EA009525B1

EA009525B1 - Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора

Info

Publication number: EA009525B1
Application number: EA200401505A
Authority: EA
Inventors: Пол Хаули; Соня Лейрер
Original assignee: Бавариан Нордик А/С
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2003-05-14
Publication date: 2008-02-28
Also published as: AU2003240243B2; IL164179A0; CN1653181A; DE60302848T2; NO20045315L; PL372091A1; CN1289682C; CA2481783A1; DE60302848D1; EA200401505A1; AU2003240243A1; EP1404852A1; DK1404852T3; SI1404852T1; ES2256747T3; JP2005525821A; ATE313641T1; HK1076835A1; WO2003097844A1; NZ536500A

Abstract

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному модифицированному вирусу осповакцины Ankara, включающему в своем геноме экспрессионную кассету, содержащую ATI-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности регулируется указанным промотором. Данный вирус может быть использован в качестве вакцины или в рамках фармацевтической композиции.

Description

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному модифицированному вирусу осповакцины Апкага, включающему в своем гене экспрессионную кассету, включающую ΑΤΙ-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия данной кодирующей последовательности регулируется с помощью указанного промотора. Данный вирус можно использовать в качестве вакцины или в рамках фармацевтической композиции.

Характеристика известного уровня техники

Рекомбинантные поксвирусы широко используют для экспрессии чужеродных антигенов в инфицированных клетках. Кроме того, рекомбинантные поксвирусы в настоящее время испытывают в качестве весьма многообещающих вакцин, которые вызывают иммунный ответ против чужеродного антигена, экспрессируемого из поксвирусного вектора. Самыми известными являются, с одной стороны, авипоксвирусы, а с другой - вирусы осповакцины. В патенте США № 5736368 и в патенте США № 6051410 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм ^уе!й, который экспрессирует антигены и белки ВИЧ. В патенте США № 5747324 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм ΝΥί’ΒΗ. экспрессирующий гены лентивируса. В ЕР 0243029 описан рекомбинантный вирус осповакцины, штамм ХУеЧегп Еекегуе, экспрессирующий ретровирусные гены человека.

Для экспрессии гетерологичных генов в поксвирусах специалистам в данной области техники известны несколько промоторов, такие как промоторы 30К и 40К (см., например, патент США № 5747324), сильный синтетический ранний/поздний промотор (см., например, 8ийег и соавт., Уассте (1994) 12, 1032-40), промотор Р7.5 (см., например, Епбо и соавт., 1. Сеп. Упо1. (1991) 72, 699-703) и промотор, полученный из гена ΑΤΙ (белка включения А-типа) вируса коровьей оспы, (Ь1 и соавт., 1. Сеп. У1го1. (1998) 79, 613). Все эти промоторы используют в рекомбинантных вирусах осповакцины для экспрессии гетерологичных генов и, как показано, очень эффективно экспрессируют указанные гены с образованием относительно высокого количества белка, кодируемого данным гетерологичным геном.

Для многих способов вакцинации весьма желательно, чтобы определенный антиген, против которого индуцируется иммунный ответ, экспрессировался в больших количествах. Однако это не всегда происходит. Описано, что разные типы цитотоксических Т-клеток (СТЬ) индуцируются иммунной системой в зависимости от концентрации данного антигена. СТЬ низкой авидности индуцируются высокими концентрациями антигена, а СТЬ высокой авидности индуцируются низкими концентрациями антигена. Было показано, что СТЬ высокой авидности являются гораздо более эффективными для очистки от заражающего вируса в животных тест-системах по сравнению с СТЬ низкой авидности. Кроме того, было продемонстрировано, что высокие концентрации антигена могут ингибировать или даже уничтожить СТЬ высокой авидности. В итоге показано, что иногда желательно использовать скорее низкие концентрации антигена, чтобы индуцировать большее количество СТЬ высокой авидности и, тем самым, стимулировать эффективный иммунный ответ (ВегхоШу и соавт., 1ттипо1ощса1 Веу1е№ (1999) 170, 151172).

Цель изобретения

Цель настоящего изобретения заключается в создании вируса осповакцины на основе системы, позволяющей экспрессировать гетерологичные гены, включенные в геном вируса осповакцины в сравнительно низких количествах, после введения животному, в том числе и человеку, которые могут являться предпосылкой для индукции высоких количеств высокоавидных СТЬ.

Подробное описание настоящего изобретения

Данная цель достигается с помощью рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины Апкага (МУА), включающего в своем геноме экспрессионную кассету, включающую АТ1-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия данной кодирующей последовательности регулируется с помощью указанного промотора. Неожиданно оказалось, что АТ1-промотор обладает в МУА сравнительно низкой активностью, хотя в других поксвирусных системах указанный промотор является очень активным (например, Ы и соавт., 1. Сеп. У1го1. (1998) 79, 613). В противоположность этому, в разделе примеров настоящего описания показано, что АТ1-промотор в два-четыре раза менее активен в системах, основанных на МУА, чем в системах, основанных на иных штаммах вируса осповакцины, таких как ХУеЧегп Кекегуе, ЕШгее или СорепИадеп. Таким образом, данный АТ1-промотор в МУА является хорошим промотором для экспрессии генов, кодирующих белки, против которых индуцируются СТЬ высокой авидности.

Модифицированный вирус осповакцины Апкага (МУА) родственен вирусу осповакцины, представителю рода Оййорохуиик в семействе Рохушбае. МУА был создан в результате 516 последовательных пассажей штамма Апкага вируса осповакцины (СУА) в фибробласты куриного эмбриона (см. обзор Мауг А., и соавт., 1п£ес1юп 3, 6-14 [1975]). В результате этих длительных пассажей получали МУА-вирус с делецией в его геномной последовательности около 31 т.п.н., и по этой причине он описан в качестве имеющего высокое ограничение размножения клеткой-хозяином, он может размножаться в клетках птиц (Меуег Н. и соавт., 1. Сеп. У1го1. 72, 1031-1038 [1991]). На разных животных моделях показано, что получающийся МУА существенно авирулентен (Мауг А. & Иапиег К. [1978] Эеу. Вю1. 81апб. 41:225-34). Кроме того, данный МУА-штамм тестировали в клинических опытах в качестве вакцины для иммунизации против заболевания человека натуральной оспой (Мауг и соавт., ΖΜ. Вак1. Нуд. I, АЫ. Огд. В 167, 375

- 1 009525

390 [1987], 8Иск1 и соавт., 1Ос11. тек. \\Όιγ. 99, 2386-2392 [1974]).

