DE69934421T2

DE69934421T2 - Selektiv-replizierende virale vectoren

Info

Publication number: DE69934421T2
Application number: DE69934421T
Authority: DE
Inventors: Muralidhara San Diego RAMACHANDRA; Paul W. Olivenhain SHABRAM
Original assignee: Canji Inc
Current assignee: Canji Inc
Priority date: 1998-10-15
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2019-10-15
Also published as: WO2000022137A3; AU6391599A; KR20020013472A; WO2000022137A2; IL142337A0; PL347898A1; EP1121441A2; HUP0104107A3; HUP0104107A2; BR9914527A; NO20011843D0; NZ510805A; JP2002541761A; CA2345900A1; EP1121441B1; KR100841815B1; ATE348169T1; IL142337A; CZ301506B6; CN101092636B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gegenwärtig werden in einer Vielzahl therapeutischer Anwendungen rekombinante Adenoviren für die Einbringung von therapeutischen Transgenen eingesetzt. Die weitreichende Infektiosität dieser Vektorsysteme hat zu Bedenken geführt, dass die Expression des Virus in Nicht-Tumorzellen schädigende Nebenwirkungen auf nicht neoplastische Zellen haben könnte. Folgerichtig wurde ein breites Spektrum von Systemen für das Targeting entwickelt, um das Transgen bevorzugt in einem gegebenen Zelltyp zu exprimieren. Gewebsspezifische und tumorspezifische Promotoren wurden eingesetzt, um den Vektor bevorzugt in bestimmten Zelltypen zu replizieren. Zum Beispiel wird in der am 16. Januar 1997 veröffentlichten, internationalen Patentanmeldung PCT/US96/10838 (Internationale Veröffentlichungsnr. WO 97/01358) der Einsatz von Vektoren beschrieben, die sich in einer spezifischen Wirtszelle replizieren, wobei prostataspezifische Promotorelememente eingesetzt wurden, welche die E1-, E2- und E4-Funktionen steuern. Insbesondere wird in dieser Publikation ein Konstrukt beschrieben, bei dem ein prostataspezifischer Enhancer die Expression von E1 kontrolliert, und das eine Expressionskassette aufweist, die den CMV-Promotor umfasst, welcher die Expression des Cytosin-Deaminase-Gens steuert, das in die E3-Region insertiert ist. Diese Vektoren sind replikationskompetent und in der Lage, sich in einem bestimmten Zelltyp in intakte Virionen zu verpacken.
Ein alternativer Ansatz zur Nutzung von tumorspezifischen Promotoren für die Steuerung der viralen Replikation ist die Anwendung von spezifischen Deletionen in der für das adenovirale E1b-55K-Protein kodierenden Sequenz. Rekombinante Adenoviren, die Defekte in der für das E1b-55K kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, sind in US Patent Nr. 5,677,178 beschrieben, das am 14. Oktober 1997 erteilt wurde. Es wurde je doch festgestellt, dass diese gewebs- oder tumorspezifischen Kontrollelemente durchlässig (leaky) sind, d.h. sie erlauben die Replikation auch in anderen Zelltypen als den bevorzugten Zielzellen.
Eine Alternative zu dieser Art eines selektiv replizierenden Vektors ist die Nutzung eines replikationsdefizienten adenoviralen Vektors, der eine intensive Eliminierung der E1-Funktion aufweist. Insbesondere Vektoren, die eine Eliminierung von E1, E2, E3 und partielle Deletion von E4 aufweisen, wurden für die Einbringung exogener Transgene eingesetzt. Solche Vektoren sind eingesetzt worden, um das p53-Gen in Zielzellen einzuführen. Es ist gezeigt worden, dass die Expression eines exogen verabreichten p53-Wildtyps in eine p53-defiziente (p53-Mutation oder p53 Null) Tumorzelle in der Lage ist, eine p53-vermittelte Apoptose in der Tumorzelle zu induzieren. Solche viralen Vektoren für die Einbringung von p53 werden zur Zeit bei der Schering Corporation und bei der Invitrogen Corporation entwickelt. Diese Vektoren haben akzeptable Toxizitätsprofile und eine therapeutische Wirksamkeit für humane therapeutische Anwendungen gezeigt, und sie befinden sich in klinischen Studien der Phase II am Menschen, um bösartige Tumore zu behandeln, die mit p53-assoziierte sind.
Replikationsdefiziente und selektiv replizierende Vektoren haben zumindest theoretisch einige Nachteile im Design, die für Kliniker von Interesse sind. Da replikationsdefiziente Vektoren sich nicht unkontrolliert im Patienten vermehren werden, haben sie theoretisch ein attraktiveres Sicherheitsprofil. Da jedoch die wirksame Tumoreliminierung die Infektion einer wesentlichen Mehrheit von Tumorzellen erfordert, wird üblicherweise ein wesentlicher molarer Überschuss an Vektor eingesetzt, um therapeutische Wirksamkeit zu garantieren. Wegen ihrer Fähigkeit zur Replikation und der potentiellen Mutation zur Bildung vollständig replikationskompetenter Vektoren im Patienten, werden selektiv replizierende Vektoren unter dem Gesichtspunkt der Sicherheit als bedeutsamer angesehen. Die Beibehaltung der natürlichen Fähigkeit des Virus, sich unter besonderen Bedingungen zu vermehren, ermöglicht diesen Vektoren, sich auf umgebende Tumorzellen auszubreiten. Da die Vektoren sich selbst replizieren können, wird eine geringere Anfangsdosis derartiger Vektoren benötigt. Dies ist sowohl aus immunologischer Sicht als auch aus ökonomischen Gründen wie bei der Herstellung solcher Mittel vorteilhaft. Deshalb gibt es im Stand der Technik einen Bedarf nach einem selektiv replizierenden Vektor, der auf die erkannten Sicherheitsprobleme eingeht und einen erhöhten therapeutischen Index bereitstellt.
WO 9839464 bezieht sich auf adenovirale Vektoren, die spezifisch für Zielzellen sind, sowie auf Verfahren zur Nutzung solcher Viren. Die adenovirale Replikation kann durch transkriptionelle Kontrolle mit zellspezifischen, heterologen transkriptionalen Regulationselementen auf Zielzellen beschränkt werden, so dass die adenoviralen Vektoren sich in den Zielzellen replizieren können und eine zellspezifische Zytotoxizität bewirken, insbesondere auf neoplastische Zellen.
WO 9821228 bezieht sich auf Fusionsproteine aus einem E2F- und einem RB-Polypeptid, die als Repressoren wirksam sind. Ebenfalls vorgeschlagen wird die gewebsspezifische Expression dieser Konstrukte. Adenovirus wird als bevorzugtes Vektorsystem vorgeschlagen.
Elsing et al. ((1998) PNAS 95 (17) 10072-10077) beschreiben die Beobachtung, dass die Zerstörung des adenoviralen ORF 14,5K die Expression von FAS/APO-1 auf der Oberfläche von Adenovirus-infizierten Zellen wiederherstellt.
WO 9418992 bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung neoplastischer Zustände durch Virus- basierte Therapie. Mutiertes Virus, dem virale Proteine fehlen, welche p53 binden und/oder inaktivieren, werden einem Patienten verabreicht, der ein Neoplasma aufweist, welches Zellen umfasst, denen p53- und/oder RB-Funktionen fehlen. Dies soll bevorzugt in neoplastischen Zellen einen Replikations-Phänotyp erzeugen, was zum bevorzugten Abtöten der neoplastischen Zellen führt.
Mori et al. ((1997) Blood 90 (12) 4924–4923) offenbaren, dass die Expression gewisser Gene des HTLV-1 Virus durch funktionelle p53-Proteine unterdrückt wird. In Zellen ohne p53-Funktion wird eine hohe Expression viraler Gene (reguliert durch das Tax-Genprodukt) beobachtet, was zur Etablierung einer produktiven viralen Infektion führt.
Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme, indem ein selektiv replizierender, adenoviraler Vektor bereitgestellt wird, der einen auf einen Weg (pathway) ausgerichteten und auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotor enthält, welcher die Expression eines Repressors der viralen Replikation steuert, so dass der Vektor sich bevorzugt in Zellen repliziert, die einen Defekt in einem Weg (pathway) aufweisen. Die vorliegende Erfindung stellt auch pharmazeutische Formulierungen bereit, die solche Vektoren enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit, um Zellen mit einem Defekt in einem Weg (pathway) aus einer Population von normalen Zellen zu eliminieren, wobei solche Vektoren verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt rekombinante Viren bereit, die das virale Genom selektiv in Abhängigkeit von den intrazellulären Bedingungen der Zielzelle replizieren, indem ein auf einen Weg (pathway) ansprechender Promotor verwendet wird, der die Expression eines Inhibitors der viralen Replikation, welcher die virale Replikation in der Wirtszelle wesentlich inhibiert, basierend auf dem Phänotyp oder Genotyp der infizierten Zelle steuert. In der Zielzelle ist das Promotorelement des auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotors inaktiv, und somit kann sich das Virus replizieren. Dies führt zu: (1) Abtöten der Zellen durch die natürliche, lytische Natur des Virus, und/oder (2) liefert eine therapeutische Dosis eines Transgenprodukts (vermehrt im Vergleich zu replikationsunfähigen Vektoren) an die Zielzelle, und (3) produziert an einer Stelle eine Konzentration des Virus, welche die Infektion von umgebenden Zielzellen durch das rekombinante Virus ermöglicht. Die Erfindung stellt darüber hinaus therapeutische und diagnostische Verfahren zur Verwendung der Vektoren bereit, sowie pharmazeutische Formulierungen, die die Vektoren umfassen, Verfahren zur Herstellung der Vektoren und transformierte Zellen, die die Vektoren enthalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1. Es wurden Ergebnisse für CPE-Assays zur Bestimmung des zytopathischen Effekts von rekombinanten Adenovirus-Vektoren, welche für die kodierende Sequenz der E2F-Rb Fusion kodieren, wobei diese unter Kontrolle eines Promotors steht, der entweder auf den TGF-β-Weg (PAI oder SRE) oder auf den p53-Weg (RGC oder p53CON) anspricht, erzeugt. Zusätzlich wurde auch das für das grüne fluoreszente Protein kodierende Gen als Reporter in den Vektor eingefügt. Teilabbildung A zeigt MRC-9 Zellen, Teilabbildung B zeigt die Hep3B-Zellen, und Teilabbildung C zeigt WIDR-Zellen. Bahn 1: Replikationsdefizientes (E1 deletiert) rekombinantes Adenovirus, welches das grüne fluoreszente Protein (GFP) exprimiert; Bahn 2: PAI-Ad; Bahn 3: SRE-Ad; Bahn 4: RGC-Ad; Bahn 5: p53CON-Ad. Die Partikelkonzentrationen sind wie rechts in der Abbildung angegeben.
2. Die Ergebnisse der Fluoreszenz-Mikroskopie (obere Teilabbildungen) zeigen die GFP-Expression durch Vektoren, die auf den Weg (pathway) ausgerichtet sind. Teilabbildung A zeigt den GFCB-Kontrollvektor, Teilabbildung B den SRE-Ad-Vektor und Teilabbildung C den p53CON-Ad-Vektor. Die Infektion erfolgte mit 5 × 10⁵ Partikeln pro Milliliter.
3. Ergebnisse der Infektion von normalen bronchialen Epithelzellen (Teilabbildung A) und C33A-Zellen (Teilabbildung B) mit den rekombinanten Viren U3EE (Quadrate), T1LT (Kreise) und L9IU (Dreiecke). Die vertikalen Achsen zeigen den Prozentsatz an uninfizierten Kontrollen, und die horizontalen Achsen zeigen die virale Dosis in Partikeln pro Milliliter. Die Experimente wurden so durchgeführt, dass eine Kultur von jedem Zelltyp mit sechs unterschiedlichen Viruskonzentrationen in Kontakt gebracht wurde, die von 10⁵ bis 10⁹ virale Partikel pro Milliliter reichten. Die Zellen wurden dem Virus für den Zeitraum einer Stunde ausgesetzt, überschüssiges Virus wurde weggewaschen, und der Prozentsatz an lebensfähigen Zellen wurde am sechsten Tag nach der Infektion mit dem MTS-Assay (Promega, Madison, WI) bestimmt, wobei im Wesentlichen die Anleitungen des Herstellers befolgt wurden. Die horizontale Linie zeigt die Menge an, bei der 50 % der Zellen lebensfähig blieben. Der Schnittpunkt der durch die Daten erzeugten Kurven mit der horizontalen gepunkteten Linie ist ein Maß für den ED₅₀ des Virus.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt einen selektiv replizierenden, rekombinanten, viralen Vektor bereit, der einen auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotor umfasst, der in funktionsfähiger Weise an einen Repressor der viralen Replika tion gekoppelt ist, wobei sich der Vektor selektiv in neoplastischen Zellen repliziert, die einen Defekt in dem Weg (pathway) aufweisen, auf den der Promotor anspricht.
Die Bezeichnung "selektiv replizierend" bezieht sich auf einen Vektor, der in der Lage ist, sich bevorzugt in einer Zelle in einem bestimmten phänotypischen Zustand relativ zu einem anderen phänotypischen Zustand zu replizieren. Beispiele für unterschiedliche phänotypische Zustände umfassen eine Zelle mit defektem p53-Weg im Vergleich zu einer normalen Zelle des entsprechenden Zelltyps. Wenn ein Virus eine bevorzugte Replikation aufweist, bedeutet dies, dass sich das Virus bei einer bestimmten Dosismenge in einem Zielzelltyp mindestens fünfmal effizienter repliziert, als in einer normalen (Kontroll-)Zelle des gleichen Typs. Um festzustellen, ob ein Virus wirklich selektiv ist, ist es hinsichtlich mehrerer Faktoren notwendig, die Fähigkeit des Virus zu bestimmen, sich in den Zielzellen zu replizieren, verglichen mit normalen Zellen des gleichen Zelltyps.
Es ist bevorzugt, dass man die Fähigkeit eines bestimmten Vektors, sich in einer Zielzelle replizieren zu können, die den Zustand aufweist, auf den abgestellt wird, mit der Fähigkeit vergleicht, sich in der normalen Zelle des gleichen Typs replizieren zu können, die diesen Zustand nicht aufweist. Zum Beispiel ist der erste Schritt nach der viralen Infektion die Induktion der Zelle zum Eintritt in den Zellzyklus, da Faktoren, die für die maximale Replikationseffizienz des Virus notwendig sind, nur in der S-Phase vorhanden sind. Wenn man dennoch versuchen würde, die Selektivität eines Vektors im Hinblick auf die Selektivität in Tumorzellen zu bewerten, indem man die Fähigkeit, sich in einer. Tumorzelle zu replizieren, relativ zu der in einer anderen Zelle vergleicht, welche bereits in den Zellzyklus eingetreten ist (wie zum Beispiel immortalisierte oder transformierte Zellinien), dann wird die Selektivität des Virus für Tumorzellen zu einem gewissen Grade überdeckt werden. Zusätzlich wurde beobachtet, dass verschiedenen Zelltypen eine sehr unterschiedliche Infektiosität für ein bestimmtes Virus besitzen. Obwohl einige Viren, wie zum Beispiel Adenoviren, einen weitreichenden Gewebetropismus besitzen, sind andere Viren im Hinblick auf den Zelltyp, den sie infizieren können, stärker eingeschränkt. Beim Versuch, die Leistungsfähigkeit eines bestimmten Vektors in Zellen mit sehr unterschiedlichen Infektiositäten zu bewerten, wird es schwierig sein, zu bestimmen, ob ein fehlender Effekt auf der Leistungsfähigkeit des Vektors innerhalb der Zelle beruht, oder einfach auf der Unfähigkeit des Virus, die Zelle überhaupt infizieren zu können. Durch Bewertung der Selektivität in Zielzellen und normalen Zellen des gleichen Typs, kann man diesen Infektiositätseffekt minimieren.
