JPWO2018124292A1 - 骨格筋細胞及びその誘導方法 - Google Patents
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Abstract
Description
体細胞は、哺乳動物由来であればよい。骨格筋細胞を生体に移植する場合には、移植される被験体由来の体細胞(自家細胞)を用いることが、感染や拒絶応答等の危険を低減させるために好ましい。しかしながら、筋の欠損などに対して移植するなどの目的の場合、自家細胞でなく、他人や他の動物の体細胞からあらかじめ準備しておいた骨格筋細胞を移植に用いることができる。またはあらかじめ準備しておいた他人や他の動物の体細胞から骨格筋細胞を作り、移植に用いることができる。すなわち、骨格筋細胞のバンクを作っておき移植目的に供することができる。このような場合、拒絶応答等の危険を低減させるために、あらかじめMHCをタイピングしておくことができる。また、あらかじめ骨格筋細胞の細胞特性や造腫瘍性などを確認しておくことができる。
本発明の方法では、体細胞にMyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する。ここで、「発現産物」としては、MyoDファミリー遺伝子及びL-myc遺伝子のmRNA又はタンパク質が挙げられる。
ヒトMyoD1遺伝子cDNA配列:NM_002478(例えば、NM_002478.4)、
ヒトMyoD1タンパク質アミノ酸配位列:NP_002469(例えば、NP_002469.2);
ヒトL-myc遺伝子cDNA配列:NM_001033081、NM_001033082、NM_005376(例えば、NM_001033081.2、NM_001033082.2、NM_005376.4)、
ヒトL-mycタンパク質アミノ酸配位列:NP_001028253.1、NP_001028254.2、NP_005367.2(例えば、NP_001028253、NP_001028254、NP_005367)。
本発明の方法は、特定の遺伝子を選択する以外は、公知のダイレクト・リプログラミングの手法に準じて行うことができ、例えば以下のいずれかの文献の方法に準じて行うことができる:
1: Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors; Masaki Ieda, Ji-Dong Fu, Paul Delgado-Olguin, Vasanth Vedantham, Yohei Hayashi, Benoit G. Bruneau, and Deepak Srivastava Cell 142: 375-386, 2010.
2: Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Thomas Vierbuchen, Austin Ostermeier, Zhiping P. Pang, Yuko Kokubu, Thomas C. Sudhof& Marius Wernig. Nature 46
3: 1035-1041, 20103: Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Pang ZP, Yang N, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M. Nature 476: 220-223, 2011.
4: Generation of hyaline cartilaginous tissue from mouse adult dermal fibroblast culture by defined factors Kunihiko Hiramatsu, Satoru Sasagawa, Hidetatsu Outani, Kanako Nakagawa, Hideki Yoshikawa, and Noriyuki Tsumaki, Journal of Clinical Investigation, 121: 640-657, 2011.
5: Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Pengyu Huang, Zhiying He, Shuyi Ji, Huawang Sun, Dao Xiang, Changcheng Liu, Yiping Hu, XinWang & Lijian Hui, . Nature 475:386-389, 2011.
6: Direct conversion of mouse fibroblasts to hepatocyte-like cells by defined factors. Sayaka Sekiya & Atsushi Suzuki. Nature 475:390-393, 2011.
7: Direct conversion of human fibroblasts into functional osteoblasts by defined factors. Yamamoto K, Kishida T, Sato Y, Nishioka K, Ejima A, Fujiwara H, Kubo T, Yamamoto T, Kanamura N & Mazda O. Proc Natl Acad Sci USA. 112:6152-6157, 2015.
8: Reprogrammed Functional Brown Adipocytes Ameliorate Insulin Resistance and Dyslipidemia in Diet-Induced Obesity and Type 2 Diabetes. Kishida T, Ejima A, Yamamoto K, Tanaka S, Yamamoto T, Mazda O. Stem Cell Reports. 5: 569-581, 2015.
9: Generation of directly converted human osteoblasts that are free of exogenous gene and xenogenic protein. Yamamoto K., Sato Y., Honjo K., Ichioka H., Oseko F., Sowa Y., Yamamoto T., Kanamura N., Kishida T., Mazda O. J Cell Biochem 117:2538-2545, 2016 .
