KR102546749B1

KR102546749B1 - 골격근 세포 및 이의 유도 방법

Info

Publication number: KR102546749B1
Application number: KR1020197021951A
Authority: KR
Inventors: 준코 와카오; 츠나오 키시다; 타츠로 타지리; 오삼 마즈다
Original assignee: 교토후고리츠다이가쿠호진
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2023-06-22
Also published as: EP3564362A1; US20190338306A1; KR20190104354A; US11242541B2; CN110291190B; CN110291190A; JPWO2018124292A1; EP3564362A4; JP7165979B2; WO2018124292A1

Abstract

포유동물의 체세포에 MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 도입하는 단계를 포함하는, 골격근 세포를 유도하기 위한 방법을 제공한다.

Description

골격근 세포 및 이의 유도 방법

본 발명은 주로 골격근 세포 및 이의 유도 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 직접 재프로그래밍에 의한 골격근 세포의 유도 방법에 관한 것이다.

근육은 동물의 운동에 필수의 조직이며 수축 능력을 갖는 섬유상의 다핵 세포로 구성되어 있다. 골격근의 분화 유도에서 단핵 근아세포가 분화하고, 융합하여 다핵 근육 세포가 형성된다. 골격근의 분화 유도는 MyoD 패밀리와 MEF2 패밀리 등의 전사 인자에 의해 제어되는 것으로 공지되어 있다.

횡격막 전체 결손 등의 근육의 선천적 이상, 근육 이영양증 등의 근육의 유전 질환, 고도 외상이나 수술 치료에 따른 근육의 결손 등의 질환에 대하여 근육을 재생하여 이식할 수 있으면, 이는 유효한 신규 재생 의료로 될 가능성이 있다.

마우스 섬유아세포에 골격근 특이적인 전사 인자, MyoD 패밀리의 유전자를 도입하면, 근아세포 모양의 세포를 유도할 수 있는 것은 이전부터 공지되어 있다. 그러나, 인간의 섬유아세포에서는 MyoD 패밀리 유전자를 도입해도 마우스와 동일한 정도로 근아세포는 유도할 수 없다는 문제가 있었다.

Davis RL, Weintraub H, Lassar AB. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 1987 Dec 24; 51(6):987-1000.

본 발명은 근육의 결손을 수반하는 질환 등에 대한 치료에 응용가능한 골격근 세포를 유도하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자는, 포유동물의 체세포에 MyoD 유전자 및 L-myc 유전자를 조합하여 도입함으로써, ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 경유하지 않고, 직접(직접 재프로그래밍에 의해) 골격근 세포를 수득할 수 있는 것을 밝혀냈다. 본 발명은 이러한 발견에 기초하여 더욱 검토를 거듭하여 완성된 것이다.

본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

제1항, 포유동물의 체세포에 MyoD 패밀리 유전자(family gene) 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 도입하는 단계를 포함하는, 골격근 세포를 유도(제조)하는 방법.

제2항, 상기 체세포가 섬유아세포인, 제1항의 방법.

제3항, 상기 체세포가 인간의 체세포인, 제1항의 방법.

제4항, MyoD 패밀리 유전자가 MyoD1 유전자이고, Myc 패밀리 유전자가 L-myc 유전자인, 제1항 또는 제2항의 방법.

제5항, 포유동물의 체세포에서 유래하고, 외래성의 MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 갖는, 골격근 세포.

제6항, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 수득되는, 청구항 제5항에 기재된 골격근 세포.

제7항, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 기재된 방법으로 수득되는 세포, 또는 제4항에 기재된 골격근 세포를 포함하는, 골격근의 결손, 부족 또는 기능저하를 기반으로 하는 질환을 치료하기 위한, 이식 재료(transplantation material).

제8항, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 포함하는, 골격근 세포를 유도(제조)하기 위한 조성물.

본 발명에 의하면, 직접 재프로그래밍을 통해 체세포에서 단기간에 골격근 세포를 제조할 수 있다. 이 골격근 세포는, 이식하는 본인의 체세포에서 용이하게 유도할 수 있기 때문에, 수득된 골격근 세포를 이식한 경우에도 면역학적 거부 반응 등의 문제는 발생하지 않는다. 또한, iPS 세포와 ES 세포를 경유하지 않고 직접 체세포에서 골격근 세포를 유도할 수 있기 때문에, 암화 등의 다능성 줄기세포에 기인하는 문제를 피할 수 있다.

도 1은 실험 방법의 개요를 나타낸다.
도 2는 미오게닌 유전자 및 CKM 유전자의 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸다.
도 3a(3-1)는 면역형광 염색의 결과를 나타낸다(CKM).
도 3b(3-2)는 면역형광 염색의 결과를 나타낸다(디스트로핀(Dystrophin)).
도 3c(3-3)는 면역형광 염색의 결과를 나타낸다(미오게닌).
도 4는 다핵 근관 세포의 출현의 관찰 결과를 나타낸다.
도 5는 다핵 근관 세포의 출현의 평가 결과를 나타낸다.
도 6은 미오게닌 유전자, CKM 유전자 및 MHC3 유전자의 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸다.
도 7은 DMD 유전자의 mRNA 발현의 경시적 측정 결과를 나타낸다.
도 8a는 실시예 8의 방법의 개요를 나타낸다.
도 8b는 이식 1주간 후의 이식 부위와 적출한 조직의 거시적 이미지를 나타낸다.
도 9a(9-1)는 섬유아세포를 이식한 조직의 면역조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 파라핀 절편, ×200배 확대.
도 9b(9-2)는 MyoD1와 L-Myc를 도입한 세포를 이식한 조직의 면역조직화학 염색의 결과를 나타낸다. 파라핀 절편, ×200배 확대.
도 10은 데스민 양성 세포의 측정 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차. 각 그룹 N=3마리 마우스. * P<0.05 vs. 비도입 세포 이식 그룹.
도 11은 CKM 양성 세포의 측정 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차. 각 그룹 N=3개 웰. * P<0.05 vs. 비도입 세포.
도 12는 (A) 핵 염색의 결과를 나타낸다. (B) 3개보다 많은 핵을 갖는 세포 수의 총 세포 수에 대한 비율의 측정 결과를 나타낸다.
도 13은 (A) 다핵 세포의 출현의 측정 결과를 나타낸다. (B) 미오게닌 유전자, CKM 유전자 및 디스트로핀 유전자의 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸다.
도 14는 세포를 이식한 조직의 면역조직화학 염색의 결과를 나타낸다.
도 15는 각종 마커 유전자의 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸다. 값은 평균±표준편차. 각 그룹 N=3. * P<0.05 vs. 비도입 세포.
도 16은 미토콘드리아(MitoTracker Red)의 검출 결과를 나타낸다.
도 17은 데스민 및 CKM 면역형광 염색의 결과를 나타낸다.
도 18a는 골격근의 발생에 관여하는 유전자 그룹의 히트맵 및 클러스터링 분석 결과를 나타낸다.
도 18b는 골격근의 수축에 관여하는 유전자 그룹의 히트맵 및 클러스터링 분석 결과를 나타낸다.
도 18c는 미오신 필라멘트에 관련하는 유전자 그룹의 히트맵 및 클러스터링 분석 결과를 나타낸다.
도 18d는 액틴 필라멘트에 관련하는 유전자 그룹의 히트맵 및 클러스터링 분석 결과를 나타낸다.
도 19는 rBC2 LCN-FITC 염색의 결과를 나타낸다.
도 20은 미오게닌 유전자 및 CKM 유전자의 mRNA 발현 측정 결과를 나타낸다.

