KR20180085699A

KR20180085699A - 원심분리를 통한 세포 크기별 분리를 이용하여 분화 유도된 연골세포

Info

Publication number: KR20180085699A
Application number: KR1020180007064A
Authority: KR
Inventors: 주지현; 남유준; 임예리
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2018-07-27
Also published as: KR102014020B1

Abstract

본 발명은 역분화줄기세포(iPSCs)로부터 제조한 배아돌출세포(outgrowth cell, OG 세포)를 단일 세포 단위로 나눈 다음 원심분리를 통해 크기별로 나누고, 이 중 크기가 작은 OG 세포를 선택하여 연골세포체(chondrogenic pellet)로 분화되로록 유도하는, 연골세포의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 크기가 작은 OG 세포를 선별하여 연골세포로의 분화를 유도하였을 때, 크기가 큰 OG 세포 유래의 연골세포체에 비해 연골세포 마커의 발현 수준이 유의적으로 높을 뿐 아니라, 조직학적으로 안정적인 연골세포체 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 제조된 연골세포는 재생의학에서 연골 손상 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

원심분리를 통한 세포 크기별 분리를 이용하여 분화 유도된 연골세포{Chondrogenic pellet differentiation using cell-size seperation by centrifugal pulse}

본 발명은 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도함에 있어서, 분화 효율을 증가시키 위해 세포의 크기에 따라 분리하는 단계를 포함하는 연골세포의 분화 방법을 제공하는 것이다.

연골(cartilage)은 연골세포와 연골기질로 구성된 뼈 조직이며, 대개 관절의 일부를 이루는 조직을 가리킨다. 연골은 탄력성이 높고 마찰 계수는 매우 낮아, 골단의 마찰을 방지하는 완충 역할을 하여, 마찰이 거의 없는 상태에서 관절이 움직일 수 있도록 도움을 주는 역할을 한다. 이 외에도, 호흡기의 기관이나 귓바퀴와 같이 탄력을 요하거나, 늑연골, 치골결합 연골과 같이 압력에 대한 저항력을 요하는 부위의 골조를 구성하는 역할을 한다.

특히, 관절 연골은 연골 기질과 연골 기질 사이에 분포하도록 특수하게 분화된 세포인 연골세포로 구성된다. 연골세포는 관절 연골을 만들고 유지하는 역할을 한다. 연골 모세포에서 세포 분열이 일어나나 일단 성장이 멈추면 연골세포는 정상적인 환경에서 더 이상 분열하지 않는다.

따라서, 연골은 한번 손상되면 재생되기 어렵다. 연골의 재생을 위해 연골세포의 분화를 유도하는 등 연골의 재생능을 증가시키기 위한 목적으로 다양한 재생 의학 연구가 진행되고 있다. 이를 위해 가장 많이 사용되는 기술은 세포를 이용하는 세포 치료 기술이다. 그러나, 세포주의 종류에 따라 증식 효율이 상이하여 제한을 가질 수 있다는 단점이 있다. 이에 따라 최근에는 환자로부터 자가적으로 분리한, 지방세포 유래의 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포(MSC)와 같은 성체 줄기세포로부터 in vitro에서 연골세포로의 분화를 유도하여 세포 치료방법에 사용하는 것으로 알려져 있다.

그러나 이러한 세포 치료 방법에서도 초기 연골세포 및 성체 줄기세포는 생체 외에서 배양하였을 때 연골세포의 특징을 빠르게 잃기 때문에 체내 이식한 이후에도 지속적인 사용에 한계가 있다는 제약을 가진다. 또한, 성체 줄기세포로부터 연골세포로 분화하는 분화능은 성체 줄기세포의 분리원이 가지는 병리학적 특징에 의해 특징이 변할 수 있어, 실제 재생 의학에 적용하기에 많은 변수를 가질 수 있다는 점에서 부작용이 우려된다.

이에 따라, 인간 유도 만능줄기세포(hiPSCs)를 조직 재생의학의 세포 치료제로서 사용하고자 하는 연구들이 시도되고 있다. hiPSC는 다양한 계통으로 분화할 수 있는 분화능을 가져 조직 재생의학에서 조직에 제한 없이 사용될 수 있다는 특징이 있다(비특허문헌 001). 때문에 줄기세포로부터 분화 유도할 때의 분화능이 낮은 조직이라고 할지라도, hiPSC를 사용하였을 때 비교적 높은 재생 효과를 기대할 수 있다.

hiPSC로부터 연골세포로 분화를 유도하기 위해 사용되는 성장인자 중, 최근 골형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 또는 형질전환생장인자(transforming growth factor, TGF) 등이 사용된다(비특허문헌 002). BMP는 그 자체만으로도 주로 뼈나 연골의 발생에 주요 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있으며 연골세포의 생존 및 증식에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 중 BMP2의 결핍으로 인해 연골 내골의 발달이 저해될 수 있다는 보고가 있다(비특허문헌 003).

