CN114615985A - 包含修饰mRNA的分子的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及组合物，其包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA、编码肌细胞增强因子2C的modRNA、编码T‑box 5的modRNA、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA、编码显性负性转化生长因子β的modRNA和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modRNA，其中所述modRNA的分子以一定比例存在于所述组合物中。本公开还涉及药物组合物，增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，治疗心脏损伤的方法，刺激血管再生的方法，治疗卒中的方法，以及增强伤口愈合的方法。

Description

包含修饰mRNA的分子的组合物及其使用方法

本申请要求于2019年9月11日提交的美国临时专利申请系列号62/898,958的权益，其通过援引整体并入本文。

本发明是在国立卫生研究院授予的HL142768-01和RO1 HL149137-01的政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

序列表

本申请包含于2020年9月11日创建的序列表；ASCII格式的文件被命名为3710049AWO_序列表_ST25.txt，并且大小为116千字节。该文件通过援引整体据此并入本申请中。

技术领域

本公开总体上涉及包含修饰mRNA的分子的组合物及其使用方法。

背景技术

缺血性心脏病在西方世界仍然是发病率和死亡率的主要原因，引起重大的社会和经济负担。问题在于心肌梗死(MI)后心肌细胞(CM)的大量损失，伴随心脏成纤维细胞的相应增加和瘢痕组织的出现。增加、促进、恢复或以其他方式刺激心肌细胞的数量或生长的能力将对用于恢复MI和其他心脏损伤的治疗提供非常有利的改进，其中心肌细胞的数量少或损失损害心脏的功能、健康或修复。可能性包括修饰参与来自前体或来自其他细胞类型的心肌细胞的发育的细胞因子的活性并促进心肌细胞健康和/或增殖。然而，难以识别和修饰相关细胞因子和信号传导途径的活性以及缺乏对其的理解妨碍了这样的目标。由于递送基因的不受控且低效率，因此难以在细胞内基因座处用调节基因编码产物的表达的处理来修饰靶向途径。此外，缺乏对为了获得所需的心肌细胞增加而靶向的细胞因子或因子以及相对量的理解妨碍了这样的目标。

成年哺乳动物心脏具有非常有限的再生能力；因此，在缺血性损伤时，大量的CM死亡，并被非收缩、富含胶原的心脏瘢痕组织代替，所述瘢痕组织在损伤后数周内被称为重塑的过程中形成。直接将瘢痕细胞(即，非CM)重编程为功能性CM是研究者目前评估的一种策略/方法，作为克服在缺血性损伤后这种缺乏CM和左心室(LV)中添加非CM的方法。

在2010年，Idea等人在14个转录因子中识别了3个(Gata4、Mef2C和Tbx5(GMT))，它们可以将心脏或尾尖成纤维细胞重编程为CM样细胞。Ieda等人，“Direct Reprogrammingof Fibroblasts Into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors,”Cell 142:375-86(2010)。从那时起，大量的出版物已经确定GMT可以诱导心脏重编程。Abad等人，“Notch Inhibition Enhances Cardiac Reprogramming by Increasing MEF2CTranscriptional Activity,”Stem Cell Reports 8:548-560(2017)；Christoforou等人，“Transcription Factors MYOCD,SRF,Mesp1 and SMARCD3 Enhance the Cardio-Inducing Effect of GATA4,TBX5,and MEF2C During Direct CellularReprogramming,”PLoS One 8:e63577(2013)；Fu等人，“Direct Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiomyocyte-Like State,”Stem Cell Reports 1:235-47(2013)；Hirai等人，“Accelerated Direct Reprogramming of Fibroblasts IntoCardiomyocyte-like Cells With the MyoD Transactivation Domain,”CardiovascRes.100:105-13(2013)；Ifkovits等人，“Inhibition of TGFβSignaling IncreasesDirect Conversion of Fibroblasts to Induced Cardiomyocytes,”PLoS One.9:e89678(2014)；Mohamed等人，“Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo DirectCardiac Reprogramming,”Circulation 135:978-995(2017)；Muraoka等人，“MiR-133Promotes Cardiac Reprogramming by Directly Repressing Snai1 and SilencingFibroblast Signatures,”EMBO J.33:1565-81(2014)；Nam等人，“Induction of DiverseCardiac Cell Types by Reprogramming Fibroblasts With Cardiac TranscriptionFactors,”Development141:4267-78(2014)；Nam等人，“Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiac Fate,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 110:5588-93(2013)；Qian等人，“In Vivo Reprogramming of Murine Cardiac Fibroblasts IntoInduced Cardiomyocytes,”Nature 485:593-8(2012)；Singh等人，“MiR-590PromotesTransdifferentiation of Porcine and Human Fibroblasts Toward a Cardiomyocyte-Like Fate by Directly Repressing Specificity Protein 1,”J.Am.Heart Assoc.5(2016)；Song等人，“Heart Repair by Reprogramming Non-Myocytes With CardiacTranscription Factors,”Nature 485:599-604(2012)；Wada等人，“Induction of HumanCardiomyocyte-Like Cells From Fibroblasts by Defined Factors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.110:12667-72(2013)；Yamakawa等人，“Fibroblast GrowthFactors and Vascular Endothelial Growth Factor Promote Cardiac Reprogrammingunder Defined Conditions,”Stem Cell Reports 5:1128-1142(2015)；和Zhao等人，“High-Efficiency Reprogramming of Fibroblasts Into Cardiomyocytes RequiresSuppression of Pro-Fibrotic Signalling,”Nat.Commun.6:8243(2015)。几个研究小组已经表明，对于人类心脏重编程，向GMT添加心肌素(Myocd)对于成功的重编程是必要的。Christoforou等人，“Transcription Factors MYOCD,SRF,Mesp1 and SMARCD3 Enhancethe Cardio-Inducing Effect of GATA4,TBX5,and MEF2CDuring Direct CellularReprogramming,”PLoS One 8:e63577(2013)；Fu等人，“Direct Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiomyocyte-Like State,”Stem Cell Reports 1:235-47(2013)；Mohamed等人，“Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo DirectCardiac Reprogramming,”Circulation 135:978-995(2017)；Muraoka等人，“MiR-133Promotes Cardiac Reprogramming by Directly Repressing Snai1 and SilencingFibroblast Signatures,”EMBO J.33:1565-81(2014)；Nam等人，“Induction of DiverseCardiac Cell Types by Reprogramming Fibroblasts With Cardiac TranscriptionFactors,”Development 141:4267-78(2014)；Wada等人，“Induction of HumanCardiomyocyte-Like Cells From Fibroblasts by Defined Factors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.110:12667-72(2013)；和Addis等人，“Optimization ofDirect Fibroblast Reprogramming to Cardiomyocytes Using Calcium Activity as aFunctional Measure of Success,”J.Mol.Cell Cardiol.60:97-106(2013)。此外，其他研究表明，将碱性螺旋-环-螺旋转录因子Hand2加入GMT(GMTH)导致更高的重编程效率。Abad等人，“Notch Inhibition Enhances Cardiac Reprogramming by Increasing MEF2CTranscriptional Activity,”Stem Cell Reports 8:548-560(2017)；Hirai等人，“Accelerated Direct Reprogramming of Fibroblasts Into Cardiomyocyte-likeCells With the MyoD Transactivation Domain,”Cardiovasc Res.100:105-13(2013)；Ifkovits等人，“Inhibition of TGFβSignaling Increases Direct Conversion ofFibroblasts to Induced Cardiomyocytes,”PLoS One.9:e89678(2014)；Nam等人，“Induction of Diverse Cardiac Cell Types by Reprogramming Fibroblasts WithCardiac Transcription Factors,”Development 141:4267-78(2014)；Nam等人，“Reprogramming of Human Fibroblasts Toward a Cardiac Fate,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 110:5588-93(2013)；Song等人，“Heart Repair byReprogramming Non-Myocytes With Cardiac Transcription Factors,”Nature485:599-604(2012)；Yamakawa等人，“Fibroblast Growth Factors and Vascular EndothelialGrowth Factor Promote Cardiac Reprogramming under Defined Conditions,”StemCell Reports 5:1128-1142(2015)；和Zhao等人，“High-Efficiency Reprogramming ofFibroblasts Into Cardiomyocytes Requires Suppression of Pro-FibroticSignalling,”Nat.Commun.6:8243(2015)。

迄今为止，心脏重编程存在两个主要障碍：一个障碍是GMT和GMTH的效率差，另一个障碍是使用病毒转染(主要是逆转录病毒或慢病毒)和小分子，这可能导致有害的副作用和监管安全问题。用GMT进行CM重编程的最初研究表明体外4.8％重编程效率(cTnT⁺细胞)(Ieda等人，“Direct Reprogramming of Fibroblasts Into Functional Cardiomyocytesby Defined Factors,”Cell 142:375-86(2010))和体内12％转化成CM样细胞(α-肌球蛋白重链(αMHC)⁺细胞)，如通过谱系追踪小鼠MI模型所示。Qian等人，“In Vivo Reprogrammingof Murine Cardiac Fibroblasts Into Induced Cardiomyocytes,”Nature 485:593-8(2012)。此外，将Hand2与Notch抑制剂和AKT激酶一起添加到GMT中将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的重编程效率提高至70％(Abad等人，“Notch Inhibition Enhances CardiacReprogramming by Increasing MEF2C Transcriptional Activity,”Stem Cell Reports8:548-560(2017))，同时GMTH与几种不同的微RNA(miR)和小分子的组合导致约60％的重编程效率。Zhao等人，“High-Efficiency Reprogramming of Fibroblasts IntoCardiomyocytes Requires Suppression of Pro-Fibrotic Signalling,”Nat.Commun.6:8243(2015)。用GMT或GMTH进行体内重编程表明，12％或6.5％的非CM转化成CM样细胞(Qian等人，“In Vivo Reprogramming of Murine Cardiac Fibroblasts Into InducedCardiomyocytes,”Nature 485:593-8(2012)和Song等人，“Heart Repair byReprogramming Non-Myocytes With Cardiac Transcription Factors,”Nature 485:599-604(2012))，尽管在这两种情况下，这种中等效率确实改善了MI结果。Qian等人，“InVivo Reprogramming of Murine Cardiac Fibroblasts Into InducedCardiomyocytes,”Nature 485:593-8(2012)和Song等人，“Heart Repair byReprogramming Non-Myocytes With Cardiac Transcription Factors,”Nature 485:599-604(2012)。然而，迄今为止，重编程研究已经使用慢病毒或逆转录病毒递送系统将重编程基因递送至非CM。Ieda等人，“Direct Reprogramming of Fibroblasts IntoFunctional Cardiomyocytes by Defined Factors,”Cell 142:375-86(2010)；Abad等人，“Notch Inhibition Enhances Cardiac Reprogramming by IncreasingMEF2CTranscriptional Activity,”Stem Cell Reports 8:548-560(2017)；Christoforou等人，“Transcription Factors MYOCD,SRF,Mesp1 and SMARCD3 Enhance the Cardio-Inducing Effect of GATA4,TBX5,and MEF2C During Direct CellularReprogramming,”PLoS One 8:e63577(2013)；Fu等人，“Direct Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiomyocyte-Like State,”Stem Cell Reports 1:235-47(2013)；Hirai等人，“Accelerated Direct Reprogramming of Fibroblasts IntoCardiomyocyte-like Cells With the MyoD Transactivation Domain,”CardiovascRes.100:105-13(2013)；Ifkovits等人，“Inhibition of TGFβSignaling IncreasesDirect Conversion of Fibroblasts to Induced Cardiomyocytes,”PLoS One.9:e89678(2014)；Mohamed等人，“Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo DirectCardiac Reprogramming,”Circulation 135:978-995(2017)；Muraoka等人，“MiR-133Promotes Cardiac Reprogramming by Directly Repressing Snai1 and SilencingFibroblast Signatures,”EMBO J.33:1565-81(2014)；Nam等人，“Induction of DiverseCardiac Cell Types by Reprogramming Fibroblasts With Cardiac TranscriptionFactors,”Development 141:4267-78(2014)；Nam等人，“Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiac Fate,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 110:5588-93(2013)；Qian等人，“In Vivo Reprogramming of Murine Cardiac Fibroblasts IntoInduced Cardiomyocytes,”Nature 485:593-8(2012)；Singh等人，“MiR-590PromotesTransdifferentiation of Porcine and Human Fibroblasts Toward a Cardiomyocyte-Like Fate by Directly Repressing Specificity Protein 1,”J.Am.Heart Assoc.5(2016)；Song等人，“Heart Repair by Reprogramming Non-Myocytes With CardiacTranscription Factors,”Nature485:599-604(2012)；Wada等人，“Induction of HumanCardiomyocyte-Like Cells From Fibroblasts by Defined Factors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.110:12667-72(2013)；Yamakawa等人，“Fibroblast GrowthFactors and Vascular Endothelial Growth Factor Promote Cardiac Reprogrammingunder Defined Conditions,”Stem Cell Reports 5:1128-1142(2015)；Zhao等人，“High-Efficiency Reprogramming of Fibroblasts Into Cardiomyocytes RequiresSuppression of Pro-Fibrotic Signalling,”Nat.Commun.6:8243(2015)；和Addis等人，“Optimization of Direct Fibroblast Reprogramming to Cardiomyocytes UsingCalcium Activity as a Functional Measure of Success,”J.Mol.Cell Cardiol.60:97-106(2013)。使用这些病毒基因递送方法进入心脏的根本问题是心肌炎症和插入诱变的可能性。Wasala等人，“The Evolution of Heart Gene Delivery Vectors,”J.GeneMed.13:557-65(2011)。此外，现有方法引起心脏发育基因的长期增加，该基因在正常条件下瞬时表达，因此可能在较长时期内产生不利的影响。Gata4过表达可能诱导心脏肥大(Liang等人，“The Transcription Factors GATA4 and GATA6 Regulate CardiomyocyteHypertrophy In Vitro and In Vivo,”J.Biol.Chem.276:30245-53(2001))，并且增加的Hand2表达与心脏缺陷相关(Tamura等人，“Overdosage of Hand2 Causes Limb and HeartDefects in the Human Chromosomal Disorder Partial Trisomy Distal 4q,”Hum.Mol.Genet.22:2471-81(2013))。因此，在不损害基因组完整性的情况下，瞬时的、非免疫原性基因递送重编程方法具有优于现有方法的优点。

修饰mRNA(modRNA)是安全的、非免疫原性的、瞬时基因递送方法，其不具有基因组整合的风险。这个小组和其他组已经使用modRNA来将基因递送到损伤后心脏中。Carlsson等人，“Biocompatible,Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function afterIntracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine,”Mol.Ther.Methods Clin.Dev.9:330-346(2018)；Magadum等人，“Ablation of a SingleN-Glycosylation Site in Human FSTL 1Induces Cardiomyocyte Proliferation andCardiac Regeneration,”Mol.Ther.Nucleic Acids 13:133-143(2018)；Zangi等人，“Modified mRNA Directs the Fate of Heart Progenitor Cells and InducesVascular Regeneration After Myocardial Infarction,”Nat.Biotechnol.31:898-907(2013)；和Zangi等人，“Insulin-Like Growth Factor 1Receptor-Dependent PathwayDrives Epicardial Adipose Tissue Formation After Myocardial Injury,”Circulation 135:59-72(2017)。心脏中的modRNA的药代动力学允许基因表达在递送后迅速启动并持续多达10天。Sultana等人，“Optimizing Cardiac Delivery of ModifiedmRNA,”Mol.Ther.25:1306-1315(2017)。modRNA已在体外直接用于将人成纤维细胞重编程为肝细胞并将间充质干细胞重编程为神经样细胞(Kim等人，“Single-Factor SOX2Mediates Direct Neural Reprogramming of Human Mesenchymal Stem Cells viaTransfection of In Vitro Transcribed mRNA,”Cell Transplant.27:1154-1167(2018)和Simeonov等人，“Direct Reprogramming of Human Fibroblasts to Hepatocyte-LikeCells by Synthetic Modified mRNAs,”PLoS One.9:e100134(2014))，然而，尚未报告任何研究使用modRNA进行体内直接重编程。

本公开旨在克服本领域中的这些和其他缺陷。

发明内容

第一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA(modRNA)(G)、编码肌细胞增强因子2C的modRNA(M)、编码T-box 5的modRNA(T)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA(H)、编码显性负性转化生长因子β的modRNA(dnT)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modRNA(dnW)，其中所述modRNA的分子以G:M:T:H:dnT:dnW的比例存在于所述组合物中。

在实例中，所述比例为1:1:1:1:1:1。在另一实例中，所述比例为2:2:2:2:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为2:1:1:1:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:1:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:2:1:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:1:2:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:2:0.5:0.5。在一种实例中，当组合物包括G:M:T:H:dnT:dnW的比例时，M以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。在一种实例中，当组合物包括G:M:T:H:dnT:dnW的比例时，H以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

另一方面涉及药物组合物，其包括前述组合物或其实例以及药学上可接受的载体。

另一方面涉及增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与前述组合物或其实例接触。在实例中，所述非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。

另一方面涉及治疗心脏损伤的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。在实例中，心脏损伤包括心肌梗死。在另一实例中，心脏损伤包括再灌注损伤。

另一方面涉及在缺血性损害后刺激血管再生的方法，其包括使缺血性损害所损害的组织与前述组合物或其实例接触。

另一方面涉及治疗卒中的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

另一方面涉及增强伤口愈合的方法，其包括向需要此类增强的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

另一方面涉及刺激骨骼肌再生的方法，其包括向需要此类刺激的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

另一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA(modRNA)(G)、编码肌细胞增强因子2C的modRNA(M)、编码T-box 5的modRNA(T)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA(H)、编码酸性神经酰胺酶的modRNA(A)、编码显性负性转化生长因子β的modRNA(dnT)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modRNA(dnW)，其中所述modRNA的分子以G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例存在于所述组合物中。

在实例中，所述比例为1:1:1:1:1:1:1。在另一实例中，所述比例为2:2:2:2:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为2:1:1:1:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:1:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:2:1:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:1:1:2:0.7:0.7:0.7。在另一实例中，所述比例为1:2:1:2:0.5:0.5:0.5。在一种实例中，当组合物包括G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例时，M以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。在一种实例中，当组合物包括G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例时，H以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

另一方面涉及药物组合物，其包括前述组合物或其实例以及药学上可接受的载体。

另一方面涉及增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与前述组合物或其实例接触。在实例中，所述非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。

另一方面涉及治疗心脏损伤的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。在实例中，心脏损伤包括心肌梗死。在另一实例中，心脏损伤包括再灌注损伤。

另一方面涉及在缺血性损害后刺激血管再生的方法，其包括使缺血性损害所损害的组织与前述组合物或其实例接触。

另一方面涉及治疗卒中的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

另一方面涉及增强伤口愈合的方法，其包括向需要此类增强的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

另一方面涉及刺激骨骼肌再生的方法，其包括向需要此类刺激的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

缺血性心脏病在工业化世界仍然是发病率和死亡率的主要原因，引起重大的社会和经济负担。在体内将非心肌细胞(非CM)重编程为心肌细胞(CM)样细胞是有前景的心脏再生策略。然而，现有的基于病毒的基因转移递送方法具有低且无规律的转导效率，这使这些技术难以应用于临床。在此，修饰mRNA(modRNA)基因递送平台用于递送4种心脏重编程基因(Gata4(G)、Mef2c(M)、Tbx5(T)和Hand2(H))以及3种重编程辅助基因(显性负性(DN)-TGFβ、DN-Wnt8a和酸性神经酰胺酶(AC))以诱导心脏重编程。已经表明，与常规的单独的Gata4、Mef2C和Tbx5(GMT)(28％)相比，称为7G的心脏重编程基因和辅助基因的modRNA混合物使心脏重编程效率加倍(57％)。重要的是，重复的7G modRNA转染导致在体外提高CM并且完成心脏重编程。然而，使用谱系追踪心肌梗死(MI)小鼠模型，确定了在MI时7G modRNA混合物的一次递送部分地重编程约25％的瘢痕区域中的非CM。令人感兴趣的是，在患有MI的小鼠中递送7G-modRNA混合物显著改善了心脏功能、瘢痕大小和长期存活率，以及毛细血管密度。从机理上讲，显示了在MI后28天，7G modRNA导致了在部分重编程的细胞中的15个关键血管生成因子的显著上调。此外，显示了7G modRNA混合物导致ApoE^-/-小鼠后肢缺血性模型中的新生血管形成，表明7G-modRNA混合物给药促进心肌和骨骼肌缺血性损伤后的血管再生。这种方法不仅具有高效率，而且具有高安全范围用于临床。

在本公开中，评估了组合modRNA混合物在缺血性条件下直接心脏重编程非CM的功效。还评估了在体内心脏和骨骼肌中部分心脏重编程的有益效果。

附图说明

当参考附图阅读以下具体实施方式时，本公开的这些和其他的特征、方面和优点将变得更好理解，其中：

图1示出了根据本公开的方面的一些实例组合物。

图2示出了根据本公开的方面的不同组合物对肌细胞样细胞数的影响。

图3示出了根据本公开的方面的不同组合物对心脏射血分数的影响。

图4示出了根据本公开的方面的不同组合物对心输出量的影响。

图5示出了根据本公开的方面的不同组合物对每搏量(每搏输出量)的影响。

图6示出了根据本公开的方面的不同组合物对缩短分数的百分比变化的影响。

图7示出了根据本公开的方面的不同组合物对心肌梗死尺寸百分比的影响。

图8示出了根据本公开的方面的不同组合物对心脏毛细血管密度的影响。

图9示出了根据本公开的方面的不同组合物对心脏VEGF-A表达的影响。

图10A-图10P例示了重编程策略和筛选诱导心肌细胞重编程的基因。图10A显示了用于测试候选心肌细胞诱导因子的方法的策略说明。从转基因小鼠分离的心脏细胞分选mCherry阴性细胞以消除心肌细胞。图10B显示蛋白质印迹(WB)的实验时间线。图10C显示用GFP、GATA4、MEF2C、TBX5 modRNA转染的mCherry阴性细胞的WB分析来了解将非心肌细胞重编程为心肌细胞的转染策略。图10D是用不同的重编程基因转染mCherry阴性细胞的时间线的示意图。图10E和图10F是显示通过从用Gata4、Mef2c和Tbx5(GMT)或GMT加Hand2(GMTH)或GMTH加AC(GMTHA)和小分子抑制剂(SMI)(a n＝10,b n＝7,c n＝5并且d n＝6)重编程14天的非CM提取的RNA的定量聚合酶链反应(qPCR)测定的主要心脏基因(cTNT和α-MHC)的表达的图形。图10G显示了用重编程基因加SMI转染的细胞的心脏标志物α-MHC/α-辅肌动蛋白的代表性免疫染色图像。图10H显示10G的百分比定量。图10I和图10J显示通过qPCR(a n＝10,d n＝6,e n＝8,f n＝4,g n＝4和h n＝4)测定的在GMTHA+SMI和GMTHA加SMI替代基因转染后14天评估的mCherry阴性细胞中cTNT和α-MHC的mRNA表达。图10K显示在用GMTHA+SMI和GMTHA加SMI替代基因第一次转染后14天，mCherry阴性细胞中α-辅肌动蛋白的免疫荧光染色。图10L显示10K的百分比定量。图10M显示在7G转染14天后，非CM中的成纤维细胞标志物的相对表达(Luc n＝4,7G n＝4)。图10N显示14天后mCherry阴性细胞的7G转染策略。图10O和图10P显示mCherry阴性细胞的代表性免疫染色图像，显示用7G转染(分别)21天和28天后α-辅肌动蛋白的条纹。图10E和图10F、图10I和图10J、图10H和图10L是单向ANOVA、Tukey多重比较检验。对于m进行非配对双尾t检验。****,P<0.0001,**,P<0.01,N.S,不显著。比例尺＝10μm。

图11A-图11F显示7种基因中不同的化学计量影响体外心脏成纤维细胞的重编程效率。图11A是使用FACS分选从α-MHC转基因小鼠中分离mCherry阴性细胞，并以不同比例的7种基因以3天间隔转染它们用于心脏重编程实验的示意图。图11B是显示具有不同比例的7种基因的转染组的表。图11C和图11D显示在用不同的基因比例转染后14天分别评估的mCherry阴性细胞中cTNT和αMHC的mRNA相对表达，通过qPCR测定(a n＝10,b n＝8,c n＝2,d n＝2,e n＝2,f n＝2,g n＝2,h n＝2,I n＝2并且j n＝4)。图11E显示了用重编程基因转染2周后显示出αMHC-mCherry和α-辅肌动蛋白的mCherry阴性细胞的免疫染色图像。图11F显示e的百分比定量。单向ANOVA、Tukey多重比较检验用于c&d和f。***,P<0.001,**,P<0.01,N.S,不显著。比例尺＝10μm。

图12A-图120例示了7G改善心脏功能和MI后的结果。图12A是在急性MI小鼠模型中递送Luc和7G modRNA后评估心血管功能的实验时间线。图12B显示在MI后28天进行的左心室收缩和舒张功能的磁共振成像(MRI)评估。代表性图像显示了舒张期和收缩期期间的左心室腔室(以红色描绘)。图12C、图12D、图12E和图12F显示在b(Luc n＝3,7G n＝3)中通过MRI实验测量的射血分数(EF)、心输出量(CO)和心肌梗死(MI)大小的百分比评价。图12G显示了在MI后第2天(基线)和第28天(Luc n＝17,7G n＝8)之间通过超声心动图获得的缩短分数差异的百分比。图12H和图12I显示在MI后第2天(基线)和第28天(Luc n＝17,7G n＝8)之间通过超声心动图评估的左心室内径舒张期(LVIDd)和收缩期(LVIDs)的差异的测量。图12J显示了分离心脏用于瘢痕组织评估以及纤维化标志物的qPCR分析的实验计划。图12K显示了在MI后28天用Masson三色染色评估瘢痕大小的代表性组织学切片。图12L显示基于j(Luc n＝3,7G n＝3)，在MI后28天由瘢痕与活组织所占据的左心室面积的百分比定量。图12M是显示在MI后28天，比较Luc处理与7G modRNA的纤维化标志物的相对表达的qPCR图片。图12N和图12O显示与Luc治疗相比，心肌梗死和7G和7G modRNA后的长期存活曲线(Luc n＝12,7G n＝12)。对于c-g和l&m进行未配对双尾t检验。对于图12H和图12I进行双向ANOVA、Bonferroni事后检验。对于o进行Mantel-Cox对数秩检验。****,P<0.0001,***,P<0.001,**,P<0.01,*,P<0.05,N.S,不显著。比例尺＝1mm(b&k)。

图13A-图13J显示7G通过促进血管生成来改善心脏功能。图13A显示了他莫昔芬注射、LAD结扎和modRNA递送，然后从转基因小鼠中分离心脏的实验计划。图13B显示从注射Luc和7G modRNA的小鼠收集的体内CM样细胞(以黄色呈现)的代表性免疫染色图像，显示心肌细胞标志物cTNT(绿色)和Tdtomato-cre的阳性染色。图13C显示在B(Luc n＝3,7G n＝3)中通过免疫染色描绘的CM样细胞的定量。图13D是用于分析内皮细胞的实验模型。图13E显示了代表性免疫荧光，显示在递送Luc和7G modRNA后28天瘢痕区域中存在腔结构(绿色)。图13F显示了基于e(Luc n＝5,7G n＝4)的毛细血管密度的百分比定量。图13G显示了在MI后注射modRNA和收集心脏用于mRNA和蛋白质分析的策略计划。图13H显示了由modRNA处理(n＝2)后28天从心脏组织提取的RNA评估中确定的主要血管生成基因的表达的qPCR定量。图13I显示了示例性蛋白质印迹图像，显示MI和随后Luc和7G的modRNA注射后4周分离的心脏组织中存在的VEGFA蛋白。图13J显示蛋白质印迹(n＝2)的定量。对于c、f、j、h进行未配对双尾t检验。****,P<0.0001,***,P<0.001,**,P<0.01,N.S,不显著。比例尺＝50μm(b)、25μm(e)。

图14A-图14E例示出在ApoE-/-小鼠后肢缺血模型中7G增强血液灌注和血管生成。图14A是股动脉结扎和modRNA递送，然后从ApoE-/-小鼠进行血液灌注分析的实验计划。图14B是代表性激光多普勒灌注成像(LDPI)，显示在第0、1、7、14和21天，在股动脉结扎后接受Luc和7GmodRNA的小鼠足部区域中血液灌注的动态变化。图14C显示了基于图14C的通过LDPI测量的足灌注的定量，其中LDPI的比例通过比较缺血性肢体与其对侧后肢的血液灌注来计算(Luc n＝5,7G n＝5)。图14D显示在小鼠腓肠肌上进行qPCR和免疫染色的实验时间线。图14E是qPCR图片，显示在严重肢体缺血后从注射Luc和7G的小鼠分离的缺血性肌肉中血管生成基因的上调。对于图14C进行双向ANOVA、Bonferroni事后检验。对于图14E进行非配对双尾t检验。****,P<0.0001,**,P<0.01,*,P<0.05,N.S,不显著。

图15显示缺血性损伤后7G modRNA诱导心脏和肢体模型中血管再生的建议模型。

图16A-图16K显示通过modRNA递送的7种基因+心肌素的混合物在成人心脏成纤维细胞中诱导心脏基因表达。图16A是在用不同modRNA转染的正常人心室心脏成纤维细胞(NHCF-V)中进行蛋白质分析的实验时间线。图16B显示在不同时间点(第1天-第6天)GFP、GATA4、MEF2C、TBX5modRNA转染的NHCF-V的蛋白质印迹分析以确定蛋白质表达长度。图16C显示NHCF-V转染和细胞收集以确定不同转染试剂的效率的实验计划。图16D显示对NHCF-V进行的免疫染色的代表性图像，显示用各种转染试剂转染的nGFP表达。图16E显示基于图16D的免疫染色的nGFP阳性细胞的百分比定量分析。图16F显示转染和收集SV40-T预处理的NHCF-V的实验计划。图16G、图16H和图16I分别显示cTNT、α-MHC和COLA1的相对表达，通过对用不同的重编程基因混合物重复转染14天后收集的NHCF-V的qPCR分析测定(a n＝3,b n＝3,c n＝2,d n＝2,e n＝2,f n＝2)。图16J显示代表性免疫荧光图像，显示了用不同的基因混合物重编程的NHCF-V中的心肌细胞标志物(α-辅肌动蛋白)的出现。(绿色：α-辅肌动蛋白，蓝色：DAPI；比例尺，50μm)。图16K显示用重编程基因转染2周后表现出α-辅肌动蛋白的细胞的百分比的定量。对于图16E、图16G、图16H、图16I、图16K进行单向ANOVA、Tukey多重比较检验。****,P<0.0001,***,P<0.001,**,P<0.01,*,P<0.05,N.S,不显著。比例尺＝10μm。

