AT405292B

AT405292B - Rekombinante poxviren mit fremd-dna in essentiellen regionen

Info

Publication number: AT405292B
Application number: AT0075295A
Authority: AT
Inventors: Falko-Guenter Dr Falkner; Georg Dipl Ing Holzer; Friedrich Dr Dorner
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-05-02
Publication date: 1999-06-25
Also published as: US5770212A; ATE298370T1; AU694519B2; DE69534289D1; EP0758397B1; EP0758397A1; JP3911010B2; US5766882A; CA2188447C; JPH09512707A; WO1995030018A2; DE69534289T2; CA2188447A1; DK0758397T3; WO1995030018A3; ATA75295A; ES2243937T3; AU2523095A

Description

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Rekombinante Poxviren finden Verwendung als Vektoren für die Expression von Fremdgenen aus einer Vielzahl von Quellen, wie z.B. Tieren, Pflanzen, Protozoen, Pilzen, Bakterien und Viren. Zusätzlich können rekombinante Poxviren zur Expression chimärer Gene und Gene von synthetischer Herkunft eingesetzt werden. Typischerweise sind Chimäre Gene und synthetische Gene DNA-Sequenzen, die von natürlich vorkommenden Sequenzen abgeleitet sind, oder auf solchen beruhen. Zum Beispiel können aus RNA-Transkripten, einschließlich solcher aus Retroviren, erzeugte cDNA-Sequenzen mit rekombinanten Poxvirusvektoren exprimiert werden.

Die gegenwärtig in Gebrauch befindlichen Poxvirusvektoren enthalten Fremd-DNA, die in genomische Regionen eingefügt sind, welche nicht für die Vermehrungsfähigkeit des Virus essentiell sind. Diese Fremdgene exprimierenden Poxviren werden üblicherweise durch Insertion der Fremdsequenzen in die genomischen Regionen, die für das Wachstum des Virus in der Zellkultur nicht essentiell sind, durch homologe Rekombination hergestellt. Siehe Panicali und Paoletti, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 79: 4927-31 (1982). Mackett et al, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 79: 7415-19 (1982). Vorzugsweise können rekombinante Poxviren durch direkte molekulare Klonierung konstruiert werden. Siehe EP 0 561 034; Schleifinger et al, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA, 89: 9977-81 (1992); Merchlinsky und Moss, Virol 190: 522-26 (1992). Viren mit in nicht-essentielle Regionen eingefügter Fremd-DNA können autonom in ihrem Wirtsorganismus wachsen und bleiben daher für ihre entsprechenden Wirte infektiös.

Das Fehlen der Produkte der nicht-essentiellen Regionen verschlechtert praktisch nicht die Vermehrungsfähigkeit des rekombinanten Poxvirus. Bei Vaccinia, das man oft als den Prototyp eines Poxvirus ansieht, ist eine der wichtigsten nicht-essentiellen Regionen für die Insertion das Thymidinkinasegen. Wird ein Fremdgen in das Vaccinia-Thymidinkinasegen eingefügt, geht dem Virus das Genprodukt verloren. Trotzdem ist das rekombinante Vaccinia noch lebensfähig. Andere Poxviren sind ebenfalls ähnlichen Manipulationen in anderen nicht-essentiellen Regionen zugänglich. Zum Beispiel wurde ein rekombinantes Avipox, wie Fowlpox, entwickelt, worin Fremd-DNA in nicht-essentielle Regionen eingefügt wurde.

Rekombinantes Vaccinia kann als Lebendimpfstoff in großmaßstäblichen Expressionssystemen und für eine Vielzahl anderer Zwecke eingesetzt werden. Siehe Miner & Hruby, TiBTECH 8: 20-25 (1990). Die Verwendung dieser rekombinanten Viren für die großmaßstäbliche Expression von Proteinen birgt jedoch ein deutliches Risiko, da die Viren ihre Infektiosität beibehalten. Demnach sind teure Vorsorgemaßnahmen und aufwendige Prozeduren bei der Handhabung von rekombinantem Vaccinia erforderlich. Es ist z.B. eine Hitzeinaktivierung aller Medien, Flüssigkeiten und des kontaminierten Laborgeräts, wie auch ein spezielles Training für das mit dem Virus umgehende Laborpersonal erforderlich. Mehrere Wege wurden zur Minimierung der Notwendigkeit für diese ausgeklügelten Vorsorgemaßnahmen vorgeschlagen. Zum Beispiel wurden hochabgeschwächte Vaccinia-Stämme entwickelt. Diese hochabgeschwächten Stämme haben eine eingeschränkte Infektiosität. Demnach wurde die Produktion von Proteinen mit diesen hochabgeschwächten Stämmen versucht. Leider zeigen hochabgeschwächte Virus-Stämme ein langsames und begrenztes Wachstum, welches sie oft ungeeignet für die Proteinproduktion in großem Maßstab macht.

Zusätzlich zu den hochabgeschwächten Poxviren kennt man Defektstämme anderer Viren. Zum Beispiel können defekte Retroviren in Helferzellinien, die zur Komplementierung des defekten Virus in der Lage sind, vermehrt werden. Siehe Kriegler, GENE TRANSFER AND EXPRESSION (Stockton Press, 1990, 33-39); Mann et al, Cell 33: 153-59 (1983). Retroviren sind aber kleine, RNA-enthaltende Viren, die sich durch Integration in das Genom der Wirtzelle vermehren, was diese Viren ungeeignet zur Verwendung als Expressionsvektoren oder Impfstoffe macht. In komplementierenden Zellen vermehrte defekte Adenoviren wurden als Impfstoffe verwendet, wie beschrieben bei Eloit et al, J. Gen. Virol. 71:, 2425-31, (1990). Adenoviren sind doppelsträngige DNA-Viren, die sich, im Gegensatz zum Vaccinia-Virus, im Kern von infizierten Zellen vermehren und ein enges Wirtsspektrum haben. Ferner wurde das Wachstum von defektem Herpesvirus in Helferzellen ebenfalls beschrieben. Siehe PCT Publikationen WO 94/03595, WO 94/21807 und WO 92/05263. Das Herpesvirus vermehrt sich ebenfalls im Kern von infizierten Zellen. Nackte Herpes-DNA ist wie die Adenovirus-DNA infektiös. Folglich funktionieren die Promotoren dieser Viren normal in der Wirtszelle. Im Gegensatz zu Poxviren sind Herpesviren und Adenoviren Kernviren. Von Kernviren abgeleitete, defekte Viren besitzen jedoch die Möglichkeit, ihr defektes Gen durch homologe Rekombination aus der Wirtszelle wieder herzustellen. Solche rekombinanten Vorkommnisse sind unerwünscht und gefährlich, da das defekte Virus möglicherweise zum Wildtypstatus zurückkehren kann, was zu einer erhöhten Infektiosität und Virulenz wie auch zum Verlust des eingefügten Fremdgens führt.

In der EP 0 397 560 wird ein modifizierter Entomopoxvirus-Vektor beschrieben, der eine Insertion eines Fremdgenes in einer nicht-essentiellen Genregion des Virus enthält. Die nicht-essentielle Genregion ist das Spheroidin-Gen, das für das Viruswachstum nicht benötigt wird. Das Spheroidin-Gen wurde ausgewählt, da es einen besonders starken Promotor im Entomopoxvirus-Expressionssystem erheblich steigert. Zum Screenen von rekombinanten Viren wurde ein Markergen wie z.B. ß-Galaktosidase unter die transkriptionelle 2

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Kontrolle des starken Spheroidin-Promotors kloniert.

Die EP 0 538 496 offenbart ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Fowlpox-Virus (FPV), bei dem eine intergenische Region zwischen dem FPV TK-Gen und einem 3' ORF als Insertionsstelle für Fremd-DNA dient. Da für die Inserierung von Fremd-DNA in das FPV TK-Gen zur Herstellung von 5 rekombinanten FPV das Problem bestand, daß diese Klone instabil waren, wurde eine nicht-essentielle intergenische Region 3'-seitig des FPV TK-Gens als Insertionsstelle ausgewählt. Dazu wurde ein Plasmid konstruiert, das die intergenische Region sowie zusätzliche Sequenzen, wie etwa das W-TK-Gen und ein Markergen, enthält, und durch in vivo Rekombination modifizierte FPV hergestellt. Das W-TK-Gen diente dann wiederum als Insertionsstelle im rekombinanten FPV, wodurch die FPV-TK-Genfunktion unbeeinträch-70 tigt war und stabile, lebensfähige Klone erhalten wurden. In der EP 0 538 496 werden an keiner Stelle in einer essentiellen Region defekte Poxviren beschrieben.

In den WO 90/12101 und WO 92/07944 werden rekombinante Vaccinia Virus-Vektoren beschrieben, bei denen ein oder mehrere Sequenzen des viralen Genoms deletiert, durch Mutation oder Insertion inaktiviert oder verändert ist (sind). Die Nukleotidsequenzen, die deletiert, inaktiviert oder verändert sind, und als 75 Insertionsstelle für Fremd-DNA eingesetzt werden können, sind dabei abgeleitet von ORFs mit der

Bezeichnung Sal F 3R, Sal F 9R, Sal F 13R, B 5R und Sal F 15R (WO 90/12101) und B15R, B18R und Sal L 4R (WO 92/07944). Diese genannten Genregionen, in die die Fremd-DNA inseriert werden kann, sind aber allesamt als nicht-essentielle Genregionen beschrieben,

Aufgrund des Bedürfnisses nach sicheren rekombinanten Expressionssystemen und Impfstoffen sind 20 erfinderische Wege notwendig, um grundlegend verschiedene rekombinante Poxviren gentechnisch herzustellen. Der hier beschriebene Weg umfaßt die Insertion eines Fremdgens in eine essentielle Region des Poxvirus ein. Der Verlust des Genprodukts aus dieser essentiellen Region im Poxvirus wird durch das gleiche oder ein ähnliches Produkt aus anderen Quellen, wie den rekombinanten Wirtszellen, Helfervirus oder transgenen Tieren, komplementiert. 25 Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, rekombinante Poxviren zur Verfügung zu stellen, die zur Expression von fremden Polynukleotiden, wie genomischer DNA oder cDNA, in der Lage sind.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, rekombinante Poxviren zur Verfügung zu stellen, die aufgrund einer fehlenden Funktion, kodiert von einer essentiellen Region des Poxvirus-Genoms, defekt sind.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, defekte Poxviren zur Verfügung zu stellen, die in essentielle 30 Regionen des Poxvirusgenoms inseriert fremde Polynukleotide besitzen.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, defekte Poxviren zur Verfügung zu stellen, bei denen eine essentielle Region in ihrer Gesamtheit oder ein Teil davon, deletiert ist.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, defekte Poxviren zur Verfügung zu stellen, die als Impfstoffe eingesetzt werden können. 35 Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Wirtszellen, Helfervirus oder transgene Tiere zur Verfügung zu stellen, die die verlorengegangene Funktion eines defekten Poxvirus komplementieren können.

Zur Durchführung dieser und anderer erfindungsgemäßer Aufgaben werden gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt rekombinante Poxviren zur Verfügung gestellt, welche in einer essentiellen Region auf 4o ihrem Ausgangs-Poxvirus, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität des Virus notwendig ist, ein fremdes Polynukleotid, das nicht natürlicherweise im Poxvirus vorkommt, unter transkriptionaler Kontrolle eines Promotors enthält, wobei das Fremd-Polynukleotid für ein Antigen, abgeleitet von Pflanzen, Tieren, Protozoen, Pilzen, Bakterien oder Viren, kodiert. Das heißt, das defekte Poxvirus ist von einem Ausgangs-Poxvirus abgeleitet, jedoch fehlt ihm eine Funktion, die normalerweise beim Ausgangs-Poxvirus vorhanden 45 ist.

Vorzugsweise stellt die essentielle Region einen offenen Leserahmen dar, der für ein für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiösität des Virus notwendiges Protein kodiert. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Poxvirus zeichnet sich dadurch aus, daß es einen Defekt in der Vermehrungsfähigkeit oder Infektiösität bei einem natürlich vorkommenden Wirt aufweist. so Der Promotor sollte mit Enzymen des defekten Poxvirus oder innerhalb des infizierten Wirts funktionsfähig sein. Solche Promotoren schließen Poxviruspromotoren und auf Poxviruspromotoren basierende Promotoren sowie synthetische Promotoren ein. Das fremde Polynukleotid kann in die essentielle Region inseriert sein oder diese ganz oder teilweise ersetzen.

Zusätzlich kann ein Marker die essentielle Region vor der Insertion des fremden Polynukleotids in das 55 Virus ersetzen. Das fremde Polynukleotid kann dann in den Marker eingefügt werden oder diesen ersetzen. Vorzugsweise ist das Ausgangspoxvirus Vaccinia und die essentiellen Funktionen, die verloren gehen sollen, werden kodiert durch die die offenen Leserahmen I7L, F18R, D13L, D6R, A8L, H4L, J1R, J3R, A10L und A3L oder die offenen Leserahmen, die ein 14 Kilodalton Hüllprotein oder ein 25 Kilodalton Strukturpro- 3

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Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden Zellinien, transgene Tiere und Helferviren zur Verfügung gestellt, die die Fähigkeit zur Komplementierung für eine verlorengegangene Funktion eines erfindungsgemäßen Poxvirus besitzen. Die Fähigkeit zur Komplementierung beruht auf dem exprimierbaren Einbau eines Gens, das für ein Produkt kodiert, welches die verlorengegangene Funktion des rekombinan-ten Virus komplementiert.

Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins zur Verfügung gestellt, umfassend die Schritte der Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Poxvirus, der Infektion einer zur Komplementierung geeigneter Zellinie mit dem Poxvirus, der Züchtung der infizierten Zellen unter Bedingungen, die eine Expression des Fremdpolynukleotids erlauben und dem Isolieren des exprimierten Proteins. Der Promotor, unter dessen transkriptionaler Kontrolle das Protein steht, sollte mit dem defekten Poxvirus oder infizierten Wirt funktionsfähig sein; solche Promotoren umfassen Poxviruspromotoren. Das Fremd-Polynukleotid kann in die essentielle Region des Ausgangspoxvirus eingefügt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Marker, wie z.B. das gpt-Gen, das lac Z-Gen oder das hph-Gen, die essentielle Region ganz oder teilweise ersetzen, und das Polynukleotid kann seinerseits in den Marker eingefügt werden oder diesen ganz oder teilweise ersetzen. Ein Verlust der Markerfunktion bedeutet, daß das Polynukleotid in das defekte Poxvirus eingebaut wurde.

Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt werden Impfstoffe zur Verfügung gestellt, die erfindungsgemäße Poxviren umfassen. Diese Poxviren enthalten Polynukleotide, die Antigene gegen Pathogene kodieren. Die Poxviren für die erfindungsgemäßen Impfstoffe können auf dieselbe oder ähnliche Weise wie andere defekte Poxviren gemäß der Erfindung konstruiert werden.

Diese und andere hierin offenbarte Aspekte der Erfindung werden dem Fachmann im Hinblick auf die hier enthaltene Offenbarung deutlich.

Fig. 1 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pRSET-l7L.

Fig. 2 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pSV-l7L-EDH.

Fig. 3 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pCR-l7Lf-ZG.

Fig. 4 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pRSET-A8L-3'/2.

Fig. 5 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pSV-A8L-EDH.

Fig. 6 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pCR-A8Lf-ZG.

Fig. 7 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pRSET-D6R und pRSET-D6R-3'.

Fig. 8 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pSV-D6R-EDH.

Fig. 9 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pCR-D6Rf-ZG.

Fig. 10 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pRSET-J1R.

Fig. 11 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pSV-JlR-EDH.

Fig. 12 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pCR-J1R-ZG.

Fig. 13 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pSV-H4L-EDH. .

Fig. 14 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pCR-H4Lf-ZG.

Fig. 15 zeigt schematisch die Konstruktion von Plasmid pHS-17L.

Die Erfindung betrifft in einem Aspekt die Verwendung defekter Poxviren für die Herstellung von Proteinen. Ein "defektes Poxvirus" gemäß der Erfindung ist ein Poxvirus, dem eine Funktion, kodiert auf einer essentiellen genomischen Region eines Ausgangspoxvirus, auf dem das defekte Poxvirus basiert, fehlt; als Konsequenz ist das defekte Poxvirus ohne Komplementierung der verlorengegangenen Funktion durch eine andere Quelle nicht vermehrungsfähig oder nicht infektiös.

Eine "essentielle Region" ist eine Region auf dem Poxvirusgenom, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität des Ausgangspoxvirus notwendig ist. Der Begriff "Komplementierung" bedeutet die Wiederherstellung einer verlorengegangenen Funktion durch eine andere Quelle, wie eine Wirtszelle, ein transgenes Tier oder ein Helfervirus. Daher ist ein defektes Poxvirus eine nichtvermehrungsfähige oder nichtinfektiöse Form eines Ausgangsvirus und kann bei Vorliegen der Komplementierung vermehrungsfähig oder infektiös werden.

Ein Ausgangspoxvirus kann ein natürlich vorkommendes Poxvirus oder ein hiervon abgeleitetes Poxvirus sein. Vorzugsweise ist das Ausgangspoxvirus ein schnellwachsendes Wildtyp-Virus, wie der Western-Reserve ("WR")-Stamm von Vaccinia oder verwandten Stämmen.

Ein defektes Virus stammt von Ausgangspoxviren, wie natürlich vorkommenden Poxviren oder von natürlich vorkommenden Poxviren abgeleiteten Poxviren. Diese abgeleiteten Poxviren zur Verwendung als Ausgangspoxviren können durch Verfahren, wie z.B. der Gentechnik, über regionspezifische oder ortsspezifische Mutagenese, in vivo Rekombination, Passagierung des Virus durch Wirtszellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Mutagenen, und alle obigen Kombinationen erhalten werden. Ein defektes Poxvirus kann auf jedem Typ eines Poxvirus beruhen, bei dem ein Defekt in einer essentiellen Region eingeführt werden 4

AT 405 292 B kann. Das defekte Poxvirus kann als Expressionssystem für Proteine verwendet werden. Die durch die erfindungsgemäßen defekten Poxviren hergestellten Proteine werden durch Fremd-Polynukleotide kodiert, z.B. Gene für cDNA-Versionen von RNA-Transkripten. Der Begriff "Fremd-Polynukleotid" bedeutet ein Polynukleotid, das normalerweise im Ausgangspoxvirus, auf dem der defekte Poxvirus beruht, nicht vorhanden ist, oder ist ein Polynukleotid, das an einem unterschiedlichen Ort oder in einer unterschiedlichen Form als man sie im Ausgangspoxvirus, auf dem das defekte Poxvirus beruht, finden würde, vorliegt. Die fremden Polynukleotide können von einer Vielzahl von Quellen, wie Tieren, Pflanzen, Protozoen, Pilzen, Bakterien und Viren stammen.

Ein defektes Poxvirus gemäß der Erfindung kann einen Promotor umfassen, der mit dem defekten Poxvirus oder mit dem durch den defekten Poxvirus infizierten Wirt funktionsfähig ist, um die Transkription des fremden DNA-Polynukleotids innerhalb des defekten Poxvirus zu kontrollieren. Der Begriff "Promotor" betrifft eine Polynukleotid-Sequenz, die die Transkription einleiten und/oder steuern kann. Jeder Promotor, der mit dem defekten Poxvirus oder innerhalb des infizierten Wirts funktionsfähig ist, kann erfindungsgemäß verwendet werden. "Funktionsfähigkeit" bedeutet die Erkennbarkeit oder Ablesbarkeit des Promotors durch transkriptionale Enzyme. Typischerweise sind die Promotoren Poxvirus-Promotoren oder synthetische Promotoren, beruhend auf Promotoren mit Poxvirusursprung.

Ein defektes Virus kann mindestens ein fremdes Polynukleotid in eine essentielle Region des Poxvirus inseriert haben. Ein Promotor kann mit dem fremden Polynukleotid so verknüpft werden, daß der Promotor zusammen mit dem Polynukleotid eingefügt wird, so daß der Promotor eine transkriptionale Kontrolle über das Polynukleotid ausüben kann. Alternativ kann der Promotor zur Kontrolle der Transkription des fremden Polynukleotids bereits im defekten Poxvirus an einem Ort vorhanden sein, der dem Promotor die Kontrolle der Transkription des fremden Polynukleotids ermöglicht.

Die essentielle Region kann vollständig aus dem Genom des defekten Virus deletiert sein, so daß keine homologe Rekombination zwischen dem Genom der Komplementierungsquelle und des defekten Virus möglich ist. Ein defektes Virus mit einer solchen Deletion kann nur in Gegenwart der Komplementierungsquelle wachsen, wie einer Helferzellinie, die die Funktion der essentiellen Region im Gegenzug übernimmt. Reine Stocklösungen von defektem Virus können in der Helferzellinie vermehrt werden, und Vermehrung in normalen Zellen und Organismen bleibt unmöglich. Das Wirtsspektrum dieses Virustyps kann auf Helferzel-linien eingeschränkt werden, die spezifisch gentechnisch verändert wurden, um den Defekt des defekten Virus zu komplementieren.

Ein Markergen kann zum Ersatz einer essentiellen Region in dem defekten Poxvirus eingesetzt werden. Das fremde Polynukleotid kann dann in den Marker eingefügt oder den Marker durch homologe Rekombination ganz oder teilweise ersetzen. Dieser Weg liefert ein Selektionssystem für Poxviren, die die fraglichen Inserts enthalten. Ein solcher Marker ist das gpt-Gen, das für die reverse gpt-Selektion in einer komplementierenden Zellinie, wie A9-Zellen (Derivate von Maus LM(TK-)Zellen) oder STO-Zellen (die gegen 6-Thioguanin resistent sind, was eine reverse gpt-Selektion erlaubt) verwendet werden kann. Dieses System bietet einen schnellen und wirksamen Weg zum Erhalt von reinen Stocklösungen des erwünschten defekten Virus. Viele Plaque-Reinigungsrunden, die üblicherweise für den Erhalt reiner Stocklösungen notwendig sind, werden durch aktives Abtöten des Wildtyp-Virus vermieden , was durch dominante Selektionsverfahren, wie die gpt-Selektion, nicht erreicht wird.

Die Erfindung ist für die Expression von Proteinen im großen Maßstab nutzbar. Die erfindungsgemäßen defekten Poxviren können auch für Impfzwecke eingesetzt werden. Wird z.B. ein geeignetes essentielles Gen inaktiviert, behalten die defekten Viren immer noch ihre Fähigkeit zur Penetration in Zellen und leiten einen abortiven (abbrechenden) Vermehrungszyklus ein. Ein solches Gen würde daher eines sein, das spät im Vermehrungszyklus erforderlich ist, und daher ist das Virus immer noch zur Vermehrung seiner DNA, möglicherweise in Form unreifer Partikel, und zur Expression seiner genomischen Information, die das Fremd-Polynukleotid umfaßt, in der Lage. Diesbezüglich könnten diese defekten Viren die Wirkung von "toten Lebendimpfstoffen" (Taylor und Paoletti, Vaccine 6: 466-68 (1988)), haben. Ein defektes Poxvirus, das als Impfstoff verwendet wird, würde ein DNA-Polynukleotid umfassen, das ein Antigen kodiert. Antigene Sind Moleküle, die ein Organismus als fremd erkennt. Diese Antigene können eine Immunantwort in dem Organismus, der mit dem Antigen exponiert ist, auslösen. Antigene umfassen Proteine bakteriellen, viralen, fungalen und protozoalen Ursprungs. Ein bevorzugter Ausgangs-Vacciniastamm für die Konstruktion von defekten Viren zur Verwendung als Impfstoffe würden Impfstämme sein, wie der Stamm der New-York-City-Department-of-Health Laboratories (ATCC VR-325).

Die erfindungsgemäßen defekten Poxviren können in Wirtszellen vermehrt werden, die die verlorengegangene essentielle Funktion des defekten Virus komplementieren. Typischerweise stammen diese Wirtszellen von Zeilinien, die spezifisch dahingehend verändert wurden, die verlorengegangene Funktion zu komplementieren. Typischerweise ist bei der Wirtszelle die gleiche oder eine ähnliche essentielle Region 5

AT 405 292 B des Poxvirus eingefügt, so daß die essentielle Region durch die Wirtszelle exprimiert wird, oder die essentielle Region in der Zelle ist bei Infektion der Wirtszelle induzierbar.

Die für die Komplementierung und anschließende Virusproduktion und Proteinproduktion ausgewählte Zellinie sollte leicht handhabbar sein, eine Virusplaque-Bildung erlauben, und die Durchführung aller s Schritte, die für die Funktionalität des Produktes erforderlich sind, zulassen. Verozellen (ATCC Nr. CCL 81) und Maus-LM(TK-)-Zellen genügen diesen Anforderungen und sind geeignete Wirte. Negative Selektion nach einem Virus, dem das TK-Gen fehlt, kann auf TK-negativen Verozellen erfolgen. TK-negative Verozellen werden erhalten durch wiederholtes Subklonieren der Zellinie in Gegenwart vom Bromdeoxyuri-din. Verozellen können zu hohen Zelldichten kultiviert werden, und wurden erfolgreich für die Produktion io von rekombinanten Proteinen eingesetzt (Barrett et al, AIDS Res. Hum. Retrovir. 5: 159-71 (1989)).

Die A9-Zellinie (ATCC CCL1.4), ein Derivat der Maus-LM(TK-)-Zellinie ist auch gegen 6-Thioguanin resistent, was eine reverse gpt-Selektion erlaubt, ein Merkmal, das für die Ausübung von direktem Selektionsdruck für die Isolierung von defektem Virus nutzbar ist. Isaacs et al, Virol. 178: 626-30 (1990).

Dominante Selektionsmarker, wie Hygromycin-Phosphotransferase- oder die Neomycin-Phosphotransfe-/5 rase-Gene werden zur Bewerkstelligung des Einbaus des komplementierenden Gens verwendet. Die Fremdgene können auf einem Plasmid verbunden werden, oder es können wahlweise Co-Transformations-prozeduren eingesetzt werden. Wigler et al, Cell 16: 777-785 (1979). Andere Selektionsmarker, wie das Herpes-simplex-Thymidinkinasegen, können bei den Maus-LM(TK-)-Zellen verwendet werden.

