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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Gegenwärtig werden
in einer Vielzahl therapeutischer Anwendungen rekombinante Adenoviren
für die Einbringung
von therapeutischen Transgenen eingesetzt. Die weitreichende Infektiosität dieser
Vektorsysteme hat zu Bedenken geführt, dass die Expression des
Virus in Nicht-Tumorzellen schädigende
Nebenwirkungen auf nicht neoplastische Zellen haben könnte. Folgerichtig
wurde ein breites Spektrum von Systemen für das Targeting entwickelt,
um das Transgen bevorzugt in einem gegebenen Zelltyp zu exprimieren.
Gewebsspezifische und tumorspezifische Promotoren wurden eingesetzt,
um den Vektor bevorzugt in bestimmten Zelltypen zu replizieren.
Zum Beispiel wird in der am 16. Januar 1997 veröffentlichten, internationalen
Patentanmeldung PCT/US96/10838 (Internationale Veröffentlichungsnr.
WO 97/01358) der Einsatz von Vektoren beschrieben, die sich in einer
spezifischen Wirtszelle replizieren, wobei prostataspezifische Promotorelememente
eingesetzt wurden, welche die E1-, E2- und E4-Funktionen steuern.
Insbesondere wird in dieser Publikation ein Konstrukt beschrieben,
bei dem ein prostataspezifischer Enhancer die Expression von E1
kontrolliert, und das eine Expressionskassette aufweist, die den
CMV-Promotor umfasst,
welcher die Expression des Cytosin-Deaminase-Gens steuert, das in die E3-Region
insertiert ist. Diese Vektoren sind replikationskompetent und in
der Lage, sich in einem bestimmten Zelltyp in intakte Virionen zu
verpacken.
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Ein
alternativer Ansatz zur Nutzung von tumorspezifischen Promotoren
für die
Steuerung der viralen Replikation ist die Anwendung von spezifischen
Deletionen in der für
das adenovirale E1b-55K-Protein kodierenden Sequenz. Rekombinante
Adenoviren, die Defekte in der für
das E1b-55K kodierenden Nukleotidsequenz enthalten, sind in US Patent
Nr. 5,677,178 beschrieben, das am 14. Oktober 1997 erteilt wurde.
Es wurde je doch festgestellt, dass diese gewebs- oder tumorspezifischen
Kontrollelemente durchlässig
(leaky) sind, d.h. sie erlauben die Replikation auch in anderen
Zelltypen als den bevorzugten Zielzellen.
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Eine
Alternative zu dieser Art eines selektiv replizierenden Vektors
ist die Nutzung eines replikationsdefizienten adenoviralen Vektors,
der eine intensive Eliminierung der E1-Funktion aufweist. Insbesondere Vektoren,
die eine Eliminierung von E1, E2, E3 und partielle Deletion von
E4 aufweisen, wurden für
die Einbringung exogener Transgene eingesetzt. Solche Vektoren sind
eingesetzt worden, um das p53-Gen in Zielzellen einzuführen. Es
ist gezeigt worden, dass die Expression eines exogen verabreichten
p53-Wildtyps in eine p53-defiziente (p53-Mutation oder p53 Null)
Tumorzelle in der Lage ist, eine p53-vermittelte Apoptose in der Tumorzelle
zu induzieren. Solche viralen Vektoren für die Einbringung von p53 werden
zur Zeit bei der Schering Corporation und bei der Invitrogen Corporation
entwickelt. Diese Vektoren haben akzeptable Toxizitätsprofile
und eine therapeutische Wirksamkeit für humane therapeutische Anwendungen
gezeigt, und sie befinden sich in klinischen Studien der Phase II
am Menschen, um bösartige
Tumore zu behandeln, die mit p53-assoziierte sind.
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Replikationsdefiziente
und selektiv replizierende Vektoren haben zumindest theoretisch
einige Nachteile im Design, die für Kliniker von Interesse sind.
Da replikationsdefiziente Vektoren sich nicht unkontrolliert im
Patienten vermehren werden, haben sie theoretisch ein attraktiveres
Sicherheitsprofil. Da jedoch die wirksame Tumoreliminierung die
Infektion einer wesentlichen Mehrheit von Tumorzellen erfordert,
wird üblicherweise
ein wesentlicher molarer Überschuss
an Vektor eingesetzt, um therapeutische Wirksamkeit zu garantieren.
Wegen ihrer Fähigkeit
zur Replikation und der potentiellen Mutation zur Bildung vollständig replikationskompetenter
Vektoren im Patienten, werden selektiv replizierende Vektoren unter
dem Gesichtspunkt der Sicherheit als bedeutsamer angesehen. Die
Beibehaltung der natürlichen
Fähigkeit
des Virus, sich unter besonderen Bedingungen zu vermehren, ermöglicht diesen
Vektoren, sich auf umgebende Tumorzellen auszubreiten. Da die Vektoren
sich selbst replizieren können,
wird eine geringere Anfangsdosis derartiger Vektoren benötigt. Dies
ist sowohl aus immunologischer Sicht als auch aus ökonomischen
Gründen
wie bei der Herstellung solcher Mittel vorteilhaft. Deshalb gibt
es im Stand der Technik einen Bedarf nach einem selektiv replizierenden Vektor,
der auf die erkannten Sicherheitsprobleme eingeht und einen erhöhten therapeutischen
Index bereitstellt.
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WO
9839464 bezieht sich auf adenovirale Vektoren, die spezifisch für Zielzellen
sind, sowie auf Verfahren zur Nutzung solcher Viren. Die adenovirale
Replikation kann durch transkriptionelle Kontrolle mit zellspezifischen,
heterologen transkriptionalen Regulationselementen auf Zielzellen
beschränkt
werden, so dass die adenoviralen Vektoren sich in den Zielzellen
replizieren können
und eine zellspezifische Zytotoxizität bewirken, insbesondere auf
neoplastische Zellen.
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WO
9821228 bezieht sich auf Fusionsproteine aus einem E2F- und einem RB-Polypeptid,
die als Repressoren wirksam sind. Ebenfalls vorgeschlagen wird die
gewebsspezifische Expression dieser Konstrukte. Adenovirus wird
als bevorzugtes Vektorsystem vorgeschlagen.
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Elsing
et al. ((1998) PNAS 95 (17) 10072-10077) beschreiben die Beobachtung,
dass die Zerstörung des
adenoviralen ORF 14,5K die Expression von FAS/APO-1 auf der Oberfläche von
Adenovirus-infizierten Zellen wiederherstellt.
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WO
9418992 bezieht sich auf Verfahren und Zusammensetzungen zur Behandlung
neoplastischer Zustände
durch Virus- basierte
Therapie. Mutiertes Virus, dem virale Proteine fehlen, welche p53
binden und/oder inaktivieren, werden einem Patienten verabreicht,
der ein Neoplasma aufweist, welches Zellen umfasst, denen p53- und/oder
RB-Funktionen fehlen. Dies soll bevorzugt in neoplastischen Zellen
einen Replikations-Phänotyp erzeugen,
was zum bevorzugten Abtöten
der neoplastischen Zellen führt.
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Mori
et al. ((1997) Blood 90 (12) 4924–4923) offenbaren, dass die
Expression gewisser Gene des HTLV-1 Virus durch funktionelle p53-Proteine
unterdrückt
wird. In Zellen ohne p53-Funktion
wird eine hohe Expression viraler Gene (reguliert durch das Tax-Genprodukt)
beobachtet, was zur Etablierung einer produktiven viralen Infektion
führt.
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Die
vorliegende Erfindung löst
diese Probleme, indem ein selektiv replizierender, adenoviraler
Vektor bereitgestellt wird, der einen auf einen Weg (pathway) ausgerichteten
und auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotor enthält, welcher
die Expression eines Repressors der viralen Replikation steuert,
so dass der Vektor sich bevorzugt in Zellen repliziert, die einen
Defekt in einem Weg (pathway) aufweisen. Die vorliegende Erfindung
stellt auch pharmazeutische Formulierungen bereit, die solche Vektoren
enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren bereit,
um Zellen mit einem Defekt in einem Weg (pathway) aus einer Population
von normalen Zellen zu eliminieren, wobei solche Vektoren verwendet
werden.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt rekombinante Viren bereit, die das
virale Genom selektiv in Abhängigkeit
von den intrazellulären
Bedingungen der Zielzelle replizieren, indem ein auf einen Weg (pathway)
ansprechender Promotor verwendet wird, der die Expression eines
Inhibitors der viralen Replikation, welcher die virale Replikation
in der Wirtszelle wesentlich inhibiert, basierend auf dem Phänotyp oder
Genotyp der infizierten Zelle steuert. In der Zielzelle ist das
Promotorelement des auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotors inaktiv,
und somit kann sich das Virus replizieren. Dies führt zu:
(1) Abtöten
der Zellen durch die natürliche, lytische
Natur des Virus, und/oder (2) liefert eine therapeutische Dosis
eines Transgenprodukts (vermehrt im Vergleich zu replikationsunfähigen Vektoren)
an die Zielzelle, und (3) produziert an einer Stelle eine Konzentration
des Virus, welche die Infektion von umgebenden Zielzellen durch
das rekombinante Virus ermöglicht. Die
Erfindung stellt darüber
hinaus therapeutische und diagnostische Verfahren zur Verwendung
der Vektoren bereit, sowie pharmazeutische Formulierungen, die die
Vektoren umfassen, Verfahren zur Herstellung der Vektoren und transformierte
Zellen, die die Vektoren enthalten.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
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1.
Es wurden Ergebnisse für
CPE-Assays zur Bestimmung des zytopathischen Effekts von rekombinanten
Adenovirus-Vektoren,
welche für
die kodierende Sequenz der E2F-Rb Fusion kodieren, wobei diese unter
Kontrolle eines Promotors steht, der entweder auf den TGF-β-Weg (PAI
oder SRE) oder auf den p53-Weg
(RGC oder p53CON) anspricht, erzeugt. Zusätzlich wurde auch das für das grüne fluoreszente
Protein kodierende Gen als Reporter in den Vektor eingefügt. Teilabbildung
A zeigt MRC-9 Zellen, Teilabbildung B zeigt die Hep3B-Zellen, und
Teilabbildung C zeigt WIDR-Zellen. Bahn 1: Replikationsdefizientes
(E1 deletiert) rekombinantes Adenovirus, welches das grüne fluoreszente
Protein (GFP) exprimiert; Bahn 2: PAI-Ad; Bahn 3: SRE-Ad; Bahn 4:
RGC-Ad; Bahn 5: p53CON-Ad. Die Partikelkonzentrationen sind wie
rechts in der Abbildung angegeben.
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2.
Die Ergebnisse der Fluoreszenz-Mikroskopie (obere Teilabbildungen)
zeigen die GFP-Expression durch Vektoren, die auf den Weg (pathway)
ausgerichtet sind. Teilabbildung A zeigt den GFCB-Kontrollvektor,
Teilabbildung B den SRE-Ad-Vektor und Teilabbildung C den p53CON-Ad-Vektor.
Die Infektion erfolgte mit 5 × 105 Partikeln pro Milliliter.
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3.
Ergebnisse der Infektion von normalen bronchialen Epithelzellen
(Teilabbildung A) und C33A-Zellen (Teilabbildung B) mit den rekombinanten
Viren U3EE (Quadrate), T1LT (Kreise) und L9IU (Dreiecke). Die vertikalen
Achsen zeigen den Prozentsatz an uninfizierten Kontrollen, und die
horizontalen Achsen zeigen die virale Dosis in Partikeln pro Milliliter.
Die Experimente wurden so durchgeführt, dass eine Kultur von jedem
Zelltyp mit sechs unterschiedlichen Viruskonzentrationen in Kontakt
gebracht wurde, die von 105 bis 109 virale Partikel pro Milliliter reichten.
Die Zellen wurden dem Virus für
den Zeitraum einer Stunde ausgesetzt, überschüssiges Virus wurde weggewaschen,
und der Prozentsatz an lebensfähigen
Zellen wurde am sechsten Tag nach der Infektion mit dem MTS-Assay
(Promega, Madison, WI) bestimmt, wobei im Wesentlichen die Anleitungen
des Herstellers befolgt wurden. Die horizontale Linie zeigt die
Menge an, bei der 50 % der Zellen lebensfähig blieben. Der Schnittpunkt
der durch die Daten erzeugten Kurven mit der horizontalen gepunkteten Linie
ist ein Maß für den ED50 des Virus.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen selektiv replizierenden, rekombinanten,
viralen Vektor bereit, der einen auf einen Weg (pathway) ansprechenden
Promotor umfasst, der in funktionsfähiger Weise an einen Repressor
der viralen Replika tion gekoppelt ist, wobei sich der Vektor selektiv
in neoplastischen Zellen repliziert, die einen Defekt in dem Weg
(pathway) aufweisen, auf den der Promotor anspricht.
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Die
Bezeichnung "selektiv
replizierend" bezieht
sich auf einen Vektor, der in der Lage ist, sich bevorzugt in einer
Zelle in einem bestimmten phänotypischen
Zustand relativ zu einem anderen phänotypischen Zustand zu replizieren.
Beispiele für
unterschiedliche phänotypische
Zustände
umfassen eine Zelle mit defektem p53-Weg im Vergleich zu einer normalen
Zelle des entsprechenden Zelltyps. Wenn ein Virus eine bevorzugte Replikation
aufweist, bedeutet dies, dass sich das Virus bei einer bestimmten
Dosismenge in einem Zielzelltyp mindestens fünfmal effizienter repliziert,
als in einer normalen (Kontroll-)Zelle des gleichen Typs. Um festzustellen,
ob ein Virus wirklich selektiv ist, ist es hinsichtlich mehrerer
Faktoren notwendig, die Fähigkeit
des Virus zu bestimmen, sich in den Zielzellen zu replizieren, verglichen
mit normalen Zellen des gleichen Zelltyps.
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Es
ist bevorzugt, dass man die Fähigkeit
eines bestimmten Vektors, sich in einer Zielzelle replizieren zu
können,
die den Zustand aufweist, auf den abgestellt wird, mit der Fähigkeit
vergleicht, sich in der normalen Zelle des gleichen Typs replizieren
zu können,
die diesen Zustand nicht aufweist. Zum Beispiel ist der erste Schritt
nach der viralen Infektion die Induktion der Zelle zum Eintritt
in den Zellzyklus, da Faktoren, die für die maximale Replikationseffizienz
des Virus notwendig sind, nur in der S-Phase vorhanden sind. Wenn
man dennoch versuchen würde,
die Selektivität
eines Vektors im Hinblick auf die Selektivität in Tumorzellen zu bewerten,
indem man die Fähigkeit,
sich in einer. Tumorzelle zu replizieren, relativ zu der in einer
anderen Zelle vergleicht, welche bereits in den Zellzyklus eingetreten
ist (wie zum Beispiel immortalisierte oder transformierte Zellinien),
dann wird die Selektivität
des Virus für
Tumorzellen zu einem gewissen Grade überdeckt werden. Zusätzlich wurde
beobachtet, dass verschiedenen Zelltypen eine sehr unterschiedliche
Infektiosität
für ein
bestimmtes Virus besitzen. Obwohl einige Viren, wie zum Beispiel
Adenoviren, einen weitreichenden Gewebetropismus besitzen, sind
andere Viren im Hinblick auf den Zelltyp, den sie infizieren können, stärker eingeschränkt. Beim
Versuch, die Leistungsfähigkeit
eines bestimmten Vektors in Zellen mit sehr unterschiedlichen Infektiositäten zu bewerten,
wird es schwierig sein, zu bestimmen, ob ein fehlender Effekt auf
der Leistungsfähigkeit
des Vektors innerhalb der Zelle beruht, oder einfach auf der Unfähigkeit
des Virus, die Zelle überhaupt infizieren
zu können.
Durch Bewertung der Selektivität
in Zielzellen und normalen Zellen des gleichen Typs, kann man diesen
Infektiositätseffekt
minimieren.