图17A-图17F显示将其他候选物添加到7G不能使心脏重编程更有效。图17A显示了实验计划的代表图解，证明使用FACS分选从转基因小鼠中分离mCherry阴性细胞，将细胞铺板并每3天用不同添加的7-基因混合物转染。图17B显示除7种基因和它们用于转染mCherry阴性细胞的比例外筛选的基因列表，以鉴定用于将成纤维细胞重编程为心肌细胞的最佳混合物。图17C和图17D显示qPCR结果，分别比较在用7种基因或7种基因加附加候选物转染后14天的mCherry阴性细胞中cTNT和αMHC的相对基因表达(a n＝10,b n＝8,c n＝4,d n＝4,e n＝4,f n＝4,g n＝2,h n＝2,I n＝2并且jn＝2,k n＝4,l n＝4,m n＝4,n＝4并且o n＝4)。图17E显示在不同基因组的重复转染后14天获取的mCherry阴性分选细胞中的α-辅肌动蛋白和αMHC-mCherry阳性细胞的代表性图像。图17F显示基于图17E的百分比定量。对于图17D、图17E和图17F进行单向ANOVA、Tukey多重比较检验。****,P<0.0001,***,P<0.001,**,P<0.01,*,P<0.05,N.S,不显著。比例尺＝20μm。

图18A-图18D显示不同化学计量的7G对心肌功能和MI后结果的影响。图18A显示评估MI后心血管功能的实验设计。在LAD结扎时将Luc、7G GMT(Hx2)和7G G(Mx2)TH modRNA注射到心肌中。图18B显示在用7G GMT(Hx2)和7G G(Mx2)TH modRNA注射的小鼠中基于超声心动图的缩短分数的Δ(第28天-第2天)的百分比定量。图18C显示在MI后28天用代表性Masson三色染色评估瘢痕大小。图18D显示基于c(Luc n＝3,7GGMT(Hx2)n＝3,7G G(Mx2)THn＝3)中所示的图像的瘢痕大小的定量。对于图18C和图18D进行单向ANOVA、Tukey多重比较检验。****,P<0.0001,**,P<0.01,N.S,不显著。对于b，比例尺＝1mm。

图19A-图19B显示用于鉴定体内CM样细胞形成的谱系追踪小鼠模型。图19A显示用于谱系追踪实验的小鼠模型中的杂交的概况。图19B显示从Tnnt2^MerCreMer/+/R26^mTmG/+小鼠心脏收集的Tnnt2^MerCreMer/+/R26^mTmG/+的代表性免疫染色图像，比较假处理与他莫昔芬处理的小鼠的Tnnt2-阳性细胞中膜绿色的出现。对于b，比例尺＝50μm。

图20A-图20H显示7G GMT(Hx2)增强成纤维细胞分化成CM样细胞并促进MI后小鼠心脏中的血管生成。图20A显示在谱系追踪小鼠模型中评估CM重编程的实验设计。图20B显示在MI后从Luc和7G GMT(Hx2)modRNA注射小鼠收集的体内重编程细胞(以黄色呈现)的免疫染色图像。图20C显示基于图20B的CM样细胞定量。图20D显示用于分析内皮细胞的实验模型。图20E显示在经历MI和随后的Luc和7G GMT(Hx2)modRNA处理的心脏的瘢痕区域中的CD31阳性细胞的代表性免疫染色图像。图20F显示CD31阳性细胞的百分比定量。图20G显示modRNA注射和收集心脏用于qPCR分析的策略计划。图20H是qPCR图片，显示在28天在严重MI小鼠模型中比较Luc处理与7G GMT(Hx2)modRNA的血管生成标志物的相对表达(Luc n＝2和7G GMT(Hx2)n＝2)。对于图20C、图20F和图20H进行非配对双尾t检验。****,P<0.0001,***,P<0.001,**,P<0.01,N.S,不显著。比例尺＝50μm(b&e)。

图21A-图21G显示心脏内递送modRNA后血管生成和成纤维细胞标志物的每周评估结果。图21A显示LAD结扎，随后modRNA注射和心脏分离用于qPCR和蛋白质印迹的实验设计。图21B、图21C和图21D显示qPCR图片，显示在第7、14和21天在严重MI小鼠模型中比较Luc处理与7G和7G GMT(Hx2)modRNA的血管生成标志物的相对表达(Luc n＝2,7Gn＝2,7G GMT(Hx2)n＝2)。图21E、图21F和图21G显示通过qPCR在第7、14和21天测定的已知纤维化标志物(Luc n＝2,7G n＝2,7G GMT(Hx2)n＝2)。图21H是在第21天收集的小鼠心脏样品中的VEGFA蛋白水平的蛋白质印迹分析。图21I显示图21H的定量。对于图21B至图21I进行单向ANOVA、Tukey多重比较检验。****,P<0.0001,***,P<0.001,**,P<0.01,*,P<0.05,N.S,不显著。

图22A-图22E显示增加的Vegfa水平与心脏中的渗漏血管或血管瘤无关。图22A显示研究增加的Vegfa水平与组织灌注和渗漏血管的关联的实验时间线。图22B是显示对3个处理组定量的身高体重/体重比的每周评估的图形。图22C显示评估用Luc、7G或7G GMT(Hx2)modRNA处理的心脏的心脏大小和心肌水肿的完整心脏图像。图22D是H&E染色的代表性图像，显示MI后28天没有与Luc、7G或7G GMT(Hx2)处理相关的血管瘤。图22E显示小鼠心脏的代表性免疫染色图像，在LAD结扎时进行假处理或者用Luc、7G和7G GMT(Hx2)处理，以评估处理与全身脉管系统(同工凝集素B4)或血管通透性(FITC-葡聚糖珠(70kDa))之间的相关性。对于b进行单向ANOVA、Tukey多重比较检验。N.S，不显著。比例尺＝1mm(图22C、图22D),10μm(图22E)。

图23A-图23D显示小鼠和人CM样细胞显著上调VegfA(关键血管生成基因)的表达。图23A显示使用FACS分选从α-MHC转基因小鼠分离mCherry阴性细胞，并使用或不使用不同的心脏重编程混合物(7G,7GGMT(Hx2))以3天间隔转染它们的程序的示意图。图23B显示在使用或不使用7G或7G GMT(Hx2)转染后14天通过mCherry阴性细胞的qPCR评估的VegfA的相对mRNA表达(Luc n＝3,7G n＝3,7G GMT(Hx2)n＝3)。图23C显示治疗和收集NHCF-V进行qPCR的实验时间线。图23D是表示VEGFA表达的图形，其通过从使用或不使用7G+Myocd重编程14天的人心脏成纤维细胞中提取的RNA的qPCR测定。对于b进行单向ANOVA、Tukey多重比较检验。对于d进行非配对双尾t检验。***,P<0.001,*,P<0.05,N.S,不显著。

具体实施方式

第一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA(modRNA)(G)、编码肌细胞增强因子2C的modRNA(M)、编码T-box 5的modRNA(T)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA(H)、编码显性负性转化生长因子β的modRNA(dnT)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modRNA(dnW)，其中所述modRNA的分子以G:M:T:H:dnT:dnW的比例存在于所述组合物中。

另一方面涉及组合物，其包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA(modRNA)(G)、编码肌细胞增强因子2C的modRNA(M)、编码T-box 5的modRNA(T)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA(H)、编码酸性神经酰胺酶的modRNA(A)、编码显性负性转化生长因子β的modRNA(dnT)和编码显性负性无翼相关整合位点8a的modRNA(dnW)，其中所述modRNA的分子以G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例存在于所述组合物中。

应理解，本发明的某些方面、模式、实施方式、变化和特征在下面以各种详细程度进行描述，以便提供对本发明技术的充分理解。本说明书中使用的某些术语的定义提供如下。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，术语“约”意指数值是近似值，并且小变化将不会显著影响所公开的实施方式的实践。在使用数值限制的情况下，除非上下文另外说明，否则“约”意指数值可以变化±10％并且保持在所公开的实施方式的范围内。

如本文所用，可互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”意指任何动物，包括哺乳动物，例如小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马或灵长类动物，例如人。

如本文所用，术语“纯的”是指当分离时，分离物含有按分离物的重量计至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的本文所述的化合物。

如本文所用，短语“基本上分离的”意指从其形成或检测的环境中至少部分地或基本上分离的化合物。

还应理解，本文描述的某些特征(为清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述)也可以在单个实施方式中组合提供。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。

术语“细胞或细胞群”旨在包括悬浮液或单层中的单细胞以及多细胞。全组织也构成细胞群。

可以通过选择基因递送方法来针对特定情况调整表达的持续时间。术语“短期表达”例如是指在数天而非数周的持续时间内表达所需的蛋白质。因此，例如，使用modRNA作为基因递送方法实现所选择的鞘脂代谢蛋白的瞬时表达，持续长达约11或12天。短持续时间的快速、瞬时表达可以足以例如延长卵母细胞和胚胎在IVF之前的存活率和质量。

术语“modRNA”是指可用于表达目标基因的合成的修饰RNA。在modRNA中进行化学修饰，例如用假尿苷代替尿苷，稳定分子并增强转录。另外，与将蛋白质剂直接递送到细胞(其可以激活免疫系统)不同，modRNA的递送可以在没有免疫影响的情况下实现。在例如WO2012/138453中更详细地描述了modRNA用于体内和体外表达的用途，其通过援引整体据此并入。

Kariko等人“Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields SuperiorNonimunogenic Vector With Increased Translational Capacity and BiologicalStability,”Mol.Ther.16(11):1833-1840(2008)，其通过援引整体据此并入)发现，分别用假尿苷和5-甲基胞苷取代尿苷和胞苷显著降低了由外源RNA引起的免疫应答，这为实现了治疗蛋白瞬时表达的新型基因递送奠定了基础。

修饰mRNA(modRNA)是相对新的基因递送系统，其可以在体外或体内用于实现治疗蛋白在异质细胞群中的瞬时表达。掺入特异性修饰核苷使得modRNA能够有效地翻译而不触发抗病毒和先天免疫应答。在本公开中，modRNA显示出在递送“存活基因”的短期稳健基因表达方面是有效的，并且其在基因治疗领域中的用途正在扩大。在例如Kondrat等人，“Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery,”Cardiac GeneTherapy1521:127-138(2017)中公开了用于递送治疗蛋白的modRNA的逐步合成方案，其通过援引整体据此并入。

modRNA(相对新生的技术)具有相当大的作为疾病的疗法的潜力。例如，编码人血管内皮生长因子-A的合成的修饰RNA的递送导致小鼠心肌梗死模型中的内源性心脏祖细胞的扩增和定向分化(Zangi等人，“Modified mRNA Directs the Fate of HeartProgenitor Cells and Induces Vascular Regeneration After MyocardialInfarction,”Nature Biotechnology 31:898-907(2013)，其通过援引整体据此并入)。在另一实例中，糖尿病性神经病可以通过递送编码神经生长因子的基因的能力而减轻。另外，随着基因组编辑技术、CRISPR/Cas9或转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的出现，如果以瞬时且细胞特异性方式递送，转染将更安全。

在根据本公开的实例中，编码可影响心肌细胞发育或采用心肌细胞样表型的蛋白质的基因递送分子包括modRNA。尽管存在用于实现外源蛋白表达的各种基因递送方法，例如使用质粒、病毒或mRNA，但在某些情况下modRNA作为基因递送工具提供了诸多优点。

基因递送相对于蛋白质的优点可以是在特定时间段内实现蛋白质的内源表达的能力，并因此延长了对目标蛋白质翻译产物的暴露。modRNA递送的另一优点可以是在翻译目标基因之前不需要核定位或转录。在翻译目标蛋白质之前减少或避免mRNA的转录可以导致更高效率的目标蛋白表达。

Kariko等人在2008年表明，用假尿苷代替mRNA中的尿苷(因此命名为修饰mRNA(modRNA))导致mRNA二级结构的变化，从而避开先天免疫系统并且减少RNase对modRNA的识别。Kariko等人，“Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields SuperiorNonimunogenic Vector With Increased Translational Capacity and BiologicalStability,”Mol.Ther.16(11):1833-1840(2008)，其通过援引整体据此并入。此外，核苷酸的这些变化在我们的体内是天然存在的，并且导致modRNA与未修饰的mRNA相比翻译增强。

本文公开了modRNA“混合物”，其包括编码影响心肌细胞发育或采用心肌细胞样表型或促进心肌细胞存活的一种或多种蛋白质的modRNA，以及给药这种混合物来促进非心肌细胞发育成心肌细胞或采用心肌细胞样表型或促进心脏健康或功能、减少心脏损害或缺陷，否则心脏损伤或损坏可能引起心脏损害或缺陷。

modRNA是合成mRNA，并且可以包括优化的5'UTR和3'UTR序列，抗反向帽类似物(ARCA)，一个或多个天然修饰的核苷酸或前述的任何组合。优化的UTR序列可以提高翻译效率。ARCA可以增加RNA的稳定性并增强翻译效率，并且天然修饰的核苷酸增加RNA的稳定性，降低细胞(体外和体内)的先天免疫应答并增强mRNA的翻译效率。在其他实例中，可以用促进采用Cap 1结构的试剂处理mRNA，其促进躲避mRNA指导的免疫应答。modRNA(如含有代替尿苷的假尿苷或其他核糖核苷酸取代的mRNA)可以用这样的试剂处理，使得它可以采用5'UTR Cap 1结构。例如，用市售的试剂如CLEANCAP^TM(TriLink Biotechnologies)处理mRNA可以促进5'UTR Cap 1结构的形成，从而可以介导更高且更长的蛋白质表达，同时免疫应答降低或最小化。

本公开涉及通过改变细胞蛋白质的活性来增加细胞群内心肌细胞数的组合物。通过增加或降低可能参与心肌细胞表型特征发展的蛋白质或信号传导途径的活性，可以诱导群内不具有心肌细胞样表型的细胞发展这种表型，从而成为心肌细胞。心肌细胞数增加则可以改善心脏功能，包括损害或损伤后的修复或再生，或者防止损害或损伤的不利后遗症，从而与没有治疗相比，导致改善的健康或功能。在其他实例中，用组合物处理可以防止心肌细胞的减少，或减少否则会促进瘢痕形成或不良心脏功能或生理的细胞，例如，在一种实例中，通过促进这种细胞向心肌细胞的转化。

许多不同的细胞因子、蛋白质或信号传导因子可以用于促进细胞从非心肌细胞表型向心肌细胞表型转化，或者以其他方式参与细胞向心肌细胞的发育，或者以其他方式促进心肌细胞或具有心肌细胞样表型的细胞的健康或存活。实例可以包括GATA结合蛋白4(GATA4)、肌细胞增强因子2C(Mef2c)、T-box 5(Tbx5)、心和神经嵴衍生物表达蛋白2(Hand2)、酸性神经酰胺酶(编码酸性神经酰胺酶的ASAH1基因)、转化生长因子β(TGFB)和无翼相关整合位点8a(Wnt8a)。

可以占哺乳动物心脏中50％细胞的心脏成纤维细胞可以通过增加它们的发育心脏调节因子GATA4、Mef2c和Tbx5的表达而在体外直接重编程为心肌细胞样细胞。Ieda等人，“Direct Reprogramming of Fibroblasts into Functional Cardiomyocytes byDefined Factors,”Cell 142:375-386(2010)，其通过援引整体据此并入。此外，用小分子抑制剂如SB431542抑制TGFB增强心肌细胞的分化，用小分子抑制剂XAV939抑制Wnt信号传导也是如此。ASAH1表达的增加也可以促进心肌细胞的健康、生长或存活。

然而，这些因子活性的改变之间可能存在复杂的相互关系，这阻碍了用于增强心肌细胞形成或发育的组合方法的发展，例如在心脏损伤或损害后，或用于增加细胞群内的心肌细胞水平。

Hand2也被证明促进心肌细胞形成，例如在斑马鱼中。Schindler等人，“Hand2Elevates Cardiomyocyte Production During Zebrafish Heart Development andRegeneration,”Development 141:3112-3122(2014)，其通过援引整体据此并入。然而，是否Hand2可以与一种或多种上述细胞蛋白质协同促进心肌细胞的发育，或非心肌细胞转化为心肌细胞或具有心肌细胞样表型的细胞是未知的。并且与上述对心肌细胞发育的细胞影响一样，对于组合治疗以促进损伤或损害后的心肌细胞发育和心脏健康，刺激这些因子来促进心肌细胞发育或存活和/或抑制这些因子来促进心肌细胞发育或存活的相对比例是未知的。

如本文所公开的，包括编码GATA4、Mef2c、Tbx5和Hand2的modRNA以及编码抑制TGFB和Wnt8a活性的肽，所谓的“显性负性”TGFB和“显性负性”Wnt8a(分别为dnTGFB和dnWnt8a)的modRNA的组合物增加了包括非心肌细胞在内的细胞群内的心肌细胞数。在实例中，非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。在另一实例中，这样的组合物包括编码ASAH1的modRNA。在实例中，可以将组合物施用于包括非心肌细胞的细胞，导致细胞群中存在的心肌细胞数增加。

在一种实施方式中，GATA4 modRNA分子:Mef2c modRNA分子:Tbx5modRNA分子:Hand2 modRNA分子:dnTGFB modRNA分子:dnWnt8amodRNA分子的比例为1:1:1:1:1:1，或2:1:1:1:0.7:0.7，或1:2:1:1:0.7:0.7，或1:1:2:1:0.7:0.7，或1:1:1:2:0.7:0.7，或1:2:1:2:0.5:0.5，或2:2:2:2:0.7:0.7。在另一种实施方式中，GATA4 modRNA分子:Mef2c modRNA分子:Tbx5modRNA分子:Hand2 modRNA分子:ASAH1 modRNA分子:dnTGFB modRNA分子:dnWnt8a modRNA分子的比例为1:1:1:1:1:1:1，或2:1:1:1:0.7:0.7:0.7，或1:2:1:1:0.7:0.7:0.7，或1:1:2:1:0.7:0.7:0.7，或1:1:1:2:0.7:0.7:0.7，或1:2:1:2:0.5:0.5:0.5，或2:2:2:2:0.7:0.7:0.7。

在一种实施方式中，当组合物包括G:M:T:H:dnT:dnW的比例时，M以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。在另一种实施方式中，当组合物包括G:M:T:H:dnT:dnW的比例时，H以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。在一种实施方式中，当组合物包括G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例时，M以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。在另一种实施方式中，当组合物包括G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例时，H以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

对应于本文公开的modRNA分子的有义DNA序列呈现在表1中。

表1：有义DNA序列

根据已知的密码子简并性，RNA分子或modRNA分子可以具有可翻译成给定氨基酸序列的核苷酸序列。任何这样的RNA或modRNA分子可以根据本公开使用，其中涉及通过编码的多肽鉴定的RNA或modRNA。本文公开的由RNA或modRNA分子编码的多肽的氨基酸序列的实例示于表2中。

表2：氨基酸序列

另一方面涉及药物组合物，其包括任何前述组合物或其实例以及药学上可接受的载体。

该方面根据上文描述的方面进行。

如本文所述的组合物可以施用于受试者，例如哺乳动物，并且在心脏损伤或损害后，与经受这种损伤或损害但未用该组合物治疗的受试者相比，受试者心脏中存在的心肌细胞的数量增加。损伤或损害可包括心肌梗死、再灌注损伤、缺血性损伤或卒中。经历这种损伤或损害的受试者可能需要增加心肌细胞数的治疗，例如用于预防、减少、最小化或以其他方式抵消对心脏健康、结构或功能的有害影响。将组合物施用于受试者还可以促进伤口愈合，这种受试者在心脏损伤或损害后可能需要这种治疗。

组合物可以作为制剂与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或添加剂组合给药。载体、赋形剂或添加剂可以在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上是“可接受的”。制剂包括适于口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内和关节内)、直肠和局部(包括真皮、口腔、舌下和眼内)给药的制剂。最合适的途径可取决于接受者的病症和疾患。制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。

在一种实施方式中，组合物还包括药学上可接受的载体。如本文使用的“药学上可接受的载体”是指常规的药学上可接受的载体。参见E.W.Martin的Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,15th Edition(1975)，其通过援引整体据此并入(描述了适于本文所述的本发明组合物的药物递送的组合物)。特别地，如本文所用的药学上可接受的载体是指涉及将目标化合物从身体的一个组织、器官或部分携带或运输至身体的另一个组织、器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或媒介物。例如，载体可以是液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料或其组合。每种载体组分必须是“药学上可接受的”，因为它必须与制剂的其他成分相容。它还必须适合用于与它可能接触的任何组织或器官接触，这意味着它必须不携带毒性、刺激、过敏响应、免疫原性的风险，或过度超过其治疗益处的任何其他并发症。在一种实施方式中，药学上可接受的载体选自由以下组成的组：液体填充剂、固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂和包封材料。

药学上可接受的载体(例如，添加剂，例如稀释剂、免疫刺激剂、佐剂、抗氧化剂、防腐剂和增溶剂)在所使用的剂量和浓度下对暴露于其的细胞或受试者是无毒的。药学上可接受的载体的实例包括水，例如用磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸的缓冲的水。可用于本公开的药学上可接受的赋形剂的代表性实例包括抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；佐剂(选择以避免佐剂诱导的毒性，如美国专利No.6,355,625中所述的β-葡聚糖，其通过援引整体据此并入，或粒细胞集落刺激因子(GCSF))；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如

聚乙二醇(PEG)和

在各种实施方式中，根据本公开的组合物可以被配制用于经由任何给药途径递送。给药途径可以是指本领域已知的任何给药途径，包括但不限于心内、气溶胶、鼻腔、口腔、经粘膜、经皮、皮下或肠胃外。肠胃外是指通常与注射有关的给药途径，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管。经由肠胃外途径，组合物可以呈用于输注或用于注射的溶液或悬浮液的形式，或冻干粉末的形式。

在一种实施方式中，组合物可以还包括佐剂。合适的佐剂是本领域已知的，包括但不限于鞭毛蛋白、弗氏完全或不完全佐剂、氢氧化铝、溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、二硝基苯酚、iscomatrix和脂质体聚阳离子DNA颗粒。在一种实施方式中，组合物被配制用于增加心肌细胞数与非心肌细胞数的比例，治疗心脏损伤，刺激缺血性损伤后的血管再生，治疗卒中和/或增强伤口愈合。

根据本公开的方法可以包括使所公开的组合物(“活性成分”)与构成一种或多种辅助成分的载体结合。通常，可以通过使活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，使产物成型为所需制剂来制备制剂。适于口服给药的本公开的制剂可以作为离散单元提供，例如各自含有预定量的活性成分的胶囊、扁囊剂或片剂；作为粉末或颗粒；作为在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者作为水包油液体乳液或油包水液体乳液。活性成分也可以以大丸剂、冲剂或糊剂的形式存在。

在一些实例中，有效化合物可以与赋形剂结合并且以可摄入片剂、口含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。片剂、锭剂、丸剂、胶囊剂等还可含有以下：粘合剂，诸如例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶或其组合；赋形剂，诸如例如磷酸二钙、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁或其组合；崩解剂，诸如例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸或其组合；润滑剂，诸如例如硬脂酸镁；甜味剂，诸如例如蔗糖、乳糖、糖精或其组合；调味剂，诸如例如薄荷油、冬青油、樱桃调味剂、橙子调味剂等。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。当剂量形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它可以含有载体，例如液体载体。明胶胶囊、片剂或丸剂可以是肠溶包衣的。肠溶包衣防止组合物在pH是酸性的胃或上肠中变性。到达小肠后，其中的碱性pH溶解包衣并允许组合物被释放并且被特化细胞例如肠上皮细胞和派尔斑M细胞吸收。酏剂的糖浆可以含有作为甜味剂的活性化合物蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，染料和调味剂，例如樱桃或橙子调味品。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药物纯的并且在所使用的量下基本上是无毒的。此外，可以将有效化合物掺入缓释配制剂和制剂。

片剂可以任选地与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制制造。压制片剂可以通过在合适的机器中压制任选地与粘合剂、润滑剂(lubricant)、惰性稀释剂、润滑剂(lubricating agent)、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式如粉末或颗粒的活性成分来制备。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制造。片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以提供其中的活性成分的持续、延迟或控制释放。

用于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。用于肠胃外给药的制剂还可以包括水性和非水性无菌悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。制剂可以以多剂量容器中的单位剂量存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在临使用前加入无菌液体载体，例如盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)等。即时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在即将使用之前重构成无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射的有机酯(例如油酸乙酯)。例如，可以通过使用包衣材料如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)可以确保防止微生物的作用。还可以期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。注射药物形式的延长吸收可以通过包含延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。通过在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐))中形成药物的微囊基质来制备可注射的贮库形式。根据药物与聚合物的比例和所用的特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。贮库注射制剂也可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备。注射制剂可以例如通过经细菌截留过滤器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述无菌固体组合物可以在即将使用之前溶解或分散在无菌水或其他无菌注射介质中。合适的惰性载体可以包括糖，例如乳糖。

制剂可以包括不同类型的载体，这取决于制剂是否将以固体、液体或气溶胶形式给药，以及对于这种给药途径如注射是否需要是无菌的。作为制剂的组合物可以静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、外用、肌内、皮下、粘膜、口服、外用、局部、吸入(例如，气溶胶吸入)、注射、输注、持续输注、直接靶向细胞的局部灌注浴、经由导管、经由灌洗、在乳膏中、在脂质组合物(例如，脂质体)中，或通过其他方法或前述方法的任何组合给药，如本领域普通技术人员已知的(参见，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences,18th Ed.Mack Printing Company,1990，其通过援引整体据此并入)。

载体、赋形剂或添加剂可以包括有助于modRNA跨细胞膜的细胞摄取、转运或转移以允许从细胞内翻译蛋白质产物的组合物。可以使用各种细胞穿透肽、纳米颗粒、脂质复合物构型和用于增强细胞摄取的其他载体。商购实例包括RNA IMAX^TM、MESSENGER MAX^TM、JETMESSENGER^TM和TRANS IT^TM。

组合物可以给药于受试者，所述组合物包括一定量的给定modRNA，或者编码彼此不同的肽的多个modRNA分子之间的相对量以治疗有效剂量或量结合应用于组合物中。即，组合物中彼此不同物质的量或相对量可以足以对心脏功能、心脏健康、心脏结构、伤口愈合或者指示或被认为或已知对应于积极的健康结果或积极的心脏健康或功能的心输出量的测量产生有益效果。实例可以包括受试者心脏中心肌细胞的增加，或心输出量的测量的改善，例如增加的射血分数(随着每次心跳被排出的左心室中血液总量的百分比)、增加的心输出量(心脏每分钟每心室泵出的血液量)、增加的每搏量(由于心脏收缩而从每心室射出的血液体积)或缩短分数(舒张末期与收缩末期之间左心室直径的缩短程度)。在实例中，可以给药多种独立的组合物，每种组合物包括待给药的一种或仅子集类型的modRNA，其中独立的组合物组合给药。在实例中，这种组合物的组合产生了施用于细胞或受试者的相对比例的各种类型的modRNA，就像所有这种子集在单一组合物中组合一样。

另一方面涉及增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与前述组合物或其实例接触。在一种实施方式中，非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。

该方面根据上文描述的方面进行。

另一方面涉及治疗心脏损伤的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。在一种实施方式中，心脏损伤包括心肌梗死。在另一种实施方式中，心脏损伤包括再灌注损伤。

该方面根据上文描述的方面进行。

另一方面涉及在缺血性损伤后刺激血管再生的方法，其包括使缺血性损伤所损伤的组织与前述组合物或其实例接触。

该方面根据上文描述的方面进行。

另一方面涉及治疗卒中的方法，其包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

该方面根据上文描述的方面进行。

另一方面涉及增强伤口愈合的方法，其包括向需要此类增强的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

该方面根据上文描述的方面进行。

另一方面涉及刺激骨骼肌再生的方法，其包括向需要此类刺激的患者给药治疗有效量的前述组合物或其实例。

如本文所用，术语“参考水平”是指可以出于比较目的而成为目标的物质的量，例如，特定细胞类型(例如，干细胞)。在一些实施方式中，参考水平可以是细胞类型的群体的水平或浓度，表示为来自健康(无疾病和/或无病原体)受试者的对照群体的样品的水平或浓度的平均值。在其他实施方式中，参考水平可以是在不同时间(例如，在使用本发明之前)在同一受试者中的水平，例如在受试者出现疾病、疾病状况和/或致病性感染之前，在开始治疗(诸如例如，干细胞疗法)之前或在疗法早期时确定的水平。根据本发明的这个方面的哺乳动物受试者包括，例如，人类受试者、马受试者、猪受试者、猫受试者和犬受试者。人类受试者是特别优选的。

出于本公开的这个和其他方面的目的，靶标“受试者”包括任何脊椎动物，例如动物、优选哺乳动物，更优选人。在给药本公开的组合物用于增加心肌细胞数与非心肌细胞数的比例、治疗心脏损伤、刺激血管再生、治疗卒中和/或增强伤口愈合的目的的背景下，靶标受试者包括具有或处于患有缺血性心脏病的风险中、心肌细胞与非心肌细胞的比例较低(与参考水平相比)、心脏损伤、血管变性、卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口的任何受试者。特别易感的受试者包括成人和老年人。然而，具有或处于患有本文所述的任何病症的风险的任何婴儿、青少年、成人或老年人可以根据本公开的方法治疗。在一种实施方式中，受试者是婴儿、青少年或成人。

如本文所用，短语“治疗有效量”是指引起研究人员、兽医、医生或其他临床医师在组织、系统、动物、个体或人类中寻求的生物或医学响应的有效化合物或药剂的量。治疗效果取决于所治疗的疾患或所需的生物效果。如此，治疗效果可以是与疾患相关的症状的严重程度的降低和/或疾患进展的抑制(部分或完全)，或改善疾患的治疗、治愈、预防或消除，或改善副作用。引起治疗响应所需的量可以基于受试者的年龄、健康、大小和性别来确定。最佳量也可以基于监测受试者对治疗的响应来确定。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”可以包括缺血性心脏病的有效抑制、压制或停止，较低比例的心肌细胞与非心肌细胞(与参考水平相比)，心脏损伤，血管变性，卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口，以便预防或延迟发作、延缓进展或减轻缺血性心脏病的症状，较低比例的心肌细胞与非心肌细胞(与参考水平相比)，心脏损伤，血管变性，卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口。

