EA012723B1

EA012723B1 - Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение

Info

Publication number: EA012723B1
Application number: EA200500879A
Authority: EA
Inventors: Соня Лейрер; Пол Хаули
Original assignee: Бавариан Нордик А/С
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2003-11-12
Publication date: 2009-12-30
Also published as: UA85379C2; JP2006515170A; CN1717488A; PT1567653E; CY1106883T1; EP1567653B1; EA200500879A1; NO20053125L; AU2003293675B2; DK1567653T3; EP1567653A2; DE60314541D1; PL375740A1; KR20050083839A; US7300658B2; WO2004048582A3; AU2003293675A1; NO20053125D0; NZ540156A; ATE365220T1

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантным поксвирусам, содержащим в вирусном геноме по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ATI коровьей оспы или его производное и кодирующую последовательность, причем экспрессия этой кодирующей последовательности регулируется указанным промотором. Этот вирус может быть применим в качестве вакцины или в качестве части фармацевтической композиции.

Description

Изобретение относится к рекомбинантным поксвирусам, содержащим в вирусном геноме по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ΑΤΙ коровьей оспы или его производное и кодирующую последовательность, причем экспрессия этой кодирующей последовательности регулируется указанным промотором или его производным. Этот вирус может быть применим в качестве вакцины или в качестве части фармацевтической композиции.

Уровень техники

Рекомбинантные поксвирусы широко используются для экспрессии чужеродных антигенов в инфицированных клетках. Кроме того, рекомбинантные поксвирусы испытываются в настоящее время в качестве очень многообещающих вакцин для индукции иммунной реакции против чужеродных антигенов, экспрессируемых из поксвирусного вектора. Наиболее популярны, с одной стороны, авипоксвирусы и, с другой стороны, вирусы коровьей оспы. В И8 5736368 и И8 6051410 описан рекомбинантный штамм \Ууе111 вируса коровьей оспы, который экспрессирует антигены и белки ВИЧ. В И8 5747324 описан рекомбинантный штамм ΝΥί,'ΒΗ вируса коровьей оспы, экспрессирующий гены лентивируса. В ЕР 0243029 описан рекомбинантный штамм ХУсЧсгп Рс^сгус вируса коровьей оспы, экспрессирующий гены ретровируса человека. Поксвирусы домашней птицы, содержащие гены ВИЧ в вирусном геноме, описаны в И8 5736368 и И8 6051410.

Для индукции эффективной иммунной реакции желательно экспрессировать не только единственный белок агента, против которого должна быть индуцирована иммунная реакция. Вместо этого предпочтительно экспрессировать настолько много различных белков и эпитопов указанного агента, насколько это возможно для получения широкого и эффективного иммунитета против указанного агента. Таким образом, может быть выгодным инсертирование нескольких различных экспрессионных кассет в один и тот же поксвирусный геном, если предполагается применение этого поксвируса в качестве вектора для вакцинации. В И8 5736368 описано конструирование несущих рекомбинантный поксвирус экспрессионных кассет для гена еиу ВИЧ-1 и гена дад-ροΐ ВИЧ-1. Для экспрессии белков, кодируемых этими различными экспрессионными кассетами, используют различные промоторы, а именно промотор И1 и промотор 40К вируса коровьей оспы. Недостатком этой стратегии является то, что активности этих различных промоторов не являются идентичными, что приводит к разному уровню белков, экспрессируемых из этих различных экспрессионных кассет.

Почти идентичный уровень экспрессии мог бы быть получен, если бы промоторы в различных экспрессионных кассетах в поксвирусном геноме были идентичными. Однако недостатком этой стратегии является то, что существует риск, что могут иметь место нежелательные события рекомбинации между гомологичными/идентичными промоторными последовательностями. Действительно, Но\у1еу е1 а1. (Оеие (1996) 172, 233-237) было показано, что может быть генерирован рекомбинантный вирус коровьей оспы, который содержит три промотора р7.5 в различных местоположениях вирусного генома; однако имела место рекомбинация между этими гомологичными промоторными последовательностями, приводящая к смешанной геномной популяции этого рекомбинантного поксвируса. Такая смешанная и неопределенная геномная популяция, которая отражает нестабильность вирусного генома, является неприемлемой, если она предназначается для использования рекомбинантного поксвируса для вакцинации, в частности для вакцинации людей.

Цель изобретения

Целью данного изобретения является обеспечение стабильных рекомбинантных поксвирусов, несущих по меньшей мере две экспрессионные кассеты, предпочтительно для генов, которые природно не являются частью поксвирусного генома, причем должно быть возможным получение белков, кодируемых указанными по меньшей мере двумя различными экспрессионными кассетами, в одинаковых количествах.

Подробное описание изобретения

Эта цель была достигнута обеспечением рекомбинантных поксвирусов, содержащих в вирусном геноме по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ΑΤΙ коровьей оспы или его производное и кодирующую последовательность, причем экспрессия этой кодирующей последовательности регулируется указанным промотором или его производным.

Авторами данного изобретения было показано, что поксвирусы, содержащие две или более копий промотора ΑΤΙ, являются неожиданно стабильными; было показано, что не происходили детектируемые события рекомбинации между этими гомологичными или даже идентичными последовательностями промотора ΑΤΙ. Это находится в противоречии с вирусами коровьей оспы, содержащими два или более промоторов р7.5 в вирусном геноме.

Согласно данному изобретению поксвирус может быть любым поксвирусом, в котором экспрессия генов должна регулироваться промотором ΑΤΙ или его производным. Таким образом, поксвирус может быть любым вирусом подсемейства Сйогборохушиае и Еи1оторохушиае (см. Е1е1б§ У1го1оду 3¹'¹ ебйюи, Ырршсо11-К.ауеи РиЫщйега, РЫ1абе1рЫа, И8А, Сйар1ег: 83, Ι8ΒΝ 0-7817-0253-4). Вирусы из подсемейства Сйогборохушиае являются особенно предпочтительными, если рекомбинантный поксвирус используется для экспрессии генов в млекопитающих животных, в том числе людях. Особенно предпочтительными родами, принадлежащими к подсемейству Сйогборохушиае, являются ортопоксвирусы, парапоксвирусы,

- 1 012723 авипоксвирусы, каприпоксвирусы, лепорипоксвирусы и суипоксвирусы. Наиболее предпочтительными являются ортопоксвирусы и авипоксвирусы. Примерами авипоксвирусов являются поксвирусы канареек и поксвирусы домашней птицы. Примером ортопоксвируса является вирус коровьей оспы. Штаммом вируса коровьей оспы, который может быть использован в соответствии с данным изобретением, может быть любой штамм вируса коровьей оспы, такой как штаммы Сореийадеп, Тетр1е о! Неауеп, \Ууе11т ХУсЫсгп Векетуе, ЕШгее, ИУСВН и т.д.

