JP2001514519A

JP2001514519A - 発現が増強されたベクターならびにそれらの作出方法および用途

Info

Publication number: JP2001514519A
Application number: JP53959198A
Authority: JP
Inventors: タータグリア，ジェイムズ; エルジャコブス，バートラム; ジェイゴーベル，スコット; アイコックス，ウィリアム; ロバートゲティッグ，ラッセル; イーピンカス，スティーヴン; パオレッティ，エンゾ
Original assignee: ヴァイロジェネティクスコーポレイション; アリゾナステイトユニヴァーシティー
Priority date: 1997-03-12
Filing date: 1998-02-25
Publication date: 2001-09-11
Also published as: DE69839554D1; WO1998040500A1; EP0968295A1; ATE397078T1; AU745836B2; CA2283462A1; EP0968295A4; DK0968295T3; CA2283462C; ES2307315T3; EP0968295B1; AU6668198A; US6004777A

Abstract

(57)【要約】発現が増強されたベクターならびにそれらを作出し、使用する方法を開示している。発現の増強は、少なくとも１個の第一の核酸分子および少なくとも１個の第二の核酸分子の実質的な共発現によるものである。第二の核酸分子は翻訳因子をコードしている。同時発現は、第一および第二の核酸分子が１個のプロモーターに機能発揮できるように結合することにより、または第一の核酸分子が第一のプロモーターに、第二の核酸分子が第二のプロモーターに機能発揮できるように結合することによって行われ、該第一および第二のプロモーターは実質的に同時に機能する。第一および第二の核酸分子はベクター内の同一の遺伝子座に存在していても異なる遺伝子座に存在していてもよい。第二の核酸分子は、１個の翻訳因子または１個以上の翻訳因子をコードすることができる。翻訳因子は、K3Lオープンリーディングフレーム、E3Lオープンリーディングフレーム、VA1 RNA、EBER RNA、シグマ３オープンリーディングフレーム、TRBPオープンリーディングフレームまたはそれらを組み合わせたものを用いることができる。ベクターとしては、減弱ポックスウイルスなどのポックスウイルスを用いることができ、例えば、NYVACワクシニアウイルスまたはALVACカナリアポックスウイルスなどが挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】発現が増強されたベクターならびにそれらの作出方法および用途関連出願パオレッティ（Paoletti）らによる出願中であるUSSN 08/417,210号、08/303 ,275号、08/709,209号、08/184,009号（米国特許第5,378,457号として発行されているUSSN 07/805,567号を参考として取り入れている）および08/521,016号、ならびに米国特許第5,378,457号、5,225,336号、5,453,364号、5,494,807号、5, 505,941号および5,110,587号を全て参考として本明細書に取り入れておく。発明の属する技術分野本発明は、増強されたベクター、ならびにそれらを作出し、使用する方法に関する。該ベクターは、翻訳および／または発現、例えば、目的の核酸配列の翻訳および／または発現が増強されている。本出願においてはいくつかの参考文献を参照している。これらの文献の引用については、引用箇所または明細書の最後に記載しており、これらの文献の各々を参考として本明細書に取り入れておく。これらの文献は本発明に関係する分野に関するものではあるが、これらの文献が従来の技術であるわけではない。発明の背景プラスミドや裸のDNAなどのDNA、ならびにウイルス性（例えば、ワクシニアウイルスおよび最近ではその他のポックスウイルスなど）のベクターのようなその他のベクター類は、外来遺伝子の挿入および発現に用いられている。外来遺伝子を生きた感染性のポックスウイルスに挿入する基本的な手法としては、ドナープラスミド内の外来遺伝子配列と接しているポックスDNA配列と、ドナープラスミドに存在する相同配列および変更されるポックスウイルス内に存在する相同配列とを組み換えることが含まれる（ピッチーニ（Piccini）ら、1987年）。組み換えポックスウイルスは、米国特許第4,769,330号、4,772,848号、4,603,112号、5 , 505,941号および5,494,807号において既知の工程を経て、または類似の方法によって構築され、これらを参考として本明細書に取り入れておく。ベクターの開発において所望されることは、例えば、安全性を増した減弱ベクターであり、そのようなベクターは例えば、免疫学的組成物またはワクチン組成物に用いることができる。例えば、ワクシニアのコペンハーゲン株（Copenhagen）から特定の毒性遺伝子および宿主域遺伝子を欠失することによって作出されたNYVACベクターは（タータグリア（Tartaglia）ら、1992年））、発現された外来抗原に対して防御免疫応答を誘起する組み換えベクターとして有用であることが証明されている。同様に、カナリアポックスウイルスのワクチン株であるALVACベクターは、ウイルス性の組み換えワクチンベクターとして有効であることが証明されている（パークス（Perkus）ら、1995年）。鳥類以外の宿主においては、これらのベクターは生産的な複製を行わない（NYVACについてはいくつかの例外あり）。全てのポックスウイルスは細胞質内でウイルスの転写に必要なタンパク質の大部分を複製し、コードしているが、全てを複製し、コードしているわけではないので（モス（Mo ss）、1990年）、適切に操作すると、ウイルス性の生産的複製がなされない状況において、ポックスウイルスプロモーターの制御下で外来コード配列を転写翻訳できる。増強されたベクター、例えば、転写または転写および翻訳ならびに／または発現が増強されたベクターを提供することは従来技術を改良するものであり、例えば、そのようなベクターが減弱されている場合には、特に、減弱によって発現レベルおよび／または持続性が上昇することから、発現レベルや持続性を改良することになる。発明の概要と目的ワクシニアの複製に関する最近の研究により、ウイルス性の転写および翻訳の制御の役割をする機能について、ある種のポックスウイルスがコードしていることが明らかになっている（モス（Moss）による総説、1990年；モス（Moss）、19 92年）。ワクシニアがコードしているこれらの機能の内のいくつか（例えば、K3 L、E3Lおよびそれらの組み合わせなど）は現在では驚くほど活用され、ベクター内（例えば、ALVACベクターなど）における遺伝子発現（例えば、外来遺伝子発現）のレベルおよび持続性を向上させており、また、新規ベクターや方法の好例である。本発明の目的としては、次のうち少なくともひとつが含まれる。ベクターによって目的のヌクレオチド配列の少なくともひとつ（例えば、ベクターによってコードされているヌクレオチド配列など）からの翻訳および／または発現を増加する方法、翻訳が増強されているベクター、翻訳および／または発現が増強されているベクターを調製する方法の提供、ベクターからの翻訳および／または発現を増強する方法の提供、ポックスウイルスベクターなどの改良ベクター（例えば、改良NYVACベクター、ALVACベクターまたはTROVACベクターなど）の提供、ならびにそれら由来の産物。従って、本発明は、細胞内の少なくとも１個の第一のヌクレオチド配列の発現が増強されているベクターを提供する。このベクターを改変して第一のヌクレオチド配列を含むようにすることができる。該ベクターを改変して、翻訳因子をコードしている少なくとも１個の第二のヌクレオチド配列を含むようにする。好ましい態様としては、第一および第二のヌクレオチド配列から実質的に共発現が行われるようにする。翻訳を増強することにより、第二のヌクレオチド配列の発現が第一のヌクレオチド配列の発現を増強する。翻訳因子によって翻訳が増強されている細胞内でベクターを使用することが好ましい。第一のヌクレオチド配列は第一のプロモーターに機能発揮できるように結合することができ、第二のヌクレオチド配列は第二のプロモーターに機能発揮できるように結合することができ、さらに、第一および第二のプロモーターは、機能上、実質的に共働または同時に作用することが好ましい。従って、第一および第二のヌクレオチド配列はベクター内の異なる遺伝子座に存在していてもよい。第一および第二のヌクレオチド配列は、第一および第二のプロモーター使用しながら、あるいは、第一のヌクレオチド配列および第二のヌクレオチド配列を機能発揮できるようにプロモーターに連結することによって、ベクター内の同じ遺伝子座に存在していてもよい。翻訳因子は、eIF-2αリン酸化の阻害もしくはPKRリン酸化の阻害に有効であり、あるいは、dsRNAの有効濃度の上昇をもたらすdsRNAを隠ぺいする。第二のヌクレオチド配列は、K3Lオープンリーディングフレーム、E3Lオープンリーディングフレーム、VAI RNA、EBER RNA、シグマ３オープンリーディングフレーム、TRB Pオープンリーディングフレームまたはそれらを組み合わせたものからなる群から選択することができる。第一のヌクレオチド配列は、目的のエピトープ、生物学的応答調節物質、成長因子、認識配列、治療遺伝子および融合タンパク質をコードしている配列からなる群から選択することができる。ベクターとしては、ポックスウイルス、例えば、オルトポックスウイルス属またはアビポックスウイルス属（例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリアポックスウイルスなど）などの組み換えウイルスを用いることができ、減弱されたポックスウイルス（例えば、NYVAC、ALVAC、TROVACなど）のような減弱されたウイルスが好ましい。本発明はさらに、ベクターを改変して少なくとも１個の第二のヌクレオチド配列を含むようにした新規なベクターを調製する方法を提供する。本方法はまた、ベクターを改変して少なくとも１個の第一のヌクレオチド配列を含むようにすることも可能である。好ましくは、ベクターを改変して第一および第二のヌクレオチド配列を実質的に共発現または同時に発現させ、さらに好ましくは、ベクターを改変して、ベクターを組み込んでいる細胞内に翻訳因子を導入する。本方法は、第一のヌクレオチド配列が第一のプロモーターに、第二のヌクレオチド配列が第二のプロモーターに機能発揮できるように結合することを含み、ここで、該第一および第二のプロモーターの機能は実質的に共働または同時作用である。本方法はまた、第一および第二のヌクレオチド配列をプロモーターに機能発揮できるように結合することを含む。本発明はさらに、少なくともひとつの新規なベクターならびに薬剤学的に許容される基剤または希釈剤を含む免疫学的ワクチンまたは治療組成物を提供する。またさらに本発明は、宿主（動物、ヒト、脊椎動物、哺乳類など）に少なくとも１種の新規な組成物を投与することによって宿主内において免疫学的応答または治療応答を起こす方法を提供する。加えて本発明は、第一のヌクレオチド配列を有するベクターによって、少なくとも１個の第一のヌクレオチド配列に由来する発現を増加させる方法を提供する。本方法は、ベクターを改変して、翻訳因子をコードしている少なくとも１個の第二のヌクレオチド配列を含むようにすることからなる。第一および第二のヌクレオチド配列は実質的に共発現または同時発現であることが好ましい。発現は細胞内で行うことができ、さらに、特定の翻訳因子によって発現が増強されている細胞内において発現する翻訳因子を有していることが好ましい。加えて、本方法は、ベクターを改変して第一のヌクレオチド配列を含むようにすることもできる。別の実施態様においては、本発明は、少なくとも１個の新規なベクターを有する適切な細胞内で、感染またはトランスフェクトによってイン・ビトロ（in vit ro）条件下、少なくとも１個の遺伝子産物を発現する方法を提供する。この生成物は目的のエピトープであることから、治療組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物の調製に有用であり、またはモノクローナル抗体などの抗体の産生に有用であり、また、診断組成物（例えば、抗体の検出など）のようなアッセイ、キット、試験などに有用である。故に、本発明は、少なくとも１個の新規なベクターを有するイン・ビトロ(in vitro）での翻訳および／もしくは発現のための組成物および方法、例えば、遺伝子産物を生成する方法（この遺伝子産物は、治療組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物において、あるいは診断もしくは検出キット、アッセイもしくは方法において、抗原またはエピトープとして用いることができ、例えば、抗体の存在、不在をを確認するため、またはモノクローナル抗体などの抗体を誘起するためなど、例えば、診断または検出キット、アッセイもしくは方法における使用のためなど）、少なくとも１個の新規なベクターを有するエクス・ビトロ（ex vitro）での翻訳および／もしくは発現のための組成物および方法、例えば、宿主（例えば、動物、ヒト、脊椎動物、哺乳類など）に再注入するために刺激を与えた細胞において遺伝子産物を生成する方法などを提供する。さらに本発明の別の実施態様においては、少なくとも１種の新規なベクターを宿主（動物、ヒト、脊椎動物、哺乳類など）に投与することによって、イン・ビボ（in vivo）において少なくとも１個のヌクレオチド配列（例えば、少なくとも１個の第一のヌクレオチド配列など）を発現する方法を提供する。このヌクレオチド配列は目的のエピトープをコードしているものとする。本方法により、抗体を得ることができる。抗体を産生させることにより、モノクローナル抗体を誘起することが可能である。あるいは、抗体はアッセイ、キット、試験もしくは診断組成物（例えば、抗原の検出など）として有用である。故に本発明は、新規なベクターを含むイン・ビボ（in vivo）における翻訳および／または発現のための方法および組成物を提供し、これは例えば、少なくとも１種の新規なベクター、もしくは少なくとも１種の新規なベクターを含む組成物、例えば、少なくとも１種の新規なベクター、ならびに適切な基剤もしくは希釈剤（例えば、獣医用薬およびヒトの薬として適したものなど）を含む治療組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物を投与することなどである。これらおよびその他の実施態様は、以下に開示しており、または以下の発明の詳細な説明から自明である。図面の簡単な説明以下の発明の詳細な説明は例示であり、本発明を特定の実施態様に限定するためのものではなく、添付の図面と併せて理解されるものであり、本明細書に参考として取り入れておく。図１は、H6/K3LおよびE3L発現カセットを含むALVAC C6挿入部位のヌクレオチド配列を示す（SEQ ID NO: ）。図２は、改変されたT5NTモチーフを有するFHV gB領域をコードしているDNA配列を示す（SEQ ID NO: ）。図３は、H6にプロモートされているFHV gBドナープラスミドであるpC3H6FHVB のDNA配列を示す（SEQ ID NO: ）。図４および５は、vCP1433およびvCP1452内の挿入体のDNA配列およびアミノ酸配列を示す（SEQ ID NOS: ）。図６は、vC1452内のK3L E3LのDNA配列を示す（SEQ ID NO: ）。