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Der
zeitliche Ablauf des viralen Lebenszyklus muss ebenfalls berücksichtigt
werden. Zum Beispiel kann sogar der Wildtyp eines Vektors kurz nach
der Infektion scheinbar Selektivität in Tumorzellen relativ zu normalen
Zellen aufweisen, weil die Zelle schon im Zellzyklus ist. Diese
scheinbare Selektivität
verringert sich jedoch mit der Zeit, nachdem das Virus den Zellzyklus
stimuliert hat. Daher muss der Zeitpunkt, zu dem Selektivität nach der
Infektion bewertet wird, ausreichend sein, um diese anfängliche
Verzögerung
der Replikation in normalen Zellen zu vermeiden. Obwohl diese Zeit
mit dem angewandten Virustyp variieren wird, kann diese anfängliche
Verzögerung
durch den Fachmann problemlos bestimmt werden.
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Der
Dosiseffekt muss ebenfalls bei der Feststellung, ob ein bestimmtes
rekombinantes Adenovirus einen selektiven Effekt im Zielzelltyp
aufweist, berücksichtigt
werden. Wenn man zum Beispiel auf die Eliminierung von Tumorzellen
abstellt, und den Effekt durch Zytotoxizität misst, kann durch unterschiedliche
Dosen ein Virus so dargestellt werden, als ob es eine selektive
Zytotoxizität
hätte.
Es ist beobachtet worden, dass bei einer ausreichend hohen Dosis
fast jedes Virus (unabhängig
davon, in welchem Ausmaß sein
Genom modifiziert wurde) zytotoxisch sein wird, allein aufgrund
der Auswirkungen der anwesenden viralen Proteine (wie zum Beispiel
Hexon im Fall des Adenovirus), die bekanntermaßen zytotoxisch sind. Obwohl
die wissenschaftliche Literatur ein Virus als "replikationsdefekt" beschreiben mag (wobei impliziert wird,
dass das Virus vollständig
unfähig
zur Replikation ist, falls keine Zellinie anwesend ist, die den
viralen Defekt komplementieren kann), werden solche Viren zutreffender
als "für die Replikation
abgemildert (attenuated)" beschrieben.
Zum Beispiel können
sich Adenoviren, die eine Deletion der gesamten E1-Region aufweisen
und die häufig
als "replikationsdefizient" oder "replikationsdefekt" beschrieben werden,
bis zu einem gewissen Grade replizieren, insbesondere in Zellen,
die sich im Zellzyklus befinden, oder in sich schnell teilenden
Zellen. Wie Mulligan beobachtete (1990, Science 260: 926–932):
- Obwohl
gezeigt wurde, dass die Expression der E1-Region sich auf die Expression anderer
viraler Genprodukte auswirkt, die zur Replikation notwendig sind
(zitierend Horwitz, M. in Virology, B.N. Fields Ed. (Raven, New York,
1990) Kapitel 60)), scheint die E1-Genexpression für die virale
Replikation nicht absolut notwendig zu sein. Die frühe Charakterisierung
von E1-defizienten Viren zeigt, dass bei einer hohen Multiplizität der Infektion die
E1-Region für
die Replikation verzichtbar ist (zitierend Jones und Shenk (1979)
PNAS (USA) 76 (8): 3665–3669).
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Somit
kann der Effekt der viralen Dosis bei der Bestimmung, ob ein Virus
sich selektiv repliziert oder nicht, nicht ignoriert werden.
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Wenn
man die Replikationsselektivität
eines Virus für
die Zielzelle bewerten möchte,
sollte man den "Selektivitätsindex" des Virus wie. folgt
bewerten. Der üblicherweise
verwendete Parameter ED50 (welcher als die
Dosis definiert ist, die ausreicht, um den Zelltod in 50% der Zellen
zu bewirken) ist eine geeignete Basis für einen Vergleich. Der ED50 eines Virus kann problemlos durch übliche Dosis-Eskalierungsexperimente
in vitro bestimmt werden. Um die einheitlichste Basis für den Vergleich
sicherzustellen, wird der ED50 am besten
relativ zu einer viralen Kontrolle dargestellt, um die Auswirkungen
von Abweichungen hinsichtlich der Infektiosität innerhalb der verglichenen
Zelltypen und von jeglichen Assay-Abweichungen zu minimieren.
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Somit
wird das einheitslose Verhältnis:
ED50 (Virus)/ED50 (Kontrolle)
verwendet, um die relative Toxizität des Virus in der Zelle darzustellen,
und es wird als der "relative
Toxizitätsindex" oder als "RTI" bezeichnet. Der "Selektivitätsindex" für ein bestimmtes
Virus wird dargestellt als das Verhältnis: RTI (Zielzellen)/RTI
normale Zellen). Selektiv replizierende Vektoren werden einen Selektivitätsindex
von mindestens 10, bevorzugt aber von 50, 100 oder mehr besitzen.
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Die
selektiv replizierenden adenoviralen Vektoren U3EE und T1LT sind
zum Beispiel konstruiert, um eine selektive Replikation und Abtötung von
Tumorzellen zu erreichen, die Defekte im p53-Weg aufweisen. Der U3EE-Vektor
wird im Wesentlichen in Übereinstimmung
mit der Lehre der hier dargelegten Beispiele hergestellt. Das U3EE-Virus
enthält
eine erste Expressionskassette, die ein auf p53 ansprechendes Element (p53CON)
enthält,
das die Expression des E2F-Rb-Fusionsproteins steuert. Das E2F-Rb-Fusionsprotein
ist ein wirkungsvoller Inhibitor der adenoviralen E2-Promotoraktivität, und seine
Gegenwart in der Zelle wird die virale Replikation wirksam unterdrücken. Das auf
p53 ansprechende Element (p53CON) ist aktiv in Reaktion auf einen
funktionellen p53-Weg.
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Folglich
wird in normalen Zellen mit intaktem p53-Weg das U3EE-Virus das
E2F-Rb-Fusionsprotein exprimieren, und das Virus wird sich nicht
replizieren. Jedoch ist in Zellen mit einem Defekt im p53-Weg (die Mehrheit
der Tumorzellen) das p53CON Element nicht aktiv, und somit gibt
es keine Unterdrückung
der viralen Replikation. Der U3EE-Vektor enthält außerdem eine Expressionskassette,
die den MLP-Promotor enthält,
der die Expression des Ad5 E3-10.5K pro-apoptotischen Gens steuert.
Die Verwendung von temporären
Promotoren (wie zum Beispiel des MLP-Promotors) ist bevorzugt, wenn
pro-apoptotische Gene eingesetzt werden, weil es erwünscht ist,
die Replikation der viralen DNA innerhalb der Zielzelle zu ermöglichen,
bevor das pro-apoptotische Signal aktiviert wird. Der MLP-Promotor
wird ca. sieben Stunden nach der Infektion aktiviert, folgend auf
den Beginn der Replikation des U3EE-Genoms, wodurch die Aktivität des E3-10.5K
pro-apoptotische Proteins induziert wird. Der adenovirale Vektor
T1LT entspricht im wesentlichen dem U3EE-Vektor, außer dass
er eine zusätzliche
Deletion in der E1a-Region aufweist, wodurch die Aminosäuren 4–25 der
adenoviralen E1a-Proteine 243R und 289R entfernt werden. Diese Deletion
verhindert die Fähigkeit
des p300-Proteins, an diese E1a-Proteine zu binden.
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Die
U3EE- und T1LT-Viren wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit bewertet, sich in normalen,
bronchialen Epithelzellen (NHBE) und in C33A (einer epithelialen
Tumorzellinie, die einen defekten p53-Weg aufweist) zu replizieren
und diese Zellen abzutöten,
wobei der L9IU-Vektor als Kontrolle verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser
Experimente sind in
3 der beigefügten Zeichnungen dargestellt.
In der folgenden Tabelle sind die gezeigten Daten zusammengefasst:
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Wie
aus den gezeigten Daten ersichtlich ist, besitzen die U3EE- und
T1LT-Viren eine hohe Selektivität für Tumorzellen.
Wie bereits erörtert
wurde, besitzt das L9IU-Virus einen kleinen Replikationsvorteil
in den im Zellzyklus befindlichen Tumorzellen relativ zu den ruhenden,
normalen Zellen. Indem die Verhältnisse
von ED50(Virus)/ED50(Kontrolle)
in jedem der Zelltypen vor Berechnung des Selektivitätsindex
verglichen werden, wird der Effekt solcher Variabilitäten minimiert.
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Der
Ausdruck "rekombinant" bezieht sich auf
ein Genom, das mittels in herkömmlicher
rekombinanter DNA-Techniken modifiziert wurde.
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Der
Ausdruck "Virus" bezieht sich auf
jeden beliebigen der obligat intrazellulären Parasiten, die keinen Mechanismus
zur Proteinsynthese oder zur Energiegewinnung aufweisen. Das virale
Genom kann eine RNA oder eine DNA innerhalb einer Proteinhüllstruktur
einer Lipidmembran sein. Beispiele für Viren, die bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung nützlich
sind, umfassen Baculoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Herpesviridae,
Poxviridae, Adenoviridae, Picotrnaviridae. Der Ausdruck rekombinante
Viren umfasst chimäre (oder
sogar multimere) Viren, d.h. Vektoren, die unter Nutzung von komplementären kodierenden
Sequenzen von mehr als einem viralen Subtyp konstruiert wurden.
Vgl. dazu Feng et al. Nature Biotechnology 15: 866–870.
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Der
Ausdruck "Adenovirus" ist mit dem Ausdruck "adenoviraler Vektor" synonym und bezieht
sich auf Viren der Gattung Adenoviridae. Der Ausdruck Adenoviridae
bezieht sich allgemein auf tierische Adenoviren der Gattung Mastadenoviren,
einschließlich
(aber nicht beschränkt
auf) humane, bovine, ovine, equine, canine, porcine, murine und
simiane Adenovirus-Subgattungen.
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Insbesondere
humane Adenoviren umfassen die Subgattungen A–F sowie einzelne Serotypen
derselben, wobei die individuellen Serotypen und A–F Subgenera
umfassen (aber nicht beschränkt
sind auf): humane Adenovirus-Typen 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11 (Ad11A und Ad11P), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 34a, 35,
35p, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 und 91.
Der Ausdruck bovine Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf)
die bovinen Adenovirus-Typen 1, 2, 3, 4, 7 und 10. Der Ausdruck
canine Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) die caninen Adenovirus-Typen
1 (Stämme
CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26–61) und 2. Der Ausdruck equine Adenoviren
umfasst (ist aber nicht beschränkt
auf) die equinen Adenovirus-Typen 1 und 2. Der Ausdruck porcine
Adenoviren umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) die porcinen Adenovirus-Typen
3 und 4. In der bevorzugten Ausführung
der vorliegenden Erfindung ist das Adenovirus abgeleitet von den
humanen Adenovirus-Serotypen 2 oder 5.
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Der
Ausdruck "auf einen
Weg (pathway) ansprechender Promotor" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die
ein bestimmtes Protein binden und dadurch bewirken, dass benachbarte
Gene transkriptionell auf die Bindung des Proteins in normalen Zellen
reagieren. Derartige Promotoren können erzeugt werden, indem
ansprechende Elemente eingebaut werden, wobei es sich um Sequenzen
handelt, an die Transkriptionsfaktoren binden. Ein solches Ansprechen
ist im allgemeinen induktiv, obwohl es mehrere Fälle gibt; in denen steigende Proteinmengen
zu einer verminderten Transkription führen. Auf einen Weg (pathway)
ansprechende Promotoren können
natürlich
vorkommen oder synthetisch sein. Auf einen Weg (pathway) ansprechende
Promotoren werden typischerweise in Bezug auf einen Weg (pathway)
konstruiert, oder in Bezug auf ein funktionelles Protein, auf das
abgestellt wird. Zum Beispiel würde
ein natürlich
vorkommender Promotor, der auf den p53-Weg anspricht, transkriptionelle
Kontrollelemente umfassen, welche durch die Anwesenheit von funktionellem
p53 aktiviert werden, wie zum Beispiel der p21- oder bax-Promotor.
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Alternativ
dazu können
synthetische Promotoren, die p53-Bindungsstellen
stromaufwärts
von einem minimalen Promotor (zum Beispiel der SV40-TATA-Box-Region)
enthalten, eingesetzt werden, um einen synthetischen Promotor zu
erzeugen, der auf einen Weg (pathway) anspricht. Synthetische, auf
einen Weg (pathway) ansprechende Promotoren werden im allgemeinen
aus einer oder aus mehreren Kopien einer Sequenz konstruiert, die
einem Konsensus-Bindungsmotiv entspricht. Solche Konsensus-DNA-Bindungsmotive
können problemlos
bestimmt werden. Solche Konsensus-Sequenzen werden im allgemeinen
als direkte oder Kopf-Schwanz-Repeats angeordnet, die durch einige
Basenpaare getrennt sind. Die Elemente, die Kopf-Kopf-Repeats enthalten
(zum Beispiel AGGTCATGACCT) werden Palindrome oder invertierte Repeats genannt,
und solche mit Schwanz-Schwanz-Repeats werden evertierte Repeats
genannt.
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Beispiele
für auf
einen Weg (pathway) ansprechende Promotoren, die bei der Ausführung der
vorliegenden Erfindung nützlich
sind, umfassen die synthetischen auf den Insulin-Weg ansprechende
Promotoren, welche die Konsensus-Insulin-Bindungssequenz enthalten
(Jacob, et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:27773–27779), den auf den Cytokin-Weg
ansprechenden Promo tor, den auf den Glucocorticoid-Weg ansprechende
Promotoren (Lange, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15673–80), auf
den IL1- und IL6-Weg ansprechende Promotoren (Won K,.-A. und Baumann
H. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3965–3978), auf den T3-Weg ansprechende
Promotoren, auf den Thyroidhormon-Weg ansprechende Promotoren, welche
das Konsensusmotiv: 5' AGGTCA
3' enthalten, auf
den TPA-Weg ansprechende Promotoren (TREs), auf den TGF-β-Weg ansprechende
Promotoren (wie in Grotendorst, et al. (1996) Cell Growth and Differentiation
7:469–480,
beschrieben). Beispiele für
auf andere Wege ansprechende Promotoren sind dem Fachmann bekannt
und können
in der Datenbank der Transkriptionregulationsregionen von eukaryontischen
Genomen identifiziert werden, die über das Internet über http://www.eimb.rssi.ru/TRRD
zugänglich
ist.
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Wie
hier dargelegt wird, umfast in der bevorzugten Ausführung der
vorliegenden Erfindung der Vektor einen synthetischen auf den TGF-β-Weg ansprechenden
Promotor, der in Gegenwart eines funktionellen TGF-β-Wegs aktiv
ist, wie zum Beispiel ein Promotor, der auf SRE- und PAI-RE ansprechende
Elemente enthält.
PAI-RE bezieht sich auf ein synthetisches, auf TGF-β ansprechendes
Element, das Sequenzen enthält, die
auf ein TGF-β-Signal ansprechen,
welches aus der Promotorregion des Plasminogenaktivators I isoliert wurde.
Die Konstruktion von PAI-RE ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung
beschrieben. Der auf den PAI-RE-Weg ansprechende Promotor kann als
ein Fragment von 749 Basenpaaren isoliert werden, das aus dem Plasmid
p800luc isolierbar ist (wie in Zonneveld, et al. (1988) PNAS 85:5525–5529 beschrieben;
verfügbar
aus GenBank unter Zugangsnummer J03836). SRE bezieht sich auf ein
synthetisches, auf TGF-β ansprechendes
Element, welches einen Repeat von 4 der Smad-4 DNA-Bindungssequenzen
hat (GTCTAGAC, wie in Zawel, et al. (1988) Mol. Cell 1:611–617 beschrieben).
Die Konstruktion von SRE ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung
beschrieben. Das auf SRE ansprechende Element kann durch Zusammenlage rung
von komplementären
Oligonukleotiden, welche für
die Smad-4 Bindungssequenzen
kodieren, und anschließende Klonierung
in Plasmid pGL#3-Promotor-Luciferase-Vektor (kommerziell von Promega
erhältlich)
erzeugt werden.
