TW202117005A - 新穎誘導性多能幹細胞(ipscs)及其應用 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種iPSC細胞及其應用，該iPSC細胞衍生自包含Cbx家族基因之體細胞。本發明亦提供用於產生具有變為誘導性多能幹(iPS)細胞(iPS細胞)之潛能而無致癌特性之該等體細胞的方法，以及用於自細胞群體產生iPS細胞之方法，該細胞群體隨後可用於移植以及用於細胞分化及相互作用。

Description

新穎誘導性多能幹細胞(IPSCS)及其應用

本發明係關於誘導性多能幹細胞(iPSC)之領域。詳言之，本發明提供一種iPSC細胞及其應用，該iPSC細胞衍生自包含Cbx家族基因之體細胞。

誘導性多能幹細胞(iPSC)最早係Shinya Yamanaka及其同事於2006年在日本之京都大學(Kyoto University)產生。iPSC為多能細胞，能夠分化為全部三個胚層，且因此在用於再生醫學之臨床應用中擁有較高的潛能。

Yamanaka等人先前已鑑別出24種因子為胚胎幹細胞中之關鍵因子，該等因子在胚胎幹細胞而非體細胞中表現(Cell. 2006年8月25日; 126(4):663-76)。在24種因子當中，Yamanaka及同事進一步證明，四種基因Oct4、Sox2、c-Myc及KLF4為藉由用反轉錄病毒引入24種因子中之23種將小鼠纖維母細胞重新編程為多能細胞所必需。其後，四種基因Oct4、Sox2、c-Myc及KLF4已被視為習知重新編程因子。隨後針對其促成胚胎發育(亦即嵌合小鼠中之嵌合)之能力來測試細胞之多能性(Cell. 2006年8月25日; 126(4):663-76)。

四種習知基因中之兩種c-Myc及KLF4為致癌的，進而導致20%嵌合小鼠之癌症發展。然而，在無c-Myc及KLF4之情況下，iPSC產生之效率極低。因此，需要研發能夠將體細胞重新編程為iPS之新穎基因/其因子。

本發明出人意料地發現，使用Cbx家族基因序列作為重新編程因子而非cMyc及Klf4可產生維持多能性及分化能力同時無致癌特性之iPSC。

在一個態樣中，本發明提供一種iPSC群體，其中經基因修飾之體細胞包含Cbx家族基因序列及除cMyc家族基因序列及Klf4家族基因序列以外的一或多個重新編程因子序列。

在一些實施例中，該體細胞來自外胚層(例如角質細胞)、中胚層(例如纖維母細胞)、內胚層(例如胰臟細胞)或神經脊譜系(例如黑色素細胞)。在一些實施例中，該體細胞為纖維母細胞、角質細胞、胰臟β細胞、神經元、寡樹突神經膠質細胞、星形膠質細胞、肝細胞、肝幹細胞、心肌細胞、骨胳肌細胞、平滑肌細胞、造血細胞、蝕骨細胞、成骨細胞、外被細胞、血管內皮細胞或神經鞘細胞。在一個實施例中，該體細胞為纖維母細胞。

在一個實施例中，該Cbx家族基因序列為Cbx7。

在一些實施例中，該重新編程因子序列包括(但不限於) Oct家族基因序列、Sox家族基因序列、c-myc家族基因序列、Klf家族基因序列、Nanog家族基因序列、Lin28家族基因序列及Glis1家族基因序列。在其他實施例中，該重新編程因子序列為Oct家族基因序列、Sox家族基因序列或包含Oct家族基因序列及Sox家族基因序列之序列。較佳地，該Oct家族基因序列為Oct3或Oct4，且該Sox家族基因序列為Sox2。在另一實施例中，該重新編程因子序列包含Oct4及Sox2之序列。

在一些實施例中，該體細胞來自哺乳動物細胞。在一個實施例中，該哺乳動物細胞為人類細胞。

在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明之iPSC群體、自如技術方案1之iPSC分化的多能幹細胞或由該等多能幹細胞產生之經分化細胞。

在另一態樣中，本發明提供一種產生誘導性多能幹細胞(iPSC)之方法，其包含(a)用表現Cbx家族基因序列之載體及表現一或多個重新編程因子多肽而非cMyc家族多肽及Klf4家族多肽之一或多個載體來引入體細胞；及(b)在對(a)之所得體細胞重新編程以產生該等iPSC之條件下培養(a)之所得體細胞。

在一些實施例中，該方法進一步包含在飼養細胞之存在下在幹細胞培育培養基中擴增該等iPSC的步驟。

在一些實施例中，該載體為慢病毒載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體(AAV)、痘病毒載體、疱疹病毒載體、麻疹病毒載體、泡沫病毒載體、α病毒載體、水泡性口炎病毒載體、轉染載體或轉位子載體。

本發明之另一態樣為一種醫藥組合物，其包含本發明之iPSC群體、自本發明之iPSC分化之多能幹細胞或由該等多能幹細胞產生之經分化細胞。

在一個態樣中，本發明提供一種產生誘導性多能幹細胞(iPSC)之方法，其包含(a)用表現Cbx7及一或多個重新編程因子序列而非cMyc家族基因序列及Klf4家族基因序列之載體來引入體細胞的步驟，及(b)在飼養細胞之存在下在幹細胞培育培養基中培養及擴增該iPSC之步驟。在一個實施例中，該重新編程因子序列包含Oct4序列、Sox2序列或Oct4及Sox2之序列。在另一實施例中，該重新編程因子序列包含Oct4序列及Sox2序列。

本發明之另一態樣提供一種治療及/或緩解有需要之患有疾病或病症之個體的方法，該方法包含向該個體投與有效量的自該等經重新編程之iPSC分化之細胞。在一個實施例中，自該等經重新編程之iPSC分化之該等細胞為多能幹細胞。

在一個實施例中，自該等經重新編程之iPSC分化之該等細胞為神經元幹細胞。在一個實施例中，該疾病或病症為神經退化性病狀。在一個實施例中，該神經退化性病狀為帕金森氏病(Parkinson's disease)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、脊髓性肌萎縮(SMA)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)或阿茲海默病(Alzheimer disease)。在一較佳實施例中，該疾病或病症為帕金森氏病。在一個實施例中，該等經分化神經元幹細胞以範圍介於約1 × 10⁵ 個細胞/劑量/天至約1 × 10⁸ 個細胞/劑量/天之劑量投與。在一個實施例中，該等經分化神經元幹細胞以約1 × 10⁶ 個細胞/劑量/天之劑量投與。

