MXPA06005559A - Promotores para la expresion en vaccinia virus ankara modificado - Google Patents

Abstract

La invención se relaciona con promotores, en particular para la expresión de genes y/o secuencias codificadoras del vaccinia virus como el vaccinia virus ankara modificado (MVA). La invención se relaciona además con casetes de expresión que comprenden el promotor, los vectores que comprenden lo casetes de expresión, asícomo composiciones farmacéuticas y vacunas.

Description

PROMOTORES PARA LA EXPRESIÓN EN VACCINIA VIRUS ANKARA MODIFICADO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con promotores, en particular con la expresión de genes y/o secuencias codificadoras en vaccinia virus como el vaccinia virus Ankara Modificado (MVA) . La invención se relaciona además con casetes de expresión que comprenden el promotor, promotores que comprenden el cásete de expresión, así como con composiciones farmacéuticas y vacunas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los poxvirus recombinantes son ampliamente usados para expresar antígenos externos o ajenos en células infectadas. Además, los poxvirus recombinantes son actualmente probados como vacunas muy prometedoras para inducir una respuesta inmune contra el antígeno externo o ajeno expresado del vector del poxvirus. Los más populares son los' avipoxvirus por un lado y los vaccinia virus en particular el vaccinia virus Ankara Modificado (MVA) por otro lado. El MVA esta • relacionado con vaccinia virus, un miembro del género ortopoxvirus de '-la familia poxviridae.

El MVA ha sido generado por 516 pases en serie en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara de vaccinia virus (CVA) (para una revisión veáse Mayr, A et al Infection 3, 6-14 [1975] ) . Como consecuencia de esos pases a largo plazo el virus MVA resultante suprimió aproximadamente 31 kilobases de su secuencia genómica y, por lo tanto, fue descrito como altamente restringido a células anfitriona en células de aves ( (Meyer, H. et al . , J. Gen, Virol. 72, 1031-1038 [1991]). Se mostró en una variedad de modelos animales que el MVA resultante fue significativamente avirulento (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41:225-34). Adicionalmente, esta cepa de MVA ha sido probada en ensayos clínicos como vacuna para inmunizar contra la enfermedad de la viruela humana (Mayr et al . , Zbl. Bakt. Hyg. 1, Abt. Org. B 157, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974] ) . La US 5,736,368 y la US 6,052,410 describen la cepa de vaccinia virus recombinante Wyeth que expresa antígenos y proteínas de VIH. La US 5,747,324 describe una cepa de vaccinia virus recombinante NYCBH que expresa el género ?entivirus. La EP 0 243 029 describe una cepa de vaccinia virus recombinante Western Reserve que expresa genes de retrovirus humano. La WO 02/42480 describe cepas de MVA atenuadas y particularmente seguras. Los MVA recombinantes son descritos inter alia en la WO 98/13500 y WO 03/048184.

Para la expresión de genes heterólogos en poxvirus son conocidos unos cuántos promotores por los expertos en la técnica, como los promotores 30K y 40K (véase por ejemplo la US 5,747,324), un promotor temprano/tardío sintético fuerte (véase por ejemplo Sutter et al., Vaccine (1994) 12, 1032-40), el promotor P7.5 (véase, Endo et al., J. Gen. Virol . (1991) 72, 699-703) y el promotor derivado de la inclusión tipo A del virus de la viruela vacuna (ATI) (Li et al., J. Gen. Virol. (1998) 79, 613) . Todos esos promotores han sido usados en vaccinia virus recombinantes para expresar genes heterólogos y mostraron expresar los genes, dando como resultado la producción de la proteína codificada por el gen heterólogo. Puesto que únicamente están disponibles unos cuantos promotores para la expresión de genes en sistemas de expresión de vaccinia virus, existe, en general, la necesidad de promotores alternativos en vaccinia virus. Además todos los promotores conocidos son más que promotores tardíos fuertes, es decir, útiles para la expresión de genes después de que ha ocurrido la replicación del vector de vaccinia virus. Para alguna aplicación es deseable tener promotores que permitan la expresión de genes inmediatamente después de la infección de las células; es decir que existe la necesidad de promotores tempranos de vaccinia virus.

Además, como se indico anteriormente, el MVA es un virus muy prometedor para " la expresión de genes heterólogos debido a su perfil de seguridad mejorado. Sin embargo, todos los promotores conocidos para la expresión de proteína heteróloga en MVA fueron derivados de otros vaccinia -virus o son promotores sintéticos para la expresión en otros vaccinia virus. De este modo, también existe la necesidad de promotores que optimicen la expresión en MVA.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con promotores derivados del genoma del vaccinia virus Ankara Modificado (MVA) . Los promotores de MVA no eran conocidos aún en la técnica. En partícula la invención se relaciona con un promotor que comprende o que consiste de una secuencia nucleotídica seleccionada del grupo que comprende: (i) La secuencia nucleotídica de cualquiera de las siguientes SEQ ID NO: 1 a 6: 5' CTGCAATATTGTTATCGTAATTGGAAAAATAGTGTTCGAGTGAGTTGGATTATGTG AGTATTGGATTGTATATTTTATTTTATATTTTATATTTTGTAGTAAGAATAGAATGCTA ATGTCAAGTTTATTCCA?TAGATGTCTTATTAA?AAACATATATAATA?ATAACA 3' (SEQ ID NO: 1) 5GATAAAAATTTAAAGTGTA?ATATAACTATTATTTTATAGTTGTAATAAAAAGGGAAA TTTGATTGTATACTTTCGGTTCTTTAAAAGAAACTGACTTGATAAAA 3' (SEQ ID NO: 2) ' GCATTTCATCTTTCTCCAATACTAATTCAAA ' TTGTTAAATAAATAATGGATAGTAT AAATAGTTATTAGTGATA?AAT?GTAAAAATAATTATTAGAATA?GAGTGTAGTATCAT AGATAACTCTCTTCTATAAAA 3 ' ( SEQ ID NO : 3 ) ' GATCTATAAAGGTAGACCTAATCGTCTCGGATGACCATATATTTATTTTCAGTTTTA TTATACGCATAAATAGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAAA 3 ' ( SEQ I D NO : 4 ) ' GGTAA?CTTTAAG?CATGTGTGTTATACTAAGATGGTTGGCTTATTOCATAGTAGCTTG TGGAATTTATAAACTTATGATAGTAAAACTAGTACCCAATATGTAAAGATGAA?AAGTAAA TTACTATTAACGCCGTCGGTATTCGTTCATCCATTCAGTT 3 ' ( SEQ ID NO : 5 ) ' ATTTCTCGGTAGCACATCAAATGATGTTACCACTTTTCTTAGCATGCTTAACTTACT AAATATTCATAACTAATTTTTATTA?TGATACAAAAACGAAATAAAACTGC?TATTATA CACTGGTTAACGCCCTTATAGGCTCTAACCATTTT (SEO ID NO: 6) ' (ii) Las subsecuencias de las secuencias de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 1 a 6 (ii) Las secuencias que tienen una o más sustituciones, supresiones 'y/o inserciones nucleotídicas con respecto a las secuencias como se definen en (i) o (ii) Las SEQ ID NO: 1 a 6 son una parte natural del genoma de MVA y se localizan corriente arriba de los marcos de lectura A42R, J6R, FßR, I2R, C7L y B9R, respectivamente. Los promotores de acuerdo a la presente invención son preferiblemente activos como promotores de vaccinia virus o activos como promotores en células infectadas por vaccinia virus. El vaccinia virus es preferiblemente MVA en particular una de las cepas de MVA como se especifica más adelante. "Activo como Promotor de Vaccinia Virus" significa que el promotor puede dirigir la expresión de un gen el cual se liga operativamente a un vaccinia virus después de la infección de las células con el virus. Las células son preferiblemente células que permiten la expresión tardía/temprana del vaccinia virus. "Un promotor activo en células infectadas por vaccinia virus" incluye también la situación en la cual el promotor no es parte del genoma de vaccinia virus, por ejemplo parte de un plásmido o un genoma viral diferente del de vaccinia virus; en tal situación el promotor de acuerdo con la presente invención es activo si la célula que comprende el promotor también comprendé un genoma de vaccinia virus, por ejemplo, si la célula esta infectada con un vaccinia virus. Bajo esas circunstancias la ARN polimerasa viral reconoce al promotor de acuerdo a la presente 'invención y la expresión del gen/secuencia codificadora está ligada al promotor es activada.