発明の詳細な説明パオレッティ（Paoletti）らの米国特許第5,494,807号を参考として本明細書中に取り入れておく。これは、ウイルスにコードされている遺伝子機能が不活化されている変性組換えウイルスに関し、組換えウイルスは毒性が減弱され、安全性が増している。パオレッティ（Paoletti）らによって開示されているウイルスは、ポックスウイルスであり、例えば、ワクシニアウイルス、もしくは鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなどのアビポックスウイルス（例えば、NY VAC、 ALVACおよびTROVAC）である。ALVACは、プダペスト条約に基づいてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）（アメリカ合衆国メリーランド州ロックヴィル、パークローン通り12301番地、郵便番号20852）にATCC受け入れ番号VR-2547として寄託されている。TROVACも同様にブダペスト条約に基づいて受け入れ番号2553としてATCCに寄託されている。さらに、vCP205、vCP1433、pMPC6H6K3E3およびpC3H6FHVBもブダペスト条約に基づいて受け入れ番号、、、およびとしてATCCに寄託されている。パオレッティ（Paoletti）らと同様に、1994年４月24日に出願された米国特許出願08/235,392号に基づく、発行されているファルクナー（Falkner）らのWO 9 5/30018号（1995年11月９日発行）（両者とも参考として本明細書中に取り入れておく）はポックスウイルスに関し、この発明では、毒性に関連する遺伝子機能に対する遺伝子座（すなわち、「必須」機能に対する遺伝子座）を外来性DNAの挿入に用いている。さらに、初期の（DNA）および後期欠損突然変異体（コンディット（Condit）およびナイルス（Niles）、「オルトポックスウイルスの遺伝子学（Orthopoxvir us Genetics）」、R.W.モイヤー（Moyer）およびP.C.ターナー（Turner）編『ポックスウイルス（Poxviruses）』より（スプリンガー−ヴェルラーグ（Springer -Verlag）社、1990年）、pp１−39、およびそれらの引用されている文献を本明細書中に参考として取り入れておく）、または後期に不全であるとされているMV Aから組換え体を作出することができる。欠損突然変異体、不全後期ウイルス、必要な遺伝子機能が欠損もしくは阻害されているウイルス、または生産的な複製を伴わない発現をするウイルス（例えば、哺乳類系におけるALVACなど）由来の組換え体は減弱されているということができる。ベクター、特に減弱されたベクター内において、外来遺伝子の発現、例えば、外来遺伝子発現レベルまたは発現の持続性などを向上させることは有用である。外来遺伝子の発現を増す方法としては、翻訳（例えば、ウイルス性のmRNAの翻訳のようなmRNAの翻訳など）の全体的な効率を増強することが含まれる。最近、ワクシニアによってコードされている２つの機能（E3LおよびK3L）は、ウイルス性翻訳の制御に役割を果たしていることが明らかになった（ベアティー（Beatti e）ら、1995年、1995年b、1991年；チャン（Chang）ら、1992年；ダヴィーズ（D avies）ら、1993年）。これらは両方とも細胞性タンパク質キナーゼ（PKR）の活性を阻害することが可能であり、これは、二本鎖RNA（dsRNA）によって活性化された場合に、翻訳開始因子であるeIF-2αをリン酸化してmRNAの翻訳の開始を阻害するものである（ヤコブス（Jacobs）およびラングランド（Langland）による総説、1996年）。故に、ウイルス性の翻訳中にdsRNAを産生するワクシニアウイルスは、eIF-2αに対するPKRの負の作用を阻止し、ウイルス性mRNAの効率的な翻訳を行わせるメカニズムを有している。（非対称転写によってdsRNAが増加し、任意のウイルス性またはプラスミド由来の発現がdsRNAを増加させる。dsRNAはPK Rを活性化し、PKRは自己リン酸化されてeIF-2αをリン酸化する。）ワクシニアのK3L ORFは、eIF-2αとのアミノ酸の相同性が非常に高いことが示されている（ゲーベル（Goebel）ら、1990年；ベアティー（Beattie）ら、199 1年；米国特許第5,378,457号；また、ベアティー（Beattie）ら、1995年a、1995 年bを参照のこと）。このタンパク質はPKRの偽基質として作用し、eIF-2α結合部位において競合すると考えられている（キャロル（Carroll）ら、1993年；ダヴィーズ（Davies）ら、1992年）。K3L遺伝子産物は活性化されたPKRに結合することができ、故に、翻訳の開始に負の影響を与えることになるeIF-2αのリン酸化を阻止する。ワクシニアのE3L遺伝子は、dsRNAに特異的に結合することができるタンパク質をコードしている（ワトソン（Watson）およびヤコブス（Jacobs）、1991年；チャン（Chang）ら、1992年）。このことは、感染した細胞内においてdsRNAの量が低下し、従って、活性化されたPKRのレベルが下がることを意味している。ワクシニアからE3Lを欠失させると、得られたウイルスはこのキナーゼ阻害機能を失い、さらに、rRNAの分解がすすむことによって２’，５’オリゴアデニレートシンセターゼ／RNアーゼＬ回路が活性化する（ベアティー（Beattie）ら、1995年a 、1995年b）。故に、ワクシニアに感染した細胞内におけるmRNAの効率的な翻訳に対しては、２つのレベル、すなわちmRNAの安定性およびeIF-2αのリン酸化の制限において、E3Lが必須であると考えられる。 ALVACゲノムは配列が明らかにされており、E3L/K3Lまたは任意の既知のdsRNA に対する相同性について研究がなされている。その結果、いずれのALVAC ORFもこれら２個のワクシニアのORFsに対して顕著な相同性は認められず、dsRNA結合モチーフも全く存在していないことが明らかになっている。従って、組換えALVACベクター内において発現レベルを向上させるためには、初期ワクシニアプロモーターの制御下において、ALVAC内でワクシニアのE3L/K3L ORFsを発現させる。感染細胞においてはPKRが阻害されるが、外来遺伝子の発現のレベルおよび持続性は向上する。このように、本明細書に記載しているALVAC組換え体は、外来遺伝子の転写または転写および翻訳レベルを増強する目的で作出されたものであり、本発明のベクターおよび方法の一例である。従って、本明細書において例示されているのは、挿入された外来遺伝子の転写または転写および翻訳レベルあるいは持続性を増強もしくは向上させるためのワクシニアE3L/K3L遺伝子の発現が可能なALVAC組換え体である。外来遺伝子の発現が多くなるように制御することにより、これらの新規なベクター由来の組換え体を投与または接種した宿主内において治療的応答または免疫学的応答の誘導に十分な効果を発揮することができ、それによって免疫学的（例えば、防御的など）応答の増強または治療的応答の増強が得られる。すなわち、E3LおよびK3Lのいずれかの発現を操作し、それによって翻訳および／または発現の効率を増強する本発明は、他の真核生物のベクター系（すなわち、DNA、ウイルス）にも応用することが可能である。事実、他の科のウイルスにおいても、PKRの活性化を介した翻訳が少なくなるように制御することによる細胞性の抗ウイルス性応答を克服するメカニズムが発見されている。アデノウイルスにおいては、RNA pol IIIによって転写されるVA I RNAについて特性がよく調べられており、直接PKRに結合することが示されていることから、dsRNAによってその活性化が阻止される（マシューズ（Mathews）およびシェンク（Shenk）、1991年）。アデノウイルスゲノムからVAIを欠失させることにより、複製をあまり行わず、後期遺伝子発現のレベルが不十分な突然変異体が得られる（シマパヤ（Thimmappaya）ら、1982年）。同様に、エプスタイン・バーウイルス（EBウイルス）、ヘルペスウイルスは、EBERとよばれる類似の RNAを有しており、これも、キナーゼに直接結合することによってPKRの活性化を阻止する働きをする（クラーク（Clark）ら、1991年；シャープ（Sharp）ら、19 93年）。レオウイルスのシグマ３遺伝子産物は、dsRNAに結合し、PKRの活性化を阻止する点において、ワクシニアのE3Lと同様に作用することが示されている（イマーニ（Imani）およびヤコブス（Jacobs）、1988年；ベアティー（Beattie）ら、1995年aも参照のこと）。実際、ひとつの研究においては、E3Lが欠失したワクシニア組換え体をレオウイルスのシグマ３遺伝子が部分的に補償することができることが示されている（ベアティー（Beattie）ら、1995年a）。さらに、HIV 感染状態において活性化された細胞性タンパク質（TRBP）はPKRの活性化を阻害することが示されている（パーク（Park）ら、1994年）。従って、本発明は広く発現の増強に関し、好ましくは、発現を増加または増強するような少なくとも１個の翻訳因子（例えば、任意の真核細胞のベクター系においてPKRの活性化を介した翻訳が少なくなるように制御することによって細胞性の抗ウイルス性応答を克服するような産物をコードしているヌクレオチド配列など）を用いる。また、本発明は、プラスミドもしくは裸DNAベクター、ウイルス性ベクター（ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスなど）を含む任意のベクター系に使用することができる。従って、ヌクレオチド配列は、ベクター系に適していれば例えばRNAでもDNAでもよい。従って、本発明は、少なくとも１個の翻訳因子をコードしている少なくとも１個のヌクレオチド配列を含むように改変されたベクター、ならびにベクターによって翻訳および／または発現を増強する方法、もしくは新規なベクターを調製する方法に関し、これは例えば、ベクターを改変して少なくとも１個のヌクレオチド配列を含むようにすることなどである。これらの方法には、（ｉ）少なくとも１個の目的とするヌクレオチド配列を含む第一のヌクレオチド配列、および（ｉｉ）翻訳因子をコードしている少なくとも１個のヌクレオチド配列を含む第二のヌクレオチド配列からの実質的共発現を含む。ベクターを改変して、少なくとも１個の目的とするヌクレオチド配列を含むようにすることもできる。この少なくとも１個の目的とするヌクレオチド配列としては、少なくとも１個のコードしているヌクレオチド配列を用いることができる。ベクターは、第一および第二のヌクレオチド配列が実質的に共発現するかまたは同時発現するものが好ましい。実質的な共発現は、感染のほぼ同じ時期または段階において機能を発揮するような第一および第二のヌクレオチド配列についてのプロモーターを導入することによって起こすことができる。従って、目的とするヌクレオチド配列および因子をコードしているヌクレオチド配列は、ベクター内の異なる遺伝子座に存在していてもよい。別の方法としては、第一および第二のヌクレオチド配列を同一の遺伝子座内に配置することによって実質的な共発現を起こすことが可能である。従って、実質的な共発現は、目的とするヌクレオチド配列を機能発揮できるように連結することにより、ならびに／または目的とするヌクレオチド配列、翻訳因子をコードしているヌクレオチド配列にプロモーターを機能発揮できるように連結することによって起こすことができる。翻訳因子は任意の適切な系から得たものを用いることができる。翻訳因子は、 eIF-2αリン酸化を阻害する、もしくはPKRリン酸化を阻害する効果を有する、またはdsRNAの有効濃度を上昇させる細胞性dsRNAを減少させるものであることが好ましい。翻訳因子は、以下ものを含む群からの発現から選択することができる。 K3Lオープンリーディングフレーム、E3Lオープンリーディングフレーム、VAI R NA、EBER RNA、シグマ３オープンリーディングフレーム、TRBPオープンリーディングフレームもしくはそれらと相同性のあるもの、またはそれらの組み合わせであり、本発明の実施に使用することができる。dsRNA濃度に関して「有効」とは、PKRおよび／またはeIF-2αリン酸化を活性化するdsRNAの量をさす（dsRNAはそのための形態をしている）。RNAに基づく因子に関しては、当業者であれば不要な実験をすることなしに、DNAに基づくベクター系に使用する適切なDNAを得ることが可能であり、また、DNAに基づく因子に関しては、当業者であれば不要な実験をすることなしに、RNAに基づくベクター系に使用する適切なRNAを得ることが可能である。「実質的な共発現（substantially co-temporal expression）」または「実質的な同時発現（substantially contemporaneous expression）」とは、翻訳因子をコードしているヌクレオチド配列が、少なくとも１個の目的のヌクレオチド配列とほぼ同じ感染段階において発現することをさす。例えば、ポックスウイルス遺伝子は同時制御されている（クーパー（Couper）ら、Eur．J．Immunol．1986，16:1479-1487，1479ページ）。従って、感染直後は一連の「初期」遺伝子が発現している（同上）。「初期遺伝子」は、感染後、感染の「後期」(DNA複製の開始）に至る前に発現が止まる（すなわち、初期プロモーターが機能停止する）。チミジンキナーゼ（「TK」）遺伝子およびTKプロモーターが「初期」遺伝子およびプロモーターの例である（ハルビー（Hruby）ら、J．Virol.，1982,43(2):403-409，403ページ）。感染約４時間後にTK遺伝子のスイッチが「切れる」。「後期遺伝子」とは、DNAの複製が開始するまで発現しない一連の遺伝子である（クーパー（Couper）ら、同上）。クーパー（Couper）らによって用いられたPL11プロモーターは「後期」プロモーターの例である。従って、クーパー（Couper）らによれば、TK領域内にあるにもかかわらず、PL11プロモーターによって制御されているHA遺伝子の発現はDNA複製後まで行われない。標準的な「初期」遺伝子および「後期」遺伝子とは対照的に、7.5kD遺伝子および7.5kDプロモーターは「初期および後期」遺伝子プロモーターの例である。「転写が制御されている状態とは明らかに異なり」、（ダヴィソン（Davison）およびモス（Moss）、「ワクシニアウイルスの初期プロモーターの構造（Struct ure of Vaccinia Virus Early Promoters）」，J．Mol．Biol.，210-69，249-69 (1989),749）7.5kDプロモーターは「初期および後期転写の両方に対する制御シグナルを有している（クーパー（Couper）ら、同上）。実際、「7.5kD遺伝子のプロモーター領域内には、独立した初期および後期のRNA開始部位」が存在している（コッホラン（Cochran）ら、J．Virol.，59(1):30-37（1985年４月））。クーパー（Couper）らは、「PF（初期）、P7.5（初期および後期）およびPL11 （後期）の各プロモーターによる一時的なHA発現の制御は、これらのプロモーターを転位してワクシニアウイルスのTK遺伝子を遮断することによって持続する」ことを観察している（同上、1482ページ）。すなわち、クーパー（Couper）らは初期のワクシニアプロモーターの制御下にある外来遺伝子の発現は「初期」に起こり、後期のワクシニアプロモーターの制御下にある外来遺伝子の発現は「後期」に起こり、また、初期および後期のワクシニア7.5kDプロモーターの制御下にある外来遺伝子の発現は初期および後期の両方において起こることを観察した（同上1479ページを参照：チミジンキナーゼ（TK）遺伝子内に転位された［ｐ］プロモーター配列は一時的な制御下において引き続き機能を発揮した（引用は省略）。）