DE60302848T2

DE60302848T2 - Expression von genen im modifizierten vaccinia virus ankara durch verwendung eines cowpox ati promoter

Info

Publication number: DE60302848T2
Application number: DE60302848T
Authority: DE
Inventors: Paul Howley; Sonja Leyrer
Original assignee: Bavarian Nordic AS
Current assignee: Bavarian Nordic AS
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2023-05-15
Also published as: DK1404852T3; WO2003097844A1; EA200401505A1; ES2256747T3; PL372091A1; BR0310020A; MXPA04011034A; US20060029619A1; EP1404852A1; EP1404852B1; KR20040108804A; CA2481783A1; DE60302848D1; JP2005525821A; EA009525B1; AU2003240243B2; SI1404852T1; CN1653181A; ATE313641T1; HK1076835A1

Description

Die Erfindung betrifft rekombinantes modifiziertes Vacciniavirus Ankara, das im viralen Genom eine Expressionskassette umfasst, die den Cowpox ATI-Promotor oder ein Derivat davon und eine codierende Sequenz umfasst, wobei die Expression der codierenden Sequenz durch den Promotor reguliert ist. Das Virus kann als Impfstoff oder Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung nützlich sein.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Rekombinante Pockenviren werden allgemein zum Exprimieren von Fremdantigenen in infizierten Zellen verwendet. Ferner werden rekombinante Poxnviren gegenwärtig als vielversprechende Impfstoffe zur Auslösung einer Immunantwort gegen das Fremdantigen getestet, das vom Pockenvirusvektor exprimiert wird. Am beliebtesten sind einerseits Avipoxviren und andererseits Vacciniaviren. US 5,736,368 und US 6,051,410 offenbaren einen rekombinanten Vacciniavirusstamm Wyeth, der HIV-Antigene und Proteine exprimiert. US 5,747,324 offenbart einen rekombinanten Vacciniavirusstamm NYCBH, der Lentivirus-Gene exprimiert. EP 0 243 029 offenbart einen rekombinanten Vacciniavirusstamm Western Reserve, der menschliche Retrovirus-Gene exprimiert.
Zur Expression heterologer Gene in Poxviren sind dem Fachmann mehrere Promotoren bekannt, wie der 30K und 40K Promotor (siehe z.B. US 5,747,324 ), ein starker synthetischer früher/später Promotor (siehe z.B. Sutter et al., Vaccine (1994) 12, 1032-40), der P7.5 Promotor (siehe z.B. Endo et al., J. Gen. Virol. (1991) 72, 699-703) und der Promotor, der von dem Cowpoxvirus A-Typ-Inklusion- (ATI-) Gen abgeleitet wird (Li et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613). Alle diese Promotoren wurden in rekombinanten Vacciniaviren verwendet, um heterologen Gene zu exprimieren, und exprimierten nachweislich diese Gene sehr effizient, was zu relativ hohen Mengen des Proteins führte, für das die heterologen Gene codierten.
Für viele Impfmethoden ist es äußerst wünschenswert, dass das Antigen, gegen das eine Immunantwort ausgelöst werden soll, in hohen Mengen exprimiert wird. Dies ist jedoch nicht immer der Fall. Es wurde beschrieben, dass verschiedene Arten von zytotoxischen T-Zellen (CTL) vom Immunsystem abhängig von den Konzentrationen des Antigens induziert werden. CTL geringer Avidität werden durch hohe Konzentrationen von Antigen induziert, während CTL hoher Avidität durch geringe Konzentrationen von Antigen induziert werden. In Tierversuchssystemen wurde gezeigt, dass CTL hoher Avidität viel effektiver beim Beseitigen des belastenden Virus sind als CTL geringer Avidität. Ferner wurde gezeigt, dass hohe Konzentrationen von Antigen CTL hoher Avidität hemmen oder sogar abtöten können. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass es manchmal wünschenswert ist, eher geringe Mengen an Antigen zu verwenden, um größere Mengen an CTL hoher Avidität zu induzieren und somit eine effektive Immunantwort auszulösen (Berzofsky et al., Immunological Reviews (1999) 170, 151-172).
AUFGABE DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein auf Vacciniavirus basierendes System bereitzustellen, dass die Expression eines heterologen Gens, das in dem Vacciniavirus-Genom enthalten ist, in relativ geringen Mengen nach der Verabreichung an ein Tier, einschließlich eines Menschen, ermöglicht, was eine Voraussetzung für die Induzierung relativ hoher Mengen an CTL hoher Avidität sein könnte.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Aufgabe wurde durch die Bereitstellung eines rekombinanten modifizierten Vacciniavirus Ankara (MVA) gelöst, dessen Virusgenom eine den Cowpox-ATI-Promotor oder ein Derivat davon und eine codierende Sequenz umfassende Expressionskassette umfasst, wobei die Expression der codierenden Sequenz durch den Promotor reguliert wird. Es war unerwartet, dass der ATI-Promotor eine relativ geringe Aktivität in MVA hat, da von dem Promotor bekannt war, dass er in anderen Poxvirensystemen sehr aktiv ist (z.B. Li et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613). Im Gegensatz dazu wird in dem Beispielabschnitt der vorliegenden Beschreibung gezeigt, dass der ATI-Promotor zwei- bis viermal weniger aktiv in Systemen auf MVA-Basis ist als in Systemen, die auf anderen Vacciniavirusstämmen basieren, wie Western Reserve, Elstree oder Copenhagen. Somit ist der ATI-Promotor in MVA ein guter Promotor zur Expression von Genen, die für Proteine codieren, gegen die CTL hoher Avidität induziert werden sollen.