如本文所用，样品可以包括从活体系统或受试者获得的任何样品，包括例如血液、血清和/或组织。在一种实施方式中，通过微创或无创方法(例如，通过尿液收集、粪便收集、抽血、针吸和涉及最小风险、不适或努力的其他程序)取样来获得样品。替代地，样品可以是气态(例如，已经呼出的呼吸)或液态流体。液体样品可以包括，例如，尿液、血液、血清、组织间液、水肿液、唾液、泪液、炎性渗出物、滑液、脓肿、脓胸或其他感染液、脑脊液、汗液、肺分泌物(痰)、精液、粪便、胆汁、肠道分泌物、鼻腔排泄物和其他液体。样品还可以包括临床样品，例如血清、血浆、其他生物流体或组织样品，并且还包括培养物中的细胞、细胞上清液和细胞裂解物。在一种实施方式中，样品选自由以下组成的组：全血、血清、尿液和鼻腔排泄物。样品可以是体内的或离体的。

在一种实施方式中，该方法包括给药一种或多种治疗受试者的缺血性心脏病、较低比例的心肌细胞与非心肌细胞(与参考水平相比)、心脏损伤、血管变性，卒中和/或由本文所述的任何病症引起的一个或多个伤口的附加剂。

如本文所用，术语“同时”治疗用途是指任选地通过相同途径并且同时或基本上同时给药至少一种除本文所述的组合物以外的附加剂。如本文所用，术语“单独”治疗用途是指通过不同的途径同时或基本上同时给药至少一种除本文所述的组合物以外的附加剂。如本文所用，术语“顺序的”治疗用途是指在不同时间给药至少一种除本文所述的组合物以外的附加剂，给药途径相同或不同。更具体地，顺序使用是指在给药本文所述的组合物之前全部给药附加剂。因此，可以在施用本文所述的组合物之前几分钟、几小时或几天内给药附加剂。

在一种实施方式中，附加剂可以包括，例如，一种或多种抗生素化合物；一种或多种抗微生物化合物；一种或多种抗体；一种或多种杀生物剂；一种或多种纳米颗粒；一种或多种自组装纳米颗粒；一种或多种病毒颗粒；一种或多种噬菌体颗粒；一种或多种噬菌体DNA；遗传物质，包括但不限于质粒、RNA、mRNA、siRNA和适配体；一种或多种化学治疗剂；一种或多种生长因子；一种或多种合成支架，包括但不限于水凝胶等；一种或多种天然支架，包括但不限于胶原凝胶和去细胞化组织(完整的、溶解的、变性的或粉末状的)；一种或多种电极，一种或多种药物或药物化合物，包括但不限于抗炎剂、炎症剂、止痛剂和麻木剂；一种或多种微生物以及一种或多种细菌。

在以下描述中，参考构成其一部分的附图，并且在附图中通过例示的方式示出了可以实践的具体实施方式。详细描述这些实施方式以使所属领域的技术人员能够实践本公开，并且应了解，在不背离本公开的范围的情况下，可以采用其他实施方式并且可以进行结构、逻辑和电气上的改变。因此，以下对示例性实施方式的描述不应被认为是限制性的。

可以通过参考以下实施例进一步说明本公开。

实施例

以下实施例旨在说明，但决不旨在限制如所附权利要求书中所阐述的本公开的范围。

实施例1-材料和方法。

小鼠-所有动物程序根据由Icahn School of Medicine at Mount SinaiInstitutional Animal Care and Use Committee(西奈山伊坎医学院动物护理和使用委员会)(IACUC)批准的方案进行。对于体外实验，从P0-P4α-肌球蛋白重链-mCherry(α-MHC-mCherry)转基因新生儿心脏(小鼠购自Jackson Laboratories)分离心脏成纤维细胞。对于谱系追踪研究，通过杂交TnnT-Cre小鼠(由Dr.Chen-Leng Cai赠予)和Rosa26mTmG(JacksonLaboratory)小鼠产生Tnnt2MerCreMer/+/R26mTmG/+小鼠。在11周龄时，将溶解在芝麻油中的他莫昔芬以0.1mg他莫昔芬/1g体重连续3天注射。注射他莫昔芬后一周通过永久结扎左前降支(LAD)动脉诱发心肌梗死(MI)。将雄性和雌性小鼠随机分成四个不同的组(Luc、7G、7G GMT(Hx2)和7G G(Mx2)TH)，并且在开胸手术期间将modRNA直接注射到心肌中。对于Echo、MRI和长期存活分析，8-10周龄的CFW小鼠在诱导MI后用四种modRNA类型治疗，并使其在动物设施中恢复6个月。监测并记录死亡情况。对于肢体缺血性研究，使用4月龄的ApoE-/-小鼠(雄性和雌性)。通过将股动脉与股神经和静脉分离，经由左股动脉的结扎诱导单侧后肢缺血，然后在髂内动脉和腘动脉水平处切割。在动脉结扎后，随机小鼠在腓肠肌中的3个不同位点接受Luc和7G的注射。

modRNA合成-通过质粒模板(Geneart,Thermo Fisher Scientific)的体外转录产生所有modRNA。用于制备本研究的modRNA的开放阅读框序列的完整列表可见于本文所示的表1中。转录步骤涉及抗反向帽类似物的定制核糖核苷酸共混物；30-O-Me-m7G(50)ppp(50)G(6mM,TriLink Biotechnologies)；鸟苷三磷酸(1.5mM,Life Technologies)；腺苷三磷酸(7.5mM,Life Technologies)；胞苷三磷酸(7.5mM,Life Technologies)和N1-甲基假尿苷-5-三磷酸(7.5mM,TriLink Biotechnologies)。接着，用Megaclear试剂盒(LifeTechnologies)纯化modRNA，并用Antarctic Phosphatase(New England Biolabs)处理。为了消除任何剩余的杂质，用Megaclear试剂盒再纯化modRNA，并使用Nanodrop光谱仪(Thermo Scientificc)定量。最后，用乙醇和乙酸铵沉淀modRNA并重悬在10mM Tris-HCl和1mM EDTA中。

modRNA转染-对于体外转染，按照由RNAiMAX制造商提供的说明书，将铺在24孔板和6孔板中的细胞分别使用编码各种基因的2.5ug的mRNA和10ug的mRNA，使用RNAiMAX转染试剂(Life Technologies)转染。根据先前公开的方法进行体内基因递送。Simeonov等人，“Direct Reprogramming of Human Fibroblasts to Hepatocyte-Like Cells bySynthetic Modified mRNAs,”PLoS One.9:e100134(2014)，其通过援引整体据此并入。使用蔗糖柠檬酸盐缓冲液递送modRNA，所述缓冲液含有在无核酸酶的水(0.3g/ml)中的20μl蔗糖和20μl柠檬酸盐(0.1M pH＝7；Sigma)与20μl的不同modRNA浓度的盐水混合至总体积为60μl。将转染混合物直接注射到MI周围的心肌中(两个在结扎的两侧，一个在顶端)，每个位点20μl。

细胞培养：小鼠心脏成纤维细胞培养-将从新生小鼠分离的心脏切成约1mm³大小的小块并在摇床上用在PBS和0.25％(wt/vol)胰蛋白酶中的II型胶原酶消化20分钟。消化后，将块状心脏组织在600g下离心2分钟，并在37℃下将成纤维细胞外植体培养基(Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)，含20％FBS)铺板于10cm培养皿中(每皿3-5只心脏)。孵育30分钟后，将板用PBS洗涤，并将细胞用新鲜培养基淬灭。当汇合时，用PBS洗涤附着的细胞，用5分钟0.05％胰蛋白酶处理收集并用成纤维细胞外植体培养基淬灭。然后通过70-μm过滤器过滤细胞并收集沉淀。然后，将细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)分选mCherry阴性细胞，以10000个细胞/cm²的浓度铺板到6孔明胶包被的板上，并新鲜用于所有重编程研究。用RNAimax转染modRNA 6小时后，用包含DMEM:M199(4:1)、10％FBS、1x非必需氨基酸(NEAA)和1x青霉素/链霉素的心肌细胞诱导培养基(iCM)替换培养基。然后，分别在感染后24小时和48小时添加SMI SB431542(2.6μM)和XAV939(5μM)。

细胞培养：人细胞系-正常人心脏成纤维细胞-心室(NHCF-V)购自Lonza(CC-2904)并且生长在心脏成纤维细胞生长培养基(Lonza,CC-4526)中。一旦半汇合，在用重编程基因转染之前3天用SV40-大T modRNA转染细胞以获得稳定的永生化细胞系。将细胞用不同的modRNA和SMI(无论何处提及)连续6天转染以进行WB，并连续14天转染以进行心肌细胞重编程测定。对于WB实验，在第1-6天期间每天收集细胞，而在第14天进行重编程分析(qPCR和ICC)。

免疫荧光–MI后28天，收获小鼠心脏，并通过在右心室腔室中注射1ml PBS除去过量的血液。通过在4％PFA中孵育过夜来固定心脏，随后用PBS洗涤至少1小时。然后将心脏置于4℃的30％蔗糖溶液中过夜。第二天，将心脏固定在OCT中并在-80℃冷冻。通过低温恒温器制备横向10μm厚的切片，并在PBS中再水合5分钟来进行免疫染色。所有染色以3-8只心脏/组进行，其中2-3个切片/心脏。为了在modRNA处理后免疫染色mCherry阴性的新生小鼠非CM，在室温下将细胞固定在含有4％PFA的盖玻片上15分钟，然后用PBST洗涤3次。用含0.1％triton X100的PBS(PBST)将细胞/组织透化7分钟，然后用第一抗体过夜染色。使用在PBST、GFP(Abcam,#13970)和tdTomato(Origene,#8181-200)中稀释的推荐浓度的肌节型α-辅肌动蛋白(Abcam,#9465)、心肌肌钙蛋白I(Abcam,#7003)和CD31(R&DSystems,#3628)。第二天，用PBST(5次，每次4分钟)洗涤载玻片，然后与在PBST中稀释的第二抗体(Invitrogen,1:200)在室温下孵育2小时。为了除去第二抗体，将样品进一步用PBST洗涤(3次，每次5分钟)，并用在PBST中稀释的Hoechst 33342(1μg/ml)染色7分钟。在用PBST洗涤5次，每次4分钟后，用封固剂(Vectashield)固定载玻片用于成像。将染色的载玻片储存在4℃下。在Zeiss荧光显微镜上以10X、20X和40X放大倍率拍摄荧光图像。

Masson三色染色-进行Masson三色染色以评估在MI和modRNA处理后LV中的瘢痕大小。将OCT冷冻的横向心脏切片在室温下风干30分钟至1小时，然后进行染色。将载玻片用Bouin溶液在55C预染色45分钟。然后，将载玻片保持在Weigert铁苏木精、BiebrichScarlet-Acid Fucshin、磷钨酸/磷钼酸溶液和苯胺蓝溶液中，持续制造商建议的时间。然后，组织样品用乙酸分化2分钟，并用95％乙醇和无水乙醇脱水。在用二甲苯清除后，用Permount封固剂(Fisher Scientific)固定载玻片。使用明视野显微镜采集图像，并使用ImageJ软件进行瘢痕大小分析。

H&E染色–H&E染色根据标准方案进行。将OCT冷冻的横向心脏切片在室温下风干30分钟至1小时，然后在PBS中水合10分钟。将载玻片保持在苏木精溶液中2分钟并用自来水洗涤5分钟。然后，用伊红溶液将切片染色1分钟，并用自来水洗涤5分钟。将载玻片转移到PBS中5分钟。然后将切片分别在100％乙醇和二甲苯中脱水1分钟。最后，用Permount封固剂(Fisher Scientific)固定切片。在明视场显微镜上拍摄图像。

蛋白质印迹-在给定的时间点从相应的细胞或解冻的组织分离总蛋白。使用SDS-PAG电泳系统在4％-15％Mini-PROTEAN TGX无染色凝胶(Bio-Rad)中解析来自每个样品的20μg蛋白质。将所得条带转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad)上。将膜在室温下封闭(5％BSA在Tris-缓冲盐水Tween 20(TBS；50mM Tris-HCl[pH 7.4],150mM NaCl,0.1％Tween 20)1小时，然后与在TBST中的5％BSA中稀释的第一抗体在4C下孵育过夜。使用抗-Flag(1:1,000,Sigma,#A8592)；抗-Vegfa(1:1,000,Abcam,#51745)；抗-GAPDH(辣根过氧化物酶[HRP]偶联物1:3,000,Cell Signaling,#8884)和小鼠单克隆抗-β-肌动蛋白(辣根过氧化物酶[HRP]偶联物1:3,000,Cell Signaling,#12262)抗体。抗兔和抗小鼠HRP偶联的第二抗体购自Cell Signaling。抗原或抗体复合物用ChemiDoc Touch成像系统(Bio-Rad)可视。

使用实时PCR进行RNA分离和基因表达分析-将Quick RNA试剂盒(Zymo Research)用于在上述时间点从细胞和缺血性小鼠组织分离总RNA，并根据制造商的说明书使用iScript^TM cDNA合成试剂盒(Bio Rad)进行逆转录。在Mastercycler Realplex 4序列检测器(Eppendorf)上使用SYBR Green(PerfeCTa SYBR Green FastMix,QuantaBio)进行实时qPCR分析。将数据归一化为GAPDH(体外实验和体内肢体组织实验)、18s(心脏组织的体内实验)和B2M(人体实验)。基因表达的倍数变化通过

方法测定并相对于内部对照呈现。PCR引物序列显示在表3中。

表3：本研究中用于qPCR的引物序列

超声心动图(Echo)-在MI后2天和28天进行经胸廓二维超声心动图，以使用配备有40MHz小鼠超声探针的GE Cares InSite(V7R5049)评估LV尺寸和功能。在双盲研究中(即，外科医生和超声心动图技术人员都不知道治疗)，将Luc、7G或7G GMT(Hx2)注射到CFW小鼠(8至12周龄)中。用空气中的1-2％异氟醚麻醉小鼠，并进行成像。射血分数和缩短分数计算为基于M型超声扫描的舒张期体积(EDV)和收缩末期体积(ESV)尺寸的百分比。％缩短分数计算为＝(舒张末期左心室内部尺寸(LVIDd)-收缩末期左心室内部尺寸(LVIDs))/LVIDd*100。对3-10个心脏/治疗组进行超声心动图检查。

磁共振成像(MRI)-在双盲研究中，在LAD结扎后第28天，对用Luc、7G或7G GMT(Hx2)modRNA处理的CFW小鼠(8周龄)进行MRI评估。在具有心脏和呼吸门控(SAInstruments)的7-T Bruker Pharmascan上获得延迟增强CINE图像。为了成像，用空气中的1-2％异氟醚麻醉小鼠。为了监测ECG期间的最佳温度，将呼吸和温度探针置于小鼠上。在IV注射0.3mmol/kg钆-二亚乙基三胺五乙酸后10至20分钟进行成像。用ECG触发和呼吸门控的FLASH序列获取从顶点到底部的8至10个短轴切片的堆叠，参数如下：回波时间(TE)为2.7msec，分辨率为200μm×200μm；切片厚度为1mm；每R-R间隔16帧；4次激发，具有60°的翻转角。成像后，分析获得的数据以计算％射血分数、心输出量、每搏量和％MI大小。

免疫检测方法-在MI和modRNA注射后28天对从小鼠分离的心脏组织进行渗漏血管检测。同工凝集素B4(0.5mg/ml,Vector Lab)用于在冷冻切片中染色内皮细胞以确定毛细血管密度。为了评估血管渗漏，将250μl同工凝集素B4和250μl 70kD FITC-葡聚糖珠(50mg/ml,Sigma)的混合物注射到小鼠尾静脉中。注射后30分钟收集心脏并使用4％PFA固定过夜。用PBS洗涤4次后，将心脏置于30％蔗糖中过夜，第二天在OCT中冷冻。在显微镜下评估切片的心脏组织的血管泄漏。

缺血肢体模型中的血流分析-使用激光多普勒灌注成像(LDPI)分析仪(MoorInstruments,Axminster,UK)，在预定时间点在结扎和对照肢体中进行血流测量。除去后肢毛发并将动物保持在37℃的加热垫上以最小化温度变化。在缺血和给药modRNA后第0天(结扎前)、1天、7天、14天和21天记录血流。通过比较缺血肢体与对照后肢的血流来计算血液灌注％。

统计分析-通过非配对双尾t检验、单向ANOVA、Tukey多重比较检验、单向ANOVA、Bonferroni事后检验或存活曲线的Log-rank(Mantel-Cox)检验来确定统计显著性，如各自图例中所详述。p-值<0.05被视为是显著的。所有的图形表示平均值，并且值被报告为平均值±平均值的标准误差。非配对双尾t检验基于假定的正态分布。****,P<0.0001***,P<0.001,**,P<0.01,*,P<0.05,N.S，不显著。

实施例2-modRNA组合物将成纤维细胞重编程为心肌细胞样细胞。

从携带转基因的小鼠中分离出心脏成纤维细胞，其中α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子是富含心肌细胞的蛋白质，可驱动标记蛋白mCherry的表达并用不同的modRNA组合转染，包括GATA4加Mef2c加Tbx5(GMT)、GMT加Hand2(GMTH)、GMT加ASAH1(GMTA)、或GMT、GMTH、或GMTHA加TGFB小分子抑制剂SB431542和Wnt8a小分子抑制剂XAV939)(SMI)。modRNA包括代替尿苷的假尿苷并用试剂处理以形成5'UTR Cap 1结构(CLEANCAP^TM)。所有处理都增加了也表达mCherry的α-辅肌动蛋白阳性细胞数，表明采用了心肌细胞表型。在用GMTHA+SMI处理后，观察到这种细胞的最高数量。处理还增加了心肌肌钙蛋白(cTNT)表达，进一步表明心肌成纤维细胞采用心肌细胞表型，在包括Hand2 modRNA的组合中观察到最高水平。在其他处理条件下，包含dnTGFB modRNA代替SB431542或dnWnt8a modRNA代替XAV939也增加mCherry表达和cTNT表达。

在用所有七种GATA4、Mef2c、Tbx5、Hand2、ASAH1、dnTGFB和dnWnt8a modRNA处理后，观察到最高水平的mCherry表达。转染后三周，接受这种处理的细胞也显示自主收缩，进一步证实了心肌细胞样表型。细胞接受不同相对量的不同modRNA分子，如表4所示：

表4：不同处理中的modRNA分子的比例

图1中例示出一些实例。所有处理引起cTNT和α-MHC表达的增加。有趣且令人惊奇的是，将GATA4、Mef2c、Tbx5或Hand2增加50％(由剩余的GATA4、Mef2c、Tbx5或Hand2 modRNA减少30％抵消，取决于实施例)消除了心肌细胞蛋白表达的增加。用附加modRNA分子转染不会进一步增加。

实施例3-小鼠中的modRNA组合物增加心肌细胞样细胞并改善心脏健康。

将具有驱动他莫昔芬诱导的Cre重组酶表达的心肌肌钙蛋白T启动子的小鼠与携带由Rosa26启动子驱动的mT/mG报告基因的转基因小鼠杂交。用他莫昔芬处理的双转基因小鼠表达细胞膜定位的tdTomato(mT)荧光，但表达Cre重组酶的细胞(和将来衍生自这些细胞的细胞谱系)(在这种情况下是心肌细胞)具有细胞膜定位的EGFP(mG)荧光。因此可以通过细胞膜定位的EGFP的表达来鉴定心肌细胞。

在8周龄时用他莫昔芬治疗小鼠。在10周龄时，它们被给予心肌梗死(MI)事件(左前降支动脉的结扎)。在12和13周龄时发生modRNA注射。在15周龄时，测试心脏功能和细胞表达。如图2所示，在具有MI事件的小鼠中，用单独的7G GMT(Hx2)、7G或GMT处理都引起梗死中心肌细胞样细胞的增加。如图3所示，与荧光素酶转染的对照小鼠相比，7G和7GGMT(Hx2)处理显著增加了射血分数，表明改善了心脏功能。图4显示与对照相比，7G GMT(Hx2)显著增加了心输出量，再次表明改善了心脏健康。图5显示与对照相比，7G GMT(Hx2)显著增加了每搏量，再次表明改善了心脏健康。图6显示与对照相比，7G GMT(Hx2)显著增加了缩短分数，再次表明改善了心脏健康。图7显示7G和7G GMT(Hx2)引起梗死大小的显著减小。图8和图9显示在7G处理后增加的毛细血管密度和VEGF-A表达。

实施例4-七种基因modRNA混合物(7G)可以在体外诱导小鼠或人非CM的高效心脏重编程。

为了证明modRNA技术可用于将成年小鼠非CM重编程为CM样细胞，产生了先前公开的基于αMHC-mCherry转基因小鼠的体外谱系追踪模型(Ieda等人，“Direct Reprogrammingof Fibroblasts Into Functional Cardiomyocytes by Defined Factors,”Cell 142:375-86(2010)和Qian等人，“In Vivo Reprogramming of Murine Cardiac FibroblastsInto Induced Cardiomyocytes,”Nature 485:593-8(2012)，两者通过援引整体据此并入)。在该模型中，携带αMHC-mCherry的小鼠的CM表达mCherry，而非CM是mCherry阴性的。使用酶解离方法，从新生小鼠心脏分离心脏细胞并培养3天，然后使用FACS分选mCherry阴性细胞。将分离的mCherry阴性细胞铺板，并且一旦细胞达到部分汇合就开始modRNA转染。通过mCherry报告基因在上调αMHC(CM-特异性细胞标志物)的非CM亚组中的表达证实了体外成功的心脏重编程(图10A)。由于modRNA导致瞬时基因表达，重复转染可以补充转染细胞中的基因表达。为了优化重编程的GMT转染效率，用GFP或GMT modRNA(flag标签)转染非CM细胞，并使用蛋白质印迹在不同的时间点(第1天至第6天)测量它们的表达(图10B)。观察到GMT表达直到modRNA转染后第3天，而不是4天(图10C)。因此，从αMHC-mCherry小鼠分离的非CM每3天用GMT modRNA转导，持续14天，然后用qPCR和免疫染色评估心脏重编程(图10D)。

GMT或GMTH驱动的心脏重编程可以通过抑制TGFβ和/或WNT途径来增强。Abad等人，“Notch Inhibition Enhances Cardiac Reprogramming by Increasing MEF2CTranscriptional Activity,”Stem Cell Reports 8:548-560(2017)；Ifkovits等人，“Inhibition of TGFβSignaling Increases Direct Conversion of Fibroblasts toInduced Cardiomyocytes,”PLoS One.9:e89678(2014)；和Mohamed等人，“ChemicalEnhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming,”Circulation135:978-995(2017)，所有文献通过援引整体据此并入。此外，由于重编程过程和重复使用转染试剂可导致增加的细胞死亡率，设计了降低细胞凋亡和应激的modRNA主链。Strelow等人已经表明酸性神经酰胺酶(AC)过表达保护细胞免于细胞死亡升高并减少细胞应激。Strelow等人，“Overexpression of Acid Ceramidase Protects From Tumor NecrosisFactor-Induced Cell Death,”J.Exp.Med.192:601-12(2000)，其通过援引整体据此并入。因此，如图10D所示，将未处理的非CM与仅用GMT或用GMT与Hand2或AC(GMTH或GMTHA)modRNA混合物以及抑制TGFβ和WNT途径的小分子(SMI)处理的组(分别为SB431542和XAV939)或者用GMTHA与抑制TGFβ(TGFβ或CCN5的显性负性(DN))和WNT途径(DN-Wnt8或Wnt5a)的基因modRNA处理的组进行比较。用GMT、GMTH或GMTHA modRNA混合物以及SB431542和XAV939处理的组在第一次转染后14天显示心脏重编程活性，通过上调的肌钙蛋白T(cTNT)和αMHC所示(图10E和图10F)。值得注意，GMTHA产生最高的重编程速率：48％CM样细胞(αMHC⁺和α辅肌动蛋白⁺细胞，图10G和图10H)。

此外，显示了重编程辅助小分子SB431542和XAV939都可以被重编程辅助modRNA(分别为DN-TGFβ或CCN5以及DN-Wnt8或Wnt5a modRNA)替代，而不损失重编程效率(图10I-图10L)。该数据表明，7种基因(7G)modRNA混合物(具有DN-TGFβ和DN-Wnt8的GMTHA)显著提高了cTNT和αMHC(图10I和图10J)，在体外第一次转染后14天产生57％的CM样细胞(图10K和图10L)。此外，重编程的CM样细胞中的胶原和纤连蛋白基因表达水平显著低于体外未处理的非CM中的表达水平(图10M)。重要的是，重复转染28天而不是21天导致形成少量具有成熟肌节结构和完全心脏重编程的收缩性CM样细胞(图10N-图10P)。

然后，评估7G modRNA是否在人心室心脏成纤维细胞中诱导心脏重编程。首先，进行蛋白质表达分析以证实GMT modRNA动力学与小鼠非CM中的动力学相似(图16A-图16B)。研究了不同的转染试剂，发现也与小鼠非CM类似，RNAiMAX转染试剂与其他市售转染试剂相比具有最高的转染效率(～80％)(图16C-图16E)。由于先前的报告表明SV40预处理(Fu等人，“Direct Reprogramming of Human Fibroblasts Toward a Cardiomyocyte-LikeState,”Stem Cell Reports 1:235-47(2013)；Nam等人，“Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiac Fate,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A110:5588-93(2013)；Singh等人，“MiR-590Promotes Transdifferentiation of Porcine and HumanFibroblasts Toward a Cardiomyocyte-Like Fate by Directly RepressingSpecificity Protein 1,”J.Am.Heart Assoc.5(2016)；和Wada等人，“Induction ofHuman Cardiomyocyte-Like Cells From Fibroblasts by Defined Factors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.110:12667-72(2013)，所有文献通过援引整体据此并入)和Myocd添加(Fu等人，“Direct Reprogramming of Human Fibroblasts Toward aCardiomyocyte-Like State,”Stem Cell Reports 1:235-47(2013)；Nam等人，“Reprogramming of Human Fibroblasts Toward a Cardiac Fate,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 110:5588-93(2013)；Wada等人，“Induction of HumanCardiomyocyte-Like Cells From Fibroblasts by Defined Factors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.110:12667-72(2013)，所有文献通过援引整体据此并入)产生更好的心脏重编程，因此在用或不用6种基因modRNA(GMT+Myocd+Hand2+AC(GMTMHA))以及重编程辅助小分子SB431542和XAV939或者可以抑制TGFβ和WNT途径的不同基因modRNA转染之前第3天用SV40 modRNA预处理人心室心脏成纤维细胞(图16F)。这些体外结果表明，在第一次心脏重编程转染后14天，GMTMHA+DN-TGFβ和DN-WNT8或GMTMHA+DN-TGFβ和WNT5amodRNA混合物显著增加cTNT和αMHC(图16G-图16H)，降低胶原表达(图16I)并且产生30-40％CM样细胞(图16J和图16K)。

实施例5–筛查附加基因以提高7G的重编程效率。

由于7G modRNA可在体外产生有效的心脏重编程，因此接下来评估是否添加一个或多个选择的候选基因可以增强7G心脏重编程。预先选择具有增加心脏重编程潜力的基因(Zfpm2(Fu等人，“Direct Reprogramming of Human Fibroblasts Toward aCardiomyocyte-Like State,”Stem Cell Reports1:235-47(2013)，其通过援引整体据此并入)、Tbx6(Sadahiro等人，“Tbx6Induces Nascent Mesoderm from Pluripotent StemCells and Temporally Controls Cardiac versus Somite Lineage Diversification,”Cell Stem Cell.23:382-395e5(2018)，其通过援引整体据此并入)、DN-SNAI1(Muraoka等人，“MiR-133Promotes Cardiac Reprogramming by Directly Repressing Snai1 andSilencing Fibroblast Signatures,”EMBO J.33:1565-81(2014)，其通过援引整体据此并入)、Mesp1(Christoforou等人，“Transcription Factors MYOCD,SRF,Mesp1 and SMARCD3Enhance the Cardio-Inducing Effect of GATA4,TBX5,and MEF2C During DirectCellular Reprogramming,”PLoS One 8:e63577(2013)，其通过援引整体据此并入)、Ets1(Islas等人，“Transcription Factors ETS2 and MESP1 Transdifferentiate HumanDermal Fibroblasts Into Cardiac Progenitors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A109:13016-21(2012)，其通过援引整体据此并入)、Ets2(Islas等人，“Transcription FactorsETS2 and MESP1 Transdifferentiate Human Dermal Fibroblasts Into CardiacProgenitors,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 109:13016-21(2012)，其通过援引整体据此并入)、Esrrg(Fu等人，“Direct Reprogramming of Human Fibroblasts Toward aCardiomyocyte-Like State,”Stem Cell Reports1:235-47(2013)，其通过援引整体据此并入)、SMarcd3(Christoforou等人，“Transcription Factors MYOCD,SRF,Mesp1 andSMARCD3 Enhance the Cardio-Inducing Effect of GATA4,TBX5,and MEF2C DuringDirect Cellular Reprogramming,”PLoS One 8:e63577(2013)，其通过援引整体据此并入)或Srf(Christoforou等人，“Transcription Factors MYOCD,SRF,Mesp1 and SMARCD3Enhance the Cardio-Inducing Effect of GATA4,TBX5,and MEF2CDuring DirectCellular Reprogramming,”PLoS One 8:e63577(2013)，其通过援引整体据此并入)或者其在心脏收缩性(SUMO1)、细胞存活率(Ad52E4)、新生儿心脏代谢(Pkm2)或端粒大小(hTERT)具有已知功能。尽管所有的7GmodRNA混合物与附加候选modRNA基因产生显著的心脏重编程(图17A-图17D)，但它们中没有一个提供了与单独的7G相似或显著更高的心脏重编程活性(图17E-图17F)。