Der zeitliche Ablauf des viralen Lebenszyklus muss ebenfalls berücksichtigt werden. Zum Beispiel kann sogar der Wildtyp eines Vektors kurz nach der Infektion scheinbar Selektivität in Tumorzellen relativ zu normalen Zellen aufweisen, weil die Zelle schon im Zellzyklus ist. Diese scheinbare Selektivität verringert sich jedoch mit der Zeit, nachdem das Virus den Zellzyklus stimuliert hat. Daher muss der Zeitpunkt, zu dem Selektivität nach der Infektion bewertet wird, ausreichend sein, um diese anfängliche Verzögerung der Replikation in normalen Zellen zu vermeiden. Obwohl diese Zeit mit dem angewandten Virustyp variieren wird, kann diese anfängliche Verzögerung durch den Fachmann problemlos bestimmt werden.
Der Dosiseffekt muss ebenfalls bei der Feststellung, ob ein bestimmtes rekombinantes Adenovirus einen selektiven Effekt im Zielzelltyp aufweist, berücksichtigt werden. Wenn man zum Beispiel auf die Eliminierung von Tumorzellen abstellt, und den Effekt durch Zytotoxizität misst, kann durch unterschiedliche Dosen ein Virus so dargestellt werden, als ob es eine selektive Zytotoxizität hätte. Es ist beobachtet worden, dass bei einer ausreichend hohen Dosis fast jedes Virus (unabhängig davon, in welchem Ausmaß sein Genom modifiziert wurde) zytotoxisch sein wird, allein aufgrund der Auswirkungen der anwesenden viralen Proteine (wie zum Beispiel Hexon im Fall des Adenovirus), die bekanntermaßen zytotoxisch sind. Obwohl die wissenschaftliche Literatur ein Virus als "replikationsdefekt" beschreiben mag (wobei impliziert wird, dass das Virus vollständig unfähig zur Replikation ist, falls keine Zellinie anwesend ist, die den viralen Defekt komplementieren kann), werden solche Viren zutreffender als "für die Replikation abgemildert (attenuated)" beschrieben. Zum Beispiel können sich Adenoviren, die eine Deletion der gesamten E1-Region aufweisen und die häufig als "replikationsdefizient" oder "replikationsdefekt" beschrieben werden, bis zu einem gewissen Grade replizieren, insbesondere in Zellen, die sich im Zellzyklus befinden, oder in sich schnell teilenden Zellen. Wie Mulligan beobachtete (1990, Science 260: 926–932):

Obwohl gezeigt wurde, dass die Expression der E1-Region sich auf die Expression anderer viraler Genprodukte auswirkt, die zur Replikation notwendig sind (zitierend Horwitz, M. in Virology, B.N. Fields Ed. (Raven, New York, 1990) Kapitel 60)), scheint die E1-Genexpression für die virale Replikation nicht absolut notwendig zu sein. Die frühe Charakterisierung von E1-defizienten Viren zeigt, dass bei einer hohen Multiplizität der Infektion die E1-Region für die Replikation verzichtbar ist (zitierend Jones und Shenk (1979) PNAS (USA) 76 (8): 3665–3669).

Somit kann der Effekt der viralen Dosis bei der Bestimmung, ob ein Virus sich selektiv repliziert oder nicht, nicht ignoriert werden.
Wenn man die Replikationsselektivität eines Virus für die Zielzelle bewerten möchte, sollte man den "Selektivitätsindex" des Virus wie. folgt bewerten. Der üblicherweise verwendete Parameter ED₅₀ (welcher als die Dosis definiert ist, die ausreicht, um den Zelltod in 50% der Zellen zu bewirken) ist eine geeignete Basis für einen Vergleich. Der ED₅₀ eines Virus kann problemlos durch übliche Dosis-Eskalierungsexperimente in vitro bestimmt werden. Um die einheitlichste Basis für den Vergleich sicherzustellen, wird der ED₅₀ am besten relativ zu einer viralen Kontrolle dargestellt, um die Auswirkungen von Abweichungen hinsichtlich der Infektiosität innerhalb der verglichenen Zelltypen und von jeglichen Assay-Abweichungen zu minimieren.
Somit wird das einheitslose Verhältnis: ED₅₀ (Virus)/ED₅₀ (Kontrolle) verwendet, um die relative Toxizität des Virus in der Zelle darzustellen, und es wird als der "relative Toxizitätsindex" oder als "RTI" bezeichnet. Der "Selektivitätsindex" für ein bestimmtes Virus wird dargestellt als das Verhältnis: RTI (Zielzellen)/RTI normale Zellen). Selektiv replizierende Vektoren werden einen Selektivitätsindex von mindestens 10, bevorzugt aber von 50, 100 oder mehr besitzen.
Die selektiv replizierenden adenoviralen Vektoren U3EE und T1LT sind zum Beispiel konstruiert, um eine selektive Replikation und Abtötung von Tumorzellen zu erreichen, die Defekte im p53-Weg aufweisen. Der U3EE-Vektor wird im Wesentlichen in Übereinstimmung mit der Lehre der hier dargelegten Beispiele hergestellt. Das U3EE-Virus enthält eine erste Expressionskassette, die ein auf p53 ansprechendes Element (p53CON) enthält, das die Expression des E2F-Rb-Fusionsproteins steuert. Das E2F-Rb-Fusionsprotein ist ein wirkungsvoller Inhibitor der adenoviralen E2-Promotoraktivität, und seine Gegenwart in der Zelle wird die virale Replikation wirksam unterdrücken. Das auf p53 ansprechende Element (p53CON) ist aktiv in Reaktion auf einen funktionellen p53-Weg.
Folglich wird in normalen Zellen mit intaktem p53-Weg das U3EE-Virus das E2F-Rb-Fusionsprotein exprimieren, und das Virus wird sich nicht replizieren. Jedoch ist in Zellen mit einem Defekt im p53-Weg (die Mehrheit der Tumorzellen) das p53CON Element nicht aktiv, und somit gibt es keine Unterdrückung der viralen Replikation. Der U3EE-Vektor enthält außerdem eine Expressionskassette, die den MLP-Promotor enthält, der die Expression des Ad5 E3-10.5K pro-apoptotischen Gens steuert. Die Verwendung von temporären Promotoren (wie zum Beispiel des MLP-Promotors) ist bevorzugt, wenn pro-apoptotische Gene eingesetzt werden, weil es erwünscht ist, die Replikation der viralen DNA innerhalb der Zielzelle zu ermöglichen, bevor das pro-apoptotische Signal aktiviert wird. Der MLP-Promotor wird ca. sieben Stunden nach der Infektion aktiviert, folgend auf den Beginn der Replikation des U3EE-Genoms, wodurch die Aktivität des E3-10.5K pro-apoptotische Proteins induziert wird. Der adenovirale Vektor T1LT entspricht im wesentlichen dem U3EE-Vektor, außer dass er eine zusätzliche Deletion in der E1a-Region aufweist, wodurch die Aminosäuren 4–25 der adenoviralen E1a-Proteine 243R und 289R entfernt werden. Diese Deletion verhindert die Fähigkeit des p300-Proteins, an diese E1a-Proteine zu binden.
Die U3EE- und T1LT-Viren wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit bewertet, sich in normalen, bronchialen Epithelzellen (NHBE) und in C33A (einer epithelialen Tumorzellinie, die einen defekten p53-Weg aufweist) zu replizieren und diese Zellen abzutöten, wobei der L9IU-Vektor als Kontrolle verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt. In der folgenden Tabelle sind die gezeigten Daten zusammengefasst:
Wie aus den gezeigten Daten ersichtlich ist, besitzen die U3EE- und T1LT-Viren eine hohe Selektivität für Tumorzellen. Wie bereits erörtert wurde, besitzt das L9IU-Virus einen kleinen Replikationsvorteil in den im Zellzyklus befindlichen Tumorzellen relativ zu den ruhenden, normalen Zellen. Indem die Verhältnisse von ED₅₀(Virus)/ED₅₀(Kontrolle) in jedem der Zelltypen vor Berechnung des Selektivitätsindex verglichen werden, wird der Effekt solcher Variabilitäten minimiert.
Der Ausdruck "rekombinant" bezieht sich auf ein Genom, das mittels in herkömmlicher rekombinanter DNA-Techniken modifiziert wurde.
Der Ausdruck "Virus" bezieht sich auf jeden beliebigen der obligat intrazellulären Parasiten, die keinen Mechanismus zur Proteinsynthese oder zur Energiegewinnung aufweisen. Das virale Genom kann eine RNA oder eine DNA innerhalb einer Proteinhüllstruktur einer Lipidmembran sein. Beispiele für Viren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Baculoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Adenoviridae, Picotrnaviridae. Der Ausdruck rekombinante Viren umfasst chimäre (oder sogar multimere) Viren, d.h. Vektoren, die unter Nutzung von komplementären kodierenden Sequenzen von mehr als einem viralen Subtyp konstruiert wurden. Vgl. dazu Feng et al. Nature Biotechnology 15: 866–870.
Der Ausdruck "Adenovirus" ist mit dem Ausdruck "adenoviraler Vektor" synonym und bezieht sich auf Viren der Gattung Adenoviridae. Der Ausdruck Adenoviridae bezieht sich allgemein auf tierische Adenoviren der Gattung Mastadenoviren, einschließlich (aber nicht beschränkt auf) humane, bovine, ovine, equine, canine, porcine, murine und simiane Adenovirus-Subgattungen.
Insbesondere humane Adenoviren umfassen die Subgattungen A–F sowie einzelne Serotypen derselben, wobei die individuellen Serotypen und A–F Subgenera umfassen (aber nicht beschränkt sind auf): humane Adenovirus-Typen 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (Ad11A und Ad11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 und 91. Der Ausdruck bovine Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) die bovinen Adenovirus-Typen 1, 2, 3, 4, 7 und 10. Der Ausdruck canine Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) die caninen Adenovirus-Typen 1 (Stämme CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26–61) und 2. Der Ausdruck equine Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) die equinen Adenovirus-Typen 1 und 2. Der Ausdruck porcine Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) die porcinen Adenovirus-Typen 3 und 4. In der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung ist das Adenovirus abgeleitet von den humanen Adenovirus-Serotypen 2 oder 5.
Der Ausdruck "auf einen Weg (pathway) ansprechender Promotor" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die ein bestimmtes Protein binden und dadurch bewirken, dass benachbarte Gene transkriptionell auf die Bindung des Proteins in normalen Zellen reagieren. Derartige Promotoren können erzeugt werden, indem ansprechende Elemente eingebaut werden, wobei es sich um Sequenzen handelt, an die Transkriptionsfaktoren binden. Ein solches Ansprechen ist im allgemeinen induktiv, obwohl es mehrere Fälle gibt; in denen steigende Proteinmengen zu einer verminderten Transkription führen. Auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotoren können natürlich vorkommen oder synthetisch sein. Auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotoren werden typischerweise in Bezug auf einen Weg (pathway) konstruiert, oder in Bezug auf ein funktionelles Protein, auf das abgestellt wird. Zum Beispiel würde ein natürlich vorkommender Promotor, der auf den p53-Weg anspricht, transkriptionelle Kontrollelemente umfassen, welche durch die Anwesenheit von funktionellem p53 aktiviert werden, wie zum Beispiel der p21- oder bax-Promotor.
Alternativ dazu können synthetische Promotoren, die p53-Bindungsstellen stromaufwärts von einem minimalen Promotor (zum Beispiel der SV40-TATA-Box-Region) enthalten, eingesetzt werden, um einen synthetischen Promotor zu erzeugen, der auf einen Weg (pathway) anspricht. Synthetische, auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotoren werden im allgemeinen aus einer oder aus mehreren Kopien einer Sequenz konstruiert, die einem Konsensus-Bindungsmotiv entspricht. Solche Konsensus-DNA-Bindungsmotive können problemlos bestimmt werden. Solche Konsensus-Sequenzen werden im allgemeinen als direkte oder Kopf-Schwanz-Repeats angeordnet, die durch einige Basenpaare getrennt sind. Die Elemente, die Kopf-Kopf-Repeats enthalten (zum Beispiel AGGTCATGACCT) werden Palindrome oder invertierte Repeats genannt, und solche mit Schwanz-Schwanz-Repeats werden evertierte Repeats genannt.
Beispiele für auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotoren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen die synthetischen auf den Insulin-Weg ansprechende Promotoren, welche die Konsensus-Insulin-Bindungssequenz enthalten (Jacob, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:27773–27779), den auf den Cytokin-Weg ansprechenden Promo tor, den auf den Glucocorticoid-Weg ansprechende Promotoren (Lange, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15673–80), auf den IL1- und IL6-Weg ansprechende Promotoren (Won K,.-A. und Baumann H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3965–3978), auf den T3-Weg ansprechende Promotoren, auf den Thyroidhormon-Weg ansprechende Promotoren, welche das Konsensusmotiv: 5' AGGTCA 3' enthalten, auf den TPA-Weg ansprechende Promotoren (TREs), auf den TGF-β-Weg ansprechende Promotoren (wie in Grotendorst, et al. (1996) Cell Growth and Differentiation 7:469–480, beschrieben). Beispiele für auf andere Wege ansprechende Promotoren sind dem Fachmann bekannt und können in der Datenbank der Transkriptionregulationsregionen von eukaryontischen Genomen identifiziert werden, die über das Internet über http://www.eimb.rssi.ru/TRRD zugänglich ist.
Wie hier dargelegt wird, umfast in der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung der Vektor einen synthetischen auf den TGF-β-Weg ansprechenden Promotor, der in Gegenwart eines funktionellen TGF-β-Wegs aktiv ist, wie zum Beispiel ein Promotor, der auf SRE- und PAI-RE ansprechende Elemente enthält. PAI-RE bezieht sich auf ein synthetisches, auf TGF-β ansprechendes Element, das Sequenzen enthält, die auf ein TGF-β-Signal ansprechen, welches aus der Promotorregion des Plasminogenaktivators I isoliert wurde. Die Konstruktion von PAI-RE ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung beschrieben. Der auf den PAI-RE-Weg ansprechende Promotor kann als ein Fragment von 749 Basenpaaren isoliert werden, das aus dem Plasmid p800luc isolierbar ist (wie in Zonneveld, et al. (1988) PNAS 85:5525–5529 beschrieben; verfügbar aus GenBank unter Zugangsnummer J03836). SRE bezieht sich auf ein synthetisches, auf TGF-β ansprechendes Element, welches einen Repeat von 4 der Smad-4 DNA-Bindungssequenzen hat (GTCTAGAC, wie in Zawel, et al. (1988) Mol. Cell 1:611–617 beschrieben). Die Konstruktion von SRE ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung beschrieben. Das auf SRE ansprechende Element kann durch Zusammenlage rung von komplementären Oligonukleotiden, welche für die Smad-4 Bindungssequenzen kodieren, und anschließende Klonierung in Plasmid pGL#3-Promotor-Luciferase-Vektor (kommerziell von Promega erhältlich) erzeugt werden.