10: 国際公開公報WO2014/010746号
上記の文献1〜10の内容は本明細書に参考として援用される。
本発明の方法において、哺乳動物の分化した体細胞を、遺伝子の導入後、培地中で培養することができる。例えば、インビトロで骨格筋細胞を誘導(調製)する場合の好適な態様である。
本発明の方法で用いる培地は、特に限定されない。DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、EMEM(Eagle's minimal essential medium)、αMEM(alpha Modified Minimum Essential Medium)などの通常の液体培地を用いることができる。必要に応じて、血清成分(Fetal Bovine Serum(FBS)、Human Serum(HS))、ストレプトマイシン、ペニシリンなどの抗菌薬、Non-Essential Amino Acids(NEAA)等の成分を添加することができる。
かくして、体細胞から骨格筋細胞が誘導される。
本発明により得られる骨格筋細胞は、種々の疾患を治療するために用いることができる。この場合、骨格筋細胞は移植材料の形態で提供されうる。
外傷や損傷による筋損傷、サルコペニア、先天性横隔膜ヘルニア、臍帯ヘルニア、腹壁破裂、臍ヘルニア、腹部手術後の腹壁瘢痕ヘルニアなどの骨格筋細胞の欠損、不足に基づく疾患;
プルーンベリー症候群、ポーランド症候群、直腸肛門奇形(鎖肛)、鼠径ヘルニア、長期臥床後の廃用症候群などの骨格筋の機能低下に基づく疾患;
皮膚筋炎・多発筋炎、封入体筋炎、ウイルス感染に伴う筋炎、マイコプラズマ感染に伴う筋炎などの炎症性筋疾患;
糖原病II型(Pompe病)、糖原病III型、糖原病V型(McArdle病)、糖原病VII型(垂井病)などの代謝性筋疾患;
筋ジストロフィ、ミオパチー、重症筋無力症、先天性筋無力症候群、ミトコンドリア病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、その他の筋疾患
などが挙げられる。
前述するように、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を体細胞に導入することにより、骨格筋細胞を誘導できる。従って、本発明は、さらに、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を含む、骨格筋細胞を誘導するための組成物を提供する。当該骨格筋細胞を誘導するための組成物は、体細胞から骨格筋細胞を誘導するために使用される因子を含むものであり、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物が体細胞に導入可能な形態で含まれていることが望ましい。上記遺伝子が体細胞に導入可能な形態として、具体的には、上記遺伝子が組み込まれたベクターが例示される。ここで、上記遺伝子は、各々別のベクターに組み込まれていてもよく、1つのベクターに2種以上の遺伝子が同時に組み込まれていてもよい。
骨格筋の欠損部位に存在する線維芽細胞などに、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入することで、当該損傷部位において骨格筋細胞をダイレクト・リプログラミングによって誘導し、もって骨格筋損傷の治療や骨格筋の再生に寄与することができる。MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物の導入においては、上記の本発明の組成物を好適に使用することができる。
1: Ieda M. Heart regeneration using reprogramming technology. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2013;89(3):118-28. Review.
2: Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, Vedantham V, Hayashi Y, Bruneau BG, Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010 Aug 6;142(3):375-86.