提供一種誘導性多能幹(iPS)細胞(iPSC)群體，其衍生自具有增強的變為無致癌特性之潛能的經基因修飾之體細胞。亦提供用於產生具有變為誘導性多能幹(iPS)細胞(iPS細胞)之潛能而無致癌特性之體細胞的方法，及用於自細胞群體產生iPS細胞之方法，該細胞群體可隨後用於移植以及用於細胞分化及相互作用。在閱讀如下文更充分描述之主題方法及組合物的細節時，本發明之此等及其他目標、優點及特徵將對熟習此項技術者變得顯而易見。定義

除非以其他方式定義，否則本文中所使用之所有科學或技術術語具有與一般熟習本發明所屬技術者所理解相同的含義。一般熟習此項技術者可理解及使用類似或等效於本文中所描述之彼等的任何方法及材料來實踐本發明。

除非另有指示，否則本說明書及申請專利範圍中所使用之表述成分數量、反應條件等之所有數字應理解為在所有情況下皆經術語「約」修飾。因此，除非有相反指示，否則本發明之說明書及申請專利範圍中所闡述的數值參數大約可視設法藉由本發明所獲得之所要特性而變化。

術語「一(a/an)」意謂本發明中所描述之目標中之一者或多於一者。術語「及/或」意謂替代方案中之一者或兩者。術語「細胞(a cell)」或「細胞(the cell)」可包括複數個細胞。

如本文中所使用之術語「體細胞」係指促成生殖系(亦稱為性細胞)外部之多細胞有機體的充分成型體且區別於構成早期胚胎之未分化幹細胞的細胞。

如本文中所使用，術語「重新編程(reprogram)」、「經重新編程」及「重新編程(reprogramming)」係指經分化體細胞基於來自轉基因載體之重新編程因子的異位表現而去分化為多能幹細胞之過程，且一般更廣泛地係指經技術上誘導之細胞譜系轉化。

如本文中所使用，術語「重新編程因子」係指用以促進細胞重新編程之轉基因，通常(而非必定)係指轉錄因子或微RNA。

術語「活體內」一般意謂活有機體內部。術語「活體外」一般意謂活有機體外部，諸如在形成於有機體外部之人工環境中進行的實驗。

術語「三胚層」係指在脊椎動物之原腸胚形成期間的三個層：外胚層、中胚層及內胚層，其衍生為所有體細胞。

本文中之術語細胞之「多能性」及「幹性」係指細胞(通常幹細胞)產生有機體中之所有類型之細胞的能力。在發育生物學之態樣中，多能細胞在胚胎發育期間可產生全部三種生殖譜系。

術語「胚胎幹細胞」係指發現於胚胎囊胚之內部細胞塊(ICM)中之天然存在的多能細胞。術語「誘導性多能幹細胞」(「iPSC」或「iPS」可互換使用)意謂在重新編程之人工過程中獲得多能性的自成年或胚胎有機體分離之經分化細胞。「iPSCs」為複數個iPSC。與胚胎幹細胞相比，iPSC不為自然界中發現之多能細胞。

術語細胞之「分化(differentiate/ differentiation)」係指細胞在細胞分裂期間損失其多能性之過程，其中子細胞中之至少一者失去多能性。當細胞經歷分化時，其處於向三種生殖譜系中之一者的譜系特異性分化之過程中。

術語「引入」或「轉導」係指經由編碼所關注基因以改變其表現水平之載體將基因遞送至細胞中之過程。轉基因為天然地或藉由任何基因工程改造技術轉移至有機體或細胞中之基因或遺傳物質，諸如DNA或RNA。遞送轉基因之方法可經由病毒載體或非病毒載體來進行。在本發明之一個實施例中，病毒載體用以將重新編程因子引入至細胞中。病毒載體可為整合或非整合病毒。本發明中所使用之整合病毒可為慢病毒或反轉錄病毒。整合病毒允許將其編碼基因與經病毒粒子感染之經轉導細胞整合。本發明中所使用之非整合病毒可為腺病毒或仙台(Sendai)病毒。本發明中亦可使用非病毒方法，諸如藉由將DNA或RNA材料轉染至細胞中。DNA材料可呈PiggyBac、微型環載體或游離型質體之形式。RNA材料可呈mRNA或miRNA之形式。

術語「細胞培養」或「培養」係指在受控環境下通常在有機體外部(活體外)或其自然環境外部使細胞生長之過程。在細胞培養中之術語「解離(dissociate/dissociation)」意謂使用力或酶來破壞向單細胞之細胞聚集。術語「胰蛋白酶消化」係指使用胰蛋白酶來消化胞外分子之過程，細胞利用該等胞外分子來附著至其生長環境。在胰蛋白酶消化之後，細胞自其生長表面剝離，且可用生長培養基收集。術語「集結粒」係指由允許細胞與其生長培養基分離之離心過程造成的細胞聚集。術語「再懸浮(resuspend/resuspension)」係指添加新液體以製造細胞懸浮液之過程。

除非指定，否則本發明中之培養基為習知實驗室用途之培養基。用於飼養細胞及MEF細胞之培養基為具有10%胎牛血清、1%青黴素及鏈黴素及1%非必需胺基酸(NEAA)之DMEM。幹細胞培育培養基為含有1% L-麩醯胺酸、7.5ml Hyclone FBS、0.5ml NEAA、91μl β-巰基乙醇及5μl白血病抑制因子之DMEM。一般熟習此項技術者將能夠使用類似或等效於本文中所描述之培養基來為iPSC提供相同或類似生長效果。

術語「群落」係指由一個單細胞之生長造成的細胞培養物中之細胞的聚集物。術語細胞之「後代」係指子細胞及在母細胞之細胞分裂/增殖後衍生的細胞。術語後代可用以定義細胞之「譜系」，其中某些細胞之相同譜系可經由細胞分裂之歷程及細胞之後代來追蹤。

術語「產生之效率」係指自體細胞重新編程為iPS細胞之效率。存在用以自體細胞產生iPS細胞之許多方法，包括反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、質體轉染、轉位子….等。藉由各方法產生iPS細胞之效率不同(Cell Transplant. 2011;20(1):15-9.)。(請提供更多資訊：)

術語「胚狀體(embryoid body/embryoid bodies)」或「EB」係指細胞培養物中之多能幹細胞之三維聚集物。胚狀體內之胚胎幹細胞或誘導性多能幹細胞經歷沿三種生殖細胞譜系之分化及細胞特異性分化。

術語「飼養細胞」或「飼養者」係指與第二類型之細胞共培養以提供該第二類型之細胞可生長於其中之環境的一種類型之細胞，此係因為飼養細胞提供生長因子及營養物質以支援第二細胞類型。飼養細胞視情況來自與其所支援之細胞不同的物種。當藉由輻照或用諸如絲裂黴素之抗有絲分裂藥劑處理來與其他細胞共培養時，飼養細胞可典型地「失活」以防止其生長超過其所支援之細胞。飼養細胞可包括內皮細胞、基質細胞(例如上皮細胞或纖維母細胞)及白血病細胞。在不限制前述內容之情況下，一種特異性飼養細胞類型可為人類飼養者，諸如人類皮膚纖維母細胞。另一飼養細胞類型可為鼠胚胎纖維母細胞(MEF)。一般而言，多種飼養細胞可部分地用以維持多能性，引導朝向某一譜系分化且促進成熟為特殊細胞類型。

