KR20180085698A - BMP2 및 TGFβ3 발현 미니서클벡터를 이용하여 분화 유도된 연골세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 성장 인자를 암호화하는 미니서클벡터를 형질도입하여 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 분화된 연골세포 펠렛(chondrogenic pellet) 및 이의 용도에 관한 것이다. 상기 연골세포 펠렛은 연골세포의 마커 유전자를 유의적으로 발현하면서, 재조합 성장 인자를 첨가한 배지에서 분화 유도된 연골세포에 비해 연골세포의 마커 유전자를 보다 높은 수준으로 발현할 수 있다. 상기 연골세포 펠렛을 생체 내의 연골 손상 부위에 이식하였을 때, 분화된 연골세포에 의해 연골의 재생이 효과적으로 나타날 수 있으며, 이는 재조합 성장 인자를 첨가하여 분화 유도한 연골세포를 이식하는 경우보다 효과적인 연골 재생능을 나타낼 수 있어, 연골 재생을 위한 조직 공학 치료 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

BMP2 및 TGFβ3 발현 미니서클벡터를 이용하여 분화 유도된 연골세포 {Chondrogenicpellet differentiation using BMP2 and TGFβ3 expression minicircle vectors}

본 발명은 성장 인자를 암호화하는 미니서클벡터를 형질도입하여 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 분화된 연골세포 펠렛(Chondrogenic pellet) 및 이의 용도에 관한 것이다.

연골(cartilage)은 연골세포와 연골기질로 구성된 뼈 조직이며, 대개 관절의 일부를 이루는 조직을 가리킨다. 연골은 탄력성이 높고 마찰 계수는 매우 낮아, 골단의 마찰을 방지하는 완충 역할을 하여, 마찰이 거의 없는 상태에서 관절이 움직일 수 있도록 도움을 주는 역할을 한다.이 외에도, 호흡기의 기관이나 귓바퀴와 같이 탄력을 요하거나, 늑연골, 치골결합 연골과 같이 압력에 대한 저항력을 요하는 부위의 골조를 구성하는 역할을 한다.

특히, 관절 연골은 연골 기질과 연골 기질 사이에 분포하도록 특수하게 분화된 세포인 연골세포로 구성된다. 연골세포는 관절 연골을 만들고 유지하는 역할을 한다. 연골 모세포에서 세포 분열이 일어나나 일단 성장이 멈추면 연골세포는 정상적인 환경에서 더 이상 분열하지 않는다.

따라서, 연골은 한번 손상되면 재생되기 어렵다. 연골의 재생을 위해 연골세포의 분화를 유도하는 등 연골의 재생능을 증가시키기 위한 목적으로 다양한 재생 의학 연구가 진행되고 있다. 이를 위해 가장 많이 사용되는 기술은 세포를 이용하는 세포 치료 기술이다. 그러나, 세포주의 종류에 따라 증식 효율이 상이하여 제한을 가질 수 있다는 단점이 있다. 이에 따라 최근에는 환자로부터 자가적으로 분리한, 지방세포 유래의 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포(MSC)와 같은 성체 줄기세포로부터 in vitro에서 연골세포로의 분화를 유도하여 세포 치료방법에 사용하는 것으로 알려져 있다.

그러나 이러한 세포 치료 방법에서도 초기 연골세포 및 성체 줄기세포는 생체 외에서 배양하였을 때 연골세포의 특징을 빠르게 잃기 때문에 체내 이식한 이후에도 지속적인 사용에 한계가 있다는 제약을 가진다. 또한, 성체 줄기세포로부터 연골세포로 분화하는 분화능은 성체 줄기세포의 분리원이 가지는 병리학적 특징에 의해 특징이 변할 수 있어, 실제 재생 의학에 적용하기에 많은 변수를 가질 수 있다는 점에서 부작용이 우려된다.

이에 따라, 인간 유도 만능줄기세포(hiPSCs)를 조직 재생의학의 세포 치료제로서 사용하고자 하는 연구들이 시도되고 있다. hiPSC는 다양한 계통으로 분화할 수 있는 분화능을 가져 조직 재생의학에서 조직에 제한 없이 사용될 수 있다는 특징이 있다(비특허문헌 001). 때문에 줄기세포로부터 분화 유도할 때의 분화능이 낮은 조직이라고 할지라도, hiPSC를 사용하였을 때 비교적 높은 재생 효과를 기대할 수 있다.

hiPSC로부터 연골세포로 분화를 유도하기 위해 사용되는 성장인자 중, 최근 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 또는 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF) 등이 사용된다(비특허문헌 002). BMP는 그 자체만으로도 주로 뼈나 연골의 발생에 주요 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있으며 연골세포의 생존 및 증식에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 중 BMP2의 결핍으로 인해 연골 내골의 발달이 저해될 수 있다는 보고가 있다(비특허문헌 003).

TGFβ 단백질은 세포의 증식, 분화 및 사멸과 같은 과정에 관여하는 것을 통해 다양한 조직에서 구조 골조를 조절하는 인자로서 알려져 있다. TGFβ 단백질은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3와 같은 3가지의 동형 단백질로 나누어 지는데, 이들 간의 작용을 통해 연골 형성을 유도할 수 있는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 004, 비특허문헌 005). 이 중에서도 특히 TGFβ1 또는 TGFβ3를 이용하여 연골 형성을 유도할 수 있으며, 이 중 TGFβ3이 보다 더 높은 분화능을 가지는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 006). 줄기 세포를 목표하는 조직 세포로 분화되도록 유도하는 과정에서, 재조합 인간 성장 인자를 사용하는 것은 중요한 요소로 작용할 수 있다. 그러나 이는 분화 도중에 성장 인자 분자를 자주 첨가해야 하며, 이 때 고가의 비용이 발생한다는 단점이 있다.

이러한 단점을 극복하기 위해, 줄기 세포의 분화 과정에서 성장인자를 배지에 첨가하지 않은 상태에서 유전자 전달을 통해 성장인자의 과발현을 유도하여 목표하는 조직 세포로 분화를 유도하는 시도가 이루어지고 있다. 연골세포로의 분화와 관련하여, 활막(synovial)-유래의 MSC에서 TGFβ1를 바이러스 벡터로 유전자 전달하였을 때, 세포의 증식이 증가하며 연골 분화 속도가 빨라질 수 있음이 보고된 바 있다 (비특허문헌 007). 또한, 마우스 중간엽 줄기세포(MSC) 및 제대혈 유래의 MSC에서 SOX9를 과발현 하였을 때 연골세포로의 분화가 증진되며(비특허문헌 008, 비특허문헌 009), 제 2형 콜라겐의 발현 역시 증가할 수 있다(비특허문헌 010).

이러한 세포 치료를 위한 유전자 전달 기술과 관련하여, 비-바이러스성 유전자 전달 기술이 안전한 방법으로서 주목 받고 있다. 상업적인 DNA 벡터 플라스미드는 세균 유래의 서열을 포함하고 있어, 세균성 단백질에 대한 면역 반응이 유도될 수 있기 때문이다. 이를 위해 미니서클벡터를 사용할 수 있는데, 미니서클벡터는 항생제 내성 유전자, 세균성 구조 단백질을 암호화하는 유전자 및 전사 단위 유전자를 제거하여 상대적으로 작은 크기를 가지는 벡터를 말한다. 미니서클벡터는 크기가 작고 면역 반응을 피할 수 있다는 장점과 함께, in vitro및 in vivo에서 외부 유전자를 높은 수준으로 발현할 수 있다는 특징을 가져, 전-임상 유전자 치료 연구에서 사용 이점을 가질 수 있는 것으로 주목 받고 있다(비특허문헌 011). 이를 통해, 안전하고 효율적인 유전자 전달이 가능하게 되어 유전자 변형 줄기세포를 치료에 적용하였을 때 치료 효과가 증진될 수 있다(비특허문헌 012).

