認されたクローンのドキシサイクリンの存在の有無によるＢＤＮＦタンパク質発現量を示すグラフであり、図３ｂは、ＢＭ０１Ａを選別するためのクローンの発現量を示す図である。 図４は、ＢＭ１０２単クローン細胞株の遺伝子操作後のＭＳＣが有する固有な特性である表面抗原タンパク質ＣＤ４４とＣＤ１０５などの発現と骨髓由来ＭＳＣの表面抗原タンパク質の発現を比較して示す図である。 図５は、ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスで形質導入された不死化ＭＳＣの細胞を長期培養することで増殖率を確認したグラフである： Ｘ軸：培養期間；および Ｙ軸：累積細胞集団倍加数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）。 図６は、ドキシサイクリンの処理有無によるＢＭ１０２の細胞増殖率を長期培養することで確認したグラフである。 Ｘ軸：培養期間；および Ｙ軸：累積細胞集団倍加数（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｌｅｖｅｌ，ＰＤＬ）。 図７は、ドキシサイクリンの処理有無によるＢＭ１０２細胞株の各継代別に形態学的に細胞の特性が維持されることを確認した図である。 図８は、ドキシサイクリンの処理有無によるＢＭ１０２細胞株のＢＤＮＦタンパク質発現量を示すグラフである。 図９は、ＢＭ１０２細胞株に遺伝子が導入されたことを確認した図である。 図１０ａは、ドキシサイクリンの処理有無によるＢＭ１０２細胞株の転写産物を比較して変化する遺伝子を示す図である。図１０ａは、ドキシサイクリン除去によってＢＭ１０２細胞株において血管生成、炎症、神経生成および免疫システム過程に関連していると知られた遺伝子の転写産物の変化を示す図である。増加した転写産物の数値は正の値であり、減少した転写産物の数値は負の値で示した。 図１０ｂは、ドキシサイクリン除去によってＢＭ１０２細胞株において細胞分化、移動、増殖およびアポトーシスに関連していると知られた遺伝子の転写産物の変化を示す図である。増加した転写産物の数値は正の値で、減少した転写産物の数値は負の値で示した。 図１０ｃは、ドキシサイクリン除去によってＢＭ１０２細胞株においてｍｉｃｒｏ ＲＮＡ遺伝子の転写産物の変化を示す図である。増加した転写産物の数値は正の値で、減少した転写産物の数値は負の値で示した。 図１１は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ１０２）にガンマ線を照射した後、細胞数を測定した結果を示す図である。 図１２は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ１０２）にエックス線を照射した後、細胞数を測定した結果を示す図である。 図１３は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ１０２）にガンマ線を照射した後、細胞力価の変化をＢＤＮＦ発現量を通じて確認した結果である。 図１４は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ１０２）にエックス線を照射した後、細胞力価の変化をＢＤＮＦ発現量を通じて確認した結果（１次）である。 図１５は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ１０２）にエックス線を照射した後、細胞力価の変化をＢＤＮＦ発現量を通じて確認した結果（２次）である。 図１６は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ０１Ａ）にガンマ線を照射した後、細胞数を測定した結果を示す図である。 図１７は、ＢＤＮＦ発現不死化幹細胞株（ＢＭ０１Ａ）にガンマ線を照射した後、細胞力価の変化をＢＤＮＦ発現量を通じて確認した結果である。 図１８は、ＴＲＡＩＬおよびＣＤを発現する不死化幹細胞株（ＢＭ０３）に低準位ガンマ線を照射した後、細胞数を測定した結果である。 図１９は、ＴＲＡＩＬおよびＣＤを発現する不死化幹細胞株（ＢＭ０３）に高準位ガンマ線を照射した後、細胞数を測定した結果である。 図２０は、ＴＲＡＩＬおよびＣＤを発現する不死化幹細胞株（ＢＭ０３）に低準位ガンマ線を照射した後、細胞力価の変化を前記ＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子発現量を通じて確認した結果である。 図２１は、ＢＭ１０２細胞株の遺伝子操作後にも腫瘍原性がないことを確認したグラフである。 図２２は、ＢＭ１０２細胞株とＣ６細胞を共培養時におけるＣ６細胞の増殖率を確認したグラフである。Ｘ軸：ＢＭ１０２細胞数；およびＹ軸：Ｃ６細胞の増殖率。

一態様において、本発明は、不死化遺伝子を導入した幹細胞株を製作する段階と、前記幹細胞株に外来タンパク質をコード化する遺伝子を導入する段階と、前記幹細胞株を凍結保存する段階と、前記凍結した状態の幹細胞株に放射線を照射する段階と、を含む、不死化幹細胞株の製作方法に関する。

本発明の一実施態様において、前記不死化遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃおよび／またはｈＴＥＲＴである。

本発明の一実施態様において、前記外来タンパク質は、成長因子、サイトカインまたはがん治療タンパク質、抗体およびケモカイン受容体の中から選ばれるものである。

本発明の一実施態様において、前記不死化幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＥＳ）、骨髄幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）、ヒト神経幹細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＮＳＣ）、角膜上皮幹細胞（ｌｉｍｂａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または口腔粘膜上皮細胞（ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）である。

本発明の一実施態様において、前記放射線は、幹細胞株に対する吸収線量が少なくとも８０Ｇｙになるように照射されるものであり、より具体的に、前記吸収線量は、照射線量０～１００Ｇｙであるとき、照射線量の８０～１４０％；照射線量１００～２００Ｇｙであるとき、照射線量の８０～１４０％；および照射線量２００Ｇｙ以上であるとき、照射線量の６０～１４０％の範囲を満たす。

本発明の一実施態様において、前記放射線は、ガンマ線、ベータ線、中性子線、エックス線および電子線を含む群から選はれるものである。

他の態様において、本発明は、前記方法によって製作された不死化幹細胞株を含む薬剤学的組成物に関する。

本発明の一実施態様において、前記薬剤学的組成物は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現する不死化幹細胞株を含むものである。

本発明の一実施態様において、前記薬剤学的組成物は、神経疾患の予防または治療効果を有するもので、前記神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、ルーゲリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、脳梗塞、慢性脳損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、脊髄損傷、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）、レット病（Ｒｅｔｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＤ）、虚血性脳疾患、脳卒中および外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、新生児虚血性脳症（Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、多発性硬化症からなる群から選はれるものである。