Das modifizierte Vaccinia-Ankara- (MVA-) Virus ist mit dem Vacciniavirus verwandt, einem Mitglied der Gattung Orthopoxvirus in der Familie der Poxviridae. MVA wurde durch 516 serielle Durchläufe auf CEF (Chicken Embryo Fibroblasts) des Ankara-Stamms des Vacciniavirus (CVA) erzeugt (siehe Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 [1975)). Infolge dieser langfristigen Durchläufe fehlten in dem erhaltenen MVA-Virus etwa 31 Kilobasen seiner genomischen Sequenz und wurde daher als starke Wirtszelle beschrieben, die auf Vogelzellen beschränkt ist (Meyer, H., et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). Es wurde in zahlreichen Tiermodellen gezeigt, dass das erhaltene MVA signifikant avirulent war (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). Zusätzlich wurde dieser MVA-Stamm in klinischen Versuchen als Impfstoff zur Immunisierung gegen die menschliche Pockenerkrankung getestet (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jeder MVA-Stamm verwendet werden. Beispiele für MVA-Virusstämme, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden und entsprechend den Anforderungen des Budapester Vertrags hinterlegt wurden, sind die Stämme MVA 572 und 575, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) unter der Hinterlegungsnummer ECACC V94012707 beziehungsweise ECACC V00120707 hinterlegt wurden, und MVA-BN mit der Hinterlegungsnummer ECACC V00083008.
Der bevorzugteste MVA-Stamm ist MVA-BN oder ein Derivat davon. Die Merkmale von MVA-BN, die Beschreibung biologischer Tests, die eine Evaluierung ermöglichen, ob ein MVA-Stamm MVA-BN oder ein Derivat davon ist, und Verfahren, die ermöglichen, MVA-BN oder ein Derivat davon zu erhalten, sind in WO 02/42480 offenbart. Auf den Inhalt dieser Anmeldung wird in der vorliegenden Anmeldung Bezug genommen.
Zur Vermehrung von MVA werden eukaryotische Zellen mit dem Virus infiziert. Die eukaryotischen Zellen sind Zellen, die für eine Infektion mit dem entsprechenden Poxvirus anfällig sind und eine Replikation und Produktion eines infektiösen Virus ermöglichen. Für MVA sind ein Beispiel für diese Art von Zellen CEF(Chicken Embryo Fibroblasts) und BHK-Zellen (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. und Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells" J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). CEF-Zellen können unter Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, kultiviert werden. Vorzugsweise werden die CEF-Zellen in serumfreiem Medium in stationären Kolben oder Rollflaschen kultiviert. Die Inkubation dauert vorzugsweise 48 bis 96 Stunden bei 37°C ± 2°C. Für die Infektion wird MVA vorzugsweise bei einer "Multiplicity of Infection" (MOI) von 0, 05 bis 1 TCID₅₀ verwendet und die Inkubation dauert vorzugsweise 48 bis 72 Stunden bei 37°C + 2°C.
Die Sequenz des Promotors des Cowpox-Virus-A-Typ-Inklusion-Proteingens (ATI-Promotors) ist dem Fachmann bekannt. In diesem Zusammenhang wird auf den Eintrag in der Genebank unter der Zugriffsnummer D00319 verwiesen. Eine bevorzugte ATI-Promotor-Sequenz ist als SEQ ID.: Nr. 1 dargestellt und wie folgt:
5'GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT 3'
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, den ATI-Promotor wie in SEQ. ID.: Nr. 1 spezifiziert, zu verwenden, oder ein Derivat des ATI-Promotors zu verwenden, das eine Teilsequenz gemäß SEQ. ID.: Nr. 1 sein kann. Der Begriff "Teilsequenz gemäß SEQ. ID.: Nr. 1" bezieht sich auf kürzere Fragmente der Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1, die noch als Promotor aktiv sind, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor. Ein typisches Fragment der Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1 hat eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden, bevorzugter von mindestens 15 Nukleotiden, insbesondere von mindestens 20 Nukleotiden, insbesondere von mindestens 25 Nukleotiden der Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1. Die Teilsequenz kann vorzugsweise Nukleotide 25 bis 29 der Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1 umfassen, d.h., die Sequenz 5'-TAAAT-3', die sich am 3'-Ende der Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1 befindet. Die Teilsequenz kann auch die Nukleotide 22 bis 29 von SEQ. ID.: Nr. 1 umfassen, d.h., die Sequenz 5'-TAATAAAT-3', die sich am 3'-Ende von SEQ. ID.: Nr. 1 befindet.
Der Promotor kann stromaufwärts einer codierenden Sequenz derart inseriert sein, dass die Nukleotide 28 bis 29 der SEQ. ID.: Nr. 1 (in der obenstehenden Sequenz unterstrichen) Teil des 5'ATG3'-Startcodons der Translation sind. Als Alternative kann der Promotor durch mehrere Nukleotide vom Startcodon der Translation getrennt sein. Der Spacer zwischen dem 3'-Ende des Promotors gemäß SEQ. ID.: Nr. 1 und dem A in dem 5'ATG3'-Startcodon ist vorzugsweise weniger als 100 Nukleotide, bevorzugter weniger als 50 Nukleotide und insbesondere weniger als 25 Nukleotide. Der Spacer kann sogar länger sein, solange der Promotor noch imstande ist, die Expression der codierenden Sequenz zu steuern, die stromabwärts des Promotors liegt.
Das Derivat des ATI-Promotors kann auch eine Sequenz sein, die eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Bezug auf die SEQ. ID.: Nr. 1 aufweist, wobei die Derivate noch als Promotor aktiv sind, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor. Eine Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen ist eine Sequenz, in der eine oder mehrere Nukleotide der Sequenz gemäß SEQ. ID.: Nr. 1 durch verschiedenen Nukleotide ersetzt sind. Eine Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotidinsertionen ist eine Sequenz, in der ein oder mehrere Nukleotide an einer oder mehreren Stellen der Sequenz gemäß SEQ. ID.: Nr. 1 inseriert sind. Eine Sequenz mit einer oder mehreren Nukleotiddeletionen ist eine Sequenz, in der ein oder mehrere Nukleotide der Sequenz gemäß SEQ. ID.: Nr. 1 an einer oder mehreren Stellen deletiert sind. In den Derivaten der SEQ. ID.: Nr. 1 können Deletionen, Substitutionen und Insertionen in einer Sequenz kombiniert sein.
Vorzugsweise hat das Derivat eine Homologie von mindestens 40%, bevorzugter mindestens 60% und insbesondere mindestens 80%, insbesondere mindestens 90% im Vergleich mit der Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1. Gemäß der bevorzugtesten Ausführungsform sind nicht mehr als 6 Nukleotide, bevorzugter nicht mehr als 3 Nukleotide substituiert, deletiert und/oder in die Sequenz von SEQ. ID.: Nr. 1 inseriert.