이에, 본 발명자들은 줄기 세포로부터 연골세포 펠렛의 분화를 유도하여 이를 연골 재생 치료에 효율적으로 적용하는 방법에 대하여 개발하고자 연구한 결과, 성장인자인 BMP2 및 TGFβ3을 발현하는 미니서클벡터를 제조하여, 이를 줄기세포에 형질도입해 연골세포로 분화 유도하였을 때, 효과적으로 연골세포 펠렛으로 분화될 수 있음을 확인하였다. 분화된 연골세포는 연골세포의 마커 유전자를 유의적으로 발현할 수 있으며, 생체 내에 이식하였을 때 연골 결손 부위에서 유의적인 연골 재생 효과를 나타낼 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

Kim Y, Rim YA, Yi H, Park N, Park SH, Ju JH: The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int 2016, 2016:1329459. Nam Y, Rim YA, Jung SM, Ju JH: Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther 2017, 8:16. Shu B, Zhang M, Xie R, Wang M, Jin H, Hou W, Tang D, Harris SE, Mishina Y, O'Keefe RJ, et al: BMP2, but not BMP4, is crucial for chondrocyte proliferation and maturation during endochondral bone development. J Cell Sci 2011, 124:3428-3440. Tuli R, Tuli S, Nandi S, Huang X, Manner PA, Hozack WJ, Danielson KG, Hall DJ, Tuan RS: Transforming growth factor-beta-mediated chondrogenesis of human mesenchymal progenitor cells involves N-cadherin and mitogen-activated protein kinase and Wnt signaling cross-talk. J Biol Chem 2003, 278:41227-41236. Mueller MB, Tuan RS: Functional characterization of hypertrophy in chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Arthritis Rheum 2008, 58:1377-1388. Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM: Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res 2001, 268:189-200. Kim YI, Ryu JS, Yeo JE, Choi YJ, Kim YS, Ko K, Koh YG: Overexpression of TGF-beta1 enhances chondrogenic differentiation and proliferation of human synovium-derived stem cells. Biochem Biophys Res Commun 2014, 450:1593-1599. Tsuchiya H, Kitoh H, Sugiura F, Ishiguro N: Chondrogenesis enhanced by overexpression of sox9 gene in mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun 2003, 301:338-343. Wang ZH, Li XL, He XJ, Wu BJ, Xu M, Chang HM, Zhang XH, Xing Z, Jing XH, Kong DM, et al: Delivery of the Sox9 gene promotes chondrogenic differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in an in vitro model. Braz J Med Biol Res 2014, 47:279-286. Kim JH, Do HJ, Yang HM, Oh JH, Choi SJ, Kim DK, Cha KY, Chung HM: Overexpression of SOX9 in mouse embryonic stem cells directs the immediate chondrogenic commitment. Exp Mol Med 2005, 37:261-268. Gill DR, Pringle IA, Hyde SC: Progress and prospects: the design and production of plasmid vectors. Gene Ther 2009, 16:165-171. Bandara N, Gurusinghe S, Chen H, Chen S, Wang LX, Lim SY, Strappe P: Minicircle DNA-mediated endothelial nitric oxide synthase gene transfer enhances angiogenic responses of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther 2016, 7:48.

상술한 바와 같이, 연골은 재생이 어려워 효과적인 재생 치료 방법이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 분화 유도된 연골세포를 유효성분으로 포함하는 연골 결손 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 i) 내지 v) 단계로 이루어지는 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법을 제공한다:

i) 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 배양하여 배아체(embryoid body, EB)를 형성(generation)하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 형성한 EB를 젤라틴 코팅 배지에서 배양하여 돌기성장 세포(outgrowth cell, OG)를 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를, BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터 또는 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터 중 어느 하나 또는 둘 다로, 형질도입(transduction)하는 단계;

iv) 상기 단계 iii)에서 형질도입한 OG 세포를 연골세포로 분화 유도하는 단계; 및

v) 상기 단계 iv)에서 분화 유도한 연골세포를 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 i) 내지 vi) 단계로 이루어지는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법을 제공한다:

i) iPSC를 배양하여 EB를 형성하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 형성한 EB를 젤라틴 코팅 배지에서 배양하여 OG를 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를 BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터로 형질도입하는 단계;

iv) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터로 형질도입하는 단계;

v) 상기 단계 iii)에서 형질도입한 OG 세포 및 상기 단계 iv)에서 형질도입한 OG 세포를 혼합 배양하여 연골세포로 분화 유도하는 단계; 및

vi) 상기 단계 v)에서 분화 유도한 연골세포를 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골세포 펠렛을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터는 (a) CMV 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 BMP2 유전자, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고; (b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및 (c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에서, 상기 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터는 (a) CMV 프로모터, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 TGFβ3 유전자, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고; (b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및 (c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터일 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 바람직한 일실시예에서, 상기 연골세포로 분화 유도하는 단계는 재조합 성장인자를 포함하지 않는 배지에서 3 내지 30 일 동안 배양하여 수행할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 또는 외상에 의한 관절손상일 수 있다.

따라서, 본 발명은 성장인자인 BMP2 및 TGFβ3를 암호화하는 미니서클벡터를 형질도입하여 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 분화된 연골세포 펠렛(chondrogenic pellet)을 제공한다.

상기 연골세포 펠렛은 연골세포의 마커 유전자를 유의적으로 발현하면서, 재조합 성장 인자를 첨가한 배지에서 분화 유도된 연골세포에 비해 연골세포의 마커 유전자를 보다 높은 수준으로 발현할 수 있다.