さらに他の態様において、本発明は、前記方法によって製作された不死化幹細胞株の細胞治療剤としての用途に関する。

さらに他の態様において、本発明は、前記方法によって製作された不死化幹細胞株を治療的に有効な量で個体に投与して疾患を治療する方法に関する。

以下、本発明を下記実施例に基づいて詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明がこれらによって限定されるものではない。

実施例１．不死化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の製造
実施例１．１．不死化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの製造
ＭＳＣを不死化させるために、不死化遺伝子ｃ－Ｍｙｃおよび／またはｈＴＥＲＴを含むレンチウイルスベクターを製造した。この際、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムを使用するために、ｔＴＡタンパク質を発現する遺伝子コンストラクトを共に挿入した。

まず、ｐＷＰＴベクター（Ｂｉｏｎｅｅｒ合成）の発現カセット内にＥＦプロモーターをＣＭＶプロモーターに置換してｐＢＤレンチウイルスベクターを製作した。前記ｐＢＤレンチウイルスベクターに、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（配列番号７）をＣＭＶプロモーターによって発現が調節されうるように挿入した。前記製作されたベクターは、ｐＢＤ－１と命名した。

一方、ｐＢＤレンチウイルスベクターに、ｈＴＥＲＴ遺伝子（配列番号８）をＣＭＶプロモーターによって発現が調節されうるように挿入した。そこに、ゼオマイシン（ｚｅｏｍｙｃｉｎ）に対する抵抗性を有する遺伝子（ＺｅｏＲ；配列番号１２）は、ＲＳＶプロモーターによって発現が調節されうるように挿入した。前記製作されたベクターは、ｐＢＤ－２と命名した。

また、ｐＢＤレンチウイルスベクターに、ｔＴＡ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ）遺伝子配列番号９）をＣＭＶプロモーターによって発現が調節されうるように挿入した。製作されたベクターは、ｐＢＤ－３と命名した。

実施例１．２．不死化遺伝子を含むレンチウイルスの生産
前記実施例１．１．で製作されたレンチウイルスベクターを用いて、次のような方法で不死化遺伝子を含むレンチウイルスを生産した。

まず、レンチ－Ｘ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）は、１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地を用いて１５０ｍｍディッシュ（ｄｉｓｈ）に培養した。一方、レンチウイルスベクターは、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｎ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、米国）を用いてＤＨ５α大腸菌細胞から抽出および定量した。

前記培養されたレンチ－Ｘ細胞をＰＢＳで洗浄した後、３ｍｌのＴｒｙｐＬＥ^ＴＭ Ｓｅｌｅｃｔ ＣＴＳ^ＴＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）を添加した。細胞を３７℃で約５分間放置した後、細胞が脱離されたことを確認した。脱離された細胞を７ｍｌの１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培地を添加して中和させた。中和した細胞は、５０ｍｌチューブに集めて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄み液を除去し、１０ｍｌの１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭ培養培地を添加して細胞を再懸濁した。

懸濁された細胞は、 ヘモサイトメーターで数を測定した後、１５０ｍｍディッシュに１．２×１０^７個の細胞になるように分注した。前記分注した細胞の細胞飽和度が約９０％程度に培養されたとき、１２μｇのレンチウイルスベクター、１２μｇのｐｓＰＡＸ（Ａｄｄｇｅｎｅ；ｇａｇ－ｐｏｌ発現、パッケージングプラスミド）および２．４μｇのｐＭＤ．Ｇプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ；ＶＳＶＧ発現、エンベローププラスミド）混合物を前記細胞に形質導入した。形質導入を助けるために、リポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）とプラスリエージェント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を使用した。形質導入６時間後、１０％ウシ胎児血清が含まれたＤＭＥＭに培地を交換した。これを４８時間追加培養した後、上澄み液を集めた。

前記収得した上澄み液をレンチウイルス濃縮キット（Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）と混合した後、４℃で一晩中培養した。これを４℃、４，０００ｒｐｍの条件で２時間遠心分離してウイルスを収得し、これをＦＢＳが含まれていない０．５ｍｌのＤＭＥＭに再懸濁した。

実施例１．３．不死化間葉系幹細胞の製造
前記実施例１．２．で生産された不死化遺伝子を含むレンチウイルスを用いて不死化ＭＳＣを製造した。

まず、骨髄由来ＭＳＣを次のような方法で準備した。具体的に、健康な供与者（ｄｏｎｏｒ）の腸骨稜（ｉｌｉａｃ ｃｒｅｓｔ）から骨髄穿刺液（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｓｐｉｒａｔｅ）を収得した。これを滅菌コンテナで２０ＩＵ／ｍｌのヘパリンと混合して凝固を抑制した。前記骨髄混合液を４℃、７３９Ｇの条件で７分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、１０倍体積の滅菌された水と混合した。これを同じ条件でさらに遠心分離して、細胞のペレットを収得した。収得されたペレットを２０％のウシ胎児血清および５ｎｇ／ｍｌのｂ－ＦＧＦ（１００－１８Ｂ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国）が含まれたＤＭＥＭ－ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ（１１８８５－０８４、Ｇｉｂｃｏ、米国）培地に懸濁して、培養フラスコに分注した。これを３７℃、５％ＣＯ_２の条件で２４～４８時間培養した後、新しい培地に交替した。これを３～４日の間隔で新しい培地に交替しつつ、継代培養し、培養２週後に蛍光細胞分析装置を用いてＭＳＣの有無を確認した。

前記実施例１．２．で生産されたｐＢＤ－１レンチウイルスにより前記準備したＭＳＣをレトロネクチン（Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）を用いて１００ＭＯＩで感染させた。その結果、ｃ－ｍｙｃを含むＭＳＣおよびそうでないＭＳＣの細胞増殖率を図１に示した。図１に示されたように、不死化遺伝子ｃ－Ｍｙｃを含むレンチウイルスによって感染したＭＳＣ細胞は、不死化遺伝子によって不滅化するにつれて、感染後に培養３０日を基準として増殖率が増加し、５０日まで高い増殖率を維持した。その一方で、正常ＭＳＣ細胞は、培養２０日以降には細胞増殖率が急激に減少した。

また、前記ｃ－Ｍｙｃを含むレンチウイルスによって感染した細胞に、ｈＴＥＲＴを含むｐＢＤ－２レンチウイルスベクターを１００ＭＯＩで感染させた。感染後、安定化した細胞の培養液に５００μｇ／ｍｌのゼオマイシンを添加して、ｐＢＤ－２レンチウイルスに感染した細胞を選別した。