Insbesondere kann es bevorzugt sein, die Nukleotide 25 bis 29 von SEQ. ID.: Nr. 1, d.h., die Sequenz 5'-TAAAT-3', im Promotor zu behalten, um eine maximale Promotor-Aktivität zu erreichen. Es kann auch bevorzugt sein, die Nukleotide 22 bis 29 von SEQ. ID.: Nr. 1 zu behalten, d.h., die Sequenz 5'-TAATAAAT-3 im Promotor.
Eine Reihe von Dokumenten nach dem Stand der Technik ermöglicht dem Fachmann die Vorhersage, welche Derivate von SEQ. ID.: Nr. 1 noch die biologische Aktivität haben, als Vacciniavirus-Promotor aktiv zu sein, insbesondere als später Vacciniavirus-Promotor. In diesem Zusammenhang wird auf Chakrarbarti et al., Biotechniques (1997) 23, 1094-1097, und Davison und Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771-784, verwiesen. Ob ein Fragment noch als Vacciniavirus-Promotor aktiv ist, insbesondere als später Promotor, kann ferner leicht von einem Fachmann geprüft werden. Insbesondere kann das Sequenzderivat stromabwärts eines Reportergens in einem Plasmidkonstrukt geklont werden. Das Konstrukt kann in eine eukaryotische Zelle oder Zelllinie transfektiert werden, wie CEF- oder BHK-Zellen, die mit MVA infiziert sind. Die Expression des Reportergens wird dann bestimmt und mit der Expression des Reportergens verglichen, die durch den Promotor gemäß SEQ. ID.: Nr. 1 gesteuert wird. Der Versuchsaufbau entspricht dem Beispiel, das in der vorliegenden Beschreibung dargestellt ist. Ein Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Derivat mit einer Promotor-Aktivität in dem Testsystem von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 30%, insbesondere mindestens 50%, insbesondere mindestens 70%, insbesondere mindestens 90% im Vergleich mit der Aktivität der Promotor-Sequenz von SEQ ID.: Nr. 1. Ebenso liegen jene Derivate von SEQ ID.: Nr. 1 im Umfang der vorliegenden Erfindung, die eine höhere Promotor-Aktivität als SEQ ID.: Nr. 1 haben.
Allgemeiner gesagt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung des Cowpox-ATI-Promotors oder eines Derivates davon, wie zuvor definiert, für die Expression der codierenden Sequenzen in MVA.
Der ATI-Promotor kann zum Exprimieren eines Gens verwendet werden, das bereits Teil des MVA-Genoms ist. Ein solches Gen kann ein Gen sein, das ein natürlicher Teil des viralen Genomes oder ein Fremdgen ist, das bereits in das MVA-Genom inseriert wurde. In diesen Fällen wird der ATI-Promotor stromaufwärts des Gens im MVA-Genom inseriert, dessen Expression vom ATI-Promotor gesteuert wird.
Der ATI-Promotor kann auch zur Regulierung der Expression eines Gens verwendet werden, das noch nicht Teil des MVA-Genoms ist. In diesem Fall ist bevorzugt, eine Expressionskassette zu konstruieren, die den ATI-Promotor und eine codierende Sequenz umfasst, deren Expression von dem ATI-Promotor reguliert wird, und die Expressionskassette in das MVA-Genom zu inserieren. Bevorzugte Insertionsstellen werden aus (i) natürlich vorkommenden Deletionsstellen des MVA-Genoms, bezogen auf das Genom des Vacciniavirusstamms Copenhagen, oder (ii) Zwischengenbereichen des MVA-Genoms gewählt. Der Begriff "Zwischengenbereich" betrifft vorzugsweise jene Teile des viralen Genoms, die zwischen zwei benachbarten Genen liegen, die weder codierende noch regulatorische Sequenzen umfassen. Die Insertionsstellen sind jedoch nicht auf diese bevorzugten Insertionsstellen beschränkt, da es im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt, dass die Expressionskassette überall in dem viralen Genom inseriert werden kann, solange es möglich ist, Rekombinanten zu erhalten, die in mindestens einem Zellkultursystem, wie CEF- (Chicken Embryo Fibroblasts) Zellen, amplifiziert und vermehrt werden können. Somit kann die Insertionskassette auch z.B. in nichtessentielle Gene oder Gene inseriert werden, deren Funktion von dem Zellsystem ergänzt werden kann, das für die Vermehrung von MVA verwendet wird.
Die Verfahren, die zum Konstruieren von rekombinantem MVA notwendig sind, sind dem Fachmann bekannt. Zum Beispiel kann die Expressionskassette und/oder der ATI-Promotor oder ein Derivat davon in das Genom von MVA durch homologe Rekombination inseriert werden. Zu diesem Zweck wird eine Nukleinsäure in eine permissive Zelllinie, wie CEF- oder BHK-Zellen, transfektiert, wobei die Nukleinsäure die Expressionskassette und/oder den ATI-Promotor oder ein Derivat davon umfasst, flankiert von Nukleotid-Teilen, die zu der Region des MVA-Genoms homolog sind, in welchen die Expressionskassette und/oder der ATI-Promotor oder ein Derivat davon inseriert werden soll. Die Zellen werden mit MVA infiziert und in den infizierten Zellen kommt es zu einer homologen Rekombination zwischen der Nukleinsäure und dem viralen Genom. Als Alternative ist es auch möglich, die Zellen zuerst mit MVA zu infizieren und dann die Nukleinsäure in die infizierten Zellen zu transfektieren. Wieder kommt es zu einer Rekombination in den Zellen. Das rekombinante MVA wird dann durch Verfahren selektiert, die nach dem Stand der Technik bekannt sind. Die Konstruktion eines rekombinanten MVA ist nicht auf dieses besondere Verfahren beschränkt. Statt dessen kann jedes geeignete Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, für diesen Zweck verwendet werden.