TGFβ 단백질은 세포의 증식, 분화 및 사멸과 같은 과정에 관여하는 것을 통해 다양한 조직에서 구조 골조를 조절하는 인자로서 알려져 있다. TGFβ 단백질은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3와 같은 3가지의 동형 단백질로 나누어 지는데, 이들 간의 작용을 통해 연골 형성을 유도할 수 있는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 004, 비특허문헌 005). 이 중에서도 특히 TGFβ1 또는 TGFβ3를 이용하여 연골 형성을 유도할 수 있으며, 이 중 TGFβ3이 보다 더 높은 분화능을 가지는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 006). 줄기 세포를 목표하는 조직 세포로 분화되도록 유도하는 과정에서, 재조합 인간 성장 인자를 사용하는 것은 중요한 요소로 작용할 수 있다. 그러나 이는 분화 도중에 성장 인자 분자를 자주 첨가해야 하며, 이 때 고가의 비용이 발생한다는 단점이 있다.

줄기세포로부터 연골세포로의 분화를 유도하는 종래 방법에서, 유도만능줄기세포 유래의 배아체를 형성하여 이로부터 계속적인 연골세포의 분화를 유도하는 과정으로 연골 세포의 분화를 유도한다. 이 과정에서 분화 효율을 높이기 위해 배아체를 젤라틴 배지에 배양하여 배아돌출세포(outgrowth cell, OG 세포)을 수득하고, 이를 단일 세포로 분화하여 분화된 연골세포를 수득하는 방법이 연구된 바 있다. 그러나, 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 재생 의학에서 세포 치료제로서 사용하기 위해서는 보다 분화효율이 증진되어야 한다는 필요가 요구됨에 따라, 보다 효과적으로 연골세포를 제조하는 방법의 개발에 대한 연구가 계속되고 있다.

이에, 본 발명자들은 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포를 제조하는 과정에서 보다 분화 효율을 높힐 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, iPSC를 배양하여 배아체를 수득하고, 이로부터 배아돌출세포(outgrowth cell, OG 세포)를 제조한 다음, 원심분리를 통해 OG 세포를 크기별로 나누었을 때 크기가 작은 OG 세포일수록 연골세포체(chondrogenic pellet)로의 분화 효율이 가장 높아질 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

Kim Y, Rim YA, Yi H, Park N, Park SH, Ju JH: The Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Blood Cells: An Efficient Protocol Using Serial Plating of Reprogrammed Cells by Centrifugation. Stem Cells Int 2016, 2016:1329459. Nam Y, Rim YA, Jung SM, Ju JH: Cord blood cell-derived iPSCs as a new candidate for chondrogenic differentiation and cartilage regeneration. Stem Cell Res Ther 2017, 8:16. Shu B, Zhang M, Xie R, Wang M, Jin H, Hou W, Tang D, Harris SE, Mishina Y, O'Keefe RJ, et al: BMP2, but not BMP4, is crucial for chondrocyte proliferation and maturation during endochondral bone development. J Cell Sci 2011, 124:3428-3440. Tuli R, Tuli S, Nandi S, Huang X, Manner PA, Hozack WJ, Danielson KG, Hall DJ, Tuan RS: Transforming growth factor-beta-mediated chondrogenesis of human mesenchymal progenitor cells involves N-cadherin and mitogen-activated protein kinase and Wnt signaling cross-talk. J Biol Chem 2003, 278:41227-41236. Mueller MB, Tuan RS: Functional characterization of hypertrophy in chondrogenesis of human mesenchymal stem cells. Arthritis Rheum 2008, 58:1377-1388. Barry F, Boynton RE, Liu B, Murphy JM: Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res 2001, 268:189-200.

본 발명의 목적은 역분화유도 줄기세포로부터 연골세포를 분화하는 방법에 있어서, 분화 효율을 증가시킬 수 있는 방법을 제공하는 것에 있다.

또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 연골세포를 분화하는 방법을 통해 제조된 연골세포 및 이의 세포치료제로서의 용도를 제공하는 것에 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 i) 내지 v) 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법을 제공한다:

i) 역분화줄기세포(induced plurientent stem cells, iPSCs)를 배양하여 배아체를 수득하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 수득한 배아체를 부착배양하여 배아돌출세포(outgrowth cell, OG 세포)을 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 배아돌출세포를 원심분리하여 세포를 크기별로 분리하고, 크기가 작은 세포를 선별하는 단계;

iv) 상기 단계 iii)에서 선별된 크기가 작은 세포를 연골 세포로 분화 유도하는 단계; 및

v) 상기 단계 iv)에서 분화 유도된 연골 세포를 수득하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 i)의 역분화 줄기세포는 제대혈단핵구세포(cord blood mononuclear cell)를 리프로그래밍하여 얻은 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 ii)의 부착배양은 젤라틴 코팅 플레이트에서 세포를 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iii)의 원심분리 및 선별은 하기 a) 내지 c)의 단계를 거쳐 수행하는 것일 수 있다:

a) 배아돌출세포를 포함하는 배지를, 300 rpm 내지 800 rpm에서 3 내지 10초간 원심분리하여 침전된 세포를 크기가 큰 세포(heavy cell)로 구분하는 단계;

b) 상기 단계 a)의 원심분리 후의 상층액을, 800 rpm 내지 1,200 rpm에서 3 내지 10 초간 원심분리하여 침전된 세포를 중간 크기 세포(medium cell)로 구분하는 단계; 및

c) 상기 단계 b)의 원심분리 후의 상층액을, 1,200 rpm 내지 2,000 rpm에서 3 내지 10 초간 원심분리하여 침전된 세포를 크기가 작은 세포(light cell)로 구분하는 단계.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 단계 iv)의 분화 유도는 인간 골형성 단백질 2(human bone morphogenetic protein 2) 및 형질전환생장인자 β3(human transforming growth factor beta 3)를 포함하는 배지에서 수행하는 것일 수 있으며, 이에 추가로 IGF2 억제제를 첨가한 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 연골세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에서, 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 또는 외상에 의한 관절손상인 것일 수 있다.

따라서, 본 발명은 역분화줄기세포(induced plurientent stem cells, iPSCs)로부터 제조한 배아돌출세포(outgrowth cell, OG 세포)를 단일 세포 단위로 나눈 다음 원심분리를 통해 크기별로 나누고, 이 중 크기가 작은 OG 세포를 선택하여 연골세포체(chondrogenic pellet)로 분화되로록 유도하는, 연골세포의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 크기가 작은 OG 세포를 선별하여 연골세포로의 분화를 유도하였을 때, 크기가 큰 OG 세포 유래의 연골세포체에 비해 연골세포 마커의 발현 수준이 유의적으로 높을 뿐 아니라, 조직학적으로 안정적인 연골세포체 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 크기가 작은 세포만을 선별하여 연골세포를 분화유도 및 제조하는 방법은, 종래 방법에 비해 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도하는 분화 효율이 개선될 뿐 아니라, 분화된 연골 세포의 품질이 향상될 수 있어, 재생의학에서 연골 손상 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 역분화줄기세포로부터 연골세포체를 제조하는 본 발명의 방법을 요약한 모식도이다.
도 2는 크기별로 분리된 OG 세포에서 분화유도 마커의 확인을 나타낸다:
도 2a 및 도 2b는 크기가 큰 OG 세포, 중간 크기 OG 세포 및 크기가 작은 OG 세포의 분리 후 및 부착배양시의 세포 형태를 관찰한 결과이고;
도 2c 내지 도 2는 크기가 큰 OG 세포, 중간 크기 OG 세포 및 크기가 작은 OG 세포에서 SOX9 및 COL10의 유전자 발현 수준을 확인한 결과이며; 및
도 2f 및 도 2g는 크기가 큰 OG 세포, 중간 크기 OG 세포 및 크기가 작은 OG 세포에서 SOX9 및 COL10의 단백질 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 OG 세포 유래의 연골세포체의 특징의 확인을 나타낸다:
도 3a는 크기별로 분리한 OG 세포를 연골분화배지에서 배양하여 분화를 유도한 연골세포체의 형태를 나타내며; 및
도 3b는 상기 연골세포체를 수득하여 조직학적 염색을 통해 연골세포체의 골형성능을 확인한 결과이다.
도 4는 OG 세포 크기에 따른 연골세포체의 마커 발현 수준의 차이를 확인한 결과이다.
도 5는 IGF2 억제제인 크로메셉틴(chromeceptin)을 처리한 환경에서, 세포 크기가 큰 OG 세포를 배양한 후의 OG 세포 증식 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 크로메셉틴을 처리하여 세포 크기가 큰 OG 세포로부터 연골세포체로의 분화를 유도하였을 때, 이에 따른 연골분화 마커의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 IGF2 억제제 처리 배지에서 분화 유도된 연골세포체의 연골세포 마커를 확인한 결과이다. 이 때 실험에 사용한 OG 세포는 원심분리로 분리된 세포 크기가 큰 세포이고, 정상 대조군으로는 크로메셉틴을 처리하지 않은 환경에서 연골세포체로의 분화를 유도한 시료를 사용하였다:
도 7a는 2 mM 크로메셉틴을 처리하여 분화를 유도한 연골세포체의 형태를 나타내며; 및
도 7b는 이에 따라 분화된 연골세포체에서 COL2A1 및 SOX9의 유전자 발현 수준을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

재생 의학 분야에 있어서, 연골의 재생을 위해 세포 치료 기술을 통해 연골세포의 분화를 유도하는 기술이 많이 사용되고 있으나, 체내 이식하는 연골세포가 가지는 분화능 및 조직형성능의 특징에 따라 치료 효과에 차이를 나타낼 수 있다.이를 위해 유도만능줄기세포 유래의 연골세포 분화 유도 기술이 요구되며, 분화 효율 및 분화된 연골세포의 조직 형성능을 개선시키기고자 하는 목적의 연구가 계속되고 있다.

