JP4064466B2 - レンチウイルスから誘導した非相同挿入部分を含むポックスウイルスベースの発現ベクター - Google Patents

Description

政府の権利の可能性についての言明
本文中で報告する研究の一部は、ＮＩＨ／ＮＩＡＩＤ補助金（Ｒ０１-ＡＩ３０９０４）およびＶｉｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．／フロリダ大学共同研究補助金の援助を受けたものである。政府は何らかの権利を有する可能性がある（権利の侵害あるいは承認を伴わない）。
関連出願
１９９４年４月６日出願の米国特許願連続番号第０８／２２３，８４２号の一部継続出願として、１９９５年４月５日出願の米国特許願連続番号第０８／４１７，２１０号を参照する。前者は１９９２年６月１１日出願の連続番号第０７／８９７，３８２（現在は１９９４年９月７日出願の米国特許願連続番号第０８／３０３，２７５号）号の一部継続出願であり、またそれは１９９１年６月１４日出願の連続番号第０７／７１５，９２１号の一部継続出願である。特許願連続番号第０８／４１７，２１０号も、１９９３年８月１３日出願の特許願連続番号第０８／１０５，４８３号、現在の米国特許第５，４９４，８０７号の一部継続出願であり、後者は１９９２年３月６日出願の連続番号第０７／８４７，９５１号の継続出願であり、またそれは１９９１年６月１１日出願の連続番号第０７／７１３，９６７号の一部継続出願であり、またそれは１９９１年３月７日出願の連続番号第０７／６６６，０５６号（現在の米国特許第５，３６４，７７３号）の一部継続出願である。１９９３年１月２０日出願の連続番号第０８／００７，１１５号の一部継続出願として１９９４年１月１９日に出願された、共同審理中の特許願連続番号第０８／１８４，００９号についても言及する。前述したおよび上記に参照した特許願および特許は、それぞれ参照してここに組み込まれる。
発明の分野
本発明は次のものに関する：対象となる特定のエピトープ、好ましくはＥｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌと付属遺伝子産物、たとえばＴａｔ、Ｒｅｖ、より好ましくはＧａｇとＰｏｌまたはＥｎｖ、ＧａｇとＰｏｌ、最も好ましくはＧａｇとプロテアーゼを含む、レンチウイルス、レトロウイルスおよび／あるいは免疫不全ウイルス、たとえばＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶからの特定産物；当該産物をコードする特定核酸分子、たとえばＲＮＡ、ＤＮＡ；当該核酸分子を含み、好ましくは当該産物をベクターに外因性として発現するベクター、好ましくは哺乳類ベクター；当該ベクターによる発現から得られたあるいは得ることができる産物；当該ベクターおよび／あるいは当該産物を含む免疫学的、免疫原性および／あるいはワクチン組成；当該産物を調製するための方法；当該ベクターを作製するための方法；当該組成を調製するための方法；当該産物、ベクターおよび／あるいは組成を単独で、または不活性化レンチウイルス、レトロウイルスあるいは組換えサブユニット製剤とのプライム／ブースト形態として、たとえば不活性化感染細胞ワクチンあるいは免疫学的または免疫原性組成（ＩＣＶ）とのプライム／ブースト形態として投与する免疫処方によるような、免疫応答を得るための方法を含む、当該産物、ベクターおよび組成を使用するための方法。
本発明は特に、組換え型免疫学的、免疫原性あるいはワクチン組成、ならびに非相同株への暴露を含む、レンチウイルス攻撃誘発暴露に対する防御を提供するような、応答を刺激する上でのそれらの有用性に関する。組換え型組成は、好ましくは、単独で、あるいは不活性化レンチウイルス製剤（たとえばＩＣＶ）または組換えサブユニット製剤とのプライム／ブースト形態での有効な免疫処方において使用される、レンチウイルス遺伝子産物を発現する哺乳類ベクター系を含む。
本出願中でいくつかの資料を参照する。これらの資料に関する詳細な引用は、請求の範囲の直前の本明細書の最後の部分、あるいは資料に言及する箇所に示されている；またこれらの資料の各々は参照してここに組み込まれる。
発明の背景
特許および学術文献には、哺乳類ウイルスベースのベクター系や哺乳類ＤＮＡベースのベクター系のような様々な哺乳類ベクター系、そしてこれらのベクター系をどのようにして作製し、使用するか、たとえば外因性ＤＮＡのクローニングや蛋白の発現のための使用、ならびにそのような蛋白についての用途およびそのような蛋白からの産物についての用途が含まれている。
たとえば、このウイルスベクター系における発現のための組換え型ポックスウイルス（たとえばワクシニアウイルス、アビポックスウイルス）と外因性ＤＮＡが、米国特許第４，６０３，１１２号、４，７６９，３３０号、５，１７４，９９３号、５，５０５，９４１号、５，３３８，６８３号、５，４９４，８０７号、５，５０３，８３４号、４，７２２，８４８号、５，５１４，３７４号、英国特許第ＧＢ ２ ２６９ ８２０ Ｂ号、第ＷＯ９２／２２６４１号、第ＷＯ９３／０３１４５号、第ＷＯ９４／１６７１６号、第ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６６５２号、および１９９４年１月１９日出願の認可された米国特許願連続番号第０８／１８４，００９号の中に認められる。一般的には、Ｐａｏｌｅｔｔｉ、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｏｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｔｏ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：Ａｎ ｕｐｄａｔｅ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３４９-１１３５３、１９９６年１０月；Ｍｏｓｓ、「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｐｏｘｕｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３４１-１１３４８、１９９６年１０月参照。