Der Promotor, der die essentielle Region des Poxvirus für die Komplementierung ("ein Komplementie-20 rungsagenz") kontrolliert, sollte in der entsprechenden Zellinie aktiv sein. Ein bevorzugter Promotor stammt aus SV40. SV40 hat einen starken konstitutiven Promotor, der in Maus-L-Zellen und Verozellen aktiv ist. Andere Promotoren, die üblicherweise zur Expression in permanenten Zellinien verwendet werden, umfassen den Actin-Promotor, Gunning Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 84: 4831-35 (1987) und den humanen Cytomegalovirus-Promotor, Boshart et al, Cell 41: 521-30 (1985), die beide ebenfalls erfindungsgemäß 25 eingesetzt werden können.

Ein Transkriptionssystem, das besonders für Vaccinia-infizierte Zellen geeignet ist, umfaßt den Promotor aus dem humanen 70 kD Hitzeschockprotein ("Hsp70") zusammen mit nichttranslatierten stromaufwärts gelegenen Regionen. Siehe Hunt and Morimoto, Proc Natt. Acad. Sei USA 82:6455059 (1985). Anders als bei der Expression vieler anderer Gene wird die Hsp70-Synthese nicht negativ durch die Abschaltung von 30 Vaccinia-Virus-Wirtsprotein in Vaccinia-infizierten Zellen beeinflußt. Siehe Jindal and Young, J. Virol. 66:5367-672 (1992).P

Ein weiterer zur Komplementierung geeigneter Wirt können murine Cl27l-Zellen (ATCC CRL 1616) oder Derivate davon sein, die mit Plasmiden transferiert sind, die bovine Papilloma-Virus (z.B. ATCC 37110)-Vektoren enthalten, die das komplementierende Poxvirusgen tragen. Um das Risiko einer homolo-35 gen Rekombination in diesem System zu minimieren, stammt das komplementierende Poxvirusgen vorzugsweise von einem anderen Genus als dem des Defektvirus. Bei dieser "Helfervirus"-Vorgehensweise wird das komplementierende Poxvirusgen nur bei Infektion der Wirtszelle mit dem defekten Poxvirus aktiviert. i

Andere Wirte, die zur Vermehrung defekter Poxviren verwendet werden können, umfassen Tiere, die für 40 das essentielle Vaccinia-Gen transgen sind (bezeichnet als "komplementierende transgene Tiere"). Solche Tiere können die komplementierende Funktion in jeder somatischen Zelle oder in einem bevorzugten Gewebe bereitstellen, was abhängig ist vom für die Expression des essentiellen Poxvirusgens im komplementierenden transgenen Tier gewählten Promotor. Die Tiere, vorzugsweise Mäuse, bilden sichere Modelle für Poxvirus-Infektionsuntersuchungen und verwandte Studien. Selektive Expression des Transgens in 45 einem definierten Organ kann auch gewebespezifische Genexpressionsuntersuchungen und/oder Studien über die selektive Funktion oder Dysfunktion eines bestimmten Organs erlauben.

Vorgehensweisen über die Erzeugung transgener Tiere sind im Stand der Technik bekannt. Zum Beispiel können transgene Tiere durch Mikroinjektion, Transformation von embryonischen Stammzellen oder Verwendung von retroviralen Vektoren hergestellt werden. Geeignete Techniken sind im einzelnen in so GENETIC ENGINEERING OF ANIMALS (Pühler ed., VCH, 1993) beschrieben.

Essentielle Genprodukte, die als komplementierende Agenzien geeignet sind, umfassen im allgemeinen Genprodukte, die spät im Vermehrungszyklus des Poxvirus erforderlich sind. Beispiele solcher Genprodukte sind solche, die bei der Morphogenese oder anderen Post-Replikationsereignissen beteiligt sind, wie auch Enzyme und regulatorische Proteine. 55 Ein essentielles Genprodukt, das ein geeignetes komplementierendes Agens darstellt, ist das 47-kDa-Protein (das "17-Protein”), kodiert durch den offenen Leserahmen ("orf") I7L, von dem man annimmt, daß es an der viralen Genomorganisation beteiligt ist. Kane und Shuman, J. Virol. 67: 2689-98 (1993). Das 17-Protein wird im Kernbereich des Virus verpackt. Es existiert eine temperaturempfindliche (ts) Mutation,

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AT 405 292 B bekannt als ts16. Condit et al, Viroi. 128: 429-43 (1983). Daher erfüllt das Gen ein klassisches Erfordernis für ein essentielles Gen, nämlich das Vorkommen einer konditional lethalen Mutante (Temperaturempfindlichkeit).

Von den essentiellen Genprodukten, die als komplementierende Agentien im vorliegenden Kontext geeignet sind, ist das durch den D13L orf kodierte 65kDa Protein. Dieses Protein wird spät in der Infektion exprimiert. Falls die Expression verhindert wird, bleibt die Replikation unbeeinflußt, während die virale Morphogenese in einem frühen Stadium blockiert ist. Siehe Zhang and Moss, Virol. 187: 643-53 (1992). Andere essentielle Genprodukte, die als komplementierende Agenzien geeignet sind, sind das Vaccinia 14kDa Hüllprotein, Lai et al, J. Biol. Chem. 265: 22174-80 (1990); das Vaccinia 25kDa Hauptstrukturprotein, Weir and Moss, J. Viroi. 56: 534-40 (1985); und andere Strukturproteine, wie P4a und P4b.

Ein weiteres essentielles Genprodukt, das als komplementierendes Agens verwendet werden kann, ist das 11kDa-Phosphoprotein, Wittek et al, J. Viroi. 49: 371-78 (1984), kodiert durch den F18R orf des WR-Wildtyp-Virus (bekannt als "F17R” des Kopenhagen-Stammes von Vaccinia). Siehe Goebel et al, Virol. 179: 247-66 (1990). Das durch den F18R orf kodierte 11 kDa-Phosphoprotein ist ein essentielles Genprodukt, das für die korrekte Virionanordnung erforderlich ist. Siehe Zhang und Moss, J. Virol. 65: 6101-10 (1991). Konditionale lethale Vaccinia-Mutanten in den F18R und F17R orfs bilden unter bestimmten Bedingungen unreife Partikel mit fehlerhaften internen Strukturen. F18R überlappt jedoch mit dem orf A und wäre daher im allgemeinen zunächst nicht eine essentielle Region von der ersten Wahl. Goebel et al, supra.

Enzyme und regulatorische Proteine können auch als komplementierende Agenzien eingesetzt werden, da diese Proteine nur in katalytischen Mengen vorhanden sein müssen, die leicht durch die komplementierende Zellinie bereitgestellt werden können. Die Untereinheiten des frühen Transkriptionsfaktors für Vacci-nia-Virus ("VETF") sind in diesem Zusammenhang geeignet. Der VETF ist für die Einleitung der Transkription von frühren Vaccinia-Genen essentiell. Vaccinia-RNA-Polymerase, der VETF fehlt, ist nicht zur Transkriptionsinitiation an frühen Vaccinia-Virus-Promotor-Sequenzen in vitro geeignet. Siehe Broyles et al, J. Biol. Chem. 263: 10754-60 (1988). Der Faktor ist ein Heterodimer mit einem 77kDa Polypeptid und einem 82kDa Polypeptid, die entsprechend durch die D6R und A8L Gen-orf des Vaccinia WR-Genoms kodiert werden. Siehe Gershon und Moss, Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA 87: 4401-05 (1990). VETF-Proteine werden spät bei der Infektion exprimiert und in die entstehenden Viruspartikel gepackt. Ein defektes Virus, dem das D6R oder das A8L Gen fehlt, das aus VETF exprimierenden Zellen isoliert wird, sollte daher in der Lage sein, einen zusätzlichen kompletten Vermehrungszyklus in einer nichtkomple-mentierenden Zellinie ohne weitere Einschränkungen der Proteinsynthese durchzuführen Die Proteinsynthese ist ein essentielles Erfordernis für die Verwendung solcher defekter Viren als "toten Lebendimpfstoffen". "Tote Lebendimpfstoffe" umfassen Avipoxviren, die Fremdgene exprimieren, welche zur Immunisierung von Säugerwirten eingesetzt werden In einem Säugerwirt vermehren sich die Viren nicht, sondern zeigen einen abbrechenden Vermehrungszyklus. Trotzdem stimuliert dieser Impftyp die Immunantwort bestimmter T-Zellen. Siehe Taylor und Paoletti, supra. Ein defektes Virus, dem VETF fehlt, ist wünschenswert, da es in der Lage sein sollte, im Gegensatz zu Viren, die nur zur Durchführung von abgebrochenen Vermehrungszyklen fähig sind, einen zusätzlichen Vermehrungszyklus von Wildtyp-Wirten durchzuführen, was eine höhere Antigenproduktion erlaubt.

Ein weiterer für die Komplementierung geeigneter Faktor ist das RNA-Polymerase assozierte Protein FlAP 94 oder der frühe Transkriptionsspezifitätsfaktor. RAP 94 wird durch den orf H4L, Ahn and Moss, Proc. Nat'l Acad. Sek USA 89, 3536-40, (1992), kodiert und ist eine Untereinheit der viralen DNA-abhängigen RNA-Polymerase. die dissoziieren kann. Die Untereinheit verleiht dem RNA-Polymerasekomplex die Promoter-Spezifität für die Einleitung der Transkription von Genen der frühen Phase. Als komplementierendes Agens erfüllt sie die gleichen Anforderungen wie die VETF-Untereinheiten. RAP 94 wird spät bei der Infektion synthetisiert und in das entstehende Virus zur Vermittlung der frühen Transkription im nachfolgenden Infektionszyklus gepackt. Daher sollten phänotypisch intakte Viruspartikel, denen das H4L-Gen fehlt, in der Lage sein, einen zusätzlichen Infektionszyklus in einem nichtkomplementierenden Wirt, ohne weitere Einschränkungen bei der Proteinsynthese, durchzuführen. Das Vorkommen von konditional lethalen Mutanten, Condit und Motytzca, Virol. 113: 224-41, (1981), bestätigt, daß H4L ein essentielles Gen ist. Man findet, daß das Protein im Virion in submolaren Mengen im Vergleich zu anderen Komponenten des RNA-Polymerasekomplexes vorliegt, Ahn und Moss, supra. Demnach sollten niedrige Expressionsspiegel von RAP94 in komplementierenden Zellinien das Wachstum des defekten Virus nicht beeinflussen.

Ein weiteres Gen, das zur Komplementierung des defekten Virus verwendet werden kann, ist das J1R-Gen, das für das Viruswachstum in Zellkultur essentiell ist. Obwohl dieses Genprodukt bislang noch nicht identifiziert wurde, ist dieser orf von bemerkenswertem Interesse aufgrund seiner Anordnung benachbart zum Thymidinkinasegen auf dem Vaccinia-Virusgenom. Deletion einer Sequenz, die den orf J1R und mindestens einen Teil des benachbarten Kinasegens (J2R) umfaßt, führt zu einem Virus, das von der 7 1

AT 405 292 B komplementierenden Zellinie abhängig ist, und das gleichzeitig durch negative Selektion auf tk-negativen Zellen, wie LM(TK-)-Zellen oder tk-negativen Vero-Zellen selektierbar ist. Reine Stocklösungen defekter Viren werden rasch bei Anwendung dieser zusätzlichen Selektionsverfahren erhalten.

Das J3R-Gen ist aus dem gleichen Grund wie der J1R orf von Interesse. Eine negative Selektion von 5 tk-negativen Zellen kann aufgrund der gleichzeitigen Deletion des J3R orf's und des benachbarten J2R orf's (Thymidinkinase) erfolgen. Das J3R-Gen kodiert eine Poly(A)po!ymerase-Untereinheit (VP39), die für die Bildung der 5’-Cap-Struktur der mRNA erforderlich ist, und die Bildung von langen Poly-(A)-Schwänzen stimuliert. Gershon et al, Cell 66, 1269-78 (1991); und Schnierle et al, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 89, 2897-2901 (1991). io Defekte Poxviren gemäß der Erfindung können mit vielen der gleichen Methoden, wie zur Konstruktion rekombinanter Viren mit Inserts in nichtessentiellen Regionen verwendet werden, hergestellt werden. Zum Beispiel kann die in vivo Rekombination über homologe flankierende Region eingesetzt werden. Siehe Panicali und Paoletti, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 79: 4927-31 (1982); Mackett et al, loc. cit. 79: 7415-19 (1982). Ein alternatives Verfahren zur Herstellung defekter Poxviren ist die direkte molekulare Klonierung ?5 und die heterologe Verpackung. Siehe EP 0 561 034; Scheiflinger et al, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 89: 9977-81 (1992); Merchlinsky and Moss, Virol. 190: 522-26 (1992).

Erfindungsgemäß kann ein defektes Poxvirus mit (einer) uniken Restriktionsstelle(n) entweder im essentiellen Gen oder an der früheren Position des essentiellen Gens als Klonierungsvehikel verwendet werden. Alternativ kann das essentielle Gen des Virus, einschließlich eines Selektionsmarkers, falls er-20 wünscht, durch unike Restriktionsschnittstellen flankiert sein, was ein gleichzeitiges Ausschneiden des essentiellen Gens und des Markers, falls vorhanden, erlaubt.

Nach dem gleichzeitigen Ausschneiden erfolgt vorzugsweise die Insertion von mindestens einem Fremd-Polynukleotid durch forcierte Klonierung, was die Ligierung des Fremd-Polynukleotids in den Virusvektor fördert. «i 25 Die Vektorarme des Ausgangsvirus mit ihrer uniken Stelle (Stellen) ("unique sites") in einer essentiellen Region oder benachbart zu einer essentiellen Region, können mit dem Fremd-Polynukleotid ligiert und in die komplementierende Zellinie mit dem Fowlpoxvirus ("FPV") als Helfervirus gepackt werden. Da FPV Vermehrungszyklen nicht abschließen und sich nicht in Säugerzellen vermehren kann, spielt dieses Virus keine wesentliche Rolle als Verunreinigung im folgenden Plaque-Test. Religiertes defektes Virus ohne ein 30 Insert kann aber immer noch Plaques bilden. Eine sorgfältige Herstellung von Vektorarmen und das forcierte Klonieren des Inserts in das Virus lösen aber dieses Problem.

Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1: Konstruktion eines defekten Vaccinia-Virus mit fehlendem 17L-Protein ("d-l7L-ZG") und 35 einer komplementierenden Zellinie auf der Basis von Vero-Zellen (“V-I7L")

Konstruktion der komplementierenden Zellinie V-I7L

Der erste Schritt bei der Konstruktion der Helferzellinie war das Klonieren des l7L-orfs durch konventio-40 nelle PCR Verfahren in ein E. coli Expressionsplasmid und in ein eukaryontisches Expressionsplasmid. Die Expression des l7L-orfs in E. coli erlaubt eine rasche Herstellung des Proteins zur Immmunisierung von Kaninchen unter Erhalt von Anti-l7L-Protein-Antikörpern, die später zur Identifikation des !7L-Proteins in permanenten Zellinien eingesetzt werden können.

Zu diesem Zweck wurde der l7L-orf durch PCR amplifiziert und dann in das Plasmid pCRII kloniert 45 (InVitrogen, Inc.). Die Primer ol7-1 (5’-AGT ACT CCA TGG AAA GAT ATA CAG ATT TAG-3') (SEQ ID Nr.:l) und OI7-2 (5'-ATC CCG GGT TTT AGA GAC TTT GAA GCT ACT-3') (SEQ ID Nr.:2) wurden zur Amplifikation des I7L-Gens als ein 1,3kb-Fragment verwendet. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCRII eingefügt, was das pCR-l7L ergab. Plasmid pCR-l7L war die Quelle für das Ncol-Hindlll-Gen-Fragment, das später durch forcierte Klonierung in das Plasmid pRSET-B (InVitrogen, Inc.) unter Erhalt von so pRSET-l7L (Fig. 1) eingefügt wurde. Plasmid pRSET-17L erlaubte eine Überexpression des l7L-orf's, der stromabwärts des T7-Promotors war. Die Expression unter T7-Promotor-Kontrolle erfordert T7 RNA-Polymerase, die durch Infektion des Plasmid-tragenden E.coli durch den Bakteriophagen M13mp18/T7 bereitgestellt wird.

Das l7L-Protein wurde in JM109 E. coli-Zellen , infiziert mit M13mpl8/T7 und die das Plasmid pRSET-55 I7L enthalten, überexprimiert. Induktion des lac-Promotors kontrolliert die Expression der der T7-Polymera-se im Bakteriophagen M13mpl8/T7 mit Isopropylthiogalactosid ("IPTG”). Das in diesem speziellen Beispiel verwendete E.coli-Expressionssystem stammte von Invitrogen, Inc. USA, und umfaßt die Ausgangsplasmide pRSET A, pRSET B und pRSET C, und einen Helferphagen M13mp18/T7 basierend auf M13. Andere 8

AT 405 292 B geeignete Expressionssysteme können ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden.

Nach der Expression wurden die Bakterienlysate hergestellt und einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen. Die Bande mit dem I7L-Protein wurde nachgewiesen, aus dem Gel ausgeschnitten und elektro-eluiert. Kaninchen wurden mit dem elektro-eluierten Material und komplettem Freund'schen Adjuvans (30 mg Protein pro Dosis, i.m.) immunisiert. Nach einem Monat werden die Tiere mit derselben Dosis mit inkomplettem Freund'schen Adjuvans geboostered und die Entwicklung von Antikörpern durch Western-Blots überwacht.

Die Western-Blots können im wesentlichen wie bei Towbin et al, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 76: 4350-54 (1979) beschrieben, durchgeführt werden. Der erste Antikörper ist ein Kaninchen-anti-l7L-Antikörper (siehe oben), verwendet in einer Verdünnung von 1:100. Der zweite Antikörper ist ein Ziege-anti-Kaninchen IgG, gekoppelt an alkalische Phosphatase (BioRad, Inc.) und verwendet in einer Verdünnung von 1:1000. Die Reagenzien (BCIP und NBT) und die Färbevorschriften stammen von Promega, Inc.

Ein Ncol-Smal-Genfragment aus Plasmid pCR-l7L ist Teil des Expressionsplasmids pSV-l7L-EDH. Siehe Fig. 2. Das Plasmid pEDH1 (Abb.2) umfaßt die "EDH-Genkassette" einschließlich einer internen ribosomalen Eintrittsstelle, die die Dihydrofolat-Reduktase ("dhfr") und Hygromycin ("hph")-Gene als ein EcoRV-Sall-Fragment. Dieses Plasmid pEDH1 stammt vom Plasmid pB4/EDHPro (Herlitschka, Doktorarbeit), in dem vier zusätzliche Restriktionsschnittstellen (Sali, Clal, Swal und Oral) stromabwärts der "EDH-Genkassette" zwischen den Stellen Spei und Notl eingefügt wurden. Die "EDH-Genkassette" von pEDH1 wurde als EcoRV-Sall-Fragment zwischen die uniken Restriktionsstellen Smal und Sali des Plasmids pSV-17L eingefügt. Diese Konstruktion lieferte das Plasmid pSV-l7L-EDH.

Plasmid pSV-l7L wurde erhalten durch Einfügen des 1,3kb Ncol-Smal-Fragments von pCR-l7L zwischen die Bbsl-Smal-Schnittstellen des Plasmids p$V-Bbs. Plasmid pSV-Bbs ist ein Derivat des Plasmids pSVjS -(Clontech, Inc. USA), dem das /S-Galactosidasegen fehlt, das aber eine unike Bbsl-Schnittstelle enthält. Die Sbsl-Schnittsteile wird durch einen Linker eingeführt, umfassend die Oligonukleotide oBbs-1 (5’-CTA GGC TTT TGC AAA AAC CTC CTC GAC CAT GGT GTC TTC A-3') (SEQ ID Nr.3) und oBbs-2 (5'-AGC TTG AAG ACA CCA TGG TCG AGG AGC TTT TTG CAA AAG C-3') (SEQ ID Nr.:4). Der Linker wurde zwischen die Avril- und die Hindlll-Schnittstellen des Plasmids pSV/S eingefügt. Siehe Fig. 2. in pSV-l7L-EDH wird der l7L-orf durch den frühen SV40-Promotor kontrolliert. Der Selekionsmarker für den Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, umfassend die dhfr- und hpg-Gene, was ein effizientes Screenen und Amplifizieren der fraglichen Gene in permanenten Zellinien erlaubt. Herlitschka, S.E. (1994), Doktorarbeit, Universität für Bodenkultur, Wien, Österreich. Jedoch ist der Einsatz dieser Erfindung nicht auf die Verwendung dieser Marker beschränkt.

Dieses Plamid wird in Affennieren-Verozellen (ATCC Nr. CCL 81) transferiert. Verozellen wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) erhalten. Diese Zellen wurden mit dem Plasmid pSV-I7L EDH nach Graham und van der Eb, Virol. 52: 456-67 (1973), transferiert und in selerivem Medium auf Hygromycin B-Basis (DMEM, 10 % fötales Rinderserum, 250 mg/ml Hygromycin B) inkubiert. Nach 10 bis 14 Tagen wurden Kolonien sichtbar. Diese Kolonien wurden expandiert, zweimal subkloniert und dann weiter chararerisiert. Permanente hph-positive Zellinien wurden in Gegenwart von Hygromycin B seleriert. Die Zellinien wurden weiter durch PCR-Analyse auf das Vorliegen des komplementierenden Genkonstrures (I7L) chararerisiert. Western-Blots werden verwendet, um zu zeigen, daß das fragliche Gen, nämlich das l7L-Protein, exprimiert wird. Die entgültige komplementierende Zellinte wird als V-I7L bezeichnet.

Konstruktion des defekten Virus d-l7L-ZG

Zur Konstruktion des Virus d-l7L-ZG, dem das l7L-Produkt fehlt, wurde das Plasmid pCR-l7Lf wie in Fig. 3 zusammengefaßt, konstruiert. Dieses Plasmid beruht auf dem pCRII-Vektor und enthält den l7L-orf, einschließlich einer flankierenden Region von ca. 0,5 kb auf beiden Seiten. Die Primer OI7-3 (5'-AGG AGT TAA TGA GGC CAA TGG A-3') (SEQ ID Nr.:5) und ol7-4 <5'-GAC ATA GGT ATA GAA TCC GGA-3') (SEQ ID Nr.:6) wurden unter Erhalt eines pCR-Produkts von ca. 2,3kb verwendet, das in das pCRII-Plasmid unter Erhalt von pCR-l7Lf subkloniert wurde.

Eine Doppelgenkassette, umfassend die E. coli-Gene lac Z und gpt wurde aus einem Sma/-Fragment aus dem Plasmid pLGb ausgeschnitten und in die einzelne Hpa /-Schnittstelle innerhalb des 17-L-orf’s, welche das pCR-!7L-Gen im resultierenden Plasmid pCR-l7Lf-ZG inaktiviert, eingefügt.

Plasmid pLGb wurde aus p2T, welches auf dem Plasmid p1Ta und PTZ19R (Pharmacia) basiert, erhalten. Zunächst wurde das große Pvull-Vektor-Fragment von pTZ19R mit reassoziierten Oligonukleotiden P-1T(1) ligiert: 5'-AGT TTA AAC GGC GCG CCC GGG CTC GAG AGG CCT CTG CAG ATG CAT CCA TGG GGA TCC GAA TTC 3' (SEQ ID Nr.:7) und P-1T(2): 5’-GAA TTC GGA TCC CCA TGG ATG CAT CTG CAG AGG CCT CTC GAG CCC GGG CGC GCC CTT TAA ACT (SEQ ID Nr.: 8). Dieses lieferte p1Ta, 9

AT 405 292 B welches dann mit mit EcoR\ und BamHI gespalten wurde. Das gespaltene p1Ta wurde dann mit den reassoziierten Oligomernukleotiden P-2T(1): 5'-GAT CCT ACG TAT CTA GAA TTA ATT AAT GGC CAA TTT AAA TGC CCG GGA-3' (SEQ ID Nr.:9) und P-2T(2): 5’-AAT TTC CCG GGC ATT TAA ATT GGC CAT TAA TTA ATT CAT GAT ACG TAG-3’ (SEQ ID Nr.:10) ligiert. Dies lieferte Plasmid p2T, das dann mit Sma1 gespalten wurde. Eine Doppelgen-Kassette, umfassend die E. coli-Gene lacZ und gpt wurde als ein Hindill, Sal I und Klenow-Polymersase behandeltes Fragment eingefügt. Die Doppeigen-Kassette wird aus dem Plasmid pZgpt-a erhalten, welche auf Plasmid pTNa und verwandten Plasmiden beruht. Für die Konstruktion des d-l7L-ZG-Virus wurde Plasmid pCR-l7Lf-ZG in den WR-Stamm von Vaccinia-Virus durch eine in vivo-Rekombination in CV-1-Zellen eingefügt. Zunächst wurden 5 x 106 CV-1-Zellen mit 0,1 pfu/Zelle Vaccinia WR infiziert, eine Stunde wachsengelassen, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat, das 20 ug des Plasmids pCR-l7Lf-ZG enthielt, transferiert, und dann für 3 Tage wachsengelassen. Siehe Graham und van der Eb, supra. Eine virale rohe Stocklösung wird hergestelit und für Plaque-Zellen in Gegenwart von gpt-Selektion, Falkner und Moss, J. Virol. 62: 1849-54 (1988) und für das Screenen auf blaue Plaques, Chakrabarti et al, Mol. Cell. Biol. S. 5: 3403-09 (1985) verwendet.

Das defekte Virus wächst nur in den V-I7L-Zellen und ist gpt und lacZ positiv, während das Wildtyp-Virus in beiden Zellinien wächst, aber gpt und lacZ negativ ist. Die Reinigung wird zehnmal durchgeführt. Die gereinigten defekten Viren werden dann in größerem Maßstab vermehrt und durch Southern-Blotting geprüft. Das Fehlen von Wildtyp-Virus und das Vorhandensein der vorhergesagten Banden bestätigt, daß die korrekten defekten Genome gebildet wurden. Plaque-Tests der defekten Viren auf komplementierenden Zellen und auf Zellen vom Wildtyp bestätigen, daß das Wirtsspektrum der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie beschränkt ist. Tierstudien bestätigen, daß die defekten Viren nicht pathogen sind.

Beispiel 2: Konstruktion eines defekten Vaccinia-Virus, der das HIV env gp160-Gen (d-l7L MN) in der komplementierenden Zellinie exprimiert

Zur Demonstration von Fremdgenexpression im neuen System wird das HIV gpl60-Gen des HIV MN-Stammes in die essentielle l7L-Region eingefügt. Zu diesem Zweck wird eine Genkassette aus einem Smal· Fragment des Plasmids pSep-ST2 erhalten. Plasmid pSeP-ST2 enthält die HIV-1 gpl60MN-Sequenzen, die durch den starken, halbsynthetischen Poxvirus-Promotor Sep kontrolliert werden, und eine Selektionskassette, die den Promotor P7.5 und das gpt-Qen umfaßt. Siehe Falkner und Moss, J. Virol. 62:1849-54 (1988).

