JP2005534326A - アビポックスウイルスの力価を増加させるためのワクシニアウイルス宿主域遺伝子 - Google Patents
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Abstract
Description
図1:組込みベクターpBNCaPVX06のプラスミド地図。
(概要)
この実施例では、NPTII(ネオマイシン耐性遺伝子)およびEGFP(緑色蛍光タンパク質)選択を使った組換えカナリア痘ウイルスの作製について説明する。ワクシニアウイルス宿主域遺伝子C7Lを、カナリア痘ウイルスの遺伝子間領域に相同組換えによってクローニングした。2回のプラーク精製(PP)後に、検出可能な野生型ウイルスは存在せず、組換えウイルスだけが存在した。組込み領域の配列決定により、組込みが正しく起こっていて、突然変異も存在しないことがわかった。RT−PCRにより、組み込まれた遺伝子、すなわち改変ワクシニアアンカラ由来のC7L遺伝子およびマーカー遺伝子カセットがうまく発現していることが示された。この組換えウイルスはGeneticin(登録商標)の選択圧がなくても、継代第20代までは安定であることが示された。
(序論)
この実施例の目的は、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子C7Lとマーカーカセットとを発現させる組換えカナリア痘ウイルス(canBN01)およびマーカーカセットだけを発現させる組換えカナリア痘ウイルス(canBNX01)を構築することだった。そこで、組込みベクターpBNCaPVX06(図1参照)およびpBNXCaPV08(図2参照)をクローニングした。これらの組込みベクターはどちらも、カナリア痘ウイルスゲノムに相同な2つの隣接配列、マーカーカセット(NPTII=ネオマイシン耐性、IRES=内部リボソーム結合部位、EGFP=強化緑色蛍光タンパク質)を持ち、pBNCaPV08はさらに、天然のC7Lプロモーターによって発現されるMVA(改変ワクシニアアンカラ)由来のC7Lも持っている(図4、SEQ ID NO:1参照)。MVA由来のC7Lはワクシニアウイルス中のC7Lと同じヌクレオチド配列を示す。マーカーカセットはPSプロモーター(ワクシニア強力合成プロモーター)によって発現される。カナリア痘ウイルスへの組込み部位は、TK遺伝子(チミジンキナーゼ)と機能未知のCa.Xと呼ばれる遺伝子との間に位置する(図3参照)。
(材料)
1.相同組換え(HR)
制限酵素BsaIによるプラスミドpBNCaPV09およびpBNCaPVX06(図1および図2参照)の線状化を50℃で一晩行った(プラスミド主鎖の切断)。消化物をPCR精製キット(Qiagen)で精製し、50μlのH2Oで溶出させた。
上述したように、組換えカナリア痘ウイルスの作製に使用されるプラスミドは、ネオマイシン耐性遺伝子を持っている。したがって、細胞培養培地にGeneticin(登録商標)を200μg/mlの濃度で添加することによって組換えウイルスを選択することができる。
(粗製ウイルスストックcanBNX01の調製)
トランスフェクション/感染(上記参照)後に、得られたウイルス含有懸濁液を、6穴プレート中で選択圧を受けている新鮮CEF細胞に加えた。蛍光プラークが得られた細胞の上清を使って、Geneticin(登録商標)の選択圧下で限界希釈を行うと共に、緑色蛍光タンパク質を発現する細胞/プラークのスクリーニングを行うことにより、組換えウイルスを精製した。組換えウイルスの生成をPCRスクリーニングによって確認した。またこれにより、残存している野生型の混入も検出することできた。野生型の混入がPCRによって検出できなくなるまで、プラーク精製工程を繰り返した。野生型が混入していないcanBNCaPVX01の陽性クローンが検出された3つのウェルの上清100μlを使って、ほぼコンフルエントなCEF細胞のT25フラスコを感染させた。培地にはGeneticin(登録商標)を加えておいた。37℃で3日間のインキュベーション後に、陽性の蛍光とCPEを検出することができた。フラスコを3回凍結/融解し、粗製ストックを採取した(P7=継代第7代)。そのうち200μlをPCR分析用に採取した。残りの材料は−20℃で凍結した。Geneticin(登録商標)による選択圧の存在下および不在下で、以下の3回の継代をCEF細胞のT25フラスコで行った。作業用粗製ストック(P11)をCEF細胞のT175フラスコ(Geneticin(登録商標)有りおよび無し)で調製した。これらの継代後に、組換えウイルスは、Geneticin(登録商標)を加えずに継代を行った場合でさえ、野生型が混入せず安定であることが示された。