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In ähnlicher
Weise bezieht sich ein auf den "p53-Weg
ansprechender Promotor" auf
ein transkriptionelles Kontrollelement, welches in der Gegenwart
eines funktionellen p53-Weg aktiv ist. Der auf den p53-Weg ansprechende
Promotor kann eine natürlich
vorkommende transkriptionelle Kontrollregion sein, welche in der Gegenwart
eines funktionellen p53-Weg aktiv ist, wie zum Beispiel der p21-
oder der mdm2-Promotor. Alternativ dazu kann der auf den p53-Weg
ansprechende Promotor eine synthetische, transkriptionelle Kontrollregion
sein, welche in der Gegenwart eines funktionellen p53-Weg aktiv
ist, wie zum Beispiel die auf den SRE- und PAI-RE-Weg ansprechende
Promotoren. p53CON beschreibt einen auf. den p53-Weg ansprechenden Promotor,
der ein synthetisches, auf p53 ansprechendes Element enthält, das
durch Insertion von zwei synthetischen p53-Konsenus-DNA-Bindungssequenzen (wie
beschrieben in Funk, et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2866–2871) stromaufwärts von
der SV40-TATA-Box erhalten wurde. Die Konstruktion des auf den p53CON-Weg
ansprechenden Promotors ist in Beispiel 3 der vorliegenden Erfindung
beschrieben. RGC bezieht sich auf einen synthetischen auf den p53-Weg
ansprechenden Promotor, wobei eine einzelne p53-Bindungsdomäne verwendet
wird, die im ribosomalen Gencluster identifiziert wurde (Kern, et
al. (1991) Science 252:1708–1711
und Park, et al. (1996) Mol. Carcinogenesis 16:101–108). Auf
p53CON und RGC ansprechende Elemente können durch Zusammenlagerung
von komplementären
Oligonukleotide konstruiert werden, und auf p53 ansprechende Promotoren
können
durch Klonierung in Plasmid pGL3 Promotor-Luciferase-Vektor (von
Promega kommerziell erhältlich)
konstruiert werden (wie ausführlicher
in Beispiel 3 beschrieben).
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Der
Ausdruck "Zielzelle" bezieht sich auf
eine Zelle in einem bestimmten phänotypischen Zustand, deren
Behandlung durch Verabreichung eines therapeutischen Transgens erwünscht ist.
Durch den Einsatz verschiedener auf einen Weg (pathway) ansprechender
Promotorelemente, kann man die Expression des Virus auf jede beliebige
Zelle mit einem intakten Weg (pathway) ausrichten. Zum Beispiel
kann der Repressor der viralen Replikation in einer neoplastischen
Zielzelle durch Einsatz von Promotoren exprimiert werden, die auf den
TGF-β- oder
p53-Weg ansprechen.
In ähnlicher
Weise kann der Repressor der viralen Replikation in einer arthritischen
Zielzelle durch einen auf Entzündung
ansprechenden Promotor exprimiert werden, wobei der Vektor wahlweise
für IL-10
kodiert.
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Der
Ausdruck "in funktionsfähiger Weise
gekoppelt" bezieht
sich auf eine Verbindung von Polynukleotidelementen in einer funktionellen
Beziehung. Eine Nukleotidsequenz ist "in funktionsfähiger Weise gekoppelt", wenn sie in einer
funktionellen Beziehung zu einer anderen Nukleotidsequenz platziert
wird. Zum Beispiel ist ein Promotor oder Enhancer in funktionsfähiger Weise
mit einer kodierenden Sequenz gekoppelt, wenn er die Transkription
der kodierenden Sequenz beeinflusst. In funktionsfähiger Weise
gekoppelt bedeutet, dass die gekoppelten Nukleotidsequenzen typischerweise
aufeinanderfolgend verknüpft
sind. Da jedoch Enhancer im allgemeinen funktionell sind, wenn sie
vom Promotor durch mehrere Kilobasen getrennt sind, und intronische Sequenzen.
von variabler Länge
sein können,
können
manche Polynukleotidelemente in funktionsfähiger Weise gekoppelt sein,
ohne sich direkt zu flankieren, und sie können sogar ausgehend von einem
anderen Allel oder Chromosom in trans wirken.
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Der
Ausdruck "Repressor
der viralen Replikation" bezieht
sich auf ein Protein, das, falls es in einer bestimmten Zelle exprimiert
wird, die virale Replikation wesentlich unterdrückt. Wie vom Fachmann erkannt
wird, wird der Repressor der viralen Replikation von der Natur des
ursprünglichen
adenoviralen Vektors abhängen, von
dem der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung abgeleitet
ist. Zum Beispiel kann im Fall der adenoviralen Vektoren oder anderen
DNA-Tumorviren das E2F-Rb-Fusionskonstrukt eingesetzt werden, wie
es in der Europäischen
Patentanmeldung 94108445.1, die am 6. Dezember 1995 (Publikations-Nr.
0 685 493 A1) veröffentlicht
wurde, beschrieben ist. Das E2F-Rb-Fusionsprotein besteht aus den
DNA-Bindungsdomänen und
DP1-Heterodimerisierungsdomänen
des humanen E2F-Transkriptionsfaktorproteins (Aminosäuren 95–286 des
Wildtyp-E2F), die mit der wachstumsunterdrückenden Domäne von Rb (Aminosäuren 379–928 des
Wildtyp-Rb-Proteins) fusioniert sind. Das E2F-Rb-Fusionsprotein
ist ein potenter Repressor der. E2F-abhängigen Transkription und arretiert
Zellen in der G1. Die DNA-Bindungsdomäne ist in den Aminosäuren 128–193 lokalisiert,
und die Dimerisierungsdomäne
in den Aminosäuren
194–289.
Die Sequenz des humanen E2F-1-Proteins ist unter der Zugangsnummer
M96577 (Hinterlegung am 10. August 1992) von Gen-Bank erhältlich. Die Sequenzen von anderen
Mitglieder der E2F-Familie
oder von E2F aus einer anderen Spezies kann eingesetzt werden, wenn
ein Vektor für
den Einsatz in anderen Spezies konstruiert wird. In einer Situation,
in der das rekombinante Virus auf dem adeno-assozierten Virus (AAV)
basiert, sind das rep-Protein und seine Derivate effektive Repressoren
der viralen Replikation in Abwesenheit einer Adenovirus-Infektion.
In einer Situation, in der das Virus vom Herpes simplex Virus abgeleitet
ist, kann das ICPO-NX, eine verkürzte
Form des unmittelbar frühen
Proteins ICPO (Liun, et al. (1998) J. Virol. 72:7785–7795),
als effektiver Repressor der viralen. Replikation eingesetzt werden.
In ähnlicher
Weise kann jedes Protein mit dominant negativer Aktivität als Repressor
der viralen Replikation verwendet werden.
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TGF-β und verwandte
Proteine, einschließlich
Activin, Inhibin und BMP sind potente, natürliche, antiproliferative Mittel,
und es wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von
Tumorgenizität
spielen. In seiner bioaktiven Form ist TGF-β ein disulfid-verbrücktes Homodimer
von 25 kDa und es wird praktisch in allen humanen Geweben exprimiert.
Interessanterweise haben viele maligne Zelltypen das Expressionsmuster
beibehalten, das in normalen Zellen beobachtet wird. TGF-β signalisiert
mittels heteromerer Rezeptorkomplexe von Typ I- und Typ II-Serin/Threonin-Kinaserezeptoren.
Von den zwei Rezeporkinasen besitzt der Typ II-Rezeptor eine intrinsische
Kinaseaktivität,
und bei Bindung an den TGF-β-Liganden
heteromerisiert der Typ II-Rezeptor mit dem Typ I-Rezeptor und transphosphoryliert
diesen. Die Phosphorylierung des Typ I-Rezeptors aktiviert seine Kinaseaktivität, welche
wiederum zur Phosphorylierung von Smads führt, welche intrazelluläre Effektoren
sind. Der phosphorylierte Typ I-Rezeptor überträgt Signale ins Innere der Zelle, was
zu zellulären
Reaktionen wie Wachstumsinhibierung führt. Es ist bekannt, dass die
Smad-Komplexe, sobald
sie im Nukleus sind, die Transkription von Zielgenen aktivieren,
indem sie entweder selbst als Transkriptionsfaktoren wirken, oder
indem sie die Aktivität
von anderen Transkriptionsfaktoren regulieren. Transkriptionsfaktoren
von denen angenommen wird, dass sie durch das TGF-β-Signal reguliert
werden, umfassen CTF/NF-1, FAST-1, Sp1, Jun, SRF/TRF, Oct and CREB.
Das Endergebnis dieser Interaktionen führt zu den verschiedenen bekannten
pleiotropen Effekten von TGF-β.
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Transformierender
Wachstumsfaktor-β (TGF-β) und verwandte
Proteine sind potente Inhibitoren der Proliferation von vielen Zelltypen.
Die maligne Progression von mehreren Tumoren epithelialen und hämatopoetischen
Ursprungs korreliert mit dem Verlust der anti-proliferativen und
anti-invasiven Wirkung von TGF-β. Es
wurde gezeigt, dass ein Versagen des TGF-β-Signalwegs auf Mutationen oder
Deletionen beruht oder auf fehlender Ex pression der Rezeptoren und/oder
der intrazellulären
Effektoren des Signalübertragungswegs. Viele
maligne Tumoren, die gegen TGF-β resistent
sind, sind auch in mehrfacher Hinsicht defekt für andere Tumorsuppressor-Gene,
wodurch der Nutzen des Ersatzes der Tumorsuppressor-Gene für eine effektive
Therapie begrenzt wird.
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Auf
den TGF-β-Weg
ansprechende Promotoren wurden konstruiert, indem Sequenzen vom
Plasminogen-Aktivator-Inhibitor-1 (PAI-Promotor) oder Bindungsstellen
für Smad4/DPC4
(SRE-Promotor) stromaufwärts von
der SV40-TATA-Box eingeführt
wurden. Die Aktivitäten
von diesen Promotoren wurden in transienten Transfektionsassays
bewertet, wobei Luciferase als Reporter verwendet wurde. Die Ergebnisse
werden in der folgenden Tabelle 2 dargestellt:
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Diese
Ergebnisse zeigen, dass diese beiden Promotoren nur in den Zellen
aktiv sind, die eine funktionelle TGF-β-Signaltransduktion haben. In
einer Zellinie mit defektem TGF-β-Weg,
wie zum Beispiel MDA-MB468, die aufgrund einer homozygoten Deletion
von Smad4/DPC4 im Hinblick auf die TGF-β-Signaltransduktion defekt ist,
wurde die Aktivität
der beiden oben genannten auf Wege ansprechende Elemente durch Transfektion
mit einem PAI-Promotor oder einem SRE-Promotor, der in funktionsfähiger Weise
mit Luciferase gekoppelt war, und Infektion mit einem rekombinanten
für Sma4
kodierenden Adenovirus wiederhergestellt, was die Spezifität dieser
beiden Promotoren, die auf einen Weg (pathway) ansprechende Elemente enthalten,
für den
TGF-β-Weg
weiter bestätigt,
wie durch die in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgeführten Daten
gezeigt wird.
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Ein
Plasmid, das den PAI-Promotor in funktionsfähiger Weise mit E2F-Rb gekoppelt
enthielt, wurde dann konstruiert und auf seine Fähigkeit untersucht, den E2-Promotor
selektiv in Zellen mit intaktem TGF-β-Weg zu unterdrücken. In
transienten Transfektionsassays zeigte eine Co-Transfektion des
E2-Promotors, der in funktionsfähiger
Weise. mit Luciferase gekoppelt war, und des PAI-Promotors, der
in funktionsfähiger
Weise mit E2F-Rb
gekoppelt war, eine selektive Unterdrückung der E2-Promotoraktivität in 293-Zellen
(mit normalem TGF-β-Weg)
und nicht in MDA-MB468-Zellen (mit defektem TGF-β-Weg), wie es in Tabelle 4 gezeigt
wird, was auf der selektiven Expression von E2F-Rb in 293-Zellen
beruht. Wie erwartet ergab die Co-Transfektion mit CMV-E2F-Rb, das E2F-Rb
in beiden Zellinien exprimiert, in. beiden Zellinien eine Inhibition
der Aktivität
des E2-Promotors.
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Auf
den p53-Weg ansprechende Promotoren wurden konstruiert, indem bekannte
p53-Bindungsstellen entweder aus dem ribosomalen Gencluster (RGC-Promotor)
oder hochaffine p53-Bindungsstellen (p53CON-Promotor)
eingeführt
wurden. Die Akti vitäten
dieser Promotoren wurden in transienten Transfektionsassays bewertet,
wobei Luciferase als Reporter verwendet wurde. Die Ergebnisse dieser
Experimente sind in der nachfolgenden Tabelle 5 gezeigt.
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Die
Ergebnisse zeigten, dass diese beiden Response-Elemente in Zellen
mit funktionellem p53 aktiv sind. Um zu bestätigen, dass die auf den p53-Weg
ansprechende Promotoraktivität
auf funktionellem p53 beruht, wurden zwei Zellinien, WIDR und U87,
mit einem RGC-Promotor, der die Expression des Luciferase-Gens steuert,
und entweder mit einem Adenovirus-Vektor mit leerer Kassette als.
Kontrolle (ZZCB) oder mit einem rekombinanten Adenovirus, das p53
konstitutiv unter Kontrolle des CMV-Promotors exprimiert (FTCB), co-transfiziert.
Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Tabelle 6 gezeigt.
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Wie
aus den gezeigten Daten ersichtlich, steigt die Aktivität des auf
den p53-Weg ansprechenden Promotors dosisabhängig und mit steigender p53-Aktivität.
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Rekombinante
Adenovirus-Vektoren wurden hergestellt, welche die für das E2F-Rb-Fusionsprotein kodierende
Sequenz entweder unter der Kontrolle eines auf den TGF-β-Weg ansprechenden
Promotors (PAI oder SRE) oder eines auf den p53-Weg ansprechenden
Promotors (RGC oder p53CON) enthalten. Zusätzlich wurde das für das grün fluoreszierende
Protein kodierende Gen als Reporter in die Vektoren eingefügt. Die resultierenden
Viren wurden in Assays, die auf die cytopathische Wirkung gerichtet
sind (CPE), im Hinblick auf ihre Fähigkeit untersucht, sich selektiv
in Zellen zu. replizieren und diese abzutöten, wenn diese entweder im TGF-β- oder im
p53-Weg defekt waren. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 1 der
beigefügten Zeichnungen
gezeigt. In MRC9 (positiv in Bezug auf den p53-Weg und positiv in
Bezug auf den TGF-β-Weg) war
der Wildtyp des Adenovirus in der Lage, sich zu replizieren und
sogar bei niedrigen Konzentrationen (1 × 106 Partikel/ml)
eine cytopathische Wirkung zu induzieren, während die auf TGF-β-Weg oder
p53-Weg ausgerichtete
Vektoren nicht in der Lage waren, eine cytopathische Wirkung bei
dieser Konzentration zu induzieren. Nur bei der höchsten verwendeten
Dosis (1 × 108 Partikel/ml), ergaben die auf einen Weg
(pathway) ausgerichteten Vektoren eine geringe cytopathische Wirkung.
Im Gegensatz dazu waren die auf einen Weg (pathway) ansprechenden
Vektoren in Zellinien wie WIDR (defekt sowohl im p53- als auch im
TGF-β-Weg)
und Hep3B (p53 Null und in Abwesenheit von exogenem TGF-β defekt im
TGF- β-Weg) bei
der Induktion einer cytopathischen Wirkung effektiv, ähnlich wie
der Wildtyp des Virus, sogar bei niedrigen Konzentrationen (1 × 106 Partikel/ml). Fluoreszenzmikroskopie von
Hep3B-Zellen, die mit Vektoren infiziert waren, welche auf einen Weg
(pathway) ansprechen (SRE-Ad und p53CON-Ad), zeigten ein hohes Niveau
bei der Expression des Transgens und bei der Ausbreitung des Virus
in der Kultur, sogar bei Infektion mit einer niedrigen Partikelkonzentration
(1 × 105 Partikel/ml, exponiert für zwei Stunden).
Im Gegensatz dazu zeigten Hep3B-Zellen,
die mit dem replikationsdefekten (Deletion von E1A) GFP-kodierenden
Adenovirus (GFCB) in der gleichen Konzentration (1 × 105 Partikel/ml) infiziert wurden, keine GFP-Expression.