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой штамм ΜVΑ. Примеры вирусных штаммов ΜνΑ, используемых в соответствии с настоящим изобретением и депонированных в соответствии с Будапештским Договором, представляют собой штаммы ΜνΑ 572 и 575, депонированные в Европейской Коллекции Культур Животных Клеток (ЕСАСС), БаШЬшу (ИК), внесенные в реестр ЕСАСС, соответственно, под номером ν94012707 и номером ν00120707, а ΜνΑ-ΒΝ внесен в реестр ЕСАСС под номером ν00083008.

Наиболее предпочтительным штаммом ΜνΑ является ΜνΑ-ΒΝ или его производное. Признаки штамма ΜνΑ-ΒΝ, описание биологических испытаний, позволяющих определить, является ли штамм ΜνΑ штаммом ΜνΑ-ΒΝ или его производным, а также описание способов, позволяющих получить штамм ΜνΑ-ΒΝ или его производное, раскрыты в νΟ 02/42480. Содержание данной заявки включено в настоящее изобретение путем ссылки.

Чтобы размножить ΜνΑ, эукариотические клетки заражают данным вирусом. Данные эукариотические клетки являются клетками, которые восприимчивы к заражению соответствующим поксвирусом с последующей репликацией и образованием инфекционного вируса. Для ΜνΑ примером данного типа клеток являются фибробласты куриного эмбриона (СЕЕ) и ВНК-клетки (Эгех1ег I., Не11ег К., ναΙιΐΌη В., ЕгГ1е ν. апк 8ийет С. Нщк1у айепиа!ек токШек уасаша Ликата гер11са1е8 ίη ЬаЬу катает к1кпеу се11§, а ро!еп!1а1 кой Гог У1ти8 рторадайоп, Ьи! ηοΐ ίη уайош китап йапйоттек апк рптагу се1к 1. Сеп. νίτο1. (1998), 79, 347-352). Клетки СЕЕ можно культивировать в условиях, известных специалистам в данной области техники. Предпочтительно клетки СЕЕ культивируют в бессывороточной среде в неподвижных матрасах (колбах) для культивирования или в бутылях, содержимое которых перемешивается при их вращении. Инкубацию предпочтительно осуществляют в течение 48-96 ч при 37±2°С. Для ΜνΑзаражения предпочтительно используют множественное заражение (ΜΟΙ) от 0,05 до 1 ТСШ₅₀, а инкубацию предпочтительно осуществляют в течение 48-72 ч при 37±2°С.

Последовательность промотора гена белка включения А-типа вируса коровьей оспы (ΑΤΙпромотор) известна специалистам в данной области техники. В этой связи сошлемся на входной каталожный номер Ό00319 в СепеЬапк. Предпочтительная последовательность ΑΤΙ-промотора представлена в виде 8ЕО ΙΌ №: 1 и имеет следующий вид:

5' СТТТТ СΑΑΤΑ ΑΑΑΤΤ ТТТТТ ΑΤΑΑΤ ΑΑΑΤ 3'

В соответствии с настоящим изобретением представляется возможным использовать ΑΤΙ-промотор, который указан в 8ЕО ΙΌ №: 1, или использовать производное данного ΑΤΙ-промотора, которое может представлять собой субпоследовательность последовательности в соответствии с 8ЕО ΙΌ №: 1. Термин субпоследовательность последовательности в соответствии с 8ЕО ΙΌ №: 1 относится к более коротким фрагментам последовательности 8ЕО ΙΌ №: 1, которые все еще активны в качестве промотора, в частности, в качестве позднего промотора вируса осповакцины. Типичный фрагмент последовательности 8ЕО ΙΌ №: 1 обладает длиной по меньшей мере в 10 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере в 15 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере в 20 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 25 нуклеотидов последовательности 8ЕО ΙΌ №: 1. Данная субпоследовательность предпочтительно может включать 25-29 нуклеотидов из 8ЕО ΙΌ №: 1, т.е. представлять последовательность 5'-ТАААТ-3', локализованную на 3'-конце 8ЕО ΙΌ №: 1. Данная субпоследовательность может также включать 22-29 нуклеотидов 8ЕС ΙΌ №: 1, т.е. представлять последовательность 5'ТААТАААТ-3', локализованную на 3'-конце 8ЕО ΙΌ №: 1.

Данный промотор можно встроить выше (справа) от кодирующей последовательности таким образом, что нуклеотиды 28-29 8ЕО ΙΌ №: 1 (подчеркнуты в вышеприведенной последовательности) составляют часть стартового кодона трансляции 5' ΑΤС 3'. В качестве альтернативы данный промотор может быть отделен несколькими нуклеотидами от стартового кодона трансляции. Спейсер между 3'концом данного промотора в соответствии с 8ЕО ΙΌ №: 1 и А в стартовом кодоне 5' ΑΤС 3' предпочтительно меньше 100 нуклеотидов, более предпочтительно составляет меньше 50 нуклеотидов и еще более предпочтительно меньше 25 нуклеотидов. Однако данный спейсер может быть и гораздо длиннее до тех пор, пока данный промотор еще способен управлять экспрессией кодирующей последовательности, локализованной правее промотора.

Производное данного ΑΤΙ-промотора может также представлять собой последовательность, которая обладает одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или вставками относительно последовательности 8ЕО ΙΌ №: 1, где указанные производные все еще активны в качестве промотора, в частности, в качестве позднего промотора вируса осповакцины.