バキュロウイルス発現系およびそれらにおける発現のための外因性ＤＮＡ、およびそれらからの組換え型蛋白の精製は、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．（編集者）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ」（１９９５ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）（たとえばインフルエンザＨＡ発現についての第１８章、組換え型蛋白精製手法についての第１９章参照）、Ｓｍｉｔｈら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａ Ｂｅｔａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ」Ｍｏｌｅｃｕｌｒａ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８３年１２月、第３巻、１２号、ｐ．２１５６-２１６５；Ｐｅｎｎｏｃｋら、「Ｓｔｒｏｎｇ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ-Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ａ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８４年３月、第４巻、３号、ｐ．３９９-４０６；第ＥＰＡ ０ ３７０ ５７３号（ＡＩＤＳに関する皮膚試験および試験キット、ＨＩＶ-１ ｅｎｖ遺伝子の一部を含むバキュロウイルス発現系を論じ、１９８６年１０月１６日出願の米国特許願連続番号第９２０，１９７号およびＥＰ特許願公開番号第２６５７８５号を囲繞している）の中に認められる。
米国特許第４，７６９，３３１号はベクターとしてのヘルペスウイルスに関する。また、Ｒｏｉｚｍａｎ，「Ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ：Ａ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｖｅｃｔｏｒｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３０７-１１３１２、１９９６年１０月；Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、「Ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３１３-１１３１８、１９９６年１０月も参照のこと。エプスタイン-バーウイルスベクターも知られている。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、「Ｅｐｓｔｅｉｎ-Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３３４-１１３４０、１９９６年１０月参照。さらに、アルファウイルスベースのベクター系がある。一般的にはＦｒｏｌｏｖら、「Ａｌｐｈｖｉｒｕｓ-ｂａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３７１-１１３７７、１９９６年１０月参照。
ポリオウイルスおよびアデノウイルスベクター系も存在する（たとえばＫｉｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５、３０６８-３０７５、１９９１；Ｇｒｕｎｈａｕｓら、１９９２、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ａｓ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第３巻）ｐ．２３７-５２、１９９３；Ｂａｌｌａｙら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第４巻、ｐ．３８６１-６５；Ｇｒａｈａｍ，Ｔｉｂｔｅｃｈ ８、８５-８７、１９９０年４月；Ｐｒｅｖｅｏら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７０、４２９-４３４参照）。また１９９６年７月３日出願の米国特許願連続番号第０８／６７５，５５６号および０８／６７５，５６６号（アデノウイルスベクター系、好ましくはＣＡＶ２）およびＰＣＴ第ＷＯ９１／１１５２５号（逆向き末端反復領域の端に近いＳｍａＩ部位から初期領域４（Ｅ４）についてのプロモーターまでの領域内にプロモーター遺伝子配列を含むように修飾されたＣＡＶ２）も参照のこと。
ＤＮＡベクター系も存在する。それらからの発現のためのプラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクションについては、Ｆｅｌｇｎｅｒら（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２５５０-２５６１を参照する。様々な感染性疾患に対するワクチン接種の簡単で有効な方法としてのプラスミドＤＮＡの直接注射については、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９：１７４５-４９、１９９３を参照する。またＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら、「Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｏｒ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ， ａｌｏｎｅ ｏｒ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ-２ ｄｉｓｅａｓｅ」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１４１４-１１４２０、１９９６年１０月も参照のこと。
