WO2003008599A2 - System zur erzeugung klonaler oder komplexer populationen rekombinanter adenoviren und deren anwendung - Google Patents

System zur erzeugung klonaler oder komplexer populationen rekombinanter adenoviren und deren anwendung Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a novel system for the production of recombinant adenoviruses (rAd); Areas of application are medicine, veterinary medicine, biotechnology, genetic engineering and functional genome analysis.
  • genes into cells are relevant for several reasons.
  • the expression of genes introduced in cell culture systems enables e.g. the functional characterization of the encoded proteins or their production.
  • therapeutically effective genes represents a new way of treating human diseases (gene therapy).
  • a variety of approaches are being investigated to achieve medically or veterinarily effective immunization (vaccination) in humans and in livestock by transferring immunostimulatory and / or pathogen-specific genes.
  • immunization vaccination
  • the vector system must also offer the possibility of constructing complex gene banks.
  • Efficient gene transfer into cells is possible in particular with recombinant viral vectors which are derived from retroviruses, adeno-associated viruses or adenoviruses (overview in: Verma, M. and I. and Somia, N. (1 997) Nature 389, 239- 242).
  • the so-called E 1 -delegated adenoviral vectors of the first generation have been intensively researched as gene transfer vectors over the past decade (review by: Bramson, JL et al. (1 995). Curr. Op. Biotech. 6, 590-595).
  • adenovirus serotype 5 she derived from human adenovirus serotype 5 and are deleted in the essential E 1 region, often also in the non-essential E3 region, whereby up to 8 KBp of foreign DNA can be inserted into the virus genome.
  • These vectors can be produced to high titers on cells complementing the E 1 deficiency. Due to their high stability, they are easy to clean and store.
  • Recombinant adenoviruses have a broad spectrum of efficiently infectable cell types in vitro and also allow efficient gene transfer to different tissues in vivo. Clonal rAd populations are already used in many ways for gene transfer in vitro and in vivo.
  • This recombination of the two S ⁇ i / tt / e plasmids can take place after contransfection in 293 cells (McGrory, WJ, Bautista, DS and Graham, FL (1 988) Virology 61 4-61 7) or after linearization and cotransformation into a recombination competent E. co / i strain (Chartier, C, Degryse, E., Gantzer, M., Dieterle, A., Pavirani, A. and Mehtali, M. (1 996) J. Virol 70: 4805-481 0). Both methods are relatively complex due to inherent limitations: when recombined in 293 cells the problem is that unwanted.
  • Recombinant or wild-type viruses can arise. Therefore, a clonal isolation of the recombinant viruses by plaque assay on 293 cells and a thorough analysis of the isolated rAd is required before the multiplication.
  • the problem with recombination in E. coli is that the recombination-competent bacterial strain provides very low plasmid yields, which makes analysis of the recombined plasmids more difficult, since the transformation of an E. coli strain with a higher plasmid yield is first necessary.
  • Newer, but not yet widely used methods for rAd construction are based on the insertion of foreign DNA into the context of the adenovirus genome by direct ligation.
  • One method is based on ligation of a fragment of the (manipulated) 5 ' viral end with a fragment which contains the rest of the viral genome, followed by transfection of the ligation products into 293 cells (Mizuguchi, H. and Kay, MA (1998 ) Hum. Gene Ther. 9: 2577-2583).
  • Another method is based on the use of the cosmid cloning technique.
  • cosmid vectors are used which contain the E1-deleted adenovirus genome and a polylinker with unique restriction sites for the insertion of foreign DNA.
  • linearized cosmid vector and foreign DNA to be inserted are packaged in vitro in lambda phage heads. After infection of E. coli, circular cosmids develop, from which linear rAd genomes can be released by restriction digestion and which are then transfected into 293 cells (Fu, S. and Deisseroth, AB (1997) Hum. Gene Ther. 8: 1321 -1330).
  • the cloned vector genomes either linearly with terminal inverted terminal repeats (ITRs) or in the circular plasmid with a ⁇ ea / -to-ta / 7 configuration of the ITRs are available.
  • ITRs terminal inverted terminal repeats
  • cloned Vector genomes differ structurally from natural adenovirus genomes, which contain a covalently bound viral protein (terminal protein, TP) on both ITRs.
  • pTP viral preterminal protein
  • the pTP is then processed by a protease to form the TP, which in the next round of replication - alongside the ITRs - is an important part of the substrate that is recognized by the replication machinery.
  • Viral genomes without TP are recognized about 1000 times worse than naturally replicated viral genomes with TP (overview in: Hay, RT, Freeman, A., Leith, I., Monoghan, A. and Webster, A. (1 995) Curr. Top. Microbiol Immunol. 1 99: 31-48).
  • the first replication of a cloned rAd vector genome without TP is therefore a rare event (approx. 1 0-100 events per 1 0 6 293 cells transfected). For this reason, the methods described above are only suitable for obtaining clonal populations of rAd. However, they are not suitable for generating complex populations of rAd that would require an efficient conversion of a complex mixture of cloned vector genomes into a complex mixture of replicated rAd.
  • Donor plasmid with 5'ITR complete packaging signal, foreign DNA and single loxP recognition sequence and two
  • Hardy et al. (1 997) can only be achieved by contransfection of virus DNA together with the donorplamide. Deproteinized viral DNA was used for this, which therefore has no terminal protein (TP).
  • the donor virus substrate introduced is therefore different from the infectious donor virus genomes with TP which are introduced by infection in the present invention.
  • An essential advantage of the present invention is that such natural substrates are available for adenoviral replication.
  • the introduction of the donor virus genome by infection was by Hardy et al. (1 997) also tried, but the contamination with donor viruses was so high in the first round of propagation that this was not investigated further.
  • the difference to the high purities of the invention is due to the disadvantage of the donor quarters due to the deleted packaging signal.
  • the construction of complex ad populations was developed by Hardy et al. neither examined nor discussed.
  • An object of the invention was therefore to provide a system for simple
  • Another task was to provide a system with which even complex recombinant adenoviruses can be generated.
  • a system for producing recombinant adenoviruses comprising (a) at least one donor virus with an at least partially deleted viral packaging signal which is framed by two recognition sites for a site-specific recombinase, (b) a packaging cell line that expresses the site-specific recombinase and
  • the novel method for rAD production according to the invention has decisive advantages over the methods described so far.
  • complex mixed rAd populations can be generated, which was not possible according to the prior art.
  • this creates the prerequisites for the construction of gene banks in an adenoviral context.
  • the essence of the new system according to the invention is that the need to convert cloned vector genomes into infectious replicated vector genomes is avoided by generating the rAd directly by enzymatic site-specific insertion of foreign DNA into a replicating virus.
  • a site-specific recombinase is used, for example recombinases from the Int family, such as Cre recombinase or Flp recombinase.
  • the reactions catalyzed by these recombinases depend on the topology of the recognition sites: If two recognition sequences lie in parallel orientation on the same DNA molecule, these site-specific recombinases catalyze the excision of the region in between as a circular molecule, with a single recognition sequence remaining at the excision site. This reaction is reversible, but the equilibrium lies on the excision side (excision / insertion reaction) for thermodynamic reasons.
  • Adenoviral packaging signals contain repeated functionally additive sequence motifs, to which cellular factors that have not yet been characterized specifically bind. Binding of these factors is necessary for efficient packaging of the replicated viral genomes in the viral envelopes.
  • the packaging signal of human adenovirus serotype 5 is currently best characterized: If one or more of the repeated, functionally additive sequence motifs ("A repeats") are deleted in the packaging signal, the partially deleted packaging signal ( ⁇ ) obtained in this way results in reduced packaging efficiency and thus reduced virus growth (Schmid, Sl and Hearing, P. (1 997) J. Virol. 71: 3375-3384).
  • the cellular factors also represent a limiting substrate, so that when a virus with a complete packaging signal is present at the same time, the growth reduction of a virus with a partially deleted packaging signal is additionally increased (Imler, JL, Bout, A., Dreyer, D., Diederle, A., Schultz, H., Valerio, D., Mehtali, M. and Pavirani, A. (1 995J Hum. Gene Ther. 6: 71 1 -721).
  • Recombinase is framed.
  • Packing signal optionally two detection points for contains a rarely cutting restriction endonuclease (in particular a restriction endonuclease with a recognition sequence> 8 bp, preferably> 10 bp) and (iv) insertion sites for foreign DNA or inserted foreign DNA. , ...
  • the packaging cell line is first infected with the donor virus.
  • the partially deleted packaging signal of the donor virus is cut out by the corresponding recognition sites in the donor virus genome by the site-specific recombinase expressed by the packaging cell line.
  • a high level of expression of the site-specific recombinase is required.
  • the donor plasmid with the transgene cassette to be inserted or the complex donor plasmid population with a large number of sequences in the context of the donor plasmid is introduced into the cells by transfection.
  • Different types of donor plasmids which differ slightly in their structure, then lead to the formation of the rAd by site-specific insertion (excision / insertion or terminal exchange, see below and Figure 2) via likewise slightly different reactions.
  • the donor plasmid or parts thereof with the transgene cassette or the gene bank and the complete viral packaging signal are inserted site-specifically into the insertion site of the donor virus ⁇ acceptor substrate via the recognition site (s) for the site-specific recombinase.
  • the resulting rAds contain the transgene cassette or the gene bank and the complete viral packaging signal.
  • they contain the covalently bound TP on one or both ITRs, which is why a single insertion event to produce a infectious and normally replicating rAd leads.
  • a complex mixture of donor plasmids therefore leads to the formation of an equally complex mixture of rAd.
  • Type 1 donor plasmids contain a bacterial backbone with a bacterial resistance gene and a bacterial origin of replication, the complete viral packaging signal, followed by a polylinker for inserting foreign DNA or already inserted foreign DNA, or - framed by a promoter and a polyadenylation signal - a polylinker for inserting coding sequences or already inserted coding sequences and a recognition site for the site-specific recombinase located in front of the viral packaging signal.
  • the complete donor plasmid is inserted into the insertion site of the donor virus ⁇ acceptor substrate by the site-specific recombinase via an insertion / excision equilibrium reaction.
  • the resulting rAd contain two recognition sites for the site-specific recombinase (see Figure 2A).
  • Type 2 donor plasmids contain a bacterial backbone with a bacterial resistance gene and a bacterial origin of replication, the viral ITR and the complete viral packaging signal, followed by a polylinker for the insertion of foreign DNA or already inserted foreign DNA, or - framed by a promoter and a polyadenylation signal - a polylinker for inserting coding sequences or already inserted coding sequences and two cutting-edge reaction endonucleases with a more than 8 bp long recognition sequence that frames the bacterial backbone, one of the interfaces directly is next to the viral ITR.
  • the clonal or complex donor plasmid population is digested with the rarely cutting restriction endonuclease. This releases fragments which contain the viral ITR, the complete viral packaging signal, the inserted foreign DNA and a single recognition sequence for the site-specific recombinase in sequential order.
  • the longer the recognition sequence of the rarely cutting restriction endonuclease the lower the likelihood of the occurrence of a corresponding sequence in the transgene cassette or individual sequences in the gene bank which would interfere with the release of these fragments.
  • the fragments are inserted by the site-specific recombinase via a terminal exchange reaction into the insertion site of the donor virus ⁇ acceptor substrate.
  • the resulting rAd contain only one recognition site for the site-specific recombinase (see Figure 2B).
  • Type 3 donor plasmids included all elements of the type 1 donor plasmids and a second recognition site for the site-specific recombinase, which is localized such that (i) both recognition sites are oriented in parallel and (ii) both recognition sites frame the bacterial backbone with the origin of replication and the bacterial resistance gene.
  • the bacterial backbone is first cut out by the site-specific recombinase.
  • the product is a circular DNA molecule that contains the complete viral packaging signal, the foreign DNA to be inserted and a single recognition site for the site-specific recombinase. This is then inserted into the insertion site of the donor virus ⁇ acceptor substrate by the site-specific recombinase via an insertion / excision equilibrium reaction.
  • the resulting rAd contain two recognition sites for the site-specific recombinase (see Figure 2C).
  • rAd When using donor plasmids of types 1 and 3, rAd is formed in which the inserted DNA and thus also the complete viral packaging signal is framed by two recognition sites for the site-specific recombinase which are repeated in parallel. The rAd are therefore still the substrate for the excision / insertion equilibrium reaction of the site-specific recombinase. The entire DNA, including the packaging signal, is cut out by the excision. This rAd is therefore preferably propagated on cells which do not express the site-specific recombinase. The selection against contamination with unprocessed donor viruses is made here solely via the partially deleted packaging signal.
  • rAd is formed which contains only one recognition site for the site-specific recombinase. They are not a substrate for the excision / insertion reaction but for the terminal exchange reaction. This is not associated with the loss of the packaging signal. RAd generated in this way can therefore be propagated both on the packaging cell line that expresses the site-specific recombinase (selection against contamination with unprocessed donor viruses (i) via the excision of the packaging signal by the site-specific recombinase and (ii) via the partially deleted packaging signal), as well on cells that do not express them (selection against contamination with unprocessed donor viruses only via the partially deleted packaging signal).
  • Human or non-human adenoviruses are used as the basis for the construction of the donor viruses in order to generate correspondingly clonal or complex populations of recombinant human or non-human adenoviruses.
  • Human adenoviruses are preferably used, for example serotype 5 (Ad5).
  • donor viruses can be used in which one or more non-essential genes have been deleted.
  • One or more essential genes can also be deleted, which must then be made available in trans by the packaging cell line or by the producer cells.
  • the producer cells used to multiply the donor virus or the recombinant viruses derived therefrom are cells or cell lines which are permissive for the corresponding, possibly partially deleted recombinant virus, for example the E1 -complementing 293 cells for multiplying E1-deleted Ad5-derived donor viruses or the derived clonal or complex populations of recombinant adenoviruses.
  • the packaging cell line is obtained on the basis of the producer cell line by stable transfection of the gene for the site-specific recombinase.
  • the expression of the recombinase gene can be constitutive or be adjustable.
  • the recombinase gene can be a fusion gene from the recombinase gene and the sequences coding for a nuclear localization signal in order to increase the concentration of the recombinase in the cell nucleus.
  • Recombinases from the Int family are preferably used as site-specific recombinases, for example the Cre recombinase or the Flp recombinase.
  • coding sequences and elements which control their expression are generally used as transgene (s) in the donor plasmids.
  • the sequence to be expressed is preferably provided with a promoter which is either constitutively active or regulatable. Viral or cellular promoters or combinations of the two can be used as promoters.
  • the genomic sequence or the cDNA of a gene can be used, the product of which is missing in the disease to be treated, occurs in unphysiological amounts or is defective. You can also use part of a genomic sequence that spans a mutation in the target gene and can recombine it homologously.
  • various genes can be used that slow down the growth or kill the tumor cells - possibly in combination with pharmaceuticals or by immunostimulation. One or more of them may modified genes of the pathogenic organism against which immunization is to be achieved.
  • complex rAd populations are particularly preferred according to the invention.
  • populations of coding sequences mixed into the donor plasmids for example cDNA banks from human or animal tissues or cells, are used. This can be done, for example, with the aim of isolating new genes.
  • mixed populations of mutated sequences of this gene are used in the donor plasmids. This can be used, for example, to generate gene banks with variants of a protein (for example enzyme or antibody) with the aim of functional optimization of this protein.
  • the coding sequences are surrounded by elements that control their expression (promoters, polyadenylation signals).
  • elements that control their expression promoter, polyadenylation signals.
  • Another possible area of use for complex populations of rAd is to construct banks of non-coding or non-expressed sequences, for example for the characterization or optimization of binding sites of DNA-binding proteins or enzymes.
  • the isolation of new genes with the properties sought or the isolation of variants of a known gene with modified properties can be carried out as follows: First, the titer of infectious particles present in the complex rAd population certainly. Then, in order to produce the so-called master plates, producer cells in multi-titer plates are infected with a defined, low number of infectious particles per well. After the producer cells are completely infected, a freeze / thaw lysate of the master plates is produced. Due to the stability of rAd, the master plates can be frozen and stored. The released, increased viruses are present in the protrusion of the wells.
  • a clonal population is understood to mean a population in which the same foreign DNA is incorporated in all adenoviruses belonging to the population.
  • Foreign DNA is understood to mean any DNA that is not adenovirus DNA.
  • a complex population which is also referred to as a complex mixed population, comprises different adenoviruses, which differ in that they each contain different foreign DNA.
  • a complex recombinant adenovirus population preferably comprises at least two types of recombinant adenoviruses, each of which contains different foreign DNA, in particular at least 10 different types, most preferably at least 100 different types.
  • the packaging signal is partially deleted, so that an increase in the donor virus (without donor plasmid) in the packaging cell line is inhibited, reduced or / and impaired.
  • the desired rAd can be selectively amplified compared to the donor virus and thus selected.
  • the packaging signal in the donor virus is preferably deleted by at least 10%, in particular at least 20% and particularly preferably at least 30% and up to 100%, more preferably up to 90% and particularly preferably up to 70% (% here means the number of bases deleted based on the total base number of the packaging signal).
  • FIG. 1 shows the donor virus structure and formation of a donor virus ⁇ acceptor substrate in a packaging cell line which expresses the site-specific recombinase (gray boxes: viral inserted terminal repeat units (ITRs); black boxes: partially deleted packaging signal ( ⁇ ); white triangles: recognition sites for the site-specific recombinase (RS); white circles: viral terminal protein (TP)).
  • FIG. 2 shows the general structure of the preferred donor plasmids of type I (A), type II (B) and type III (C) and the principle of recombinant adenovirus production by site-specific recombination with the donor virus ⁇ v acceptor substrate in a packaging cell line, which the site-specific recombinase expressed (gray boxes: viral inserted terminal repeat units (ITRs); black boxes: complete viral packaging signal ( ⁇ ); white triangles: recognition sites for the site-specific recombinase (RS); white circles: viral terminal protein (TP); arrow: promoter (P); pA: polyadenylation signal; RCE: recognition site for a rarely cutting endonuclease).
  • ITRs viral inserted terminal repeat units
  • RS complete viral packaging signal
  • RS recognition sites for the site-specific recombinase
  • TP site-specific recombinase
  • arrow promoter
  • pA polyadenylation signal
  • RCE recognition site
  • Figure 3 shows a schematic overview of the use of adenovirus cDNA expression libraries for the identification of genes which induce a given phenotype in a functional cell-based assay.
  • FIG. 4 shows the genome structures of the donor viruses clantis and Ad / antisU, which are part of a system for the construction of clonal or complex populations of recombinant E1-deleted adenovirus serotype 5, and their functional characterization.
  • (4A) Schematic structure of Ad / antis ⁇ and Ad / antisW as well as the donor virus ⁇ acceptor substrate formed by Cre // ⁇ ° -mediated excision of the packaging signal and interfaces for Nhe I, which in the Analyzes were used in (4b) (gray boxes: viral inverted terminal repeat units (ITRs); black boxes with Latin numbers: so-called A repeats of the partially deleted packaging signal ( ⁇ ); white triangles: recognition sites for Cre recombinase (loxP); S : 929Bp spacer; gray boxes: Inverted terminal repeats of Ad5 (ITRs).
  • FIG. 5 shows the structures of the donor plasmids pCBI-3, pCBII-3, pCBIII-3, pCBI-CMVIl, pCBII-CMVIl and pCBIII-CMVIl, which are part of a system for the construction of clonal or complex populations of recombinant E1-deleted adenovirus serotype 5 are, as well as their • polylinker for the insertion of DNA (white circles: bacterial origin of replication (ori); Amp R: ampicillin resistance gene; gray boxes: 5'-inverted terminal repeat of Ad5 (5 'ITR); black boxes: complete packaging signal of Ad5 containing so-called A repeats l-VII ( ⁇ ); white triangles: recognition sites for Cre recombinase (
  • FIG. 6 shows the structure of the donor plasmids pCBI-DsRed, pCBII-DsRed and pCBIII-DsRed and the recombinant adenoviruses AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed and AdCBIII-DsRed formed from these donor plasmids by recombination with Ad / antis. Furthermore, the size of the Ps? AI fragments, in particular that of the 5 ' terminal Ps /? AI fragments, which were used in the analysis in FIG. 8A to distinguish between viral DNA from Adlantis and the newly formed recombinant adenoviruses.
  • the structures of the recombinant adenoviruses indicate the binding sites of the primers and the size of the corresponding PCR products, the formation of which in FIG. 8B confirms the formation of the recombinant adebnoviruses (round white circle (ori): bacterial origin of replication; white triangle (loxP): / oxP recognition site, ⁇ : complete packaging signal from Ad5; ⁇ *: partially deleted packaging signal from Ad5; black boxes: inverted terminal repetitions of Ad5 (ITRs); S: spacer; RSV: RSV promoter; bGHpA: bovine Growth hormone polyadenylation signal (bovine growth hormone polyadeny / ation signal); DsRed: open reading frame of the DsRed reporter gene).
  • round white circle (ori) bacterial origin of replication
  • white triangle (loxP) / oxP recognition site
  • ⁇ complete packaging signal from Ad5
  • ⁇ * partially deleted packaging signal from Ad5
  • black boxes inverted terminal repetitions
  • FIG. 7 shows the analysis of the mixtures of residual donor virus and newly formed recombinant adenoviruses obtained using the Ad / antisl donor virus and the pCBI-DsRed, pCBII-DsRed or pCBIII-DsRed donor plasmids.
  • 10 6 CIN 1004 cells were infected with 5 infectious particles Ad / antis ⁇ per cell and then transfected with 10 ⁇ g pCBI-DsRed, pCBII-DsRed (1-Scel-digested) or pCBIII-DsRed.
  • Three completely independent experiments were carried out for each donor plasmid.
  • FIG. 8 shows the analysis of the mixtures of residual donor virus and newly formed recombinant adenoviruses obtained at the level of the viral DNA when using the Adlantis donor virus and the pCBI-DsRed, pCBII-DsRed or pCBIII-DsRed donor plasmids.
  • (8A) shows the cleavage of 1 ⁇ g of the shepherd extracts with PshA ⁇ . Viral DNA from the Adlantis donor virus is applied as a control. This cleavage enables the 5 ' - terminal fragments of the newly formed recombinant adenoviruses and the donor virus Ad / antis ⁇ to be distinguished. (see Figure 6). When using pCBI-DsRed and pCBIII-DsRed as donor plasmid, only the 3909 bp 5 ' terminal fragment of Ad / antis ⁇ can be recognized.
  • both the 4581 bp 5 ' terminal fragment of AdCBII-DsRed and the 3909 bp 5 ' terminal fragment of Ad / ant / ' s ⁇ are in a ratio of about 1: 1 to recognize. This shows that the formation of AdCBII-DsRed from pCBII-DsRed is significantly more efficient than that of AdCBI-DsRed from pCBI-DsRed or that of AdCBIII-DsRed from pCBIII-DsRed.
  • (8B) shows the PCR detection of the DNA of the newly formed recombinant adenoviruses AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed or AdCBIII-DsRed in the shepherd extracts.
  • 1 ⁇ ⁇ of the shepherd extracts were used in a PCR with the specified primers AdCBI-s or bGHpA-s and Ad-as.
  • 1 ⁇ H 2 0 was used as a negative control. See FIG. 6 for the binding sites of the primers and the size of the corresponding PCR products (M: DNA size marker).
  • FIG. 9 shows the structure of the donor plasmids pCBII-DsRed and pCBII- / acZ and the recombinant adenoviruses AdCBII-DsRed and AdCBIIJacZ formed from these donor plasmids by recombination with the donor viruses Ad / antis and AdlantisW. Furthermore, the size of the Ps ⁇ AI fragments, in particular that of the 5 '-terminal s ⁇ AI fragments, which were used in the restriction analyzes in FIGS. 10 and 11 to differentiate between viral DNA of the donor viruses and the newly formed recombinant adenoviruses.
  • Figure 10 shows the experimental scheme that for the preparation of large preparations of the recombinant adenoviruses AdCBII-DsRed and AdCBIIJacZ was used. According to this scheme, 3 parallel independent experiments were carried out for both Dobnorviruses Ad / antis ⁇ and AdlantisW in combination with the donor plasmids pCBII-DsRed or pCBII- / acZ.
  • Figure 1 1 shows the analysis of the virus mixtures, which were obtained in the amplification round 1 (A1) according to the scheme of Figure 10.
  • 1 ml of the freezer / tau lysate A1 was used to infect 10 6 293 cells. After the cytopathic effect appeared, the replicated viral DNA was isolated by shepherd extraction. 1 ⁇ g of the shepherd extracts was then digested with PshA ⁇ .
  • This enzyme provides characteristic fragments from the 5 ' end of the donor viruses Adlantis ⁇ and AdlantisW as well as the recombinant adenoviruses AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ (see FIG. 9).
  • Control (C) was 1 ⁇ g of purified DNA from the donor virus Ad / antls ⁇ or AdfantisW used in each case.
  • the upper two figures show the results with pCBII-DsRed as donor plasmid (recombinant adenovirus AdCBII-DsRed), the two lower ones with pCBII- / acZ (recombinant adenovirus AdCBII- / acZ).
  • Adlantis ⁇ was used in the right-hand figures and AdlantisW in the left-hand figures as a donor virus.
  • the three independent experiments (a, b, c) with proliferation on 293 or CIN 1 004 cells are shown in the figures.
  • FIG. 12 shows the analysis of large preparations of the recombinant adenoviruses AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ, which were obtained according to the experimental scheme of FIG. 10.
  • the viral DNA was extracted from the purified infectious particles and 1 ⁇ g of the purified DNA was digested with PshA ⁇ .
  • This enzyme provides characteristic fragments from the 5 ' end of the donor viruses Ad / antis ⁇ and AdlantisW as well as the recombinant adenoviruses AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ (see FIG. 9).
  • Control (C) was 1 ⁇ g of purified DNA from the Adlantisl or AdlantisW donor virus used.
  • the upper two figures show the results with the recombinant adenovirus AdCBII-DsRed, the two lower ones with the recombinant adenovirus AdCBII- / acZ.
  • Ad / antis ⁇ was used in the right-hand figures and AdlantisW in the left-hand figures as a donor virus.
  • the three independent experiments (a, b, c) with proliferation on 293 or CIN 1 004 cells are shown in the figures.
  • FIG. 13 shows the determination of the titer of intact infectious particles and the total titer of viral particles in the large preparations of AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ, which were produced according to the scheme in FIG.
  • the titer of intact infectious particles was determined by dilution endpoint analysis on 293 cells (black bars), the total titer of viral particles by measuring the photometric absorption of the virus preparation (white bars). The mean of the three independent experiments and the standard deviation are shown. The ratio of the total titer of viral particles to the titer of infectious particles is shown above the pairs of bars.
  • FIG. 13 shows the determination of the titer of intact infectious particles and the total titer of viral particles in the large preparations of AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ, which were produced according to the scheme in FIG.
  • the titer of intact infectious particles was determined by dilution endpoint analysis on 293 cells (black bars
  • FIG. 15 shows the testing of the large preparations of AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ, which were prepared according to the scheme of FIG. 10, for contamination with replication-competent wild-type adenoviruses (RCA).
  • RCA replication-competent wild-type adenoviruses
  • FIG. 16 shows the high efficiency with which replication-competent wild-type adenoviruses (RCA) arise from Ad / antis ⁇ , but not from AdlantisW, after infection of CIN1004 cells.
  • 293 or CIN1004 cells were infected with 5 infectious particles per cell Ad / antis ⁇ or 1 infectious particles per cell AdlantisW. After the virus-induced cytopathic effect appeared, the cells were disrupted by freeze-thaw lysis and the lysates were tested for the presence of RCA by means of PCR. Primers were used which lead to the formation of a 600 bp product when RCA DNA is present.