实施例6-具有相等比例或更高浓度的Hand2或Mef2c的7G modRNA混合物在体外小鼠非CM中产生高心脏重编程活性。

modRNA基因递送方法相对于病毒的一个优点是能够控制被递送到细胞中的mRNA的量。因此，探讨了7G modRNA混合物中不同比例的重编程基因modRNA(GMTH)在驱动心脏重编程中的潜力(图11A-图11B)。如图11A-图11F所示，与TBX5或GATA4相比，Hand2或Mef2C的两倍但非三倍浓度在体外产生与7G相似的心脏重编程活性(图11E-图11F)。因此，推断7GmodRNA混合物或增强的Hand2 7G modRNA混合物(7G GMT(HX2))或增强的Mef2c 7G modRNA混合物(7G G(MX2)TH)在体外转染后14天具有～50％的心脏重编程效率。

实施例7-7G或7G GMT(HX2)modRNA混合物改善MI后的结果。

除了在体外评估心脏重编程之外，还评估了7G modRNA混合物改善MI后的功能结果的能力。为此，使用MI的小鼠模型，并在MI后2天和28天测量心脏功能(图12A-图12O和图18A-图18D)。MI后Luc或7GmodRNA递送后28天的MRI评估(图12B-图12F)表明，在以下方面显著改善：射血分数百分比(％EF，7G为48％)与对照modRNA(萤光素酶(Luc))的22％相比；在心输出量(CO，7G为14％)与对照的11％相比；每搏量(SV，7G为38％，与对照的28％相比)和MI大小(7G为10％，与对照的24％相比)。为了证实这些改善不是由于MI诱导的差异，在MI并用不同modRNA混合物处理后2天和28天测量％缩短分数(％FS)以及舒张末期(LVIDd)和收缩末期(LVIDs)的左心室内部尺寸(LVID)。百分比FS显著较高(7G为2.5％，与对照的-2.4％相比(图12G)。此外，虽然在对照组的第2天和第28天之间LVIDd和LVIDs都显著不同(图12H和图12I)，但当递送7G modRNA混合物时，这些差异并不显著。还评估了MI和不同处理后28天的心脏瘢痕形成和细胞外标志物如胶原和纤连蛋白的表达(图12J-图12M)。显示用7GmodRNA混合物处理的小鼠中的心脏瘢痕与对照的21％相比明显更小(10％)(图3J-图3L)，并且具有更低的胶原和纤连蛋白的表达(图3M)。

重要的是，与对照相比，具有更高浓度的Mef2c(7G G(Mx2)TH的7G没有改善心脏瘢痕形成或心脏功能(图18A-图18D)，而增加Hand2(7G GMT(HX2)modRNA)显示出与7G modRNA类似的有益效果。该发现表明体内较高浓度的Hand2而非Mef2c对MI后的结果具有有益效果。最后，显示7G modRNA混合物显著改善MI后6个月小鼠存活率(图12N和图12O)。

实施例8-7G modRNA混合物上调LV中的血管生成旁分泌因子分泌并促进MI后的心血管再生。

由于7G modRNA混合物促进体外CM样细胞形成并改善MI后结果，因此评估它们在体内诱导CM样细胞的能力。为此，使用谱系追踪模型(TnnT^Cre/mTmG小鼠，图19A-图19B)，其以绿色(GFP)预先标记心脏中的所有预先存在的CM，而以红色(tdTomato⁺)标记所有非CM。显示在MI和将7GmodRNA混合物递送到LV中后第4周，总非CM(tdTomato⁺细胞)中存在24％CM样细胞(tdTomato⁺和cTnI⁺细胞)(图13A-图13C)。值得注意的是，这些CM样细胞缺少成熟的肌节结构，并且比现有的成熟CM小得多(图13B)。由7G modRNA混合物形成的未成熟的、部分重编程的CM样细胞不太可能有助于心肌再生。因此，推测7G modRNA混合物的有益作用机制可能通过旁分泌效应来诱导MI后的心血管再生而发生。为了检验这一推测，在MI并且递送不同的modRNA后28天评估LV毛细血管密度。显示与对照相比，7G modRNA混合物显著提高了LV中的毛细血管密度(图13D-图13F)。为了评估7G modRNA混合物血管生成因子分泌的作用，使用qPCR来测量16种预先选择的已知其增加血管形成和成熟的能力的关键血管生成因子的基因表达。在MI并且递送7G modRNA混合物或Luc对照modRNA后一周、两周、三周和四周评估Vegfa(Haro等人，“Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)-InducedAngiogenesis in Herniated Disc Resorption,”J.Orthop.Res.20:409-15(2002)，其通过援引整体据此并入)、Vegfb(Robciuc等人，“VEGFB/VEGFR1-Induced Expansion ofAdipose Vasculature Counteracts Obesity and Related Metabolic Complications,”Cell Metab.23,712-24(2016)，其通过援引整体据此并入)、Vegfc(Cao等人，“VascularEndothelial Growth Factor C Induces Angiogenesis In Vivo,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 95:14389-94(1998)，其通过援引整体据此并入)、Vegfd(Rissanen等人，“VEGF-D is the Strongest Angiogenic and LymphangiogenicEffector Among VEGFs Delivered Into Skeletal Muscle Via Adenoviruses,”Circ.Res.92:1098-106(2003)，其通过援引整体据此并入)、Ang1(Koblizek等人，“Angiopoietin-1Induces Sprouting Angiogenesis In Vitro,”Curr.Biol.8:529-32(1998)，其通过援引整体据此并入)、Angpt1(Rosa等人，“The Angiogenic FactorAngiopoietin-1is a Proneurogenic Peptide on Subventricular Zone Stem/progenitor Cells,”J.Neurosci.30:4573-84(2010)，其通过援引整体据此并入)、Lep(Zhou等人，“Leptin Pro-Angiogenic Signature in Breast Cancer is Linked to IL-1Signalling,”Br.J.Cancer 104:128-37(2011)，其通过援引整体据此并入)、Plf(Toft等人，“Reactivation of Proliferin Gene Expression is Associated With IncreasedAngiogenesis in a Cell Culture Model of Fibrosarcoma Tumor Progression,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 98:13055-9(2001)，其通过援引整体据此并入)、Tgfβ(Vinals等人，“Transforming Growth Factor Beta1(TGF-beta1)Promotes Endothelial CellSurvival During In Vitro Angiogenesis Via an Autocrine Mechanism ImplicatingTGF-alpha Signaling,”Mol.Cell Biol.21:7218-30(2001)，其通过援引整体据此并入)、Hgf(Kaga等人，“Hepatocyte Growth Factor Stimulated Angiogenesis WithoutInflammation:Differential Actions Between Hepatocyte Growth Factor,VascularEndothelial Growth Factor and Basic Fibroblast Growth Factor,”Vascul.Pharmacol.57:3-9(2012)，其通过援引整体据此并入)、Areg(Wang等人，“Amphiregulin Enhances VEGF-A Production in Human Chondrosarcoma Cells andPromotes Angiogenesis by Inhibiting miR-206via FAK/c-Src/PKCδPathway,”CancerLett.385:261-270(2017)，其通过援引整体据此并入)、Fgfa(Murakami等人，“FibroblastGrowth Factor Regulation of Neovascularization,”Curr.Opin.Hematol.15:215-20(2008)，其通过援引整体据此并入)、Fgfb(Murakami等人，“Fibroblast Growth FactorRegulation of Neovascularization,”Curr.Opin.Hematol.15:215-20(2008)，其通过援引整体据此并入)、Egf(Mehta等人，“HB-EGF Promotes Angiogenesis in EndothelialCells via PI3-kinase and MAPK Signaling Pathways,”Growth Factors 25:253-63(2007)，其通过援引整体据此并入)、Tb4(Lv等人，“Thymosin beta4 InducesAngiogenesis Through Notch Signaling in Endothelial cells,”Mol.CellBiochem.381:283-90(2013)，其通过援引整体据此并入)和Pdgf(Xie等人，“PDGF-BBSecreted by Preosteoclasts Induces Angiogenesis During Coupling withOsteogenesis,”Nat.Med.20:1270-8(2014)，其通过援引整体据此并入)(图13G、图13H)。在MI后1周至4周，16个(FGF-2除外)中有15个血管生成因子显著上调。当在MI后递送7G GMT(Hx2)modRNA混合物时，可以看到类似的结果(图20A-图20H)。这表明7G和7G GMT(Hx2)modRNA混合物递送可能在MI背景后诱导血管生成机制。此外，这种作用在modRNA递送后1周开始(图21A-图21G)，并持续至少4周，在modRNA翻译停止后很长时间(约第10天)。

由于Vegfa蛋白是心脏血管形成的关键调节因子(Zangi等人，“Modified mRNADirects the Fate of Heart Progenitor Cells and Induces Vascular RegenerationAfter Myocardial Infarction,”Nat.Biotechnol.31:898-907(2013)和Kikuchi等人，“AnAntiangiogenic Isoform of VEGF-A Contributes to Impaired Vascularization inPeripheral Artery Disease,”Nat.Med.20:1464-71(2014)，两者通过援引整体据此并入)，蛋白质印迹分析用于评估在MI和不同modRNA处理后21天或28天的Vegfa水平。显示MI后28天而非21天Vegfa水平在LV中明显较高(图13G-13J以及图21H和图21I)。此外，在MI以及各种处理后不同时间点LV的qPCR评估表明，7G或7G GMT(Hx2)modRNA混合物降低了Col1a2和纤连蛋白的水平(图21E-图21F)，特别是在MI后第2周时。由于MI后心脏中高的不受调节的Vegfa水平可能会产生有害的副作用，例如水肿和血管瘤，并且可能导致血管渗漏(Zangi等人，“Modified mRNA Directs the Fate of Heart Progenitor Cells andInduces Vascular Regeneration After Myocardial Infarction,”Nat.Biotechnol.31:898-907(2013)和Lee等人，“VEGF Gene Delivery to Myocardium:Deleterious Effectsof Unregulated Expression,”Circulation 102:898-901(2000)，两者通过援引整体据此并入)，在MI以及不同modRNA混合物处理后的不同时间点评估心脏中这些因子(图22A-图22E)。根据图21A-图21G可以看出，在MI后28天，与Luc对照modRNA相比，7G和7G GMT(Hx2)modRNA混合物没有显著改变心脏重量与体重比例(图22B)或心脏大小(图22C)，并且没有在心肌中诱导血管瘤形成(图22D)或渗漏血管(图22E)。得出结论，尽管7G和7G GMT(Hx2)modRNA混合物都提高了MI后LV中的Vegfa蛋白水平(图13I、图13J)，但这种提高与Vegfa的有害作用无关(图22A-图22E)。此外，还确定了在使用或不使用modRNA混合物转染后14天，来自小鼠或人心脏的非CM的心脏重编程是否还可以诱导较高的Vegfa表达。小鼠(图23A、图23B)和人(图23C、图23D)心脏重编程导致显著增加的Vegfa表达，证明非CM细胞向CM样细胞的转化可以开启促血管生成程序，促进该修复过程。

为了进一步评估非CM中的这种促血管生成程序，试图检测在非心肌(例如，骨骼肌)的缺血条件下注射7G modRNA是否可以导致损伤后增强血管形成。将先前示出的ApoE-/-小鼠后肢缺血模型用作骨骼肌的血管再生的优选模型。Kang等人，“Apolipoprotein E-/-Mice Have Delayed Skeletal Muscle Healing After Hind LimbIschemia-Reperfusion,”J.Vasc.Surg.48:701-8(2008)，其通过援引整体据此并入。在股动脉结扎后立即注射7GmodRNA混合物或Luc modRNA。使用激光多普勒灌注成像评估损伤后第0、1、7、14和21天足部区域中的血液灌注(图14A)。数据显示，与Luc modRNA相比，7GmodRNA混合物显著促进血液灌注的改善(图14B和图14C)。此外，表明在肌肉缺血性损伤并且递送7G modRNA混合物后，与Luc对照modRNA相比，与心脏组织类似，关键血管生成因子表达显著不受调节。总而言之，该数据表明，7G modRNA混合物在心脏和骨骼肌中的细胞中诱导促血管生成程序(图15)。

实施例9-讨论。

哺乳动物心脏含有～50％的CM，而余者是非CM。心脏缺血性损伤后，大量的CM死亡并被非CM细胞类型替代。克服这种CM比例不平衡的一种方法是将非CM重编程为CM，由此从头生成CM。使用这种重编程用于心脏修复的主要障碍是心脏重编程的低效力以及使用病毒递送方法和小分子的可能的有害的副作用。在本公开中，表明通过modRNA技术递送重编程基因和辅助基因消除了对病毒转染或小分子的需求，并且在体外和体内产生大量的CM样细胞。迄今为止，在转染后14天报告的最高重编程效率产生～30％CM样细胞。Mohamed等人，“Chemical Enhancement of In Vitro and In Vivo Direct Cardiac Reprogramming,”Circulation 135:978-995(2017)和Nam等人，“Induction of Diverse Cardiac CellTypes by Reprogramming Fibroblasts With Cardiac Transcription Factors,”Development 141:4267-78(2014)，两者通过援引整体据此并入。在此，证明了使用7G或7GGMT(Hx2)modRNA混合物增加了重编程活性并在体外产生了～50％CM样细胞(图10A-图10P、图11A-图11F)。还表明使用7G+Myocd或GMTMHA+DN-TGFβ和WNT5a modRNA混合物在人心室心脏成纤维细胞中产生30％或40％的重编程效率(图16A-图16J)。这些结果与先前用GHTM、miR-1和miR133a进行人心脏重编程的报告相似。Nam等人，“Reprogramming of HumanFibroblasts Toward a Cardiac Fate,”Proc.Natl.Acad.Sci.U S A110:5588-93(2013)，其通过援引整体据此并入。另外，重复转染28天产生成熟样收缩CM的事实得到以下结论：modRNA是用于体外诱导CM样细胞的有效且安全的基因递送系统(图10N-图10P)。在重编程基因modRNA比例中的任何附加基因或改变不能被鉴定为提供更高的重编程水平。然而，显示将任何心脏重编程基因升高三倍，消除了重编程过程(图11A-11F)。这表明每种重编程基因都起到重要作用，并且它们中任何一个的缺乏或低水平都阻止重编程。

使用谱系追踪体内模型可以证实，在MI并且递送7G modRNA混合物后第28天，modRNA成功地促进LV中形成～25％CM样细胞(图13A-图13C)。这是比先前公开的在体内12％心脏重编程更高的心脏重编程效率。Jayawardena等人，“MicroRNA Induced CardiacReprogramming In Vivo:Evidence For Mature Cardiac Myocytes and ImprovedCardiac Function,”Circ.Res.116：418-24(2015)，其通过援引整体据此并入。尽管如此，在CM样细胞群中没有检测到具有成熟肌节的CM。这可能是由于以下发现：短期(约10天)使用modRNA递送平台不足以有效地将非CM重编程为成熟的收缩CM，如先前使用具有长期表达模式的病毒递送系统所显示的。Song等人，“Heart Repair by Reprogramming Non-Myocytes With Cardiac Transcription Factors,”Nature 485:599-604(2012)，其通过援引整体据此并入。即使没有从头形成成年CM，该方案也导致在MI并且递送7G或7G GMT(HX2)modRNA混合物后28天心脏功能、瘢痕大小和长期存活率的显著改善(图12A-图12和图18A-图18D)。还证明了这种改善是由于modRNA部分心脏重编程过程中血管生成因子的诱导(图13A-图13J、图20A-图20H、图21A-图21G)。由于modRNA基因递送保持了DNA完整性并且还没有显示出诱导插入诱变，因此希望对于临床基因递送而言，modRNA比慢病毒或逆转录病毒系统更优选。然而，这些基因转移病毒方法在LV中生成少量的功能性CM，并且它们的临床应用具有严重的不利副作用。此外，还表明modRNA可以在重编程过程中消除对抑制TGFβ和WNT途径的小分子的需求。这使得所有-modRNA混合物的组合物能够增强心脏重编程并导致MI后更高的毛细血管密度和心血管再生。

重要的是，这种modRNA重编程混合物不会导致异常的结果，例如心脏血管瘤或水肿(图22A-图22E)。这表明分泌的血管生成因子的modRNA上调被严格调节。因此，modRNA指导的心脏重编程对成熟的CM没有贡献；相反，通过旁分泌效应促进MI后的心脏保护和心血管再生。在这点上，这些发现与先前将血管生成因子分泌细胞(大多数是骨髓源细胞)递送至LV以促进心血管再生的尝试(Gong等人，“Exosomes Derived From SDF1-overexpressing Mesenchymal Stem Cells Inhibit Ischemic Myocardial CellApoptosis and Promote Cardiac Endothelial Microvascular Regeneration in MiceWith Myocardial Infarction,”J.Cell Physiol.234:13878-13893(2019)；Leong等人，“Cardiac Stem Cells for Myocardial Regeneration:They Are Not Alone,”FrontCardiovasc Med.4:47(2017)；Lader等人，“Cardiac Stem Cells for MyocardialRegeneration:Promising But Not Ready For Prime Time,”Curr.Opin.Biotechnol.47:30-35(2017)；Beltrami等人，“Adult Cardiac Stem Cells are Multipotent andSupport Myocardial Regeneration,”Cell 114:763-76(2003)；Yoon等人，“ClonallyExpanded Novel Multipotent Stem Cells From Human Bone Marrow RegenerateMyocardium After Myocardial Infarction,”J.Clin.Invest.115:326-38(2005)，所有文献通过援引整体据此并入)类似，益处微不足道。因此，modRNA方法可以为改进先前无效的细胞因子递送方法以激发心脏修复奠定基础。此外，表明7G modRNA能够促进心脏组织外的促血管生成程序(例如，骨骼肌，图14A-图14E)的能力，表明7G，其中4个基因(Gata4、Mef2c、Tbx5和Hand2)是心脏发育基因，可能不只在心脏组织中起作用，还可以促进心脏外的非CM中的促血管生成程序。这一数据揭示了部分心脏重编程的有益作用机制，其可以促进缺血性肌肉损伤后的血管再生。此外，报告了7G modRNA混合物在心脏外的其他缺血性器官中诱导血管生成的显著性能，为此采用了后肢缺血模型。尽管之前已经表明VEGFA modRNA在缺血性心脏或骨骼肌小鼠模型中增强了血管再生(Zangi等人，“Modified mRNA Directs theFate of Heart Progenitor Cells and Induces Vascular Regeneration AfterMyocardial Infarction,”Nat.Biotechnol.31:898-907(2013)和Witman等人，“Cell-Mediated Delivery of VEGF Modified mRNA Enhances Blood Vessel Regenerationand Ameliorates Murine Critical Limb Ischemia,”J.Control Release 310:103-114(2019)，其通过援引整体据此并入),但在此确定了7G混合物在modRNA翻译完成后很久增强非CM在生理水平上分泌血管生成因子，并且诱导体内血管再生，为缺血性损伤的治疗提供了先进的策略。

自2002年以来，骨髓源细胞已经在许多临床试验中被用于在患有急性MI和慢性缺血性心脏病或慢性危重肢体缺血性疾病的患者中诱导血管再生。Leong等人，“CardiacStem Cells for Myocardial Regeneration:They Are Not Alone,”Front CardiovascMed.4:47(2017)和Ponemone等人，“Safety and Effectiveness of Bone Marrow CellConcentrate in the Treatment of Chronic Critical Limb Ischemia Utilizing aRapid Point-of-Care System,”Stem Cells Int.4137626(2017)，其通过援引整体据此并入。多年的临床试验表明，这种治疗是安全的并产生生理和解剖参数的适度改善，超过常规治疗。Leong等人，“Cardiac Stem Cells for Myocardial Regeneration:They Are NotAlone,”Front Cardiovasc Med.4:47(2017)和Ponemone等人，“Safety andEffectiveness of Bone Marrow Cell Concentrate in the Treatment of ChronicCritical Limb Ischemia Utilizing a Rapid Point-of-Care System,”Stem CellsInt.4137626(2017)，其通过援引整体据此并入。然而，这种方法的根本问题是注射细胞的存活率差，并且需要增加离体培养细胞的数量，通常来自相同的供体。Gong等人，“ExosomesDerived From SDF1-overexpressing Mesenchymal Stem Cells Inhibit IschemicMyocardial Cell Apoptosis and Promote Cardiac Endothelial MicrovascularRegeneration in Mice With Myocardial Infarction,”J.Cell Physiol.234:13878-13893(2019)；Leong等人，“Cardiac Stem Cells for Myocardial Regeneration:TheyAre Not Alone,”Front Cardiovasc Med.4:47(2017)；Lader等人，“Cardiac Stem Cellsfor Myocardial Regeneration:Promising But Not Ready For Prime Time,”Curr.Opin.Biotechnol.47:30-35(2017)；Beltrami等人，“Adult Cardiac Stem Cellsare Multipotent and Support Myocardial Regeneration,”Cell 114:763-76(2003)；Yoon等人，“Clonally Expanded Novel Multipotent Stem Cells From Human BoneMarrow Regenerate Myocardium After Myocardial Infarction,”J.Clin.Invest.115:326-38(2005)，所有文献通过援引整体据此并入。因此，这种方法是使用现成的modRNA混合物，其可以将来自瘢痕区域的非CM转化为血管生成因子分泌细胞(类似于骨髓源细胞)而没有移植问题或没有离体培养细胞的需求。

尽管表明modRNA血管生成作用也在人心脏重编程中产生(图23A-图23D)，但需要定量modRNA混合物在大动物模型(例如猪)中诱导血管再生中的作用。总之，本研究的实验揭示了7G modRNA混合物在缺血性肌肉损伤后的治疗血管生成功能，并且可以鼓励其他人创建不同的、新的modRNA混合物用于部分或完全重编程或其他类型的多组分药物发现。

虽然已经在附图和上文的描述中详细地说明和描述了新技术，但应将其视为说明性的而非限制性的，应理解，仅示出并描述了优选实施方式，并且希望保护落入新技术的精神内的所有改变和修改。同样，尽管使用具体的实例、理论论证、说明和插图来说明新技术，但这些说明和所附讨论决不应被解释为限制该技术。本申请中引用的所有专利、专利申请以及对文本、科学论文、出版物等的引用都通过援引整体并入本文。

尽管在本文已经详细地描绘和描述了优选实施方式，但对于相关领域技术人员而言，在不背离本发明的精神的情况下，可以进行各种修改、添加、替换等，并且因此这些都被视为落入所附权利要求所限定的本发明的范围内。

序列表

<110> 西奈山伊坎医学院(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)

利奥尔·赞吉(Zangi, Lior)

基拉特·考尔(Kaur, Keerat)