Последовательность, обладающая одной или несколькими нуклеотидными заменами, представляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов последовательности, в соответствии с 8ЕО ΙΌ №: 1, замещены отличными нуклеотидами. Последовательность, обладающая одной или несколькими нуклеотидными вставками, представляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов встроены в одно или в несколько мест последовательности в соответствии с 8ЕО ΙΌ №: 1. Последовательность, обладающая одной или несколькими нуклеотидными делециями, пред

- 2 009525 ставляет собой последовательность, в которой один или несколько нуклеотидов последовательности, в соответствии с 8ЕО ГО Νο: 1, делетированы в одном или в нескольких местах. В производных 8ЕЦ ГО Νο: 1 делеции, замены и вставки могут объединяться в одной последовательности.

Предпочтительно данное производное обладает по меньшей мере 40% гомологией, более предпочтительно по меньшей мере 60% гомологией, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% гомологией, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% гомологией при сравнении с последовательностью 8ЕО ГО Νο: 1. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения не более 6 нуклеотидов, еще более предпочтительно не более 3 нуклеотидов замещены, делетированы и/или встроены в последовательность 8ЕЦ ГО Νο: 1.

В частности, предпочтительно сохранение с 25 по 29 нуклеотид 8ЕО ГО Νο: 1, т.е. сохранение последовательности 5'-ТАААТ-3' в данном промоторе, чтобы достичь максимальной промоторной активности. Предпочтительным также может быть сохранение нуклеотидов с 22 по 29 8ЕО ГО Νο: 1, т.е. последовательности 5'-ТААТАААТ-3' в данном промоторе.

Совокупность документов предшествующего уровня техники позволяет специалистам в данной области техники предсказать, какие из производных 8ЕО ГО Νο: 1 все же обладают биологической активностью в качестве промотора вируса осповакцины, в частности, позднего промотора вируса осповакцины. В этой связи следует обратиться к ссылке СЕакгатЬагй и соавт., Вю1се11пк|ис5 (1997) 23, 1094-1097 и Όίΐνίδοη апб Μοδδ, б. Μοί. ΒίοΙ. (1989) 210, 771-784. Кроме того, специалистам в данной области техники легко проверить, является ли какой-либо фрагмент активным в качестве промотора вируса осповакцины, в частности, позднего промотора. В частности, в плазмидной конструкции производное данной последовательности можно клонировать левее от репортерного гена. Указанную конструкцию можно трансфицировать в эукариотическую клетку или клеточную линию, такую как СЕР- или ВНК-клетки, которые инфицированы с МУА. Затем определяют экспрессию данного репортерного гена и сравнивают с экспрессией репортерного гена, контролируемого промотором в соответствии с 8ЕО ГО Νο: 1. Эти экспериментальные данные соответствуют примеру, представленному в настоящем описании. Производное в соответствии с настоящим изобретением представляет собой производное, обладающее в указанной тестсистеме по меньшей мере 10% промоторной активностью, предпочтительно по меньшей мере 30% промоторной активностью, более предпочтительно по меньшей мере 50% промоторной активностью, еще более предпочтительно по меньшей мере 70% промоторной активностью, наиболее предпочтительно 90% промоторной активностью по сравнению с активностью промотора последовательности 8ЕО ГО Νο: 1. Кроме того, в рамках настоящего изобретения находятся и производные 8ЕО ГО Νο: 1, обладающие более высокой промоторной активностью, чем 8ЕО ГО Νο: 1.

В более общих чертах настоящее изобретение относится к использованию ΑΤΙ-промотора вируса коровьей оспы или его производного, как указано выше, для экспрессии кодирующей последовательности в МУА.

ΑΤΙ-промотор можно использовать для экспрессии гена, который уже является частью МУАгенома. Такой ген может представлять собой ген, который является естественной частью вирусного генома, или чужеродный ген, который уже был встроен в МУА-геном. В этих случаях ΑΤΙ-промотор встраивают левее данного гена в МУА-геноме, экспрессия которого контролируется данным АТ1промотором.

Данный АТ1-промотор можно также использовать для регуляции экспрессии гена, который еще не является частью МУА-генома. В данном случае предпочтительно сконструировать экспрессионную кассету, включающую АТ1-промотор и кодирующую последовательность, экспрессия которой регулируется данным АТ1-промотором, и встроить указанную экспрессионную кассету в МУА-геном. Предпочтительные сайты встраивания выбирают из (ί) естественно встречаемых делеционных сайтов в МУА-геноме в отношении генома штамма Οοροη1ι;·ι§οη вируса осповакцины или (й) межгенных областей МУА-генома. Термин межгенная область относится предпочтительно к тем частям данного вирусного генома, которые локализованы между двумя смежными генами, которые не включают ни кодирующую, ни регуляторную последовательности. Однако данные встраиваемые сайты не ограничиваются этими предпочтительными встраиваемыми сайтами, т.к. то, что экспрессионную кассету можно встроить, где угодно в геноме вируса до тех пор, пока возможно получить рекомбинанты, которые можно амплифицировать и размножить по меньшей мере в одной культуральной клеточной системе, такой как фибробласты куриного эмбриона (СЕР-клетки), находится в рамках настоящего изобретения. Таким образом, встраиваемую кассету можно также встроить, например, в несущественные гены или в гены, функция которых может быть дополнена клеточной системой, используемой для размножения МУА.

Способы, необходимые для конструирования рекомбинантного МУА, известны специалистам в данной области техники. В качестве примера, экспрессионную кассету, и/или АТ1-промотор, или его производное можно встроить в геном МУА с помощью гомологичной рекомбинации. Для этого нуклеиновую кислоту трансфицируют в пермиссивную клеточную линию, такую как клетки СЕР или ΒΗΚ, где данная нуклеиновая кислота включает экспрессионную кассету, и/или АТ1-промотор, или его производное, фланкированные нуклеотидными участками, которые гомологичны области МУА-генома, в который должны быть встроены экспрессионная кассета, и/или АТ1-промотор, или его производное. Данные клет

- 3 009525 ки инфицируют с помощью МУЛ, и в этих инфицированных клетках осуществляется гомологичная рекомбинация между нуклеиновой кислотой и вирусным геномом. Альтернативно также возможно сначала заразить клетки с помощью МУА и затем трансфицировать нуклеиновую кислоту в инфицированные клетки. Опять-таки, в клетках происходит рекомбинация. Затем с помощью способов, уже известных в данной области техники, отбирают рекомбинантный МУА. Конструирование рекомбинантного МУА не ограничивается данным конкретным способом. Вместо него с этой целью можно использовать любой подходящий способ, известный специалистам в данной области техники.