Der ATI-Promotor in MVA kann zur Steuerung der Expression jeder codierenden Sequenz verwendet werden. Die codierende Sequenz kann vorzugsweise für mindestens ein antigenes Epitop oder Antigen codieren. In diesem Fall kann das rekobminante MVA zum Exprimieren des Antigens nach Infektion von Zellen in einem Organismus, z.B. einem Säugetier, einschließlich eines Menschen, verwendet werden. Die Präsentation des Antigen/Epitops kann eine Immunantwort in dem Organismus hervorrufen, die zu einer Schutzimpfung des Organismus gegen das Agens, von dem das Antigen/Epitop abgeleitet wird, führt. Insbesondere kann das Epitop/Antigen Teil einer größeren Aminosäuresequenz sein, wie eines Polyepitops, Peptids oder Proteins. Beispiele für solche Polyepitope, Peptide oder Proteine können Polyepitope, Peptide oder Proteine sein, die von (i) Viren, wie HIV, HTLV, Herpesvirus, Denguevirus, Poliovirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Hepatitisviren und so weiter, (ii) Bakterien, (iii) Pilzen abgeleitet werden.
Als Alternative kann die codierende Sequenz für eine therapeutische Verbindung, wie Interleukine, Interferone, Ribozyme oder Enzyme, codieren.
Das rekombinante MVA kann dem tierischen oder menschlichen Körper der Kenntnis des Fachmanns entsprechend verabreicht werden. Somit kann das rekombinante MVA der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel (d.h., pharmazeutische Zusammensetzung) oder Impfstoff nützlich sein.
Die pharmazeutische Zusammensetzung oder der Impfstoff kann im Allgemeinen einen oder mehrere pharmazeutisch verträgliche und/oder anerkannte Träger, Zusatzstoffe, Antibiotika, Konservierungsmittel, Hilfsmittel, Verdünnungsmittel und/oder Stabilisatoren zusätzlich zu dem rekombinanten MVA enthalten. Solche Hilfssubstanzen können Wasser, Kochsalzlösung, Glycerol, Ethanol, Benetzungsmittel oder Emulgatoren, pH-Puffersubstanzen oder dergleichen sein. Geeignete Träger sind für gewöhnlich große, langsam metabolisierte Moleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäure-Copolymere, Lipidaggregate oder dergleichen.
Für die Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen oder Impfstoffe wird das rekombinante MVA in eine physiologisch verträgliche Form umgewandelt. Dies kann basierend auf der Erfahrung in der Herstellung von Poxvirus-Impfstoffen erfolgen, die zur Schutzimpfung gegen Pocken verwendet werden (wie von Stickl, H. et al., [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 be schrieben ist). Zum Beispiel wird das gereinigte Virus bei –80°C mit einem Titer von 5 × 10⁸ TCID₅₀/ml gelagert, formuliert in etwa 10 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,4. Für die Herstellung von Impfstoffgaben werden z.B. 10¹ bis 10⁹ Partikel des rekombinanten Virus gemäß der vorliegenden Erfindung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in Gegenwart von 2% Pepton und 1% Humanalbumin in einer Ampulle, vorzugsweise einer Glasampulle, lyophilisiert. Als Alternative können die Impfstoffgaben durch schrittweises Gefriertrocknen des Virus in einer Formulierung produziert werden. Diese Formulierung kann weitere Zusatzstoffe, wie Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Lactose oder Poylvinylpyrrolidon, oder andere Zusatzstoffe, wie Antioxidantien oder Inertgas, Stabilisatoren oder rekombinante Proteine (z.B. Humanserumalbumin) enthalten, die zur in vivo Verabreichung geeignet sind. Eine typische virushaltige Formulierung, die zur Gefriertrocknung geeignet ist, umfasst 10 mM Tris-Puffer, 140 mM NaCl, 18,9 g/l Dextran (MW 36000 bis 40000), 45 g/l Sucrose, 0,108 g/l L-Glutaminsäuremonokaliumsalz-Monohydrat, pH 7,4. Die Glasampulle wird dann dicht verschlossen und zwischen 4°C und Raumtemperatur über mehrere Monate gelagert. Solange jedoch kein Bedarf besteht, wird die Ampulle vorzugsweise bei Temperaturen unter –20°C gelagert.
Zur Impfung oder Therapie kann das Lyophilisat oder das gefriergetrocknete Produkt in 0,1 bis 0,5 ml einer wässerigen Lösung, vorzugsweise Wasser, physiologische Kochsalzlösung oder Tris-Puffer, aufgelöst werden und entweder systemisch oder lokal, d.h., über einen parenteralen, intramuskulären oder anderen Verabreichungsweg, verabreicht werden, wie dem geübten Praktiker bekannt ist. Die Art der Verabreichung, die Dosis und die Anzahl von Verabreichungen kann auf bekannte Weise von Fachleuten optimiert werden.
Somit betrifft die Erfindung gemäß einer zugehörigen Ausführungsform ein Verfahren zur Beeinflussung, vor zugsweise Auslösung einer immunologischen Reaktion in einem lebenden Tierkörper, einschließlich eines Menschen, das die Verabreichung des Virus, der Zusammensetzung oder des Impfstoffs gemäß der vorliegenden Erfindung an ein zu behandelndes Tier oder einen zu behandelnden Menschen umfasst. Für gewöhnlich umfasst eine Impfstoffgabe mindestens 10², vorzugsweise mindestens 10⁴, insbesondere mindestens 10⁶, insbesondere 10⁸ TCID₅₀ (infektiöse Gewebekulturdosis) des Virus.
Es ist ein besonderer Vorteil des rekombinanten MVA gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere des rekombinanten MVA-BN und seiner Derivate, dass das Virus zur Prime-Boost-Verabreichung verwendet werden kann. Somit betrifft die Erfindung des Weiteren ein Verfahren, in dem das Virus, die Zusammensetzung oder der Impfstoff einem bedürftigen Tier, einschließlich eines Menschen, in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Inokulation ("Primer-Inokulation") und in einer zweiten Inokulation ("Booster-Inokulation") verabreicht wird.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Einführung einer codierenden Sequenz in Zielzellen, bei dem man die Zielzellen mit dem Virus gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert. Die Zielzelle kann eine Zelle sein, in der das Virus zur Replikation imstande ist, wie CEF- oder BHK-Zellen, oder eine Zelle, die mit MVA infiziert werden kann, in der das Virus jedoch nicht repliziert, wie alle Arten menschlicher Zellen.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren eine Wirtszelle mit dem rekombinanten Virus gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert, die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und ferner das von der Wirtzelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtzelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert. Wenn das Virus gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, d.h., amplifiziert, werden soll, muss die Zelle eine Zelle sein, in der das Virus replizieren kann, wie CEF- oder BHK-Zellen. Wenn ein Peptid/Protein erzeugt werden soll, für das das Virus codiert, vorzugsweise ein Protein/Peptid, für das eine codierende Sequenz codiert, deren Expression von dem ATI-Promotor oder einem Derivat davon gesteuert wird, kann die Zelle jede Zelle sein, die mit dem rekombinanten Virus infiziert werden kann, und die die Expression von MVA-codierten Proteinen/Peptiden ermöglicht.