Особенно предпочтительным является штамм вируса Моб1йеб Уасшша Апкага (МУЛ). МУЛ был получен 516 серийными пассажами на фибробластах куриных эмбрионов штамма Апкага вируса коровьей оспы (СУЛ) (в отношении обзора см. Мауг, А., е! а1. 1пГес1юп 3, 6-14, 1975). Вследствие этих долгосрочных пассажей полученный вирус МУЛ делетировал приблизительно 31 т.п.н. из его геномной последовательности и, следовательно, был описан как высокорестриктированный в отношении клеткихозяина, а именно в отношении клеток птиц (Меуег, Н. е! а1., 1. Оеп. У1го1. 72, 1031-1038, 1991). Было показано на различных моделях животных, что полученный МУЛ был значимо авирулентным (Мауг, А. & Оаппет, К. Эеу. Вю1. 8!апб. 41: 225-34,1978). Кроме того, этот штамм МУЛ был испытан в клинических испытаниях в качестве вакцины для иммунизации против заболевания оспы (натуральной) человека (Мауг е! а1., ΖΒ1. Вас!. Нуд. I, ЛЬ!. Огд. В 167, 375-390, 1987), 8Бск1 е! а1., Э15с11. теб. ХУксйг. 99, 23862392, 1974).

В соответствии с изобретением может быть использован любой штамм МУЛ. Примерами штаммов вируса МУЛ, используемых в соответствии с изобретением и депонированных в соответствии с требованиями Будапештского Договора, являются штаммы МУЛ 572 и МУЛ 575, депонированные в Европейской Коллекции Культур Клеток Животных (ЕСАСС), ЗаШЬшу (ИК) с номерами депозитов ЕСАСС У94012707 и ЕСАСС У00120707 соответственно и МУЛ-ΒΝ с номером депозита ЕСАСС У00083008.

Наиболее предпочтительным МУЛ-штаммом является МУЛ-ΒΝ или его производное. Признаки МУЛ-ΒΝ, описание биологических анализов, позволяющих оценить, является ли штамм МУЛ штаммом МУЛ-ΒΝ или его производным, и способы, позволяющие получать МУЛ-ΒΝ или его производное, описаны в \УО 02/42480. Содержание этой заявки включено в настоящее описание в виде ссылки.

В общих чертах, предпочтительно использовать вирусы, которые не являются вредными для животного, в том числе человека, если вирус используют для вакцинации или лечения животного, в том числе человека. Для людей особенно безопасными поксивирусами являются различные штаммы вируса коровьей оспы, такие как МУЛ, и авипоксвирусы, такие как поксвирус домашней птицы и поксвирус канареек.

Для размножения поксвирусов эукариотические клетки инфицируют вирусом. Такими эукариотическими клетками являются клетки, которые восприимчивы к инфекции соответствующим поксвирусом и делают возможными репликацию и продуцирование инфекционного вируса. Такие клетки известны специалисту с квалификацией в данной области для каждого вида поксвируса. Для МУЛ примером этого типа клеток являются фибробласты куриного эмбриона (СЕЕ) и клетки БНК (Эгех1ег I., Не11ег К., ХУайгеп В., ЕгГ1е У. апб 8и11ег О., 1. Оеп. У1го1. (1998), 79, 347-352). Клетки СЕЕ могут культивироваться при условиях, известных лицу с квалификацией в данной области. Предпочтительно клетки СЕЕ культивируют в бессывороточной среде в стационарных колбах или роллерных флаконах. Инкубирование происходит предпочтительно в течение 48-96 ч при 37±2°С. Для инфицирования МУЛ предпочтительно используют при множественности заражения (МО1) 0,05-1 ТСШ₅₀, и инкубирование предпочтительно происходит в течение 48-72 ч при 37±2°С.

Последовательность промотора гена белка включения А-типа вируса коровьей оспы (промотора ЛТ1) известна лицу с квалификацией в данной области. В этой связи делается ссылка на номер доступа ОепеЬапк еп!ту ассекыоп питЬег Ό00319. Предпочтительная последовательность промотора ЛТ1 показана в виде 8ЕО Ш ΝΟ:1 и является следующей:

5' ОТТТТ ОЛАТА АААТТ ТТТТТ АТААТ АААТ 3'

В соответствии с изобретением можно использовать промотор ЛТ1 в том виде, как указано в 8ЕО Ш ΝΟ:1, или использовать производное этого промотора ЛТ1, которое может быть субпоследовательностью последовательности 8ЕО Ш ΝΟ:1. Термин «субпоследовательность последовательности 8ЕО Ш ΝΟ:1» относится к более коротким фрагментам последовательности 8ЕО Ш ΝΟ:1, которые все еще являются активными в качестве промотора, в частности позднего промотора вируса коровьей оспы. Типичный фрагмент последовательности 8ЕО Ш ΝΟ:1 имеет длину по меньшей мере 10 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 15 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере 20 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 25 нуклеотидов последовательности 8ЕО Ш ΝΟ:1. Эта субпоследовательность предпочтительно может содержать нуклеотиды 25-29 8ЕО Ш ΝΟ:1, т.е. последовательность 5'-ТАААТ-3', локализованную на 3'-конце 8ЕО Ш ΝΟ:1. Эта субпоследовательность может также содержать нуклеотиды 22-29 8ЕО Ш ΝΟ:1, т.е. последовательность 5'-ТААТАААТ-3', расположенную на 3'-конце 8ЕО Ш ΝΟ:1.

- 2 012723

Промотор может быть встроен слева от кодирующей последовательности таким образом, что нуклеотиды 28-29 ЗЕО ΙΌ N0:1 (подчеркнутые в последовательности, приведенной выше) являются частью стартового кодона трансляции 5'-ЛТО-3'. Альтернативно, этот промотор может быть отделен несколькими нуклеотидами от стартового кодона трансляции. Спейсер между З'-концом промотора в соответствии с 8Е0 ΙΌ N0:1 и А в стартовом кодоне 5'-АТО-3' содержит предпочтительно менее чем 100 нуклеотидов, более предпочтительно менее чем 50 нуклеотидов и еще более предпочтительно менее чем 25 нуклеотидов. Однако этот спейсер может быть даже еще более длинным, пока этот промотор все еще способен управлять экспрессией кодирующей последовательности, расположенной справа от этого промотора.