따라서, 본 발명은 하기 i) 내지 v) 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법을 제공한다:

본 발명의 연골세포의 제조방법에 있어서, 상기 단계 iii)의 “원심분리”는 세포의 크기가 작은 배아돌출세포(OG 세포)를 선별하고자 하는 관점에서 수행된다. 이를 위해, 상기 단계 ii)에서 수득한 OG 세포는 세포 덩어리를 제거하여 단일 세포 단위로 분리된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같이 단일 세포 단위로 분리하였을 때, 각각의 세포가 크기에 따라 유의적으로 분리될 수 있을 것으로 기대할 수 있다. 응집된 형태로 배양되는 배아체 형태에서 단일 세포 단위로 분리하기 위해서는, 세포 스트레이너를 사용하는 등 통상의 방법에 따라 분리가 가능하다.

본 발명의 연골세포의 제조방법에 있어서, 상기 단계 iii)의 “원심분리” 및 “선별”은 하기 a) 내지 c)의 단계를 거쳐 수행하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 상기 “원심분리” 조건으로서, a) 단계에서는 500 rpm에서 5 초간 수행하는 것이 바람직하고, b) 단계에서는 1,100 rpm에서 5 초간 수행하는 것이 바람직하며, c) 단계에서는 1,500 rpm에서 5 초간 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에서 세포 크기가 작은 OG 세포를 선별하여 연골세포로 분화를 유도하고자 한다는 관점에서, 상기 a) 단계를 생략하고 b) 단계만을 수행한 다음, 원심분리 후의 상층액을 이용하여 상기 c) 단계를 통해 크기가 작은 세포로 구분하는 단계를 수행하는 것으로 변경할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업계의 통상의 기술자에 의해 세포 크기가 작은 세포만을 선별할 수 있는 것으로 이해될 수 있는 범위의 방법이라면 본 발명의 방법이 제한없이 응용될 수 있을 것이다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 i)의 “역분화 줄기세포”는 환자 유래의 세포로부터 유도된 것일 수 있고, 시판되는 것을 사용하여도 무방하다. 그러나, 본 발명의 연골세포를 연골 결손 부위에 이식함에 있어서 생체 적합성을 증진시키고자 하는 관점에서, 상기 iPSC는 환자 유래의 세포로부터 유도된 것을 사용하는 것이 보다 바람직하다. 구체적으로, 상기 iPSC는 환자의 제대혈단핵구세포(cord blood mononuclear cell)를 리프로그래밍하여 얻은 것을 사용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 ii)의 “부착배양”은 젤라틴 코팅 플레이트에서 세포를 배양하는 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 iv)의 “분화 유도”는 인간 골형성 단백질 2(human bone morphogenetic protein 2) 및 형질전환생장인자 β3(human transforming growth factor beta 3)를 포함하는 배지에서 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도할 수 있는 인자로서 알려진 분화 유도 인자들은 선택적으로 가감될 수 있다. 또한, 상기 배지는 IGF2 억제제를 추가로 포함할 수 있고, 상기 IGF2 억제제는 대표적으로 크로메셉틴(chromeceptin)을 들 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 크기가 작은 배아돌출세포를 선별하여 연골세포로의 분화를 유도하였을 때, 크기가 큰 세포 유래의 연골세포체에 비해 연골세포 마커의 발현 수준이 유의적으로 높을 뿐 아니라, 조직학적으로 안정적인 연골세포체 구조를 형성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 크기가 작은 세포만을 선별하여 연골세포를 분화유도 및 제조하는 방법은, 종래 방법에 비해 줄기세포로부터 연골세포로 분화를 유도하는 분화 효율이 개선될 뿐 아니라, 분화된 연골 세포의 품질이 향상될 수 있어, 재생의학에서 연골 손상 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합 및 외상에 의한 관절손상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않으며, 연골의 결손 또는 손상에 의해 유발될 수 있는 연골 부위의 질병으로서 당업계에 공지된 질병이라면 제한 없이 해당될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

세포 크기별로 분리함에 따른 연골세포 분화의 유도

본 발명자들은, 세포 치료제 등급의 연골 세포를 제작할 수 있는 방법을 확립하기 위해, 역분화줄기세포(induced plurientent stem cells, iPSCs)로부터 배아체(Embryoid bodies, EB)를 생성한 후, 중간엽-유사 배아돌출세포(outgrowth cells, OG 세포)를 수득하고, 원심분리를 통해 크기로 구분하여 얻은 OG 세포를 연골세포로 분화 유도하는 방법을 구축하였다(도 1).

i) iPSC의 준비

먼저 제대혈 단핵세포(CBMC) 유래의 유도만능줄기세포를 제조하였다. 이 때 사용한 CBMC는 한국 서울 성모병원의 제대혈 은행에서 획득한 것을 사용하였다. 제대혈을 인산완충 식염수 (PBS)로 희석하고 피콜농도구배(Ficoll gradient)를 통해 850×g에서 30 분간 원심분리하여 CBMC를 수집한 다음, 세척 및 동결하여 사용시까지 보관하였다. CBMC는 사용 직전에 해동한 다음 CC110 사이토카인 칵테일(STEMCELL)이 보충 된 StemSpan 배지(STEMCELL Technological, Vancouver, British Columbia, Canada)에 재현탁하고, 37℃의 5% CO₂배양기에서 5일 동안 배양하였다.