ΑΤΙ-промотор в МУА можно использовать для контроля экспрессии любой кодирующей последовательности. Эта кодирующая последовательность может предпочтительно кодировать, по меньшей мере, антигенный эпитоп или антиген. В этом случае рекомбинантный МУА можно использовать для экспрессии указанного антигена после инфицирования клеток в организме, например, млекопитающего, в том числе и человека. Презентация указанного антигена/эпитопа может вызвать иммунный ответ в данном организме, что может привести к вакцинации этого организма против агента, из которого данный антиген/эпитоп произошел. В частности, эпитоп/антиген может являться частью большей аминокислотной последовательности, такой как полиэпитоп, пептид или белок. Примерами таких полиэпитопов, пептидов или белков могут быть полиэпитопы, пептиды или белки, произошедшие из (1) вирусов, таких как ВИЧ, НТЬУ, герпесвирус, вирус лихорадки Денге, вирус полиомиелита, вирус кори, вирус паротита, вирус краснухи, вирусы гепатита и так далее, (ίί) бактерий, (ίίί) грибов.

Альтернативно кодирующая последовательность может кодировать терапевтическое соединение, такое как интерлейкины, интерфероны, рибозимы или ферменты.

Рекомбинантный МУА можно вводить в организм животного или человека в соответствии с опытом специалиста в данной области техники. Так, рекомбинантный МУА в соответствии с настоящим изобретением может оказаться полезным в качестве лекарственного средства (т.е. фармацевтической композиции) или вакцины.

Фармацевтическая композиция или вакцина может, как правило, включать, помимо данного рекомбинантного МУА, один или несколько фармацевтически приемлемых и/или апробированных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такие вспомогательные вещества могут представлять собой воду, физиологический раствор, глицерин, этанол, смачивающие или эмульгирующие агенты, вещества, обеспечивающие рН буфера, или им подобные. Подходящие носители представляют собой, как правило, большие, медленно метаболизируемые молекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегаты или им подобные.

Для получения фармацевтических композиций или вакцин рекомбинантный МУА преобразуют в физиологически приемлемую форму. Это можно осуществить на основе опыта получения поксвирусных вакцин, используемых для вакцинации против натуральной оспы (как описано у 8бск1 Н. и соавт., [1974] Э15с11. теб. ХУхсйг. 99, 2386-2392). Например, выделенный очисткой вирус хранят при -80°С с титром 5х10⁸ ТСШ₅₀/мл, рецептированного в около 10 мМ ТгТ. 140 мМ ИаС1 рН 7,4. Для получения вакцинных доз, например, 10¹-10⁹ частиц рекомбинантного вируса в соответствии с настоящим изобретением лиофилизируют в фосфатно-солевом буфере (РВ8) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно в стеклянной ампуле. Или же вакцинные дозы можно получить путем постепенной лиофилизации данного вируса в композиции. Данная композиция может содержать дополнительные добавки, такие как манит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон, либо иные добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, альбумин сыворотки человека), пригодные для введения ίη νίνο. Типичная вируссодержащая композиция, пригодная для лиофилизации, включает 10 мМ Тпк-буфера, 140 мМ ИаС1, 18,9 г/л декстрана (м.в. 36000-40000), 45 г/л сахарозы, 0,108 г/л моногидрата монокалиевой соли Ь-глутаминовой кислоты, рН 7,4. Затем стеклянную ампулу запаивают и ее можно хранить в диапазоне между 4°С и комнатной температурой в течение нескольких месяцев. Однако в отсутствие необходимости использовать данную ампулу, ее хранят при температуре ниже -20°С.

Для вакцинации или для лечения лиофилизат или лиофилизованный продукт можно растворить в 0,1-0,5 мл водного раствора, предпочтительно в воде, физиологическом растворе или в Тгщ-буфере, и ввести либо системно, либо местно, а именно парентерально, внутримышечно или иным путем введения, известным специалисту широкого профиля. Определенный режим введения, определенная доза и определенная частота введения могут быть оптимизированы специалистом в данной области техники известным способом.

Таким образом, в соответствии с близким вариантом осуществления настоящее изобретение относится к способу воздействия, предпочтительно индукции иммунологического ответа в живом организме животного, в том числе и человека, включающему введение вируса, композиции или вакцины в соответствии с настоящим изобретением в подвергаемого лечению животного или человека. Обычно, вакцинная доза включает по меньшей мере 10², предпочтительно по меньшей мере 10⁴, более предпочтительно по меньшей мере 10⁶, еще более предпочтительно 10⁸ ТСШ₅₀ (инфицирующая доза тканевой культуры) дан

- 4 009525 ного вируса.

Особое преимущество рекомбинантного МУЛ в соответствии с настоящим изобретением, в частности, рекомбинантного МУА-ΒΝ и его производных, состоит в том, что данный вирус можно использовать для основной и повторной иммунизации. Таким образом, настоящее изобретение относится, кроме того, к способу, в котором вирус, композиция или вакцина вводятся животному, в том числе и человеку, нуждающемуся в них, в терапевтически эффективных количествах для первой иммунизации (первичная иммунизация) и для второй иммунизации (повторная иммунизация).