Производным промотора АТ1 может быть также последовательность, которая имеет одну или более нуклеотидных замен, делеций и/или инсерций относительно последовательности ЗЕО ΙΌ N0:1 или ее субпоследовательности, причем указанные производные все еще являются активными в качестве промотора, в частности позднего промотора вируса коровьей оспы. Последовательность, имеющая одну или несколько нуклеотидных замен, является последовательностью, в которой один или несколько нуклеотидов последовательности, соответствующей ЗЕО ΙΌ N0:1, заменен отличающимися нуклеотидами. Последовательность, имеющая одну или несколько инсерций, является последовательностью, в которой один или несколько нуклеотидов инсертирован в одном или нескольких местоположениях последовательности, соответствующей ЗЕО ΙΌ N0:1. Последовательность, имеющая одну или несколько нуклеотидных делеций, является последовательностью, в которой один или несколько нуклеотидов последовательности, соответствующей ЗЕО ΙΌ N0:1, делетирован в одном или нескольких местоположениях. В производных 8Е0 ΙΌ N0:1 делеции, замены и инсерции могут быть объединены в одной последовательности. Предпочтительно это производное имеет гомологию по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% в сравнении с последовательностью ЗЕО ΙΌ N0:1. В соответствии с наиболее предпочтительным вариантом осуществления в последовательности ЗЕО Ш N0:1 заменены, делетированы и/или инсертированы не более чем 6 нуклеотидов, даже более предпочтительно не более чем 3 нуклеотида.

В частности, может быть предпочтительным сохранение нуклеотидов 25-29 ЗЕО ΙΌ N0:1, т.е. последовательности 5'-ТАААТ-3', в промоторе для получения максимальной промоторной активности. Может быть предпочтительным сохранение нуклеотидов 22-29 ЗЕО ΙΌ N0:1, т.е. последовательности 5'-ТААТАААТ-3', в этом промоторе.

Приведенные выше замечания относительно местоположения промотора ΑΤΙ или его субпоследовательностей приложимы также к определенным выше последовательностям, имеющим одну или несколько замен, делеций и/или инсерций относительно последовательности, соответствующей 8Е0 ΙΌ N0:1, или относительно ее субпоследовательности.

Большое количество документов известного уровня техники позволяет лицу с квалификацией в данной области предсказывать, какие производные ЗЕО ΙΌ N0:1 все еще имеют биологическую активность, являясь активными в качестве промотора поксвируса, в частности в качестве позднего промотора вируса коровьей оспы. В этой связи делается ссылка на СйакгагЬагИ с1 а1., Вю1сс1шк|ис8 (1997), 23, 10941097 и Όίΐνίκοη аиб Мокк, 1. Мо1. Βίο1. (1989), 210, 771-784. Кроме того, лицо с квалификацией в данной области может легко проверить, является ли фрагмент все еще активным в качестве промотора поксвируса, в частности позднего промотора вируса коровьей оспы. В частности, это производное последовательности может быть клонировано слева от репортерного гена в плазмидной конструкции. Указанная конструкция может быть трансфицирована в эукариотическую клетку или клеточную линию, такую как клетки СЕЕ или ΒΗΚ, которые были инфицированы поксвирусом. Поксивирусом, используемым для инфицирования, является предпочтительно поксвирус из того же самого рода и даже более предпочтительно тот же самый поксвирус, что и поксвирус, в геном которого должен быть инсертирован этот промотор. Затем определяют экспрессию репортерного гена и сравнивают с экспрессией этого репортерного гена, регулируемой промотором в соответствии с ЗЕО ΙΌ N0:1. Производное в соответствии с данным изобретением является предпочтительно производным, имеющим промоторную активность в указанной тест-системе по меньшей мере 10%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, даже более предпочтительно по меньшей мере 70%, наиболее предпочтительно 90% в сравнении с активностью промоторной последовательности ЗЕО ΙΌ N0:1. В объеме данного изобретения находятся также производные ЗЕО ΙΌ N0:1, которые имеют более высокую активность, чем 5ЕО ΙΌ N0:1.

Согласно изобретению рекомбинантный поксвирус содержит по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ΑΤΙ или его производное. Другими словами, геном рекомбинантного поксвируса может содержать два или более промоторов ΑΤΙ или их производных. Таким образом, может быть случай, когда все из промоторов ΑΤΙ имеют последовательность, соответствующую ЗЕО ΙΌ N0:1. Может быть также, что все промоторы ΑΤΙ являются одним и тем же производным последовательности, соответствующей ЗЕО ΙΌ N0:1. Альтернативно, один или несколько промоторов ΑΤΙ может иметь последовательность ЗЕО ΙΌ N0:1, а один или несколько промоторов ΑΤΙ в том же самом поксвирусном геноме может быть производными последовательности, соответствующей ЗЕО ΙΌ N0:1.

- 3 012723

Если такой поксвирусный геном содержит два или несколько производных промотора ΑΤΙ, эти производные могут быть одинаковыми или различными. В соответствии с дополнительной альтернативой все промоторы ΑΤΙ в поксвирусном геноме могут быть различными производными последовательности, соответствующей 8ЕО ΙΌ N0:1.

В общих чертах изобретение относится к рекомбинантным поксвирусам, содержащим по меньшей мере два промотора ΑΤΙ или их производных в поксвирусном геноме. Таким образом, вирусный геном может содержать, например, два, три, четыре, пять, шесть или более промоторов ΑΤΙ или их производных в вирусном геноме.

Промоторы ΑΤΙ или их производные являются обычно частью экспрессионных кассет, каждая из которых содержит промотор ΑΤΙ вируса коровьей оспы или его производное и кодирующую последовательность, экспрессия которой регулируется указанными промоторами. Этими кодирующими последовательностями могут быть любые последовательности, экспрессия которых должна контролироваться промотором ΑΤΙ или его производным.

В соответствии с одной альтернативой по меньшей мере один из промоторов ΑΤΙ в поксвирусном геноме может быть использован для экспрессии гена, который уже является частью поксвирусного генома. Таким геном может быть ген, который является природной частью этого вирусного генома, или чужеродный ген, который уже был встроен в поксвирусный геном. В этих случаях промотор ΑΤΙ встраивают слева от этого гена в поксвирусном геноме, экспрессия которого должна регулироваться этим промотором ΑΤΙ.