  • H 2 0 or freeze / tau lysates of sham-infected 293 cells (mock) were used as negative controls, freeze / tau lysates of RCA-infected cells (M: DNA size marker) as positive controls (PC).
  • FIG. 17 shows the determination of the number of independent recombinant adenovirus clones which arise when using the Adlant / sl or AdlantisW donor viruses and type 2 donor plasmids from 10 6 CIN 1 004 cells.
  • 1 0 6 CIN 1 004 cells were infected with 5 infectious particles per cell Ad / ant / s ⁇ (top) or 1 infectious particles per cell AdlantisW (bottom) and then each with 12 vg of different mixtures of / -Scel-digested pCBII-DsRed and pCBII- / acZ transfected. Mixing ratios from 50: 1 to 500,000: 1 were used.
  • the Huh7 cells were stained with XG al.
  • the number of pC BI I- / acZ resulting en / acZ-transducing units could then be determined by counting the blue-stained cells.
  • the bars indicate the mean of the total number of LTU and the standard deviation in those experiments in which blue cells could be detected. The ratio of the number of positive experiments to the total number of experiments is shown above the bar.
  • FIG. 18 shows the experimental scheme for the production of adenoviral cDNA expression banks and their use for the identification of genes which produce a certain phenotype in a test system (white circle: bacterial origin of replication (ori); white arrow: ampicillin resistance gene (amp); white triangle : / oxP recognition site (loxP); black boxes: terminal inverted repeats of Ad5 (ITRs); ⁇ : complete packaging signal of Ad5; Ad5 ⁇ E1 ⁇ E3: coding sequences of Ad5 with deletion of the E1 and E3 region; boxes with arrow: CMV Promoter (CMV); pA: CMV polyadenylation signal).
  • CMV CMV Promoter
  • FIG. 19 summarizes the experimental procedure for the construction of the expression library for human liver cDNA in the donor plasmid pCBII-CMVII (white circle: bacterial origin of replication (ori); white arrow: ampicillin resistance gene (amp); white triangle: / oxP recognition site oxP ); black boxes: 5 ' terminals inverted repeat of Ad5 (5'ITR); ⁇ : full packaging signal from Ad5; Box with arrow: CMV promoter (CMV); pA: CMV polyadenylation signal.
  • FIG. 20 shows the characterization of the expression library for human liver cDNA in the donor plasmid pCBII-CMVIl (pCBII-CMVIl-LIVERcDNA), which had been prepared according to the scheme from FIG.
  • (20A) shows the determination of the size range of the inserted cDNAs.
  • 1 ⁇ g plasmid DNA from individual clones was digested with St7aBI.
  • pCBII-CMVII was digested with SnaB ⁇ without inserted foreign DNA.
  • This enzyme supplies a 3554 bp fragment from the plasmid backbone, as well as a further fragment which contains the expression cassette together with the CMV promoter, inserted cDNA and CMV polyadenylation signal (see FIG. 19).
  • the size of this fragment can be estimated by subtracting the sum of the sizes of the CMV promoter and the polyadenylation signal (632 bp) from the size of the inserted cDNA.
  • (20B) shows the presence of the cDNAs for hAAT (top) and hFlX (bottom) using PCR.
  • the binding sites of the primers used and the size of the products are shown schematically.
  • 50, 200 or 500 ⁇ g of the plasmid bank were used in the PCR.
  • H 2 0 and 10 ng pCBII-CMVII served as negative controls
  • 10 ng each of a plasmid with the complete reading frame of hAAT (top) or hFlX (bottom) served as positive controls (PC).
  • FIG. 21 shows the experimental scheme that was used in the conversion of the expression library for human liver cDNA in the donor plasmid pCBII-CMVIl (“pCBII-CMVIl-LIVERcDNA”) into adenoviral cDNA expression banks.
  • Figure 22 shows the controls for the complexity and efficiency of the V u r u s n t h e n g e d u r E d i n e n u n g e n e n u n g e n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n g n e n u n e n g u n e n
  • Non-infected and non-transfected Huh7 cells (ni / nt) served as negative controls, Huh7 cells, which had been infected with 20 infectious particles per cell of a recombinant adenovirus with an RSV promoter-driven / acZ expression cassette, served as negative controls ( AdRSV- / lacZ)
  • FIG. 23 shows the characterization of the ad enoviral liver cDNA expression banks Ad / a / 7f / sLIVERcDNAI & II with respect to the sizes of the inserted cDNAs.
  • Individual virus clones isolated by piaque assay on 293 cells were used to infect 10 6 293 cells each. After 36 h, the replicated viral DNA was extracted and subjected to a restriction analysis with PshA ⁇ . This enzyme provides a characteristic fragment from the 5 'end of the recombinant adenovirus, the size of which is composed of 3667 bbp vector sequences and the size of the inserted cDNA.
  • FIG. 24 shows the extent of the contamination of the adenoviral liver cDNA expression banks Ad / a / 7 / sLIVERcDNAI & II with replication-competent adenoviruses (RCA). 10 7 Huh7 cells were infected with 1 - 10 8 infectious particles (IP) from the expression banks.
  • IP infectious particles
  • FIG. 25 shows in table form the characterization of the inserted cDNAs in the clones I-6, I-8, I-9, 1-1 5, 1-1 7 isolated from the adenoviral liver cDNA expression bank Ad / a ⁇ t / sLIVERcDNA I by piaque assay and 1-1 8.
  • FIG. 26 shows in tabular form the characterization of the inserted cDNAs in the clones 1-1 9, I-24, I-25, I-26 and I-27 isolated from the adenoviral liver cDNA expression bank Ad / a ⁇ f / sLIVERcDNA I by piaque assay.
  • FIG. 27 shows the scheme on which the first screening round of the adenoviral liver cDNA expression banks (Ad / anf / sLIVERcDNA) was based for recombinant adenoviruses which contain the hAAT or hFlX cDNA.
  • adenoviral liver cDNA expression banks Ad / anf / sLIVERcDNA
  • 3 ⁇ 10 3 293 cells were sown in 96-we // plates.
  • wells A1-F1 2 were then infected with 50 (first screening round hAAT) or 500 (first screening round hFlX) infectious particles per well.
  • Non-infected cells (wells G 1 -G6) and cells infected with 50 (first screening round hAAT) or 500 (first screening round hFlX) Ad / ant / s per well (wells G7-G 1 2) served as controls. After 7 days, the propagated viruses were released by freeze / thaw lysis of the cells in the master plates. In each case 40 ⁇ ⁇ of the virus-containing supernatants were used for the infection of 96-we // plates with 3 ⁇ 1 0 4 293 cells per well (master plates S1 A2). After the virus-induced cytopathic effect appeared after about 3 days, the cell culture supernatants were tested for hAAT or hFlX by ELISA.
  • Non-infected cells (wells G 1 -G6) and adfantisl particles infected with 1 (second screening round hAAT) or 10 (second screening round hFlX) per well (wells G7-G 1 2) served as controls.
  • the propagated viruses were released by freeze / thaw lysis of the cells in the master plates.
  • 40 ⁇ l of the virus-containing supernatants were used to infect 96-well plates with 3 ⁇ 1 0 4 293 cells per well (master plates S2A2).
  • the second screening round hFlX the cell culture supernatants of these master plates were tested for hFlX by ELISA after the virus-induced cytopathic effect (CPE) had occurred.
  • CPE virus-induced cytopathic effect
  • FIG. 29 shows the experimental scheme for the clonal isolation of recombinant adenoviruses which contain the hAAT or hFlX cDNA from the positive wells in S2A3 (second screening round hAAT) and S2A2 (second screening round hFlX).
  • Individual virus plaques are obtained by piaque assays with serial dilutions of the freeze / thaw lysates from the positive wells of the second round of screening. The plaque isolates are then individually expanded on 293 cells and the cell culture supernatants are tested for hAAT or hFlX by ELISA. Both positive PIaqueisolaten the presence of the hAAT or hFlX cDNA is then verified by sequencing.
  • FIG. 30 shows the results of the first screening round of the two adenoviral liver cDNA expression banks Ad / a / 7f / sLIVERcDNAI (top) and Ad / ant sLIVERcDNAII (bottom) for recombinant adenoviruses which contain the hAAT cDNA.
  • the raw data of the hAAT ELISA (OD 490 ) are shown with the supernatants of each of the 3 (a, b, c) master plates S1 A2, which were produced according to the scheme of FIG.
  • FIG. 31 shows the results of the second screening round of the adenoviral liver cDNA expression bank Ad / a / 7f / sLIVERcDNAI for recombinant adenoviruses which contain the hAAT cDNA.
  • the raw data of the hAAT-ELISA (OD 490 ) are shown with the supernatants of each 1 master plate S2A3, per selected positive subpopulation (1 -a-B9, 1 -a-D1, 1 -b-D10 and 1 -C-B8 ) the master plates S1 A2 were produced according to the scheme of FIG.
  • FIG. 32 shows the results of the first screening round of the adenoviral liver cDNA expression bank Ad / at7t / sLIVERcDNAI for recombinant adenoviruses which contain the hFlX cDNA.
  • the raw data of the hFlX-ELISA (OD 490 ) with the supernatants of the 9 (af) master plates S1 A2 are shown, which were produced according to the scheme of FIG.
  • FIG. 34 shows the results of the second screening round of the adenoviral liver cDNA expression bank Ad / a ⁇ r / sLIVERcDNAI for recombinant adenoviruses which contain the hFlX cDNA.
  • the raw data of the hFlX-ELISA (OD 490 ) are shown with the supernatants of the two master plates (A, B) S2A2, the per selected positive subpopulation (la-A1 1 and 1 -b-F5) of the master plates S1 A2 according to the scheme of Figure 289 with 10 infectious particles per well in S2A1 (A1 -F1 2: samples; G 1 -G6: negative controls 1 (supernatants of uninfected 293 cells; G7-G 1 2: negative controls 2 (supernatants with Ad / antisl infected cells); F1 - F9: standard series hFlX (1: 2 dilution levels, starting with 25 ng hFlX / ⁇ l); F1 0-F1 2: blank value).
  • the system according to the invention for the production of rAd was implemented for the construction of clonal or complex populations of recombinant E1-deleted human adenoviruses of serotype 5 (Ad5).
  • the packaging signal of Ad5 consists of seven so-called A repeats, which are between nt 200 and nt 380 at the 5 'end of the Ad5 genome (Schmid, Sl and Hearing, P. (1 997) J. Virol. 71: 3375-3384) ,
  • the Cre // oxP recombination system of bacteriophage P1 was used as the site-specific recombination system, consisting of the Cre recombinase and the / ox sequence recognized by it (Sternberg, N.
  • Ad5-derived E 1 -deleted replication-deficient viruses are used as donor viruses, the packaging signal of which (i) is partially deleted and (ii) is framed by parallel / oxf sequences.
  • the donor viruses also have a 2.7 kbp deletion in the E3 region and can therefore take up to 8 kbp foreign DNA.
  • Adlantis ⁇ the A repats VI and VII have been deleted, so it contains the A repeats l-V (nt 1 94-358 of the Ad5 genome).
  • AdlantisW the A repeats III, IV and V are deleted, so it contains the A repeats I, II, VI and VII (nt 1 94-271 and then nt 355-542 of the Ad5 genome).
  • the donor virus genomes were constructed by homologous recombination in E. coli. First, S / ji / tt / e plasmids were constructed which contained the 5 'end of the donor viruses (pAd2lis for Ad / antis ⁇ and pAd2lis ⁇ for AdlantisW).
  • the starting plasmid for the construction of pAd2lis was p_E1-2lox, which, in sequential order, the 5 'ITR of Ad5, an / ox sequence, a partially deleted packaging signal from Ad5 with the repeats IV ( ⁇ IV-VII), and a 929 bp size was not -coding spacer fragment, a second parallel / ox sequence and then the nt 3524-5790 of the Ad5 genome (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Loser, P. and Strauss, M. (2001) Hum Gene Ther. 1 2: 642-657).
  • the functional elements mentioned were released from p_E1-2lox as a 3008 bp / 4 / 7lll // 3s ⁇ II fragment and inserted into the S ⁇ i / r ⁇ / e plasmid pHVAd2 (Sandig, V., unpublished) via the same restriction sites, from which pAd2lis emerged.
  • the partially deleted packaging signal ⁇ VI-VII in pAd2lis was replaced by the partially deleted packaging signal ⁇ III-V.
  • the starting point was the plasmid pSLITRPS, which contains the first 542 bp of the Ad5 genome including the 5 'ITR and the complete packaging signal (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Lenter, P. and Strauss, M. (2001) Hum. Gene Ther. 1 2: 642-657).
  • a 704 bp Sa / l / ⁇ / ⁇ l fragment was cleaved, which contained the Ad5 sequences mentioned and was inserted into the Dsal site of the plasmid pBSSK- (Stratagene), resulting in plasmid pBSITRPS.
  • an 84 bp Dsal / M / t / NI fragment was cleaved, which corresponds to nt 272-355 of the Ad5 genome and which contains repeats III-V.
  • the vector was obtained by religation of the plasmid pBSITRPS ⁇ , which contains the partially deleted packaging signal ⁇ III-V.
  • pHVAd 1 (Sandig, V., unpublished) contains the rest of the Ad5 genome with a 2.7 kbp deletion in the E3 region.
  • the genomes of the donor viruses Adlantis ⁇ and AdlantisW were released from the plasmids pAdl lis and pAdl lis ⁇ obtained by this recombination by digestion with Pac ⁇ and then transfected into 293 cells.
  • the 293 cells complement the E1 deficiency of the donor virus, resulting in a Virus propagation can take place.
  • the infectious viruses obtained from this were then propagated to 293 cells.
  • Ad / antis ⁇ was released as a supernatant from thoroughly infected lysed 293 cells and then purified using CsCI density gradients, AdlantisW was used directly as a supernatant from thoroughly infected lysed 293 cells.
  • the cell line derived from 293 cells comes as the packaging cell line
  • CIN1004 for use, which constitutively expresses the gene for a core-localized Cre recombinase (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Lenderr, P. and Strauss, M. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 642- 657).
  • This cell line could be obtained by using a bicistronic vector in which the expression of a nuclear-localized Cre recombinase was linked to that of the selectable neo gene via an internal ribosome entry site. After transfection of 293 cells with this vector, a direct selection for high expression of the Cre recombinase could be made via a selection for the high expression of the neo gene.
  • Donor plasmids are used, each corresponding to type 1, 2 and 3 donor plasmids (pCBI, pCBII and pCBIII). They contain one (pCBI, pCBII) or two (pCBIII) / oxP recognition sites and the complete packaging signal of Ad5 (A repeats l-VII, nt 194-526 of the Ad5 genome). pCBII also contains two recognition sites for the rarely cutting restriction endonuclease I-Scel (18 bp recognition sequence).
  • the plasmids are each in various forms (see Figure 54), for example with a polylinker into which complete expression cassettes with promoter, coding region and polyadenylation signal can be inserted (pCBI-3, pCBII-3, pCBIII-3) or with a polylinker , which is framed by the hCMV promoter and the hCMV polyadenylation signal, for the insertion of coding sequences, for example transgenes or cDNA banks (pCBI-CMVIl, pCBII-CMVIl, pCBIII-CMVIl).
  • the donor plasmids were constructed on the basis of pMV, a plasmid which, in addition to a bacterial origin of replication (ColEI), a cos signal and the ampicillin resistance gene, is an I-Scel recognition site in sequence, nt 1-542 of the Ad5 genome (5 ' ITR and complete packaging signal), a polylinker containing 3 'ITR of Ad5 and a second I-Scel recognition site (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Lenter, P. and Strauss, M. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 642-657).
  • pCBI-3 and pCBI-CMVIl were first carried out by inserting a 107 bp-Xmal fragment containing a / ⁇ xP recognition sequence into the SprAI located in pMV between the Ad5-5 ' ITR and the Ad5 packaging signal Interface pMVI obtained.
  • a 905 bp fragment was released from pMVI, which contained the I-Scel recognition sequence, the Ad5-5 'ITR, the / oxf recognition sequence, the Ad5 packaging signal and the polylinker.
  • PCBI-3 was obtained by cutting out the part of the F1 replication origin as a 284 bp / o; oMI fragment and religation of the vector. By inserting a 688 bp fragment containing the hCMV promoter and the hCMV polyadenylation signal with an intermediate polylinker between the Pml ⁇ and / ael sites of the polylinker of pCBI-3, pCBI-CMV was obtained.
  • pCBII-CMV was obtained.
  • pClII was obtained.
  • pCBIII-3 and pCBIII-CMVII were constructed from pCBI-3 (see above).
  • the plasmid pCBIII-3 was first obtained by inserting a 107 bp fragment with a / ox sequence into the ⁇ / groMI site of the polylinker of pCBI-3.
  • pCBIII-CMV was obtained.
  • CIN 1004 cells were infected with Ad / antis or AdlantisW. After the virus-induced cythopathic effect appeared, the replicated viral DNA was isolated and subjected to a restriction analysis in which a distinction can be made between unprocessed donor virus and processed donor virus ⁇ -acceptor substrate. The fragment pattern corresponded to completely processed donor virus ⁇ acceptor substrate (FIG. 4B).
  • the comparison of the number per cell produced as progeny of infectious particles after infection of CIN 1 004 or 293 cells showed an approximately 100-fold reduction in growth of the donor viruses Adlantis ⁇ and AdlantisW on CIN 1004 cells (FIG.
  • a constitutive expression cassette for the reporter gene DsRed was inserted into the polylinker of the donor plasmids pCBI, pCBI I and pCBII I.
  • donor plasmids pCBI-DsRed, pCBII-DsRed and pCBIII-DsRed as well as the recombinant adenoviruses resulting from these donor plasmids by Cre / tox -mediated recombination with the donor virus ⁇ acceptor substrate AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed and AdCBIII-DsRed are shown in Figure 6.
  • pCBI-DsRed, pCBII-DsRed (digested with I-Scel) and pCBIII-DsRed were transfected into CIN 1004 cells which had previously been infected with Adlantis ⁇ .
  • the virus-induced cythopathic effect (CPE) appeared, the cells were lysed (freeze / thaw lysate amplification round 0, AO).
  • the virus-containing lysate obtained in this way was used to multiply the recombinant adenoviruses for the infection of 293 cells, which in turn were lysed after the appearance of the CPE (freezer / tau lysate amplification round 1, A1).
  • the total amount of the recombinant adenoviruses AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed and AdCBIII-DsRed contained in AO and A1 were then determined.
  • DsRed transducing units DsRed transducing units
  • the total amount of infectious particles in A0 and A1 was titrated by dilution endpoint analysis on 293 cells (FIG. 7).
  • DTUs were detected and recombined adenoviruses were formed.
  • the total amount of DTU when using the donor plasmids pCBI-DsRed and pCBIII-DsRed was about 100 in A0 and about 1000 in A1.
  • the total amount of infectious particles was about 10 5 in AO and about 10 7 in A1, which indicated that the recombinant adenoviruses were heavily contaminated with residual donor virus.
  • the total amount of DTU was significantly higher at about 10 5 in AO and about 10 7 in A1 for a comparable total amount of infectious particles.
  • PCR analyzes were carried out with the same herbal extracts, in which primer pairs were used which were only from the recombinant adenoviruses AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed and AdCBIII-DsRed, but not from the donor virus or Donor plasmids deliver a product (see Figure 6).
  • the product characteristic of the recombinant adenoviruses occurred in all experiments (FIG. 8B).
  • donor plasmids of type 2 (derivatives of pCBII-3 or pCBII-CMVII, see FIG. 5) were subsequently used to generate clonal and complex populations of recombinant adenoviruses.
  • the donor plasmids pCBII-DsRed and pCBII- / acZ were used, which contain constitutive expression units driven by the RSV promoter for the reporter genes DsRed and lacZ as transgenes.
  • pCBII-DsRed see above
  • pCBII- / acZ was obtained by inserting the expression cassette into the polylinker of pCBII-3.
  • Both plasmids and the recombinant adenoviruses AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ resulting from recombination with the donor virus ⁇ acceptor substrate are shown in FIG. 9.
  • the efficient generation of recombinant adenoviruses from donor plasmids of type 2 in conjunction with Adlantisl as donor virus had already been shown in the previous experiments. Subsequently, it was tested under which conditions large preparations of clonal recombinant adenoviruses with sufficient purity can be obtained.
  • the system according to the invention for the production of recombinant adenoviruses enables the use of two selection principles, which may also be combined, when using type 2 donor plasmids Reduction of contamination by residual donor virus: (1)
  • the donor viruses have a deletion in the packaging signal.
  • the recombinant adenoviruses should therefore have a growth advantage. This advantage should be inversely related to the extent of deletion of the packaging signal, which is different in the Adlantisl and AdlantisW donor viruses.
  • CIN 1004 cells they are therefore not a substrate for the Cre // ox -mediated excision of the packaging signal, in contrast to the donor viruses whose packaging signal is framed by two / oxP sequences and whose growth on CIN 1004 cells is approximately 100 times is reduced (see Figure 4).
  • FIG. 10 summarizes the experimental procedure. After infection of 1 0 6 CIN 1 004 cells with Adlantisl or AdlantisW, the cells were transfected with the 1-Scel-digested donor plasmids pCBII-DsRed or pCBII- / acZ. After the virus-induced cytopathic effect appeared, the cells were lysed.
  • Each 1/5 ml of the virus-containing lysate thus obtained was used for propagation on 293 or CIN 1 004 cells, sequentially a 60 mm dish (amplification round 1, A1), a 1 50 mm dish (amplification round 2, A2) and finally 10 1 50 mm dishes (amplification round 3, A3) were used.
  • the viruses released from the last round of amplification were purified by means of CsCI density gradient centrifugation and, after separation of the CsCI by gel filtration, 2 ml of purified virus preparations were obtained.
  • the viral DNA was extracted from the purified virus preparations and again analyzed by cleavage with PshA. Only the characteristic 5 ' -terminal fragment of the recombinant adenovirus was recognizable in all purified virus DNAs (FIG. 1 2). Contamination with residual donor virus could therefore not be detected using this method. In addition, these results showed that the structure of the recombinant viruses had remained intact during the propagation.
  • the titer of intact infectious particles (by dilution endpoint analysis on 293 cells) and the total titer of viral particles (by measuring the photometric absorption of the virus preparation) was then determined for all purified large-scale preparations of AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ ( Figure 1 3). Both the titer of intact infectious particles (10 10 - 10 1 1 per ml) and the ratios of the total titer of viral particles to the titer of infectious particles (1 5 - 43) are within the scope of what is also possible with other common methods of production and Propagation of recombinant adenoviruses is obtained.
  • AdCBII-DsRed and AdCBII- / ac were then checked for contamination with replication-competent wild-type adenoviruses (RCA). As is known, these arise with a frequency that cannot be neglected when multiplying recombinant adenoviruses on 293 cells. This is based on homologous recombination events between the 5 ' termini of the recombinant adenoviruses and the 43445 ' terminal Bp of Ad5 inserted into the genome of 293 cells (and also of the CIN1004 cells derived therefrom). A double crossover event creates wild-type viruses that are no longer deficient in E1.
  • AdCBII-DsRed and AdCBII- / acZ are identical when using both donor viruses, it was unlikely that the RCA would arise from these recombinant adenoviruses during their multiplication. Rather, it had to be assumed that they would arise with a high probability after infection of CIN 1004 cells in AO specifically when Adlantisl was used and would then grow with the proliferation of the recombinant adenoviruses. To verify this, Adlantisl and Ad / antisl were passaged once through 293 and CIN 1004 cells. The same conditions were used as for the A0 for the production of recombinant adenoviruses according to the scheme of FIG.
  • AdlantisW is used as a donor virus in conjunction with donor plasmids of type 2 (pCBII-3 derivatives)
  • reproducible reproductions can be obtained by directly increasing the recombinant adenoviruses generated in AO to 293 or CIN 1004 cells, which ( 1) contain the recombinant adenoviruses with intact genome structure in high titers, (2) have a residual donor virus contamination of less than 0.001% and (3) are not contaminated with RCA.
  • the method according to the invention represents an advance over previous methods for producing clonal populations of adenoviruses, since it requires significantly fewer work steps and is therefore faster and moreover easier to handle. It is also cheaper in terms of material costs.
  • Adlantisl and AdlantisW were used as donor viruses and mixtures of the donor plasmids pCBII-DsRed and pCBII- / acZ to determine the number of independent rAd formation events, which is a measure of the complexity to be achieved with the system in the production of mixed rAd populations ).
  • Adlantisl 5 infectious particles per cell
  • Adlantisll 1 infectious particle per cell
  • 1 0 6 CIN 1 004 cells each with 1 2 ⁇ g different mixtures of / -Scel-digested pCBII-DsRed and pCBil- / acZ transfected. Molar mixing ratios of 50: 1 to 500,000: 1 were used.
  • AdlantisW The complexity of 50,000 independent clones per 10 6 cells achieved with Adlantisl means that when using only 2 x 10 7 cells (corresponding to 20 subconfluent 60 mm dishes), a total complexity of 10 6 independent clones, which is necessary for the construction of gene banks, for example adenoviral cDNA- Expression banks, is sufficient.
  • AdlantisW is unsuitable as a donor virus for the construction of cDNA expression banks, since a complexity of 10 6 independent clones would require the use of 10 8 -10 9 CIN 1004 cells (corresponding to 200 - 2000 subconfluent 60 mm dishes). In addition, this would require the transfection of a total of 2.4-24 mg cDNA expression bank in the donor plasmid. The proliferation of cDNA expression banks in plasmids to such amounts is not possible without loss of complexity.
  • the diagram in FIG. 18 shows the experimental procedure for the construction of adenoviral expression banks and the method for isolating cDNAs from them by means of a biological test system.
  • cDNA is synthesized, which is then directed between the CMV promoter and the CMV polyadenylation signal into the polylinker of the Donorplasmids pCBII-CMVIl is inserted.
  • a cDNA expression bank in pCBII-CMVII is obtained from this.
  • adenoviral cDNA expression bank with 10 6 independent clones, a total of 20 60 mm cell culture dishes, each with 10 6 CIN 1004 cells, were infected with 5 infectious Adlantisl particles per cell and then transfected with 1 2 ⁇ g l-Scel-digested plasmid bank. By multiplying the viruses generated in this way and subsequently cleaning the viruses, a high-titer purified adenoviral cDNA expression bank is obtained.
  • master plates are produced by infection of 293 cells in multiwell plates.
  • One or more infectious particles from the adenoviral cDNA expression bank are used per well, as a result of which defined monoclonal or oligoclonal subpopulations are increased.
  • the master plates can be stored for a long time due to the stability of adenoviruses.
  • the supernatants in the wells of the master plates contain the increased infectious adenoviruses.
  • they contain the proteins which are encoded by the cDNAs contained in the respective adenovirus clones, since the CMV promoter leads to their expression in the infected 293 cells.
  • a direct detection of a desired protein in the lysates can therefore serve as a test system, for example an enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA).
  • the lysates are used to infect cells in a cell-based test system, in which a phenotypic change caused by the expression of the cDNA in the cells can be detected.
  • the recombinant adenoviruses can be clonally isolated from 293 cells by piaque assay from those wells of the master plates, the supernatants of which deliver the signal in such test systems.
  • the cDNAs can then be characterized, for example, by sequencing.