(粗製ウイルスストックcanBN01の調製)
canBNCaPV01の陽性クローンが検出された3つのウェルの上清100μlを使って、ほぼコンフルエントなCEF細胞のT25フラスコを感染させた。さらなる精製は上述と同じ方法で行った。
DNA:5.0μl
H2O:2.95μl
10倍緩衝液:1.0μl
dNTP:0.2μl
プライマー#487:0.4μl
プライマー#488:0.4μl
Taqポリメラーゼ:0.05μl
(PCR条件):
94℃、5分;94℃、30秒;53℃、30秒;68°、3分;35サイクル;68℃、7分;4℃で維持。
(対照):
pBNCaPVX06およびpBNCaPV08(組込みに使用したプラスミド)
カナリア痘ウイルス(CaPV)由来のDNA(野生型の対照)
水対照
(予想されるPCR産物のサイズ)
pBNCaPVX06および組換えウイルス(canBNX01):2734bp
pBNCaPV08および組換えウイルス(canBNX01):3461bp
CaPV:436bp
PCR分析(図5Aおよび図5B)により、組換えウイルスが産生されることと、精製ウイルスが投入した野生型ウイルスを含まないことが明確に実証された。
配列決定は、ABI Prism配列決定装置で、製造者の指示に従って行った。配列決定には、プライマー#487、#488およびExpandポリメラーゼで生成したPCR産物を使用した。このPCR産物は、組込み隣接配列(F1、F1)の一部と、NPTII IRES EGFP領域およびC7L領域の全体とを含んでいる。予想どおりの配列を確認することができた。
ウイルス力価を二重の力価測定で決定し、平均力価を計算したところ、次のとおりだった:
canBNX01+Geneticin(登録商標):4.9×106 TCID50/ml
canBNX01[Geneticin(登録商標)なし]:3.7×106 TCID50/ml
canBN01+Geneticin(登録商標):1.3×107 TCID50/ml
canBN01[Geneticin(登録商標)なし]:2.2×106 TCID50/ml。
6.1 RNA調製
CEF細胞を6穴プレートに播種し(1ウェルあたり5×105細胞、DMEM 10%FCS)、翌日、100μlのcanBNX01およびcanBN01に、それぞれ感染させた。感染は、蛍光が検出可能になるまで2日間放置することによって行った。RNA抽出は、Rneasyミニキット(Qiagen)を使用し、製造者の指示に従って行った。RNA濃度をODによって測定した。
RNA:25μl
DNアーゼ(RNアーゼフリー):3μl
10×緩衝液A(Roche):5μl
H2O(RNアーゼフリー):50μlまで
37℃で90分。
RNAとプライマー#504(canBNX08用)または#498(canBN01用)とを、RNA 2μg対プライマー1μgの比率で混合した。水(RNアーゼフリー)を総液量が10μlになるまで加えた。その混合物を70℃で5分間放置した後、氷上でインキュベートした。
5×緩衝液:5μl
dNTP:5μl
Rnasin:0.5μl
M−MLV RT:2μl
H2O(RNアーゼフリー):2.5μl
42℃で60分。
DNA:5μl
10×緩衝液:5μl
dNTP:1μl
プライマー1:2μl
プライマー2:2μl
Taq(Roche):1μl。
(PCR条件):
94℃、5分;94℃、30秒;58℃、30秒;68℃、2分30秒;30サイクル;68℃、7分;4℃を維持。
RT−PCRおよび浄化後のRNA
対照:pBNCaPVX06およびpBNCaPV08(陽性対照)
プライマー:canBNX01には#505、#506
canBN01には#496、#497
予想されるPCR産物のサイズ:
pBNCaPVX06および組換えウイルス(canBNX01):2188bp
pBNCaPV08および組換えウイルス(canBN01):428bp。
(結論)
上述した方法を使って、ワクシニアウイルスC7L遺伝子を含んでいる組換えカナリア痘ウイルスを構築することができた。このC7L遺伝子はMVA(改変ワクシニアアンカラ)に由来し、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株中のC7L遺伝子と同じヌクレオチド配列を示す。2回のプラーク精製後に検出可能な野生型ウイルスは存在しなかったので、上記の選択方法は極めて有効であることが示された。挿入された遺伝子と両脇の隣接配列の一部とを配列決定したが、機能に影響を及ぼす突然変異は示さなかった。RT−PCRにより、天然プロモーターの調節を受けるワクシニア宿主域遺伝子C7Lの発現が示された。
組換えカナリア痘ウイルスcanBNX01(pS NPTII IRES EGFP)およびcanBN01(pS NPTII IRES EGFP C7L−MVA)の多段階増殖曲線解析
(概要)
この実施例の目的は、天然プロモーターの調節を受けるヒト(組織培養)宿主域遺伝子C7Lを発現させる組換えカナリア痘ウイルスの複製を、いくつかの細胞株での多段階増殖曲線で調べることだった。多段階増殖曲線とは、感染を低いmoi(感染の多重度)で行うことを意味し、これによりウイルスの伝播と複製を調べることが可能になる。その結果から、組換えカナリア痘ウイルスはCEF細胞での増殖性が向上していて、マーカーカセットだけを発現させる対照ウイルスの力価よりも1log高い力価をもたらすことがわかる。いくつかの哺乳類細胞株(ヒト、サルおよびウサギ細胞株)での複製特性は依然として影響を受けていない。これは組換えウイルスが対照ウイルスと同程度に弱毒化されているらしいことを意味する。
(序論)
この実施例では、C7Lを発現させる組換えカナリア痘ウイルス(canBN01;クローニングの詳細については実施例1を参照されたい)およびC7L遺伝子を発現させない対照ウイルス(canBN01;実施例1参照)の様々な細胞株または初代細胞における増殖能を評価する。使用する細胞株/細胞は、カナリア痘ウイルスに対して許容性である細胞、例えばCEF細胞と、カナリア痘ウイルスに対して非許容性である細胞株、例えばBHK−21、Vero、143B、HaCaT、Hela、MRC−5およびRK−13細胞である。カナリア痘ウイルスは、初代CEF細胞をはじめとする鳥類細胞でしか増殖しないという厳密な制約を持つことが知られている(Espositoら、1991;Plotkinら、1995;Taylorら、1995)。残念なことに、そのウイルス力価は、他のポックスウイルス(例えばMVAなど)と比較すると相対的に低い。そこで、ヒトワクシニアウイルス宿主域遺伝子C7L(Perkusら、1990;Oguiuraら、1993)を発現させる組換えカナリア痘ウイルスの増殖特性を、CEF細胞で評価し、組換えウイルスが依然として哺乳類細胞株では複製することができないかどうかを調べた。
(材料)
細胞株:
CEF:ニワトリ胚線維芽細胞、初代細胞
BHK−21:ベビーハムスター腎細胞、線維芽細胞株
Vero:アフリカミドリザル腎細胞、線維芽細胞株
143B:ヒト骨肉腫細胞株、TK−
HaCaT:ヒト角化細胞株
Hela:ヒト子宮頚部癌細胞株、上皮
MRC−5:ヒト肺細胞株、線維芽細胞
RK−13:ウサギ腎細胞株、上皮
細胞はすべてDMEM 10%FCSで培養する。
canBNX01、マーカーカセット(NPTII、IRES、EGFP;pS強力合成プロモーターによって調節される)だけを発現させる組換えカナリア痘ウイルス
canBN01、マーカーカセット(NPTII、IRES、EGFP;pS強力合成プロモーターによって調節される)と天然プロモーターによって調節されるMVA由来のC7Lとを発現させる組換えカナリア痘ウイルス。
DMEM(Gibco)
FCS(PAA)
他の試薬:RPMI(Gibco)、抗生物質−抗真菌物質(Gibco)、PBS(Gibco)、トリプシンEDTA(1×)(Gibco)、固定液:アセトン/メタノール1:1、インキュベーション溶液:PBS+3%FCS、抗CaPV血清(モルモット#433/1)、抗モルモットIgG−POD(Sigma)、染色液:PBS+TMB(Seramun)1:1。