術語「神經幹細胞」係指能夠在發育或再生過程期間產生神經系統中之神經元及膠細胞的先驅細胞。

術語「退化性病症」及「退化性疾病」在本文中互換使用，係指退化性細胞變化、影響器官或組織以及導致惡化之連續過程的結果。術語「神經退化」在本文中係指因中樞神經細胞喪失或功能障礙所造成的退化性病症。在本發明之一些實施例中，神經退化可藉由引入藥劑來破壞個體或動物模型之中樞神經系統以進行人工方式地誘導。術語「動物模型」係指患有與人類中疾病相同或相似疾病的動物。在本發明之一些實施例中，動物模型之疾病係經人工方式誘導，且熟習此項技術者應理解，此模型可轉譯成特定人類疾病之進展。術語「治療(treatment/treating/treat)」一般係指獲得所要藥理學及/或生理學效果。就完全或部分預防疾病、病症或其症狀而言，該效果可為預防性的，且就部分或完全治癒疾病、病症及/或其所帶來之症狀而言，該效果可為治療性的。本文中所使用之「治療」包括對哺乳動物(較佳地，人類)中疾病的任何治療，且包括(1)遏制個體中疾病、病症或其症狀之發展，或(2)緩解或減輕個體中疾病、病症或其症狀。

術語「個體(individual/subject)」及「患者」在本文中互換使用，且係指需要對其診斷、治療(treatment)或治療(therapy)之任何哺乳動物個體。

術語「治療有效量」係指當向需要治療疾病或病症之患者或個體投與時，足以對該疾病或病症具有有益效果之細胞或其衍生後代的量。治療有效量將視疾病或病症之病狀及其嚴重程度而變化。其不限於本說明書中所陳述之範圍。確定給定細胞或其衍生後代之治療量在此項技術之一般技能內，且僅需要常規實驗。

本發明之術語「醫藥組合物」包括用以治療退化性病狀之有效量的活細胞。細胞組分可為培養細胞或經分離之細胞群體之混合物，諸如經分化組織細胞、先驅細胞及/或幹細胞。本發明之醫藥組合物呈液體形式或為細胞懸浮緩衝液，且可含有穩定液體懸浮液且有助於細胞生存力的醫藥學上可接受之賦形劑。本發明之 iPSC 及其產生

此項技術中已知，Oct4、Sox2、c-Myc及Klf4為產生iPSC所必需。然而，四種基因中之兩者(c-Myc及Klf4)為致癌的，且可能導致癌症。若不使用c-Myc及Klf4，則產生iPSC之效率極低。Cbx7在ESC分化期間下調，且Cbx7決不用以產生iPS細胞世代。本發明出人意料地發現，將Cbx家族基因序列而非c-Myc家族基因序列及Klf4家族基因序列引入至體細胞可將經分化細胞有效地重新編程為不具有致癌特性之iPSC。

因此，本發明提供一種iPSC群體，其中經基因修飾之體細胞包含Cbx家族基因序列及除cMyc家族基因序列及Klf4家族基因序列以外的一或多個重新編程因子序列。

體細胞為已充分分化之細胞，其將不會以天然地方是產生身體之全部三個胚層(亦即外胚層、中胚層及內胚層)的細胞。該等細胞可分化至其能夠產生特定譜系之細胞的點，例如成年非多能性多能幹細胞，例如間葉幹細胞、神經幹細胞、心臟幹細胞、肝幹細胞及其類似者。體細胞之實例包括來自外胚層譜系(例如角質細胞)、中胚層譜系(例如纖維母細胞)、內胚層譜系(例如胰臟細胞)或神經脊譜系(例如黑色素細胞)之細胞。某些實施例包括纖維母細胞、角質細胞、胰臟β細胞、神經元、寡樹突神經膠質細胞、星形膠質細胞、肝細胞、肝幹細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、造血細胞、蝕骨細胞、成骨細胞、外被細胞、血管內皮細胞、神經鞘細胞及其類似者。在一個非限制性實例中，體細胞可為纖維母細胞譜系之細胞。

使用Cbx家族基因序列及一或多個重新編程因子序列(除cMyc家族基因序列及Klf4家族基因序列以外)對體細胞重新編程。較佳地，Cbx家族基因序列為與Cbx7之序列具有至少70%一致性的核酸序列。更佳地，Cbx家族基因序列為Cbx7。

一或多個重新編程因子序列較佳地為Oct家族基因序列、Sox家族基因序列、Nanog家族基因序列、Lin28家族基因序列。在一較佳實施例中，一或多個重新編程因子序列包括Oct家族基因序列及Sox家族基因序列。

較佳地，Oct家族基因序列為與Oct 3/4之胺基酸序列具有至少70%一致性的核酸序列。較佳地，Sox家族基因序列為與Sox2之胺基酸序列具有至少70%一致性的核酸序列。較佳地，Nanog家族基因序列為與Nanog之胺基酸序列具有至少70%一致性的核酸序列。較佳地，Lin28家族基因序列為與Lin28之胺基酸序列具有至少70%一致性的核酸序列。

本發明之iPSC細胞藉由包含以下步驟之方法來產生：(a)用表現Cbx家族基因之載體及表現一或多個重新編程因子基因而非cMyc家族基因及Klf4家族基因之一或多個載體來引入體細胞；及(b)在對(a)之所得體細胞重新編程以產生iPSC之條件下培養(a)之所得體細胞。

可使用表現本文中所描述之重新編程因子的任何適當載體來將轉基因引入至體細胞中。合適的載體尤其包括質體載體及病毒載體。病毒載體可為複製勝任型或複製選擇性的(例如經工程改造以在特定宿主細胞中較佳或選擇性複製)，或可為基因失能的以便成為複製缺陷型或複製受損的。典型地，此類載體為可商購的(例如在Invitrogen、Stratagene、Amersham Biosciences、Promega等中)或可購自寄存機構，諸如American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md.)，或已成為眾多公開案之主題，該等公開案描述其序列、組織及生產之方法，從而允許技術人員將其應用。

合適的病毒載體之代表性實例由多種不同病毒(例如反轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、α病毒、水泡性口炎病毒、慢病毒等)產生。如上文所描述，術語「病毒載體」涵蓋載體DNA、基因組DNA以及由其產生之病毒粒子，且尤其感染性病毒粒子。在一較佳實施例中，反轉錄病毒載體或慢病毒載體。在本發明之一較佳實施例中，慢病毒用以將轉基因引入至經分化細胞中。