De acuerdo a la presente invención es posible usar cualquiera de los promotores "especificados como SEQ ID N0:1 a SEQ ID NO: 6. El promotor que sea usado realmente para dirigir la expresión del gen/secuencia codificadora puede consistir de cualquiera de las SEQ ID N0:1 a la SEQ ID NO: 6 o el promotor realmente usado puede ser cualquier estructura grande que comprenda cualquiera de la SEQ ID N0:1 a la SEQ ID NO: 6. De manera alternativa está dentro del alcance de la presente invención usar un derivado de esos promotores, el cual puede ser una subsecuencia de la secuencia definidas en cualquiera de las SEQ ID NO:l a 6. El término "Subsecuencia de las secuencias de acuerdo con cualquiera de la SEQ ID NO:l a 6" se refiere a fragmentos más cortos de cualquiera de la SEQ ID N0:1 a 6 que son aún activos como promotores, en particular promotor en vaccinia virus o células infectadas por vaccinia virus. Nuevamente, el vaccinia virus es preferiblemente MVA, como una de las cepas especificadas más adelante. Una subsecuencia típica de cualquiera de la SEQ ID NO:l a la SEQ ID NO: 6 tiene una longitud" de al menos 15 nucleótidos, y de manera más preferible de al menos 20 nucleótidos, de manera aún más preferible de al menos 25 nucleótidos, de manera aún más preferible de al menos 30 de cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO:l a la SEQ ID NO: 6. Una subsecuencia preferida de la SEQ ID NO:l es la SEQ ID NO: 7. Una subsecuencia preferida de la SEQ ID NO; 2 es la SEQ ID NO: 8. Las subsecuencias y/o derivados preferidos de las subsecuencias de las SEQ ID NO: 3 son la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10. Las subsecuencias preferidas de la SEQ ID NO: 4 son las SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 11. Las secuencias de la SEQ ID NO : 6 a 12 se dan la sección de ejemplos . El derivado del promotor que comprende o que consiste de una secuencia nucleotídica de cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 6 o una subsecuencia de la misma, en particular un derivado de la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 12 también puede ser una secuencia que tenga una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones nucleotídicas con respecto a cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO: 1 a 6 o subsecuencias de la misma, en particular de las secuencias nucleotídicas de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 12. Los derivados de acuerdo a la presente invención son aún activos como promotores, en particular como promotores de vaccinia virus en vaccinia virus o "en células infectadas con vaccinia virus, de manera más preferible como promotor de MVA en MVA o células infectadas con MVA. Una secuencia que tiene una o más sustituciones nucleotídicas es una secuencia en la cual uno o más nucleótidos de la secuencia de acuerdo con cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 6 o subsecuencias de la misma, como las secuencias de acuerdo a cualquiera de la SEQ ID NO: 7 a 12 están sustituidas por diferentes nucleótidos. Una secuencia que tiene una o más inserciones nucleotídicas es una secuencia en la cual uno o más- nucleótidos están insertados en uno o más lugares en cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 6 o subsecuencias de las mismas, en particular de las secuencias nucleotídicas de la SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 12. Una secuencia que tiene una o más supresiones nucleotídicas es una secuencia en la cual uno o más nucleótidos de la secuencia de acuerdo a cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 6 o subsecuencias de las mismas, en particular de las secuencias nucleotídicas de la SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 12 están suprimidos. En los derivados de acuerdo a la presente invención las supresiones, sustituciones o inserciones pueden ser combinadas en una secuencia . Un ejemplo de un derivado de una subsecuencia de acuerdo a la presente invención es la SEQ ID NO: 10, la cual es una subsecuencia de la SEQ ID NO: 3 que tiene además un cambio de nucleótido con respecto a la secuencia nucleotídica correspondiente en la SEQ ID NO: 3. Preferiblemente el derivado tiene una homología de al menos el 40%, de manera más preferible de al menos 60%, de manera a un más preferible de al menos 80%, de manera más preferible de al menos 90% cuando se compara con cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a la SEQ ID NO: 6 o subsecuencias de las mismas, " en particular de las secuencias de acuerdo a cualquiera de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 12. De acuerdo a la modalidad más preferida no más de 10 nucleótidos, de manera aún más preferible no más de 5 nucleótidos están sustituidos, suprimidos y/o insertados en la secuencia de cualquiera de la SEQ ID NO: 7 a la SEQ ID NO: 12. Un conjunto de documentos de la técnica anterior permite al experto en la técnica predecir cuales derivados o subsecuencias de cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 12 tienen aún la actividad biológica para ser activos como un promotor de vaccinia virus, en particular como promotor activo en MVA. En este contexto se hace referencia a Cakrarbarti et al., Biotechniques (1997)23, 1094-1097 y Davison and Moss, J. Mol. Biol. (1989)210, 771-784. Además, si un fragmento es aún activo, el producto de vaccinia virus, en particular, un promoctor de MVA puede ser fácilmente evaluado por un experto en la técnica. En particular, la secuencia derivada puede ser clonada corriente arriba de un gen reportero en un constructo plasmídico. El constructo o pl+asmido recombinate puede ser transferido a una célula o línea celular eucariótica, como las células CEF o BHK que han sido infectadas con MVA. La expresión del gen reportero es determinada y comparada con la expresión del gen reportero controlada por el promotor de acuerdo a cualquiera de la SEQ" ID NO: 1 a 6. Un derivado de acuerdo a la presente invención es un derivado que tiene una actividad de promotor en el sistema de prueba de al menos 10%, de manera preferible de al menos 30%, de manera más preferible de al menos 50%, de manera aún más preferible de al menos 70%, de manera más preferible de al menos 90% en comparación con la actividad de la secuencia productora de cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 6. También aquellos derivados de cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 12 están dentro del alcance de la presente invención que tienen una actividad promotora mayor. Los promotores de acuerdo a la presente invención son particularmente adecuados para la expresión de secuencias codificadoras en MVA. El promotor de toda la SEQ ID NO: 1 tiene una actividad muy fuerte, en particular de promotor tardío aunque también puede ser usado como un promotor temprano. La misma consideración se aplica a las subsecuencias correspondientes como la secuencia de la SEQ ID NO: 7, la cual es, sin embargo, particularmente útil como promotor tardío . El promotor de acuerdo a la SEQ ID NO: 2 también tiene una actividad más que fuerte, en particular como promotor tardío. También puede ser usado como un promotor temprano. La misma consideración se aplica a las subsecuencias correspondientes, cómo la secuencia de la SEQ ID NO: 8, la cual es, sin embargo, particularmente útil como promotor tardío. El promotor de acuerdo a la SEQ ID NO: 3 es particularmente útil como promotor temprano y tiene la actividad de promotor temprano más alta de todos los promotores probados. Sin embargo, también puede ser usado como promotore tardío. Las mismas consideraciones se aplican a las subsecuencias correspondientes, como las secuencias de la SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente. De esas subsecuencias la SEQ ID NO: 9 es particularmente útil como promotor temprano y la SEQ ID NO: 10 es particularmente útil como promotor tardío. El promotor de acuerdo a la SEQ ID NO: 4 es particularmente útil si se pretende expresar la secuencia codificadora ligada temprana o tardíamente puesto que éste promotor tiene una activadas más que alta bajo condiciones tempranas así como tardías. La misma consideración se aplica -a las subsecuencias correspondientes, como las secuencias de la SEQ ID NO: 11 y 12, respectivamente. Esas subsecuencias de la SEQ ID NO: 11 son particularmente útiles como promotoras tempranos y la SEQ ID NO: 12 es particularmente útil como promotor tardío. Los promotores de acuerdo a la SEQ ID NO: 5 y 6 son particularmente útiles si se pretende expresar secuencias codificadoras ligadas' ' en cantidades más que bajas. Esto es algunas veces deseable si la secuencia codificadora ligada codifica para un producto de un gen tóxico y/o si se pretende inducir una propuesta inmune altamente ávida. El término "promotor temprano" se refiere a promotores que son activos en vaccinia virus o células infectadas con vaccinia virus, antes de que haya ocurrido la replicación del ADN viral. Los expertos en la técnica conocen los métodos de cómo puede ser verificado si un promotor es un promotor temprano. En particular, el promotor de interés puede ser insertado corriente arriba de un gen reportero. El constructo o plásmido recombinante que comprende el promotor y el gen reportero