본 발명은, 포유동물의 분화된 체세포를 골격근 세포로 전환하여 골격근 세포를 유도하는 방법에 관한 것이다. "전환"은 체세포를 목적의 골격근 세포로 변환하는 것을 의미한다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시형태의 하나는 "직접 재프로그래밍", "다이렉트 전환"으로도 불리는, iPS 세포의 작제로 대표되는 세포의 초기화 과정을 거치지 않고, 체세포를 골격근 세포로 전환하는 방법이다.

골격근 세포로의 유도는, 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 중의 어느 하나로 수행할 수 있다.

정상 골격근의 발생 과정에서는 근아세포가 융합하여 다핵 근관 세포가 되고, 또한 근섬유로 성숙한다. 또한, 정상 골격근 조직에는 줄기세포로서 기능할 수 있는 근육 위성세포가 존재한다. 본 명세서에서는 근아세포, 근육 위성세포, 근관 세포, 근관, 근섬유, 성숙 근섬유 등을 총칭하여 골격근 세포 또는 근육세포라고 부른다.

골격근은 동물의 근육 중 심근과 평활근 이외의 근육을 말한다. 골격근은 횡문근과 평활근 중 횡문근에 속한다. 골격근 세포는 다핵 세포이며, 다수의 근아세포로부터 근섬유가 생성된다.

골격근 세포는 간엽계 줄기세포에서 유래한다. 생체내의 분화에서는 간엽계 줄기세포가 근아세포로 분화하고, 근아세포가 다수 융합하여 근관 세포가 형성된다.

골격근 세포가 수득된 것은 미오게닌, 크레아틴 키나제 근육(CKM), 미오신 중쇄 3(MHC3) 등의 골격근 특이적 마커의 유전자 발현 및 단백질 발현, 다핵 및 근섬유의 형성 등의 형태적 특징, 수축능 등의 기능 등에 의해 평가할 수 있다.

체세포

체세포는 포유동물 유래이면 된다. 골격근 세포를 생체에 이식하는 경우에는, 이식되는 피험체 유래의 체세포(자가 세포)를 사용하는 것이, 감염이나 거부 반응 등의 위험을 감소시키기 위해 바람직하다. 그러나, 근육의 결손 등에 대하여 이식하는 등의 목적의 경우, 자가 세포가 아닌, 다른 인간이나 다른 동물의 체세포에서 미리 준비해둔 골격근 세포를 이식에 사용할 수 있다. 또는, 미리 준비해둔 다른 인간이나 다른 동물의 체세포에서 골격근 세포를 제조하여 이식에 사용할 수 있다. 즉, 골격근 세포 은행을 만들어 놓고 이식 목적에 제공할 수 있다. 이러한 경우, 거절 응답 등의 위험을 감소시키기 위해, 미리 MHC를 타이핑해 둘 수 있다. 또한, 미리 골격근 세포의 세포 특성과 종양원성 등을 확인할 수 있다.

본 명세서에서, 포유동물은 마우스, 래트, 햄스터, 인간, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 소, 말, 돼지 등을 들 수 있으며, 특히 인간을 들 수 있다.

본 발명의 방법(직접 재프로그래밍)의 대상이 되는 체세포는 특별히 한정되는 것은 아니다.

체세포로서 용이하게 생체에서 채취할 수 있는 체세포를 사용할 수 있다. 예를 들면, 섬유아세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 비강 점막 상피 세포, 기도 점막 상피 세포, 위 점막 상피 세포, 장관 점막 상피 세포, 혈관 내피 세포, 평활근 세포, 지방 세포, 잇몸 세포(잇몸 섬유아세포 및 잇몸 상피 세포), 펄프 세포, 치근막 세포, 골수 세포, 골수 유래 간질 세포, 백혈구, 림프구, 결막 상피 세포, 및 파골 세포 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 섬유아세포, 케라티노사이트, 구강 점막 상피 세포, 잇몸 세포, 백혈구, 및 임파구 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 생체에서 채취한 상기의 세포를 이용하는 것이 바람직하다.

유전자 또는 이의 발현 산물

본 발명의 방법에서, 체세포에 MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물이 도입된다. 여기에서, "발현 산물"로서는, 예를 들어, MyoD 패밀리 유전자 및 L-myc 유전자의 mRNA 또는 단백질을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물에 추가하여, 마이크로 RNA, siRNA, shRNA과 이들을 발현하는 DNA를 함께 사용할 수도 있다. 또한, 다양한 단백질을 함께 사용할 수도 있다. 골격근 세포를 수득할 수 있는 효율성의 관점 및 간편성의 관점에서 MyoD 패밀리 유전자 및 Myc 패밀리 유전자의 2개 유전자, 예를 들면, MyoD1 유전자 및 L-myc 유전자의 2개 유전자만을 사용하는 것이 바람직하다.

MyoD 패밀리 유전자는 근육의 분화 제어에 관여하는 bHLH(basic helix loop helix)형 전사 인자를 코딩하는 일군의 유전자이다. MyoD 패밀리 유전자로는 MyoD1, Myf5, 미오게닌, 및 MRF4를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, MyoD 패밀리 유전자는 바람직하게는 MyoD1 유전자이다.

Myc 패밀리 유전자도 bHLH(basic helix loop helix)형 전사 인자를 코딩한다. Myc 패밀리 유전자로는 c-myc, N-myc, 및 L-Myc를 들 수 있다. 본 발명에 있어서, Myc 패밀리 유전자는 바람직하게는 L-Myc이다.

상기 유전자는 모두 척추동물에서 고도로 보존되어 있는 유전자이며, 본 명세서에서는 특히 동물명을 표시하지 않는 한, 상동체를 포함한 유전자를 나타내는 것으로 한다. 또한, 폴리모피즘(다형)을 포함하여, 변이를 갖는 유전자도, 야생형 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 유전자도 포함하는 것으로 한다.

예를 들면, 인간(Homo sapiens)의 MyoD1 유전자, L-myc 유전자의 cDNA 염기서열 및 이를 코딩하는 단백질의 아미노산 서열은 미국 생물 공학 정보 센터(NCBI; National Center for Biotechnology Information)가 제공하는 GenBank에 하기의 수탁 번호로 등록되어 있다(복수의 개정(revision)이 등록되어 있는 경우, 최신 버전을 지칭하는 것으로 이해된다.):

인간 MyoD1 유전자 cDNA 서열: NM_002478(예: NM_002478.4)

인간 MyoD1 단백질 아미노산 서열: NP_002469(예: NP_002469.2);

인간 L-myc 유전자 cDNA 서열: NM_001033081, NM_001033082, NM_005376(예: NM_001033081.2, NM_001033082.2, NM_005376.4),

인간 L-myc 단백질 아미노산 서열: NP_001028253.1, NP_001028254.2, NP_005367.2(예: NP_001028253, NP_001028254, NP_005367).

도입

본 발명의 방법은, 특정 유전자를 선택하는 이외에는, 공지의 직접 재프로그래밍 방법에 준하여 실시할 수 있으며, 예를 들면, 이하의 어느 문헌의 방법에 준하여 실시할 수 있다:

1: Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava, Cell, 142: 375-386, 2010.