상기 연골세포 펠렛을 생체 내의 연골 손상 부위에 이식하였을 때, 분화된 연골세포에 의해 연골의 재생이 효과적으로 나타날 수 있으며, 이는 재조합 성장 인자를 첨가하여 분화 유도한 연골세포를 이식하는 경우보다 효과적인 연골 재생능을 나타낼 수 있어, 연골 재생을 위한 조직 공학 치료 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 인간 성장인자를 암호화하는 미니서클벡터의 제조 및 확인을 나타낸다:
도 1a는 BMP2 및 TGFβ3의 발현을 위한 미니서클벡터의 제조 과정을 나타내는 모식도이고; 및
도 1b는 BMP2 암호화 유전자를 포함하는 미니서클벡터(mcBMP2) 및 TGFβ3 암호화 유전자를 포함하는 미니서클벡터(mcTGFβ3)의 크기를 확인한 결과이다.
도 2는 HEK293T 세포에 형질도입(transduction)한 mcBMP2 또는 mcTGFβ3의 발현 효율의 확인을 나타낸다:
도 2a는 HEK293T 세포에서 mcBMP2 또는 mcTGFβ3의 형질도입에 따른 RFP 발현 정도를 확인한 형광현미경 사진이고;
도 2b는 mcBMP2 또는 mcTGFβ3이 형질도입된 세포의 비율을 확인한 결과이며;
도 2c는 mcBMP2 또는 mcTGFβ3을 형질도입한 HEK293T 세포에서 BMP2의 상대적 발현 수준을 비교한 결과이고; 및
도 2d는 mcBMP2 또는 mcTGFβ3을 형질도입한 HEK293T 세포에서 TGFβ3의 상대적 발현 수준을 비교한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 iPSC로부터 연골세포 펠렛의 분화 유도를 낸다:
도 3a은 iPSC로부터 연골세포 펠렛으로 분화 유도하는 과정의 모식도이고;
도 3b 내지 도 3e는 분화 유도 과정에서의 iPSC 콜로니(도 3b), 배아체(도 3c), EB를 젤라틴 용기에 부착 배양한 OG 세포(도 3d) 및 형질도입 전의 OG 세포(도 3e)의 형태를 나타내며; 및
도 3f 내지 도 3h는 미니서클벡터가 형질도입된 OG 세포에서의 RFP 발현을 확인하기 위한 형광현미경 사진이다.
도 4는 본 발명의 미니서클벡터로 형질도입된 OG 세포 내 중간엽 줄기세포 관련 인자의 확인을 나타낸다:
도 4a는 미니서클벡터로 형질도입된 OG 세포의 비율을 나타내고;
도 4b 내지 도 4f는 미니서클벡터로 형질도입된 OG 세포 내 중간엽 줄기세포 마커 유전자의 발현 수준을 확인한 결과이며; 및
도 4g 내지 도 4i는 미니서클벡터로 형질도입된 OG 세포를 알리자닌 레드 염색(도 4g), 오일 레드 O 염색(도 4h) 및 알시안 블루 염색(도 4i)한 결과이다.
도 5는 미니서클벡터를 형질도입하여 분화 유도된 연골세포 펠렛의 특징을 확인한 결과이다:
도 5a는 mcBMP2 또는 mcTGFβ3를 형질도입한 후 5일 뒤의 세포 형태이며; 및
도 5b 내지 도 5e는 mcBMP2 또는 mcTGFβ3를 형질도입한 뒤 분화 유도 개시 5일 뒤(도 5b), 10일 뒤(도 5c), 20일 뒤(도 5d) 및 30일 뒤(도 5e)의 RFP 발현 수준을 확인한 결과이다. GFP 결과는 3차원적으로 배양되는 펠렛에서 자발적으로 발현되는 형광 강도를 확인하기 위해 확인하였다.
도 6은 본 발명의 미니서클벡터를 형질도입하여 분화된 연골세포 펠렛에서의 연골세포 마커 유전자의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 미니서클벡터를 형질도입하여 분화된 연골세포 펠렛의 특징을 확인한 결과이다:
도 7a 내지 도 7c는 연골세포 펠렛을 알시안 블루 염색(도 7a), 사프라닌 O 염색(도 7b) 및 톨루이딘 블루 염색(도 7c)한 결과이고; 및
도 7d 및 도 7e는 연골세포 펠렛에서 발현된 콜라겐의 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 8은 미니서클벡터 형질도입으로 분화 유도된 연골세포 펠렛의 생체 내 연골 재생능 확인한 결과를 나타낸다:
도 8a는 생체 내 연골 재생능을 확인하기 위해 연골 결손 모델 마우스에 연골세포 펠렛을 이식하는 과정을 나타내는 모식도이고;
도 8b 내지 도 8d는 미니서클벡터 형질도입으로 분화 유도된 연골세포 펠렛을 이식하고 4주 뒤 알시안 블루(도 8b), 톨루이딘 블루(도 8c) 및 사프라닌 O(도 8d) 염색으로 결손 부위를 확인한 결과이며; 및
도 8e는 미니서클벡터 형질도입된 연골세포 이식에 따른 연골 재생 정도를 ICRS 점수로 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 연골은 재생이 어려워 효과적인 재생 치료 방법이 요구되고 있다. 이를 위해 줄기 세포로부터 연골세포를 분화 유도하여 세포 치료제로서 연골 재생 효과를 나타내고자 하는 방법이 사용되고 있으나, 연골세포로 분화 유도하기 위해 재조합 성장인자를 사용하였을 때 분화 효율에 한계가 있어, 이를 극복하기 위한 연구가 필요하다.

따라서, 본 발명은 하기 i) 내지 v) 단계로 이루어지는 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법을 제공한다:

i) 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 배양하여 배아체(embryoid body, EB)를 형성(generation)하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 형성한 EB를 젤라틴 코팅 배지에서 배양하여 돌기성장 세포(outgrowth cell, OG)를 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를, BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터 또는 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터 중 어느 하나 또는 둘 다로, 형질도입(transduction)하는 단계;

iv) 상기 단계 iii)에서 형질도입한 OG 세포를 연골세포로 분화 유도하는 단계; 및

v) 상기 단계 iv)에서 분화 유도한 연골세포를 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 하기 i) 내지 vi) 단계로 이루어지는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법을 제공한다:

i) iPSC를 배양하여 EB를 형성하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 형성한 EB를 젤라틴 코팅 배지에서 배양하여 OG를 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를 BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터로 형질도입하는 단계;

iv) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터로 형질도입하는 단계;

v) 상기 단계 iii)에서 형질도입한 OG 세포 및 상기 단계 iv)에서 형질도입한 OG 세포를 혼합 배양하여 연골세포로 분화 유도하는 단계; 및

vi) 상기 단계 v)에서 분화 유도한 연골세포를 수득하는 단계.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골세포 펠렛을 제공한다.

본 발명의 연골세포의 제조방법에 있어서, 상기 단계 i)의 iPSC는 환자 유래의 세포로부터 유도된 것일 수 있고, 시판되는 것을 사용하여도 무방하다. 그러나, 본 발명의 연골세포를 연골 결손 부위에 이식함에 있어서 생체적합성을 증진시키고자 하는 과점에서, 상기 iPSC는 환자 유래의 세포로부터 유도된 것이 보다 바람직하다.

본 발명의 연골세포의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 ii)에서 수득하는 OG 세포는 분리하여 단일 세포 단위로 수득하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 단일 세포 단위로 수득하기 위해서는 세포 스트레이너 등으로 배아체를 분리할 수 있고, 본 발명의 제조 방법에서 수득할 수 있는 단일 세포의 OG는 중간엽 줄기세포와 유사한 형태의 섬유상을 나타내는 것이 바람직하다.

본 발명의 연골세포의 제조 방법에 있어서, 미니서클벡터로 형질도입된 OG 세포는 연골 분화 배지에서 3 내지 30일 동안 배양하여 연골세포 펠렛으로 분화 유도하는 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 분화 유도는 5 내지 20일 동안 배양하여 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 분화 유도에 있어서, 연골 분화 배지에 재조합 성장인자를 추가로 포함하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 인간 성장인자를 암호화하는 미니서클 벡터를 제조하기 위해 도 1a의 모식도와 같은 과정으로 BMP2 또는 TGFβ3를 발현하는 미니서클벡터(mcBMP2 또는 mcTGFβ3)를 제조하였다(도 1).

또한, 본 발명자들은 제조한 mcBMP2 및 mcTGFβ3이 세포 내에서 유의적으로 성장 인자를 발현할 수 있는지 확인한 결과, mcBMP2 또는 mcTGFβ3로 형질도입한 HEK293T 세포에서 유의적인 성장인자 발현이 나타나는 것을 확인하였다(도 2).