son introducidos en células que están infectadas con vaccinia virus. Para evaluar la actividad como promotor temprano las células son incubadas con una sustancia que inhibe la replicación del ADN como AraC. La replicación del ADN es un prerrequisito para la- actividad del promotor tardío. De este modo, cualquier actividad promotora que sea medida en este sistema de ensayo se debe a elementos activos como promotores tempranos. En consecuencia, el término "promotor tardío" se refiere a cualesquier promotores que estén activos después de que ha tomado lugar la replicación del ADN. La actividad tardía también puede ser medida por métodos conocidos por los exp.ertós en la técnica. Con el propósito de simplificar, el término "promotor tardío" como se usa en la presente solicitud se refiere a la actividad de un promotor que es determinada si no se agrega sustancia que bloquee la replicación del ADN. De acuerdo a una modalidad más, la presente invención se refiere a un cásete de expresión que comprende el promotor de acuerdo a la presente invención y una secuencia codificadora, donde la expresión de la secuencia codificadora es controlada por el promotor. El cásete de expresión preferiblemente no es un cásete de expresión natural en el genoma de un vaccinia virus. De este modo, si el promotor de acuerdo a la presente invención es un promotor natural en el genoma del vaccinia virus, la secuencia a la cual el promotor está ligado es preferiblemente diferente de la secuencia a la cual el promotor está ligado de manera natural en el genoma de vaccinia virus. En otras palabras, si el promotor de acuerdo -a la presente invención es idéntico a un promotor natural, la secuencia codificadora, la expresión de la cual es controlada por el promotor y/o las secuencias localizadas entre el promotor y la secuencia codificadora, son diferentes de las secuencias correspondientes a las cuales el promotor está ligado de manera natural. El término "diferente" en este contexto se refiere a secuencias que muestran al " menos una diferencia nucleotídica en la secuencia. Preferiblemente esta es la secuencia codificadora que tiene al menos una diferencia nucleotídica. De acuerdo a otras alternativas, la homología entre la secuencia codificadora en el cásete de expresión y la secuencia a la cual el promotor está ligado de manera natural es de menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40% o aún menos del 20%. De manera más preferible, la secuencia codificadora que es controlada por el promotor de acuerdo a la presente invención codifica para un péptido/proteína que tiene una diferencia de al menos un aminoácido en comparación con las proteínas naturales codificadas por la secuencia codificadora. A manera de ejemplo el cásete de expresión no es el cásete de expresión que comprende el promotor de vaccinia virus C7L natural que dirige la expresión del gen C7L natural, por ejemplo, el cásete de expresión no es el cásete de expresión descrito en la WO2004/015118 que comprende el promotor de C7L y la secuencia codificadora de C7L. Por otro lado, si la secuencia deberá ser expresada es una secuencia : de vaccinia virus natural el promotor que es usado para expresar las secuencias diferentes del promotor que dirige la expresión de la secuencia codificadora en el contexto natural. De acuerdo a esta alternativa, la secuencia ñucleotídica del promotor difiere en al menos un nucleótido de la secuencia del promotor de vaccinia virus natural. De acuerdo a otras alternativas, la homología del promotor de acuerdo a la presente invención que controla la expresión de la secuencia de vaccinia virus y el promotor natural ligado a la secuencia de vaccinia virus es de menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60&, menos del 50, o aún menos del 40%. Preferiblemente, la secuencia codificadora puede codificar para al menos un epítope antigénico o antígeno, péptidos o proteínas terapéuticas, ARN antisentido o ribozimas. Si la secuencia codificadora codifica para un epítope de antígeno o antígeno el cásete de expresión puede ser usado para expresar el antígeno después de la introducción del cásete de expresión en células en un organismo, por ejemplo, un animal mamífero, incluyendo un humano. La presentación del antígeno/epítope puede producir una respuesta inmune en los organismos, que puede conducir a la vacunación del organismo contra el agente del cual se derivó el antígeno/epítiope . De manera más específica, el epítipe/antígeno puede ser parte •. de una secuencia de aminoácidos más grande como un poliepítope, péptido o proteína. Preferiblemente, la secuencia codificadora codifica para al menos un epítope antigénico o antígeno, péptidos o proteínas terapéuticas, ARN antisentido o ribozimas las cuales no son codificadas por el genoma de un vaccinia virus. Los ejemplos de esos poliepítopes, péptidos o proteínas pueden ser poliepítopes, péptidos o proteínas derivadas de (i) virus, en particular virus diferentes a los vaccinia virus, como el VIH, VLTH, Herpesvirus, Dengevirus, Poliovirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la rubéola, virus de la hepatitis y así sucesivamente, (ii) bacterias, (iii) hongos, (iv) polipéptidos/proteínas relacionadas con tumores como antígenos relacionados con tumores. En términos más generales la invención se relaciona con cualquier secuencia de ácido nucleico que comprenda el promotor de acuerdo a la presente invención y/o el cásete de expresión de acuerdo a la presente invención. El ácido nucleico puede ser ARN, por ejemplo si el promotor es parte de un genoma retroviral. De manera más preferible, el ácido nucleico es ADN. El ADN puede ser cualquier tipo de ADN como ADN lineal, circular, de una sola hebra o de doble hebra. De acuerdo a una -'modalidad más el promotor y/o cásete de expresión de acuerdo a la presente invención puede ser parte de un vector. El término "vector" se refiere a cualesquier vectores conocidos por los expertos en la técnica. Un vector puede ser un vector plasmídico como el pBR322 o un vector de la serie pUC. De manera más preferible el vector es un vector de virus. En el contexto de la presente invención el término "vector viral" o "vector de virus" se refiere a un virus infeccioso que comprende un genoma viral. En este caso, el ADN de la presente invención es parte del genoma viral del vector viral respectivo. El 'genoma viral recombinante es empaquetado y los vectores recombinantes obtenidos pueden ser usados para la infección de células y líneas celulares, en particular para la infección de animales vivientes incluyendo humanos. Los vectores de virus típicos que pueden ser usados de acuerdo a la presente invención son vectores adenovirales, vectores retrovirales o vectores basados en el virus adenoasociado 2 (AAV2 ) . Los más preferidos son los vectores poxvirales . El poxvirus puede ser un virus de la viruela del canario, un virus de la viruela aviar o un vaccinia virus. - El más preferido es el vaccinia virus Ankara modificado (MVA) (Sutter, G. et al. [1994], Vaccine 12:1032-40; Antoine, G. et al. [1998], Virology 244:365-396) . El término "MVA" como ¡se usa en la presente solicitud se refiere a cualquier cepa de MVA conocida en la técnica anterior. Un ejemplo de una cepa de MVA es el depósito VR- 1508, depositado en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20108, "EUA. En los. ejemplos adicionales de cepas de virus MVA usadas de acuerdo a la presente invención son las cepas MVA 572 y 575 depositadas en la Colección Europea de Cultivos de Células de Animales (ECACC), Salisbury (RU) con el número de depósito ECACC V94012707 y ECACC V00120707, respectivamente, MVA-BN con el número de depósito ECACC V00083008. La cepa de MVA más preferida es la MVA-BN o un derivado de la misma. Las características de la MVA-BN, la descripción de los ensayos biológicos que permiten evaluar si una cepa de MVA es MVA-BN o un derivado de la misma y métodos que permiten obtener la MVA-VN o un derivado de la misma se describen en la WO02/42480. El contenido de esta solicitud se incluye en la presente solicitud como referencia. En particular, se hace referencia a la definición de las propiedades del vaccinia virus de acuerdo a la invención como se describe en la WO 02/42480, como las propiedades de MVA y las propiedades y definiciones de los derivados de MVA-BN, la referencia también describe como el MVA y otros vaccinia virus pueden ser propagados. De manera breve, son infectadas células eucarióticas con el virus. Las células eucarióticas son- células' que son susceptibles a la infección con respecto al poxvirus' o virus de la viruela y permiten la replicación y producción de virus infecciosos. Para el MVA un ejemplo de este tipo de células son los fibroblastos de embrión 'de pollo (CEF) y células BHK (Drexler I., Heller K., Wahren'B., Erfle V y Sutter G. "Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hámster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cells"" J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). Las células CEF pueden ser cultivadas bajo condiciones conocidas por el experto en la técnica. Preferiblemente las células CEF son cultivadas en medio libre de suero en matraces estacionarios o botellas giratorias . La incubación preferiblemente toma lugar de 48 a 96 horas a 37°C + 2°C. Para la infección preferiblemente se usa MVA a una multiplicidad de infección (MOI) de 0.05 a 1 TCID50 y la incubación preferiblemente toma lugar de 48 a 72 horas a 37°C + 2°C. Los expertos en la técnica conocen los métodos de cómo el cásete de expresión o el promotor de acuerdo a la presente invención pueden ser insertados en un genoma viral, en particular en el genoma de un vaccinia virus, de manera más preferible en el genoma de MVA. A manera de ejemplo, el cásete de expresión o el promotor o derivado del mismo de acuerdo a la presente invención puede ser insertado en el genoma de MVA por recombinación homologa. Hasta este punto un ácido nucleico es transfectado en una línea celular permisiva, como las células CEF o BHK, donde el ácido nucleico comprende el cásete de expresión o el promotor o derivado del mismo de acuerdo a la presente invención flanqueado por extensiones de -nucleótidos que son homologas a la región del genoma de MVA en el cual el cásete de expresión o el promotor o el derivado del mismo de acuerdo a la presente invención va a ser insertado. Las células son infectadas por MVA y ocurre la recombinación homologa de las células infectadas entre el ácido nucleico y el genoma viral. De manera alternativa también es posible infectar primero las células con MVA y entonces transfectar el ácido nucleico en las células infectadas. Nuevamente ocurre recombinación en las células . El MVA recombinante es entonces seleccionado por métodos conocidos en la técnica anterior. La construcción del MVA recombinante no se restringe a este método particular. En su lugar, puede ser usado hasta este punto cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. El cásete de expresión o el promotor de acuerdo a la presente invención puede ser introducido en cualquier parte adecuada del vector, en particular en un genoma viral. En el caso de vaccinia virus la inserción puede ser hecha en partes no esenciales del 'genoma viral o en una región intergénica del genoma viral. El término "región intergénica" se refiere preferiblemente a aquellas partes del genoma viral localizadas entre dos genes adyacentes que no comprenden secuencias codificadoras . Si el vector es MVA la inserción también puede hacerse en un sitio de supresión natural del genoma viral. El término "sitio de supresión natural" se refiere a aquellas partes del genoma viral que están suprimidas con respecto al genoma de el vaccinia virus cepa Copenhagen. Sin embargo, los sitios de inserción no están restringidos a esos sitios de inserción preferidos en el genoma de vaccinia virus y el genoma de MVA, puesto que está dentro del alcance de la presente invención que el cásete de expresión pueda ser insertado en cualquier parte en el genoma viral en tanto sea posible obtener recombinantes que puedan ser amplificados y propagados en al menos un sistema de cultivo celular, como fibroblatos de embrión de pollo (células CEF) . El promotor de acuerdo a la presente invención puede ser usado para expresar un gen que ya es parte del vector, por .ejemplo el genoma de MVA. Ese gen puede ser un gen que sea parte naturalmente del genoma viral o un gen externo 'que ya haya sido insertado en el vector. En esos casos el promotor de acuerdo la presente invención es insertado corriente arriba del gen en el vector, la expresión del cual será controlada por el promotor. Un vector de MVA que comprende un cásete de expresión de acuerdo a la presente invención también puede ser producido reemplazando cualquiera de los marcos de lectura abierta A42R, J6R, F6R, I2R, C7L y " B9R por una secuencia codificadora como la expresión de la cual va a ser controlada por el promotor que controla naturalmente la expresión de cualquiera de los marcos de lectura abierta. De este modo, a manera de ejemplo, la secuencia codificadora A42R o partes de la misma puede ser reemplazada por la secuencia codificadora, que va a ser expresada. En el constructo o plasmado recombinante resultante la secuencia codificadora es controlada por un promotor de acuerdo a la invención, es decir por la secuencia promotora de acuerdo a la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 7. Esos casetes de expresión también están dentro del alcance de la presente invención. De acuerdo a una modalidad más la invención se relaciona con un vector de acuerdo a la presente invención como vacuna o medicamento. En términos más generales la invención se relaciona con una vacuna o composición farmacéutica que comprende un cásete de expresión, un ADN o un vector de acuerdo a la presente invención. Los expertos en la técnica conocen los métodos de cómo la vacuna o la composición farmacéutica puede ser administrada al cuerpo animal o humano. En el caso 'del ADN ' y vectores plasmídicos el ADN y el vector pueden ser administrados simplemente por inyección. Si el vector es un vector viral como un vector de vaccinia virus, en particular también puede ser administrado un vector de MVA al cuerpo animal o humano de acuerdo al conocimiento del experto en la técnica, por ejemplo por administración intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica o subcutánea. Los detalles adicionales sobre la cantidad de virus administrada se dan más adelante. La composición farmacéutica o la vacuna pueden incluir, de manera general uno o más excipientes, aditivos, antibióticos, preservativos, adyuvantes, diluentes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables y/o aprobados además del promotor, cásete de expresión o vector de acuerdo a la presente invención. Esas sustancias auxiliares pueden ser agua, solución salina, glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsificantes, sustancias amortiguadoras del pH, o similares. Los excipientes adecuados son típicamente moléculas grandes, metabolizadas lentamente como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, agregados lipidíeos o similares. Para la preparación de las composiciones farmacéuticas o vacunas, el ADN, cásete de expresión o vector de acuerdo a la presente invención, en particular un vaccinia virus recombinante como el MVA recombínante es convertido en una forma fisiológicamente aceptable. Para vaccina virus, en particular, el MVA, esto puede hacerse sobre de la experiencia -de la preparación de vacunas de poxvirus usadas para la vacunación contra la viruela (de acuerdo a lo descrito por Stickl, H et al., [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Por ejemplo, el virus purificado es almacenado a -80 °C con un título de 5xl08 TCID50/ml formulado en aproximadamente Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4. Para la preparación de aplicaciones de vacuna, por ejemplo, 101-109 partículas de virus recombinante de acuerdo a la presente invención en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en presencia de 2% de peptona y 1% de albúmina humana en una ampolleta, preferiblemente una ampolleta de vidrio. De manera alternativa, las aplicaciones de vacuna pueden ser producida por secado por congelamiento gradual del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales como manitol, dextran, azúcar, glicerina, lactosa o polivinilpirrolidona u otros aditivos como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantres (por ejemplo albúmina de suero humano) adecuadas para la administración in vivo . Un virus típico que contiene la formulación adecuada para secar por congelamiento comprende amortiguador de Tris 10 mM, NaCl 140 mM, 18.9 g/1 de dextran (MW 36000-40000), 45 g/1 de Sucrosa, 0.108 g/L de monohidrato de sal monopotásica de ácido L-glutámico pH 7.4. La ampolleta de vidrio es entonces sellada y puede ser almacenada entre'.4 °C y temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, en tanto no exista la necesidad la ampolleta es almacenada preferiblemente a temperaturas inferiores a -20°C. Para la vacunación o terapia el liofilizado o producto secado por congelamiento puede ser disuelto en 0.1 a 0.5 mi de una solución acuosa, preferiblemente agua, solución salina fisiológica o amortiguador de Tris, y administrada sistémica o localmente, es decir por administración parenteral, intramuscular o cualquier otra vía de administración conocida por el experto en la técnica. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones pueden ser optimizadas por el experto en la técnica en una forma conocida. De este modo, de acuerdo a una modalidad relacionada la invención se relaciona con un método para afectar, preferiblemente inducir una respuesta inmunológica en un cuerpo animal viviente, incluyendo un humano que comprende administrar el cásete de expresión, el ADN, el vector, la composición farmacéutica o la vacuna de acuerdo a la presente invención al animal o humano a ser tratado. Si la vacuna es un. vaccinia virus, en particular MVA una aplicación de vacuna típica para humanos comprende al menos 102, preferiblemente al menos 104, de manera más preferible al menos 106, de manera aún más 107 o 108 TCID50 (dosis infecciosa de cultivo tisular) del virus. Si la vacuna es un MVA recombinante, en particular MVA-BN recombinante y sus derivados, aquel virus puede ser usado para la administración del primer refuerzo.

