DE69434486T2

DE69434486T2 - Adenovirus vektoren für gentherapie

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Publication number: DE69434486T2
Application number: DE69434486T
Authority: DE
Original assignee: Advec Inc
Current assignee: Advec Inc
Priority date: 1993-06-24
Filing date: 1994-06-24
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2014-06-25
Also published as: AU7118494A; CA2166118C; ATE304604T1; CA2166118A1; JP2002509422A; EP0705344A1; AU687829B2; ES2249761T3; WO1995000655A1; DE69434486D1; EP0705344B1; EP0705344B8; JP3532566B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Adenovirus (Ad)-Vektoren, die für die verstärkte Exprimierung ausgewählter Nukleinsäuren in infizierten, transfizierten bzw. transformierten Zellen, insbesondere eukaryontischen Säugetierzellen nützlich sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem allgemein auf gentechnisch hergestellte Vektoren, die therapeutische Substanzen codieren, die als Impfstoffe und für die Gentherapie nützlich sind.
Stand der Technik
Adenoviren (Ads) sind eine relativ gut gekennzeichnete homogene Virengruppe. Ungefähr 100 unterschiedliche Adenoviren inklusive beinahe 50 aus dem Menschen isolierter Serotypen wurden bislang identifiziert.
Die häufigsten Ads-Serotypen sind nicht pathogen sowie physisch und genetisch stabil, in sehr hohen Titern züchtbar (konzentrierte Ansätze mit 10¹¹–10¹² PFU/ml infektiöser Virus sind leicht zu gewinnen) und können durch isopyknisches Zentrifugieren in CsCl-Gradienten leicht gereinigt werden. Das Ad-Genom wird durch rekombinante DNA-Techniken leicht beeinflusst und die durch Fremd-DNA-Inserts codierten und in Säuretierzellen exprimierten Proteine werden anders als in Bakterien-, Hefe- und einigen Insektenzellen exprimierte rekombinante Proteine für gewöhnlich angemessen glycosyliert oder phosphoryliert. Zwar werden menschliche Ads in menschlichen Zellen mit Epithelursprung am wirksamsten repliziert, doch diese Viren infizieren beinahe jede Säugetierzelle und exprimieren zumindest einige virale Gene. Anders als Retroviren infizieren Ads sich nicht replizierende Zellen und werden in ihnen exprimiert. Daher können Vektoren auf Ad-Basis für die Genzuführung, -exprimierung und -therapie nützlich sein.
Ad-Vektoren wurden bislang durch Ligation oder Rekombination viraler DNA mit in bakteriellen Plasmiden enthaltenen viralen Subgenomsequenzen konstruiert (Berkner, K. L. und Sharp, P. A., 1983, Nucleic Acid Res. 11: 6003–6020; Haj-Ahmad, Y. und Graham, F. L., 1986, J. Virol. 57: 267–274; Stow, N. D., 1981, J. Virol. 37: 171–180). Dieser Ansatz besitzt verschiedene Nachteile, z.B. die für die Herstellung der viralen DNA erforderliche Zeit und die technischen Schwierigkeiten, den Hintergrund des infektiösen parentalen Virus, der die Tests arbeitsaufwendiger macht, sowie im Fall einer direkten Ligation die begrenzte Verfügbarkeit nützlicher Restriktionsstellen infolge der relativen Größe des Adenovirusgenoms.
Eine andere Strategie ist die Rekombination zweier Plasmide, die zusammen Sequenzen enthalten, die das gesamte Ad-Genom umfassen. Es wurde eine Reihe bedingt defekter Plasmidsysteme entwickelt, die die Konstruktion von Vektoren vereinfachen und die Anzahl der zur Identifikation rekombinanter Viren erforderlichen Folgeanalysen reduzieren (McGrory, W. J., Bautista, D. S. und Graham, F. L., 1988, Virol. 163: 614–617; Gosh-Choudhury, G., Haj-Ahmad, Y., Brinkley, P., Rudy, J. und Graham, F. L., 1986, Gene 50: 161–171; Mittal, S. K., McDermott, M. R., Johnson, D. C., Prevec, L. und Graham, F. L., 1993, Virus Res. 28: 67–70).
Das in den erfindungsgemäßen Ausführungsformen verwendete repräsentative Adenovirus 5 („Ad5")-Genom ist ein lineares 36 kb-Duplex. Seine Sequenz wurde veröffentlicht (Chroboczek, J., Bieber, F. und Jacrot, B., 1992, The Sequence of the Genome of Adenovirus Type 5 and its Comparison with the Genome of Adenovirus Type 2, Virol. 186: 280–285, worauf hierin Bezug genommen wird). Das Ad5-Genom enthält eine invertierte terminale Wiederholungssequenz („ITR") mit jeweils 100–150 Basenpaaren (bp) an beiden Enden des linearisierten Genoms. Ein terminales Protein („TP") von 55.000 Dalton ist jeweils kovalent an die 5'-Enden des Stranges gebunden. Man geht davon aus, das sowohl das TP als auch die ITRs eine Rolle bei der Replikation viraler DNA spielen (McGrory, W. J. et al., 1988, Virol. 163: 614–617 und Gosh-Choudhuxy, G. et al., 1986, Gene 50: 161–171). Ad5 infizierte sämtliche getesteten menschlichen Zellen, auch wenn manche Zellen wie z.B. Lymphozyten relativ nonpermissiv sind.
4 nicht aneinander grenzende Bereiche des Ad5-Genoms werden zur Beginn der Infektion vor der DNA-Replikation transkribiert. Diese Bereiche sind der frühe Bereich 1 (E1) (etwa 1,3–11,2 mU oder etwa Position 198–4025 bp eines standardisierten Genoms inklusive des E1A-Vexstärkerbereiches; Sussenbach, J. S., 1984, in Ginsburg (Hrsg.), THE ADENOVIRUSES, Plenum Press, S. 35–124), der wiederum in die Unterbereiche E1A und E1B untergliedert ist, der frühe Bereich 2 (E2), der die DNA-Replikationsfunktionen des Virus codiert, der frühe Bereich 3 (E3) (etwa 75,9–86,0 mU oder etwa Position 7.275–30.904 bp, Cladaras, C. und Wold, W. S. M., 1985, Virol. 140: 28–43) und der frühe Bereich 4 (E4). E1A ist am Herumdrehen der anderen frühen Bereiche und der Regulierung einer Reihe von Wirtszellfunktionen beteiligt. E1B und E4 sind hauptsächlich an der Beendigung der Proteinsynthese der Wirtszelle beteiligt. E3 reguliert die Immunreaktion der Wirtszelle auf eine Virusinfektion. Einige dieser frühen Gene dienen dem „Umdrehen" später exprimierter Gene, die für die Replikation des Genoms und die Bildung viraler Partikel notwendig sind.
Es wurden verschiede Ad-Vektoren beschrieben. Beispielsweise wurde ein Ad5-Vektor aus einem Adenovirus-DNA-Fragment und einem linearisierten Plasmid konstruiert (Quantin et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581–2584). Es wurde ein aus einer CTFR-Expressionskassette und einem Adenovirus-DNA-Fragment konstruierter rekombinanter Adenovirusvektor beschrieben (Rosenfeld et al., 1992, Cell 68: 143–155).
Das Ad-Virion besitzt die Fähigkeit, bis zu 105–106% der Länge des Wildartgenoms zu packen (Bett, A. J., Prevec, L. und Graham, F. L., 1993, Packaging Capacity and Stability of Human Adenovirus Type 5 Vectors, J. Virol. 67: 5911–5921). Größere Genome (z.B. 108% der Größe der Wildart) führen zur Instabilität des Virus und schlechten Wachstumsraten. Diese Packungsfähigkeit erlaubt das Einfügen von nur etwa 1,8–2,0 kb überschüssiger DNA in das Ad-Genom.
Zum Packen größerer Inserts müssen zunächst Teile des viralen Genoms deletiert werden. Es können Teile des Bereiches E1 deletiert und die entstandenen Viren in menschlichen 293-Zellen verbreitet werden (293-Zellen enthalten und exprimieren E1 und komplementieren virale Mutanten, die in E1 defekt sind). Anstelle von E1 können Fremdnukleinsäuren in Ad5-Genome eingefügt werden, die E1-Deletionen von bis zu 2,9 kb enthalten, so dass bedingte helfer-unabhängige Vektoren mit einer Insert-Kapazität von 4,7–4,9 kb entstehen.
