JP6960396B2 - 分裂終了細胞の細胞分裂を誘発するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2015年4月7日に出願された米国仮特許出願第62/144,244号、及び2015年4月22日に出願された米国仮特許出願第62/151,321号の優先権を主張し、これらは参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
I.定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は以下の意味を有する。
本開示を読めば当業者に明らかとなるように、本開示は、分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する方法であって、分裂終了細胞を、分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を刺激するのに効果的な量で有効量の組成物(例えば、1つ以上の増殖及び/または細胞周期再進入因子)と接触させることを含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる方法を提供する。細胞は、任意の種、動物、哺乳動物からの細胞、例えばイヌ、ネコ、ネズミ、ラット、またはヒト細胞であってもよい。
本開示の心臓細胞は、心臓機能を提供する、心臓に存在する任意の細胞を含む。心臓細胞は、心臓の心外膜、心筋または心内膜内に存在する細胞を包含する。心臓細胞はまた、例えば、心臓筋肉細胞または心筋細胞、及び心臓血管の細胞、例えば冠状動脈または静脈の細胞を含む。心臓細胞の他の限定されない例は、心筋、血管及び心臓細胞支持構造を構成する、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞または前駆細胞、伝導心筋細胞及び心臓ペースメーカー細胞を含む。
本開示の神経細胞は、神経機能を提供する、神経系に存在する任意の細胞を含む。神経細胞は、脳(例えば、大脳、小脳及び脳幹)及び脊髄に存在する細胞、ならびに感覚ニューロンを含む末梢神経系の細胞を包含する。神経細胞はまた、例えば、ニューロン、乏突起膠細胞、及び星状膠細胞を含む。ニューロンの限定されない例は、運動ニューロン、錐体ニューロン、プルキンエ細胞、網膜神経細胞、嗅覚ニューロン、触覚及び痛覚ニューロン、ならびに無軸索細胞を含む。
本開示の膵臓細胞は、膵臓機能を提供する、膵臓に存在する任意の細胞を含む。膵臓細胞の例は、ランゲルハンス島内の細胞(例えば、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、PP細胞及びイプシロン細胞)ならびに腺房細胞を含む。いくつかの実施形態において、膵臓細胞は、膵臓前駆細胞である。
本開示の有毛細胞は、内有毛細胞(不動毛)及び外有毛細胞を含む。有毛細胞は、有毛または非有毛細胞から誘導され得る。有毛細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。有毛細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後(例えば成体)有毛細胞であってもよい。好ましい実施形態において、有毛細胞は、成体有毛細胞である。いくつかの実施形態において、有毛細胞は、幹細胞から誘導される。非有毛細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、in vitroまたはin vivoで有毛細胞に分化され得る。例えば、Mohammad et al.(2014)Stem Cells and Dev.23(11):1275−1284に記載の方法を参照されたい。好ましい実施形態において、成体分裂終了有毛細胞は、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。
本開示の骨格筋細胞は、筋線維の細胞を指す。骨格筋細胞は、骨格筋細胞または非骨格筋細胞から誘導され得る。骨格筋細胞は、様々な組織源のいずれかからの細胞であってもよく、またはそれから誘導されてもよい。例えば、幹細胞、線維芽細胞、包皮線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、肺線維芽細胞等である。骨格筋細胞は、胚細胞、胎児細胞、または出生後(例えば成体)骨格筋細胞であってもよい。好ましい実施形態において、骨格筋細胞は、成体骨格筋細胞である。いくつかの実施形態において、骨格筋細胞は、幹細胞から誘導される。非骨格筋細胞は、当業者に利用可能な任意の方法を使用して、in vitroまたはin vivoで骨格筋細胞に分化され得る。例えば、Salani et al.(2012)J Cell Mol.Med.16(7):1353−1364に記載の方法を参照されたい。好ましい実施形態において、成体分裂終了骨格筋細胞は、増殖能力を有さない、または増殖能力が低い。