１９８３年に、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ １）がＡＩＤＳの原因物質として同定され、その後レトロウイルス科のレンチウイルス亜科に分類された（Ｈａｒｄｙ、１９９０）。レンチウイルス亜科の他の成員は、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびＨＩＶ-２である。医学ウイルス学の分野では、ＨＩＶの感染によって引き起こされる汎流行性のＡＩＤＳに多大の関心が注がれてきた。このレンチウイルス系は、安全で有効なワクチンと抗ウイルス療法を開発するための努力の一貫として、その分子生物学、免疫生物学および病因に関して詳細に検討されてきた。現在まで、ＨＩＶならびに種々のワクチン型を用いた他のレンチウイルスワクチン試験は様々な度合の成功を収めてきた（Ｈｅｅｎｅｙら、１９９４；Ｄａｎｉｅｌら、１９９２；Ｆｕｌｔｚら、１９９２；Ｇｉｒａｒｄら、１９９１；Ｉｓｓｅｌら、１９９２）。さらに、ヒトでのワクチンの効果に関する特異的ＨＩＶ免疫応答の関連性については、まだ知識が欠如している。それ故、長年を経たあとも、多大の世界的な努力にもかかわらず、有効なＨＩＶ１ワクチンはまだ得られていない。
ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）によるネコの感染は、持続感染と、ＨＩＶ感染に類似したＡＩＤＳ様の免疫抑制性疾患を引き起こす。ネコのＦＩＶ感染は、それ自体で、レンチウイルスの免疫病原性とワクチン開発を検討するためのモデルを提供する（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８７；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４）。ＨＩＶと同様に、異質性が存在し、それ故多数のＦＩＶ亜型が存在する（Ｓａｄｏｒａら、１９９４；Ｏｋａｄａら、１９９４）。実際に、ＨＩＶのように、ＦＩＶ株は主としてｅｎｖ、そしてより小さな度合でｇａｇコード領域における遺伝的差異に基づいて、４つの亜型（Ａ-Ｄ）に分類されてきた。
それ故、完全な不活性化ＦＩＶワクチンと不活性化ＦＩＶ感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）は相同なＦＩＶとわずかに非相同なＦＩＶに対する防御を得たが（Ｈｏｓｉｅら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３）、これらの同じワクチンは他の亜型の明白に非相同なＦＩＶ株に対しては防御免疫を誘発することができなかったため、広い範囲のＦＩＶ亜型に対する防御免疫の誘発は、修正されたあるいは異なるワクチンアプローチを必要とすると考えられる。このことは明らかにワクチン開発に関する懸念を提起する。また、ネコ個体群におけるＦＩＶの罹患率がヒトにおけるＨＩＶ罹患率より高いことにも留意しなければならない（Ｖｅｒｓｃｈｏｏｒら、１９９６）。ＦＩＶワクチンあるいは免疫原性組成の開発は、ＨＩＶワクチンあるいは免疫原性組成のためのモデルを提供する上で有用であるのみならず、獣医学的保健衛生の将来という観点からも重要である。
特に、これまでのＦＩＶ試験から（Ｈｏｓｉｅら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４；Ｙｍａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３）、有意のＦＩＶ Ｅｎｖ特異的血清反応性を持つネコだけが同種攻撃誘発暴露に対して防御される可能性が高いことが認められた。そのような反応を欠如しているワクチン投与動物では、ＦＩＶ攻撃誘発に対する防御は認められなかった（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３）。同時に、これらの結果を、現在までの、サブユニット免疫原は標的種における防御免疫応答の誘発を示さなかったという所見と合わせて考えられると、ＦＩＶおよびレンチウイルスについての技術水準、一般的なワクチン開発に関連した最前線のいくつかの重要な点が提起される。ひとつの例外はおそらくサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）／マカク系に関するものであり、この系では、一部の組換え型サブユニット製剤（ワクシニアベースの組換え型を含む）あるいはこれらの組換え型サブユニットの組合せが、ＳＩＶ攻撃誘発暴露からの少なくとも部分的な防御をもたらした（Ｈｕ、１９９２；１９９４；１９９５）。感染からの完全な防御は認められておらず、攻撃誘発試験は明白に非相同なＳＩＶ株に関して実施されたものではなかったので、このデータはいくぶん範囲が限定されている。さらに、ＳＩＶ Ｅｎｖ成分を持たない組換え型サブユニットによっては、いかなるレベルの防御ももたらされなかった（Ｈｕら、１９９４）。
ＦＩＶワクチン開発に関して、サブユニットベースの候補ワクチンは全く教示あるいは提案されてこなかった；いかにしてサブユニットワクチンを開発するかについての教示は全くない；またどのようにしてサブユニットベースのワクチン候補を開発するかに関しても明らかではない。
第二に、非相同株に対する防御を与えるためには、不活性化された従来のワクチンと比較して、異なるあるいはおそらく修正されたアプローチが開発される必要がある（Ｈｏｓｉｅら、１９９５；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４）。
最後に、保護免疫におけるＥｎｖ特異的免疫応答は重要であると考えられる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９４；Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３）。実際に、Ｆｌｙｎｎらの「ＥＴＶ特異的ＣＴＬは、ワクチン接種によってネコ免疫不全ウイルス感染から防御されるネコにおいて優勢である」Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９６，１５７；３６５８-３６６５において、３６６４ページで著者は、「ＦＩＶ Ｅｎｖ特異的ＣＴＬはペットのネコのＦＩＶ感染に対する防御免疫においてより有効と考えられる」ので、「今後のワクチン戦略は、長命で、ウイルスエンベロープの糖蛋白上の適切なエピトープを認識し、ウイルスを隔離することが知られている組織を標的する、体液性と細胞媒介の両方の免疫反応を誘発することを目指すべきである」と結論している。