2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof & Marius Wernig, Nature, 463: 1035-1041, 2010

3: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M, Nature, 476: 220-223, 2011.

4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors, Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.

5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, Nature, 475: 386-389, 2011.

6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki, Nature, 475: 390-393, 2011.

7: Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors. Yamamoto K, Kishida T, Sato Y, Nishioka K, Ejima A, Fujiwara H, Kubo T, Yamamoto T, Kanamura N & Mazda O. Proc Natl Acad Sci USA. 112:6152-6157, 2015.

8: Reprogrammed Functional Brown Adipocytes Ameliorate Insulin Resistance and Dyslipidemia in Diet-Induced Obesity and Type 2 Diabetes. Kishida T, Ejima A, Yamamoto K, Tanaka S, Yamamoto T, Mazda O. Stem Cell Reports. 5: 569-581, 2015.

9: Generation of directly converted human osteoblasts that are free of exogenous gene and xenogenic protein. Yamamoto K., Sato Y., Honjo K., Ichioka H., Oseko F., Sowa Y., Yamamoto T., Kanamura N., Kishida T., Mazda O. J Cell Biochem 117:2538-2545, 2016.

10: WO 2014/010746

상기 문헌 1 내지 10의 내용은 본 명세서에 참고로 원용된다.

구체적으로는, 목적 유전자를, 하나 또는 복수의 발현 벡터에 도입하고, 대상으로 하는 신체 세포에 발현 벡터를 도입하여 세포 내에서 발현시키는 것이 바람직하다.

유전자를 도입하는 방법으로는, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등의 바이러스성 벡터를 감염시키는 방법 외에도, 유전자와 이의 발현 산물의 도입의 경우에는 양이온성 리포좀, 양이온성 폴리머, 전기천공법 등의 비-바이러스 벡터에서 플라스미드 벡터 및 에피좀성 벡터 유전자의 발현 산물(mRNA, 단백질)을 형질감염시키는 방법도 사용할 수 있다. 또한, mRNA를 도입할 수도 있다. 이러한 유전자 도입에 이용하는 수단을 모두 포괄하여, 본 명세서에서는 "벡터"라고 지칭한다.

도입 효율과 도입 유전자의 안정성 유지의 관점에서, 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 위험을 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.

또한, 목적 유전자와 함께 약제 선택 마커로 되는 유전자(퓨로마이신 내성, 블라스티시딘 S 내성, 네오마이신 내성, 하이그로마이신 내성 등)를 도입하고, 그 후 약제 선택을 수행함으로써, 목적 유전자를 발현하는 세포를 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 유전자 도입은 플라스미드로 수행해도 좋고, 또한 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터를 이용해도 좋다. 도입 효율과 도입 유전자의 안정성 유지의 관점에서는 바이러스 벡터가 바람직하고, 암화의 위험을 억제하기 위해서는 플라스미드가 바람직하다.

체세포에 도입되는 유전자는 LTR 프로모터에 의해 전사시킬 수도 있고, 벡터 내부의 다른 프로모터로부터 발현시킬 수도 있다. 예를 들면, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, CAG 프로모터 등의 구성적 발현 프로모터, 또는 원하는 유도성 프로모터를 이용할 수 있다. 또한, LTR의 일부를 다른 프로모터로 치환한 키메라 프로모터를 이용해도 좋다.

또한, 도입 인자가 유전자의 발현 산물(예: 단백질)인 경우에는 "단백질 형질도입 도메인(Protein Transduction Domain; PTD)"으로 불리우는 펩티드 등을 발현 산물인 단백질에 결합시켜 배지에 첨가함으로써 체세포에 도입할 수 있다.

배양

본 발명의 방법에 있어서, 포유동물의 분화된 체세포를, 유전자 도입 후, 배지 중에서 배양할 수 있다. 예를 들면, 시험관내에서 골격근 세포를 유도(제조)하는 경우가 바람직한 실시형태이다.

배양은, 세포 및 배지를 저장하기 위한 적절한 용기로 수행할 수 있다. 바람직한 배양을 수행하는 방법으로서, 약 37℃ 정도 및 이산화탄소 농도 약 5% 정도의 조건하에서 배양하는 방법이 예시되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 조건에서의 배양은, 예를 들면, 공지의 CO₂ 인큐베이터를 사용하여 수행할 수 있다.

배양을 수행하는 기간은, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위에서, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 12시간 내지 1개월 정도, 1일 내지 3주 정도, 3일 내지 2주 정도로 할 수 있다. 필요에 따라, 배지 교환을 수행할 수 있다. 배양 조건은 통상적인 방법에 준하는 것이 바람직하다.

배양에서, 필요에 따라 계대를 수행할 수 있다. 계대를 수행할 경우는, 컨플루언트 상태에 도달하기 전에 또는 직후에 세포를 회수하고, 세포를 새로운 배지에 파종한다. 또한, 본 발명의 배양에서, 배지를 적절하게 교환할 수 있다.

배지

본 발명의 방법에서 이용하는 배지는 특별히 한정되지 않는다. DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium), EMEM(Eagle 's minimal essential medium), αMEM(alpha Modified Minimum Essential Medium) 등의 통상의 액체 배지를 사용할 수 있다. 필요에 따라, 혈청 성분(Fetal Bovine Serum(FBS), Human Serum(HS)), 스트렙토마이신, 페니실린 등의 항생제, 비-필수 아미노산(Non-Essential Amino Acids; NEAA) 등의 성분을 첨가할 수 있다.

IGF-1 등의 성장 인자를 첨가할 수도 있다.

본 발명의 방법에 의한 골격근 세포의 조제 시의 효율이 높다는 관점에서, 배지로서 골격근 세포를 분화시키기 위한 분화 유도 배지를 이용하는 것이 바람직하다. "골격근 세포를 분화시키기 위한 분화 유도 배지"는 다능성 줄기세포(ES 세포, iPS 세포 등)을 골격근 세포로 분화시킬 수 있는 성분을 포함하는 배지를 지칭한다.

골격근 세포를 분화시키기 위한 분화 유도 배지로는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 근아세포 분화용 배지(IGF-1 10ng/ml, 100U/mL 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 가한 1% 비-필수 아미노산(NEAA), 및 5% 말 혈청 첨가 αMEM 배지)을 들 수 있다. 그러나, 이들에 국한되지 않는다.

유도(제조)

따라서, 체세포에서 골격근 세포가 유도된다.

유도된 골격근 세포는, 한 가지 실시형태에서는, 외래성의 MyoD 패밀리 유전자 및 Myc 패밀리 유전자를 갖는다. 여기서, "외래성"은, 주로 상기 도입 수단의 결과 도입된 유전자 또는 이의 발현 산물의 형태이며, 천연의 형태와는 다른 형태를 지칭한다. 예를 들면, 천연 프로모터 이외의 프로모터 발현을 제어하는 유전자, 천연 이외의 염색체상의 위치, 또는 염색체 외에 존재하는 유전자의 실시형태 등을 들 수 있다.

골격근 세포는, 골격근 세포 이외의 세포(예를 들면, 원래의 체세포)의 혼합물로 수득할 수 있는 경우가 있다. 이런 경우, 골격근 세포와 골격근 세포 이외의 세포를, 필요에 따라, 분리할 수 있다. 분리하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 세포 분류기나 자기 비드를 이용하여 분리할 수 있다.