<120> 包括修饰mRNA分子的组合物及其使用方法

<130> PPI22170422US

<150> US 62/898,958

<151> 2019-09-11

<160> 92

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1329

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠GATA4

<400> 1

atgtaccaaa gcctggccat ggccgccaac cacggccccc cgcccggcgc ctacgaagca 60

ggtggccctg gcgccttcat gcacagcgcg ggcgccgcgt cctcgcccgt ctacgtgccc 120

actccgcggg tgccgtcctc tgtgctgggc ctgtcctacc tgcagggcgg tggcagtgcc 180

gctgcagctg gaaccacctc gggtggcagc tccggggccg gcccgtcggg tgcagggcct 240

gggacccagc agggtagccc tggctggagc caagctggag ccgagggagc cgcctacacc 300

ccgccgcccg tgtccccgcg cttctctttc ccggggacta ctgggtccct ggcggccgct 360

gccgccgctg ccgcagcccg ggaagctgca gcctacggca gtggcggcgg ggcggcgggc 420

gctggtctgg ctggccgaga gcagtacggg cgtccgggct tcgccggctc ctactccagc 480

ccctacccag cctacatggc cgacgtggga gcatcctggg ccgcagccgc tgccgcctct 540

gccggcccct tcgacagccc agtcctgcac agcctgcctg gacgggccaa ccctggaaga 600

caccccaatc tcgtagatat gtttgatgac ttctcagaag gcagagagtg tgtcaattgt 660

ggggccatgt ccaccccact ctggaggcga gatgggacgg gacactacct gtgcaatgcc 720

tgtggcctct atcacaagat gaacggcatc aaccggcccc tcattaagcc tcagcgccgc 780

ctgtccgctt cccgccgggt aggcctctcc tgtgccaact gccagactac caccaccacg 840

ctgtggcgtc gtaatgccga gggtgagcct gtatgtaatg cctgcggcct ctacatgaag 900

ctccatgggg ttcccaggcc tcttgcaatg cggaaggagg ggattcaaac cagaaaacgg 960

aagcccaaga acctgaataa atctaagacg ccagcaggtc ctgctggtga gaccctccct 1020

ccctccagtg gtgcctccag cggtaactcc agcaatgcca ctagcagcag cagcagcagt 1080

gaagagatgc gccccatcaa gacagagccc gggctgtcat ctcactatgg gcacagcagc 1140

tccatgtccc agacattcag tactgtgtcc ggccacgggc cctccatcca tccagtgctg 1200

tctgctctga agctgtcccc acaaggctat gcatctcctg tcactcagac atcgcaggcc 1260

agctccaagc aggactcttg gaacagcctg gtcctggctg acagtcatgg ggacataatc 1320

accgcgtaa 1329

<210> 2

<211> 1401

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Mef2c

<400> 2

atggggagaa aaaagattca gattacgagg ataatggatg agcgtaacag acaggtgact 60

tttacgaaga ggaaatttgg attgatgaag aaggcttatg agctgagcgt gctgtgcgac 120

tgtgagattg cactgatcat cttcaacagc accaacaagc tgttccagta cgccagcact 180

gacatggata aggtgttgct caagtacacc gagtacaacg agccgcacga gagccggaca 240

aactcagaca ttgtggagac attgagaaag aagggcctca atggctgtga cagcccagat 300

cccgatgcag acgattcagt aggtcacagc cctgagtctg aggacaagta caggaaaatt 360

aacgaagata ttgatctaat gatcagcagg caaagattgt gtgctgttcc acctcccagc 420

tttgagatgc cagttaccat cccagtgtcc agccataaca gtttggtgta cagcaatcct 480

gtcagcacac tgggaaaccc caatcttctg ccactggccc acccgtctct gcagaggaat 540

agtatgtctc ctggtgtaac acatagacct ccaagtgcag gtaacacagg cggtctgatg 600

ggcggagatc tgacatccgg tgcaggcacc agcgcaggga atggatacgg caacccccgg 660

aactcaccag gcctgctggt ctcacctggt aacctgaaca agaatataca agccaaatct 720

cctcccccta tgaatctagg aatgaataat cgtaagccag atctccgcgt tcttatccca 780

cctggcagca agaacacgat gccatcagtg aatcaaagga taaataactc ccagtcggct 840

cagtcattgg ctaccccggt ggtttccgta gcaactccta ctttaccagg acaaggaatg 900

ggaggatatc catcagccat ttcaacaaca tatggtactg agtactctct gagtagcgca 960

gatctgtcat ctctgtctgg cttcaacact gccagtgcgc tccacctcgg ctctgtaact 1020

ggctggcagc agcagcacct acataacatg ccgccatctg ccctcagtca gttgggagct 1080

tgcactagca ctcatttatc tcagagttca aatctctccc tgccttctac tcaaagcctc 1140

agcatcaagt cagaacctgt ttctcctcct agagaccgta ccaccacccc ttcgagatac 1200

ccacaacaca ccacgcgcca cgaggcgggg aggtctcctg ttgacagctt gagcagctgt 1260

agcagttcct acgatgggag cgaccgagag gatcaccgga acgaattcca ctcccccatt 1320

ggactcacca gaccttcgcc ggacgaaagg gaaagtcctt cagtcaagcg catgcgactc 1380

tctgaaggat gggcaacatg a 1401

<210> 3

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Tbx5

<400> 3

atgagtctgg tggggggctt tccccaccac cccgtggtgc accatgaggg ctacccattc 60

gccgcagccg ccgccgccgc tgccgccgcc gccgccagcc gctgcagcca cgaggagaac 120

ccctacttcc acggctggct tattggccac ccggagatgt cgccccccga ctacagtatg 180

gccctgtcct acagccccga gtacgccagc ggtgccgcgg gcctggacca ctcccattat 240

gggggagtgc cgcccggcgc cgggcctccc ggcctggggg ggccgcgccc ggtgaagcgc 300

cggggcaccg ccaaccgcaa ggagcggcgc aggactcaga gcatcaacag cgccttcgcc 360

gagctgcgcg agtgcatccc caacgtgccc gccgacacca aactctccaa gatcaagaca 420

ctgcgcctgg ccaccagcta catcgcctac ctcatggatc tgctggccaa ggacgaccag 480

aacggagagg cggaggcctt caaggcggag atcaagaaga ccgacgtgaa agaggagaag 540

aggaagaaag agctgaatga gatcttgaaa agcacagtga gcagcaacga caagaaaacc 600

aaaggccgga caggctggcc acagcacgtc tgggccctgg agctcaagca gtga 654

<210> 4

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Hand2

<400> 4

atgagtctgg tggggggctt tccccaccac cccgtggtgc accatgaggg ctacccattc 60

gccgcagccg ccgccgccgc tgccgccgcc gccgccagcc gctgcagcca cgaggagaac 120

ccctacttcc acggctggct tattggccac ccggagatgt cgccccccga ctacagtatg 180

gccctgtcct acagccccga gtacgccagc ggtgccgcgg gcctggacca ctcccattat 240

gggggagtgc cgcccggcgc cgggcctccc ggcctggggg ggccgcgccc ggtgaagcgc 300

cggggcaccg ccaaccgcaa ggagcggcgc aggactcaga gcatcaacag cgccttcgcc 360

gagctgcgcg agtgcatccc caacgtgccc gccgacacca aactctccaa gatcaagaca 420

ctgcgcctgg ccaccagcta catcgcctac ctcatggatc tgctggccaa ggacgaccag 480

aacggagagg cggaggcctt caaggcggag atcaagaaga ccgacgtgaa agaggagaag 540

aggaagaaag agctgaatga gatcttgaaa agcacagtga gcagcaacga caagaaaacc 600

aaaggccgga caggctggcc acagcacgtc tgggccctgg agctcaagca gtga 654

<210> 5

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Gata4-Flag

<400> 5

atgtaccaaa gcctggccat ggccgccaac cacggccccc cgcccggcgc ctacgaagca 60

ggtggccctg gcgccttcat gcacagcgcg ggcgccgcgt cctcgcccgt ctacgtgccc 120

actccgcggg tgccgtcctc tgtgctgggc ctgtcctacc tgcagggcgg tggcagtgcc 180

gctgcagctg gaaccacctc gggtggcagc tccggggccg gcccgtcggg tgcagggcct 240

gggacccagc agggtagccc tggctggagc caagctggag ccgagggagc cgcctacacc 300

ccgccgcccg tgtccccgcg cttctctttc ccggggacta ctgggtccct ggcggccgct 360

gccgccgctg ccgcagcccg ggaagctgca gcctacggca gtggcggcgg ggcggcgggc 420

gctggtctgg ctggccgaga gcagtacggg cgtccgggct tcgccggctc ctactccagc 480

ccctacccag cctacatggc cgacgtggga gcatcctggg ccgcagccgc tgccgcctct 540

gccggcccct tcgacagccc agtcctgcac agcctgcctg gacgggccaa ccctggaaga 600

caccccaatc tcgatatgtt tgatgacttc tcagaaggca gagagtgtgt caattgtggg 660

gccatgtcca ccccactctg gaggcgagat gggacgggac actacctgtg caatgcctgt 720

ggcctctatc acaagatgaa cggcatcaac cggcccctca ttaagcctca gcgccgcctg 780

tccgcttccc gccgggtagg cctctcctgt gccaactgcc agactaccac caccacgctg 840

tggcgtcgta atgccgaggg tgagcctgta tgtaatgcct gcggcctcta catgaagctc 900

catggggttc ccaggcctct tgcaatgcgg aaggagggga ttcaaaccag aaaacggaag 960

cccaagaacc tgaataaatc taagacgcca gcaggtcctg ctggtgagac cctccctccc 1020

tccagtggtg cctccagcgg taactccagc aatgccacta gcagcagcag cagcagtgaa 1080

gagatgcgcc ccatcaagac agagcccggg ctgtcatctc actatgggca cagcagctcc 1140

atgtcccaga cattcagtac tgtgtccggc cacgggccct ccatccatcc agtgctgtct 1200

gctctgaagc tgtccccaca aggctatgca tctcctgtca ctcagacatc gcaggccagc 1260

tccaagcagg actcttggaa cagcctggtc ctggctgaca gtcatgggga cataatcacc 1320

gcgggaggcg gtggagccga ctacaaggac cacgacggcg actacaagga ccacgacatc 1380

gactacaagg acgacgacga caaggggccc gtt 1413

<210> 6

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Mef2c-Flag

<400> 6

atggggagaa aaaagattca gattacgagg ataatggatg agcgtaacag acaggtgact 60

tttacgaaga ggaaatttgg attgatgaag aaggcttatg agctgagcgt gctgtgcgac 120

tgtgagattg cactgatcat cttcaacagc accaacaagc tgttccagta cgccagcact 180

gacatggata aggtgttgct caagtacacc gagtacaacg agccgcacga gagccggaca 240

aactcagaca ttgtggagac attgagaaag aagggcctca atggctgtga cagcccagat 300

cccgatgcag acgattcagt aggtcacagc cctgagtctg aggacaagta caggaaaatt 360

aacgaagata ttgatctaat gatcagcagg caaagattgt gtgctgttcc acctcccagc 420

tttgagatgc cagttaccat cccagtgtcc agccataaca gtttggtgta cagcaatcct 480

gtcagcacac tgggaaaccc caatcttctg ccactggccc acccgtctct gcagaggaat 540

agtatgtctc ctggtgtaac acatagacct ccaagtgcag gtaacacagg cggtctgatg 600

ggcggagatc tgacatccgg tgcaggcacc agcgcaggga atggatacgg caacccccgg 660

aactcaccag gcctgctggt ctcacctggt aacctgaaca agaatataca agccaaatct 720

cctcccccta tgaatctagg aatgaataat cgtaagccag atctccgcgt tcttatccca 780

cctggcagca agaacacgat gccatcagtg aatcaaagga taaataactc ccagtcggct 840

cagtcattgg ctaccccggt ggtttccgta gcaactccta ctttaccagg acaaggaatg 900

ggaggatatc catcagccat ttcaacaaca tatggtactg agtactctct gagtagcgca 960

gatctgtcat ctctgtctgg cttcaacact gccagtgcgc tccacctcgg ctctgtaact 1020

ggctggcagc agcagcacct acataacatg ccgccatctg ccctcagtca gttgggagct 1080

tgcactagca ctcatttatc tcagagttca aatctctccc tgccttctac tcaaagcctc 1140

agcatcaagt cagaacctgt ttctcctcct agagaccgta ccaccacccc ttcgagatac 1200

ccacaacaca ccacgcgcca cgaggcgggg aggtctcctg ttgacagctt gagcagctgt 1260

agcagttcct acgatgggag cgaccgagag gatcaccgga acgaattcca ctcccccatt 1320

ggactcacca gaccttcgcc ggacgaaagg gaaagtcctt cagtcaagcg catgcgactc 1380

tctgaaggat gggcaacagg aggcggtgga gccgactaca aggaccacga cggcgactac 1440

aaggaccacg acatcgacta caaggacgac gacgacaagg ggcccgtt 1488

<210> 7

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠TBX5-Flag

<400> 7

atggccgata cagatgaggg ctttggcctg gcgcgcacgc ctctggagcc tgattccaaa 60

gacaggtctt gcgattcgaa acctgagagt gctctggggg ctcccagcaa gtctccatca 120

tccccgcagg ctgccttcac ccagcagggc atggaaggaa tcaaggtgtt tcttcatgaa 180

cgtgaactgt ggctgaagtt ccacgaagtg ggcacagaga tgatcatcac caaggcaggg 240

aggagaatgt ttcctagtta caaagtgaag gtgactggcc ttaatcccaa aacgaagtat 300

attcttctca tggatattgt tcccgcagac gaccacagat ataaatttgc tgataacaaa 360

tggtccgtaa ctggcaaagc agagcctgcc atgccggggc gcctttacgt gcacccggac 420

tccccagcaa ccggagccca ctggatgcga caacttgtct ccttccagaa gctcaaactc 480

accaacaacc acctggaccc gtttggacac attatcctga actccatgca caaataccag 540

ccccgattac acatcgtgaa agcagacgaa aataatgggt tcggttcaaa gaacactgcg 600

ttttgcaccc acgtcttccc ggagacagct tttatcgctg tgacttcgta ccagaatcac 660

aagatcacac agctgaaaat tgagaacaac cccttcgcca aaggctttcg gggcagtgat 720

gacctggagt tacacaggat gtctcggatg caaagtaaag agtatcctgt ggttcccagg 780

agcacagtga ggcacaaagt cacctccaac cacagcccct tcagcagcga gacccgagct 840

ctctccacct catccaattt agggtcccag taccagtgtg agaatggtgt ctctggcccc 900

tcccaggacc ttctgccccc acctaaccca tacccactgg cccaggagca cagccaaatt 960

taccactgta ccaagaggaa agatgaggaa tgttccagca cggagcaccc ctataagaag 1020

ccgtacatgg agacatcccc cagcgaggaa gacaccttct atcgctcggg ctacccccag 1080

cagcagggcc tgagtacctc ttacaggaca gagtcggccc agcggcaggc ctgcatgtat 1140

gccagctccg ctccccccag cgagcccgtg cctagcctgg aggacatcag ctgtaacaca 1200

tggcccagca tgccctccta tagcagctgt accgtcacca ccgtgcagcc catggaccgt 1260

cttccctacc agcacttctc cgctcatttc acctcggggc ccctggtccc tcggttggct 1320

ggcatggcca accatggttc tccccagctc ggcgaaggga tgtttcagca ccagacctca 1380

gtggcccatc agcctgtggt caggcagtgc gggcctcaga ctggccttca gtctccgggc 1440

ggcctccagc ccccagagtt tctctacact cacggcgtgc ccaggaccct gtccccccat 1500

cagtatcact cggtacacgg cgtcggcatg gtgccagagt ggagtgagaa tagcggaggc 1560

ggtggagccg actacaagga ccacgacggc gactacaagg accacgacat cgactacaag 1620

gacgacgacg acaaggggcc cgtt 1644

<210> 8

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ASAH1

<400> 8

atgccgggcc ggagttgcgt cgccttagtc ctcctggctg ccgccgtcag ctgtgccgtc 60

gcgcagcacg cgccgccgtg gacagaggac tgcagaaaat caacctatcc tccttcagga 120

ccaacgtaca gaggtgcagt tccatggtac accataaatc ttgacttacc accctacaaa 180

agatggcatg aattgatgct tgacaaggca ccagtgctaa aggttatagt gaattctctg 240

aagaatatga taaatacatt cgtgccaagt ggaaaaatta tgcaggtggt ggatgaaaaa 300

ttgcctggcc tacttggcaa ctttcctggc ccttttgaag aggaaatgaa gggtattgcc 360

gctgttactg atataccttt aggagagatt atttcattca atatttttta tgaattattt 420

accatttgta cttcaatagt agcagaagac aaaaaaggtc atctaataca tgggagaaac 480

atggattttg gagtatttct tgggtggaac ataaataatg atacctgggt cataactgag 540

caactaaaac ctttaacagt gaatttggat ttccaaagaa acaacaaaac tgtcttcaag 600

gcttcaagct ttgctggcta tgtgggcatg ttaacaggat tcaaaccagg actgttcagt 660

cttacactga atgaacgttt cagtataaat ggtggttatc tgggtattct agaatggatt 720

ctgggaaaga aagatgtcat gtggataggg ttcctcacta gaacagttct ggaaaatagc 780

acaagttatg aagaagccaa gaatttattg accaagacca agatattggc cccagcctac 840

tttatcctgg gaggcaacca gtctggggaa ggttgtgtga ttacacgaga cagaaaggaa 900

tcattggatg tatatgaact cgatgctaag cagggtagat ggtatgtggt acaaacaaat 960

tatgaccgtt ggaaacatcc cttcttcctt gatgatcgca gaacgcctgc aaagatgtgt 1020

ctgaaccgca ccagccaaga gaatatctca tttgaaacca tgtatgatgt cctgtcaaca 1080

aaacctgtcc tcaacaagct gaccgtatac acaaccttga tagatgttac caaaggtcaa 1140

ttcgaaactt acctgcggga ctgccctgac ccttgtatag gttggtga 1188

<210> 9

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人GATA4

<400> 9

atgtatcaga gcttggccat ggccgccaac cacgggccgc cccccggtgc ctacgaggcg 60

ggcggccccg gcgccttcat gcacggcgcg ggcgccgcgt cctcgccagt ctacgtgccc 120

acaccgcggg tgccctcctc cgtgctgggc ctgtcctacc tccagggcgg aggcgcgggc 180

tctgcgtccg gaggcgcctc gggcggcagc tccggtgggg ccgcgtctgg tgcggggccc 240

gggacccagc agggcagccc gggatggagc caggcgggag ccgacggagc cgcttacacc 300

ccgccgccgg tgtcgccgcg cttctccttc ccggggacca ccgggtccct ggcggccgcc 360

gccgccgctg ccgcggcccg ggaagctgcg gcctacagca gtggcggcgg agcggcgggt 420

gcgggcctgg cgggccgcga gcagtacggg cgcgccggct tcgcgggctc ctactccagc 480

ccctacccgg cttacatggc cgacgtgggc gcgtcctggg ccgcagccgc cgccgcctcc 540

gccggcccct tcgacagccc ggtcctgcac agcctgcccg gccgggccaa cccggccgcc 600

cgacacccca atctcgtaga tatgtttgac gacttctcag aaggcagaga gtgtgtcaac 660

tgtggggcta tgtccacccc gctctggagg cgagatggga cgggtcacta tctgtgcaac 720

gcctgcggcc tctaccacaa gatgaacggc atcaaccggc cgctcatcaa gcctcagcgc 780

cggctgtccg cctcccgccg agtgggcctc tcctgtgcca actgccagac caccaccacc 840

acgctgtggc gccgcaatgc ggagggcgag cctgtgtgca atgcctgcgg cctctacatg 900

aagctccacg gggtccccag gcctcttgca atgcggaaag aggggatcca aaccagaaaa 960

cggaagccca agaacctgaa taaatctaag acaccagcag ctccttcagg cagtgagagc 1020

cttcctcccg ccagcggtgc ttccagcaac tccagcaacg ccaccaccag cagcagcgag 1080

gagatgcgtc ccatcaagac ggagcctggc ctgtcatctc actacgggca cagcagctcc 1140

gtgtcccaga cgttctcagt cagtgcgatg tctggccatg ggccctccat ccaccctgtc 1200

ctctcggccc tgaagctctc cccacaaggc tatgcgtctc ccgtcagcca gtctccacag 1260

accagctcca agcaggactc ttggaacagc ctggtcttgg ccgacagtca cggggacata 1320

atcactgcgt aa 1332

<210> 10

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Mef2c

<400> 10

atggggagaa aaaagattca gattacgagg attatggatg aacgtaacag acaggtgaca 60

tttacaaaga ggaaatttgg gttgatgaag aaggcttatg agctgagcgt gctgtgtgac 120

tgtgagattg cgctgatcat cttcaacagc accaacaagc tgttccagta tgccagcacc 180

gacatggaca aagtgcttct caagtacacg gagtacaacg agccgcatga gagccggaca 240

aactcagaca tcgtggaggc attgaacaag aaagaaaaca aaggctgtga aagccccgat 300

cccgactcct cttatgcact caccccacgc actgaagaaa aatacaaaaa aattaatgaa 360

gaatttgata atatgatcaa gagtcataaa attcctgctg ttccacctcc caacttcgag 420

atgccagtct ccatcccagt gtccagccac aacagtttgg tgtacagcaa ccctgtcagc 480

tcactgggaa accccaacct attgccactg gctcaccctt ctctgcagag gaatagtatg 540

tctcctggtg taacacatcg acctccaagt gcaggtaaca caggtggtct gatgggtgga 600

gacctcacgt ctggtgcagg caccagtgca gggaacgggt atggcaatcc ccgaaactca 660

ccaggtctgc tggtctcacc tggtaacttg aacaagaata tgcaagcaaa atctcctccc 720

ccaatgaatt taggaatgaa taaccgtaaa ccagatctcc gagttcttat tccaccaggc 780

agcaagaata cgatgccatc agtgaatcaa aggataaata actcccagtc ggctcagtca 840

ttggctaccc cagtggtttc cgtagcaact cctactttac caggacaagg aatgggagga 900

tatccatcag ccatttcaac aacatatggt accgagtact ctctgagtag tgcagacctg 960

tcatctctgt ctgggtttaa caccgccagc gctcttcacc ttggttcagt aactggctgg 1020

caacagcaac acctacataa catgccacca 1050

<210> 11

<211> 1557

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Tbx5

<400> 11

atggccgacg cagacgaggg ctttggcctg gcgcacacgc ctctggagcc tgacgcaaaa 60

gacctgccct gcgattcgaa acccgagagc gcgctcgggg cccccagcaa gtccccgtcg 120

tccccgcagg ccgccttcac ccagcagggc atggagggaa tcaaagtgtt tctccatgaa 180

agagaactgt ggctaaaatt ccacgaagtg ggcacggaaa tgatcataac caaggctgga 240

aggcggatgt ttcccagtta caaagtgaag gtgacgggcc ttaatcccaa aacgaagtac 300

attcttctca tggacattgt acctgccgac gatcacagat acaaattcgc agataataaa 360

tggtctgtga cgggcaaagc tgagcccgcc atgcctggcc gcctgtacgt gcacccagac 420

tcccccgcca ccggggcgca ttggatgagg cagctcgtct ccttccagaa actcaagctc 480

accaacaacc acctggaccc atttgggcat attattctaa attccatgca caaataccag 540

cctagattac acatcgtgaa agcggatgaa aataatggat ttggctcaaa aaatacagcg 600

ttctgcactc acgtctttcc tgagactgcg tttatagcag tgacttccta ccagaaccac 660

aagatcacgc aattaaagat tgagaataat ccctttgcca aaggatttcg gggcagtgat 720

gacatggagc tgcacagaat gtcaagaatg caaagtaaag aatatcccgt ggtccccagg 780

agcaccgtga ggcaaaaagt ggcctccaac cacagtcctt tcagcagcga gtctcgagct 840

ctctccacct catccaattt ggggtcccaa taccagtgtg agaatggtgt ttccggcccc 900

tcccaggacc tcctgcctcc acccaaccca tacccactgc cccaggagca tagccaaatt 960

taccattgta ccaagaggaa agaggaagaa tgttccacca cagaccatcc ctataagaag 1020

ccctacatgg agacatcacc cagtgaagaa gattccttct accgctctag ctatccacag 1080

cagcagggcc tgggtgcctc ctacaggaca gagtcggcac agcggcaagc ttgcatgtat 1140

gccagctctg cgccccccag cgagcctgtg cccagcctag aggacatcag ctgcaacacg 1200

tggccaagca tgccttccta cagcagctgc accgtcacca ccgtgcagcc catggacagg 1260

ctaccctacc agcacttctc cgctcacttc acctcggggc ccctggtccc tcggctggct 1320

ggcatggcca accatggctc cccacagctg ggagagggaa tgttccagca ccagacctcc 1380

gtggcccacc agcctgtggt caggcagtgt gggcctcaga ctggcctgca gtcccctggc 1440

acccttcagc cccctgagtt cctctactct catggcgtgc caaggactct atcccctcat 1500

cagtaccact ctgtgcacgg agttggcatg gtgccagagt ggagcgacaa tagctaa 1557

<210> 12

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Hand2

<400> 12

atgagtctgg taggtggttt tccccaccac ccggtggtgc accacgaggg ctacccgttt 60

gccgccgccg ccgccgcagc tgccgccgcc gccgccagcc gctgcagcca tgaggagaac 120

ccctacttcc atggctggct catcggccac cccgagatgt cgccccccga ctacagcatg 180

gccctgtcct acagccccga gtatgccagc ggcgccgccg gcctggacca ctcccattac 240

gggggggtgc cgccgggcgc cgggcccccg ggcctggggg ggccgcgccc ggtgaagcgc 300

cgaggcaccg ccaaccgcaa ggagcggcgc aggactcaga gcatcaacag cgccttcgcc 360

gaactgcgcg agtgcatccc caacgtaccc gccgacacca aactctccaa aatcaagacc 420

ctgcgcctgg ccaccagcta catcgcctac ctcatggacc tgctggccaa ggacgaccag 480

aatggcgagg cggaggcctt caaggcagag atcaagaaga ccgacgtgaa agaggagaag 540

aggaagaagg agctgaacga aatcttgaaa agcacagtga gcagcaacga caagaaaacc 600

aaaggccgga cgggctggcc gcagcacgtc tgggccctgg agctcaagca gtga 654

<210> 13

<211> 1422

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人GATA4-Flag

<400> 13

atgtatcaga gcttggccat ggccgccaac cacgggccgc cccccggtgc ctacgaggcg 60

ggcggccccg gcgccttcat gcacggcgcg ggcgccgcgt cctcgccagt ctacgtgccc 120

acaccgcggg tgccctcctc cgtgctgggc ctgtcctacc tccagggcgg aggcgcgggc 180

tctgcgtccg gaggcgcctc gggcggcagc tccggtgggg ccgcgtctgg tgcggggccc 240

gggacccagc agggcagccc gggatggagc caggcgggag ccgacggagc cgcttacacc 300

ccgccgccgg tgtcgccgcg cttctccttc ccggggacca ccgggtccct ggcggccgcc 360

gccgccgctg ccgcggcccg ggaagctgcg gcctacagca gtggcggcgg agcggcgggt 420

gcgggcctgg cgggccgcga gcagtacggg cgcgccggct tcgcgggctc ctactccagc 480

ccctacccgg cttacatggc cgacgtgggc gcgtcctggg ccgcagccgc cgccgcctcc 540

gccggcccct tcgacagccc ggtcctgcac agcctgcccg gccgggccaa cccggccgcc 600

cgacacccca atctcgtaga tatgtttgac gacttctcag aaggcagaga gtgtgtcaac 660

tgtggggcta tgtccacccc gctctggagg cgagatggga cgggtcacta tctgtgcaac 720

gcctgcggcc tctaccacaa gatgaacggc atcaaccggc cgctcatcaa gcctcagcgc 780

cggctgtccg cctcccgccg agtgggcctc tcctgtgcca actgccagac caccaccacc 840

acgctgtggc gccgcaatgc ggagggcgag cctgtgtgca atgcctgcgg cctctacatg 900

aagctccacg gggtccccag gcctcttgca atgcggaaag aggggatcca aaccagaaaa 960

cggaagccca agaacctgaa taaatctaag acaccagcag ctccttcagg cagtgagagc 1020

cttcctcccg ccagcggtgc ttccagcaac tccagcaacg ccaccaccag cagcagcgag 1080

gagatgcgtc ccatcaagac ggagcctggc ctgtcatctc actacgggca cagcagctcc 1140

gtgtcccaga cgttctcagt cagtgcgatg tctggccatg ggccctccat ccaccctgtc 1200

ctctcggccc tgaagctctc cccacaaggc tatgcgtctc ccgtcagcca gtctccacag 1260

accagctcca agcaggactc ttggaacagc ctggtcttgg ccgacagtca cggggacata 1320

atcactgcgt aaggaggcgg tggagccgac tacaaggacc acgacggcga ctacaaggac 1380

cacgacatcg actacaagga cgacgacgac aaggggcccg tt 1422

<210> 14

<211> 1140

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Mef2c-Flag

<400> 14

atggggagaa aaaagattca gattacgagg attatggatg aacgtaacag acaggtgaca 60

tttacaaaga ggaaatttgg gttgatgaag aaggcttatg agctgagcgt gctgtgtgac 120

tgtgagattg cgctgatcat cttcaacagc accaacaagc tgttccagta tgccagcacc 180

gacatggaca aagtgcttct caagtacacg gagtacaacg agccgcatga gagccggaca 240

aactcagaca tcgtggaggc attgaacaag aaagaaaaca aaggctgtga aagccccgat 300

cccgactcct cttatgcact caccccacgc actgaagaaa aatacaaaaa aattaatgaa 360

gaatttgata atatgatcaa gagtcataaa attcctgctg ttccacctcc caacttcgag 420

atgccagtct ccatcccagt gtccagccac aacagtttgg tgtacagcaa ccctgtcagc 480

tcactgggaa accccaacct attgccactg gctcaccctt ctctgcagag gaatagtatg 540

tctcctggtg taacacatcg acctccaagt gcaggtaaca caggtggtct gatgggtgga 600

gacctcacgt ctggtgcagg caccagtgca gggaacgggt atggcaatcc ccgaaactca 660

ccaggtctgc tggtctcacc tggtaacttg aacaagaata tgcaagcaaa atctcctccc 720

ccaatgaatt taggaatgaa taaccgtaaa ccagatctcc gagttcttat tccaccaggc 780

agcaagaata cgatgccatc agtgaatcaa aggataaata actcccagtc ggctcagtca 840

ttggctaccc cagtggtttc cgtagcaact cctactttac caggacaagg aatgggagga 900

tatccatcag ccatttcaac aacatatggt accgagtact ctctgagtag tgcagacctg 960

tcatctctgt ctgggtttaa caccgccagc gctcttcacc ttggttcagt aactggctgg 1020

caacagcaac acctacataa catgccacca ggaggcggtg gagccgacta caaggaccac 1080

gacggcgact acaaggacca cgacatcgac tacaaggacg acgacgacaa ggggcccgtt 1140

<210> 15

<211> 1647

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Tbx5- Flag

<400> 15

atggccgacg cagacgaggg ctttggcctg gcgcacacgc ctctggagcc tgacgcaaaa 60

gacctgccct gcgattcgaa acccgagagc gcgctcgggg cccccagcaa gtccccgtcg 120

tccccgcagg ccgccttcac ccagcagggc atggagggaa tcaaagtgtt tctccatgaa 180

agagaactgt ggctaaaatt ccacgaagtg ggcacggaaa tgatcataac caaggctgga 240

aggcggatgt ttcccagtta caaagtgaag gtgacgggcc ttaatcccaa aacgaagtac 300

attcttctca tggacattgt acctgccgac gatcacagat acaaattcgc agataataaa 360

tggtctgtga cgggcaaagc tgagcccgcc atgcctggcc gcctgtacgt gcacccagac 420

tcccccgcca ccggggcgca ttggatgagg cagctcgtct ccttccagaa actcaagctc 480

accaacaacc acctggaccc atttgggcat attattctaa attccatgca caaataccag 540

cctagattac acatcgtgaa agcggatgaa aataatggat ttggctcaaa aaatacagcg 600

ttctgcactc acgtctttcc tgagactgcg tttatagcag tgacttccta ccagaaccac 660

aagatcacgc aattaaagat tgagaataat ccctttgcca aaggatttcg gggcagtgat 720

gacatggagc tgcacagaat gtcaagaatg caaagtaaag aatatcccgt ggtccccagg 780

agcaccgtga ggcaaaaagt ggcctccaac cacagtcctt tcagcagcga gtctcgagct 840

ctctccacct catccaattt ggggtcccaa taccagtgtg agaatggtgt ttccggcccc 900

tcccaggacc tcctgcctcc acccaaccca tacccactgc cccaggagca tagccaaatt 960

taccattgta ccaagaggaa agaggaagaa tgttccacca cagaccatcc ctataagaag 1020

ccctacatgg agacatcacc cagtgaagaa gattccttct accgctctag ctatccacag 1080

cagcagggcc tgggtgcctc ctacaggaca gagtcggcac agcggcaagc ttgcatgtat 1140

gccagctctg cgccccccag cgagcctgtg cccagcctag aggacatcag ctgcaacacg 1200

tggccaagca tgccttccta cagcagctgc accgtcacca ccgtgcagcc catggacagg 1260

ctaccctacc agcacttctc cgctcacttc acctcggggc ccctggtccc tcggctggct 1320

ggcatggcca accatggctc cccacagctg ggagagggaa tgttccagca ccagacctcc 1380

gtggcccacc agcctgtggt caggcagtgt gggcctcaga ctggcctgca gtcccctggc 1440

acccttcagc cccctgagtt cctctactct catggcgtgc caaggactct atcccctcat 1500

cagtaccact ctgtgcacgg agttggcatg gtgccagagt ggagcgacaa tagctaagga 1560

ggcggtggag ccgactacaa ggaccacgac ggcgactaca aggaccacga catcgactac 1620

aaggacgacg acgacaaggg gcccgtt 1647

<210> 16

<211> 1188

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ACVI

<400> 16

atgccgggcc ggagttgcgt cgccttagtc ctcctggctg ccgccgtcag ctgtgccgtc 60

gcgcagcacg cgccgccgtg gacagaggac tgcagaaaat caacctatcc tccttcagga 120

ccaacgtaca gaggtgcagt tccatggtac accataaatc ttgacttacc accctacaaa 180

agatggcatg aattgatgct tgacaaggca ccagtgctaa aggttatagt gaattctctg 240

aagaatatga taaatacatt cgtgccaagt ggaaaaatta tgcaggtggt ggatgaaaaa 300

ttgcctggcc tacttggcaa ctttcctggc ccttttgaag aggaaatgaa gggtattgcc 360

gctgttactg atataccttt aggagagatt atttcattca atatttttta tgaattattt 420

accatttgta cttcaatagt agcagaagac aaaaaaggtc atctaataca tgggagaaac 480

atggattttg gagtatttct tgggtggaac ataaataatg atacctgggt cataactgag 540

caactaaaac ctttaacagt gaatttggat ttccaaagaa acaacaaaac tgtcttcaag 600

gcttcaagct ttgctggcta tgtgggcatg ttaacaggat tcaaaccagg actgttcagt 660

cttacactga atgaacgttt cagtataaat ggtggttatc tgggtattct agaatggatt 720

ctgggaaaga aagatgtcat gtggataggg ttcctcacta gaacagttct ggaaaatagc 780

acaagttatg aagaagccaa gaatttattg accaagacca agatattggc cccagcctac 840

tttatcctgg gaggcaacca gtctggggaa ggttgtgtga ttacacgaga cagaaaggaa 900

tcattggatg tatatgaact cgatgctaag cagggtagat ggtatgtggt acaaacaaat 960

tatgaccgtt ggaaacatcc cttcttcctt gatgatcgca gaacgcctgc aaagatgtgt 1020

ctgaaccgca ccagccaaga gaatatctca tttgaaacca tgtatgatgt cctgtcaaca 1080

aaacctgtcc tcaacaagct gaccgtatac acaaccttga tagatgttac caaaggtcaa 1140

ttcgaaactt acctgcggga ctgccctgac ccttgtatag gttggtga 1188

<210> 17

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dnTGFbeta

<400> 17

atgggtcggg ggctgctcag gggcctgtgg ccgctgcaca tcgtcctgtg gacgcgtatc 60

gccagcacga tcccaccgca cgttcagaag tcggttaata acgacatgat agtcactgac 120

aacaacggtg cagtcaagtt tccacaactg tgtaaatttt gtgatgtgag attttccacc 180

tgtgacaacc agaaatcctg catgagcaac tgcagcatca cctccatctg tgagaagcca 240

caggaagtct gtgtggctgt atggagaaag aatgacgaga acataacact agagacagtt 300

tgccatgacc ccaagctccc ctaccatgac tttattctgg aagatgctgc ttctccaaag 360

tgcattatga aggaaaaaaa aaagcctggt gagactttct tcatgtgttc ctgtagctct 420

gatgagtgca atgacaacat catcttctca gaagaatata acaccagcaa tcctgacttg 480

ttgctagtca tatttcaagt gacaggcatc agcctcctgc caccactggg agttgccata 540

tctgtcatca tcatcttcta ctgctaccgc gttggatcca tggactacaa agacgatgac 600

gataaatag 609

<210> 18

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CCN5

<400> 18

atgagaggca caccgaagac ccacctcctg gccttctccc tcctctgcct cctctcaaag 60

gtgcgtaccc agctgtgccc gacaccatgt acctgcccct ggccacctcc ccgatgcccg 120

ctgggagtac ccctggtgct ggatggctgt ggctgctgcc gggtatgtgc acggcggctg 180

ggggagccct gcgaccaact ccacgtctgc gacgccagcc agggcctggt ctgccagccc 240

ggggcaggac ccggtggccg gggggccctg tgcctctgta agcaggaccc cagttttctg 300

gccttgtctc ttccctgccc cctggtgtcc cctgcccaga atggagcacg gcctggggac 360

cctgctcgac cacctgtggg ctgggcatgg ccacccgggt gtccaaccag aaccgcttct 420

gccgactgga gacccagcgc cgcctgtgcc tgtccaggcc ctgcccaccc tccaggggtc 480

gcagtccaca aaacagtgcc ttctagagcc gggctgggaa tggggacacg gtgtccacca 540

tccccagctg gtggccctgt gcctgggccc tgggctgatg gaagatggtc cgtgcccagg 600

cccttggctg caggcaacac tttagcttgg gtccaccatg cagaacacca atattaa 657

<210> 19

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dnWnt8a

<220>

<221> misc_feature

<222> (669)..(669)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (672)..(672)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 19