。従って、翻訳因子をコードしているヌクレオチド配列は、第一の型のプロモーターの制御下におくことが可能であり、少なくとも１個の目的のヌクレオチド配列コードしているヌクレオチド配列は、第二の型のプロモーターの制御下におくことが可能であり、ここで、該第一および第二のプロモーターは両者ともに初期、両者ともに後期（中間を含む）もしくは両者ともに初期および後期とするか、あるいは、第一のプロモーターは初期もしくは後期であり、第二のプロモーターは初期および後期であるか、または第一のプロモーターは初期および後期であり、第二のプロモーターは初期もしくは後期である。目的のヌクレオチド配列および翻訳因子をコードしているヌクレオチド配列は、同じ遺伝子座もしくは異なる遺伝子座に存在することが可能であり、または同一のプロモーターの制御下におくことも可能である。以上のことから本発明は、翻訳および／または発現が増強しているベクターを調製する方法、あるいは、少なくとも１個の目的のヌクレオチドに対して、または、少なくとも１個の翻訳因子に対応する少なくとも１個のヌクレオチド配列が機能発揮できるように結合したプロモーターに対して機能発揮できるように結合しているベクター内における翻訳および／または発現を向上または増強する方法に関する。翻訳因子は、eIF-2αリン酸化を阻害する効果、ならびに／またはPKR のリン酸化および／もしくは細胞性キナーゼ（これはeIF-2αリン酸化および／またはdsRNAの有効濃度を減少させる効果に関与している）を阻害する効果を有していることが好ましい。故にまた、本発明はそのような方法によって得られたベクターに関する。別の態様としては、本発明の方法には、ベクター内において、少なくとも１個の目的のヌクレオチド配列を第一の型のプロモーターに機能発揮できるように連結し、少なくとも１個の翻訳因子をコードしている少なくとも１個の第二のヌクレオチド配列を第二のプロモーターに機能発揮できるように連結することを含み、ここで、該第一および第二のプロモーターは感染の同時期または同段階において機能を発揮し、例えば、両者ともに初期、両者ともに後期（中間を含む）もしくは両者ともに初期および後期とするか、あるいは、第一のプロモーターは初期もしくは後期であり、第二のプロモーターは初期および後期であるか、または第一のプロモーターは初期および後期であり、第二のプロモーターは初期もしくは後期である。もちろん、該第一および第二のプロモーターは２つまたはそれ以上の遺伝子座において同一のプロモーターを用いてもよく、あるいは１つの遺伝子座において同一のプロモーターを用いてもよい。さらに、本発明はそのような方法によって得られたベクターに関する。また、本明細書において使用している「ヌクレオチド配列」とは核酸分子をさしている。従って、ヌクレオチド配列は単離された核酸分子、例えば外来性DNA などを用いることができる。以上のことから、本発明は、少なくとも１個の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは少なくとも１個の目的のエピトープおよび少なくとも１個の翻訳因子をコードしている外来性ヌクレオチド配列を含むように改変されたベクター（ここで、外来性ヌクレオチド配列および因子の実質的に一時的な共発現、または実質的な共発現もしくは実質的に同時に発現が起こる）、ならびにそのようなベクターおよびそれらの生成物を作出し、使用する方法を提供する。本発明のベクターおよび方法によって発現の増強または向上がもたらされる。発現の増強または向上とは、発現のレベルの上昇および／または持続性を意味している。本発明は、挿入されたヌクレオチド配列、例えば外来遺伝子などのレベルおよび持続性を増強および／または向上するための手段として、ワクシニアE3Lおよび／またはK3L（またはそれらと相同なもの、例えば、ワクシニア、ヘルペスウイルス（EBウイルスなど）以外のポックスウイルス、アデノウイルス、プラスミドもしくは裸DNAなどのその他のベクター系など;PKRの活性化を介して翻訳を少なくするように制御するという細胞性の抗ウイルス応答を克服する細胞のメカニズムについては上述の記載を参照）に由来する発現を有するベクター、例えば、ポックスウイルスベクター（例えば、NYVA組換え体C、ALVAC組換え体、TROVAC組換え体など）を提供する。以下の実施例に示すように、E3L/K3L因子を有するALVAC-HIV組換え体であるvC P1452は、ヒト細胞内において、vCP1433またはvCP300よりも発現が増強されている。事実、ヒトおよびイヌの細胞内においては、E3L/K3L翻訳因子による発現増強が観察されている。 E3L/K3Lのような翻訳因子による発現の増強は細胞型に依存していることがある。例えば、ヒトおよびイヌの細胞においてはE3L/K3Lによる発現増強が観察されるが、マウスおよびネコの細胞においては観察されない。本開示および当該分野の知識から、当業者であれば、不要な実験をすることなく、特定の細胞型に対して使用する適切な翻訳因子を選択することができる。例えば、当業者であれば細胞間の差異については自明である。従って、翻訳因子は、発現の増強が観察される細胞内で発現するもの、例えば、細胞に応じて翻訳因子を選ぶことが好ましい。さらに、マウスを用いた免疫原性の予備試験においては、E3L/K3L翻訳因子による免疫原性の増強は認められなかった。このことは、マウス細胞内において発現の増強が観察されなかったことと一致している。従って、本開示および当該分野の知識から、当業者であれば、不要な実験をすることなく、所望する動物の体内において免疫原性を増強すると考えられる適切な翻訳因子を選択することができる。イン・ビトロ（in vitro）条件下で、ある特定の翻訳因子（例えば、ヒトまたはイヌの細胞内のE3L/K3Lなど）によって、ある特定の細胞系内において発現の増強が観察される場合には、当業者であれば、不要な実験をすることなく、その特定の翻訳因子によって、その細胞が由来している動物（ヒトを含む）の体内においてイン・ビボ（in vivo）での免疫原性の増強を期待することができる（例えば、E3L/K3L翻訳因子によるヒトおよびイヌの体内における免疫原性の増強など）。 ALVACまたはNYVACなどの初期不全系においては、初期に外来性DNAおよび翻訳因子を発現することが好ましい。後期不全系（中間系を含む）においては、後期または初期および後期に外来性DNAおよび翻訳因子を発現することが好ましい（初期のみの発現は最適発現の達成には不要である）。本開示および当該分野の知識から、適切な翻訳因子およびその発現時期の選択は当業者に可能である。すなわち、当業者であれば、ベクターの性質に基づいた翻訳因子の発現および因子と共に使用するプロモーターの発現を選択することが可能であり、これは例えば、ベクターの不全表現型に基づくものであり、例えば、MVAは後期不全であるとされており、このベクターを使用することによって翻訳因子由来の発現は後期（中間期を含む）または初期または初期/後期となり、また、ALVACは初期不全であり、このベクターを使用した場合の翻訳因子由来の発現は初期または初期/後期である。ベクターはさらに、ts（温度感受性）突然変異体（初期DNAに対して）および後期不全突然変異も用いることができ、これらも本発明の実施例において使用しており、コンディット（Condit）およびナイルス（Niles）の同上の文献を参照している。従って、翻訳因子および少なくとも１個の目的のヌクレオチド配列は、ベクターの表現型に応じて初期、後期（中間期を含む）または初期/後期に発現することが好ましい。また、好ましくは、ベクターを組み込んでいる細胞型に合わせて実際に翻訳および/または発現を増強するように翻訳因子を選択すべきである。ベクターまたは組換え体を作出する方法は、以下に開示されている方法またはそれらと類似の方法である。米国特許第4,603,112号、第4,769,330号、第5,174, 993号、第5,505,941号、第5,338,683号、第5,494,807号および第4,722,848号、W O 95/30018号；パオレッティ（Paoletti）「ポックスウイルスベクターのワクチン接種への応用：最新情報（Applications of poxvirus vectors to vaccina tion:An update）」、PNAS USA 93:11349-11353、1996年10月；モス（Moss）「組換え遺伝子発現、ワクチン接種および安全性の目的で遺伝子操作されたポックスウイルス（Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expre ssion，vaccination，and safety）」、PNAS USA 93:11341-11348、1996年10月；スミス（Smith）らの米国特許第4,745,051号（組換えバキュロウイルス）；リチャードソン（Richardson），C.D．（編者）『分子生物学における方法 39（M ethods in Molecular Biology 39）』より「バキュロウイルス発現のプロトコール（Baculovirus Expression Protocols）」（1995年、ヒューマナ・プレス（Hu mana Press）社）；スミス（Smith）ら「バキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞内におけるヒトβ−インターフェロンの産生（Production of Hu man Beta Interferon in Incect Cells Infected with Baculovirus Expression Vector）」、分子および細胞生物学（Molecular and Celllar Biology）、1983 年12月、第３巻12号、p.2156-2165;ペノック（Pennock）ら「バキュロウイルス発現ベクターを感染させた昆虫細胞内における大腸菌（Escherichia coli）β− ガラクトシダーゼの強力かつ制御された発現（Strong and Regulated Expressio n of Escherichia coli β-Galactosidase in Infect Cells with a Baculoviru s Vector）」、分子および細胞生物学（Molecular and Cellular Biology）、19 84年４月、第４巻３号、p.399-406；EPA 0 370 573、1986年10月16日出願の米国特許出願第920,197号、EP特許公報第265785号、米国特許第4,769,331号（組換えヘルペスウイルス）；ロイツマン（Roizman）「単純ヘルペスウイルス遺伝子の機能：新規なベクターの遺伝子工学のためのプライマー（The function of he rpes simprex virus genes:A promaer for genetic engineering of novel vect ors）」、PNAS USA 93:11313-11318、1996年10月；ロバートソン（Robertson）ら「Ｂリンパ球へ遺伝子を輸送するためのEBウイルスベクター（Epstein-Barr v irus vectors for gene delivery to B lymphocytes）」、PNAS USA 93:11334-1 1340、1996年10月；フロロヴ（Frolov）ら「アルファウイルスに基づく発現ベクター：戦略および応用（Alphavirus-based expression vectors:Strategies and applications）」、PNAS USA 93:11371-11377、1996年10月；キトソン（Kitson ）ら、J．Viol．65，3068-3075，1991；米国特許第5,591,439号、5,5 52,143号；グルンハウス（Grunhaus）ら、1992年「クローニングベクターとしてのアデノウイルス（Adenovirus as cloning vectors）」ウイルス学セミナー第３巻（Seminars in Virology）、p.237-52、1993年；バライ（Ballay）ら、EMBO Journal，vol.4，p.3861-651；グラハム（Graham）、Tibtech 8，85-87，1990 年４月；プレヴェック（Prevec）ら、J．Gen．Virol．70，429-434；PCT WO91/ 11525号；フェルグナー（Felgner）ら（1994年），J．Biol．Chem．269，2550-2 561，Science，259:1745-49;およびマククレメンツ（McClements）ら「糖タンパク質Ｄまたは糖タンパク質ＢをコードしているDNAワクチン単独または組み合わせて用いた免疫が単純ヘルペス２型疾患の動物モデルにおいて防御免疫を誘導する（Immunization tiwh DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprote in B，alone or in combination，induces protective immunity in animal mod els of herpes simplex virus-2 disease）」、PNAS USA 93:11414-11420、1996 年10月；ならびに米国特許第5,591,639号、5,589,466号および5,580,859号（中でもDNA発現ベクターに関する）。アデノウイルスベクターを含むベクターに関する米国特許出願08/675,566号および08/675,556号も参照のこと。本発明のベクター内に挿入されたヌクレオチド配列、例えば外来遺伝子、異型もしくは外因性のヌクレオチド配列（例えば、DNAなど）に関しては、目的のエピトープ、生物学的応答の調製物質、成長因子、認識配列、治療遺伝子または融合タンパク質を含む発現産物をコードしていることが好ましい。これらの事項については、以下の考察、ならびに一般的なものとしてはケンドリュー（Kendrew ）「分子生物学辞典（THE ENCYCLOPEDIS OF MOLECULAR BIOLOGY）」（ブラックウェル・サイエンス（Blackwell Science）社、1995年）およびサンブルック（S ambrook）、フリッシュ（Fritsch）およびマニアティス（Maniatis）「分子クローニング実験室マニュアル（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）第２版」（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、1982年）を参照のこと。目的のエピトープは、抗原もしくは免疫原の中の免疫学的に意味のある領域、またはそれらの免疫学的に活性な断片（例えば、獣医学またはヒトについての病原体または毒素に由来する）である。目的のエピトープは、病原体もしくは毒素、または病原体に対して応答を誘起するその他の病原体もしくは毒素から調製することができる。