본 발명에 의해 유도된 골격근 세포는, 예를 들면, 후술하는 이식 재료로서 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 의해 유도된 골격근 세포는, 골격근 세포를 이용한 다양한 연구 및 기술 개발 등에 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 골격근의 발생, 분화, 형태 형성의 메커니즘, 이들에 대한 역학적 스트레스, 영양, 호르몬 등의 영향의 분석 등의 기초 연구에 유용하다.

본 발명에 의해 유도된 골격근 세포를 이용하면, 다양한 질환과 유전적 배경을 갖는 인간이나 동물에서 간편, 신속, 저렴하게 골격근 세포를 수립할 수 있기 때문에, 질환이나 유전적 배경과 관련된 골격근 세포의 이상을 생화학적, 분자생물학적, 면역학적 등의 방법을 통해 분석할 수 있으며, 이를 통해 질환의 발병 기전의 해명 등의 연구 및 진단법의 개발에 도움을 줄 수 있다. 또한, 이러한 골격근 세포를 이용하여, 약물의 개발, 약제의 독성 시험 등을 수행하면, 다양한 질환에 대한 새로운 치료법의 개발에 도움을 줄 수 있다.

이식 재료

본 발명에 의해 수득되는 골격근 세포는 다양한 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 이 경우, 골격근 세포는 이식 재료의 형태로 제공될 수 있다.

이식 재료는, 근육 조직(특히, 근섬유)의 복구, 재건을 위해 생체내에 도입하는, 골격근을 함유하는 재료를 말한다. 본 발명에서 수득된 골격근 세포는, 이식 재료의 제작에 사용할 수 있다. 골격근 세포 자체로 이식 재료가 된다. 따라서, 골격근 세포를 세포 제제로 환자에게 이식할 수도 있고, 인공 재료로 이루어지는 기재(스캐폴드(예를 들면, 양막, 생체 적합성 폴리머 등))와 함께 이식하거나, 스캐폴드와 함께 배양한 후에 이식할 수 있다.

상기의 치료 대상이 되는 질환으로는

외상이나 손상에 의한 근육 손상, 사르코페니아, 선천성 횡격막 탈장, 제대 탈장, 복벽 파열, 배꼽 탈장, 복부 수술 후의 복벽 반흔 탈장 등의 골격근 세포의 결손, 부족을 기반으로 하는 질환;

프룬 벨리 증후군, 폴란드 증후군, 직장 항문 기형(항문 폐쇄증), 사타구니 탈장, 장기 침대 휴식 후의 폐용 증후군 등의 골격근의 기능저하를 기반으로 하는 질환;

피부 근염 ·다발성 근염, 봉입체 근염, 바이러스 감염에 따른 근염, 마이코플라스마 감염에 따른 근염 등의 염증성 근육 질환;

당원병 II형(Pompe 병), 당원병 III형, 당원병 V형(McArdle 병), 당원병 VII형(타루이 질환) 등의 대사성 근육 질환;

근육 이영양증, 근병, 중증 근무력증, 선천성 근무력 증후군, 미토콘드리아 질환, 근위축성 측삭 경화증(ALS) 등의 근육 질환

등을 들 수 있다.

본 명세서에서, 특별히 명시하지 않는 한, "치료"라는 용어는 환자가 특정 질병 또는 장애를 앓고 있는 사이에 수행하는 처치를 의도하고, 이에 따라 질병 또는 장애의 중증도, 또는 하나 또는 복수의 그 증상이 경감되거나 또는 질환 또는 장애의 진행을 지연 또는 감속하는 것을 의미한다. 본 명세서에서, "치료"는 "예방"을 포함한다.

본 발명에서 수득되는 골격근 세포는, 질병의 치료로 한정되지 않고, 미용과 기능 강화의 목적으로 사용할 수 있다. 이 때, 인간에 대한 처치도, 본 명세서에서는 편의상 치료로 부르고, "환자"는 "건강자" 또는 "인간", "질환"은 "미용" 또는 "기능"으로 대체할 수 있다.

본 발명은 또한, 인간 뿐만 아니라, 개, 고양이 등의 애완 동물이나 소, 말, 돼지, 양, 닭 등의 가축을 포함한 포유동물의 질병의 치료에 이용하는 것이 가능하다. 그 경우, "환자"를 "발병 가축" 또는 "포유동물"로 대체할 수 있다.

조성물

전술한 바와 같이, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 체세포에 도입함으로써 골격근 세포를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 포함하는, 골격근 세포를 유도하기 위한 조성물을 제공한다. 해당 골격근 세포를 유도하는 조성물은, 체세포에서 골격근 세포를 유도하기 위해 사용되는 인자를 포함하며, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 체세포에 도입가능한 형태로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 유전자의 체세포에 도입가능한 형태로서, 구체적으로는, 상기 유전자가 삽입된 벡터가 예시된다. 여기서, 상기 유전자는, 각각 다른 벡터에 도입될 수도 있고, 하나의 벡터에 2종 이상의 유전자가 동시에 도입될 수도 있다.

사용할 수 있는 벡터의 종류 등에 대해서는 전술한 바와 같다.

상기 조성물은, 예를 들면, 유전자 치료에서 의약(치료제)로서 사용할 수 있다.

생체내(in vivo)에서의 직접 재프로그래밍

골격근의 결손 부위에 존재하는 섬유아세포 등에 MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 도입하는 것으로, 해당 손상 부위에서 골격근 세포를 직접 재프로그래밍에 의해 유도하여 골격근 손상의 치료 및 골격근의 재생에 기여할 수 있다. MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물의 도입에 있어서는 상기의 본 발명의 조성물을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 유도 방법은 시험관내(in vitro)에서의 직접 재프로그래밍 뿐만 아니라, 상기와 같은 생체내에서의 직접 재프로그래밍도 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 생체내에서의 직접 재프로그래밍을 통해, 예를 들면, 각종 질환을 치료하는 유전자 치료를 수행할 수 있다. 질환의 구체적인 예는 상기에 기재된 것을 들 수 있다.

생체내에서의 직접 재프로그래밍은, 골격근의 손상부에서 섬유아세포 내로의, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물의 도입 외에도, 예를 들면, 하기의 문헌에 기재된 생체내에서의 심근 세포로의 직접 재프로그래밍에 준하여 수행할 수 있다.

1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013; 89(3 ):118-28. Review.

2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors:Cell 2010 Aug 6; 142(3):375-86.

3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes . Nature 2012 May 31; 485(7400):593-8.

상기 문헌 1 내지 3의 내용은 본원에 참고로 원용된다.

실시예

이하에 실시예를 나타내지만, 본 발명이 이 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 중, HDF는 인간 피부 섬유아세포(Human Dermal Fibroblast)를 나타낸다.

실시예 1(도 1)

도 1에 방법의 개요를 나타낸다. 레트로바이러스 벡터 플라스미드 pMXs.puro에 MyoD1, L-Myc, c-Myc, Oct4, Klf4 및 SOX2 유전자의 cDNA 코딩 서열을 제네아트 심리스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit)(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 도입했다. 패키징 세포 Plat GP 세포를, 100U/mL 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 가한 1% NEAA, 10% FBS 첨가 DMEM 배지(통상 배지)에 현탁시키고, 젤라틴 코팅한 10cm 배양 접시에 5×10⁶개 파종했다.