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу встраивания кодирующей последовательности в клетки-мишени, включающему инфицирование клеток-мишеней вирусом в соответствии с настоящим изобретением. Эти клетки-мишени могут быть представлены клетками, такими как клетки СЕР и ΒΗΚ, в которых вирус способен реплицироваться, либо клетками, такими как все типы клеток человека, которые могут быть инфицированы МУА, но в которых данный вирус не может реплицироваться.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения пептида, белка и/или вируса, включающему инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным вирусом в соответствии с настоящим изобретением с последующим культивированием инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях, и с последующим извлечением и/или обогащением пептида и/или белка, а также вирусов, продуцируемых указанной клеткой-хозяином. Если это подразумевает получение, т.е. амплификацию вируса в соответствии с настоящим изобретением, то клетка должна представлять собой клетку, такую как клетки СЕР и ΒΗΚ, в которой вирус способен реплицироваться. Если это подразумевает получение пептида/белка, кодируемого вирусом, предпочтительно белка/пептида, кодируемого кодирующей последовательностью, экспрессия которого контролируется с помощью ΑΤΙ-промотора или его производного, то клетка может представлять собой любую клетку, которая может быть инифицирована рекомбинантным вирусом, и которая делает возможным экспрессию белков/пептидов, кодируемых МУА.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам, инфицированным вирусом в соответствии с настоящим изобретением.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - результаты реакции ПЦР, которая обнаруживает присутствие РНК, экспрессируемой с ΑΤΙпромотора рекомбинантного МУА после заражения им СЕР-клеток (см. пример 2);

фиг. 2 - результаты Вестерн-блота белков, выделенных из клеток, инфицированных различными рекомбинантными МУА;

фиг. 2А - невосстанавливающие условия, непрогретые белки;

фиг. 2В - восстанавливающие условия, непрогретые белки;

фиг. 2С - невосстанавливающие условия, прогретые белки.

Дорожки 1, 3, 4 представляют собой, соответственно, клеточные лизаты клеток, инфицированных МУА-ΑΤΙ-ΝδΙ, МУА-СРР, а также неинфицированных клеток. Дорожки 5, 7, 8 представляют собой, соответственно, супернатанты клеток, инфицированных МУА-АТ1-Ы81, МУА-СРР, а также супернатанты контрольных клеток. Дорожки 2 и 6 оставались пустыми.

Примеры

Нижеследующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что представленные примеры никоим образом не интерпретируются так, что применимость технологии, разработанной в настоящем изобретении, ограничена данными примерами.

Пример 1. Активность АТ1-промотора вируса коровьей оспы в разных штаммах вируса осповакцины.

Цель данного примера проанализировать силу АТ1-промотора вируса коровьей оспы в разных штаммах вируса осповакцины.

Введение.

АТ1-промотор вируса коровьей оспы сливали с СИ8 (β-глюкуронидаза Е. соБ), репортерным геном для анализа экспрессии. Клетки ΒΗΚ (почки детеныша хомяка) инфицировали с помощью разных штаммов вируса осповакцины и трансфицировали с помощью плазмиды, содержащей АТ1-промотор, слитый с данным СИ8-геном. Анализируемые штаммы вируса осповакцины включали СУА, СорепБадеп, Е15(гсс. ΙΗΌ, \Ус51егп гекегуе и МУА-ΒΝ. Когда данный промотор функционирует, то должен экспрессироваться СИ8, что можно количественно оценить с помощью ферментативной реакции.

Материалы и оборудование.

Клетки ΒΗΚ (ЕСАСС Νο.84100501)

Все вирусы осповакцины использовали с титром 7,5 х 10⁷ ТСШ₅₀ на мл

Плазмида ρΒΝΧ73 (рЕБюхспрПАТЕпромотор+С^)

Набор для трансфекции ЕГГес1епе (01адеп)

Среда БМЕМ для культуры клеток (С1Ьсо ΒΡΕ)

РС8 (С1Ьсо ΒΡΕ)

Буфер для лизиса клеток (ΡΒ8+0,1% Тритона+1 мМ ингибитора протеазы)

- 5 009525 мМ субстрат для СИ8 (паранитрофенил-бета-(Р)-глюкуронид; 8фша. Са1. Νο. N1627)

2,5 М стоп-раствор (2-амино-2-метил-1.3-пропандиол; 8фша. Са1. Νο. А9754)

Посев клеток.

В лунки 6-луночного планшета высевали 5х10⁵ клеток ВНК для осуществления реакции трансфекции и выдерживали их в ΌΜΕΜ/10% РС8 в течение ночи при 37°С и 5% СО₂.

Инфицирование/трансфекция.

Клетки инфицировали разными штаммами вируса осповакцины (МО1 0,1) в 0,5 мл ΌΜΕΜ/10% РС8 на лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре со встряхиванием. Трансфекцию осуществляли как описано в протоколе производителей. В буфере ЕВ (общий объем 100 мкл) разбавляли 2 мкг плазмиды. После добавления 3,2 мкл раствора энхансера полученный раствор перемешивали и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мкл реактива Е£1ес1епе, суспензию перемешивали и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре. Суспензию вируса отделяли от клеток и приливали 1,6 мл ΌΜΕΜ/10% РС8. Добавляли 0,6 мл ΌΜΕΜ/10% РС8 к полученной Е£1ес1епе-смеси ДНК, которую затем капали на клетки, содержащиеся во вращающейся культуральной планшете. Затем клетки инкубировали в течение 48 ч.

Сбор клеток.

Среду отделяли от клеток и приливали к ним 0,5 мл лизирующего буфера. После 15-минутного встряхивания при КТ, клетки соскабливали в данный лизирующий буфер, переносили в 1,5миллилитровую реакционную пробирку и энергично встряхивали. Лизированные клетки центрифугировали в течение 1 мин при 500 об./мин и 4°С, полученный прозрачный супернатант переносили в чистый флакон и хранили при -20°С до использования.

Определение Οϋδ-активности.

мкл клеточного экстракта (= белку от 2х10⁴ клеток) приливали к 1 мл предварительно нагретому раствору субстрата (37°С) и инкубировали при 37°С до появления желтой окраски. Затем образцы помещали непосредственно на лед и приливали 0,4 мл стоп-раствора. Определяли экстинкцию при 415 нм и приравнивали к Ουδ-активности, экстинкция которой находится между 0,05 и 2,0 линейного диапазона. Данный раствор субстрата использовали в качестве эталона, а клеточный экстракт неинфицированных клеток использовали в качестве негативного контроля.

Результаты.