Die Erfindung betrifft des Weiteren Zellen, die mit dem Virus gemäß der vorliegenden Erfindung infiziert sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: Ergebnisse einer PCR-Reaktion für den Nachweis der Gegenwart von RNA, die von dem ATI-Promotor in einem rekombinanten MVA nach Infektion von CEF-Zellen exprimiert wird (siehe Beispiel 2).
2: Ergebnisse eines Western-Blots mit Proteinen, die von Zellen isoliert wurden, die mit verschiedenen rekombinanten MVAs infiziert wurden. 2A: nicht reduzierende Bedingungen, nicht erwärmte Proteine; 2B: reduzierende Bedingungen, nicht erwärmte Proteine; C: nicht reduzierende Bedingungen, erwärmte Protein. Bahnen 1, 3, 4 sind die Zelllysate von Zellen, die mit MVA-ATI-NS1, MVA-GFP beziehungsweise nicht infizierten Zellen infiziert sind. Bahnen 5, 7, 8 sind die Überstände von Zellen, die mit MVA-ATI-NS1, MVA-GFP beziehungsweise den Überständen von Zellkontrollen infiziert sind. Bahnen 2 und 6 wurden leer gelassen.
Beispiele
Die folgenden Beispiele erklären die vorliegende Erfindung näher. Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die bereitgestellten Beispiele in keiner Weise als Einschränkung der Anwendbarkeit der Technologie, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, auf diese Beispiele zu verstehen sind.
Beispiel 1: Aktivität des Cowpox-ATI-Promotors in verschiedenen Vacciniavirusstämmen
Das Ziel dieses Beispiels war, die Stärke des Cowpox-ATI-Promotors in verschiedenen Vacciniavirusstämmen zu analysieren.
Einleitung:
Der Cowpox-ATI-Promotor wurde an das GUS- (E. coli β-Glucuronidase) Reportergen zur Expressionsanalyse fusioniert. BHK- (Baby Hamster Kidney) Zellen wurden mit verschiedenen Vacciniavirusstämmen infiziert und mit einem Plasmid transfektiert, das den ATI-Promotor enthielt, der an das GUS-Gen fusioniert war. Die analysierten Vacciniavirusstämme umfassten CVA, Copenhagen, Elstree, IHD, Western Reserve und MVA-BN. Bei einem funktionalen Promotor würde GUS exprimiert werden und könnte durch eine enzymatische Reaktion quantifiziert werden.
Materialien und Geräte

– BHK-Zellen (ECACC Nr. 84100501)
– Alle Vacciniaviren wurden mit einem Titer von 7,5 × 10⁷ TCID₅₀ pro ml verwendet
– Plasmid pBNX73 (pBluescript + ATI-Promotor + GUS)
– Effectene Transfektionskit (Qiagen)
– DMEM-Zellkulturmedien (Gibco BRL)
– FCS (Gibco BRL)
– Lysis-Puffer (PBS + 0,1 % Triton + 1mM Protease-Inhibitor)
– GUS-Substrat 1 mM (p-Nitrophenyl-Beta-(D)-Glucuronid; Sigma, Kat. Nr. N1627)
– Stopplösung 2,5 M (2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol; Sigma, Kat. Nr. A9754)

Verfahren:
Beimpfung von Zellen
5 × 10⁵ BHK-Zellen wurden pro Transfektion in eine Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen geimpft und in DMEM/10% FCS über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ gehalten.
Infektion/Transfektion
Zellen wurden mit den verschiedenen Vacciniavirusstämmen (MOI 0,1) in 0,5 ml DMEM/10% FCS pro Vertiefung infiziert und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttelapparat inkubiert. Die Transfektion wurde laut Beschreibung im Herstellerprotokoll durchgeführt. 2 μg Plasmid wurden in Puffer EB verdünnt (100 μl Gesamtvolumen). Nach der Zugabe einer 3,2 μl Verstärkerlösung wurde die Lösung gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden 10 μl Effectene-Reagens zugegeben, die Suspension wurde gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Virussuspension wurde von den Zellen entfernt und 1,6 ml DMEM/10% FCS wurden zugegeben. 0,6 ml DMEM/10% FCS wurden zu der DNA-Effectene-Mischung zugegeben und auf die Zellen getropft, während die Kulturplatte gedreht wurde. Die Zellen wurden dann 48 Stunden inkubiert.
Ernten der Zellen
Das Medium wurde von den Zellen entfernt und 0,5 ml Lysis-Puffer wurde zugegeben. Nach 15 min Schütteln bei RT wurden die Zellen im Lysis-Puffer abgeschabt, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und heftig verwirbelt. Lysierte Zellen wurden 1 min bei 500 rcf und 4°C zentrifugiert, der klare Überstand wurde in eine frische Ampulle überführt und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Bestimmung der GUS-Aktivität
10 μl Zellextrakt (= Protein von 2 × 10⁴ Zellen) wurde einer 1 ml vorgewärmten Substratlösung (37°C) zugegeben und bei 37°C inkubiert, bis sich eine gelbe Farbe entwickelte. Dann wurden die Proben sofort auf Eis gelegt und 0,4 ml Stopplösung zugegeben. Die Extinktion bei 415 nm wurde bestimmt und mit der GUS-Aktivität gleichgesetzt, da Extinktionswerte zwischen 0,05 und 2,0 in einem linearen Bereich sind. Die Substratlösung wurde als Referenz verwendet, und ein Zellextrakt nicht infizierter Zellen wurde als negative Kontrolle verwendet.