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Wie
bereits angedeutet sind die Vektoren der vorliegenden Erfindung
zur selektiven Replikation befähigt,
sowie zur Lyse der Zielzelle unter selektiven Bedingungen. Dies
soll jedoch nicht bedeuten, dass nicht noch zusätzliche Ebenen von Selektivität oder Toxizität in diesen
Vektoren eingebracht werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus rekom binante Adenoviren
bereit, die zusätzliche
Modifikationen des viralen Genoms aufweisen, wie zum Beispiel Modifikationen
für das
Targeting, transgene Expressionskassetten oder Modifikationen des
viralen Genoms, um die selektive Replikation in einem bestimmten
Zelltyp oder in einem bestimmten phänotypischen Zustand zu ermöglichen.
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Der
Ausdruck "Modifikation
für das
Targeting" bezieht
sich auf Modifikationen des viralen Genoms, die so konstruiert sind,
dass sie zu einer bevorzugten Infektiosität eines besonderen Zelltyps
führen.
Eine Spezifität
für einen
Zelltyp oder ein auf einen Zelltyp ausgerichtetes Targeting kann
auch durch Modifikation des viralen Hüllproteins in Vektoren erreicht
werden, die von Viren abgeleitet sind, welche charakteristischerweise breite
Infektiositäten
aufweisen, wie zum Beispiel das Adenovirus. Ein Zell-Targeting wurde
zum Beispiel bei adenoviralen Vektoren durch selektive Modifikation
der viralen genomischen Sequenzen erreicht, die für Knob und
Fiber kodieren, um die Expression modifizierter Knob- und Fiberdomänen zu erreichen,
welche eine spezifische Wechselwirkung mit einzigartigen Zelloberflächenrezeptoren
aufweisen. Beispiele für
solche Modifikationen sind beschrieben in Wickham, et al. (1997)
J. Virol. 71 (11):8221–8229
(Einführung
von RGD-Peptiden in
adenovirale Fiberproteine); Arnberg, et al. (1997) Virology 227:239–244 (Modifikation
von adenoviralen Fibergenen, um Tropismus für das Auge und den Genitaltrakt
zu erreichen); Harris und Lemoine (1996) TIG 12 (10):400–405; Stevenson,
et al. (1997) J. Virol. 71 (6):4782–4790; Michael, et al. (1995)
Gene Therapy 2:660–668
(Einführung
eines Gastrinfreisetzenden Peptidfragments in adenovirale Fiberproteine);
und Ohno, et al. (1997) Nature Biotech. 15:763–767 (Einführung der Protein A-IgG-bindenden
Domäne
in Sindbis Virus). Andere Verfahren zum Erreichen eines zellspezifischen
Targetings wurden durch die Konjugation von Antikörpern oder
Antikörperfragmenten
an die Hüllproteinen
realisiert (vgl. zum Beispiel Mi chael, et al. (1993) J. Biol. Chem.
268: 6866–6869,
Watkins, et al. (1997) Gene Therapy 4: 1004–1012; Douglas, et al. (1996)
Nature Biotech. 14: 1574–1578).
Alternativ dazu können
bestimmte. Gruppen an die virale Oberfläche konjugiert werden, um ein
Targeting zu erreichen (vgl. zum Beispiel Nilon, et al. (1996) Gene
Therapy 3:280–286,
Konjugation von EGF an retrovirale Proteine). Diese rekombinant
modifizierten Vektoren können
in Übereinstimmung mit
der Ausführung
der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
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Der
Ausdruck "Transgen-Expressionskassette" bezieht sich auf
einen in der Zielzelle funktionellen Promotor, der in funktionsfähiger Weise
mit einem therapeutischen Transgen gekoppelt ist. Der Ausdruck Promotor
bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, welche sich auf die Transkription
einer anderen Nukleotidsequenz auswirken. Beispiele für Promotoren
umfassen schwache konstitutive Promotoren, temporäre virale
Promotoren oder regulierbare Promotoren.
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Der
Ausdruck "temporäre Promotoren" bezieht sich auf
Promotoren, welche die Transkription oder die Expression therapeutischer
Transgene im Vergleich zum Promotor, der die Expression des auf
den Weg (pathway) ansprechenden Promotors kontrolliert, zu einem
späteren
Zeitpunkt im viralen Lebenszyklus aktivieren. Beispiele für derartige
temporär
regulierte Promotoren umfassen den adenoviralen "major late promotor" (MLP), und andere Promotoren, wie zum
Beispiel E3. In der bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung
wird der MLP-Promotor
eingesetzt. Bei Herpes simplex-Viren könnten die latent Aktivierten
Promotoren verwendet werden.
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Der
Ausdruck "regulierbarer
Promotor" bezieht
sich auf induzierbare Promotoren, gewebsspezifische Promotoren oder
tumorspezifische Promotoren. Der Ausdruck "induzierbarer Promotor" bezieht sich auf
Promotoren, welche die Transkription des therapeutischen Transgens
bevorzugt (oder ausschließlich)
unter gewissen Bedingungen ermöglichen
und/oder in Reaktion auf externe chemische oder andere Stimuli.
Beispiele für
induzierbare Promotoren sind in der wissenschaftlichen Literatur
bekannt (vgl. zum Beispiel Yoshida und Hamada (1997) Biochem. Biophys.
Res. Comm. 230:426–430;
Iida, et al. (1996) J. Virol. 70(9):6054–6059; Hwang, et al. (1997)
J. Virol. 71(9):7128–7131;
Lee, et al. (1997) Mol. Cell. Biol. 17 (9):5097–5105; und Dreher, et al. (1997)
J. Biol. Chem. 272(46):29364–29371).
Beispiele für
durch Strahlung induzierbare Promotoren werden in Manome, et al.
(1998) Human Gene Therapy 9:1409–1417, beschrieben. Eine. zusätzliche
Ebene der Selektivität
kann durch den Einsatz von gewebs- oder tumorspezifischen Promotoren
vermittelt werden. Gewebs- und tumorspezifische Promotoren sind
dem Fachmann wohl bekannt und umfassen Promotoren, die bevorzugt
in glatten Muskeln aktiv sind (α-Aktin-Promotor),
oder pankreasspezifische (Palmiter, et al. (1987) Cell 50:435),
leberspezifische (Rovet, et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:2075;
Lemaigne, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:19896; Nitsch, et al.
(1993) Mol. Cell. Biol. 13: 494), magenspezifische (Kovarik, et
al. (1993) J. Biol. Chem. 268:9917), hypophysenspezifische (Rhodes,
et al. (1993) Genes Dev. 7:913), prostataspezifische, etc.
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Der
Ausdruck "therapeutisches
Transgen" bezieht
sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in der Zielzelle
eine therapeutischen Wirkung erzielt. Der Ausdruck therapeutisches
Transgen umfasst (ist aber nicht beschränkt auf) Tumorsuppressor-Gene,
antigenische Gene, zytotoxische Gene, zytostatische Gene, Pro-Wirkstoff
aktivierende Gene, apoptotische Gene, pharmazeutische Gene oder
anti-angiogene Gene. Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können verwendet
werden, um ein oder mehrere therapeutische Transgene zu produzieren,
entweder im Tandem durch die Verwendung von IRES-Elementen oder
durch unabhängig
regulierte Promotoren.
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Der
Ausdruck "Tumorsuppressor-Gen" bezieht sich auf
eine Nukleotidsequenz, deren Expression in der Zielzelle in der
Lage ist, den neoplastischen Phänotyp
zu unterdrücken
und/oder eine Apoptose zu induzieren. Beispiele für Tumorsuppressor-Gene, die bei der
Ausführung
der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, umfassen das p53-Gen, das APC-Gen, das DPC-4/Smad4-Gen, das BRCA-1-Gen,
das BRCA-2-Gen, das WT-1-Gen, das Retinoblastom-Gen (Lee, et al.
(1987) Nature 329:642), das MMAC-1-Gen,
das adenomatöse Polyposis
coli Protein (Albertsen, et al., US Patent 5,783,666, erteilt am
21. Juli 1998), das in Kolonkarzinomen deletierte (DCC) Gen, das
MMSC-2-Gen, das NF-1-Gen,
das Tumorsuppressor-Gen des nasopharyngialen Karzinoms, das auf
Chromosom 3p21.3 kartiert ist (Cheng, et al. (1998) Proc. Nat. Acad.
Sci. 95:3042–3047), das
MTS1-Gen, das CDK4-Gen,
das NF-1-Gen, das NF-2-Gen und das VHL-Gen.
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Der
Ausdruck "antigenische
Gene" bezieht sich
auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in der Zielzelle zur
Produktion eines antigenischen Zellobeflächenproteins führt, das
in der Lage ist, durch das Immunsystem erkannt zu werden. Beispiele
für antigenische
Gene umfassen das karzinoembryonische Antigen (CEA) und p53 (wie
beschrieben in Levine, A. PCT Internationale Veröffentlichung WO 94/02167, veröffentlicht am
3. Februar 1994). Um die Immunerkennung zu ermöglichen, kann das antigenische
Gen mit dem MHC Klasse I Antigen fusioniert werden.
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Der
Ausdruck "zytotoxisches
Gen" bezieht sich
auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle einen
toxischen Effekt bewirkt. Beispiele für solche zytotoxischen Gene
umfassen Nukleotidsequenzen, die für das Exotoxin von Pseudomonas,
das Ricin-Toxin, das Diphterie-Toxin und dergleichen kodieren.
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Der
Ausdruck "zytostatisches
Gen" bezieht sich
auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle einen
Arrest im Zellzyklus bewirkt. Beispiele für solche zytostatische Gene
umfassen p21, das Retinoblastom-Gen, das gen für das E2F-Rb-Fusionsprotein, Gene,
welche Cyclin-abhängige
Kinaseinhibitoren kodieren, wie zum Beispiel p16, p15, p18 und p19,
das Gen für
die Homeobox (GAX), welche für
einen Wachstumsarrest spezifisch ist, beschrieben in Branellec,
et al. (PCT-Publikation WO 97/16459, veröffentlicht am 9. Mai 1997,
und PCT-Publikation
WO 96/30385, veröffentlicht
am 3. Oktober 1996).
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Der
Ausdruck "Cytokin-Gen" bezieht sich auf
eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle ein Cytokin
erzeugt. Beispiele für
solche Cytokine umfassen GM-CSF, die Interleukine, insbesondere
IL-1, IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, Interferone der Subtypen α, β und γ, insbesondere
Interferon α-2b
und Fusionen, wie zum Beispiel Interferon α-2α-1.
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Der
Ausdruck "Chemokin-Gen" bezieht sich auf
eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle ein Chemokin
erzeugt. Der Ausdruck "Chemokin" bezieht sich auf
eine Gruppe von strukturell verwandten Cytokin-Faktoren mit niedrigem
Molekulargewicht, die von Zellen ausgeschieden werden, strukturell
verwandt sind, und mitogene, chemotaktische oder inflammatorische
Aktivitäten
aufweisen. Es sind meist kationische Proteine mit 70 bis 100 Aminosäureresten,
die vier konservierte Cystein-Reste gemeinsam haben. Diese Proteine
können
basierend auf dem Abstand der beiden aminoterminalen Cysteine in
zwei Gruppen unterteilt werden. In der ersten Gruppe sind die beiden
Cysteine durch eine einzige Aminosäure getrennt (C-x-C), während sie
in der zweiten Gruppe direkt benachbart sind (C-C). Beispiele für Mitglieder
der 'C-x-C' Chemokine umfassen
(sind aber nicht beschränkt
auf) den Blutplättchenfaktor
4 (PF4), das basisches Blutplättchenprotein (PBP),
Inter leukin-8 (IL-8), das die Wachstumsaktivität von Melanomen stimulierende
Protein (melanoma growth stimulatory activity protein, MGSA), das
Makrophagen inflammatorische Protein 2 (MIP-2), Maus-Mig (m119), Hühner-9E3
(oder pCEF-4), porcine alveolare Makrophagen-chemotaktische Faktoren
I und II aus dem Schwein (AMCF-I und -II), Prä-B-Zellen wachstumsstimulierender
Faktor (PBSF) und IP10. Beispiele für Mitglieder der 'C-C' Gruppe umfassen
(sind aber nicht beschränkt
auf) Monozyten chemotaktisches Protein 1 (MCP-1), Monozyten chemotaktisches
Protein 2 (MCP-2), Monozyten chemotaktisches Protein 3 (MCP-3), Monozyten chemotaktisches
Protein 4 (MCP-4), Makrophagen inflammatorisches Protein 1 α (MIP-1-α), Makrophagen
inflammatorisches Protein 1 β (MIP-1-β), Makrophagen
inflammatorisches Protein 1 γ (MIP-1-γ), Makrophagen
inflammatorisches Protein 3 α (MIP-3-α), Makrophagen
inflammatorisches Protein 3 β (MIP-3-β), Chemokin
(ELC), Makrophagen inflammatorisches Protein 4 (MIP-4), Makrophagen
inflammatorisches Protein 5 (MIP-5), LD78 β, RANTES, SIS-epsilon (p500),
Thymus und aktivierungsregulierte Chemokine (TARC), Eotaxin, I-309,
humanes Protein HCC-1/NCC-2, humanes Protein HCC-3 und das murine
Protein C10.
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Der
Ausdruck "pharmazeutisches
Protein-Gen" bezieht
sich auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression zur Produktion
eines Proteins führt,
das eine pharmazeutische Wirkung in der Zielzelle hat. Beispiele
für solche
pharmazeutischen Gene umfassen das Proinsulin-Gen und Analoga (wie
in der PCT Internationalen Patentanmeldung WO 98/31397 beschrieben),
das Wachstumshormon-Gen, Dopamin, Serotonin, epidermaler Wachstumsfaktor,
GABA, ACTH, NGF, VEGF (zur Erhöhung
der Blutperfusion zum Zielgewebe, zur Induktion der Angiogenese,
PCT-Publikation WO 98/32859, die am 30. Juli 1998 veröffentlicht
wurde), Thrombospondin, etc.
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Der
Ausdruck "pro-apoptotisches
Gen" bezieht sich
auf eine Nukleotidsequenz, deren Expression in einer Zelle zum program mierten
Zelltod führt.
Beispiele für
pro-apoptotische Gene umfassen p53, adenovirales E3-11.6K (von Ad2
abgeleitet) oder adenovirales E3-10.5K (von Ad abgeleitet), das
adenovirale E4ordf4-Gen, Gene des p53-Weg, und Gene, die für Caspasen
kodieren.
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Der
Ausdruck "Pro-Wirkstoff
aktivierende Gene" bezieht
sich auf Nukleotidsequenzen, deren Expression in einer Zelle zur
Produktion eines Proteins führt,
das in der Lage ist, eine nicht-therapeutische Verbindung in eine
therapeutische Verbindung umzuwandeln, welche die Zelle für das Abtöten durch
externe Faktoren empfindlich macht oder einen toxischen Zustand
in der Zelle verursacht. Ein Beispiel für ein Pro-Wirkstoff aktivierendes
Gen ist das Cytosin-Deaminase-Gen. Cytosin-Deaminase wandelt 5-Fluorcytosine (5-FC)
in 5-Fluoruracil (5-FU) um, ein potentes Antitumor-Mittel. Die Lyse
der Tumorzelle ergibt eine lokale Häufung von Cytosin-Deaminase,
die in der Lage ist, 5-FC an einer Stelle des Tumors in 5-FU umzuwandeln,
was zum Abtöten vieler
umgebender Tumorzellen führt.
Dies führt
zum Abtöten
einer großen
Zahl von Tumorzellen, ohne die Notwendigkeit, diese Zellen mit einem
Adenovirus zu infizieren (der sogenannte "Bystander Effekt"). Zusätzlich kann das Thymidin-Kinase
(TK)-Gen eingesetzt werden (vgl. zum Beispiel Woo, et al. US Patent
No. 5, 631, 236, erteilt am 20. Mai 1997, und Freeman, et al. US
Patent 5,601,818, erteilt am 11. Februar 1997), wobei Zellen, die
das TK-Genprodukt exprimieren für
das Abtöten
durch die Verabreichung von Gangcyclovir empfindlich werden.