3: Qian L, Huang Y, Spencer CI, Foley A, Vedantham V, Liu L, Conway SJ, Fu JD, Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 2012 May 31;485(7400):593-8。
図1に手法の概要を示す。レトロウイルスベクタープラスミドpMXs.puroに、MyoD1, L-Myc, c-Myc, Oct4, Klf4, 及びSOX2遺伝子のcDNAコーディング配列を、GeneArt Seamless Cloning & Assembly Kit(Thermo Fisher Scientific)を用いて組み込んだ。パッケージング細胞 Plat GP細胞を、100U/mL Penicillinと100μg/ml Streptomycinを加えた1% NEAA 、10% FBS添加 DMEM培地(通常培地)に縣濁し、ゼラチンコートした10cm培養ディシュに5×106 個播種した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞から筋芽細胞へのコンバージョンにおける、Myogenin遺伝子およびCKM遺伝子のmRNA発現計測結果。
12wellプレートで細胞培養し、骨格筋細胞特異的マーカー(Myogenin, CKM、Dystrophin)の発現を蛍光免染で確認した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、図1のように実験した。遺伝子導入14日後に、各wellから培養液を吸引除去し、PBS(−)で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS(−)にて3回洗浄した後、Blocking Oneを加えて、室温で60分間インキュベートした。
12wellプレートで細胞培養し、多核の筋管細胞の出現を観察した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞aHDFを、12wellプレートに培養し、図1の手法に従い培養を行った。遺伝子導入14日後、各wellから培養液を吸引除去し、PBS(−)で洗浄した。4%パラホルムアルデヒドで固定後、PBS(−)にて3回洗浄し、ライフテクノロジー社製のSlowFadeGold anti fade reagent with DAPIを用いて核染色を行った。蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて撮像した。MyoD1とL-Mycを共導入した群では、多核の筋管細胞が高頻度に観察された。L-Myc またはc-Myc遺伝子をMyoD1遺伝子と共導入すると、細胞融合が亢進することがわかる。
12wellプレートで細胞培養し、多核の筋管細胞の出現を評価した。
ヒト正常皮膚線維芽細胞から筋芽細胞へのコンバージョン、Myogenin遺伝子、CKM遺伝子、MHC3遺伝子のmRNA発現計測結果。
ヒト正常皮膚線維芽細胞から筋芽細胞へのコンバージョン、DMD遺伝子のmRNA発現の経時的計測結果。
MyoD1とL-Mycを導入した細胞を7日間培養しマウスの腹部皮下に注入移植し、摘出標本から切片を作製し免疫染色を施行した。
実施例8で摘出した組織を、4%パラホルムアルデヒドで24時間固定した。その後、24時間かけてパラフィン包埋し、パラフィンブロックを作成した。
実施例8及び9と同様に、遺伝子導入をしなかったヒト線維芽細胞(aHDFs)またはMyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた後7日間培養した細胞(dMBs(directly converted myoblasts))を、マトリゲル(BD Bioscience, San Jose, CA)と体積比1:1 で混合し、NOG/SCIDマウスの側腹部に移植した(細胞数は3〜5x105個/マウス)。7日後に移植部位の組織を摘出し、実施例9と同様に、4% paraformaldehyde で8 h 固定後paraffinで包埋し、薄切した。抗デスミン抗体を用いた免疫組織化学を行い、蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて400倍の倍率で観察し、1視野あたりのデスミン陽性細胞のパーセンテージを算出した。
実施例1と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターを感染させた(M)。また別の細胞に、L-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(L)とMyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(M)との両方を感染させた(ML)。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した(-)。これらを実施例1と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染14日後に、実施例3と同様に、抗CKM抗体を用いた免疫蛍光染色と核染色を行った。蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて撮像し、総細胞数に対するCKM陽性細胞のパーセンテージを計測した。
結果を図11に示す。MyoD1遺伝子を単独導入した細胞は、約26%がCKM陽性であったが、MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とを共導入した細胞は、約90%がCKM陽性であった。したがって、MyoD1とL-Myc遺伝子を共導入するとヒト線維芽細胞の約90%が筋芽細胞にコンヴァートすることが分かった。値は平均値±標準偏差。N=3ウェル/群。*P<0.05 vs. 非導入細胞。
実施例1と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(M)、L-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(L)、c-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(C)を、記載の組み合わせで感染させた。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した(-)。これらを実施例1と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染14日後に、実施例3と同様に核染色を行った。蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて撮像した(図12A)。また、3個よりも多くの核を有する細胞のパーセンテージを計測した(図12B)。