これについては、図２から明らかなように、不死化遺伝子ｃ－ＭｙｃおよびｈＴＥＲＴを両方とも含むレンチウイルスによって感染したＭＳＣ細胞は、培養１２０日以降にも高い細胞増殖率を維持した。その一方で、正常ＭＳＣ細胞は、培養４０日以降には細胞増殖率が急激に減少した。

また、前記ｐＢＤ－１および／またはｐＢＤ－２に感染した細胞にｔＴＡを含むｐＢＤ－３レンチウイルスベクターを１００ＭＯＩで感染させた。感染後、安定化した細胞の培養液に１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加して、ｐＢＤ－３レンチウイルスに感染した細胞を選別した。

実施例２．外来遺伝子を含むレンチウイルスの製作
実施例２．１．ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスの製作
前記実施例１．１．で製作したｐＢＤレンチウイルスベクターに、ＢＤＮＦ遺伝子（配列番号２）を挿入した。

まず、ＢＤＮＦ発現に及ぼすプロモーターの影響を確認するために、ＣＭＶプロモーターおよびＴＲＥプロモーターをそれぞれ用いてＢＤＮＦ遺伝子が発現するようにレンチウイルスベクターを製造し、これを用いてＢＤＮＦ遺伝子を発現するＭＳＣを製造した。その結果、ＣＭＶプロモーターが適用された細胞株の場合、長期継代培養時にＢＤＮＦを発現するＭＳＣが形態学的に変化し、継代培養が進められるほどＢＮＤＦの発現率が減少することを確認した。

これより、ＢＮＤＦ遺伝子をＴＲＥプロモーターによって発現が調節されるようにそれぞれのｐＢＤベクターに挿入した。ＴＲＥプロモーターは、ドキシサイクリンの添加有無によって前記プロモーターと連結された遺伝子の発現を調節できる。

また、前記製作されたＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスベクター（ｐＢＤ－４およびｐＢＤ－５）を用いて、前記実施例１．２．の記載と同じ方法でレンチウイルスを生産した。生産されたレンチウイルスは、４．７×１０^６ ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ（ｐＢＤ－４）、１．４×１０^１２ ｃｏｐｉｅｓ／ｍｌ（ｐＢＤ－５）の濃度でそれぞれ準備した。

実施例２．２．ＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスの製作
ＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスは、韓国登録特許第１０－１９８５２７１号公報に記載された内容によって製作した。前記実施例１．１で製作されたｐＢＤレンチウイルスベクターに、ＴＲＡＩＬ遺伝子（配列番号４）およびＣＤ遺伝子（配列番号６）を挿入した。この際、挿入されたＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子がＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）に連結され、ＴＲＥプロモーターによって発現が調節されるようにした。ＩＲＥＳは、リボソーム結合部位であり、５’－キャップ構造がなくても翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）が開始できるようにして、一つのｍＲＮＡで２つのタンパク質が発現できるようにする。一方、ＴＲＥプロモーターは、ドキシサイクリンの添加有無によって前記プロモーターと連結された遺伝子の発現を調節できる。

前記ＴＲＡＩＬおよびＣＤが挿入されたベクターは、ｐＢＤ－６と命名し、これを用いて、前記実施例１の記載と同じ方法でレンチウイルスを生産した。生産されたレンチウイルスは、７．６×１０^８ ＴＵ／ｍｌの濃度で準備した。

実施例３．外来遺伝子を含むレンチウイルスで形質感染した不死化幹細胞の製作
実施例３．１．ＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスで形質感染したＭＳＣの製作
３．１．１．ＢＭ１０２細胞株の製作
前記実施例１．３．で製造した不死化ＭＳＣに、前記実施例２．１．で生産したＢＤＮＦ遺伝子を含むレンチウイルスを１００ＭＯＩ感染させて、ＢＤＮＦ遺伝子を発現する細胞を製造した。ここで、前記レンチウイルスは、不死化遺伝子のうちｃ－Ｍｙｃが導入されたｐＢＤ－１ベクターによって生産されたものを使用した。形質導入された細胞は、２μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、６３１３１１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）が添加された培地で培養することによって、培養中にＢＤＮＦタンパク質の発現を抑制させた。

Ｃｌｏｎｅ ｓｅｌｅｃｔ ｉｍａｇｅｒを用いて前記細胞がコロニーを形成するように培養した。９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅで細胞を接種したｗｅｌｌ別に番号を付与した後、コロニーの形成を確認した２００個余りのクローンのうちヒトＢＤＮＦ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ２４８、米国）でＢＤＮＦタンパク質の発現有無を確認した。

前記細胞のうち、ｐＢＤ－４を導入したレンチウイルスによって製作された不死化ＭＳＣは、ドキシサイクリンの除去後、ＢＤＮＦタンパク質を１．５ｎｇ／ｍｌ以上発現する＃１０、＃２２、＃２８、＃６５、＃１１０、＃１１６、＃１２６、＃５９６、＃６６９および＃７４１クローンを選別した。その後、ドキシサイクリン処理時に、ＢＤＮＦタンパク質を０．５ｎｇ／ｍｌ以下で発現する＃２８と＃１１０クローンを選別した（図３ａ）。

前記選別されたクローンの細胞増殖能を確認した結果、安定した増殖パターンを示し、ＢＤＮＦタンパク質発現量が最も優秀な＃２８クローンをＢＭ１０２細胞株と命名し、特許菌株として寄託した（韓国生命工学研究院、ＫＣＴＣ１３８７６ＢＰ）。

３．１．２．ＢＭ０１Ａ細胞株の製作
また、前記３．１．１と同一に、ｐＢＤ－１とｐＢＤ－２を導入したレンチウイルスによって感染させた不死化ＭＳＣを製作した。前記細胞株の製造方法は、韓国登録特許第１０－２０７４３３６号に記載された方法によって製作した。ウイルス感染後、細胞を安定化させた後、培養液に５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加して、ｃ－ＭｙｃおよびｈＴＥＲＴ遺伝子が両方とも導入されたｐＢＤ－５レンチウイルスに感染した細胞を選別した。選別された細胞は、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、６３１３１１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）が添加された培地で培養することによって、培養中にＢＤＮＦタンパク質の発現を抑制した。