이에, 본 발명자들은 iPSC로부터 EB 및 OG 세포를 거쳐 연골세포로 분화를 유도하였다(도 3a). iPSC를 배양하여 EB를 형성하고, 이를 젤라틴 코팅 용기에서 배양하여 OG 세포를 수득하였다(도 3b 내지 도 3d). 수득한 OG 세포에 mcBMP2 또는 mcTGFβ3를 형질도입하고 연골세포로 분화 유도하였다(도 3f 내지 도 3h). mcBMP2 또는 mcTGFβ3로 형질도입된 OG 세포는 중간엽 줄기세포의 마커 유전자를 유의적으로 발현하였으며(도 4a 내지 도 4f), 분화 가능성을 확인하였을 때 연골세포 계통으로 분화 가능함을 확인하였다(도 4g 내지 도 4i).

다음으로, 본 발명자들은 mcBMP2 또는 mcTGFβ3로 형질도입된 OG 세포를 연골세포로 분화 유도하였다(도 5). 분화 유도 후 수득한 연골세포 펠렛에서는 연골세포 마커 유전자를 유의적으로 발현하였으며, 이는 재조합 성장인자를 배지에 첨가하여 분화 유도한 대조군에 비해 높은 수준으로 마커 유전자를 발현할 수 있음을 확인하였다(도 6). 분화 유도된 연골세포 펠렛은 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)을 축적할 수 있으며, 제 1형 콜라겐 및 제 2형 콜라겐을 모두 생성할 수 있음을 확인하였다(도 7).

마지막으로, 본 발명자들은 분화된 연골세포 펠렛이 생체 내 연골 결손 부위에서 유의적인 재생능을 나타내는지 확인하기 위해 연골 결손 모델 마우스의 관절에 분화된 연골세포 펠렛을 이식하고 사육하였다(도 8a). 그 결과, 본 발명의 연골세포 펠렛을 이식한 부위에서 유의적으로 연골세포가 재생되어 연골 재생 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 8).

따라서, 본 발명에서 제공하는, 성장인자 BMP2 및 TGFβ3를 암호화하는 미니서클벡터를 형질도입하여 유도만능줄기세포(iPSC)로부터 분화된 연골세포 펠렛은 연골세포의 마커 유전자를 유의적으로 발현하면서, 재조합 성장 인자를 첨가한 배지에서 분화 유도된 연골세포에 비해 연골세포의 마커 유전자를 보다 높은 수준으로 발현할 수 있다.

상기 연골세포 펠렛을 생체 내의 연골 손상 부위에 이식하였을 때, 분화된 연골세포에 의해 연골의 재생이 효과적으로 나타날 수 있으며, 이는 재조합 성장 인자를 첨가하여 분화 유도한 연골세포를 이식하는 경우보다 효과적인 연골 재생능을 나타낼 수 있어, 연골 재생을 위한 조직 공학 치료 방법에 유용하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 연골의 결손 또는 손상에 의해 유발될 수 있는 연골 부위의 질병으로서 당업계에 공지된 질병이라면 제한 없이 해당될 수 있다.

본 발명의 조성물의 치료상으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

인간 성장인자를 암호화하는 미니서클벡터 제조

<1-1> BMP2 또는 TGFβ3를 발현하는 미니서클벡터 제조

본 발명에서 BMP2 및 TGFβ3의 발현을 유도하기 위해, 도 1a와 같은 과정으로 미니서클벡터를 제조하였다.

구체적으로, 인간 BMP2 및 TGFβ3 유전자는 코돈을 최적화하여 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로서 cDNA 서열을 합성하여 사용하였다. 합성한 cDNA 서열을 빈 벡터(mock vector)인 모체 플라스미드(CMV-MCS-EF1-RFP-SV40-PolyA; 제조사: System Biosciences, Mountain View, CA, USA)에 삽입하였다. 삽입시, BMP2 및/또는 TGFβ3 서열은 CMV 프로모터 하위에 존재하는 다클로닝 부위(multiple cloning site) 내 BamHI 및 XbaI 사이의 서열에 삽입하여 성장인자 유전자를 포함하는 모벡터를 제조하였다. BMP2 또는 TGFβ3를 포함하는 각각의 모벡터(ppBMP2, pp TGFβ3)를 각각 ZYCY10P3S2T E.coli 세포에 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 단일 콜로니 단위로 분리하여 이를 500 ㎍/㎖ 카나마이신이 포함된 LB 배지 2 ㎖에 접종하여 2 시간 동안 30에서 초기배양하였다. 그런 다음, 1 L 배양 플라스크에 200 ㎖ terrific broth (TB)를 가하고, 초기 배양한 배지 100 ㎕를 접종하여 30에서 200 rpm으로 진탕 배양하면서 15 시간 동안 배양하였다. 배양 후 모벡터 플라스미드를 미니서클 벡터로 전환하기 위해, 4% 1N NaOH 및 20% L-아라비노즈 200 ㎕를 포함하는 LB 배지 200 ㎖를 배양 플라스크에 첨가하였다. 배지가 첨가된 플라스크는 다시 30에서 200 rpm으로 5 시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후, 세포를 수득하여 NucleoBond Xtra 플라스미드 정제 키트(Macherey-Nagel, Duren, Germany)를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 XbaI 및 BamHI으로 이중 절단하여 제조된 미니서클의 크기 및 삽입된 BMP2 또는 TGFβ3 유전자를 확인하였다. BMP2 및 TGFβ3가 삽입된 각각의 벡터는 mcBMP2 및 mcTGFβ3로 명명하였다. 음성 대조군을 제조하기 위해서, BMP2 및 TGFβ3가 삽입되지 않은 모체 플라스미드(ppMock)를 이용하여 동일 방법으로 미니서클 벡터(mcMock)를 제조하였다.

그 결과, 도 1b에서 나타난 바와 같이 mcBMP2의 크기는 약 7.3 kb로서, 제한효소로 이중 절단하였을 때 약 1.1 kb의 BMP2 유전자와 약 5 kb의 미니서클의 2 개 밴드로 나타나는 것을 확인하였다. 이와 함께, mcTGFβ3의 크기는 약 7.5 kb로서, 제한효소로 이중 절단하였을 때 약 1.3 kb의 TGFβ3 유전자와 약 5 kb의 미니서클의 2 개 밴드로 나타나는 것을 확인하였다.

<1-2> mcBMP2 및 mcTGFβ3의 형질도입(transduction) 효율 확인

mcBMP2 및 mcTGFβ3가 세포 내로 형질도입 되었을 때 유의적으로 발현 활성을 나타낼 수 있는지 확인하고자, mcBMP2 및 mcTGFβ3 내에 함께 존재하는 RFP의 발현 정도를 측정하였다.

구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 mcBMP2 또는 mcTGFβ3를 각각 리포펙타민(lipofectamine)을 Opti-MEM 배지(Thermo Fisher Scientific) 내에서 20 분 동안 혼합하였다. 그런 다음, 혼합된 DNA-리포펙타민 혼합물을 HEK293T 세포 배양 배지에 첨가하여 37의 5% CO₂ 배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 위상차 현미경으로 세포의 형태(morphology)를 확인한 다음, 형광 현미경을 사용하여 HEK293T 세포 내 RFP 발현 수준을 관찰하였다. 또한, 세포를 배양한 배지를 대상으로 브래드포드 분석(bradford assay)으로 단백질 발현 수준을 확인하여 mcBMP2 또는 mcTGFβ3로 형질전환된 HEK293T 세포에서 발현되는 단백질 수준을 확인하였다. 정량적 분석을 위해, 재조합 BMP2 단백질(rhBMP2) 또는 재조합 TGFβ3 단백질 용액의 흡광도 값을 1.0 기준으로 하여 흡광도 값을 상대적으로 비교하였다.