これらの病原体または毒素としては、モルビリウイルス（Morbillivirus）抗原（例えば、イヌジステンパーウイルスまたは麻疹または牛疫抗原（HAまたはＦなど））、狂犬病糖タンパク質（狂犬病糖タンパク質Ｇなど）、トリインフルエンザ抗原（例えば、七面鳥インフルエンザHA、ニワトリ／ペンシルバニア／１／83インフルエンザ抗原（ヌデオプロテイン（NP）など）など）、ウシ白血病ウイルス抗原（例えば、 gp51，30エンベロープなど）、ニューカッスル病ウイルス（NDV）抗原（例えば、HNまたはＦなど）、ネコ白血病ウイルス抗原（FeLV）（例えば、FeLVエンベロープタンパク質など）、RAV-１エンベロープ、感染性気管支炎ウイルスのマトリックスおよび／またはプレプロマー、ヘルペスウイルスの糖タンパク質（例えば、ネコヘルペスウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、偽狂犬病ウイルス、イヌヘルペスウイルス、HSV、マレック病（Marek's Disease）ウイルスまたはサイトメガロウイルス由来の糖タンパク質など）、フラビウイルス抗原（例えば、日本脳炎ウイルス（JEV）抗原、黄熱病抗原またはデングウイルス抗原など）、マラリヤ（プラスモジウム（Plasmodium））抗原、免疫不全ウイルス抗原（例えば、ネコ免疫不全ウイルス（FIV）抗原、サル免疫不全ウイルス（SIV）抗原、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原など）、パルボウイルス抗原（例えば、イヌパルボウイルスなど）、ウマインフルエンザ抗原、ポックスウイルス抗原（例えば、エクトロメリア抗原、カナリアポックスウイルス抗原または鶏痘ウイルス抗原など）、感染性粘液嚢疾患ウイルス抗原（例えば、VP2、VP3、VP 4など）などが挙げられる。目的のエピトープは、ヒトの病原体もしくは毒素、または病原体に対して応答を誘起するその他の病原体もしくは毒素から調製することができる。これらの病原体または毒素としては、モルビリウイルス（Morbillivirus）抗原（例えば、麻疹ウイルス抗原（HAまたはFなど）など）、狂犬病糖タンパク質（例えば、狂犬病タンパク質Ｇなど）、インフルエンザ抗原（例えば、インフルエンザウイルスHAまたはNなど）、ヘルペスウイルス抗原（例えば、単純ヘルペスウイルス（H SV）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、EBウイルスの糖タンパク質など）、フラビウイルス抗原、JEV、黄熱病ウイルスまたはデング病ウイルス抗原、肝炎ウイルス抗原（例えば、HBsAgなど）、免疫不全ウイルス抗原（gp120、gp160などのHIV抗原など）、ハンタンウイルス（Hantaan）抗原、破傷風菌(Clostoridiu m tetani）抗原、おたふくかぜウイルス、肺炎球菌抗原（例えば、PspAなど）、ボレリア（Borrelia）抗原（例えば、OspA、OspB、OspCなど：ボレリア（Borrel ia）はライム（Lyme）病の発症に関与しており、ボレリア・ブルグドフェリ（Bo rrelia burgdorferi）、ボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelli）およびボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）などが存在する）、水痘（バリセラ・ゾスター（varicella zoster））抗原またはプラスモジウム（Plasmodium））抗原などが挙げられる。もちろん、上述のリストは例示であり、目的のエピトープは任意の動物またはヒトの病原体の任意の抗原から得ることができ、目的のエピトープを得るためには、任意の動物またはヒトの病原体の任意の抗原を発現することができる（本発明は、少なくとも１個の抗原をコードしている外因性または外来性のヌクレオチド配列を意図している）。異型DNAが成長因子または治療遺伝子である場合には、本発明の組換え体を遺伝子治療に用いることができる。遺伝子治療には遺伝情報の移転を含んでおり、遺伝子治療および免疫治療については、米国特許第5,252,479号（この特許に引用されている文献と共に参考として本明細書に取り入れておく）、およびWO 94 /16716号および1994年１月19日に出願された米国特許出願08/184,009号（この出願に引用されている文献と共に参考として本明細書に取り入れておく）を参照のこと。成長因子または治療遺伝子は、例えば、疾患抵抗性タンパク質、癌治療のための分子、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、腫瘍関連抗原またはインターフェロンなどをコードすることができる。さらに、成長因子または治療遺伝子は、例えば、α−グロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、マスト細胞成長因子、腫瘍サプレッサーp53、網膜芽腫、インターフェロン、メラノーマ関連抗原またはB7をコードしている遺伝子を含む群から選択することができる。更に本発明は、新規なベクターならびに許容される基剤もしくは希釈剤（例えば、獣医学的に許容されるまたは薬剤学的に許容されるものなど）を含有する免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物に関する。ベクター（またはそれらの発現産物）を含有する免疫学的組成物は、局所または全身性の免疫学的応答を誘発する。応答は防御的であることが望ましいが、必須ではない。本発明の組換え体（またはそれらの発現産物）を含有する免疫原性組成物は、同様に局所または全身性の免疫学的応答を誘発し、ここでこの応答は防御的であることが望ましいが、必須ではない。ワクチン組成物は局所または全身性の免疫学的応答を誘発する。従って、「免疫学的組成物」および「免疫原性組成物」という語には「ワクチン組成物」を含んでいる（前二者は防御的組成物を意味するものとして用いられる）。故に、本発明は、脊椎動物宿主における免疫学的応答の誘導方法をも提供し、この方法は、本発明の組換えウイルスもしくはベクターならびに許容される基剤もしくは希釈剤を含有する免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物を宿主に投与することを含む。本明細書においては、「動物」にはヒトを除く全ての脊椎動物種が含まれ、「脊椎動物」には動物（本明細書中で使用している意味での「動物」）を含む全ての脊椎動物種およびヒトを含んでいる。更にもちろん、「動物」のうちの一部が「哺乳類」であり、本明細書においてはヒトを除く全ての哺乳類を含む。ヒトへの投与においては、本発明の組換え体またはベクターは生産的複製をすることなく発現を行うことができるという利点を有する。このことは従って、免疫が低下している患者に対して本発明の組換え体を使用する可能性を提供し、また、本発明の組換え体と接触する作業者に対する安全性のレベルを提供する。故に、本発明は組換えウイルスまたはベクターを宿主に投与または接種することによってタンパク質を増幅または発現するための方法を含んでおり、ここで、宿主は組換えウイルスまたはベクターの本来の宿主ではなく、生産的複製を伴わない発現をする。外因性DNAまたは異型DNA（またはワクチンウイルスに対して外来性のDNA）としては、上掲しているような上述のエピトープのいずれかをコードしているDNA を用いることができる。この点に関して、ボレリア（Borrelia）DNAについては、米国特許第5,523,089号、WO 93/08306号、PCT/US92/08697号、分子微生物学（Molecular Microbiology）（1989），3(4)，479-486、およびPCT公開公報WO 93/04175号およびWO 96/06165号を参考とし、参照として本明細書中に取り入れておく。肺炎球菌エピトープに関しては、ブリレス（Briles）らのWO 92/14488号を参考とし、参照として本明細書中に取り入れておき、腫瘍ウイルスに関しては、『腫瘍ウイルスの分子生物学、RNA腫瘍ウイルス（Molecular Biology of Tumor Vi ruses，RNA TUMOR VIRUSES）』（第２版、ウェイス（Weiss）ら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、1982年）（例えば、44ページ以降−レトロウイルスの分類学（Taxo nomy of Retroviruses）など）を参考とし、参照として本明細書中に取り入れておく。目的のエピトープをコードしているDNAに関しては、例えば、これまでに引用している文献および以下に引用している文献などの本明細書に引用している文献を参照のこと。そのような文献としては例えば、米国特許第5,174,993号および5 ,505,941号（例えば、組換えアビポックスウイルス（avipoxvirus）、ワクシニアウイルス；狂犬病糖タンパク質（Ｇ）遺伝子、七面鳥インフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、gp51、gp30、牛白血病ウイルスのエンベロープ遺伝子、ニューカッスル病ウイルス（NDV）抗原、FeIVエンベロープ遺伝子、RAV-1エンベロープ遺伝子、NP（ニワトリ／ペンシルバニア／１／83インフルエンザウイルスのヌデオタンパク質遺伝子）、感染性気管支炎ウイルスのマトリックスおよびプレプロマー；HSV gDなど）米国特許第5,338,683号（例えば、組換えワクシニアウイルス、アビポックスウイルス（avipoxvirus）；特にヘルペスウイルスの糖タンパク質をコードしているDNAなど）、米国特許第5,494,807号（例えば、組換えワクシニア、アビポックス（avipox）；特に、狂犬病、Ｂ型肝炎、JEV、YF、デング、麻疹、偽狂犬病、エプスタイン−バー（Epstein-Barr）、HSV、HIV、SIV、EHV、BH V、HCMV、イヌパルボウイルスウマインフルエンザ、FeLV、FHV、ハンタン（Hant aan）、破傷風菌（Clostoridium tetani）、トリインフルエンザ、おたふくかぜ、 NDV由来の抗原をコードしている外因性DNAなど）、米国特許第5,503,834号（例えば、組換えワクシニア、アビポックス（avipox）、モルビリウイルス（Morbil livirus）（例えば、特に麻疹Ｆ、赤血球凝集素など））、米国特許第4,722,848 号（例えば、組換えワクシニアウイルス；特に、HSV tk、HSV糖タンパク質（例えば、gB、gDなど）、インフルエンザHA、Ｂ型肝炎（例えばHBsAgなど）など）、英国特許GB 2 269 820 Bおよび米国特許第5,514,375号（例えば、組換えポックスウイルス；フラビウイルス構造タンパク質）、WO 92/22641号ならびに米国特許出願08/417,210号および08/372,664号（例えば、組換えポックスウイルス：特に免疫不全ウイルス、HTLVなど）、WO 93/03145号ならびに米国特許出願 08/204,729号および08/303,124号（例えば、組換えポックスウイルス；特にIBDV など）、WO 94/16716号および1994年１月19日に出願した米国特許出願08/184,0 09号（例えば、組換えポックスウイルス；特にサイトカインおよび／または腫瘍関連抗原など）、米国特許出願08/469,969号（狂犬病組換え組成物）、米国特許出願08/746,668号（レンチウイルス、レトロウイルスおよび／または特にネコ免疫不全ウイルスを含む免疫不全ウイルス）、米国特許番号第5,529,780号および米国特許出願08/413,118号（イヌヘルペスウイルス）、米国特許出願08/471,025 号（カリシウイルス）、WO 96/3941および米国特許出願08/658,665号（サイトメガロウイルス）、ならびにPCT/US94/06652（プラスモジウム（Plasmodium）の生活環の各段階に由来するようなプラスモジウム（Plasmodium）抗原）が挙げられる。ワクチンまたは免疫学的組成物として用いられる抗原については本明細書に引用されている文献（例えば、上掲の文献など）を参考とし、更にステッドマン医学辞典（Stedman's Medical Dictionary）（第24版、1982年）を参照のこと。例えば、ワクチンの決定については、ワクチン製剤に使用される抗原の一覧表などがあり、そのような抗原またはこれらの抗原由来の目的のエピトープは、新規な組換えウイルスまたはベクターのいずれの発現産物も本発明に使用することができ、また、新規な組換えウイルスもしくはベクターまたはそれらの発現産物を含有する多価組成物中に使用することができる。目的のエピトープに関しては、アミノ酸ならびにペプチドまたはポリペプチドの対応するDNA、さらに特定のアミノ酸の性質（例えば、大きさ、電荷など）およびコドン辞書から、当業者であれば、ペプチドまたはポリペプチド内のエピトープまたは免疫に関与する領域、また逆にそれらがコードしているDNAを不要な実験をすることなく決定することができる。タンパク質のどの部分を免疫学的組成に使用するかを決定する一般的な方法は、目的の抗原の大きさおよび配列に注目することである。「一般的には、大きなタンパク質は（強力な決定因子をより多く有していることから）、小さいものよりも抗原としてふさわしい。抗原が外来性（すなわち、寛容性を誘発する自己構造との類似性が小さい）であればあるほど、免疫応答の遊起には有効である。」（イヴァン・ロイット（Ivan Roitt）『基礎免疫学（Essential Immunology）』、1998年）大きさについては、当業者であれば、ウイルスベクターに挿入すべきDNAによってコードされているタンパク質の大きさを（ベクターの挿入限度を考慮しながら）最大にすることができる。発現されるタンパク質の大きさを最大にしながら挿入されるDNAを最小限にするために、DNA配列からイントロン（これは、転写されるが、一次RNA転写に続いて切除される領域である）を排除することができる。最小の場合には、DNA配列はアミノ酸長が少なくとも８〜９このペプチドをコードすることができる。これは、CD8+ Ｔ細胞応答（これは、ウイルスに感染した細胞または癌様細胞を認識する）を刺激するために必要なペプチドの最短長である。ペプチドの最短長がアミノ酸数13〜25個のペプチドは、DC4+ Ｔ細胞応答（これは、病原体に取り込まれている特定抗原呈示細胞を認識する）の刺激に有用である。ケンドリュー（Kendrew）らの上述の文献を参照のこと。しかしながら、これらは最短長であっても、これらのペプチドは免疫学的応答、すなわち抗体応答またはＴ細胞応答を起こすと考えられる。しかし、ワクチン組成物からのような防御応答についてはより長いペプチドが好ましい。配列に関しては、抗体応答またはＴ細胞応答を起こすペプチド領域をDNA配列が少なくともコードしていることが好ましい。Ｔ細胞およびＢ細胞のエピトープを決定する方法のひとつとしてエピトープマッピングがある。目的のタンパク質を「タンパク質分解酵素を用いてオーバーラップペプチドに切断する。次に、個々のペプチドについて、元のタンパク質から誘発された抗体への結合能、またはＴ細胞もしくはＢ細胞活性化の誘導能について調べる。Ｔ細胞はMHC分子とコンプレックスを形成する短い直鎖ペプチドを認識することから、この方法はＴ細胞エピトープのマッピングに特に有用である。Ｂ細胞エピトープは直鎖アミノ酸配列であることは少なく、むしろ三次元のタンパク質が折り畳まれた４次構造をとっていることから、この方法はＢ細胞エピトープの決定にはあまり有効ではない。」ジャニス・クビー（Janis Kuby）、Immunology（1992）pp.79-80．目的のエピトープを決定するための別の方法は、親水性のタンパク質の領域を選択することである。親水性残基はタンパク質の表面に存在していることが多く、故に抗体に受け入れられやすいタンパク質の領域である。ジャニス・クビー（ Janis Kuby）、Immunology（1992）p.81．目的のエピトープを決定するためのさらに別の方法は、抗原（全長）−抗体コンプレックスのＸ線結晶解析を行うことである。