Количественный анализ Ουδ-активности, экспрессируемой конструкцией АТ1-промотор/Ои8-ген в ВНК-клетках, инфицированных разными штаммами вируса осповакцины, дал следующие результаты:

Штамм вируса осповакцины, используемый для инфицирования ВНК-клеток, трансфицированных ρΒΝΧ73	Сиз-активность
(неинфицированные клетки)	0
СУА	1,30
СорепЬадеп	1,86
Е1з£гее	2,07
ΙΗϋ	1,30
Иез^егп Кезегуе	0, 96
МУА-ΒΝ	0, 48

Пример 2. Экспрессия чужеродных генов, встроенных в ΜνΑ-геном и регулируемых с помощью АТ1-промотора вируса коровьей оспы.

Целью данного примера является демонстрация того, что АТ1-промотор способен регулировать и экспрессировать гены при его встраивании в геном ΜνΑ.

Введение.

АТ1-промотор вируса коровьей оспы сливали с неструктурным (Νδ) геном 1 вируса лихорадки Денге. Эту экспрессионную кассету встраивали в рекомбинантный вектор, включающий последовательности, гомологичные последовательностям генома ΜVΑ. В получающейся рекомбинантной плазмиде экспрессионная кассета фланкирована последовательностями, гомологичными последовательностям генома ΜVΑ, в который должна встраиваться экспрессионная кассета. Клетки СЕР инфицировали ΜVΑ-ВN и трансфицировали с помощью рекомбинантного вектора, включающего АТ1-промотор-№1экспрессионную кассету. В данных клетках между геномом ΜVΑ и рекомбинантной плазмидой происходила гомологичная рекомбинация, дающая рекомбинантный ΜVΑ-геном. После нескольких циклов выделения очисткой анализировали, действительно ли №1-белок рекомбинантного ΜVΑ экспрессируется под контролем АТ1-промотора. В параллельных экспериментах экспрессионную кассету, включающую последовательность, кодирующую ВИЧ-политоп под контролем данного АТ1-промотора, встраивали в геном ΜVΑ и вновь проверяли, действительно ли АТ1-промотор активен в ΜVΑ и экспрессирует ВИЧ-политоп.

Материалы и оборудование: эмбриональные СЕР-клетки,

- 6 009525 клетки почек детеныша хомячка (ВНК; депозит 85011433 в Европейской Коллекции Клеточных Культур Животных),

ΜνΑ-ΒΝ с титром 10⁸ ТСШ₅₀/мл, плазмида ρΒΝ74 и ρΒΝ84:ρΒΝ74 включает последовательность, кодирующую ВИЧ-политоп под контролем ΑΤΙ-промотора, а ρΒΝ84 включает кодирующую последовательность Νδΐ-белка вируса лихорадки Денге под контролем данного ΑΤΙ-промотора. Помимо данной экспрессионной кассеты, включающей, соответственно, кодирующую последовательность вируса лихорадки Денге и ВИЧ-политопкодирующую последовательность, обе плазмиды включают в качестве маркерных генов ген устойчивости к 0418 и ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок. Эти маркерные гены, а также экспрессионные кассеты, соответственно, для N81 вируса лихорадки Денге и ВИЧ-политопа, фланкированы последовательностями ΜνΑ, которые гомологичны области генома ΜνΑ, в которую должны быть встроены гетерологичные гены.

Ейес1епе-набор для трансфекции (О1;щсп)

Клеточная культуральная среда νΡ-8ΕΜ (01Ьсо ВКЬ)

К№а§у-набор для извлечения РНК (О|;щеп)

ДНКаза, без РНКазы (Коске)

Обратная транскриптаза ΜΜΕν (Рготеда)

Τа^-^NΑ-полимераза (Коске)

РНКазный ингибитор ΚΝΑδίη (Рготеда)

Следующие олигонуклеотиды получены от Μν0, Германия: праймер оВШ65 дд1с1да1йсса1сссд1ас (21 нуклеотид), используемый для реакции с обратной транскриптазой; праймер оВШ63 даас1даад1д1ддсад1 (18 нуклеотидов), используемый для ПЦР; праймер оВШ64 сдд1дд1аа1д1дсаада1с (20 нуклеотидов), используемый для ПЦР.

Методы.

Интеграция в геном ΜνΑ с помощью гомологичной рекомбинации.

Описанные выше плазмиды ρΒΝ74 или ρΒΝ84 использовали для интеграции, соответственно, ВИЧполитоп-кодирующей последовательности и кассеты для экспрессии Ν81 вируса лихорадки Денге, в геном ΜνΑ путем гомологичной рекомбинации между ΜνΑ-последовательностями, фланкирующими экспрессионные кассеты в ρΒΝ74 или ρΒΝ84, с одной стороны, и гомологичными последовательностями-мишенями в рамках генома ΜνΑ, с другой стороны. Это осуществляется путем трансфекции линеаризованной плазмиды ρΒΝ74 или ρΒΝ84 в фибробластные клетки куриного эмбриона (СЕЕ), ранее инфицированные ΜνΑ при низкой множественности заражения. В частности, СЕЕ-клетки высевали в 6луночные планшеты и поддерживали в ΥΡ-8ΕΜ в течение ночи при 37°С и 5% СО₂. Затем эти клетки инфицировали ΜνΑ-ΒΝ (ΜΟΙ 1,0) в 0,5 мл ΥΡ-8ΕΜ на лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на встряхивающей мешалке. Трансфекцию данных клеток осуществляли либо с помощью ρΒΝ74, либо с помощью ρΒΝ84, как описано в протоколе их производителя. Через 48 ч после инфицирования или когда данное инфицирование приводило к слиянию, готовили вирусный экстракт и хранили при -20°С, готовый для селекции и очистки клона требуемого рекомбинантного ΜνΑ (τΜνΑ).

Селекция и очистка клона рекомбинантного ΜνΑ (τΜνΑ).