그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 mcBMP2 및 mcTGFβ3로 형질도입된 HEK293T 세포에 비해, mcMock으로 형질도입된 세포에서 가장 높은 수준의 RFP 발현 수준을 나타내어 mcMock의 형질도입 효율이 가장 높은 것으로 확인하였다(도 2a 및 도 2b). 또한, 세포 배양 배지 내 발현 분비된 단백질 수준을 확인하였을 때, mcBMP2로 형질전환된 HEK293T 세포의 상층액의 흡광도는 유의적으로 높은 수준을 나타내어, 약 0.1 ㎎/㎖의 발현 수준을 나타내는 것으로 확인하였다(도 2c). 이와 비교하였을 때, mcTGFβ3의 발현은 상대적으로 낮은 수준을 나타내는 것으로 확인하였으나, mcMock의 배양 상층액과 비교하였을 때 mcTGFβ3으로 형질도입됨에 따라 유의적인 수준의 단백질 발현 수준을 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다(도 2d).

mcBMP2 및 mcTGFβ3를 이용한 인간 iPSC 유래의 연골세포 분화의 유도

인간 유래의 iPSC(hiPSC)로부터 연골세포로 분화하는 방법은, 도 3a에 나타난 모식도의 과정을 따라 수행하였다. 모든 실험은 동일 실험군에 대하여 총 3 회 반복 실험되었다.

i) iPSC 준비 단계: 제대혈단핵구 세포(cord blood mononuclear cell, PBMC)로부터 iPSC를 수득하는 방법은 종래의 역분화 유도 방법(비특허문헌 001)을 따라 리프로그래밍(reprogramming) 방법으로 수행하였다. 수득한 iPSC는 비트로넥틴(vitronectin)이 코팅된 용기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 배양하였으며, 배양 배지는 E8 배지(STEMCELL Technologies)를 사용하여 매일 1회 주기로 교체하면서 배양하였다. 준비한 iPSC의 형태는 도 3b와 같다.

ii) iPSC로부터 배아체(EB)를 형성(generation)하는 단계: 준비한 iPSC는 용기 바닥 면으로부터 탈리(detach)하여 2×10⁶ 세포로 계수하여 새로운 플레이트에 접종하였다. 배양 배지는 TeSR-E8 배지 및 Aggrewell 배지(STEMCELL Technologies)를 1:1로 혼합하여 사용하였다. 혼합 배지에 접종한 iPSC 세포는 37의 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지를 제거하고 신선한 E8 배지로 교체하여 3 일간 배양한 다음, 다시 배지를 E7 배지로 교체하여 추가로 3 일간 배양하여 배아체(EB)를 수득하였다(도 3c).

iii) EB에서 배아 돌출세포(outgrowth cell, OG세포)로 유도(induction)하는 단계: 그런 다음, EB는 젤라틴이 코팅된 용기로 옮겼다. 이를 위해 배양 용기는 0.1% 젤라틴으로 30 분 동안 용기 바닥 면을 코팅하고, 완전히 말린 것을 사용하였다. 수득한 EB를 수득하여 OG 유도 배지에 현탁하였다. OG 유도 배지는 20% 우태아혈청(FBS, Thermo Fisher Scientific) 및 10% 페니실린/스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific)을 포함하는 DMEM(Thermo Fisher Scientific) 배지를 사용하였다. EB는 젤라틴-코팅 용기에 50 내지 70 EB/㎠의 밀도로 접종하였으며, 37의 5% CO₂ 배양기에서 3 일 동안 배양하여 가지처럼 돌출된 세포(배아 돌출 세포, outgrowth cell, OG 세포)로 배양 유도하였다. 유도된 OG의 세포 형태는 도 3d와 같다.

iv) OG 세포를 미니서클벡터로 형질도입하는 단계: 그런 다음, OG 세포를 탈리하고 남아있는 EB 무더기(EB clump)는 40 ㎛ 세포 스트레이너(BD Technologies, Franklin Lakes, NJ, USA)로 제거하여 단일 세포 단위의 OG 세포를 수득하였다(도 3e). OG 세포는 중간엽 줄기세포와 유사한 형태의 섬유상 형태를 나타낸다. 수득한 OG 세포는 다시 새로운 젤라틴 코팅 용기에 1 내지 5×10⁴ 세포/㎠ 밀도로 접종하고 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 미니서클벡터로 형질도입하였다. 형질도입하기 전날, 배양 배지는 혈청 및 항생제를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환하여 하룻밤 동안 배양한 다음 리포펙타민 2000 시약(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 mcMock, mcBMP2 또는 mcTGFβ3으로 형질도입하였다. 미니서클벡터를 형질도입한 세포는 형광 현미경을 이용하여 세포 내 RFP의 발현 수준을 확인하는 것을 통해, 형질도입 여부를 확인하였다(도 3f 내지 도 3h). mcMock으로 형질도입한 OG 세포에서는 높은 수준의 RFP 발현 수준을 나타내며, HEK293T 세포에서의 RFP 발현 양상과 유사하게, mcBMP2 또는 mcTGFβ3로 형질도입한 OG 세포에서 RFP 발현 수준이 mcMock에 비해 낮은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다.

v) 미니서클벡터로 형질도입된 OG 세포를 연골세포 펠렛으로 분화 유도하는 단계: 하루밤 동안 배양하여 형질도입된 OG 세포는 펠렛당 3×10⁵ 세포가 되도록 15 ㎖ 코니칼 튜브에 준비하여 연골 분화 배지에서 배양하였다. 연골 분화 배지(CDM)는 20% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement), 1×비필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 1% 소듐피루베이트(sodium pyruvate), 1% ITS+프리믹스, 10^-7 M 덱사메타손, 50 mM아스코르브산 및 40 ㎍/㎖ L-프롤린을 포함하는 DMEM 배지의 조성을 사용하였다. 상기 CDM에는 BMP2 및 TGFβ3과 같은 재조합 성장 인자는 첨가하지 않았다. OG 세포를 CDM 배지에 현탁한 후, 750×g에서 5 분 동안 원심분리하여 침전시킨 다음, 30 일 동안 배양하여 연골세포 펠렛으로 분화시켰다. 배지는 3일 간격으로 교체하였다. 최종적으로 배양 종료한 후, 분화된 연골세포 펠렛을 수득하였다. 수득한 연골세포 펠렛은 사용 전까지 -80에서 냉동보관하였다.

미니서클벡터를 이용해 분화 유도된 세포의 특징 분석

<3-1> iPSC로부터 유도된 OG 세포의 특징 분석

상기 iii) EB에서 OG세포로 유도(induction)하는 단계로 배양한 OG 세포의 특징을 확인하기 위해, 중간엽 줄기세포(MSC) 마커의 발현 수준을 확인하였다.

상기 <실시예 2>의 iii) 단계로 유도한 OG 세포를 수득하여 트리졸(Trizol, Thermo Fisher Scientific 사)에 현탁하여 세포를 파쇄하고, mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 주형으로 하여, RevertAid^TM First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 다시 주형으로 하여 MSC 마커 유전자인 CD44, CD73, CD90, CD105 및 CD45에 대한 PCR을 수행하여 각각의 유전자의 발현 수준을 확인하였다. 동일한 유전자에 대하여 3 회 반복하여 정량 분석한 다음, 동일 세포 내 GAPDH 발현 수준을 기준으로 하여 각각의 유전자 발현 수준 값을 보정하였다. OG 세포와 함께, iPSC를 대상으로 동일 유전자 발현 수준을 확인하였다.