그런 다음, CBMC로부터 iPSC를 제조하기 위해, CBMC를 3x10⁵농도로 24-웰 플레이트(well plate)에 접종하고, CytoTune-iPS 센다이 리프로그램 키트를 사용하여 제조사에서 제공하는 프로토콜에 따라 리프로그래밍을 유도해, CBMC 유래의 iPSC를 수득하였다.

ii) CBMC 유래 iPSC로부터 배아체(EB) 및 배아돌출세포(OG 세포)의 유도

CBMC 유래의 iPSC를 Aggrewell 배지(STEMCELL)에 재현탁하고, 2×10⁶ 세포/웰의 농도로 100-mm 배양 플레이트에 접종하였다. 접종한 iPSC는 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하고, 다음날 TeSR-E8 배지로 배지를 교체한 다음, 6일 동안 추가로 배양하여 EB를 수득하였다. 수득한 EB는 20% 우태아혈청(FBS)을 함유하는 DMEM 배지에 현탁하고, 젤라틴 코팅 플레이트 상에서 7 일간 배양하여 OG 세포의 형성을 유도하였다.

iii) OG 세포의 크기별 분리

형성한 OG 세포를 젤라틴 코팅 플레이트에서 분리하여, 40 ㎛ 크기의 셀 스트레이너(Thermo Fisher Scientific)에 통과시켜 세포 덩어리를 제거하고 단일 세포 단위로 분리하였다. 분리한 세포는 크기별로 다시 분리하기 위해 원심분리하였다. 먼저 500 rpm으로 5 초간 원심분리하여 침전된 세포를 크기가 큰 세포(heavy cell)로서 수득하고, 상층액을 다시 1,100 rpm으로 5 초간 원심분리하여 침전된 세포를 중간 크기 세포(medium cell)로서 수득하였다. 또한, 상층액을 다시 1,500 rpm으로 5 초간 원심분리하여 침전된 세포를 크기가 작은 세포(light cell)로서 수득하였다.

iv) OG 세포로부터 연골세포체로의 분화 유도

수득한 상기 크기가 큰 세포, 중간 크기 세포 및 크기가 작은 세포는 각각 세포는 계수하여 3×10⁵ 세포/튜브의 농도로 연골분화배지에 접종하여 배양하였다. 상기 연골분화배지는, 20% 넉아웃 혈청 대체물(knockout serum replacement), 1× 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 1% 소듐 피루브산, 1% ITS+ 프리믹스, 10^-7M 덱사메타손, 50 ㎛ 아스코르브산, 40 ㎍/mL L-프롤린, 50 ng/mℓ 인간 골형성 단백질 2(human bone morphogenetic protein 2) 및 10 ng/mℓ 형질전환생장인자 β3(human transforming growth factor beta 3)를 포함하는 DMEM 배지를 사용하였다. 연골분화배지에 각각의 세포를 접종한 후, 750 ×g에서 5 분간 원심분리하여 세포를 침전시키고, 매일 1회 새로운 배지로 교체하면서 총 30일 동안 37℃에서 배양하여 최종적으로 분화 유도된 연골세포체을 수득하였다.

크기별로 분리된 OG 세포에서 분화유도 마커의 확인

OG 세포를 크기별로 분리함에 따라 연골세포로의 분화능이 구별되는지 확인하기 위해, 먼저 원심분리를 통해 크기별로 분리한 OG 세포의 특징을 확인하였다.

먼저, 상기 [실시예 1]의 iii) 단계에서 수득한 각각의 크기가 큰 OG 세포, 중간 크기 OG 세포 및 크기가 작은 OG 세포의 세포 형태(cell morphology)를 현미경으로 관찰한 결과, 도 2a 및 도 2b에서 나타난 바와 같이, 크기에 따라 세포가 분리된 것을 확인하였다.

그런 다음, 각각의 세포는 5×105 세포로 시료에 따라 동일하게 계수한 다음, 트리졸(Trizol, Life Technologies 사)을 사용하여 각각의 세포를 파쇄하여 mRNA를 추출하고, Revert Aid TM First Strand cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조사의 제공하는 프로토콜에 따라 mRNA를 주형으로 하는 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 하여, 다시 하기 [표 1]에 기재된 프라이머 서열을 사용하여 PCR 반응을 수행해 연골세포로의 분화 유도를 돕는 전사인자인 SOX9 및 세포 성장을 돕는 비대 마커(hypertrophy marker)인 COL10의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. mRNA 발현 수준은 전기영동을 통해 확인한 다음, 정량 분석을 위해 GAPDH를 기준으로 세포 내 SOX9 및 COL10A1의 상대적인 발현 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 2c 내지 도 2e에서 나타난 바와 같이, 크기가 큰 OG 세포에서는 SOX9의 발현 수준이 낮고 COL10의 발현 수준이 높은 반면, 세포크기가 작은 OG 세포에서는 SOX9의 발현 수준이 상대적으로 높고 COL10의 발현은 나타나지 않는 것으로 확인하였다.