In ähnlicher Weise bezieht sich ein auf den "p53-Weg ansprechender Promotor" auf ein transkriptionelles Kontrollelement, welches in der Gegenwart eines funktionellen p53-Weg aktiv ist. Der auf den p53-Weg ansprechende Promotor kann eine natürlich vorkommende transkriptionelle Kontrollregion sein, welche in der Gegenwart eines funktionellen p53-Weg aktiv ist, wie zum Beispiel der p21- oder der mdm2-Promotor. Alternativ dazu kann der auf den p53-Weg ansprechende Promotor eine synthetische, transkriptionelle Kontrollregion sein, welche in der Gegenwart eines funktionellen p53-Weg aktiv ist, wie zum Beispiel die auf den SRE- und PAI-RE-Weg ansprechende Promotoren. p53CON beschreibt einen auf. den p53-Weg ansprechenden Promotor, der ein synthetisches, auf p53 ansprechendes Element enthält, das durch Insertion von zwei synthetischen p53-Konsenus-DNA-Bindungssequenzen (wie beschrieben in Funk, et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2866–2871) stromaufwärts von der SV40-TATA-Box erhalten wurde. Die Konstruktion des auf den p53CON-Weg ansprechenden Promotors ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung beschrieben. RGC bezieht sich auf einen synthetischen auf den p53-Weg ansprechenden Promotor, wobei eine einzelne p53-Bindungsdomäne verwendet wird, die im ribosomalen Gencluster identifiziert wurde (Kern, et al. (1991) Science 252:1708–1711 und Park, et al. (1996) Mol. Carcinogenesis 16:101–108). Auf p53CON und RGC ansprechende Elemente können durch Zusammenlagerung von komplementären Oligonukleotide konstruiert werden, und auf p53 ansprechende Promotoren können durch Klonierung in Plasmid pGL3 Promotor-Luciferase-Vektor (von Promega kommerziell erhältlich) konstruiert werden (wie ausführlicher in Beispiel 3 beschrieben).
Der Ausdruck "Zielzelle" bezieht sich auf eine Zelle in einem bestimmten phänotypischen Zustand, deren Behandlung durch Verabreichung eines therapeutischen Transgens erwünscht ist. Durch den Einsatz verschiedener auf einen Weg (pathway) ansprechender Promotorelemente, kann man die Expression des Virus auf jede beliebige Zelle mit einem intakten Weg (pathway) ausrichten. Zum Beispiel kann der Repressor der viralen Replikation in einer neoplastischen Zielzelle durch Einsatz von Promotoren exprimiert werden, die auf den TGF-β- oder p53-Weg ansprechen. In ähnlicher Weise kann der Repressor der viralen Replikation in einer arthritischen Zielzelle durch einen auf Entzündung ansprechenden Promotor exprimiert werden, wobei der Vektor wahlweise für IL-10 kodiert.
Der Ausdruck "in funktionsfähiger Weise gekoppelt" bezieht sich auf eine Verbindung von Polynukleotidelementen in einer funktionellen Beziehung. Eine Nukleotidsequenz ist "in funktionsfähiger Weise gekoppelt", wenn sie in einer funktionellen Beziehung zu einer anderen Nukleotidsequenz platziert wird. Zum Beispiel ist ein Promotor oder Enhancer in funktionsfähiger Weise mit einer kodierenden Sequenz gekoppelt, wenn er die Transkription der kodierenden Sequenz beeinflusst. In funktionsfähiger Weise gekoppelt bedeutet, dass die gekoppelten Nukleotidsequenzen typischerweise aufeinanderfolgend verknüpft sind. Da jedoch Enhancer im allgemeinen funktionell sind, wenn sie vom Promotor durch mehrere Kilobasen getrennt sind, und intronische Sequenzen. von variabler Länge sein können, können manche Polynukleotidelemente in funktionsfähiger Weise gekoppelt sein, ohne sich direkt zu flankieren, und sie können sogar ausgehend von einem anderen Allel oder Chromosom in trans wirken.
Der Ausdruck "Repressor der viralen Replikation" bezieht sich auf ein Protein, das, falls es in einer bestimmten Zelle exprimiert wird, die virale Replikation wesentlich unterdrückt. Wie vom Fachmann erkannt wird, wird der Repressor der viralen Replikation von der Natur des ursprünglichen adenoviralen Vektors abhängen, von dem der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist. Zum Beispiel kann im Fall der adenoviralen Vektoren oder anderen DNA-Tumorviren das E2F-Rb-Fusionskonstrukt eingesetzt werden, wie es in der Europäischen Patentanmeldung 94108445.1, die am 6. Dezember 1995 (Publikations-Nr. 0 685 493 A1) veröffentlicht wurde, beschrieben ist. Das E2F-Rb-Fusionsprotein besteht aus den DNA-Bindungsdomänen und DP1-Heterodimerisierungsdomänen des humanen E2F-Transkriptionsfaktorproteins (Aminosäuren 95–286 des Wildtyp-E2F), die mit der wachstumsunterdrückenden Domäne von Rb (Aminosäuren 379–928 des Wildtyp-Rb-Proteins) fusioniert sind. Das E2F-Rb-Fusionsprotein ist ein potenter Repressor der. E2F-abhängigen Transkription und arretiert Zellen in der G1. Die DNA-Bindungsdomäne ist in den Aminosäuren 128–193 lokalisiert, und die Dimerisierungsdomäne in den Aminosäuren 194–289. Die Sequenz des humanen E2F-1-Proteins ist unter der Zugangsnummer M96577 (Hinterlegung am 10. August 1992) von Gen-Bank erhältlich. Die Sequenzen von anderen Mitglieder der E2F-Familie oder von E2F aus einer anderen Spezies kann eingesetzt werden, wenn ein Vektor für den Einsatz in anderen Spezies konstruiert wird. In einer Situation, in der das rekombinante Virus auf dem adeno-assozierten Virus (AAV) basiert, sind das rep-Protein und seine Derivate effektive Repressoren der viralen Replikation in Abwesenheit einer Adenovirus-Infektion. In einer Situation, in der das Virus vom Herpes simplex Virus abgeleitet ist, kann das ICPO-NX, eine verkürzte Form des unmittelbar frühen Proteins ICPO (Liun, et al. (1998) J. Virol. 72:7785–7795), als effektiver Repressor der viralen. Replikation eingesetzt werden. In ähnlicher Weise kann jedes Protein mit dominant negativer Aktivität als Repressor der viralen Replikation verwendet werden.
TGF-β und verwandte Proteine, einschließlich Activin, Inhibin und BMP sind potente, natürliche, antiproliferative Mittel, und es wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von Tumorgenizität spielen. In seiner bioaktiven Form ist TGF-β ein disulfid-verbrücktes Homodimer von 25 kDa und es wird praktisch in allen humanen Geweben exprimiert. Interessanterweise haben viele maligne Zelltypen das Expressionsmuster beibehalten, das in normalen Zellen beobachtet wird. TGF-β signalisiert mittels heteromerer Rezeptorkomplexe von Typ I- und Typ II-Serin/Threonin-Kinaserezeptoren. Von den zwei Rezeporkinasen besitzt der Typ II-Rezeptor eine intrinsische Kinaseaktivität, und bei Bindung an den TGF-β-Liganden heteromerisiert der Typ II-Rezeptor mit dem Typ I-Rezeptor und transphosphoryliert diesen. Die Phosphorylierung des Typ I-Rezeptors aktiviert seine Kinaseaktivität, welche wiederum zur Phosphorylierung von Smads führt, welche intrazelluläre Effektoren sind. Der phosphorylierte Typ I-Rezeptor überträgt Signale ins Innere der Zelle, was zu zellulären Reaktionen wie Wachstumsinhibierung führt. Es ist bekannt, dass die Smad-Komplexe, sobald sie im Nukleus sind, die Transkription von Zielgenen aktivieren, indem sie entweder selbst als Transkriptionsfaktoren wirken, oder indem sie die Aktivität von anderen Transkriptionsfaktoren regulieren. Transkriptionsfaktoren von denen angenommen wird, dass sie durch das TGF-β-Signal reguliert werden, umfassen CTF/NF-1, FAST-1, Sp1, Jun, SRF/TRF, Oct and CREB. Das Endergebnis dieser Interaktionen führt zu den verschiedenen bekannten pleiotropen Effekten von TGF-β.
Transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β) und verwandte Proteine sind potente Inhibitoren der Proliferation von vielen Zelltypen. Die maligne Progression von mehreren Tumoren epithelialen und hämatopoetischen Ursprungs korreliert mit dem Verlust der anti-proliferativen und anti-invasiven Wirkung von TGF-β. Es wurde gezeigt, dass ein Versagen des TGF-β-Signalwegs auf Mutationen oder Deletionen beruht oder auf fehlender Ex pression der Rezeptoren und/oder der intrazellulären Effektoren des Signalübertragungswegs. Viele maligne Tumoren, die gegen TGF-β resistent sind, sind auch in mehrfacher Hinsicht defekt für andere Tumorsuppressor-Gene, wodurch der Nutzen des Ersatzes der Tumorsuppressor-Gene für eine effektive Therapie begrenzt wird.
Auf den TGF-β-Weg ansprechende Promotoren wurden konstruiert, indem Sequenzen vom Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-Promotor) oder Bindungsstellen für Smad4/DPC4 (SRE-Promotor) stromaufwärts von der SV40-TATA-Box eingeführt wurden. Die Aktivitäten von diesen Promotoren wurden in transienten Transfektionsassays bewertet, wobei Luciferase als Reporter verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 2 dargestellt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass diese beiden Promotoren nur in den Zellen aktiv sind, die eine funktionelle TGF-β-Signaltransduktion haben. In einer Zellinie mit defektem TGF-β-Weg, wie zum Beispiel MDA-MB468, die aufgrund einer homozygoten Deletion von Smad4/DPC4 im Hinblick auf die TGF-β-Signaltransduktion defekt ist, wurde die Aktivität der beiden oben genannten auf Wege ansprechende Elemente durch Transfektion mit einem PAI-Promotor oder einem SRE-Promotor, der in funktionsfähiger Weise mit Luciferase gekoppelt war, und Infektion mit einem rekombinanten für Sma4 kodierenden Adenovirus wiederhergestellt, was die Spezifität dieser beiden Promotoren, die auf einen Weg (pathway) ansprechende Elemente enthalten, für den TGF-β-Weg weiter bestätigt, wie durch die in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführten Daten gezeigt wird.
Ein Plasmid, das den PAI-Promotor in funktionsfähiger Weise mit E2F-Rb gekoppelt enthielt, wurde dann konstruiert und auf seine Fähigkeit untersucht, den E2-Promotor selektiv in Zellen mit intaktem TGF-β-Weg zu unterdrücken. In transienten Transfektionsassays zeigte eine Co-Transfektion des E2-Promotors, der in funktionsfähiger Weise. mit Luciferase gekoppelt war, und des PAI-Promotors, der in funktionsfähiger Weise mit E2F-Rb gekoppelt war, eine selektive Unterdrückung der E2-Promotoraktivität in 293-Zellen (mit normalem TGF-β-Weg) und nicht in MDA-MB468-Zellen (mit defektem TGF-β-Weg), wie es in Tabelle 4 gezeigt wird, was auf der selektiven Expression von E2F-Rb in 293-Zellen beruht. Wie erwartet ergab die Co-Transfektion mit CMV-E2F-Rb, das E2F-Rb in beiden Zellinien exprimiert, in. beiden Zellinien eine Inhibition der Aktivität des E2-Promotors.
Auf den p53-Weg ansprechende Promotoren wurden konstruiert, indem bekannte p53-Bindungsstellen entweder aus dem ribosomalen Gencluster (RGC-Promotor) oder hochaffine p53-Bindungsstellen (p53CON-Promotor) eingeführt wurden. Die Akti vitäten dieser Promotoren wurden in transienten Transfektionsassays bewertet, wobei Luciferase als Reporter verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der nachfolgenden Tabelle 5 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigten, dass diese beiden Response-Elemente in Zellen mit funktionellem p53 aktiv sind. Um zu bestätigen, dass die auf den p53-Weg ansprechende Promotoraktivität auf funktionellem p53 beruht, wurden zwei Zellinien, WIDR und U87, mit einem RGC-Promotor, der die Expression des Luciferase-Gens steuert, und entweder mit einem Adenovirus-Vektor mit leerer Kassette als. Kontrolle (ZZCB) oder mit einem rekombinanten Adenovirus, das p53 konstitutiv unter Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert (FTCB), co-transfiziert. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Tabelle 6 gezeigt.
Wie aus den gezeigten Daten ersichtlich, steigt die Aktivität des auf den p53-Weg ansprechenden Promotors dosisabhängig und mit steigender p53-Aktivität.
Rekombinante Adenovirus-Vektoren wurden hergestellt, welche die für das E2F-Rb-Fusionsprotein kodierende Sequenz entweder unter der Kontrolle eines auf den TGF-β-Weg ansprechenden Promotors (PAI oder SRE) oder eines auf den p53-Weg ansprechenden Promotors (RGC oder p53CON) enthalten. Zusätzlich wurde das für das grün fluoreszierende Protein kodierende Gen als Reporter in die Vektoren eingefügt. Die resultierenden Viren wurden in Assays, die auf die cytopathische Wirkung gerichtet sind (CPE), im Hinblick auf ihre Fähigkeit untersucht, sich selektiv in Zellen zu. replizieren und diese abzutöten, wenn diese entweder im TGF-β- oder im p53-Weg defekt waren. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 1 der beigefügten Zeichnungen gezeigt. In MRC9 (positiv in Bezug auf den p53-Weg und positiv in Bezug auf den TGF-β-Weg) war der Wildtyp des Adenovirus in der Lage, sich zu replizieren und sogar bei niedrigen Konzentrationen (1 × 10⁶ Partikel/ml) eine cytopathische Wirkung zu induzieren, während die auf TGF-β-Weg oder p53-Weg ausgerichtete Vektoren nicht in der Lage waren, eine cytopathische Wirkung bei dieser Konzentration zu induzieren. Nur bei der höchsten verwendeten Dosis (1 × 10⁸ Partikel/ml), ergaben die auf einen Weg (pathway) ausgerichteten Vektoren eine geringe cytopathische Wirkung. Im Gegensatz dazu waren die auf einen Weg (pathway) ansprechenden Vektoren in Zellinien wie WIDR (defekt sowohl im p53- als auch im TGF-β-Weg) und Hep3B (p53 Null und in Abwesenheit von exogenem TGF-β defekt im TGF- β-Weg) bei der Induktion einer cytopathischen Wirkung effektiv, ähnlich wie der Wildtyp des Virus, sogar bei niedrigen Konzentrationen (1 × 10⁶ Partikel/ml). Fluoreszenzmikroskopie von Hep3B-Zellen, die mit Vektoren infiziert waren, welche auf einen Weg (pathway) ansprechen (SRE-Ad und p53CON-Ad), zeigten ein hohes Niveau bei der Expression des Transgens und bei der Ausbreitung des Virus in der Kultur, sogar bei Infektion mit einer niedrigen Partikelkonzentration (1 × 10⁵ Partikel/ml, exponiert für zwei Stunden). Im Gegensatz dazu zeigten Hep3B-Zellen, die mit dem replikationsdefekten (Deletion von E1A) GFP-kodierenden Adenovirus (GFCB) in der gleichen Konzentration (1 × 10⁵ Partikel/ml) infiziert wurden, keine GFP-Expression.