実施例12と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた(ML)。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した(-)。一部の群ではERK5パスウェイ阻害剤、XMD8-92 を記載の濃度で添加した。これらを実施例12と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染14日後に、実施例3と同様に核染色を行った。蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて撮像したイメージを示す(図13A上段)。また、4個以上の核を有する細胞、2〜3個の核を有する細胞、1個の核を有する細胞のパーセンテージを算出した(図13A下段)。
実施例8、9と同様の実験後、移植部位の組織切片を、実施例10と同様の方法で、抗CKM抗体と抗αアクチン抗体をそれぞれ用いた免疫組織化学に供した。
実施例1と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた後、筋芽細胞分化用培地で10日間培養した(ML)。コントロールとして遺伝子導入しないヒト線維芽細胞も用いた(-)。褐色脂肪細胞マーカーであるUCP1遺伝子とCIDEA遺伝子、軟骨細胞マーカーであるSOX9遺伝子とアグリカン遺伝子、骨芽細胞マーカーであるRunx2遺伝子とオステオカルシン遺伝子について、それぞれのmRNA発現をreal time RT-PCRで計測した。
実施例1と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(M)、L-Mycを組み込んだレトロウイルス・ベクター(L)、及びc-Mycを組み込んだレトロウイルス・ベクター(C)を、図に記載のとおりにM単独、MC及びMLの組み合わせで感染させた。コントロールとしてレトロウイルス・ベクターを感染させない細胞も準備した(-)。これらを実施例1と同様に、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染後14日後に、200 nM のMitoTracker Red probe (Invitrogen) で37℃で15分間染色した。蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて撮像した。
ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた後、6日間培養した(ML)。コントロールとして遺伝子導入しないヒト線維芽細胞も用いた(-)。抗デスミン抗体または抗CKM抗体による免疫染色と、DAPIによる核染色を記載のように行った。
実施例1と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターを感染させた。(M)、またL-Myc遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクター(L)とMyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとの両方を感染させた(ML)。これらを筋芽細胞分化用培地で培養し、感染後14日目に各細胞からRNAを抽出した。コントロールとして、レトロウイルス・ベクターを感染させない細胞(-)とプライマリーのヒト骨格筋細胞(pSKMS)からもRNAを抽出した。これらのRNAを、GeneChip human Gene 1.0 ST (Affymetrix)を用いたDNAマイクロアレイ解析に供した。
実施例1と同様に、ヒト線維芽細胞に、MyoD1遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターとL-Mycを遺伝子を組み込んだレトロウイルス・ベクターの両方を感染させ(ML)、筋芽細胞分化用培地で培養した。感染後2日おきにrBC2LCN-FITC (Wako 180-02991) で染色し、また細胞核をHoechst33342で染色した。コントロールとして、レトロウイルス・ベクター感染前の細胞(一番左)も同様に染色した。陽性コントロールとして、ヒトiPS細胞(hiPS235G1)も同様に染色した。これらの細胞を、蛍光顕微鏡(Keyence BZ710)を用いて撮像した。
MyoD1遺伝子とL-Myc遺伝子とをそれぞれプラスミド・ベクターpCXに導入し、発現ベクターを構築した。ヒト線維芽細胞(HDFs)に、MyoD1プラスミドのみ、またはMyoD1プラスミドとL-Mycプラスミドの両方を、electroporationで導入し、筋芽細胞分化用培地中で14日間培養した。これらの細胞、およびコントロールとして遺伝子導入しなかった線維芽細胞(HDF)からRNAを抽出し、Myogenin遺伝子とCKM遺伝子のmRNAをreal time RT-PCRで定量した。結果を図19に示す。
Claims (8)
- 哺乳動物の体細胞に、MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を導入する工程を含む、骨格筋細胞を誘導する方法。
- 前記体細胞が線維芽細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記体細胞が、ヒトの体細胞である、請求項1に記載の方法。
- MyoDファミリー遺伝子がMyoD遺伝子であり、Mycファミリー遺伝子がL-myc遺伝子である、請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物の体細胞に由来し、外来性のMyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を有す骨格筋細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法により得られる、請求項5に記載の骨格筋細胞。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法で得られる細胞、又は、請求項5若しくは6に記載の骨格筋細胞を含む、骨格筋の欠損、不足若しくは機能低下に基づく疾患を治療するための、移植材料。
- MyoDファミリー遺伝子もしくはその発現産物及びMycファミリー遺伝子もしくはその発現産物を含む、骨格筋細胞を誘導するための組成物。
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