24시간 배양 후, 상기의 유전자를 도입한 pMXs 벡터를 다양한 조합으로 pCMV VSV 벡터와 함께 X-tremeGENE 9를 이용하여 하기 비율로 도입했다.

즉, 도입 유전자 5㎍, pCMV.VSV 2.5㎍, Opti-MEM 500㎕, X-tremeGENE 9 22.5㎕의 혼합 용액을 10ml의 배지를 함유하는 10cm 접시에 첨가했다.

24시간 후, 배지를 항생제를 포함하지 않는 통상 배지로 교환했다. 동일에, 인간 정상 피부 섬유아세포주인 aHDF를 2.2×10⁶ 세포/mL로 10cm 배양 접시에 파종했다.

24시간 후, Plat GP 배양 상청액을, 기공의 직경이 0.45㎛인 주사기 필터를 통과시킨 후, 폴리브렌(최종 농도 4㎍/mL)와 혼합했다(바이러스 용액).

인간 정상 피부 섬유아세포(aHDF)의 배양 상청액을 흡인 제거한 후, 바이러스 용액을 첨가했다(Day 0).

24시간 배양하여 감염시킨 후, 배양 상청액을 흡인 제거하고, 근아세포 분화용 배지(IGF-1 10ng/ml, 100U/mL 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 가한 1% NEAA, 5% 말 혈청 첨가 αMEM 배지)를 첨가했다. 그 후, 배양액을 2일에 1회 교환하고, 14일까지 배양했다.

실시예 2(도 2)

인간 정상 피부 섬유아세포로부터 근아세포로의 전환에 있어서, 미오게닌 유전자 및 CKM 유전자의 mRNA 발현 측정 결과.

인간 정상 피부 섬유아세포(aHDF)를 12웰 플레이트에 파종하고, 도 1의 방법에 따라 배양을 수행했다.

인간 MyoD1 유전자, 인간 Oct4 유전자, 인간 Sox2 유전자, 인간 Klf 유전자, 인간 L-Myc 유전자, 인간 c-Myc 유전자를 지시된 조합으로 도입했다.

유전자 도입 14일 후, 전체 RNA를 회수하고, Rever Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 이용하여 cDNA를 합성했다. 미오게닌 유전자, CKM 유전자와 β-액틴 유전자의 mRNA 수준을 정량할 목적으로, 실시간 PCR 마스터 믹스(Master Mix), Taqman pobe, 특이적 프라이머 및 cDNA를 혼합하고, AB7300 실시간 PCR 시스템을 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행했다. 각 세포의 β-액틴 mRNA 수준에 대한 미오게닌 mRNA 및 CKM mRNA 수준의 값을 계산했다.

결과를 도 2에 도시한다. MyoD1와 L-Myc, 2개 유전자를 도입한 세포는, 대조군과 비교하여, 유전자 수준에서 골격근 세포 특이적 마커인 미오게닌 유전자, CKM 유전자의 가장 강력한 발현을 나타냈다. 또한, 인간 MyoD1 유전자, 인간 L-Myc 유전자의 두 유전자를 도입한 그룹만이 일차 인간 골격근 세포(pSKM)와 동등한 발현을 나타냈다.

실시예 3(도 3)

12 웰 플레이트에서 세포 배양하고, 골격근 세포 특이적 마커(미오게닌, CKM, 디스트로핀)의 발현을 면역형광 염색으로 확인했다.

인간 정상 피부 섬유아세포 aHDF를 12 웰 플레이트에서 배양하고, 도 1과 같이 실험 했다. 유전자 도입 14일 후, 각 웰에서 배양액을 흡인 제거하고, PBS(-)로 세척했다. 4% 파라포름알데히드로 고정 후, PBS(-)로 3회 세척한 후, Blocking One을 첨가하여 실온에서 60분 동안 인큐베이팅했다.

일차 항체(항-CKM 항체, 항-디스트로핀 항체, 항-미오게닌 항체)를 밤새 4℃에서 반응시킨 후, 세척 완충액으로 3회 세척했다. 이차 항체(Alexa 488-접합된 항-래빗 IgG 항체, Alexa 546-접합된 항-마우스 IgG 항체)를 실온에서 1시간 반응시킨 후, 세척 완충액으로 3회 세척하고, 라이프 테크놀로지사의 DAPI를 갖는 슬로우페이드골드(SlowFadeGold) 항-페이드 시약을 이용하여 핵 염색을 실시했다. 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영했다.

결과를 도 3a, 3b, 3c에 나타낸다. MyoD1만을 도입한 세포보다 MyoD1과 LMyc를 도입한 세포에서 CKM, DMD, 미오게닌은 보다 강력한 및 양성으로 되었다.

또한, MyoD1과 LMyc를 도입한 세포는 일차 인간 근아세포보다 CKM, DMD, 미오게닌에서 보다 강력하게 염색되었다.

실시예 4(도 4)

12 웰 플레이트에서 세포 배양하고, 다핵 근관 세포의 출현을 관찰했다. 인간 정상 피부 섬유아세포 aHDF를 12 웰 플레이트에서 배양하고, 도 1의 방법에 따라 배양했다. 유전자 도입 14일 후, 각 웰에서 배양액을 흡인 제거하고, PBS(-)로 세척했다. 4% 파라포름알데히드로 고정 후, PBS(-)로 3회 세척하고, 라이프 테크놀로지사의 DAPI를 갖는 슬로우페이드골드 항-페이드 시약을 이용하여 핵 염색을 실시했다. 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영했다. MyoD1와 L-Myc를 함께 도입한 그룹에서는 다핵 근관 세포가 높은 빈도로 관찰되었다. L-Myc 또는 c-Myc 유전자를 MyoD1 유전자와 함께 도입하면, 세포 융합이 촉진하는 것을 알 수 있다.

실시예 5(도 5)

12 웰 플레이트에서 세포 배양하고, 다핵 근관 세포의 출현을 평가했다.

인간 정상 피부 섬유아세포 aHDF를 12 웰 플레이트에서 배양하고, 도 1의 방법에 따라 배양했다. 유전자 도입 14일 후, 각 웰에서 배양액을 흡인 제거하고, PBS(-)로 세척했다. 4% 파라포름알데히드로 고정 후, PBS(-)로 3회 세척하고, 라이프 테크놀로지사의 DAPI를 갖는 슬로우페이드골드 항-페이드 시약을 이용하여 핵 염색을 실시했다. 위상차 현미경으로 관찰하고, 세포와 핵을 계수했다.

결과를 도 5에 도시한다. MyoD1와 L-Myc를 도입한 그룹에서는 3개보다 많은(4개 이상) 핵을 갖는 근관 세포가 높은 빈도로 출현했다.

실시예 6(도 6)

인간 정상 피부 섬유아세포로부터 근아세포로의 전환, 미오게닌 유전자, CKM 유전자, MHC3 유전자의 mRNA 발현 측정 결과.

인간 정상 피부 섬유아세포(aHDF)를 12 웰 플레이트에서 배양하고, 도 1과 동일한 방법에 의해 배양을 수행했다.

인간 MyoD1 유전자, 인간 L-Myc 유전자를 단독 또는 2개 유전자를 동시에 도입하고, 14일 후에, 전체 RNA를 회수하고, 레버(Rever) Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스(Master Mix)를 이용하여 cDNA를 합성했다. 미오게닌 유전자, CKM 유전자, MHC3 유전자와 β-액틴 유전자의 mRNA 수준을 정량할 목적으로, 실시간 PCR 마스터 믹스, Taqman pobe, 특이적 프라이머 및 cDNA를 혼합하고, AB7300 실시간 PCR 시스템을 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행했다. 각 세포의 β-액틴 mRNA 수준에 대한 미오게닌 mRNA 및 CKM mRNA 수준의 값을 계산했다.