ジャニス・クビー（Janis Kuby ）、Immunology（1992）p.80．Ｔ細胞応答を誘起することができる目的のエピトープを決定するためのまたさらに別の方法は、MHC分子に結合する傾向を有することが知られているペプチド配列であるHLAアンカー結合モチーフである可能性があるタンパク質配列から確認することである。Ｔ細胞応答を誘起し、目的のエピトープであると推定されるペプチドはMHCコンプレックス内に存在するはずである。好ましくは、ペプチドはMHC分子に結合するための適切なアンカーモチーフを有しており、十分な親和性を持って結合し、免疫応答を誘起するはずである。考慮すべき因子としては、免疫性を与えることが予測される患者（脊椎動物、動物またはヒト）のHLA型、タンパク質の配列、適切なアンカーモチーフの存在ならびに他の生細胞中でのペプチド配列の存在が挙げられる。一般的には、免疫応答は次のように起こる。タンパク質が小さいペプチドに解裂され、他の細胞の表面に存在している「主要組織適合遺伝子複合体 MHC」と呼ばれるコンプレックス内に存在している場合にのみＴ細胞はタンパク質を認識する。MHCコンプレックスには２つのクラス−クラスＩおよびクラスIIがあり、各クラスは多くの異なる対立遺伝子から構成されている。異なる患者は異なる型のMHCコンプレックス対立遺伝子を有し、このことは「異なるHLA型」を有すると称される。 MHCコンプレックスクラスＩはほぼ全ての細胞において見出され、細胞内で産生されたタンパク質由来のペプチドを提供する。従って、MHCコンプレックスクラスＩは、ウイルスに感染した場合、もしくは癌化した場合、ならびに癌遺伝子の発現の結果、細胞を殺すのに有用である。細胞表面にCD8と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞は、Ｔ細胞レセプターを介してMHCコンプレックスクラスＩ／ペプチドコンプレックスに特異的に結合する。このことにより、細胞溶解エフェクター活性がもたらされる。 MHCコンプレックスクラスIIは抗原呈示細胞のみにおいて見出され、抗原呈示細胞によってエンドサイトースされた循環病原体由来のペプチドを提供するのに用いられる。CD4と呼ばれるタンパク質を有するＴ細胞は、Ｔ細胞レセプターを介してMHCコンプレックスクラスII／ペプチドコンプレックスに結合する。このことにより、免疫応答を刺激する特定のサイトカインの合成が行われる。あるタンパク質がＴ細胞応答を刺激するエピトープとなり得るか否かを決定するいくつかの指標があり、それには例えば、ペプチドの長さなどが含まれ、MHC コンプレックスクラスＩに適合するためにはペプチドの長さは少なくともアミノ酸数が８〜９個でなければならず、また、MHCコンプレックスクラスIIに適合するためにはペプチドの長さは少なくともアミノ酸数が13〜15個でなければならない。この長さはペプチドがMHCコンプレックスに結合するための最短長である。細胞は発現されたペプチドを切断することがあるため、ペプチドはこれらより長い方が好ましい。ペプチドは適切なアンカーモチーフを有し、このアンカーモチーフは、免疫応答を誘起するために十分な高い特異性を持って様々なクラスＩおよびクラスII分子とペプチドが結合することができるようにする（ボキア，M．（Bocchia）ら、「白血病癌遺伝子融合タンパク質ペプチドのHLAクラスＩ分子への特異的結合（Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pepti de to HLA class I Molecu1es）」、Blood 85:2680-2684；イングルハード（Eng lehard），VH、「MHC分子クラスＩおよびクラスIIに関連するペプチドの構造（Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecul es）」、Ann．Rev．Immunol．12:181(1984)）。これは、MHC分子に関連するペプチドについての公表されている構造と目的のタンパク質の配列とを比較することにより、不要な実験をすることなく、行うことが可能である。Ｔ細胞レセプターによって認識されるタンパク質エピトープは、タンパク質分子の酵素分解によって生じたペプチドであり、MHC分子のクラスＩまたはクラスIIに関連する細胞表面に存在している。更に、当業者であれば、タンパク質データベースに掲載されている配列とタンパク質配列とを比較することにより、目的のエピトープを確認することができる。更にまた、別の方法としては、単純に目的のタンパク質の一部分を誘起または発現し、目的のタンパク質のこれらの部分に対するモノクローナル抗体を誘起し、これらの抗体について、イン・ビトロ（in vitro）において、そのタンパク質の起源となっている病原体の成長を阻害するか否かを確認する。当業者であれば、本明細書に記載している他の指針、およびイン・ビトロ（in vitro）において抗体が成長を阻害するか否かについて分析するための目的のタンパク質の一部を誘起または発現するための当該分野の指針を利用することができる。例えば、当業者であれば、アミノ酸数が８〜９個または13〜15個の長さのタンパク質の一部を選択することにより、抗原（全長）−抗体コンプレックスのＸ線データから結合を示した部分を選択することにより、配列が他のタンパク質とは異なる領域を選択することにより、HLAアンカーモチーフとなり得る部分を選択することにより、またはこれらの方法もしくは当該分野において既知の他の方法の任意の組み合わせによって目的のタンパク質の一部分を誘起することができる。抗体によって認識されるエピトープはタンパク質の表面に発現される。抗体応答を刺激する可能性が高いタンパク質領域を明らかにするためには、上述の一般的方法または当該分野において既知のたのマッピング法を用いることにより、エピトープマッピングを行うことが好ましい。上記からわかるように、本開示および当該分野の知識から、当業者であれば、不要な実験をすることなく、Ｔ細胞、Ｂ細胞および／または抗体を得るための目的のエピトープのアミノ酸配列および対応するDNA配列を確認することができる。更に、1991年５月28日に登録されたジェフター（Gefter）らによる米国特許第5, 019,384号およびその特許に引用されている文献を本明細書中に参考として取り入れておく（特に、該特許の「関連文献」および該特許の13欄、すなわち、「広範な微生物に対する多数のエピトープが明らかになっている。特に注目されるのは、中和抗体を対象とするものである。そのようなエピトープについての開示は関連文献の項に引用されている多くの参考文献中に見出される。」という記載を参照）。例えば、生物学的応答の調節物質は生物学的活性を調節する。例えば、生物学的応答の調節物質は、非NMDA刺激性のアミノ酸レセプターに関連のある高分子量のタンパク質などの調節性の構成要素であり、これは、AMPA結合の親和性をアロステリックに制御する（ケンドリュー（Kendrew）、同上参照）。本発明の組換え体はそのような高分子量のタンパク質を発現することができる。より一般的には、自然界は生物学的応答の調節物質についての多数の先例を提供している。活性の調節は、在／不在（例えば、発現／分解など）系に至るアロステリックに誘導された四段階変化と同程度の複雑かつ入り組んだメカニズムを介して行われると考えられる。実際、多くの生物学的分子の発現の抑制／活性化は、様々なメカニズムを介してその活性を調節することができるような分子によって自己仲介されている。ニードハート（Neidhardt）ら、『バクテリア細胞の生理学（Physiology of B acterial Cell）』（シナウアー・アソシエーツ（Sinauer Associates）社、199 0年）、73ページの表２にバクテリアタンパク質の化学的変性が挙げられている。この表に示しているように、いくつかの変性は適切な構成を含んでおり、他の変性はそうではないが、いずれの場合においても、そのような変性は機能の調節をすることができる。この表から、不要な実験をすることなく、他の細胞のタンパク質に対する類似の化学調節を判断することができる。いくつかの例においては、生物学的活性の調節は、ある分子が単に適切／不適切ぶ局在することによって仲介されていると考えられる。分子が特定の位置に存在している場合にのみ分子が作用して成長促進または抑制をすると考えられる。例えば、ある細胞の機能が細胞から分泌された分解酵素によって最初に分解された場合には、一般的には、その分子は細胞に取り込まれまたは利用されることはない。従って、組換え体による酵素の産生によって、細胞による分子の利用または取り込みを制御することができる。同様に、組換え体は、分子の取り込みまたは利用に必要な酵素に結合する分子を発現することができ、それによって取り込みまたは利用を同じように制御する。タンパク質の局在位置を定めるためには、別の型の調節または制御を行うシグナルペプチドの解裂を行う。この場合には、組換え体を用いて特異的エンドヌクレアーゼ触媒活性を発現することができる。機能の調節が起こるメカニズムのその他の例としては、RNAウイルスポリタンパク質、アロステリック効果、ならびに一般的な共有結合および非共有結合立体障害がある。HIVはよく研究されているRNAウイルスの一例であり、これは、非機能性のポリタンパク質構築体を発現する。HIVにおいては、「gag、polおよびenv ポリタンパク質を分解して、ウイルス構造タンパク質であるp17、p24およびp15 （逆転写酵素およびインテグラーゼ）ならびに２個のエンベロープタンパク質gp 41およびgp120がそれぞれ得られる」（コール（Kohl）ら、PNAS USA 85:4686-90 (1988)）。ポリタンパク質を適切に解裂することはウイルスの複製にきわめて重要であり、不活性な突然変異型HIVプロテアーゼを有するビリオンは非感染性である（同上）。これは、活性が低くなるように調節するタンパク質の融合のもうひとっの例である。従って、解裂の干渉または促進によって、あるタンパク質の本来の発現を阻害または増強する目的で、エンドプロテアーゼに干渉する、またはエンドプロテアーゼを産生する分子を発現する組換えウイルスを構築することが可能である。酵素の機能的な有用性は、それらが反応を触媒する能力を変化させることによっても調節することができる。調節された分子の例としては、チモーゲン（酵素前駆体）、マルチサブユニット機能性コンプレックスの形成／分離、RNAウイルスポリタンパク質鎖、アロステリック相互作用、一般的な立体障害（共有および非共有）および様々な化学調節（例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニル化およびウリデニル化など）が挙げられる（ニードハート（Neidhardt）ら（上述）、315ページの表１および73ページの表２を参照のこと）。チモーゲンは、天然に存在する酵素活性の調節をするタンパク質融合体の例である。チモーゲンは、限定的タンパク質分解によって活性状態に転換する一群のタンパク質である。ライヒ（Reich）ら、『プロテアーゼおよび生物学的制御第２巻（Proteases and Biological Control）』、54ページの表３を参照のこと。自然界は、酵素と共に追加としてそのアミノ末端に「リーダー」ペプチド配列を発現することによって、ある種の酵素（例えば、トリプシンなど）の活性が低くなるように調節するメカニズムを発達させてきた。追加のペプチド配列を有することにより、酵素は不活性なチモーゲン状態にある。この配列を解裂することによって、チモーゲンは酵素的に活性な状態に転換する。チモーゲンの全体的な反応速度は「対応する酵素の約10⁵〜10⁶分の１である」（ライヒ（Reich）ら（上述）、54ページの表３参照）。故に、酵素の末端に単にペプチド配列を付加することによって、ある酵素の機能が低くなるように調節することが可能である。例えば、適切な知識をもってすれば、ある組換え体は、一方の端または両端に追加のアミノ酸を有するペプチド配列を発現することができる。マルチサブユニット酵素の形成または分離は、制御を起こすもうひとつの方法である。マルチサブユニット酵素の形成または分離においては、活性の調節に対して異なるメカニズムが関与していると考えられる。故に、適切な特異的サブユニットの相互作用に対する立体障害は、触媒活性を低くなるように調節する。従って更に、本発明の組換え体は、生物学的機能を調節するための天然に存在する酵素または酵素コンプレックスに立体障害を与える分子を発現することができる。ある種の酵素阻害剤は、共有結合立体障害または変性を介した機能を低く調節するものの好例である。活性部位内の触媒的に重要なアミノ酸において、酵素の活性部位に不可逆的に結合する自殺基質は、酵素の活性部位を立体的に阻止する共有結合変性の例である。自殺基質の例としては、キモトリプシンのTPCKが挙げられる（フリッシュ（Fritsh）、『酵素の構造およびメカニズム（Enzyme Struc ture and Mechanism）第２版』（フリーマン（Freeman）社、（1984年））。この型の調節は、組換え体によって適切な自殺基質を発現し、それによって生物学的応答を調節すること（例えば、酵素活性を制限するなど）によって可能である。非共有結合立体障害の例としては、多くのリプレッサー分子が挙げられる。組換え体はリプレッサー分子を発現することができ、この分子は、立体障害を起こすことができ、従って、特定のDNA−RNAポリメラーゼの相互作用を抑制することによってDNA配列の機能が低下するように調節する。アロステリック効果は、ある種の生体系において調節を行うもうひとつの方法である。アスパラギン酸トランスカルバミラーゼは、よく特性が明らかになっているアロステリック酵素である。基質サブユニットと相互作用するのは制御ドメインである。CTPまたはUTPと結合することによって、制御サブユニットは、触媒活性が低くなるように調節を行うホロ酵素の四次構造の変化を促すことができる。対照的に、制御サブユニットがATPに結合することによって、触媒活性を高くするように調節をすることができる（フリッシュ（Fritsh）、同上）。本発明の方法を用いることにより、結合でき、四次構造または三次構造の変化を調節することができる分子を発現させることができる。更に、機能を調節するために、様々な化学的変性、例えば、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニル化およびウリデニル化などを行うことができる。このような変性は、多くの重要な細胞成分の制御において重要な役割を果たしていることが知られている。ニードハート（Neidhardt）ら（上述）の73ページの表２には、そのような変性を行う種々のバクテリア性酵素が掲載されている。当業者であれば、その表から、不要な実験をすることなく、同一または類似の変性を行う他の系の他の酵素を確認することができる。加えて、ヒトの疾患に関与する多くのタンパク質もそのような化学的変性を行う。例えば、多くの癌遺伝子はリン酸化によって変性され、または、リン酸化もしくは脱リン酸化を介して他のタンパク質を変性することが知られている。故に、本発明によってもたらされた調節物質（これは、例えばリン酸化などのように、機能を変性または変化させることができるもの）を発現する能力が重要である。上記から、当業者であれば、不要な実験をすることなく、本発明を利用して生物学的反応の調節物質を発現させることができる。