본 발명에서 마커 발현 확인을 위해 사용한 프라이머 목록 및 이의 서열

Target Name	Direction	Primer Sequence	Size
SOX5	Forward	CAGCCAGAGTTAGCACAATAGG	104
	Reverse	CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT
SOX6	Forward	GGATGCAATGACCCAGGATTT	141
	Reverse	TGAATGGTACTGACAAGTGTTGG
SOX9	Forward	GAACGCACATCAAGACGGAG	631
	Reverse	TCTCGTTGATTTCGCTGCTC
COL2A1	Forward	GGCAATAGCAGGTTCACGTACA	79
	Reverse	CGATAACAGTCTTGCCCCACTTA
COL1A1	Forward	TCTGCGACAACGGCAAGGTG	146
	Reverse	GACGCCGGTGGTTTCTTGGT
COL10A1	Forward	GTCTGCTTTTACTGTTATTCTCTCCAAA	108
	Reverse	TGCTGTTGCCTGTTATACAAAATTTT
ACAN	Forward	AGCCTGCGCTCCAATGACT	107
	Reverse	TAATGGAACACGATGCCTTTCA
CHAD	Forward	GATCCCCAAGGTGTCAGAGAAG	66
	Reverse	GCCAGCACCGGGAAGTT
PRG4	Forward	AAAGTCAGCACATCTCCCAA	108
	Reverse	GTGTCTCTTTAGCGGAAGTAGTC
RUNX2	Forward	TCTTAGAACAAATTCTGCCCTTT	136
	Reverse	TGCTTTGGTCTTGAAATCACA
OPN	Forward	GGGAGTACGAATACACGGGC	92
	Reverse	TCGGTAATTGTCCCCACGAG
BGLAP	Forward	ATGAGAGCCCTCACACTCCT	117
	Reverse	CTTGGACACAAAGGCTGCAC

상기 SOX9 및 COL10A1의 발현을 단백질 수준에서 재확인하기 위해, 형광면역분석을 수행하였다. 각각의 세포는 동일하게 계수한 다음, PBS로 세척하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켰다. 고정된 세포는 0.1 % triton X-100을 10 분간 처리하여 투과력(permeability)을 가지도록 한 다음, 침전시켜 세포를 수득하고 2 % 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS(PBA)을 처리하여 실온에서 30분 동안 세포를 차단하였다. 차단한 세포에 항-SOX9 항체 또는 항-COL10 항체를 1차 항체로서 처리한 다음 2 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다음, Alexa Fluor 594-항체를 가하여 암실에서 1 시간 동안 반응을 유도하였다. 반응 종료 후, PBA로 세포를 세척하고 형광 현미경으로 염색된 세포를 관찰하였다. 세포의 핵은 DAPI로 염색하였다.

그 결과 도 2f 및 도 2g에서 나타난 바와 같이, 세포 크기가 큰 OG 세포에서 SOX9의 발현 수준이 낮고 COL10의 발현 수준이 높은 반면, 크기가 작은 OG 세포에서는 SOX9의 발현 수준이 상대적으로 높고 COL10의 발현은 나타나지 않는 것을 확인하여, mRNA 발현 수준에서 확인한 결과과 단백질 수준에서 확인한 결과와 일치하는 양상을 나타내는 것으로 확인하였다.

OG 세포 유래의 연골세포체의 특징 확인

<3-1> OG 세포 크기에 따른 연골세포체 구조생성능 확인

본 발명의 방법을 통해 분화된 연골세포체 중, OG 세포의 크기에 따라 분화 정도의 차이를 나타내는지 확인하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 1]의 iv) 단계에서 분화 유도하여 수득한 연골세포체의 콜로니를 대상으로 4% 파라포름알데히드를 이용하여 실온에서 2 시간 동안 고정시키고, 에탄올 및 자일렌을 혼합한 용액으로 탈수하였다. 탈수된 세포체는 파라핀으로 고정한 다음 7 ㎛ 크기로 절단하여 절편을 제작하였다. 제작한 절편을 대상으로 톨루이딘 블루(toluidine blue), 사프라닌 O(safranin O) 및 알시안 블루(alcian blue) 염색을 수행하고, 각각의 시료를 현미경으로 확인하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 크기에 따라 분리된 OG 세포는 연골세포체로 분화를 유도하는 시간이 지남에 따라 콜로니의 크기 역시 상이한 것을 확인하였다(도 3a). 분화 유도 종료 후, 연골세포체를 염색하여 조직학적으로 확인하였을 때, 크기가 작은 세포로부터 분화 유도된 연골세포체가 보다 안정적인 구조를 이루는 것으로 확인하였다(도 3b). 이에 반해, 크기가 큰 OG 세포로부터 분화 유도된 연골세포체는 연골조직체가 엉성한 구조를 이루는 것으로 확인하여, 이는 골관절염 환자와 비슷한 특성을 나타내는 것으로 확인하였다.