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Der
Ausdruck "anti-angiogene
Gene" bezieht sich
auf Nukleotidsequenzen, deren Expression in der Zelle zur extrazellulären Sekretion
von anti-angiogenen Faktoren führt.
Antiangiogene Faktoren umfassen Angiostatin, Inhibitoren des vaskulären, endothelialen
Wachstumsfaktors (VEGF), wie zum Bei spiel Tie 2 (wie in PNAS (USA)
(1998) 95: 8795–8800,
beschrieben) und Endostatin.
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Für den Fachmann
wird ersichtlich sein, dass Modifikationen und/oder Deletionen in
den oben genannten Genen, bei denen funktionelle Subfragmente des
Wildtyp-Proteins kodiert werden, problemlos zur Ausführung der
vorliegenden Erfindung vorgenommen werden können. Zum Beispiel umfasst
die Erwähnung des
p53-Gens nicht nur
das Wildtyp-Protein, sondern auch modifizierte p53-Proteine. Beispiele
für solche
modifizierten p53-Proteine umfassen Modifikationen von p53, um die
Verweilzeit im Kern zu erhöhen,
Deletionen, wie zum Beispiel die Δ13-19-Aminosäuren, um
die Konsensus-Spaltsequenz für
Calpain zu entfernen, Modifikationen der Oligomerisierungsdomänen (wie
in Branco, et al. veröffentlichte
PCT Anmeldung WO 97/0492 oder in US Patent No. 5,573,925 beschrieben).
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Für den Fachmann
wird ersichtlich sein, dass die oben genannten therapeutischen Gene
ins Medium ausgeschieden oder an bestimmten intrazellulären Stellen
lokalisiert werden können,
indem eine zielweisende Gruppe (targeting moiety), wie zum Beispiel
ein Signalpeptid oder ein nukleäres
Lokalisierungssignal (NLS) verwendet wird. Die Definition therapeutische
Transgene umfasst auch Fusionsproteine des therapeutischen Transgens
mit dem Strukturprotein VP22 des Herpes simplex Virus vom Typ 1
(HSV-1). Wenn Fusionsproteine, die das VP22-Signal enthalten, in einer infizierten
Zelle exprimiert werden, werden sie aus der infizierten Zelle exportiert
und dringen effizient in umgebende, nichtinfizierte Zellen ein,
was eine Region mit einem Durchmesser von ca. 16 Zellen betrifft.
Dieses System ist in Kombination mit transkriptionell aktiven Proteinen (zum
Beispiel p53) besonders nützlich,
da die Fusionsproteine effizient in die Zellkerne benachbarter Zellen transportiert
werden. Vgl. zum Beispiel Elliott, G. & O'Hare, P. Cell 88: 223–233: 1997;
Marshall, A. & Castellino,
A. Rese arch News Briefs. Nature Biotech. 15: 205: 1997; O'Hare, et al. PCT-Veröffentlichung
WO 97/05265, die am 13. Februar 1997 veröffentlicht wurde. Eine ähnliche
zielweisende Gruppe, die von einem Tat-Protein von HIV abgeleitet
ist, wird. auch von Vives, et al. (1997) in J. Biol. Chem. 272:
16010–16017
beschrieben.
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Zusätzliche
Modifikationen zur Erhöhung
der Potenz der erfindungsgemäßen Vektoren
umfassen (sind aber nicht beschränkt
auf) Änderungen
innerhalb von E1, die Einführung
von Mutationen in E4 zur Erhöhung
der Zytotoxizität
(Muller, et al. (1992) J. Virol. 66: 5867–5878), Hochregulation der
viralen Todesproteine (death proteins), wie zum Beispiel die E4orf4- oder E3 11.6K-Proteine.
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In
der bevorzugten Ausführung
der Erfindung, die vorliegend beispielhaft dargestellt ist, umfasst
der Vektor der vorliegenden Erfindung einen sich bedingt replizierendes
Adenovirus, der einen auf den p53- oder TGF-β-Weg ansprechenden Promotor
enthält,
welcher die Expression des E2F-Rb-Fusionsproteins steuert, und zusätzlich das
Cytosin-Deaminase-Gen unter Kontrolle des temporären E3-Promotors umfasst. Unter
diesen Voraussetzungen wird die Cytosin-Deaminase nur nach viraler
Replikation in Tumorzellen produziert. In der bevorzugten Ausführung der
Erfindung, ist das Pro-Wirkstoff aktivierende Gen unter der Kontrolle
eines relativ schwachen, oder gewebsspezifischen oder tumorspezifischen
Promotors.
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In
einer anderen Ausführung
der Erfindung umfasst der Vektor ein rekombinantes Adenovirus mit
einem auf den p53- oder TGF-β-Weg
ansprechenden Promotor, der die Expression des E2F-Rb-Fusionsproteins steuert,
und eine Transgen-Expressionskassette, welche Cytosin-Deaminase
allein oder in einer bicistronischen Expressionskassette exprimiert,
welche Cytosin-Deaminase
und das IRES-Element und das MIP-3-alpha Protein enthält. Da die
Cytosin-Deaminase exprimiert wird, wird Zellabtötung nach Verabreichung eines Pro-Wirkstoffs,
wie zum Beispiel 5-Fluorcytosine, erreicht. Die Expression von MIP-3-alpha
auf niedrigem Niveau wird bei der Entwicklung von Antitumor-Immunität helfen.
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Kaskaden
mit mehreren Ebenen, multifunktionelle Kaskaden oder auf mehrere
Wege (pathways) ansprechende Kaskaden werden vorliegend in austauschbarer
Weise verwendet, um die Konstruktion eines auf einen Weg (pathway)
ansprechenden Elements zu beschreiben, um so eine therapeutische
Wirkung zu produzieren, wobei mehr als ein Weg (pathway) simultan
untersucht werden kann. Für
den Fachmann wird ersichtlich sein, dass die oben beschriebenen
Vektor-Kontrollelemente kombiniert werden können, um den Vektoren der vorliegenden
Erfindung mehrere Selektivitätsebenen
zu verleihen. Als ein Beispiel für
die Kontrolle auf mehreren Ebenen wäre es möglich, ein sich bedingt replizierendes
Adenovirus zu konstruieren, das sich replizieren und Zellen abtöten kann,
die entweder im Rb-, TGF-β-
oder p53-Weg einen
Defekt aufweisen. Ein solcher Vektor würde als eine erste Kontrollebene
die Expression eines dominant negativen Inhibitors der viralen Replikation
einschließen,
welcher durch einen auf den p53-Weg ansprechenden Promotor kontrolliert wird.
Als Ergebnis wird in jeder beliebigen Zelle (wie zum Beispiel in
normalen Zellen) mit funktionellem p53, aber nicht in Zellen mit
inaktivem p53, der dominant negative Inhibitor exprimiert und die
virale Replikation wird blockiert. Dieser Vektor kann sich jedoch
in Tumorzellen replizieren, die funktionelles p53 haben, aber Defekte in
anderen Wegen (pathways) aufweisen, wie zum Beispiel im TGF-β- und Rb-Weg.
Deshalb können
zusätzliche
Kontrollebenen eingeführt
werden, die im wesentlichen das funktionelle p53 in Tumorzellen
inaktivieren, wodurch die virale Replikation erlaubt wird, wenn
andere Wege defekt sind.
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Als
eine zweite Kontrollebene könnte
der gleiche Vektor auch eine Expressionskassette enthalten, die das
adenovirale E1B-55K Protein enthält,
das p53 funktionell inaktivieren kann, und das unter Kontrolle eines Promotors
steht, der nur in Zellen mit einem defekten TGF-β-Weg aktiv ist. Ein Promotor,
der nur in Zellen mit einem defekten TGF-β-Weg aktiv ist, kann durch die
Einführung
von Repressor-Bindungsstellen innerhalb des Promotors konstruiert
werden, so dass die Expression des Repressors unter Verwendung eines
auf den TGF-β-Weg
ansprechenden Promotors anderswo im Vektor zur Blockade der Promotor-Aktivität in Zellen
mit intaktem TGF-β-Signalweg
führt.
Auf der anderen Seite wird der Repressor in Zellen, in denen der
TGF-β-Weg defekt ist, nicht
synthetisiert, und somit wird der Promotor aktiv sein. Wegen der
Expression von E1B-55K durch diesen Promotor, der nur in Zellen
aktiv ist, deren TGF-β-Weg
defekt ist, wird endogenes p53 inaktiviert. Alternativ dazu kann
jeder beliebige natürliche
Promotor verwendet werden, der durch den TGF-β-Signalweg herunterreguliert
wird. Die Einbeziehung der beiden oben genannten Expressionskassetten
wird absichern, dass der dominant negative Inhibitor nur dann exprimiert
wird, wenn sowohl der p53- als auch der TGF-β-Weg normal sind (was zur Blockade
der Replikation führt),
aber nicht wenn einer oder beide defekt sind (was zur viralen Replikation
führt).
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Als
eine dritte Kontrollebene wird im gleichen Vektor die Expression
eines Proteins, wie zum Beispiel Smad7 oder jede beliebige andere
dominant negative Form von Smad erreicht, die in der Lage ist, den TGF-β-Weg zu inaktivieren
(Nakao, et al., Nature 1997, Okt. 9; 389 (6651): 631–635), welcher
durch einen auf E2F ansprechenden Promotor kontrolliert wird. Ein
auf E2F ansprechender Promotor (wie zum Beispiel der E2F1-Promotor,
der E2-Promotor oder ein synthetischer Promotor mit mehreren E2F-Bindungsstellen
stromaufwärts
von einem minimalen Promotor, wie zum Beispiel der SV40-TATA-Box)
ist aktiv, wenn der Rb-Weg defekt ist. Wegen dieser dritten Kontrollebene
wird Smad7 in Zellen exprimiert, die einen defekten Rb-Weg haben,
was wiederum Smad4 inaktiviert und die TGF-β-Signaltransduktion blockiert.
Deshalb wird E1B-55K hergestellt und p53 wird inaktiviert, was zum
Ausfall der Expression des dominant negativen Inhibitors führt. Deshalb
kann die virale Replikation ungehindert fortschreiten. Auf der anderen
Seite wird Smad7 nicht synthetisiert, wenn der Rb-Weg normal ist,
wodurch die TGF-β-Signaltransduktion
normal verläuft.
Somit wird kein E1B-55K erzeugt, was zu funktionellem p53 führt, das
in der Lage ist, den dominant negativen Inhibitor zu exprimieren,
um die virale Replikation zu blockieren.
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Mit
den drei oben beschriebenen Kontrollebenen wird ein Defekt in einer
beliebigen oder in zweien oder in allen drei Wegen (Rb, TGF-β und p53)
schließlich
zur viralen Replikation und zur Zelllyse führen. Die virale Replikation
wird nur dann nicht eintreten, wenn alle drei Wege funktionstüchtig sind,
wie es in normalen Zellen der Fall ist.
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Wie
vom Fachmann erkannt werden wird, können die Vektoren der vorliegenden
Erfindung in vielen Abwandlungen verwendet werden, das heißt für den Nachweis
und die Behandlung einer breiten Vielfalt von Defekten in einem
Weg (pathway), wobei eine Vielzahl von auf einen Weg (pathway) ansprechenden
Promotoren verwendet werden kann. In der vorliegend beispielhaft
dargestellten Ausführung
der Erfindung wird der rekombinante adenovirale Vektor jedoch von
der Gattung Adenoviridae abgeleitet. Besonders bevorzugte Viren
werden vom humanen Adenovirus Typ 2 oder Typ 5 abgeleitet. Wenn
ein adenoviraler Vektor als Ausgangsvektor verwendet wird, ist der
bevorzugte Inhibitor der viralen Replikation das E2F-Rb-Fusionsprotein.
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In
der bevorzugten Ausführung
der Erfindung ist es bei Verwendung der erfindungsgemäßen Vektoren zur
Behandlung von Krankheiten mit unkontrollierter Zellproliferation
bevorzugt, dass ein adenoviraler Vektor eingesetzt wird, der spezifische
Deletionen in der E1A-Region aufweist, um so die Fähigkeit
des E1a-Genprodukts zu eliminieren, an die p300- und die Rb-Proteine zu binden,
wobei die transaktivierende Funktion der E1A CR3-Domäne erhalten
bleibt. Die erfindungsgemäßen Vektoren
weisen Deletionen in der für
E1a kodierenden Sequenz auf, um Bindungsstellen für p300 und
p105-Rb in der für
13S kodierenden Sequenz zu eliminieren. In der bevorzugten Ausführung der
Erfindung werden die Deletionen für die p300-Bindung durch Deletionen
der Aminosäuren
von etwa 4 bis etwa 25 oder von etwa 36 bis etwa 49 realisiert.
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Die
Deletionen in der für
E1a289R kodierenden Sequenz, die erforderlich sind, um die p300-
und Rb-Bindung zu eliminieren, sind bevorzugt so klein wie möglich, um
eine bedeutende Störung
der Sekundär- und
Tertiär-Struktur
des E1a289-Proteins zu verhindern. Um die p300-Bindung zu eliminieren,
wird es bevorzugt, dass eine Mutation in die DNA-Sequenz eingeführt wird,
welche für
die p300-Bindungsdomäne
von 289R kodiert. Deletionen von weniger als etwa 30 Aminosäuren in
der C-terminalen Region sind zur Eliminierung der p300-Bindung bevorzugt,
obwohl kleinere Modifikationen stärker bevorzugt sind. Zum Beispiel
ist alternativ dazu eine Deletion der Aminosäuren 4 bis 25 (411101), von
etwa Aminosäure
30 bis Aminosäure
49 (411103) und insbesondere von 36 bis 49 bevorzugt, um die p300-Bindung
zu eliminieren. Punktmutationen, die ausreichen, um die p300-Bindung zu zerstören, sind
besonders bevorzugt. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass eine Punktmutation
in der zweiten Aminosäure
im 289R Protein von Arginin zu Glycin (Arg2 → Gly2) die p300-Bindung zerstören kann
(vgl. zum Beispiel pm563, Whyte, et al. (1989) Cell 56: 67–75). In ähnlicher
Weise werden minimale Modifikationen bezüglich der Eliminierung der
pRb105-Bindung bevorzugt. Eliminierung von ausgewählten Aminosäuren in
der pRb105-Bindungsdomäne,
wie zum Beispiel Aminosäuren
111–123
(dl1107) und Aminosäuren
124–127
(dl1108) sind bevorzugt. Die Deletion der Aminosäuren 111–123 (dl1107) ist besonders bevorzugt,
da sie die p107-Bindungsaktivität
des 289R Proteins erhält.
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Zusätzlich kann
die Eliminierung der Aminosäuren
von etwa 219 bis 289 des E1a 289R-Proteins und 173 bis 243 des E1A
243R-Proteins eingeführt
werden. Zum Beispiel wird durch Einführung einer Punktmutation an
einer Position, die der Position 1131 im humanen Ad5-Genom (d.h. Änderung
des Cytosins1131 zu einem Guanin) entspricht,
ein Stop-Codon gebildet. Diese Mutation resultiert in der Eliminierung
der Aminosäuren 219
bis 289 des E1a 289R-Proteins und 173 bis 243 des E1A 243R-Proteins. Diese Mutation
kann wahlweise zusätzlich
zu den oben beschriebenen Deletionen in der Rb- und p300-Bindung
gemacht werden. Zusätzliche Beispiele
für solche
Ausgangsvektoren sind in den parallel anhängigen US Patentanmeldungen
mit den Seriennummern 60/104,317 und 08/09/172,684 beschrieben,
die am 15. Oktober 1998 eingereicht wurden.
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In
der bevorzugten Ausführung
der Erfindung ist das therapeutische Gen einen Pro-Wirkstoff aktivierendes
Gen, zum Beispiel Cytosin-Deaminase. In der bevorzugten Ausführung der
Erfindung kodiert der Vektor gemäß der vorliegenden
Erfindung MIP-3-alpha, um eine Antitumor-Immunität zu induzieren.
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Bevorzugte
Promotoren für
die Expression des therapeutischen Gens sind die temporären Promotoren,
wie zum Beispiel MLP und E3.