Wie bereits angedeutet sind die Vektoren der vorliegenden Erfindung zur selektiven Replikation befähigt, sowie zur Lyse der Zielzelle unter selektiven Bedingungen. Dies soll jedoch nicht bedeuten, dass nicht noch zusätzliche Ebenen von Selektivität oder Toxizität in diesen Vektoren eingebracht werden können. Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus rekom binante Adenoviren bereit, die zusätzliche Modifikationen des viralen Genoms aufweisen, wie zum Beispiel Modifikationen für das Targeting, transgene Expressionskassetten oder Modifikationen des viralen Genoms, um die selektive Replikation in einem bestimmten Zelltyp oder in einem bestimmten phänotypischen Zustand zu ermöglichen.
Der Ausdruck "Modifikation für das Targeting" bezieht sich auf Modifikationen des viralen Genoms, die so konstruiert sind, dass sie zu einer bevorzugten Infektiosität eines besonderen Zelltyps führen. Eine Spezifität für einen Zelltyp oder ein auf einen Zelltyp ausgerichtetes Targeting kann auch durch Modifikation des viralen Hüllproteins in Vektoren erreicht werden, die von Viren abgeleitet sind, welche charakteristischerweise breite Infektiositäten aufweisen, wie zum Beispiel das Adenovirus. Ein Zell-Targeting wurde zum Beispiel bei adenoviralen Vektoren durch selektive Modifikation der viralen genomischen Sequenzen erreicht, die für Knob und Fiber kodieren, um die Expression modifizierter Knob- und Fiberdomänen zu erreichen, welche eine spezifische Wechselwirkung mit einzigartigen Zelloberflächenrezeptoren aufweisen. Beispiele für solche Modifikationen sind beschrieben in Wickham, et al. (1997) J. Virol. 71 (11):8221–8229 (Einführung von RGD-Peptiden in adenovirale Fiberproteine); Arnberg, et al. (1997) Virology 227:239–244 (Modifikation von adenoviralen Fibergenen, um Tropismus für das Auge und den Genitaltrakt zu erreichen); Harris und Lemoine (1996) TIG 12 (10):400–405; Stevenson, et al. (1997) J. Virol. 71 (6):4782–4790; Michael, et al. (1995) Gene Therapy 2:660–668 (Einführung eines Gastrinfreisetzenden Peptidfragments in adenovirale Fiberproteine); und Ohno, et al. (1997) Nature Biotech. 15:763–767 (Einführung der Protein A-IgG-bindenden Domäne in Sindbis Virus). Andere Verfahren zum Erreichen eines zellspezifischen Targetings wurden durch die Konjugation von Antikörpern oder Antikörperfragmenten an die Hüllproteinen realisiert (vgl. zum Beispiel Mi chael, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 6866–6869, Watkins, et al. (1997) Gene Therapy 4: 1004–1012; Douglas, et al. (1996) Nature Biotech. 14: 1574–1578). Alternativ dazu können bestimmte. Gruppen an die virale Oberfläche konjugiert werden, um ein Targeting zu erreichen (vgl. zum Beispiel Nilon, et al. (1996) Gene Therapy 3:280–286, Konjugation von EGF an retrovirale Proteine). Diese rekombinant modifizierten Vektoren können in Übereinstimmung mit der Ausführung der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Der Ausdruck "Transgen-Expressionskassette" bezieht sich auf einen in der Zielzelle funktionellen Promotor, der in funktionsfähiger Weise mit einem therapeutischen Transgen gekoppelt ist. Der Ausdruck Promotor bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, welche sich auf die Transkription einer anderen Nukleotidsequenz auswirken. Beispiele für Promotoren umfassen schwache konstitutive Promotoren, temporäre virale Promotoren oder regulierbare Promotoren.
Der Ausdruck "temporäre Promotoren" bezieht sich auf Promotoren, welche die Transkription oder die Expression therapeutischer Transgene im Vergleich zum Promotor, der die Expression des auf den Weg (pathway) ansprechenden Promotors kontrolliert, zu einem späteren Zeitpunkt im viralen Lebenszyklus aktivieren. Beispiele für derartige temporär regulierte Promotoren umfassen den adenoviralen "major late promotor" (MLP), und andere Promotoren, wie zum Beispiel E3. In der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung wird der MLP-Promotor eingesetzt. Bei Herpes simplex-Viren könnten die latent Aktivierten Promotoren verwendet werden.
Der Ausdruck "regulierbarer Promotor" bezieht sich auf induzierbare Promotoren, gewebsspezifische Promotoren oder tumorspezifische Promotoren. Der Ausdruck "induzierbarer Promotor" bezieht sich auf Promotoren, welche die Transkription des therapeutischen Transgens bevorzugt (oder ausschließlich) unter gewissen Bedingungen ermöglichen und/oder in Reaktion auf externe chemische oder andere Stimuli. Beispiele für induzierbare Promotoren sind in der wissenschaftlichen Literatur bekannt (vgl. zum Beispiel Yoshida und Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426–430; Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054–6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol. 71(9):7128–7131; Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17 (9):5097–5105; und Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(46):29364–29371). Beispiele für durch Strahlung induzierbare Promotoren werden in Manome, et al. (1998) Human Gene Therapy 9:1409–1417, beschrieben. Eine. zusätzliche Ebene der Selektivität kann durch den Einsatz von gewebs- oder tumorspezifischen Promotoren vermittelt werden. Gewebs- und tumorspezifische Promotoren sind dem Fachmann wohl bekannt und umfassen Promotoren, die bevorzugt in glatten Muskeln aktiv sind (α-Aktin-Promotor), oder pankreasspezifische (Palmiter, et al. (1987) Cell 50:435), leberspezifische (Rovet, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2075; Lemaigne, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:19896; Nitsch, et al. (1993) Mol. Cell. Biol. 13: 494), magenspezifische (Kovarik, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:9917), hypophysenspezifische (Rhodes, et al. (1993) Genes Dev. 7:913), prostataspezifische, etc.
Der Ausdruck "therapeutisches Transgen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in der Zielzelle eine therapeutischen Wirkung erzielt. Der Ausdruck therapeutisches Transgen umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) Tumorsuppressor-Gene, antigenische Gene, zytotoxische Gene, zytostatische Gene, Pro-Wirkstoff aktivierende Gene, apoptotische Gene, pharmazeutische Gene oder anti-angiogene Gene. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um ein oder mehrere therapeutische Transgene zu produzieren, entweder im Tandem durch die Verwendung von IRES-Elementen oder durch unabhängig regulierte Promotoren.
Der Ausdruck "Tumorsuppressor-Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in der Zielzelle in der Lage ist, den neoplastischen Phänotyp zu unterdrücken und/oder eine Apoptose zu induzieren. Beispiele für Tumorsuppressor-Gene, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen das p53-Gen, das APC-Gen, das DPC-4/Smad4-Gen, das BRCA-1-Gen, das BRCA-2-Gen, das WT-1-Gen, das Retinoblastom-Gen (Lee, et al. (1987) Nature 329:642), das MMAC-1-Gen, das adenomatöse Polyposis coli Protein (Albertsen, et al., US Patent 5,783,666, erteilt am 21. Juli 1998), das in Kolonkarzinomen deletierte (DCC) Gen, das MMSC-2-Gen, das NF-1-Gen, das Tumorsuppressor-Gen des nasopharyngialen Karzinoms, das auf Chromosom 3p21.3 kartiert ist (Cheng, et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. 95:3042–3047), das MTS1-Gen, das CDK4-Gen, das NF-1-Gen, das NF-2-Gen und das VHL-Gen.
Der Ausdruck "antigenische Gene" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in der Zielzelle zur Produktion eines antigenischen Zellobeflächenproteins führt, das in der Lage ist, durch das Immunsystem erkannt zu werden. Beispiele für antigenische Gene umfassen das karzinoembryonische Antigen (CEA) und p53 (wie beschrieben in Levine, A. PCT Internationale Veröffentlichung WO 94/02167, veröffentlicht am 3. Februar 1994). Um die Immunerkennung zu ermöglichen, kann das antigenische Gen mit dem MHC Klasse I Antigen fusioniert werden.
Der Ausdruck "zytotoxisches Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle einen toxischen Effekt bewirkt. Beispiele für solche zytotoxischen Gene umfassen Nukleotidsequenzen, die für das Exotoxin von Pseudomonas, das Ricin-Toxin, das Diphterie-Toxin und dergleichen kodieren.
Der Ausdruck "zytostatisches Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle einen Arrest im Zellzyklus bewirkt. Beispiele für solche zytostatische Gene umfassen p21, das Retinoblastom-Gen, das gen für das E2F-Rb-Fusionsprotein, Gene, welche Cyclin-abhängige Kinaseinhibitoren kodieren, wie zum Beispiel p16, p15, p18 und p19, das Gen für die Homeobox (GAX), welche für einen Wachstumsarrest spezifisch ist, beschrieben in Branellec, et al. (PCT-Publikation WO 97/16459, veröffentlicht am 9. Mai 1997, und PCT-Publikation WO 96/30385, veröffentlicht am 3. Oktober 1996).
Der Ausdruck "Cytokin-Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle ein Cytokin erzeugt. Beispiele für solche Cytokine umfassen GM-CSF, die Interleukine, insbesondere IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, Interferone der Subtypen α, β und γ, insbesondere Interferon α-2b und Fusionen, wie zum Beispiel Interferon α-2α-1.
Der Ausdruck "Chemokin-Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle ein Chemokin erzeugt. Der Ausdruck "Chemokin" bezieht sich auf eine Gruppe von strukturell verwandten Cytokin-Faktoren mit niedrigem Molekulargewicht, die von Zellen ausgeschieden werden, strukturell verwandt sind, und mitogene, chemotaktische oder inflammatorische Aktivitäten aufweisen. Es sind meist kationische Proteine mit 70 bis 100 Aminosäureresten, die vier konservierte Cystein-Reste gemeinsam haben. Diese Proteine können basierend auf dem Abstand der beiden aminoterminalen Cysteine in zwei Gruppen unterteilt werden. In der ersten Gruppe sind die beiden Cysteine durch eine einzige Aminosäure getrennt (C-x-C), während sie in der zweiten Gruppe direkt benachbart sind (C-C). Beispiele für Mitglieder der 'C-x-C' Chemokine umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) den Blutplättchenfaktor 4 (PF4), das basisches Blutplättchenprotein (PBP), Inter leukin-8 (IL-8), das die Wachstumsaktivität von Melanomen stimulierende Protein (melanoma growth stimulatory activity protein, MGSA), das Makrophagen inflammatorische Protein 2 (MIP-2), Maus-Mig (m119), Hühner-9E3 (oder pCEF-4), porcine alveolare Makrophagen-chemotaktische Faktoren I und II aus dem Schwein (AMCF-I und -II), Prä-B-Zellen wachstumsstimulierender Faktor (PBSF) und IP10. Beispiele für Mitglieder der 'C-C' Gruppe umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Monozyten chemotaktisches Protein 1 (MCP-1), Monozyten chemotaktisches Protein 2 (MCP-2), Monozyten chemotaktisches Protein 3 (MCP-3), Monozyten chemotaktisches Protein 4 (MCP-4), Makrophagen inflammatorisches Protein 1 α (MIP-1-α), Makrophagen inflammatorisches Protein 1 β (MIP-1-β), Makrophagen inflammatorisches Protein 1 γ (MIP-1-γ), Makrophagen inflammatorisches Protein 3 α (MIP-3-α), Makrophagen inflammatorisches Protein 3 β (MIP-3-β), Chemokin (ELC), Makrophagen inflammatorisches Protein 4 (MIP-4), Makrophagen inflammatorisches Protein 5 (MIP-5), LD78 β, RANTES, SIS-epsilon (p500), Thymus und aktivierungsregulierte Chemokine (TARC), Eotaxin, I-309, humanes Protein HCC-1/NCC-2, humanes Protein HCC-3 und das murine Protein C10.
Der Ausdruck "pharmazeutisches Protein-Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression zur Produktion eines Proteins führt, das eine pharmazeutische Wirkung in der Zielzelle hat. Beispiele für solche pharmazeutischen Gene umfassen das Proinsulin-Gen und Analoga (wie in der PCT Internationalen Patentanmeldung WO 98/31397 beschrieben), das Wachstumshormon-Gen, Dopamin, Serotonin, epidermaler Wachstumsfaktor, GABA, ACTH, NGF, VEGF (zur Erhöhung der Blutperfusion zum Zielgewebe, zur Induktion der Angiogenese, PCT-Publikation WO 98/32859, die am 30. Juli 1998 veröffentlicht wurde), Thrombospondin, etc.
Der Ausdruck "pro-apoptotisches Gen" bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle zum program mierten Zelltod führt. Beispiele für pro-apoptotische Gene umfassen p53, adenovirales E3-11.6K (von Ad2 abgeleitet) oder adenovirales E3-10.5K (von Ad abgeleitet), das adenovirale E4ordf4-Gen, Gene des p53-Weg, und Gene, die für Caspasen kodieren.
Der Ausdruck "Pro-Wirkstoff aktivierende Gene" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, deren Expression in einer Zelle zur Produktion eines Proteins führt, das in der Lage ist, eine nicht-therapeutische Verbindung in eine therapeutische Verbindung umzuwandeln, welche die Zelle für das Abtöten durch externe Faktoren empfindlich macht oder einen toxischen Zustand in der Zelle verursacht. Ein Beispiel für ein Pro-Wirkstoff aktivierendes Gen ist das Cytosin-Deaminase-Gen. Cytosin-Deaminase wandelt 5-Fluorcytosine (5-FC) in 5-Fluoruracil (5-FU) um, ein potentes Antitumor-Mittel. Die Lyse der Tumorzelle ergibt eine lokale Häufung von Cytosin-Deaminase, die in der Lage ist, 5-FC an einer Stelle des Tumors in 5-FU umzuwandeln, was zum Abtöten vieler umgebender Tumorzellen führt. Dies führt zum Abtöten einer großen Zahl von Tumorzellen, ohne die Notwendigkeit, diese Zellen mit einem Adenovirus zu infizieren (der sogenannte "Bystander Effekt"). Zusätzlich kann das Thymidin-Kinase (TK)-Gen eingesetzt werden (vgl. zum Beispiel Woo, et al. US Patent No. 5, 631, 236, erteilt am 20. Mai 1997, und Freeman, et al. US Patent 5,601,818, erteilt am 11. Februar 1997), wobei Zellen, die das TK-Genprodukt exprimieren für das Abtöten durch die Verabreichung von Gangcyclovir empfindlich werden.
Der Ausdruck "anti-angiogene Gene" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, deren Expression in der Zelle zur extrazellulären Sekretion von anti-angiogenen Faktoren führt. Antiangiogene Faktoren umfassen Angiostatin, Inhibitoren des vaskulären, endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), wie zum Bei spiel Tie 2 (wie in PNAS (USA) (1998) 95: 8795–8800, beschrieben) und Endostatin.
Für den Fachmann wird ersichtlich sein, dass Modifikationen und/oder Deletionen in den oben genannten Genen, bei denen funktionelle Subfragmente des Wildtyp-Proteins kodiert werden, problemlos zur Ausführung der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können. Zum Beispiel umfasst die Erwähnung des p53-Gens nicht nur das Wildtyp-Protein, sondern auch modifizierte p53-Proteine. Beispiele für solche modifizierten p53-Proteine umfassen Modifikationen von p53, um die Verweilzeit im Kern zu erhöhen, Deletionen, wie zum Beispiel die Δ13-19-Aminosäuren, um die Konsensus-Spaltsequenz für Calpain zu entfernen, Modifikationen der Oligomerisierungsdomänen (wie in Branco, et al. veröffentlichte PCT Anmeldung WO 97/0492 oder in US Patent No. 5,573,925 beschrieben).