Удаление нерекомбинантного ΜνΑ (пустой вирусный вектор) и амплификация τΜΥΑ осуществляется путем инфицирования слитых фибробластных клеток куриного эимбриона (СЕЕ) при низком ΜΟΙ в присутствии 0418 (количество 0418 оптимизируют, чтобы определить наивысшую дозу, которая не убивает СЕЕ-клетки). Любой вирус, который не содержит интегрированный ген ΝΡΤ II, не реплицируется в присутствии 0418, добавляемого в поддерживающую клеточную среду. 0418 ингибирует репликацию ДНК, но поскольку эти СЕЕ-клетки должны находиться в стационарном нереплицирующемся состоянии, они не подвергаются воздействию 0418. СЕЕ-клетки, инфицированные τΜνΑ, можно визуализировать под флуоресцентным микроскопом, благодаря усиленной экспрессии зеленого флуоресцентного белка.

Вирусные экстракты из стадии гомологичной рекомбинации последовательно разбавляют и используют для заражения свежих СЕЕ-клеток в присутствии 0418. Полученные инфицированные клетки покрывают слоем геля из легкоплавкой агарозы. Через 2 дня после инфицирования под флуоресцентным микроскопом в планшетах просматривают отдельные очаги зеленых инфицированных клеток. Данные клетки маркированы и агарозные блоки, содержащие очаги инфицированных клеток, отбирают и помещают в 1,5 миллилитровые микроцентрифужные пробирки, содержащие стерильную поддерживающую клеточную среду. Вирус высвобождается из отобранного агарозного блока в результате трехкратного замораживания-оттаивания микроцентрифужной пробирки при -20°С.

Полученный рекомбинантный ΜνΑ с встроенной кассетой экспрессии Ν81 вируса лихорадки Денге, описанной в настоящем изобретении, назвали ΜνΑ-ΑΤΙ-Ν81.

Детекция РНК, экспрессируемой под контролем ΑΤΙ-промотора в рекомбинантном ΜνΑ.

Для детекции РНК, экспрессируемой под контролем промотора ΑΤΙ в клетках, инфицированных рекомбинантным ΜνΑ, экстрагирование РНК осуществляли, как описано в протоколе производителей (К№а§у Μίηί Рто1осо1 для выделения тотальной РНК из клеток животных). Реакцию обработки ДНКазой осуществляли путем добавления 3 мкл ДНКазы, свободной от РНКазы (= 30 Ед.; Коске), 3 мкл 10хбуфер

- 7 009525

А (обычно используемый для рестрикции, Косйе) к 5 мкг РНК в объеме, доведенном водой до 30 мкл. Полученную смесь инкубировали в течение 90 мин при 37°С. РНК выделяли очисткой с использованием Кпеаку-колонок, в соответствии с протоколом производителя. Для обратной транскрипции 2 мкг РНК смешивали с 1 мкг праймера ΟΒΝ465 для обратной транскрипции и общий объем доводили до 10 мкл добавлением воды. Инкубацию проводили в течение 5 мин при 70°С и данную пробирку ставили на лед. Затем приливали 5 мкл 5хбуфера, 5 мкл смеси 6ΝΤΡ (10 мкМ), 0,5 мкл Кпакш, 2 мкл М-МЬУ КТ (200 Ед.) и 2,5 мкл Н₂О и данную смесь инкубировали в течение 60 мин при 42°С.

Для осуществления ПЦР-амплификации 5 мкл КТ-реакции смешивали с 36 мкл Н₂О, 5 мкл 10хбуфера, 1 мкл смеси 6ΝΤΡ, 2 мкл каждого праймера ΟΒΝ463 и ΟΒΝ464 (10 мкМ) и 1 мкл Της-полимеразы. ДНК амплифицировали в 25 циклах (1 мин удлинение, температура отжига 55°С) и анализировали с помощью гель-электрофореза.

Детекция экспрессируемого №1-белка вируса лихорадки Денге в клетках, инфицированных МУЛΑΊΊ-Ν81.

В 25 см² матрас, содержащий около 80% слившегося монослоя ΒΗΚ-клеток, инокулировали 100 мкл вирусного штамма ΜνΑ-ΑΤΙ-Ν81, разбавленного до 1 х 10⁷ в МЕМа с 1% ЕС8, и качали при комнатной температуре в течение 30 мин. В каждый матрас приливали 5 мл МЕМа с 3% ЕС8 и инкубировали при 30°С в СО₂-инкубаторе. Инкубированные матрасы убирали через 48 ч. Из каждого матраса удаляли супернатант и центрифугировали его при 260д в течение 10 мин при 4°С. Данные супернатанты хранили в аликвотах при -80°С. Полученный осадок дважды промывали 5 мл 1χΡΒ8 и затем ресуспендировали в 1 мл гипотонического буфера для гомогенизации с 1%ТХ100. Клеточные лизаты собирали и центрифугировали в течение 5 мин при 16000д, а полученные супернатанты хранили в микроцентрифужных пробирках при -80°С.

Матрасы, инокулированные контрольными вирусами, и незараженные матрасы обрабатывали таким же образом, как описано выше.

Клеточно/вирусный лизат и его супернатант обрабатывали либо невосстанавливающим, либо восстанавливающим буфером для образцов в условиях нагревания или без нагрева. Белки разделяли в 10% δΌδ-ПААГ и переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Полученные блоты зондировали в течение ночи объединенной сывороткой от выздоравливающих пациентов (РРС8), т.е. сывороткой от пациентов, которые страдали от заражения вирусом лихорадки Денге, в разведении 1:500. После трехкратной отмывки с помощью 1ΧΡΒ8 данные блоты инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена (НКР) антителами против 1дС человека (ΌΑΚΟ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем блоты промывали, как описано выше, перед проявлением с использованием 4-хлор-1-нафтола. Результаты представлены на фиг. 2.

Результаты.