各細胞株を、両ウイルスのそれぞれについて3枚の6穴組織培養皿で、ほぼコンフルエントまで成長させた。その細胞単層を、各ウェルにつき500μlのDMEM中、合計5×104 TCID50/mlを使って、約0.05のmoi(感染の多重度)で感染させた。37℃で1時間放置して感染させた後、未吸着ウイルスを除去するために細胞をDMEMで2回洗浄し、1000μlのDMEM 2%FCSにて37℃、5%CO2で4日間インキュベートした。感染後に細胞を培地中に掻き落とし、細胞+培地を3回凍結融解して、細胞からウイルスを遊離させた。これらのウイルス抽出物の力価をCEF細胞で測定した。
(CaPVの力価測定(カナリア痘ウイルス特異的抗血清による免疫染色))
力価測定をCEF細胞で行った。簡単に述べると、試験細胞(CEF)を、RPMI 1%抗生物質/抗真菌物質7%FCS中、1×104細胞/ウェルの濃度で、96穴プレートに播種し、37℃にて5%CO2で一晩インキュベートした。試験試料は既に3回凍結/融解されており、RPMI培地を使って、10−1〜10−12の希釈液を調製した。ウイルス希釈液を試験細胞に分配し、37℃にて5%CO2で5日間インキュベートして、CPEを発生させた。試験細胞を10分間固定し、PBSで洗浄し、インキュベーション緩衝液で1:1000希釈したカナリア痘ウイルス特異的ポリクローナル抗血清と共に、室温で1時間インキュベートした。PBSで2回洗浄した後、インキュベーション緩衝液で1:1000希釈したHPR結合抗モルモット抗体を、室温で1時間加えた。細胞を再びPBSで2回洗浄し、青色のスポットが見えるようになるまで(15分)、染色液と共にインキュベートした。染色液を除去し、細胞をPBSで洗浄した。褐色のスポットを呈する各ウェルはCPEに関して陽性であるとして印を付け、Kaeberの式を使って力価を計算した(TCID50に基づくアッセイ)(Kaerber,G.1931.Arch.Exp.Pathol.Pharmakol.162,480)。
(結果)
ワクシニアウイルス宿主域遺伝子C7Lを発現させる組換えカナリア痘ウイルスを使って、三つ組にしたCEF、BHL−21、Vero、143B、HaCaT、Hela、MRC−5およびRK−13細胞を、低い感染多重度(moi 0.05)で感染させた。感染後にウイルス接種物を除去し、未吸着の遊離ウイルス粒子を除去するために細胞を2回洗浄した。次に、4日間放置して感染させ、ウイルス抽出物を調製し、CEF細胞で力価を測定した。図6は、それらの6穴プレートについて産生量/投入量の比をプロットしたものである(産生量とは4日後の総ウイルス産生量を意味し、投入量とは最初の感染に使用したウイルスの量を意味する)。これらの比はさまざまな細胞タイプにおけるウイルス増幅度の明確な指標になる。
(結論)
ワクシニアウイルスヒト宿主域遺伝子C7L(MVA(改変ワクシニアアンカラ)由来)がその天然プロモーターの調節を受けて発現するようにするカナリア痘ウイルスの遺伝子工学は、CEF細胞でのウイルス力価を増加させるのに有用である。カナリア痘ウイルスは、増殖しても力価は比較的低く、他のポックスウイルス(例えばMVA)と比べると増殖速度も遅いことが知られている。したがって、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子は、一連の哺乳類細胞に対する弱毒化された複製特性に影響を及ぼさずにカナリア痘ウイルスの産生量を増加させるための、優れた道具である。
Esposito,J.J.ら:Arch.Virol.Suppl.(1991)2,79−102.
Oguirua,N.ら:Journal of General Virology(1993)74,1409−1413.
Perkus,M.ら:Virology(1990)179,276−286.
Plotkin,S.A.ら:Dev Biol Stand.Basel,Karger(1995)Vol.84,165−170.
Taylor,J.ら:Vaccine(1995)Vol.13,No.6,439−549.