  • an adenoviral cDNA expression bank was constructed on the basis of human liver mRNA. From this adenovirus clones were isolated, which isolated the cDNAs of human alpha-1-antitrypsin ( hAAT) and human blood coagulation factor IX (hFlX). ELISAs were used as a detection system to detect these secreted proteins in the supernatants of the master plates. These serum proteins expressed in the liver were selected because they are exemplary for a gene that is strongly expressed in the liver (hAAT, Serum concentration about 2 g / l) and a weakly expressed gene in the liver (hFlX, serum concentration about 4 mg / l).
  • plasmid DNA from isolated clones was subjected to a restriction analysis with St? ABI. This enzyme cleaves the entire expression cassette including the CMV promoter, cDNA and polyadenylation signal. The size of the inserted cDNA can be estimated from the size of the corresponding fragment (FIG. 20A).
  • This plasmid library was then used to obtain adenoviral liver cDNA expression banks.
  • the experimental procedure is summarized in FIG. 21. Twenty 60 mm cell culture dishes, each with 10 6 CIN 1004 cells, were infected with 5 infectious Adlantisl particles per cell and then transfected with 1 2 ⁇ g l-Scel-digested plasmid bank pCBII-CMVII-LIVERcDNA per dish. After the virus-induced cytopathic effect (CPE) appeared, the cells were disrupted by freeze / thaw lysis and the lysates from the twenty dishes were combined (primary adenoviral liver cDNA expression bank, amplification round 0, AO).
  • CPE virus-induced cytopathic effect
  • Half of the lysate from AO was used to multiply the expression bank to infect four subconfluent 1 50 mm cell culture dishes with CIN 1004 cells. After the CPE had appeared, the cells were freeze-thawed open-minded (amplification round 1, A1). Half of the lysate from A1 was then used to infect nine subconfluent 150 mm cell culture dishes with 293 cells. After the appearance of the CPE, the cells were sedimented and disrupted by freeze / thaw lysis (round of amplification 2, A2). The viruses released in this way were purified by CsCI density gradient centrifugation and, after separation of the CsCI, two ml of purified adenoviral liver cDNA expression bank were obtained.
  • the efficiency of virus generation in AO was therefore very high. Isolated blue cells were detected in all of the three controls for the complexity, which indicated that in each dish at least one recombinant adenovirus had arisen from the 1: 50,000 diluted pCBII- / acZ.
  • the complexity in AO was therefore at least 50,000 independent clones per 60 mm shell. When the primary adenoviral expression banks were obtained from twenty 60 mm shells in AO, a complexity of at least 1 0 6 independent adenovirus clones could be assumed.
  • the plasmid bank pCBII-CMVII-LIVERcDNA was thus converted with high efficiency into adenoviral liver cDNA expression banks with a complexity of at least 10 6 independent adenovirus clones in two independent experiments.
  • F / sLIVERcDNA II were within the scope of what was also achieved with the system according to the invention in the generation of clonal adenovirus populations (see above).
  • Individual clones of recombinant adenoviruses were then obtained from the two purified adenoviral expression banks for characterization of the insert size range by piaque assay on 293 cells.
  • the PIaqueisolaten were then infected 293 cells and then the replicated viral DNA isolated and subjected to a restriction analysis with PsbAI. This enzyme provides a characteristic fragment from the 5 ' end of the recombinant adenoviruses, from the size of which the size of the inserted cDNAs can be estimated.
  • Adlantisl Since the use of Adlantisl as a donor virus is associated with the risk of contamination of the virus preparations with replication-competent wild-type adenoviruses (RCA), the extent of contamination was determined for Ad / a ⁇ r / sLIVERcDNA I and Ad / anf / sLIVERcDNA II. This resulted in a contamination of ⁇ 1% with Ad / a / 7 / VsLIVERcDNAI and approximately 10% with Ad / ant / sLIVERcDNAII (FIG. 24). Due to the lower contamination with RCA, all subsequent experiments were carried out with Ad / a / 7f / sLIVERcDNA I.
  • the first step was to characterize individual plaque isolates from Ad / ar / rvsUVERcDNA I with regard to the inserted cDNAs in order to be able to make a statement about the percentage of complete cDNAs in the bank.
  • the PCR products were then cloned into the pBSKS polylinker.
  • the inserts were then sequenced with primers that bind to the T3 and T7 promoters on both sides of the insertion site of the PCR products in the plasmid vector.
  • BLASTN www.ncbi.gov
  • the sequences were compared with sequence databases. The results are summarized in a table in FIGS. 25 and 26.
  • the cDNAs were identified for 9 of the 11 plaque isolates. In two of the inserts (plaque isolates 1-15 and 1-19), apart from homologies to chromosomal regions, no matches could be found with known cDNAs. They may therefore represent genes not yet characterized.
  • the remaining nine inserts were five complete cDNAs (I-6, I-8, 1-11, 1-17, I-26) and four 5 ' truncated cDNAs (1- 18, I-24, I-25, I-28).
  • the cDNAs encoded in six cases for serum proteins that are synthesized in the liver (apolipoprotein A, complement component 4 binding protein, histidine-rich glycoprotein, vitronectin, 2 x haptoglobin) and in three cases for intracellular proteins of the liver (deoxyguanosine kinase, cytochrome P450 and the proteasomal modulatory subunit PSMD9).
  • serum proteins that are synthesized in the liver
  • apolipoprotein A complement component 4 binding protein
  • histidine-rich glycoprotein histidine-rich glycoprotein
  • vitronectin 2 x haptoglobin
  • intracellular proteins of the liver deoxyguanosine kinase, cytochrome P450 and the proteasomal modulatory subunit PSMD9
  • T / ' sLIVERcDNA I has thus shown that more than 50% of the cDNAs were complete, that 2/11 inserts correspond to genes which have hitherto not been characterized and that all clearly identifiable cDNAs code as expected for genes expressed in the liver.
  • Screening of the adenoviral liver cDNA expression banks For the screening for recombinant adenoviruses which contain the cDNAs for hAAT or hFlX, sandwich ELISAs with the supernatants of cells which were in 96-we // plates with subpopulations from the adenoviral liver cDNA expression banks had been infected.
  • FIGS. 27-29 For the isolation of recombinant adenoviruses which contain the cDNAs for hAAT or hFlX, the procedure summarized in FIGS. 27-29 was followed.
  • the supernatants of the master plates S1 A1 were used to infect a further 96-we // plate with 293 cells.
  • master plates S 1 A2 screening round 1 amplification round 2).
  • the supernatants of the master plates S 1 A2 were then tested for hAAT or hFlX by ELISA.
  • oligoclonal subpopulations in the Master plates S1 A2 can be identified which contain recombinant adenoviruses with the hAAT or hFlX cDNA.
  • the second round of screening ( Figure 28) was then about reducing the complexity of these subpopulations.
  • master plates S2A2 screening round 2, amplification round 2).
  • the supernatants from the S 1 A2 master plates were then either tested directly by hISA or hFlX by ELISA, or used again to infect another 96-well plate with 293 cells.
  • the master plates S2A3 were then obtained, which were then tested for hAAT or hFlX by ELISA.
  • low-complex subpopulations in the master plates S2A2 and S2A3 could be identified that contain recombinant adenoviruses with the hAAT or hFlX cDNA.
  • Their separation in clonal form can then be carried out according to the scheme in FIG. 29: piaque assay on 293 cells can then be used to obtain individual adenovirus clones from the positive wells of the master plates S2A2 or S2A3. These can then be multiplied individually on 293 cells.
  • the adenovirus clones which contain the cDNAs for hAAT and hFlX can then be identified by testing the cell culture supernatants by means of ELISA.
  • T / ' sLIVERcDNAI were then selected and the titer of infectious particles was determined (master plate S1A2 a well B9: ⁇ 3 x 10 8 IP / ml; master plate S1A2 a well D1: ⁇ 10 8 IP / ml; master plate S1A2b wellülO: ⁇ 10 8 IP / ml; master plate S1A2 c well B8: ⁇ 3 x 10 8 IP / ml).
  • master plate S1A2 a well B9 ⁇ 3 x 10 8 IP / ml
  • master plate S1A2 a well D1 ⁇ 10 8 IP / ml
  • master plate S1A2b wellülO ⁇ 10 8 IP / ml
  • master plate S1A2 c well B8 ⁇ 3 x 10 8 IP / ml
  • the results of the ELISAs with the supernatants of the four master plates S2A3 are shown in FIG. 31. 2-4 wells per master plate were positive, indicating successful isolation of recombinant adenoviruses containing the hAAT cDNA.
  • individual virus plaques can be obtained by piaque assay on 293 cells according to FIG.
  • the plaque isolates can then be individually expanded on 293 cells and the cell culture supernatants can be tested for verification by ELISA for hAAT or hFlX.
  • the presence of the hAAT or hFlX cDNA can be verified in the adenovirus clones by sequencing.
  • adenoviral cDNA expression banks could thus be produced starting from mRNA which correspond to the generally required criteria for cDNA expression banks: a complexity of approximately 1 0 6 independent clones, a high proportion of complete cDNAs (> 50%), and the presence of cDNAs even at low level expressed genes. Furthermore, it was shown that screening of the adenoviral cDNA expression banks generated in this way via master plates with low-complex subpopulations is suitable for isolating adenovirus clones with the desired properties. The system according to the invention for generating the adenoviral cDNA expression banks and the methods according to the invention for their screening therefore appear to be generally suitable for identifying genes which produce a detectable phenotype in a biological test system.
  • the invention thus relates to a novel system for the production of recombinant adenoviruses (rAd); Areas of application are in particular medicine, veterinary medicine, biotechnology, genetic engineering and functional genome analysis.
  • the content of the invention is a novel system for the production of rAd.
  • the rAd are generated by site-specific insertion of foreign DNA into an infectious replicating virus.
  • clonal rAd populations can be produced more quickly and easily compared to previous methods.
  • the new process also enables the production of complex mixed rAd populations.
  • the content of the invention is also the use of new method of rAd production for obtaining complex gene banks in the adenoviral context, for example cDNA expression banks.
  • the rAd obtained in this way can be used for the transfer and expression of genes in cells and for the transfer of genetic material in animals and humans with the aim of gene therapy and / or vaccination. Furthermore, the complex rAd populations (gene banks) obtained in this way can be used for isolating new genes and for functional modification or optimization of known genes.
  • the system for rAd production preferably consists of a donor virus, the packaging signal (i) of which has been partially deleted and (ii) is framed by parallel-oriented recognition sites for a site-specific recombinase, a packaging cell line which expresses the site-specific recombinase and
  • Donor plasmids which contain (i) one or two recognition sites for the site-specific recombinase, (ii) the complete viral packaging signal, (iii) optionally two recognition sites for a rarely cutting restriction endonuclease and (iv) insertion sites for foreign DNA or inserted foreign DNA ,

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neuartiges System zur Herstellung rekombinanter Adenoviren (rAd); Einsatzgebiete sind die Medizin, Veterinärmedizin, Biotechnologie, Gentechnik und die funktionelle Genomanalyse. Das erfindungsgemässe System zur rAd-Herstellung besteht bevorzugt aus - einem Donorvirus, dessen Verpackungssignal (i) partiell deletiert ist und (ii) von parallel orientierten Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase umrahmt wird, - einer Verpackungszelllinie, die die ortsspezifische Rekombinase exprimiert und Donorplasmiden, die (i) eine oder zwei Erkennungsstellen für die ortspezifische Rekombinase, (ii) das vollständige virale Verpackungssignal, (iii) gegebenenfalls zwei Erkennungsstellen für eine selten schneidende Restriktionsendonuklease und (iv) insertionsstellen für Fremd-DNA bzw. insertierte Fremd-DNA enthalten.

Description

System zur Erzeugung klonaler oder komplexer Populationen rekombinanter Adenoviren und deren Anwendung
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein neuartiges System zur Herstellung rekombinanter Adenoviren (rAd); Einsatzgebiete sind die Medizin, Veterinärmedizin, Biotechnologie, Gentechnik und die funktionelle Genomanalyse.
Der Transfer von Genen in Zellen ist aus mehreren Gründen relevant. Die Expression von in Zellkultursystemen eingeführter Gene ermöglicht z.B. die funktionelle Charakterisierung der kodierten Proteine oder deren Produktion . Ferner stellt der Transfer therapeutisch wirksamer Gene einen neuen Weg zur Behandlung menschlicher Erkrankungen dar (Gentherapie) . Zudem wird eine Vielzahl von Ansätzen untersucht, beim Menschen und bei Nutzvieh durch den Transfer immunstimulatorischer und/oder pathogenspezifischer Gene eine medizinisch oder veterinärmedizinisch wirksame Immunisierung zu erreichen (Vakzinierung) . Schließlich besteht auch auf dem Gebiet der funktionellen Genomanalyse ein besonderes Interesse an effizienten Systemen zum Gentransfer in zeilbasierte funktionelle Testsysteme. Hierbei muss das Vektorsystem neben effizientem Gentransfer auch die Möglichkeit der Konstruktion komplexer Genbanken bieten.
In den vergangenen Jahren sind zahlreiche Vektoren für den Gentransfer in Zellen entwickelt worden. Besonders mit rekombinanten viralen Vektoren, die sich von Retroviren, Adeno-assoziierten Viren oder Adenoviren ableiten, ist ein effizienter Gentransfer in Zellen möglich (Übersicht bei: Verma, M .l. und Somia, N. ( 1 997) Nature 389, 239-242) . Die sogenannten E 1 -delegierten adenoviralen Vektoren der ersten Generation wurden über das letzte Jahrzehnt intensiv als Gentransfer-Vektoren erforscht (Übersicht bei: Bramson, J.L. et al. ( 1 995) . Curr. Op. Biotech. 6, 590-595) . Sie leiteten sich vom humanen Adenovirus des Serotyps 5 ab und sind in der essentiellen E 1 -Region, oft auch in der nicht-essentiellen E3-Region, deletiert, wodurch bis zu 8 KBp Fremd-DNA in das Virusgenom insertiert werden können. Diese Vektoren können auf die E 1 -Defizienz komplementierenden Zellen zu hohen Titern produziert werden. Aufgrund ihrer hohen Stabilität lassen sie sich gut reinigen und lagern. Rekombinante Adenoviren weisen breites Spektrum effizient infizierbarer Zelltypen in vitro auf und erlauben auch in vivo einen effizienten Gentransfer in verschiedene Gewebe. Klonale rAd-Populationen werden bereits vielseitig zum Gentransfer in vitro und in vivo eingesetzt. Auch der Einsatz von komplexen Populationen von rAd in der funktioneilen Genomanalyse - beispielsweise von cDNA-Expressionsbanken im adenoviralen Kontext - erscheint sehr vielversprechend. Mit den bisherigen Methoden der rAd-Herstellung ist aber die Gewinnung gemischter rAd-Populationen mit einer ausreichenden Komplexität nicht möglich.
Es wurde eine Vielzahl von Methoden zur rAd-Herstellung beschrieben. Die derzeit gebräuchlichsten Methoden beruhen auf der Insertion der Fremd-DNA in den Kontext des Adenovirus-Genoms durch homologe Rekombination. Dabei werden zwei sogenannte S/wtt/e-Plasmide eingesetzt. Ein kleines
Figure imgf000003_0001
enthält den Teil des Adenovirus-Genoms, der manipuliert werden soll. Nach der Insertion der Fremd-DNA in das kleinere SΛtvft/e-Plasmid erfolgt die Insertion in den Kontext des Adenovirus-Genoms durch Rekombination mit dem größeren
Figure imgf000003_0002
das den Rest des Adenovirus-Genoms bereitstellt. Diese Rekombination der beiden SΛi/tt/e-Plasmide kann nach Kontransfektion in 293-Zellen erfolgen (McGrory, W.J., Bautista, D.S. und Graham, F.L. ( 1 988) Virology 61 4-61 7) oder nach Linearisierung und Kotransformation in einen rekombinationskompetenten E. co/i Stamm (Chartier, C, Degryse, E., Gantzer, M., Dieterle, A., Pavirani, A. und Mehtali, M. ( 1 996) J. Virol 70: 4805-481 0) . Beide Methoden sind aufgrund systemimmanenter Limitierungen relativ aufwendig: Bei der Rekombination in 293-Zellen besteht das Problem, dass ungewünschte . Rekombinanten oder Wildtypviren entstehen können. Daher ist eine klonale Vereinzelung der rekombinanten Viren durch plaque assay auf 293-Zellen und eine gründliche Analyse der vereinzelten rAd vor der Vermehrung erforderlich. Bei der Rekombination in E. coli besteht das Problem, dass der rekombinationskompetente Bakterienstamm sehr niedrige Plasmid-Ausbeuten liefert, wodurch die Analyse der rekombinierten Plasmide erschwert ist, da zunächst die Transformation eines E. coli Stammes mit höherer Plasmid-Ausbeute erforderlich ist.
Neuere, aber bislang wenig verbreitete Methoden zur rAd-Konstruktion beruhen auf der Insertion von Fremd-DNA in den Kontext des Adenovirus-Genoms durch direkte Ligation. Eine Methode beruht auf der Ligation eines Fragments des (manipulierten) viralen 5 '-Endes mit einem Fragment, das den Rest des viralen Genoms enthält, gefolgt von einer Transfektion der Ligationsprodukte in 293-Zellen (Mizuguchi, H. und Kay, M.A. (1998) Hum. Gene Ther. 9: 2577-2583). Eine andere Methode basiert auf dem Einsatz der Cosmid-Klonierungstechnik. Dabei werden Cosmidvektoren eingesetzt, die das E1-deletierte Adenovirus-Genom und einen Polylinker mit unikalen Restriktionsschnittstellen zur Insertion von Fremd-DNA enthalten. Die Ligationsprodukte aus linearisiertem Cosmidvektor und zu insertierender Fremd-DNA werden in vitro in Lambda-Phagenköpfe verpackt. Nach Infektion von E. coli entstehen zirkuläre Cosmide, aus denen durch Restriktionsverdau lineare rAd-Genome freigesetzt werden können, die dann in 293-Zellen transfiziert werden (Fu, S. und Deisseroth, A.B. (1997) Hum. Gene Ther. 8: 1321-1330).
Den beschriebenen bisherigen Methoden zur rAd-Herstellung ist gemeinsam, dass die infektiösen rAd in 293-Zellen aus klonierter DNA entstehen, wobei die klonierten Vektorgenome entweder linear mit endständigen inverted terminal repeats (ITRs) oder im zirkulären Plasmid mit einer Λea/-to-ta/7-Konfiguration der ITRs vorliegen. Diese klonierten Vektorgenome unterscheiden sich strukturell von natürlichen Adenovirus-Genomen, die an beiden ITRs ein kovalent gebundenes virales Protein (terminales Protein, TP) enthalten. Dies ist eine Folge einer Besonderheit des adenoviralen Replikationsmechanismus, bei dem das virale präterminale Protein (pTP) als Primer für die DNA-Synthese dient und nach Abschluss der Replikation mit der neu synthetisierten DNA verbunden bleibt. Durch eine Protease wird das pTP dann zum TP prozessiert, das in der nächsten Replikationsrunde - neben den ITRs - wichtiger Teil des Substrates ist, das von der Replikationsmaschinerie erkannt wird . Virale Genome ohne TP werden etwa 1000-fach schlechter erkannt, als natürlich replizierte virale Genome mit TP (Übersicht in: Hay, R.T., Freeman, A., Leith, I ., Monoghan, A. und Webster, A. (1 995) Curr. Top. Microbiol Immunol. 1 99: 31 -48) . Die erste Replikation eines klonierten rAd-Vektorgenoms ohne TP ist daher ein seltenes Ereignis (ca. 1 0-100 Ereignisse pro 1 06 transfizierte 293-Zellen) . Aus diesem Grund sind die oben beschriebenen Methoden nur geeignet, um klonale Populationen von rAd zu gewinnen. Sie sind aber nicht zur Erzeugung komplexer Populationen von rAd geeignet, die eine effiziente Umwandlung eines komplexen Gemisches klonierter Vektorgenome in ein komplexes Gemisch replizierte rAd erfordern würde.
In der Publikation Hardy, S., Kitamura, M., Harris-Stansil, T. , Dai, Y. und Phipps, L.M. ( 1 997) J. Virol. 71 , 1 842-1 849, wird ein System zur Herstellung von (klonalen) Populationen von rekombinanten Adenoviren (rAd) durch Cre/loxP Rekombination beschrieben, umfassend
Donorvirus mit vollständigem Verpackungssignal, das von loxP-Erkennungssequenzen umrahmt ist,
Verpackungszelllinie, die Cre exprimiert,
Donorplasmid mit 5'ITR, vollständigem Verpackungssignal, Fremd-DNA und einzelner loxP-Erkennungssequenz und zwei
Erkennungsstellen für eine Restriktionsendonuklease (8 Bp
Erkennungssequenz) . Ein wesentlicher Unterschied der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu dem System von Hardy, der für die Funktion des Systems essentiell ist, ist das partiell deletierte Verpackungssignal im Donorvirus, welches die Selektion gegen das Donorvirus ermöglicht und auch für die Rekombinanten auf normalen 293-Zellen erforderlich ist.
Saubere Präparationen von rAd konnten von Hardy et al. ( 1 997) nur durch Kontransfektion von Virus-DNA zusammen mit dem Donorplamid erreicht werden. Dazu wurde deproteinierte virale DNA eingesetzt, die somit kein terminales Protein (TP) hat. Das eingeführte Donorvirus-Substrat unterscheidet sich daher von den infektiösen Donorvirusgenomen mit TP, die bei der vorliegenden Erfindung durch Infektion eingeführt werden . Dass solche natürlichen Substrate für die adenovirale Replikation vorliegen, ist ein wesentlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung . Die Einführung des Donorvirusgenoms durch Infektion wurde von Hardy et al. ( 1 997) zwar auch erprobt, die Kontaminationen mit Donorviren waren hier in der ersten Vermehrungsrunde aber so hoch, dass dieses nicht weiter untersucht wurde. Der Unterschied zu den hohen Reinheiten der Erfindung ist durch die Benachteiligung der Donorvieren aufgrund des deletierten Verpackungssignals begründet. Die Konstruktion komplexer Ad-Populationen wurde von Hardy et al. weder untersucht noch diskutiert.
Eine Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein System zur einfachen
Herstellung einer klonalen rekombinanten Adenoviren-Population bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe war es , ein System bereitzustellen, mit dem auch komplexe rekombinante Adenoviren erzeugt werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein System zur Herstellung rekombinanter Adenoviren, umfassend (a) mindestens einen Donorvirus mit einem zumindest partiell deletierten viralen Verpackungssignal, das von zwei Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase umrahmt wird, (b) eine Verpackungszelllinie, die die ortsspezifische Rekombinase exprimiert und
(c) mindestens ein Donorplasmid, das eine oder zwei Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase, das vollständige virale Verpackungssignal und Insertionsstellen für Fremd-DNA bzw. insertierte Fremd-DNA enthält.
Die erfindungsgemäße neuartige Methode zur rAd-Herstellung hat gegenüber den bislang beschriebenen Methoden entscheidende Vorteile. Zum einen ist die Konstruktion klonaler rAd-Populationen schneller und weniger aufwendig. Zum anderen können komplexe gemischte rAd-Populationen erzeugt werden, was nach dem bisherigen Stand der Technik nicht möglich war. Dies schafft erstmalig die Voraussetzungen für die Konstruktion von Genbanken im adenoviralen Kontext. Das Wesentliche des erfindungsgemäßen neuen Systems ist dabei, dass die Notwendigkeit der Umwandlung klonierter Vektorgenome in infektiöse replizierte Vektorgenome umgangen wird, indem die rAd direkt durch enzymatische ortsspezifische Insertion von Fremd-DNA in ein replizierendes Virus erzeugt werden. Dabei kommt eine ortspezifische Rekombinase zum Einsatz, beispielsweise Rekombinasen der Int-Familie, wie Cre-Rekombinase oder Flp-Rekombinase. Die von diesen Rekombinasen katalysierten Reaktionen hängen von der Topologie der Erkennungsstellen ab: Liegen zwei Erkennungssequenzen in paralleler Orientierung auf demselben DNA-Molekül, so katalysieren diese ortsspezifischen Rekombinasen die Exzision des dazwischen liegenden Bereichs als zirkuläres Molekül, wobei an der Exzisionsstelle eine einzelne Erkennungssequenz zurückbleibt. Diese Reaktion ist reversibel, das Gleichgewicht liegt allerdings aus thermodynamischen Gründen auf der Exzisionseite (Exzision/ Insertion-Reaktion) . Liegen zwei Erkennungssequenzen auf unterschiedlichen linearen Molekülen, so katalysieren die ortsspezifischen Rekombinasen den kreuzweisen Austausch der Endstücke (terminal exchange) . Auch hier handelt es sich um eine Gleichgewichtsreaktion, das Gleichgewicht liegt hier allerdings in der Mitte, da Hin- und Rückreaktion thermodynamisch gleichwertig sind.
Ferner kommen partiell deletierte und vollständige adenovirale Verpackungssignale zum Einsatz. Adenovirale Verpackungssignale (Ψ) enthalten wiederholte funktionell additiv wirkende Sequenzmotive, an denen bislang noch nicht genauer charakterisierte zellluläre Faktoren binden. Die Bindung dieser Faktoren ist für eine effiziente Verpackung der replizierten viralen Genome in die viralen Hüllen erforderlich. Am besten ist derzeit das Verpackungssignal des humanen Adenovirus Serotyp 5 charakterisiert: Werden einzelne oder mehrere der wiederholten, funktionell additiv wirkenden Sequenzmotive ("A repeats") im Verpackungssignal deletiert, so bewirkt das auf diese Weise erhaltene partiell deletierte Verpackungssignal (ΨΔ) eine reduzierte Verpackungseffizienz und damit ein reduziertes Viruswachstum (Schmid, S.l. und Hearing, P. (1 997) J. Virol. 71 : 3375-3384) . Die zellulären Faktoren stellen zudem ein limitierendes Substrat dar, so dass bei gleichzeitiger Anwesenheit eines Virus mit einem vollständigen Verpackungssignal die Wachstumsreduktion eines Virus mit einem partiell deletierten Verpackungssignal zusätzlich verstärkt wird (Imler, J.L., Bout, A., Dreyer, D., Diederle, A., Schultz, H., Valerio, D., Mehtali, M. und Pavirani, A. (1 995J Hum. Gene Ther. 6: 71 1 -721 ).
Der Einsatz der neuartigen Methode zur rAd-Herstellung erfordert drei wesentliche Komponenten, die Teil der Erfindung sind: - Ein Donorvirus, dessen Verpackungssignal (i) partiell deletiert ist und
(ii) von parallel orientierten Erkennungsstellen für eine ortsspezifische
Rekombinase umrahmt wird.
Eine Verpackungszelllinie, die die ortsspezifische Rekombinase exprimiert. - Ein Donorplasmid, das (i) eine oder zwei Erkennungsstellen für die ortspezifische Rekombinase, (ii) das vollständige virale
Verpackungssignal, (iii) gegebenenfalls zwei Erkennungsstellen für eine selten schneidende Restriktionsendonuklease (insbesondere eine Restriktionsendonuklease mit einer Erkennungsseqenz > 8 Bp, bevorzugt > 10 Bp) und (iv) Insertionsstellen für Fremd-DNA bzw. insertierte Fremd-DNA enthält. . .. .