Viren mit einer Deletion im E3-Bereich können ebenfalls in gezüchteten menschlichen Zellen wie HeLa oder KB repliziert werden und Tiere inklusive den Menschen infizieren und in ihnen exprimiert werden. Eine Deletion einer E3-Sequenz von 3,0 kb ohne begleitendes Einfügen wurde berichtet (Ranheim, T. S., Shisler, J., Horton, T. M., Wold, L. J., Gooding, L. R. und Wold W. S. M., 1993, J. Virol. 67: 2159–2167).
Unter den bislang entwickelten Verfahren existiert kein einfaches Verfahren zur Herstellung von Vektoren, die E1- und E3-Deletionen verwenden. Darüber hinaus können Vektoren, die entweder E1- oder E3-Deletionen verwenden, nur relativ kleine Inserts aufnehmen. Zur Vereinfachung der Herstellung und Verwendung von Ad-Vektoren, die größere Fragmente tolerieren können, haben wir eine neue Methodik entwickelt, die auf einer Reihe bakterieller Plasmide beruht, die einen Großteil des viralen Ad-Genoms enthalten.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einfache, flexible und wirksame Ad5-Klonierungs- und Exprimierungsvektoren mit hoher Kapazität bereitzustellen. Dementsprechend wurde ein neues Vektorsystem entwickelt, das ausgedehnte Deletionen in E1 und E3 umfasst und sie weiterhin in einem einzelnen Vektorsystem kombiniert, das Inserts von bis zu 8000 bp tolerieren kann, was ausreicht, den Großteil der proteincodierenden Gene zusammen mit Steuerelementen zur Regulierung der Exprimierung aufzunehmen. Die Erfindung stellt die Möglichkeit der Klonierung von Fremdnukleinsäuren im E1- und/oder E3-Bereich bereit und verspricht die vielseitigste und am leichtesten anzuwendende bislang entwickelte Technologie zu sein. Darüber hinaus erlaubt eine Modifikation des Systems die Konstruktion von Viren, die einen Wildart-E3-Bereich sowie Insertionen, Substitutionen oder Mutationen in dem E1-Bereich tragen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein bakterielles Plasmid bereit, das ein zirkularisiertes modifiziertes menschliches Adenovirus Typ 5 (Ad5)-Genom umfasst. Die Nukleotidsequenz des Plasmids weist eine Deletion in dem frühen Bereich 3 (E3) des Ad5-Genoms sowie ein Segment des bakteriell replizierbaren pBR322-Plasmids auf, das eine Ampicillinresistenz codiert, die eine Sequenz des frühen Bereiches 1A (E1A), die ganz oder teilweise dem Packungssignal entspricht, substituiert.
Eine weitere Ausführungsform stellt ein bakterielles Plasmid bereit, das etwa 340 Basenpaare des linken Endes des Adenovirus Typ 5-Genoms, die invertierten terminalen Wiederholungssequenzen des linken Genomendes und die Packungssignalsequenzen davon umfasst, wobei das Plasmid auch eine eukaryontische Gensequenz von bis zu etwa 8 kb umfasst, die dem Plasmid und dem viralen Genom fremd ist. Die Adenovirussequenz von etwa Nukleotidposition 3540 bis etwa Position 5790 befindet sich auf der rechten Seite der Fremdsequenz.
Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen durch Kombinationen der Größe der E1-Deletion und/oder der Größe des Fremd-Inserts, das in das Plasmid aufgenommen werden und darin funktionsfähig bleiben kann, Adenovirus-Genomkonstrukte ein, die E1-Deletionen und Fremd-Inserts eukaryontischen Ursprungs enthalten. Aufgrund der großen Kapazität der hierin bereitgestellten Vektoren können verschiedene Inserts von Fremdgenen in die E1-Klonierungsstelle verbracht werden. Beispielsweise können zwei oder mehr Gene, die verschiedene Antigene codieren, oder Gene, die nützliche Proteine codieren, mit Genen kombiniert werden, die chemisch selektierbare Marker codieren.
Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung, das Plasmid pBHG10, kann zum Einfügen von Fremdgenen in den E3- und/oder E1-Bereich des Ad5-Genoms verwendet werden. In E3 eingefügte Gene können durch geeignete Wahl des ctransfizierten, Sequenzen des linken Endes (E1) enthaltenden Plasmids mit einer Vielzahl von Mutationen, Deletionen oder Insertionen in E1 kombiniert werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein Diagramm der Struktur und Konstruktion des Vektors pBHG10 dar.
2 stellt ein Diagramm der Struktur und Konstruktion des Vektors pBHG3 dar.
3 stellt ein Diagramm der Rescue mittels pBHG-Vektoren dar.
4 stellt ein Diagramm der Struktur und Konstruktion einer E1-Deletion (3,2 kb) und zwei Beispiele (pΔE1sp1A und pΔE1sp1B) für Plasmide, die die Deletion enthalten, dar.
5 veranschaulicht die unterschiedlichen Konzentrationen des mit Hilfe von Plasmiden mit unterschiedlichen E1-Deletionen mit oder ohne wiedereingeführte Ssp1-Stelle synthetisierten Proteins IX.
7 stellt die Konstruktion und Rescue eines 7,8 kb-Inserts mit Hilfe von pBHG10 dar.
8 stellt die Strategie für die Konstruktion einer Doppel-rekombinante dar, die LacZ in der E3-Deletion und Glühwürmchen-Luciferase in der E1-Deletion enthält.
9 stellt ein Diagramm der Plasmide pABS.6, pABS.7 und pABS.9 dar.
10 stellt ein Diagramm der Shuttle-Plasmide pHCMVsp1A, pHCMVsp1B, pHCMVsp1Cund pHCMVsp1D dar.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die hierin bereitgestellten rekombinanten Ad-Vektoren unterscheiden sich erheblich von zuvor berichteten Konstrukten, da sie z.T. die größtmögliche Deletion von E1-Sequenzen (innerhalb von 30–40 bp) enthalten, die bei gleichzeitig möglicher Erzeugung lebensfähiger viraler Rekombinanten erzeugt werden kann. Überraschenderweise führt die Kombination der hierin beschriebenen verschiedenen genetischen Elemente zu einem für das Einführen und Exprimieren von Fremdnukleinsäuren in Wirtszellen stabilen Konstrukt.
Zu Beginn dieser Experimente war unbekannt, wie groß eine Deletion sein könnte oder an welcher Stelle sie vorliegen müsste, um Wachstum, Produktion und Infektionsvermögen gepackter Virionen nicht zu beeinträchtigen. Für virale Lebensfähigkeit und maximale Packungskapazität sollten Deletionen im E1-Bereich die linke invertierte terminale Wiederholungssequenz (ITR, 1–103 bp) bzw. die Packungssignale (194–358 bp) vorzugsweise nicht beeinträchtigen (Hearing, P. und Shenk, T., 1983, Cell 33: 695–703; Grable, M. und Hearing, P., 1992, J. Virol. 64: 2047–2056). Da die einzige derzeit verfügbare E1-Komplementierungszelllinie (293-Zellen) Protein IX nicht exprimiert, sollten sich Deletionen darüber hinaus nicht in die Codierungssequenzen dieses Polypeptids erstrecken. (Zwar wurden virale Deletionsmutanten, denen das Protein IX-Gen fehlt, isoliert, es scheint jedoch das Protein zu sein, das für das Packen der Genome voller Länge in den funktionsfähigen Virus ausschlaggebend ist.)
In den pBHG-Plasmidausführungsformen der Erfindung substituieren die pBR322-Sequenzen Ad5-Sequenzen von Position 188 bis 1339, die das Packungssignal, den E1A-Verstärker, den Promotor und den Großteil der E1A-Proteincodierungssequenzen einschließen. Das pBR322-Insert enthält nicht nur eine Ampicillinresistenz, sondern ermöglicht auch eine Replikation der pBHG-Vektorenfamilie in Zellen, in denen pBR322 repliziert werden kann.
Einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten eine Deletion des E1-Bereiches zwischen einer SspI-Stelle bei 339 bp und einer Afl-Stelle bei 3533 bp. Da die SspI-Stelle für die Protein IX-Exprimierung ausschlaggebend sein kann, wurde sie als synthetisches Oligonukleotid, das die SspI-Stelle näher an die Protein IX-TATA-Box positioniert als im Fall des Wildart (wt)-Protein IX-Gens, wieder eingeführt.