먼저, OG 세포 내로 미니서클벡터를 형질도입하였을 때의 효율을 확인하였을 때, OG 세포 내로 형질도입된 미니서클벡터의 효율은 HEK293T 세포와 유사한 경향으로 나타나는 것을 확인하였다(도 4a). 또한, MSC 마커 유전자의 발현을 확인한 결과, OG 세포에서 CD44, CD73 및 CD105의 발현 수준이 유의적으로 나타나, MSC에 비해는 다소 낮은 발현 수준을 나타내지만 hiPSC 세포와 비교하였을 때에는 유의적으로 높은 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 4b, 도 4c 및 도 4e). 이에 비해, CD90은 OG 세포에서 MSC와 다소 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 4d). 또한, 중간엽 줄기세포에서 음성적으로 발현되는 마커로서 알려진 CD45의 경우, MSC 및 OG 세포 모두에서 낮은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 4f).

또한, MSC의 분화 가능성을 함께 확인하고자 하였다. MSC는 지방세포, 연골세포 및 조골세포의 3 가지 계통으로 분화할 수 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 iPSC로부터 유도된 OG 세포의 계통 분화능을 확인하기 위해, 알리자린 레드(Alizarin red) 염색, 오일 레드 O 염색(oil red O) 및 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행하였다.

그 결과, 도 4g 내지 도 4i에서 나타난 바와 같이 OG 세포는 연골세포 계통으로 분화 가능하며(도 4g), 지방 세포 계통으로도 분화 가능할 뿐 아니라(도 4h), 연골세포 펠렛으로도 분화 가능한 다분화능을 나타내는 것으로 확인하였다(도 4i).

<3-2> mcBMP2 및 mcTGFβ3를 이용해 분화 유도된 세포 내 성장인자 단백질 발현 효율 확인

상기 <실시예 2>의 v) 단계에서 분화 유도한 연골세포 펠렛 내에서 미니서클벡터의 발현 효율을 확인하기 위해, 분화 유도 과정의 세포 내에서 RFP 및 GFP의 발현을 확인하였다. mcBMP2를 형질도입시킨 OG(mcBMP2-OG) 및 mcTGFβ3를 형질도입시킨 OG(mcTGFβ3-OG) 뿐 아니라, mcBMP2-OG 및 mcTGFβ3-OG을 1:1 비율로 혼합하여 배지에 접종(mcBOTH-OG)하고 공동 배양하여 연골세포로 분화 유도하였다. 미니서클벡터를 형질도입시킨 OG 세포를 연골세포 분화 배지에서 분화 유도를 개시한 후, 5일, 10일, 20일 및 30일째에 원심분리로 펠렛을 침전시켜 응축체를 형성시킨 다음, 응축체의 세포의 형태, 세포 내 RFP 발현 및 GFP의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 먼저 응축된 세포의 양은 mcTGFβ3-OG의 양이 다른 실험군에 비해 다소 낮은 수준인 것을 확인하였다(도 5a). 분화 유도 개시 20일 이후부터, mcBMP2-OG 및 mcBOTH-OG에 비해 mcTGFβ3-OG의 세포 응축체의 크기가 증식하여, 세포의 증식 속도가 다른 실험군에 비해 유의적으로 높은 수준으로 나타났다(도 5d).

RFP의 발현 수준을 확인하였을 때, 모든 실험군에서 분화 유도 개시 5일 이후부터 연골세포 펠렛 내의 RFP 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 5b). 이후, 10일째에도 응집된 세포의 형태가 계속 지속되는 것을 확인하였다(도 5c). mcBMP2-OG, mcTGFβ3-OG 및 mcBOTH-OG의 모든 실험군에서 RFP의 발현이 분화 유도 개시 20일까지 지속적으로 증가하는 경향을 나타내다가(도 5d). 30일 이후부터는 감소하는 경향을 나타내었다(도 5e). mcMock을 형질도입한 OG 세포 대조군(NA)의 경우, RFP 발현은 분화 개시 이후 지속적으로 증가하여, 30일 이후까지도 유지되는 것으로 확인하였다.

<3-3> mcBMP2 및 mcTGFβ3를 이용해 분화 유도된 연골세포 펠렛의 분화 효율 확인

이후, 분화된 연골세포 펠렛의 특징을 분석하기 위해, 연골세포 내 마커 유전자인 SOX9, ACAN, COL2A1, COL1A1 및 COL10A1의 발현 수준을 확인하였다. 이와 함께, 골 형성 마커인 RUNX2의 발현 수준을 확인함으로써 연골세포 펠렛의 연골세포 펠렛조골형성능을 확인하였다. 본 발명의 미니서클벡터를 이용한 분화 효율을 종래 기술과 비교하기 위해서, 미니서클벡터를 형질도입하지 않고 BMP2 및 TGFβ3의 성장인자를 모두 포함하는 배지에서 연골세포 분화 유도된 양성 대조군(Both rhGF)에 대하여도 동일 마커 유전자 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 mcBMP2-OG, mcTGFβ3-OG 및 mcBOTH-OG의 모든 실험군에서hiPSC, OG 세포 및 mcMock형질도입 OG 세포의 대조군에 비해 연골세포 마커 유전자가 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다. 초기 연골세포에서 발현되는 마커인 SOX9는 미니서클벡터가 형질도입된 세포 유래의 연골세포 펠렛에서 유의적인 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 6a). ACAN 및 COL10A1 마커의 경우, 절대적인 발현 수준은 SOX9에 비해 낮은 수준으로 발현되었으나, 양성 대조군인 Both rhGF 군에 비해서는 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(도 6d 및 도 6e). 이와 함께, COL2A1 및 COL1A1 역시 mcBMP2-OG, mcTGFβ3-OG 및 mcBOTH-OG 에서 유의적인 수준으로 발현되며, Both rhGF 양성 대조군에 비해 현저히 높은 수준으로 연골세포 마커 유전자가 발현 되는 것으로 확인하였다(도 6c 및 도 6d). 이에 비해, 골 형성 마커인 RUNX2는 재조합 성장인자를 첨가한 경우보다 낮은 수준으로 발현되는 것을 확인하였으며, mcBOTH-OG에서 가장 낮은 수준으로 발현 되는 것을 확인하였다.

연골세포 마커 유전자의 발현과 함께, 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)의 축적 수준을 함께 확인하였다. ECM 축적 확인은, mcBMP2-OG, mcTGFβ3-OG 및 mcBOTH-OG으로부터 분화 유도된 연골세포 펠렛에 대하여 알시안 블루(alcian blue), 사프라닌 O(safranin O) 및 톨루이딘 블루(toluidine blue) 염색으로 확인하였다.