Zur Konstruktion des Plasmid pSep-ST2 wurde zunächst das Plasmid pSep(1) konstruiert. Zum Erhalt von pSep(1) wurde der halbsynthetische Poxvirus-Promotor Sep durch Kombination des späten Fowlpox-Viruspromotors P2 (EP 0 538 496 A1, Doner et al) mit einer frühen synthetischen Promotorsequenz konstruiert. Hierzu wurde der Hpal/Ncol verdaute Vektor pS2gpt-P2 (Europäische Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 0 561 034 A2) mit den reassoziierten Oligonukleotiden P-Sep(3) und P-Sep(4) ligiert. Die Sequenz der Oligonukleotide war P-Sep(3),5’-CTCGTAAAAA TTGAAAAACT ATTCTAATTT ATTGCACGGT CGCGA-3’ (SEQ ID Nr.: 11), und P.-Sep(4), 5'-CATGGTACGT ACCGTGCAAT AAATTA-GAAT AGTI η iCAA 11 ϊ I i ACGAG-3’ (SEQ ID Nr.:l2) Das erhaltene Plasmid wurde als pSep(1) bezeichnet. Für den Erhalt von pSep-ST2 wurde zunächst ein 2,65 kb Stul/Pvull-Fragment, abgeleitet vom Plasmid pMNenv2 (beschrieben in EP 0 561 034 A2), enthaltend das HIV1-MNenv-Gen, mit dem SnaBI linearisierten Plasmid pSep(1) ligiert. Das erhaltene Plasmid, das das Insert in der Promotororientierung in Bezug auf den "Sep-Promotor" enthielt, wurde pSep-gp160mn bezeichnet. Zur Beseitigung der Punktmutation, lokalisiert innerhalb des gpl60-orf, wurde ein 1,9 kb Nsil/Sall-Fragment des pSep-gpl60mn durch ein Äquivalentes Fragment, das aus dem Plasmid pMN-ST2 stammte, ersetzt. Das erhaltene Plasmid wurde als als pSep-ST2 bezeichnet. Die Plasmide pMNenvl und pMN-ST2 wurden von Marvin Reitz (N.C.I. Bethesda, Maryland, USA) zur Verfügung gestellt.

Die Kassette aus pSep-ST2 enthält das HIV gp160-Gen und das E. coli gpf-Gen, und wird in die unike HpaFSchnittstelle von pCR-l7Lf eingefügt, was zum Plasmid pCR-l7Lf-MN führt. Das Plasmid wird in einem in vivo - Rekombinationsexperiment in CV-1-Zellen, woran der WR-Wildtyp-Virus beteiligt ist, verwendet, unter Erhalt einer viralen rohen Stocklösung, d.h. eine Mischung von: (1) defekten Viren (bei denen beide Cross-Over-Vorkommnisse stattfanden, um ein rekomoinantes Virus zu erhalten), (2) Viren, bei denen nur ein Cross-Over-Vorkommnis stattfand, und (3) Helferviren vom Wildtyp. Eine vollständige Erklärung der Cross-Over-Vorkommnisse findet sich bei Falkner und Moss, J. Virol. 64: 3108-11 (1990).

Diese Virenmischung wird in den auf Reinheit geprüften komplementierenden Zellen Plaque-gereinigt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Ausnahme, daß die Plaque-Tests allein auf der gpt-Selektion beruhen. Das erhaltene Virus wird als d-!7L-MN bezeichnet und zur Expression von rekombinanten gp160 in V-I7L-Zellen verwendet. Das Virus I7L-MN wird in Kombination mit ihrer komplementären Zellinie unter Expres- 10

AT 405 292 B sion von gp160 eingesetzt. V-I7L-Zellen werden mit 0,1 pfu d-l7L-MN infiziert und drei Tage wachsengelassen. Das rekombinante Protein wird durch Western-Blotts unter Verwendung von anti-gp4l monoklonalem Antikörper in einem Verfahren gemäß Towbin et al, supra, nachgewiesen. Tierexperimente in Mäusen werden durchgeführt, um zu zeigen, daß d-l7L-MN nicht pathogen ist, aber immer noch die immunantwort auslösen kann.

Beispiel 3: Konstruktion eines defekten Vaccinia-Virus ohne die große Untereinheit des frühen Transkriptionsfaktors (d-A8L-ZG) und einer komplementierenden Zeliinie zur Vermehrung des Virus.

Konstruktion einer Helferzelle, beruhend auf Verozellen (V-A8L)

Der VETF-Faktor Heterodimer, umfassend ein 77kD Polypeptid und ein 82kD Polypeptid, die von dem D6R und dem A8L-orf des Vaccinia-WR-Genoms kodiert werden. Gershon und Moss, Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 87: 4401-05 (1990). VETF-Proteine werden spät bei der Infektion exprimiert und in naszierende Viruspartikel gepackt. Ein defektes Virus, dem VETF fehlt, ist erwünscht, da es im Gegensatz zu Viren, die nur abbrechende Vermehrungszyklen durchführen können, zur Durchführung eines zusätzlichen Vermehrungszyklus in Wildtypwirten in der Lage sein sollte.

Die D6R-Untereinheit enthält eine mögliche ATP-Bindungsstelle, und es wurde gefunden, daß sie an die frühe Promotor-DNA-Sequenz bindet. Siehe Broyles und Li, J. Vicol. 67: 5677-80 (1993). In dem D6R-Gen wurden temperaturempfindliche Mutationen kartiert. Zur Vermeidung unerwünschter Protein-DNA-Wechsel-wirkungen in der komplementierenden Zeliinie wurde das A8L-orf ausgewählt.

Der erste Schritt bei der Konstruktion der Helfer-Zellinie war die Klonierung des A8L-orf's durch PCR-Techniken in ein E. coli-Expressionsplasmid und in ein eukaryontisches Expressionsplasmid. Die Expression des orf's in E. coli erlaubte eine rasche Vermehrung des Proteins zur Immunisierung von Kaninchen unter Erhalt von Antikörpern gegen die große anti-VETF-Untereinheit, die in Folge zur Identifizierung des Proteins in permanenten Zellinien verwendet werden.

Zu diesem Zweck wurde der A8L-orf durch PCR amplifiziert und in das Plasmid pCRII kloniert. Die Primer oA8-9t (5'-AAA CTG CAG GAT GCG ATA TAT AGT AAG TCC GCA AAT GGT ATT A-3') (SEQ ID Nr.: 13) und oA8-2t (5'-AGG AAT TCA GGC CTG TTT AAT TAA TTT GTG CTC TTC-3’) (SEQ ID Nr.: 14) wurden zur Amplifikation des A8L-Gens in einem 2,1 kb Fragment verwendet. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pCRII eingefügt (Invitrogen Inc.), was zu pCR-A8Lt führte.

Plasmid pCR-A8Lt ist die Quelle des 0,9kb Sam/-//-£coflf-Gen-Fragments. Die BamHl·Schnittstelle (liegt im A8L-Gen vor) und die £co/?/-Schnittstelle (eingeführt durch die multiple Klonierungsstelle auf pCRII) wurden unter Erhalt des Fragments gespalten, das durch forcierte Klonierung in das Plasmid pRSET-B eingefügt wurde (InVitrogen Inc.), was zur Herstellung des Plasmids pRSET-A8L-372 führte. Siehe Fig. 4. Das Plasmid enthält ein Fusionsgen, das den C’-terminalen Teil der großen VETF Untereinheit mit einem Ν'-terminalen 6-Histidin-tag kodiert. Das verkürzte A8L-Protein wurde in E. coli-Zellen (Stamm JM109), die das Plasmid pRSET-A8L-3'/2 enthielten, überexprimiert.

Die Bakterien wurden danach durch den Helferphagen M13mp18/T7 in Gegenwart von IPTG infiziert, welches den fac-Promotor induziert, der die Expression von T7-Polymerase in Bacteriophage Ml3mpl8/T7 steuert. Das rekombinante verkürzte A8L-Protein einschließlich dem His-tag wurde aus Bakterienlysaten durch Affinitäts-Chromatographie auf Nickel-NTA-Säulen, nach den Anweisungen des Herstellers (Diagen, Inc.) gereinigt. Das gereinigte Material, emulgiert im kompletten Freund'schen Adjuvans, wurde zur Immunisierung von Kaninchen (80 mg Protein pro Dosis, subkutan und intramuskulär) verwendet. Nach einem Monat wurden den Tieren Booster-Injektionen mit der gleichen Dosis gegeben, und die Entwicklung der Antikörper wurde durch Western-Blots überwacht.

Zur Charakterisierung des Kaninchen-Antiserums wurden die A8L-Proteine in Bakterienlysaten durch Western-Blots nachgewiesen. Die Western-Blots erfolgten im wesentlichen wie bei Towbin et al, supra, beschrieben. Der erste Antikörper war ein Kaninchen-anti-A8L-Protein-Antikörper, verwendet in einer Verdünnung von 1:100. Der zweite Antikörper war ein Ziege-anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt an alkalische Phosphatase (BioRad, Inc.), verwendet in einer Verdünnung von 1:1000. Die Reagenzien (BCIP und NBT) und die Färbeprotokolle stammten von Promega, Inc.

Zum Erhalt des Expressionsplasmids pSV-A8L-EDH wurde das A8L-Gen aus dem Plasmid pCR-A8Lt als ein 2,1 kb Pstl-Stul-Genfragment isoliert. Die Stellen Pstl und Stul wurden durch PCR Primer oA8-9t und oA8-2t eingeführt. Dieses Fragment, und ein EcoRV-Clal-Genfragment aus dem Plasmid pEDH1, umfassend die "EDH-Genkassette", wurden in den Pstl-Clal geschnittenen Expressionsvektor pSVMC$#51 tigiert, der vom pSVß (Clontech, inc.) durch Substitution des jS-Galactosidasegens durch eine multiple Klonierungsstel- 11

AT 405 292 B !e ("msc"), umfassend die Restriktionsschnittstelien Apal, Avrlll, Spei, Hindill, Pstl, Sali, Xbal, Smal, EcoRI und Clal abgeleitet ist. Zu diesem Zweck wurde der Vektor pCMVß mit Notl geschnitten und unter Erhalt des Plasmids pCMV religiert. Dieses Plasmid wurde mit Sali und Hindill geschnitten, mit Klenow-Polymerase behandelt und unter Erhalt eines intermediären Plasmids religiert. Dieses Plasmid wurde mit Xhol geschnitten, und ein doppelsträngiger, für die Restriktions-Schnittstellen Apal, Avrlll, Spei, Hindill, Pstl, Sali, Xbal, Smal, EcoRI und Clal kodierender Linker wurde unter Erhalt des Plasmids p$VMCS#51 eingefügt. Siehe Fig. 5. Im Plasmid pSV-A8L-EDH wird der A8L-orf durch den frühen SV40-Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker für den Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, umfassend das dhfr-Gen und das hph-Qen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Das Plasmid pSV-A8L-EDH wurde in Affennieren-Verozellen (ATCC Nr. CCL 81) mit einem Verfahren gemäß Graham & van der Eb, supra, transferiert und in selektivem Medium (DMEM, 10 % fötales Rinderserum, 250 ug/ml Hydromycin) inkubiert und weiter wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Permanente, auf Hygromycin-Phosphotransferase positive Zellinien wurden in Gegenwart des Antibiotikums Hygromycin B selektiert. Nach fünf Passagen wurde der Einbau der Fremd-DNA durch PCR unter Verwendung von für ein 0,5kb-Segment des A8L-Gens spezifischen Primer demonstriert.

Western-Blots werden zur Bestimmung verwendet, ob das fragliche Gen, nämlich die große VETF-Untereinheit exprimiert wird. Die Zellinien, die die höchsten Spiegel an der großen VETF Untereinheit exprimieren, werden ferner durch PCR-Analyse charakterisiert und als komplementierende Zellinie mit der Bezeichnung V-A8L eingesetzt.

Konstruktion des defekten Virus d-A8L-ZG

Zur Konstruktion des Virus d-A8L-ZG wurde das Plasmid pCR-A8Lf-ZG wie in Fig. 6 schematisch gezeigt, kloniert. Regionen (mit einer Größe zwischen 0,5kb und 0,7kb), die den A8L-orf an beiden Seiten flankieren, wurden durch PCR amplifiziert und in das Plasmid pCRII unter Erhalt von pCR-A8L-f1 und pCR-A8L-fr subkloniert. Die PCR-Primer für die Amplifikation der A8L 5'-flankierenden Region waren 0A8-8 (5'-AGC GCC GCT ACT AGC ACT CC-3’) (SEQ ID Nr.: 15) und oA8-5 (5'-GAA CGT TAA CAT TTA TAT CGT GGG GTA AAG TGA AAA TC-3’) (SEQ ID Nr.: 16). Die Primer für die A8L-3’ flankierende Region waren OA8-4 (5 TTG GAG AAC TTG ATA CGC CG-3') (SEQ ID Nr.: 17) und 0A8-6 (5’-CAT ATG GAA TTG TAA ATT AAA CAA CTA AAT CTG TAA ATA AAT A-3') (SEQ ID Nr.: 18). Die A8L-5' flankierende Region wurde als 0,7kb Notl-Spel-Fragment aus pCR-A8L-fl zwischen die Stellen Notl und Xbal auf der rechten Seite stromaufwärts der A8L-3' flankierenden Region in pCR-A8L-fr unter Erhalt von Plasmid pCR-A8L-flanks ligiert.