Gemäß des erfindungsgemäßen neuartigen Systems zur rAd-Herstellung wird zunächst die Verpackungszelllinie mit dem Donorvirus infiziert. Durch die entsprechenden Erkennungsstellen im Donorvirusgenom wird das partiell deletierte Verpackungssignal des Donorvirus durch die von der Verpackungszelllinie exprimierte ortsspezifische Rekombinase herausgeschnitten. Dadurch entstehtdas Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat, das (i) nicht mehr in virale Hüllen verpackt werden kann und (ii) aufgrund der zurückbleibenden unikalen Erkennungsstelle für die Rekombinase eine Insertionsstelle für die ortspezifische Aufnahme von Fremd-DNA aufweist (siehe Abbildung 1 ). Um eine ausreichende Prozessierung des Donorvirus zu erreichen ist dabei ein hohes Expressionsniveau der ortspezifischen Rekombinase erforderlich. Durch Transfektion wird das Donorplasmid mit der zu insertierenden Transgenkassette oder die komplexe Donorplasmid- Population mit einer Vielzahl von Sequenzen im Kontext des Donorplasmids in die Zellen eingeführt. Unterschiedliche Typen von Donorplasmiden, die sich in ihrem Aufbau geringfügig unterscheiden, führen dann über ebenfalls geringfügig unterschiedliche Reaktionen zur Bildung der rAd durch ortspezifische Insertion (Exzision/Insertion oder terminal exchange, s.u. und Abbildung 2) . Im Wesentlichen wird über die Erkennungsstelle(n) für die ortsspezifische Rekombinase das Donorplasmid oder Teile davon mit der Transgenkassette oder der Genbank und dem vollständigen viralen Verpackungssignal ortspezifisch in die Insertionsstelle des Donorvirus-ΔΨ- Akzeptorsubstrats insertiert. Die so entstehenden rAd enthalten die Transgenkassette oder die Genbank und das vollständige virale Verpackungssignal. Zudem enthalten sie - wie das Donorvirus-ΔΨ- Akzeptorsubstrat - an einem oder beiden ITRs das kovalent gebundene TP, weshalb bereits ein einzelnes Insertionsereignis zur Entstehung eines infektiösen und normal replizierenden rAd führt. Ein komplexes Gemisch von Donorplasmiden führt daher zur Entstehung eines ebenfalls komplexen Gemisches von rAd. Schließlich ist es eine wesentliche Eigenschaft des erfindungsgemäßen Systems zur rAd-Herstellung, dass die rAd im Unterschied zu kontaminierenden nicht-prozessierten Donorviren das vollständige virale Verpackungssignal enthalten und daher bevorzugt in virale Hüllen verpackt werden.
Je nach Aufbau des Donorplasmids können bei der erfindungsgemäßen Methode zur Herstellung von rAd unterschiedliche Arten der ortsspezifischen Insertion unterschieden werden.
Im Folgenden werden 3 bevorzugte Typen von Donorplasmiden beschrieben: Donorplasmide des Typs 1 enthalten ein bakterielles Rückgrat mit einem bakteriellen Restistenzgen und einem bakteriellen Replikationsurprung, das vollständige virale Verpackungssignal, gefolgt von einem Polylinker zur Insertion von Fremd-DNA bzw. bereits insertierte Fremd-DNA, oder - umrahmt von einem Promotor und einem Polyadenylierungssignal - einen Polylinker zur Insertion kodierender Sequenzen bzw. bereits insertierte kodierende Sequenzen und eine vor dem viralen Verpackungssignal gelegene Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase.
Nach der Transfektion in die mit Donorvirus infizierte Verpackungszelllinie wird durch die ortsspezifische Rekombinase das vollständige Donorplasmid über eine Insertions/Exzisions-Gleichgewichtsreaktion in die Insertionsstelle des Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat insertiert. Die resultierenden rAd enthalten zwei Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase (siehe Abbildung 2A) . Donorplasmide des Typs 2 enthalten ein bakterielles Rückgrat mit einem bakteriellen Restistenzgen und einem bakteriellen Replikationsurprung, das virale ITR und das vollständige virale Verpackungssignal, gefolgt von einem Polylinker zur Insertion von Fremd-DNA bzw. bereits insertierte Fremd-DNA, oder - umrahmt von einem Promotor und einem Polyadenylierungssignal - einen Polylinker zur Insertion kodierender Sequenzen bzw. bereits insertierte kodierende Sequenzen und zwe i Sc h n ittste l l e n f ü r e i n e s e lte n s c h n e i d en d e Reastriktionsendonuklease mit einer mehr als 8 Bp langen Erkennungssequenz, die das bakterielle Rückgrat umrahmen, wobei eine der Schnittstellen direkt neben dem viralen ITR liegt.
Vor der Transfektion in die mit Donorvirus infizierte Verpackungszelllinie wird die klonale oder komplexe Donorplasmid-Population mit der selten schneidenden Restriktionsendonuklease verdaut. Dadurch werden Fragmente freigesetzt, die in sequenzieller Abfolge das virale ITR, das vollständige virale Verpackungssignal, die insertierte Fremd-DNA und eine einzelne Erkennungssequenz für die ortsspezifische Rekombinase enthalten. Je länger die Erkennungssequenz der selten schneidenden Restriktionsendonuklease, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit des Auftretens einer entsprechenden Sequenz in der Transgenkassette oder einzelnen Sequenzen der Genbank, die die Freisetzung dieser Fragmente stören würde. Nach der Transfektion werden die Fragmente durch die ortsspezifische Rekombinase über eine terminal exchange Reaktion in die Insertionsstelle des Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrats insertiert. Die resultierenden rAd enthalten nur eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase (siehe Abbildung 2B).
Donorplasmide des Typs 3 enthalten sämtliche Elemente der Donorplasmide des Typs 1 und eine zweite Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase, die so lokalisiert ist, dass (i) beide Erkennungsstellen parallel orientiert sind und (ii) beide Erkennungsstellen das baktierielle Rückgrat mit Replikationsursprung und bakteriellem Resistenzgen umrahmen.
Nach der Transfektion in die mit Donorvirus infizierte Verpackungszelllinie wird durch die ortsspezifische Rekombinase zunächst das bakterielle Rückgrat herausgeschnitten. Als Produkt entsteht ein zirkuläres DNA-Molekül, das das vollständige virale Verpackungssignal, die zu insertierende Fremd-DNA und eine einzelne Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase enthält. Dieses wird dann durch die ortsspezifische Rekombinase über eine Insertions/ Exzisions-Gleichgewichtsreaktion in die Insertionsstelle des Donorvirus- ΔΨAkzeptorsubstrats insertiert. Die resultierenden rAd enthalten zwei Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase (siehe Abbildung 2C).
Bei Einsatz von Donorplasmiden des Typs 1 und 3 entstehen rAd, bei denen die insertierte DNA und damit auch das vollständige virale Verpackungssignal von zwei parallel wiederholten Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase umrahmt ist. Die rAd sind daher weiterhin Substrat für die Exzisions/Insertions-Gleichgewichtsreaktion der ortsspezifischen Rekombinase. Durch die Exzision wird die gesamte insertierte DNA inklusive des Verpackungssignals wieder herausgeschnitten. Die Vermehrung dieser rAd erfolgt daher bevorzugt auf Zellen, die die ortspezifische Rekombinase nicht exprimieren. Die Selektion gegen die Kontamination mit unprozessierten Donorviren erfolgt hier allein über das partiell deletierte Verpackungssignal. Bei Einsatz von Donorplasmiden des Typs 2 entstehen dagegen rAd, die nur eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase enthalten. Sie sind kein Substrat für die Exzision/Insertion-Reaktion sondern für die terminal exchange Reaktion. Diese ist nicht mit dem Verlust des Verpackungssignals verbunden. So erzeugte rAd können daher sowohl auf der Verpackungszelllinie vermehrt werden, die die ortsspezifische Rekombinase exprimiert (Selektion gegen die Kontamination mit unprozessierte Donorviren (i) über die Exzision des Verpackungssignals durch die ortsspezifische Rekombinase und (ii) über das partiell deletierte Verpackungssignal), als auch auf Zellen, die diese nicht exprimieren (Selektion gegen die Kontamination mit unprozessierte Donorviren nur über das partiell deletierte Verpackungssignal) .
Als Grundlage für die Konstruktion der Donorviren werden humane oder nicht-humane Adenoviren eingesetzt, um entsprechend klonale oder komplexe Populationen rekombinanter humaner oder nicht-humaner Adenoviren zu erzeugen. Vorzugsweise werden humane Adenoviren eingesetzt, beispielsweise der Serotyp 5 (Ad5) . Um eine hohe Kapazität der Donorviren für die Insertion von Fremd-DNA zu erreichen, können Donorviren eingesetzt werden, in denen eine/mehrere nicht-essentielle Gen(e) deletiert sind. Es können auch ein/mehrere essentielle Gen(e) deletiert sein, die dann in trans von der Verpackungszelllinie oder den Produzentenzellen zur Verfügung gestellt werden müssen. Als Produzentenzellen zur Vermehrung des Donorvirus bzw. der davon abgeleiteten rekombinanten Viren werden Zellen oder Zelllinien eingesetzt, die für das entsprechende, gegebenenfalls partiell deletierte rekombinante Virus permissiv sind, bespielsweise die E1 -komplementierenden 293-Zellen zur Vermehrung E1 -deletierter Ad5-abgeleiteter Donorviren oder der davon abgeleiteten klonalen oder komplexen Populationen rekombinanter Adenoviren. Die Verpackungszelllinie wird auf Basis der Produzentenzelllinie durch stabile Transfektion des Gens für die ortsspezifische Rekombinase gewonnen. Die Expression des Rekombinasegens kann konstitutiv oder regulierbar sein. Die Rekombinasegen kann dabei ein Fusionsgen aus dem Rekombinasegen und den für ein Kernlokalisierungssignal kodierenden Sequenzen sein, um die Konzentration der Rekombinase im Zellkern zu erhöhen. Als ortspezifische Rekombinasen werden vorzugsweise - Rekombinasen der Int-Familie eingesetzt, eispielsweise die Cre-Rekombinase oder die Flp-Rekombinase.
Bei der Konstruktion von klonalen rAd-Populationen werden als Transgen(e) in die Donorplasmide in der Regel kodierende Sequenzen sowie Elemente eingesetzt, die deren Expression kontrollieren (Promotoren, Polyadenylierungssignale u.a.). Zur Expression eines oder mehrer Gene in Zellen wird die zu exprimierende Sequenz bevorzugt mit einem Promotor versehen, der entweder konstitutiv aktiv oder regulierbar ist. Als Promotoren können virale oder zelluläre Promotoren oder auch Kombinationen aus beiden eingesetzt werden. Zum Ziel einer Gentherapie kann die genomische Sequenz oder die cDNA eines Gens verwendet werden, dessen Produkt bei der zu behandelnden Krankheit fehlt, in unphysiologischen Mengen auftritt oder defekt ist. Man kann auch einen Teil einer genomischen Sequenz einsetzen, die eine Mutation im Zielgen überspannt und mit dieser homolog rekombinieren kann. Zum Ziel einer Tumor-Gentherapie können verschiedene Gene, die ein verlangsamtes Wachstum oder ein Abtöten der Tumorzellen - gegebenenfalls in Kombination mit Pharmaka oder durch Immunstimulation - bewirken, eingesetzt werden. Zum Ziel einer Vakzinierung können ein oder mehrere u.U. veränderte Gene des pathogenen Organismus, gegen den eine Immunisierung erreicht werden soll, eingesetzt werden.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist die Bildung von komplexen rAd-Populationen. Bei der Konstruktion von komplexen rAd-Populationen mit dem Ziel der Konstruktion von Genbanken werden in die Donorplasmide gemischte Populationen kodierender Sequenzen, beispielsweise cDNA-Banken aus menschlichen oder tierischen Geweben oder Zellen, eingesetzt. Dies kann bespielsweise mit dem Ziel der Isolierung neuer Gene erfolgen. Bei der Konstruktion von komplexen rAd-Populationen mit dem Ziel der funktioneilen Veränderung eines bekannten Gens werden in die Donorplasmide gemischte Populationen mutierter Sequenzen dieses Gens eingesetzt. Dies kann beispielsweise zur Erzeugung von Genbanken- mit Varianten eines Proteins (z.B. Enzyms oder Antikörper) eingesetzt werden, mit dem Ziel einer funktionellen Optimierung dieses Proteins. Die kodierenden Sequenzen werden von Elementen umgeben, die deren Expression kontrollieren (Promotoren, Polyadenylierungssignale) . Ein weiteres mögliches Einsatzgebiet komplexer Populationen von rAd liegt darin, Banken nicht-kodierender oder nicht-exprimierter Sequenzen zu konstruieren, beispielsweise zur Charakterisierung oder Optimierung von Bindungsstellen von DNA-bindenden Proteinen oder Enzymen.
Sofern für die gesuchte biologische Funktion ein zellbasiertes Testsystem vorhanden ist, kann die Isolierung neuer Gene mit den gesuchten Eigenschaften bzw. die Isolierung von Varianten eines bekannten Gens mit veränderten Eigenschaften folgendermaßen erfolgen: Zunächst wird der in der komplexen rAd-Population vorliegende Titer an infektiösen Partikeln bestimmt. Anschließend werden zur Herstellung der sogenannten Masterplatten Produzentenzellen in Multititerplatten mit einer definierten, niedrigen Anzahl von infektiösen Partikeln pro Vertiefung infiziert. Nachdem die Produzentenzellen durchinfiziert sind, wird ein Frier/Tau-Lysat der Masterplatten hergestellt. Aufgrund der Stabilität von rAd können die Masterplatten eingefroren und gelagert werden. Im Überstand der Vertiefungen liegen die freigesetzten, vermehrten Viren vor. Diese Überstande können zur Infektion der Zellen des zellbasierten funktioneilen Testsystems verwendet werden. Dadurch können dann die Vertiefungen der Masterplatten identifiziert werden, deren Überstände rAd enthalten, die nach Infektion im Testsystem den gewünschten Phänotyp hervorrufen. Durch Piaquereinigung auf Produzentenzellen können anschließend die rAd aus diesen Überständen in klonaler Form erhalten werden und anschließend das/die enthaltene(n) Gen(e) charakterisiert werden (siehe Abbildung 3). Mit dem erfindungsgemäßen System zur Herstellung rekombinanter Adenoviren können sowohl sowohl klonale rekombinante Adenoviren-Populationen als auch komplexe- rekombinante Adenoviren-Populationen hergestellt werden. Unter einer klonalen Population wird eine Population verstanden, in der in allen zur Population gehörenden Adenoviren die gleiche Fremd-DNA eingebaut ist. Unter Fremd-DNA wird jede DNA verstanden, bei der es sich nicht um Adenoviren-DNA handelt. Eine komplexe Population, welche auch als komplexe gemischte Population bezeichnet wird, umfasst unterschiedliche Adenoviren, die sich darin unterscheiden, dass sie jeweils unterschiedliche Fremd-DNA enthalten. Bevorzugt umfasst eine komplexe rekombinanten Adenoviren-Population mindestens zwei Arten von rekombinanten Adenoviren, die jeweils unterschiedliche Fremd-DNA enthalten, insbesondere mindestens 10 verschiedene Arten, am meisten bevorzugt mindestens 1 00 verschiedene Arten.
In dem erfindungsgemäß eingesetzten Donorvirus ist das Verpackungssignal partiell deletiert, so dass eine Vermehrung des Donorvirus (ohne Donorplasmid) in der Verpackungszelllinie gehemmt, verringert oder/und beeinträchtigt ist. Dadurch kann der gewünschte rAd gegenüber dem Donorvirus selektiv amplifiziert und damit selektiert werden. Das Verpackungssignal im Donorvirus ist dabei bevorzugt zu mindestens 10 %, insbesondere mindestens 20 % und besonders bevorzugt mindestens 30 % und bis zu 100 %, mehr bevorzugt bis zu 90 % und besonders bevorzugt bis zu 70 % deletiert (% bedeutet hier Anzahl der deletierten Basen bezogen auf die Gesamtbasenzahl des Verpackungssignals) .
Die Erfindung wird durch die beigefügten Figuren und die folgenden Ausführungsbeispiele weiter erläutert. Figur 1 zeigt die Donorvirusstruktur und Bildung eines Donorvirus-ΔΨ- Akzeptorsubstrats in einer Verpackungszelllinie, welche die ortsspezifische Rekombinase exprimiert (graue Kästchen: virale insertierte terminale Wiederholeinheiten (ITRs); schwarze Kästchen: partiell deletiertes Verpackungssignal (ΔΨ); weiße Dreiecke: Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase (RS); weiße Kreise: virales terminales Protein (TP)) .
Figur 2 zeigt die allgemeine Struktur der bevorzugten Donorplasmide des Typs l(A), des Typs ll(B) und Typs lll(C) sowie das Prinzip der rekombinanten Adenoviruserzeugung durch ortsspezifische Rekombination mit dem Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat in einer Verpackungszelllinie, welche die ortsspezifische Rekombinase exprimiert (graue Kästchen: virale insertierte terminale Wiederholeinheiten (ITRs); schwarze Kästchen: vollständiges virales Verpackungssignal (Ψ); weiße Dreiecke: Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase (RS); weiße Kreise: virales terminales Protein (TP); Pfeil : Promotor (P); pA: Polyadenylierungssignal; RCE: Erkennungsstelle für eine selten schneidende Endonuklease) .
Figur 3 zeigt einen schematischen Überblick über die Verwendung von Adenovirus-cDNA-Expressionsbibliotheken für die Identifizierung von Genen, welche einen gegebenen Phänotyp in einem funktionellen Assay auf Zellbasis induzieren.
Figur 4 zeigt die Genomstrukturen der Donorviren kύlantis\ und Ad/antisU, die Teil eines Systems zur Konstruktion von klonalen oder komplexen Populationen von rekombinantem E1 -deletierten Adenovirus Serotyp 5 sind, und deren funktionelle Charakterisierung. (4A) Schematische Struktur von Ad/antis\ und Ad/antisW sowie des durch Cre//σλΑ°-vermittelte Exzision des Verpackungssignals gebildeten Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrats und Schnittstellen für Nhe I, das bei den Analysen in (4b) verwendet wurde (graue Kästchen: virale invertierte terminale Wiederholeinheiten (ITRs); schwarze Kästchen mit lateinischen Zahlen: sog. A repeats des partiell deletierten Verpackungssignals (ΨΔ); weiße Dreiecke: Erkennungsorte für Cre-Rekombinase (loxP); S: 929Bp- Spacer; graue Kästchen: Invertierte terminale Sequenzwiederholungen von Ad5 (ITRs) .
(4B) Nachweis der hocheffizienten Cre/toxP-vermittelten Prozessierung der Donorviren zum Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrats nach Infektion der Verpackungszelllinie CIN 1 004. CIN 1004-Zellen und 293-Zellen als Kontrolle wurdenmit Ad/antis oder Ad/antisW infiziert. Anschließend wurde die virale DNA isoliert und einem Restriktionsverdau mit Nhe\ unterworfen. Bei beiden Donorviren trat bei Infektion von 293-Zellen das für das nicht- prozessierte Donorvirus charakteristische 5 «^-terminale Fragment auf, nach Infektion von CIN 1004-Zellen dagegen ausschließlich das charakteristische 5 <^ -terminale Fragment des Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrats (7557 Bp) . Dies zeigt eine fast vollständige Prozessierung der Donorviren in der Verpackungszelllinie.
(4C) Nachweis der Wachstumsreduktion der Donorviren auf der Verpackungszelllinie CIN 1004 als Folge der Prozessierung zum Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat. Jeweils 106 CIN 1004-Zellen oder 293-Zellen als Kontrolle wurden mit Adlantis\ oder AdlantisW infiziert. Nach Auftreten des zytopatischen Effekts wurde mittels Titration die Anzahl der pro Zelle als Nachkommen gebildeten infektiösen Partikel (IP) bestimmt. Bei beiden Donorviren war die Anzahl pro Zelle gebildeter IP auf CIN 1 004-Zellen um etwa zwei Größenordnungen geringer als auf 293-Zellen. Bei AdlantisW war zudem auf beiden Zellinien die Anzahl pro Zelle gebildeter IP insgesamt um etwa zwei Größenordnungen geringer. Als weitere Kontrolle diente AdC, ein rekombinantes Adenovirus, dessen Verpackungssignal nicht von /ox -Erkennungsstellen flankiert wird und daher keine Wachstumsreduktion auf CIN 1 004-Zellen zeigt. Figur 5 zeigt die Strukturen der Donorplasmide pCBI-3, pCBII-3, pCBIII-3, pCBI-CMVIl, pCBII-CMVIl und pCBIII-CMVIl, die Teil eines Systems zur Konstruktion von klonalen oder komplexen Populationen von rekombinantem E1 -deletiertem Adenovirus Serotyp 5 sind, sowie deren • Polylinker für die Insertion von DNA (weiße Kreise: bakterieller Replikationsursprung (ori); AmpR: Ampizillinresistenz-Gen; graue Kästchen: 5'-terminale invertierte Wiederholeinheit von Ad5 (5'ITR); schwarze Kästchen: vollständiges Verpackungssignal von Ad5 enthaltend sog. A repeats l-VII (Ψ); weiße Dreiecke: Erkennungsstellen für die Cre- Rekombinase (loxP); I-Scel: Erkennungsstellen für I-Scel; CMV: hCMV Immediate früher Promotor; CMVpA: hCMV Polyadenylierungssignal).
Figur 6 zeigt die Struktur der Donorplasmide pCBI-DsRed, pCBII-DsRed und pCBIII-DsRed und der aus diesen Donorplasmiden durch Rekombination mit Ad/antis\ gebildeten rekombinanten Adenoviren AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed und AdCBIII-DsRed. Ferner ist die Größe der Ps ?AI-Fragmente, insbesondere die der 5 '-terminalen Ps/?AI-Fragmente, die bei der Analyse in Figur 8A zur Unterscheidung von viraler DNA aus Adlantis\ und der neu gebildeten rekombinanten Adenoviren dienten. Zudem sind bei den Strukturen der rekombinanten Adenoviren die Bindungsstellen der Primer und die Größe der entsprechenden PCR-Produkte angegeben, deren Bildung in Figur 8B die Entstehung der rekombinanten Adebnoviren belegt (runder weißer Kreis (ori) : bakterieller Replikationsursprung; weißes Dreieck (loxP) : /oxP-Erkennungsstelle, Ψ: vollständiges Verpackungssignal von Ad5; Ψ*: partiell deletiertes Verpackungssignal von Ad5; schwarze Kästchen: invertierte terminale Wiederholungen von Ad5 (ITRs); S: Abstandhalter (spacer); RSV: RSV-Promoter;bGHpA:Rinder-Wachstumshormon-Polyadenylierungssignal (bovine growth hormone polyadeny/ation signal); DsRed: offener Leserahmen des DsRed- Reportergens). Figur 7 zeigt die Analyse der bei Einsatz des Donorvirus Ad/antisl und der Donorplasmide pCBI-DsRed, pCBII-DsRed oder pCBIII-DsRed gewonnenen Gemische aus restlichem Donorvirus und neu gebildeten rekombinanten Adenoviren. Jeweils 106 CIN 1004-Zellen wurden mit 5 infektiösen Partikeln Ad/antis\ pro Zelle infiziert und anschließend mit jeweils 10 μg pCBI-DsRed, pCBII-DsRed (l-Scel-verdaut) oder pCBIII-DsRed transfiziert. Für jedes Donorplasmid wurden jeweils drei vollständig unabhängige Experimente durchgeführt. Nach Auftreten des virusinduzierten czythopathischen Effekts (CPE) wurden Frier/Tau-Lysate der Zellen hergestellt (Amplifikationsrunde 0, AO) . Jeweils 106 CIN 1004-Zellen wurden dann mit jeweils 1 ml AO infiziert. Nach Auftreten des CPE wurden wieder Freir/Tau-Lysate hergestellt (Amplifikationsrunde 1 , A1 ). Anschließend wurde durch Verdünnungsendpunkt-Analyse auf 293-Zellen der Gesamtzahl infektiöser Partikel in AO und A1 bestimmt (IP, weiße Balken) . Ferner wurde die Gesamtzahl neu gebildeter rekombinanter Adenoviren in AO und aA1 als Gesamtzahl DsRed-transduzierender Einheiten bestimmt (schwarze bBalken, DTU). Es ist jeweils der Mittelwert aus den drei unabhängigen Experimenten sowie die Standartabweichung gezeigt.
Figur 8 zeigt die Analyse der bei Einsatz des Donorvirus Adlantis\ und der Donorplasmide pCBI-DsRed, pCBII-DsRed oder pCBIII-DsRed gewonnenen Gemische aus restlichem Donorvirus und neu gebildeten rekombinanten Adenoviren auf der Ebene der viralen DNA. Jeweils 1 ml Freier/Tau-Lysat der Amplifikationsrunde 1 (A1 , zu deren Gewinnung siehe Figur 7) wurde zur Infektion von 106 293-Zellen eingesetzt. Nach 36 h wurde aus den infizierten Zellen durch Hirt-Extraktion die replizierte virale DNA isoliert. Es wurden jeweils 3 unabhängige Experimente pro Donorplasmid gemacht (a, b, c) . (8A) zeigt die Spaltung von jeweils 1 μg der Hirt-Extrakte mit PshA\. Als Kontrolle ist virale DNA aus dem Donorvirus Adlantis\ aufgetragen. Diese Spaltung ermöglicht die Unterscheidung der 5 ' - terminalen Fragmente der neu gebildeten rekombinanten Adenoviren und des Donorvirus Ad/antis\ (siehe Figur 6). Bei Einsatz von pCBI-DsRed und pCBIII-DsRed als Donorplasmid ist nur das 3909 Bp große 5 '-terminale Fragment von Ad/antis\ zu erkennen. Bei Einsatz von pCBII-DsRed als Donorplasmid ist sowohl das 4581 Bp große 5 '-terminale Fragmentes von AdCBII-DsRed als auch das 3909 Bp große 5 '-terminale Fragment von Ad/ant/'s\ in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 zu erkennen. Dies zeigt, daß die Bildung AdCBII-DsRed aus pCBII-DsRed deutlich effizienter ist, als die von AdCBI-DsRed aus pCBI-DsRed bzw. die von AdCBIII-DsRed aus pCBIII-DsRed. (8B) zeigt den PCR-Nachweis der DNA der neu gebildeten rekombinanten Adenoviren AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed oder AdCBIII-DsRed in den Hirt-Extrakten. Jeweils 1 μ\ der Hirt-Extrakte wurde in eine PCR mit den angegebenenen Primern AdCBI-s oder bGHpA-s und Ad-as eingesetzt. Als Negativkontrolle diente 1 μ\ H20. Bezüglich der Bindungsstellen der Primer und die Größe der entsprechenden PCR-Produkte siehe Figur 6 (M: DNA-Größenmarker) . Das Auftreten der für die neu gebildeten rekombinanten Adenoviren charakteristischen PCR-Produkte bei Einsatz aller Hirt-Extrakte zeigt, dass - auch wenn die Effizienz unterschiedlich ist (vergleiche Figur 8A) - aus allen drei Donorplasmiden tatsächlich rekombinante Adenoviren entstehen.
Figur 9 zeigt dir Struktur der Donorplasmide pCBII-DsRed und pCBII-/acZ und der aus diesen Donorplasmiden durch Rekombination mit den Donorviren Ad/antis und AdlantisW gebildeten rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBIIJacZ. Ferner ist die Größe der PsΛAI-Fragmente, insbesondere die der 5 '-terminalen sΛAI-Fragmente, die bei den Restriktionsanalysen in den Figuren 10 und 1 1 zur Unterscheidung von viraler DNA der Donorviren und der neu gebildeten rekombinanten Adenoviren dienten.
Figur 10 zeigt das experimentelle Schema, dass zur Herstellung von Großpräaparationen der rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBIIJacZ verwendet wurde. Nach diesem Schema wurden jeweils 3 parallele unabhängige Experimente für beide Dobnorviren Ad/antis\ und AdlantisW in Kombination mit den Donorplasmiden pCBII-DsRed oder pCBII-/acZ durchgeführt.