それ故、宿主に投与したときネコ免疫不全ウイルス感染に対して免疫応答を誘発する、ネコ免疫不全ウイルス組換え型サブユニットの免疫原性、免疫学的あるいはワクチン組成、たとえばＦＩＶ、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、あるいはＰｏｌのＦＩＶエピトープのような対象となるＦＩＶエピトープをコードする外因性ＤＮＡを、特に免疫原性形態で、あるいはそれらの組合せで、たとえばＦＩＶ Ｇａｇ-プロテアーゼ、Ｇａｇ-Ｐｏｌ、あるいはＧａｇとＰｏｌの一部（プロテアーゼを含むＰｏｌの部分のような）あるいはＥｎｖ、ＧａｇとＰｏｌの全部またはＰｏｌの一部の組合せで含む、ＮＹＶＡＣあるいはＡＬＶＡＣベースの組換え型のような高い安全性を有する組成を提供することは、現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろうと評価できる。さらに、プライム-ブースト処方において、たとえば当該組換え型組成を初回免疫において使用し、その後の免疫を不活性化ＦＩＶ、ＩＣＶ、あるいは他の組換え型サブユニット製剤で行う場合、そのような組換え型あるいはそのような組換え型を含む組成の使用は現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろう。
より一般的には、宿主に投与したときレンチウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス感染に対する免疫応答を誘発する、レンチウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス組換え型サブユニットの免疫原性、免疫学的あるいはワクチン組成、たとえばＥｎｖ、Ｇａｇ、あるいはＰｏｌのような対象となるレンチウイルス、レトロウイルス、あるいは免疫不全ウイルスエピトープをコードする外因性ＤＮＡを、特に免疫原性形態で、あるいはそれらの組合せで、たとえばＧａｇ-プロテアーゼ、Ｇａｇ-Ｐｏｌ、あるいはＧａｇとＰｏｌの一部（プロテアーゼを含む部分のような）あるいはＥｎｖ、Ｇａｇの全部とＰｏｌまたはＰｏｌの一部を、Ｅｎｖ、Ｇａｇ-プロテアーゼの組合せで含む、ＮＹＶＡＣあるいはＡＬＶＡＣベースの組換え型のような高い安全性を有する組成を提供することは、現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろうと評価できる。さらに、プライム-ブースト処方において、たとえば当該組換え型組成を初回免疫において使用し、その後の免疫を不活性化レンチウイルス、レトロウイルスあるいは免疫不全ウイルス、あるいはＩＣＶ、あるいは各々の不活性化ウイルス、ＩＣＶまたは他の組換え型サブユニット製剤のような他の組換え型サブユニット製剤で行う場合、そのような組換え型あるいはそのような組換え型を含む組成の使用は現在のテクノロジー水準に比べて極めて望ましい進歩になるであろう（「各々の」に関しては、組換え型がたとえばＦＩＶ組換え型であれば、不活性化ＦＩＶあるいはＦＩＶ ＩＣＶ製剤が「各々の」になるであろう）。
発明の目的および要旨
従って、本発明の目的は、レンチウイルス、レトロウイルスおよび／または免疫不全症ウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＥＩＡＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶ）、ビスナウイルス、ヤギ関節炎−脳脊髄炎ウイルスに由来する特定の産物を提供することである。この産物は、目的の特定のエピトープを含み、好ましくはＥｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌまたはそれらに関するエピトープを、必要に応じて、それらに対する目的の補助的機能体またはタンパク質またはエピトープ（例えば、Ｔａｔおよび／またはＲｅｖ）を伴って含む。より好ましくは、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌの一部分、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの一部分である（特に、そのような部分はプロテアーゼを含む）。最も好ましくは、Ｇａｇおよびプロテアーゼ、またはＥｎｖ、Ｇａｇおよびプロテアーゼ、またはそれらに関するエピトープで、必要に応じて、補助的な機能体またはタンパク質（例えば、Ｔａｔおよび／またはＲｅｖまたは他のそのような機能体／タンパク質、またはそれらに関するエピトープ）を伴うものである。目的の産物またはエピトープに含むことができる他の補助的な機能体またはタンパク質として、ｎｅｔ、ｖｐｕ、ｖｉｔ、ｖｐｒおよびｖｐｘ、またはそれらに関するエピトープのいずれかまたはすべてが挙げられる（特に、Ｔｒｏｎｏ，Ｄ、Ｃｅｌｌ、８２：１８９−１９２、Ｊｕｌｙ ２８、１９９５を参照のこと）。そのような補助的な機能体またはタンパク質は、非エンベロープ性の機能体またはタンパク質と考えることができる。これらは、例えば、細胞性応答の誘導に関して、目的の産物またはエピトープに含めることができる。例えば、特定のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの病原体については、そのような病原体の補助的な機能体またはタンパク質またはそれらに関するエピトープは含まれ得る：従って、例えば、産物には、Ｇａｇ−Ｐｒｏおよび補助的な機能体またはタンパク質またはそれに関するエピトープを含むことができる。
本発明のさらなる目的は、特定の核酸分子を提供することである。このような核酸分子は、例えば、産物をコードするＲＮＡ、ＤＮＡであり、例えば、目的の特定のエピトープ（ＧａｇおよびプロテアーゼあるいはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌのすべてなど）をコードするＲＮＡ、ＤＮＡである。