atgcaaaaca ccactttgtt catccttgca actcttctga tcttctgccc attcttcact 60

gcctcagcat ggtcagtcaa taactttctg atgacaggac ccaaggcata tctgacatac 120

tcagcgagtg ttgccgtggg tgcgcagaat ggaattgagg agtgtaaata tcagtttgcg 180

tgggaaagat ggaattgccc tgaaagtacc ctgcagcttg ctacccacaa tggacttcga 240

agtgcaacca gagaaacctc ctttgtgcat gccattagct cagcgggagt tatgtataca 300

ctgacgagaa actgcagcat gggggacttt gataactgtg gatgtgatga ctccagaaat 360

ggccgcatcg gtggccgagg ctgggtatgg ggcggctgca gtgataatgc agaatttggt 420

gagcggatct ctaaactatt cgtcgatggc ttggagacgg gacaagatgc cagagcccta 480

atgaacttgc ataacaatga agcaggaaga cttgcagtga aagagacaat gaaaaggact 540

tgcaagtgcc atggaatatc tggaagttgc agcatacaaa cttgctggct tcagctggcc 600

gagtttcggg atattggcaa tcccttaaag atcaagcacg accaagcgct aaagcttgag 660

atggacaana gnaaatga 678

<210> 20

<211> 1083

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> WNT5a

<400> 20

atgtcttcca agttcttcct aatggctttg gccacgtttt tctccttcgc ccaggttgtt 60

atagaagcta attcttggtg gtctctaggt atgaataacc ctgttcagat gtcagaagta 120

tatatcatag gtgcacagcc tctctgcagc caactggcag gactttctca aggacagaag 180

aaactctgcc acttgtatca ggaccacatg cagtacattg gagaaggtgc gaagacaggc 240

atcaaggaat gccagtacca gttccggcat cggagatgga actgcagcac agtggacaat 300

acttctgtct ttggcagggt gatgcaaata ggcagccgag agacggcctt cacgtacgcg 360

gtgagcgcag ctggggtggt gaacgccatg agccgagcat gccgggaggg cgagctgtct 420

acctgtggct gcagccgcgc tgcgcgcccc aaggacctgc ctcgggactg gttgtggggc 480

ggctgcggag acaacatcga ctatggctac cgcttcgcca aggagttcgt ggacgctaga 540

gaaagggaac gaatccacgc taagggttcc tatgagagcg cacgcatcct catgaactta 600

cacaacaatg aagcaggccg taggacagta tacaacctgg cagatgtagc ctgtaagtgt 660

catggagtgt ctggctcctg tagcctcaag acgtgctggc tgcagctggc ggacttccgg 720

aaggtgggcg atgccctcaa ggagaagtat gatagcgcgg cggccatgag gctcaacagc 780

cggggcaagc tggtgcaggt caacagccgc ttcaactccc cgaccacgca ggacctggtc 840

tacatcgacc ccagtccgga ctactgtgtg cgcaacgaga gcactggctc gctgggcacg 900

cagggacgcc tgtgcaacaa gacctcagag gggatggacg gctgcgagct catgtgctgt 960

gggcgtggct atgaccagtt taagacagtg cagaccgaac gctgtcattg caagtttcac 1020

tggtgctgct atgtcaaatg caagaagtgc acggagattg tggatcagtt cgtgtgcaaa 1080

tag 1083

<210> 21

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SV40 Large T

<400> 21

atgcctaggc ttttgcaaaa agctttgcaa atatggataa agttttaaac agagaggaat 60

ctttgcagct aatggacctt ctaggtcttg aaaggagtgc ctgggggaat attcctctga 120

tgagaaaggc atatttaaaa aaatgcaagg agtttcatcc tgataaagga ggagatgaag 180

aaaaaatgaa gaaaatgaat actctgtaca agaaaatgga agatggagta aaatatgctc 240

atcaacctga ctttggaggc ttctgggatg caactgaggt atttgcttct tccttaaatc 300

ctggtgttga tgcaatgtac tgcaaacaat ggcctgagtg tgcaaagaaa atgtctacta 360

actgcatatg cttgctgtgc ttactgagga tgaagcatga aaatagaaaa ttatacagga 420

aagatccact tgtgtgggtt gattgctact gcttcgattg ctttagaatg tggtttggac 480

ttgatctttg tgaaggaacc ttacttctgt ggtgtgacat aattggacaa actacctaca 540

gagatttaaa gctataaggt aaatataaaa tttttaagtg tataatgtgt taaactactg 600

attctaattg tttgtgtatt ttagattcca acctatggaa ctgatgaatg ggagcagtgg 660

tggaatgcct ttaatgagga aaacctgttt tgctcagaag aaatgccatc tagtgatgat 720

gaggctactg ctgactctca acattctact cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac 780

cccaaggact ttccttcaga attgctaagt tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga 840

actcttgctt gctttgctat ttacaccaca aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa 900