本開示の細胞は、当業者に知られている任意の条件下で培養され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、1〜20%の酸素(O2)及び5%の二酸化炭素(CO2)の条件下で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、低酸素条件下(例えば、10%未満のO2の存在下)で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約37℃で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約37℃、5%のCO2及び10〜20%のO2で培養され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、ある期間低酸素条件下で培養される。例えば、細胞は、ある期間低酸素条件(約20%のO2)下で培養され、次いで低酸素条件、例えば約5%のO2に切り替えられてもよい。
一態様において、本開示の方法及び組成物は、分裂終了細胞を、少なくとも1つのサイクリン依存性キナーゼ(CDK)及び少なくとも1つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を含む有効量の組成物と接触させ、それにより分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発することにより、分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する。
いくつかの実施形態において、本開示は、in vivoで分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する方法を提供する。いくつかの実施形態において、組成物は、分裂終了細胞を、in vivoで、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、または少なくとも9日の期間、in vivoで分裂するように誘発する。一実施形態において、分裂終了細胞の少なくとも約0.1%が、増殖及び/または細胞周期に再進入するように誘発される。別の実施形態において、分裂終了細胞の少なくとも約0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、5%、10%、15%が、増殖及び/または細胞周期に再進入するように誘発される。
議論されたように、分裂終了細胞(例えば心筋細胞)は、細胞周期調整遺伝子の発現を増加させるように改質され得る。細胞周期調整遺伝子、例えばサイクリン依存性キナーゼ(CDK)、サイクリン、及び/またはオーロラキナーゼは、核酸によりコードされてもよく、またはポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、細胞周期調整遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、オーロラキナーゼ、またはそれらの等価物を含む。他の実施形態において、細胞周期調整遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ及びサイクリンまたはそれらのそれぞれの等価物を含む。分裂終了細胞は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、オーロラキナーゼ、アクチン結合タンパク質アニリン(ANLN)、細胞分裂周期(CDC)タンパク質、カドヘリン、COP9シグナロソーム複合体サブユニット、カリン、GTPase活性化タンパク質、細胞質分裂のタンパク質調整因子及び/もしくはWNT1誘発性シグナル伝達経路タンパク質またはそれらの等価物の少なくとも1つ等の増殖及び/または細胞周期再進入因子を含む組成物の導入により改質され得る。分裂終了細胞は、(1)サイクリンB1(CCNB1)、オーロラキナーゼB(AURKB)及び周期依存性キナーゼ 1(CDK1);(2)CCNB1及びCDK1;(3)サイクリンD1(CCND1)、周期依存性キナーゼ4(CDK4);(4)CCNB1、CDK1、CCND1及びCDK4;(5)CCNB1、CCND1及びCDK4;またはそれらの任意の組み合わせ等の増殖及び/または細胞周期再進入因子を含む組成物の導入により改質され得る。
サイクリン依存性キナーゼ(CDK)は、その調整サイクリンとの複合化により細胞周期の進行を調整するように機能する。例えば、CDK1は、M期の間サイクリンB1(CCNB1)に結合して機能し、一方CDK2/サイクリンA複合体は、S期及びS/G2移行における進行を確実にし、CDK2/サイクリンEは、G1/S期の間の進行を促進する。Gerard et al.(2012)Frontiers in Physiol.3(413):1−18。
サイクリンは、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)を活性化することにより、細胞周期を通した細胞の進行を制御するように機能する。Galderisi et al.(2003)Oncogene 22(33):5208−5219。サイクリン−CDK複合体は、リン酸化により他のタンパク質を活性化し、これは一方で、細胞周期における特定のイベントの原因となる。サイクリンは、十分に特性決定されており、ファミリーに分類されている。例えば、サイクリンAファミリーは、CCNA1及びCCNA2の2つのメンバーからなり、一方、サイクリンBファミリーは、CCNB1、CCNB2及びCCNB3の3つのメンバーからなる。細胞周期の異なる期の間は、異なるサイクリンが活性である。例えば、サイクリンAは、合成期(S期)において活性であり、その間、DNAが複製され、G1期とG2期との間で生じる。一方、サイクリンDは、G1期からS期への移行を調整する。サイクリンBは、G2期からM期への進行を調整する。特に、サイクリンB1は、CDK1に結合する有糸分裂サイクリンとして機能し、細胞周期のM期における、及びM期外への細胞の進行に必要である。