이를 위한 실험 과정은 다음과 같다. 연골세포 펠렛 세포는 먼저 인산염완충 생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 세척한 시료는 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 실온에서 2 시간 동안 처리하여 고정하였다. 고정 후, 에탄올 용액을 사용하여 탈수하고, 에탄올-자일렌 혼합 용액을 사용하여 다시 세척하였다. 세척된 시료는 하루밤 동안 파라핀에 포매하였다. 수득한 파라핀 조각을 고정하고 마이크로톰(microtome)을 이용하여 7 ㎛ 단위로 잘라 시료 조각을 만들었다. 각 조각을 염색하기 이전에, 조각 절편은 최소 10 분 동안 60 오븐에 두어 온도를 상승시켰다. 조각 절편은 즉시 자일렌을 이용하여 탈파라핀하고, 에탄올 농도를 감소시키면서 수화한 다음 1 분 동안 흐르는 수돗물로 닦았다.

알시안 블루 염색을 위해서는, 절편 조각을 1% 알시안 블루 용액(Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 담가 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 배양 후, 조각 절편은 다시 수돗물로 세척하고 nuclear fast red 용액을 사용하여 대비 염색한 후, 시료를 현미경으로 관찰하였다.

사프라닌 O 염색을 위해서, 조각 절편은 Weigert's 헤마톡실린(Sigma Aldrich) 용액을 처리하고 실온에서 10 분간 염색한 후, 다시 10 분 동안 흐르는 수돗물로 세척하였다. 세척한 조각은 다시 0.001% 패스트 그린 용액(Sigma Aldrich) 및 0.1% 사프라닌 O 용액(Sigma Aldrich)으로 각각 5 분씩 염색한 후, 시료를 현미경으로 관찰하였다.

톨루이딘 블루 염색은 탈수한 절편 조각을 0.04% 톨루이딘 블루 용액에 담가 10 분 동안 배양하여 수행하였다. 염색한 절편 조각은 흐르는 수돗물로 세척하고 완벽하게 건조될 때까지 10 분 간 건조시켰다. 염색 과정이 끝나면, 에탄올 농도를 증가시키면서 절편 조각에 처리하여 탈수시켰다. 에탄올은 100% 자일렌을 2 회 처리하여 제거하고, VectaMount^TM Permanent 마운팅 배지(vector Laboratories, CA, USA) 위에 마운팅한 후 현미경으로 관찰하였다.

아울러, 생성된 ECM을 구성하는 콜라겐의 종류를 확인하기 위해, 제 1형 콜라겐 및 제 2형 콜라겐 염색을 통해 연골세포 펠렛의 콜라겐 형성 여부를 면역화학 염색하여 확인하였다. 각 조각을 염색하기 이전에, 조각 절편은 최소 10 분 동안 60 오븐에 두어 온도를 상승시켰다. 조각 절편은 즉시 자일렌을 이용하여 탈파라핀하고, 에탄올 농도를 감소시키면서 수화한 다음 1 분 동안 흐르는 수돗물로 닦았다.

그런 다음, 시료 절편은 끓는 시트레이트 완충용액(citrate buffer)에 담가 다시 수화시켜 항원 단백질을 노출(unmasking)시켰다. 항원 노출이 완료된 시료 조각은 냉각시킨 다음, 조직 내 발현되어 있는 과산화효소의 활성을 차단하기 위해 3% 과산화수소 용액을 처리하였다. 그런 다음, 시료 조각을 다시 세척하고 1% BSA를 포함하는 TBS로 차단하였다. 1차 항체는 차단 용액으로 희석하여 사용하였으며, 항-1형 콜라겐 항체(1/200 희석; Abcam) 또는 항-2형 콜라겐 항체(1/100 희석; Abcam)를 시료에 처리하여 4에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 시료 조각을 0.1% 트윈-20을 포함하는 TBS로 세척하고, 2차 항체를 처리하였다. 2차 항체(1/200 희석; vector Laboratories)는 실온에서 40 분 동안 처리한 다음, 세척하였다. 세척 후, ABC reagent drops(vector Laboratories)를 30 분 동안 처리하였다. 그런 다음, DAB 용액에 담가 5 분 동안 배양하고, Mayer's 헤마톡실린(Sigma Aldrich)을 1 분 동안 처리하여 대비 염색하였다. 대비 염색된 시료는 마운팅하고, 밝은 조도로 현미경 관찰하였다.

그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 모든 실험군에서 ECM이 유의적으로 형성되는 것을 확인하였으며, 이 중 mcBMP2-OG 유래의 연골세포 펠렛에서 전체적으로 균일한 ECM 발현을 나타내는 반면, mcTGFβ3-OG 유래의 연골세포 펠렛에서는 일부 영역에서 ECM이 축적되어 발현되는 것으로 확인하였다(도 7a 내지 도 7c).

생체 내에서 연골을 구성하는 콜라겐으로 제 1형 콜라겐 및 제 2형 콜라겐을 들 수 있다. 제 1형 콜라겐은 섬유상 연골을 형성하고 제 2형 콜라겐은 유리질 연골(hyaline cartilage)을 형성하는 것으로 알려져 있다. 콜라겐의 발현은 모든 실험군에서 유의적으로 발현되는 것을 확인하였으나, mcBOTH-OG 유래의 연골세포 펠렛에서 제 1형 콜라겐 및 제 2형 콜라겐 모두 높은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다(도 7d 및 도 7e). 이를 통해, 본 발명자들은 본 발명의 미니서클벡터를 이용하여 연골세포의 분화를 유도하는 과정에서, mcBMP2-OG 및 mcTGFβ3-OG를 함께 배양하여 연골세포를 분화하는 경우에서 보다 효과적인 연골세포 분화 유도가 가능할 것으로 예상하였다.

미니서클벡터 형질도입으로 분화 유도된 연골세포 펠렛의 생체 내 연골 재생능 확인

본 발명의 방법으로 분화 유도된 연골세포 펠렛이 실제 생체 내에서 연골 재생능을 효과적으로 나타내는지 확인하기 위해, 연골 결함 마우스 모델에서 mcBOTH-OG로부터 분화 유도된 연골세포 펠렛을 이식하여 재생 효과를 확인하였다.

먼저, 연골의 결함을 가지는 모델 마우스를 제조하였다(도 8a). 이를 위해, 실험용 쥐(Sprague-Dawley)를 마취시켜 대퇴골 원위부(distal femur)의 도르래고랑(trochlear groove)의 관절 연골(articular cartilage)에 미세드릴을 이용하여 1.5 ㎜ x 1.5 ㎜ x 1.5 ㎜ 크기의 연골 결함을 유발하였다. 그런 다음, 상기 <실시예 2>에서 10 일 동안 분화 유도한 연골세포 펠렛을 연골 결함 위치에 이식하였다. 관절절개술(arthrotomy)을 위해 열린 수술 부위의 피부는 나일론 실로 봉합하였다. 수술 후 4 주간 동물 모델에 충분한 사료와 식수를 공급하면서 사육하고, 4 주 후 마우스를 희생하여 해당 연골 결손 부위를 조직면역하여 관찰하였다. 연골 재생 효과를 위해, 국제 연골재생학회(International Cartilage Repair Society, ICRS)에서 제정한 회복 점수를 사용하여 재생 정도를 확인하고 이를 비교하였다.

그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 알시안 블루, 톨루이딘 블루 및 사프라닌 O 염색을 통해 연골 결손이 유도된 부위에서 이식한 연골세포에 의한 ECM 형성이 유도되었음을 확인하였다. 4 주 동안 결함을 유지한 대조군(defect only)과 mcMock-OG 유래의 연골세포를 이식한 대조군에서는 ECM 축적이 나타나지 않고 빈 공간이 증가됨을 확인하였다. 이는 mcMock-OG의 세포를 이식하였음에도 불구하고 성장 인자가 갖추어지지 않아 유의적인 연골세포의 분화가 진행되지 않았고, 이에 따라 세포의 사멸이 유도되었음을 나타내는 것으로 확인하였다.