Zur Durchführung weiterer Klonierungsprozeduren wurde ein synthetischer Linker, enthaltend die seltenen Restriktionsstellen Smal, Notl, Sfil und Rsrll, zwischen die A8L-flankierenden Regionen in den pCR-A8L-Flanken ligiert. Die für die Konstruktion der Linker verwendeten Oligonukleotide waren oA8-11 (5'-AAC GGT CCG GCC CGG GCG GCC GCC-3') (SEQ ID Nr.:19) und oA8-12 (5’-AAT TGG CGG CCG CCC GGG CCG GAC CGT T-3') (SEQ ID Nr.:20). Das Plasmid pCR-A8L-flanks wurde danach mit Muni und Hpal linearisiert (beide Stellen werden durch die PCR-Primer 0A8-5 und 0A8-6 eingeführt). Das erhaltene Plasmid, bezeichnet als pdA8L, wurde mit einer 3,9kb Smal-Doppelgen-Kassette aus dem Plasmid pLGb, beschrieben in Beispiel 1, unter Erhalt von pCR-A8Lf-ZG ligiert. In diesem Konstrukt ist der A8L orf vollständig deletiert, um eine Rekonstitution des Wildtyp-Virus durch die komplementierende Zellinie mittels homologer Rekombination zu verhindern. Für die Konstruktion des d-A8L-ZG-Virus wurde das Plasmid pCR-A8L-ZG in das Vaccinia-Virus WR eingefügt. Das Plasmid pCR-A8Lf-ZG wurde für die in vivo -Rekombination in CV-1-Zellen verwendet. Zunächst wurden 5x10® CV-1-Zellen mit 0,1 pfu/Zellen Vaccinia WR infiziert, eine Stunde inkubiert, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat transferiert (nach Graham & van der Eb, supra), das 20 ug des Plasmids pCR-A8L-ZG enthielt, und drei Tage wachsengelassen.

Dies führte zu einer rohen Stocklösung, die Wildtyp-Viren (Helfer) und defekte Viren enthielt. Um reine Stocklösung mit defektem Virus zu erhalten, wurden Plaque-Tests in V-A8L-Zellen durchgeführt, die zur Komplementierung des defekten Virus in der Lage sind. Die virale rohe Stocklösung wurde hergestellt und für Plaque-Tests auf V-A8L-Zellen in Gegenwart von gpt-Selektion (Falkner und Moss (1988) supra) und blauen Plaque-Screening (Chakrabarti et al, supra) verwendet. Die Plaque-Reinigung wird zehnmal wiederholt. Die gereinigten defekten Poxviren werden im größeren Maßstab wachsengelassen und durch Southern-Blotting geprüft. Das Fehlen des Wildtyp-Virus und das Vorliegen der vohergesagten Banden bestätigt, daß sich die korrekten defekten Genome gebildet haben. Plaque-Tests der defekten Viren auf komplementierenden Zellen und auf Wildtyp Zellen bestätigen, daß das Wirtsspektrum der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie beschränkt ist. Tieruntersuchungen bestätigen, daß die defekten Viren nicht 12 ΑΤ 405 292 Β pathogen sind.

Beispiel 4: Konstruktion eines defekten Vaccinia-Virus ohne die kleine Untereinheit des frühen Transkriptionsfaktors (d-D6R-ZG) und einer komplementierenden Zellinie

Konstruktion einer Helferzeilinie, basierend auf Verozellen (V-D6R)

Die kleine Untereinheit des frühren Transkriptionsfaktors VETF ist ein Polypeptid mit einer Größe von 77kD. Wie in Beispiel 3 beschrieben, enthält VETF eine mögliche ATP-Bindungsstelle, und es wurde gefunden, daß es an die frühe Promotor-DNA-Sequenz bindet. Broyles und Li, supra. Der D6R orf wird zur Komplementierung ausgewählt, da Temperatur-empfindliche Mutationen in diesem Gen kartiert wurden, was ein Element für die Definition eines essentiellen Gens ist. Seto et al, Virol. 160, 110-119 (1987

Die Schritte bei der Konstruktion der Helferzellinie V-D6R sind im allgemeinen identisch mit der Konstruktion der Zellinie V-A8L in Beispiel 3. Zunächst wurde der D6R orf in das Plasmid pCRII (InVitrogen, Inc.) durch PCR-Techniken kloniert. Das erhaltene Plasmid ist die Quelle für das D6R-Genfragment zur Konstruktion eines eukaryontischen Expressionsvektors und eines E. coli-Expressionsplasmids. Die Expression des orf in E. coli erlaubt eine rasche Produktion des Proteins zur Immunisierung von Kaninchen unter Erhalt von Antikörpern gegen die kleine anti-VETF Untereinheit, die anschließend zur Identifikation des Proteins in den permanenten Zellinien verwendet werden.

Zu diesem Zweck wurde der D6R-orf als ein 1,9kb-Fragment mittels PCR unter Verwendung der Primer 0D6-1 (5'-CTG CAG AAT GAA TAC CGG ATT TAT AGA TTT -3’) (SEQ ID Nr.: 21) und oD6-2 (5'-CCC GGG TTA TGG AGA AGA TAC CAC GTT-3') (SEQ ID Nr.: 22) amplifiziert und in pCRII kloniert, was zum Plasmid pCR-D6R führte.

Wie in Fig. 7 gezeigt, wurde das E. coli-Expressionsplasmid pRSET-D6R-3' durch Ligieren eines 1,6kb EcoRI-Fragments aus pCR-D6R in den Vektor pRSET-B (InVitrogen, Inc.) konstruiert. Plasmid pRSET-D6R-3' enthält ein Fusionsgen, das für ein N-terminales 6-Histidin-tag kodiert, das an die kleine VETF Untereinheit, dem die ersten 100 Aminosäuren fehlen, fusioniert ist. Die bakterielle Expression, die tagvermittelte Reinigung des rekombinanten Proteins und die Produktion von Antikörpern gegen die kleine VETF Untereinheit wurden wie in Beispiel 3 ausgeführt.

Das Expressionsplasmid pSV-D6R-EDH wurde wie folgt konstruiert: Der DGR orf wurde als 1,9kb Genfragment aus pCR-D6R durch Schneiden des Plasmids mit Pstl und Smal isoliert und in den Vektor pSVMCS#51 (Heriitschka, supra) durch forciertes Klonieren unter Erhalt des Plasmids pSV-D6R ligiert. Die Schnittstellen Pstl und Smal wurden durch die PCR-Primer 0D6-I (5’-CTGCAGAATG AATACCGGAA TTATAGATTT-3’) (SEQ ID Nr.:21) und oD6-2 (5'-CCCGGGTTAT GGAGAAGATA CCACGTT-3’) (SEQ ID Nr.:22) eingeführt. Ligierung eines EcoRV-CIal Genfragments aus dem Plasmid pEDHl, umfassend die "EDH-Genkassette", in Smal-Clal geschnittenes pSV-D6R lieferte das Expressionsplasmid pSV-D6R-EDH. Siehe Fig. 8.

Im Plasmid pSV-D6R-EDH wird der D6R-orf durch den frühen SV40-Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker für den Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen mit dem dhfr-Qen und dem hph-Gen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Transfektion und die Screening-Verfahren für die Konstruktion der komplementierenden Zellinie sind identisch mit denen in Beispiel 3.

Konstruktion des defekten Virus d-D6R-ZG

Zur Konstruktion des Virus d-D6R-ZG wurde das Plasmid pCR-D6Rf-ZG wie in Fig. 9 schematisch gezeigt, kloniert. Die Regionen (mit Größen zwischen 0,5kb und 0,6kb), die den D6R orf an beiden Seiten flankieren, wurden durch PCR-Verfahren amplifiziert und in das Plasmid pCRII unter Erhalt von pCR-D6R-fl und pCR-D6R-fr subkloniert. Die PCR-Primer für die Amplifikation der D6R 5'-f!ankierenden Region sind OD6-3 (5'-TGA GAA GAA TTG CCG TCG-3’) (SEQ ID Nr.:23) und oD6-5 (5'-GTC GAC GAT ATC TTC TAT AAA TAT ATG AGC-3') (SEQ ID Nr.:24). Die Primer für die D6R 3'-flankierende Region sind oD6-4 (5'-TAG AGT ACC CGA ATG TCT AC-3') (SEQ ID Nr.:25) und 0D6-6 (5’-ACA ATT GGT ATT AAG TAT AAC GAC TCC-3') (SEQ ID Nr.:26). Die D6R 5'-flankierende Region wurde als 0,6kb Sacl-Spel-Fragment aus pCR-D6R-fl zwischen die Stellen Sacl und Xbal rechts stromabwärts der D6R 5’-flankierenden Region in pCR-D6R-fl unter Erhalt von Plasmid pCR-D6R-flanks ligiert. Zur Durchführung weiterer Klonier-Prozeduren wurde ein synthetischer Linker, enthaltend die seltenen Restriktionsstellen Smal, Notl, Sfil und Rsrll, zwischen die D6R-flankierenden Regionen in den pCR-D6R-flanks ligiert. Die für die Konstruktion der Linker verwendeten Oligonukleotide sind oA8-11 und 0A8-12. Siehe Beispiel 3. Das Plasmid pCR-D6R-flanks wird daher mit Sali linearisiert, mit Klenow Polymerase behandelt und mit Muni (beide Restriktionsstellen werden 13

AT 405 292 B durch die PCR-Primer oD6-5 und 0D6-6 eingeführt) geschnitten. Das erhaltene Plasmid, bezeichnet als pdD6R, wird mit der 3,9kb Smal-Doppelgenkassette aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pLGb unter Erhalt von pCR-D6Rf-ZG ligiert. In diesem Konstrukt ist der D6R orf vollständig deletiert, um eine Rekonstitution ("rescueing") des Wildtyp-Virus durch die komplementierende Zellinie aufgrund homologer 5 Rekombination zu verhindern. Für die Konstruktion des d-D6R-ZG-Virus wird das Plasmid pCR-D6Rf-ZG in das Vaccinia-Virus WR eingefügt. Das Plasmid pCR-D6Rf-ZG wird zur in vivo-Rekombination in CV-1 -Zellen verwendet. Zunächst werden 5 x 106 CV-1-Zellen mit 0,1 pfu/Zelle Vaccinia WR infiziert, eine Stunde inkubiert, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat (nach Graham & van der Eb, supra) enthaltend 20 ug Plasmid pCR-D6R-ZG 70 transferiert und drei Tage lang vermehrt. Dieses führt zu einer rohen Stocklösung mit Wildtyn (Helfer) und defekten Viren. Für den Erhalt reiner Stocklösungen des defekten Virus werden Plaque-Tests in V-D6R-Zellen durchgeführt, die in der Lage sind, den defekten Vrus zu komplementieren. Die virale rohe Stocklösung wird hergestellt und für Plaque-Tests auf V-D6R-Zellen in Gegenwart von gpt-Selektion (Falkner und Moss, supra, (1988)) und für blaues Plaque-Screening (Chakrabarti et al, supra) verwendet. 15 Die Plaque-Reinigung wird zehnmal wiederholt. Die gereinigten defekten Poxviren werden in größerem Maßstab vermehrt und durch Southern Blotting überprüft. Das Fehlen des Wildtyp-Virus und das Vorliegen der vorhergesagten Banden bestätigt, daß die korrekten defekten Genome gebildet wurden. Plaque-Tests der defekten Vren auf komplementierenden Zellen und auf Wildtypzellen bestätigen, daß das Wirtsspektrum der defekten Viren auf die komplementierende Zellinie beschränkt ist. Tierstudien bestätigen, daß die so defekten Vren nicht pathogen sind.

Beispiel 5: Konstruktion eines defekten Vacciniavirus ohne das J1R-Genprodukt (d-JIR-ZG) und einer komplementierenden Zellinie

Ts rs Fi TI T* TI ri 25 Konstruktion einer Helferzelllinie, basierend auf Verozellen (V-J1R)

Der erste Schritt war Expression des J1R orf in E. coli (unter Verwendung des InVtrogen pRSET-Vektorsystems). Zunächst wurde das Plasmid pCR-J1R durch Klonieren des J1R PCR-Produkts, erhalten mit den Primern oJ1R-1 (5'-GCCATGGATC ACAACCAGTA TCTCTT-3’) ((SEQ ID Nr.:27) und oülR-2 (5’-30 ACCCGGGTTA ATTAATTATT GTTCACTTTA-3') (SEQ ID Nr.:28) in den pCRII-Vektor konstruiert. Dann wurde ein Ncol-EcoRI-Fragment in pRSET-J1R unter Erhalt des E. coli Expressionsvektors pRSET-J1R (Fig. 10) eingefügt. Mit diesem Plasmid wurden große Mengen an J1R-Protein erhalten, die bemerkenswerterweise nicht in Kaninchen immunogen waren. Antikörper zur weiteren Identifikation des Proteins in den permanenten Zellinien wurden daher gegen ein Konjugat eines synthetischen J1R-Peptids mit dem 35 Trägerprotein KLH erzeugt. Das synthetische Peptid mit der Aminosäuresequenz SLATTAIDPIRYIDP, entsprechend den Aminosäurepositionen 118 bis 132 des JIR-Proteins, wurde an KHL gekoppelt (voraktivierte KLH von Pierce, USA). Das gereinigte Konjugat in komplettem Freund'schen Adjuvans wurde zur Immunisierung von Kaninchen (Dosis: 100 mg Protein, subkutan und intramuskulär) verwendet. Nach einem Monat wurden die Tiere mit der gleichen Dosis geboosted, und die Entwicklung der Antikörper wird mit 40 Western-Blots überwacht.