オーロラキナーゼは、細胞周期制御に重要なセリン/トレオニン キナーゼである。Fu et al.(2007)Mol Cancer Res 5(1):1−10。これらのキナーゼは、細胞分裂中の染色分体の分離を制御するように機能する。現在まで、オーロラキナーゼA(AURKA)、オーロラキナーゼB(AURKB)及びオーロラキナーゼC(AURKC)の3つの哺乳動物オーロラキナーゼが特定されている。特に、AURKBは、部分的に、動原体への有糸分裂紡錘体の付着において特異的に機能する。
いくつかの実施形態において、分裂終了細胞(例えば分裂終了心筋細胞)は、分裂終了細胞を遺伝子的に改質する組成物を分裂終了細胞に投与することにより、増殖及び/または細胞周期に再進入するように誘発される。組成物は、細胞周期調整ポリペプチド、例えば、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及びオーロラキナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの核酸を含んでもよい(概して「少なくとも1つの核酸」と呼ばれる)。いくつかの実施形態において、オーロラキナーゼは、分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する組成物及び/または方法から明示的に除外される。
別の態様において、ポリペプチドは、当技術分野において知られている任意の方法を使用して分裂終了細胞内に導入され得る。タンパク質送達(すなわちタンパク質形質導入)は、ペプチドまたはタンパク質モチーフが細胞原形質膜を通過するプロセスである。ペプチドを細胞内に導入する方法は、例えば、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ナノ粒子、ウイルス様粒子(VLP)を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は、CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、AURKBまたはそれらの組み合わせ及び/もしくはそれらのそれぞれの等価物である。
別の態様において、本開示は、分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する方法であって、増殖及び/または細胞周期再進入を刺激するのに効果的な量の少なくとも1つの化学物質を含む組成物を細胞に投与することを含む方法を提供し、上記化学組成物は、サイクリン依存性キナーゼ、サイクリン、及びオーロラキナーゼ、またはそれらの等価物の発現を増加させることができる。他の実施形態において、方法は、細胞を、少なくとも1つのサイクリン依存性キナーゼ、少なくとも1つのサイクリン、またはそれらの等価物の発現を増加させる有効量の少なくとも1つの化学物質と接触させることを含む、または代替として本質的にそれからなる、またはさらにそれからなる。いくつかの実施形態において、化学物質は、CCNB1、CCND1、CDK1、CDK4、それらの組み合わせ及び/またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる。
分裂終了細胞(例えば分裂終了心筋細胞)は、上述のように(遺伝子的または非遺伝子的に)改質されてもよく、また、組成物に添加され得る1つ以上の追加の薬剤及び/または因子と接触させられてもよく、例えば、1つ以上の追加の薬剤及び/または因子は、培養培地または組成物への添加剤として含まれてもよい。
本開示はまた、増殖及び/または細胞周期再進入因子(例えば、CDK1、CCNB1、及びAURKBまたはそれらの等価物)を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞を提供する。
心臓血管疾患
一態様において、心臓血管疾患を処置するための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
一態様において、神経疾患を処置するための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
一態様において、膵臓疾患を処置するための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
一態様において、聴力損失を処置するための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
一態様において、筋肉量を増加させるための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む。
Aa = アミノ酸(複数可)