결과를 도 6에 나타낸다. MyoD1와 L-Myc, 두 유전자를 도입한 세포는, 대조군과 비교하여, 일차 골격근 세포(pSKM)와 동등하게 유전자 수준에서 골격근 세포 특이적 마커인 미오게닌 유전자, CKM 유전자, MHC3 유전자의 강력한 발현을 나타냈다.

실시예 7(도 7)

인간 정상 피부 섬유아세포로부터 근아세포로의 전환, DMD 유전자의 mRNA 발현의 경시적 측정 결과.

인간 정상 피부 섬유아세포(aHDF)를 12 웰 플레이트에서 배양하고, 도 1과 동일한 방법으로 배양을 수행했다.

인간 MyoD1 유전자와 인간 L-Myc 유전자를 공-형질도입하고, 도입 후 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14일째에 전체 RNA를 회수했다. 레버 Tra Ace qPCR RT 마스터 믹스를 사용하여 cDNA를 합성했다. DMD 유전자와 β-액틴 유전자의 mRNA 수준을 정량할 목적으로, 실시간 PCR 마스터 믹스, Taqman pobe, 특이적 프라이머 및 cDNA를 혼합하고, AB7300 실시간 PCR 시스템을 이용하여 실시간 RT-PCR을 수행했다. 각 세포의 β-액틴 mRNA 수준에 대한 DMD mRNA 수준의 값을 계산했다.

결과를 도 7에 도시한다. MyoD1와 L-Myc의 2개 유전자를 도입한 세포는 골격근 세포의 기능 발현에 필수적인 단백질인 DMD 유전자의 발현이 경시적으로 강력해지고, 14일째는 일차 골격근 세포(pSKM)와 동등한 발현을 나타냈다.

실시예 8(도 8)

MyoD1와 L-Myc를 도입한 세포를 7일간 배양 마우스의 복부 피하에 주입 이식하고, 적출 표본으로부터 절편을 생성하여 면역염색을 수행했다.

도 8에 방법의 개요를 나타낸다. 레트로바이러스 벡터 플라스미드 pMXs.puro에, MyoD1, L-Myc 유전자의 cDNA 코딩 서열을 제네아트 심레스 클로닝 앤드 어셈블리 키트(GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit)(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 도입했다. 패키징 세포 Plat GP 세포를 100U/mL 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 포함한 1% NEAA 10% FBS를 가한 DMEM(통상 배지)에 현탁하고, 젤라틴 코팅된 10cm 배양 접시에 5×10⁶개 파종했다.

24시간 배양 후, 상기 유전자를 포함하는 pMXs 벡터를 다양한 조합으로 pCMV VSV 벡터와 함께 X-tremeGENE 9를 이용하여 하기의 비율로 도입했다.

즉, 도입 유전자 5㎍, pCMV. VSV 2.5㎍, Opti-MEM 500㎕, X-tremeGENE 9 22.5㎕의 혼합 용액을 10ml의 배지를 함유하는 10cm 접시에 첨가했다.

24시간 후, 항생제를 포함하지 않는 통상 배지로 교환했다. 동일에, 인간 정상 피부 섬유아세포 균주 aHDF를 2.2×10⁶ 세포/mL로 10cm 배양 접시에 파종했다.

24시간 후, Plat GP 배양 상청액을 기공의 직경이 0.45㎛인 주사기 필터를 통과시킨 후, 폴리브렌(최종 농도 4㎍/mL)와 혼합했다(바이러스 용액).

aHDF의 배양 상청액을 흡인 제거한 후, 바이러스 용액을 첨가했다(Day 0).

24시간 배양하여 감염시킨 후, 배양 상청액을 흡인 제거하고, 근아세포 분화용 배지(IGF-1 10ng/ml, 100U/mL 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신을 가한 1% NEAA, 5% 말 혈청 첨가 αMEM 배지)를 첨가했다. 그 후, 배양액을 2일마다 1회 교환하고, 7일까지 배양했다.

7일에, 아쿠타제를 이용하여 접시로부터 세포를 떼어 내고, 3x10⁵개씩 아이스에 100㎕의 마트리겔(CORNING REF354234) 스톡 용액에 용해시켰다.

NOD/SCID 마우스의 우측 상복부 피하에 마트리겔에 혼탁한 세포액을 주입 이식했다. 대조군의 마우스는 aHDF를 3x10⁵개씩 아이스에 100㎕의 마트리겔(CORNING REF354234) 스톡 용액에 용해된 세포를 주입 이식했다. 주입 이식 1주 후, 마우스를 안락사시키고, 상복부 피하를 박리하고, 피하 이식 조직을 피부마다 적출했다.

이식 1주 후의 이식 부위와 적출한 조직의 현미경 사진을 도 8b에 나타낸다. MyoD1와 L-Myc 유전자를 도입한 세포의 이식 부위에는 섬유성 결절 모양 조직이 관찰되었다.

실시예 9(도 9)

실시예 8에서 적출한 조직을, 4% 파라포름알데히드로 24시간 고정했다. 그 후, 24시간 동안 파라핀 매립하여 파라핀 블록을 제조했다.

파라핀 고정된 마우스 피하 조직 표본으로부터 3㎛ 두께의 슬라이스 절편을 생성했다. 절편을 60℃에서 15분간 인큐베이션한 후 크실렌에 5분 침지하고, 이것을 3회 반복했다. 또한, 100% 에탄올에 3분 침지하고, 이것을 3회 반복했다. 그 후, 탈파라핀하고, 증류수로 5분간 세척했다.

다음에, 절편을 덮도록 BLOXALL을 적하하고, 10분간 실온에서 정치했다.

PBS로 5분 세척하고, 절편을 덮도록 2.5% 말 혈청을 적하하고, 20분 동안 실온에서 정치했다.

종이 타올 위에 슬라이드를 가볍게 부딪혀 혈청을 제거했다. 일차 항체로서, 데스민 항체, 항-CKM 항체, 항-디스트로핀 항체, 항-ACTA 항체 또는 항-미오게닌 항체를, 절편을 덮도록 적하했다. 30분간 실온에서 정치하고, PBS로 5분간 세척했다. 종이 타올 위에 슬라이드를 가볍게 부딪혀 PBS를 제거했다.

절편을 덮도록 ImmPRESS 시약을 적하하고, 30분간 정치하고, PBS에 의한 5분간의 세정을 2회 반복하고, 종이 타올 위에 슬라이드를 가볍게 부딪혀 PBS를 제거했다.

ImmPACT DAB 희석액 1ml를 넣고, ImmPACT DAB 크로마겐 농축물을 1방울 가하고, 이들을 보텍스(Vortex)에서 잘 혼합했다. 절편을 덮도록 효소 기질 용액을 적하하고, 30초에서 1분간 정치한 후, 증류수로 5분간 세척했다.