本発明の組換え体による融合タンパク質の発現に関しては、サンブルック(Sa mbrook）、フリッシュ（Fritsh）、マニアティス（Maniatis）、『分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A LABORATORY MANUAL）第２版』（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harb or Laboratory Press）社、1989年）（特に第３巻）、およびケンドリュー（Ken drew）（同上）を参照し、参考として本明細書に取り入れておく。サンブルック（Sambrook）らの教示によれば、当業者であれば不要な実験をすることなく、本開示から適切な変性ができ、融合タンパク質を発現する組換え体またはベクターを作出することができる。遺伝子治療および免疫治療に関しては、米国特許第4,690,915号および5,252,4 79号を参照し、その中に引用されている文献と共に参考として本明細書中に取り入れ、また、WO 94/16716および1994年１月19日出願の来国特許出願08/184,009 号を参照し、その中に引用されている文献と共に参考として本明細書中に取り入れておく。成長因子は、個体発生ならびに組織および機能の維持の両方を制御する局所作用性細胞内シグナリングペプチドと定義付けすることができる（ケンドリュー（ Kendrew）（同上）、特に455ページを参照）。成長因子または治療遺伝子は、例えば、抗疾患性タンパク質、癌を治療する分子、腫瘍サプレッサー、サイトカイン、腫瘍関連抗原またはインターフェロンをコードすることができる。また、成長因子または治療遺伝子は、例えば、α−グロビン、β−グロビン、γ−グロビン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、インターロイキン（例えば、インターロイキン１〜14もしくは１〜11、またはそれらの任意の組み合わせなど）、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、マスト細胞成長因子、腫瘍サプレッサーp53、網膜芽腫、インターフェロン、メラノーマ関連抗原もしくはB 7をコードしている遺伝子を含む群から選択することができる。米国特許第5,252 ,479号は、遺伝子治療に用いられ、アデノウイルス系において発現することができるタンパク質の一覧を示しており、当業者であればこの開示に従って実施することができる。WO 94/16716および1994年１月19日出願の米国特許出願08/184,0 09号は、サイトカインおよび腫瘍関連抗原の遺伝子、ならびにエクス・ビボ（ex vivo）法を含む免疫治療法を提供しており、当業者であればこの開示に従って実施することができる。従って、当業者であれば不要な実験をすることなく、本開示および当該分野の知識から、成長因子もしくは治療遺伝子を発現するベクターを作出し、ならびに組換え体もしくはベクターを使用することができる。更に、以上の記載および当該分野における知識から、当業者であれば不要な実験を要せずに、目的のエピトープ、生物学的応答の調節物質、成長因子、認識配列、治療遺伝子または融合タンパク質を発現する新規な組換え体またはベクターを構築することができ、またはそのような組換え体またはベクターを使用することができる。本発明の組換え体またはベクターは、イン・ビトロ（in vitro）における遺伝子産物の発現に用いることができ、タンパク質精製のための技術を本発明の実施に利用することができる。そのような技術としては一般的に以下のようなものがある。概略すると、細胞を破壊し、目的のタンパク質を水性「抽出液」中に放出させる。細胞破壊には、比較的穏やかな条件から過激な条件までの幅広い多くの方法があり、原材料に応じてよりよい方法を選択する。動物の組織は、非常に崩壊しやすい赤血球から強固な膠原質性の材料（血管などにみられるような平滑筋を含む組織など）まで様々である。バクテリアは、消化酵素または浸透圧ショックによって破壊することができる非常に脆いものから、崩壊には過激な機械的処理を要する厚い細胞壁を有するより抵抗性のものまで様々である。緩和な方法としては、細胞溶解、酵素消化、化学的溶解、手動ホモジェナイズおよび細断（または破砕）などが挙げられる。細胞破壊の中程度の方法としては、刃を用いたホモジェナイズ、研磨剤（すなわち、砂またはアルミナ）を用いた破砕などが挙げられ、過激な方法としては、フレンチプレス、超音波、ビーズミルまたはマントン−ガウリン（Manton-Gaulin）ホモジェナイズなどが挙げられる。上記の各方法は当該分野において既知であり、出発原料、ならびに本明細書および当該分野の教示に基づいて適切な細胞破壊の方法を決定することは当業者の知識の範ちゅうである。細胞破壊に続いて、遠心分離によって不溶材料を除去することによって抽出物を調製する。この段階において、精製法を行って目的のタンパク質を可能な限り多量に含む抽出物を調製するが、適切に行われた場合には、粒子性および大部分の非タンパク質材料は除去される。タンパク質精製の標準的な技術を用いて目的のタンパク質を更に精製するが、その方法としては、種々の塩濃度における目的のタンパク質の溶解性を利用した沈澱、有機溶媒、ポリマーおよびその他の材料を用いた沈澱、親和沈澱および選択的変性、カラムクロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーまたは染料リガンドクロマトグラフィーなどを含む）、免疫沈降およびゲル透過法、電気泳動法、限外ろ過、ならびに等電点電気泳動などが挙げられる。上述の各方法は当業者において既知であり、不要な実験をすることなく、本明細書および文献中に概説している標準的な方法および以下の実施例における教示を用いて、本発明の組換え体またはベクターの発現産物から目的のタンパク質またはエピトープを精製することができる。発現産物は抗原性応答、免疫学的応答または防御（ワクチン）応答を示し、従って本発明は更に、それらからの産物、すなわち、抗体およびその利用にも関する。更に特定すると、これらの発現産物、または発現を行う組換え体またはベクターを投与することによって、発現産物は抗体を誘起することができる。抗体としてはモノクローナル抗体を用いることができ、該抗体または発現産物は、キット、アッセイ、試験およびその他結合を伴うものに利用することができることから、本発明はこれらの利用にも関する。加えて、本発明の組換え体またはベクターを用いてDNAを複製することができることから、本発明は、新規な組換え体もしくはベクター、ならびに組換え体およびそこから採取したDNAを用いて感染もしくはトランスフェクトした細胞によってDNAを複製する方法に関する。得られたDNAは増幅用のプローブまたはプライマーとして使用することができる。本発明の組換え体またはベクターまたはそれらの発現産物の投与手段としては、本発明の組成物（免疫学的組成物、抗原性組成物もしくはワクチン組成物または治療組成物）を非経口経路（皮内、筋肉内または皮下）で投与することができる。そのような投与によって全身性の免疫応答が可能である。投与は経粘膜（例えば、経口、経鼻、経性器など）で行うこともできる。そのような投与においては局所免疫応答を起こすことができる。更に一般的には、本発明の抗原性組成物、免疫原性組成物もしくはワクチン組成物または治療組成物は、薬学、医学または獣医学の分野の当業者において既知の標準的な技術に基づいて調製することができる。血統もしくは種、年齢、性別、体重および特定の患者の状態ならびに投与経路を考慮し、医学または獣医学の分野の当業者において既知の技術により、そのような組成物を投与することができる。組成物は、単独で、あるいは本発明の他の組成物、またはその他の免疫学的組成物、抗原性組成物、ワクチン組成物もしくは治療組成物と共にまたは連続して投与することができる。そのような他の組成物としては、天然由来の精製された抗原もしくはエピトープ、あるいは本発明の組換え体もしくはベクターまたは別のベクター系によって発現された抗原もしくはエピトープが含まれ、上述の因子を考慮して投与する。本発明の組成物の例としては液体製剤が挙げられ開口部（例えば、経口、経鼻、経肛門、経性器（例えば、経腟など）など）投与用としては懸濁液、シロップまたはエリキシルなど、また、非経口、皮下、皮内、筋肉内もしくは静脈内投与（例えば、注射による投与など）用としては無菌懸濁液もしくはエマルションなどがある。そのような組成物においては、組換え体またはベクターを適切な基剤、希釈剤、または賦形剤（無菌水、生理食塩水、グルコースなど）と混合することができる。一般的には、免疫学的組成物またはワクチン組成物は、アジュバントならびに一定量の組換え体もしくはベクターまたは発現産物を含んでおり、所望する応答を誘起する。ヒトへの応用においては、アラム（ミョウバン）（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）が一般的なアジュバントである。研究および動物への応用に用いられるサポニンおよびその精製成分であるクイルＡ（Quil A）、フロインド（Freund）の完全アジュバントならびにその他のアジュバントは毒性を有していることから、ヒトのワクチンへの積極的な利用が制限されている。ムラミルジペプチド、モノリン酸化リピドＡ、リン脂質コンジュゲート（グッドマン−スニトコフ（Goodman-Snitkoff）ら、J．Immunol．147:410-415(1991)によって記載されているようなもの、本明細書中に参考として取り入れておく）などの化学的に明らかになっている製剤、ミラー（Miller）らによって記載されているようなプロテオリポソーム内へのタンパク質の封入（J．Exp．Med．176:1739- 1744(1992)、本明細書中に参考として取り入れておく）、ならびにノヴァソーム^TM 脂質粒子（Novasome^TM）（ミクロ・ヴェスキュラー・システムズ（Micro Vesc ular Systems）社、ニューハンプシャー州ナシュア）のような脂質粒子内へのタンパク質の封入も用いることができる。該組成物は、非経口（すなわち、筋肉内、皮内または皮下）投与または開口部（例えば、経舌（すなわち経口）、消化管内、経粘膜（口腔内、肛門内、腟内を含む）投与およびその他の投与による免疫用に単回投与型に充填することができる。また、組成物の性質、発現産物の性質、組換え体をそのまま使用する場合には発現レベル、ならびに血統もしくは種、年齢、性別、体重および状態などの既知の因子、ならびに宿主の性質、さらにLD₅₀およびその他のスクリーニング手段により、有効投与量および投与経路を決定するが、これらは既知であり、不要な実験を要しない。発現産物の投与量の範囲は数μｇ〜数百μｇ、例えば、５〜50 ０μｇである。本発明の組換え体またはベクターは、これらの投与レベルにおいて発現を行うことができるような任意の適切な量を投与することができる。ウイルス性組換え体は約10³〜10⁵pfuの量を投与することができ、従って、本発明のウイルス性組換え体は少なくともこの量を投与することが好ましい。より好ましくは約10⁴〜約10⁵pfuである。しかしながら、約10⁴〜約10¹⁰程度の高投与量、例えば、約10⁵〜約10⁹pfu、例えば、約10⁶〜10⁸pfuでも用いることができる。プラスミド組成物または裸DNA組成物中のプラスミドまたは裸DNAの適量は１μｇ〜10 0mgであり、好ましくは0.1〜10mgであるが、0.1〜２mg、好ましくは１〜10μｇの少量でも用いることができる。その他の適切な基剤または希釈剤としては、保存剤を含むまたは含まない水または緩衝生理食塩水がある。発現産物または組換え体もしくはベクターは、凍結乾燥して投与時に再懸濁するかまたはまたは溶液の形にすることができる。基剤（キャリア）は、ポリマー性の放出抑制系を用いることもできる。放出制御組成物の調製においては合成ポリマーが特に有用である。このことに関する初期の例においては、メチルメタクリレートをポリマー化して直径１ミクロン以下の球（スフェア）とし、いわゆるナノ粒子を形成している（クレウター（Kreute r），J、『医薬品および薬物学におけるマイクロカプセルおよびナノ粒子（Micr ocapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacology）』、M．ドンブロウ（Donbrow）編、（CRCプレス（CRC Press）社、p.125-148）。マイクロカプセル化は、マイクロカプセル化された薬剤粒子の注入に応用され放出が制御される。マイクロカプセル化に用いる特定のポリマーの選択には多くの因子が関与している。考慮すべき因子としては、ポリマー合成およびマイクロカプセル化過程の再現性、マイクロカプセル化材料および過程のコスト、毒性曲線、様々な放出動態、ならびにポリマーと抗体との物理化学的適合性などがある。有用なポリマーの例としては、ポリカーボネート類、ポリエステル類、ポリウレタン類、ポリオルトエステル類およびポリアミド類が挙げられ、これらは特に生体内で分解される。薬剤学および最近では抗原に頻繁に用いられる基剤はポリd,1−ラクチド−コグリコリド（PLGA）である。これは生体分解性ポリエステルであり、侵食性縫合線、骨板およびその他の一時的な補綴において医学的に使用されてきた長い歴史があり、全く毒性を示していない。ペプチドおよび抗原を含む広範な薬剤がPLGA マイクロカプセルに製剤されている。抗体の放出制御に関するPLGAの適合性についての多くのデータが蓄積されており、例えば、エルドリッジ（Erdridge），J ．H.らによる総説（Current topics in Microbiology and Immunology，1989，1 46:59-66）がある。直径１〜10ミクロンのPLGAマイクロスフェア内中の抗原の取り込みは、経口投与した場合に顕著なアジュバント効果を有することが示されている。PLGAのマイクロカプセル化過程においては、油中水エマルションの相分離を用いる。目的の化合物を水溶液として調製し、PLGAは塩化メチレンおよび酢酸エチルエステルなどのような適切な有機溶媒に溶解する。これら２つの非混和性溶液を高速撹拌によって共エマルション化する。次に、ポリマーに対する非溶媒を添加し、水滴の周囲にポリマーの沈澱を起させ、未熟なマイクロカプセルを形成する。マイクロカプセルを集め、溶剤（ポリビニルアルコール（PVA）、ゼラチン、アルギネート類、ポリビニルピロリドン（PVP）、メチルセルロース）のうちのひとつを用いて安定化し、真空乾燥または溶媒抽出のいずれかによって溶媒を除去する。従って、固体組成物（液体充填固体を含む）、液体組成物およびゲル組成物（「ゲルカプセル」を含む）も考えられる。更にまた、本発明のベクターまたは組換え体は、任意の所望する免疫または投与計画において使用することができ、それは例えば、獣医学分野における毎年のワクチン接種、ヒトの医学分野における定期的なワクチン接種または初期ブースター計画などのような定期的ワクチン接種の一部としての使用である。ここで、本発明のベクターまたは組換え体は、同一または異なるエピトープ（同一または異なるエピトープを発現する組換え体またはベクターを含む）を発現するような同一または異なるエピトープまたは組換え体もしくはベクターの前または後のいずれにも投与することができる。（例えば、米国特許出願08/746,668号などを参照。）更に、本発明のベクターもしくは組換え体ならびにそれらの発現産物は、動物において免疫応答または抗体応答を刺激することができる。これらの抗体から、当該分野において既知の技術によってモノクローナル抗体を調製することができ、これらの抗体を既知の抗体結合アッセイ、診断キットもしくは試験に用いて、抗体の在否および生来の抗原発生原の在否を判断し、そのような発生原または抗原に対する免疫応答が単に刺激されただけであるのか否かを判断する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体はただひとつの抗原決定因子と反応し、従来の血清由来の抗体よりも特異性が高い。