Bp = 塩基対(複数可)
H = 時間
G = グラム
Kb = キロベース
kDa = キロダルトン
Kg = キログラム
L = リットル
LC = 液体クロマトグラフィー
Mg = ミリグラム
Min = 分
mL = ミリリットル
mM = ミリモル
nM = ナノモル
nT = ヌクレオチド(複数可)
pM = ピコモル
s.d. = 標準偏差
μCi = マイクロキュリー
Μg = マイクログラム
μL = マイクロリットル
μΜ = マイクロモル
Μm = マイクロメートル
℃ = セ氏温度
A = アラニン
R = アルギニン
N = アスパラギン
D = アスパラギン酸
C = システイン
E = グルタミン酸
Q = グルタミン
G = グリシン
H = ヒスチジン
I = イソロイシン
L = ロイシン
K = リシン
M = メチオニン
F = フェニルアラニン
P = プロリン
S = セリン
T = トレオニン
W = トリプトファン
Y = チロシン
V = バリン
心筋細胞の細胞培養:
マウス心筋細胞を、Ieda et al.(2009)Dev.Cell 16(2):233−244に記載のように新生仔マウス(新生P0)及び成体(6週齢)から単離した。心筋細胞を、10%FBSを含有するDMEM/M199培地中で培養した。
マウスのゲノム規模での遺伝子発現分析を、Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Arrayを使用して行った。Trizol(Invitrogen)を使用して、新生仔マウス(新生P0)及び成体(6週齢)の心筋細胞からRNAを抽出した。Affymetrix Genechipプロトコルに従い、独立した生体試料から3回マイクロアレイ分析を行った。データは、Affymetrix Power Tool(APT、バージョン1.8.5)を使用して分析した。統計/閾値の組み合わせを使用して、差次的遺伝子発現を決定した。
Mohamed et al.,Cardiovasc Res.2014 Jul 1;103(1):47−59に従い、アデノウイルスを構築した。簡潔に説明すると、EGFP、CDK1、CCNB1及びAURKBのコード領域をPCRにより増幅し、pENTR(商標)/SD/D−TOPOシャトルベクターにサブクローニングした。アデノウイルスは、製造者の推奨方法に従ってGateway(登録商標)クローニングシステムを使用したpENTR(商標)/SD/D−TOPOシャトルベクターとpAd/CMV/V5−DESTベクター(Life Technologies)との間のホモログ組み換えにより生成した。アデノウイルス粒子は、アデノウイルスコードプラスミドをHEK293細胞にトランスフェクトすることにより生成し、塩化セシウムカラムを使用して精製し、滴定した。心筋細胞を感染させるために、25多重度(MOI)のアデノウイルスを24時間インキュベートし、次いで培地を新鮮な培地で置き換えた。
細胞を、室温で4%パラホルムアルデヒド中に15min固定し、サポニンで透過処理し、ブロックし、トロポニンT(cTnT)(Thermo Scientific)、ホスホヒストンH3(PHH3)(Life Technologies)に対する一次抗体と、次いでAlexa 488(緑)または594(赤)(Molecular Probes)、及び4′,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)(Invitrogen)と複合化した二次抗体と共にインキュベートした。
マッソントリクローム染色法のために、心筋梗塞から6週間後に心臓を採取し、パラフィン内に包理し、横方向に断面化した。脱パラフィン化した断面を、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン希釈標準溶液中に10min、ビーブリッヒ赤−酸性フクシン溶液中に15min、リンモリブデン−リンタングステン酸溶液中に15min、アニリンブルー溶液中に5〜10min、及び1%酢酸溶液中に2〜5min順次浸漬した。細胞注入心臓における免疫組織化学的試験のために、心臓を0.4%パラホルムアルデヒド中に一晩固定し、OCT化合物内に包理し、液体窒素中で凍結させた(Ieda et al.,2010、Ieda et al.,2009)。心臓を、両方の心室を示すように7μmの断面に垂直に切断した。断面をPHH3(S10)及びトロポニンT(cTnT)に対する一次抗体で、Alexa 488または594、及びDAPIと複合化した二次抗体で染色した。
CDK1、CCNB1及びAURKB、または対照アデノウイルスベクターを過剰発現する2ヶ月齢のhiPSC誘導心筋細胞を、培養物中で成長させた。EdU(5−エチニル−2´−デオキシウリジン;10μM)を、培養培地に30分間投与した。EdUの組み込みは、Click−iT EdU Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen Inc.)を使用して検出され、顕微鏡法により分析された。