이에 비해, mcBOTH-OG 유래의 연골세포 펠렛을 이식한 실험군에서는 연골세포가 다양한 영역에서 밀집되어 분화 유도됨을 통해 유의적으로 연골 재생 효과를 나타내어 ECM의 축적이 유도되었음을 확인하였다(도 8b 내지 도 8d). 또한, 조직학적 점수를 확인하였을 때에도 대조군에 비해 현저히 높은 수준의 점수를 나타내어 연골 재생이 효과적으로 이루어졌음을 확인하였다(도 8e).

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> {Chondrogenicpellet differentiation using BMP2 and TGFb3 expression minicircle vectors} <130> 1063586 <150> KR 10-2017-0009015 <151> 2017-01-19 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1119 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcgttcccg agcttggtcg gaggaagttt gcggccgcgt caagcggaag gcccagtagt 60 cagcctagcg acgaggtcct ttctgaattc gagcttcggc tcctgtccat gtttggactt 120 aaacagcgac ctacgcccag ccgggatgcc gttgtaccgc cctatatgct cgatctttat 180 cgaagacatt ccggtcagcc aggatcaccg gctccagatc atagacttga gcgcgctgcc 240 tcccgggcaa acactgtgcg atcctttcac catgaggaat cactggaaga attgccagaa 300 acttcaggta agactacgag acgattcttt tttaatctct catccattcc tacagaagaa 360 ttcattacgt ctgccgagct tcaggtattc agagaacaga tgcaagatgc tttggggaat 420 aacagcagct ttcaccatcg catcaacata tacgagataa tcaaacccgc aacagccaac 480 agcaaatttc ccgtaacgcg attgctggat acgcgacttg tgaaccaaaa cgctagcaga 540 tgggaatcat tcgatgtgac gcccgcggtc atgagatgga ccgctcaggg ccacgcgaat 600 cacggctttg ttgtagaggt ggcacatctt gaagagaagc aaggtgtcag caaaagacat 660 gtacgaataa gtcgatcact ccatcaagat gaacactcat ggagccaaat aagacctctc 720 cttgtgacat tcgggcatga cggaaagggt caccctcttc acaaaaggga gaagcgccag 780 gcgaagcata aacagcggaa acgccttaag tcaagttgca aacgccatcc tttgtacgtc 840 gatttctccg atgttggatg gaatgattgg atcgtagctc ctcctggata ccatgccttc 900 tattgccatg gcgagtgccc gttccctctt gcggatcatc tcaacagtac caatcatgca 960 atcgtgcaaa cccttgtaaa cagcgtcaac tccaaaattc ccaaggcttg ttgcgttcct 1020 actgagctga gcgccataag tatgctgtac ctcgatgaaa atgaaaaagt tgtcctgaag 1080 aattatcaag atatggtggt agaaggttgt ggatgtagg 1119 <210> 2 <211> 1167 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttgtccacct gtactacttt ggattttggt cacataaaaa aaaaacgggt cgaggcaatc 60 cgagggcaaa ttctcagcaa actgaggctt acatcacccc ccgaaccgac cgttatgacc 120 cacgtaccat atcaggtctt ggctctgtat aactctactc gcgaactgct tgaggagatg 180 catggggaaa gagaggaggg ttgtacccaa gagaataccg aaagcgagta ctatgctaag 240 gagattcata aattcgatat gattcagggt ctggcagagc acaacgagct ggcagtgtgt 300 ccaaaaggaa tcacctcaaa ggtgtttcgc ttcaatgtat ccagcgtcga aaagaatcgc 360 accaacctct tccgagcgga gtttagggtt cttcgggtac caaaccctag ctcaaagcga 420 aatgagcaac gcattgagtt gttccagata cttaggccgg atgaacacat tgcgaagcag 480 aggtatatag gtggtaaaaa cctcccgact cggggtactg cggagtggct ctcatttgat 540 gtcaccgaca cagtacgcga atggcttctg cgaagagaga gcaatcttgg acttgaaatc 600 agtatccact gtccttgtca taccttccaa ccgaatggag atatactgga gaacatccac 660 gaggtaatgg aaattaagtt taaaggcgtg gacaacgaag atgatcacgg tcggggtgat 720 ctgggacgac tgaagaaaca aaaagaccac cataacccgc atctgatcct tatgatgatc 780 cccccgcata gactcgacaa cccaggtcaa ggcgggcaga gaaagaaaag agctctggat 840 actaactact gttttaggaa tctggaagaa aactgctgcg tacgaccctt gtatattgat 900 tttagacaag acctcggttg gaaatgggtc cacgaaccaa agggatacta tgccaatttc 960 tgtagcggcc cttgtcccta cttgaggagt gccgacacta cacattctac tgtgctcggt 1020 ttgtataaca ccttgaaccc agaagctagt gcatctccct gctgcgttcc ccaggatctc 1080 gaacccctca ctattttgta ttacgttggt cggacaccaa aagtcgaaca actttcaaac 1140 atggtcgtga agtcctgtaa gtgcagc 1167

Claims (8)

1. i) 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)를 배양하여 배아체(embryoid body, EB)를 형성(generation)하는 단계;
   ii) 상기 단계 i)에서 형성한 EB를 젤라틴 코팅 배지에서 배양하여 돌기성장 세포(outgrowth cell, OG)를 수득하는 단계;
   iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를, BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터 또는 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터 중 어느 하나 또는 둘 다로, 형질도입(transduction)하는 단계;
   iv) 상기 단계 iii)에서 형질도입한 OG 세포를 연골세포로 분화 유도하는 단계; 및
   v) 상기 단계 iv)에서 분화 유도한 연골세포를 수득하는 단계;로 이루어지는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
   
2. i) iPSC를 배양하여 EB를 형성하는 단계;
   ii) 상기 단계 i)에서 형성한 EB를 젤라틴 코팅 배지에서 배양하여 OG를 수득하는 단계;
   iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를 BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터로 형질도입하는 단계;
   iv) 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포를 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터로 형질도입하는 단계;
   v) 상기 단계 iii)에서 형질도입한 OG 세포 및 상기 단계 iv)에서 형질도입한 OG 세포를 혼합 배양하여 연골세포로 분화 유도하는 단계; 및
   vi) 상기 단계 v)에서 분화 유도한 연골세포를 수득하는 단계;로 이루어지는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
   
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 BMP2를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터는
   (a) CMV 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 BMP2 유전자, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고;
   (b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및
   (c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
   
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 TGFβ3를 암호화하는 염기서열을 포함하는 미니서클벡터는
   (a) CMV 프로모터, 서열번호 2의 염기서열로 구성되는 TGFβ3 유전자, 및 SV40 폴리아데닐화 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하고;
   (b) 상기 (a)의 유전자 발현 카세트 외부에 위치하는, 박테리오파지 람다의 att 부착 서열을 포함하며; 및
   (c) 복제 개시점 및 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는 비-바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
   
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 연골세포로 분화 유도하는 단계는 재조합 성장인자를 포함하지 않는 배지에서 3 내지 30 일 동안 배양하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
   
6. 제 1항 또는 제 2항의 방법으로 제조된 연골세포.
   
7. 제 6항의 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
8. 제 7항에 있어서, 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 또는 외상에 의한 관절손상인 것을 특징으로 하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   

Images