Альтернативно или дополнительно, по меньшей мере один из промоторов ΑΤΙ или их производных может быть частью экспрессионной кассеты, которую вводят в поксвирусный геном. Экспрессионные кассеты, содержащие промотор ΑΤΙ или его производное и кодирующую последовательность, могут быть встроены в любом подходящем местоположении вирусного генома. Без связывания со следующими примерами подходящие сайты инсерций могут быть выбраны из (ί) несущественных генов, таких как ΤΚ-ген; (ίί) генов, которые необходимы для репликации вируса, если функция указанного гена дополняется клеткой, которую используют для размножения этого вируса; (ш) межгенных районов поксвирусного генома, где термин «межгенный район» обозначает предпочтительно части вирусного генома, расположенные между двумя соседними генами, которые не содержат кодирующих последовательностей; (ίν) природно встречающихся сайтов делеции поксвирусного генома. Примером вирусного генома, имеющего природно встречающийся сайт делеции, является геном ΜνΑ, в котором некоторые районы являются делетированными относительно генома штамма Сореийадеи вируса коровьей оспы.

Как указывалось выше, сайты инсерции не ограничиваются этими предпочтительными сайтами инсерции, так как в рамках изобретения находится то, что экспрессионная кассета может быть встроена в любом месте вирусного генома, пока можно получить рекомбинанты, которые могут быть амплифицированы и размножены по меньшей мере в одной системе культуры клеток, такой как фибробласты куриного эмбриона (клетки СЕЕ), в случае ΜνΑ и других поксвирусов, таких как вирусы коровьей оспы в целом и авипоксвирусы.

Различные экспрессионные кассеты/промоторы ΑΤΙ или их производные могут быть инсертированы в различные сайты инсерции в поксвирусном геноме.

По разным причинам может быть предпочтительно инсертирование двух или более экспрессионных кассет в один и тот же сайт инсерции поксвирусного генома. Однако в таком случае должна быть исключена возможность осуществления гомологичной рекомбинации между этими различными экспрессионными кассетами. Гомологичная рекомбинация приводила бы к рекомбинантным вирусам, в которых части экспрессионных кассет являются делетированными. Поскольку делетируются несущественные части генома поксвирусного вектора, полученные рекомбинанты являются все еще жизнеспособными. Таким образом, не может проводиться отбор на вирусы, сохранившие две или более экспрессионных кассет в одном и том же сайте инсерции. Во избежание таких нежелательных событий рекомбинации в существующем состоянии данной области использовали различные промоторы, если две или более экспрессионных кассет встраивали в один и тот же сайт инсерции. Согласно изобретению теперь можно встраивать две или более экспрессионных кассет, каждая из которых содержит промотор ΑΤΙ или его производное, в один и тот же сайт инсерции, так как не происходит гомологичная рекомбинация между этими промоторами в этих экспрессионных кассетах.

Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления по меньшей мере две, если не все, экспрессионные кассеты встраивают в один и тот же сайт инсерции в поксвирусном геноме. В этом случае различные экспрессионные кассеты находятся непосредственно рядом с не принадлежащими поксвирусу последовательностями между различными экспрессионными кассетами или, по меньшей мере, только с короткими поксвирусными последовательностями между различными экспрессионными кассетами.

Способы, необходимые для конструирования рекомбинантных поксвирусов, известны лицу с квалификацией в данной области. В качестве примера экспрессионная кассета и/или промотор ΑΤΙ или его производное могут быть встроены в поксвирусный геном гомологичной рекомбинацией. Для этой цели нуклеиновую кислоту трансфицируют в пермиссивную клеточную линию, причем эта нуклеиновая ки

- 4 012723 слота содержит экспрессионную кассету и/или промотор ΑΤΙ или его производное, фланкированные нуклеотидными отрезками, которые являются гомологичными району поксвирусного генома, в который должная быть инсертирована эта экспрессионная кассета и/или промотор ΑΤΙ или его производное. Для МУА пермиссивными клетками являются клетки СЕЕ и клетки ВНК. Эти клетки инфицируют поксвирусом, и в этих инфицированных клетках происходит гомологичная рекомбинация между этой нуклеиновой кислотой и вирусным геномом. Альтернативно, можно сначала инфицировать эти клетки поксвирусом и затем трансфицировать нуклеиновую кислоту в инфицированные клетки. В этом случае опять происходит рекомбинация в этих клетках. Затем рекомбинантные поксвирусы отбирают способами, известными в данной области. Конструирование рекомбинантных поксвирусов не ограничивается этим конкретным способом. Вместо этого для этой цели может быть использован любой подходящий способ, известный лицу с квалификацией в данной области.

Промотор ΑΤΙ в рекомбинантном поксвирусе может быть использован для контроля экспрессии любой кодирующей последовательности (любых кодирующих последовательностей). Эта кодирующая последовательность может предпочтительно кодировать по меньшей мере один антигенный эпитоп или антиген. В этом случае рекомбинантный поксвирус может быть использован для экспрессии указанного антигена после инфицирования клеток в организме, например, млекопитающего животного, в том числе человека. Презентация указанного антигена/эпитопа может индуцировать иммунную реакцию в организме, которая может приводить к вакцинации этого организма против агента, из которого получен этот антиген/эпитоп. Более конкретно, этот эпитоп/антиген может быть частью большей аминокислотной последовательности, такой как полиэпитоп, пептид или белок. Примерами таких полиэпитопов, пептидов или белков могут быть полиэпитопы, пептиды или белки, полученные из (ί) вирусов, таких как ВИЧ, НТЬУ, герпесвирус, вирус денге, полиовирус, вирус кори, вирус паротита, вирус коревой краснухи, вирусы гепатита и т.д.; (ίί) бактерий; (ίίί) грибов.

Эти белки, пептиды или эпитопы, экспрессируемые из различных экспрессионных кассет, могут происходить из одного и того же агента, такого как вирус, бактерия или гриб. В качестве примера все продукты, экспрессируемые из этих экспрессионных кассет, могут быть белками ВИЧ. Если все продукты происходят из одного и того же агента, можно индуцировать очень широкую иммунную реакцию против указанного агента. Альтернативно, возможным является также, что эти белки, пептиды или эпитопы, экспрессируемые из различных экспрессионных кассет, происходят из различных агентов. В качестве примера продукты, полученные из экспрессионных кассет в одном поксвирусном геноме, происходят из различных вирусов, таких как вирус паротита, вирус кори и вирус коревой краснухи. Согласно этому варианту осуществления можно использовать один рекомбинантный поксвирус для индукции иммунной реакции против нескольких антигенов.

Альтернативно, по меньшей мере одна из кодирующих последовательностей может кодировать терапевтическое соединение, такое как интерлейкины, интерфероны, рибозимы, ферменты и т.д.