合適的質體載體之代表性實例包括(但不限於) pREP4、pCEP4 (Invitrogen)、pCI (Promega)、pVAX (Invitrogen)及pGWiz (Gene Therapy System Inc.)。

用於向主題細胞提供重新編程因子作為核酸之載體將典型地包含用於驅動重新編程因子核酸之表現(亦即轉錄活化)之合適啟動子。此可包括廣泛起作用的啟動子，例如CMV-b-肌蛋白啟動子或誘導性啟動子，諸如在特定細胞群體中有效或對諸如四環素之藥物的存在有反應之啟動子。

隨後，可藉由在飼養細胞之存在下在重新編程所得體細胞以產生iPSC之條件下培養及擴增所得體細胞而將如本文中所描述的含有Cbx家族基因序列及重新編程因子序列之經基因修飾之體細胞轉變為iPSC。本發明之 iPSC 的 組合物及應用

在與將不干擾其預期用途的諸如培養基之載劑或稀釋劑混合時，iPSC為實質上分離的。可替代地，本發明之iPSC可存在於生長基質中或經固定化於表面上。

由以上方法產生之iPSC可用於經由植入來復原或補充分化或分化接受者中之細胞。接受者中之誘導性細胞可分化為各種譜系之細胞類型。經分化細胞之實例包括來自外胚層(例如神經元及纖維母細胞)、中胚層(例如心肌細胞)或內胚層(例如胰臟細胞)譜系之任何經分化細胞。經分化細胞可為一或多個：胰臟β細胞、神經幹細胞、神經元(例如多巴胺激導性神經元)、寡樹突神經膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞先驅細胞、肝細胞、肝幹細胞、星形膠質細胞、肌細胞、造血細胞或心肌細胞。

衍生自誘導性細胞之經分化細胞可為終末分化細胞，或其可能夠產生特定譜系之細胞。舉例而言，誘導性細胞可分化為多種多能細胞類型，例如神經幹細胞、心臟幹細胞或肝幹細胞。幹細胞可隨後進一步分化為新穎細胞類型，例如神經幹細胞可分化為神經元；心臟幹細胞可分化為心肌細胞；且肝幹細胞可分化為肝細胞。

在本發明之一些實施例中，藉由檢查其生長為含有全部三種胚細胞之畸胎瘤的能力來活體內測試細胞之多能性。在另一實施例中，藉由某些標記物在活體外培養細胞中的表現來測試多能性。在又另一實施例中，藉由其對胚胎發育為活有機體之貢獻度來測試細胞之多能性。將多能幹細胞注射至胚胎囊胚之內部細胞塊(ICM)中，該胚胎囊胚隨後經植入至雌性有機體之子宮中且發育為胎兒。術語「嵌合」係指幹細胞及其後代對產生活有機體中之各種組織的全部三種胚層之貢獻度。

存在使誘導性細胞分化為更特殊的細胞類型之眾多方法。分化誘導性細胞之方法可類似於用以分化幹細胞，詳言之，ES細胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血幹細胞(HSC)的彼等方法。在一些情況下，分化在活體外發生；在一些情況下，分化在活體內發生。

在一個實施例中，神經幹細胞可藉由在頭蛋白或其他骨形態生成蛋白質拮抗劑之存在下將誘導性細胞培養為浮置聚集物來產生。在另一實例中，神經幹細胞可藉由在生長因子之存在下在懸浮液中培養誘導性細胞以形成聚集物來產生。

衍生自誘導性細胞之神經幹細胞可分化為神經元、寡樹突神經膠質細胞或星形膠質細胞。通常，用以產生神經幹細胞之條件亦可用以產生神經元、寡樹突神經膠質細胞或星形膠質細胞。

誘導性細胞或自誘導性細胞分化之細胞可用作療法以治療疾病(例如遺傳缺陷)。該療法可針對治療疾病之病因；或可替代地，該療法可用以治療疾病或病狀之影響。誘導性細胞可經轉移至或接近於個體中之受損部位；或可以允許細胞遷移或回歸至受損部位之方式將該等細胞引入至個體中。經轉移細胞可有利地替換損壞或受損細胞，且允許個體之總體病狀的改善。在一些情況下，經轉移細胞可刺激組織再生或修復。

經轉移細胞可為自誘導性細胞分化之細胞。經轉移細胞亦可為自誘導性細胞分化之多能幹細胞。在一些情況下，經轉移細胞可為尚未分化之誘導性細胞。

誘導性細胞可分化為細胞，且隨後經轉移至罹患廣泛範圍之疾病或病症的個體。罹患神經疾病或病症之個體可尤其得益於幹細胞療法。在一些方法中，誘導性細胞可分化為神經幹細胞或神經細胞，且隨後經移植至受損部位以治療神經病狀，例如阿茲海默症、帕金森氏病、多發性硬化症、腦梗塞、脊髓損傷或其他中樞神經系統病症。因此，本發明之另一態樣提供一種使用本發明之iPSC來治療神經退化性疾病的方法。在一些實施例中，神經退化性疾病包括(但不限於)帕金森氏病、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、脊髓性肌萎縮(SMA)、亨廷頓氏病或阿茲海默病。在一個實施例中，iPSC以範圍介於約1 × 10⁵ 個細胞/劑量/天至約1 × 10⁸ 個細胞/劑量/天之劑量投與。在一個實施例中，經分化神經元幹細胞以約1 × 10⁶ 個細胞/劑量/天之劑量投與。

在本發明之一個實施例中，iPSC分化為隨後經投與至有需要之個體中的神經幹細胞及/或含有神經元幹細胞之先驅細胞。一般熟習此項技術者將能夠使用類似或等效於本文中所描述之方法及材料自iPSC培養物衍生神經幹細胞及/或含有神經幹細胞之先驅細胞混合物。

在一較佳實施例中，將自iPSC分化之神經元幹細胞投與至需要治療或減輕帕金森氏病之個體中。一般熟習此項技術者將能夠富集或分離疾病治療所需要之神經元幹細胞，且使用類似或等效於本文中所描述之方法及材料以將細胞投與至需要所要治療效果之個體中。

對於多發性硬化症之治療，神經幹細胞可分化為隨後經轉移至罹患MS之個體中的寡樹突神經膠質細胞或寡樹突神經膠質細胞之先驅細胞。

除神經病症以外之疾病亦可藉由使用自誘導性細胞分化之細胞的幹細胞療法來治療，該等誘導性細胞例如誘導性多能或多能性幹細胞。諸如缺血性心肌症之退化性心臟疾病、傳導疾病及先天性缺陷可得益於幹細胞療法。