증류수로 추가로 5분간 2회 세척하고, 헤마톡실린 용액에서 5분간 핵 염색을 실시했다. 흐르는 물에서 5분간 세척하고, 50℃의 워터 버스에 2분간 침지한 후, 흐르는 물에서 세척을 2분간 수행했다. 100% 에탄올에서의 3분간 침지를 3회 실시하고, 크실렌에서 5분간의 침지를 3회 수행하여 탈수한 후, 절편을 덮도록 봉입제를 적하하고, 커버 유리로 덮었다.

조직의 관찰은 케이엔스(Keyence) BZ710에서 명시야로 수행했다.

결과를 도 9에 나타낸다.

섬유아세포를 이식한 조직에서는, 피하 조직 내에 근섬유 모양의 구조는 관찰되지 않고, 다핵 세포는 관찰되지 않고, 데스민 양성 세포도 관찰되지 않았다(도 9a). 한편, MyoD1과 L-Myc를 도입한 세포를 이식한 조직에서는, 피하 조직 내에 근섬유 모양의 구조가 관찰되고, 그 중에는 데스민 양성, CKM 양성, ACTA 양성의 다핵 세포를 다수 확인할 수 있었다(도 9b). 이러한 결과로부터, MyoD1과 L-Myc 유전자로 유도한 세포를 이식하면, 생체내에서 생착하고, 근섬유 모양의 조직을 형성하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 10

실시예 8 및 9와 동일한 방식으로, 유전자를 도입하지 않은 인간 섬유아세포(aHDFs) 또는 MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터와 L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터의 모두를 감염시킨 후 7일간 배양한 세포(dMB(직접 전환된 근아세포))를 마트리겔(BD Bioscience, San Jose, CA)과 용적비 1:1로 혼합하고, NOG/SCID 마우스의 측면 복부에 이식했다(세포 수는 3 내지 5x10⁵개/마우스). 7일 후, 이식 부위의 조직을 적출하고, 실시예 9와 동일한 방식으로 4% 파라포름알데히드에서 8시간 고정 후 파라핀에 매립하고, 슬라이싱했다. 항-데스민 항체를 이용한 면역조직화학을 실시하여, 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 400배의 배율로 관찰하고, 1 시야당 데스민 양성 세포의 비율을 산출했다.

결과를 도 10에 도시한다. ML 도입 세포를 이식한 그룹(dMBs(직접 전환된 근아세포))에서 데스민 양성 세포가 유의적으로 다수 이식 부위의 조직에 존재하는 것을 알 수 있다. 값은 평균±표준편차. 각 그룹 N=3마리 마우스. * P <0.05 vs. 비도입 세포 이식 그룹.

실시예 11

실시예 1과 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에 MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터를 감염시켰다(M). 또 다른 세포에 L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(L)와 MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(M)의 모두를 감염시켰다(ML). 대조군으로서 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않는 세포도 준비했다(-). 이들을 실시예 1과 동일한 방식으로 근아세포 분화용 배지에서 배양했다. 감염 14일 후에, 실시예 3과 동일한 방식으로 항-CKM 항체를 이용한 면역형광 염색과 핵 염색을 실시했다. 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영하여 총 세포 수에 대한 CKM 양성 세포의 비율을 측정했다.

결과를 도 11에 도시한다. MyoD1 유전자를 단독 도입한 세포는 약 26%가 CKM 양성이었지만, MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 공-도입한 세포는 약 90%가 CKM 양성이었다. 따라서, MyoD1와 L-Myc 유전자를 공-도입함으로써 인간 섬유아세포의 약 90%가 근아세포로 전환하는 것으로 나타났다. 값은 평균±표준편차. N=3개 웰/그룹. * P <0.05 vs. 비도입 세포.

실시예 12

　실시예 1과 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에 MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(M), L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(L), c-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(C)를 하기 조합으로 감염시켰다. 대조군으로서 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않는 세포도 준비했다(-). 이들을, 실시예 1과 동일한 방식으로, 근아세포 분화용 배지에서 배양했다. 감염 14일 후에, 실시예 3과 동일한 방식으로 핵 염색을 실시했다. 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영했다(도 12a). 또한, 3개보다 많은 핵을 갖는 세포 백분율을 측정했다(도 12b).

MyoD1 유전자를 단독 도입한 세포는 약 6%가 3개보다 많은 핵을 갖는 세포였지만, MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 공-도입한 세포는 약 43%가 3개보다 많은 핵을 갖는 세포였다. MyoD1 유전자와 c-Myc 유전자를 공-도입한 세포는 약 27%가 3개보다 많은 핵을 갖는 세포였다. 따라서, MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 공-도입한 세포는 가장 높은 효율로 다핵 세포가 되는 것으로 나타났다. 도 12b의 값은 평균±표준편차. 각 그룹 N=3개 웰. * P<0.05 vs. 비도입 세포.

실시예 13

실시예 12와 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에 MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터와 L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터의 모두를 감염시켰다(ML). 대조군으로서 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않는 세포도 준비했다(-). 일부 그룹에서는 ERK5 경로 억제제 XMD8-92을 기재된 농도로 첨가했다. 이들을, 실시예 12와 동일한 방식으로, 근아세포 분화용 배지에서 배양했다. 감염 14일 후에, 실시예 3과 동일한 방식으로 핵 염색을 실시했다. 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영한 이미지를 나타낸다(도 13a 상단). 또한, 4개 이상의 핵을 갖는 세포, 2 내지 3개의 핵을 갖는 세포, 1개의 핵을 갖는 세포의 백분율을 산출했다(도 13a 하단).

유전자 도입하지 않은 섬유아세포는 모두 단핵 세포였지만, ML을 감염시킨 세포는 약 40%가 4개 이상의 핵을 갖는 세포이고, 약 16%가 2 내지 3개 핵을 갖는 세포였다. 그러나, ERK5 억제제인 XMD8-92을 2 내지 5μM 첨가하여, 4개 이상의 핵을 갖는 세포는 약 10 내지 12%로 감소하고, 2 내지 3개 핵을 갖는 세포는 약 21 내지 23%로 되었다.

또한, 감염 14일 후에 세포로부터 RNA를 추출했다. 대조군으로서, 일차 인간 골격근 세포(pSKMs(일차 골격근 세포))로부터 RNA를 추출했다. 실시간 RT-PCR로 미오게닌, CKM, 디스트로핀의 mRNA를 정량했다. 결과를 도 13b에 나타낸다. ML 유전자 도입에 의한 이러한 근아세포 특이적 유전자의 발현 유도는 XMD8-92의 첨가에 의해 억제되지 않았다. 따라서, ERK5 경로 억제에 의한 다핵화 억제는 근아세포로의 전환의 억제가 아닌 것으로 나타났다.

이러한 결과로부터, MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 공-도입한 세포의 다핵화는 ERK5 경로 의존성 세포 융합에 의한 것임이 밝혀졌다.

실시예 14

실시예 8 및 9와 동일한 방식으로 실험 후, 이식 부위의 조직 절편을, 실시예 10과 동일한 방법으로 항-CKM 항체와 항-α-액틴 항체를 각각 이용한 면역조직화학에 제공했다.

결과를 도 14에 도시한다. MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 도입한 세포(dMB(직접 전환된 근아세포))를 이식한 그룹에서, CKM 및 α-액틴은 양성의 근섬유 모양의 조직이 이식 부위에서 다수 형성된 것을 알 수 있다.