De este modo, la invención se relaciona además con un método, donde el vector es MVA, en particular MVA-BN y sus derivados, y donde el vector o composición o la vacuna que comprende el vector es administrada a un animal, incluyendo un humano que necesite de la misma, en cantidades terapéuticamente efectivas en una primera inoculación ("inoculación cebadora") y en una segunda inoculación ("inoculación re refuerzo") . La invención se relaciona además con un método para introducir una secuencia codificadora en una célula blanco que comprende la introducción del vector, el cásete de expresión o el ADN de acuerdo a la presente invención en la célula blanco. Si el vector es un vaccinia virus, en particular MVA como MVA-BN la célula blanco puede ser una célula en la cual el virus pueda replicarse como célula CEF o BHK o una célula que pueda ser infectada por MVA, pero en la cual el virus no se replique (como todos los tipos de células humanas para, MVA-BN) . La invención se relaciona además con un método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la infección de una célula anfitriona con un vector de virus de acuerdo-, a la presente invención, seguido por el cultivo de la célula anfitriona infectada bajo condiciones adecuadas, y además por el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteína y/o virus producidos, por la célula anfitriona. Si se pretende producir, es decir, amplificar el virus de acuerdo a la presente invención las células tienen que ser células en las cuales el virus pueda replicarse. Para vaccinia virus, en particular el MVA las células adecuadas son células CEF o BHK. Si se pretende producir un péptido/proteína codificada por el vector de virus de acuerdo a la presente invención la célula puede ser cualquier célula que pueda ser infectada por el vector de virus y que permita la expresión de las proteínas/péptidos codificados por el virus. La invención se relaciona además con un método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la transfección de una célula con el cásete de expresión, el ADN o el vector plasmídico de acuerdo a la presente invención, seguido por la infección de la célula con un vaccinia virus. La célula anfitriona infectada es cultivada bajo condiciones adecuadas. Un paso adicional comprende el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteína y/o virus producidos por la célula anfitriona. El paso de infectar las células con un vaccinia virus puede ser infectado antes o después del paso de transfección de las células. La invención se relaciona además con células que comprenden un promotor, ADN, cásete de expresión o vector de acuerdo a la presente invención. En particular, la invención se relaciona con células infectadas con el vector de virus de acuerdo a la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Actividad del GUS después de la expresión de diferentes promotores Se infectaron células con MVA-BN y se transfectaron con los plásmidos apropiados. Después de 48 horas las células fueron extraídas y la actividad de GUS fue determinada indirectamente midiendo la extinción a 415 nm después de la reacción enzimática, la cual causa el desarrollo de color amarillo. Zex = control negativo (células infectadas con MVA-BN) .