更にまた、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、所望する特異性、結合力およびアイソタイプを有するそれぞれの抗体を選択することが可能である。ハイブリドーマ細胞系は化学的に同質の抗体の安定した安価な供給源であり、そのような抗体の調製法は標準化されている。モノクローナル抗体を産生する方法は当業者においては既知であり、例えば、コプロウスキー（Koprowski）,H.らによる、1989年４月１日に公開された米国特許第4,196,265号などがあり、参考として本明細書に取り入れておく。モノクローナル抗体の使用についても既知である。そのような使用のひとつとして診断法があり、例えば、1983年３月８日に公開されたデーヴィッド（David ），G.およびグリーン（Greene）,H.による米国特許第4,376,110号などであり参考として本明細書に取り入れておく。モノクローナル抗体はまた、免疫吸着クロマトグラフィーによる回収材料としても用いられる（例えば、ミルステイン（Milstein）,C，1980，Scientific Ame rican，243:66，70など、参考として本明細書に取り入れておく）。本発明のベクターもしくは組換え体ならびにそれらの発現産物を用い、患者への連続的な再注入を行うためにイン・ビトロ（in vitro）またはエクス・ビボ（ ex vivo）において細胞の応答を刺激することができる。もし患者が血清陰性の場合には、再注入により免疫応答（例えば、能動免疫のような免疫学的応答または抗原性応答など）が刺激される。血清陽性の患者の場合には、再注入により病原体に対して免疫系を刺激または増強する。本発明の組換え体またはベクターは、DNA産生用のプローブまたはPCRプライマーとして有用であり、これらは、ハイブリダイズ可能なDNAの在否の検出またはD NAの増幅（例えば、サンプル中の病原体の検出またはDNAの増幅など）に用いることができる。ウイルスは複製に必要なウイルスタンパク質を発生させるためにウイルスmRNA の翻訳を必要としていることから、感染した細胞内のPKRの活動を阻止する機能はいずれもウイルスタンパク質の発現に正の効果を有することは明らかである。従って、一般的に、ワクシニアのE3L/K3L遺伝子産物またはE3Lおよび／もしくは K3Lの同類体（ホモログ）を何らかの形で共発現させることにより、ベクターによる異型遺伝子産物の発現レベルの増強に対する一般的なメカニズムを与えることになる。E3L/K3Lまたはそのホモログの機能は、生来の抗PKRメカニズムを増強または増幅することから、タンパク質の発現レベルおよび／または持続性が増すこのことは、免疫運搬者としての真核性ウイルス型の効率を最適化するための有用な要素を提供する。この方法は、DNAに基づく免疫原、例えば、裸DNAベクター系またはプラスミドDNAベクター系などの改変を更に促進することができる。従って、発現のレベルの上昇もしくは増強または発現の持続性が得られる。本発明のよりよい理解とその多くの利点は、以下の限定を伴わない例示である実施例から明らかになるであろう。実施例実施例１−ALVAC組換え体イン・ビボ（in vivo）での組換えにおいて、レスキューウイルスvC205（ATCC 受入れ番号）を用い、pMPC6H6K3E3（ATCC受入れ番号：米国特許出願番号08/417,210号を参考として本明細書中に取り入れておく；HIV発現カセット− ワクシニアV6プロモーター／HIV MN株の切断したenv、ALVAC C3挿入部位にプロテアーゼを有するI3L gag）をドナープラスミドとして使用し、得られた組換えウイルスをvCP1431A（ワクシニアのH6/K3LおよびE3LカセットはC6遺伝子座に存在している）とした。H6/K3L発現カセットおよびALVAC C6挿入部位配列に挟まれた外因性のプロモーターを有するE3L遺伝子に関しては図１（SEQ ID NO: ）を参照。 pC3H6FHVB（ATCC受入れ番号；図３、SEQ ID NO: ；H6をプロモーターとするFHV gB ORFであり、５’および３’末端に初期転写および翻訳停止シグナルを有し、これがALVAC C3遺伝子座の左右のアームに挟まれている）を使用して、ALVAC（ATCC受入れ番号VR-2547）とのイン・ビボ（in vivo）組換えを行い、v CP1459（オープンリーディングフレーム（ORF）を外したC3挿入遺伝子座に存在し、H6をプロモーターとするFHV gB発現カセット）を作出した。FHV-1 gBをコードしている領域に関しては、２個の内部T₅NTモチーフが変異している（図２（ SEQ ID NO: ）を参照）。 pC3H6FHVBを用い、vCP1431Aとのイン・ビボ（in vivo）組換えを行い、vCP146 0（H6をプロモーターとし、ORFを外したC3挿入遺伝子座に存在するFHV gB発現カセットおよびC6遺伝子座のワクシニアのE3L/K3L遺伝子）を作出した。 vCP205との組換えにおいてpMPC5H6PN（ALVAC C5遺伝子に存在するHIV pol/ne f「ビーズで構成された糸（string of beads）」カセット）を用いることによってvCP1433（ATCC受入れ番号）を得た。すなわち、vCP205のC5として既知の挿入部位に既知の全てのPol CTLエピトープ（ニクソン（Nixon）およびマクミカエル（McMichael）:1991年）および既知の全てのヒトNef CTLを含む合成ポリペプチドをコードしている発現カセットを挿入することによって組換え体ALVAC-MN 120TMGNPst（vCP1433）を作出した。においてpMPC6H6K3E3（ATCC受入れ番号；ALVAC C6挿入部位配列が接続している外来性プロモーターを有するワクシニアのH6/K3L発現カセットおよびワクシニアE3L遺伝子を含む）を用い、vCP1433との組換えを行うことによってvCP145 2を得た。図４および５にvCP1433およびvCP1452挿入体のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。図６はvCP1452内のC6部位内のE3L K3Lを示す。vCP1452 は、IIIB単離株由来のHIV １型のgagおよびプロテアーゼ遺伝子、MN単離株由来のgp120エンベロープ配列、ならびにHIV-1 NefおよびPol由来の既知のヒトCTL エピトープ（Nef1およびNef2 CTLエピトープ、ならびにPol1、Po12およびPol3 エピトープ）を含むポリペプチドをコードしている配列を含む。発現されたgp12 0部位は、エンベロープ糖タンパク質から構成される膜透過（TM）アンカー配列（アミノ酸数28個）に連結した。HIVをコードしている配列に加えて、vCP1452は、C6部位に挿入されたワクシニアウイルスのE3LおよびK3Lをコードしている配列を含んでいる。この構築体の挿入部位およびプロモーターの連結については以下の表に示す。表：vCP1452内の挿入部位およびプロモーターの連結 vCP300は、HIV gp120TM（MN）、gag/pro（IIIB）（C3遺伝子座）、Nef（C6遺伝子座）、およびPol（C5遺伝子座）を有するALVAC組換え体であり、これは米国特許出願08/417,210号に記載されており、参考として本明細書に取り入れておく。これらの組換え体を調製するためのプラスミドは以下のように調製した。 K3L 発現カセット米国特許第5,378,457号に記載されているように、鋳型としてコペンハーゲンワクシニアのHindIII Ｋ断片を含むpSD407VCを用い、PCR増幅によってK3Lをコードしている配列を合成した。オリゴヌクレオチドMPSYN763およびMPSYN764をPC R反応用のプライマーとして使用した。 XbaIおよびEcoRIを用いて約325bpのPCR断片を切断し、315bpの断片を得た。アガロースゲルを用いた単離によってこの315bpの断片を精製し、XbaIおよびEcoRI で切断したpBSSK+ベクター（ストラタジーン（Stratagene）社（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）から入手）と連結した。変形T7ポリメラーゼ（タボール（Tabor ）,S.およびリチャードソン（Richardson）,C.C.、1987年）およびシークエナーゼ（Sequenase）（U.S.バイオケミカルズ（U.S．Biochemicals）社（オハイオ州クリーヴランド）から入手）を用い、ハットリ（Hattori）,M.およびササキ（Sa saki）,Y.が記載しているように、アルカリ変性したプラスミド鋳型から直接核酸配列を決定した。このプラスミドをpBS763/764とした。NruIおよびXhoIを用いてpBS763/764を切断し、プラスミドベクターpMM154にクローニングするための34 0bpの断片を単離した。ここでpMM154は、NYVAC tk-挿入ベクター（NruI（部分的）およびXhoIを用いて切断することによって調製）に無関係な遺伝子を制御するワクシニアH6プロモーターを含むカセットを含んでいる。K3L遺伝子を有するpBS 763/764から得た340bpの断片を直接的にH6プロモーターの隣に結合することによってpMPTKH6K3Lを作出した。エントモポックス（Entomopox）の42ｋのプロモーターの制御下における優先的選択マーカーであるEco gpt遺伝子（プラット（Pra tt）,D.およびスブラマーニ（Subramani），S.、1983年）を含むpMP42GP TをSmaIおよびBamHIを用いて切断し、0.7kbpの42kEco gpt発現カセットを得た。この0.7kbpの断片を精製し、SmaIおよびBamHIで切断したpMPTKH6K3Lに連結してプラスミドpMPTKH6K3Lgptを作出した。このプラスミドをXhoIで切断してH6/K3L および42k/Ecogpt発現カセットを含む1.2kbpの断片を得、次にこれをゲル精製した。1.2kbpのXhoI断片をALVAC C6挿入プラスミドであるpC6LのXhoI部位に挿入し（米国特許第5,494,807号に記載）、pMPC6H6K3Lgptを作出した。 E3L/K3L ALVAC 発現カセットコペンハーゲンワクシニア由来のHindIII E断片のクローンを含むpSD401VCから単離した2.3kbpのEcoRI断片内にE3Lの全遺伝子が含まれている。EcoRIで部分切断したpMPC6H6K3Lgptに2.3kbpのEcoRI断片を挿入してプラスミドpMPC6H6K3E3g ptを作出した。このプラスミドpMPC6H6K3E3gptをXhoIで切断し、得られた6.8kbp のベクター断片を精製、自己連結し、プラスミドpMPC6E3を得た。プラスミドpMP TKH6K3LをPspAIで切断し、H6/K3L発現カセットを含む560bpの得られた断片をPsp AIで切断したpMPC6E3に連結してプラスミド構築体pMPC6H6K3E3を得た。 H6 をプロモーターとするFHV gBドナープラスミドの構築ネコヘルペスウイルスＩの糖タンパク質gB（FHV-1 gB）の全コード領域は、P stIを用いてpJCA079を切断することによって得られ、アガロースゲルによって３ kbpの断片を単離した（FHV gBをコードしている領域では、T₅NT配列の５’および３’が突然変異を起こしてアミノ酸配列に影響を与えない初期転写停止シグナルに変化している；I3LワクシニアプロモーターはgB ORFの５’末端に結合している；図４、SEQ ID NO: 参照）。精製PstI断片をやはりPstIで切断したALVACC 3挿入プラスミド（pVQH6CP3LSA）内にクローニングした。pVQH6CP3LSA内の特徴的なBamHI部位はBamHIで切断することによって予め不活化し、クレノー（Klenow ）ポリメラーゼを用いて末端を平滑化して再連結した；NotIおよびNsiIを用いて pNV6CP3L（米国特許第5,494,807号に記載）を切断することによってpVQH6CP3LSA を得、そこから6623bpの断片を単離し、アニールしたオリゴヌクレオチドCP34（５’ＧＧＣＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＣＡ３’）およびCP35（５’ＴＧＴＣＧＡＣＧＣ３’）（SEQ ID NOS: ）に連結した。得られたプラスミドpRAC5について、H6プロモーターに関してgBをコードしている領域が正しい方向性であるか否かをスクリーニングした。H6プロモーターをFHV gB開始コドンに正しく連結させるために、オリゴヌクレオチドRG789（SEQ ID NO: ）（５’−ＴＴＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣ−ＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣＣＡＣＴＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣ−３’）およびRG787（SEQ ID NO: ）（５’− ＧＧＡＧＧＧＴＴＴＣＡＧＡＧＧＣＡＧ−３’）を用いてpJCA079から800bpのPC R断片を増幅させた。この精製した断片をNruI/BamHIを用いて切断し、同様にNru I/BamHIを用いて切断したpRAC5に連結した。得られたプラスミドをFHV gBドナープラスミドpC3H6FHVBとした。「ビーズで構成された糸」カセット nefおよびpol CTLエピトープに対する「ビーズで構成された糸」カセット（H 6/Pol 3/Nef Ｃ末端／Pol 2/Nef 中央／Pol1）は、以下に詳細に記載しているように、polエピトープに対してはpHXBD2を鋳型として用い、Nefエピトープに対しては2-60-HIV.3を鋳型として用い、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）によって作出した。初期の組立ては２つの部分に分けて行った。pBSSK内の（１）H6（部分的プロモーター）／Pol 3/Nef C末端（Nef2）；（２）Pol 2/Nef中央（Nef1） /Pol 1。これらを組み合わせ、次にH6全プロモーターを組立てるためにpBSH6-11 に移し、続いてH6/HIVカセットをC5挿入プラスミドに移した。（１）H6 ／Pol 3/Nef C末端（Nef2） PCR由来の230bpの断片（Ａ）から、合成オリゴヌクレオチドMPSYN783およびMP SYN784ならびに鋳型pHXBD2を用いてH6連鎖およびPolを得た。pHXBD2はNIH/NCI（ナンシー・ミラー（Nancy Miller）博士）に由来し、これは、HTLV-1に感染した H9細胞をラムダ−J1細胞にクローニングしたものに由来するDNAをXbaIで切断することによって得られた組換えファージライブラリーから得たものである（シャウ（Shaw）ら、1994年）。このプラスミドは、HIV IIIB単離株のプロウイルス性 DNAの全てを含んでいる。 PCR由来の110bpの断片（Ａ）から、合成オリゴヌクレオチドMPSYN785／MPSYN7 86ならびに鋳型p2-60-HIV.3を用いてNefを得た（米国特許出願08/417,210号に記載）。外部プライマーMPSYN783／MPSYN786（SEQ ID NOS: ）を用い、PCRにおいて鋳型としてPCR断片ＡおよびＢを組み合わせてH6連結/Po13/Nef2を含む300bpの断片を得た。XhoI/HindIIIを用いてこの300bpの断片を切断して290bpの断片を単離し、同様に切断したpBSSKと連結することによってpBS783/786を作出した。