Definitionen
Sämtliche hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe sollen im Allgemeinen, sofern nicht anders definiert, dieselbe Bedeutung haben wie gemeinhin vom Fachmann verstanden. Eine Reihe der hierin verwendeten Begriffe soll nicht beschränkend sein, auch wenn ihr üblicher Gebrauch unter Umständen anderes ausdrückt. Der Begriff „Exprimierung" oder „Exprimieren" einer Fremdnukleinsäure, eines Gens oder cDNA beispielsweise wird nachfolgend für die Replikation einer Nukleinsäure, die Transkription von DNA und/oder die Translation von RNA in Proteine, Zellen oder zellfreie Systeme wie z.B. Weizenkeime oder Kaninchenretikulozyten verwendet; „Nukleinsäure" wird austauschbar mit Gen, cDNA, RNA oder anderen Oligonukleotiden, die Genprodukte codieren, verwendet. Der Begriff „Fremd" bedeutet, dass die Nukleinsäure in der Natur nicht identisch assoziiert mit demselben Vektor oder derselben Wirtszelle vorkommt, vielmehr aber dass die genaue Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und dem Vektor bzw. der Wirtszelle gentechnisch erzeugt wurde. Die Begriffe „Rekombinante" und „Rekombination" beziehen sich allgemein auf Neuanordnungen von genetischem Material, die die Erfinder erwägen und die das Ergebnis experimenteller Beeinflussung sind.
Mit dem Begriff „Vektor" wird ein gentechnisch erzeugtes Nukleinsäurekonstrukt bezeichnet, das durch genetische Rekombinationstechniken modifiziert werden kann, um eine gewünschte Fremdnukleinsäuresequenz einzuführen, und als Mittel zur Einführung der Sequenz in eine Wirtszelle, Replikation, Klonierung und/oder Exprimierung der Nukleinsäuresequenz verwendet werden kann, wobei der Vektor sämtliche notwendigen Sequenzinformationen umfasst, die den Vektor in die Lage versetzen, in den Wirtszellen repliziert zu werden, und/oder es der Nukleinsäuresequenz ermöglichen exprimiert zu werden, und/oder eine Rekombination erlauben und/oder bewirken, dass der Vektor in virale Partikel gepackt wird. Diese Aufzählung der Vektoreigenschaften soll nicht als vollständig gelten.
Vektoren, die wahlweise eine Fremdnukleinsäure enthalten, können gemäß bekannter Techniken wie Transformation, Transfektion mittels calciumphosphat-ausgefällter DNA, Elektroporation, Genpistolen, Transfektion mit einem rekombinanten Virus oder Phagemid, Infektion mit einem infektiösen viralen Partikel, Injektion in Gewebe oder Mikroinjektion der DNA in Zellen oder dergleichen in eine Wirtszelle, ein Gewebe oder einen Organismus „eingeschleust" werden. Es können prokaryontische und eukaryontische Wirte wie z.B. Bakterien-, Hefe-, Pflanzen- und Tier- inklusive menschlicher Zellen verwendet werden.
Ein Vektor „unterstützt die Exprimierung von Codierungssequenzen in dem Vektor", wenn er als Vehikel zur Einführung eines Gens in eine Wirtszelle dient, Sequenzen in dem Vektor bewirken, dass der Vektor und die darin enthaltenen Codierungsbereiche in einer Zelle repliziert werden und dort verbleiben, ohne dass sie degeneriert werden, und Sequenzen in dem Vektor eine Transkription, Rekombination oder Einführung der Codierungssequenzen in das Genom der Wirtszelle ermöglichen.
Sobald ein Strukturgen, cDNA oder ein offenes Leseraster in den geeigneten Wirt eingeführt worden ist, kann der Wirt so gezüchtet werden, dass er das Stukturgen, die cDNA oder das offene Leseraster exprimiert. Soll die exogene Nukleinsäure in einem Wirt exprimiert werden, der die natürlich vorkommenden Transkriptions- und Translationsregulationsbereiche der Nukleinsäure nicht erkennt, kann oberhalb oder unterhalb des Codierungsbereiches eine Vielzahl von Transkriptionsregulationsbereichen eingefügt werden, von denen einige extern induzierbar sind. Illustrative Transkriptionsregulationsbereiche oder -promotoren zur temperaturempfindlichen Exprimierung eines Strukturgens zur Verwendung in Bakterien schließen z.B. den γ-gal-Promotor, den rechten und linken Lambda-Promotor, trp- und lac-Promotoren, den trplac-Fusionspromotor sowie den Bakteriophagen-Lambda-P_L-Promotor, den Bakteriophagen-Lambda-O_L-Operator und den temperaturempfindlichen CI857-Repressor ein. Die Regulation des Promotors wird durch Wechselwirkung zwischen dem Repressor und dem Operator erzielt. Zur Verwendung bei Hefe schließen illustrative Transkriptionsregulationsbereiche oder -promotoren Glycolyseenzym-Promotoren wie ADH-I- und ADH II-Promotoren, den GPK-Promotor, den PGI-Promotor, den TRP-Promotor, usw. ein. Zur Verwendung in Säugetierzellen schließen Transkriptionssteuerelemente frühe und späte SV40-Promotoren, späte Adenovirus-Hauptpromotoren, usw. ein. Eine andere für eukaryontische Zellen nützliche Regulationssequenz ist z.B. die Cytomegalovirus-Verstärkersequenz, die mit einer Promotorsequenz wie z.B. dem SV40-Promotor zur Bildung eines Chimären-Promotors fusioniert oder anderswo in dem Exprimierungsvehikel, vorzugsweise in unmittelbarer Nähe der Promotorsequenz eingefügt werden kann. Ist der Promotor induzierbar, können permissive Bedingungen zur Anwendung kommen (z.B. Temperaturänderung, Mangel oder Überschuss eines metabolischen Produktes oder Nährstoffes oder dergleichen).
Falls gewünscht, kann die Exprimierung von Strukturgenen z.B. durch Tandem-Ligation einer Nukleinsäure für einen dominanten amplifizierbaren genetischen Marker (5'- oder 3'-Ende des Strukturgens) und Züchten der Wirtszellen unter selektiven Bedingungen amplifiziert werden. Ein Beispiel für eine amplifizierbare Nukleinsäure ist das Gen für Dihydrofolatreduktase, dessen Exprimierung in Zellen, die für Methotrexat, einen Folatantagonisten, resistent gemacht wurden, gesteigert werden kann.
Die hierin verwendeten oder bereitgestellten Exprimierungsvehikel können sich in einem Replikationssystem zur episomalen Erhaltung in einem geeigneten zellulären Wirt befinden, ohne Replikationssystem bereitgestellt werden oder in das Genom des Wirts eingebaut sein.
Zwar wird eine große Vielzahl von Wirtszellen erwogen, bestimmte Ausführungsformen erfordern aber, dass die Wirtszelle E1-Sequenzen exprimiert, die im Vektor fehlen oder in ihm deaktiviert sind. Die menschliche 293-Zelllinie ist zwar die bevorzugte Wirtszelle, die Erfindung erwägt aber auch andere Zelllinien, die den Vektor mit einer E1-Deletion komplementieren können. „Komplementieren" bzw. „komplementiert" bedeutet, dass die Wirtszelllinie Funktionen codiert und/oder exprimiert, die für die Erzeugung lebensfähiger viraler Partikel notwendig sind, die im Vektor fehlen oder in ihm deaktiviert sind.
Es wichtig zu erkennen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung solcher Zellen, wie sie hierin verwendet werden, beschränkt ist. Zellen anderer Spezies (Mensch, Maus, usw.) oder andere Gewebe (Brustepithel, Darm, Nervengewebe, Lymphozyten, usw.) können ebenfalls eingesetzt werden.
Die „Modifikation" einer Nukleinsäure schließt sämtliche molekularen Veränderungen einer Nukleinsäuresequenz ein, die die Fähigkeit zur Ausübung einer angegebenen Funktion verändern, insbesondere Deletionen, Insertionen, chemische Modifikationen und dergleichen. Insertionen und Deletionen können in verschiedener, dem Fachmann bekannter Weise durchgeführt werden, z.B. durch enzymatisches Zerschneiden der Sequenz voller Länge und anschließende Modifikation und Ligation definierter Fragmente oder durch ortsspezifische Mutagenese, insbesondere Loop-out-Mutagenese der von Kramen et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 9441–9456 beschriebenen Art.
„Fragment" bezieht sich auf eine von einer Referenzsequenz durch Ausschneiden oder Deletieren eines oder mehrerer Nukleotide an einer beliebigen Stelle der Referenzsequenz mittels bekannter Rekombinationstechniken oder durch Einfügen eines zuvor bestimmten Nukleotids oder einer Nukleotidsequenz an einer zuvor bestimmten Position innerhalb der Referenzsequenz mittels bekannter Rekombinationstechniken oder durch Substituieren eines zuvor bestimmten Nukleotids oder einer Nukleotidsequenz durch ein zuvor bestimmtes Nukleotid oder eine Nukleotidsequenz innerhalb der Referenzsequenz mittels bekannter Rekombinationstechniken abgeleitete isolierte Nukleinsäure. Die Erfindung soll nicht auf die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen einer bestimmten Spezies oder Gattung beschränkt sein, kann aber mit Nukleinsäuren aus einer Vielzahl von Quellen durchgeführt werden. Es wird erwogen, dass alle Nukleinsäuren aus jeder Quelle mit oder ohne Steuerelemente in den Vektor eingefügt werden können.