本発明のさらなる目的は、ベクター（好ましくは、哺乳動物のベクター系）を提供することである。このようなベクターは核酸分子を含み、そして好ましくは、産物を以下のベクターに対する外因性として発現する：例えば、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バール、アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスまたはＤＮＡベクター系。
本発明のさらなる目的は、前記のベクターによる発現から得られるか、または得ることができる産物を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、前記のベクターおよび／または前記の産物を含む免疫学的な免疫原性および／またはワクチン組成物を提供することである。
本発明のなお別の目的は、前記の産物を調製するための方法を提供することである。
本発明のなお別の目的は、前記のベクターを調製するための方法を提供することである。
本発明のなおさらなる目的は、前記の組成物を調製するための方法を提供することである。
そして、本発明のさらなる目的は、前記の産物、ベクターおよび組成物を使用するための方法を提供することである。この方法は、免疫化療法などによる免疫学的応答を得るための方法を含む。そのような免疫化療法において、前記の産物、ベクターおよび／または組成物は、単独で、あるいは不活性化されたレンチウイルス、レトロウイルスまたは組換えサブユニット調製物による初期／追加免疫形状で投与される：例えば、不活性化した感染細胞ワクチンまたは免疫学的または免疫原性の組成物（ＩＣＶ）（個々のＩＣＶなど）による初期／追加免疫形状で投与される。
従って、本発明は、組換えの免疫学的な免疫原性またはワクチン組成物、および標的種においてレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの抗原暴露から保護することなどにより応答を増強させることにおけるそれらの利用に関する。
より具体的には、本発明は、応答（レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスに対する保護的な免疫応答など）を増強するための安全な免疫化ビヒクルとして使用するための外来遺伝子の挿入および発現に必要な哺乳動物ベクター系に関する。
従って、本明細書中の目的によれば、本発明は、哺乳動物ベクター系に関する。このベクター系は、以下のウイルスの遺伝子産物（例えば、目的のエピトープを含む遺伝子産物）を発現する：レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶなど：ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）が現在のところ好ましい）。本発明は、免疫原性および／または免疫学的および／またはワクチンの組成物に関する。このような組成物は、以下のウイルスの暴露に対する免疫学的および／または保護的な応答を、標的宿主（例えば、ＦＩＶおよびネコ（飼いネコまたは子ネコ））に投与したときに誘導する：レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶなど）。
さらなる本明細書中の目的でのある局面において、本発明は、以下の哺乳動物ベクターを含む（例えば、ポックスウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バール、アルファウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスまたはＤＮＡベクター系；好ましくは、ポックスウイルス）。このような哺乳動物ベクターは、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくはＦＩＶ）の目的エピトープを発現する。目的のエピトープは、好ましくは、Ｇａｇ／プロテアーゼである。ベクターは、高度に相同的な抗原の暴露に対する標的種（例えば、ネコ）の保護において有用である。従って、本発明は、ベクターおよび必要に応じて受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む免疫学的な免疫原性またはワクチン組成物を包含する。
本明細書中の目的による別の局面において、本発明は、免疫学的応答（好ましくは、保護的な応答）を誘導するための方法を含む。この方法は、ベクターまたはベクターを含む組成物を宿主に投与することを含む。この方法は免疫化療法であり得る。この免疫化療法は、例えば、ベクターまたはベクターを含む組成物により最初に行われ（そして、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＦＩＶ）の目的エピトープの遺伝子産物を発現する）、そして個々のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスのサブユニット調製物（例えば、ＦＩＶの不活性化全細胞（ＩＣＶ）調製物）を用いるか、または個々のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの組換えサブユニット調製物（例えば、そのようなものをコードする外因性の核酸分子を含有する組換え体の発現からからそのようもの単離することから得られるＦＩＶの目的エピトープ）を用いて追加免疫して、同種および異種のレンチウイルス・レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス集団から宿主（例えば、ネコ）を保護するなどの免疫学的応答を増強する。
本発明のさらなる目的は、公知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して、安全性のレベルが増大している組換えポックスウイルスの抗原、ワクチンまたは免疫学的組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、宿主において遺伝子産物を発現するために改変されたベクターを提供することである。この場合、このベクターは、宿主における毒力が低減されるように改変される。