Рекомбинантный поксвирус в соответствии с изобретением может быть введен в организм животного или человека в соответствии со знаниями лица с квалификацией в данной области. Таким образом, рекомбинантный поксвирус в соответствии с изобретением может быть применим в качестве медикамента (т.е. фармацевтической композиции) или вакцины.

Фармацевтическая композиция или вакцина может обычно включать в себя один или несколько фармацевтически приемлемых и/или одобренных носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов, наряду с рекомбинантным поксвирусом. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, солевой раствор, глицерин, этанол, увлажняющие или эмульгирующие агенты, буферящие рН вещества или т.п. Подходящими носителями являются обычно большие, медленно метаболизирующиеся молекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, липидные агрегаты или т.п.

Для приготовления фармацевтических композиций или вакцин рекомбинантный поксвирус превращают в физиологически приемлемую форму. Это может быть выполнено на основании опыта в приготовлении поксвирусных вакцин, используемых для вакцинации против оспы (натуральной) (как описано 8Иск1, Н. с1 а1. Э15с11. шсб. \У5с11г. 99, 2386-2392, 1974). Например, если поксвирусом является МУА, этот очищенный вирус может храниться при -80°С с титром 5х10⁸ ТСШ₅₀/мл, приготовленный в приблизительно 10 мМ Трис, 140 мМ №1С1 рН 7,4. Для приготовления вакцинных доз, например, 10¹-10⁹ частиц рекомбинантного вируса данного изобретения лиофилизируют в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) в присутствии 2% пептона и 1% человеческого альбумина в ампуле, предпочтительно стеклянной ампуле. Альтернативно, вакцинные дозы могут быть получены ступенчатой лиофилизацией вируса в препарате. Этот препарат может содержать дополнительные добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон, или другие добавки, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, человеческий сывороточный альбумин), пригодные для введения ίη νίνο. Типичный препарат, пригодный для лиофилизации рекомбинантного МУА, содержит 100 мМ Трис-буфер, 140 мМ №1С1. 18,9 г/л декстрана (молекулярная масса 36000-40000), 45 г/л сахарозы, 0,108 г/л моногидрата монокалиевой соли Ь-глутаминовой кислоты рН 7,4. Затем стеклянную ампулу запаивают, и она может храниться при 4°С комнатной температуры в те

- 5 012723 чение нескольких месяцев. Однако пока нет необходимости ее применения, эту ампулу хранят предпочтительно при температуре ниже -20°С.

Для вакцинации или терапии этот лиофилизат может быть растворен в 0,1-0,5 мл водного раствора, предпочтительно воды, физиологического солевого раствора или Трис-буфера, и введен либо системно, либо локально, т.е. парентеральным, внутримышечным или любым другим способом введения, известным квалифицированному практику. Способ введения, доза и количество введений могут быть оптимизированы специалистами с квалификацией в данной области известным образом.

Таким образом, в соответствии с родственным вариантом осуществления изобретение относится к способу воздействия на иммунологическую реакцию, предпочтительно индукции иммунологической реакции в теле живого животного, в том числе человека, предусматривающему введение вируса, композиции или вакцины в соответствии с изобретением животному или человеку, которые должны лечиться. Если рекомбинантным поксвирусом является рекомбинантный МУЛ, вакцинная доза обычно содержит по меньшей мере 10², предпочтительно по меньшей мере 10⁴, более предпочтительно по меньшей мере 10⁶, даже более предпочтительно 10⁸-10⁹ ТСШ₅₀ (инфекционных доз для культуры ткани) этого вируса.

Изобретение дополнительно относится к способу введения по меньшей мере двух кодирующих последовательностей в клетки-мишени, предусматривающему инфицирование клеток-мишеней вирусом по изобретению. Клеткой-мишенью может быть клетка, в которой этот вирус способен реплицироваться, или клетка, которая может быть инфицирована этим рекомбинантным вирусом, но в которой этот вирус не реплицируется, такой как все типы клеток человека, в случае рекомбинантного МУА.

Далее, изобретение относится к способу получения пептида, белка и/или вируса, предусматривающему инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным вирусом по изобретению с последующим культивированием инфицированной клетки-хозяина при подходящих условиях с последующим выделением и/или обогащением этого пептида, и/или белка, и/или вирусов, продуцируемых указанной клеткойхозяином. Если предполагается продуцировать, т. е. размножать, вирус в соответствии с изобретением, этой клеткой должна быть клетка, в которой этот вирус способен реплицироваться, такая как клетка СЕР или ВНК, в случае рекомбинантного МУА. Если предполагается продуцировать пептид/белок, кодируемый этим вирусом, предпочтительно белок/пептид, кодируемый кодирующей последовательностью, экспрессия которой регулируется промотором АТ1 или его производным, этой клеткой может быть любая клетка, которая может быть инфицирована этим рекомбинантным вирусом и которая делает возможной экспрессию кодируемых поксвирусом белков/пептидов.

Изобретение дополнительно относится к клеткам, инфицированным вирусом по изобретению.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 и 2. Схематическое представление рекомбинантных векторов ρΒΝ70 (фиг. 1) и ρΒΝ71 (фиг. 2):

Р1А137Ь = боковая сторона Р1апк 1 района инсерции; Р2А1371 = боковая сторона Р1апк 2 района инсерции; Р2тр1 = повтор боковой стороны Р1апк 2; ргАТ1 = промотор АТ1; рг7.5 = промотор р7.5; ОИ8 = кодирующий ОИ8 район; N81 = кодирующий N81 район; ΝΡΊΊΙ = ген устойчивости к неомицину; ΙΚΕ8 = внутренний сайт вхождения рибосом; ЕОРР - район, кодирующий белок усиленной зеленой флуоресценции; АтрК = ген устойчивости к ампициллину.