CDK1、CCNB1及びAURKBを過剰発現するようにアデノウイルスで形質導入された心筋細胞を、24ウェルプレート内に4通りで播種し(ウェル当たり10,000細胞)、IncuCyte撮像装置(Essen BioSciences、Ann Arbor、MI、USA)を使用して細胞増殖について分析した。プレートを、IncuCyteにおいて1時間間隔で4日間走査した。データをIncuCyteソフトウェアで分析した。
CDK1AF、CCNB1、及びAURKBまたはGFP対照アデノウイルスを、Qian et al.,(2014)Nature 485(7400):593−8、Saxena et al.(2008)Circulation 117:2224−2231に記載のように、C57bl6/N心臓の心筋梗塞(MI)後の損傷部位に注射した。細胞増殖を評価するために梗塞から5日後に、または心臓機能を評価するため、及び組織学用に梗塞から6週間後に心臓を採取した。
CDK1AF、CCNB1及びAURKBまたはGFP対照アデノウイルスに感染させたマウスにおける駆出率(EF)を測定するために、2次元測定を使用して収縮機能を評価した。マウスを、1.75%イソフルランで麻酔した。コア温度を37〜38℃に維持し、無作為盲検的に走査を行った。パーセント駆出率(%EF)及び経時的なEFの低下が測定された。各マウスに対し、梗塞後3日目、10日目、24日目及び40日目に別個の走査を行った。
細胞周期遺伝子は、新生仔心筋細胞と成体心筋細胞との間で異なるように調整される
心臓細胞増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する潜在的因子を選択するために、マイクロアレイ分析を行って、新生仔(新生P0)マウス心筋細胞と成体(6週齢)マウス心筋細胞との間で異なるように発現した細胞周期遺伝子を特定した。増殖(新生仔)心筋細胞と非増殖(成体)心筋細胞との間で異なるように発現した代表的な細胞周期遺伝子を、図1に示す。
いずれか1つの遺伝子の過剰発現が、EdU組み込みにより検出される増殖及び/または細胞周期再進入を増加し得るかどうかを決定するために、成体心筋細胞における上から15の下方調整細胞周期遺伝子を試験した。AURKB(Aurora)、CCNB1、CDC5、CDK1、CDK2、CDK3、CENPA、COPS5、CUL3、CYK4、及びPRC1を過剰発現する心筋細胞は、EdU組み込みの増加を示した(図2、パネルA)。一方で、ANLN、CDH6及びWISP1の過剰発現は、対照と比較して、EdU組み込みの減少を示した(図2、パネルA)。増殖性細胞(EdU+)はまた、心臓細胞マーカーである心臓トロポニンT(cTnT)に対して染色陽性であった(図2、パネルB)。
次に、CDK1、CCNB1及びAURKBを過剰発現する心筋細胞の集団の細胞数の定量を行った。3つの独立した方法を使用した。増殖心筋細胞の定量では、72時間のCDK1、CCNB1及びAURKBの過剰発現に応じて核数が倍加することが示された(図4、パネルA)。さらに、全核の30%がPHH3に対して染色陽性であった。FACS分析では、CDK1、CCNB1及びAURKBを過剰発現する心筋細胞の集団における細胞数が、対照と比較して2倍増加することが示された(図4、パネルB)。FACSにより必要とされるような培養皿からの細胞の分離を必要とすることなく細胞数及び細胞生存率を試験するために、ATP Gloアッセイを行った。この方法を使用して、72時間のCDK1、CCNB1及びAURKBの過剰発現後の細胞数の2倍の増加が、FACS分析において報告されたものと同様に観察された(図4、パネルC)。
CDK1、CCNB1及びAURKBの過剰発現による心筋細胞増殖の誘発が、心筋損傷後に有益であるかどうかを決定するために、CDK1AF、CCNB1及びAURKBアデノウイルスまたは対照GFPアデノウイルスを、マウスの心筋梗塞後の損傷部位に注射した。梗塞から5日後、心臓は、対照GFP注射心臓と比較して、CDK1AF、CCNB1及びAURKB注射心臓における損傷部位で増殖の増加を示した(図8、パネルA)。さらに、梗塞から6週間後、CDK1AF、CCNB1及びAURKBが注射された5つの心臓のうち3つが、GFP対照と比較して、梗塞領域内の著しい量の心筋細胞を示した(図8、パネルB)。
ヒト分裂終了心筋細胞の細胞増殖及び/または細胞周期再進入を誘発するための因子の最適なカクテルを決定するために、因子の組み合わせをスクリーニングした。ヒト胚幹細胞誘導心筋細胞を、以前に説明されたように(Lian,X.et al.(2013)Nat Protoc 8(1):162−175)生成した。細胞を、TGF−βi(SB431542、「SB」)、CDK活性化剤(MK1775、「MK」)、及びIGF1の組み合わせあり、またはなしで、CDK1AF、CDK4、CCNB1、CCND1、AURKBまたはGFP対照アデノウイルスの組み合わせで処置した。因子カクテルでの処置から4日後、8日後及び12日後の増加したホスホ−ヒストンH3染色により評価されるように、有糸分裂を生じる細胞の数を増加させた因子のカクテルを特定するために、分析を行った。図10、パネルA。また、核の総数の増加により評価されるように、どの因子のカクテルが最も高い細胞生存率を有していたかを特定するために、分析を行った。図10、パネルB。