„Gentherapie" umfasst die Korrektur genetischer Defekte sowie die Zuführung und Exprimierung ausgewählter Nukleinsäuren während einer Kurzzeitbehandlung einer Erkrankung oder eines pathologischen Zustands.
Die Bezugnahme auf bestimmte Puffer, Medien, Reagenzien, Zellen, Kulturbedingungen oder dergleichen oder auf deren Unterklassen soll nicht beschränkend sein, sondern als all solche verwandten Materialien einschließend gelten, die der Fachmann in dem speziellen Zusammenhang, in dem die Diskussion präsentiert wird, als interessant oder wertvoll erkennt. Ein Puffersystem oder ein Kulturmedium z.B. kann häufig durch ein anderes substituiert sein, usw., so dass zum Erreichen derselben Ziele, auf die die Verwendung eines vorgeschlagenen Verfahrens, Materials oder einer Zusammensetzung gerichtet ist, verschiedene, jedoch bekannte Wege eingeschlagen werden können.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Verwendung aller beschriebenen Entdeckungen oder hierin explizit beschriebenen Ausführungsformen beschränkt. Zwar kann ihre Kombination de facto bevorzugt sein, doch es ist nicht notwendig für die Erfindung, dass alle Aspekte gleichzeitig zur Anwendung kommen.
Die erfindungsgemäßen isolierten Nukleinsäuren können zur Erzeugung modifizierter Polypetide eingesetzt werden, die jeweils mindestens eine Eigenschaft des nativen Polypetids aufweisen. Dazu gehören Unterfragmente, Deletionsmutanten, Verarbeitungsmutanten oder Substitutionsmutanten, Polypeptide mit derselben Sekundärstruktur wie der Bindungsbereich des nativen Polypeptids und Kombinationen davon. Solche modifizierten Polypeptide können die Funktionalität des „Wildaxt"peptids tragen oder eine modifizierte oder extern regulierbare Funktionalität aufweisen. Solche modifizierten Polypeptide können, wie der Fachmann erkennen wird, in der vorliegenden Erfindung sehr nützlich sein.
Die „Wildart"mutante sowie analoge Polypeptide und Zusammensetzungen davon können zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, die bei der Analyse der Ergebnisse der im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Tests Anwendung finden können. Die Antikörper können auf herkömmlichem Wege hergestellt werden; dabei wird z.B. das erfindungsgemäße Polypeptid als Immunogen verwendet und das Polypeptid in einen Säugetierwirt, z.B. Mäuse, Kühe, Ziegen, Schafe, Kaninchen, usw. injiziert, insbesondere mit einem Hilfsstoff, z.B. dem vollständigen Freundschen Adjuvans, Aluminiumhydroxidgel oder dergleichen. Dem Wirt kann dann Blut abgenommen und dieses zur Isolierung polyklonaler Antikörper verwendet werden oder die Peripherblutlymphozyten (B-Zellen) können mit einer geeigneten Myelomzelle fusioniert werden, so dass eine unsterbliche Zelllinie entsteht, die für die erfindungsgemäßen Verbindungen spezifische monoklonale Antikörper sezerniert.
Auf sämtliche hierin erwähnten Publikationen wird Bezug genommen.
Enzyme, Zellen und Viren
Zur rekombinanten DNA-Beeinflussung verwendete Enzyme wurden von Boehringer-Mannheim, Inc. (Laval, Quebec, Kanada), New England Biolabs (Beverly, MA) oder Bethesda Research Laboratories (Burlington, Ontario, Kanada) erworben und gemäß den Empfehlungen der Hersteller verwendet. Die Plasmide wurden nach Standardprotokollen konstruiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y.). Der E. coli-Stamm DH5 (supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1) wurde mittels Elektroporation mit neu konstruierten Plasmiden transformiert (Dower, W. J., Miller, J. F. und Ragsdale, C. W., 1988, High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation, Nucleic Acids Res. 16: 6127–6145). Plasmid-DNA wurde nach dem Alkalilyseverfahren hergestellt und durch Zentrifugieren mit dem CsCl-Ethidiumbromid-Dichtegradienten gereinigt (Birnboim, H. C. und Doly, J., 1978, A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res. 7: 1513–1523).
Die Zellkulturmedien und -reagenzien wurden von GIBCO Laboratories (Grand Island, NY) bezogen. Die Adenovirus (Ad)-Vektoren wurden titriert und durch 293-Zellen geleitet, die die übrigen 11% des Ad5-Genoms inklusive des E1-Bereiches konstitutiv exprimieren (Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C. und Nairn, R., 1977, Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5, J. Gen. Virol. 36: 59–72). Die 293-Zellen wurden als Monoschicht in essentiellem F-11-Minimalmedium mit 100 Einheiten Penicillin/ml, 100 μg Streptomycin/ml, 2,5 μg Amphotericin/ml und 10% Serum neugeborener Kälber zur Zellerhaltung oder 5% Pferdeserum zur Virusinfektion gezüchtet. In einer Spinnerkultur gezüchtete KB-Zellen wurden in Jokliks modifiziertem Medium mit Antibiotika (wie zuvor) und 10% Pferdeserum erhalten.
Für einstufige Wachstumskurven wurden KB-Zellen auf eine Dichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml gezüchtet, zentrifugiert und in 1/10 des Volumens des Originalmediums erneut suspendiert; dann wurde der Virus zugesetzt (20 PFU/Zelle) und man ließ ihn unter Rühren eine Stunde lang bei 37°C adsorbieren. Dann wurden die Zellen in das Originalvolumen mit 50% frischem und 50% Originalmedium zurück verbracht. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden 4 ml-Aliquote entnommen, mit 0,5 ml Glycerol versetzt und die Proben für Tests des infektiösen Virus durch Plaquetitration bei –70°C gelagert.
Konstruktion und Wachstum rekombinanter Viren
Rekombinante Viren wurden durch Cotransfektion von 293-Zellen mit geeigneten Plasmiden isoliert (Graham, F. L., Van der Eb, A. J., 1973, A new technique fox the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA, Virol. 52: 456–467). Nach 8–10 Tagen wurden die Plaques isoliert, expandiert und die virale DNA mittels Restriktionsenzymdigestion wie zuvor beschrieben analysiert (Graham, F. L. and Prevec, L., 1991, Manipulation of Adenovirus Vectors in E. J. Murry (Hrsg.) Methods in molecular biology, Band 7: Gene transfer and expression protocols, The Humana Press Inc., Clifton, N. J., S. 109–128). Anschließend wurden Kandidatenviren einmal von Plaque gereinigt und die Vektoren für Stabilitätsstudien zunächst zur viralen DNA-Analyse nach der ersten Plaquereinigung durch ein Medium aus infizierten Zellen geleitet. Semikonfluente Monoschichten der 293-Zellen in 60 mm-Petrischalen wurden mit 0,5 ml Medium aus der jeweiligen vorangegangenen Hindurchleitung (etwa 40 PFU/Zelle) infiziert; den Virus ließ man eine halbe Stunde lang adsorbieren, dann wurde das Medium ersetzt. Zellen und Medium wurden nach Abschluss der zytopathischen Wirkung, für gewöhnlich innerhalb von 2–3 Tagen nach der Infektion geerntet.
³²p-Markierung und Extraktion viraler DNA
Semikonfluente Monoschichten der 293-Zellen in 60 mm-Petrischalen wurden mit dem Virus aus den zu analysierenden Hindurchleitungen infiziert und das Medium 24 Stunden nach der Infektion entfernt und durch 1 ml phosphatfreies 199-Medium mit 5% Pferdeserum und 25 uCi/ml ³²p-ortho-Phosphorsäure (erworben von DuPont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) ersetzt. Nach einer Inkubation der infizierten Zellen für weitere 6 Stunden wurden die Zellen geerntet und die DNA extrahiert. Die virale DNA wurde anschließend mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und einer Elektrophorese auf 1% Agarosegelen unterzogen; die Gele wurden getrocknet und die DNA-Banden mittels Audioradiographie sichtbar gemacht.