Für den Fachmann wird ersichtlich sein, dass die oben genannten therapeutischen Gene ins Medium ausgeschieden oder an bestimmten intrazellulären Stellen lokalisiert werden können, indem eine zielweisende Gruppe (targeting moiety), wie zum Beispiel ein Signalpeptid oder ein nukleäres Lokalisierungssignal (NLS) verwendet wird. Die Definition therapeutische Transgene umfasst auch Fusionsproteine des therapeutischen Transgens mit dem Strukturprotein VP22 des Herpes simplex Virus vom Typ 1 (HSV-1). Wenn Fusionsproteine, die das VP22-Signal enthalten, in einer infizierten Zelle exprimiert werden, werden sie aus der infizierten Zelle exportiert und dringen effizient in umgebende, nichtinfizierte Zellen ein, was eine Region mit einem Durchmesser von ca. 16 Zellen betrifft. Dieses System ist in Kombination mit transkriptionell aktiven Proteinen (zum Beispiel p53) besonders nützlich, da die Fusionsproteine effizient in die Zellkerne benachbarter Zellen transportiert werden. Vgl. zum Beispiel Elliott, G. & O'Hare, P. Cell 88: 223–233: 1997; Marshall, A. & Castellino, A. Rese arch News Briefs. Nature Biotech. 15: 205: 1997; O'Hare, et al. PCT-Veröffentlichung WO 97/05265, die am 13. Februar 1997 veröffentlicht wurde. Eine ähnliche zielweisende Gruppe, die von einem Tat-Protein von HIV abgeleitet ist, wird. auch von Vives, et al. (1997) in J. Biol. Chem. 272: 16010–16017 beschrieben.
Zusätzliche Modifikationen zur Erhöhung der Potenz der erfindungsgemäßen Vektoren umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Änderungen innerhalb von E1, die Einführung von Mutationen in E4 zur Erhöhung der Zytotoxizität (Muller, et al. (1992) J. Virol. 66: 5867–5878), Hochregulation der viralen Todesproteine (death proteins), wie zum Beispiel die E4orf4- oder E3 11.6K-Proteine.
In der bevorzugten Ausführung der Erfindung, die vorliegend beispielhaft dargestellt ist, umfasst der Vektor der vorliegenden Erfindung einen sich bedingt replizierendes Adenovirus, der einen auf den p53- oder TGF-β-Weg ansprechenden Promotor enthält, welcher die Expression des E2F-Rb-Fusionsproteins steuert, und zusätzlich das Cytosin-Deaminase-Gen unter Kontrolle des temporären E3-Promotors umfasst. Unter diesen Voraussetzungen wird die Cytosin-Deaminase nur nach viraler Replikation in Tumorzellen produziert. In der bevorzugten Ausführung der Erfindung, ist das Pro-Wirkstoff aktivierende Gen unter der Kontrolle eines relativ schwachen, oder gewebsspezifischen oder tumorspezifischen Promotors.
In einer anderen Ausführung der Erfindung umfasst der Vektor ein rekombinantes Adenovirus mit einem auf den p53- oder TGF-β-Weg ansprechenden Promotor, der die Expression des E2F-Rb-Fusionsproteins steuert, und eine Transgen-Expressionskassette, welche Cytosin-Deaminase allein oder in einer bicistronischen Expressionskassette exprimiert, welche Cytosin-Deaminase und das IRES-Element und das MIP-3-alpha Protein enthält. Da die Cytosin-Deaminase exprimiert wird, wird Zellabtötung nach Verabreichung eines Pro-Wirkstoffs, wie zum Beispiel 5-Fluorcytosine, erreicht. Die Expression von MIP-3-alpha auf niedrigem Niveau wird bei der Entwicklung von Antitumor-Immunität helfen.
Kaskaden mit mehreren Ebenen, multifunktionelle Kaskaden oder auf mehrere Wege (pathways) ansprechende Kaskaden werden vorliegend in austauschbarer Weise verwendet, um die Konstruktion eines auf einen Weg (pathway) ansprechenden Elements zu beschreiben, um so eine therapeutische Wirkung zu produzieren, wobei mehr als ein Weg (pathway) simultan untersucht werden kann. Für den Fachmann wird ersichtlich sein, dass die oben beschriebenen Vektor-Kontrollelemente kombiniert werden können, um den Vektoren der vorliegenden Erfindung mehrere Selektivitätsebenen zu verleihen. Als ein Beispiel für die Kontrolle auf mehreren Ebenen wäre es möglich, ein sich bedingt replizierendes Adenovirus zu konstruieren, das sich replizieren und Zellen abtöten kann, die entweder im Rb-, TGF-β- oder p53-Weg einen Defekt aufweisen. Ein solcher Vektor würde als eine erste Kontrollebene die Expression eines dominant negativen Inhibitors der viralen Replikation einschließen, welcher durch einen auf den p53-Weg ansprechenden Promotor kontrolliert wird. Als Ergebnis wird in jeder beliebigen Zelle (wie zum Beispiel in normalen Zellen) mit funktionellem p53, aber nicht in Zellen mit inaktivem p53, der dominant negative Inhibitor exprimiert und die virale Replikation wird blockiert. Dieser Vektor kann sich jedoch in Tumorzellen replizieren, die funktionelles p53 haben, aber Defekte in anderen Wegen (pathways) aufweisen, wie zum Beispiel im TGF-β- und Rb-Weg. Deshalb können zusätzliche Kontrollebenen eingeführt werden, die im wesentlichen das funktionelle p53 in Tumorzellen inaktivieren, wodurch die virale Replikation erlaubt wird, wenn andere Wege defekt sind.
Als eine zweite Kontrollebene könnte der gleiche Vektor auch eine Expressionskassette enthalten, die das adenovirale E1B-55K Protein enthält, das p53 funktionell inaktivieren kann, und das unter Kontrolle eines Promotors steht, der nur in Zellen mit einem defekten TGF-β-Weg aktiv ist. Ein Promotor, der nur in Zellen mit einem defekten TGF-β-Weg aktiv ist, kann durch die Einführung von Repressor-Bindungsstellen innerhalb des Promotors konstruiert werden, so dass die Expression des Repressors unter Verwendung eines auf den TGF-β-Weg ansprechenden Promotors anderswo im Vektor zur Blockade der Promotor-Aktivität in Zellen mit intaktem TGF-β-Signalweg führt. Auf der anderen Seite wird der Repressor in Zellen, in denen der TGF-β-Weg defekt ist, nicht synthetisiert, und somit wird der Promotor aktiv sein. Wegen der Expression von E1B-55K durch diesen Promotor, der nur in Zellen aktiv ist, deren TGF-β-Weg defekt ist, wird endogenes p53 inaktiviert. Alternativ dazu kann jeder beliebige natürliche Promotor verwendet werden, der durch den TGF-β-Signalweg herunterreguliert wird. Die Einbeziehung der beiden oben genannten Expressionskassetten wird absichern, dass der dominant negative Inhibitor nur dann exprimiert wird, wenn sowohl der p53- als auch der TGF-β-Weg normal sind (was zur Blockade der Replikation führt), aber nicht wenn einer oder beide defekt sind (was zur viralen Replikation führt).
Als eine dritte Kontrollebene wird im gleichen Vektor die Expression eines Proteins, wie zum Beispiel Smad7 oder jede beliebige andere dominant negative Form von Smad erreicht, die in der Lage ist, den TGF-β-Weg zu inaktivieren (Nakao, et al., Nature 1997, Okt. 9; 389 (6651): 631–635), welcher durch einen auf E2F ansprechenden Promotor kontrolliert wird. Ein auf E2F ansprechender Promotor (wie zum Beispiel der E2F1-Promotor, der E2-Promotor oder ein synthetischer Promotor mit mehreren E2F-Bindungsstellen stromaufwärts von einem minimalen Promotor, wie zum Beispiel der SV40-TATA-Box) ist aktiv, wenn der Rb-Weg defekt ist. Wegen dieser dritten Kontrollebene wird Smad7 in Zellen exprimiert, die einen defekten Rb-Weg haben, was wiederum Smad4 inaktiviert und die TGF-β-Signaltransduktion blockiert. Deshalb wird E1B-55K hergestellt und p53 wird inaktiviert, was zum Ausfall der Expression des dominant negativen Inhibitors führt. Deshalb kann die virale Replikation ungehindert fortschreiten. Auf der anderen Seite wird Smad7 nicht synthetisiert, wenn der Rb-Weg normal ist, wodurch die TGF-β-Signaltransduktion normal verläuft. Somit wird kein E1B-55K erzeugt, was zu funktionellem p53 führt, das in der Lage ist, den dominant negativen Inhibitor zu exprimieren, um die virale Replikation zu blockieren.
Mit den drei oben beschriebenen Kontrollebenen wird ein Defekt in einer beliebigen oder in zweien oder in allen drei Wegen (Rb, TGF-β und p53) schließlich zur viralen Replikation und zur Zelllyse führen. Die virale Replikation wird nur dann nicht eintreten, wenn alle drei Wege funktionstüchtig sind, wie es in normalen Zellen der Fall ist.
Wie vom Fachmann erkannt werden wird, können die Vektoren der vorliegenden Erfindung in vielen Abwandlungen verwendet werden, das heißt für den Nachweis und die Behandlung einer breiten Vielfalt von Defekten in einem Weg (pathway), wobei eine Vielzahl von auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotoren verwendet werden kann. In der vorliegend beispielhaft dargestellten Ausführung der Erfindung wird der rekombinante adenovirale Vektor jedoch von der Gattung Adenoviridae abgeleitet. Besonders bevorzugte Viren werden vom humanen Adenovirus Typ 2 oder Typ 5 abgeleitet. Wenn ein adenoviraler Vektor als Ausgangsvektor verwendet wird, ist der bevorzugte Inhibitor der viralen Replikation das E2F-Rb-Fusionsprotein.
In der bevorzugten Ausführung der Erfindung ist es bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren zur Behandlung von Krankheiten mit unkontrollierter Zellproliferation bevorzugt, dass ein adenoviraler Vektor eingesetzt wird, der spezifische Deletionen in der E1A-Region aufweist, um so die Fähigkeit des E1a-Genprodukts zu eliminieren, an die p300- und die Rb-Proteine zu binden, wobei die transaktivierende Funktion der E1A CR3-Domäne erhalten bleibt. Die erfindungsgemäßen Vektoren weisen Deletionen in der für E1a kodierenden Sequenz auf, um Bindungsstellen für p300 und p105-Rb in der für 13S kodierenden Sequenz zu eliminieren. In der bevorzugten Ausführung der Erfindung werden die Deletionen für die p300-Bindung durch Deletionen der Aminosäuren von etwa 4 bis etwa 25 oder von etwa 36 bis etwa 49 realisiert.
Die Deletionen in der für E1a289R kodierenden Sequenz, die erforderlich sind, um die p300- und Rb-Bindung zu eliminieren, sind bevorzugt so klein wie möglich, um eine bedeutende Störung der Sekundär- und Tertiär-Struktur des E1a289-Proteins zu verhindern. Um die p300-Bindung zu eliminieren, wird es bevorzugt, dass eine Mutation in die DNA-Sequenz eingeführt wird, welche für die p300-Bindungsdomäne von 289R kodiert. Deletionen von weniger als etwa 30 Aminosäuren in der C-terminalen Region sind zur Eliminierung der p300-Bindung bevorzugt, obwohl kleinere Modifikationen stärker bevorzugt sind. Zum Beispiel ist alternativ dazu eine Deletion der Aminosäuren 4 bis 25 (411101), von etwa Aminosäure 30 bis Aminosäure 49 (411103) und insbesondere von 36 bis 49 bevorzugt, um die p300-Bindung zu eliminieren. Punktmutationen, die ausreichen, um die p300-Bindung zu zerstören, sind besonders bevorzugt. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass eine Punktmutation in der zweiten Aminosäure im 289R Protein von Arginin zu Glycin (Arg2 → Gly2) die p300-Bindung zerstören kann (vgl. zum Beispiel pm563, Whyte, et al. (1989) Cell 56: 67–75). In ähnlicher Weise werden minimale Modifikationen bezüglich der Eliminierung der pRb105-Bindung bevorzugt. Eliminierung von ausgewählten Aminosäuren in der pRb105-Bindungsdomäne, wie zum Beispiel Aminosäuren 111–123 (dl1107) und Aminosäuren 124–127 (dl1108) sind bevorzugt. Die Deletion der Aminosäuren 111–123 (dl1107) ist besonders bevorzugt, da sie die p107-Bindungsaktivität des 289R Proteins erhält.
Zusätzlich kann die Eliminierung der Aminosäuren von etwa 219 bis 289 des E1a 289R-Proteins und 173 bis 243 des E1A 243R-Proteins eingeführt werden. Zum Beispiel wird durch Einführung einer Punktmutation an einer Position, die der Position 1131 im humanen Ad5-Genom (d.h. Änderung des Cytosins¹¹³¹ zu einem Guanin) entspricht, ein Stop-Codon gebildet. Diese Mutation resultiert in der Eliminierung der Aminosäuren 219 bis 289 des E1a 289R-Proteins und 173 bis 243 des E1A 243R-Proteins. Diese Mutation kann wahlweise zusätzlich zu den oben beschriebenen Deletionen in der Rb- und p300-Bindung gemacht werden. Zusätzliche Beispiele für solche Ausgangsvektoren sind in den parallel anhängigen US Patentanmeldungen mit den Seriennummern 60/104,317 und 08/09/172,684 beschrieben, die am 15. Oktober 1998 eingereicht wurden.
In der bevorzugten Ausführung der Erfindung ist das therapeutische Gen einen Pro-Wirkstoff aktivierendes Gen, zum Beispiel Cytosin-Deaminase. In der bevorzugten Ausführung der Erfindung kodiert der Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung MIP-3-alpha, um eine Antitumor-Immunität zu induzieren.
Bevorzugte Promotoren für die Expression des therapeutischen Gens sind die temporären Promotoren, wie zum Beispiel MLP und E3.
In adenoviralen Konstrukten wird die Eliminierung oder Verzögerung der Wirkung des AD E3-11.6K Proteins erreicht, um die durch den Adenovirus induzierte Zelllyse solange zu minimieren, bis die virale Replikation eingetreten ist. Insbesondere wäre die Eliminierung des nativen E3-11.6K/10.5K Gens bevorzugt. Dies würde die Immunantwort bis nach dem Auftreten der initialen Runde der lokalen Ausbreitung minimieren. Die Immunantwort wäre zu diesem späteren Zeitpunkt, wenn die Apoptose der initial infizierten Zellen erreicht wird, und die lokale Ausbreitung des Virus ermöglicht wird, vorteilhaft. Das 11.6K Protein (oder das entsprechende E3-10.5K Protein von Ad5) ist ein pro-apoptotisches Gen und kann verwendet werden, um die Zellabtötung in Tumorzellen zu erreichen. Da man jedoch anstrebt, dass die frühe Lyse der Zielzelle verzögert wird, um virale Replikation zu maximieren, ist es bevorzugt, dass das 11.6K/10.5K-Gen unter Kontrolle eines temporären Promotors gestellt wird, wie zum Beispiel des MLP-Promotors, um den Beginn seines apoptotischen Effekts zu verzögern.