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In
adenoviralen Konstrukten wird die Eliminierung oder Verzögerung der
Wirkung des AD E3-11.6K Proteins erreicht, um die durch den Adenovirus
induzierte Zelllyse solange zu minimieren, bis die virale Replikation
eingetreten ist. Insbesondere wäre
die Eliminierung des nativen E3-11.6K/10.5K Gens bevorzugt. Dies würde die
Immunantwort bis nach dem Auftreten der initialen Runde der lokalen
Ausbreitung minimieren. Die Immunantwort wäre zu diesem späteren Zeitpunkt,
wenn die Apoptose der initial infizierten Zellen erreicht wird, und
die lokale Ausbreitung des Virus ermöglicht wird, vorteilhaft. Das
11.6K Protein (oder das entsprechende E3-10.5K Protein von Ad5)
ist ein pro-apoptotisches Gen und kann verwendet werden, um die
Zellabtötung
in Tumorzellen zu erreichen. Da man jedoch anstrebt, dass die frühe Lyse
der Zielzelle verzögert
wird, um virale Replikation zu maximieren, ist es bevorzugt, dass
das 11.6K/10.5K-Gen unter Kontrolle eines temporären Promotors gestellt wird,
wie zum Beispiel des MLP-Promotors, um den Beginn seines apoptotischen
Effekts zu verzögern.
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Pharmazeutische
Formulierungen
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine pharmazeutisch akzeptable
Formulierung des rekombinanten Virus in Kombination mit einem Träger bereit.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung können in der Praxis durch die
Zugabe von Trägern
und Hilfsstoffen für
die dosierte Verabreichung formuliert werden, wie es herkömmlicher
pharmazeutischer Praxis entspricht. Dosierte Formulierungen können intravenöse, intratumorale, intramuskuläre, intraperitoneale,
topische, Matrix- oder
Aerosol-Verabreichung umfassen.
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Der
Ausdruck "Träger" bezieht sich auf
Verbindungen, wie sie üblicherweise
bei der Formulierung pharmazeutischer Verbindungen verwendet werden,
um Stabilität,
Sterilität
und Verabreichbarkeit der pharmazeutischen Verbindung zu verbessern.
Wenn das Virus als. Lösung
oder Suspension formuliert wird, liegt das Verabreichungssystem
in einem akzeptablen Träger
vor, vorzugsweise in einem wässrigen
Träger.
Eine Vielzahl wässriger
Träger
kann verwendet werden, zum Beispiel Wasser, gepuffertes Wasser,
0.8% Salzlösung, 0,3%
Glycin, Hyaluronsäure
und dergleichen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche,
wohlbekannte Sterilisationstechniken sterilisiert werden, oder sie
können
sterilfiltriert werden. Die resultierenden wässrigen Lösungen können ohne Veränderung
zur Verwendung verpackt werden, oder sie können lyophilisiert werden,
wobei die lyophilisierte Zubereitung vor der Verabreichung mit einer
sterilen Lösung
kombiniert wird. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch akzeptable
Zusatzsubstanzen enthalten, soweit diese erforderlich sind, um sich
physiologischen Bedingungen zu nähern,
wie zum Beispiel Mittel zur pH-Einstellung und
Puffermittel, Mittel zur Anpassung der Tonizität, Benetzungsmittel und dergleichen,
zum Beispiel Natriumacetat, Natriumlaktat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid,
Calciumchlorid, Sorptions-Monolaurat, Triethanolaminoleat, etc.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner pharmazeutische Formulierungen
des Virus mit einem Träger und
einem oder mehreren die Verabreichung verbessernden Mittel bereit.
Die Begriffe "Verabreichungsverbesserer" oder "die Verabreichung
verbesserndes Mittel" werden
vorliegend in austauschbarer Weise verwendet und umfassen eines
oder mehrere Mittel, welche die Aufnahme des Virus in die Zielzelle
erleichtern. Beispiele für
Verabreichungsverbesserer sind in den parallel anhängigen US-Patentanmeldungen
mit den Seriennummern 09/112,074, die am 8. Juli 1998 eingereicht
wurde, und 08/938,089, die am 26. September 1997 eingereicht wurde,
beschrieben. Beispiele für
solche die Verabreichung verbessernde Mittel umfassen Detergentien, Alkohole,
Glykole, oberflächenaktive
Substanzen, Gallensalze, Heparin-Antagonisten, Cyclooxygenase-Inhibitoren,
hypertonische Salzlösungen
und Acetate. Alkohole umfassen zum Beispiel die aliphatischen Alkohole, wie
zum Beispiel Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, Butylalkohol, Acetylalkohol.
Glykole umfassen Glycerin, Propylenglykol, Polethylenglykol und
andere Glykole mit niedrigem Molekulargewicht, wie zum Beispiel
Glycerol und Thioglycerol. Acetate, wie zum Beispiel Essigsäure, Glukonsäure und
Natriumacetat, sind weitere Beispiele für die Verabreichung verbessernde
Mittel. Hypertonische Salzlösungen,
wie zum Beispiel 1 M NaCl sind ebenfalls Beispiele für die Verabreichung
verbessernde Mittel. Beispiele für
oberflächenaktive
Substanzen sind Natriumdodecylsulfat (SDS) und Lysolecithin, Polysorbat
80, Nonylphenoxypolyoxyethylen, Lysophosphatidylcholin, Polyethylenglykol
400, Polysorbat 80, Polyoxyethylenether, Polyglykolether und DMSO.
Gallensalze, wie zum Beispiel Taurocholat, Natrium-Taurodesoxycholat,
Desoxycholat, Chenodesoxycholat, Glykocholinsäure, Glykochenodesoxycholatsäure, sowie
andere Adstringenzien, wie zum Beispiel Silbernitrat, können verwendet
werden. Heparin-Antagonisten, wie zum Beispiel quartäre Amine,
wie zum Beispiel Protaminsulfat, können ebenfalls verwendet werden.
Cyclooxygenase-Inhibitoren,
wie zum Beispiel Natriumsalicylat, Salicylsäure und nichtsteroidale anti-inflammatorische
Wirkstoffe (NSAIDS), wie zum Beispiel Indomethacin, Naproxen, Diclofenac
können
verwendet werden.
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Der
Ausdruck "Detergens" umfasst anionische,
kationische, zwitterionische und nichtionische Detergentien. Exemplarische
Detergentien umfassen (sind aber nicht beschränkt auf) Taurocholat, Desoxycholat, Taurodesoxycholat,
Cetylpyridinium, Benalkoniumchlorid, Zwittergent 3-14 Detergens,
CHAPS (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammoniol]-1-propansulfonat-Hydrat,
Big CHAP, Desoxy Big CHAP, Triton X-100-Detergens, C12E8, Octyl-B-D-Glucopyranosid,
PLURONIC-F68-Detergens, Tween 20-Detergens, und Tween 80-Detergens
(Calbiochem Biochemicals).
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Einheits-Dosis-Formulierungen
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
in einen Kit mit Produkten einbezogen werden, der das rekombinante
Virus gemäß Anspruch
1 in lyophilisierter Form sowie eine Lösung zur Rekonstitution des
lyophilisierten Produkts enthält.
Rekombinante Viren gemäß der vorliegenden
Erfindung können
mit herkömmlichen
Verfahren lyophilisiert und rekonstituiert werden.
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Die
Vektoren der vorliegenden Erfindung können auch in Kombination mit
Calpain-Inhibitoren verabreicht werden. Der "Calpain-Inhbitor" (abgekürzt als "CI")
bezieht sich auf eine Verbindung, welche die proteolytische Tätigkeit
von Calpain-I, zum Beispiel von μ-Calpainen,
inhibiert. Der Ausdruck Calpain-Inhibitor
umfasst wie vorliegend verwendet solche Verbindungen, die zusätzlich zu
ihren anderen biologischen Aktivitäten oder unabhängig von
diesen eine inhibitorische Aktivität für Calpain I aufweisen. Für eine große Vielzahl
von Verbindungen ist gezeigt worden, dass sie bei der Inhibierung
der proteolytischen Tätigkeit
von Calpainen aktiv sind. Beispiele für Calpain-Inhibitoren, die
bei der Ausführung
der vorliegenden Erfindung nützlich
sind, umfassen N-Acetyl-Leu-Leu-Norleucinal, das auch als "Calpain-Inhibitor
1" bekannt ist.
Bei Calpain-Inhibitoren
ist beobachtet worden, dass sie die Infektiosität von Zellen bezüglich viraler
Vektoren erhöhen,
die Transkriptionsrate von Promotoren erhöhen, indem sie die Mengen der
Transkriptionsfaktoren NF-kappa-B und AP-1 erhöhen, und die CTL-Antwort auf
adenovirale Vektoren vermindern. Daher können die Formulierungen und
Verfahren der vorliegenden Erfindung wahlweise Calpain-Inhibitoren
umfassen. Calpain-Inhibitoren und ihre Anwendungen sind beschrieben
in Atencio, et al., parallel anhängige
US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 60/104,321 und 09/073,076,
die am 15. Oktober 1998 eingereicht wurden.
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Verfahren
zur Verwendung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Abtöten einer
Zelle mit einem Defekt in einem regulatorischen Weg (pathway) bereit,
wobei die Zielzelle mit einem erfindungsgemäßen, selektiv replizierenden Vektor
in Kontakt gebracht wird. In einer hier dargestellten Ausführungsform
der Erfindung ist die Zelle, die einen Defekt in einem Weg (pathway)
aufweist, eine neoplastische Zelle. Der Ausdruck "neoplastische Zelle" bezieht sich auf
eine Zelle, die einen anormalen Phänotyp in Bezug auf das Wachstums
zeigt, welcher durch eine Unabhängigkeit
von normalen, zellulären
Wachstumskontrollen charakterisiert ist. Da sich neoplastische Zellen
nicht notwendigerweise zu jedem beliebigen Zeitpunkt replizieren,
umfasst der Ausdruck neoplastische Zellen solche Zellen, die sich
aktiv replizieren, oder sich in einem temporären, nicht-replikativen Ruhestadium befinden
(G1 oder G0). Lokalisierte Populationen von neoplastischen Zellen
werden als Neoplasmen bezeichnet. Neoplasmen können bösartig oder gutartig sein.
Bösartige
Neoplasmen werden auch als Krebs bezeichnet. Der Ausdruck Krebs
und die Bezeichnung Tumor werden vorliegend in austauschbarer Weise
verwendet. Neoplastische Transformation bezieht sich auf die Umwandlung
einer normalen Zelle in eine neoplastische Zelle, oftmals in eine
Tumorzelle.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, um neoplastische
Zellen in einem Säugetier-Organismus
in vivo durch Verabreichung einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung
des erfindungsgemäßen rekombinanten
Adenovirus zu entfernen. Der Ausdruck "entfernen" bedeutet die wesentliche Verringerung der
Population von lebensfähigen,
neoplastischen Zellen, um so die physiologischen Schädigungen
durch die Anwesenheit der neoplastischen Zellen zu lindern. Der
Ausdruck "wesentlich" bedeutet eine Reduktion
der Population von lebensfähigen
neoplastischen Zellen in dem Säugetier-Organismus
um mehr als ca. 20 % der Population vor der Behandlung. Der Ausdruck "lebensfähig" bedeutet das Vorliegen
der unkontrollierten regulatorischen Eigenschaften von Wachstums
und Zellzyklus in einer neoplastischen Zelle. Der Ausdruck "lebensfähige neoplastische
Zelle" wird vorliegend
verwendet, um die Zellen von neoplastischen Zellen zu unterscheiden,
die sich nicht mehr replizieren können. Zum Beispiel kann nach
der Behandlung eine Tumormasse verbleiben, wobei jedoch die Zellen,
welche die Tumormasse bilden, tot sein können. Diese toten Zellen wurden entfernt
und ihnen fehlt die Fähigkeit
zur Replikation, obwohl etwas Tumormasse verbleiben kann.
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Der
Ausdruck "Säugetier-Organismus" umfasst (ist aber
nicht beschränkt
auf) Menschen, Schweine, Pferde, Rinder, Hunde, Katzen. Vorzugsweise
verwendet man einen adenoviralen Vektor, der in Bezug auf den behandelten
Typ von Säugetier
endogen ist. Obwohl es im Allgemeinen bevorzugt ist, einen Virus
der zu behandelnden Spezies einzusetzen, kann es in manchen Situationen
vorteilhaft sein, Vektoren zu verwenden, die von anderen Spezies
abgeleitet wurden, und die vorteilhafte pathogene Eigenschaften
aufweisen. Zum Beispiel wird berichtet (WO 97/06826, veröffentlicht
am 10. April 1997), dass ovine adenovirale Vektoren bei der humanen
Gentherapie eingesetzt werden können,
um die Immunantwort zu minimieren, welche für humane adenovirale Vektoren
charakteristisch ist. Durch Minimierung der Immunantwort wird die
schnelle systemische Entfernung des Vektors vermieden, was zu einer
verlängerten
Aktivität
des Vektors führt.
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Die
Vektoren der vorliegenden Erfindung sind besonders für die Behandlung
von Tumoren geeignet, die mit einem Mangel an anti-proliferativer
Wirkung von TGF-β assoziiert
sind; diese umfassen (sind jedoch nicht beschränkt auf) Brustkarzinome, Hepatome,
Magen-, Dickdarm- und Haut-Tumore, sowie Lymphome bei B-Zellen und
T-Zellen (Markowitz und Roberts, 1996). Mutationen des TGF-β-Rezeptors
vom Typ II sind in Magen- und Dickdarm-Karzinomen, sowie in Plattenepithelkarzinomen
von Kopf und Nacken identifiziert worden. Mutationen oder Deletionen
des Rezeptors vom Typ I sind auch im Kaposi-Sarkom, sowie in Brust-,
Eierstock- und kolorektalen Tumoren gefunden worden. Unter den intrazellulären Effektoren
des TGF-β-Signalwegs
wurden Smads, Smad4/DPC4, als Kandidaten für Tumorsuppressor-Gene identifiziert,
die in fast 50% der Pankreas-Tumoren verändert waren. Die Veränderung
im DPC4-Gen sind auch Tumoren von Dickdarm, Brust und Eierstock
gefunden worden, wenn auch in einer viel geringeren Häufigkeit.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung sind insbesondere für die Behandlung
von TGF-β-insensitiven Tumoren
geeignet, wie zum Beispiel Pankreas-Krebs.
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Die
Vektoren der vorliegenden Erfindung sind auch für die Behandlung von Tumorzellen
mit Defekten im p53-Weg geeignet. Diese Tumoren umfassen solche,
die Veränderungen
in p53, mdm2 und p14/p19ARF(INK4a-Gen) aufweisen. Die Vektoren der
vorliegenden Erfindung sind auch für die Behandlung von Tumorzellen
mit Defekten im Rb-Weg geeignet. Defekte im Rb-Weg entstehen durch
Veränderungen
in Rb, Cyclin D, cyclinabhängigen
Kinasen (wie zum Beispiel CDK4) und p16 (INK4a-Gen).
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Während die
vorliegende Erfindung nur ein Verfahren zur Verwendung der rekombinanten
Adenoviren bereitstellt, können
die Adenoviren der vorliegenden Erfindung und Formulierungen derselben
in Kombination mit herkömmlichen
chemotherapeutischen Mitteln oder Behandlungsregimen eingesetzt
werden. Beispiele für solche
chemotherapeutische Substanzen umfassen Inhibitoren der Purinsynthese
(zum Beispiel Pentostatin, 6-Mercaptopurin,
6-Thioguanin, Methotrexat) oder der Pyrimidinsynthese (zum Beispiel
Pala, Azarbin), der Umwandlung von Ribonukleotiden zu Desoxyribonukleotiden
(zum Beispiel Hydroxyharnstoff), sowie Inhibitoren der dTMP-Synthese
(5-Fluoruracil), DNA-schädigende
Mittel (zum Beispiel Strahlung, Bleomycine, Etoposid, Teniposid,
Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Mitoxantron, alkylierende
Mittel, Mitomycin, Cisplatin, Procarbazin) sowie auch Inhibitoren
der Mikrotubulus-Funktion
(zum Beispiel Vinca-Alkaloide und Colchizin). Chemotherapeutische
Behandlungsverfahren beziehen sich vor allem auf nicht chemische
Vorgehensweisen, um neoplastische Zellen zu entfernen, wie zum Beispiel
Strahlungstherapie. Beispiele für
eine Kombinationstherapie mit p53 als therapeutischem Gen sind in
Nielsen et al. WO/9835554A2 beschrieben, die am 20. August 1998
veröffentlicht
wurde.