Фиг. 3. ОТ-ПЦР-анализ для определения экспрессии гена N81 в клетках, инфицированных МУА-тВН30 (фиг. 3А) или МУА-тВН31 (фиг. 3В). Во всех случаях, в которых выполняли ПЦР, праймер был специфическим в отношении гена N81:

A) М: маркер молекулярных масс;

дорожка 1: анализ с плазмидой рВШ0 (положительный контроль);

дорожка 2: анализ без добавленных нуклеиновых кислот (отрицательный контроль);

дорожка 3: ПЦР с РНК, выделенной из ВНК-клеток, инфицированных МУА-тВН30. без добавления обратной транскриптазы;

дорожка 4: ОТ-ПЦР с РНК, выделенной из ВНК-клеток, инфицированных МУА-тВН30;

дорожка 5: ПЦР с РНК, выделенной из клеток ВНК, инфицированных МУА-В^ без добавления обратной транскриптазы;

дорожка 6: ОТ-ПЦР с РНК, выделенной из клеток ВНК, инфицированных МУА-В^

B) М: маркер молекулярных масс;

дорожка 1: ОТ-ПЦР с РНК, выделенной из клеток, инфицированных тВН31;

дорожка 2: ОТ-ПЦР с РНК, выделенной из клеток, инфицированных различными рекомбинантными МУА, содержащими ген N81 в геноме;

дорожка 3: ОТ-ПЦР с РНК из клеток, инфицированных МУА-В№ дорожка 4: ПЦР с РНК, выделенной из клеток, инфицированных тВН31 (без добавленной обратной транскриптазы);

дорожка 5: ПЦР с РНК из клеток, инфицированных различными рекомбинантными МУА, содержащими ген N81 в геноме (без добавленной обратной транскриптазы);

дорожка 6: ПЦР с РНК из клеток, инфицированных МУА-ВN (без добавленной обратной транскриптазы);

- 6 012723 дорожка 7: анализ с плазмидой ρΒΝ71 (положительный контроль);

дорожка 8: анализ без добавленных нуклеиновых кислот (отрицательный контроль).

Пример

Следующий пример будет дополнительно иллюстрировать изобретение. Специалисту будет понятно, что представленный пример никоим образом не может рассматриваться как ограничение только этим примером применимости технологии, обеспечиваемой изобретением.

Стабильное инсертирование двух чужеродных генов, регулируемых промотором ΑΤΙ коровьей оспы, в единственный сайт генома ΜνΑ

Целью этого примера была демонстрация того, что инсерция двух чужеродных генов, оба из которых регулируются промотором ΑΤΙ, является стабильной.

Резюме.

Следующий пример демонстрирует стабильность рекомбинантного МУА, содержащего две копии промотора ΑΤΙ в вирусном геноме. Для этой цели промотор ΑΤΙ коровьей оспы сливали с геном Си8 (β-глюкуронидазы Е.сой) и неструктурным (N8) геном 1 вируса денге соответственно. Для сравнения ген СИ8 сливали также с природно встречающимся промотором рг7.5 вируса коровьей оспы. Экспрессионную кассету промотор ΑΤΙ-ген N81, либо экспрессионную кассету промотор ΑΤΙ-ген СИ8, либо экспрессионную кассету промотор р7.5-ген СИ8 встраивали в рекомбинантный вектор, содержащий последовательности, гомологичные геному ΜνΑ (фиг. 1 и 2). В полученных плазмидах ρΒΝ70 (экспрессионная кассета промотор ΑΤΙ-ген N81 и экспрессионная кассета промотор ΑΤΙ-ген СИ8) и ρΒΝ71 (экспрессионная кассета промотор ΑΤΙ-ген N81 и экспрессионная кассета промотор р7.5-ген СИ8) эти экспрессионные кассеты были фланкированы последовательностями, гомологичными последовательностям в геноме ΜνΑ, в который должна была инсертироваться эта экспрессионная кассета. Эти гомологичные последовательности направляют инсертирование этих экспрессионных кассет в межгенный район ВСЕ) 136-137 генома ΜνΑ. Клетки СЕЕ инфицировали ΜУΑ-ΒN и трансфицировали в рВШО и рВШ1 соответственно. В этих клетках происходила гомологичная рекомбинация, имеющая место между геномом ΜνΑ и плазмидами рекомбинации, приводя к рекомбинантным геномам ΜνΑ. Рекомбинанты подвергали нескольким раундам очистки из бляшек и пассировали в клетках СЕЕ (общее число пассажей, в том числе очисток из бляшек: 20). Эти рекомбинанты испытывали на стабильность, экспрессию инсертированных генов и последовательность рекомбинантных конструкций ΜνΑ, содержащих две различные комбинации этих двух промоторов. Анализ этой последовательности ПЦР и функциональные тесты показали, что эти рекомбинантные фрагменты инсертируются правильно и что инсерции, даже в том случае, когда промотор ΑΤΙ встраивали два раза в геном, являются стабильными и функциональными.

Материалы и оборудование.

Первичные клетки СЕЕ; ΜVΑ-ΒN с титром 10⁸ ΤΕΊΟ^/λίπ; набор ЕГГес1епе йаиГесбои ΚίΙ (01адеп); среда для культуры клеток νΡ-8ΕΜ (С1Ьсо ВЕЬ); С418 (С1Ьсо ВЕЬ); набор ^NΑ №с1ео§рш В1ооб Ошск Риге Κίΐ (ΜαΟκίΌν №ще1); ДНК-полимераза Τι^Ε Μа8ΐе^ (ЕрреибогГ); олигонуклеотиды (олиго) (ΜΑ^; набор для секвенирования Όί.’Τ8 ОшскЧаП (Весктаи СоиИег).

Способы.

Векторы рекомбинации рВЮО и рВЮ1 (фиг. 1 и 2) клонировали в соответствии со стандартными протоколами, известными лицам с квалификацией в данной области.

5х 10⁵ клеток высевали на одну реакцию трансфекции в лунку 6-луночного планшета и поддерживали в среде νΡ-8ΕΜ в течение ночи при 37°С и 5% СО₂. Эти клетки инфицировали ΜVΑ-ΒN (то1 1,0) в 0,5 мл среды νΡ-8ΕΜ на лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Трансфекцию линеаризованных плазмид рВЮ0 и 71 выполняли, как описано в протоколе изготовителя (0а§еи).

Полученные рекомбинантные вирусы пассировали несколько раз при селективных условиях (С418, 300 мкг/мл) и выделяли отдельные бляшки, размножали и анализировали, пока не получали очищенные клоны. Анализированный вирус был пассирован в конечном счете 20 раз.

Результаты.

1. Конструирование рекомбинантных вирусов.

Были созданы два рекомбинантных ΜνΑ, экспрессирующих последовательности N81 и СИ8 под контролем двух различных промоторных комбинаций ^^N81^4-0^ или ΑΤI-N81/ρ7.5-Сυ8). Эти последовательности вместе с кассетой отбора ГЕЕ8/ЕСЕР (внутренний сайт вхождения рибосом/усиленный зеленый флуоресцентный белок) встраивали в сайт ΙΟΕ 136-137 (межгенный район между О ЕЕ Α136Ε и Α137Ε генома ΜνΑ) генома ΜνΑ в соответствии со способами, известными лицу с квалификацией в данной области. Эти вирусы очищали и пассировали 20 раз при селективных условиях. Оба рекомбинантных ΜνΑ амплифицировали до степени неочищенного исходного материала (бутыль 1x175 см²). Последовательность промотора ΑΤΙ в этом примере соответствовала последовательности 8ЕО ΙΌ N0:1.