Pharmazeutische Formulierungen
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung des rekombinanten Virus in Kombination mit einem Träger bereit. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in der Praxis durch die Zugabe von Trägern und Hilfsstoffen für die dosierte Verabreichung formuliert werden, wie es herkömmlicher pharmazeutischer Praxis entspricht. Dosierte Formulierungen können intravenöse, intratumorale, intramuskuläre, intraperitoneale, topische, Matrix- oder Aerosol-Verabreichung umfassen.
Der Ausdruck "Träger" bezieht sich auf Verbindungen, wie sie üblicherweise bei der Formulierung pharmazeutischer Verbindungen verwendet werden, um Stabilität, Sterilität und Verabreichbarkeit der pharmazeutischen Verbindung zu verbessern. Wenn das Virus als. Lösung oder Suspension formuliert wird, liegt das Verabreichungssystem in einem akzeptablen Träger vor, vorzugsweise in einem wässrigen Träger. Eine Vielzahl wässriger Träger kann verwendet werden, zum Beispiel Wasser, gepuffertes Wasser, 0.8% Salzlösung, 0,3% Glycin, Hyaluronsäure und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, wohlbekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden, oder sie können sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können ohne Veränderung zur Verwendung verpackt werden, oder sie können lyophilisiert werden, wobei die lyophilisierte Zubereitung vor der Verabreichung mit einer sterilen Lösung kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable Zusatzsubstanzen enthalten, soweit diese erforderlich sind, um sich physiologischen Bedingungen zu nähern, wie zum Beispiel Mittel zur pH-Einstellung und Puffermittel, Mittel zur Anpassung der Tonizität, Benetzungsmittel und dergleichen, zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Sorptions-Monolaurat, Triethanolaminoleat, etc.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner pharmazeutische Formulierungen des Virus mit einem Träger und einem oder mehreren die Verabreichung verbessernden Mittel bereit. Die Begriffe "Verabreichungsverbesserer" oder "die Verabreichung verbesserndes Mittel" werden vorliegend in austauschbarer Weise verwendet und umfassen eines oder mehrere Mittel, welche die Aufnahme des Virus in die Zielzelle erleichtern. Beispiele für Verabreichungsverbesserer sind in den parallel anhängigen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 09/112,074, die am 8. Juli 1998 eingereicht wurde, und 08/938,089, die am 26. September 1997 eingereicht wurde, beschrieben. Beispiele für solche die Verabreichung verbessernde Mittel umfassen Detergentien, Alkohole, Glykole, oberflächenaktive Substanzen, Gallensalze, Heparin-Antagonisten, Cyclooxygenase-Inhibitoren, hypertonische Salzlösungen und Acetate. Alkohole umfassen zum Beispiel die aliphatischen Alkohole, wie zum Beispiel Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Butylalkohol, Acetylalkohol. Glykole umfassen Glycerin, Propylenglykol, Polethylenglykol und andere Glykole mit niedrigem Molekulargewicht, wie zum Beispiel Glycerol und Thioglycerol. Acetate, wie zum Beispiel Essigsäure, Glukonsäure und Natriumacetat, sind weitere Beispiele für die Verabreichung verbessernde Mittel. Hypertonische Salzlösungen, wie zum Beispiel 1 M NaCl sind ebenfalls Beispiele für die Verabreichung verbessernde Mittel. Beispiele für oberflächenaktive Substanzen sind Natriumdodecylsulfat (SDS) und Lysolecithin, Polysorbat 80, Nonylphenoxypolyoxyethylen, Lysophosphatidylcholin, Polyethylenglykol 400, Polysorbat 80, Polyoxyethylenether, Polyglykolether und DMSO. Gallensalze, wie zum Beispiel Taurocholat, Natrium-Taurodesoxycholat, Desoxycholat, Chenodesoxycholat, Glykocholinsäure, Glykochenodesoxycholatsäure, sowie andere Adstringenzien, wie zum Beispiel Silbernitrat, können verwendet werden. Heparin-Antagonisten, wie zum Beispiel quartäre Amine, wie zum Beispiel Protaminsulfat, können ebenfalls verwendet werden. Cyclooxygenase-Inhibitoren, wie zum Beispiel Natriumsalicylat, Salicylsäure und nichtsteroidale anti-inflammatorische Wirkstoffe (NSAIDS), wie zum Beispiel Indomethacin, Naproxen, Diclofenac können verwendet werden.
Der Ausdruck "Detergens" umfasst anionische, kationische, zwitterionische und nichtionische Detergentien. Exemplarische Detergentien umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Taurocholat, Desoxycholat, Taurodesoxycholat, Cetylpyridinium, Benalkoniumchlorid, Zwittergent 3-14 Detergens, CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol]-1-propansulfonat-Hydrat, Big CHAP, Desoxy Big CHAP, Triton X-100-Detergens, C12E8, Octyl-B-D-Glucopyranosid, PLURONIC-F68-Detergens, Tween 20-Detergens, und Tween 80-Detergens (Calbiochem Biochemicals).
Einheits-Dosis-Formulierungen gemäß der vorliegenden Erfindung können in einen Kit mit Produkten einbezogen werden, der das rekombinante Virus gemäß Anspruch 1 in lyophilisierter Form sowie eine Lösung zur Rekonstitution des lyophilisierten Produkts enthält. Rekombinante Viren gemäß der vorliegenden Erfindung können mit herkömmlichen Verfahren lyophilisiert und rekonstituiert werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit Calpain-Inhibitoren verabreicht werden. Der "Calpain-Inhbitor" (abgekürzt als "CI") bezieht sich auf eine Verbindung, welche die proteolytische Tätigkeit von Calpain-I, zum Beispiel von μ-Calpainen, inhibiert. Der Ausdruck Calpain-Inhibitor umfasst wie vorliegend verwendet solche Verbindungen, die zusätzlich zu ihren anderen biologischen Aktivitäten oder unabhängig von diesen eine inhibitorische Aktivität für Calpain I aufweisen. Für eine große Vielzahl von Verbindungen ist gezeigt worden, dass sie bei der Inhibierung der proteolytischen Tätigkeit von Calpainen aktiv sind. Beispiele für Calpain-Inhibitoren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen N-Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal, das auch als "Calpain-Inhibitor 1" bekannt ist. Bei Calpain-Inhibitoren ist beobachtet worden, dass sie die Infektiosität von Zellen bezüglich viraler Vektoren erhöhen, die Transkriptionsrate von Promotoren erhöhen, indem sie die Mengen der Transkriptionsfaktoren NF-kappa-B und AP-1 erhöhen, und die CTL-Antwort auf adenovirale Vektoren vermindern. Daher können die Formulierungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung wahlweise Calpain-Inhibitoren umfassen. Calpain-Inhibitoren und ihre Anwendungen sind beschrieben in Atencio, et al., parallel anhängige US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/104,321 und 09/073,076, die am 15. Oktober 1998 eingereicht wurden.
Verfahren zur Verwendung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Abtöten einer Zelle mit einem Defekt in einem regulatorischen Weg (pathway) bereit, wobei die Zielzelle mit einem erfindungsgemäßen, selektiv replizierenden Vektor in Kontakt gebracht wird. In einer hier dargestellten Ausführungsform der Erfindung ist die Zelle, die einen Defekt in einem Weg (pathway) aufweist, eine neoplastische Zelle. Der Ausdruck "neoplastische Zelle" bezieht sich auf eine Zelle, die einen anormalen Phänotyp in Bezug auf das Wachstums zeigt, welcher durch eine Unabhängigkeit von normalen, zellulären Wachstumskontrollen charakterisiert ist. Da sich neoplastische Zellen nicht notwendigerweise zu jedem beliebigen Zeitpunkt replizieren, umfasst der Ausdruck neoplastische Zellen solche Zellen, die sich aktiv replizieren, oder sich in einem temporären, nicht-replikativen Ruhestadium befinden (G1 oder G0). Lokalisierte Populationen von neoplastischen Zellen werden als Neoplasmen bezeichnet. Neoplasmen können bösartig oder gutartig sein. Bösartige Neoplasmen werden auch als Krebs bezeichnet. Der Ausdruck Krebs und die Bezeichnung Tumor werden vorliegend in austauschbarer Weise verwendet. Neoplastische Transformation bezieht sich auf die Umwandlung einer normalen Zelle in eine neoplastische Zelle, oftmals in eine Tumorzelle.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um neoplastische Zellen in einem Säugetier-Organismus in vivo durch Verabreichung einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung des erfindungsgemäßen rekombinanten Adenovirus zu entfernen. Der Ausdruck "entfernen" bedeutet die wesentliche Verringerung der Population von lebensfähigen, neoplastischen Zellen, um so die physiologischen Schädigungen durch die Anwesenheit der neoplastischen Zellen zu lindern. Der Ausdruck "wesentlich" bedeutet eine Reduktion der Population von lebensfähigen neoplastischen Zellen in dem Säugetier-Organismus um mehr als ca. 20 % der Population vor der Behandlung. Der Ausdruck "lebensfähig" bedeutet das Vorliegen der unkontrollierten regulatorischen Eigenschaften von Wachstums und Zellzyklus in einer neoplastischen Zelle. Der Ausdruck "lebensfähige neoplastische Zelle" wird vorliegend verwendet, um die Zellen von neoplastischen Zellen zu unterscheiden, die sich nicht mehr replizieren können. Zum Beispiel kann nach der Behandlung eine Tumormasse verbleiben, wobei jedoch die Zellen, welche die Tumormasse bilden, tot sein können. Diese toten Zellen wurden entfernt und ihnen fehlt die Fähigkeit zur Replikation, obwohl etwas Tumormasse verbleiben kann.
Der Ausdruck "Säugetier-Organismus" umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) Menschen, Schweine, Pferde, Rinder, Hunde, Katzen. Vorzugsweise verwendet man einen adenoviralen Vektor, der in Bezug auf den behandelten Typ von Säugetier endogen ist. Obwohl es im Allgemeinen bevorzugt ist, einen Virus der zu behandelnden Spezies einzusetzen, kann es in manchen Situationen vorteilhaft sein, Vektoren zu verwenden, die von anderen Spezies abgeleitet wurden, und die vorteilhafte pathogene Eigenschaften aufweisen. Zum Beispiel wird berichtet (WO 97/06826, veröffentlicht am 10. April 1997), dass ovine adenovirale Vektoren bei der humanen Gentherapie eingesetzt werden können, um die Immunantwort zu minimieren, welche für humane adenovirale Vektoren charakteristisch ist. Durch Minimierung der Immunantwort wird die schnelle systemische Entfernung des Vektors vermieden, was zu einer verlängerten Aktivität des Vektors führt.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind besonders für die Behandlung von Tumoren geeignet, die mit einem Mangel an anti-proliferativer Wirkung von TGF-β assoziiert sind; diese umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Brustkarzinome, Hepatome, Magen-, Dickdarm- und Haut-Tumore, sowie Lymphome bei B-Zellen und T-Zellen (Markowitz und Roberts, 1996). Mutationen des TGF-β-Rezeptors vom Typ II sind in Magen- und Dickdarm-Karzinomen, sowie in Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Nacken identifiziert worden. Mutationen oder Deletionen des Rezeptors vom Typ I sind auch im Kaposi-Sarkom, sowie in Brust-, Eierstock- und kolorektalen Tumoren gefunden worden. Unter den intrazellulären Effektoren des TGF-β-Signalwegs wurden Smads, Smad4/DPC4, als Kandidaten für Tumorsuppressor-Gene identifiziert, die in fast 50% der Pankreas-Tumoren verändert waren. Die Veränderung im DPC4-Gen sind auch Tumoren von Dickdarm, Brust und Eierstock gefunden worden, wenn auch in einer viel geringeren Häufigkeit. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Behandlung von TGF-β-insensitiven Tumoren geeignet, wie zum Beispiel Pankreas-Krebs.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind auch für die Behandlung von Tumorzellen mit Defekten im p53-Weg geeignet. Diese Tumoren umfassen solche, die Veränderungen in p53, mdm2 und p14/p19ARF(INK4a-Gen) aufweisen. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind auch für die Behandlung von Tumorzellen mit Defekten im Rb-Weg geeignet. Defekte im Rb-Weg entstehen durch Veränderungen in Rb, Cyclin D, cyclinabhängigen Kinasen (wie zum Beispiel CDK4) und p16 (INK4a-Gen).
Während die vorliegende Erfindung nur ein Verfahren zur Verwendung der rekombinanten Adenoviren bereitstellt, können die Adenoviren der vorliegenden Erfindung und Formulierungen derselben in Kombination mit herkömmlichen chemotherapeutischen Mitteln oder Behandlungsregimen eingesetzt werden. Beispiele für solche chemotherapeutische Substanzen umfassen Inhibitoren der Purinsynthese (zum Beispiel Pentostatin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Methotrexat) oder der Pyrimidinsynthese (zum Beispiel Pala, Azarbin), der Umwandlung von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden (zum Beispiel Hydroxyharnstoff), sowie Inhibitoren der dTMP-Synthese (5-Fluoruracil), DNA-schädigende Mittel (zum Beispiel Strahlung, Bleomycine, Etoposid, Teniposid, Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Mitoxantron, alkylierende Mittel, Mitomycin, Cisplatin, Procarbazin) sowie auch Inhibitoren der Mikrotubulus-Funktion (zum Beispiel Vinca-Alkaloide und Colchizin). Chemotherapeutische Behandlungsverfahren beziehen sich vor allem auf nicht chemische Vorgehensweisen, um neoplastische Zellen zu entfernen, wie zum Beispiel Strahlungstherapie. Beispiele für eine Kombinationstherapie mit p53 als therapeutischem Gen sind in Nielsen et al. WO/9835554A2 beschrieben, die am 20. August 1998 veröffentlicht wurde.
Die Immunantwort auf wiederholte Verabreichungen von viralen Vektoren in vivo ist signifikant. Demnach können die Vektoren der vorliegenden Erfindung in Kombination mit immunsuppressiven Mitteln verabreicht werden. Beispiele für immunsuppressive Mittel umfassen Cyclosporin, Azathioprin, Methotrexat, Cyclophosphamid, Lymphozyten-Immunglobulin, Antikörper gegen den CD3-Komplex, Adrenokortikosteroide, Sulfasalzain, FK-506, Methoxsalen und Thalidomid.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein ex vivo Verfahren zur Entfernung neoplastischer Zellen innerhalb einer Population von normalen Zellen bereit, die mit den neoplastischen Zellen kontaminiert sind; erreichbar durch Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus der vorliegenden Erfindung an die besagte Population. Ein Beispiel für die Anwendung eines solchen Verfahrens wird gegenwärtig bei ex vivo Anwendungen eingesetzt, wie zum Beispiel bei der Reinigung von autologen Stammzellprodukten, die im Allgemeinen als "Knochenmark-Purging" bekannt ist. Der Ausdruck "Stammzellprodukt" bezieht sich auf eine Population von hämatopoetischen Zellen, Vorläuferzellen und Stammzellen, die in der Lage ist, die langfristige hämatopoetische Funktion eines Patienten wiederherzustellen, nachdem er eine myoablative Therapie erhalten hat. Stammzellprodukte werden in herkömmlicher Weise durch Apherese (Blutreinigung) von mobilisiertem oder nicht-mobilisiertem peripheren Blut erhalten. Die Apherese wird in herkömmlicher Weise durch Verwendung bekannter Vorgehensweisen erreicht, wobei. eine kommerziell erhältliche Apherese-Apparatur verwendet wird, wie zum Beispiel das COBE Spectra Apherese-System, das von COBE International, 1185 Oak Street, Lakewood, CO, kommerziell erhältlich ist. Es ist bevorzugt, dass die Behandlungsbedingungen so optimiert sind, dass ein "3-Log-Purge" (d.h. eine Entfernung von ca. 99,9 der Tumorzellen aus dem Stammzellprodukt) und besonders bevorzugt ein "5-Log-Purge" (Entfernung von ca. 99,999% der Tumorzellen aus dem Stammzellprodukt) erreicht wird. In der bevorzugten Ausführung der Erfindung würde ein Stammzellprodukt mit einem Volumen von 100 ml bei einem Verhältnis von Partikelzahl zu kernhaltigen Zellen von ca. 2 × 10¹¹ der erfindungsgemäßen Vektoren für einen Zeitraum von ca. 4 Stunden bei 37°C behandelt.