前記選別された細胞がコロニーを形成するように培養した。ヒトＢＤＮＦ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＹ２４８、米国）でＢＤＮＦタンパク質の発現有無を確認して、形成された＃１～＃５０のクローンのうちＢＤＮＦタンパク質を発現する＃１０、＃１２、＃１４、＃１８、＃２０、＃２２、＃２３、＃２６、＃２９および＃４１クローンを選別し、ドキシサイクリン処理時にＢＤＮＦタンパク質を発現しない＃１４、＃２２、＃２３および＃４１クローンを再選別した（図３ｂ）。同じ方法で細胞増殖能を確認し、安定した増殖パターンを示し、発現量が最も優秀な＃４１クローンをＢＭ－０１Ａ細胞株と命名した。

実施例３．２．ＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスに形質感染したＭＳＣの製造
韓国登録特許第１０－１９８５２７１号に記載された方法によって、前記実施例１－３で製造した不死化ＭＳＣに、前記実施例２－２で生産したＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスを感染させて、ＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子を発現する細胞を製造した。感染は、実施例１－３の記載と同じ方法で行われた。感染後、安定化した細胞の培養液に１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、６３１３１１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、米国）を添加して、ＴＲＡＩＬおよびＣＤの発現を抑制させた状態で培養した。細胞が安定化した後、ドキシサイクリンを除去した培養培地で７２時間培養してＴＲＡＩＬおよびＣＤの発現を誘導させ、前記細胞でＦＡＣＳを行って、細胞表面にＴＲＡＩＬを発現する細胞を選別した。

具体的に、ＴＲＡＩＬおよびＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスに感染した細胞をＦＡＣＳチューブ当たり５×１０^５個になるように分注し、これを４℃で、１，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離して、上澄み液を除去した。そこに１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清が含まれたＰＢＳ）を添加して細胞を再懸濁し、同じ条件で遠心分離して、上澄み液を除去した。上記の洗浄過程を１回さらに行った後、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液に細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞に２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に０．３μｌのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国）および５μｌの抗ＴＲＡＩＬ抗体であるＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ２５３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃．３０８２１０、米国）を添加した混合物を添加して、４℃で３０分間反応させた。反応後、上記のような方法で細胞を２回洗浄し、上澄み液を除去した。洗浄した細胞に３００μｌの固定緩衝液（ｆｉｘｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（２％ホルムアルデヒドおよび１％ウシ胎児血清が含まれたＰＢＳ）を添加し、４℃で最小１５分間放置した。前記細胞をＦＡＣＳ（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）機器で分析して、ＴＲＡＩＬを発現する細胞を選別し、コロニーを形成するように培養した。

形成されたコロニーから単クローンの細胞を培養して細胞株を確立し、これをＢＭ－０３と命名した。

実施例４．不死化幹細胞株に対する放射線照射試験
前記実施例３で製作されたそれぞれの不死化ＭＳＣ細胞株を臨床試料として使用するために、細胞が増殖することなく、治療タンパク質の発現量を維持させるための放射線照射段階をさらに実施し、これを通じて好適な放射線照射（吸収）線量を確認した。

まず、剤形化して液体窒素タンクで凍結保管中の不死化ＭＳＣ細胞株を放射線照射のために製作された移動カートリッジを用いて輸送した。この際、ドライアイスを用いて冷凍状態を維持した。

前記凍結状態の不死化ＭＳＣ細胞株に放射線照射を実施した。放射線照射は、公知の方法および機器を使用し、ガンマ線の場合、低準位ガンマ線照射器または高準位ガンマ線照射器（ＭＤＳ Ｎｏｒｄｉｏｎ、Ｃａｎａｄａ）を使用し、エックス線の場合、Ｘ－ＲＡＤ ３２０ Ｘ－ＲＡＹ ＩＲＲＡＤＩＡＴＯＲ（ソウル大学校融合科学技術院）またはＲＳ１８００Ｑ（Ｒａｄ Ｓｏｕｒｃｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用した。放射線照射中にも移動カートリッジ内部の温度がドライアイスによって凍結状態を持続できる温度に維持され、放射線照射が完了したＭＳＣ細胞株は、さらに液体窒素タンクに保管された。

放射線照射線量を確認するために、放射線吸収線量は、別途のアラニンドシメータを用いて照射量別に測定し、前記結果値を通じて不死化ＭＳＣ細胞株の吸収線量を計算することができた。

前記放射線照射が完了した不死化ＭＳＣ細胞株は、検体別に３バイアルずつ３７℃恒温水槽で約２分間解凍した後、９ｍＬのＰＢＳを添加して４℃、１，５００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離した後に上澄み液を除去し、１０％ＦＢＳ（１６０００－０４４、Ｇｉｂｃｏ、米国）、１０ｎｇ／ｍＬのｂ－ＦＧＦ（１００－１８Ｂ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、米国）が含まれたＤＭＥＭ－ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ ｇｌｕｃｏｓｅ（１１８８５－０８４、Ｇｉｂｃｏ、米国）培地に懸濁した。懸濁した細胞は、ヘモサイトメーターで数を測定した後、実験を進めた。

実験例１．ＢＭ１０２細胞株において表面抗原タンパク質発現の確認
遺伝子を挿入する前の骨髄由来ＭＳＣとＢＤＮＦ遺伝子が挿入されたＢＭ１０２細胞株の表面抗原タンパク質発現をヒトＭＳＣ分析キット（Ｓｔｅｍｆｌｏｗ^ＴＭ、Ｃａｔ Ｎｏ５６２２４５、ＢＤ）を用いて分析した。実験は、各キットに含まれているマニュアルに沿って行われ、実験結果を図４に示した。

その結果、図４に示されたように、ＢＭ１０２細胞株は、ＢＤＮＦを発現させるための遺伝子操作を経た後にも、ＭＳＣが有する固有な特性である表面抗原タンパク質ＣＤ４４とＣＤ１０５の発現が骨髄由来ＭＳＣと類似していることを証明した。

実験例２．放射線照射前のＢＭ１０２細胞株の増殖率の確認
前記実施例３．１．で確立したＢＭ１０２細胞株の増殖率を確認した。Ｔ１７５フラスコに０．２×１０^６～０．８×１０^６個のＢＭ１０２細胞株を接種した後、ドキシサイクリンを添加するかまたは添加せず、３日または４日培養を進め、ＰＤＬ（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｏｕｂｌｉｎｇ Ｌｅｖｅｌ）と細胞生存率を測定した。ＰＤＬは、「ＰＤＬ＝Ｘ＋３．２２２（ｌｏｇＹ－ｌｏｇＩ）」公式によって計算し、Ｘは初期ＰＤＬ、Ｉはフラスコに接種された初期細胞数、Ｙは最終細胞数を示した。確立された細胞株の増殖率を図５および図６に示した。