可經由以下途徑中之任一者將細胞引入至個體中：非經腸、靜脈內、動脈內、肌內、皮下、經皮、氣管內、腹膜內或向脊髓液中。

本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明之iPSC群體、自本發明之iPSC分化之多能幹細胞或由多能幹細胞產生之經分化細胞。

根據一些實施例，本發明之組合物可用包括(但不限於)溶劑之賦形劑、載劑或媒劑來調配。醫藥學上可接受之載劑必須具有充分高的純度且具有足夠低的毒性以使其適用於向所治療之哺乳動物投與。該醫藥學上可接受之載劑進一步應維持活性劑之穩定性及生物可用性。醫藥學上可接受之載劑可為液體或固體，且經選擇(考慮計劃投與方式)以在與活性劑及給定組合物之其他組分組合時提供所要體積、稠度等。用於本發明之組合物之合適的醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏稠石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及其類似者。此類載劑溶液亦可含有緩衝劑、稀釋劑及其他合適的添加劑。如本文中所使用，術語「緩衝劑」係指其化學組成中和酸或鹼而無pH之顯著變化的溶液或液體。本發明所設想之緩衝劑之實例包括(但不限於)杜爾貝科氏(Dulbecco's)磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、林格氏溶液(Ringer's solution)、含5%右旋糖之水(D5W)、生理(normal/physiologic)鹽水(0.9% NaCl)。根據一些實施例，輸注溶液與個體組織等張。根據一些實施例，輸注溶液對於個體組織為高張的。用於非經腸投與之本發明之組合物可包括在諸如醇之常見溶劑中的醫藥學上可接受之載劑，諸如無菌水溶液、非水溶液，或在液體油基中之溶液。

本發明之組合物可以無菌可注射水性或油性懸浮液之形式非經腸投與。如本文中所使用，術語「非經腸」或「非經腸地」係指藉助於注射(亦即藉由注射投與)引入至身體中，該注射包括(但不限於)輸注技術。根據一些實施例，非經腸投與包括(但不限於)血管內遞送(意指向血管中)、靜脈內遞送(意指向靜脈中)、動脈內遞送(意指向動脈中)、骨內遞送(意指向骨髓中)、肌內遞送(意指向肌肉中)、皮下遞送(意指在皮膚下)、心臟遞送(意指向心臟、心肌中)等。

遞送途徑可變化，且視退化性疾病之起源而定。在一較佳實施例中，用於治療中樞神經系統中之退化性病狀之遞送途徑為顱內注射。

在本發明之一個實施例中，藉由個體在諸如旋轉桿中跑步、在平衡木上行走或在開放空間中之認知運動的各種運動中維持其平衡的能力來檢測個體之認知及運動行為。實施例不限於類似或等效於本發明在本文中所描述之彼等。對測試個體之認知及運動行為的方法進行修改在此項技術之一般技能內，且僅需要常規實驗。

以下實例說明本發明。實例

實例 1 自鼠胚胎纖維母細胞產生誘導性多能幹細胞

製備病毒

單獨製備三種病毒載體：在一個實施例中，製備慢病毒載體pAS3-Oct4、pAS3-Sox3及PAS3-Cbx7，其中各基因之cDNA為可商購的(Thermos Scientific)，其中限制位點EcoRI允許選殖至pAS3載體中。反轉錄病毒或慢病毒藉由使用293T細胞株作為宿主細胞來製備。針對各反轉錄病毒或慢病毒收集且濃縮經轉染293T細胞之上清液，該上清液隨後用於製備誘導性多能幹細胞(iPSC) (圖1)。

製備鼠胚胎纖維母細胞

鼠胚胎纖維母細胞(MEF)用於製備iPSC。自懷孕C57BL6小鼠取出處於E13.5之胎兒，且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)使胎兒暴露於培養皿中。藉由自胎兒解剖出四肢、頭部、尾部及器官而獲取含有MEF之組織，且在用PBS洗滌三次之後在培養皿中絞碎該等組織。隨後將0.1mM胰蛋白酶/1mM EDTA溶液(GIBCO BRL)添加至培養皿中以用於胰蛋白酶消化。隨後將已絞碎組織轉移至錐形管中且在振盪器上搖盪20分鐘。隨後將組織培養基(具有10%胎牛血清、1%青黴素及鏈黴素及1%非必需胺基酸(NEAA)之DMEM)添加至該管中。隨後將上清液轉移至新錐形管中且在離心機中旋轉。將細胞集結粒再懸浮於組織培養基中且轉移至培養皿以用於培育(5% CO₂ 及37℃)。

飼養細胞用以養育纖維母細胞培養物，且為稍後發育之iPSC提供生長因子，從而預防幹細胞之底層分化。飼養細胞衍生自在37℃下用含有絲裂黴素C (購自Roche)之細胞培養基培育2.5小時的MEF。絲裂黴素C阻止MEF之增殖，其隨後經歷與鼠胚胎纖維母細胞之共培養。

iPSC 細胞培養

藉由在37℃培育箱(5% CO₂ )中將6孔盤培育30分鐘而用明膠塗佈該盤，其中各孔中具有1ml之0.2%明膠。將2ml之溫熱DMEM培養基轉移至各孔中以在37℃下以5%CO₂ 將新鮮解凍之飼養細胞培育隔夜。用幹細胞培育培養基(含有1% L-麩醯胺酸、7.5ml Hyclone FBS、0.5ml NEAA、91μlβ-巰基乙醇及5μl白血病抑制因子之42.5ml DMEM)替換DMEM培養基，且隨後將該等細胞培養1小時。隨後在37℃下以5% CO₂ 用飼養細胞培養誘導性多能幹細胞。在細胞培養後兩天更新培養基，且之後每日更新以確保對幹細胞生長之營養物質的適當供應。

將Cbx-7引入至MEF細胞(經分化細胞)導致iPSC群落產生。Cbx-7與Sox-2及Oct-4之組合導致iPSC產生增加，其中產生之效率大於或為約0.01%。

鹼性磷酸酶染色

鹼性磷酸酶染色係用以測試所得iPSC或ES細胞之幹性。在用幹細胞培育培養基培育48小時之後，用各種濃度之新鮮N-丁烯基苯酞緩衝液替換iPSC或ES細胞培養物。在某一培養時長之後，將細胞用PBS洗滌兩次，且在4℃下用1ml之80%乙醇固定2至24小時。隨後替換細胞且將其浸沒於蒸餾水中以洗掉乙醇。用蒸餾水施加額外洗滌及浸沒2至3分鐘。在移除蒸餾水之後，隨後替換細胞且在室溫下將其浸沒於100mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.2至8.5)中5分鐘。移除Tris緩衝液且用白細胞鹼性磷酸酶套組替換以用於染色20至30分鐘。在移除鹼性磷酸酶基質工作溶液之後，將細胞準備好針對鹼性磷酸酶之活性進行觀測及攝影，且用100mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.2至8.5)洗滌。鹼性磷酸酶之活性在幹細胞中較高，以基質染色展示為紅色，而在經分化幹細胞中較低，以淡紅色或無顏色活性展示(圖3)。