Figur 1 1 zeigt die Analsyse der Virusgemische, die in der Amplif kationsrunde 1 (A1 ) nach dem Schema von Figur 10 erhalten wurden. Jeweils 1 ml der Frier/Tau-Lysate A1 wurde zur Infektion von 106 293-Zellen eingesetzt. Nach Auftreten des zytopatischen Effekts wurde die replizierte virale DNA durch Hirt-Extraktion isoliert. Jeweils 1 μg der Hirt-Extrakte wurde dann mit PshA\ verdaut. Dieses Enzym liefert charakteristische Fragmente vom 5 '-Ende der Donorviren Adlantis\ und AdlantisW sowie der rekombinaten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ (siehe Figur 9) . Als Kontrolle (C) wurde 1 μg gereinigte DNA des jeweils verwendeten Donorvirus Ad/antls\ oder AdfantisW eingesetzt. Die oberen beiden Abbildungen zeigen die Ergebnisse mit pCBII-DsRed als Donorplasmid (rekombinantes Adenovirus AdCBII-DsRed), die beiden unteren diejenigen mit pCBII-/acZ (rekombinantes Adenovirus AdCBII-/acZ) . In den rechten Abbildungen wurde Adlantis\, in den linken Abbildungen AdlantisW als Donorvirus eingesetzt. Innerhalb der Abbildungen sind jeweils die drei unabhängigen Experimente (a, b, c) mit Vermehrung auf 293- oder CIN 1 004-Zellen zusammengestellt. In allen Ansätzen ist das Vorhandensein der neu gebildeten rekombinanten Adenoviren anhand der charakteristischen 5 '-terminalen Fragmente zu erkennen (4581 Bp bei AdCBII-DsRed und 7221 Bp bei AdCBII-/acZ, siehe Figur 9) . Bei Einsatz von Ad/antis\ und Vermehrung auf 293-Zellen ist zusätzlich das 5 '- terminale Fragment des Donorvirus zu erkennen, was eine Restkontamination mit diesem Donorvirus anzeigt. Bei Einsatz von AdlantisW und Vermehrung auf 293-Zellen tritt dagegen das 5 '- terminale Fragment des Donorvirus nicht auf. Bei Vermehrung auf CIN 1004-Zellen ist bei Einsatz beider Donorviren das 5 '- terminale Fragment des Donorvirus ebenfalls nicht zu detektieren. Figur 12 zeigt die Analyse von Großpräparationen der rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ, die nach dem experimentellen Schema von Figur 10 gewonnen wurden. Aus den gereinigten infektiösen Partikeln wurde die virale DNA extrahiert und jeweils 1 μg der gereinigten DNA mit PshA\ verdaut. Dieses Enzym liefert charakteristische Fragmente vom 5 '-Ende der Donorviren Ad/antis\ und AdlantisW sowie der rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ (siehe Figur 9) . Als Kontrolle (C) wurde 1 μg gereinigte DNA des jeweils verwendeten Donorvirus Adlantisl oder AdlantisW eingesetzt. Die oberen beiden Abbildungen zeigen die Ergebnisse mit dem rekombinanten Adenovirus AdCBII-DsRed, die beiden unteren diejenigen mit dem rekombinanten Adenovirus AdCBII-/acZ. In den rechten Abbildungen wurde Ad/antis\, in den linken Abbildungen AdlantisW als Donorvirus eingesetzt. Innerhalb der Abbildungen sind jeweils die drei unabhängigen Experimente (a, b, c) mit Vermehrung auf 293- oder CIN 1 004-Zellen zusammengestellt. In sämtlichen gereinigten Virus-DNAs ist nur das charakteristische 5 '-terminale Fragment des rekombinanten Adenovirus zu erkennen, d.h. das 4581 -Bp-Fragment bei AdCBII-DsRed und das 7221 -Bp-Fragment bei AdCBII-/acZ.
Figur 13 zeigt die Bestimmung der Titer an intakten infektiösen Partikeln und der Gesamttiter viraler Partikel bei den Großpräparationen von AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ, die nach dem Schema in Figur 1 0 hergestellt wurden. Der Titer an intakten infektiösen Partikeln wurde durch Verdünnungsendpunkt-Analyse auf 293-Zellen bestimmt (schwarze Balken), der Gesamttiter an viralen Partikeln durch Messung der photometrischen Absorpbtion der Viruspräparation (weiße Balken). Gezeigt ist jeweils der Mittelwert der drei unabhängigen Experimente und die Standartabweichung. Über den Balkenpaaren ist das Verhältnis des Gesamttiters viraler Partikel zum Titer an infektiösen Partikeln angegeben. Figur 14 zeigt die genauere Bestimmung des Ausmaßes der Restkontamination mit Donorviren bei den Großpräparationen von AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ, die nach dem Schema von Figur 10 hergestellt wurden, durch Southern Blot. Jeweils 1 μg PshA\ -verdaute virale DNA aus den gereinigten Viruspräparationen wurde über Agarosegele aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertagen. Die spezifische radioaktive Detektion des 5 '-terminalen PsΛAI-Fragments der Donorviren (Adlantisl. 3906 Bp; AdlantisW: 3798 Bp) erfolgte mit einer markierten Sonde, die das Abstandhalterfragment (spacer, S in Figur 9) erkennt, das nur in diesen Donorviren, nicht aber in den entstandenen rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ enthalten ist. Links ist die Zelllinie angegeben, auf der die Vermehrung der Viren (A1 -A3 nach Figur 1 0) erfolgt war, sowie das Donorvirus, das bei der Generierung der Viren (AO nach Figur 1 0) verwendet wurde. Als Kontrollen wurde jeweils 1 μg Heringssperma-DNA mit 0.01 μg ( 100fache Verdünnung, log 2), 0.001 μg (1 .OOOfache Verdünnung, log 3) 0.0001 μg ( 10.000fache Verdünnung, log 4) oder 0.00001 μg (100. OOOfache Verdünnung, log 5) PsΛAI-gespaltener DNA des jeweils verwendeten Donorvirus eingesetzt. Das Ausmaß der Helferviruskontamination kann durch Vergleich der Bandenintensitäten mit den Kontrollen abgeschätzt werden.
Figur 15 zeigt die Testung der Großpräparationen von AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ, die nach dem Schema von Figur 10 hergestellt wurden, auf Kontaminationen mit Replikationskompetenten Wildtyp-Adenoviren (RCA). Jeweils 1 07 Huh7-Zellen wurden mit 108 infektiösen Partikeln der gereinigten Viruspräparationen infiziert. Nach 7 Tagen wurden die Zellen durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen und jeweils 1 /3 des Lysats zur Eerneuten Infektion von 107 Huh7-Zellen verwendet. Nach weiteren 7 Tagen wurde der Zellkultur-Überstand mittels PCR auf das Vorhandensein von RCA getestet. Dabei kamen Primer zum Einsatz, die bei Vorhandensein von RCA-DNA zur Bildung eines 600-Bp-Produkts führen. Als Negativkontrollen wurde (1 ) H20 und (2) Zellkultur-Überstand aus nicht-infizierten Huh7-Zellen (mock) eingesetzt. Als Positivkontrolle (PC) diente eine mit RCA kontaminierte Präparationen eines anderen rekombinanten Adenovirus (M: DNA-Größenmarker) .
Figur 16 zeigt die hohe Effizienz mit der aus Ad/antis\, nicht aber aus AdlantisW, nach Infektion von CIN1004-Zellen Rreplikationskompetente Wildtyp-Adenoviren (RCA) entstehen. In jeweils 4 unabhängigen Experimenten (a, b, c, d) wurden 293- oder CIN1004-Zellen mit 5 infektiösen Partikeln pro Zelle Ad/antis\ oder 1 infektiösen Partikel pro Zelle AdlantisW infiziert. Nach Auftreten des virusinduzierten zytopathischen Effekts wurden die Zellen durch Frier-Tau-Lyse aufgeschlossen und die Lysate mittels PCR auf das Vorhandensein von RCA getestet. Dabei kamen Primer zum Einsatz, die bei Vorhandensein von RCA-DNA zur Bildung eines 600-Bp-Produkts führen. Als Negativkontrollen wurde H20 oder Frier/Tau-Lysate scheininfizierter 293-Zellen (mock) verwendet, als Positivkontrolle (PC) Frier/Tau-Lysate RCA-infizierter Zellen (M: DNA-Größenmarker) .
Figur 17 zeigt die Ermittlung der Anzahl unabhängiger rekombinanter Adenovirusklone, die bei Einsatz der Donorviren Adlant/sl oder AdlantisW und Donorplasmiden des Typs 2 aus 106 CIN 1 004-Zellen entstehen. Jeweils 1 06 CIN 1 004-Zellen wurden mit 5 infektiösen Partikeln pro Zelle Ad/ant/s\ (oben) oder 1 infektiösen Partikel pro Zelle AdlantisW (unten) infiziert und anschließend mit jeweils 12 vg unterschiedlicher Gemische von /-Scel-verdautem pCBII-DsRed und pCBII-/acZ transfiziert. Dabei kamen Mischungsverhältnisse von 50: 1 bis 500.000: 1 zum Einsatz. Als Positivkontrollen dienten Transfektionen Donorvirus-infizierter CIN 1 004-Zellen mit 1 2 μg /-Scel-verdautem pCBII-/acZ, als Negativkontrollen entsprechende Transfektionen mit 1 2 μg /-Scel-verdautem pCBII-DsRed. Nach Auftreten des virusinduzierten zythopathischen Effekts (CPE) wurden Frier/Tau-Lysate der Zellen hergestellt. Jeweils 1 /5 dieser Lysate wurden zur Infektion von 106 293-Zellen eingesetzt. Nach Auftreten des CPE wurden wiederum Frier/Tau-Lysate der Zellen hergestellt und 1 /5 dieser Lysate zur Infektion von 1 06 Huh7-Zellen verwendet. Nach 48 h wurden die Huh7-Zellen mit X-G al g efärbt . Die Anza h l aus p C BI I-/acZ entstand ener /acZ-transduzierender Einheiten (lacZ transducing units, LTU) konnte dann durch Auszählung der blaugefärbten Zellen bestimmt werden. Die Balken geben jeweils den Mittelwert der Gesamtzahl an LTU und die Standartabweichung in denjenigen Experimenten an, bei denen blaue Zellen detektiert werden konnten. Über den Balken ist jeweils das Verhältnis der Anzahl positiver Experimente zur Gesamtzahl der Experimente angegeben.
Figur 18 zeigt das experimentelle Schema zur Herstellung adenoviraler cDNA-Expressionsbanken sowie deren Einsatz zur Identifizierung von Genen, die in einem Testsystem einen bestimmten Phänotyp hervorrufen (weißer Kreis: bakterieller Replikationsursprung (ori); weißer Pfeil: Ampizillin-Resistenzgen (amp); weißes Dreieck: /oxP-Erkennungsstelle (loxP); schwarze Kästchen: terminale invertierte Sequenzwiederholungen von Ad5 (ITRs); Ψ: vollständiges Verpackungssignal von Ad5; Ad5ΔE1 ΔE3: kodierende Sequenzen von Ad5 mit Deletion der E1 - und E3-Region; Kästchen mit Pfeil: CMV-Promotor (CMV); pA: CMV-Polyadenylierungssignal).
Figur 19 fasst die experimentelle Vorgehensweise bei der Konstruktion der Expressionsbank für humane Leber-cDNA im Donorplasmid pCBII-CMVIl zusammen (weißer Kreis: bakterieller Replikationsursprung (ori); weißer Pfeil: Ampizillin-Resistenzgen (amp); weißes Dreieck: /oxP-Erkennungsstelle oxP); schwarze Kästchen: 5 '-terminale invertierte Sequenzwiederholung von Ad5 (5 ' ITR); Ψ: vollständiges Verpackungssignal von Ad5; Kästchen mit Pfeil: CMV-Promotor (CMV); pA: CMV-Polyadenylierungssignal. Figur 20 zeigt die Charakterisierung der Expressionsbank für humane Leber-cDNA im Donorplasmid pCBII-CMVIl (pCBII-CMVIl-LIVERcDNA), die nach dem Schema von Figur 1 9 hergestellt worden war. (20A) zeigt die Bestimmung des Größenbereichs der inserierten cDNAs. Jeweils 1 μg Plasmid-DNA aus vereinzelten Klonen wurde mit St7aBI verdaut. Als Kontrolle wurde pCBII-CMVIl ohne inserierte Fremd-DNA mit SnaB\ verdaut. Dieses Enzym liefert vom Plasmidrückgrat ein 3554 Bp-Fragment, sowie ein weiteres Fragment, das die Expressionskassette samt CMV-Promoter, inserierter cDNA und CMV-Polyadenylierungssignal enthält (siehe Figur 1 9). Aus der Größe dieses Fragments lässßt sich durch Abzug der Summe der Größen des CMV-Promoters und des Polyadenylierungssignals (632 Bp) die Größe der ilnserierten cDNA abschätzen. (20B) zeigt den Nachweis der Präsenz der cDNAs für hAAT (oben) und hFlX (unten) mittels PCR. Neben den Abbildungen sind schematisch die Bindungsstellen der verwendeten Primer sowie die Größe der Produkte gezeigt. In die PCR wurden 50, 200 oder 500 μg der Plasmidbank eingesetzt. Als Negativkontrollen dienten H20 und 10 ng pCBII-CMVIl, als Positivkontrollen (PC) jeweils 10 ng eines Plasmids mit dem vollständigen Leserahmen von hAAT (oben) oder hFlX (unten) .
Figur 21 zeigt das experimentelle Schema, dass bei der Umwandlung der Expressionsbank für humane Leber-cDNA im Donorplasmid pCBII-CMVIl ("pCBII-CMVIl-LIVERcDNA") in adenovirale cDNA-Expressionsbanken zum Einsatz kam.
Figur 22 zeigt die Kontrollen für Komplexität und Effizienz der V i r u s e n tste h u n g be i d e r G ew i n n u n g d e r a d e n o v i ra l e n
Leber-cDNA-Expressionsbanken Ad/aπt/'sLIVERcDNAI & II nach dem
Schema von Figur 21 . Jeweils 1 ml der Frier/Ttau-Lysate der A1 der jeweils 3 (a, b, c) für Komplexität (pCBII-CMVII-LIVERcDNA/pCBII-/acZ 50.000: 1 ) bzw. Effizienz (pCBII-/acZ) wurden zur Infektion von subkonfluenten Huh7-Zellen in 60mm-Zellkulturschalen eingesetzt. Nach 48 h wurden die Zellen mit X-Gal gefärbt.
Als Negativkontrollen dienten nicht-infizierte und nicht-transfizierte Huh7-Zellen (n.i./n.t.), als Positivkontrolle Huh7-Zellen, die mit 20 infektiösen Partikeln pro Zelle eines rekombinanten Adenovirus mit einer RSV-Promoter-getriebenen /acZ-Expressionskassette infiziert worden waren (AdRSV-/acZ)
Figur 23 zeigt die Chara kterisierung der ad enoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken Ad/a/7f/sLIVERcDNAI & II bezüglich Größen der inserierten cDNAs. Individuelle Virusklone, die durch piaque assay auf 293-Zellen isoliert worden waren, wurden zur Infektion von jeweils 106 293-Zellen eingesetzt. Nach 36 h wurde die replizierte virale DNA extrahiert und einer Restriktionsanalyse mit PshA\ unterworfen. Dieses Enzym liefert vom 5 '- Ende der rekombinanten Adenoviren ein charakteristisches Fragment, dessen Größe sich aus 3667 bBp Vektorsequenzen und der Größe der inserierten cDNA zusammensetzt.
Figur 24 zeigt die Bestimmung des Ausmasses der Kontamination der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken Ad/a/7 /sLIVERcDNAI & II mit Rreplikationskompetenten Adenoviren (RCA) . Jeweils 107 Huh7 Zellen wurden mit 1 - 108 infektiösen Partikeln (IP) der Expressionsbanken infiziert.
Nach 7 Tagen wurden die Zellen durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen und jeweils 1 /3 des Frier/Tau-Lysats zur erneuten Infektion von 107 Huh7-Zellen verwendet. Nach weiteren 7 Tagen wurde der Zellkulturüberstand mittels PCR auf das Vorhandensein von RCA getestet. Dabei kamen Primer zum Einsatz, die bei Vorhandensein von RCA-DNA zur Bildung eines 600-Bp-Produkts führen . Die RCA-Kontamination liegt bei Ad/a/7<7sLIVERcDNAI bei unter 1 %, bei Ad/aπzVsLIVERcDNAII bei 10%. Als Positivkontrolle (PC) diente eine mit RCA kontaminierte Präparation eines anderen rekombinanten Adenovirus. Als Negativkontrolle (NC) wurde Zellkultur-Überstand aus nicht-infizierten Huh7-Zellen eingesetzt (M: DNA-Größenmarker) .
Figur 25 zeigt tabellarisch die Charakterisierung der inserierten cDNAs in den aus der adenoviralen Leber-cDNA-ExpressionsbankAd/aπt/sLIVERcDNA I durch piaque assay isolierten Klonen I-6, I-8, I-9, 1-1 5, 1-1 7 und 1-1 8.
Figur 26 zeigt tabellarisch die Charakterisierung der inserierten cDNAs in den aus der adenoviralen Leber-cDNA-ExpressionsbankAd/aπf/sLIVERcDNA I durch piaque assay isolierten Klonen 1-1 9, I-24, I-25, I-26 und I-27.
Figur 27 zeigt das Schema, das der ersten Screeningrunde der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken (Ad/anf/sLIVERcDNA) nach rekombinanten Adenoviren, die die hAAT- oder hFlX-cDNA enthalten, zugrunde lag. Zur Herstellung der Masterplatten S1 A1 wurden jeweils 3 x 103 293-Zellen in 96-we//-Platten eingesät. Ausgehend von den gereinigten und getiterten Viruspräparationen wurden dann die wells A1 -F1 2 mit 50 (erste Screeningrunde hAAT) bzw. 500 (erste Screeningrunde hFlX) infektiösen Partikeln pro well infiziert. Als Kontrollen dienten nicht-infizierte Zellen (wells G 1 -G6) und mit 50 (erste Screeningrunde hAAT) bzw. 500 (erste Screeningrunde hFlX) infektiösen Partikeln Ad/ant/s pro well infizierte Zellen (wells G7-G 1 2) . Nach 7 Tagen wurden die vermehrten Viren durch Frier/Tau-Lyse der Zellen in den Masterplatten freigesetzt. Jeweils 40 μ\ der virushaltigen Überstände wurden zur Infektion von 96-we//-Platten mit 3 x 1 04 293-Zellen pro well verwendet (Masterplatten S1 A2). Nach Auftreten des virus-induzierten zytopathischen Effekts nach ca. 3 Tagen würden die Zellkulturüberstande mittels ELISA auf hAAT oder hFlX getestet. Figur 28 zeigt das Schema, das der zweiten Screeningrunde der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken (Ad/ar f/sLIVERcDNA) nach rekombinanten Adenoviren, die die hAAT- oder hFlX-cDNA enthalten, zugrundelag. Zur Herstellung der Masterplatten S2A1 wurden jeweils 3 x 1 03 293-Zellen in 96-we//-Platten eingesät. Ausgehend von den getiterten positiven wells in S1 A2 wurden dann die wells A1 -F1 2 mit 1 (zweite Screeningrunde hAAT) bzw. 10 (zweite Screeningrunde hFlX) infektiösen Partikeln pro well infiziert. Als Kontrollen dienten nicht-infizierte Zellen (wells G 1 -G6) und mit 1 (zweite Screeningrunde hAAT) bzw. 10 (zweite Screeningrunde hFlX) infektiösen Partikeln Adfantisl pro well infizierte Zellen (wells G7-G 1 2) . Nach 7 Tagen wurden die vermehrten Viren durch Frier/Tau-Lyse der Zellen in den Masterplatten freigesetzt. Jeweils 40 μl der virushaltigen Überstände wurden zur Infektion von 96-well-Platten mit 3 x 1 04 293-Zellen pro well verwendet (Masterplatten S2A2) . Bei der zweiten Screeningrunde hFlX wurden nach Auftreten des virusinduzierten zytopathischen Effekts (CPE) die Zellkulturüberstande dieser Masterplatten mittels ELISA auf hFlX getestet. Bei der zweiten Screeningrunde hAAT wurden dagegen nach 7 Tagen die vermehrten Viren in S2A2 wiederum durch Frier/Tau-Lyse der Zellen in den Masterplatten freigesetzt und erneut jeweils 40 μ\ der virushaltigen Überstände zur Infektion von 96-ιve//-Platten mit 3 x 104 293-Zellen pro well verwendet (Masterplatten S2A3) . Nach Auftreten des CPE wurden die Zellkulturüberstande von S2A3 mittels ELISA auf hAAT getestet.
Figur 29 zeigt das experimentelle Schema zur klonalen Vereinzelung von rekombinanten Adenoviren, die die hAAT- oder hFlX-cDNA enthalten, aus den positiven wells in S2A3 (zweite Screeningrunde hAAT) bzw. S2A2 (zweite Screeningrunde hFlX) . Durch piaque assays mit seriellen Verdünnungen der Frier/Tau-Lysate aus den positiven wells der zweiten Screeningrunde werden vereinzelte Virusplaques gewonnen. Die Plaqueisolate werden dann individuell auf 293-Zellen vermehrt und die Zellkulturüberstande per ELISA auf hAAT bzw. hFlX getestet. Bei den positiven PIaqueisolaten wird dann die Präsenz der hAAT- bzw. hFlX-cDNA durch Sequenzierung verifiziert.
Figur 30 zeigt die Ergebnisse der ersten Screeningrunde der beiden adenovirale Leber-cDNA-Expressionsbanken Ad/a/7f/sLIVERcDNAI (oben) und Ad/ant sLIVERcDNAII (unten) nach rekombinanten Adenoviren, die die hAAT-cDNA enthalten. Dargestellt sind die Rohdaten des hAAT-ELISAs (OD490) mit den Überständen der jeweils 3 (a, b, c) Masterplatten S1 A2, die nach dem Schema von Figur 27 mit 50 infektiösen Partikeln/we// in S1 A1 hergestellt wurden (A1 -F1 2: Proben; G 1 -G6: Negativkontrollen 1 (Überstände nicht-infizierter 293-ZeIlen; G7-G 1 2: Negativkontrollen 2 (Überstände mit Adlantis\ infizierter Zellen); F1 - F9: Standartreihe hAAT (1 :2-Verdünnungsstufen startend mit 250 ng/μl); F10-F1 2: Leerwert) .
Figur 31 zeigt die Ergebnisse der zweiten Screeningrunde der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbank Ad/a/7f/sLIVERcDNAI nach rekombinanten Adenoviren, die die hAAT-cDNA enthalten. Dargestellt sind die Rohdaten des hAAT-ELISAs (OD490) mit den Überständen der jeweils 1 Masterplatte S2A3, die pro ausgewählte positive Subpopulation (1 -a-B9, 1 -a-D1 , 1 -b-D10 und 1 -C-B8) der Masterplatten S1 A2 nach dem Schema von Figur 28 mit 1 infektiösen Partikel pro well in S2A1 hergestellt wurden (A1 -F1 2: Proben; G 1 -G6: Negativkontrollen 1 (Überstände nicht-infizierter 293-Zellen; G7-G 1 2: Negativkontrollen 2 (Überstände mit Ad/antis\ infizierter Zellen); F1 - F9: Standartreihe hAAT (1 :2-Verdünnungsstufen, startend mit 250 ng hAAT l μ\); F10-F1 2: Leerwert).
Figur 32 zeigt die Ergebnisse der ersten Screeningrunde der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbank Ad/at7t/sLIVERcDNAI nach rekombinanten Adenoviren, die die hFlX-cDNA enthalten. Dargestellt sind die Rohdaten des hFlX-ELISAs (OD490) mit den Überständen der 9 (a-f) Masterplatten S1 A2, die nach dem Schema von Figur 27 mit 500 infektiösen Partikeln pro well in S1 A1 hergestellt wurden (A1 -F1 2: Proben; G 1 -G6: Negativkontrollen 1 (Überstände nicht-infizierter 293-Zellen; G7-G1 2 Negativkontrollen 2 (Überstände mit Ad/antis\ infizierter Zellen); F1 - F9 Standartreihe hFlX (1 :2-Verdünnungsstufen startend mit 100 ng/μl) F10-F1 2: Leerwert) .
Figur 34 zeigt die Ergebnisse der zweiten Screeningrunde der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbank Ad/aπr/sLIVERcDNAI nach rekombinanten Adenoviren, die die hFlX-cDNA enthalten. Dargestellt sind die Rohdaten des hFlX-ELISAs (OD490) mit den Überständen der jeweils zwei Masterplatten (A, B) S2A2, die pro ausgewählte positive Subpopulation (l-a-A1 1 und 1 -b-F5) der Masterplatten S1 A2 nach dem Schema von Figur 289 mit 10 infektiösen Partikel pro well in S2A1 hergestellt wurden (A1 -F1 2: Proben; G 1 -G6: Negativkontrollen 1 (Überstände nicht-infizierter 293-Zellen; G7-G 1 2: Negativkontrollen 2 (Überstände mit Ad/antisl infizierter Zellen); F1 - F9: Standartreihe hFlX (1 :2-Verdünnungsstufen, startend mit 25 ng hFlX / μl); F1 0-F1 2: Leerwert) .
Ausführungsbeispiele
1 . System zur Konstruktion von klonalen oder komplexen Populationen E1 -deletierter rekombinanter Adenoviren des humanen Serotyps 5
Das erfindungsgemäße System zur Herstellung von rAd wurde zur Konstruktion klonaler oder komplexer Populationen von rekombinanten E1 -deletierten humanen Adenoviren des Serotyps 5 (Ad5) realisiert. Das Verpackungssignal von Ad5 besteht aus sieben sogenannten A repeats, die zwischen nt 200 und nt 380 am 5 '-Ende des Ad5 Genoms liegen (Schmid, S.l. und Hearing, P. (1 997) J. Virol. 71 : 3375-3384) . Als ortsspezifisches Rekombinationssystem wurde das Cre//oxP-Rekombinationssystem des Bakteriophagen P1 eingesetzt, bestehend aus der Cre-Rekombinase und der von ihr erkannten /ox -Sequenz (Sternberg, N. und Hamilton, D. (1 981 ) J. Mol. Biol. 1 50: 467-486) . Als selten schneidende Restriktionsendonuklease in Donorplasmiden des Typs 2 wurde I-Scel verwendet, das eine 1 8-Bp-Erkennungssequenz hat (Monteilhet, C, Rerrin, A., Thierry, A., Colleaux, L. und Dujon, B. (1 990) Nucleic Acids Res. 1 8: 1407-141 3). In der Folge werden die Komponenten des Systems und ihre Gewinnung beschrieben.
Konstruktion der Donorviren
Als Donorviren werden von Ad5 abgeleitete E 1 -deletierte replikationsdefiziente Viren verwendet, deren Verpackungssignal (i) partiell deletiert ist und (ii) von parallel orientierten /oxf-Sequenzen umrahmt wird. Die Donorviren haben zudem eine 2.7 kBp-Deletion in der E3-Region und können daher bis zu 8 kBp Fremd-DNA aufnehmen. Es liegen zwei Donorviren vor - Adlantisl und AdlantisW - die in ihrem Aufbau identisch sind, sich aber durch das Ausmaß der Deletion des Verpackungssignals unterscheiden (siehe Abbildung 4) . Bei Adlantis\ sind die A repats VI und VII deletiert, es enthält somit die A repeats l-V (nt 1 94-358 des Ad5-Genoms). Bei AdlantisW sind die A repeats III, IV und V deletiert, es enthält somit die A repeats I, II, VI und VII (nt 1 94-271 und daran anschließend nt 355-542 des Ad5-Genoms).