その結果、図５に示されたように、ＢＭ１０２細胞株は、１００日を超える期間まで安定的に増殖した。また、図６に示されたように、ドキシサイクリンを添加せずに８０日まで培養したＢＭ１０２細胞株は、ドキシサイクリンを添加して培養したＢＭ１０２細胞株と比較して細胞増殖率が次第に減少することを確認した。

実験例３．継代培養によるＢＭ１０２細胞株の形態学的確認
前記実施例３．１．で確立したＢＭ１０２細胞株の継代培養による形態学的変形を確認するために、実験例２．でＢＭ１０２細胞株の増殖率を確認しつつ、顕微鏡で細胞の写真を撮影し、ＢＭ１０２細胞の形態を図７に示した。

その結果、図７に示されたように、ＢＭ１０２細胞株は、１００日まで長期培養をしても形態学的に変化がないことを確認し、これを通じて、長期培養による細胞老化のような現象が観察されないことが分かった。しかしながら、ドキシサイクリンを添加せずに培養した場合、ＢＤＮＦの発現によってＢＭ１０２細胞株が形態学的に変化することを確認した。これは、ＢＤＮＦタンパク質が発現することによってＢＭ１０２細胞に影響を及ぼし、そのため、細胞の特性が変化することを意味する。

実験例４．放射線照射前のＢＭ１０２細胞株においてＢＤＮＦタンパク質の発現確認
前記実施例３．１．で確立したＢＭ１０２細胞においてＢＤＮＦタンパク質の発現をＥＬＩＳＡ分析方法で確認した。具体的に、ＢＤＮＦタンパク質の発現レベルは、ヒトＢＤＮＦ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキットで確認した。実験は、各キットに含まれているマニュアルに沿って行われた。ドキシサイクリンを除去した培地とドキシサイクリンを除去しない培地で約１×１０^５個の細胞から４８時間発現が誘導されたＢＤＮＦタンパク質の発現レベルを図８に示した。

その結果、図８に示されたように、ドキシサイクリンが存在する培地では、約０．２ｎｇのＢＤＮＦが検出されたのに対し、ドキシサイクリンを除去した培地では、約７４０ｎｇのＢＤＮＦが検出された。

その結果、前記表１のように、放射線を照射する前のＢＭ１０２細胞株においては、約７４０ｎｇ／１０^５ ｃｅｌｌｓのＢＤＮＦタンパク質が発現することを確認した。

実験例５．ＢＭ１０２細胞株においてＢＤＮＦ導入遺伝子の確認
前記実施例３．１．で製造したＢＭ１０２細胞株に遺伝子が導入されたかを確認するためにＰＣＲを行った。具体的に、前記ＢＭ１０２細胞株を９ｍｌのＰＢＳが含まれた１５ｍｌチューブに移した後、１，５００ｒｐｍで５分間セルダウン（Ｃｅｌｌ Ｄｏｗｎ）させた。ＰＢＳを完全に除去した後、１．５ｍｌチューブに２００μｌのＰＢＳでペレットを懸濁させた後に移した。その後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＮ、７４０９５２．２５０）を用いてｇＤＮＡを準備し、下記表２のように混合物を作成した後、下記表３の段階でＰＣＲを行った。この際、陽性対照群として１００ｎｇのＢＭ１０２プラスミドＤＮＡを、陰性対照群として１μｌの精製水を入れた。前記ＢＭ１０２プラスミドＤＮＡは、韓国公開特許第２０１７－００９３７４８号に記載された方法によって分離精製できる。

１％（ｖ／ｖ）アガロースゲルを電気泳動キットに入れた。一番目のウェルに１０μｌのＤＮＡ Ｓｉｚｅ Ｍａｒｋｅｒをローディングし、次のウェルから陰性対照群、陽性対照群、３個のＢＭ１０２検体の順にそれぞれ１０μｌずつローディングした。以後、１００Ｖで２０分間電気泳動を実施し、ゲル写真を撮って、その結果を図９に示した。その結果、図９に示されたように、３個のＢＭ１０２細胞株がいずれも陽性対照群と同じサイズ（０．６ｋｂ）のＰＣＲプロダクトであることを確認した。

実験例６．ＢＭ１０２細胞株において転写産物の変化の確認
前記実施例３．１．で製造したＢＭ１０２細胞株においてドキシサイクリン処理の有無によるＢＤＮＦ発現による遺伝子の発現変化を確認するために、転写産物の塩基配列分析（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。

塩基配列分析は、マクロジェンに依頼して結果を確保した。試験は、ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｓ４ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＮｏｖａＳｅｑ ６０００ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ＃１０００００００１９３５８ ｖ０２（ｉｌｌｕｍｉｎａ）によって行い、ＮｏｖａＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒおよび１０００００００１９３５８ ｖ０２ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を通じて分析を実施した。ＢＭ１０２細胞株においてドキシサイクリン除去によって変化する転写産物は、図１０ａ、図１０ｂおよび図１０ｃに羅列した。

その結果、図１０ａに示されたように、ドキシサイクリン除去によってＢＭ１０２細胞株において血管生成、炎症、神経生成および免疫システム過程に関連していることが知られたＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＧＰＴ１、ＣＥＮＤ１、ＮＦＡＳＣ、ＧＲＡＰ２およびＴＲＩＭ６遺伝子の発現が増加し、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ６、ＩＬ１ＢおよびＰＴＧＳ２の発現が減少することを確認した。

また、図１０ｂに示されたように、ドキシサイクリン除去によってＢＭ１０２細胞株において細胞分化、移動および増殖に関連していることが知られたＨＬＦ、ＲＯＲ２、ＩＣＡＭ１遺伝子の発現が減少し、アポトーシスに関連していることが知られたＣＥＢＰＢ、ＥＧＲ２、ＢＭＰ８Ａ、ＢＥＸ２、ＫＬＦ４、ＴＮＦＳＦ１５、ＰＴＢＰ３およびＩＧＦＢＰ２遺伝子の発現が減少することを確認した。

さらに、ドキシサイクリン除去によってＢＭ１０２細胞株においてｍｉｃｒｏ ＲＮＡ遺伝子の転写産物の変化がまた確認され、具体的に、ＭｉＲ４４４４－１、ＭｉＲ４４４４－２、ＭｉＲ１２４４－１の発現が増加し、ＭｉＲ１２４４－４、ＭｉＲ３１９Ｉ、ＭｉＲＬＥＴ７Ｄの発現が減少することを確認した（図１０ｃ）。