因子の異なるカクテルが分裂終了細胞の細胞増殖及び/または細胞周期再進入を促進する作用機序をより良く理解するために、蛍光ユビキチン細胞増殖インジケータ(FUCCI)技術を使用して細胞の細胞周期挙動を可視化した。Zielke et al.(2015)WIREs Dev Biol 4:469−487。このシステムを使用すると、M/G1期における細胞は赤色蛍光を発し(mCherry)、S/G2における細胞は緑色蛍光を発し(GFP)、Sにおける細胞は赤色及び緑色の蛍光を発する。CDK1、CCNB1、及びAURKBのカクテルの組み合わせ(パネルA)と、CDK4及びCCNDのカクテル(パネルB)ならびにCDK1、CCNB、CDK4及びCCNDのカクテル(パネルC)との比較では、CDK1、CCNB1、及びAURKBの組み合わせがG2カクテルとして作用し、G1またはSではなく、G2における細胞の数を上昇させることを示した。CDK4及びCCND1の組み合わせは、G1カクテルとして作用し、G2ではなくG1及びSにおける細胞の数を上昇させた。一方、CDK1、CCNB1、CDK4及びCCND1の組み合わせは、G1/G2細胞のバランスの取れた分布を誘発した。バランスの取れた分布は、細胞生存に役立つと考えられる。
CDK1/CCNB1/CDK4/CCND1のG1/G2カクテルが心筋梗塞後の心臓機能を改善し得るかどうかを決定するために、in vivo試験を行った。手術のための動物プロトコルは、University of California、San Francisco Institutional Animal Care and Use Committeeにより承認された。全ての手術は、以前に説明されたように行われた。Qian,L.,et al.(2012)Nature 485:593−598。簡潔に説明すると、マウスを2.4%イソフルラン/97.6%酸素で麻酔し、仰臥位で加熱パッド(37℃)上に設置した。動物に19Gスタンプ針を挿管し、MiniVent Type 845マウスベンチレータ(Hugo Sachs Elektronik−Harvard Apparatus;1回拍出量、250μl;呼吸速度、毎分120呼吸)を使用して、室内空気で通気した。Qian,L.,et al.(2012)Nature 485:593−598に記載のように、7−0プロレン縫合糸での左前下行(LAD)枝の永久的な結紮により心筋梗塞(MI)を誘発した。偽手術動物は手術対照として役立ち、LADが結紮されていないことを除いて、実験動物と同じ手順に供した。MIの時点で、動物の心筋にG1/G2カクテルを注射した。
G1/G2カクテルがまた分裂終了ニューロンの細胞増殖及び/または細胞周期再進入を誘発し得るかどうかを決定するために、Arrasate,M.et al.(2005)Proc Natl Acad Sci USA 102(10):3840−3845において報告されているように、新生仔ラット(P16〜18)から皮質ニューロンの一次培養物を調製した。大脳皮質を切除し、パパインで、次いでトリプシン阻害剤で処置し、穏やかに研和して、Optimem_glucose培地内で単一ニューロンを分離させた。96ウェル組織培養プレートの各ウェルに、細胞(約150,000)を播種した。2時間後、播種培地を、血清を含む成長培地で置き換えた。細胞が成熟ニューロンであることを示すために、形態マーカーとしてのpGW1−GFP及び神経特異的プロモーターMAP2−DsRedでそれらの細胞を標識化した。分裂細胞を特定するために、経時的顕微鏡法を行った。図15に示されるように、G1/G2カクテルは、分裂終了ニューロンの細胞分裂を誘発した。さらに、G1/G2カクテルにより感染後60〜90時間の間でほとんどの分裂が生じ、一方いくつかの分裂は、感染後120時間という遅い時期に生じることが決定された。図16。
G1/G2カクテルが分裂終了膵臓β細胞の細胞増殖及び/または細胞周期再進入を誘発し得るかどうかを決定するために、例えばClardy et al.(2015)Scientific Reports 5:13681に記載の方法により、他の非β細胞部分集団からβ細胞を精製する。精製β細胞を組織培養プレート内に播種し、G1/G2アデノウイルスカクテルまたは偽アデノウイルス対照で処置する。G1/G2カクテルで処置されたβ細胞は、感染から48時間後、72時間後及び96時間後に細胞分裂の増加を示す。偽カクテルで処置されたβ細胞は、細胞分裂の増加を示さない。
G1/G2カクテルがまた内耳の分裂終了有毛細胞の細胞増殖及び/または細胞周期再進入を誘発し得るかどうかを決定するために、Ronaghi M et al.(2014)Stem Cells Dev 23(11)1275−1284に記載のものに類似した方法を使用して、人工多能性幹細胞からn vitroで内耳細胞を誘導する。分化内耳細胞を組織培養プレート内に播種し、G1/G2アデノウイルスカクテルまたは偽アデノウイルス対照で処置する。G1/G2カクテルで処置された細胞は、感染から48時間後、72時間後及び96時間後に細胞分裂の増加を示す。偽カクテルで処置された細胞は、細胞分裂の増加を示さない。
配列番号1
ヒトCDK1
遺伝子ID:983
mRNA:NM_001786(転写変異体1)、CDS(143..1036)
ヒトCDK1
ヒトサイクリンB1(CCNB1)
遺伝子ID:891
mRNA:NM_031966.3、CDS(254..1555)
ヒトサイクリンB1(CCNB1)