免疫螢光染色

諸如Nanog、Oct4及Sox2之某些標記物之表現可用以研究幹細胞培養物之幹性(圖3)。為測定此等標記物之表現，利用此等標記物之免疫螢光染色。在染色之前，iPSC或ES細胞經歷幹細胞培養基48小時。各種濃度之新鮮N-丁烯基苯酞緩衝劑用以培育細胞持續某一時長，且將細胞用PBS洗滌並在室溫下用4%多聚甲醛固定10分鐘。使用0.1% Tween-20/1X PBS洗滌細胞三次，每次浸沒10分鐘。隨後在室溫下藉由0.3% Triton-X 100/1× PBS滲透細胞30分鐘，且在室溫下用5% FBS/1× PBS使該等細胞經歷阻斷持續2小時。在室溫下在1:100稀釋下使用所關注標記物之初級抗體來染色隔夜。隨後將細胞浸沒且用0.1% Tween-20/1× PBS洗滌5分鐘。在室溫下在1:500稀釋下使用螢光結合二級抗體來染色1小時。隨後將細胞浸沒且用0.1% Tween-20/1× PBS洗滌10分鐘。使用含有DAPI之封固劑(用於DNA染色)來封固及密封細胞以在倒置顯微鏡下觀測。

用Cbx7引入MEF細胞(經分化細胞)意外導致iPSC群落形成。另外，用三種因子Oct-4、Sox-2及Cbx-7引入MEF細胞導致高效率之iPSC產生，其中經重新編程之iPSC群落表現幹細胞標記物AP、Oct4、Sox2、SSEA1及SSEA4 (圖3)。

畸胎瘤形成

畸胎瘤形成為用以活體內研究iPSC或ES細胞培養物之幹性的標準方法。為測試iPSC培養物之幹性，在SCID小鼠之背部皮下注射iPSC，且在6至8週之後形成畸胎瘤。將腫瘤/畸胎瘤細胞以手術方式移除且浸沒於4%多聚甲醛中。畸胎瘤細胞隨後經冷凍且經歷組織之剖切。隨後用蘇木精及曙紅對腫瘤切片染色，且觀測到三個生殖細胞層：外胚層、中胚層及內胚層之完全發育(圖4)。

Cbx7 、 Oct4 及 Sox2 之組合導致高效率之 iPSC 產生

引入Sox-2或Oct-4一般不會導致iPSC產生，而將單個Cbx-7基因引入至經分化細胞中導致低效率之iPSC產生(圖2)。一次引入兩種基因(諸如Sox2及Cbx7或Oct4及Cbx7)增加iPSC產生之發生率。iPSC產生之最佳效率發現於用三種基因(Oct4、Sox2及Cbx7)引入之經分化細胞中(圖2)，藉由該三種基因，iPSC產生之效率為約0.01%。

實例 2 iPSC 分化為神經元幹細胞

首先在無LIF之幹細胞培育培養基：含有1% L-麩醯胺酸、15% Hyclone FBS、1% NEAA、1mM β-巰基乙醇、100U/ml青黴素及100μg/ml鏈黴素之85% DMEM中培養iPSC。將液體懸浮液中之2 × 10⁶ 個細胞接種於各10cm² 培養皿中，且隔日用無LIF之新鮮幹細胞培育培養基替換細胞培養物。在接種細胞之後四天，將iPS衍生之胚狀體(EB)轉移至新培養皿，且使其接種24小時。隨後用ITN-FN培養基：含有2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、1% ITS-G培養基補充劑及5 μg/ml纖維結合蛋白之DMEM/F12供應細胞。在4天培育之後，隨後將細胞用PBS洗滌兩次，且用0.05%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶化(以使細胞自培養皿剝離)5分鐘。用無LIF之等體積的幹細胞培育培養基將經剝離細胞中和且轉移至15ml錐形管。使該等管靜置5分鐘以沈澱較大細胞塊(未分化之胚狀體)。將上清液轉移至新錐形管，且在800 rpm下離心5分鐘。使細胞集結粒再懸浮，且以1.5 × 10⁵ 個細胞/毫升在N-2培養基：具有2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、1% N-2培養基補充劑及20ng/ml bFGF之DMEM/F12中培養。隨後將細胞接種至經聚-L-鳥胺酸/纖維結合蛋白預處理之培養皿上。經聚-L-鳥胺酸/纖維結合蛋白預處理之培養皿藉由以下方法製備：在37℃下用15 μg/ml聚-L-鳥胺酸/PBS溶液培育培養皿24小時。移除聚-L-鳥胺酸/PBS溶液，且用PBS緩衝液將培養皿洗滌三次，且在37℃下用PBS培育24小時。自培養皿移除PBS，且用新鮮製備之PBS洗滌。在37℃下使用1 μg/ml纖維結合蛋白/PBS來處理培養皿6小時。在移除纖維結合蛋白溶液且用PBS洗滌培養皿之後，將培養皿準備好使用。

細胞培養物每日用20 ng/mL bFGF補給，且隔日用新鮮N-2培養基補給。每4至5天將細胞繼代至經聚-L-鳥胺酸/纖維結合蛋白預處理之新培養皿，且可使其繼代高達五倍。在分化之後，藉由免疫螢光染色針對iPS-NSC測定神經元幹細胞製造者巢蛋白及Tuj1之表現(圖5)。

實例 3 使用經 iPSC 分化之神經元幹細胞來治療帕金森氏病

MPTP 誘導性帕金森氏病模型

以7 mg/ml之濃度在溶液中製備MPTP之工作溶液。以20 mg/kg之劑量經由腹膜內注射一天4次且各劑量之間2小時來給與各小鼠MPTP。熟習此項技術者已知，以此劑量及程序，小鼠隨時間發展帕金森氏病。

移植神經元幹細胞

在右頂骨及額骨處鑽三個點(A、B及C)以用於細胞移植。點A定位於前囟門與λ之間的中點之右側0.1mm處；點B定位於冠狀縫之頂部處；點C定位於點A與點B之間的中點處。

出於標記目的，用1 μl/ml之Hoechst 33342對神經元幹細胞染色持續1小時。隨後，將神經元幹細胞離心且再懸浮於鹽水中。將再懸浮之細胞自點C至點A且隨後點B依序注射至小鼠顱中。對點A及點C之注射深度為3.5mm，且對點B為3 mm。在各點處以總計1 × 10⁶ 個細胞/鼠注射8 ml體積之細胞。