<3-2> OG 세포 크기에 따른 연골세포체의 마커 발현 수준의 차이 확인

본 발명의 방법을 통해 분화된 연골세포체에서 연골세포의 마커 유전자를 발현하는지 양상을 확인하고자, 연골분화 촉진 마커인 SOX5, SOX6 및 SOX9; 콜라겐 마커인 COL2A1, COL1A1 및 COL10A10; 세포외 기질 단백질인 ACAN, CHAD 및 PRG4; 및 골 분화마커인 RUNX2, OPN 및 BGLAP의 유전자 발현 수준 양상을 확인하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 1]의 iv) 단계에서 분화 유도하여 수득한 연골세포체를 수득하여 액체 질소로 급속 동결한 다음, 막자로 분쇄하였다. 분쇄한 각각의 시료는 트리졸(trizol)을 가하여 세포체를 파쇄하고 전체 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하고, 다시 cDNA를 주형으로 하여 상기 [표 1]에 기재된 프라이머 서열을 이용하여 PCR 반응을 수행하여 각각의 마커의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. mRNA 발현 수준은 GAPDH를 기준으로 상대적인 발현 수준을 비교하여, 분화된 연골세포체에서 OG 세포의 크기에 따른 마커 유전자의 상대적인 발현 수준을 분석하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 OG 세포의 크기가 작을수록 이로부터 분화 유도된 연골세포체의 세포외 기질단백질의 유전자 발현이 높은 반면, 골분화 마커는 군간의 유의성이 떨어지는 것을 확인하였다. 이를 통해 크기가 작은 OG 세포 유래의 연골세포체가 초자연골의 형성을 유의적으로 나타낼 수 있고, 가치성이 높은 것을 확인하였다.

OG 세포의 크기에 따라 연골세포체로서 분화능의 차이를 나타내는 원인 확인

OG 세포의 크기에 따라 연골세포체로 분화되는 분화능에서 차이를 나타내어 OG 세포가 작을수록 연골세포체로의 분화능이 우수한 것을 확인하였으므로, OG 세포 크기가 큰 세포가 분화능을 유의적으로 나타내지 못하도록 하는 인자를 찾고자 하였다.

구체적으로, 상기 [실시예 1]의 iii) 단계에서 수득한 각각의 크기가 큰 OG 세포, 중간 크기 OG 세포 및 크기가 작은 OG 세포로부터 전체 mRNA를 추출한 다음, 이의 유전자 발현 수준을 마이크로어레이 분석을 통해 확인하였다. 마이크로어레이 분석 결과를 중간 크기의 OG 세포 및 크기가 작은 OG 세포 내의 유전자 발현 수준에 대한 크기가 큰 OG 세포 내의 유전자 발현 수준으로 비교하여, 크기가 큰 OG 세포에서 특이적으로 발현 수준이 변화하는 유전자를 스크리닝하였다.

그 결과, 하기 [표 2] 및 [표 3]에서 나타난 바와 같이 OG 세포의 크기가 큰 OG 세포일수록 IGF2(Insulin-like growth Factor 2)의 발현 수준이 현저히 높은 것으로 확인하였다.

IGF2 억제제를 처리한 환경에서 분화 유도된 연골세포체의 분화능 확인

<5-1> IGF2 억제제 처리 배지에서 배양한 OG 세포의 증식 정도 확인

상기 [실시예 4]를 통해 OG 세포의 크기에 따라 이로부터 분화된 연골세포체에서 IGF2의 발현 수준이 차이를 나타내는 것으로 확인하여, IGF2 억제제인 크로메셉틴(chromeceptin)을 처리하였을 때 OG 세포의 분화능이 변화하는지 확인하고자 하였다.

먼저, 상기 [실시예 1]의 iii) 단계에서 수득한 OG 세포 중 크기가 큰 세포를 대상으로 하여 iv) 단계에 따라 연골세포체로 분화를 유도하는 중, 3 일간 배지에 크로메셉틴을 2 nM 내지 2 μM 농도로 처리하면서 배양하였다. 그런 다음, 처리 시간에 따라 세포의 형태를 관찰하고, 증식되는 세포 수를 계수하였다.

그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이 크로메셉틴의 처리 농도가 증가함에 따라 세포의 증식 정도가 감소하여, 72 시간 후에는 2 μM 크로메셉틴을 포함하는 배지에서 분화 유도한 OG 세포의 수가 미처리 대조군에 비해 약 3배 이상 감소하는 것을 확인하였다.