ヒトオーロラキナーゼB(AURKB)
遺伝子ID:9212
mRNA:NM_004217.3(転写変異体1)、CDS(123..1157)
ヒトオーロラキナーゼB(AURKB)
マウスCDK1
遺伝子ID:12534
mRNA:NM_007659.3、CDS(104..997)
マウスCDK1
アミノ酸配列
マウスサイクリンB1(CCNB1)
遺伝子ID:268697
mRNA:NM_172301.3、CDS(85..1377)
マウスサイクリンB1(CCNB1)
アミノ酸配列
マウスオーロラキナーゼB(AURKB)
遺伝子ID:20877
mRNA:NM_011496.1、CDS(319..1356)
マウスオーロラキナーゼB(AURKB)
アミノ酸配列
ヒトCDK4
mRNA:KR709911
ヒトCDK4
アミノ酸配列
ヒトCCND1
mRNA:NM_053056
ヒトCCND1
アミノ酸配列
マウスCDK4
mRNA:NM_009870
マウスCDK4
アミノ酸配列
マウスCCDN1
mRNA:NM_007631.2
マウスCCND1
アミノ酸配列
(構成1)
分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する方法であって、前記分裂終了細胞を、有効量の少なくとも1つのサイクリン依存性キナーゼ(CDK)及び少なくとも1つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を含む組成物と接触させ、それにより前記分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発することを含む方法。
(構成2)
前記接触させることは、in vitroまたはin vivoで行われる、構成1に記載の方法。
(構成3)
前記細胞を、有効量のCDK活性化剤、形質転換成長因子β阻害剤、またはそれらの組み合わせと接触させることをさらに含む、構成1に記載の方法。
(構成4)
前記CDK活性化剤は、CDK1活性化剤である、構成3に記載の方法。
(構成5)
前記分裂終了細胞は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される、構成1に記載の方法。
(構成6)
前記サイクリン依存性キナーゼ(CDK)及び/または前記サイクリンは、核酸によりコードされる、構成1に記載の方法。
(構成7)
前記核酸は、改質mRNAである、構成6に記載の方法。
(構成8)
前記核酸は、構成的に発現される、構成6に記載の方法。
(構成9)
前記サイクリンは、サイクリンA、サイクリンB、サイクリンD、及びサイクリンEからなる群から選択される、構成1に記載の方法。
(構成10)
前記サイクリンBは、サイクリンB1(CCNB1)である、構成9に記載の方法。
(構成11)
前記サイクリンDは、サイクリンD1(CCND1)である、構成9に記載の方法。
(構成12)
前記CDKは、CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、及びCDK6からなる群から選択される、構成1に記載の方法。
(構成13)
前記CDKは、CDK1である、構成1に記載の方法。
(構成14)
前記CDKは、CDK4である、構成1に記載の方法。
(構成15)
前記CDKは、構成的に発現される、構成1に記載の方法。
(構成16)
前記CDKは、CDK1であり、前記サイクリンは、CCNB1である、構成1に記載の方法。
(構成17)
前記組成物は、CDK4、CCND1、またはその両方をさらに含む、構成16に記載の方法。
(構成18)
少なくとも1つのCDK及び少なくとも1つのサイクリン、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞。
(構成19)
CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、単離された増殖性分裂終了細胞。
(構成20)
CDK4、CCND1、またはその両方を過剰発現するようにさらに改質されている、構成19に記載の細胞。
(構成21)
前記分裂終了細胞は、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される、構成18または19に記載の細胞。
(構成22)
心臓血管疾患を処置するための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
(構成23)
CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む、構成22に記載の方法。
(構成24)
心臓血管疾患を処置するための方法であって、有効量の構成18に記載の増殖性分裂終了細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
(構成25)
前記増殖性分裂終了細胞は、増殖性心筋細胞である、構成24に記載の方法。
(構成26)
前記増殖性心筋細胞は、CDK1及びCCNB1、またはそれらの等価物を過剰発現するように改質されている、構成25に記載の方法。
(構成27)
前記増殖性心筋細胞は、CDK4、CCND1、またはその両方を過剰発現するように改質されている、構成25に記載の方法。