配列確認を行った。（２）Pol 2/Nef 中央（Nef 1)/Pol 1 合成オリゴヌクレオチドMPSYN787／MPSYN788（SEQ ID NOS: ）ならびに鋳型p HXBD2を用い、PCRによってPo12を含む210bpの断片（Ｃ）を得た。合成オリゴヌクレオチドMPSYN789／MPSYN790（SEQ ID NOS: ）ならびに鋳型p 2-60-HIV.3を用い、PCRによってNef1を含む270bpの断片（Ｄ）を得た（（米国特許出願08/417,210号に記載）。合成オリゴヌクレオチドMPSYN791／MPSYN792（SEQ ID NOS: ）ならびに鋳型p HXBD2を用い、PCRによってPol1を含む170bpの断片（Ｃ）を得た。外部プライマーMPSYN787／MPSYN790（SEQ ID NOS: ）を用い、Pol2/Nef1に対するPCRにおいて鋳型として断片ＣおよびＤを組み合わせて460bpのPCR産物（Ｃ＋Ｄ）を得た。外部プライマーMPSYN789／MPSYN792（SEQ ID NOS: ）を用い、Nef1/Pol1に対するPCRにおいて鋳型として断片ＤおよびＥを組み合わせ、420bpの断片（Ｄ＋Ｅ）を単離した。外部プライマーMPSYN787／MPSYN792（SEQ ID NOS: ）を用い、PCRにおいて鋳型として断片（Ｃ＋Ｄ）および（Ｄ＋Ｅ）を組み合わせ、Pol 2/Nef1/Pol1を含む6100bpの断片を得た。この610bpの断片をHindIII/PstIで切断した。得られた5 90bpの断片をHindIII/PstIで切断したpBSSKに連結し、pBS787/792を作出した。配列確認を行った。全カセットの組立 pBS787/792から590bpのHindIII/PstI断片を単離し、HindIII/PstIで切断したp BS783/786ベクターと連結し、pBS783/792を作出した。pBS783/792をEcoRVおよび PstIで切断して880bpの断片を作出し、次にこれを同様に切断したベクターpBSH6 -1と連結してpBSH6PNを作出した。プラスミドpBSH6PNをBamHIで切断して1060bp の断片を単離した。一般的なC5ドナープラスミドであるpVQC5LPS1をBamHIで切断し、pBSH6PN由来の1060bpの断片と連結した。得られたプラスミドpMPC5H6PNは、 ALVAC C5遺伝子座にHIV pol/nefの「ビーズで構成された糸」カセットを有する。実施例２−発現実験融合性の単層細胞の入ったペトリ皿を感染の多重度（moi）２で感染させた。一定時間インキュベートした後、ラベルした培地内で細胞を１時間インキュベートした。インキュベーション終了後、細胞を回収してハーロウ（Harlow），E.およびレーン（Lane），D．（1988年）；ランゴーン（Langone），J．（1982年）の記載に従って免疫沈降分析を行った。細胞をmoiが２pfu/細胞となるように感染させ、一定時間インキュベートした。適切な時間に後感染を行い、細胞溶解物を調製してRNA分析を行った。培地を吸引除去して細胞を回収した。TRI試薬（TRI-Reagent）（モレキュラー・リサーチ・センター（Molecular Research Center）社、オハイオ州シンシナテイ、452 12）を用い、メーカーの指示に従ってRNAを単離、調製し、スロットブロット（ドッドブロット）によって分析した。放射活性ラベルしたDNAを用いて特定のRNA 種を検出した。 ALVAC-HIV 組換え体免疫沈降法（IP）を用い、MRC-5が感染したALVAC組換え体の中に存在するHIV- 1の一時的な発現についての半定量的比較を行った。方法に記載されているように、HIV患者由来の熱不活化血清を入手し、IPに使用した。抗血清は、120kDaのe nvタンパク質およびgagタンパク質前駆体由来の様々な解裂産物を沈降する。IP データの分析から、E3L/K3Lカセットを有しないALVAC組換え体vCP205と比較すると、後感染の全期間にわたり、E3L/K3Lカセットを有するvCP1431AなどのALVAC組換え体は、発現のレベルが著しく上昇していたことが明らかである。 RNAスロットブロットを用い、ALVAC組換え体であるvCP205およびvCP1431Aを感染させたMRC-5細胞内における一時的な転写性発現を評価した。この分析においては、envおよびgagタンパク質をコードしているHIVカセットから転写されたmRN Aのレベルについて比較を行った。envおよびgag遺伝子のmRNAのレベルに関して、E3L/K3Lカセットを有するALVAC組換え体（vCP1431A）は、ALVAC組換え体vCP20 5よりも顕著な上昇を示したわけではなかった。ワクシニアのE3L/K3L機能を有するALVAC組換え体内においては、既述したように、ワクシニアに感染した細胞内ではE3L/K3LがPKRを少なくするように制御することにより翻訳を調節する役割を果たしていると考えられる。データから、E3L/ K3L遺伝子を有するALVAC組換え体が感染した細胞内では翻訳が顕著に増強されているが、転写レベルの顕著な上昇は観察されていないことが示されている。このことは、ポックスウイルスに感染した細胞内での翻訳効率にE3L/K3Lが与える影響を例示するものである。 ALVAC親ウイルス、ALVAC-MN120TMG（vCP205）、ALVAC-MN120TMGNPst（vCP1433 ）vCP1452およびvCP300（テイラー（Taylor）ら、（1990年）の記載を参照）、ならびにHIV血清陽性患者由来のヒト血清（抗HIV）を用いて感染したCEF細胞由来の放射活性ラベルした溶解物を用いて免疫沈降分析も行った。分析から、組換え体内においては、分子量120kDaのエンベロープ配列および分子量55kDaのGag前駆体タンパク質の発現が確認されたが、親ウイルス内においては確認されなかった。しかしながら、vCP1452と比較すると、vCP300は発現が弱まっていた。vCP14 52は、本発明に従う転写および／または翻訳因子の発現によって驚くほどの発現の増強を示したのである。ヒト抗HIV抗体を用いたFACスキャン分析においては、ALVAC-MN120TMGNPst（vC P1433）が感染したヒーラ（HeLa）細胞の表面にgp120が発現していることが明らかになった。ALVAC親ウイルスを感染させた細胞においては全く蛍光が検出されなかった。 vCP1433またはvCP1452を感染させたMRC-5細胞の放射活性ラベルした溶解物に関して行った免疫沈降分析（HIV感染患者由来のポリクローナル血清プールを使用）によって、挿入されたHIV遺伝子の適切な発現がさらに確認された。この分析により、vCP1452内における分子量120kDaのエンベロープ配列および分子量55k DaのGag前駆体タンパク質の発現が確認された。 vCP1433およびvCP300と比較して、vCP1452はヒト細胞において発現を増強した。実際、ヒトおよびイヌの細胞内において、E3L/K3L翻訳因子による発現の増強が観察された。マウスを用いた予備的な免疫原性実験においては、E3L/K3L翻訳因子による免疫原性の増強は認められなかった。このことは、マウス細胞内において発現の増強が観察されなかったことと一致している。従って、本発明のイン・ビトロ（in vitro）またはイン・ビボ（in vivo）における応用においては、細胞の起源がベクターの性質（例えば、ベクターの表現系（例えば、不全性、および初期不全、後期不全のような不全性など）など）と同様に重要な因子であるが、細胞およびベクターの表現系、ならびに因子および外来性および／もしくは外因性DNAの発現時間について適切な選択を行うことは、本開示および当該分野の知識から当業者の範ちゅうであり、不要な実験を要しない。 ALVAC-FHV gB 組換え体ヒツジ抗FHV gBポリクローナル血清を用い、免疫沈降分析によってvCP1459およびvCP1460の発現の分析を行った。ヒトMRC-5細胞に時間０の時にmoi＝５で接種を行い、次に、３、６、24、48および72時間目に³⁵Ｓラベルしたメチオニンを１時間照射した。沈降したタンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離した。これらのIP の放射能写真を濃度計を用いてスキャンした。この方法により、特定の時間点におけるFHV gB発現に関する半定量的分析が得られた。全ての組換え体が、グルコシル化されたFHV gBポリペプチドの正しい大きさの全長（見かけの分子量は約115kDa）を発現することが示された。しかしながら、vCP1459と比較すると、組換え体vCP1460はgBタンパク質の量の著しい増加（約５倍）を示した。さらに、これらの発現レベルは72時間後においても持続していた。従って、ALVAC内におけるワクシニアのE3L/K3Lの発現は、FHV gBの発現のレベルおよび持続性に顕著な効果を有していると考えられる。実施例３−追加のベクター本明細書に引用されている文献および以上の実施例を含む明細書の教示に従い、プラスミド、裸DNAおよび追加のウイルス性ベクター（これには、ポックスウイルス（例えば、NYVAC、TROVAC、ALVAC、MVA、ts（温度感受性）突然変異体、または初期（DNA）および後期検出変異体など）、アデノウイルス（例えば、CAV 2のようなCAVなど）、ヘルペスウイルス（例えば、エプステイン−バー（Epstei n-Barr）ウイルスなど）をE3L、K3L、VAT、EBER、シグマ３、TRBPまたはこれらの組み合わせを用いるなどして発現が増強された形で作出し、ベクターを変形して少なくとも１個の翻訳因子を含むようにした。このようにして、外因性のコードしている核酸分子（そのような外因性のコードしている核酸分子としては、本明細書中に記載している文献もしくはその他当該分野において既知のもの、またはこれらの教示を本明細書の教示と組み合わせて適用したものに由来するものが挙げられる）の発現を増強させる。本発明の好ましい実施態様の詳細について記載してきたが、本発明は請求の範囲によって規定されるものであり、上述の特定の記載によって制限されるものではなく、それらの種々の変形もまた本発明の範中に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者タータグリア，ジェイムズアメリカ合衆国ニューヨーク州 12303 スケネクタディークリスティナドライヴ７ (72)発明者ジャコブス，バートラムエルアメリカ合衆国アリゾナ州 85003 フェニクスウェストリンウッドストリート 522 (72)発明者ゴーベル，スコットジェイアメリカ合衆国ニューヨーク州 12020 ボールストンスパーグレイドマローロード 19 (72)発明者コックス，ウィリアムアイアメリカ合衆国ニューヨーク州 12153 サンドレイクメイプルトレイル 1379 (72)発明者ゲティッグ，ラッセルロバートアメリカ合衆国ニューヨーク州 12018 アヴェリルパークボックス 421シーアールディー２ (72)発明者ピンカス，スティーヴンイーアメリカ合衆国ニューヨーク州 12061 イーストグリーンブッシュトロイロード 78 (72)発明者パオレッティ，エンゾアメリカ合衆国ニューヨーク州 12054 デルマーマーレイアヴェニュー 297

Claims

【特許請求の範囲】１．細胞内で少なくとも１個の第一の核酸分子の発現を増強するベクターであって、第一の核酸分子および翻訳因子をコードしている第二の核酸分子を少なくとも１個含むように改変されており、第一および第二の核酸分子の実質的な共発現が起こり、これにより、第二の核酸分子の発現が翻訳を増強することによって第一の核酸分子の発現を増強することを特徴とするベクター。２．第一のプロモーターが機能発揮できるように第一の核酸分子に結合し、第二のプロモーターが機能発揮できるように第二の核酸分子に結合し、さらに、第一および第二のプロモーターが実質的に同時に機能することを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。３．第一および第二の核酸分子がベクター内の異なる遺伝子座に存在することを特徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。４．第一および第二の核酸分子がベクター内の同じ遺伝子座に存在することを特徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。５．第一および第二の核酸分子が機能発揮できるようにプロモーターに結合していることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。６．翻訳因子がeIF-2αのリン酸化を阻害し、もしくはPKRのリン酸化を阻害し、またはdsRNAを封鎖してdsRNAの有効濃度の上昇を妨げることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。７．該少なくとも１個の第二の分子が、K3Lオープンリーディングフレーム、E3L オープンリーディングフレーム、VAI RNA、EBER RNA、シグマ３オープンリーディングフレーム、TRBPオープンリーディングフレームおよびそれらの組み合わせを含む群より選択されることを特徴とする請求の範囲第６項記載のベクター。８．該第一の核酸分子が、目的のエピトープ、生物学的応答の調節物質、成長因子、認識配列、治療遺伝子および融合タンパク質をコードしている核酸分子を含む群から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。９．ベクターが組み換えウイルスであることをを特徴とする請求の範囲第１項記載のベクター。 10．ベクターが組み換えポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第９項記載のベクター。 11．請求の範囲第１項記載のベクターを調製する方法であって、ベクターを変形して少なくとも１個の核酸分子を含むようにし、さらに任意にベクターを改変して第一の核酸分子を含むようにし、第一および第二の核酸分子が実質的に共発現をすること特徴とする方法。 12．第一の核酸分子が第一のプロモーターに、第二の核酸分子が第二のプロモーターにそれぞれ機能発揮できるように結合しており、ここで、該第一および第二のプロモーターが実質的に同時に機能することを特徴とする請求の範囲第11 項記載の方法。 13．第一および第二の核酸分子が機能発揮できるように１個のプロモーターに結合していることを特徴とする請求の範囲第11項記載の方法。 14．請求の範囲第１項記載のベクターならびに薬剤学的に許容できる基剤もしくは希釈剤を含むことを特徴とする免疫学的組成物、ワクチン組成物または治療組成物。 15．請求の範囲第14項記載の組成物を宿主に投与することを特徴とする宿主に免疫学的応答または治療的応答を誘起する方法。 16．ベクターを改変して、翻訳因子をコードしている少なくとも１個の第二の核酸分子を含むようにした細胞内において、第一の核酸分子を有するベクターによって少なくとも１個の第一の核酸分子の発現を増強する方法であって、該第一および第二の核酸分子は実質的に共発現し、それにより、第二の核酸分子の発現が翻訳の増強によって第一の核酸分子の発現を増強することを特徴とする方法。 17．請求の範囲第１項に記載しているようなベクターを用いて適切な細胞を感染またはトランスフェクトすることを含む、イン・ビトロ（in vitro）において遺伝子産物を発現させることを特徴とする方法。 18．請求の範囲第１項記載のベクターを宿主に投与することを含む、イン・ビボ（in vivo）において第一の核酸分子を発現させることを特徴とする方法。