動物行為之分析

為評定動物自帕金森氏病症之恢復情況，使用三種工具來量測及分析動物行為：旋轉桿、運動機及平衡木。

旋轉桿量測動物平衡及鍛煉之能力。旋轉桿在內側處具有用於嚙齒動物攀爬之旋轉軸及用以分隔通道之壁。旋轉軸之大小為直徑3 cm且長度5 cm。分隔壁為直徑25 cm且長度1cm。先前已確立，初始嚙齒動物(未經任何治療)可在5rpm之速度下停留於旋轉軸處超過3分鐘。每7天執行測試，總計3次。

運動機為一種允許記錄動物之活動而不受外部之任何干擾的自動系統。

平衡木行走為一種用以測定嚙齒動物在高且窄的橋上之協調性的方法。平衡木之大小為寬度0.6 cm且長度120 cm。存在暗盒(13 cm³ )以用於嚙齒動物在一側休息。將嚙齒動物置放於暗盒中3分鐘，且隨後置放於與暗盒相距15 cm之平衡木上。一旦嚙齒動物可輕易步行回至暗盒，則將與暗盒之距離增加至80cm。一旦達至80cm之距離，則收集兩種類型之量測值：(1)嚙齒動物自80cm點返回步行至暗盒之時長，及(2)嚙齒動物四肢滑出平衡木之頻率。每7天收集量測值3次。

在MPTP誘導性帕金森氏症候群模型中，衍生自經重新編程之iPSC的經分化神經元幹細胞(iPS-NSC)顯著改善平衡木行走及旋轉桿運動中之動物行為(*p ＜0.05. **p ＜0.01)。平衡木行走行為分析用以測試小鼠之平衡能力。相較於在用鹽水移植之小鼠之平衡能力，用iPS衍生之神經元幹細胞(iPS-NSC)移植顯著改善平衡能力(包括滑倒(圖6A)及通過時間(圖6B))。另外，旋轉桿分析用以測試小鼠之協調能力。相較於用鹽水移植之小鼠組中的協調能力，經iPS-NSC治療之小鼠改善協調能力(圖6C)。

iPSC 分化之神經元幹細胞能夠治療帕金森氏病症

吾等亦藉由免疫螢光染色而獲得黑質中之TH陽性細胞(多巴胺神經元)數目。結果顯示，在與鹽水治療組比較時，iPS-NSC治療組中之TH陽性細胞之數目增加。此資料指示，iPSC衍生之神經元幹細胞(iPS-NSC)治療之治療挽救黑質中之多巴胺神經元的數目(圖7)。另外，在iPS-NSC治療組中發現顯著減少之Iba1陽性細胞(作為炎症之指示的免疫細胞)之數目，從而指示在MPTP誘導性帕金森氏病模型中之免疫反應減小(圖8)。

在 MPTP 誘導性帕金森氏病中 ， 血清多巴胺之含量藉由 iPS-NSC 治療增加

用ELISA套組來分析多巴胺含量-在行為評定之前一天藉由後眼眶出血自小鼠收集500 μl之血液。將收集之血液在室溫下靜置30分鐘，且在4℃下以1,000 rpm之速度旋轉10分鐘。收集血清/上清液，且在-20℃下儲存以用於後續分析。用購自Uson的多巴胺之酶免疫吸附劑分析套組來執行ELISA實驗。

在MPTP誘導性帕金森氏病模型中量測多巴胺之含量。發現iPS-NSC將血清中之多巴胺含量挽救至與未受損對照組相當的含量，從而指示iPS-NSC細胞修復神經元之能力(圖9)。

免疫螢光染色及分析

在行為評定之後，殺死小鼠並解剖以收集大腦組織。用4%多聚甲醛固定大腦組織且用OCT冷凍。將腦切片置於載片上且用TBST/PBST洗滌5分鐘以自大腦組織之邊緣清除剩餘OCT。藉由將載片浸沒於抗原獲取溶液(237.5ml之ddH₂ O中之12.5 ml Trilogy)中且在灶具中將其汽蒸3分鐘來執行抗原獲取。隨後用TBST/PBST將載片洗滌10分鐘。藉由在室溫下用0.3% Triton-X100將其培育30分鐘且用TBST/PBST洗滌10分鐘來滲透組織細胞。隨後在室溫下經1小時用含有5% FBS之阻斷緩衝液來阻斷載片。將所關注標記物之初級抗體添加至阻斷緩衝液中且在4℃下培育隔夜。用TBST/PBST將載片洗滌10分鐘，且在室溫下用二級抗體培育1小時。在用TBST/PBST洗滌10分鐘之後，在室溫下用PI對載片染色15分鐘。隨後再次用TBST/PBST將載片洗滌10分鐘，且用封固劑密封。

MPTP 誘導性帕金森氏病模型之 TUNEL 檢定

為量測自小鼠收集之大腦組織內之細胞死亡，對載片上之大腦切片執行TUNEL檢定。使用可商購套組「DeadEnd^TM Fluorometric TUNEL System」執行實驗。一般熟習此項技術者將能夠理解且藉由類似於或等效於本文中所描述之反應劑來執行此實驗。

用PBS將載片洗滌5分鐘，且隨後轉移至0.2% Triton-100/PBS進行5分鐘培育以滲透細胞膜。隨後，將載片洗滌兩次，每次5分鐘。隨後在室溫下在具有100 μl之平衡緩衝液的暗染色盒中將載片培育10分鐘，且將50 μl之TdT Mix添加至各樣本中。在37℃下，在暗處將載片進一步培育1小時。隨後，藉由用2× SSC緩衝液將載片培育15分鐘來阻止反應。藉由用PBS將其各自培育5分鐘而將載片洗滌三次，用DAPI染色，且隨後用封固劑密封。

因此，在與MPTP受損之對照組比較時，發現經iPS-NSC治療之小鼠在黑質中呈現顯著低水準的細胞死亡。細胞死亡之水準與未受損之溶劑對照組相當，指示iPS-NSC細胞在神經元再生中之挽救能力(圖10)。

圖1(A)及圖1(B)：用293T細胞產生慢病毒以用於轉導鼠胚胎纖維母細胞(MEF) (A)。在轉導Cbx7、Oct4及Sox2之慢病毒攜載轉基因之後，可發現在MEF細胞中表現之蛋白質(B)。

圖2(A)及圖2(B)：使用轉基因之不同組合之iPSC產生的效率。iPSC產生之效率藉由經轉導之分化細胞產生iPSC群落之能力來量測(A)。條形圖展示在此特定實驗中產生之群落數目(SC：Sox2及Cbx7；OC：Oct4及Cbx7；SOC：Sox2、Oct4及Cbx7) (B)。