Die Proteine werden durch Western-Blots nachgewiesen. Die Western-Blots erfolgen im wesentlichen wie bei Towbin et al, supra, beschrieben. Der erste Antikörper ist ein Kaninchen-Anti-JIR-Proteinantikörper, verwendet in einer Verdünnung von T.100. Der zweite Antikörper ist ein Ziege-Anti-Kaninchen-IgG, gekoppelt mit alkalischer Phosphatase (BioRad, Inc.), verwendet in einer Verdünnung von 1:1.000. Die Reagen-45 zien (BCIP und NBT) und die Färbevorschriften sind von Promega, Inc., USA. Für den Erhalt des Expressionsplasmids pSV-JlR-EDH (Abb. 11) zur Transformation in die Verozellen wurde ein 0,5kb Ncol-Smal-Genfragment, kodierend das komplette J1R-Gen, aus dem Plasmid pCR-J1R isoliert. Die Schnittstellen Ncol und Smal wurden durch die PCR-Primer oJ1R-1 und oJlR-2 (siehe oben) eingeführt. Dieses Fragment wurde in den Bbsl geschnittene Expressionsvektor pSV-Bbs (siehe Beispiel 1) 50 ligiert. Einfugen eines EcoRV-Clal-Genfragments aus Plasmid pEDHI, umfassend die "EDH-Genkassette”, in den Smal-Clal geschnittenen pSV-JlR lieferte pSV-JlR-EDH (siehe Fig. 11). Im Plasmid pSV-JlR-EDH wird der J1R orf durch den frühen SV40-Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker für den Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, umfassend das dhfr-Gen und das hph-Gen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

55 Das Plasmid pSV-JlR-EDH wurde in Affennieren-Verozellen (ATCC Nr. CCL 81) nach einem Verfahren von Graham und van der Eb, supra, transferiert und in selektiven Medium inkubiert (DMEM, 10 %, fötales Rinderserum, 250 ug/ml Hygromycin) und ferner wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Zellinien, permanent positiv auf Hygromycinphosphotransferase, wurden in Gegenwart des Antibiotikums Hygromycin 14

AT 405 292 B B selektiert. Nach 5 Passagen wurde der Einbau der Fremd-DNA durch PCR unter Verwendung von für ein 0,5kb-Segment des J1R-Gens spezifischer Primer demonstriert. Western-Blots werden zum Nachweis verwendet, ob das fragliche Genprodukt, das J1R-Protein, exprimiert wird. Die Zellinien, die die höchsten Spiegel an JIR-Protein exprimieren, werden ferner durch Southern-Blotting charakterisiert und als komple-s mentierende Zellinie mit der der Bezeichnung V-J1R verwendet.

Konstruktion des defekten Virus d-J1R-ZG

Zur Konstruktion des Virus d-JlR-ZG wurde das Plasmid pCR-J1Rf-ZG wie schematisch in Fig. 12 ro gezeigt, kloniert. Ein 1,5kb-Genfragment, umfassend den J1R-orf und ca. 0,5kb der flankierenden Sequenzen zu beiden Seiten, wurde aus dem Vaccinia-Virus (Stamm WR) durch PCR amplifiziert und in das Plasmid pCRII unter Erhalt von pCR-J1Rf subkloniert. Die PCR-Primer waren oJ1-3 (5'-TCC ACA TCC ATG AGA TTG AAT-3’) (SEQ ID Nr.:29) und 0J1-4 (5’-CGA TTG ATA CAT ATC ATT ACC-3’) (SEQ ID Nr.:30). Die Deletion des kompletten J1R-Gens und der ersten 40 Nukleotide des benachbarten Thymidinkinase-75 gens erfolgte ebenfalls durch PCR-Techniken. Das komplette Plasmid pCR-JlRf ohne die zu deletierenden Sequenzen wurde über PCR amplifiziert, was zu einem 6kb-Produkt führte. Polynukleotidkinase-Behandlung und anschließende Religierung des PCR-Produktes lieferte die Flanken des Plasmids pCR-J1R. Die Primer OJ1-5 (5'-AACAATTGCA TCATCTGCGA AGAACATCG-3’) (SEQ ID Nr.:3l) und 0J1-6 (5'-CAGTTAACTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT-3') (SEQ ID Nr.:32), die für diese Reaktion verwendet wurden, führen die 20 Restriktionsschnittstellen Muni und Hpal ein. Das Plasmid wurde an diesen Stellen geschnitten, und der Linker (0A8-11 und oA8-12, wie in Beispiel 3 beschrieben) wurde unter Erhalt von pdJlR eingefügt. Analog zum Beispiel 3 wurde eine lacZ-gpt-Doppelmarker-Kassette in die Smal-Schnittstelle von pdJ1 R ligiert, was zum Rekombinationsvektor pCR-JlRf-ZG führte. (Dieses Plasmid enthält nur 40 Basenpaare des J1R-Gens an seinem 5’-Ende, die notwendig für die Integrität des benachbarten L5R orf's im defekten Virus sind.) 25 Zur Konstruktion des d-J1R-ZG-Virus wurde das Plasmid pCR-J1R-ZG in das Vaccinia-Virus WR eingefügt. Das Plasmid pCR-J1Rf-ZG wurde für die in vivo-Rekombination in CV-1-Zellen verwendet. Zunächst wurden 5 x 10® CV-1-Zellen mit 0,1 pfu/Zelle Vaccinia WR infiziert, eine Stunde inkubiert, mit einem Calciumphosphat-Präzipitat (nach Graham & van der Eb, supra), enthaltend 20 ng an Plasmid pCR-J1R-ZG, transferiert und 3 Tage vermehrt. 30 Dieses Verfahren führte zu einer rohen Stocklösung mit Wildtyp-(Helferviren) und defekten Viren. Es wurden Plaque-Tests in V-J1R-Zellen unter Erhalt reiner Stocklösung an defektem Virus durchgeführt, die zur Komplementierung des defekten Virus in der Lage sind. Die virale rohe Stocklösung wurde hergestellt und für Plaque-Tests auf V-J1R-Zellen in Gegenwart von gpt-Selektion (Falkner und Moss (1988), supra) und blauem Plaque-Screening (Chakrabarti et al, supra) verwendet, abwechselnd mit Plaque-Tests auf tk-35 negativen V-J1R-Zellen in Gegenwart von BUdR (Mackett et al, supra). Die Plaque-Reinigung wird zehnmal wiederholt. Die gereinigten defekten Poxviren werden in größerem Maßstab vermehrt und durch Southern-Blotting überprüft. Das Fehlen von Wildtyp-Virus und das Auftreten der vorhergesagten Banden bestätigt, daß die korrekten defekten Genome gebildet wurden. Plaque-Tests der defekten Viren auf komplementierenden Zellen und auf Wildtypzellen bestätigen, daß das Wirtsspektrum der defekten Viren begrenzt auf die 40 komplementierende Zellinie ist. Tierstudien bestätigen, daß die defekten Viren nicht pathogen sind.

Beispiel 6: Konstruktion eines defekten Vaccinia-Virus ohne das H4L-Genprodukt (d-H4L-ZG) und einer komplementierenden Zellinie 45 Der H4L-orf wird zur Komplementierung ausgewählt, da konditional lethale Temperatur-empfindliche Mutationen in diesem Gen kartiert wurden (Seto et al, supra).

Die Schritte bei der Konstruktion der Helfer-Zellinie V-H4L sind im allgemeinen identisch mit der Konstruktion der Zellinie V-A8L in Beispiel 3. Zunächst wurde der H4L orf in das Plasmid pCRII (InVitrogen, Inc.) durch PCR-Techniken kloniert. Das erhaltene Plasmid ist die Quelle des H4L-Genfragment zur so Konstruktion des Verozell-Expressionsvektors pSV-H4L-EDH, wie in Fig. 13 gezeigt.

Antikörper zur Identifikation des H4L-Genprodukts (RAP94) in den permanenten Zellinien werden gegen ein KLH-Konjugat eines synthetischen Peptids erzeugt. Das Konjugat wurde hergestellt durch Verknüpfen des synthetischen Peptids KIYKNSFSEDHNNSLD entsprechend den Aminosäure-Positionen 242 bis 258 im H4L orf, Kane und Shuman, J. Virol. 66, 5752-62, (1992), an aktivieres KLH (KLH-Kopplungskit, Pierce Inc., 55 USA). Dieses Konjugat wurde zur Herstellung von Anti-H4L-Antikörpern, analog zu Beispiel 5, verwendet.

Zur Konstruktion des Verozell-Expressionsvektors wurde der H4L-orf als ein 2,4kb-Fragment durch PCR unter Verwendung der Primer oH4-1 (5'-ACC ATG GAC TCT AAA GAG ACT AT-3') (SEQ ID Nr.:33) und 0H4-2 (5'-CAA TTG CCC GGG TTA ATT AAT GAA ATT AAT CAT ATA CAA CTC-3') (SEQ ID Nr.:34) 15 n :ü m

AT 405 292 B amplifiziert und in pCRII kloniert, was zum Plasmid pCR-H4L führte. Das Expressionsplasmid pSV-H4L-EDH wurde wie folgt konstruiert: Der H4L orf wurde als 2,4kb-Genfragment aus PCR-H4L durch Schneiden des Plasmids mit Ncol und Smal isoliert und in den Vektor pSV-Bbs (siehe Beispiel 1) durch forciertes Klonieren unter Erhalt des Plasmids pSV-H4L ligiert. Die Schnittstellen Ncol und Smal wurden durch die 5 PCR-Primer oH4-1 und oH4-2 eingeführt. Ligierung eines EcoRV-Sall-Genfragments aus dem Plasmid pEDH1 umfassend die "EDH-Genkassette" in Smal-Sall geschnittenem pSV-H4L lieferte das Expressionsplasmid pSV-H4L-EDH. Siehe Rg. 13.

Im Plasmid pSV-H4L-EDH wird der H4L orf durch den frühen SV40-Promotor kontrolliert. Der Selektionsmarker für den Erhalt permanenter Zellinien ist ein Fusionsgen, umfassend das dhfr-Gen und das hph-10 Gen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Transfektions- und Screening-Prozeduren für die Konstruktion der komplementierenden Zellinien erfolgten wie in Beispiel 3, mit Ausnahme, daß H4L-spezifische Reagenzien verwendet wurden.

Konstruktion des defekten Virus d-H4L-ZG is

Zur Konstruktion des Virus d-H4L-ZG wurde das Plasmid pCR-H4Lf-ZG, wie schematisch in Fig. 14 gezeigt, kloniert. Den H4L orf an beiden Seiten flankierende Regionen (mit einer Größe von 0,5kb und 0,6kb) wurden durch PCR-Techniken amplifiziert, und in das Plasmid pCRII unter Erhalt von pCR-H4L-fl und pCR-H4L-fr subkloniert. Die PCR-Primer für die Amplifikation der H4L 5'-flankierenden Region sind oH4-3 20 (5’CCT TTA GGT CAG AA GAT CGC-3’) (SEQ ID Nr.:35) und 0H4-5 (5’-GTC GAC AAT TGT TAA AG TAC AAA CAA CTA GGA-3') (SEQ ID Nr.:36). Die Primer für die H4L 3'-flankierende Region sind oH4-4 (5'-GCT AAC ATC ATA CCC TCC TG-3') (SEQ ID NR..37) und oH4-6 (5’-GTC GAC GTT AAC AGA AGC ATT GGA ATA CGC AT-3') (SEQ ID Nr.:38). Die H4L 3'-flankierende Region wurde als 0,5kb Sall-Spel-Fragment aus pCR-H4L-fr zwischen die Stellen Sali und Xbal rechts stromabwärts der H4L 5’-flankierenden Region in 25 pCR-D6R-f! unter Erhalt von pCR-H4L-flanks ligiert. Für weitere Klonierungsprozeduren wurde ein synthetischer Linker, enthaltend die seltenen Restriktionsschnittstellen Smal, Notl, Sfil und Rsrll, zwischen die H4L-flankierenden Regionen in pCR-H4L-flanks ligiert. Die für die Konstruktion der Linker verwendeten Oligonu-kleotide sind OA8-11 und 0A8-12. Das Plasmid pCR-H4L-f!anks wurde danach mit Muni und Hpal linearisiert (beide Stellen wurden durch die PCR-Primer oH4-5 und oH4-6 eingeführt). Das erhaltene Plasmid, 30 bezeichnet als pdH4L, wurde mit einer 3,9kb Smal-Doppelgen-Kassette aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Plasmid pLGb unter Erhalt von pCR-H4Lf-ZG ligiert. In diesem Konstrukt ist der H4L orf vollständig deletiert, um eine Rekonstruktion des Wildtyp-Virus durch die komplementierende Zellinie ("rescueing") aufgrund homologer Rekombination zu verhindern. Die Konstruktion des d-H4L-ZG-Virus durch in vivo-Rekombination und Plaque-Reinigung erfolgt nach dem in Beispiel 1 angegebenen Schema. 35

Beispiel 7 Konstruktion einer komplementierenden Zellinie mit einer Hitzeschock-induzierbaren l7L-Funktion

Der Effekt der Abschaltung der Vaccinia-wirtseigenen Proteinsynthese ("host protein shutoff") variiert, 40 was die Effektivität der Komplementierung beeinflußt und daher die Anzahl der Plaque-Reinigungen bestimmt, die notwendig sind für den Erhalt reiner Stocklösungen an defektem Virus für die mit den Wirtszellinien erhältlichen Titer. Um die Komplementierung effizienter zu machen, wird der essentielle offene Leserahmen, der für die komplementierende Funktion kodiert, stromabwärts des Promotors des 70kd humanen Hitzeschockproteins (Hsp70)-Gen (Hunt & Morimoto, supra) kloniert Die Transkription des Hsp-70-45 Gens wird durch Vaccinia-Infektion induziert, und man vermutet, daß das Hsp70 bei der Anordnung des Vaccinia-Virions beteiligt ist (Jindal und Young, supra).