<5-2> IGF2 억제제 처리 배지에서 배양한 OG 세포의 연골분화 마커 확인

IGF2 억제제인 크로메셉틴을 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 OG 세포의 증식능에도 변화를 나타냄을 확인하여, 이에 따른 연골분화 마커의 발현 수준에서도 차이를 나타내는지 확인하고자 하였다.

이에, 상기 실시예 <5-1>의 조건으로 크로메셉틴을 처리하여 크기가 큰 OG 세포로부터 연골세포체로의 분화를 유도하면서, OG 세포를 수득해 mRNA를 추출하고 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여 SOX9, COL2A1, COL10A1 및 IGF2의 발현 수준을 정량 분석하였다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 먼저 크로메셉틴의 처리 농도가 증가함에 따라 OG 세포에서 IGF2의 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 이와 반대로, 연골분화 마커인 SOX9의 발현 수준을, 크로메셉틴의 처리 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하여, 2 μM 크로메셉틴을 처리한 세포시료에서 미처리 대조군(Normal Ctrl)에 비해 SOX9의 발현 수준이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.

<5-3> IGF2 억제제 처리 배지에서 분화 유도된 연골세포체의 연골세포 마커 확인

IGF2 억제제를 처리함에 따라, 크기가 큰 OG 세포에서도 유의적으로 연골세포 분화 마커의 발현 수준이 증가할 수 있음을 확인하였다. 이에, 이러한 환경에서 분화 유도된 연골세포체에서도 유의적으로 분화가 되었는지 확인하고자 하였다.

먼저, 상기 [실시예 1]의 iii) 단계에서 수득한 OG 세포 중 크기가 큰 세포를 대상으로 하여 iv) 단계에 따라 연골세포체로 분화를 유도하는 중, 3 일간 배지에 크로메셉틴을 2 mM 농도로 처리하면서 배양하였다. 실험군은 2 군으로 나누어, 연골세포체가 형성되지 시작한 시점부터 크로메셉틴을 처리하여 연골세포 분화를 유도한 실험군(before aggregation) 및 연골세포체 형성을 유도한 후 7일 째가 되는 시점부터 크로메셉틴을 처리하여 연골세포 분화를 유도한 실험군(after aggregation)으로 하여, 분화된 각각의 연골세포체를 수득하였다. 그런 다음, 수득한 연골세포체로부터 mRNA를 추출하여, COL2A1, SOX9, COL1A1 및 COL10A1의 발현 수준을 확인하였다.

그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 연골세포 마커인 SOX9는 크로메셉틴을 처리하여 연골세포체로 분화를 유도함에 따라, 연골세포체 형성 초기(before aggregation)에 비해 연골세포체 형성 말기(after aggregation)에서 SOX9의 발현 수준이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.

Claims

i) 역분화줄기세포(induced plurientent stem cells, iPSCs)를 배양하여 배아체를 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득한 배아체를 부착배양하여 배아돌출세포(outgrowth cell, OG 세포)을 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 배아돌출세포를 원심분리하여 세포를 크기별로 분리하고, 크기가 작은 세포를 선별하는 단계;
iv) 상기 단계 iii)에서 선별된 크기가 작은 세포를 연골 세포로 분화 유도하는 단계; 및
v) 상기 단계 iv)에서 분화 유도된 연골 세포를 수득하는 단계;를 포함하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 i)의 역분화 줄기세포는 제대혈단핵구세포(cord blood mononuclear cell)를 리프로그래밍하여 얻은 것임을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 ii)의 부착배양은 젤라틴 코팅 플레이트에서 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iii)의 원심분리 및 선별은 하기 a) 내지 c)의 단계를 거쳐 수행하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법:
a) 배아돌출세포를 포함하는 배지를, 300 rpm 내지 800 rpm에서 3 내지 10초간 원심분리하여 침전된 세포를 크기가 큰 세포(heavy cell)로 구분하는 단계;
b) 상기 단계 a)의 원심분리 후의 상층액을, 800 rpm 내지 1,200 rpm에서 3 내지 10 초간 원심분리하여 침전된 세포를 중간 크기 세포(medium cell)로 구분하는 단계; 및
c) 상기 단계 b)의 원심분리 후의 상층액을, 1,200 rpm 내지 2,000 rpm에서 3 내지 10 초간 원심분리하여 침전된 세포를 크기가 작은 세포(light cell)로 구분하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 단계 iv)의 분화 유도는 인간 골형성 단백질 2(human bone morphogenetic protein 2) 및 형질전환생장인자 β3(human transforming growth factor beta 3)를 포함하는 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
제 5항에 있어서, 상기 배지에 IGF2 억제제를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포로부터 분화 유도된 연골세포의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조된 연골세포.
제 7항의 연골세포를 유효성분으로 포함하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 연골 손상 질환은 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 골절, 족저근막염, 상완골외과염, 석회화근염, 골절의 불유합, 또는 외상에 의한 관절손상인 것을 특징으로 하는, 연골 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.