(構成28)
神経疾患を処置するための方法であって、CDK1及びCCNB1、またはそれらの等価物の発現を増加させる有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
(構成29)
CDK4、CCND1、またはその両方の発現を増加させる有効量の組成物を投与することをさらに含む、構成28に記載の方法。
(構成30)
神経疾患を処置するための方法であって、有効量の構成18に記載の増殖性分裂終了細胞の集団を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
(構成31)
前記増殖性分裂終了細胞は、増殖性神経細胞である、構成30に記載の方法。
(構成32)
前記増殖性神経細胞は、CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物を過剰発現するように改質されている、構成31に記載の方法。
(構成33)
前記増殖性神経細胞は、CDK4、CCND1、またはその両方を過剰発現するように改質されている、構成31に記載の方法。
Claims (18)
- 周期依存性キナーゼ4(CDK4)及びサイクリンD1(CCND1)、またはそれらのそれぞれの等価物;及びG2カクテルを含む、分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発するための組成物であって、該G2カクテルが:
a)周期依存性キナーゼ1(CDK1)及びサイクリンB1(CCNB1)、またはそれらのそれぞれの等価物;または
b)MK1775及びSB431542を含む、前記組成物。 - 前記周期依存性キナーゼ4(CDK4)及びサイクリンD1(CCND1)、またはそれらのそれぞれの等価物が、前記分裂終了細胞とin vitroまたはin vivoで接触されるように用いられる、請求項1に記載の組成物。
- 前記G2カクテルが、周期依存性キナーゼ1(CDK1)及びサイクリンB1(CCNB1)、またはそれらのそれぞれの等価物を含む、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記分裂終了細胞が、心筋細胞、神経細胞、膵臓細胞、有毛細胞、及び骨格筋細胞からなる群から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記分裂終了細胞が、心筋細胞である、請求項4に記載の組成物。
- 前記分裂終了細胞が、神経細胞である、請求項4に記載の組成物。
- 前記CDK4及び/または前記CCND1が、核酸によりコードされる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記核酸が、改質mRNAである、請求項7に記載の組成物。
- 前記核酸が、構成的に発現される、請求項7または8に記載の組成物。
- 分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発する方法であって、該分裂終了細胞を、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物とin vitroで接触させ、それにより該分裂終了細胞の増殖及び/または細胞周期再進入を誘発することを含む、前記方法。
- 周期依存性キナーゼ4(CDK4)及びサイクリンD1(CCND1)、またはそれらのそれぞれの等価物;及びG2カクテルを含む、心臓血管疾患または神経疾患を処置するための医薬組成物であって、該G2カクテルが:
a)周期依存性キナーゼ1(CDK1)及びサイクリンB1(CCNB1)、またはそれらのそれぞれの等価物;または
b)MK1775及びSB431542を含む、前記医薬組成物。 - 周期依存性キナーゼ4(CDK4)及びサイクリンD1(CCND1)、またはそれらのそれぞれの等価物を含む、心臓血管疾患または神経疾患を処置するための医薬組成物であって、
CDK1及びCCNB1、またはそれらのそれぞれの等価物の発現を増加させる該組成物が、G2カクテルとともに投与されるように用いられ、
該G2カクテルが:
a)周期依存性キナーゼ1(CDK1)及びサイクリンB1(CCNB1)、またはそれらのそれぞれの等価物;または
b)MK1775及びSB431542を含む、前記医薬組成物。 - 前記G2カクテルが、周期依存性キナーゼ1(CDK1)及びサイクリンB1(CCNB1)、またはそれらのそれぞれの等価物を含む、請求項11または12に記載の医薬組成物。
- 前記CDK4及び/または前記CCND1が、核酸によりコードされる、請求項11、12または13に記載の医薬組成物。
- 前記核酸が、改質mRNAである、請求項14に記載の医薬組成物。
- 前記核酸が、構成的に発現される、請求項14または15に記載の医薬組成物。
- 心臓血管疾患または神経疾患を処置するための、請求項11〜16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 神経疾患を処置するための、請求項11〜16のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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