Beispiel 1: Erzeugung des Plasmids pBHG10
Adenoviren tragen eine cis-Sequenz im E1-Bereich, die für die Enkapsidation viraler DNA-Moleküle ausschlaggebend ist. Wird dieses cic-Signal (194 bis 358 bp in Ad5) deletiert, können virale Genome nicht gepackt werden, sondern würden, so erwartet man, ihre DNA weiter in transfizierten Zellen replizieren. Dies und die Tatsache, dass Ad- DNA in infizierten Zellen zirkulieren und die Cotransfektion zweier Plasmide mit überlappenden Sequenzen in Säugetierzellen einen infektiösen Virus mit guter Wirksamkeit erzeugen kann, führte uns zur Entwicklung der nachfolgend beschriebenen Strategie.
Der erste Schritt ist die Konstruktion eines Virus (AdPacI), der das gesamte Ad5-Genom mit einer Deletion der E3-Sequenzen von 28133 bis 30818 bp enthält. Ad5PacI wurde durch Cotransfektion von 293-Zellen mit zwei Plasmiden (pFG173 und pAB14PacI, einem modifizierten pAB14) hergestellt (Bett, A. J., Prevec, L. und Graham, F. L., 1993, J. Virol. 67: 5911–5921), wobei E3 (2,69 kb) durch eine PacI-Klonierungsstelle substituiert ist (1A). Als Nächstes wurde gereinigte virale DNA aus AdSPacI mit ClaI und XbaI verdaut und mit einem anderen Plasmid (pWH3) in 293-Zellen cotransfiziert (Bautista, D. S. und Graham, F. L., 1989, Gene 82: 201–208), so dass der Virus AdBHG entstand (1B). pWH3 ist ein Plasmid, das Ad5-Sequenzen des linken Endes sowie eine Insertion eines modifizierten pBR322-Plasmids bei bp 1339 enthält und so konzipiert ist, dass die Packungssignale in jedem Stadium deletiert werden könnten.
Beim nächsten Schritt werden ein das gesamte AdBHG-Genom enthaltendes bakterielles Plasmid erzeugt und anschließend infektiöse Klone identifiziert. Zellen aus Babyrattennieren (BRK) wurden mit AdBHG unter den zuvor dargestellten Bedingungen infiziert, so dass zirkularisierte Ad5-Genome entstanden (Graham, F. L., 1984, EMBO J. 3: 2917–2922; Ruben, M., Bacchetti, S. und Graham, F. L., 1983, Nature 301: 172–174). 48 Stunden nach der Infektion wurde DNA aus den infizierten BRK-Zellen extrahiert und zur Transformation des E. coli-Stammes HMS 174 in Ampicillin (Ap^r)- und Tetracyclinresistenz (Tet^r) verwendet. In zwei Experimenten wurden insgesamt 104 Kolonien gewonnen. Plasmidpräparate im Labormaßstab wurden mittels HindII- und BamHI/SmaI-Digestion und Gelelektrophorese untersucht. Die Ergebnisse der Restriktionsanalyse zeigten, dass die Plasmide bezüglich der Menge des viralen Genoms, die sie enthielten, variierten. Man glaubt, dass dies zumindest teilweise Folge der Bildung eines 206 bp-Palindroms ist, bei dem die invertierten terminalen Wiederholungssequenzen (ITRs) des Ad5-Genoms Kopf an Schwanz verbunden sind (Anschluss).
Aus der Restriktionsanalyse wurden 4 Kandidatenplasmide ausgewählt, die ein vollständiges AdBHG-Genom mit intakten Anschlussbereichen zu besitzen scheinen. Es stellte sich heraus, dass alle 4 Plasmide in Tests zum Infektionsvermögen, in denen 293-Zellen mit 5 bzw. 10 μg der Plasmid-DNA transfiziert wurden, infektiös waren (Daten nicht dargestellt).
Die ITR-Anschlüsse in den infektiösen Klonen wurden sequenziert und analysiert. Die Anzahl der aus dem Mittelpunkt des Palindroms in den Klonen fehlenden Nukleotide variierte von einigen wenigen, z.B. 4 bp (1 bp der rechten ITR und 3 bp der linken) bis zu 19 bp (1 bp der rechten ITR und 18 bp der linken). Für die weitere Arbeit wählten wir das Klon mit 19 fehlenden bp aus dem Anschluss aus und nannten es pBHG9.
pBHG10 wurde durch Deletion der Packungssignale in pBHG9 erzeugt. Dies erfolgte durch teilweise BamHI-Digestion und -Religation (1B). Der pBHG10-Test wurde durch die Tatsache, dass die Entfernung der Packungssignale auch zur Eliminierung des Tet^r-Gens führte, erleichtert.
pBHG10 enthält Ad5-DNA-Sequenzen von bp 19 (linkes Genomende) bis bp 188, bp 1339 bis 28133 und bp 30818 bis 35934 (rechtes Genomende). Das linke und rechte Ende der Ad5-Genome sind kovalent miteinander verbunden. Ein Segment des Plasmids pBR322, das die Nukleotide 375–1/4361–2964 des pBR322-Genoms darstellt, welches den Replikationsursprung von pBR322 und das pBR322-Ampicillinresistenzgen einschließt, befindet sich zwischen Ad5 bp 188 und 1339, was die Verbreitung von pBHG10 in Wirtszellen wie E. coli ermöglicht. Eine PacI-Restriktionsenzymstelle – die einzige in diesem Plasmid – befindet sich zwischen Ad5 bp 28133 und bp 30818, was das Einfügen von Fremdgenen erlaubt. Da das Packungssignal deletiert ist, führt pBHG10 selbst nicht zu infektiösen viralen Partikeln. Die Cotransfektion von pBHG10 mit Helferplasmiden, die Sequenzen des linken Endes von Ad5 wie z.B. das Packungssignal enthalten, führt durch Rekombination in der Wirtszelle zu infektiösen viralen Vektoren, deren Wirksamkeit mit der von pJM17 vergleichbar ist.
Beispiel 2: Zusätzliche Änderungen bei pBHG10: Einfügen von Wildart-E3-Sequenzen und Substitution des E3-Bereiches durch eine expandierte Deletion
Da bei einigen Anwendungszwecken die Erzeugung von Ad-Vektoren mit intakten Wildart-Ad5-E3-Sequenzen wünschenswert sein kann, führten wir Wildart-E3-Sequenzen erneut in pBHG10 ein (2). Der erste Schritt war die Konstruktion eines Plasmids mit E3-Sequenzen, die ein Kanamycinresistenzgen (Kn^r) flankieren, um das Einfügen in pBHG10 zu erleichtern. Das Ap^r-Plasmid pFG23 (McKinnon, R. D., Bacchetti, S. und Graham, F. L., 1982, Gene 19: 33–42) wurde mit XbaI, das bei Position 28592 in Ad5-Sequenzen schneidet, verdaut (es erfolgt keine Spaltung bei 30470 bp aufgrund der Dam-Methylierung in dem verwendeten E. coli-Stamm) und mit XbaI-verdautem pKN30 ligiert (Lee, F., 1982, Doktorarbeit, McMaster University, Hamilton, Ontario, Kanada), so dass pFG23AK (Ap^r und Kn^r) entstand (2A). Zur Entfernung von Fremd-Ad5-Sequenzen und des Ap^r-Gens wurde pFG23AK mit AflII verdaut und ligiert, so dass pFG23K entstand.
Der nächste Schritt war das die Wiedereinführung der E3-Sequenzen in pBHG10 in der richtigen Ausrichtung (2B). pBHG10 wurde mit SpeI, das nur bei 75,4 mU in Ad5-Sequenzen schneidet, verdaut und mit pFG23K, das mit SpeI linearisiert worden war, ligiert, so dass pBHG10A entstand, das nun die gewünschten Wildart-E3-Sequenzen in tandem mit dem vorherigen E3-Bereich mit der 2,69 kb-Deletion enthielt. Zur Entfernung der Wiederholungssequenzen wurde pBHG10A teilweise mit NdeI verdaut und erneut ligiert, so dass pBHG10B entstand. Im letzten Schritt wurde das Kn^r-Segment durch teilweise Verdauung mit XbaI und Religation aus pBHG10B entfernt, so dass pBHGE3 entstand. Mit Ausnahme der Gegenwart eines Wildaxt-E3-Bereiches ist pBHGE3 mit pBHG10 identisch und erzeugt Ad-Vektoren mit E1-Substitution durch Cotransfektion genauso wirksam.