Die Konstruktion Donorvirus-Genome erfolgte durch homologe Rekombination in E. coli. Zunächst wurden S/ji/tt/e-Plasmide konstruiert, die das 5 '-Ende der Donorviren enthielten (pAd2lis für Ad/antis\ und pAd2lisΔ für AdlantisW).
Ausgangsplasmid für die Konstruktion von pAd2lis war p_E1 -2lox, das in sequenzieller Folge das 5 ' ITR von Ad5, eine /ox -Sequenz, ein partiell deletiertes Verpackungssignal von Ad5 mit den A repeats l-V (ΔΨIV-VII), ein 929 Bp großes nicht-kodierendes Abstandhalterfragment (spacer), eine zweite parallel orientierte /ox Sequenz und daran anschließend die nt 3524-5790 des Ad5 Genoms enthält (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Löser, P. und Strauss, M. (2001 ) Hum. Gene Ther. 1 2: 642-657) . Die genannten funktionellen Elemente wurden aus p_E1 -2lox als 3008-Bp-/4/7lll//3s-ΕII-Fragment freigesetzt und über die gleichen Restriktionsschnittstellen in das SΛi/rϊ/e-Plasmid pHVAd2 (Sandig, V., unveröffentlicht) insertiert, woraus pAd2lis entstand.
Zur Konstruktion von pAd2lisΔ wurde das partiell deletierte Verpackungssignal ΔΨVI-VII in pAd2lis durch das partiell deletierte Verpackungssignal ΔΨIII-V ersetzt. Ausgangspunkt war das Plasmid pSLITRPS, das die ersten 542 Bp des Ad5 Genoms inklusive des 5 ' ITRs und des vollständigen Verpackungssignals enthält (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Löser, P. und Strauss, M. (2001 ) Hum. Gene Ther. 1 2: 642-657) . Aus diesem wurde ein 704-Bp-Sa/l/Λ/Λαl-Fragment herausgespalten, das die genannten Ad5-Sequenzen enthielt und in den Dsal-Ort des Plasmids pBSSK- (Stratagene) insertiert, resultierend in Plasmid pBSITRPS. Aus diesem wurde ein 84-Bp-Dsal/M/t/NI-Fragment herausgespalten, das den nt 272-355 des Ad5-Genoms entspricht und die A repeats lll-V beinhaltet. Durch Religation des Vektors wurde das Plasmid pBSITRPSΔ erhalten, das das partiell deletierte Verpackungssignal ΨΔIII-V enthält. Dieses wurde anschließend als 249-Bp-/3srGI//lsp71 8-Fragment herausgespalten und anstelle des partiell deletierte Verpackungssignal ΨΔVI-VII zwischen die HindW\- und 4sp71 8-Orte von pAd2lis eingefügt, woraus sich pAd2lisΔ ergab.
Die zu insertierenden viralen 5 '-Enden wurden aus pAd2Iis und pAd2lisΔ durch Verdau mit AsplOO und Stu\ freigesetzt und zusammen mit dem C/al-linearisierten pHVAd l zur Rekombination in E. coli kotransformiert. pHVAd l (Sandig, V., unveröffentlicht) enthält den Rest des Ad5-Genoms mit einer 2.7-kBp-Deletion in der E3-Region. Aus den durch diese Rekombination gewonnenen Plasmiden pAdl lis und pAdl lisΔ wurden die Genome der Donorviren Adlantis\ und AdlantisW durch Verdau mit Pac\ freigesetzt und anschließend in 293-Zellen transfiziert. Die 293-Zellen komplementieren die E1 -Defizienz der Donorviren, wodurch eine Virusvermehrung stattfinden kann. Die daraus gewonnenen infektiösen Viren wurden dann auf 293-Zellen weitervermehrt. Ad/antis\ wurde als Überstand aus durchinfizierten lysierten 293-Zellen freigesetzt und anschließend über CsCI-Dichtegradienten gereinigt, AdlantisW wurde direkt als Überstand aus durchinfizierten lysierten 293-Zellen eingesetzt.
Verpackungszelllinie
Als Verpackungsszellinie kommt die von 293-Zellen abgeleitete Zelllinie
CIN1004 zum Einsatz, die auf hohem Niveau konstitutiv das Gen für eine kernlokalisierte Cre-Rekombinase exprimiert (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Löser, P. und Strauss, M. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 642-657). Die Gewinnung dieser Zelllinie war durch den Einsatz eines bicistronischen Vektors möglich gewesen, bei dem die Expression einer kernlokalisierten Cre-Rekombinase über eine interne Ribosomen-Eintrittstelle mit derjenigen des selektierbaren neo-Gen gekoppelt war. Nach Transfektion von 293-Zellen mit diesem Vektor konnte über eine Selektion für die Hochexpression des neo-Gens eine direkte Selektion für eine Hochexpression der Cre-Rekombinase erfolgen.
Konstruktion der Donorplasmide
Es werden Donorplasmide eingesetzt, die jeweils Donorplasmiden des Typs 1, 2 und 3 entsprechen (pCBI, pCBII und pCBIII). Sie enthalten eine (pCBI, pCBII) oder zwei (pCBIII) /oxP-Erkennungsstellen und das vollständige Verpackungssignal von Ad5 (A repeats l-VII, nt 194-526 des Ad5-Genoms). pCBII enthält zudem noch zwei Erkennungsstellen für die selten schneidende Restriktionsendonuklease I-Scel (18-Bp-Erkennungssequenz). Die Plasmide liegen jeweils in verschiedenen Formen vor (siehe Abbildung 54), beispielsweise mit einem Polylinker, in den vollständige Expressionskassetten mit Promotor, kodierender Region und Polyadenylierungssignal insertiert werden können (pCBI-3, pCBII-3, pCBIII-3) oder mit einem Polylinker, der vom hCMV-Promotor und vom hCMV-Polyadenylierungssignal umrahmt wird, zur Insertion von kodierenden Sequenzen, beispielsweise Transgenen oder cDNA-Banken (pCBI-CMVIl, pCBII-CMVIl, pCBIII-CMVIl).
Die Donorplasmide wurden ausgehend von pMV konstruiert, einem Plasmid, das neben einem bakteriellen Replikationsursprung (ColEI ), einem cos-Signal und dem Ampizillin-Resistengen in sequenzieller Abfolge eine I-Scel-Erkennungsstelle, nt 1-542 des Ad5-Genoms (5 'ITR und vollständiges Verpackungssignal), einen Polylinker, das 3 'ITR von Ad5 und eine zweite I-Scel-Erkennungsstelle enthält (Hillgenberg, M., Schnieders, F., Löser, P. und Strauss, M. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 642-657). Zur Konstruktion von pCBI-3 und pCBI-CMVIl wurde zunächst durch Insertion eines 107-Bp-Xmal-Fragemntes, das eine /σxP-Erkennungssequenz enthält, in die in pMV zwischen dem Ad5-5 '-ITR und dem Ad5-Verpackungssignal gelegene SprAI-Schnittstelle pMVI gewonnen. Aus pMVI wurde ein 905-Bp- ral-Fragment freigesetzt, das die I-Scel-Erkennungssequenz, das Ad5-5 'ITR, die /oxf-Erkennungssequenz, das Ad5-Verpackungssignal und den Polylinker enthielt. Dieses wurde mit dem 2348-Bp-f,s/l//Vi;ll-Fragment aus pBSKS- (Stratagene) zur Ligation gebracht, das einen bakteriellen Replikationsursprung (ColEI ), das Ampizillin-Resistengen und einen Teil des F1-Replikationsursprungs enthält, was pCBI-1.o2 ergab. Nach Herausspalten der I-Scel-Erkennungsstellen und des Ad5-5'ITRs als 311-Bp-Sapl//3a/77HI-Fragment und anschließende Religation des Vektors wurde aus pCBI-1.o2 dann pCBI-2 erhalten. Durch Herausspalten des Teils des F1-Replikationsurpsrunges als 284-Bp- /o;oMI-Fragment und Religation des Vektors wurde pCBI-3 erhalten. Durch Insertion eines 688-Bp-Fragments, das den hCMV-Promotor und das hCMV-Polyadenylierungssignal mit einem dazwischenliegenden Polylinker enthält, zwischen die Pml\- und /ael-Orte des Polylinkers von pCBI-3 wurde pCBI-CMV erhalten. Durch Insertion eines Linkers, der durch H y b r i d i s i e r u n g d e r O l i g o n u k l e o t i d e 5 ' -AATTGTTTAAACGG-CCCTCGAGCCGT-3 ' und 5-ATACGGCCTCGAGGGCCGTTT-AAAC-3 ' erhalten wurde, zwischen die Mun\- und Acc\-Orte des Polylinkers von pCBI-CMV wurde pCBI-CMVIl gewonnen.
Zur Konstruktion von pCBII-3 und pCBII-CMVIl wurde aus pMV das Ad5-3 ' ITR als 261 -Bp-/?r//ll-Fragment herausgeschnitten, die Religation des Vektors ergab pCBII-1. Durch Insertion eines 107-Bp-Fragmentes mit einer /ox -Erkennungssequenz in den Polylinker von pCBII-1 wurde pCBII-2 erhalten. Nach Herausspalten der cos-Sequenz als 2332-Bp-£coNI/Sapl-Fragment aus pCBII-2 wurde pCBII-3 erhalten. Durch Insertion eines 688-Bp-Fragments, das den hCMV-Promotor und das hCMV-Polyadenylierungssignal mit einem dazwischenliegenden Polylinker enthält, zwischen die Pmlλ und Bst\ 107i-Orte des Polylinkers von pCBII-3 wurde pCBII-CMV gewonnen. Durch Insertion eines Linkers, der durch Hybridisierung der Oligonukleotide 5 '-AATTGTTTAAACGGCCCTCGAGG CCGT-3 ' und 5-ATACGGCCTCGAGGGCCGTTTAAAC-3 ' erhalten wurde, zwischen die Mun\- und v4ccl-Orte des Polylinkers von pCBII-CMV wurde pCBII-CMVIl erhalten.
pCBIII-3 und pCBIII-CMVIl wurden ausgehend von pCBI-3 (s.o.) konstruiert. Zunächst wurde durch Insertion eines 107-Bp-Fragments mit einer /ox -Sequenz in den Λ/groMI-Ort des Polylinkers von pCBI-3 das Plasmid pCBIII-3 erhalten. Durch Insertion eines 688-Bp-Fragments, das den hCMV-Promotor und das hCMV-Polyadenylierungssignal mit einem dazwischenliegenden Polylinker enthält, in den Bst 107i-Ort des Polylinkers von pCBIII-3 wurde pCBIII-CMV gewonnen. Durch Insertion eines Linkers, der durch H y b r i d i s i e r u n g der Oligonukleotide 5 ' -AATTGTTTAAACGGCCCTCGAGGCCGT-3 ' und 5-ATACGGCCTC-GAGGGCCGTTTAAAC-3 ' erhalten wurde, zwischen die Mun\- und Acc\-Oτte des Polylinkers von pCBIII-CMV wurde pCBIII-CMVN* konstruiert. Durch Herausspalten eines 43-Bp-/3/77/l/Λ/rzvl-Fragments aus pCBIII-CMVIl*, das einen zu dem im Polylinker vorliegenden zusätzlichen XΛol-Ort enthielt, gefolgt von der Religation des Vektors wurde pCBIII-CMVIl erhalten.
Funktionelle Testung der Donorviren Z u r T e s t u n g d e r E f f i z i e n z d e r E r z e u g u n g d e s Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrats wurden CIN 1004-Zellen mit Ad/antis oder AdlantisW infiziert. Nach Auftreten des virusinduzierten zythopathischen Effekts wurde die replizierte virale DNA isoliert und einer Restriktionsanalyse unterworfen, bei der zwischen unprozessiertem Donorvirus und prozessiertem Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat unterschieden werden kann. Das Fragmentmuster entsprach vollständig prozessiertem Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat (Figur 4B) . Zudem ergab der Vergleich der Anzahl pro Zelle als Nachkommen produzierter infektiöser Partikel nach Infektion von CIN 1 004 oder 293-Zellen eine etwa 100fache Wachstumsreduktion der Donorviren Adlantis\ und AdlantisW auf CIN 1004-Zellen (Figur 4C), eine Folge der Exzision des viralen Verpackungssignals. Diese Befunde zeigen eine sehr hohe Effizienz bei der Bildung des Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrates. Ferner wurde bei diesen Experimenten auch das Wachstum von Ad/antis\ und AdlantisW auf 293-Zellen verglichen (Figur 4C). Dabei zeigte sich, dass AdlantisW im Vergleich zu Adlantis\ auf beiden Zellinien etwa l OOfach stärker verpackungsinhibiert ist, eine Folge des im Vergleich zu Adlantis\ stärker deletierten Verpackungssignals..
Funktionelle Testung der Donorplasmide
Zur Testung der Erzeugung von rAd nach Transfektion von Donorplasmiden in die Donorvirus-infizierte Verpackungszelllinie wurde in den Polylinker der Donorplasmide pCBI, pCBI I und pCBII I eine konstitutive Expressionskassette für das Reportergen DsRed inseriert. Die so erhaltenen Donorpasmide pCBI-DsRed, pCBII-DsRed und pCBIII-DsRed sowie die aus diesen Donorplasmiden durch Cre/tox -vermittelte Rekombination mit dem Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorsubstrat resultierenden rekombinanten Adenoviren AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed und AdCBIII-DsRed .sind in Figur 6 gezeigt. Zur Gewinnung dieser Viren wurden pCBI-DsRed, pCBII-DsRed (mit I-Scel verdaut) und pCBIII-DsRed in CIN 1004-Zellen transfiziert, die zuvor mit Adlantis\ infiziert worden waren. Nach Auftreten des virusinduzierten zythopathischen Effekts (CPE) wurden die Zellen lysiert (Frier/Tau-Lysat Amplifikationsrunde 0, AO) . Das so erhaltene virushaltge Lysat wurde zwecks Vermehrung der rekombinanten Adenoviren zur Infektion von 293-Zellen eingesetzt, die wiederum nach Auftreten des CPE lysiert wurden (Frier/Tau-Lysat Amplifikationsrunde 1 , A1 ). Anschließend wurden die Gesamtmenge der in AO und A1 enthaltenen rekombinanten Adenoviren AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed und AdCBIII-DsRed bestimmt. Der Nachweis e rf o l g t e ü b e r d i e D s Re d - R e p o rte rg e n k a s s ett e m itt e l s Fluoreszenzmikroskopie als DsRed-transduzierende Einheiten (DsRed transducing units, DTU) nach Infektion von Zellen. Zudem wurde durch Verdünnungsendpunkt-analyse auf 293-Zellen die Gesamtmenge an infektiösen Partikeln in A0 und A1 titriert (Figur 7). Bei Einsatz aller drei Donorplamide waren DTU nachzuweisen, somit rekombiante Adenoviren gebildet worden. Die Gesamtmenge an DTU lag bei Einsatz der Donorplasmide pCBI-DsRed und pCBIII-DsRed bei etwa 100 in A0 und etwa 1000 in A1 . Die Gesamtmenge an infektiösen Partikeln lag dagegen bei etwa 105 in AO und etwa 107 in A1 , was auf eine starke Verunreinigung der rekombinanten Adenoviren mit restlichem Donorvirus hinwies. Bei Einsatz von l-Scel-verdautem pCBII-DsRed als Donorplasmid dagegen war bei vergleichbarer Gesamtmenge infektiöser Partikel die Gesamtmenge an DTU mit etwa 105 in AO und etwa 107 in A1 deutlich höher.
Um die Virusgemische genauer zu charakterisieren wurden 293-Zellen mit den Frier/Tau-Lysaten A1 infiziert. Nach Auftreten des virusinduzierten zytopathischen Effekts die replizierte virale DNA extrahiert & mittels Verdau mit PshA\ analysiert (Figur 8A) . Dieses Enzym liefert für die rekombinanten Adenoviren AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed und AdCBIII-DsRed sowie für das Donorvirus Adlantis\ jeweils charakteristische 5 '-terminale Fragmente (vergleiche Figur 6). In den Verdaus der Hirtextrakte, die nach Einsatzt von pCBI-DsRed und pCBIII-DsRed als Donorplasmide gewonnen wourden waren, konnte nur das 5 '-terminale Fragment von Adlantisl detektiert werden. In den Verdaus der Hirtextrakte, die nach Einsatz von pCBII-DsRed als Donorplasmid gewonnen wurden, konnten dagegen in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 sowohl das für Adlantisl charakteristische, als auch das für das rekombinante Adenovirus AdCBII-DsRed charakteristische 5 '-terminale Fragment detektiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen die in Figur 7 gezeigten fast gleich hohen Gesamtmengen an DTU und infektiösen Partikeln bei Einsatz von pCBII-DsRed als Donorplasmid in A1 . Zudem zeigen sie, dass die im Verhältnis zur Gesamtmenge an DTU deutlich höhere Gesamtzahl an infektiösen Partikeln bei Einsatz von pCBI-DsRed und pCBIII-DsRed als Donorplasmid eine starke Kontamination mit restlichem Donorvirus widerspiegelt.
Um die Entstehung der rekombinanten Adenoviren weiter zu belegen wurden mit den gleichen Hirtextrakten PCR-Analysen durchgeführt, bei denen Primerpaare zum Einsatz kamen, die nur von den rekombinanten Adenoviren AdCBI-DsRed, AdCBII-DsRed und AdCBIII-DsRed, nicht aber vom Donorvirus oder den Donorplasmiden ein Produkt liefern (vergleiche Figur 6). In allen Experimenten trat das für die rekombinanten Adenoviren charakteristischen Produkte auf (Figur 8B) . Dies belegt, dassß die DTU in AO und A1 in Figur 7 tatsächlich den rekombinanten Adenoviren entsprechen, und dassß die Abwesenheit des für AdCBI-DsRed bzw. AdCBIII-DsRed charakteristischen 5 '-terminalen Fragments bei Einsatz der Donorplasmide nur durch die hohe Kontamination mit restlichem Donorvirus verursacht wurde.
Die Testung der Donorplasmide hatte somit ergeben, daß rekombinante
Adenoviren reproduzierbar bei Einsatz aller drei Donorplasmid-Typen 1 , 2 und 3 entstehen, und daß bei Einsatz von Donorplasmiden des Typs 2
(pCBII-DsRed) zum einen die Effizienz der Entstehung der rekombinanten Adenoviren am effizientesten ist und zum anderen die Kontamination mit restlichem Donorvirus am niedrigsten ist.
Deshalb wurden in der Folge zur Erzeugung klonaler und komplexer Populationen rekombinanter Adenoviren Donorplasmide des Typs 2 (Derivate von pCBII-3 oder pCBII-CMVIl, vergleiche Figur 5) eingesetzt.
2. Konstruktion klonaler rAd-Populationen
Zur Gewinnung klonaler Populationen von rAd wurden die Donorplasmide pCBII-DsRed und pCBII-/acZ eingesetzt (Donorplasmide des Typs 2), die als Transgen konstitutive, durch den RSV-Promotor getriebene Expressions-einheiten für die Reportergene DsRed und lacZ enthalten. pCBII-/acZ wurde wie pCBII-DsRed (s.o.) durch Insertion der Expressionskassette in den Polylinker von pCBII-3 erhalten. Beide Plasmide sowie die durch Rekombination mit dem Donorvirus-ΔΨ-Akzeptorzubstrat entstehenden rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ sind in Figur 9 gezeigt. Die effiziente Entstehung rekombinanter Adenoviren aus Donorplasmiden des Typs 2 in Verbindung mit Adlantisl als Donorvirus war bereits in den vorrangegangenen Experimenten gezeigt worden. In der Folge wurde getestet unter welchen Bedingungen Großpräparationen klonaler rekombinanter Adenoviren mit ausreichender Reinheit erhalten werden können. Insbesondere kam es dabei an auf ( 1 ) eine möglichst niedrige Kontamination mit restlichem Donorvirus, auf (2) die strukturelle Integrität der rekombinanten Adenoviren während der Amplifikation und (3) auf die Abwesenheit von Kontaminationen mit Replikationskompetenten Wildtyp-Adenoviren (RCA), die bekanntermaßen häufig bei der Vermehrung von rekombinanten Adenoviren auf 293-Zellen entstehen.
Das erfindungsgemäße System zur Erzeugung rekombinanter Adenoviren ermöglicht bei Verwendung von Donorplasmiden des Typs 2 den Einsatz zweier gegebenenfalls auch kombinierbarer Selektionsprinzipien zur Reduktion der Kontamination durch restliches Donorvirus: (1 ) Die Donorviren weisen im Unterschied zu den rekombinanten Adenoviren eine Deletion im Verpackungssignal auf. Durch die direkte Konkurrenz um die vorgebildeten Kapside in den infizierten Zellen sollten daher die rekombinanten Adenoviren einen Wachstumsvorteil haben. Dieser Vorteil sollte in umgekehrtem Verhältnis zum Ausmass der Deletion des Verpackungssignals stehen, das in den Donorviren Adlantisl und AdlantisW unterschiedlich ist. Um die Effizienz dieses Selektionsprinzips zu testen, war es erforderlich zu ermitteln, wie hoch die Kontamination in Großpräparationen klonaler rekombinanter Adenoviren bei Einsatz beider Donorviren nach Vermehrung auf normalen 293-Zellen ist. (2) Bei Vermehrung der rekombinanten Adenoviren auf der die Cre-Rekombinase exprimierenden Verpackungszellinie CIN 1004 wirkt ein zusätzliches Selektionsprinzip: Rekombinante Adenoviren, die bei Einsatz von Donorplasmiden des Typs 2 entstehen, enthalten nur eine /σxP-Erkennungsstelle. In CIN 1004-Zellen sind sie daher kein Substrat für die Cre//ox -vermittelte Exzision des Verpackungssignals, im Unterschied zu den Donorviren, deren Verpackungssignal von zwei /oxP-Sequenzen umrahmt wird, und deren Wachstum auf CIN 1004-Zellen etwa l OOfach reduziert wird (vergleiche Figur 4) .
Somit war es zunächst das Ziel, die restliche Donorviruskontamination in klonalen Populationen rekombinanter Adenoviren zu ermitteln, die auf 293-Zellen vermehrt worden waren (Selektion nur über das partiell deletierte Verpackungssignal) oder auf CIN 1004-Zellen vermehrt worden waren (Selektion über die Exzision des Donorvirus-Verpackungssignals und das partiell deletierte Verpackungssignal) . Figur 10 fasst das experimentelle Vorgehensweise zusammen. Nach der Infektion von jeweils 1 06 CIN 1 004-Zellen mit Adlantisl oder AdlantisW wurden die Zellen mit den l-Scel-verdauten Donorplasmiden pCBII-DsRed oder pCBII-/acZ transfiziert. Nach Auftreten des virusinduzierten zytopathischen Effekts wurden die Zellen lysiert. Jeweils 1 /5 ml des so erhaltenen virushaltigen Lysats wurde zur Vermehrung auf 293- oder CIN 1 004-Zellen eingesetzt, wobei sequenziell eine 60mm-Schale (Amplifikationsrunde 1 , A1 ), eine 1 50mm-Schale (Amplifikationsrunde 2, A2) und schließlich 10 1 50mm-Schalen (Amplifi-kationsrunde 3, A3) eingesetzt wurden. Die aus der letzten Amplifikations-runde freigesetzten Viren wurden über CsCI-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und nach Abtrennung des CsCI durch Gelfitration jeweils 2 ml gereinigte Viruspräparationen erhalten. Es wurden für beide Donorplasmide pCBII-DsRed und pCBII-/acZ in Kombination mit den beiden Donorviren Adlantisl und AdlantisW, sowie mit Vermehrung auf 293- und auf CIN1004-Zellen jeweils drei unabhängige parallele Experimente durchgeführt, insgesamt also 24 Großpräparationen erhalten.
Um die Mischungsverhältnisse von rekombinanten Adenoviren und restlichen Donorviren nach der ersten Vermehrungsrunde (A1 ) zu überprüfen, wurden 293-ZelIen mit 1 /5 des Frier/Tau-Lysats von A1 infiziert, und anschließend die replizierte virale DNA isoliert und per Restriktionsverdau mit PshAl, das für die rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ sowie für die Donorviren Adlantisl und AdlantisW jeweils charakteristische 5 '-terminale Fragmente liefert (vergleiche Figur 9), analysiert (Figur 1 1 ). In allen Ansätzen war das Vorhandensein der rekombinanten Adenoviren anhand der charakteristischen 5 '-terminalen Fragmente zu erkennen. Bei Einsatz von Adlantisl als Donorvirus und Vermehrung auf 293-Zellen war zusätzlich in allen Experimenten das 5 '- terminale Fragment des Donorvirus zu erkennen, was eine Restkontamination mit diesem Donorvirus anzeigte. Bei Einsatz von AdlantisW als Donorvirus und Vermehrung auf 293-Zellen trat dagegen das 5 '- terminale Fragment des Donorvirus nicht auf. Dies zeigt eine verstärkte Reduktion der Donorviruskontamination durch das im Vergleich zu Adlantisl stärker deletierte Verpackungssignal von AdlantisW. Bei Vermehrung auf CIN1004-Zellen war bei Einsatz beider Donorviren das 5 '- terminale Fragment des Donorvirus nicht zu detektieren. Dies zeigt eine verstärkte Reduktion der Donorviruskontamination durch die Cre-/ox -vermittelte Exzision des Donorvirus-Verpackungssignals in diesen Zellen an.
Zur Analyse der Mischungsverhältnisse von rekombinanten Adenoviren und restlichen Donorviren, sowie zur Überprüfung der strukturellen Integrität der rekombinanten Adenoviren nach der Vermehrung wurde aus den gereinigten Viruspräparationen die virale DNA extrahiert und wiederum durch Spaltung mit PshA analysiert. In sämtlichen gereinigten Virus-DNAs war nur das charakteristische 5 '-terminale Fragment des rekombinanten Adenovirus zu erkennen (Figur 1 2) . Kontaminationen mit restlichem Donorvirus konnten somit mit dieser Methode nicht nachgewiesen werden. Zudem belegten diese Ergebnisse, daßss die Struktur der rekombinanten Viren während der Vermehrung intakt geblieben war.
Es wurde dann für sämtliche gereinigte Großpräparationen von AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ der Titer an intakten infektiösen Partikeln (durch Verdünnungsendpunkt-Analyse auf 293-Zellen) und der Gesamttiter viraler Partikel (durch Messung der photometrischen Absorbtion der Virus-präparation) bestimmt (Figur 1 3) . Sowohl die Titer an intakten infektiösen Partikeln ( 1010 - 101 1 pro ml) als auch die Verhältnisse des Gesamttiters viraler Partikel zum Titer an infektiösen Partikeln ( 1 5 - 43) liegen im Rahmen dessen, was auch mit anderen gängigen Methoden zur Herstellung und Vermehrung rekombinanter Adenoviren erhalten wird.