Claims (28)
- ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルス(ただし当該アビポックスウイルスが、ワクシニアウイルスK3L遺伝子と、HIV gag−pro、gp120/TMおよびNef/Polポリエピトープストリングの各発現カセットとを、ウイルスゲノム中に含んでいる組換えカナリア痘ウイルスである場合は、上記宿主域遺伝子はE3L遺伝子ではないものとする)。
- ワクシニアウイルス宿主域遺伝子がヒト細胞用の宿主域遺伝子である、請求項1記載のアビポックスウイルス。
- 宿主域遺伝子がワクシニアウイルス遺伝子E3L、C7LおよびK1Lから選ばれる、請求項1又は2記載のアビポックスイルス。
- 鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルスより成る群から選ばれる、請求項1〜3のいずれか1つに記載のアビポックスウイルス。
- ウイルスゲノム中に少なくとも1つの追加異種核酸配列を含んでいる、請求項1〜4のいずれか1つに記載のアビポックスウイルス。
- 追加異種核酸配列が、少なくとも1つの抗原、抗原エピトープ及び(又は)治療化合物をコードする配列から選ばれる、請求項5記載のアビポックスウイルス。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載のアビポックスウイルスと、薬学的に許容し得る担体、希釈剤及び(又は)添加剤を含む薬学的調合物。
- 請求項1〜6のいずれか1つに記載のアビポックスウイルスを含むワクチン。
- ヒトを含む動物生体において免疫学的応答に影響を及ぼすための、好ましくは誘導するための薬物としての、請求項1〜6のいずれか1つに記載のウイルス、請求項7記載の調合物、または請求項8記載のワクチン。
- 医薬またはワクチンの製造を目的とする、請求項1〜6のいずれか1つに記載のウイルスの使用。
- 標的細胞中に相同及び(又は)異種核酸配列を導入する方法であって、標的細胞を請求項5または6記載のウイルスに感染させることを含む、上記方法。
- ペプチド、タンパク質及び(又は)ウイルスを生産する方法であって、宿主細胞を請求項1〜6のいずれか1つに記載のウイルスに感染させる工程、感染した宿主細胞を適切な条件下で培養する工程、ならびにウイルスゲノムから発現したペプチド及び(又は)タンパク質及び(又は)該宿主細胞によって産生されたウイルスを単離及び(又は)濃縮する工程を含む、上記方法。
- ヒを含む動物の生体における免疫応答に影響を及ぼす、好ましくは誘導する方法であって、処置すべき動物またはヒトに、請求項1〜6のいずれか1つに記載のウイルス、請求項7記載の調合物、または請求項8記載のワクチンを投与することを含む、上記方法。
- 動物が免疫不全状態である、請求項13記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか記載のウイルスを含んでいる細胞。
- 次の工程:
場合により請求項5又は6記載の異種核酸をウイルスゲノム中に含んでいるアビポックスウイルスゲノム及び請求項1〜3のいずれか1つに記載の宿主域遺伝子を含んでいるDNA(このDNAは当該アビポックスウイルスのゲノムDNAと特異的な組換えを起こす能力を持っている)を、該ウイルスが増殖的に複製できる細胞中に導入する工程及び、
該宿主域遺伝子をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離/濃縮する工程
を含む、請求項1〜6のいずれか1つに記載のアビポックスウイルスを得る方法。 - 次の工程:
請求項1〜4のいずれか1つに記載のアビポックスウイルスのゲノム、及び少なくとも1つの追加異種配列を含んでいるDNA(このDNAは当該アビポックスウイルスのゲノムDNAと特異的な組換えを起こす能力を持っている)を、該ウイルスが増殖的に複製できる細胞中に導入する工程及び、
少なくとも1つの該追加異種配列をウイルスゲノム中に含んでいるウイルス粒子を、これらの細胞から単離/濃縮する工程
を含む、請求項5又は6記載のアビポックスウイルスを得る方法。 - アビポックスウイルスおよびワクシニアウイルスに感染した細胞(特に鳥類細胞)であって、当該ワクシニアウイルスが少なくとも1つのワクシニア宿主域遺伝子またはその相同体をウイルスゲノム中に含んでいる、上記細胞。
- ワクシニアウイルス宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体を含んでいる細胞(特に鳥類細胞)であって、該宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体がワクシニアウイルスゲノムの一部ではない、上記細胞。
- 宿主域遺伝子が請求項2又は3記載の宿主域遺伝子である、請求項18又は19記載の細胞。
- 宿主域遺伝子が細胞ゲノムに組み込まれる、請求項19又は20記載の細胞。
- 宿主域遺伝子が非組込みDNAの一部である、請求項19又は20記載の細胞。
- アビポックスウイルスに感染した、請求項19〜22のいずれか1つに記載の細胞。
- アビポックスウイルスが組換えアビポックスウイルスである、請求項23記載の細胞。
- 宿主域遺伝子または同宿主域遺伝子の相同体がアビポックスウイルスのゲノムの一部ではない、請求項23又は24記載の細胞。
- アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする細胞であって、請求項15又は18〜25のいずれか1つに記載の細胞。
- アビポックスウイルスによる鳥類細胞の感染後にその細胞から産生されるアビポックスウイルスの力価を増加させることを目的とする、ワクシニアウイルス宿主域遺伝子またはその相同体(特に請求項2又は3記載の宿主域遺伝子)の使用方法であって、当該宿主域遺伝子が該細胞内で発現される、上記使用方法。
- 請求項19〜22のいずれか1つに記載の細胞をアビポックスウイルスに感染させることによって、または請求項15、18又は23〜25のいずれか1つに記載の細胞を培養することによって、アビポックスウイルスの力価を増加させる方法であって、該細胞が、当該アビポックスウイルスの増殖的複製を可能にする細胞である、上記方法。
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