実験例７．ＢＭ１０２細胞株に対する放射線照射試験
ＢＭ１０２細胞株に対して、ガンマ線およびエックス線を用いて放射線照射試験を実施例４のような方法で進め、照射される放射線の種類は、ガンマ線およびエックス線を使用した。

まず、８０、１００、１２０、１４０Ｇｙの照射線量でガンマ線を１次照射した後、ＢＭ１０２細胞株の吸収線量と、コロニー形成の有無、細胞数および力価を確認し、２００、３００Ｇｙの照射線量でガンマ線を２次照射した後、同じ方法で吸収線量、コロニー形成の有無、細胞数および力価をそれぞれ確認した。

その結果を下記表４に示した。

また、エックス線を用いて１次に１００、２００、３００、４００、５００Ｇｙの照射線量でそれぞれ照射して、吸収線量、コロニー形成の有無および力価を確認し、表５および図１１に示し、２次に０、５０、１００、２００、３００、４００、５００Ｇｙの照射線量でそれぞれ照射して、その結果を下記の表６および図１２に示した。

実験例７．１．放射線照射されたＢＭ１０２細胞株のコロニー形成の有無
ＢＭ１０２細胞株に対して、ガンマ線およびエックス線を前記範囲でそれぞれ照射後、コロニー形成の有無を確認するために、６－ｗｅｌｌプレートでｗｅｌｌに５×１０^５個の細胞になるように、バイアル当たり１２個のｗｅｌｌに分注して、合計２個の６－ｗｅｌｌプレートに分注した。プレートを振とうして細胞が均一に広がるようにし、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で３日あるいは４日ごとに培地を交換しつつ、顕微鏡を用いてコロニーが形成されるかを目視で観察した。

その結果、前記表４から明らかなように、ガンマ線を照射した場合、照射線量８０Ｇｙであるとき、コロニーが形成され、それ以上の範囲では、コロニーが形成されないことを確認した。コロニーが形成された場合、細胞株の放射線吸収線量は７９．５Ｇｙであることが確認され、実験上確認した最大吸収線量は約３２２Ｇｙであった。

また、エックス線の照射結果、コロニー形成の有無に対しても同一に確認した。前記表５および表６から明らかなように、１次実験で照射線量が１００Ｇｙである場合には、コロニーが形成されて、臨床試料として使用が適していないことを確認し、それ以上の範囲では、コロニーが形成されなかった。コロニーが形成された場合、細胞株の吸収線量は６２．５Ｇｙであることが確認された。

その一方で、２次エックス線照射実験で確認したところ、１００Ｇｙで照射した場合、吸収線量が８３．１Ｇｙと測定された。この際、コロニーは形成されなかった。すなわち、同じ照射線量で照射された場合であるとしても、吸収線量に差異があり得、細胞に吸収される線量が６２．５Ｇｙである場合には、臨床試料として使用が適合していないが、８３．１Ｇｙである場合には使用が可能であることを確認することができた。したがって、吸収線量を基準として約８０Ｇｙ超過範囲の放射線が吸収される場合、本発明の細胞株は、臨床試料として使用が可能であることを予測できる。

実験例７．２．放射線照射されたＢＭ１０２細胞株の細胞数の測定結果
前記コロニー形成の有無の試験のために接種された細胞を用いて細胞数測定試験を実施した。前記実験例７でガンマ線が照射されたＢＭ１０２細胞株に対して、細胞解凍日を基準としてＤａｙ ７、１４、２８、３５、４９、６３日にそれぞれ付着した細胞をトリプシンを用いて脱離させた後、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）染色を行い、ヘモサイトメーター（Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて総細胞数と生存細胞数の個数を計数した。

その結果、下記の表７および図１１から明らかなように、ガンマ線を用いた１次照射試験および２次照射試験の両方で、６３日まで観察した場合、放射線照射時に細胞が増殖しなかったことを確認した。

また、エックス線を用いて照射実験を進めた細胞株に対して、細胞株を解凍した日以降、１４、２８、４２、５６、７０日にそれぞれ細胞数を測定した結果、下記の表８、図１２のように、３００、４００、５００Ｇｙそれぞれの照射グループで観察したすべての期間中に追加で増殖する細胞がないことを確認した。

実験例７．３．放射線照射されたＢＭ１０２細胞株のＢＤＮＦ発現の確認
前記実験例７で放射線を照射したＢＭ１０２細胞の一部は、力価試験のために１２－ｗｅｌｌプレートでｗｅｌｌに１×１０^５または５×１０^５個の細胞になるように、バイアル当たり合計１個のｗｅｌｌに分注した。プレートを振とうして細胞が均一に広がるようにし、３７℃、５％ＣＯ_２培養器で４８時間または６０時間培養した。

ＢＤＮＦの発現量を測定するために、前記培養液から上澄み液を収得し、４℃で５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を２００μＬずつ４個のｅ－ｔｕｂｅに小分し、－８０℃で冷凍保管した。ＢＤＮＦタンパク質の発現量は、ＢＤＮＦ分析キット（ＤＢＤ００、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて分析した。

ガンマ線を照射したＢＭ１０２細胞株の場合、表４および図１３から明らかなように、放射線の照射時にもＢＤＮＦの発現量が適正レベル（５００ｎｇ／５×１０^５／４８ｈｒｓ）以上に維持されることを確認し、エックス線を照射した場合には、表５および図１４と図１５から確認できるように、高い照射線量でもＢＤＮＦの発現量が維持されること（１００ｎｇ／１０^５／４８ｈｒｓ以上または４００ｎｇ／１０^５／６０ｈｒｓ以上）を確認した。

実験例８．ＢＭ０１Ａ細胞株に対する放射線照射試験
実験例７と同じ方式で、ＢＭ０１Ａ細胞株に対する放射線照射試験を実施した。照射される放射線の種類は、ガンマ線を使用し、照射線量９０、１００、１１０、１２０Ｇｙのガンマ線を一次に照射した後、吸収線量と、コロニー形成の有無、細胞数および力価を確認し、照射線量１４０、１６０、１８０Ｇｙのガンマ線を２次に照射した後、同じ方法で吸収線量、コロニー形成の有無、細胞数および力価をそれぞれ確認した。その結果を下記表９に記載した。