本発明の別の目的は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養される細胞内で遺伝子産物を発現するための方法を提供することである。この方法は、安全性のレベルが増大している改変された組換えウイルスまたは改変されたベクターを使用する。
本発明のこれらの目的および利点および他の目的および利点は、以下を考察した後ではより容易に明らかになる。
さらなる局面において、本発明はベクターに関する。好ましくは、不活性化されたウイルスコードの遺伝子的機能を有する改変された組換えウイルスに関し、その結果組換えウイルスは、弱毒化されて安全性が増強される。この機能は、本質的ではあり得ないか、または毒力（例えば、本質的）と結合し得る。ウイルスはポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス（鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなど）が好都合である。好ましくは改変された組換えウイルスであるベクターは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、異種のＤＮＡ配列を含むことができる。この異種ＤＮＡ配列は、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に由来する抗原またはエピトープ（例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）または以下のようなそれらの任意の組合せをコードする：Ｇａｇ−ＰｏｌまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびＰｏｌまたはＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖの一部、ＧａｇおよびＰｏｌの一部（プロテアーゼ、またはＧａｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼを含むＰｏｌの一部など）など。
別の局面において、本発明は、抗原性で免疫学的、免疫原性またはワクチンの組成物、あるいは抗原性または免疫学的または保護的な応答を、該組成物が接種された宿主動物（ネコ（例えば、飼いネコまたは子ネコ）など）において誘導するための治療組成物に関する。この組成物は、キャリアおよび考案されたベクター（好ましくは、不活性化された非必須ウイルスコードの遺伝子的機能を有する改変された組換えウイルスであり、その結果組換えウイルスは弱毒化されて安全性が増強される）、あるいはそのようなベクターまたは改変された組換えウイルスの発現産物を含むことができる。本発明による組成物（または組成物において使用される産物を発現するための）ウイルスは、ポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス（鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなど）が好都合である。改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、抗原性タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列を含むことができる。このようなタンパク質は、例えばレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に由来する目的エピトープ（抗原など、例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、プロテアーゼ、またはそれらの任意の組合せ（Ｇａｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼなど））である。
なお別の局面において、本発明は、抗原性の免疫学的、免疫原性、ワクチン（保護的）および／または治療的応答を、宿主動物（ネコ（飼いネコまたは子ネコ）など）で、例えばそのような応答を必要とする宿主動物において誘導するための方法に関する。この方法は、応答を得るために効果的な量の本発明の上記組成物を、単独で、あるいは初期−追加免疫療法（例えば、本発明の組成物を投与するか、あるいは不活性化されたレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスまたはＩＣＶまたはＩＷＶのいずれかまたは両方を、本発明の組成物を投与する前またはその後のいずれかで投与する療法）の一部としてのいずれかで投与することを含む。
さらなる局面において、本発明は、本発明のベクター（弱毒化されて安全性が増強されている改変された組換えウイルスなど）を細胞に導入することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞内で遺伝子産物を発現するための方法に関する。ベクターまたは改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、抗原タンパク質などの目的のエピトープをコードする異種のＤＮＡ配列を含むことができる。このような抗原タンパク質は、例えば、レトロウイルス、レンチウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に由来し、例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）、または以下のようなそれらの任意の組合せなどである：Ｇａｇ−Ｐｏｌ、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖの一部、ＧａｇまたはＰｏｌの一部分（この場合、その部分は、プロテアーゼ、またはＧａｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼを含むことができる）。遺伝子産物は細胞から集めることができる。あるいは、次いで細胞を動物に直接、再注入することができ、あるいは細胞は、再注入に必要な特異的な反応性を増幅するために使用することができる（エクスビボ治療）。