Der erste Schritt ist die Klonierung des Hsp70-Promotors durch PCR-Techniken. Es wurden die Oligonukleotide oHS-1, 5'-TACGTATGGA GACCAACACC CTTCC-3' (SEQ ID Nr.:39) und oHS-2, 5'-CCATGGATAT CGGTTCCCT GCTCTCTGTC GG-3' (SEQ ID Nr.:40) zusammen mit humaner DNA (Clon-50 tech, Inc.) als Matritze unter Erhalt der humanen Hsp70-Promotorsequenzen verwendet. Das PCR-Produkt wurde in den pCRII-Vektor (InVitrogen, Inc.) unter Gewinnung von Plasmid pCR-Hsp kloniert. Das SnaBI-Ncol-Promotorfragment wird zur Substitution des SV40-Promotors im Plasmid pSV-Bbs (siehe Beispiel 1) verwendet, was nach Enfernung des in diesem Plasmid vorhandenen SV40-lntrons zu dem Plasmid pHS führt. Dieser Vektor wird verwendet, um offene Leserahmen, wie z.B. I7L, durch Ligierung des Ncol-Smal-55 Fragments von pSV-l7L (Beispiel 1) mit pHS unter Gewinnung des Plasmids pHS-l7L, einzufügen. (Siehe Rg. 15).

Zur Konstruktion der komplementierenden Zellinie wird das Co-Transformationsverfahren (Wigler, supra) durchgeführt. Ein geeigneter Selektionsmarker, wie das auf dem Plasmid pSV2-neo vorhandene 16

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Neomycin-Resistenzgen (Southern, P.J. und Berg, P., J. Mot. Appl. Geriet. 1, 327, (1982) wird zusammen mit dem Plasmid pHS-l7L in einem Transfektionsexperiment in Verozellen verwendet. Die Zellen werden nach Graham und van der Eb, supra, transfektiert und in selektivem Medium mit dem Antibiotikum G418 (DMEM, 10 % fötales Rinderserum, 500 ug/ml G-418) inkubiert. Nach 10 bis 14 Tagen werden Kolonien sichtbar. Diese Kolonien werden expandiert, zweimal subkloniert und dann weiter charakterisiert. Die Zellinien werden weiter durch PCR-Analyse auf Anwesenheit des komplementierenden Genkonstrukts charakterisiert. Western-Blots werden verwendet, um zu zeigen, daß das fragliche Gen, das I7L-Protein, bei Induktion exprimiert wird. Die letztendliche komplementierende Zellinie wird als VHsp-l7L bezeichnet. Die Zellinie wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, charakterisiert.

Die Konstruktion des defekten Virus d-l7L*ZG/Hsp erfolgt wie in Beispiel 1 für das Virus d-l7L-ZG beschrieben, mit Ausnahme, daß die Zellinie Vhsp-I7L für die Komplementierung verwendet wird, und daß nur fünf Zyklen von Plaque-Reinigung unter Erhalt des defekten Virus erfolgen. 17

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SEQUENZ PROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN: (i) ANMELDER:

(A) NAME: IMMUNO AG (B) STRASSE: Industriestr. 67 (C) ORT: Wien

(E) LAND: OESTERREICH (F) POSTLEITZAHL: A-1221 (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Rekombinante Poxviren mit Fremd-Polynukleotiden in essentiellen Regionen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 40 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG: (A) DATENTRÄGER: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA) (vi) DATEN DER URANMELDUNG: (A) ANMELDENUMMER: US 08/235,392 (B) ANMELDETAG: 29-APR-1994 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÖLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1: AGTACTCCAT GGAAAGATAT ACAGATTTAG 30 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÖLS: Genom-DNA (Xi) SEQUENZBBSCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: ÄTCCCGGGTT TTAGAGACTT TGAAGCTACT 30 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 40 Basenpaare (8) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang 18

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(D) TOPOLOGIE: linear <ii) ART OES MOLEKÜLS: Genom-DNA (Xi) SEQÜENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3: CTAGGCTTTT GCAAAAAGCT CCTCGACCAT GGTGTCTTCA (2) ANGABEN 20 SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 40 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4: AGCTTGAAGA CACCATGGTC GAGGAGCTTT TTGCAAAAGC (2) ANGABEN ZU SBQ ID NO: 5: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 22 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5: AGGAGTTAAT GAGGCCAATG GA (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 2i Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (Xi) SEQÜENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6: GACATAGGTA TAGAATCCGG A (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 63 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear 19 60 10 15 20 25 30 35 40 45 50

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(ii> ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7: AGTTTAAACG GCGCGCCCGG GCTCGAGAGG CCTCTGCAGA TGCATCCATG GGGATCCGAArrc !2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 63 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8: GAATTCGGAT CCCCATGGAT GCATCTGCAG AGGCCTCTCG AGCCCGGGCG CGCCGTTTAA ACT (2) ANGABEN ZU SSQ ID NO: 9: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 48 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Binzeistrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9: GATCCTACGT ATCTAGAATT AATTAATGGC CAATTTAAÄT GCCCGGGA (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LANGE: 48 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: AATTTCCCGG GCATTTAAAT TGCCCATTAA TTAATTCTAG ATACGTAG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 45 Basenpaare 63 60 63 48 48 20 55

AT 405 292 B (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11: CTCGTAAAAA TTGAAAAACT ATTCTAATTT ATTGCACGGT CGCGA (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 50 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM.- Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÖLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBONG: SEQ ID NO: 12: CATGGTACGT ACCGTGCAAT AAATTAGAAT AG'ITTTTCAA TTTTTACGAG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 43 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÖLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13: AAACTGCAGG ATGCGATATA TAGTAAGTCC GCAAATGGTA ITA (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14: (i> SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 36 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÖLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14: AGGAATTCAG GCCTGTTTAA TTAATTTGTG CTCTTC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid 21 20 10

AT 405 292 B (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

{ii) ART DES MOLEKÜLS:' Genom-DNA (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15: AGCGCCGCTA CTAGCACTCC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 38 Basenpaare (B) ART; Nucleotid 15 (C) STRANGFORM: Einzelstrang <D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16: GAACGTTAAC ATTTATATCG TGGGGTAAAG TGAAAATC 38 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17: (i) SEQUENZKENNZEICKEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17: TTGGAGAACT TGATACGCCG 20 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 43 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA 45 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18: CATATGCAAT TGTAAATTAA ACAACTAAAT CTGTAAATAA ATA 43 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19: (i) SEQUENZKENNZEICHEN; so (A) LÄNGE: 24 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang 22 55

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(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19: AACGGTCCGG CCCGGGCGGC CGCC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 28 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelscrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNÄ (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20: AATTGGCGGC CGCCCGGGCC GGACCGTT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 21: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Binzeistrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21: CTGCAGAATG AATACCGGAA TTATAGATTT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 27 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22: CCCGGGTTAT GGAGAAGATA CCACGTT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 23: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) länge: 18 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear 23

AT 405 292 B

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23: TGAGAAGAAT tgccgtcg (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24: GTCGACGATA TCTTCTATAA ATATATGAGC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25: TACAGTACCC GAATCTCTAC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 27 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 26: ACAATTGGTA TTAAGTATAA CGACTCC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 26 Basenpaare (B) ART: Nucleotid <C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear 24

AT 405 292 B

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 27: GCCATGGATC ACAACCAGTA TCTCTT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28: ACCCGGGTTA ATTAATTATT GTTCACTTTA (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 29: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 21 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 29: TCCACATCCA tgagattgaa t (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30: <i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 21 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 30: CGATTGATAC ATATCATTAC C (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 31: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 29 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA 25 i n

AT 405 292 B (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31: AACAATTGCA TCATCTGCGA AGAACATCG 29 5 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 30 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang 70 (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32: CAGTTAACTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33: 20 (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 23 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGPORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear „ (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA 30 m M H « m

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33: 30 ACCATGGACT CTAAAGAGAC TAT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 42 Basenpaare (B) ART: Nucleotid 35 (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA 23 40 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34: CAATTGCCCG GGTTAATTAA TGAAATTAAT CATATACAAC TC 42 ^ (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear 50

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA

26

AT 405 292 B (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35: CCTTTAGGTC AGAAGATCGC (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36: (i> SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 32 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36: GTCGACAATT GTTAAAGTAC AAACAACTAG GA (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 20 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37: GCTAACATCA TACCCTCCTG (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 32 Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE; linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 38: GTCGACGTTA ACAGAAGGAT TGGAATACGC AT (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 39: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 2S Basenpaare (B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear

(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBÜNG: SEQ ID NO: 39: 27

Claims

AT 405 292 B TACGTATGGA GACCAACACC CTTCC 25 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: '40: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: <A) LÄNGE: 32 Basenpaare (B) ART: Nucleocid (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40: CCATGGATAT CGGGTTCCCT GCTCTCTGTC OG 32 Patentansprüche 1. Rekombinantes Poxvirus, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer essentiellen Region, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität des Virus notwendig ist; ein Fremd-Polynukleotid, das nicht natürlicherweise im Poxvirus vorkommt, unter transkriptioneller Kontrolle eines Promotors enthält, wobei das Fremd-Polynukleotid für ein Antigen, abgeleitet von Pflanzen, Tieren, Protozoen, Pilzen, Bakterien oder Viren, kodiert.
2. Rekombinantes Poxvirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die essentielle Region einen offenen Leserahmen darstellt, der für ein für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität des Virus notwendiges Protein kodiert.
3. Rekombinantes Poxvirus nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Defekt in der Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität bei einem natürlich vorkommenden Wirt aufweist.
4. Rekombinantes Poxvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Poxviruspromotor, ein von einem Poxvirus abgeleiteter Promotor oder ein synthetischer Promotor ist.
5. Rekombinantes Poxvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die essentielle Region deletiert und durch ein Markergen ersetzt ist.
6. Rekominantes Poxvirus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Markergen ausgewählt ist aus der Gruppe von lacZ, gpt oder hph-Marker.
7. Rekombinantes Poxvirus nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß es im Markergen eine Fremd-Polynukleotidsequenz.kodierend für ein Antigen, abgeleitet von Pflanzen, Tieren, Protozoen, Pilzen, Bakterien oder Viren, enthält.
8. Rekombinantes Poxvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Vaccinia Virus ist.
9. Rekombinantes Poxvirus nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die essentielle Region ein offener Leserahmen ist, ausgewählt aus 17L, FI8R, DI3L, D6R, A8L, J1R, J3R, H4L, A10L und A3L.
10. Zellinie, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Polynukleotidsequenz enthält, die für eine essentielle Funktion, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität eines Poxvirus notwendig ist, kodiert.
11. Zellinie nach Anspruch 10, dadurch kennzeichnet, daß sie eine essentielle Funktion, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität eines Poxvirus notwendig ist, exprimiert, wobei die essentielle 28 AT 405 292 B Region durch einen durch eine Poxvirusinfektion induzierten Promotor kontrolliert wird.
12. Zellinie nach Anspruch 11. dadurch gekennzeichnet, daß der Promotor ein Hsp70-Promotor ist.
13. Zellinie nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine essentielle Funktion, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität eines Poxvirus notwendig ist, exprimiert und nach Infektion mit einem rekombinanten Poxvirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 die defekte virale Funktion komplementiert.
14. Helfervirus, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Polynukleotidsequenz enthält, die für eine essen tielle Funktion, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität eines Poxvirus notwendig ist, kodiert.
15. Helfervirus nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es eine essentielle Funktion, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität eines Poxvirus notwendig ist, exprimiert, wobei die essentielle 75 Region durch einen durch eine Poxvirusinfektion induzierten Promotor kontrolliert wird.
16. Helfervirus nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß es eine essentielle Funktion, die für die Vermehrungsfähigkeit oder Infektiosität eines Poxvirus notwendig ist, exprimiert und nach Infektion mit einem rekombinanten Poxvirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 die 20 defekte essentielle Funktion des Poxvirus komplementiert.
17. Verfahren zur Herstellung eines Proteins, umfassend die Schritte der Bereitstellung eines rekombinanten Poxvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9, Infektion einer Zellinie gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13 mit dem rekombinanten Poxvirus, Züchten der infizierten Zellen unter Bedingungen, die eine 25 Expression des Fremdpolynukleotides erlauben und Isolierung des exprimierten Proteins.
18. Impfstoff, enthaltend ein rekombinantes Poxvirus gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9.
19. Verwendung eines rekombinanten Poxvirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines 30 Impfstoffes. Hiezu 15 Blatt Zeichnungen 35 40 45 50 29 55