Figura 2: actividad de GUS después de la expresión temprana/tardia Se infectaron células con MVA-BN y se transfectaron con .los plásmidos apropiados. Después de 48 horas las células fueron extraídas y la actividad de GUS fue determinada indirectamente midiendo la extinción a 415 nm después de la reacción enzimática, la cual causa el desarrollo de color amarillo. Zex = control negativo (células infectadas con MVA-BN) . Para esa reacción enzimática, tuvieron que ser incubadas muestreas sin expresión AraC (temprana + tardía) durante 5 horas, una que sería incubada con AraC (expresión temprana) para obtener una reacción de color.

Figura 3 : Actividad de GUS después de la actividad por diferentes promotores. Se infectaron células con MVA-BN y se transfectaron con los plásmidos apropiados. Después de 24 horas las células fueron extraídas y la actividad de GUS fue determinada indirectamente midiendo la extinción a 415 nm después de una reacción enzimática, a cual causa el desarrollo de color amarillo. Control = control negativo (células infectadas con MVA-BN) .

Ejemplos Los siguientes ejemplos ilustrarán mejor la presente invención. Será comprendido por un experto en la técnica que lo ejemplos proporcionados no deben ser interpretados de ninguna manera como limitantes de la aplicabilidad de la tecnología proporcionada por la presente invención para estos ejemplos.

Ejemplo 1: Análisis de promotores para expresar secuencias codificadoras en el genoma de MVA-BN 1.1 Propósito principal de experimento : El propósito principal de este análisis fue identificar los promotores que son adecuados, para expresar secuencias codificadoras en el genoma de MVA, preferiblemente secuencias codificadoras que son heterólogas al genoma de MVA. Especialmente para la inserción de dos o más genes en un solo sitio de inserción, es ventajoso usar diferentes promotores para la expresión de genes individuales para reducir el riesgo de eventos de recombinación, lo cual podría dar como resultado la supresión de uno de los genes ajenos. Además es deseable tener promotores de diferentes fuerza para tener la posilibidad de expresar genes ajenos insertados en MVA-BN recombinante en cantidades variables, dependiendo de la fuerza del promotor. Se aisló un total de 11 promotores putativos. Esas secuencias promotoras putativas fueron clonadas en una estructura plasmídica (BSKS+) . Para analizar su actividad potencial, los promotores fueron fusionados al- gen reportero de GUS ( -Glucuronidasa de E. colí) . Se infectaron células BHK (riñon de hámster bebé) con MVA-BN y se transfectaron con los plásmidos quecontienen los promotores putativos fusionados al gen de GUS. Si el promotor fue funcional, GUS se expresó y pudo er cuantificada por una reacción enzimática de Gus. Como control positivo y como referencia se fusionaron los promotores de Vaccinia virus bien caracterizados p7.5 y Ps a GUS y se analizaron en paralelo. Mediante la medición de la expresión de GUS se separaron los promotores putativos sobre la base de la actividad, fuerza y expresión temprana/tardía. La expresión temprana/tardía fue verificada agregando AraC (Arabinosido Citosina) a los medios de cultivo. Los promotores, que mostraron ser funcionales, es decir los promotores Ps, p7.5, 7.51 y ATI que eran conocidos en la técnica anterior así como las secuencias promotoras recién identificadas están implicadas naturalmente en el control de expresión de ORF de MVA, A42L, B9R, C7L, F6R, I2R, J6R pueden ser usados preferiblemente para la expresión de genes ajenos en constructor o plásmidos de MVA recombinantes (recMVA-BN) 1.2 Material Células: células BHK Virus: patrón crudo estándar de MVA-BN (7.5 x 107 TCID50) ADN: pAB-GUS (promotor Ps + GUS) pBNX71 (pBluescript + Vaccinia virus pr7.5 + GUS) pBNX73 (pBluescript + promotor ATI del virus de la viruela vacuna + GUS) pBN81 (pBluescript +promotor H5R modificado + GUS1) pBNdl (pBluescript + promotor B1R de MVA + 5 GUS) pBN62 (pBluescript + promotor de B2R de MVA + GUS) pBN63 (pBluescript + promotor B3R de MVA + GUS) 10 pBN60 (pBluescript + promotor A30R de MVA + GUS) pBN82 (pBluescript + promotor 7.5L Vaccinia virus + GUS) pBN83 (pBluescript + promotor C7L de MVA 15 (SEQ ID NO: 5 + GÜS) pBNX49 (pBluescript + promotor A42R de MVA (SEQ ID NO: 1)+ GUS) pBNX69 (pBluescript + promotor I2R de MVA (SEQ ID NO: 4) + GUS) 20 pBNX72 (pBluescript + promotor K5L de MVA + GUS) pBNX83 (pBluescript + promotor F6R de MVA (SE ID NO: 3) + GUS) pBNX84 (pBluescript + promotor B9R de MVA 25 (SEQ ID NO: 6 + GUS) pBNX (pBluescript + promotor J6R de MVA (SEQ ID. NO: 2) + GUS) Equipo de transíección: Equipo de transfección Effectene (Qiagen) . Medios y suplementos: DMEM (Gibco BR) con 10% de FCS (Gibco BRL) Reactivos químicos y Amortiguadores: Amortiguador de Lisis (PBS + 0.1% de Tritón + inhibidor de proteasa 1 mM) AraC (Sigma, Cat. No. C1768) Sustrato de GUS ImM (p-Nitrofenil-beta- (D) -glucurónico; Sigma, Cat. No. N1627) Solución interruptora 2.5 M (2-amino-2-metil-l, 3-propandiol; Sigma, Cat. No. A 9754) 1.3 Métodos Sembrado de las células Se sembraron 5 x 105 células BHK por reacción de transfección en un pozo de una placa de 6 pozos y se mantuvieron en DMEM/10% de FCS durante la noche a 37 °C y 5% de C02.

Infección/transfección Se infectaron células con MVA-BN . (moi 0.1) en 0.5 mi de DMEM/10% de FCS por pozo y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente en un agitador. La transfección fue efectuada como lo describe el protocolo de los .fabricantes. Se diluyeron 2 µq de plásmido en un amortiguador EB (volumen total de 100 µl ) . Después de la adición de 3.2 µl de solución mej oradora la solución fue mezclada e incubada durante 5 min a temperatura ambiente. Entonces se agregaron 10 µl de reactivo Effectene, la suspensión fue mezclada e incubada durante 10 min a temperatura ambiente. La suspensión del virus fue removida de las células y se le agregaron 1.6 mi de DMEM/10% de FCS. Se agregaron 0.6 mi de DMEM/10% de FCS a la mezcla de Effectene de ADN y se gotearon sobre células mientras se hacía girar la placa de cultivo. Las células fueron entonces incubadas 7, 24 ó 48 dependiendo del análisis. Para el análisis de la expresión temprana/tardía se agregó Arac al medio durante la infección y transfección (40 µg/ml) .

Cosecha de las células Se removió el medio de las células y se les agregó 0.5 mi de amortiguador de Lisis. Después de agitar 15 min a TA, las células fueron desprendidas en el amortiguador de Lisis, transferidas a un tuvo de reacción de 1.5 mi y agitadas vorticialmente, vigorosamente. Las células fueron centrifugadas a 1 min a 500 rcf y 4°C, el sobrenadante claro fue transferido a un frasco nuevo y almacenado a -20°C hasta su uso.