Aufgrund unserer Analyse der Sequenzen im E3-Bereich von Ad5 glauben wir, dass es möglich sein könnte, die 2,69 kb-Deletion in pBHG10 auf 3,13 kb zu expandieren. Durch Anwendung der Technik der Polymerasekettenreaktion (PCR) und Anwendung einer Strategie, die der zuvor für die Konstruktion von pBHGE3 beschriebenen Strategie ähnelt (2), erzeugten wir eine 3,13 kb-E3-Deletion und führten sie in pBHG10 ein. Das entstandene Plasmid pBHG11 ist mit pBHG10 identisch mit Ausnahme einer expandierten E3-Deletion, die die Sequenzen von 27865 bis 30995 bp entfernt. Wie pBHG10 enthält auch pBHG11 eine einzige PacI-Restriktionsenzymstelle anstelle der deletierten E3-Sequenzen, um das Einfügen von Fremdgenen zu erlauben.
Beispiel 3: Konstruktion von E1-Shuttle-Plasmiden zur Verwendung bei Cotansfektionen mit pBHG-Vektoren
Die Plasmide pBHG10, pBHG11 und pBHGE3 wurden so konzipiert, dass sie alle wichtigen Ad5-Sequenzen enthalten, die bei der Transfektion von 293-Zellen für die Erzeugung eines infektiösen Virus erforderlich sind, mit Ausnahme des für die Enkapsidation der viralen DNA in virale Partikel notwendigen Packungssignals (194–358 bp). Zur Erzeugung infektiöser viraler Vektoren müssen pBHG10, pBHG11, pBHGE3 oder ein Insert in E3 enthaltende Derivate mit einem zweiten Plasmid, das virale Sequenzen des linken Endes (E1) inklusive des Packungssignals enthält, wie in 3 dargestellt in 293-Zellen cotransfiziert werden. Zur Maximierung der Kapazität des BHG-Vektorsystems brauchten wir ein Plasmid mit der größtmöglichen E2-Deletion zur Cotransfektion mit den BHG-Plasmiden.
Unsere Analyse der E1-Sequenzen zeigte, dass eine Deletion von etwa 3,2 kb durch Entfernung der Sequenzen zwischen einer SspI-Stelle bei 339 bp und einer AflII-Stelle bei 3533 bp erzeugt werden könnte (4). Diese Deletion stört die ITR (1–103 bp), das essentielle Kernpackungssignal (194–358 bp) oder die Codierungssequenzen für Protein IX zwar nicht, entfernt jedoch die sp1-Bindungsstelle (3525–3530 bp) aus dem Protein IX-Promotor. Zwar stört diese 3,2 kb E1-Deletion den E1-Verstärkerbereich nicht, entfernt aber das 3' am nächsten gelegene Packungselement. Die Entfernung dieses Elementes hat eine geringe oder keine Wirkung auf das Packen.
Da man glaubt, dass die sp1-Bindungsstelle für die Exprimierung von Protein IX ausschlaggebend ist (Babiss, L. E. und Vales, L. D., 1991, J. Virol. 65: 598–605), wurde sie als synthetisches Oligonukleotid, das die sp1-Stelle 1 bp näher an die Protein IX-TATA-Box positionierte wieder eingeführt (4).
Zur Bewertung der Wirkung der 3,2 kb E1-Deletion und der Wiedereinführung der sp1-Bindungsstelle untersuchten wir die Exprimierung von Protein IX mittels Immunfällung.
293-Zellen wurden mit Viren (10 PFU/Zelle) infiziert, die entweder keine Deletion in E1 (Wildart-Ad5), eine sich in das Protein IX-Gen erstreckende 2,3 kb Deletion (d1313), die zuvor beschriebene 3,2 kb Deletion (d170-3), die den HCMV-Promotor (AdHCMV2) oder β-Actin-Promotor (AdβAct2) enthaltende 3,2 kb Deletion in der zu E1 antiparallelen Ausrichtung oder die den HCMV-Promotor (AdHCMVsp1) oder β-Actin-Promotor (AdβActsp1) enthaltende 3,2 kb Deletion mit der wiedereingeführten sp1-Bindungsstelle enthielten. Nach der Markierung mit [³⁵S]-Methionin wurden Zellextrakte geerntet und Proben mit Anti-Ad2-Protein IX-Antikörpern einer Immunfällung und einer SDS-PAGE (12% Gel) unterzogen. Die Ergebnisse (5) zeigen, dass je nachdem welche Sequenzen oberhalb des Protein IX-Gens liegen, verschiedene Protein IX-Konzentrationen exprimiert wurden; lag die sp1-Stelle vor, erfolgte eine Reduktion um höchstens 25% im Vergleich zum Wildart-AdS.
Da Protein IX bekanntermaßen die Wärmestabilität viraler Partikel beeinträchtigt, untersuchten wir die Wärmestabilität von Wildart-Ad5 im Vergleich zu d1313, d170-3, AdHCMV2, AdβAct2, AdHCMVsp1 und AdβActsp1. Ansätze dieser Viren wurden vor und nach der Inkubation bei 45°C über 1 bzw. 2 Stunden titriert. Von den 6 getesteten viralen Mutanten unterschied sich nur d1313 bezüglich der Wärmelabilität signifikant von der Wildart (6). Selbst AdβAct2, das nur 16% der Protein IX-Konzentration der Wildart produziert (5), war gegenüber Wärmedeaktivierung genauso resistent wie der Wildartvirus. Dies deutet darauf hin, dass Protein IX während einer Virusinfektion wahrscheinlich im Übermaß produziert wird. Wir haben außerdem festgestellt, dass sich Viren, die die 3,2 kb E1-Deletion enthalten, in 293-Zellen bis zu denselben endgültigen Titern replizieren wie Wildart-Ad5 (Daten nicht dargestellt).
Mit der Bestätigung, dass Wachstumscharakteristiken und Stabilität von Viren mit der 3,2 kb E1-Deletion nicht beeinträchtigt waren, entschieden wir uns, diese Deletion in die Plasmide pΔE1sp1A und pΔE1sp1B zur Verwendung bei Cotransfektionen mit den BHG-Plasmiden einzubauen (4). Diese Plasmide enthalten verschiedene Restriktionsstellen zur Erleichterung des Einfügens von Fremdgenen.
Die Erfindung schließt darüber hinaus einen Vektor ein, der ein Fragment oder Fragmente des Plasmids pBR322 enthält, das eine Ampicillinresistenz und den Replikationsursprung von pBR322 enthält (der es dem Vektor ermöglicht, sich in Zellen zu replizieren, in denen pBR322 repliziert werden kann), sowie ein Insert zwischen dem frühen Bereich 4 (E4) und der rechten invertierten terminalen Wiederholungssequenz, eine Deletion der E1-Sequenzen von Position 188 bis zur oder nahe der AflII-Sequenz an Position 3533 sowie Klonierungssequenzen für das Einfügen einer Fremdnukleinsäure.
Test der Wirksamkeit und Kapazität der pBHG-Vektoren
Zur Bewertung der Fähigkeit der BHG-Plasmide zur Erzeugung infektiöser viraler Vektoren wurden Cotransfektionen mit verschiedenen Plasmiden des linken Endes durchgeführt; es stellte sich heraus, dass die Rescue-Wirksamkeit mit der von pJM17 vergleichbar ist (Daten nicht dargestellt).
Die Verwendung von pBHGE3, pBHG10 oder pBHG11 in Kombination mit der 3,2 kb Deletion in E1 sollte die Rescue von Inserts mit etwa 5,2, 7,9 bzw. 8,3 kb in virale Vektoren erlauben. Um die Kapazität des BHG-Systems zu testen, konstruierten wir ein Insert von 7,8 kb aus dem durch den unmittelbaren frühen Promotor des menschlichen Cytomegalovirus angetriebenen lacZ-Gen und dem durch den SV40-Promotor in der 3,2 kb E1-Deletion angetriebenen gB-Gen des Herpes simplex-Virus vom Typ 1 (HSV-1; (7). Nach der Cotransfektion von 293-Zellen in 20–60 mm-Petrischalen (10 mit jeweils 5 μg pBHG10 und pHlacZgBR und die andere Hälfte mit jeweils 10 μg davon) erhielt man eine Plaque. Diese wurde isoliert, expandiert und durch Restriktionsdigestion mittel HindIII analysiert. Es stellte sich heraus, dass sie das erwartete Restriktionsmuster aufwies. Wir fanden heraus, dass das mit AdHkacZgBR bezeichnete Isolat lacZ und HSV-1 gB in einer Konzentration exprimiert, die der Konzentration bei Vektoren mit einzelnen Inserts dieser Gene entspricht (Daten nicht dargestellt).
Beispiel 4: Zusätzliche Shuttle-Plasmide
Zur Konstruktion einer Doppelrekombinante mit lacZ in der E3-Deletion und Glühwürmchen-Luciferase in der E1-Deletion wurde ein Shuttle-Vektor (pABS.4) verwendet. Die Konstruktion dieses Vektors veranschaulicht weiterhin auch die Verwendung der Shuttle-Vektoren als Doppelrekombinante.