- 7 012723

2. Экспрессия кодирующего ЕОЕР района.

Для определения функциональности инсертированного тест-гена в ЮК 136-137 во время пассирования наблюдали флуоресценцию. Если бы инсертированный ген не был функциональным, экспрессия ЕОЕР должна была бы быть недетектируемой. Клетки ВНК, инфицированные МУА-тВЫЗО и МУА111ΒΝ31. явно обнаружили, что ген, инсертированный в ЮК 136-137, транскрибировался.

3. ПЦР-анализ ЮК 136-137 \1\Α-ιιιΒΝ,30 и ΜΥΑ-μΒΝ31.

Для исключения возможных примесей пустого вектора в сайте ЮК 136-137 и для проверки, содержит ли вирусный геном инсерты ожидаемого размера, проводили ПЦР-анализ. Для этой цели использовали праймеры, которые связываются в районах, фланкирующих сайт инсерции. Ожидаемые ПЦРполосы для праймеров, связывающихся в сайтах фланкирующих последовательностей Даик1 и Даик2, равны (ί) 3,4 т.п.н. для рекомбинантного МУА-тВ№0; (ίί) 3,5 т.п.н. для рекомбинантного МУА-тВН31 и (ίίί) 212 п.н. для пустого вектора МУА-ΒΝ. Были обнаружены полосы ожидаемого размера для МУА111ΒΝ30 и МУА-шВ№1, указывающие на то, что эти рекомбинанты имели ожидаемую структуру генома. Вирус дикого типа не был обнаружен ни в одном из испытанных ДНК-препаратов МУА-тВЫ30 или МУА-тВЫ31. Далее, контроль пустого вектора МУА-ВЫ (пустой вектор) давал ожидаемый продукт 212 п.н. в обоих рекомбинантных МУА. Таким образом, посредством давления отбора достигнуты эффективный отбор и отделение рекомбинантного вектора от пустого вектора МУА-ВЫ.

4. Секвенирование области 136-137.

Результаты секвенирования показали, что для тВЫ30 и тВЫ31 промоторы и ОИ8 были инсертированы без изменений пар оснований в ЮК 136-137. Для N81 в тВЫ30 также не были обнаружены изменения в последовательности пар оснований. В тВЫ31 N81 имел четыре точковые мутации в последовательности пар оснований (положение 1315: С вместо О, положение 1582: О вместо А, положение 1961: А вместо С и положение 1963: О вместо Т). Два из них (в положении 1582 и 1963) не приводили к изменению аминокислот. Независимо от этих минорных отклонений последовательности из результатов секвенирования ясно, что оба рекомбинанта, тВЫ30 и тВЫ31, содержат полные последовательности N81. Кроме того, из результатов секвенирования был сделан вывод, что ген Ν81 стабильно содержится в рекомбинантном шВ№0, который содержит два промотора АТ1. Эти эксперименты демонстрируют стабильность этого рекомбинанта, хотя в вирусном геноме включены две идентичные последовательности промотора АТ1.

5. Анализ экспрессии гена N81 и гена ОИ8 в рекомбинантах тВН30 и тВН31.

Описанные выше результаты ПЦР и секвенирования обнаружили, что ген N81 и ген ОИ8 содержатся в геноме рекомбинантов МУА-тВН30 и МУА-тВН31. Для испытания, экспрессируются ли эти гены из вирусного генома, выполняли ОТ-ПЦР района N81 и функциональный тест и количественное определение продуцированных белков ОИ8.

5.1. ОТ-ПЦР района N81.

Этот эксперимент проводили для демонстрации того, что рекомбинантные МУА-тВ№0 и МУАтВГ31, которые оба содержат ген N81, встроенный в сайте 1ОК 136-137, функционально экспрессируют N81 в виде мРНК. Клетки ВНК инфицировали вирусами МУА-тВ№0 и МУА-тВН31 соответственно. РНК выделяли из этих клеток и использовали для ОТ-ПЦР-анализа. Результаты ясно показывают, что N81 экспрессируется из обоих вирусов в инфицированных ВНК-клетках. Загрязнение вирусной ДНК могло быть исключено, поскольку ПЦР-сигнал не детектировался в отсутствие стадии обратной транскрипции. Водный контроль был отрицательным, а для положительного в отношении плазмиды контроля обоих вирусов можно было обнаружить ясную ПЦР-полосу (фиг. 3).

5.2. Измерение активности ОИ8.

Для демонстрации экспрессии ОИ8, инсертированного в МУА-тВН30 и МУА-тВ№1 после 20 раундов пассирования, активность ОИ8 определяли количественно. В таблице ясно показано, что ОИ8 экспрессировался в обоих рекомбинантных вирусах, тогда как в МУА-ΒN без инсерции не удавалось измерить экспрессию ОИ8.

Измерение активности ОИ8 в МУА-шВ№0, МВа-тВН31 и МУА-ΒN после 20 пассажей. МУАтВН30 и МУА-тВН31 пассировали в целом 20 раз. Клетки инфицировали обоими рекомбинантными вирусами и собирали после 24 ч в лизисном буфере. Активность ОИ8 измеряли в соответствии со способами, известными лицу с квалификацией в данной области. Величины активности измеряли по оптической плотности при 415 нм. Величины <0,05 и >2,0 находятся за пределами диапазона

Разведение	1:2	1:10	1:10
πιΒΝ30	0,968	0,224	0,022
Π1ΒΝ31	0,414	0,089	0,012
ΒΝ	0,007	0,007	0,007

- 8 012723

Критерии приемлемости.

ПЦР-анализ ЮК. 136-137.

В дорожках отрицательного контроля не должны наблюдаться полосы, а в положительном контроле должна наблюдаться только полоса ожидаемого размера. Для ΜνΑ-ΒΝ ожидается фрагмент 212 п.н.

Секвенирование и ПЦР района 136-137.

ПЦР-амплификация вирусной ДНК-мишени с праймерами должна обнаруживать единственный фрагмент ожидаемой длины. Сборка этих последовательностей должна приводить к одной непрерывной последовательности, представляющей двухцепочечный ДНК-фрагмент ожидаемой длины. Допускаются короткие одноцепочечные отрезки, если в данном районе не произошла мутация. Кроме того, допускается, что концы этой непрерывной последовательности являются лишь одноцепочечными, вследствие гетерогенной природы продуктов ПЦР-амплификации. Последовательность тест-пробы должна обнаруживать гомологию >/=97% относительно ссылочной последовательности или соответствующей последовательности базы данных.