attatggaaa aataa 915

<210> 22

<211> 915

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SRF

<400> 22

atgatcacca gtgagaccgg caaggcactg attcagacct gcctcaactc gccagactct 60

ccaccccgtt cagaccccac aacagaccag agaatgagtg ccactggctt tgaagagaca 120

gatctcacct accaggtgtc ggagtctgac agcagtgggg agaccaagga cacactgaag 180

ccggcgttca cagtcaccaa cctgccgggt acaacctcca ccatccaaac agcacctagc 240

acctctacca ccatgcaagt cagcagcggc ccctcctttc ccatcaccaa ctacctggca 300

ccagtgtctg ctagtgtcag ccccagtgct gtcagcagtg ccaatgggac tgtgctgaag 360

agtacaggca gcggccctgt ctcctctggg ggccttatgc agctgcctac cagcttcacc 420

ctcatgcctg gtggggcagt ggcccagcag gtcccagtgc aggccattca agtgcaccag 480

gccccacagc aagcgtctcc ctcccgtgac agcagcacag acctcacgca gacctcctcc 540

agcgggacag tgacgctgcc cgccaccatc atgacgtcat ccgtgcccac aactgtgggt 600

ggccacatga tgtaccctag cccgcatgcg gtgatgtatg cccccacctc gggcctgggt 660

gatggcagcc tcaccgtgct gaatgccttc tcccaggcac catccaccat gcaggtgtca 720

cacagccagg tccaggagcc aggtggcgtc ccccaggtgt tcctgacagc atcatctggg 780

acagtgcaga tccctgtttc agcagttcag ctccaccaga tggctgtgat agggcagcag 840

gccgggagca gcagcaacct caccgagcta caggtggtga acctggacac cgcccacagc 900

accaagagtg aatga 915

<210> 23

<211> 2961

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人心肌素

<400> 23

atgacactcc tggggtctga gcattccttg ctgattagga gcaagttcag atcagtttta 60

cagttaagac ttcaacaaag aaggacccag gaacaactgg ctaaccaagg cataatacca 120

ccactgaaac gtccagctga attccatgag caaagaaaac atttggatag tgacaaggct 180

aaaaattccc tgaagcgcaa agccagaaac aggtgcaaca gtgccgactt ggttaatatg 240

cacatactcc aagcttccac tgcagagagg tccattccaa ctgctcagat gaagctgaaa 300

agagcccgac tcgccgatga tctcaatgaa aaaattgctc tacgaccagg gccactggag 360

ctggtggaaa aaaacattct tcctgtggat tctgctgtga aagaggccat aaaaggtaac 420

caggtgagtt tctccaaatc cacggatgct tttgcctttg aagaggacag cagcagcgat 480

gggctttctc cggatcagac tcgaagtgaa gacccccaaa actcagcggg atccccgcca 540

gacgctaaag cctcagatac cccttcgaca ggttctctgg ggacaaacca ggatcttgct 600

tctggctcag aaaatgacag aaatgactca gcctcacagc ccagccacca gtcagatgcg 660

gggaagcagg ggcttggccc ccccagcacc cccatagccg tgcatgctgc tgtaaagtcc 720

aaatccttgg gtgacagtaa gaaccgccac aaaaagccca aggaccccaa gccaaaggtg 780

aagaagctta aatatcacca gtacattccc ccagaccaga aggcagagaa gtcccctcca 840

cctatggact cagcctacgc tcggctgctc cagcaacagc agctgttcct gcagctccaa 900

atcctcagcc agcagcagca gcagcagcaa caccgattca gctacctagg gatgcaccaa 960

gctcagctta aggaaccaaa tgaacagatg gtcagaaatc caaactcttc ttcaacgcca 1020

ctgagcaata cccccttgtc tcctgtcaaa aacagttttt ctggacaaac tggtgtctct 1080

tctttcaaac caggcccact cccacctaac ctggatgatc tgaaggtctc tgaattaaga 1140

caacagcttc gaattcgggg cttgcctgtg tcaggcacca aaacggctct catggaccgg 1200

cttcgaccct tccaggactg ctctggcaac ccagtgccga actttgggga tataacgact 1260

gtcacttttc ctgtcacacc caacacgctg cccaattacc agtcttcctc ttctaccagt 1320

gccctgtcca acggcttcta ccactttggc agcaccagct ccagcccccc gatctcccca 1380

gcctcctctg acctgtcagt cgctgggtcc ctgccggaca ccttcaatga tgcctccccc 1440

tccttcggcc tgcacccgtc cccagtccac gtgtgcacgg aggaaagtct catgagcagc 1500

ctgaatgggg gctctgttcc ttctgagctg gatgggctgg actccgagaa ggacaagatg 1560

ctggtggaga agcagaaggt gatcaatgaa ctcacctgga aactccagca agagcagagg 1620

caggtggagg agctgaggat gcagcttcag aagcagaaaa ggaataactg ttcagagaag 1680

aagccgctgc ctttcctggc tgcctccatc aagcaggaag aggctgtctc cagctgtcct 1740

tttgcatccc aagtacctgt gaaaagacaa agcagcagct cagagtgtca cccaccggct 1800

tgtgaagctg ctcaactcca gcctcttgga aatgctcatt gtgtggagtc ctcagatcaa 1860

accaatgtac tttcttccac atttctcagc ccccagtgtt cccctcagca ttcaccgctg 1920

ggggctgtga aaagcccaca gcacatcagt ttgcccccat cacccaacaa ccctcacttt 1980

ctgccctcat cctccggggc ccagggagaa gggcacaggg tctcctcgcc catcagcagc 2040

caggtgtgca ctgcacagaa ctcaggagca cacgatggcc atcctccaag cttctctccc 2100

cattcttcca gcctccaccc gcccttctct ggagcccaag cagacagcag tcatggtgcc 2160

gggggaaacc cttgtcccaa aagcccatgt gtacagcaaa agatggctgg tttacactct 2220

tctgataagg tggggccaaa gttttcaatt ccatccccaa ctttttctaa gtcaagttca 2280

gcaatttcag aggtaacaca gcctccatcc tatgaagatg ccgtaaagca gcaaatgacc 2340

cggagtcagc agatggatga actcctggac gtgcttattg aaagcggaga aatgccagca 2400

gacgctagag aggatcactc atgtcttcaa aaagtcccaa agatacccag atcttcccga 2460

agtccaactg ctgtcctcac caagccctcg gcttcctttg aacaagcctc ttcaggcagc 2520

cagatcccct ttgatcccta tgccaccgac agtgatgagc atcttgaagt cttattaaat 2580

tcccagagcc ccctaggaaa gatgagtgat gtcacccttc taaaaattgg gagcgaagag 2640

cctcactttg atgggataat ggatggattc tctgggaagg ctgcagaaga cctcttcaat 2700

gcacatgaga tcttgccagg ccccctctct ccaatgcaga cacagttttc accctcttct 2760

gtggacagca atgggctgca gttaagcttc actgaatctc cctgggaaac catggagtgg 2820

ctggacctca ctccgccaaa ttccacacca ggctttagcg ccctcaccac cagcagcccc 2880

agcatcttca acatcgattt cctggatgtc actgatctca atttgaattc ttccatggac 2940

cttcacttgc agcagtggta g 2961

<210> 24

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ETS1

<400> 24

atgagctact ttgtggattc tgctgggagc agccccgtcc cttactcagc gcctcgtcct 60

gcagtggtga ggcaaggacc tagcaacact tatgaagatc ctcgaatgaa ctgtggtttc 120

cagtccaatt atcaccagca aagaccttgc tacccctttt gggatgagat ggcaactcag 180

gaagttccta ctggtcttga acactgtgtc tcagatatgg aatgtgcaga tgtcccacta 240

ttaactccaa gcagcaaaga aatgatgtct caagcattaa aagctacttt cagtggtttc 300

actaaagaac agcaacgact ggggatccca aaagaccccc ggcagtggac agaaacccat 360

gttcgggact gggtgatgtg ggctgtgaat gaattcagcc tgaaaggtgt agacttccag 420

aagttctgta tgaatggagc agccctctgc gccctgggta aagactgctt tctcgagctg 480

gccccagact ttgttgggga catcttatgg gaacatctag agatcctgca gaaagaggat 540

gtgaaaccat atcaagttaa tggagtcaac ccagcctatc cagaatcccg ctatacctcg 600

gattacttca ttagctatgg tattgagcat gcccagtgtg ttccaccatc ggagttctca 660

gagcccagct tcatcacaga gtcctatcag acgctccatc ccatcagctc ggaagagctc 720

ctctccctca agtatgagaa tgactacccc tcggtcattc tccgagaccc tctccagaca 780

gacaccttgc agaatgacta ctttgctatc aaacaagaag tcgtcacccc agacaacatg 840

tgcatgggga ggaccagtcg tggtaaactc gggggccagg actcttttga aagcatagag 900

agctacgata gttgtgatcg cctcacccag tcctggagca gccagtcatc tttcaacagc 960

ctgcagcgtg ttccctccta tgacagcttc gactcagagg actatccggc tgccctgccc 1020

aaccacaagc ccaagggcac cttcaaggac tatgtgcggg accgtgctga cctcaataag 1080

gacaagcctg tcattcctgc tgctgcccta gctggctaca caggcagtgg accaatccag 1140

ctatggcagt ttcttctgga attactcact gataaatcct gtcagtcttt tatcagctgg 1200

acaggagatg gctgggaatt caaactttct gacccagatg aggtggccag gagatgggga 1260

aagaggaaaa acaaacctaa gatgaattat gagaaactga gccgtggcct acgctactat 1320

tacgacaaaa acatcatcca caagacagcg gggaaacgct acgtgtaccg ctttgtgtgt 1380

gacctgcaga gcctgctggg gtacacccct gaggagctgc acgccatgct ggacgtcaag 1440

ccagatgccg acgagtga 1458

<210> 25

<211> 1830

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ETS2

<400> 25

atggggtcgg ctcaatttca gggccttatt acccaagccc ggctgccctt cggtgccacc 60

agcaccactg ctccgtcgct gcggaattcc aaaggcaggt ttggcgttag ggccttggcc 120

ccagagagga cgccgagcgc tccacggaaa gtctccgccc ggctcccagg gcgcacactc 180

gcgcgcacgt ggggccgagg ccctgctccc ggggcctcag ggccagccgg cgagggaccc 240

agccgagtga cagcaggagg cggagggaag ctcagagctc ccggagccgc ccggccagcg 300

tccggcctcc ctgatcgtct ctggccggcg ccctcgccct cgcccggcgc gcaccgagca 360

gccgcgggcg ccgagcagcc accgtcccga ccaagcgccg gccctgcccg cagcggcagg 420

atgaatgatt tcggaatcaa gaatatggac caggtagccc ctgtggctaa cagttacaga 480

gggacactca agcgccagcc agcctttgac acctttgatg ggtccctgtt tgctgttttt 540

ccttctctaa atgaagagca aacactgcaa gaagtgccaa caggcttgga ttccatttct 600

catgactccg ccaactgtga attgcctttg ttaaccccgt gcagcaaggc tgtgatgagt 660

caagccttaa aagctacctt cagtggcttc aaaaaggaac agcggcgcct gggcattcca 720

aagaacccct ggctgtggag tgagcaacag gtatgccagt ggcttctctg ggccaccaat 780

gagttcagtc tggtgaacgt gaatctgcag aggttcggca tgaatggcca gatgctgtgt 840

aaccttggca aggaacgctt tctggagctg gcacctgact ttgtgggtga cattctctgg 900

gaacatctgg agcaaatgat caaagaaaac caagaaaaga cagaagatca atatgaagaa 960

aattcacacc tcacctccgt tcctcattgg attaacagca atacattagg ttttggcaca 1020

gagcaggcgc cctatggaat gcagacacag aattacccca aaggcggcct cctggacagc 1080

atgtgtccgg cctccacacc cagcgtactc agctctgagc aggagtttca gatgttcccc 1140

aagtctcggc tcagctccgt cagcgtcacc tactgctctg tcagtcagga cttcccaggc 1200

agcaacttga atttgctcac caacaattct gggactccca aagaccacga ctcccctgag 1260

aacggtgcgg acagcttcga gagctcagac tccctcctcc agtcctggaa cagccagtcg 1320

tccttgctgg atgtgcaacg ggttccttcc ttcgagagct tcgaagatga ctgcagccag 1380

tctctctgcc tcaataagcc aaccatgtct ttcaaggatt acatccaaga gaggagtgac 1440

ccagtggagc aaggcaaacc agttatacct gcagctgtgc tggccggctt cacaggaagt 1500

ggacctattc agctgtggca gtttctcctg gagctgctat cagacaaatc ctgccagtca 1560

ttcatcagct ggactggaga cggatgggag tttaagctcg ccgaccccga tgaggtggcc 1620

cgccggtggg gaaagaggaa aaataagccc aagatgaact acgagaagct gagccggggc 1680

ttacgctact attacgacaa gaacatcatc cacaagacgt cggggaagcg ctacgtgtac 1740

cgcttcgtgt gcgacctcca gaacttgctg gggttcacgc ccgaggaact gcacgccatc 1800

ctgggcgtcc agcccgacac ggaggactga 1830

<210> 26

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ESRRG

<400> 26

atgtcaaaca aagatcgaca cattgattcc agctgttcgt ccttcatcaa gacggaacct 60

tccagcccag cctccctgac ggacagcgtc aaccaccaca gccctggtgg ctcttcagac 120

gccagtggga gctacagttc aaccatgaat ggccatcaga acggacttga ctcgccacct 180

ctctaccctt ctgctcctat cctgggaggt agtgggcctg tcaggaaact gtatgatgac 240

tgctccagca ccattgttga agatccccag accaagtgtg aatacatgct caactcgatg 300

cccaagagac tgtgtttagt gtgtggtgac atcgcttctg ggtaccacta tggggtagca 360

tcatgtgaag cctgcaaggc attcttcaag aggacaattc aaggcaatat agaatacagc 420

tgccctgcca cgaatgaatg tgaaatcaca aagcgcagac gtaaatcctg ccaggcttgc 480

cgcttcatga agtgtttaaa agtgggcatg ctgaaagaag gggtgcgtct tgacagagta 540

cgtggaggtc ggcagaagta caagcgcagg atagatgcgg agaacagccc atacctgaac 600

cctcagctgg ttcagccagc caaaaagcca tataacaaga ttgtctcaca tttgttggtg 660

gctgaaccgg agaagatcta tgccatgcct gaccctactg tccccgacag tgacatcaaa 720

gccctcacta cactgtgtga cttggccgac cgagagttgg tggttatcat tggatgggcg 780

aagcatattc caggcttctc cacgctgtcc ctggcggacc agatgagcct tctgcagagt 840

gcttggatgg aaattttgat ccttggtgtc gtataccggt ctctttcgtt tgaggatgaa 900

cttgtctatg cagacgatta tataatggac gaagaccagt ccaaattagc aggccttctt 960

gatctaaata atgctatcct gcagctggta aagaaataca agagcatgaa gctggaaaaa 1020

gaagaatttg tcaccctcaa agctatagct cttgctaatt cagactccat gcacatagaa 1080

gatgttgaag ccgttcagaa gcttcaggat gtcttacatg aagcgctgca ggattatgaa 1140

gctggccagc acatggaaga ccctcgtcga gctggcaaga tgctgatgac actgccactc 1200

ctgaggcaga cctctaccaa ggccgtgcag catttctaca acatcaaact agaaggcaaa 1260

gtcccaatgc acaaactttt tttggaaatg ttggaggcca aggtctga 1308

<210> 27

<211> 1452

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SMARCD3

<400> 27

atggccgcgg acgaagttgc cggaggggcg cgcaaagcca cgaaaagcaa actttttgag 60

tttctggtcc atggggtgcg ccccgggatg ccgtctggag cccggatgcc ccaccagggg 120

gcgcccatgg gccccccggg ctccccgtac atgggcagcc ccgccgtgcg acccggcctg 180

gcccccgcgg gcatggagcc cgcccgcaag cgagcagcgc ccccgcccgg gcagagccag 240

gcacagagcc agggccagcc ggtgcccacc gcccccgcgc ggagccgcag tgccaagagg 300

aggaagatgg ctgacaaaat cctccctcaa aggattcggg agctggtccc cgagtcccag 360

gcttacatgg acctcttggc atttgagagg aaactggatc aaaccatcat gcggaagcgg 420

gtggacatcc aggaggctct gaagaggccc atgaagcaaa agcggaagct gcgactctat 480

atctccaaca cttttaaccc tgcgaagcct gatgctgagg attccgacgg cagcattgcc 540

tcctgggagc tacgggtgga ggggaagctc ctggatgatc ccagcaaaca gaagcggaag 600

ttctcttctt tcttcaagag tttggtcatc gagctggaca aagatcttta tggccctgac 660

aaccacctcg ttgagtggca tcggacaccc acgacccagg agacggacgg cttccaggtg 720

aaacggcctg gggacctgag tgtgcgctgc acgctgctcc tcatgctgga ctaccagcct 780

ccccagttca aactggatcc ccgcctagcc cggctgctgg ggctgcacac acagagccgc 840

tcagccattg tccaggccct gtggcagtat gtgaagacca acaggctgca ggactcccat 900

gacaaggaat acatcaatgg ggacaagtat ttccagcaga tttttgattg tccccggctg 960

aagttttctg agattcccca gcgcctcaca gccctgctat tgccccctga cccaattgtc 1020

atcaaccatg tcatcagcgt ggacccttca gaccagaaga agacggcgtg ctatgacatt 1080

gacgtggagg tggaggagcc attaaagggg cagatgagca gcttcctcct atccacggcc 1140

aaccagcagg agatcagtgc tctggacagt aagatccatg agacgattga gtccataaac 1200

cagctcaaga tccagaggga cttcatgcta agcttctcca gagaccccaa aggctatgtc 1260

caagacctgc tccgctccca gagccgggac ctcaaggtga tgacagatgt agccggcaac 1320

cctgaagagg agcgccgggc tgagttctac caccagccct ggtcccagga ggccgtcagt 1380

cgctacttct actgcaagat ccagcagcgc aggcaggagc tggagcagtc gctggttgtg 1440

cgcaacacct ag 1452

<210> 28

<211> 3297

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ZFPM2

<400> 28

atgtcccggc gaaagcaaag caaaccccgg cagatcaaac gtgatgatga aggaatccag 60

gagacagcag aatcagatgg ggacacacag tcagagaaac cggggcaacc tggagttgag 120

acagacgact gggatggacc aggagagctg gaggtgtttc agaaagatgg ggaacgaaaa 180

attcagagtc gacagcaact tccagtggga acaacctggg ggccgtttcc tgggaagatg 240

gacttgaata ataattcttt gaagacaaag gctcaggtcc caatggtgct gactgctggt 300

cccaagtggt tgctggatgt gacttggcaa ggagtggaag acaacaaaaa caactgcatt 360

gtgtacagca aagggggtca gctttggtgt acaactacga aggccatctc tgagggtgaa 420

gagctaattg cctttgtggt ggattttgac tcaaggctac aagctgccag tcagatgact 480

ctcacagaag ggatgtaccc tgcacgcctg ctggactcaa ttcagctgct tcctcagcaa 540

gctgccatgg cttctatttt gcccacagct attgtcaata aggatatatt cccttgcaag 600

tcctgtggca tctggtatcg gagtgagcgg aatctgcagg cccatttgat gtactactgc 660

agtgggaggc aaagagaagc tgctccggtg tcagaggaaa atgaagacag tgcccatcag 720

atttccagcc tgtgcccctt cccacagtgc accaagagct tttcaaatgc tcgagctcta 780

gaaatgcacc tgaattcaca cagtggagtg aaaatggaag aattcctgcc ccctggtgct 840

agtctaaaat gcaccgtctg tagctacact gctgattccg tgatcaactt tcaccaacac 900

ctgttctccc atctcactca agctgccttc cgatgtaatc actgccattt cggcttccag 960

actcagaggg agttattgca gcaccaggag ctccatgtcc ctagcggcaa acttcccaga 1020

gaaagtgaca tggaacactc tccaagtgca actgaagaca gcttacagcc agccacagac 1080

ttattgacca gaagcgaact tccccagagc caaaaggcca tgcagactaa agatgcgagc 1140

tctgacacag agctggacaa gtgtgagaaa aagactcagc tctttctcac gaaccagaga 1200

ccagagatac agcctacaac aaataaacaa agcttttctt acacaaaaat aaagtctgag 1260

ccctctagcc caagacttgc ctcatctcca gttcagccta atattgggcc ttctttccct 1320

gtgggccctt tcctatctca gttttctttc ccccaagata tcaccatggt ccctcaagct 1380

tcagagatct tagctaagat gtctgaactg gtgcatcggc gactgaggca tggcagtagt 1440

agctaccctc ccgtcattta cagccctttg atgcccaagg gggctacttg ttttgagtgt 1500

aacataacat tcaataattt ggataattat ctagtgcaca aaaagcatta ttgcagcagc 1560

cgatggcagc agatggctaa gtccccagag ttccctagtg tgtcagaaaa gatgcctgaa 1620

gctttgagtc ccaacactgg ccaaacctcc ataaaccttc tcaacccagc tgctcattct 1680

gctgatcctg agaatccact tcttcaaaca tcttgcatca attcttccac tgtcttagat 1740

ttaattgggc caaatgggaa gggccatgac aaggactttt ccactcaaac taagaagctc 1800

tccacctcca gtaacaatga tgacaaaatt aatggaaaac ctgttgatgt gaaaaatccc 1860

agtgtcccct tagtggatgg ggaaagtgac ccaaataaga ctacctgtga agcttgcaac 1920

attaccttca gccggcacga aacatacatg gtccacaaac agtattactg tgctacacgc 1980

cacgaccctc cactgaagag gtctgcttcc aacaaagtgc ctgccatgca gagaaccatg 2040

cgcacacgca agcgcagaaa gatgtatgag atgtgcctac ctgagcagga acaaaggcct 2100

ccactggttc agcagagatt tcttgacgta gccaacctca ataatccttg tacctccact 2160

caagaaccca cagaagggct aggagagtgc taccacccaa gatgtgatat ctttccagga 2220

attgtctcta aacacttgga aacttctctg acgatcaaca agtgtgttcc agtttccaaa 2280

tgtgatacta ctcattccag tgtttcctgc ctagagatgg acgtgcccat agatctcagc 2340

aaaaagtgtt tatctcagtc tgagcggacg accacgtctc ccaaaaggct gctggactat 2400

cacgagtgca ctgtgtgcaa gatcagtttc aataaggtag aaaactatct ggcccacaag 2460

cagaatttct gcccggttac tgcacatcag cgtaatgacc tgggtcaact ggacggcaaa 2520

gtgtttccga atccagaaag cgaacgaaac agccctgatg tcagctacga aagaagcata 2580

ataaaatgtg agaaaaatgg gaatttgaag cagccttccc ccaatggaaa cttattttca 2640

tcccacctag caaccctgca aggcttgaag gtctttagtg aagctgctca gctcattgct 2700

acaaaagaag aaaacagaca tttgtttctt ccacaatgcc tttaccctgg agcaataaag 2760

aaagcaaaag gagccgacca gctttctcca tattatggaa tcaagccaag tgattatatt 2820

tctggttctc ttgtcatcca taacactgac atcgagcaaa gcagaaatgc agaaaatgaa 2880

tctcctaaag gccaggcttc ctcaaatggg tgtgctgcgc tgaagaaaga ttctctgcca 2940

ttgttgccca aaaatcgagg aatggtaata gtgaatggtg gactgaaaca agatgagaga 3000

cctgctgcca acccacagca agagaacatt tcccagaatc ctcagcacga agacgaccac 3060

aaatctccct cgtggatctc tgagaaccca ttagctgcca atgagaatgt ctcaccagga 3120

attccctcag cagaggaaca gttgtctagt atagcaaaag gtgtgaatgg ttccagccag 3180

gctccaacca gtgggaaata ttgccggcta tgtgatatcc agttcaacaa cctttcaaac 3240

tttataactc acaagaagtt ttattgctca tcacatgcag cagaacatgt caaatga 3297

<210> 29

<211> 1033

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DN SNAI1

<400> 29

cactataggg cgaattggcg gaaggccgtc aaggccgcat ttggaccctc gtacagaagc 60

taatacgact cactataggg aaataagaga gaaaataaga gtaagaagaa atataagagc 120

caccatgagg aagccgtccg acccccgccg gaagcccaac tatagcgagc tgcaggacgc 180

gtgtgtggag ttcaccttcc agcagcccta cgaccaggcc cacctgctgg ccgccatccc 240

tccgcccgag gtcctcaacc ccgccgcttc gctgcccacc ctcatctggg actctctcct 300

ggtaccccaa gtgcggccgg ttgcctgggc caccctcccg ctgcgggaga gccccaaggc 360

cgtagagctg acctcgctgt ccgatgagga cagtggcaaa agctcccagc cgcccagccc 420

gccctcgccg gcgccgtcgt ccttctcgtc cacctcggcc tcctccctgg aggccgaggc 480

cttcatcgcc ttccctggct tgggccaact tcccaagcag ctggccaggc tctcggtggc 540

caaggacccc cagtcgcgga agatcttcaa ctgcaaatat tgtaacaagg agtacctcag 600

cctgggcgct ctgaagatgc acatccgaag ccacacgctg ccttgtgtct gcacgacctg 660

tggaaaggcc ttctctaggc cctggctgct tcagggccac gtccgcaccc acactggtga 720

gaagccattc tcctgctccc actgcaaccg tgcttttgct gaccgctcca acctgcgtgc 780

ccacctccaa acccactcgg atgtgaagag ataccagtgc caggcctgtg cccgaacctt 840

ctcccgcatg tccttgctcc acaagcacca agagtctggc tgctccggag gccctcgctg 900

agctgccttc tgcggggctt gccttctggc catgcccttc ttctctccct tgcacctgta 960

cctcttggtc tttgaataaa gcctgagtag gaactgggcc tcatgggcct tccgctcact 1020

gcccgctttc cag 1033

<210> 30

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mesp1

<400> 30

atggcccagc ccctgtgcga gccgcgctcc gagtcctgga tcctgagtcc cgctggtcgg 60

cagccaccga tgccttccga tgggaacagc gtctgctccc cagcctggtc ctcggacccg 120

tgggacggtg cccaggccag cagccctgca ccaccctgcg cccgcccggc ccggcgtgct 180

gggaccccgg gtaggcgcgg gacgcacggt agccgcctgg gtagcggaca gcggcagagc 240

gccagcgagc gggagaagct acgtatgcgc acactcgccc gcgcgctgca cgagctgcgc 300

cgcttcttgc cgccatccgt ggcaccaacc ggccagaacc tgaccaagat cgagacgctg 360

cgcctggcca tccgctacat tggccacctg tcggctgtgc tgggactcag cgaggacaac 420

ctccggcgac agcggcacgc ggtgtcacct cgaggctgcc cgctgtgccc cgacagcgac 480

ctggcgcagt cgcagtcgct cggtccccgt ttaagcccgg ccgtctgcag cggggtgtcg 540

tggggatccc cgcctgccta ccctagaccc cgagtcgccg cagaatcgtg ggacccatcg 600

ttcctgtacg cagaaacagc atcccaggaa aggcaggaaa tggagcccag tccctcatct 660

ccgctcttca gcagcgacat gctggctctt ctagaaacct ggacgccgcc gcaggagtgg 720

ccgcctgcct ga 732

<210> 31

<211> 306

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sumo1

<400> 31

atgtctgacc aggaggcaaa accttcaact gaggacttag gcgataagaa ggaaggagaa 60

tacattaaac tcaaagttat tggacaggat agcagtgaga tacatttcaa agtgaaaatg 120

acaacacatc tcaagaaact caaagaatca tactgtcaaa gacagggagt tccaatgaat 180

tcactcaggt ttctctttga aggtcagaga attgctgata atcatactcc gaaagaactg 240

ggaatggagg aagaagatgt gattgaagtt tatcaggaac aaacgggggg tcactcgacg 300

gtttag 306

<210> 32

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NKX2.5

<400> 32

atgttcccca gccctgcgct cacacccacg cctttctcag tcaaagacat cctgaacctg 60

gagcagcagc agcgtagcct ggcgtctggg gacctgtctg cgcgcctcga ggccaccctg 120

gcccctgcct cctgcatgct ggccgccttc aagcccgagg cctactctgg ccccgaggcg 180

gcagcgtccg gcctggcaga gctgcgcgcg gagatgggcc ccgcgccttc gccccccaag 240

tgctctcctg ctttcccagc cgcccccaca ttttacccgg gagcctacgg tgaccctgac 300

ccagccaaag accctcgggc ggataaaaaa gagctgtgcg cgctgcagaa ggcagtggag 360

ctggacaaag ccgagacgga tggcgccgag agaccacgcg cacggcggcg acggaagcca 420

cgcgtgctct tctcgcaggc gcaggtctac gagctggagc ggcgcttcaa gcaacagcgg 480

tacctgtcgg cgccagagcg cgaccagctg gccagcgtgc tgaagctcac gtccacgcag 540

gtcaagatct ggttccagaa ccgtcgctac aagtgcaagc gacagcggca ggaccagact 600

ctggagcttc tggggccgcc gccgccgccc gcgcgcagga tcgcggtgcc cgtgctggtg 660

cgcgacggga agccctgcct gggggacccc gcggcctacg ctcccgccta cggcgtgggt 720

ctcaatgcct atggctacaa cgcctacccc taccccagct acggcggcgc ggcctgcagt 780

cccggctaca gctgcgccgc ctaccccgct gcgccccccg ccgcgcagcc ccccgccgcc 840

tccgccaaca gcaacttcgt gaactttggc gtcggggact tgaacaccgt gcagagtccc 900

gggatgccgc agggcaattc gggcgtctcc acgctgcacg gcatccgagc ctggtag 957

<210> 33

<211> 1311

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tbx6

<400> 33

atgtaccatc cacgagagtt gtacccctcc ctggggactg gctaccgtct gggacacccc 60

cagcctgggg cagactccac cttcccacct gccctgacag agggttaccg ctaccctgat 120

ttggatactt ctaaactgga ttgcttcctc tctgggatcg aggcagctcc ccacactctg 180

gctgcagccg ctcctttgcc ccttctccca tctgctctgg gccccgagac agcaccgcca 240

cccccagagg cccttcactc gcttcctggg gtcagcctga gcttggagaa ccaggaactg 300

tggaaggaat tcagcgctgt ggggacagag atgatcatca ccaaggctgg caggcgcatg 360

ttccctgctt gccgagtatc agtcactggc ctggacccag aggcccgcta cttgtttctt 420

ctggatgtgg ttccagtgga tggggcccga taccgctggc agggccagca ctgggagcca 480

agtggcaagg ctgaaccccg cctacccgac cgtgtctaca ttcaccctga ctctcctgcc 540

actggtgccc actggatgcg gcagcccgta tccttccatc gtgttaagct caccaacagc 600

acactggacc cccatggcca cctgatcttg cactcgatgc acaagtacca gcctcgcatc 660

cacctggtga gagccaccca actatgcagc caacactggg ggggtgtggc ctccttccga 720

tttcctgaga ccacattcat ctctgtgaca gcctaccaga accctaggat cacacagctg 780

aagatcgcag ccaatccctt tgccaaaggt ttccgagaaa atggcagaaa ctgtaagagg 840

gagcgggatg cccgtgtgaa gaggaaactt cggggcccag agccagtggc cacagaggcc 900

tgtgggagtg gggatacacc agggggtccc tgtgactcca ccctgggtgg ggacattcgg 960

gactcagatc cagagcaggc cccaaccccc caggaagctg cttctgcctc agctcctcca 1020

tgtgggggcc ccagtgctga ggcctacctt ctacaccctg ccgcttttca tggcgccccc 1080

agtcacctac cagccaggac ccccagcttc gctgaggctc cagaccctgg gcgcccagcc 1140

ccctactcag ctgcatttct ggacctacag cctggaccag ggggctctgc ctatcaggca 1200

gctccatctg taccatcctt tgccccacac ttcatccaag ggggtccctt ccctctaccg 1260

tacccaggac ctggaggtta tctggacatg ggatccaagc caatgtactg a 1311

<210> 34

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ad52E4

<400> 34

atggctgatc aacatatata tgtgcatttg ctgggacgtc gggccttttt gccccagcaa 60

cagggttatt ctaatatgta tgttcttttt tcaccggagg attttgtgct tgctcccaga 120

gggattattt tgctgtcttt gcagctgtcg ttggatattc ccactgggta tctgggacgt 180

tttttttctg tggcggatat gaatgtgagg ggggtattgc tgtgtgctca ggagatccaa 240

ccgagtacat ggtgggaagt ttctgttgtt ctttttaatc attcggatga attttaccgc 300

ggttcccggg gacagccggt tgcttgcctg ctgctggagc gtgtcatata tcccaccgtt 360

cgccaagctt ctttagttta a 381

<210> 35

<211> 3210

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人TERT

<400> 35

atgccgcgcg ctccccgctg ccgagccgtg cgctccctgc tgcgcagcca ctaccgcgag 60

gtgctgccgc tggccacgtt cgtgcggcgc ctggggcccc agggctggcg gctggtgcag 120

cgcggggacc cggcggcttt ccgcgcgctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180

gacgcacggc cgccccccgc cgccccctcc ttccgccagg tgtcctgcct gaaggagctg 240

gtggcccgag tgctgcagag gctgtgcgag cgcggcgcga agaacgtgct ggccttcggc 300

ttcgcgctgc tggacggggc ccgcgggggc ccccccgagg ccttcaccac cagcgtgcgc 360

agctacctgc ccaacacggt gaccgacgca ctgcggggga gcggggcgtg ggggctgctg 420

ctgcgccgcg tgggcgacga cgtgctggtt cacctgctgg cacgctgcgc gctctttgtg 480

ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcgggccgc cgctgtacca gctcggcgct 540

gccactcagg cccggccccc gccacacgct agtggacccc gaaggcgtct gggatgcgaa 600

cgggcctgga accatagcgt cagggaggcc ggggtccccc tgggcctgcc agccccgggt 660

gcgaggaggc gcgggggcag tgccagccga agtctgccgt tgcccaagag gcccaggcgt 720

ggcgctgccc ctgagccgga gcggacgccc gttgggcagg ggtcctgggc ccacccgggc 780

aggacgcgtg gaccgagtga ccgtggtttc tgtgtggtgt cacctgccag acccgccgaa 840

gaagccacct ctttggaggg tgcgctctct ggcacgcgcc actcccaccc atccgtgggc 900

cgccagcacc acgcgggccc cccatccaca tcgcggccac cacgtccctg ggacacgcct 960

tgtcccccgg tgtacgccga gaccaagcac ttcctctact cctcaggcga caaggagcag 1020

ctgcggccct ccttcctact cagctctctg aggcccagcc tgactggcgc tcggaggctc 1080

gtggagacca tctttctggg ttccaggccc tggatgccag ggactccccg caggttgccc 1140

cgcctgcccc agcgctactg gcaaatgcgg cccctgtttc tggagctgct tgggaaccac 1200

gcgcagtgcc cctacggggt gctcctcaag acgcactgcc cgctgcgagc tgcggtcacc 1260

ccagcagccg gtgtctgtgc ccgggagaag ccccagggct ctgtggcggc ccccgaggag 1320

gaggacacag acccccgtcg cctggtgcag ctgctccgcc agcacagcag cccctggcag 1380

gtgtacggct tcgtgcgggc ctgcctgcgc cggctggtgc ccccaggcct ctggggctcc 1440

aggcacaacg aacgccgctt cctcaggaac accaagaagt tcatctccct ggggaagcat 1500

gccaagctct cgctgcagga gctgacgtgg aagatgagcg tgcgggactg cgcttggctg 1560

cgcaggagcc caggggttgg ctgtgttccg gccgcagagc accgtctgcg tgaggagatc 1620

ctggccaagt tcctgcactg gctgatgagt gtgtacgtcg tcgagctgct caggtctttc 1680

ttttatgtca cggagaccac gtttcaaaag aacaggctct ttttctaccg gaagagtgtc 1740

tggagcaagt tgcaaagcat tggaatcaga cagcacttga agagggtgca gctgcgggag 1800

ctgtcggaag cagaggtcag gcagcatcgg gaagccaggc ccgccctgct gacgtccaga 1860

ctccgcttca tccccaagcc tgacgggctg cggccgattg tgaacatgga ctacgtcgtg 1920

ggagccagaa cgttccgcag agaaaagagg gccgagcgtc tcacctcgag ggtgaaggca 1980

ctgttcagcg tgctcaacta cgagcgggcg cggcgccccg gcctcctggg cgcctctgtg 2040

ctgggcctgg acgatatcca cagggcctgg cgcaccttcg tgctgcgtgt gcgggcccag 2100

gacccgccgc ctgagctgta ctttgtcaag gtggatgtga cgggcgcgta cgacaccatc 2160

ccccaggaca ggctcacgga ggtcatcgcc agcatcatca aaccccagaa cacgtactgc 2220

gtgcgtcggt atgccgtggt ccagaaggcc gcccatgggc acgtccgcaa ggccttcaag 2280

agccacgtct ctaccttgac agacctccag ccgtacatgc gacagttcgt ggctcacctg 2340

caggagacca gcccgctgag ggatgccgtc gtcatcgagc agagctcctc cctgaatgag 2400

gccagcagtg gcctcttcga cgtcttccta cgcttcatgt gccaccacgc cgtgcgcatc 2460

aggggcaagt cctacgtcca gtgccagggg atcccgcagg gctccatcct ctccacgctg 2520

ctctgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt ttgcggggat tcggcgggac 2580

gggctgctcc tgcgtttggt ggatgatttc ttgttggtga cacctcacct cacccacgcg 2640

aaaaccttcc tcagctatgc ccggacctcc atcagagcca gtctcacctt caaccgcggc 2700

ttcaaggctg ggaggaacat gcgtcgcaaa ctctttgggg tcttgcggct gaagtgtcac 2760

agcctgtttc tggatttgca ggtgaacagc ctccagacgg tgtgcaccaa catctacaag 2820

atcctcctgc tgcaggcgta caggtttcac gcatgtgtgc tgcagctccc atttcatcag 2880

caagtttgga agaaccccac atttttcctg cgcgtcatct ctgacacggc ctccctctgc 2940

tactccatcc tgaaagccaa gaacgcaggg atgtcgctgg gggccaaggg cgccgccggc 3000

cctctgccct ccgaggccgt gcagtggctg tgccaccaag cattcctgct caagctgact 3060

cgacaccgtg tcacctacgt gccactcctg gggtcactca ggacagccca gacgcagctg 3120

agtcggaagc tcccggggac gacgctgact gccctggagg ccgcagccaa cccggcactg 3180

ccctcagact tcaagaccat cctggactga 3210

<210> 36

<211> 1776

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pkm2

<400> 36

atgactcaac ctttcaactt tgcggctttt gagaaaattt tcttccttgg ctcttcaggg 60

caaagcatac tccactctga gcgatctttc caagtgaggc caccaagcca cactgagtca 120

acaaaacagc aatatgccat cagaagccca gacccagaga accaaaggac ttcaggaacc 180

atgccgaagc cacacagtga agcagggact gccttcattc agacccagca gctccatgca 240

gccatggctg acaccttcct ggaacacatg tgccgcctgg acattgactc tgcccccatc 300

acggcccgca acactggcat catttgtacc attgggcctg cttcccgatc tgtggagatg 360

ctgaaggaga tgattaagtc tggaatgaat gtggctcggc tgaatttctc tcatggaacc 420

catgagtacc atgcagagac catcaagaat gtccgtgaag ccacagaaag ctttgcatct 480

gatcccattc tctaccgtcc tgttgcggtg gctctggata caaagggacc tgagatccgg 540

actggactca tcaagggcag cggcaccgct gaggtggagc tgaagaaggg agccactctg 600

aagatcaccc tggacaacgc ttacatggag aagtgtgacg agaacatcct gtggctggac 660

tacaagaaca tctgcaaggt ggtggaggtg ggcagcaaga tctacgtgga cgatgggctc 720

atctcactgc aggtgaagga gaaaggcgct gacttcctgg tgacggaggt ggagaatggt 780

ggctccttgg gcagcaagaa gggcgtgaac ctgccgggcg ctgctgtgga tctccccgct 840

gtgtcggaaa aggacatcca ggacctgaag tttggggtgg agcaggatgt ggacatggtg 900

tttgcatctt tcatccgcaa ggcagccgac gtgcatgaag tcaggaaggt gctgggagag 960

aagggcaaga acatcaagat catcagcaaa atcgagaacc atgaaggcgt ccgcaggttt 1020

gatgagatct tggaggccag tgatgggatc atggtggctc gtggtgacct gggcattgag 1080

attcctgcag agaaggtctt cctggctcag aagatgatga tcgggcgatg caaccgagct 1140

gggaagcctg tcatctgtgc cacacagatg ctggagagca tgatcaagaa gccacgcccc 1200

acccgtgctg aaggcagtga tgtggccaat gcagtcctgg atggagcaga ctgcatcatg 1260

ctgtctggag aaacagccaa gggggactac cctctggagg ctgttcgcat gcagcacctg 1320

atagctcggg aggctgaggc agccatgttc caccgtctgc tgtttgaaga gcttgtgcga 1380

gcctccagtc actccacaga cctcatggag gccatggcca tgggcagcgt ggaggcctct 1440

tataagtgtt tagcagcagc tttgatagtt ctcacggagt ctggcaggag tgctcaccaa 1500

gtggccaggt accgccctcg ggctcctatc attgccgtga ctcgaaatcc ccagactgct 1560

cgccaggccc atctgtaccg tggcatcttc cctgtgctgt gtaaggatgc cgtgctgaat 1620

gcctgggctg aggatgtcga ccttcgtgta aacttggcca tggatgttgg caaggcccga 1680

ggcttcttca agaagggaga tgtggtcatt gtgctgaccg ggtggcgccc tggctctgga 1740

ttcaccaaca ccatgcgtgt agtgcctgta ccttga 1776

<210> 37

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠GATA4

<400> 37

Met Tyr Gln Ser Leu Ala Met Ala Ala Asn His Gly Pro Pro Pro Gly

1 5 10 15

Ala Tyr Glu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Phe Met His Ser Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Ser Ser Pro Val Tyr Val Pro Thr Pro Arg Val Pro Ser Ser Val

35 40 45

Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Ala Gly

50 55 60

Thr Thr Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ala Gly Pro Ser Gly Ala Gly Pro

65 70 75 80

Gly Thr Gln Gln Gly Ser Pro Gly Trp Ser Gln Ala Gly Ala Glu Gly

85 90 95

Ala Ala Tyr Thr Pro Pro Pro Val Ser Pro Arg Phe Ser Phe Pro Gly

100 105 110

Thr Thr Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala

130 135 140

Gly Arg Glu Gln Tyr Gly Arg Pro Gly Phe Ala Gly Ser Tyr Ser Ser

145 150 155 160

Pro Tyr Pro Ala Tyr Met Ala Asp Val Gly Ala Ser Trp Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Ser Ala Gly Pro Phe Asp Ser Pro Val Leu His Ser Leu

180 185 190

Pro Gly Arg Ala Asn Pro Gly Arg His Pro Asn Leu Val Asp Met Phe

195 200 205

Asp Asp Phe Ser Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Met Ser

210 215 220

Thr Pro Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala

225 230 235 240

Cys Gly Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Ile Asn Arg Pro Leu Ile Lys

245 250 255

Pro Gln Arg Arg Leu Ser Ala Ser Arg Arg Val Gly Leu Ser Cys Ala

260 265 270

Asn Cys Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Glu Gly

275 280 285

Glu Pro Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Met Lys Leu His Gly Val

290 295 300

Pro Arg Pro Leu Ala Met Arg Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Lys Arg

305 310 315 320

Lys Pro Lys Asn Leu Asn Lys Ser Lys Thr Pro Ala Gly Pro Ala Gly

325 330 335

Glu Thr Leu Pro Pro Ser Ser Gly Ala Ser Ser Gly Asn Ser Ser Asn

340 345 350

Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Glu Met Arg Pro Ile Lys Thr

355 360 365

Glu Pro Gly Leu Ser Ser His Tyr Gly His Ser Ser Ser Met Ser Gln

370 375 380

Thr Phe Ser Thr Val Ser Gly His Gly Pro Ser Ile His Pro Val Leu

385 390 395 400

Ser Ala Leu Lys Leu Ser Pro Gln Gly Tyr Ala Ser Pro Val Thr Gln

405 410 415

Thr Ser Gln Ala Ser Ser Lys Gln Asp Ser Trp Asn Ser Leu Val Leu

420 425 430

Ala Asp Ser His Gly Asp Ile Ile Thr Ala

435 440

<210> 38

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Mef2c

<400> 38

Met Gly Arg Lys Lys Ile Gln Ile Thr Arg Ile Met Asp Glu Arg Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Thr Lys Arg Lys Phe Gly Leu Met Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Cys Glu Ile Ala Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Asn Ser Thr Asn Lys Leu Phe Gln Tyr Ala Ser Thr Asp Met Asp Lys

50 55 60

Val Leu Leu Lys Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Pro His Glu Ser Arg Thr

65 70 75 80

Asn Ser Asp Ile Val Glu Thr Leu Arg Lys Lys Gly Leu Asn Gly Cys

85 90 95

Asp Ser Pro Asp Pro Asp Ala Asp Asp Ser Val Gly His Ser Pro Glu

100 105 110

Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Lys Ile Asn Glu Asp Ile Asp Leu Met Ile

115 120 125

Ser Arg Gln Arg Leu Cys Ala Val Pro Pro Pro Ser Phe Glu Met Pro

130 135 140

Val Thr Ile Pro Val Ser Ser His Asn Ser Leu Val Tyr Ser Asn Pro

145 150 155 160

Val Ser Thr Leu Gly Asn Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala His Pro Ser

165 170 175

Leu Gln Arg Asn Ser Met Ser Pro Gly Val Thr His Arg Pro Pro Ser

180 185 190

Ala Gly Asn Thr Gly Gly Leu Met Gly Gly Asp Leu Thr Ser Gly Ala

195 200 205

Gly Thr Ser Ala Gly Asn Gly Tyr Gly Asn Pro Arg Asn Ser Pro Gly

210 215 220

Leu Leu Val Ser Pro Gly Asn Leu Asn Lys Asn Ile Gln Ala Lys Ser

225 230 235 240

Pro Pro Pro Met Asn Leu Gly Met Asn Asn Arg Lys Pro Asp Leu Arg

245 250 255

Val Leu Ile Pro Pro Gly Ser Lys Asn Thr Met Pro Ser Val Asn Gln

260 265 270

Arg Ile Asn Asn Ser Gln Ser Ala Gln Ser Leu Ala Thr Pro Val Val

275 280 285

Ser Val Ala Thr Pro Thr Leu Pro Gly Gln Gly Met Gly Gly Tyr Pro

290 295 300

Ser Ala Ile Ser Thr Thr Tyr Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Ser Ser Ala

305 310 315 320

Asp Leu Ser Ser Leu Ser Gly Phe Asn Thr Ala Ser Ala Leu His Leu

325 330 335

Gly Ser Val Thr Gly Trp Gln Gln Gln His Leu His Asn Met Pro Pro

340 345 350

Ser Ala Leu Ser Gln Leu Gly Ala Cys Thr Ser Thr His Leu Ser Gln

355 360 365

Ser Ser Asn Leu Ser Leu Pro Ser Thr Gln Ser Leu Ser Ile Lys Ser

370 375 380

Glu Pro Val Ser Pro Pro Arg Asp Arg Thr Thr Thr Pro Ser Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Gln His Thr Thr Arg His Glu Ala Gly Arg Ser Pro Val Asp Ser

405 410 415

Leu Ser Ser Cys Ser Ser Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Arg Glu Asp His

420 425 430

Arg Asn Glu Phe His Ser Pro Ile Gly Leu Thr Arg Pro Ser Pro Asp

435 440 445

Glu Arg Glu Ser Pro Ser Val Lys Arg Met Arg Leu Ser Glu Gly Trp

450 455 460

Ala Thr

465

<210> 39

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Tbx5

<400> 39

Met Ala Asp Thr Asp Glu Gly Phe Gly Leu Ala Arg Thr Pro Leu Glu

1 5 10 15

Pro Asp Ser Lys Asp Arg Ser Cys Asp Ser Lys Pro Glu Ser Ala Leu

20 25 30

Gly Ala Pro Ser Lys Ser Pro Ser Ser Pro Gln Ala Ala Phe Thr Gln

35 40 45

Gln Gly Met Glu Gly Ile Lys Val Phe Leu His Glu Arg Glu Leu Trp

50 55 60

Leu Lys Phe His Glu Val Gly Thr Glu Met Ile Ile Thr Lys Ala Gly

65 70 75 80

Arg Arg Met Phe Pro Ser Tyr Lys Val Lys Val Thr Gly Leu Asn Pro

85 90 95

Lys Thr Lys Tyr Ile Leu Leu Met Asp Ile Val Pro Ala Asp Asp His

100 105 110

Arg Tyr Lys Phe Ala Asp Asn Lys Trp Ser Val Thr Gly Lys Ala Glu

115 120 125

Pro Ala Met Pro Gly Arg Leu Tyr Val His Pro Asp Ser Pro Ala Thr

130 135 140

Gly Ala His Trp Met Arg Gln Leu Val Ser Phe Gln Lys Leu Lys Leu

145 150 155 160

Thr Asn Asn His Leu Asp Pro Phe Gly His Ile Ile Leu Asn Ser Met

165 170 175

His Lys Tyr Gln Pro Arg Leu His Ile Val Lys Ala Asp Glu Asn Asn

180 185 190

Gly Phe Gly Ser Lys Asn Thr Ala Phe Cys Thr His Val Phe Pro Glu

195 200 205

Thr Ala Phe Ile Ala Val Thr Ser Tyr Gln Asn His Lys Ile Thr Gln

210 215 220

Leu Lys Ile Glu Asn Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg Gly Ser Asp

225 230 235 240

Asp Leu Glu Leu His Arg Met Ser Arg Met Gln Ser Lys Glu Tyr Pro

245 250 255

Val Val Pro Arg Ser Thr Val Arg His Lys Val Thr Ser Asn His Ser

260 265 270

Pro Phe Ser Ser Glu Thr Arg Ala Leu Ser Thr Ser Ser Asn Leu Gly

275 280 285

Ser Gln Tyr Gln Cys Glu Asn Gly Val Ser Gly Pro Ser Gln Asp Leu

290 295 300

Leu Pro Pro Pro Asn Pro Tyr Pro Leu Ala Gln Glu His Ser Gln Ile

305 310 315 320

Tyr His Cys Thr Lys Arg Lys Asp Glu Glu Cys Ser Ser Thr Glu His

325 330 335

Pro Tyr Lys Lys Pro Tyr Met Glu Thr Ser Pro Ser Glu Glu Asp Thr

340 345 350

Phe Tyr Arg Ser Gly Tyr Pro Gln Gln Gln Gly Leu Ser Thr Ser Tyr

355 360 365

Arg Thr Glu Ser Ala Gln Arg Gln Ala Cys Met Tyr Ala Ser Ser Ala

370 375 380

Pro Pro Ser Glu Pro Val Pro Ser Leu Glu Asp Ile Ser Cys Asn Thr

385 390 395 400

Trp Pro Ser Met Pro Ser Tyr Ser Ser Cys Thr Val Thr Thr Val Gln

405 410 415

Pro Met Asp Arg Leu Pro Tyr Gln His Phe Ser Ala His Phe Thr Ser

420 425 430

Gly Pro Leu Val Pro Arg Leu Ala Gly Met Ala Asn His Gly Ser Pro

435 440 445

Gln Leu Gly Glu Gly Met Phe Gln His Gln Thr Ser Val Ala His Gln

450 455 460

Pro Val Val Arg Gln Cys Gly Pro Gln Thr Gly Leu Gln Ser Pro Gly

465 470 475 480

Gly Leu Gln Pro Pro Glu Phe Leu Tyr Thr His Gly Val Pro Arg Thr

485 490 495

Leu Ser Pro His Gln Tyr His Ser Val His Gly Val Gly Met Val Pro

500 505 510

Glu Trp Ser Glu Asn Ser

515

<210> 40

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠Hand2

<400> 40

Met Ser Leu Val Gly Gly Phe Pro His His Pro Val Val His His Glu

1 5 10 15

Gly Tyr Pro Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

20 25 30

Ser Arg Cys Ser His Glu Glu Asn Pro Tyr Phe His Gly Trp Leu Ile

35 40 45

Gly His Pro Glu Met Ser Pro Pro Asp Tyr Ser Met Ala Leu Ser Tyr

50 55 60

Ser Pro Glu Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Gly Leu Asp His Ser His Tyr

65 70 75 80

Gly Gly Val Pro Pro Gly Ala Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Pro Arg

85 90 95

Pro Val Lys Arg Arg Gly Thr Ala Asn Arg Lys Glu Arg Arg Arg Thr

100 105 110

Gln Ser Ile Asn Ser Ala Phe Ala Glu Leu Arg Glu Cys Ile Pro Asn

115 120 125

Val Pro Ala Asp Thr Lys Leu Ser Lys Ile Lys Thr Leu Arg Leu Ala

130 135 140

Thr Ser Tyr Ile Ala Tyr Leu Met Asp Leu Leu Ala Lys Asp Asp Gln

145 150 155 160

Asn Gly Glu Ala Glu Ala Phe Lys Ala Glu Ile Lys Lys Thr Asp Val

165 170 175

Lys Glu Glu Lys Arg Lys Lys Glu Leu Asn Glu Ile Leu Lys Ser Thr

180 185 190

Val Ser Ser Asn Asp Lys Lys Thr Lys Gly Arg Thr Gly Trp Pro Gln

195 200 205

His Val Trp Ala Leu Glu Leu Lys Gln

210 215

<210> 41

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ASAH1

<400> 41

Met Pro Gly Arg Ser Cys Val Ala Leu Val Leu Leu Ala Ala Ala Val

1 5 10 15

Ser Cys Ala Val Ala Gln His Ala Pro Pro Trp Thr Glu Asp Cys Arg

20 25 30

Lys Ser Thr Tyr Pro Pro Ser Gly Pro Thr Tyr Arg Gly Ala Val Pro

35 40 45

Trp Tyr Thr Ile Asn Leu Asp Leu Pro Pro Tyr Lys Arg Trp His Glu

50 55 60

Leu Met Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Lys Val Ile Val Asn Ser Leu