Diagnostische Anwendungen
Zusätzlich zu den oben beschriebenen therapeutischen Anwendungen, sind die Vektoren der vorliegenden Erfindung auch für diagnostische Zwecke nützlich. Zum Beispiel können die Vektoren der vorliegenden Erfindung ein Reportergen enthalten, das bei einer viralen Infektion oder Replikation exprimiert wird. Der Ausdruck "Reportergen" bezieht sich auf ein Gen, dessen Produkt in der Lage ist, entweder allein oder in Kombination mit zusätzlichen Elementen ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Beispiele für Reportergene umfassen das β-Galaktosidase-Gen, das Luciferase-Gen, das Gen für dass grün fluoreszierende Protein, Nukleotidsequenzen, die für Proteine kodieren, welche durch bildgebende Systeme, wie zum Beispiel Röntgenstrahlen oder Magnetfeld (MRI)-Bildgebungssysteme, nachweisbar sind. Solche Vektoren wären nützlich, um die Gegenwart eines funktionellen Wegs nachzuweisen (zum Beispiel p53- oder TGF-β-Weg). Alternativ dazu können solche Vektoren auch eingesetzt werden, um ein Zelloberflächenprotein zu exprimieren, das in der Lage ist, durch Bindung eines Moleküls, wie zum Beispiel eines fluoreszent markierten Antikörpers, erkannt zu werden. Alternativ dazu können in Fällen, in denen der auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotor verwendet wird, um die Expression eines Repressors der viralen Replikation (zum Beispiel E2F-Rb) zu steuern, späte virale Promotoren (zum Beispiel E2, welcher durch E2F-Rb oder einen beliebigen anderen Promotor mit Repressorbindungsstellen, wie zum Beispiel E2F-Bindungsstellen) verwendet werden, um die Expression des Reportergens für diagnostische Anwendungen zu steuern, wenn der auf den Weg (pathway) ansprechende Promotor ausgeschaltet ist. Diese diagnostischen Konstrukte können für diagnostische Zwecke in vivo oder in vitro verwendet werden. Beispiele für Anwendungen in vivo umfassen bildgebende Anwendungen, wie zum Beispiel Röntgenstrahlen, CT-Untersuchungen oder Magnetresonanz-Bildgebungsverfahren (MRI).
Verfahren zur Herstellung der Vektoren
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen rekombinanten Viren bereit, bei dem man:

a. eine Herstellerzelle mit einem rekombinanten Virus infiziert,
b. die infizierte Herstellerzelle unter Bedingungen kultiviert, welche die Replikation des viralen Genoms in der Herstellerzelle erlauben,
c. die Herstellerzellen aberntet, und
d. das rekombinanten Virus aufreinigt.

Der Ausdruck "Infektion" bedeutet, das das rekombinante Virus der Herstellerzelle unter Bedingungen ausgesetzt wird, so dass die Infektion der Herstellerzelle mit dem rekombinanten Adenovirus erleichtert wird. In Zellen, die mit mehreren Kopien eines bestimmten Virus infiziert wurden, sind die für die virale Replikation und die Virion-Verpackung notwendigen Aktivitäten kooperativ. Deshalb ist es bevorzugt, dass die Bedingungen so eingestellt werden, dass eine erhebliche Wahrscheinlichkeit dafür vorliegt, dass die Herstellerzellen mehrfach mit dem Virus infiziert sind. Ein Beispiel für eine Be dingung, welche die Herstellung des Virus in den Herstellerzellen begünstigt, ist eine erhöhte Virus-Konzentration in der Infektionsphase. Es ist jedoch möglich, dass die Gesamtzahl an viralen Infektionen pro Herstellerzelle übertrieben wird, was zu toxischen Effekten für die Zelle führt. Somit sollte man sich bei den Infektionen bemühen, die Viruskonzentration im Bereich von 1 × 10⁶ bis 1 × 10¹⁰ zu halten, bevorzugt bei etwa 1 × 10⁹ Virionen pro ml. Es können auch chemische Mittel verwendet werden, um die Infektiosität der Herstellerzelllinie zu erhöhen. Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Infektiosität von Herstellerzelllinien für die virale Infektiosität bereit, indem ein Calpain-Inhibitor einbezogen wird. Beispiele für Calpain-Inhibitoren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen Calpain-Inhibitor 1 (auch bekannt als N-Acetyl-Leucyl-Leucyl-Norleucinal, kommerziell erhältlich von Boehringer Mannheim). Es wurde beobachtet, dass der Calpain-Inhibitor 1 die Infektiosität der Herstellerzelllinien für rekombinante Adenoviren erhöht.
Der Ausdruck "Herstellerzelle" bezieht sich auf eine Zelle, die in der Lage ist, die Replikation des zu erzeugenden viralen Genoms des rekombinanten Adenovirus zu ermöglichen. Eine Vielzahl von Säugetier-Zelllinien für die Kultur von rekombinanten Adenoviren sind öffentlich verfügbar. Zum Beispiel ist die 293-Zellinie (Graham und Smiley (1977) J. Gen. Virol. 36: 59–72) konstruiert worden, um die Defekte in der E1-Funktion zu komplementieren, und sie ist eine bevorzugte Zellinie für die Produktion der aktuellen Vektoren. Beispiele für andere Herstellerzelllinien umfassen HeLa-Zellen, PERC.6-Zellen (wie in der Publikation WO/97/00326 beschrieben, Anmeldenummer PCT/NL96/00244).
Der Ausdruck "kultivieren unter Bedingungen, welche die Replikation des viralen Genoms erlauben" bedeutet das Auf rechterhalten der Bedingungen für die infizierte Herstellerzelle, um so dem Virus die Vermehrung in der Herstellerzelle zu ermöglichen. Es ist wünschenswert, die Bedingungen zu kontrollieren, um so die Anzahl der von jeder Zelle produzierten Viruspartikel zu maximieren. Somit wird es notwendig sein, die Reaktionsbedingungen, wie zum Beispiel die Temperatur, der gelöste Sauerstoff, der pH-Wert, etc., zu überwachen und zu kontrollieren. Kommerziell erhältliche Bioreaktoren, wie zum Beispiel der CelliGen Plus Bioreaktor (kommerziell erhältlich von New Brunswick Scientific, Inc. 44 Talmadge Road, Edison, NJ) haben Vorrichtungen zur Überwachung und zum Einhalten solcher Parameter. Die Optimierung der Infektionsbedingungen und Kulturbedingungen werden etwas variieren. Die Bedingungen für die effiziente Replikation und Produktion des Virus können jedoch vom Fachmann erreicht werden, wobei die bekannten Eigenschaften der Herstellerzelllinie, die Eigenschaften des Virus, die Art des Bioreaktors, etc. in Betracht gezogen werden. Wenn 293-Zellen als Herstellerzelllinie verwendet werden, wird die Sauerstoffkonzentration bevorzugt im Bereich von ca. 50% bis ca. 120 gelöstem Sauerstoff gehalten, vorzugsweise bei 100 gelöstem Sauerstoff. Wenn die Konzentration der viralen Partikel (wie sie mit herkömmlichen Methoden wie HPLC unter Nutzung einer Resource-Q-Säule bestimmt wird) ein Plateau erreicht, wird der Reaktor abgeerntet.
Der Ausdruck "Ernten" bedeutet das Einsammeln der Zellen, die das rekombinante Adenovirus enthalten, aus den Medien. Dies kann durch herkömmliche Verfahren erreicht werden, wie differentielle Zentrifugation oder chromatographische Mittel. In diesem Stadium können die geernteten Zellen gelagert oder durch Lyse und Reinigung weiterverarbeitet werden, um das rekombinante Virus zu isolieren. Zur Lagerung sollten die Zellen bei oder in etwa bei physiologischem pH-Wert gepuffert und bei –70°C eingefroren werden.
Der Ausdruck "Lyse" bezieht sich auf das Aufbrechen der Herstellerzellen. Eine Lyse kann durch eine Vielzahl von Mitteln erreicht werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Wenn es gewünscht ist, die viralen Partikel aus den Herstellerzellen zu isolieren, werden die Zellen unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren lysiert, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel können Säugetierzellen bei niedrigem Druck (100–200 psi differentieller Druck) oder durch herkömmliche Verfahren mit Einfrieren und Auftauen lysiert werden. Exogene, freie DNA/RNA wird durch Abbau mit DNAse/RNAse entfernt.
Der Ausdruck "Aufreinigung" bedeutet die Isolierung einer im Wesentlichen reinen Population von rekombinanten Viruspartikeln aus den lysierten Herstellerzellen. Es können herkömmliche Reinigungstechniken, wie zum Beispiel chromatographische oder differentielle Verfahren der Dichtegradientenzentrifukation verwendet werden. Bei der bevorzugten Ausführung der Erfindung wird das Virus durch Säulenchromatographie gereinigt, wobei im Wesentlichen dem Verfahren von Huyghe, et al. (1995) Human Gene Therapy 6: 1403–1416, wie es in der parallel anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/400,793, die am 7. März 1995 eingereicht wurde, beschrieben ist, gefolgt wird.
Zusätzliche Verfahren und Maßnahmen zur Optimierung der Produktion der rekombinanten Adenoviren der vorliegenden Erfindung werden in der parallel anhängigen US Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/073,076 beschrieben, die am 4. Mai 1998 eingereicht wurde, und den Titel "Viral Production Process" trägt.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele stellen die Methodik und die Ergebnisse von Experimenten bereit, welche die Konstruktion be stimmter rekombinanter adenoviraler Vektoren und Plasmid-Vektoren zeigen. Es wird für den auf dem Gebiet der Erfindung tätigen Fachmann ersichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung in anderen Formen ausgeführt werden kann als denjenigen, die in diesen Beispielen spezifisch offenbart werden, ohne dabei vom Erfindungsgedanken oder von den essentiellen Eigenschaften der Erfindung abzuweichen. Die besonderen Ausführungsformen der Erfindung, wie sie im folgenden beschrieben werden, sollen deshalb als illustrativ und nicht als restriktiv betrachtet werden. In den folgenden Beispielen bedeutet "g" Gramm, "ml" bedeutet Milliliter, "mol" bedeutet Mol, "°C" bedeutet Grad Celsius, "min" bedeutet Minuten, "FBS" bedeutet fötales Rinderserum, und "PN" bezieht sich auf die Partikelzahl an rekombinantem Virus.
Beispiel 1. Plasmid-Konstruktion
p800luc, ein Plasmid, welches für eine Luciferase unter Kontrolle des 800 bp-PAI-Promotors kodiert, wurde von Dr. David Luskutoff (Scripps Institute, LaJolla, California) erhalten. Das Plasmid pCTMIE-E2F-Rb, welches einen CMV-Promotor gefolgt von einer dreiteiligen Adenovirus-5-Leadersequenz und einem SV40-Enhancer stromaufwärts von der für das E2F-Rb-Fusionsprotein kodierenden Sequenz enthält, wurde von Doug Antelman (Canji) zur bereitgestellt.
Beispiel 2. Konstruktion des Luciferase-Plasmids mit Promotoren, die auf TGF-β ansprechen
A. PAI-Luciferase-Plasmid:
Sequenzen aller Fragmente werden in 5'-3'-Richtung gezeigt. Ein Fragment von 749 bp, das von einer SacI- und XhoI-Schnittstellen am 5'- bzw. 3'-Ende flankiert wird, und einer SV40-TATA-Box anstelle einer nativen TATA-Box innerhalb des Promotors, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei p800luc als Template und die Primer AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA und GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (enthält die SV40 TATA-Box) verwendet wurden. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit SacI und XhoI verdaut und mit einem Fragment ligiert, das nach Verdau von PGL3-basic erhalten wurde (einem Luciferase-Konstrukt ohne Promotor (Promega)), wobei PAI-Plasmid erhalten wurde.
B. SRE-Luciferase-Plasmid:
Die folgenden Oligonukleotide wurden zusammengelagert: GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC und GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. Das zusammengelagerte Produkt wurde mit XhoI verdaut und mit PGL3-basic ligiert, das mit MluI verdaut war, bei dem mittels Klenow stumpfe Enden erzeugt worden waren, und das mit XhoI verdaut worden war, wodurch pSVT-luc (ein Luciferase-Konstrukt mit SV40 TATA-Box) erhalten wurde. Die Oligonukleotide, die Bindungsstellen für Smad4/DPC4 enthielten, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC und AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC, wurden zusammengelagert und mit pSVT-Luciferase ligiert, das mit KpnI verdaut worden war, um das Plasmid SRE-Luciferase zu erhalten.
Beispiel 3. Konstruktion von Luciferase-Plasmiden mit Promotoren, die auf p53 ansprechen
A. Das Plasmid RGC-Luciferase:
Zwei komplementäre, 5'-phosphorylierte Oligonukleotide mit Bindungsstellen für p53 aus dem ribosomalen Gencluster, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC und CA CGA GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC, wurden miteinander hybridisiert. Das hybridisierte Fragment wurde mit pSVT- Luciferase ligiert, das mit Kpn I verdaut worden war, wobei das Plasmid RGC-Luciferase erhalten wurde.
B. Das Plasmid p53CON-Luciferase:
Zwei komplementäre, 5'-phosphorylierte Oligonukleotide, die Konsensus-Bindungsstellen für p53 (p53CON) enthielten, CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC und AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC, wurden zusammengelagert. Das zusammengelagerte Fragment wurde mit pSVT-Luciferase ligiert, welches mit KpnI verdaut worden war, wobei das Plasmid p53CON-Luciferase erhalten wurde.
C. Das Plasmid PAI-E2F-Rb:
Die Sequenz, die in dem Plasmid pCTMIE-E2F-Rb den CMV-Promotor gefolgt von der dreiteiligen Adenovirus-5-Leadersequenz und einem SV40 Enhancer stromaufwärts von der für das E2F-RB-Fusionsprotein kodierenden Sequenz enthielt, wurde durch Verdau mit BglI und XbaI herausgeschnitten, und das resultierende Fragment wurde ligiert, wobei das promotorlose Plasmid E2F-RB erhalten wurde. Ein Fragment, das den modifizierten PAI-Promotor enthielt, wurde aus dem Plasmid PAI-Luciferase durch Verdau mit SacI und XhoI herausgeschnitten, und durch Behandlung mit Klenow wurden stumpfe Enden erzeugt. Dieses Fragment wurde mit dem promotorlosen Plasmid E2F-Rb ligiert, das mit EcoRI verdaut und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I behandelt worden war, wobei das Plasmid PAI-E2F-RB erhalten wurde.