Ergebnisse:
Die Quantifizierung der GUS-Aktivität, die von dem ATI-Promotor-GUS-Genkonstrukt in BHK-Zellen exprimiert wurde, die mit den verschiedenen Vacciniavirusstämmen infiziert waren, ergab die folgenden Ergebnisse:
Beispiel 2: Expression von Fremdgenen, die in das MVA-Genom inseriert und durch den Cowpox-ATI-Promotor reguliert waren
Das Ziel dieses Beispiels war der Nachweis, dass der ATI-Promotor imstande ist, Gene zu regulieren und zu exprimieren, wenn sie in das Genom von MVA inseriert waren.
Einleitung:
Der Cowpox-ATI-Promotor wurde an das nicht strukturelle (NS) 1 Gen des Denguevirus fusioniert. Diese Expressionskassette wurde in einen Rekombinationsvektor inseriert, der Sequenzen umfasste, die zu dem MVA-Genom homolog waren. In dem erhaltenen Rekombinationsplasmid war die Expressionskassette von Sequenzen flankiert, die zu den Sequenzen im MVA-Genom homolog waren, in das die Expressionskassette inseriert werden sollte. CEF-Zellen wurden mit MVA-BN infiziert und mit dem Rekombinationsvektor transfektiert, der die ATI-Promotor-NS1-Expressionskassette umfasste. In den Zellen trat eine homologe Rekombination zwischen dem MVA-Genom und dem Rekombinationsplasmid ein, wodurch ein rekombinantes MVA-Genom erhalten wurde. Nach mehreren Reinigungsdurchgängen wurde analysiert, ob das NS1-Protein in dem rekombinanten MVA von dem ATI-Promotor exprimiert wurde. In parallelen Experimenten wurde eine Expressionskassette, die eine Sequenz umfasste, die für ein HIV-Polytop unter der Steuerung des ATI-Promotors codierte, in das MVA-Genom inseriert, und es wurde erneut getestet, ob der ATI-Promotor in MVA aktiv ist und das HIV-Polytop exprimiert.
Materialien und Geräte

– Primäre CEF-Zellen
– Baby Hamster Kidney Zellen (BHK; Hinterlegung 85011433 bei der European Collection of Animal Cell Cultures)
– MVA-BN mit einem Titer von 10⁸ TCID₅₀/ml
– Plasmid pBN74 und pBN84; pBN74 umfasst eine Sequenz, die für ein HIV-Polytop unter der Steuerung eines ATI-Promotors codiert, und pBN84 umfasst die codierende Sequenz für das Denguevirus NS1 Protein unter der Steuerung des ATI-Promotors. Zusätzlich zu der Expressionskassette, die die Deguevirus codierende Sequenz beziehungsweise die HIV-Polytop codierende Sequenz umfasst, umfassen beide Plasmide ein G418 Resistenzgen und ein Gen, das für das grüne fluoreszierende Protein codiert, als Markergene. Die Markergene, wie auch die Expressionskassetten für Denguevirus NS1 beziehungsweise das HIV-Polytop, sind von MVA-Sequenzen flankiert, die zu der Region des MVA-Genoms homolog sind, in die die heterologen Gene zu inserieren sind.
– Effectene Transfektionskit (Qiagen)
– VF-SFM Zellkulturmedien (Gibco BRL)
– RNeasy RNA Isolierungskit (Qiagen)
– DNAse, RNAse-frei (Roche)
– MMLV Reverse Transkriptase (Promega)
– Taq DNA Polymerase (Roche)
– RNAse Inhibitor RNAsin (Promega)
– Die folgenden Oligonukleotide wurden von MWG, Deutschland, gekauft: Primer oBN465 ggtctgatttccatcccgtac (21 Nukleotide), der für die Reserve Transkriptase Reaktion verwendet wird,; Primer oBN463 gaactgaagtgtggcagt (18 Nukleotide), der zur PCR verwendet wird; Primer pBN464 cggtggtaatgtgcaagatc (20 Nukleotide), der zur PCR verwendet wird.

Methoden Integration ins MVA-Genom durch homologe Rekombination
Die zuvor beschriebenen Plasmide pBN74 oder pBN84 wurden zum Integrieren einer HIV-Polytop codierenden Sequenz beziehungsweise der Dengue NS1 Expressionskassette in das MVA-Genom durch homologe Rekombination zwischen einerseits MVA-Sequenzen, die die Expressionskassetten in pBN74 oder pBN84 flankierten, und andererseits den homologen Zielsequenzen innerhalb des MVA-Genoms verwendet. Dies wird durch Transfektieren des linearisierten Plasmids pBN74 oder pBN84 in Chicken Embryo Fibroblasts (CEF-) Zellen erreicht, die zuvor mit MVA bei geringer Multiplicity of Infection infiziert worden waren. Insbesondere wurden CEF-Zellen in Platten mit 6 Vertiefungen geimpft und über Nacht bei 37°C und 5% CO₂ in VP-SFM gehalten. Die Zellen wurden mit MVA-BN (MOI 1,0) in 0,5 ml VP-SFM pro Vertiefung infiziert und 1 h bei Raumtemperatur auf einem Schüttelapparat inkubiert. Die Transfektion der Zellen entweder mit pBN74 oder pBN84 wurde laut der Beschreibung im Herstellerprotokoll durchgeführt. 48 Stunden nach der Infektion oder sobald die Infektion Konfluenz erreicht hat, wird ein virales Extrakt hergestellt und bei –20°C gelagert und ist für die Selektion und Klonreinigung der gewünschten rekombinanten MVA (rMVA) bereit.
Selektion rekombinanter MVA (rMVA) und Klonreinigung
Die Eliminierung des nicht rekombinanten MVA (leeres Vektorvirus) und die Amplifizierung von rMVA wird durch Infektion konfluenter Chicken Embryo Fibroblast (CEF-) Zellen bei einer geringen MOI in Gegenwart von G418 erreicht (die Menge von G418 muss optimiert werden, um die höchste Dosis zu bestimmen, die die CEF-Zellen nicht abtötet). Jedes Virus, das kein integriertes NPT II Gen enthält, repliziert nicht in Gegenwart von G418, das dem Zellerhaltungsmedium zugegeben wird. G418 hemmt die DNA-Replikation, aber da die CEF-Zellen im stationären, nicht replizierenden Zustand sind, werden sie durch die Wirkung von G418 nicht beeinflusst. CEF-Zellen, die mit rMVAs infiziert sind, können unter einem Fluoreszenzmikroskop augrund der Expression des verstärkten flureszierenden grünen Proteins sichtbar gemacht werden.