65 70 75 80

Lys Asn Met Ile Asn Thr Phe Val Pro Ser Gly Lys Ile Met Gln Val

85 90 95

Val Asp Glu Lys Leu Pro Gly Leu Leu Gly Asn Phe Pro Gly Pro Phe

100 105 110

Glu Glu Glu Met Lys Gly Ile Ala Ala Val Thr Asp Ile Pro Leu Gly

115 120 125

Glu Ile Ile Ser Phe Asn Ile Phe Tyr Glu Leu Phe Thr Ile Cys Thr

130 135 140

Ser Ile Val Ala Glu Asp Lys Lys Gly His Leu Ile His Gly Arg Asn

145 150 155 160

Met Asp Phe Gly Val Phe Leu Gly Trp Asn Ile Asn Asn Asp Thr Trp

165 170 175

Val Ile Thr Glu Gln Leu Lys Pro Leu Thr Val Asn Leu Asp Phe Gln

180 185 190

Arg Asn Asn Lys Thr Val Phe Lys Ala Ser Ser Phe Ala Gly Tyr Val

195 200 205

Gly Met Leu Thr Gly Phe Lys Pro Gly Leu Phe Ser Leu Thr Leu Asn

210 215 220

Glu Arg Phe Ser Ile Asn Gly Gly Tyr Leu Gly Ile Leu Glu Trp Ile

225 230 235 240

Leu Gly Lys Lys Asp Val Met Trp Ile Gly Phe Leu Thr Arg Thr Val

245 250 255

Leu Glu Asn Ser Thr Ser Tyr Glu Glu Ala Lys Asn Leu Leu Thr Lys

260 265 270

Thr Lys Ile Leu Ala Pro Ala Tyr Phe Ile Leu Gly Gly Asn Gln Ser

275 280 285

Gly Glu Gly Cys Val Ile Thr Arg Asp Arg Lys Glu Ser Leu Asp Val

290 295 300

Tyr Glu Leu Asp Ala Lys Gln Gly Arg Trp Tyr Val Val Gln Thr Asn

305 310 315 320

Tyr Asp Arg Trp Lys His Pro Phe Phe Leu Asp Asp Arg Arg Thr Pro

325 330 335

Ala Lys Met Cys Leu Asn Arg Thr Ser Gln Glu Asn Ile Ser Phe Glu

340 345 350

Thr Met Tyr Asp Val Leu Ser Thr Lys Pro Val Leu Asn Lys Leu Thr

355 360 365

Val Tyr Thr Thr Leu Ile Asp Val Thr Lys Gly Gln Phe Glu Thr Tyr

370 375 380

Leu Arg Asp Cys Pro Asp Pro Cys Ile Gly Trp

385 390 395

<210> 42

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> dnTGFB

<400> 42

Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu

1 5 10 15

Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val

20 25 30

Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro

35 40 45

Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln

50 55 60

Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro

65 70 75 80

Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile

100 105 110

Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys

115 120 125

Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn

130 135 140

Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu

145 150 155 160

Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu

165 170 175

Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Gly

180 185 190

Ser Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

195 200

<210> 43

<211> 225

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> dnWnt8a

<220>

<221> misc_feature

<222> (223)..(224)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 43

Met Gln Asn Thr Thr Leu Phe Ile Leu Ala Thr Leu Leu Ile Phe Cys

1 5 10 15

Pro Phe Phe Thr Ala Ser Ala Trp Ser Val Asn Asn Phe Leu Met Thr

20 25 30

Gly Pro Lys Ala Tyr Leu Thr Tyr Ser Ala Ser Val Ala Val Gly Ala

35 40 45

Gln Asn Gly Ile Glu Glu Cys Lys Tyr Gln Phe Ala Trp Glu Arg Trp

50 55 60

Asn Cys Pro Glu Ser Thr Leu Gln Leu Ala Thr His Asn Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Ala Thr Arg Glu Thr Ser Phe Val His Ala Ile Ser Ser Ala Gly

85 90 95

Val Met Tyr Thr Leu Thr Arg Asn Cys Ser Met Gly Asp Phe Asp Asn

100 105 110

Cys Gly Cys Asp Asp Ser Arg Asn Gly Arg Ile Gly Gly Arg Gly Trp

115 120 125

Val Trp Gly Gly Cys Ser Asp Asn Ala Glu Phe Gly Glu Arg Ile Ser

130 135 140

Lys Leu Phe Val Asp Gly Leu Glu Thr Gly Gln Asp Ala Arg Ala Leu

145 150 155 160

Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Leu Ala Val Lys Glu Thr

165 170 175

Met Lys Arg Thr Cys Lys Cys His Gly Ile Ser Gly Ser Cys Ser Ile

180 185 190

Gln Thr Cys Trp Leu Gln Leu Ala Glu Phe Arg Asp Ile Gly Asn Pro

195 200 205

Leu Lys Ile Lys His Asp Gln Ala Leu Lys Leu Glu Met Asp Xaa Xaa

210 215 220

Lys

225

<210> 44

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人GATA4

<400> 44

Met Tyr Gln Ser Leu Ala Met Ala Ala Asn His Gly Pro Pro Pro Gly

1 5 10 15

Ala Tyr Glu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Phe Met His Gly Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Ser Ser Pro Val Tyr Val Pro Thr Pro Arg Val Pro Ser Ser Val

35 40 45

Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ala Gly Ser Ala Ser Gly

50 55 60

Gly Ala Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ala Ala Ser Gly Ala Gly Pro

65 70 75 80

Gly Thr Gln Gln Gly Ser Pro Gly Trp Ser Gln Ala Gly Ala Asp Gly

85 90 95

Ala Ala Tyr Thr Pro Pro Pro Val Ser Pro Arg Phe Ser Phe Pro Gly

100 105 110

Thr Thr Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala

130 135 140

Gly Arg Glu Gln Tyr Gly Arg Ala Gly Phe Ala Gly Ser Tyr Ser Ser

145 150 155 160

Pro Tyr Pro Ala Tyr Met Ala Asp Val Gly Ala Ser Trp Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Ser Ala Gly Pro Phe Asp Ser Pro Val Leu His Ser Leu

180 185 190

Pro Gly Arg Ala Asn Pro Ala Ala Arg His Pro Asn Leu Val Asp Met

195 200 205

Phe Asp Asp Phe Ser Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Met

210 215 220

Ser Thr Pro Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn

225 230 235 240

Ala Cys Gly Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Ile Asn Arg Pro Leu Ile

245 250 255

Lys Pro Gln Arg Arg Leu Ser Ala Ser Arg Arg Val Gly Leu Ser Cys

260 265 270

Ala Asn Cys Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Glu

275 280 285

Gly Glu Pro Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Met Lys Leu His Gly

290 295 300

Val Pro Arg Pro Leu Ala Met Arg Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Lys

305 310 315 320

Arg Lys Pro Lys Asn Leu Asn Lys Ser Lys Thr Pro Ala Ala Pro Ser

325 330 335

Gly Ser Glu Ser Leu Pro Pro Ala Ser Gly Ala Ser Ser Asn Ser Ser

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Ser Ser Ser Glu Glu Met Arg Pro Ile Lys Thr Glu

355 360 365

Pro Gly Leu Ser Ser His Tyr Gly His Ser Ser Ser Val Ser Gln Thr

370 375 380

Phe Ser Val Ser Ala Met Ser Gly His Gly Pro Ser Ile His Pro Val

385 390 395 400

Leu Ser Ala Leu Lys Leu Ser Pro Gln Gly Tyr Ala Ser Pro Val Ser

405 410 415

Gln Ser Pro Gln Thr Ser Ser Lys Gln Asp Ser Trp Asn Ser Leu Val

420 425 430

Leu Ala Asp Ser His Gly Asp Ile Ile Thr Ala

435 440

<210> 45

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Mef2c

<400> 45

Met Gly Arg Lys Lys Ile Gln Ile Thr Arg Ile Met Asp Glu Arg Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Thr Lys Arg Lys Phe Gly Leu Met Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Cys Glu Ile Ala Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Asn Ser Thr Asn Lys Leu Phe Gln Tyr Ala Ser Thr Asp Met Asp Lys

50 55 60

Val Leu Leu Lys Tyr Thr Glu Tyr Asn Glu Pro His Glu Ser Arg Thr

65 70 75 80

Asn Ser Asp Ile Val Glu Ala Leu Asn Lys Lys Glu Asn Lys Gly Cys

85 90 95

Glu Ser Pro Asp Pro Asp Ser Ser Tyr Ala Leu Thr Pro Arg Thr Glu

100 105 110

Glu Lys Tyr Lys Lys Ile Asn Glu Glu Phe Asp Asn Met Ile Lys Ser

115 120 125

His Lys Ile Pro Ala Val Pro Pro Pro Asn Phe Glu Met Pro Val Ser

130 135 140

Ile Pro Val Ser Ser His Asn Ser Leu Val Tyr Ser Asn Pro Val Ser

145 150 155 160

Ser Leu Gly Asn Pro Asn Leu Leu Pro Leu Ala His Pro Ser Leu Gln

165 170 175

Arg Asn Ser Met Ser Pro Gly Val Thr His Arg Pro Pro Ser Ala Gly

180 185 190

Asn Thr Gly Gly Leu Met Gly Gly Asp Leu Thr Ser Gly Ala Gly Thr

195 200 205

Ser Ala Gly Asn Gly Tyr Gly Asn Pro Arg Asn Ser Pro Gly Leu Leu

210 215 220

Val Ser Pro Gly Asn Leu Asn Lys Asn Met Gln Ala Lys Ser Pro Pro

225 230 235 240

Pro Met Asn Leu Gly Met Asn Asn Arg Lys Pro Asp Leu Arg Val Leu

245 250 255

Ile Pro Pro Gly Ser Lys Asn Thr Met Pro Ser Val Asn Gln Arg Ile

260 265 270

Asn Asn Ser Gln Ser Ala Gln Ser Leu Ala Thr Pro Val Val Ser Val

275 280 285

Ala Thr Pro Thr Leu Pro Gly Gln Gly Met Gly Gly Tyr Pro Ser Ala

290 295 300

Ile Ser Thr Thr Tyr Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Ser Ser Ala Asp Leu

305 310 315 320

Ser Ser Leu Ser Gly Phe Asn Thr Ala Ser Ala Leu His Leu Gly Ser

325 330 335

Val Thr Gly Trp Gln Gln Gln His Leu His Asn Met Pro Pro Ser Ala

340 345 350

Leu Ser Gln Leu Gly Ala Cys Thr Ser Thr His Leu Ser Gln Ser Ser

355 360 365

Asn Leu Ser Leu Pro Ser Thr Gln Ser Leu Asn Ile Lys Ser Glu Pro

370 375 380

Val Ser Pro Pro Arg Asp Arg Thr Thr Thr Pro Ser Arg Tyr Pro Gln

385 390 395 400

His Thr Arg His Glu Ala Gly Arg Ser Pro Val Asp Ser Leu Ser Ser

405 410 415

Cys Ser Ser Ser Tyr Asp Gly Ser Asp Arg Glu Asp His Arg Asn Glu

420 425 430

Phe His Ser Pro Ile Gly Leu Thr Arg Pro Ser Pro Asp Glu Arg Glu

435 440 445

Ser Pro Ser Val Lys Arg Met Arg Leu Ser Glu Gly Trp Ala Thr

450 455 460

<210> 46

<211> 518

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Tbx5

<400> 46

Met Ala Asp Ala Asp Glu Gly Phe Gly Leu Ala His Thr Pro Leu Glu

1 5 10 15

Pro Asp Ala Lys Asp Leu Pro Cys Asp Ser Lys Pro Glu Ser Ala Leu

20 25 30

Gly Ala Pro Ser Lys Ser Pro Ser Ser Pro Gln Ala Ala Phe Thr Gln

35 40 45

Gln Gly Met Glu Gly Ile Lys Val Phe Leu His Glu Arg Glu Leu Trp

50 55 60

Leu Lys Phe His Glu Val Gly Thr Glu Met Ile Ile Thr Lys Ala Gly

65 70 75 80

Arg Arg Met Phe Pro Ser Tyr Lys Val Lys Val Thr Gly Leu Asn Pro

85 90 95

Lys Thr Lys Tyr Ile Leu Leu Met Asp Ile Val Pro Ala Asp Asp His

100 105 110

Arg Tyr Lys Phe Ala Asp Asn Lys Trp Ser Val Thr Gly Lys Ala Glu

115 120 125

Pro Ala Met Pro Gly Arg Leu Tyr Val His Pro Asp Ser Pro Ala Thr

130 135 140

Gly Ala His Trp Met Arg Gln Leu Val Ser Phe Gln Lys Leu Lys Leu

145 150 155 160

Thr Asn Asn His Leu Asp Pro Phe Gly His Ile Ile Leu Asn Ser Met

165 170 175

His Lys Tyr Gln Pro Arg Leu His Ile Val Lys Ala Asp Glu Asn Asn

180 185 190

Gly Phe Gly Ser Lys Asn Thr Ala Phe Cys Thr His Val Phe Pro Glu

195 200 205

Thr Ala Phe Ile Ala Val Thr Ser Tyr Gln Asn His Lys Ile Thr Gln

210 215 220

Leu Lys Ile Glu Asn Asn Pro Phe Ala Lys Gly Phe Arg Gly Ser Asp

225 230 235 240

Asp Met Glu Leu His Arg Met Ser Arg Met Gln Ser Lys Glu Tyr Pro

245 250 255

Val Val Pro Arg Ser Thr Val Arg Gln Lys Val Ala Ser Asn His Ser

260 265 270

Pro Phe Ser Ser Glu Ser Arg Ala Leu Ser Thr Ser Ser Asn Leu Gly

275 280 285

Ser Gln Tyr Gln Cys Glu Asn Gly Val Ser Gly Pro Ser Gln Asp Leu

290 295 300

Leu Pro Pro Pro Asn Pro Tyr Pro Leu Pro Gln Glu His Ser Gln Ile

305 310 315 320

Tyr His Cys Thr Lys Arg Lys Glu Glu Glu Cys Ser Thr Thr Asp His

325 330 335

Pro Tyr Lys Lys Pro Tyr Met Glu Thr Ser Pro Ser Glu Glu Asp Ser

340 345 350

Phe Tyr Arg Ser Ser Tyr Pro Gln Gln Gln Gly Leu Gly Ala Ser Tyr

355 360 365

Arg Thr Glu Ser Ala Gln Arg Gln Ala Cys Met Tyr Ala Ser Ser Ala

370 375 380

Pro Pro Ser Glu Pro Val Pro Ser Leu Glu Asp Ile Ser Cys Asn Thr

385 390 395 400

Trp Pro Ser Met Pro Ser Tyr Ser Ser Cys Thr Val Thr Thr Val Gln

405 410 415

Pro Met Asp Arg Leu Pro Tyr Gln His Phe Ser Ala His Phe Thr Ser

420 425 430

Gly Pro Leu Val Pro Arg Leu Ala Gly Met Ala Asn His Gly Ser Pro

435 440 445

Gln Leu Gly Glu Gly Met Phe Gln His Gln Thr Ser Val Ala His Gln

450 455 460

Pro Val Val Arg Gln Cys Gly Pro Gln Thr Gly Leu Gln Ser Pro Gly

465 470 475 480

Thr Leu Gln Pro Pro Glu Phe Leu Tyr Ser His Gly Val Pro Arg Thr

485 490 495

Leu Ser Pro His Gln Tyr His Ser Val His Gly Val Gly Met Val Pro

500 505 510

Glu Trp Ser Asp Asn Ser

515

<210> 47

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人Hand2

<400> 47

Met Ser Leu Val Gly Gly Phe Pro His His Pro Val Val His His Glu

1 5 10 15

Gly Tyr Pro Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala

20 25 30

Ser Arg Cys Ser His Glu Glu Asn Pro Tyr Phe His Gly Trp Leu Ile

35 40 45

Gly His Pro Glu Met Ser Pro Pro Asp Tyr Ser Met Ala Leu Ser Tyr

50 55 60

Ser Pro Glu Tyr Ala Ser Gly Ala Ala Gly Leu Asp His Ser His Tyr

65 70 75 80

Gly Gly Val Pro Pro Gly Ala Gly Pro Pro Gly Leu Gly Gly Pro Arg

85 90 95

Pro Val Lys Arg Arg Gly Thr Ala Asn Arg Lys Glu Arg Arg Arg Thr

100 105 110

Gln Ser Ile Asn Ser Ala Phe Ala Glu Leu Arg Glu Cys Ile Pro Asn

115 120 125

Val Pro Ala Asp Thr Lys Leu Ser Lys Ile Lys Thr Leu Arg Leu Ala

130 135 140

Thr Ser Tyr Ile Ala Tyr Leu Met Asp Leu Leu Ala Lys Asp Asp Gln

145 150 155 160

Asn Gly Glu Ala Glu Ala Phe Lys Ala Glu Ile Lys Lys Thr Asp Val

165 170 175

Lys Glu Glu Lys Arg Lys Lys Glu Leu Asn Glu Ile Leu Lys Ser Thr

180 185 190

Val Ser Ser Asn Asp Lys Lys Thr Lys Gly Arg Thr Gly Trp Pro Gln

195 200 205

His Val Trp Ala Leu Glu Leu Lys Gln

210 215

<210> 48

<211> 986

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人心肌素

<400> 48

Met Thr Leu Leu Gly Ser Glu His Ser Leu Leu Ile Arg Ser Lys Phe

1 5 10 15

Arg Ser Val Leu Gln Leu Arg Leu Gln Gln Arg Arg Thr Gln Glu Gln

20 25 30

Leu Ala Asn Gln Gly Ile Ile Pro Pro Leu Lys Arg Pro Ala Glu Phe

35 40 45

His Glu Gln Arg Lys His Leu Asp Ser Asp Lys Ala Lys Asn Ser Leu

50 55 60

Lys Arg Lys Ala Arg Asn Arg Cys Asn Ser Ala Asp Leu Val Asn Met

65 70 75 80

His Ile Leu Gln Ala Ser Thr Ala Glu Arg Ser Ile Pro Thr Ala Gln

85 90 95

Met Lys Leu Lys Arg Ala Arg Leu Ala Asp Asp Leu Asn Glu Lys Ile

100 105 110

Ala Leu Arg Pro Gly Pro Leu Glu Leu Val Glu Lys Asn Ile Leu Pro

115 120 125

Val Asp Ser Ala Val Lys Glu Ala Ile Lys Gly Asn Gln Val Ser Phe

130 135 140

Ser Lys Ser Thr Asp Ala Phe Ala Phe Glu Glu Asp Ser Ser Ser Asp

145 150 155 160

Gly Leu Ser Pro Asp Gln Thr Arg Ser Glu Asp Pro Gln Asn Ser Ala

165 170 175

Gly Ser Pro Pro Asp Ala Lys Ala Ser Asp Thr Pro Ser Thr Gly Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Asn Gln Asp Leu Ala Ser Gly Ser Glu Asn Asp Arg Asn

195 200 205

Asp Ser Ala Ser Gln Pro Ser His Gln Ser Asp Ala Gly Lys Gln Gly

210 215 220

Leu Gly Pro Pro Ser Thr Pro Ile Ala Val His Ala Ala Val Lys Ser

225 230 235 240

Lys Ser Leu Gly Asp Ser Lys Asn Arg His Lys Lys Pro Lys Asp Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Val Lys Lys Leu Lys Tyr His Gln Tyr Ile Pro Pro Asp

260 265 270

Gln Lys Ala Glu Lys Ser Pro Pro Pro Met Asp Ser Ala Tyr Ala Arg

275 280 285

Leu Leu Gln Gln Gln Gln Leu Phe Leu Gln Leu Gln Ile Leu Ser Gln

290 295 300

Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Arg Phe Ser Tyr Leu Gly Met His Gln

305 310 315 320

Ala Gln Leu Lys Glu Pro Asn Glu Gln Met Val Arg Asn Pro Asn Ser

325 330 335

Ser Ser Thr Pro Leu Ser Asn Thr Pro Leu Ser Pro Val Lys Asn Ser

340 345 350

Phe Ser Gly Gln Thr Gly Val Ser Ser Phe Lys Pro Gly Pro Leu Pro

355 360 365

Pro Asn Leu Asp Asp Leu Lys Val Ser Glu Leu Arg Gln Gln Leu Arg

370 375 380

Ile Arg Gly Leu Pro Val Ser Gly Thr Lys Thr Ala Leu Met Asp Arg

385 390 395 400

Leu Arg Pro Phe Gln Asp Cys Ser Gly Asn Pro Val Pro Asn Phe Gly

405 410 415

Asp Ile Thr Thr Val Thr Phe Pro Val Thr Pro Asn Thr Leu Pro Asn

420 425 430

Tyr Gln Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ala Leu Ser Asn Gly Phe Tyr His

435 440 445

Phe Gly Ser Thr Ser Ser Ser Pro Pro Ile Ser Pro Ala Ser Ser Asp

450 455 460

Leu Ser Val Ala Gly Ser Leu Pro Asp Thr Phe Asn Asp Ala Ser Pro

465 470 475 480

Ser Phe Gly Leu His Pro Ser Pro Val His Val Cys Thr Glu Glu Ser

485 490 495

Leu Met Ser Ser Leu Asn Gly Gly Ser Val Pro Ser Glu Leu Asp Gly

500 505 510

Leu Asp Ser Glu Lys Asp Lys Met Leu Val Glu Lys Gln Lys Val Ile

515 520 525

Asn Glu Leu Thr Trp Lys Leu Gln Gln Glu Gln Arg Gln Val Glu Glu

530 535 540

Leu Arg Met Gln Leu Gln Lys Gln Lys Arg Asn Asn Cys Ser Glu Lys

545 550 555 560

Lys Pro Leu Pro Phe Leu Ala Ala Ser Ile Lys Gln Glu Glu Ala Val

565 570 575

Ser Ser Cys Pro Phe Ala Ser Gln Val Pro Val Lys Arg Gln Ser Ser

580 585 590

Ser Ser Glu Cys His Pro Pro Ala Cys Glu Ala Ala Gln Leu Gln Pro

595 600 605

Leu Gly Asn Ala His Cys Val Glu Ser Ser Asp Gln Thr Asn Val Leu

610 615 620

Ser Ser Thr Phe Leu Ser Pro Gln Cys Ser Pro Gln His Ser Pro Leu

625 630 635 640

Gly Ala Val Lys Ser Pro Gln His Ile Ser Leu Pro Pro Ser Pro Asn

645 650 655

Asn Pro His Phe Leu Pro Ser Ser Ser Gly Ala Gln Gly Glu Gly His

660 665 670

Arg Val Ser Ser Pro Ile Ser Ser Gln Val Cys Thr Ala Gln Asn Ser

675 680 685

Gly Ala His Asp Gly His Pro Pro Ser Phe Ser Pro His Ser Ser Ser

690 695 700

Leu His Pro Pro Phe Ser Gly Ala Gln Ala Asp Ser Ser His Gly Ala

705 710 715 720

Gly Gly Asn Pro Cys Pro Lys Ser Pro Cys Val Gln Gln Lys Met Ala

725 730 735

Gly Leu His Ser Ser Asp Lys Val Gly Pro Lys Phe Ser Ile Pro Ser

740 745 750

Pro Thr Phe Ser Lys Ser Ser Ser Ala Ile Ser Glu Val Thr Gln Pro

755 760 765

Pro Ser Tyr Glu Asp Ala Val Lys Gln Gln Met Thr Arg Ser Gln Gln

770 775 780

Met Asp Glu Leu Leu Asp Val Leu Ile Glu Ser Gly Glu Met Pro Ala

785 790 795 800

Asp Ala Arg Glu Asp His Ser Cys Leu Gln Lys Val Pro Lys Ile Pro

805 810 815

Arg Ser Ser Arg Ser Pro Thr Ala Val Leu Thr Lys Pro Ser Ala Ser

820 825 830

Phe Glu Gln Ala Ser Ser Gly Ser Gln Ile Pro Phe Asp Pro Tyr Ala

835 840 845

Thr Asp Ser Asp Glu His Leu Glu Val Leu Leu Asn Ser Gln Ser Pro

850 855 860

Leu Gly Lys Met Ser Asp Val Thr Leu Leu Lys Ile Gly Ser Glu Glu

865 870 875 880

Pro His Phe Asp Gly Ile Met Asp Gly Phe Ser Gly Lys Ala Ala Glu

885 890 895

Asp Leu Phe Asn Ala His Glu Ile Leu Pro Gly Pro Leu Ser Pro Met

900 905 910

Gln Thr Gln Phe Ser Pro Ser Ser Val Asp Ser Asn Gly Leu Gln Leu

915 920 925

Ser Phe Thr Glu Ser Pro Trp Glu Thr Met Glu Trp Leu Asp Leu Thr

930 935 940

Pro Pro Asn Ser Thr Pro Gly Phe Ser Ala Leu Thr Thr Ser Ser Pro

945 950 955 960

Ser Ile Phe Asn Ile Asp Phe Leu Asp Val Thr Asp Leu Asn Leu Asn

965 970 975

Ser Ser Met Asp Leu His Leu Gln Gln Trp

980 985

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

aggtcggtgt gaacggattt g 21

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 50

tgtagaccat gtagttgagg tca 23

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 51

taacgaacga gactctggca t 21

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 52

cggacatcta agggcatcac ag 22

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 53

ggtgtgcgga taaaagacgg 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 54

tggtccacct aagagggtgt 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 55

ctgagacaga ggaggccaac 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 56

ttccgctctg tcttctggat 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 57

ctgtgcaggc tgctgtaacg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 58

gttcccgaaa ccctgaggag 20

<210> 59

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 59

cccctgtgtc ccagtttg 18

<210> 60

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 60

cgtctatcca tggcaccac 19

<210> 61

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 61

cagacaagtt cattcaatta ttagacg 27

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 62

catgtcttgt tagctgcctg a 21

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 63

gcaactttct atgacactga aacac 25

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 64

tctctctagg gctgcattgg 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 65

cacagatggc cttgatgttg 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 66

ctctggctca gcatgactcc 20

<210> 67

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 67

gggggaggtt ggacagtaa 19

<210> 68

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 68

catcagctca atcctcagc 19

<210> 69

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 69

caagcagtgc ctatccaga 19

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 70

aagcccagga atgaagtcca 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 71

ttcaaccatg ctcctggata 20

<210> 72

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 72

gaccattcct cattgcacac 20

<210> 73

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 73

gctgcgcttg cagagattaa a 21

<210> 74

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 74

ttgctgtact gtgtgtccag 20

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 75

gtaaatggga ttccaacacg aacaa 25

<210> 76

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 76

tgtcgtgcag taagaaccca actc 24

<210> 77

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 77

gccattatgc agctgctttg gagc 24

<210> 78

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 78

tgtttttctt gggcttaatc acct 24

<210> 79

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 79

gttgacccta ccatgttccc ttg 23

<210> 80

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 80

gccagcagca tctatgggac 20

<210> 81

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 81

gaaacactct tctgtaacac actt 24

<210> 82

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 82

gtcaaactac aactccaagc ag 22

<210> 83

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 83

gcaactccgt ccgggcgagg a 21

<210> 84

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 84

gaagatgact gtggtcccgg g 21

<210> 85

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 85

aaacccgata tggctgagat tg 22

<210> 86

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 86

gcctgcttgc ttctcctgtt 20

<210> 87

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 87

cccctgccca ttcggaggaa gag 23

<210> 88

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 88

ttggccacct tgacgctgcg gtg 23

<210> 89

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 89

ttgccttgct gctctacctc ca 22

<210> 90

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 90

gatggcagta gctgcgctga ta 22

<210> 91

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 91

tgcctgccgt gtgaaccatg t 21

<210> 92

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 92

tgcggcatct tcaaacctcc atga 24

Claims (40)

1.一种组合物，包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA(modRNA)(G)、编码肌细胞增强因子2C的modRNA(M)、编码T-box 5的modRNA(T)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA(H)、编码显性负性转化生长因子β的modRNA(dnT)和编码显性负性无翼相关整合位点8的modRNA(dnW)，其中，modRNA的所述分子以G:M:T:H:dnT:dnW的比例存在于所述组合物中。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由1:1:1:1:1:1组成。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由2:2:2:2:0.7:0.7组成。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由2:1:1:1:0.7:0.7组成。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由1:2:1:1:0.7:0.7组成。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由1:1:2:1:0.7:0.7组成。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由1:1:1:2:0.7:0.7组成。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述比例由1:2:1:2:0.5:0.5组成。

9.一种药物组合物，包括权利要求1至8中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体。

10.一种增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与权利要求1至9中任一项所述的组合物接触。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。

12.一种治疗心脏损伤的方法，包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的组合物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述心脏损伤包括心肌梗死。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述心脏损伤的原因包括再灌注损伤。

15.一种在缺血性损害后刺激血管再生的方法，包括使由缺血性损害而损害的组织与权利要求1至9中任一项所述的组合物接触。

16.一种治疗卒中的方法，包括向需要所述治疗的患者给药治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的组合物。

17.一种增强伤口愈合的方法，包括向需要此类增强的患者给药治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的组合物。

18.一种组合物，包括以下分子：编码GATA结合蛋白4的修饰mRNA(modRNA)(G)、编码肌细胞增强因子2C的modRNA(M)、编码T-box 5的modRNA(T)、编码心脏和神经嵴衍生物表达蛋白2的modRNA(H)、编码酸性神经酰胺酶的modRNA(A)、编码显性负性转化生长因子β的modRNA(dnT)和编码显性负性无翼相关整合位点8的modRNA(dnW)，其中，modRNA的所述分子以G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例存在于所述组合物中。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由1:1:1:1:1:1:1组成。

20.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由2:2:2:2:0.7:0.7:0.7组成。

21.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由2:1:1:1:0.7:0.7:0.7组成。

22.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由1:2:1:1:0.7:0.7:0.7组成。

23.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由1:1:2:1:0.7:0.7:0.7组成。

24.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由1:1:1:2:0.7:0.7:0.7组成。

25.根据权利要求18所述的组合物，其中，所述比例由1:2:1:2:0.5:0.5:0.5组成。

26.一种药物组合物，包括权利要求18至25中任一项所述的组合物和药学上可接受的载体。

27.一种增加细胞群内心肌细胞数与非心肌细胞数的比例的方法，包括使所述细胞群与权利要求18至26中任一项所述的组合物接触。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非心肌细胞包括心脏成纤维细胞。

29.一种治疗心脏损伤的方法，包括向需要此类治疗的患者给药治疗有效量的权利要求18至26中任一项所述的组合物。

30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述心脏损伤包括心肌梗死。

31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述心脏损伤的原因包括再灌注损伤。

32.一种在缺血性损害后刺激血管再生的方法，包括使由缺血性损害而损害的组织与权利要求18至26中任一项所述的组合物接触。

33.一种治疗卒中的方法，包括向需要所述治疗的患者给药治疗有效量的权利要求18至26中任一项所述的组合物。

34.一种增强伤口愈合的方法，包括向需要此类增强的患者给药治疗有效量的权利要求18至26中任一项所述的组合物。

35.根据权利要求1所述的组合物，其中，当组合物包括G:M:T:H:dnT:dnW的比例时，M以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

36.根据权利要求1所述的组合物，其中，当所述组合物包括G:M:T:H:dnT:dnW的比例时，H以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

37.根据权利要求1所述的组合物，其中，当所述组合物包括G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例时，M以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

38.根据权利要求1所述的组合物，其中，当所述组合物包括G:M:T:H:A:dnT:dnW的比例时，H以高于所述组合物中存在的其他modRNA的量存在。

39.一种刺激骨骼肌再生的方法，包括向需要所述刺激的患者给药治疗有效量的权利要求1至9中任一项所述的组合物。

40.一种刺激骨骼肌再生的方法，包括向需要所述刺激的患者给药治疗有效量的权利要求18至26中任一项所述的组合物。

Images