Determinación de la actividad de GUS Se agregaron 10 -µl de extracto celular (=proteína obtenida de 2 x 104 células) a 1 mi de solución de sustrato precalentada (37 °C) y se incubó a 37 °C hasta que se desarrolló un color amarillo. Las muestras fueron entonces colocadas sobre hielo inmediatamente y se agregaron 0.4 mi de solución de interrupción. Se determinó la Extinción a 415 nm y se igualó con la actividad de GUS puesto que los valores de extinción entre 0.05 y 2.0 están en un intervalo lineal. La solución del sustrato fue usada como referencia y se usó un extracto celular de células infectadas con MVA- BN como control negativo. 1.4 Experimentos y Resultados Experimento 1 : Determinación de la función de los promotores putativos Para el primer experimento fueron analizados todos los plásmidos, que contienen un promotor de MVA putativo o un promotor bien caracterizado fusionado al gen de GUS. Las células fueron infectadas con MVA-BN (moi 0.1) y transfectadas con el plásmido correspondiente. Las células fueron cosechadas después de 48 horas, usadas y se determinó la actividad de GUS. Este experimento fue efectuado para determinar, cuales promotores son ' funcionales. Los resultados se muestran en la Figura 1. El control negativo (extracto de células infectadas con MVA- BN) no mostró claramente - actividad de GUS (Zex; extinción de 0.001). El promotor Ps sintético fuerte, bien caracterizado, mostró ser muy eficiente (Ps; extinción de 0.87) puesto que existió una alta cantidad de GUS detectable después de 48 horas de la expresión. El promotor pr7.5 de vaccinia virus natural también bien conocido no mostró tampoco una actividad muy alta (p7.5; extinción de 0.41). También la porción tardía de pr7.5 (7.5L; extinción de 0.25) no mostró actividad claramente detectable. El promotor ATI de la vacuna de viruela mostró claramente ser muy eficiente para la expresión de los genes ajeno por MVA- BN (ATI; extinción de 0.76). Para las regiones promotoras putativas del genoma de MVA-BN, se demostró que A42R (A42; extinción de 0.48), B9R (B9; extinción de 0.06), C7 (C7; extinción de 0.055), F6R (F6; extinción de 0.208), I2R (12; extinción de 0.130) y J6R (J6; extinción de 0.290) son promotores funcionales. Los promotores, los cuales claramente mostraron ser activos (extinción > 0.05) en el primer experimento preliminar, fueron caracterizados con mayor detalle (Experimento 2) .

Experimento 2 : Caracterización de la Expresión de promotores Los promotores que mostraron actividad en el experimento 1 fueron caracterizados sobre su patrón de expresión. Para ese propósito, las células infectadas con MVA-BN y transfectadas con el plásmido correspondiente fueron incubadas con AraC. AraC inhibe la replicación del ADN, el cual es un prerrequisito esencial para la expresión tardía de los genes durante el sitio de replicación de MVA. En paralelo se efectuó el mismo experimento sin la adición de AraC. Las células infectadas y transfectadas fueron cosechadas después de 24 horas y la actividad de GUS fue determinada por triplicado. La Figura 2 muestra la extinción promedio de cada muestra. Después de la incubación sin AraC (-AraC9 durante 24 horas, la expresión total de GUS (temprana + tardía) es claramente detectable para todos los promotores (Figura 2; columnas de la derecha) . La fuerza de los promotores recién identificados en sucesión decreciente es: I2R (12) > A42R (A42) > F6R (F6) > J6R (J6) > (B9) = C7L (C7) . Los promotores B9, C7 y J6 mostraron estar implicados principalmente en la expresión tardía durante el ciclo de vida del MVA, puesto que la incubación con AraC (+AraC) , la cual inhibe la expresión tardía, da como resultado un nivel de expresión de luz comparable con el del control negativo (Zex) . Aunque el promotor C7L pareció ser más débil existen varios indicios de que juega un papel importante durante la expresión temprana.

Los promotores A42R, I2R y F6R muestran claramente una expresión -temprana muy eficiente. Como para la determinación de la expresión temprana las muestras tuvieron que ser incubadas durante la noche para obtener una reacción de color detectable. Esos resultados no pueden ser comparados con los valores de la expresión temprana + tardía (Figura 2; - AraC) directamente puesto que únicamente fueron incubados durante 5 horas. Los promotores, que no mostraron expresión temprana fueron analizados nuevamente 7 horas después de la expresión y los resultados después de 24 horas pudieron ser confirmados (no se muestran los datos) . 1.5 Conclusión Se demostró claramente que podrían ser obtenidos promotores de diferente fuerza y que ahora existe un espectro de diferentes promotores disponibles, los cuales muestran diferentes patrones de expresión dependiendo del periodo de incubación y la posibilidad de replicar el MVA-BN. Si la expresión temprana más tardía es preferida, los promotores A42R, I2R y F6R son usados preferiblemente. Si deberá ser evitada la expresión temprana (por ejemplo, para genes ajenos, los cuales contienen la señal de interrupción TTTTTNT para la expresión temprana) , preferiblemente se usan los promotores B9R, J6R o C7L.