実験例２．１．放射線照射されたＢＭ０１Ａ細胞株のコロニー形成の有無
ＢＭ０１Ａ細胞株を６－ｗｅｌｌプレートで３×１０^５ ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの数で分注し、前記実験例７．１．と同じ方法で培養した後、培地でコロニー形成の有無を確認した。

その結果、前記表９から明らかなように、照射線量９０～１２０Ｇｙおよび１４０～１８０Ｇｙの範囲で全部コロニーが形成されず、これを通じて、コロニーが生成されない最小吸収線量が９５．６Ｇｙ、最大吸収線量が１９１．４Ｇｙであることを確認した。

実験例８．２．放射線照射されたＢＭ０１Ａ細胞株の細胞数の測定結果
前記実験例７．２．と同じ方法で、ガンマ線が照射されたＢＭ０１Ａ細胞株の細胞数測定実験を実施した。

細胞解凍日を基準としてＤａｙ ７、１４、２８、３５、４２日に付着した細胞をトリプシンを用いて脱離させた後、トリパンブルーで染色を行い、ヘモサイトメーターで総細胞数と生存細胞数の個数を計数した。

その結果、下記表１０および図１６から明らかなように、ＢＭ０１Ａ細胞株に対してガンマ線を照射した場合、４２日まで観察した場合、細胞数が増殖しないことを確認した。

実験例８．３．放射線照射されたＢＭ０１Ａ細胞株のＢＤＮＦ発現量の確認
前記実験例８で放射線照射されたＢＭ０１Ａ細胞株の力価試験のために、実験例７．３．と同じ方法で細胞を培養および冷凍保管した。ＢＭ０１ＡのＢＤＮＦ発現量は、ＢＤＮＦ分析キット（ＤＹ２４８、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を用いて分析した。

その結果、表９および図１７から明らかなように、ガンマ線の照射時に、照射しない場合と比較してＢＤＮＦの発現量が高いレベルに維持されることを確認した。

実験例９．ＢＭ０３細胞株に対する放射線照射試験
ＴＲＡＩＬおよびＣＤを発現する不死化幹細胞ＢＭ０３細胞株に対して、実験例７と同じ方式で放射線照射試験を実施した。ＢＭ０３菌株の放射線照射試験はガンマ線を活用し、低準位および高準位ガンマ線をそれぞれ照射して、その結果を確認した。

低準位ガンマ線は、バイアルに充填後、凍結したＢＭ０３（ＢＭ０３－Ｐ００５、１×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｖｉａｌ）を韓国原子力研究院の先端放射線研究所で低準位照射器を用いて放射線照射を実施し、照射線量０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０Ｇｙでそれぞれ照射して、下記の表１１のように、吸収線量、コロニー形成の有無、細胞数および力価を確認した。

また、同じ方法で、高準位ガンマ線の照射試験を実施し、高準位ガンマ線は、０、３０、４０、６０、７０Ｇｙで１次試験後、０、１００、１１０、１２０、１３０Ｇｙの線量で２次試験を実施して、吸収線量、コロニー形成の有無を測定した。バイアルに充填後、凍結されたＢＭ０３（１×１０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｖｉａｌ）を韓国原子力研究院の先端放射線研究所の高準位照射器を用いて実施し、それぞれの試験において、吸収線量はＡｌａｎｉｎｅ ｄｏｘｙｍｅｔｅｒを用いて測定した。その結果を下記表１２のように確認した。

実験例９．１．放射線照射されたＢＭ０３細胞株のコロニー形成の有無
前記実験例９のＢＭ０３細胞に対するコロニー形成の有無を確認するために、前記実験例７．１．と同じ方式で細胞株のコロニー形成の有無を確認した。前記実験例９で、低準位ガンマ線が照射されたＢＭ０３および高準位ガンマ線が照射されたＢＭ０３に対してコロニー形成の有無を確認した結果、前記表１１および表１２から明らかなように、低準位ガンマ線の照射時に、特に５０Ｇｙ以下の照射線量でコロニーが形成され、高準位ガンマ線の照射時には、６０Ｇｙ以下の照射線量でコロニーが形成されて、臨床試料として使用するのに適していないことを確認した。しかしながら、低準位ガンマ線の場合、７０Ｇｙ以上、高準位ガンマ線の場合、１００Ｇｙ以上では、コロニーが形成されないことを確認した。

実験例９．２．放射線照射されたＢＭ０３細胞株の細胞数の測定
実験例９．１．で培養される細胞に対して、低準位ガンマ線が照射されたＢＭ０３細胞株の場合、細胞解凍日からそれぞれ２、７、１４、２８、３５、４２、４９日に付着した細胞の数を計数して、培養された細胞数の増加の有無を確認した。

その結果、下記表１３および図１８から明らかなように、１０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ ７から接種数より多い細胞数が確認され、２０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ １４、３０、４０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ ２１、および５０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ ３５に接種数より多い細胞数が確認された。また、６０Ｇｙ照射グループでは、接種数より少ない数の細胞が維持されたが、Ｄａｙ ４２からは細胞数が増加し、７０Ｇｙでは、生存細胞数が持続的に減少した。これは、低準位ガンマ線の照射線量および吸収線量が６０Ｇｙ以下である場合、細胞が増殖する可能性があることを示す。

また、同じ方法で高準位ガンマ線が照射されたＢＭ０３細胞株の場合、細胞解凍日から７、１４、２１、２８日（１次）、および７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、６３日（２次）目に付着した細胞数を計数した。

その結果、下記表１４および図１９から明らかなように、１次実験で３０Ｇｙ、４０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ １４から接種数より多い細胞数が確認され、５０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ ２１、６０Ｇｙ照射グループでは、Ｄａｙ ２８に接種数より多い細胞数が確認された、しかしながら、２次試験結果、１００、１１０、１２０、１３０Ｇｙ照射グループで６３日まで観察した場合、増殖する細胞がないことを確認した。

このような結果から、ＢＭ０３細胞株の場合、最小吸収線量が６０Ｇｙ以上でなければならないことが分かる。

実験例９．３．放射線照射されたＢＭ０３細胞株の遺伝子発現量の確認
放射線照射後、細胞の力価の変化を測定するために、挿入された治療遺伝子ＴＲＡＩＬとＣＤ：：ＵＰＲＴを確認できるプライマーを選定した後、ｑＲＴ－ＰＣＲ反応を通じて挿入された遺伝子の発現を定量的に測定した。