Beispiel 4. Konstruktion von rekombinanten Adenoviren
Ein Transfer-Plasmid, das die Ad5-Sequenz mit einer 3-kb Deletion in der E3-Region enthielt, pNEBΔE3, wurde durch Klo nierung eines SnaBI-Fragments von 7,4 kb aus pBHG11 (26676 bis 34140) in pNEB193 (Plasmid von NEB), das mit BamHI, AccI und Klenow behandelt worden war, konstruiert. Es wurde eine multiple Klonierungsstelle (MCS) in das oben genannte Plasmid eingeführt, indem die 5-phosphorylierten Oligonukleotide AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T und TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T zusammengelagert wurden, und das zusammengelagerte Fragment durch Ligation in pNEBΔE3 eingebracht wurde, das mit Pac I verdaut worden war, wobei das Plasmid pNEBΔE3(MCS) erhalten wurde.
Ein Transfer-Plasmid zur Erzeugung von rekombinantem Adenovirus, das für E2F-Rb unter der Kontrolle des PAI-Promotors und für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors kodiert, wurde wie folgt konstruiert. Ein intermediärer Vektor pABS.4-E2F-Rb wurde hergestellt, indem ein Fragment, welches den PAI-Promotor und die für E2F-RB kodierende Sequenz enthielt, und das durch Verdau von Plasmid PAI-E2F-RB mit NacI und XbaI und Ligation mit einem Fragment aus Plasmid pABS.4 (Microbix), das durch Verdau mit Kpn I, Behandlung mit Klenow, und erneutem Verdau mit Xba I hergestellt worden war, ligiert wurde. Ein Fragment, das den PAI-Promotor, die für E2F-Rb kodierende Sequenz und ein Kanamycin-Gen enthielt, wurde dann durch Verdau mit PacI aus dem Plasmid pABS.4-E2F-Rb herausgeschnitten, mit Klenow behandelt und mit dem Plasmidfragment ligiert, welches durch Verdau des Plasmids pNEBΔE3 mit PacI und Behandlung mit Klenow erhalten worden war, wobei das Plasmid pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb erhalten wurde, das keine PacI-Schnittstelle enthält. Das Kanamycin-Gen in diesem Plasmid wurde durch den CMV-Promotor ersetzt, der in funktionsfähiger Weise mit dem Gen für das grün fluoreszierende Protein (GFP) gekoppelt war, indem pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb mit SwaI verdaut. und mit einem Fragment ligiert wurde, das durch Verdau mit AflII und SspI und Behandlung mit Klenow aus pEGFP-N (Clontech) isoliert worden war, wobei das Plasmid pΔE3-PAI-E2F-Rb-GFP erhalten wurde.
Transfer-Plasmide zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren, die für E2F-Rb unter Kontrolle eines auf TGF-β ansprechenden Promotors mit SRE und für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors kodiert, wurden wie folgt konstruiert. Die für E2F-Rb kodierende Sequenz wurde in das Plasmid pNEBΔE3(MCS) eingeführt, wobei das Plasmid pNEBΔE3-E2F-Rb erhalten wurde, indem ein Fragment, das durch Verdau von pNEBΔE3(MCS) mit XbaI und NruI erhalten worden war, und ein Fragment, das durch Verdau von pCTMIE-E2F-Rb mit XbaI und NaeI erhalten worden war, ligiert wurden. Ein auf TGF-β ansprechender Promotor, der SRE enthielt, wurde in das oben genannte Plasmid durch Amplifikation dieser Sequenz mittels PCR eingeführt, wobei das Plasmid SRE-Luciferase als das Template und die Primer GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C und GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T verwendet wurden. Das resultierende PCR-Produkt wurde mit SpeI verdaut und mit pNEBΔE3-E2F-Rb ligiert, welches mit SnaBI und XbaI verdaut worden war, wobei pNEBΔE3-DPC-E2F-Rb erhalten wurde.
Transfer-Plasmide zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren, die für E2F-Rb unter Kontrolle eines auf p53 ansprechenden Promotors und für verstärktes grünes fluoreszierendes Protein (GFP) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors kodieren, wurden wie folgt konstruiert. Die auf p53 ansprechenden Promotor mit p53-Bindungsstellen aus dem ribosomalen Gencluster oder mit einer p53-Konsensus-Stelle (p53CON) wurden durch Amplifikation der Promotorsequenz mittels PCR in das Plasmid pNEBΔE3-E2F-Rb eingeführt, wobei RGC-Luciferase oder p53CON-Luciferase als Template und die phosphorylierten Primer GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C und GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T eingesetzt wurden. Die resultierenden PCR-Produkte wur den mit XbaI verdaut und mit pNEBΔE3-E2F-Rb ligiert, das mit SnaBI und XbaI verdaut worden war, wobei pΔE3-RGC-E2F-Rb und pdelataE3-PCON-E2F-Rb zu erhalten.
Beispiel 5. Homologe Rekombination zur Konstruktion von rekombinanten Adenoviren
Die rekombinante Adenoviren PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad und CON-Ad wurden wie beschrieben durch homologe Rekombination in Bakterien erhalten (Chartier, et al. (1996) J. Virol. 70: 4805–4810). Das Transfer-Plasmid wurde mit AscI verdaut, um die Fragmente zu erhalten, die E2F-Rb unter Kontrolle eines auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotors und GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthielten, flankiert von Ad5-Sequenzen. Das resultierende Fragment wurde zusammen mit einem Fragment, das durch Verdau von PTG4609 (kommerziell erhältlich von Transgene, Inc. und beschrieben in Chartier, et al. (1996) J. Virol. 70: 4805–4810) mit BstBI und SpeI erhalten worden war, in den Bakterienstamm BJ 5183 co-transformiert. Die resultierenden Bakterienkolonien wurden auf Anwesenheit der erwünschten rekombinanten infektiösen Ad5-Plasmide pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad und pCON-GFP-Ad durchsucht. Diese infektiösen Plasmide wurden dann durch Verdau mit PacI linearisiert, durch Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung gereinigt und zur Transfektion von 293-Zellen eingesetzt.
Die Transfektion wurde unter Verwendung von Superfect (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. 2,5 μg der linearisierten Plasmide wurden zur Transfektion von 250.000 Zellen eingesetzt, die in Platten mit 6 Vertiefungen und 12 μl Superfect/Vertiefung angezüchtet worden waren. Nach 8 Tagen wurde ein zytopathischer Effekt auf Grund der Virusproduktion beobachtet. Die Zellen wurden gemeinsam mit dem Zellkulturüberstand geerntet und drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Rekombinante Viren in den erhaltenen Lysaten wurden durch Reinfektion von 293-Zellen vermehrt.
Beispiel 6. Zellinien
Alle in dieser Untersuchung verwendeten Zelllinien wurden von der ATCC (Rockville, MD) erhalten und als Monolayer-Kulturen bei 37°C in einem CO₂-Inkubator kultiviert. 293, Hep3B, MRC9, A549, Panc1, U87, Caco2, MCF-7 und WIDR wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war. MDA-MB 469 Zellen wurden in Ham-Medium kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war, während MiaPaca-2-Zellen in DMEM-Medium angezüchtet wurden, das mit 10% fötalem Rinderserum und 2,5% Pferdeserum ergänzt war.
Beispiel 7. Transfektion
Die Zellen wurden entweder in Platten mit 6 Vertiefungen (250.000 Zellen/Vertiefung) oder in Platten mit 24 Vertiefungen (62.500 Zellen/Vertiefung) ausplattiert und über Nacht für die Anhaftung inkubiert. Dann wurden Transfektionen unter Verwendung von Calciumphosphat mit 293-Zellen wie beschrieben durchgeführt, und mit Superfect (Qiagen) für andere Zellen, wobei der Anleitung des Herstellers gefolgt wurde.
Beispiel B. Reporter/Luciferase-Assays
Die Zellen wurden mit 1,5 μg Reporterplasmid und 1,0 μg des Inhibitors transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden Lysate durch Zugabe von 1 × Reporter-Lysispuffer (Promega) und Inkubation für 10 min hergestellt. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung von Top Count (Packard) und einem Assay-Kit von Packard gemäß den Anweisungen von Packard bestimmt.
Beispiel 9. Assays zur Bestimmung des Virus-vermittelten zytopathischen Effekts
Die Zellen wurden mit den angegebenen rekombinanten oder Wildtyp-Adenoviren infiziert und 6 Tage nach der Infektion mit 0,5% Kristallviolett gefärbt, das in 20% Ethanol hergestellt worden war; dabei wurde im Wesentlichen der von Bischoff, et al. (1996) Science 274: 373–376, beschriebenen Vorgehensweise gefolgt.
Beispiel 10. Konstruktion von cU3EE- und cT1LT-Viren
Die MLP-Promotorsequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC und GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG und Ad5-DNA (wie sie im Plasmid pFG140 (Microbix) vorliegt) als Template verwendet wurden. Das MLP-PCR-Produkt wurde dann in die Pac I-Schnittstelle im Plasmid pdelataE3-PCON-E2F-Rb kloniert, wobei das Plasmid pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP erhalten wurde. Die für das Adenovirus-Protein E3 10.5K kodierende Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert wobei die Primer GCG ACC CAC CCT AAC AGA und GAT CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A verwendet wurden, und das resultierende PCR-Produkt wurde in die Xho I-Schnittstelle des Plasmids pCDNA3.1 (Invitrogen) kloniert, wobei das Plasmid pcDNA3-10.5 erhalten wurde. Die für das Adeno virus-Protein E3 10.5K kodierende Sequenz wurde dann aus pCDNA3-10.5 durch Verdau mit DraIII und Xba I herausgeschnitten. Anschließend wurde eine Klenow-Behandlung durchgeführt, und die Sequenz wurde mit dem pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP ligiert, der mit PacI und Klenow behandelt worden war, wodurch das Plasmid pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K erhalten wurde.
Die rekombinanten Adenoviren cU3EE und cT1LT wurden wie beschrieben durch homologe Rekombination in Bakterien erhalten (Chartier, et al. (1996) J. Virol. 70: 4805–4810). Das Transfer-Plasmid wurde mit AscI verdaut, um die Fragmente zu erhalten, die E2F-Rb unter Kontrolle der p53CON-Sequenz und E310.5K unter Kontrolle des MLP-Promotors enthielten, flankiert von Ad5-Sequenzen. Das resultierende Fragment wurde zusammen mit einem Fragment, das durch Verdau von PTG4609 (Transgene) mit BstBI und SpeI erhalten worden war, in den Bakterienstamm BJ 5183 co-transformiert. Die resultierenden Bakterienkolonien wurden auf die Anwesenheit des erwünschten rekombinanten, infektiösen Ad5-Plasmid pCEMD durchsucht. Das infektiöse Ad5-Plasmid p01/CEMD wurde nach einem ähnlichen Protokoll erhalten, wobei jedoch ein Derivat von PTG4609 (Transgene) verwendet wurde, bei dem die Wildtyp-E1A-Sequenz durch eine E1A-Sequenz mit 01 Mutation ersetzt worden war. Diese infektiösen Plasmide wurden dann durch Verdau mit PacI linearisiert und durch Phenol-Chloroform-Extraktion und anschließender Ethanolfällung gereinigt und zur Transfektion von 293 Zellen eingesetzt.
Die Transfektion mit den Plasmiden pCEMD und p01/CEMD wurde durchgeführt, wobei die rekombinanten Viren cU3EE bzw. cT1LT erzeugt wurden, und wobei Superfect (Qiagen) gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet wurde. 2,5 μg des linearisierten Plasmids wurden zur Transfektion von 500.000 Zellen eingesetzt, die in Platten mit 6 Vertiefungen mit 12 μl Superfect/Vertiefung angezüchtet worden waren. Nach 8 Tagen wurde ein zytopathischer Effekt auf Grund der Virusproduktion beobachtet. Die Zellen wurden gemeinsam mit dem Zellkulturüberstand geerntet und drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Rekombinante Viren in den erhaltenen Lysaten wurden durch Reinfektion von 293-Zellen vermehrt. Sequenzprotokoll

Claims

Selektiv replizierender, rekombinanter, viraler Vektor, der einen auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotor umfaßt, der in funktionsfähiger Weise an einen Repressor der viralen Replikation gekoppelt ist, wobei sich der Vektor selektiv in neoplastischen Zellen repliziert, die einen Defekt in dem Weg (pathway) aufweisen, auf den der Promotor anspricht.
Vektor gemäß Anspruch 1, wobei die neoplastischen Zellen Tumorzellen sind.
Vektor gemäß den Ansprüchen 1–2, wobei der auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotor ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem auf den p53-Weg ansprechenden Promotor, einem auf den Rb-Weg ansprechenden Promotor und einem auf den TGF-beta-Weg ansprechenden Promotor.
Vektor gemäß Anspruch 3, wobei das Virus aus der Gattung der Adenoviridiae abgeleitet ist.
Vektor gemäß Anspruch 4, wobei der Repressor der viralen Replikation E2F-RB ist.
Vektor gemäß den Ansprüchen 1–2, der ferner eine Transgen-Expressionskassette umfaßt.
Vektor gemäß Anspruch 6, wobei die Transgen-Expressionskassette ein pro-apoptotisches Gen umfasst, das in funktionsfähiger Weise an einen Promotor gekoppelt ist.
Vektor gemäß Anspruch 7, wobei das pro-apoptotische Gen Ad5 E3-10.5K ist.
Vektor gemäß Anspruch 8, wobei der auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotor ein auf den p53-Weg ansprechender Promotor ist.
Vektor gemäß Anspruch 9, wobei der auf einen p53-Weg ansprechende Promotor p53CON ist, der die Sequenz CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC oder AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC aufweist.
Vektor gemäß Anspruch 10, wobei der Promotorbestandteil der Transgen-Expressionskassette ein temporärer Promotor ist.
Vektor gemäß Anspruch 11, wobei der temporäre Promotor der "major late"-Promotor (MLP) ist.
Vektor gemäß Anspruch 12, der ferner eine Deletion in dem Bereich umfaßt, der für adenovirales E1a kodiert, sodass eine p300-Bindung ausgeschlossen wird.
Vektor gemäß Anspruch 13, wobei die Deletion in dem Bereich, der für adenovirales E1a kodiert, eine Deletion der Aminosäuren 4–25 des E1a 289R-Proteins umfaßt.
Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff einen selektiv replizierenden, rekombinanten Vektor gemäß einem der Ansprüche 1–14 in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern für diesen umfaßt.
Verfahren zum Abtöten einer Zelle mit einem Defekt in einem Weg (pathway) durch Inkontaktbringen der Zelle ex vivo mit einem selektiv replizierenden, rekombinanten Virus gemäß einem der Ansprüche 1–14.
Verwendung eines selektiv replizierenden, viralen Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–14 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Abtöten einer Zelle mit einem Defekt in einem Weg (pathway).
Verwendung gemäß Anspruch 17, bei der die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs verwendet wird.
Isolierte Zelle, die mit einem selektiv replizierenden, rekombinanten Virus transformiert ist, das einen auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotor umfaßt, der in funktionsfähiger Weise an einen Repressor der viralen Replikation gekoppelt ist.
Verfahren zur Herstellung eines selektiv replizierenden, viralen Vektors gemäß einem der Ansprüche 1–14, bei dem man eine Population von Herstellerzellen mit einer Probe des Vektors infiziert, die Herstellerzellinie unter Bedingungen kultiviert, welche die Replikation des Vektors in den Herstellerzellen ermöglichen, und den Vektor aus den Herstellerzellen isoliert.