Показано, что при регуляции ΑΤΙ-промотором вируса коровьей оспы экспрессируется №1-ген, а также ВИЧ-политоп (фиг. 1). Соответствующая мРНК четко детектировалась. В частности, ожидаемый сигнал 926 п.н. четко детектировался после ΚΤ-ПЦР РНК-образца (фиг. 1, дорожка 2). Сигнал не детектировался при использовании образца только для ПЦР (фиг. 1, дорожка 3). По этой причине можно исключить ложный позитивный сигнал, вызванный загрязнением ДНК. На фиг. 1, дорожка 4, представлен результат ПЦР для плазмидного положительного контроля. Как ожидалось, размер ПЦР-продукта оказался идентичным размеру ПЦР-продукта после ΚΤ-ПЦР образца РНК. На фиг. 1, дорожка 5, представлен результат ΚΤ-ПЦР-реакции для отрицательного контроля (воды). На фиг. 1, дорожки 1 и 6, представлен маркер молекулярных масс (100 п.н.Ьаббег).

Результаты Вестерн-блотов свидетельствуют, что Ν81 экспрессируется в клетках, инфицированных ΜνΑ-ΑΤΙ-Ν81. Ν81 экспрессировался в правильной конформации и в виде димера в условиях без нагрева, как показано на дорожке 1 фиг. 2А и 2В. При нагревании данного образца можно видеть Ν81мономер, как показано на фиг. 2С.

Полученные результаты свидетельствуют также о том, что Ν81, экспрессируемый в клетках, инфицированных ΜνΑ-ΑΤΙ-Ν81, является антигенным и распознается объединенной сывороткой выздоравливающих пациентов.

В заключение, результаты данных экспериментов свидетельствуют, что Ν81 экспрессируется в правильной конформации в ΒΗΚ-клетках, инфицированных ΜνΑ-ΑΤΙ-Ν81. И димер, и мономер являются антигенными и распознаются с помощью объединенной сыворотки выздоравливающих пациентов.

- 8 009525

Список последовательностей <110» вауаНап мопНс А/5 <12О> Экспрессия генов модифицированного вируса осповакцины Апкага путем использования ΛΤΙ-промотора вируса коровьей оспы <130> ВК51РСТ <150> РК РА 2002 01813 <151> 2002-11-25 <1б0> 1 <170> РагепПп уегатоп 3.1 <210» 1 <211> 29 <212» ДНК <213» Вирус коровьей оспы <220» <221» промотор <222> (1)..(29) <223» <400» 1 дшедааеа ааашпм асаахааас 29

Claims

1. Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины Апкага (МУА), содержащий в своем геноме экспрессионную кассету, содержащую ΑΤΙ-промотор вируса коровьей оспы или его производное, и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора.

2. Рекомбинантный МУА по п.1, в котором ΑΤΙ-промотор имеет последовательность 8ЕО ΙΌ N0:1.

3. Рекомбинантный МУА по п.1, в котором производное ΑΤΙ-промотора выбрано из:

(ί) фрагментов последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1 и (й) последовательностей с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или инсерциями в 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагменте, где указанные фрагменты и последовательности соответственно сохраняют активность промотора в МУА.

4. Рекомбинантный МУА по любому из пп.1-3, представляющий собой штамм МУА-ΒΝ ЕСАСС У00083008, или производный от указанного штамм, или штамм МУА 575 ЕСАСС У00120707.

5. Рекомбинантный МУА по любому из пп.1-4, в котором экспрессионная кассета встроена в природный сайт с делецией генома МУА по сравнению с геномом штамма СорепЪадеп вируса осповакцины или в межгенную область генома МУА.

6. Рекомбинантный МУА по любому из пп.1-5, где последовательность кодирует по меньшей мере один антиген, антигенный эпитоп и/или терапевтическое соединение, такое как интерлейкин, интерферон, рибозим или фермент.

7. Фармацевтическая композиция, в частности вакцина, содержащая рекомбинантный МУА по любому из пп.1-6.

8. Применение рекомбинантного МУА по любому из пп.1-6 для получения вакцины или лекарственного средства против агента, из которого получен антиген или антигенный эпитоп.

9. Применение по п.8, где терапевтически эффективные количества вакцины или лекарственного средства вводят при первой иммунизации («первичная вакцинация») и при второй иммунизации («ревакцинация»).

10. Способ введения кодирующей последовательности в клетки-мишени, который предусматривает инфицирование клеток-мишеней вирусом по любому из пп.1-6.

11. Способ получения пептида и белка, где пептид/белок кодируется вирусом, и/или амплификации вируса, который предусматривает:

- 9 009525

а) инфицирование клетки-хозяина вирусом по любому из пп.1-6,

б) культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и

с) выделение и/или обогащение пептида, белка и/или вируса, продуцируемого или амплифицируемого указанной клеткой-хозяином.

12. Способ индукции иммунного ответа в организме животного, в том числе в организме человека, предусматривающий введение вируса по любому из пп.1-6 или композиции, в частности вакцины, по п.7 указанному животному, в том числе человеку.

13. Способ по п.12, предусматривающий введение по меньшей мере 10² ΤΟΙΌ₅₀ вируса.

14. Способ по любому из пп.12 или 13, согласно которому вирус, композицию, в частности вакцину, вводят в терапевтически эффективных количествах при первой иммунизации («первичная вакцинация») и при второй иммунизации («ревакцинация»).

15. Эукариотическая клетка, содержащая вирус по пп.1-6.

16. Применение ΑΤΙ-промотора вируса коровьей оспы или его производного для экспрессии кодирующих последовательностей в МУА, где производное ΑΤΙ-промотора выбрано из:

(ί) фрагментов последовательности 8ЕО ΙΌ N0:1 и (ίί) последовательностей с одной или несколькими нуклеотидными заменами, делециями и/или инсерциями в 8Е0 ΙΌ N0:1 или ее фрагменте, где указанные фрагменты и последовательности соответственно сохраняют активность промотора в МУА.

17. Применение ΑΤΙ-промотора вируса коровьей оспы или его производного для экспрессии кодирующих последовательностей в МУА, где ΑΤΙ-промотор имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1.

18. Способ получения рекомбинантного МУЛ по любому из пп.1-6, предусматривающий встраивание экспрессионной кассеты в геном МУΑ, где экспрессионная кассета содержит промотор ΑΤΙ или его производное и кодирующую последовательность и где экспрессия кодирующей последовательности находится под контролем указанного промотора.

1 2 3 4 5 6