解凍直後、２日、７日、１４日間培養した細胞をそれぞれ収穫した後、Ｔｒｉｚｏｌを用いてＲＮＡを抽出し、５Ｘ Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＲＮＡ １ｕｇでｃＤＮＡを合成し、ＴＲＡＩＬとＣＤそれぞれに特異的に結合できるプライマーを用いてＲＴ－ｑＰＣＲを行った。

その結果、図２０から明らかなように、低準位ガンマ線が照射されたＢＭ０３細胞株において発現する治療遺伝子ＴＲＡＩＬおよびＣＤの発現量は有意差が発見されなかった。高準位ガンマ線の照射時にも、生存細胞が存在する場合、放射線照射線量による力価の変化が殆どないことを確認した。

実験例１０．試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＢＭ１０２細胞株の腫瘍原性の確認
ＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ ９６－ｗｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いてソフト寒天ゲル（Ｓｏｆｔ Ａｇａｒ Ｇｅｌｓ）で骨髄由来ＭＳＣ、ＢＭ１０２細胞株、陽性対照群（ＨｅＬａ）および陰性対照群（ＮＩＨ３Ｔ３）において足場非依存性増殖（Ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ）によるコロニー形成の有無を確認し、ＭＴＳ溶液で染色して、吸光度を測定することによって、細胞形質転換による腫瘍形成の有無を定量化した。

その結果、図２１に示されたように、陽性対照群において細胞形質転換によるコロニーが形成され、陰性対照群、骨髄由来ＭＳＣおよびＢＭ１０２細胞株は、コロニーが形成されないことから、ＢＭ１０２細胞株は、細胞培養時に形質転換能力がなく、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）腫瘍原性がないことを確認することができた。

実験例１１．試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ＢＭ１０２細胞株の神経細胞の保護および治療効果の確認
ＢＭ１０２細胞株の神経細胞の保護および治療効果を確認するために、ＢＤＮＦによって良好に成長することが知られた神経膠細胞Ｃ６をＢＭ１０２細胞株と共培養した後、Ｃ６細胞の増殖率の増加を細胞数依存的に確認した。

具体的に、Ｃ６細胞とＢＭ１０２細胞株をｔｒａｎｓ－ｗｅｌｌを用いて共培養した。Ｃ６細胞を同一に２×１０^３個ずつ９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接種した後、ＢＭ１０２細胞株は、１×１０^４個から１／２ずつ希釈してｔｒａｎｓ－ｗｅｌｌに接種する方式で共培養する細胞数を異ならせた。２４時間共培養後、培養中のＣ６細胞培地にＭＴＳ溶液を処理して吸光度を測定することによって、ＢＭ１０２細胞株において発現するＢＤＮＦタンパク質によるＣ６細胞の増殖率を定量化した。

その結果、図２２に示されたように、ＢＭ１０２細胞株の数字に比例して増加するＢＤＮＦ分泌量によって直接的な接触がなくともＣ６細胞の増殖率が増加することを確認した。

上記結果から、ＢＭ１０２細胞株が細胞治療剤として使用できるほどにＢＤＮＦを安定的に大量生産することができ、ＢＤＮＦを安定的に発現するＢＭ１０２細胞株が神経細胞を保護したり治療する細胞治療剤として使用できることを確認した。

寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ１３８７６ＢＰ
受託日：２０１９０７０２

Claims (13)

1. 不死化遺伝子を導入した幹細胞株を製作する段階と、
   前記幹細胞株に外来タンパク質をコード化する遺伝子を導入する段階と、
   前記幹細胞株を凍結保存する段階と、
   前記凍結した状態の幹細胞株に放射線を照射する段階と、を含む、不死化幹細胞株の製作方法。
2. 前記不死化遺伝子は、ｃ－Ｍｙｃおよび／またはｈＴＥＲＴである、請求項１に記載の不死化幹細胞株の製作方法。
3. 前記外来タンパク質は、成長因子、サイトカインまたはがん治療タンパク質、抗体およびケモカイン受容体の中から選ばれる、請求項１に記載の不死化幹細胞株の製作方法。
4. 前記不死化幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＥＳ）、骨髄幹細胞（ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＢＭＳＣ）、間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ＭＳＣ）、ヒト神経幹細胞（ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，ｈＮＳＣ）、角膜上皮幹細胞（ｌｉｍｂａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または口腔粘膜上皮細胞（ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）である、請求項１に記載の不死化幹細胞株の製作方法。
5. 前記放射線は、幹細胞株に対する吸収線量が少なくとも８０Ｇｙになるように照射される、請求項１に記載の不死化幹細胞株の製作方法。
6. 前記幹細胞株に対する吸収線量は、放射線照射線量に対して、下記の範囲を満たす、請求項５に記載の不死化幹細胞株の製作方法。
   照射線量０～１００Ｇｙであるとき、照射線量の８０～１４０％；
   照射線量１００～２００Ｇｙであるとき、照射線量の８０～１４０％；および
   照射線量２００Ｇｙ以上であるとき、照射線量の６０～１４０％。
7. 前記放射線は、ガンマ線、ベータ線、中性子線、エックス線および電子線を含む群から選ばれる、請求項１に記載の不死化幹細胞株の製作方法。
8. 請求項１に記載の方法によって製作された不死化幹細胞株を含む薬剤学的組成物。
9. 前記薬剤学的組成物は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現する不死化幹細胞株を含む、請求項８に記載の薬剤学的組成物。
10. 前記薬剤学的組成物は、神経疾患の予防または治療効果を有する、請求項９に記載の薬剤学的組成物。
11. 前記神経疾患は、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）、ルーゲリック病（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）、脳梗塞、慢性脳損傷（ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、脊髄損傷、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＨＤ）、レット病（Ｒｅｔｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＲＤ）、虚血性脳疾患、脳卒中および外傷性脳損傷（Ｔｒａｕｍａｔｉｃ ｂｒａｉｎ ｉｎｊｕｒｙ）、新生児虚血性脳症（Ｎｅｏｎａｔａｌ Ｈｙｐｏｘｉｃ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）、多発性硬化症からなる群から選ばれるものである、請求項１０に記載の神経疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
12. 請求項１に記載の方法によって製作された不死化幹細胞株の細胞治療剤としての用途。
13. 請求項１に記載の方法によって製作された不死化幹細胞株を治療的に有効な量で個体に投与して疾患を治療する方法。
    

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