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Die
Immunantwort auf wiederholte Verabreichungen von viralen Vektoren
in vivo ist signifikant. Demnach können die Vektoren der vorliegenden
Erfindung in Kombination mit immunsuppressiven Mitteln verabreicht
werden. Beispiele für
immunsuppressive Mittel umfassen Cyclosporin, Azathioprin, Methotrexat,
Cyclophosphamid, Lymphozyten-Immunglobulin, Antikörper gegen
den CD3-Komplex, Adrenokortikosteroide, Sulfasalzain, FK-506, Methoxsalen
und Thalidomid.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein ex vivo Verfahren zur Entfernung
neoplastischer Zellen innerhalb einer Population von normalen Zellen
bereit, die mit den neoplastischen Zellen kontaminiert sind; erreichbar
durch Verabreichung eines rekombinanten Adenovirus der vorliegenden
Erfindung an die besagte Population. Ein Beispiel für die Anwendung
eines solchen Verfahrens wird gegenwärtig bei ex vivo Anwendungen eingesetzt,
wie zum Beispiel bei der Reinigung von autologen Stammzellprodukten,
die im Allgemeinen als "Knochenmark-Purging" bekannt ist. Der
Ausdruck "Stammzellprodukt" bezieht sich auf
eine Population von hämatopoetischen
Zellen, Vorläuferzellen
und Stammzellen, die in der Lage ist, die langfristige hämatopoetische
Funktion eines Patienten wiederherzustellen, nachdem er eine myoablative
Therapie erhalten hat. Stammzellprodukte werden in herkömmlicher
Weise durch Apherese (Blutreinigung) von mobilisiertem oder nicht-mobilisiertem peripheren
Blut erhalten. Die Apherese wird in herkömmlicher Weise durch Verwendung bekannter
Vorgehensweisen erreicht, wobei. eine kommerziell erhältliche
Apherese-Apparatur
verwendet wird, wie zum Beispiel das COBE Spectra Apherese-System,
das von COBE International, 1185 Oak Street, Lakewood, CO, kommerziell
erhältlich
ist. Es ist bevorzugt, dass die Behandlungsbedingungen so optimiert sind,
dass ein "3-Log-Purge" (d.h. eine Entfernung
von ca. 99,9 der Tumorzellen aus dem Stammzellprodukt) und besonders
bevorzugt ein "5-Log-Purge" (Entfernung von
ca. 99,999% der Tumorzellen aus dem Stammzellprodukt) erreicht wird.
In der bevorzugten Ausführung
der Erfindung würde
ein Stammzellprodukt mit einem Volumen von 100 ml bei einem Verhältnis von
Partikelzahl zu kernhaltigen Zellen von ca. 2 × 1011 der
erfindungsgemäßen Vektoren
für einen
Zeitraum von ca. 4 Stunden bei 37°C
behandelt.
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Diagnostische
Anwendungen
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Zusätzlich zu
den oben beschriebenen therapeutischen Anwendungen, sind die Vektoren
der vorliegenden Erfindung auch für diagnostische Zwecke nützlich.
Zum Beispiel können
die Vektoren der vorliegenden Erfindung ein Reportergen enthalten,
das bei einer viralen Infektion oder Replikation exprimiert wird.
Der Ausdruck "Reportergen" bezieht sich auf
ein Gen, dessen Produkt in der Lage ist, entweder allein oder in
Kombination mit zusätzlichen
Elementen ein nachweisbares Signal zu erzeugen. Beispiele für Reportergene
umfassen das β-Galaktosidase-Gen,
das Luciferase-Gen, das Gen für
dass grün
fluoreszierende Protein, Nukleotidsequenzen, die für Proteine
kodieren, welche durch bildgebende Systeme, wie zum Beispiel Röntgenstrahlen oder
Magnetfeld (MRI)-Bildgebungssysteme, nachweisbar sind. Solche Vektoren
wären nützlich,
um die Gegenwart eines funktionellen Wegs nachzuweisen (zum Beispiel
p53- oder TGF-β-Weg).
Alternativ dazu können solche
Vektoren auch eingesetzt werden, um ein Zelloberflächenprotein
zu exprimieren, das in der Lage ist, durch Bindung eines Moleküls, wie
zum Beispiel eines fluoreszent markierten Antikörpers, erkannt zu werden. Alternativ
dazu können
in Fällen,
in denen der auf einen Weg (pathway) ansprechende Promotor verwendet wird,
um die Expression eines Repressors der viralen Replikation (zum
Beispiel E2F-Rb) zu steuern, späte
virale Promotoren (zum Beispiel E2, welcher durch E2F-Rb oder einen
beliebigen anderen Promotor mit Repressorbindungsstellen, wie zum
Beispiel E2F-Bindungsstellen) verwendet werden, um die Expression
des Reportergens für
diagnostische Anwendungen zu steuern, wenn der auf den Weg (pathway)
ansprechende Promotor ausgeschaltet ist. Diese diagnostischen Konstrukte
können
für diagnostische
Zwecke in vivo oder in vitro verwendet werden. Beispiele für Anwendungen
in vivo umfassen bildgebende Anwendungen, wie zum Beispiel Röntgenstrahlen,
CT-Untersuchungen oder Magnetresonanz-Bildgebungsverfahren (MRI).
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Verfahren
zur Herstellung der Vektoren
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung
der oben beschriebenen rekombinanten Viren bereit, bei dem man:
- a. eine Herstellerzelle mit einem rekombinanten
Virus infiziert,
- b. die infizierte Herstellerzelle unter Bedingungen kultiviert,
welche die Replikation des viralen Genoms in der Herstellerzelle
erlauben,
- c. die Herstellerzellen aberntet, und
- d. das rekombinanten Virus aufreinigt.
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Der
Ausdruck "Infektion" bedeutet, das das
rekombinante Virus der Herstellerzelle unter Bedingungen ausgesetzt
wird, so dass die Infektion der Herstellerzelle mit dem rekombinanten
Adenovirus erleichtert wird. In Zellen, die mit mehreren Kopien
eines bestimmten Virus infiziert wurden, sind die für die virale
Replikation und die Virion-Verpackung notwendigen Aktivitäten kooperativ.
Deshalb ist es bevorzugt, dass die Bedingungen so eingestellt werden,
dass eine erhebliche Wahrscheinlichkeit dafür vorliegt, dass die Herstellerzellen mehrfach
mit dem Virus infiziert sind. Ein Beispiel für eine Be dingung, welche die
Herstellung des Virus in den Herstellerzellen begünstigt,
ist eine erhöhte
Virus-Konzentration in der Infektionsphase. Es ist jedoch möglich, dass
die Gesamtzahl an viralen Infektionen pro Herstellerzelle übertrieben
wird, was zu toxischen Effekten für die Zelle führt. Somit
sollte man sich bei den Infektionen bemühen, die Viruskonzentration
im Bereich von 1 × 106 bis 1 × 1010 zu halten, bevorzugt bei etwa 1 × 109 Virionen pro ml. Es können auch chemische Mittel
verwendet werden, um die Infektiosität der Herstellerzelllinie zu
erhöhen.
Zum Beispiel stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Erhöhung
der Infektiosität
von Herstellerzelllinien für
die virale Infektiosität
bereit, indem ein Calpain-Inhibitor
einbezogen wird. Beispiele für
Calpain-Inhibitoren, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung
nützlich
sind, umfassen Calpain-Inhibitor 1 (auch bekannt als N-Acetyl-Leucyl-Leucyl-Norleucinal,
kommerziell erhältlich
von Boehringer Mannheim). Es wurde beobachtet, dass der Calpain-Inhibitor 1 die Infektiosität der Herstellerzelllinien
für rekombinante
Adenoviren erhöht.
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Der
Ausdruck "Herstellerzelle" bezieht sich auf
eine Zelle, die in der Lage ist, die Replikation des zu erzeugenden
viralen Genoms des rekombinanten Adenovirus zu ermöglichen.
Eine Vielzahl von Säugetier-Zelllinien
für die
Kultur von rekombinanten Adenoviren sind öffentlich verfügbar. Zum
Beispiel ist die 293-Zellinie (Graham und Smiley (1977) J. Gen.
Virol. 36: 59–72)
konstruiert worden, um die Defekte in der E1-Funktion zu komplementieren, und sie
ist eine bevorzugte Zellinie für
die Produktion der aktuellen Vektoren. Beispiele für andere
Herstellerzelllinien umfassen HeLa-Zellen, PERC.6-Zellen (wie in der
Publikation WO/97/00326 beschrieben, Anmeldenummer PCT/NL96/00244).
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Der
Ausdruck "kultivieren
unter Bedingungen, welche die Replikation des viralen Genoms erlauben" bedeutet das Auf rechterhalten
der Bedingungen für
die infizierte Herstellerzelle, um so dem Virus die Vermehrung in
der Herstellerzelle zu ermöglichen.
Es ist wünschenswert,
die Bedingungen zu kontrollieren, um so die Anzahl der von jeder
Zelle produzierten Viruspartikel zu maximieren. Somit wird es notwendig
sein, die Reaktionsbedingungen, wie zum Beispiel die Temperatur,
der gelöste
Sauerstoff, der pH-Wert, etc., zu überwachen und zu kontrollieren.
Kommerziell erhältliche
Bioreaktoren, wie zum Beispiel der CelliGen Plus Bioreaktor (kommerziell
erhältlich
von New Brunswick Scientific, Inc. 44 Talmadge Road, Edison, NJ)
haben Vorrichtungen zur Überwachung
und zum Einhalten solcher Parameter. Die Optimierung der Infektionsbedingungen
und Kulturbedingungen werden etwas variieren. Die Bedingungen für die effiziente
Replikation und Produktion des Virus können jedoch vom Fachmann erreicht
werden, wobei die bekannten Eigenschaften der Herstellerzelllinie,
die Eigenschaften des Virus, die Art des Bioreaktors, etc. in Betracht
gezogen werden. Wenn 293-Zellen als Herstellerzelllinie verwendet
werden, wird die Sauerstoffkonzentration bevorzugt im Bereich von
ca. 50% bis ca. 120 gelöstem
Sauerstoff gehalten, vorzugsweise bei 100 gelöstem Sauerstoff. Wenn die Konzentration der
viralen Partikel (wie sie mit herkömmlichen Methoden wie HPLC
unter Nutzung einer Resource-Q-Säule bestimmt
wird) ein Plateau erreicht, wird der Reaktor abgeerntet.
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Der
Ausdruck "Ernten" bedeutet das Einsammeln
der Zellen, die das rekombinante Adenovirus enthalten, aus den Medien.
Dies kann durch herkömmliche
Verfahren erreicht werden, wie differentielle Zentrifugation oder
chromatographische Mittel. In diesem Stadium können die geernteten Zellen
gelagert oder durch Lyse und Reinigung weiterverarbeitet werden,
um das rekombinante Virus zu isolieren. Zur Lagerung sollten die
Zellen bei oder in etwa bei physiologischem pH-Wert gepuffert und
bei –70°C eingefroren
werden.
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Der
Ausdruck "Lyse" bezieht sich auf
das Aufbrechen der Herstellerzellen. Eine Lyse kann durch eine Vielzahl
von Mitteln erreicht werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Wenn es gewünscht
ist, die viralen Partikel aus den Herstellerzellen zu isolieren,
werden die Zellen unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren
lysiert, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Zum Beispiel können Säugetierzellen
bei niedrigem Druck (100–200
psi differentieller Druck) oder durch herkömmliche Verfahren mit Einfrieren
und Auftauen lysiert werden. Exogene, freie DNA/RNA wird durch Abbau
mit DNAse/RNAse entfernt.
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Der
Ausdruck "Aufreinigung" bedeutet die Isolierung
einer im Wesentlichen reinen Population von rekombinanten Viruspartikeln
aus den lysierten Herstellerzellen. Es können herkömmliche Reinigungstechniken, wie
zum Beispiel chromatographische oder differentielle Verfahren der
Dichtegradientenzentrifukation verwendet werden. Bei der bevorzugten
Ausführung
der Erfindung wird das Virus durch Säulenchromatographie gereinigt,
wobei im Wesentlichen dem Verfahren von Huyghe, et al. (1995) Human
Gene Therapy 6: 1403–1416, wie
es in der parallel anhängigen
US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/400,793, die am 7. März 1995
eingereicht wurde, beschrieben ist, gefolgt wird.
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Zusätzliche
Verfahren und Maßnahmen
zur Optimierung der Produktion der rekombinanten Adenoviren der
vorliegenden Erfindung werden in der parallel anhängigen US
Patentanmeldung mit der Seriennummer 09/073,076 beschrieben, die
am 4. Mai 1998 eingereicht wurde, und den Titel "Viral Production Process" trägt.
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BEISPIELE
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Die
folgenden Beispiele stellen die Methodik und die Ergebnisse von
Experimenten bereit, welche die Konstruktion be stimmter rekombinanter
adenoviraler Vektoren und Plasmid-Vektoren zeigen. Es wird für den auf
dem Gebiet der Erfindung tätigen
Fachmann ersichtlich sein, dass die vorliegende Erfindung in anderen Formen
ausgeführt
werden kann als denjenigen, die in diesen Beispielen spezifisch
offenbart werden, ohne dabei vom Erfindungsgedanken oder von den
essentiellen Eigenschaften der Erfindung abzuweichen. Die besonderen
Ausführungsformen
der Erfindung, wie sie im folgenden beschrieben werden, sollen deshalb
als illustrativ und nicht als restriktiv betrachtet werden. In den
folgenden Beispielen bedeutet "g" Gramm, "ml" bedeutet Milliliter, "mol" bedeutet Mol, "°C" bedeutet Grad Celsius, "min" bedeutet Minuten, "FBS" bedeutet fötales Rinderserum,
und "PN" bezieht sich auf
die Partikelzahl an rekombinantem Virus.
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Beispiel 1. Plasmid-Konstruktion
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p800luc,
ein Plasmid, welches für
eine Luciferase unter Kontrolle des 800 bp-PAI-Promotors kodiert, wurde
von Dr. David Luskutoff (Scripps Institute, LaJolla, California)
erhalten. Das Plasmid pCTMIE-E2F-Rb, welches einen CMV-Promotor
gefolgt von einer dreiteiligen Adenovirus-5-Leadersequenz und einem SV40-Enhancer
stromaufwärts
von der für
das E2F-Rb-Fusionsprotein
kodierenden Sequenz enthält,
wurde von Doug Antelman (Canji) zur bereitgestellt.
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Beispiel 2. Konstruktion
des Luciferase-Plasmids mit Promotoren, die auf TGF-β ansprechen
-
A. PAI-Luciferase-Plasmid:
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Sequenzen
aller Fragmente werden in 5'-3'-Richtung gezeigt.
Ein Fragment von 749 bp, das von einer SacI- und XhoI-Schnittstellen am
5'- bzw. 3'-Ende flankiert wird,
und einer SV40-TATA-Box anstelle einer nativen TATA-Box innerhalb
des Promotors, wurde mittels PCR amplifiziert, wobei p800luc als
Template und die Primer AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA und GAT
CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (enthält die SV40
TATA-Box) verwendet wurden. Das resultierende PCR-Produkt wurde
mit SacI und XhoI verdaut und mit einem Fragment ligiert, das nach
Verdau von PGL3-basic erhalten wurde (einem Luciferase-Konstrukt
ohne Promotor (Promega)), wobei PAI-Plasmid erhalten wurde.