Virale Extrakte aus dem homologen Rekombinationsschritt werden seriell verdünnt und zum Infizieren frischer CEF-Zellen in Gegenwart von G418 verwendet. Die infizierten Zellen werden mit Agarose mit niederem Schmelzpunkt bedeckt. Nach 2 Tagen Infektion werden die Platten unter einem fluoreszierenden Mikroskop auf einzelne Herde grüner infizierter Zellen untersucht. Diese Zellen werden markiert und Agarosepropfen, die die infizierten Zellherde enthalten, werden entnommen und in 1,5 ml Mikrozentrifugationsröhrchen überführt, die steriles Zellerhaltungsmedium enthalten. Virus wird aus dem Agarosepropfen durch dreifaches Gefrieren-Auftauen der Röhrchen bei –20°C freigesetzt.
Das rekombinante MVA mit der inserierten Dengue-NS1-Expressionskassette, das in dieser Erfindung beschrieben ist, wurde als MVA-ATI-NS1 bezeichnet.
Nachweis der RNA, die vom ATI-Promotor in rekombinantem MVA exprimiert wird
Für den Nachweis der RNA, die vom ATI-Promotor in Zellen exprimiert wird, die mit dem rekombinanten MVA infiziert sind, wurde eine RNA-Extraktion wie laut Beschreibung im Herstellerprotokoll durchgeführt (Rneasy Mini Protocol for the Isolation of Total RNA from Animal Cells). Eine DNAse-Aufschlussreaktion wurde durch Zugabe von 3 μl DNAse RNAse-frei (= 30U; Roche), 3 μl 10 × Puffer A (üblicherweise für Restriktionen verwendet, Roche) zu 5 μg RNA in einem Volumen von 30 μlm, eingestellt mit Wasser, durchgeführt. Die Mischung wurde 90' bei 37°C inkubiert. RNA wurde unter Verwendung von Rneasy-Säulen entsprechend dem Herstellerprotokoll gereinigt. Zur reversen Transkription wurden 2 μg RNA mit 1 μg Primer oBN465 zur reversen Transkription gemischt und das Gesamtvolumen wurde durch Zugabe von Wasser auf 10 μl eingestellt. Dies wurde 5' bei 70°C inkubiert und das Röhrchen wurde auf Eis überführt. Dann wurden 5 μl 5 × Puffer, 5 μl dNTP Mischung (10 μM), 0,5 μl Rnasin, 2 μl M-MLV RT (200U) und 2,5 H₂O zugegeben und die Mischung wurde 60' bei 42°C inkubiert.
Für die PCR-Amplifikation wurden 5 μl der RT-Reaktion mit 36 μl H₂O, 5 μl 10 × Puffer, 1 μl dNTPs, 2 ml jedes Primers oBN463 und oBN464 (10 μM) und 1 μl Taq-Polymerase gemischt. Die DNA wurde in 25 Zyklen amplifiziert (1 min Extension, Annealing-Temperatur 55°C) und durch Gelelektrophorese analysiert.
Nachweis des Denguevirus N1 Proteins, das in Zellen exprimiert wird, die mit MVA-ATI-NS1 infiziert sind
Ein 25 cm² Kolben mit etwa 80% konfluenten Monoschichten von BHK Zellen wurde mit 100 μl MVA-ATI-NS1 Virusstamm, verdünnt auf 1 × 10⁷ in MEMα mit 1% FCS inokuliert und bei Raumtemperatur 30 Minuten geschüttelt. 5 ml MEMα mit 3% FCS wurden jedem Kolben zugegeben und bei 30°C in einem CO₂ Inkubator inkubiert. Der Kolben wurde nach 48 Stunden geerntet. Der Überstand wurde aus dem Kolben entfernt und bei 260 g 10 Minuten bei 4°C rotiert. Die Überstände wurden in Teilmengen bei –80°C gelagert. Das Pellet wurde zweimal mit 5 ml 1xPBS gewaschen und dann in 1 ml hypotonem Douncing-Pufer mit 1% TX100 resuspendiert. Die Zelllysate wurden geerntet und 5 Minuten bei 16000 g rotiert und die Überstände wurden in einem Mikrozentrifugationsröhrchen bei –80°C gelagert.
Kolben, die mit Kontrollviren inokuliert waren, und nicht infizierte Kolben wurden auch auf dieselbe Weise wie zuvor beschrieben behandelt.
Das Zell-/virale Lysat und der Überstand wurden entweder in einem nicht reduzierenden oder reduzierenden Probenpuffer entweder unter nicht erwärmten oder erwärmten Bedingungen behandelt. Die Proteine wurden auf 10% SDS PAGE getrennt und auf Nitrozellulosemembrane überführt. Die Blots wurden über Nacht mit gepoolten Seren von konvaleszenten Patienten (PPCS), d.h., Seren von Patienten, die an einer Denguevirusinfektion litten, bei 1:500 Verdünnung sondiert. Nach drei Waschungen mit 1x PBS wurden die Blots mit Anti-Mensch-IgG-Meerrettichperoxidase (HRP) (DAKO) 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem die Blots wie zuvor beschrieben gewaschen worden waren, wurde die Farbe unter Verwendung von 4-Chloro-1-naphthol entwickelt. Die Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
Ergebnisse
Das NS1 Gen wie auch das HIV Polytop wurden nachweislich exprimiert, wenn sie durch den Cowpox-ATI-Promotor reguliert wurden (1). Die entsprechende mRNA war klar nachweisbar. Insbesondere war das erwartete Signal von 926 bp nach RT-PCR der RNA-Probe klar nachweisbar (1, Bahn 2). Unter Verwendung nur der Probe für PCR war kein Signal nachweisbar (1, Bahn 3). Daher kann ein falsch-positives Signal, das durch DNA-Kontamination verursacht wird, ausgeschlossen werden. 1, Bahn 4 zeigt das Ergebnis der PCR mit der positiven Plasmidkontrolle. Wie erwartet, war die Größe des PCR-Produkts mit der Größe des PCR-Produkts nach RT-PCR der RNA-Probe identisch. 1, Bahn 5 zeigt das Ergebnis einer RT-PCT Reaktion mit einer negativen Kontrolle (Wasser). 1, Bahn 1 und 6 sind Molekulargewichtsmarker (100bp Leiter).