Die Strategie zur Konstruktion dieses Vektors ist in 8 dargestellt. Zunächst wurde das lacZ-Gen mit dem SV40-PolyA-Signal zwischen die SalI- und XbaI-Stellen in dem Klonierungsbereich von pABS.4 eingefügt, so dass pABSLacZ entstand (8A). Im nächsten Schritt wurde pABSLacZ mit PacI und BstBI verdaut, so dass ein Fragment entstand, das das lacZ-Gen und das Kanamycinresistenzgen (Kan^r) enthielt. Dieses Fragment wurde anschließend in zu E3 paralleler Ausrichtung zwischen die PacI- und BstBI-Stellen von pAdBHG.28 eingefügt, so dass pAdBHGLacZK entstand. Aufgrund einer doppelten antibiotischen Auswahl war der Test auf das gewünschte, das lacZ-Insert enthaltende Plasmid unbedeutend. Schließlich wurde pAdBHGLacZK mit SwaI verdaut, um das Kan^r-Gen zu entfernen, so dass pAdBHGLacZ entstand. pAdBHGLacZ werden gezüchtet und in Cotransfektion mit pCA15, einem Plasmid mit Ad5-Sequenzen der linken Seite mit Glühwürmchen-Luciferase, unter der Kontrolle des unmittelbaren frühen Promotors des menschlichen Cytomegalovirus (HCMV)-Gens anstelle der meisten E1 verwendet (8B). pAdBHGLacZ kann in Cotransfektion mit praktisch jedem von E1 abgeleiteten Konstrukt zur Erzeugung von Vektoren mit einer Vielzahl von Kombinationen von lacZ in E3 oder Fremdgen-Inserts oder Mutationen in E1 verwendet werden.
Wir entwickelten die Shuttle-Vektoren pABS.6, pABS.7 und pABS.9, um die Einführung von Inserts in die E3-Deletion in den pAdBHG-Plasmiden zu vereinfachen (9). Sie werden für einen einfacheren Transfer von Fremdgenen in die pAdBHG-Plasmidreihe wie folgt verwendet: Die Gensequenzen werden mit Hilfe der Klonierungsstellen SphI, PstI, SalI, BamHI, KpnI, SacI oder EcoRI in pABS.7 bzw. pABS.9 eingefügt. Anschließend wird das Shuttle-Plasmid mit einer oder zwei Kombinationen aus XbaI, PacI oder BstBI zerschnitten und das Kan-haltige Fragment mit Hilfe der Amp+Kan-Doppelresistenz in das Amp^r-pAdBHG-Plasmid eingefügt, um bakterielle Transformanten mit dem gewünschten Plasmid auszuwählen. Anschließend wird das Kan^r-Gen durch Digestion mit ClaI oder SwaI und Ligation entfernt. Schließlich erfolgt eine „Rescue" des Plasmids in die infektiösen viralen Ad-Vektoren durch Cotransfektion von 293-Zellen mit einem geeigneten, E1-Sequenzen enthaltenden Plasmid.
Es wurde eine Reihe von Shuttle-Plasmiden konstruiert, die zur Cotransfektion mit Vektoren der pGBH-Reihe eingesetzt werden können. Diese sind in Tabelle 1 aufgeführt (siehe auch 10). Insbesondere Teil des erfindungsgemäßen Gegenstandes ist ein E1-Shuttle-Plasmid mit einem zwischen dem frühen Bereich 4 (E4) und der rechten invertierten terminalen Wiederholungssequenz (ITR) eingefügten Packungssignal. Tabelle 1. Zusätzliche E1-Shuttle-Plasmide zur Cotransfektion mit pBHG-Vektoren
X: XbaI, B: BamHI, Xh: Xh01, S: SalI, C: ClaI, EV: EcoRV, E: EcoRI, H: HindIII, Bg: BglII
Die zuvor beschriebenen experimentellen Verfahren sollen nicht beschränkend sein. Der Fachmann erkennt, dass eine Vielzahl von Verfahren zur Einführung von Vektoren in die Zellen von Empfängergeweben verwendet werden kann (z.B. könnten Lebertumore durch Infusion der befallenen Leber mit Vektoren der hierin und in den Hauptanwendungszwecken beschriebenen und/oder beanspruchten Art über die Pfortader behandelt werden). Darüber hinaus erwägt die Erfindung die Verwendung von Vektoren, die Fremdnukleinsäuren enthalten, die Moleküle codieren, die für die Behandlung von Krankheiten nützlich sein können, z.B. Antisense-RNA, Gewebewachstumsfaktoren wie GM-CSF, Moleküle, die eine Differenzierung auslösen, Moleküle, die eine Apoptose induzieren, usw. Schließlich erkennt der Fachmann, dass die erfindungsgemäßen Verfahren zur Behandlung anderer Tiere als Mäuse und Menschen verwendet werden können.

Claims

Vektorsystem, das folgendes aufweist: (a) ein erstes Plasmid, das ein modifiziertes Adenovirus-Genom hat, das folgendes hat: (i) eine Modifikation innerhalb des frühen Bereichs 1 (E1) des Genoms, die das Packungssignal in dem Genom eliminiert; und (ii) ein Fragment oder Fragmente eines bakteriellen Plasmids, die für eine Antibiotikaresistenz codieren und den Replikationsursprung des Plasmids und andere Sequenzen aufweisen, die erforderlich sind, um zuzulassen, daß der Vektor in Zellen repliziert wird, in denen das baktierielle Plasmid repliziert werden kann; und (b) ein zweites Plasmid, das als ein E1-Shuttle-Plasmid dient und folgendes aufweist: (i) ein Fragment oder Fragmente eines bakteriellen Plasmids, die für eine Antibiotikaresistenz codieren und den Replikationsursprung des Plasmids und andere Sequenzen aufweisen, die erforderlich sind, um zuzulassen, daß der Vektor in Zellen repliziert wird, in denen das bakterielle Plasmid repliziert werden kann, und (ii) eine von einem Ad-E1-Bereich abgeleitete Sequenz, (c) wobei das erste und das zweite Plasmid rekombinierbar ist, um ein rekombinantes modifiziertes Adenovirus-Genom zu produzieren, das imstande ist, in virale Partikel gepackt zu werden.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das zweite Plasmid ferner eine Fremd-Nucleinsäure aufweist, die innerhalb der von einem Ad-E1-Bereich abgeleiteten Sequenz gespleißt ist, und wobei das durch Rekomination des ersten und des zweiten Plasmids prozudierte rekombinante modifizierte Adenovirus-Genom diese Fremd-Nucleinsäure enthält.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das modifizierte Adenovirus-Genom des ersten Plasmids von dem Genom von Adenovirus 5 (Ad5) abgeleitet ist.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei die Modifikation in E1 eine Deletion ist, die den E1A-Bereich umfaßt.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei die Modifikation in E1 eine Deletion ist, welche die Nucleotide 188 bis 1339 umspannt.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei die Modifikation in E1 eine Deletion ist, die das Nucleotid 188 und die Af1II-Stelle an Position 3533 umspannt.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei eine sp1-Stelle an Position 3525, die von dem ersten Plasmid deletiert wurde, in das zweite Plasmid wieder eingeführt wird, indem ein synthetisches Oligonucleotid eingefügt wird, das eine sp1-Stelle aufweist.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das erste Plasmid ferner eine Deletion innerhalb des frühen Bereichs 3 (E3) aufweist, wobei die E3-Deletion die Exprimierung von Sequenzen nicht hemmt, die erforderlich sind für virale Replikation, Packen, Lebensfähigkeit oder Infektionsvermögen.
Vektorsystem nach Anspruch 8, wobei die E3-Deletion Positionen 27865–30995 des Ad5-Genoms umfaßt.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das erste Plasmid zusätzlich aufweist: ein Fragment oder Fragmente von bakteriellem Plasmid pBR322, das für eine Ampicillinresistenz codiert, und ferner einen pBR322-Replikationsursprung, der ermöglicht, daß das erste Plasmid in Zellen repliziert wird, in denen pBR322 repliziert werden kann.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das Plasmidfragment oder die Plasmidfragmente nach Anspruch 1 (a) (ii) an einer Stelle eingefügt sind, die aus der Gruppe von Stellen ausgewählt ist, die besteht aus: einer Stelle zwischen dem frühen Bereich 4 (E4) und der rechten invertierten terminalen Sequenzwiederholung (ITR); einer Stelle innerhalb des frühen Bereichs 4; und einer Stelle, an der E4 umspannende Sequenzen deletiert und mit dem Plasmidfragment oder den Plasmidfragmenten substituiert sind.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das erste Plasmid ferner Klonierungsstellen für die Insertion einer Nucleinsäuresequenz aufweist.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das erste Plasmid aufweist: ein Fragment oder Fragment von bakteriellem Plasmid pBR322, das für eine Ampicillinresistenz codiert, und ferner einen pBR322-Replikationsursprung, der ermöglicht, daß der Vektor in Zellen repliziert wird, in denen pBR322 repliziert werden kann, wobei der Vektor ferner modifiziert ist, um ein Insert zwischen dem frühen Bereich 4 (E4) und der rechten invertierten terminalen Sequenzwiederholung zu enthalten, wobei der Vektor ferner eine Deletion von E1-Sequenzen von Position 188 bis zu oder in die Nähe der Af1II-Sequenz an Position 3533 hat, wobei der Vektor Klonierungsstellen für die Insertion einer Fremd-Nucleinsäure enthält.