Da die Restriktionsanalyse der viralen DNA aus gereinigtem Virus zur Detektion geringfügiger Kontaminationen mitr restlichem Donorvirus nicht sensitiv genug ist, wurden zur genaueren Quantifizierung der Kontamination Southern-Blot-Ana ysen durchgeführt. Dazu wurde aus den gereinigten Viruspräparationen isolierte und mit PshAl verdaute Virus-DNA sowie eine Sonde, die spezifisch an das 5 '-Ende der Donorviren bindet, eingesetzt. Als Kontrollen dienten serielle Verdünnungen von Donorvirus-DNA (Figur 14). Über die Intensität der Signale wurden so durch Vergleich mit den Kontrollen folgende Kontaminationen mit restlichem Donorvirus ermittelt: Bei Verwendung von Adlantisl als Donorvirus und Vermehrung auf 293-Zellen liegt die Kontamination bei etwa 1%. Dies ist eine Folge der Selektion gegen das Donorvirus mit partiell deletiertem Verpackungssignal während der Vermehrung der rekombinanten Adenoviren, da die Donorviruskontamination in A1 noch bei etwa 50% lag. Bei Verwendung von AdlantisW als Donorvirus und Vermehrung auf 293-Zellen liegt die Kontamination bei nur etwa 0.03%. Dies ist ein Ausdruck der verstärkten Selektion für die rekombinanten Adenoviren bei Einsatz von AdlantisW als Donorvirus durch dessen stärker deletiertes Verpackungssignal. Bei Vermehrung auf CIN1004-Zellen war bei Einsatz beider Donorviren kein Signal zu erkennen, die Kontamination lag somit unter der letzten Verdünnungsstufe der Donorvirus-DNA, die in den Kontrollen noch ein Signal lieferte, somit unter 0.001%. Durch Kombination beider Selektionsprinzipien mittels Vermehrung der rekombinanten Viren auf CIN1004-Zellen können somit Großpräparationen erhalten werden, deren Reinheit in bezug auf die Donrvirus-Restkontamination für die meisten Anwendungen rekombiananter Adenoviren ausreichend ist.
Es wurden dann sämtliche gereinigte Großpräparationen von AdCBII-DsRed und AdCBII-/ac auf Kontaminationen mit Replikationskompetenten Wildtyp-Adenoviren (RCA) geprüft. Diese entstehen bekanntermaßen mit nicht zu vernachlässigender Frequenz bei der Vermehrung rekombinanter Adenoviren auf 293-Zellen. Dem liegen homologe Rekombinationsereignisse zwischen den 5 '-Termini der rekombinanten Adenoviren und den in das Genom von 293-Zellen (und auch der davon abgeleiteten CIN1004-Zellen) inserierten 43445 '-terminalen Bp von Ad5 zugrunde. Durch ein doppeltes Crossover-Ereignis entstehen Wildtypviren, die keine E1-Defizienz mehr aufweisen. Zur Testung der Präparationen wurden jeweils 108 infektiöse Partikel zur Infektion von Huh7-Zellen eingesetzt, auf denen nur RCA zur Vermehrung befähigt sind. Nach 7 Tagen wurden die Zellen lysiert und jeweils 1 /3 des Lysats zur Vermehrung möglicherweise entstandener RCA erneut zur Infektion von Huh7-Zellen eingesetzt. Nach weiteren 7 Tagen wurden die Zellkulturüberstande mittels PCR auf die Anwesenheit von RCA getestet (Figur 1 5) . In -1 2/1 2 Präparationen, die mit Adlantisl als Donorvirus gewonnen worden waren, konnten Kontaminationen mit RCA gefunden werden. Dagegen wurde nur in 1 /1 2 Präparationen, bei denen AdlantisW als Donorvirus gedient hatte, eine RCA-Kontamination gefunden. Eine RCA-Kontamination in 1 /1 2 Präparationen liegt im Rahmen dessen, was auch mit bisherigen gängigen Verfahren zur Herstellung und Vermehrung rekombinanter Adenoviren beobachtet wird.
Da die rekombinanten Adenoviren AdCBII-DsRed und AdCBII-/acZ bei Verwendung beider Donorviren identisch sind, war es unwahrscheinlich, daß die RCA aus diesen rekombinanten Adenoviren während deren Vermehrung entstehen. Es mußte vielmehr angenommen werden, daß sie mit hoher Wahrscheinlichkeit nach der Infektion von CIN 1004-Zellen in AO spezifisch bei Einsatz von Adlantisl entstehen und dann während der Vermehrung der rekombinanten Adenoviren mitwachsen. Um dies zu verifizieren wurden Adlantisl und Ad/antisl einmal durch 293- und CIN 1004-Zellen passagiert. Dabei kamen die gleichen Bedingungen zum Einsatz wie bei der A0 zur Herstellung rekombinanter Adenoviren nach dem Schema von Figur 10: Infektion von 60mm-Schalen mit 5 infektiösen Partikeln pro Zelle bei Adlantisl und mit 1 infektiösen Partikel pro Zelle bei AdlantisW. Nach Auftreten des virusinduzierten zytopathischen Effekts wurden die Zellen durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen und die Lysate in eine PCR zum Nachweis von RCA eingesetzt (Figur 1 6). Während bei AdlantisW nach Passagierung durch 293- oder CIN 1004-Zellen in keinem der vier jeweils parallelen Experimente RCA gefunden wurden, traten bei Adlantisl nach Passagierung durch CIN 1004-Zellen in 3/4 Experimenten RCA auf, nicht dagegen bei Passagierung durch 293-Zellen. Es kann daher ausgeschlossen werden, dass die RCA bereits in der Präparation vion Adlantisl enthalten waren. Sie müssen vielmehr nach Infektion der CIN 1004-Zellen neu entstanden sein.
Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass bei Einsatz von AdlantisW als Donorvirus in Verbindung mit Donorplasmiden des Typs 2 (pCBII-3-Derivate) reproduzierbar durch direkte Vermehrung der in AO generierten rekombinanten Adenoviren auf 293- oder CIN 1004-Zellen Großpräparationen erhalten werden können, die (1 ) die rekombinanten Adenoviren mit intakter Genomstruktur in hohen Titern enthalten, (2) eine restliche Donorviruskontamination von weniger als 0.001 % aufweisen und (3) nicht mit RCA kontaminiert sind. Insgesamt stellt das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber bisherigen Verfahren zur Herstellung klonaler Populationen von Adenoviren einen Fortschritt dar, da es deutlich weniger Arbeitschritte erfordert und dadurch schneller und zudem in der Handhabung einfacher ist. Zudem ist es hinsichtlich der Materialkosten billiger.
3. Konstruktion komplexer rAd-Populationen
Zur Ermittlung der Anzahl unabhängiger rAd-Entstehungsereignisse, die ein Maß für die mit dem System zu erreichende Komplexität bei der Herstellung gemischter rAd-Populationen ist, wurden Adlantisl und AdlantisW als Donorviren und Gemische der Donorplasmide pCBII-DsRed und pCBII-/acZ eingesetzt (s.o.). Nach der Infektion mit Adlantisl (5 infektiöse Partikel pro Zelle) oder Adlantisll (1 infektiöses Partikel pro Zelle) wurden jeweils 1 06 CIN 1 004-Zellen mit jeweils 1 2 μg unterschiedlicher Gemische von /-Scel-verdautem pCBII-DsRed und pCBil-/acZ transfiziert. Dabei kamen molare Mischungsverhältnisse von 50: 1 bis 500.000: 1 zum Einsatz. Nach Auftreten des zytopathischen Effekts wurden die Zellen lysiert und die im Lysat enthaltenen Viren einmal auf 293-Zellen vermehrt. Anschließend wurde die Gesamtmenge der so vermehrten rAd bestimmt, die das lacZ-Gen enthalten AdCQW-lacZ) . Die Detektion und Titration der rAd erfolgte dabei über den Nachweis der /acZ-Reportergenexpression nach Infektion von Huh7-Zellen (Figur 1 7) . Bei Einsatz von Adlantisl als Donorvirus war bei Mischungsverhältnissen 1 :50, 1 :500 und 1 :5000 in allen Fällen, bei 1 :50000 in 7/8 Fällen die Entstehung von AdCBII-/acZ nachweisbar. Bei höheren Mischungsverhältnissen war nur in wenigen Experimenten AdCBII-/acZ nachweisbar. Bei AdlantisW waren bereits bei einer Verdünnung von lediglich 1 :5000 nur noch 3/9 Experimenten positiv. Die Anzahl unabhängig entstandener rekombinanter Adenovirusklone pro 1 06 CIN 1004-Zellen liegt somit bei Einsatz von Adlantisl bei etwa 50.000, bei Einsatz von AdlantisW deutlich niedriger zwischen 500 - 5000.
Die mit Adlantisl erreichte Komplexität von 50.000 unabhängigen Klonen pro 106 Zellen bedeutet bei Einsatz von lediglich 2 x 107 Zellen (entsprechend 20 subkonfluenten 60mm-Schalen) eine Gesamtkomplexität von 106 unabhängigen Klonen, was für die Konstruktion von Genbanken, beispielsweise adenoviralen cDNA-Expressionsbanken, ausreichend ist. AdlantisW dagegen ist als Donorvirus zur Konstruktion von cDNA-Expressionsbanken ungeeignet, da eine Komplexität von 106 unabhängigen Klonen den Einsatz von 108-109 CIN 1004-Zellen (entsprechend 200 - 2000 subkonfluenten 60mm-Schalen) erfordern würde. Außerdem würde dies die Transfektion von insgesamt 2.4-24 mg cDNA-Expressionsbank im Donorplasmid erfordern. Die Vermehrung von cDNA-Expressionsbanken in Plasmiden zu solchen Mengen ist ohne Verluste der Komplexität nicht möglich.
Das Schema in Figur 18 zeigt die experimentelle Vorgehensweise zur Konstruktion adenoviraler Expressionsbanken sowie die Methode zur Isolierung von cDNAs aus diesen durch ein biologisches Testsystem. Zunächst wird ausgehend von der Poly-A( + )-RNA aus dem Gewebe bzw. dem Zelltyp der Wahl cDNA synthetisiert, die dann gerichtet zwischen den CMV-Promotor und das CMV-Polyadenylierungssignal in den Polylinker des Donorplasmids pCBII-CMVIl inseriert wird. Daraus wird eine cDNA-Expressionsbank in pCBII-CMVIl gewonnen. Zur Gewinnung der adenoviralen cDNA-Expressionsbank mit 106 unabhängigen Klonen werden dann insgesamt 20 60mm-Zellkulturschalen mit jeweils 106 CIN 1004-Zellen mit 5 infektiösen Partikeln Adlantisl pro Zelle infiziert und anschließend mit jeweils 1 2 μg l-Scel-verdauter Plasmidbank transfiziert. Durch Vermehrung der so erzeugten Viren und eine anschließende Reinigung der Viren wird eine hochtitrige gereinigte adenovirale cDNA-Expressionsbank gewonnen. Um aus daraus mittels eines biologischen Testsystems Adenovirusklone zu isolieren, die cDNAs mit bestimmten in einem biologischen Testsystem nachweisbaren Eigenschaften enthalten, werden durch Infektion von 293-Zellen in Multiwellplatten sogenannte Masterplatten hergestellt. Dabei werden ein oder mehrere infektiöse Partikel aus der adenoviralen cDNA-Expressionsbank pro well eingesetzt, wodurch definierte monoklonale oder oligoklonale Subpopulationen vermehrt werden. Nachdem die Zellen in den Masterplatten durchinfiziert sind, werden sie durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen. Die Masterplatten können aufgrund der Stabilität von Adenoviren durch Einfrieren lange gelagert werden. Die Überstande in den wells der Masterplatten enthalten zum einen die vermehrten infektiösen Adenoviren. Zum anderen enthalten sie die Proteine, die von den in den jeweiligen Adenovirusklonen enthaltenen cDNAs kodiert werden, da der CMV-Promotor zur deren Expression in den infizierten 293-Zellen führt. Als Testsystem kann daher zum einen ein direkter Nachweis eines gesuchten Proteins in den Lysaten dienen, beispielsweise ein enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) . Oder aber die Lysate werden zur Infektion von Zellen in einem zellbasierten Testsystem eingesetzt, bei dem eine durch die Expression der cDNA in den Zellen hervorgerufene phänotypische Veränderung nachgewiesen werden kann. Aus denjenigen wells der Masterplatten, deren Überstände in solchen Testsystemen das gesuchte Signal liefern, können die rekombinanten Adenoviren durch piaque assay auf 293-Zellen klonal vereinzelt werden. Anschließend können die cDNAs beispielsweise durch Sequenzierung charakterisiert werden.
Um zu zeigen, daß diese experimentelle Vorgehensweise tatsächlich möglich ist (proof of concept), wurde " eine adenovirale cDNA-Expressionsbank ausgehend von humaner Leber-mRNA konstruiert. Aus dieser wurden dann Adenovirusklone isoliert, die die cDNAs des humanen Alpha- 1 -Antitrypsins (hAAT) und des humanen Blutgerinnungsfaktors IX (hFlX) enthalten. Als Nachweissystem dienten ELISAs zur Detektion dieser sekretierten Proteine in den Überständen der Masterplatten. Diese in der Leber exprimierten Serumproteine wurden ausgewählt, weil sie exemplarisch für ein in der Leber stark exprimiertes Gen (hAAT, Serumkonzentration etwa 2 g/l) und ein in der Leber schwach exprimiertes Gen (hFlX, Serumkonzentration etwa 4 mg/l) stehen.
Konstruktion adenoviraler Leber-cDNA-Expressionsbanken Zunächst wurde die Expressionsbank für humane Leber-cDNA im Donorplasmid pCBII-CMVIl konstruiert. Die experimentelle Vorgehensweise ist in Figur 1 9 zusammengefaßt. Aus 5 μg Poly-A( + )-RNA aus gesunder humaner Leber wurde mittels des "cDNA Synthesis Kits" (Stratagene) cDNA mit kohäsiven EcoRI- und /?σl-Enden gewonnen, und nach Größenfraktionierung gerichtet in die kompatiblen Muni- und XΛol-Schnittstellen des Polylinkers von pCBII-CMVIl inseriert. Dabei wurden insgesamt 1 2 Ligationen mit jeweils 30 ng //7l/ /?ol-verdauten und dephosphorylierten Vektors pCBII-CMVIl und 10 ng cDNA durchgeführt, und die Ligationsprodukte vollständig in E. coli XL10GOLD (Stratagene) transformiert. Daraus wurden 8.23 x 105 Transformanden auf 24 1 50mm-Agarplatten erhalten. Diese wurden von den Platten geschabt und in insgesamt 2 I LB-Medium vermehrt. Anschließend wurden durch Plasmidextraktion und -reinigung insgesamt 1 800 μg gereinigte Plasmidbank pCBII-CMVIl-LIVERcDNA gewonnen. Es wurde dann die gereinigte Plasmidbank bezüglich der Größe der inserierten cDNAs charakterisert. Dazu wurde Plasmid-DNA aus vereinzelten Klonen einer Restriktionsanalyse mit St?aBI unterworfen. Dieses Enzym spaltet die gesamte Expressionskassette samt CMV-Promotor, cDNA und Polyadenylierungssignal heraus. Aus der Größe des entsprechenden Fragments läßt sich die Größe der inserierten cDNA abschätzen (Figur 20A) .
Diese lag bei den insgesamt 1 7 getesteten Klonen im Bereich von 400 - 3100 Bp, mit einem Durchschnitt von etwa 1 500 Bp. Die Größe der cDNAs für hAAT (1 258 Bp) und hFlX (1 390 Bp) liegt innerhalb dieses Größenbereichs. Die Präsenz der cDNAs für hAAT und hFlX in der Plasmidbank wurde anschließend durch PCR-Analysen mit Primern bestätigt, die nur bei Anwesenheit der vollständigen cDNAs ein Produkt liefern (Figur 20B) . Es wurde somit eine Leber-cDNA-Expressionbank in pCBII-CMVIl konstruiert, die eine Komplexität von 8.2 x 105 unabhängigen Klonen aufweist und nachgewiesenermaßssen die cDNAs für hAAT und hFlX enthält.
Diese Plasmidbank wurde dann zur Gewinnung adenoviraler Leber-cDNA-Expressionsbanken eingesetzt. Die experimentelle Vorgehensweise ist in Figur 21 zusammengefaßt. Zwanzig 60mm-Zellkulturschalen mit jeweils 106 CIN 1004-Zellen wurden mit 5 infektiösen Partikeln Adlantisl pro Zelle infiziert und anschließend mit jeweils 1 2 μg l-Scel-verdauter Plasmidbank pCBII-CMVIl-LIVERcDNA pro Schale transfiziert. Nach Auftreten des virus-induzierten zytopathischen Effekts (CPE) wurden die Zellen durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen und die Lysate aus den zwanzig Schalen vereinigt (primäre adenovirale Leber-cDNA-Expressionsbank, Amplifikationsrunde O, AO). Zur Vermehrung der Expressionsbank wurde die Hälfte des Lysats von AO zur Infektion von vier subkonfluenten 1 50mm-Zellkulturschalen mit CIN 1004-Zellen eingesetzt. Nach Aufteten des CPE wurden die Zellen durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen (Amplifikationsrunde 1, A1). Die Hälfte des Lysats von A1 wurde dann zur Infektion von neun subkonfluenten 150mm-Ze!lkulturschalen mit 293-Zellen eingesetzt. Nach Auftreten des CPE wurden die Zellen sedimentiert und durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen (Amplifikationsrunde 2, A2). Die so freigesetzten Viren wurden über CsCI-Dichtegradienten-Zentrifugation gereinigt und nach Abtrennung des CsCI zwei ml gereinigte adenovirale Leber-cDNA-Expressionbank erhalten. Um die Bedingungen bei der Entstehung der primären adenovirale Leber-cDNA-Expressionsbank in AO zu kontrollieren wurden zwei Arten von Kontrollen parallel durchgeführt: Zur Kontrolle der Effizienz der Virusentstehung wurden drei subkonfluente 60mm-Schalen mit CIN1004-Zellen nach Infektion mit 5 infektiösen Partikeln Adlantisl pro Zelle mit jeweils 12μg l-Scel-verdautem pCBII-/acZ pro Schale transfiziert. Zur Kontrolle der Komplexität wurden drei subkonfluente 60mm-Schalen mit CIN1004-Zellen nach Infektion mit 5 infektiösen Partikeln Adlantisl pro Zelle mit jeweils 12 μg eines molaren 1 :50.000-Gemisches von l-Scel-verdautem pCBII-/acZund l-Scel-verdauter Plasmidbank pCBII-CMVIl-LIVERcDNA pro Schale transfiziert. Nach Auftreten des CPE wurden die Zellen jeweils getrennt durch Frier/Ttau-Lyse aufgeschlossen (Amplifikationsrunde 0, A0 der Kontrollen) . Jeweils 1 /5 der Lysate wurden dann einmal in jeweils 106 293-Zellen vermehrt (Amplifikationsrunde 1, A1 der Kontrollen). Jeweils 1/5 der Lysate der A1 der Kontrollen wurde dann zur Infektion subkonfluenter Huh7-Zellen in 60mm-Schalen eingesetzt. Nach zwei Tagen wurden die Zellen mit X-Gal gefärbt. Blaue Zellen zeigten eine Infektion durch das aus pCBII-/acZ entstandene rekombinante Adenovirus AdCBII-/acZ an.
Das gesamte Schema wurde inklusive Kontrollen zweimal unabhängig durchgeführt, was zur den beiden adenoviralen Expressionsbanken Ad/aπt/sLIVERcDNAI und Ad/aπf/'sLIVERcDNAII führte. Die entspechenden Kontrollen für die Effizienz der Virusentstehung und der Komplexität der Virusenstehung sind in Figur 22 gezeigt. In sämtlichen der jeweils drei Kontrollen für die Effizienz waren etwa 50% der Zellen blau gefärbt. Dies waren mehr blaugefärbte Zellen als in parallelen Experimenten nach Infektion subkonfluenter Huh7-Zellen in 60mm-Schalen mit insgesamt 1 07 infektiösen Partikien AdRSV-/acZ (ein rekombinantes Adenovirus mit einer RSV-Promotor-getriebenen /acZ-Expressionskassette) erhalten wurden. Die Effizienz der Virusentstehung in AO war somit sehr hoch. In sämtlichen der jeweils drei Kontrollen für die Komplexität waren vereinzelte blaue Zellen zu detektieren, was anzeigte, daß in jeder Schale mindestens ein rekombi-nantes Adenovirus aus dem 1 :50.000-verdünnten pCBII-/acZ entstanden war. Die Komplexität in AO lag somit bei mindestens 50.000 unabhängigen Klonen pro 60mm-Schale. Bei der Virusentstehung bei der Gewinnung der primären adenoviralen Expressionbanken aus zwanzig 60mm-Schalen in AO konnte daher von einer Komplexität von mindestens 1 06 unabhängigen Adenovirusklonen ausgegangen werden . Zusammenfassend war somit in zwei unabhängigen Experimenten die Plasmidbank pCBII-CMVIl-LIVERcDNA mit hoher Effizienz in adenovirale Leber-cDNA-Expressionsbanken mit einer Komplexität von mindestens 106 unabhängigen Adenovirusklonen umgewandelt worden.
Charakterisierung der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken
Es wurde dann für beide gereinigten adenoviralen cDNA-Expressionsbanken d e r T i t e r a n i n t a kt e n i n f e kt i ö s e n P a rt i k e l n ( d u r c h Verdünnungsendpunkt-Analyse auf 293-Zellen) und der Gesamttiter viraler Partikel (durch Messung der photometrischen Absorbtion der Viruspräparation) bestimmt. Sowohl die Titer an intakten infektiösen Partikeln (Jeweils 2.3 x 101 1 infektiöse Partikel pro ml bei Ad/a/7t7sUVERcDNAI und Ad/a 7f/sLIVERcDNA II) als auch die Verhältnisse des Gesamttiters viraler Partikel zum Titer an infektiösen Partikeln ( — 10 bei Ad/aπzVsLIVERcDNAI und ~ 1 2 bei Ad/a ?f/sLIVERcDNA II) lagen im Rahmen dessen, was auch bei der Erzeugung klonaler Adenovirus-populationen mit dem erfindungsgemäßen System erreicht wurde (s.o.). Es wurden dann zur Charakterisierung des Insertgrößenbereichs durch piaque assay auf 293-Zellen individuelle Klone rekombinanter Adenoviren aus den beiden gereinigten adenoviralen Expressionsbanken gewonnen . Mit den PIaqueisolaten wurden dann 293-Zellen infiziert und anschließend die replizierte virale DNA isoliert und einer Restriktionsanalyse mit PsbAI unterworfen. Dieses Enzym liefert vom 5 ' -Ende der rekombinanten Adenoviren ein charakteristisches Fragment, aus dessen Größe sich die Größe der inserierten cDNAs abschätzen läßt. Bei Einsatz der jeweils 1 7 untersuchten Plaqueisolate ergab sich, dass ( 1 ) - erkennbar an unterschiedlichen Fragmentgrößen - die inserierten cDNAs alle verschieden waren, (2) die Größen der cDNAs im Größenbereich von 300 - 2700 Bp (Ad/anf/sLIVERcDNA I) bzw. 400 - 2100 Bp (Ad/amYsLIVERcDNA II) lagen und (3) die durchschnittliche Größe der cDNAs bei etwa 1 300 Bp (Ad/ar/t/sLIVERcDNA I) bzw. 1 500 Bp (Ad/aAϊtfsLIVERcDNA II) lag (Figur 23) . Sowohl der Insertgrößenbereich als auch die durchschnittliche Insertgröße stimmen gut mit denjenigen der Plasmidbank pCBII-CMVIl-LIVERcDNA überein (s.o.), was anzeigt, daß es bei der Umwandlung in die adenoviralen Expressionsbanken und bei deren Vermehrung nicht zu einer Verschiebung der Insertgrößen gekommen war. Die Plasmidbank pCBII-CMVIl-LIVERcDNA war somit in zwei unabhängigen Experimenten unter Beibehaltung der Komplexität und der Insertgrößenverteilung in eine adenovirale Expressionsbank umgewandelt worden.
Da der Einsatz von Adlantisl als Donorvirus mit der Gefahr der Verunreinigungen der Viruspräparationen mit Replikationskompetenten Wildtyp-Adenoviren (RCA) verbunden ist, wurde für Ad/aπr/sLIVERcDNA I und Ad/anf/sLIVERcDNA II das Ausmaß der Kontamination bestimmt. Dabei ergab sich eine Kontamination von < 1 % bei Ad/a/7/VsLIVERcDNAI und etwa 1 0% bei Ad/ant/sLIVERcDNAII (Figur 24) . Aufgrund der geringeren Kontamination mitr RCA wurden alle folgenden Experimente mit Ad/a/7f/sLIVERcDNA I durchgeführt. Zunächst ging es darum, individuelle Plaqueisolate aus Ad/ar/rvsUVERcDNA I bezüglich der inserierten cDNAs zu charakterisieren um eine Aussage über den prozentualen Anteil an vollständigen cDNAs in der Bank machen zu können. Dazu wurden die Hirt-Extrakte der Plaqueisolate 1-6, 1-8, 1-11,1-15, 1-17, 1-18, 1-19, I-24, I-25, I-26 und I-28, die bereits zur Restriktionsanalyse mit PshAl eingesetzt worden waren (s.o.), als Substrat in eine PCR mit Primern, die in se7se-Orientierung im CMV-Promotor (ACCGTCAGATCGCCTG-GAGA) und in anf/sense-Orientierung im CMV-Polyadenylierungssignal (CGCTGCTAACGCTGCAAGAG) binden, eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden dann in den Polylinker von pBSKS- kloniert. Mit Primern, die an den T3- und T7-Promotoren beiderseits der Insertionsstelle der PCR-Produkte im Plasmidvektor binden, wurden dann die Inserts sequenziert. Mittels BLASTN (www.ncbi.gov) wurden die Sequenzen mit Sequenzdatenbanken verglichen. Die Ergebnisse sind in den Figuren 25 und 26 tabellarisch zusammengefaßt. Für 9 der 11 Plaqueisolate wurden die cDNAs identifiziert. Bei zwei der Inserts (Plaqueisolate 1-15 und 1-19) konnten außer Homologien zu chromosomalen Regionen keine Übereinstimmungen mit bekannten cDNAs gefunden werden. Sie stellen daher möglicherweise bislang nicht charakterisierte Gene dar. Bei den restlichen neun Inserts waren fünf vollständige cDNAs (I-6, I-8, 1-11, 1-17, I-26) und vier 5 '-verkürzte cDNAs (1-18, I-24, I-25, I-28). Die cDNAs kodierten in sechs Fällen für Serumproteine, die in der Leber synthetisiert werden (Apolipoprotein A, Complement component 4 binding protein, Histidine-rich Glycoprotein, Vitronektin, 2 x Haptoglobin) und in drei Fällen für intrazelluläre Proteine der Leber (Deoxyguanosinkinase, Cytochrom P450 und die proteasomale modulatorische Untereinheit PSMD9). Zusammenfassend hat die Charakterisierung der Inserts der Plaqueisolate aus Ad/a/?t/'sLIVERcDNA I somit ergeben, daß mehr als 50% der cDNAs vollständig waren, daß 2/11 Inserts möglicherweise bislang nicht charakterisierten Gene entsprechen und und daß alle eindeutig identifizierbaren cDNAs erwartungsgemäß für in der Leber exprimierte Gene kodieren. Screening der adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken Für das Screening nach rekombinaten Adenoviren, die die cDNAs für hAAT oder hFlX enthalten, dienten Sandwich-ELISAs mit den Überständen von Zellen, die in 96-we//-Platten mit Subpopulationen aus den adenoviralen Leber-cDNA-Expressionsbanken in fiziert worden waren. Für die ELlSAs wurden 96-we//-Platten zunächst mit kommerziellen Antikörpern beschichtet, die hAAT (Anti-hAAT aus der Ziege) bzw. hFlX (Anti-HFIX aus der Maus) binden. Dann wurden die Platten mit 1 :4-Verdünnungen der zu testenden Zellkultur-überstände inkubiert. An die Platten gebundenes Antigen wurde dann nach Inkubation mit POD-gekoppelten Antikörpern (Schaf-Anti-hAAT-POD bzw . Hase-Anti-hFIX-IgG gefolgt von Ziege-anti-Hase-lgG-POD) und Zugabe von OPD durch Messung der Absorption bei 490 nm nachgewiesen. Als Negativkontrollen wurden Überstände aus nicht-infizierten Zellen sowie Überstände von Zellen, die mit dem "leeren" Donorvirus Adlantisl infiziert worden waren, verwendet.