Die Western Blot Ergebnisse zeigten, dass NS1 in Zellen exprimiert wird, die mit MVA-ATI-NS1 infiziert sind. NS1 wurde in der rechten Konformation und als ein Dimer unter nicht erwärmten Bedingungen exprimiert, wie in Bahn 1 von 1A und 2B dargestellt ist. Wenn die Probe erwärmt wurde, wird das NS1 Monomer sichtbar, wie in 2C dargestellt ist.
Die Ergebnisse zeigten auch, dass NS1, das in Zellen exprimiert wird, die mit MVA-ATI-NS1 infiziert sind, antigen ist und von den gepoolten konvaleszenten Patientenseren erkannt wird.
Als Schlussfolgerung haben die Versuche gezeigt, dass NS1 in der rechten Konformation in den BHK Zellen exprimiert wird, die mit MVA-ATI-NS1 infiziert sind. Sowohl das Dimer wie auch das Monomer sind antigen und werden von den gepoolten konvaleszenten Patientenseren erkannt.
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT RULE 13bis)
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT RULE 13bis)
ANGABEN ZU EINEM HINTERLEGTEN MIKROORGANISMUS (PCT RULE 13bis)
SEQUENZLISTE

Claims

Rekombinantes modifiziertes Vacciniavirus Ankara (MVA), dessen Virusgenom eine den Cowpox-ATI-Promotor oder ein Derivat davon umfassende Expressionskassette und eine codierende Sequenz umfaßt, wobei die Expression der codierenden Sequenz durch den Promotor oder dessen Derivat reguliert wird und wobei es sich bei dem Derivat des ATI-Promotors um (i) eine Sequenz mit einer Homologie von mindestens 60% im Vergleich mit der Sequenz von SEQ ID: Nr. 1, (ii) eine Sequenz, in der höchstens 6 Nukleotide in der Sequenz von SEQ ID: Nr. 1 substituiert, deletiert und/oder inseriert sind, und/oder (iii) eine Teilsequenz der Sequenz gemäß SEQ ID: Nr. 1, wobei die Teilsequenz eine Länge von mindestens 10 Nukleotiden der Sequenz von SEQ ID: Nr. 1 aufweist, handelt, wobei die Sequenz und Teilsequenz aus (i), (ii) und/oder (iii) noch als Promotor aktiv sind.
Rekombinantes MVA nach Anspruch 1, wobei die Sequenz und Teilsequenz gemäß (i), (ii) und/oder (iii) noch als später Vacciniavirus-Promotor aktiv sind.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei die Teilsequenz aus (iii) eine Länge von mindestens 20 Nukleotiden der Sequenz von SEQ ID: Nr. 1 aufweist.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Teilsequenz aus (iii) eine Länge von mindestens 25 Nukleotiden der Sequenz von SEQ ID: Nr. 1 aufweist.
Rekombinantes MVA nach Anspruch 1, wobei die Sequenz aus (i) eine Homologie von mindestens 80% im Vergleich mit der Sequenz von SEQ ID: Nr. 1 aufweist.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Sequenz aus (i), (ii) und/oder die Teilsequenz aus (iii) die Nukleotide 25 bis 29 und/oder 22 bis 29 von SEQ ID: Nr. 1 umfaßt.
Rekombinantes MVA nach Anspruch 1, wobei der ATI-Promotor die Sequenz von SEQ ID: Nr. 1 aufweist.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das MVA ausgewählt ist aus dem unter der Nummer V00083008 bei der European Collection of Cell Cultures (ECACC) hinterlegten Stamm MVA-BN oder einem Derivat davon sowie dem unter der Nummer V00120707 bei der ECACC hinterlegten Stamm MVA 575.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Expressionskassette an einer natürlich vorkommenden Deletionsstelle des MVA-Genoms, bezogen auf das Genom des Vacciniavirusstamms Copenhagen, oder in einem Zwischengenbereich des MVA-Genoms inseriert ist.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die codierende Sequenz für mindestens ein Antigen, antigenes Epitop und/oder eine therapeutische Verbindung codiert.
Rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 10 als Impfstoff oder Arzneimittel.
Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein rekombinantes MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Verwendung des rekombinanten MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Impfstoffs oder Arzneimittels zum Hervorrufen einer Immunantwort gegen das Agens, aus dem das von der codierenden Sequenz codierte Antigen/Epitop stammt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Antigen/Epitop Teil eines aus einem Virus, Bakterium oder Pilz stammenden Polypeptids, Peptids oder Proteins ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das Virus ausgewählt ist aus HIV, HTLV, Herpesvirus, Denguevirus, Poliovirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus und Hepatitisviren.
Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Impfstoff, die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel mindestens 10² TCID₅₀ (infektiöse Gewebekulturdosis) des Virus umfaßt.
Impfstoff oder pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 oder 16 oder Verwendung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei der Impfstoff, die pharmazeutische Zusammensetzung oder das Arzneimittel in therapeutisch wirksamen Mengen in einer ersten Inokulation ("Primer-Inokulation") und in einer zweiten Inokulation ("Booster-Inokulation") zu verabreichen ist.
Verfahren zur Einführung einer codierenden Sequenz in Zielzellen, bei dem man die Zielzellen mit dem Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 10 infiziert, wobei es sich bei der Zielzelle nicht um eine Zelle im menschlichen und/oder tierischen Körper handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids, Proteins und/oder Virus, wobei man in dem Verfahren a) eine Wirtszelle mit dem Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 10 infiziert, b) die infizierte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen kultiviert und c) das von der Wirtzelle produzierte Peptid und/oder Protein und/oder die von der Wirtzelle produzierten Viren isoliert und/oder anreichert.
Zelle, enthaltend das Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 10.
Verwendung des Cowpox-ATI-Promotors oder eines Derivats davon mit der in einem der Ansprüche 1 bis 7 angegebenen Bedeutung zur Expression von codierenden Sequenzen in MVA.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten MVA nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei man in einem Verfahrensschritt eine Expressionskassette in das MVA-Genom inseriert.