Ejemplo 2 : Análisis de los elementos promotores mínimos derivados*- de la SEQ ID NO: 1 a 4 En el ejemplo 1 han sido identificadas varias secuencias que son particularmente adecuadas para la expresión de genes ajenos en el genoma de MVA. Para verificar si los fragmentos más cortos son satisfactorios se llevaron a cabo experimentos adicionales para el mismo propósito. Los fragmentos más cortos de la SEQ ID' NO: 1 a 4 se aislaron por PCR y se clonaron en una estructura plasmídica (pBSKS-f-) . Se probó un total de 6 promotores mínimos putativos. Para analizar su actividad potencial, los promotores fueron fusionados al gen reportero de GUS. Las células BHK fueron infectadas con MVA-BN y transfectadas con los plásmidos que contienen los promotores putativos mínimos funcionados al gen de luz. Mediante la medición de la expresión de GUS los promotores putativos fueron separados sobre la base de la actividad y fuerza de la expresión (véase el ejemplo 1) . Como control positivo y como referencia se fusionó el promotor Ps tardío de vaccinia virus bien caracterizado a GUS y se analizó en paralelo. Los elementos promotores mínimos de aproximadamente 30 pb pueden ser usados para la expresión de genes ajenos en constructos de MVA recombinantes' (recMVA-BN) sin el riesgo de recombinación homologa entre las secuencias homologas del promotor original y clonado adicionalmente. 2.1 Materiales y métodos Si no se indica otra cosa los materiales y métodos usados en el ejemplo 2 corresponden a los métodos del ejemplo 1. La PCR se efectuó de acuerdo a técnicas estándar. 2.2 Experimentos y Resultados Fusión de promotores del gen de GUS por PCR. Las reacciones de PCR dieron como resultado la fusión de las siguientes secuencias promotoras mínimas al gen de GUS: SEQ ID NO: 7 ("A42 tardío corto") TCTTATTAAAAAACATATATAATAAATAACA SEQ ID NO: 8 ("J6R tardío corto") GA AAAATTTAAAGTGT AA ATAACTAT SEQ ID NO: 9 ("F6R temprano corto) AGAGTGTAGTATCATAGATAACTCTCTTCTATAAAAT SEQ ID NO: 10 ("F6R tardío corto") ATTGTTAAATAAATAATGGATAGTATAAAT SEQ ID NO: 11 ("I2R temprano corto") AGTAAAAAATATGTTAGGTTTACAAA? SEQ ID , NO: 12 ("I2R tardío corto") ATTTATTTTCAGTTTTATTATACGCATAAAT Todos los promotores mínimos putativos fusionados al gen de GUS fueron clonados en pBSKS+ y secuenciados . Determinación de la función de los promotores mínimos putativos Para analizar la funcionalidad de los elementos promotores mínimos putativos las células BHK fueron infectadas con MVA-BN (moi 1.0) y transfectadas con el plásmido correspondiente. Las células fueron cosechadas después de 24 hoas, usadas y se determinó la actividad de GUS (Figura 3) . El control negativo (extracto de células infectadas con MVA-BN) no mostró claramente actividad de GUS (control; extinción promedio de 0.00167). El promotor Ps sintético fuerte bien caracterizado mostró ser muy eficiente (Ps; extinción promedio de 2.05267) puesto que existió una alta cantidad de luz detectable después de 24 horas de expresión. Para el promotor putativo los elementos promotores mínimos del genoma de MVA-BN, se demostró que todos del F6R ' temprano corto, F6R tardío corto, I2R temprano corto, I2R tardío corto, A42R tardío corto y JßR tardío corto son promotores funcionales. En total se aislaron seis elementos promotores mínimos funcionales. Dos son adecuados para la transcripción temprana más débil (I2R corto temprano: extinción promedio de 0.06933; F6R temprano corto: extinción promedio de 0.189) y cuatro son adecuados para la expresión tardía de diferentes niveles (F6R tardío corto: extinción promedio: 0.09833; I2R tardío corto: extinción promedio de 0.391; JßR tardío corto: extinción promedio: 0.800167 y A42R tardío corto: extinción promedio de 2.07). 2.3 Conclusión Se demostró claramente, que pudieron ser aislados promotores de diferente fuerza y que no existió un espectro de diferentes promotores disponibles. Si se prefiere la expresión temprana, el promotor mínimo FßR temprano corto o I2R temprano corto son usados preferiblemente. Si la expresión tardía es la preferida y la expresión temprana deberá ser evitada (por ejemplo para genes ajenos, que contengan la señal de la interrupción TTTTTNT para la expresión temprana) , se usan preferiblemente los elementos promotores mínimos FßR tardío corto, I2R tardío corto, JßR tardío corto y A42R tardío corto.

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Promotor que comprende o que consiste de una secuencia que tiene una homología de al menos 60%, cuando se compara con cualquiera de las secuencias seleccionadas de (i) la secuencia nucleotídica de cualquiera de la SEQ ID NO: I a 4 y 7 a l2 y (ii) una secuencia nucleotídica que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO: 1 a 4 y 6, donde el promotor es activo como promotor de vaccinia virus y/o activado en células infectadas con vaccinia virus.
2. 2. Promotor según la reivindicación 1, que comprende o consiste de una secuencia que tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos de cualquiera de las secuencias de la SEQ ID NO: 1 a 4 y 6.
3. 3. Promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende o consiste de una secuencia seleccionada de cualquiera de la SEQ ID No. 1 a 4 y 6.
4. 4. Promotor según la reivindicación 1, que comprende o consiste de un derivado de cualquiera de la SEQ ID: No. 7 a 12, donde en el derivado no más de 19 nucleótidos están sustituidos, suprimidos y/o insertados cuando se comparan,, con la secuencia correspondiente de cualquiera de la SEQ ID: No. 7 a 12.
5. 5. Promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende o consiste de una secuencia seleccionada de^ cualquiera de la SEQ ID: No. 7 a 12.
6. 6. C sete de expresión que comprende un promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y una secuencia codificadora, donde la expresión de la secuencia codificadora es controlada por el promotor y donde el cásete de expresión no es un cásete de expresión natural en el genoma de vaccinia virus .
7. 7. Cásete de expresión según la reivindicación 6, donde la secuencia codificadora codifica para las proteínas o péptidos terapéuticos, antígenos, epítopes antigéhicos, ARN antisentido o ribozimas.
8. 8. ADN que comprende el promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el cásete de expresión según -cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7.
9. 9. Vector que comprende el promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7.
10. 10. Vector según la reivindicación 9, seleccionado de vectores plasmídicos y vectores virales.
11. 11. Vector según la reivindicación 10, donde el vector viral es un vaccinia virus.
12. 12. Vector según la reivindicación 11, donde el vaccinia virus es vaccinia virus Ankara modificado (MVA) , preferiblemente la cepa MVA-BN depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) bajo el número V00083008 o un derivado de la misma, la cepa MVA 572 depositada en la ECACC bajo el número VA94012707 o la cepa MVA 575 depositada bajo el número V00120707 en la ECACC.
13. 13. Vector según la reivindicación 12, donde el promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7 está insertado en un sitio de supresión natural del genoma de MVA.
14. 14. Vector según la reivindicación 12, donde el promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7 está insertado en una parte no esencial del genoma viral o en la región intergénica del genoma viral.
15. 15. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 como vacuna o medicamento.
16. 16. Vacuna o composición farmacéutica que comprende un cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, un ADN según la reivindicación 8 o un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14.
17. 17. Vacuna o composición farmacéutica según la reivindicación 16, que comprende al menos 102 TCID50 (dosis infecciosa de cultivo tisular) del vector de virus según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14.
18. 18. Uso' de un cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, de un ADN según la reivindicación 8 o de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 para la preparación de -una vacuna o medicamento .
19. 19. Uso según la reivindicación 18, donde el medicamento o vacuna comprende un vector de virus según la reivindicación 17 donde el medicamento es administrado con cantidades terapéuticamente efectivas del vector en una primer inoculación ("inoculación cebadora") y en una segunda inoculación ("inoculación de refuerzo") .
20. 20. Método para introducir una secuencia codificadora en una célula blanco que comprende la introducción de un vector- según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 de un cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 o de un ADN según la reivindicación 8 en la célula blanco.
21. 21. Método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la infección de una célula anfitriona en el vector de virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, el cultivo de la células anfitriona infectada bajo condiciones adecuadas, y el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteína y/o virus producidos por la célula anfitriona.
22. 22. Método para producir un péptido, proteína y/o virus que comprende la transfección de las células con un cásete de expresión en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, el ADN según la reivindicación 8 o el vector plasmídico según la reivindicación 10, la infección de la célula con un vaccinía virus, el cultivo de la célula anfitriona infectada bajo condiciones adecuadas y el aislamiento y/o enriquecimiento del péptido y/o proteína y/o virus producidos por la célula anfitriona, donde el paso para infectar las células con vaccinia virus puede ser efectuado antes o después del paso de la transfección de las células.
23. 23. Célula que contiene el cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones ß a 7 o el vector de virus según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.
24. 24. Uso del promotor según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la expresión de la secuencia codificadora, donde la secuencia codificadora no es la secuencia que está ligada naturalmente al promotor en un vaccinia virus.
25. 25. Método para la producción de un vector según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, que comprende el paso de insertar el. cásete de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 en el genoma del vector.