従って、特定のさらなる局面において、本発明は、ベクター、好ましくは弱毒化されて安全性が増強されている改変された組換えウイルスを細胞に導入することによってｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された細胞内で遺伝子産物を発現するための方法に関する。ベクターまたは改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に、目的のエピトープまたは抗原タンパク質をコードする異種のＤＮＡ配列を含むことができる。このような抗原タンパク質は、例えば、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくはネコ免疫不全症ウイルス）に由来し、例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）、または以下のようなそれらの任意の組合せなどである：Ｇａｇ−Ｐｏｌ、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌの一部分、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌの一部分、この場合、その部分は、プロテアーゼ、またはＧａｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼを含むことができる。次いで、産物を宿主に投与して、応答を刺激することができる。
抗体は、本発明のベクターまたは組換え体あるいは本発明のベクターまたは組換え体の発現産物を含む組成物により惹起させることができる。惹起された抗体は、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（ネコ免疫不全症ウイルスなど）を予防または処置するために宿主において有用であり得る。抗体あるいは本発明のベクターまたは組換え体の発現産物は、診断キット、アッセイまたは試験において有用であり、サンプル（血清など）におけるレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ネコ免疫不全症ウイルス）、あるいはそれらの抗原、あるいはそれらに対する抗体、あるいは本発明の組換え体の抗原または抗体の存在または非存在を決定することができる。従って、本発明の一局面は、そのような抗体、診断キット、アッセイまたは試験を含む。
さらにさらなる局面において、本発明は、改変された組換えウイルスに関する。このウイルスは、非必須または必須のウイルスコードの遺伝子的機能がその中で不活性化され、その結果ウイルスは弱毒化される。この改変された組換えウイルスは、ウイルスゲノムの必須領域内または非必須領域内に異種起源に由来するＤＮＡをさらに含有する。ＤＮＡは、レンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルス（例えば、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ；好ましくは、ネコ免疫不全症ウイルス）の以下のような目的の抗原またはエピトープをコードすることができる：例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、補助的機能体、または以下のようなそれらの任意の組合せ（Ｇａｇ−Ｐｏｌ、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖの一部分、ＧａｇおよびＰｏｌの一部分：この場合、Ｐｏｌの部分は、プロテアーゼ、またはＧａｇ−プロテアーゼまたはＥｎｖ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼを含むことができる）。特に、遺伝子的機能は、ビルエンス因子（例えば、必須領域）をコードするオープンリーデングフレームの欠失または破壊によって、あるいは天然の宿主制限ウイルス（特に、連続的な継代物および／またはプラーク精製（その後の継代を伴うか伴わない）であることから弱毒化を呈する天然の宿主制限ウイルス）の利用によって不活性化される。本発明に従って使用されるウイルスは、ポックスウイルスが好都合であり、特にワクシニアウイルスまたはアビポックスウイルス（鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルスなど）が好都合である。
好都合なことには、オープンリーデングフレームは、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７Ｌ−Ｋ１ＬおよびＩ４Ｌ（Ｇｏｅｂｅｌら．、１９９０ａ、ｂに報告される用語による）、それらの任意の組合せからなる群から、好ましくはそれらの任意の組合せからなる群から選択される。この点に関して、オープンリーデングフレームは、チミジンキナーゼ遺伝子領域、出血領域領域、Ａ型封入体領域領域、血球凝集素遺伝子領域、宿主域遺伝子領域またはラージサブユニット、リボヌクオチドレダクターゼ；またはそれらの任意の組合せを含む：好ましくは、それらの任意の組合せである。ワクシニアウイルスの改変されたＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ株が、ＮＹＶＡＣとして同定された（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２）。ＮＹＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ変異株は、必須領域がその中で欠失または破壊されている。Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２のその後の刊行物に関して、それは、Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２と同様に、ワクシニアウイルスの必須領域の欠失に関する（従って、ＮＹＶＡＣ、ＮＹＶＡＣ変異株、あるいはＴａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９９２のウイルス（例えば、ＮＹＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ変異株）により教示されるかまたはそれから明らかな変異株に関する）：例えば、ＮＹＶＡＣ．１、ＮＹＶＡＣ．２。ＰＣＴ ＷＯ ９５／３００１８を参照のこと。ＮＹＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ変異株に関しては、米国特許第５，３６４，７７３号および同第５，４９４，８０７号もまた参照のこと。しかし、他のワクシニアウイルス株（ＣＯＰＡＫ株など）もまた、本発明の実施において使用することができる。