圖3：iPSC細胞之免疫組織化學染色表明，經重新編程之iPSC表現幹細胞標記物，諸如鹼性磷酸酶(AP)、Oct4、Sox2、SSEA1及SSEA4。

圖4：經iPSC注射之裸鼠中的畸胎瘤形成。全部三個胚層內胚層、中胚層及外胚層存在於iPSC衍生之畸胎瘤中證實iPSC活體內之多能性。

圖5：經重新編程之iPSC能夠產生神經元幹細胞，指示iPSC活體外之分化能力。

圖6(A)至圖6(C)：在MPTP誘導性帕金森氏症候群模型中，衍生自經重新編程之iPSC的經分化神經元幹細胞(iPS-NSC)在平衡木行走及旋轉桿運動中顯著改善動物行為(*p ＜0.05. **p ＜0.01)。(A及B)平衡木行走行為分析用以測試小鼠之平衡能力。相較於用鹽水移植之小鼠的平衡能力，使用iPS衍生之神經元幹細胞(iPS-NSC)的移植顯著改善平衡能力(包括滑倒(A)及通過時間(B))。(C)藉由旋轉桿分析，相較於用鹽水移植之小鼠的協調能力，經iPS-NSC治療之小鼠改善協調能力。

圖7(A)至圖7(D)：小鼠中之酪胺酸羥化酶(TH)表現細胞之數目：(A)溶劑對照；(B)對誘導性帕金森病之MPTP治療；(C)對誘導性帕金森病之MPTP治療且用iPS-NSC移植。(D)對於TH為陽性之細胞經計數，且在條形圖中呈現為與MPTP組之百分比。誤差杠表示平均+SD。在iPS-NSC治療之後，黑質中之多巴胺分泌神經元之數目增加。發現多巴胺分泌神經元(TH陽性細胞)在MPTP受損組中減少，其中iPS-NSC之治療挽救TH陽性細胞之數目。

圖8(A)至圖8(D)：小鼠中之Iba1表現細胞之數目：(A)溶劑對照；(B)對誘導性帕金森病之MPTP治療；(C)對誘導性帕金森病之MPTP治療且用iPS-NSC移植。(D)對於Iba1為陽性之細胞經計數，且在條形圖中呈現為與MPTP組之百分比。誤差杠表示平均+SD。在iPS-NSC治療之後，紋狀體中之免疫反應減小。發現Iba1陽性細胞在MPTP受損組中增加，其中iPS-NSC之治療顯著減少Iba1陽性細胞，從而指示免疫反應減小。(***p ＜0.001)

圖9：在MPTP誘導之帕金森氏病模型中，血清多巴胺之含量隨iPS-NSC治療而增加(***p ＜0.001)。

圖10(A)至圖10(D)：藉由TUNEL檢定之小鼠中之凋亡細胞的數目：(A)溶劑對照；(B)對誘導性帕金森病之MPTP治療；(C)對誘導性帕金森病之MPTP治療且用iPS-NSC移植。(D)對於TUNEL檢定為陽性之細胞經計數，且在條形圖中呈現為與MPTP組之百分比。誤差杠表示平均+SD。在iPS-NSC治療之後，黑質中之神經元細胞死亡減少。當相較於MPTP受損對照組時，iPS-NSC治療顯著減少細胞死亡(**p ＜0.01)。

Claims (20)

1. 一種iPSC群體，其衍生自經基因修飾之體細胞，其中該等經基因修飾之體細胞包含Cbx家族基因序列及除cMyc家族基因序列及Klf4家族基因序列以外的一或多個重新編程因子序列。
2. 如請求項1之iPSC群體，其中該體細胞為人類細胞。
3. 如請求項1之iPSC群體，其中該體細胞為纖維母細胞、角質細胞、胰臟β細胞、神經元、寡樹突神經膠質細胞、星形膠質細胞、肝細胞、肝幹細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、造血細胞、蝕骨細胞、成骨細胞、外被細胞、血管內皮細胞或神經鞘細胞。
4. 如請求項1之iPSC群體，其中該體細胞為纖維母細胞。
5. 如請求項1之iPSC群體，其中該Cbx家族基因序列為Cbx7。
6. 如請求項1之iPSC群體，其中該重新編程因子序列為Oct家族基因序列、Sox家族基因序列、Nanog家族基因序列、Lin28家族基因序列及Glis1家族基因序列或其組合。
7. 如請求項1之iPSC群體，其中該重新編程因子序列包含Oct家族基因序列及Sox家族基因序列。
8. 如請求項7之iPSC群體，其中該Oct家族基因序列為Oct3或Oct4，且該Sox家族基因序列為Sox2。
9. 如請求項1之iPSC群體，其中該重新編程因子序列包含Oct4及Sox2。
10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1之iPSC群體、自如請求項1之iPSC分化的多能幹細胞或由該等多能幹細胞產生之經分化細胞。
11. 一種產生誘導性多能幹細胞(iPSC)之方法，其包含：(a)用表現Cbx家族基因序列之載體及表現一或多種重新編程因子多肽而非cMyc家族多肽及Klf4家族多肽之一或多個載體來引入體細胞；及(b)在將(a)之所得體細胞重新編程以產生該等iPSC之條件下培養(a)之所得體細胞。
12. 如請求項11之方法，其進一步包含在飼養細胞之存在下，在幹細胞培育培養基中擴增該等iPSC之步驟。
13. 如請求項10之方法，其中該載體為慢病毒載體、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體(AAV)、痘病毒載體、疱疹病毒載體、麻疹病毒載體、泡沫病毒載體、α病毒載體、水泡性口炎病毒載體、轉染載體或轉位子載體。
14. 如請求項10之方法，其中該載體為慢病毒載體。
15. 一種治療及/或緩解有需要之患有疾病或病症之個體的方法，該方法包含向該個體投與有效量的自如請求項1之經重新編程之iPSC分化的細胞。
16. 如請求項15之方法，其中自該等經重新編程之iPSC分化之該等細胞為神經元幹細胞。
17. 如請求項15之方法，其中該疾病或病症為神經退化性病狀。
18. 如請求項17之方法，其中該神經退化性病狀為帕金森氏病(Parkinson's disease)、多發性硬化症(MS)、肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、脊髓性肌萎縮(SMA)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)或阿茲海默病(Alzheimer disease)。
19. 如請求項15之方法，其中該等經分化之神經元幹細胞係經投與範圍介於約1 × 10⁵ 個細胞/劑量/天至約1 × 10⁸ 個細胞/劑量/天之劑量。
20. 如請求項19之方法，其中該等經分化之神經元幹細胞係投與約1 × 10⁶ 個細胞/劑量/天之劑量。

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