ОТ-ПЦР N81.

Не должны наблюдаться полосы в дорожках отрицательных контролей и только одна полоса ожидаемого контроля должна наблюдаться в положительном контроле. Для ρΒΝ71 ожидается фрагмент 909 п.н., а для ρΒΝ70 ожидается фрагмент 907 п.н.

Заключение.

После 20 пассажей при селективных условиях ПЦР-анализ ЮК 136-137 не обнаружил загрязнения пустым вектором для ΜνΑ-ωΒΝ31 (ΑΤΙ-Ν81/р7.5-СИ8) или ΜνΑ-ωΒΝ30 (ΑΤΙ-Ν81/ΑΤΙ-θυ8). Для ΜVΑ-тΒN30 ПЦР обнаружила, что в сайте ΑΤΙ не происходила гомологичная рекомбинация. ΜVΑ-тΒN30 и ΜVΑ-тΒN31 испытывали (1) конечной ПЦР для демонстрации, что исходный материал не содержит пустого вектора и что оба гена являются все еще инсертированными, даже когда оба находятся под контролем одного и того же промотора в одном и том же сайте ЮК (для ιηΒΝ30): (2) секвенированием этого района для демонстрации неизмененной последовательности оснований и (3) функциональной экспрессией Си8 посредством количественного анализа Си8 и ОТ-ПЦР для Ν81. Результаты этого исследования показывают, что двойная инсерция двух различных генов в одном и том же ЮК под контролем одного и того же промотора не приводит к событию рекомбинации в этом сайте промотора даже после высокого числа пассажей. Было показано, что оба инсертированных гена экспрессировались.

Список последовательностей <110> вауагтал 1МогсНс А/5 <120> Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора АТ, коровьей оспы <130> ВН52РСГ <15 0> ОК РА 2002 01814 <151> 2002-11-25 <160> 1 <17 0> Рагепгтп чегепоп 3.1 <210> 1 <211> 29 <212> ДНК <213> Вирус коровьей оспы <220>

<221> Промотор <222> (1)..(29) <223>

<400> 1 дИХрдаага ааасгштр аТааГаааТ

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Рекомбинантный поксвирус, содержащий в вирусном геноме по меньшей мере две экспрессионные кассеты, каждая из которых содержит промотор ΑΤΙ вируса коровьей оспы или его производное или субпоследовательность промотора ΑΤΙ или ее производное и кодирующую последовательность, где экспрессия кодирующей последовательности регулируется указанным промотором, производным или субпоследовательностью и где производное промотора ΑΤΙ коровьей оспы является последовательностью, которая имеет гомологию по меньшей мере 60% при сравнении с последовательностью 5>ЕО ΙΌ N0:1, и/или последовательностью, в которой не более чем 6 нуклеотидов заменены, делетированы и/или инсертированы в последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, причем длина субпоследовательности промотора ΑΤΙ составляет по меньшей мере 10 нуклеотидов последовательности 8Е0 ΙΌ N0:1, и промотор, производное или субпоследовательность имеют такую же биологическую активность, что и активность исходного промотора.
2. Рекомбинантный поксвирус по п.1, где промотор, производное или субпоследовательность являются поздним промотором вируса осповакцины.
3. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1, 2, где промотор, производное или субпоследовательность содержат нуклеотиды 25-29 или 22-29 8Е0 ΙΌ N0:1.
4. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-3, в котором экспрессия каждой кодирующей последовательности в каждой экспрессионной кассете находится под контролем каждого промотора ΑΤΙ, или каждого производного, или каждой субпоследовательности, причем производные или субпоследовательности имеют одинаковую структуру.
5. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-4, где по меньшей мере две экспрессионные кассеты встроены в один и тот же сайт инсерции в геноме поксвируса.
6. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-5, где промотор по меньшей мере в одной из экспрессионных кассет имеет последовательность 8Е0 ΙΌ N0:1.
7. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-6, где промотор по меньшей мере в одной из экспрессионных кассет является производным промотора ΑΤΙ, или субпоследовательностью промотора ΑΤΙ, или ее производным.
8. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-7, полученный на основе поксвируса, выбранного из группы, состоящей из ортопоксвирусов и авипоксвирусов.
9. Рекомбинантный поксвирус по п.8, где ортопоксвирус является вирусом осповакцины и где авипоксвирус выбран из поксвируса канареек и поксвируса домашней птицы.
10. Рекомбинантный поксвирус по п.9, где вирус осповакцины является модифицированным штаммом вируса осповакцины Лпкага (ΜΥΑ), в частности ΜVΑ-ΒN У00083008 и ΜνΑ 575 У00120707 соответственно.
11. Рекомбинантный поксвирус по п.10, где по меньшей мере одна из экспрессионных кассет встроена в природный сайт делеции генома ΜνΑ относительно генома штамма Сореийадеи вируса осповакцины.
12. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-11, где по меньшей мере одна из экспрессионных кассет встроена в межгенную область генома поксвируса.
13. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-12, где по меньшей мере одна из кодирующих последовательностей кодирует по меньшей мере один антиген, антигенный эпитоп и/или терапевтическое соединение.
14. Применение рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13 в качестве вакцины или лекарственного средства для индукции иммунного ответа.
15. Вакцина или фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-13, для индукции иммунного ответа.
16. Применение рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13 для получения вакцины или лекарственного средства для индукции иммунного ответа.
17. Способ введения кодирующих последовательностей в клетки-мишени, предусматривающий инфицирование этих клеток-мишеней вирусом по любому из пп.1-13.
18. Способ получения пептида, белка и/или вируса, предусматривающий:

а) инфицирование клетки-хозяина рекомбинантным поксвирусом по любому из пп.1-13;

й) культивирование инфицированной клетки-хозяина в подходящих условиях и

с) выделение и/или обогащение пептида, и/или белка, и/или вируса, продуцируемых указанной клеткой-хозяином.
19. Способ индукции иммунного ответа в организме животного, в том числе человека, включающий введение вируса по любому из пп.1-13, или композиции, или вакцины по п.15 подлежащему лечению животному или человеку.
20. Способ по п.19, включающий введение по меньшей мере 10² ТСШ₅₀ (инфекционных доз культуры ткани) вируса.
21. Клетка, содержащая вирус по любому из пп.1-13.

- 10 012723
22. Способ получения рекомбинантного вируса по любому из пп.1-13, включающий встраивание по меньшей мере двух экспрессионных кассет в геном поксвируса.