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B. SRE-Luciferase-Plasmid:
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Die
folgenden Oligonukleotide wurden zusammengelagert: GG TAT TTA TGA
GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC und GAT CCT CGA GCT
CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. Das zusammengelagerte
Produkt wurde mit XhoI verdaut und mit PGL3-basic ligiert, das mit
MluI verdaut war, bei dem mittels Klenow stumpfe Enden erzeugt worden
waren, und das mit XhoI verdaut worden war, wodurch pSVT-luc (ein
Luciferase-Konstrukt mit SV40 TATA-Box) erhalten wurde. Die Oligonukleotide,
die Bindungsstellen für
Smad4/DPC4 enthielten, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC
TGT AC und AGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC, wurden
zusammengelagert und mit pSVT-Luciferase
ligiert, das mit KpnI verdaut worden war, um das Plasmid SRE-Luciferase
zu erhalten.
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Beispiel 3. Konstruktion
von Luciferase-Plasmiden mit Promotoren, die auf p53 ansprechen
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A. Das Plasmid RGC-Luciferase:
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Zwei
komplementäre,
5'-phosphorylierte
Oligonukleotide mit Bindungsstellen für p53 aus dem ribosomalen Gencluster,
AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC und CA CGA
GTT GCC TGG ACT TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC, wurden miteinander
hybridisiert. Das hybridisierte Fragment wurde mit pSVT- Luciferase ligiert,
das mit Kpn I verdaut worden war, wobei das Plasmid RGC-Luciferase
erhalten wurde.
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B. Das Plasmid p53CON-Luciferase:
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Zwei
komplementäre,
5'-phosphorylierte
Oligonukleotide, die Konsensus-Bindungsstellen für p53 (p53CON) enthielten,
CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC
CTG TAC und AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA
TGT CCG TCG AGG TAC, wurden zusammengelagert. Das zusammengelagerte
Fragment wurde mit pSVT-Luciferase ligiert, welches mit KpnI verdaut
worden war, wobei das Plasmid p53CON-Luciferase erhalten wurde.
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C. Das Plasmid PAI-E2F-Rb:
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Die
Sequenz, die in dem Plasmid pCTMIE-E2F-Rb den CMV-Promotor gefolgt
von der dreiteiligen Adenovirus-5-Leadersequenz und einem SV40 Enhancer
stromaufwärts
von der für
das E2F-RB-Fusionsprotein kodierenden Sequenz enthielt, wurde durch
Verdau mit BglI und XbaI herausgeschnitten, und das resultierende
Fragment wurde ligiert, wobei das promotorlose Plasmid E2F-RB erhalten
wurde. Ein Fragment, das den modifizierten PAI-Promotor enthielt,
wurde aus dem Plasmid PAI-Luciferase
durch Verdau mit SacI und XhoI herausgeschnitten, und durch Behandlung
mit Klenow wurden stumpfe Enden erzeugt. Dieses Fragment wurde mit
dem promotorlosen Plasmid E2F-Rb ligiert, das mit EcoRI verdaut
und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I behandelt worden
war, wobei das Plasmid PAI-E2F-RB
erhalten wurde.
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Beispiel 4. Konstruktion
von rekombinanten Adenoviren
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Ein
Transfer-Plasmid, das die Ad5-Sequenz mit einer 3-kb Deletion in
der E3-Region enthielt, pNEBΔE3,
wurde durch Klo nierung eines SnaBI-Fragments von 7,4 kb aus pBHG11
(26676 bis 34140) in pNEB193 (Plasmid von NEB), das mit BamHI, AccI
und Klenow behandelt worden war, konstruiert. Es wurde eine multiple
Klonierungsstelle (MCS) in das oben genannte Plasmid eingeführt, indem
die 5-phosphorylierten Oligonukleotide AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA
GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA T und TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC
GCT CTA GAA TGC ATT ACG TAT TTA T zusammengelagert wurden, und das zusammengelagerte
Fragment durch Ligation in pNEBΔE3
eingebracht wurde, das mit Pac I verdaut worden war, wobei das Plasmid
pNEBΔE3(MCS)
erhalten wurde.
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Ein
Transfer-Plasmid zur Erzeugung von rekombinantem Adenovirus, das
für E2F-Rb
unter der Kontrolle des PAI-Promotors und für ein verstärktes grün fluoreszierendes Protein
(GFP) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors kodiert, wurde wie
folgt konstruiert. Ein intermediärer
Vektor pABS.4-E2F-Rb wurde hergestellt, indem ein Fragment, welches
den PAI-Promotor und die für
E2F-RB kodierende Sequenz enthielt, und das durch Verdau von Plasmid
PAI-E2F-RB mit NacI und XbaI und Ligation mit einem Fragment aus
Plasmid pABS.4 (Microbix), das durch Verdau mit Kpn I, Behandlung
mit Klenow, und erneutem Verdau mit Xba I hergestellt worden war,
ligiert wurde. Ein Fragment, das den PAI-Promotor, die für E2F-Rb
kodierende Sequenz und ein Kanamycin-Gen enthielt, wurde dann durch
Verdau mit PacI aus dem Plasmid pABS.4-E2F-Rb herausgeschnitten,
mit Klenow behandelt und mit dem Plasmidfragment ligiert, welches
durch Verdau des Plasmids pNEBΔE3
mit PacI und Behandlung mit Klenow erhalten worden war, wobei das
Plasmid pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb
erhalten wurde, das keine PacI-Schnittstelle enthält. Das
Kanamycin-Gen in diesem Plasmid wurde durch den CMV-Promotor ersetzt,
der in funktionsfähiger
Weise mit dem Gen für
das grün
fluoreszierende Protein (GFP) gekoppelt war, indem pNEBΔE3-PAI-E2F-Rb mit SwaI
verdaut. und mit einem Fragment ligiert wurde, das durch Verdau
mit AflII und SspI und Behandlung mit Klenow aus pEGFP-N (Clontech)
isoliert worden war, wobei das Plasmid pΔE3-PAI-E2F-Rb-GFP erhalten wurde.
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Transfer-Plasmide
zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren, die für E2F-Rb
unter Kontrolle eines auf TGF-β ansprechenden
Promotors mit SRE und für
ein verstärktes
grün fluoreszierendes
Protein (GFP) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors kodiert, wurden wie folgt
konstruiert. Die für
E2F-Rb kodierende
Sequenz wurde in das Plasmid pNEBΔE3(MCS)
eingeführt,
wobei das Plasmid pNEBΔE3-E2F-Rb
erhalten wurde, indem ein Fragment, das durch Verdau von pNEBΔE3(MCS) mit
XbaI und NruI erhalten worden war, und ein Fragment, das durch Verdau
von pCTMIE-E2F-Rb mit XbaI und NaeI erhalten worden war, ligiert
wurden. Ein auf TGF-β ansprechender
Promotor, der SRE enthielt, wurde in das oben genannte Plasmid durch
Amplifikation dieser Sequenz mittels PCR eingeführt, wobei das Plasmid SRE-Luciferase
als das Template und die Primer GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C und
GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T verwendet wurden. Das resultierende
PCR-Produkt wurde mit SpeI verdaut und mit pNEBΔE3-E2F-Rb ligiert, welches mit SnaBI
und XbaI verdaut worden war, wobei pNEBΔE3-DPC-E2F-Rb erhalten wurde.
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Transfer-Plasmide
zur Erzeugung von rekombinanten Adenoviren, die für E2F-Rb
unter Kontrolle eines auf p53 ansprechenden Promotors und für verstärktes grünes fluoreszierendes
Protein (GFP) unter der Kontrolle eines CMV-Promotors kodieren,
wurden wie folgt konstruiert. Die auf p53 ansprechenden Promotor mit
p53-Bindungsstellen aus dem ribosomalen Gencluster oder mit einer
p53-Konsensus-Stelle (p53CON) wurden durch Amplifikation der Promotorsequenz
mittels PCR in das Plasmid pNEBΔE3-E2F-Rb
eingeführt, wobei
RGC-Luciferase oder p53CON-Luciferase
als Template und die phosphorylierten Primer GTA AGG TGC CAG AAC
ATT TCT C und GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T eingesetzt wurden.
Die resultierenden PCR-Produkte wur den mit XbaI verdaut und mit
pNEBΔE3-E2F-Rb
ligiert, das mit SnaBI und XbaI verdaut worden war, wobei pΔE3-RGC-E2F-Rb
und pdelataE3-PCON-E2F-Rb zu erhalten.
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Beispiel 5. Homologe Rekombination
zur Konstruktion von rekombinanten Adenoviren
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Die
rekombinante Adenoviren PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad und CON-Ad wurden
wie beschrieben durch homologe Rekombination in Bakterien erhalten
(Chartier, et al. (1996) J. Virol. 70: 4805–4810). Das Transfer-Plasmid
wurde mit AscI verdaut, um die Fragmente zu erhalten, die E2F-Rb
unter Kontrolle eines auf einen Weg (pathway) ansprechenden Promotors
und GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors enthielten, flankiert
von Ad5-Sequenzen.
Das resultierende Fragment wurde zusammen mit einem Fragment, das
durch Verdau von PTG4609 (kommerziell erhältlich von Transgene, Inc.
und beschrieben in Chartier, et al. (1996) J. Virol. 70: 4805–4810) mit
BstBI und SpeI erhalten worden war, in den Bakterienstamm BJ 5183
co-transformiert. Die resultierenden Bakterienkolonien wurden auf
Anwesenheit der erwünschten
rekombinanten infektiösen Ad5-Plasmide
pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad und pCON-GFP-Ad durchsucht.
Diese infektiösen
Plasmide wurden dann durch Verdau mit PacI linearisiert, durch Phenol-Chloroform-Extraktion
und Ethanolfällung
gereinigt und zur Transfektion von 293-Zellen eingesetzt.
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Die
Transfektion wurde unter Verwendung von Superfect (Qiagen) gemäß den Anweisungen
des Herstellers durchgeführt.
2,5 μg der
linearisierten Plasmide wurden zur Transfektion von 250.000 Zellen
eingesetzt, die in Platten mit 6 Vertiefungen und 12 μl Superfect/Vertiefung
angezüchtet
worden waren. Nach 8 Tagen wurde ein zytopathischer Effekt auf Grund
der Virusproduktion beobachtet. Die Zellen wurden gemeinsam mit
dem Zellkulturüberstand
geerntet und drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Rekombinante
Viren in den erhaltenen Lysaten wurden durch Reinfektion von 293-Zellen
vermehrt.
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Beispiel 6. Zellinien
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Alle
in dieser Untersuchung verwendeten Zelllinien wurden von der ATCC
(Rockville, MD) erhalten und als Monolayer-Kulturen bei 37°C in einem CO2-Inkubator
kultiviert. 293, Hep3B, MRC9, A549, Panc1, U87, Caco2, MCF-7 und
WIDR wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium kultiviert,
das mit 10% fötalem Rinderserum
ergänzt
war. MDA-MB 469 Zellen wurden in Ham-Medium kultiviert, das mit
10% fötalem
Rinderserum ergänzt
war, während
MiaPaca-2-Zellen in DMEM-Medium angezüchtet wurden, das mit 10% fötalem Rinderserum
und 2,5% Pferdeserum ergänzt
war.
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Beispiel 7. Transfektion
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Die
Zellen wurden entweder in Platten mit 6 Vertiefungen (250.000 Zellen/Vertiefung)
oder in Platten mit 24 Vertiefungen (62.500 Zellen/Vertiefung) ausplattiert
und über
Nacht für
die Anhaftung inkubiert. Dann wurden Transfektionen unter Verwendung
von Calciumphosphat mit 293-Zellen wie beschrieben durchgeführt, und
mit Superfect (Qiagen) für
andere Zellen, wobei der Anleitung des Herstellers gefolgt wurde.
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Beispiel B. Reporter/Luciferase-Assays
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Die
Zellen wurden mit 1,5 μg
Reporterplasmid und 1,0 μg
des Inhibitors transfiziert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden
Lysate durch Zugabe von 1 × Reporter-Lysispuffer
(Promega) und Inkubation für
10 min hergestellt. Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung von
Top Count (Packard) und einem Assay-Kit von Packard gemäß den Anweisungen
von Packard bestimmt.
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Beispiel 9. Assays zur
Bestimmung des Virus-vermittelten zytopathischen Effekts
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Die
Zellen wurden mit den angegebenen rekombinanten oder Wildtyp-Adenoviren
infiziert und 6 Tage nach der Infektion mit 0,5% Kristallviolett
gefärbt,
das in 20% Ethanol hergestellt worden war; dabei wurde im Wesentlichen
der von Bischoff, et al. (1996) Science 274: 373–376, beschriebenen Vorgehensweise
gefolgt.
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Beispiel 10. Konstruktion
von cU3EE- und cT1LT-Viren
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Die
MLP-Promotorsequenz wurde mittels PCR amplifiziert, wobei die Primer
GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC und GAT CTT AAT TAA
ATG GCA GTG ACC CGG AAG und Ad5-DNA (wie sie im Plasmid pFG140 (Microbix)
vorliegt) als Template verwendet wurden. Das MLP-PCR-Produkt wurde dann
in die Pac I-Schnittstelle
im Plasmid pdelataE3-PCON-E2F-Rb kloniert, wobei das Plasmid pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP
erhalten wurde. Die für
das Adenovirus-Protein E3 10.5K kodierende Sequenz wurde mittels
PCR amplifiziert wobei die Primer GCG ACC CAC CCT AAC AGA und GAT
CGG ATC CAA AGC GCA ACA AGG GTC A verwendet wurden, und das resultierende
PCR-Produkt wurde in die Xho I-Schnittstelle des
Plasmids pCDNA3.1 (Invitrogen) kloniert, wobei das Plasmid pcDNA3-10.5
erhalten wurde. Die für
das Adeno virus-Protein E3 10.5K kodierende Sequenz wurde dann aus
pCDNA3-10.5 durch Verdau mit DraIII und Xba I herausgeschnitten.
Anschließend
wurde eine Klenow-Behandlung durchgeführt, und die Sequenz wurde mit
dem pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP ligiert, der mit PacI und Klenow behandelt
worden war, wodurch das Plasmid pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K
erhalten wurde.
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Die
rekombinanten Adenoviren cU3EE und cT1LT wurden wie beschrieben
durch homologe Rekombination in Bakterien erhalten (Chartier, et
al. (1996) J. Virol. 70: 4805–4810).
Das Transfer-Plasmid wurde mit AscI verdaut, um die Fragmente zu
erhalten, die E2F-Rb unter Kontrolle der p53CON-Sequenz und E310.5K unter
Kontrolle des MLP-Promotors enthielten, flankiert von Ad5-Sequenzen.
Das resultierende Fragment wurde zusammen mit einem Fragment, das
durch Verdau von PTG4609 (Transgene) mit BstBI und SpeI erhalten worden
war, in den Bakterienstamm BJ 5183 co-transformiert. Die resultierenden
Bakterienkolonien wurden auf die Anwesenheit des erwünschten
rekombinanten, infektiösen
Ad5-Plasmid pCEMD durchsucht. Das infektiöse Ad5-Plasmid p01/CEMD wurde nach einem ähnlichen
Protokoll erhalten, wobei jedoch ein Derivat von PTG4609 (Transgene)
verwendet wurde, bei dem die Wildtyp-E1A-Sequenz durch eine E1A-Sequenz mit 01 Mutation
ersetzt worden war. Diese infektiösen Plasmide wurden dann durch
Verdau mit PacI linearisiert und durch Phenol-Chloroform-Extraktion
und anschließender
Ethanolfällung
gereinigt und zur Transfektion von 293 Zellen eingesetzt.
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Die
Transfektion mit den Plasmiden pCEMD und p01/CEMD wurde durchgeführt, wobei
die rekombinanten Viren cU3EE bzw. cT1LT erzeugt wurden, und wobei
Superfect (Qiagen) gemäß der Anleitung
des Herstellers verwendet wurde. 2,5 μg des linearisierten Plasmids
wurden zur Transfektion von 500.000 Zellen eingesetzt, die in Platten
mit 6 Vertiefungen mit 12 μl
Superfect/Vertiefung angezüchtet
worden waren. Nach 8 Tagen wurde ein zytopathischer Effekt auf Grund
der Virusproduktion beobachtet. Die Zellen wurden gemeinsam mit
dem Zellkulturüberstand
geerntet und drei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Rekombinante
Viren in den erhaltenen Lysaten wurden durch Reinfektion von 293-Zellen
vermehrt. Sequenzprotokoll