실시예 15

실시예 1과 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에, MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터와 L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터의 모두를 감염시킨 후, 근아세포 분화용 배지에서 10일간 배양했다(ML). 대조군으로서 유전자 도입하지 않는 인간 섬유아세포도 이용했다(-). 갈색 지방세포 마커인 UCP1 유전자와 CIDEA 유전자, 연골세포 마커인 SOX9 유전자와 아그레칸(aggrecan) 유전자, 조골세포 마커인 Runx2 유전자와 오스테오칼신 유전자에 대해 각각의 mRNA 발현을 실시간 RT-PCR로 측정했다.

결과를 도 15에 도시한다. MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 도입한 세포(ML 도입 세포)는, 이러한 간엽 세포의 마커를 모두 유의하게 발현 상승시키지 않는 것을 알 수 있다. 값은 평균 값±표준편차. 각 그룹 N=3개 그룹. * P<0.05 vs. 비도입 세포.

실시예 16

실시예 1과 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에, MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(M), L-Myc를 도입한 레트로바이러스 벡터(L) 및 c-Myc를 도입한 레트로바이러스 벡터(C)를, 도에 기재된 바와 같이 M 단독, MC 및 ML의 조합으로 감염시켰다. 대조군으로서 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 세포도 준비했다(-). 이들을, 실시예 1과 동일한 방식으로, 근아세포 분화용 배지에서 배양했다. 감염후 14일 후에, 200nM의 미토트랙커 레드 프로브(MitoTracker Red probe)(Invitrogen)에서 37℃로 15분간 염색했다. 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영했다.

결과를 도 16에 나타낸다. 상부 사진은 위상차 이미지, 하부 사진은 형광 이미지이다. 유전자 도입하지 않는 인간 섬유아세포와 MyoD1 유전자를 단독 도입한 세포에 비하여, MC를 공-도입시킨 세포는 다수의 미토콘드리아를 갖고 있으며, ML를 공-도입한 세포는 더 많은 미토콘드리아를 갖고 있었다.

실시예 17

인간 섬유아세포에, MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터와 L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터의 모두를 감염시킨 후, 6일간 배양했다(ML). 대조군으로서 유전자 도입하지 않은 인간 섬유아세포도 이용했다(-). 항-데스민 항체 또는 항-CKM 항체에 의한 면역 염색과 DAPI에 의한 핵 염색을 기재된 바와 같이 수행했다.

결과를 도 17에 나타낸다. 상부 사진은 위상차 이미지, 하부 사진은 형광 이미지이다. 유전자 도입후 6일간이라는 비교적 단기간 배양 후에도, ML 도입 세포는 근아세포 특이적 유전자 데스민과 CKM을 발현하는 것을 알 수 있다.

실시예 18

실시예 1과 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에, MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터를 감염시켰다(M). 또한, L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터(L)와 MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터의 모두를 감염시켰다(ML). 이들을 근아세포 분화용 배지에서 배양하고, 감염후 14일째에 각 세포로부터 RNA를 추출했다. 대조군으로서 레트로바이러스 벡터를 감염시키지 않은 세포(-)와 일차 인간 골격근 세포(pSKMS)로부터 RNA를 추출했다. 이들 RNA를, 제네칩 휴먼 진(GeneChip human Gene) 1.0 ST(Affymetrix)을 이용한 DNA 마이크로어레이 분석에 제공했다.

골격근의 발생에 관여하는 유전자 그룹(도 18a), 골격근의 수축에 관여하는 유전자 그룹(도 18b), 미오신 필라멘트에 관여하는 유전자 그룹(도 18c) 및 액틴 필라멘트에 관여하는 유전자 그룹(도 18d)의 각각 히트맵 및 클러스터링 분석의 결과를 나타낸다. 골격근에 대한 이들 유전자 그룹의 발현은 모두, ML 도입 세포는 pSKMS와의 상동성이 가장 높고, 섬유아세포와의 상동성이 낮았다. M 단독 도입 세포는 pSKMS보다 섬유아세포와의 상동성이 더 높았다.

실시예 19

실시예 1과 동일한 방식으로, 인간 섬유아세포에, MyoD1 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터와 L-Myc 유전자를 도입한 레트로바이러스 벡터의 모두를 감염시키고(ML), 근아세포 분화용 배지에서 배양했다. 감염후 2일 간격으로 rBC2LCN-FITC(Wako 180-02991)에서 염색하고, 또한 세포 핵을 Hoechst33342로 염색했다. 대조군으로서, 레트로바이러스 벡터 감염전 세포(가장 좌측)도 동일한 방식으로 염색했다. 양성 대조군으로서, 인간 iPS 세포(hiPS235G1)도 동일한 방식으로 염색했다. 이들 세포를, 형광 현미경(Keyence BZ710)을 이용하여 촬영했다.

결과를 도 19에 나타낸다. 상부 사진은 위상차 이미지, 하부 사진은 형광 이미지이다. 섬유아세포는 ML를 감염시켜도 rBC2LCN-FITC에서는 염색되지 않는 것으로부터, ML 유전자 도입에 의한 섬유아세포로부터 근아세포로의 전환에 있어서는, 그 도상에서 iPS 세포 모양의 줄기세포를 경유하지 않는 것을 알 수 있다.

실시예 20

MyoD1 유전자와 L-Myc 유전자를 각각 플라스미드 벡터 pCX에 도입하여 발현 벡터를 작제했다. 인간 섬유아세포(HDFs)에, MyoD1 플라스미드 단독 또는 MyoD1 플라스미드와 L-Myc 플라스미드 모두를 전기천공으로 도입하고, 근아세포 분화용 배지에서 14일간 배양했다. 이러한 세포, 및 대조군으로서 유전자 도입하지 않은 섬유아세포(HDF)로부터 RNA를 추출하고, 미오게닌 유전자와 CKM 유전자의 mRNA를 실시간 RT-PCR로 정량했다. 결과를 도 19에 나타낸다.

MyoD1 유전자 단독 도입 세포와 비교하여, MyoD1와 L-Myc 유전자를 공-도입한 세포는 미오게닌과 CKM 유전자를 보다 강력하게 발현하고 있었다. 따라서, 플라스미드 벡터를 이용한 형질감염에 의해서도 MyoD1+L-Myc 유전자 도입은 섬유아세포로부터 근아세포로의 전환을 유도할 수 있음을 나타냈다.

Claims

MyoD 패밀리 유전자(family gene) 또는 이의 발현 산물, 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 포함하는, 포유동물의 분화된 체세포를 골격근 세포로 전환하기 위한 조성물로서, 상기 Myc 패밀리 유전자가 L-myc 유전자인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 체세포가 섬유아세포인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 체세포가 인간의 체세포인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 MyoD 패밀리 유전자가 MyoD1 유전자인, 조성물.
MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물, 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 포함하는, 포유동물의 분화된 체세포를 골격근 세포로 전환하여 근육 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물로서, 상기 Myc 패밀리 유전자가 L-myc 유전자이고, 상기 근육 질환이 골격근의 결손, 부족 또는 기능저하를 기반으로 하는 근육 질환인, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 형태인, 조성물.
포유동물의 체세포에, MyoD 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물 및 Myc 패밀리 유전자 또는 이의 발현 산물을 도입하는 단계를 포함하는, 골격근 세포를 유도하는 시험관 내 방법으로서, 상기 Myc 패밀리 유전자가 L-myc 유전자인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 체세포가 섬유아세포인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 체세포가 인간의 체세포인, 방법.
제7항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 MyoD 패밀리 유전자가 MyoD1 유전자인, 방법.