Plasmid, das aufweist: Adenovirus-AdS-DNA-Sequenzen von bp 19 (linker Genom-Terminus) bis bp 188; bp 1339 bis 28133; und bp 30818 bis bp 35934 (rechter Genom-Terminus), wobei die linken und rechten Genom-Termini der Ad5-Sequenzen kovalent gebunden sind, und ferner aufweist: ein Fragment von Plasmid pBR322, das aus den Nucleotiden 375–1/4361–2064 besteht, die zwischen Ad 5 bp 188 und bp 1339 eingefügt sind, und eine PacI-Restriktions-Schnittstelle, die zwischen Ad5 bp 28133 und bp 30818 positioniert ist.
Plasmid, das aufweist: Adenovirus-Ad5-DNA-Sequenzen von bp 19 (linker Genom-Terminus) bis bp 188; bp 1339 bis bp 35934 (rechter Genom-Terminus), wobei die linken und rechten Genom-Termini der Ad5-Sequenzen kovalent gebunden sind, und ferner aufweist: ein Fragment von Plasmid pBR322, das aus den Nucleotiden 375–1/4361–2064 besteht, die zwischen Ad 5 bp 188 und bp 1339 eingefügt sind.
Plasmid, das aufweist: Adenovirus-Ad5-DNA-Sequenzen von bp 19 (linker Genom-Terminus) bis bp 188; bp 1339 bis 27865; und bp 30995 bis bp 35934 (rechter Genom-Terminus), wobei die linken und rechten Genom-Termini der Ad5-Sequenzen kovalent gebunden sind, und ferner aufweist: ein Fragment von Plasmid pBR322, das aus den Nucleotiden 375–1/4361–2064 besteht, die zwischen Ad 5 bp 188 und bp 1339 eingefügt sind, und eine PacI-Restriktions-Schnittstelle, die zwischen Ad5 bp 27865 und bp 30995 positioniert ist.
Vektorsystem nach Anspruch 1, wobei das zweite Plasmid ein E1-Shuttle-Plasmid ist, das die genannte von dem Ad5-E1-Bereich abgeleitete Sequenz aufweist, einschließlich eines Packungssignals.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei eine Fremd-Nucleinsäure, die ein offenes Leseraster aufweist, in das E1-Shuttle-Plasmid eingefügt ist.
Vektorsystem nach Anspruch 18, wobei ferner Sequenzen, welche die Exprimierung des offenen Leserasters regulieren, in das E1-Shuttle-Plasmid eingefügt sind.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei das E1-Shuttle-Plasmid eine Deletion für die von dem Ad5-E1-Bereich abgeleitete Sequenz für das Fragment von ungefähr 3,19 kb zwischen einer SspI-Stelle bei 339 bp und einer Af1II-Stelle bei 3533 bp aufweist, wobei das Plasmid ferner eine synthetische sp1-Bindungsstelle und Klonierungsstellen für die Insertion einer Fremd-Nucleinsäure innerhalb der E1-Deletion aufweist.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei das E1-Shuttle-Plasmid eine Deletion in der von dem Ad5-E1-Bereich abgeleiteten Sequenz aufweist, und ferner aufweist: einen HCMV-Promotor, der innerhalb der E1-Deletion positioniert ist, und Klonierungsstellen für die Insertion einer Fremd-Nucleinsäure, die dem HCMV-Promoter innerhalb der E1-Deletion benachbart positioniert sind.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei das E1-Shuttle-Plasmid eine Deletion in der von dem Ad5-E1-Bereich abgeleiteten Sequenz aufweist, und ferner aufweist: einen HCMV-Promotor und ein SV40-Polyadenylierungssignal, die beide innerhalb der E1-Deletion positioniert sind, und Klonierungsstellen für die Insertion einer Fremd-Nucleinsäure, die zwischen dem HCMV-Promotor und dem SV40-Polyadenylierungssignal positioniert sind.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei das E1-Shuttle-Plasmid eine Deletion von ungefähr 2,88 kb in der von dem Ad5-E1-Bereich abgeleiteten Sequenz aufweist, und ferner Klonierungsstellen für die Insertion einer Fremd-Nucleinsäure aufweist, die innerhalb der E1-Deletion positioniert sind.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei das E1-Shuttle-Plasmid eine Deletion in der von dem Ad5-E1-Bereich abgeleiteten Sequenz aufweist, und ferner aufweist: einen β-Actin-Promotor und ein SV40- Polyadenylierungssignal, die beide innerhalb der E1-Deletion positioniert sind, und Klonierungsstellen für die Insertion einer Fremd-Nucleinsäure, die zwischen dem β-Actin-Promotor und dem SV40-Polyadenylierungssignal positioniert sind.
Vektorsystem nach Anspruch 17, wobei das E1-Shuttle-Plasmid ein Packungssignal aufweist, das zwischen den frühen Bereich 4 (E4) und die rechte invertierte terminale Sequenzwiederholung (ITR) eingefügt ist.
In vitro Verfahren zum Einführen und Exprimieren einer Fremd-Nucleinsäure in eine Wirtszelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte aufweist: (a) Einführen (i) eines ersten Plasmids, das ein modifiziertes Adenovirus-Genom aufweist, das eine Modifikation innerhalb des frühen Bereichs 1 (E1) des Genoms aufweist, die das Packungssignal in dem Genom eliminiert; und (ii) eines E1-Shuttle-Plasmids, das eine von einem Ad-E1-Bereich abgeleitete Sequenz enthält, einschließlich eines Enkapsidationssignals und einer eingefügten Nucleinsäuresequenz, in eine Wirtszelle, welche durch die E1-Sequenz codierte Funktionen exprimiert, die von dem ersten Plasmid deletiert worden sind; und (b) Isolieren eines rekombinanten viralen Genoms, in dem das erste Plasmid mit dem E1-Shuttle-Plasmid rekombiniert wurde, um ein rekombinantes modifiziertes virales Genom zu ergeben, welches das Enkapsidationssignal und die eingefügte Nucleinsäuresequenz des E1-Shuttle-Plasmids und Elemente des ersten Plasmids unter Ausschluß der Modifikation innerhalb von E1 enthält, (c) Einführen des rekombinanten modifizierten viralen Genoms in eine Wirtszelle, und (d) Exprimieren der codierenden Sequenzen, die in dem modifizierten rekombinanten viralen Genom enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das erste Plasmid ferner ein Fragment oder Fragmente eines bakteriellen Plasmids aufweist, die für eine Antibiotikaresistenz codieren und den Replikationsursprung des Plasmids und andere Sequenzen aufweisen, die erforderlich sind, um zuzulassen, daß der Vektor in Zellen repliziert wird, in denen das Plasmid repliziert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 26 oder Anspruch 27, wobei in das E1-Shuttle-Plasmid ferner eine Nucleinsäuresequenz eingefügt wird, die ein offenes Leseraster aufweist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei in das E1-Shuttle-Plasmid ferner Sequenzen eingefügt werden, welche die Exprimierung des offenen Leserasters regulieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, wobei das rekombinante virale Genom in ein rekombinantes virales Partikel gepackt wird, das imstande ist, Zellen zu infizieren, die durch das Adenovirus, von dem das modifizierte Adenovirus-Genom ursprünglich abgeleitet wurde, infiziert werden können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 30, wobei das modifizierte Adenovirus-Genom ursprünglich von Adenovirus 5 abgeleitet wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 31, wobei der Vektor, der eine E1-Deletion hat, gemeinsam mit einem adenoviralen Partikel, das einen intakten E1-Bereich hat, in die Wirtszellen eingeführt wird, wobei das adenovirale Partikel einen intakten E1-Bereich hat, der imstande ist, die Replikation des Vektors, der eine E1-Deletion hat, zu komplementieren.