Zur Isolierung von rekombinanten Adenoviren, die die cDNAs für hAAT oder hFlX enthalten, wurde nach dem in den Figuren 27-29 zusammengefaßten Schema vorgegangen. In der ersten Screeningrunde (Figur 27) wurden 293-Zellen in 96-w e//-Platten mit oligoklonalen Subpopulationen der gereinigten adenoviralen Expressionsbanken infiziert und die Zellen nach 7 Tagen in den Platten durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen (Masterplatten S 1 A 1 = Screeningrunde 1 Amplifikationsrunde 1 ) . Zur Vermehrung der Viren mit dem Ziel deutlicherer Signale im ELISA wurden die Überstände der Masterplatten S1 A1 zur Infektion einer weiteren 96-we//-Platte mit 293-Zellen verwendet. Nach die Zellen durchinfiziert waren, wurden sie wiederum durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen (Masterplatten S 1 A2 = Screeningrunde 1 Amplifikationsrunde 2) . Die Überstände der Masterplatten S 1 A2 wurden dann mittels ELISA auf hAAT oder hFlX getestet. Als Ergebnis der ersten Screeningrunde konnten so oligoklonale Subpopulationen in den Masterplatten S1 A2 identifiziert werden, die rekombinante Adenoviren mit dem hAAT oder hFlX-cDNA enthalten.
In der zweiten Screeningrunde (Figur 28) ging es dann darum, die Komplexität dieser Subpopulationen zu reduzieren. Dazu wurde zunächst der Gesamttiter an infektiösen Partikeln in den entsprechenden wells der Masterplatten S1 A2 bestimmt. Dann wurden 293-Zellen in 96-we//-Platten mit einer definierten Anzahl infektiöser Partikel aus den positiven wells der Masterplatten S1 A2 infiziert und die Zellen nach 7 Tagen in den Platten durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen (Masterplatten S2A 1 = Screeningrunde 2 Amplifikationsrunde 1 ). Zur Vermehrung der Viren mit dem Ziel deutlicherer Signale im ELISA wurden die Überstände der Masterplatten S1 A1 dann wieder zur Infektion einer weiteren 96- we//- Platte mit 293-Zellen verwendet. Nach die Zellen durchinfiziert waren, wurden sie wiederum durch Frier/Tau-Lyse aufgeschlossen (Masterplatten S2A2 = Screeningrunde 2 Amplifikationsrunde 2) . Die Überstände der Masterplatten S 1 A2 wurden dann etweder direkt mittels ELISA auf hAAT oder hFlX getestet, oder aber erneut zur Infektion einer weiteren 96- well- Platte mit 293-Zellen verwendet. Dadurch wurden dann die Masterplatten S2A3 erhalten, die dann mittels ELISA auf hAAT oder hFlX getestet wurden.
Als Ergebnis der zweiten Screeningrunde konnten so niedrig komplexe Subpopulationen in den Masterplatten S2A2 bzw. S2A3 identifiziert werden, die rekombinante Adenoviren mit dem hAAT oder hFlX-cDNA enthalten. Deren Vereinzelung in klonaler Form kann dann nach dem Schema in Figur 29 erfolgen: Durch piaque assay auf 293-Zellen können aus den positiven wells der Masterplatten S2A2 bzw. S2A3 dann individuelle Adenovirusklone erhalten werden . Diese können dann individuell auf 293-Zellen vermehrt werden. Durch Testung der Zellkulturüberstande mittels ELISA können dann die Adenovirusklone identifiziert werden, die die cDNAs für hAAT und hFlX enthalten. Aufgrund des hohen Expressionniveaus des hAAT-Gens in der Leber wurde angenommen, daß etwa 1/100 bis 1/1000 der Viren in den adenoviralen Expressionsbanken die hAAT-cDNA enthalten. Es erschien daher ausreichend, in der ersten Screeningrunde nach Figur 27 jeweils drei 96-well-Platten einzusetzen, in denen bei S1A1 50 infektiöse Partikel pro we//aus Ad/a7f/sLIVERcDNAI und Ad/ant/sLIVERcDNAII eingesetzt wurden. Dies entspricht bei insgesamt 216 wells jeweils 10.800 unabhängigen Adenovirusklonen in der ersten Screeningrunde. Die Ergebnisse der hAAT-ELISAs mit den Überständen der jeweils 3 Masterplatten S1A2 sind in Figur 30 gezeigt. Bei Einsatz von Ad/a?t/sLIVERcDNAI waren insgesamt 52 wells der Masterplatten S1A2 positiv. Bei Einsatz von Ad/a/7-7'sLIVERcDNAII waren es insgesamt 65 wells. Dies entspricht einer Frequenz von 1/207 (Ad/ant/sLIVERcDNAI) bzw 1/166 (Ad/ant/sLIVERcDNAII) Adenovirusklonen, was gut mit der initial angenommenen Frequenz (s.o.) übereinstimmt. Vier positive wells der Masterplatten S1A2 der ersten Screeningrunde von Ad/a?t/'sLIVERcDNAI wurden dann ausgewählt und der Titer an infektiösen Partikeln bestimmt (Masterplatte S1A2 a well B9: ~ 3 x 108 IP/ml; Masterplatte S1A2 a well D1: ~ 108 IP/ml; Masterplatte S1A2b wellülO: ~ 108 IP/ml; Masterplatte S1A2 c well B8: ~ 3 x 108 IP/ml). In der zweiten Screeningrunde nach dem Schema in Figur 28 wurde dann zur Reduktion der Komplexität dieser positiven Subpopulationen jeweils eine 96- well- Platte in S2A1 mit einem infektiösen Partikel pro well infiziert (insgesamt 72 wells = 72 Adenovirusklone, was die in der ersten Screeningrunde eingesetzte Komplexität von 50 unabhängigen Adenovirusklonen pro well abdeckt). Die Ergebnisse der ELISAs mit den Überständen der vier Masterplatten S2A3 sind in Figur 31 gezeigt. Jeweils 2-4 wells pro Masterplatte waren positiv, was eine erfolgreiche Isolierung von rekombinante Adenoviren, die die hAAT-cDNA enthalten, anzeigt.
Das Screening auf rekombinante Adenoviren, die die hFlX-cDNA enthalten, wurde nur mit Ad/a7f/sLIVERcDNAI durchgeführt. Aufgrund des niedrigen Expressionniveaus des hFlX-Gens in der Leber wurde angenommen, daß weniger als 1 /1 0.000 der Viren in der adenoviralen Expressionsbank die hFlX-cDNA enthalten. In der ersten Screeningrunde nach Figur 27 wurden daher neun 96- well- Platten eingesetzt, in denen bei S1 A 1 500 infektiöse Partikel pro well aus Ad/ant/sLIVERcDNAI eingesetzt wurden. Dies entspricht bei insgesamt 648 wells 324.000 unabhängigen Adenovirusklonen in der ersten Screeningrunde. Die Ergebnisse der hFlX-ELISAs mit den Überständen der neun Masterplatten S1 A2 sind in Figur 32 gezeigt. Es waren nur zwei wells positiv, was einer Frequenz von 1 /1 62.000 Adenovirusklonen in der adenoviralen Expressionsbank entspricht und wiederum gut mit der initial angenommenen Frequenz (s.o.) übereinstimmt. Für beide positiven wells der Masterplatten S 1 A2 der ersten Screeningrunde wurde dann der Titer an infektiösen Partikeln bestimmt (Masterplatte S1 A2 a well A λ : ~ 1 08 IP/ml; Masterplatte S 1 A2 b well F5: ~ 3 x 108 IP/ml) . In der zweiten Screeningrunde nach dem Schema in Figur 28 wurden dann zur Reduktion der Komplexität dieser positiven Subpopulationen jeweils zwei 96-we//-Platte in S2A1 mit zehn infektiösen Partikel pro we// infiziert (insgesamt 1 44 wells = 1 440 Adenovirusklone, was die in der ersten Screeningrunde eingesetzte Komplexität von 500 unabhängigen Adenovirusklonen pro well abdeckt) . Die Ergebnisse der ELISAs mit den Überständen der vier Masterplatten S2A2 sind in Figur 33 gezeigt. Jeweils 7 - 1 3 wells pro Masterplatte waren positiv, was eine erfolgreiche Isolierung von niedrig komplexen Subpopulationen anzeigt, die rekombinante Adenoviren enthalten, die die hFlX-cDNA enthalten.
Zur Gewinnung monoklonaler Subpupulationen aus den positiven wells der zweiten Screeningrunde können über piaque assay auf 293-Zellen nach Figur 29 vereinzelte Virusplaques gewonnen werden. Die Plaqueisolate können dann individuell auf 293-Zellen vermehrt werden und die Zellkulturüberstande zur Verifizierung per ELISA auf hAAT bzw. hFlX getestet werden. Anschließend kann die Präsenz der hAAT- bzw. hFlX-cDNA in den Adenovirusklonen durch Sequenzierung verifiziert werden.
Unter Einsatz des erfindungsgemäßen Systems zur Herstellung rekombinanter Adenoviren konnten somit ausgehend von mRNA adenovirale cDNA-Expressionsbanken hergestellt werden, die den allgemein erforderlichen Kriterien für cDNA-Expressionsbanken entsprechen: eine Komplexität von etwa 1 06 unabhängigen Klonen, ein hoher Anteil an vollständigen cDNAs ( > 50%), und die Präsenz von cDNAs auch auf niedrigem Niveau exprimierter Gene. Weiterhin wurde gezeigt, daß ein Screening der so erzeugten adenoviralen cDNA-Expressionsbanken über Masterplatten mit niedrig komplexen Subpopulationen zur Isolierung von Adenovirusklonen mit den gewünschten Eigenschaften geeignet ist. Das erfindungsgemäße System zur Erzeugung der adenoviralen cDNA-Expressionsbanken sowie die erfindungsgemäßen Methoden zu deren Screening erscheinen daher allgemein dazu geeignet, um Gene zu identifizieren, die in einem biologischen Testsystem einen nachweisbaren Phänotyp hervorrufen.
Die Erfindung betrifft somit ein neuartiges System zur Herstellung rekombinanter Adenoviren (rAd); Einsatzgebiete sind insbesondere die Medizin, Veterinärmedizin, Biotechnologie, Gentechnik und die funktionelle Genomanalyse.
Inhalt der Erfindung ist ein neuartiges System zur Herstellung von rAd . Die rAd werden durch ortspezifische Insertion von Fremd-DNA in ein infektiöses replizierendes Virus erzeugt. Mit diesem neuen System können klonale rAd-Populationen, verglichen mit bisherigen Methoden, schneller und einfacher hergestellt werden. Zudem ermöglicht das neue Verfahren im Unterschied zu bisherigen Methoden die Herstellung komplexer gemischter rAd-Populationen. Inhalt der Erfindung ist des Weiteren der Einsatz der neuen Methode der rAd-Herstellung zur Gewinnung komplexer Genbanken im adenoviralen Kontext, beispielsweise von cDNA-Expressionsbanken.
Die auf diese Weise gewonnenen rAd sind für den Transfer und die Expression von Genen in Zellen sowie für den Transfer von genetischem Material in Tiere und Menschen mit dem Ziel einer Gentherapie und/oder Vakzinierung einsetzbar. Ferner sind die auf diese Weise gewonnenen komplexen rAd-Populationen (Genbanken) einsetzbar zur Isolierung neuer Gene sowie zur funktioneilen Veränderung oder Optimierung bekannter Gene.
Das erfindungsgemäße System zur rAd-Herstellung besteht bevorzugt aus einem Donorvirus, dessen Verpackungssignal (i) partiell deletiert ist und (ii) von parallel orientierten Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase umrahmt wird, einer Verpackungszelllinie, die die ortsspezifische Rekombinase exprimiert und
Donorplasmiden, die (i) eine oder zwei Erkennungsstellen für die ortspezifische Rekombinase, (ii) das vollständige virale Verpackungssignal, (iii) gegebenenfalls zwei Erkennungsstellen für eine selten schneidende Restriktionsendonuklease und (iv) Insertionsstellen für Fremd-DNA bzw. insertierte Fremd-DNA enthalten.

Claims

Ansprüche
1 . System zur Herstellung rekombinanter Adenoviren, umfassend (a) einen Donorvirus mit einem partiell deletierten viralen
Verpackungssignal, das von zwei Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase umrahmt wird, (b) eine Verpackungszelllinie, die die ortsspezifische Rekombinase exprimiert und (c) ein Donorplasmid, das eine oder zwei Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase, das vollständige virale Verpackungssignal und Insertionsstellen für Fremd-DNA bzw. insertierte Fremd-DNA enthält.
2. System nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass es zur Herstellung einer klonalen Population von rekombinanten Adenoviren geeignet ist, wobei eine klonale Population des Donorplasmids eingesetzt wird.
3. System nach Anpruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es zur Herstellung einer komplexen Population von rekombinanten Adenoviren geeignet ist, wobei eine komplexe Population des Donorplasmids eingesetzt wird.
4. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Donorvirus, das von humanen Adenoviren abgeleitet ist, verwendet wird.
5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Donorvirus, das von nicht-humanen Adenoviren abgeleitet ist, verwendet wird.
6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorvirus mindestens ein nicht-essentielles virales Gen deletiert ist.
7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorvirus mindestens ein essentielles virales Gen deletiert ist.
8. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Gewinnung und Vermehrung des Donorvirus in einer Produzentenzelllinie erfolgt, die das/die deletierte(n) essentielle(n) virale(n) Gen(e) zur Verfügung stellt.
9. System nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass ein Donorvirus, das vom humanen Adenovirus Serotyp 5 abgeleitet ist und eine Deletion der essentiellen E1 -Region aufweist, verwendet wird.
1 0. System nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass vom humanen Adenovirus Serotyp 5 abgeleitete Donorviren mit einer Deletion der nicht-essentiellen E3-Region verwendet werden.
1 1 . System nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorvirus zwei Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase der Int-Familie vorliegen.
2. System nach einem der Ansprüche 1 bis 1 0, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorvirus zwei Erkennungsstellen für die Cre-Rekombinase vorliegen.
3. Ein vom humanen Adenovirus Serotyp 5 abgeleitetes rekombinantes Virus, dadurch gekennzeichnet, dass es
(a) eine Deletion der E1 -Region,
(b) eine Deletion der E3-Region und (c) ein partiell deletiertes virales Verpackungssignal enthält,
(d) das von parallel orientierten Erkennungsstellen für die Cre-Rekombinase umrahmt ist.
4. Ein rekombinantes Virus nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass das partiell deletierte virale Verpackungssignal die A repeats l-V enthält.
5. Ein rekombinantes Virus nach Anspruch 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass das partiell deletierte virale Verpackungssignal die A repeats I, II, VI und VII enthält.
6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Donorplasmid verwendet wird, das (a) einen bakteriellen Replikationsursprung, (b) ein bakterielles Resistenzgen,
(c) eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase,
(d) ein vollständiges virales Verpackungssignal sowie
(e) eine Insertionsstelle für Fremd-DNA bzw. Fremd-DNA enthält.
7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Donorplasmid verwendet wird, das (a) einen bakteriellen Replikationsursprung,
(b) ein bakterielles Resistenzgen,
(c) eine Erkennungsstelle für die ortsspezifische Rekombinase,
(d) ein virale ITR,
(e) ein vollständiges virales Verpackungssignal, (f) eine Insertionsstelle für Fremd-DNA bzw. Fremd-DNA und
(g) zwei Erkennungsstellen für eine selten schneidende
Restriktionsendonuklease enthält.
8. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Donorplasmid verwendet wird, das
(a) einen bakteriellen Replikationsursprung,
(b) ein bakterielles Resistenzgen, (c) zwei Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase,
(d) ein vollständiges virales Verpackungssignal sowie
(e) eine Insertionsstelle für Fremd-DNA bzw. Fremd-DNA enthält.
9. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 1 6 bis 1 8, dadurch gekennzeichnet. dass im Donorplasmid das vollständige Verpackungssignal von Adenovirus Serotyp 5 vorliegt.
20. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie 1 6 bis 1 9, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorplasmid eine oder zwei Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase der Int-Familie vorliegen.
21 . System nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorplasmid eine oder zwei Erkennungsstellen für die Cre-Rekombinase vorliegen.
22. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 1 7 oder 1 9 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass im Donorplasmid Erkennungsstellen für eine selten schneidende Restriktionsendonuklease mit einer mehr als 8 Bp langen Erkennungssequenz vorliegen.
23. System nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorplasmid Erkennungsstellen für die selten schneidende Restriktionsendonuklease I-Scel vorliegen .
24. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 1 7 oder 1 9 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass im Donorplasmid das 5'ITR von Adenovirus Serotyp 5 vorliegt.
25. Donorplasmide zum Einsatz in einem System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 1 6 bis 24.
26. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszelllinie eine ortsspezifische Rekombinase der Int-Familie exprimiert.
27. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszelllinie neben der ortsspezifischen Rekombinase auch das/die gegebenenfalls im Donorvirus deletierte(n) essentielle(n) virale(n) Gen(n) zur Verfügung stellt.
28. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 26 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Verpackungszelllinie die Cre-Rekombinase exprimiert und die E1 -Genprodukte von Adenovirus Serotyp 5 zur Verfügung stellt.
29. System nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 26 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass als Verpackungszelllinie die Zelllinie CIN 1004 verwendet wird .
30. Verwendung der Zelllinie CIN 1004 zur Herstellung klonaler oder komplexer Populationen rekombinanter Adenoviren.
31 . System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine klonale Population des Donorplasmids eingesetzt wird, bei der als Fremd-DNA eine Expressionskassette vorliegt, die
(a) einen Promotor,
(b) den offenen Leserahmen eines Gens,
(c) ein Polydenylierungssignal, (d) gegebenenfalls mindestens einen Insulator,
(e) gegebenenfalls mindestens ein Intron und
(f) gegebenenfalls mindestens einen Enhancer enthält.
32. System nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass eine komplexe Population des Donorplasmids eingesetzt wird, bei der als Fremd-DNA ein Gemisch unterschiedlicher DNA-Sequenzen vorliegt.
33. System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch nicht-kodierender DNA-Sequenzen vorliegt.
34. System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch kodierender DNA-Sequenzen vorliegt.
35. System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch von Expressionseinheiten vorliegt, bei denen unterschiedliche kodierende DNA-Sequenzen unter der Kontrolle des gleichen Promotors und Polyadenylierungssignals vorliegen.
36. System nach Anspruch 32 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass als Gemisch kodierender Sequenzen eine cDNA-Bank vorliegt.
37. System nach Anspruch 32 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass als Gemisch kodierender Sequenzen ein Gemisch von Varianten eines einzelnen Gens vorliegt, die sich mindestens in einzelnen Basenpaarpositionen unterscheiden, und/oder Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar aufweisen.
38. System nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch von Expressionseinheiten vorliegt, bei denen unterschiedliche Promotoren, die sich mindestens in einer Bp-Position unterscheiden und/oder Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar aufweisen, die Expression der gleichen kodierenden DNA-Sequenz kontrollieren.
39. Verfahren zur Herstellung rekombinanter Adenoviren umfassend die Schritte
(a) Bereitstellen eines Donorvirus mit einem zumindest partiell deletierten viralen Verpackungssignal, das von zwei Erkennungsstellen für eine ortsspezifische Rekombinase umrahmt wird, (b) Infizieren einer Verpackungszellline, die die ortsspezifische
Rekombinase exprimiert, mit dem Donorvirus,
(c) Bilden eines Donorvirus-Akzeptorsubstrat durch Einwirkung der ortsspezifischen Rekombinase auf den Donorvirus,
(d) Transfektion von Donorplasmiden, welche eine oder zwei Erkennungsstellen für die ortsspezifische Rekombinase, das vollständige virale Verpackungssignal und Insertionsstellen für Fremd-DNA bzw. insertierte Fremd-DNA enthalten, in die Donorvirus-infizierte Verpackungszelllinie und
(e) Bilden von rekombinanten Adenoviren durch Einwirkung der ortsspezifischen Rekombinase.
40. Verfahren nach Anspruch 39 zur Herstellung einer klonalen Population von rekombinanten Adenoviren.
41. Verfahren nach Anspruch 39 zur Herstellung einer komplexen Population von rekombinanten Adenoviren.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 41, weiterhin umfassen den Schritt
(f) Vermehrung der rekombinanten Adenoviren.
43. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Vermehrung auf Zellen erfolgt, die die ortsspezifische Rekombinase exprimieren.
44. Verfahren nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass die Vermehrung auf Zellen erfolgt, die die ortsspezifische Rekombinase exprimieren.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 44, weiterhin umfassend den Schritt
(g) Reinigung der rekombinanten Adenoviren durch D ichteg rad ienten -Zentrif ug ati o n o d er Affinitätschromatographie.
46. Rekombinante Adenoviren-Population erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 39 bis 45 oder unter Verwendung eines Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 12, 16 bis 24, 26 bis 29 oder 31 bis 38.
47. Rekombinante Adenoviren-Population nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine klonale Population handelt.
48. Rekombinante Adenoviren-Population nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine komplexe Population handelt.
49. Klonale Adenovirus-Population nach Anspruch 47, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA eine Expressionskassette vorliegt, die
(a) einen Promotor,
(b) einen offenen Leserahmen eines Gens,
(c) ein Polydenylierungssignal,
(d) gegebenenfalls mindestens einen Insulator, (e) gegebenenfalls mindestens ein Intron und
(f) gegebenenfalls mindestens einen Enhancer enthält.
50. Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch unterschiedlicher DNA-Sequenzen vorliegt.
51 . Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch nicht-kodierender DNA-Sequenzen vorliegt.
52. Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch kodierender DNA-Sequenzen vorliegt.
53. Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch von Expressionseinheiten vorliegt, bei denen unterschiedliche kodierende DNA-Sequenzen unter der Kontrolle des gleichen Promotors und Polyadenylierungssignals vorliegen.
54. Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Gemisch kodierender Sequenzen eine cDNA-Bank vorliegt.
55. Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Gemisch kodierender Sequenzen ein Gemisch von Varianten eines einzelnen Gens vorliegt, die sich mindestens in einzelnen
Basenpaarpositionen unterscheiden, und/oder Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar aufweisen.
56. Komplexe Adenovirus-Population nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass als Fremd-DNA ein Gemisch von Expressionseinheiten vorliegt, bei denen unterschiedliche Promotoren, die sich mindestens in einer Bp-Position unterschieden, und/oder Insertionen oder Deletionen von mindestens einem Basenpaar aufweisen, die Expression der gleichen kodierenden DNA-Sequenz kontrollieren.
57. Verwendung einer rekombinanten Adenoviren-Population nach einem der Ansprüche 46 bis 56 für den Transfer von genetischem Material in Zellen oder/und Tiere, insbesondere in menschliche Zellen oder/und den Menschen .
58. Verwendung nach Anspruch 57 für den Gentransfer und die Expression von Genen in Zellen.
59. Verwendung nach Anspruch 57 für den Transfer von genetischem Material in Tiere oder/und Menschen für Gentherapie oder/und
Vakzinierung .
60. Verwendung nach einem der Ansprüche 57 bis 59 für den Gentransfer in Zellen oder Zellkomplexe, die veränderte, insbesondere krankhafte Erscheinungen aufweisen.
61 . Verwendung nach Anspruch 60 zur Therapie von ererbten, erworbenen oder malignen Erkrankungen.
62. Verwendung nach einem der Ansprüche 57 bis 60 für die DNA-Vakzinierung, insbesondere für die Vakzinierung gegen Pathogene, wie etwa Viren, Bakterien, sowie eukaryontische Ein- oder Mehrzeller oder für die Vakzinierung gegen maligne oder nichtmaligne Zellen bzw. Zellpopulationen.
63. Verwendung einer komplexen Population rekombinanter Adenoviren nach Anspruch 53 oder 54 zur Isolierung gegebenenfalls neuer Gene, die in einem zeilbasierten Testsystem einen bestimmten Phänotyp hervorrufen.
64. Verwendung einer komplexen Population rekombinanter Adenoviren nach Anspruch 55 zur Isolierung von Varianten eines Gens mit veränderten Eigenschaften.
65. Verwendung einer komplexen Population rekombinanter Adenoviren nach Anspruch 56 zur Isolierung von Varianten eines Promotors mit veränderten Eigenschaften.
66. Verwendung einer komplexen Population rekombinanter Adenoviren nach Anspruch 51 zur Isolierung von Sequenzen mit bestimmten Bindungsstellen für Proteine.
67. Verfahren zur Herstellung von Masterplatten mit klonalen oder wenig komplexen Subpopulationen aus einer komplexen Population von Adenoviren, umfassend
(a) die Titration der komplexen Population rekombinanter Adenoviren, (b) die Infektion von in Multititerplatten kultivierten
Produzentenzellen mit nur einem oder wenigen infektiösen Partikeln der rekombinanten Adenovirus-Population pro Multititerplatten-Vertiefung,
(c) die Lyse der Produzentenzellen in der Multititerplatte nach Auftreten des zytopathischen Effekts und
(d) die Lagerung der Masterplatten in eingefrorenem Zustand.
68. Masterplatten erhältlich mit einem Verfahren nach Anspruch 67.
69. Verfahren zur Identifizierung von klonalen oder wenig komplexen Subpopulationen aus einer komplexen Population von Adenoviren, die in einem zellbasierten Testsystem einen bestimmten nachweisbaren Phänotyp hervorrufen, umfassend
(a) die Verwendung der virushaltigen Überstände der lysierten Zellen in Masterplatten, die gemäß einem Verfahren nach
Anspruch 67 erhältlich sind, zur Infektion der Zellen des funktionellen Testsystems,
(b) die Durchführung des funktionellen Tests mit den infizierten Zellen des Testsystems und (c) die Identifizierung der Vertiefung(en) der Masterplatte, die
Viren mit den gewünschten funktionellen Eigenschaften enthält/enthalten.
70. Verfahren nach Anspruch 69, weiterhin umfassend
(d) die klonale Vereinzelung der rekombinanten Adenoviren durch Piaque assay auf einer Produzentenzelllinie, (e) die Anzucht der so gewonnenen klonalen rekombinanten
Adenovirus-Population und die Charakterisierung der in ihr enthaltenen Fremd-DNA.
71 . Verwendung von Masterplatten, die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 67 erhältlich sind oder/und einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 69 oder 70 zur Isolierung gegebenenfalls neuer Gene, die in dem zeilbasierten Testsystem einen bestimmten Phänotyp hervorrufen.
72. Verwendung von Masterplatten, die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 67 erhältlich sind oder/und einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 69 oder 70 zur Isolierung von Varianten eines Gens mit veränderten Eigenschaften.
73. Verwendung von Masterplatten, die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 67 erhältlich sind oder/und einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 69 oder 70 zur Isolierung von Varianten eines Promotors mit veränderten Eigenschaften.
74. Verwendung von Masterplatten, die gemäß einem Verfahren nach Anspruch 67 erhältlich sind oder/und einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 69 oder 70 zur Isolierung von Sequenzen mit bestimmten Bindungsstellen für Proteine.
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