別の好ましい実施態様において、ベクターは、弱毒化されたカナリアポックスウイルス（混合集団でないカナリアポックスウイルスなど）である。例えば、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒワクチン株は、ニワトリ胚線維芽細胞での２００代を超える連続的な継代により弱毒化され、それから得られる元となる種株は、寒天下の４回の連続したプラーク精製を行い、そこからプラーククローンをさらに５回の継代により増幅した。そのようなカナリアポックスウイルスはＡＬＶＡＣと呼ばれる。
カナポックスから得られるプラークの制限消化の結果は、以下の通りである。ゲノムＤＮＡを、カナリアポックスウイルス（カナポックス）のクローン化されたプラーク単離物１，４および５から単離した。これらのプラークから得られたＤＮＡおよびクローン化していないカナリアポックスウイルスから得られたＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、０．８％アガロースゲルで流した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＵＶ光線下で写真撮影を行った（図１を参照のこと）。レーンに印を付ける：ｖ＝非クローン化カナリアポックスウイルス、１＝プラーク１、４＝プラーク４、および５＝プラーク４。１ｋｂの分子量マーカーを左端のレーンで流した。制限プロフィールは、種々のプラーク単離物の間に明らかな違いを示す。プラーク１を、ＡＬＶＡＣ（ＣＰ_PP）として選んだ。
非クローン化カナリアポックスウイルスの制限消化パターン（レーン＝ｖ）において、いくつかのサブモーラーバンドを認めることができる。しかし、クローン化されたプラークの場合、これらのサブモーラーバンド（レーン：１、４および５）は、少なくともプラーククローン化された単離体のいくつかではモーラー試料になる。このことは、非クローン化のカナリアポックスウイルス（カナポックス）が、制限プロフィールが異なるゲノム変異体の混合物であることを示す。
従って、ＡＬＶＡＣはカナポックスと異なり、カナポックス以上に特徴的な特性を有し、カナポックスより優れている。従って、ＡＬＶＡＣは、本発明の実施における好ましいベクターである。特に、Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株のカナリアポックスウイルス（カナポックス）は、制限分析からウイルス変異体の混合物であることを示す。すなわち、ＡＬＶＡＣが誘導されたカナポックスは混合集団であった。カナポックスなどのワクチン調製物が複数の変異体を含有することは、今回初めてのことではない。ＡＬＶＡＣは混合集団ではない。従って、ＡＬＶＡＣは、カナポックスが有さないいくつかの特徴的な特性を有する。例えば、以下の通りである。
ＡＬＶＡＣは、均一的な遺伝子背景を有する。この特性により、矛盾しない（一致した）ＡＬＶＡＣが得られる：ベクターに基づくワクチンを調製するために有用であるという独特の特徴。一致していることは、品質問題および定期的な検討に関して有用である。ＡＬＶＡＣの一致しているというこの特性により、品質管理および定期的な検討に合格する能力を有するＡＬＶＡＣが得られ、すなわち、予想される遺伝子的特性を有するベクターに基づくワクチンの開発において有用である。
生物学的一致性は、組換え体を得るためにＡＬＶＡＣを使用して調節される。カナポックスは、生物学的一致性を与えない。実際、カナポックスは、効果的な組換え産物を矛盾することなく提供することができない。生物学的一致性および一致した効果的な組換え産物は有用である：例えば、毒力に関して、ウイルス／宿主の相互作用に関して一致した生物学的プロフィールについて、および究極的には免疫化ビヒクルとしての使用について。ＡＬＶＡＣは、生物学的一致性および一致した効果的な組換え産物を達成する。カナポックスを組換え体誘導において使用する場合、外来遺伝子が導入されるウイルス背景に関するコントロールがない。従って、得られる組換え体の特性は疑わしいままである（すべてのワクシニアの遺伝子的背景は必ずしも免疫化ビヒクルとして等価でないことを明らかにするワクシニアウイルスによる研究と比較すること）。ＡＬＶＡＣは、そのウイルス背景、毒力に関連するその特性、および免疫化ビヒクルとしてのその機能性に関して確実性を提供する。
本発明を、主として、カナリアポックスウイルス（ＡＬＶＡＣ）に基づくベクターを使用して説明してきたが、発明はまた、本明細書中において、特定のレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全症ウイルスの遺伝子産物の発現、および免疫応答（保護的な免疫応答など）を与えるためのそれらを利用することに権利を有することを理解しなければならない。それ故、本発明はまた、代替的な哺乳動物ベクター系に関する。そのようなベクター系の例には、他のポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルスに基づく系、細菌発現系、およびＤＮＡに基づく免疫原処方物が含まれる。
本発明を、主として、レンチウイルスのＦＩＶを使用して説明してきたが、本発明はまた、本明細書中において、他のレンチウイルスおよびレトロウイルスおよび免疫不全症ウイルスの系に由来するＦＩＶ遺伝子産物の機能的ホモログの発現に権利を有することを理解しなければならない：例えば、Ｅｎｖ、Ｇａｇ／プロテアーゼ（すなわち、Ｅｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌまたはＰｏｌの一部分、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＰｏｌの一部分：この場合、Ｐｏｌの部分は以下のものをを含むことができる；プロテアーゼ（Ｅｎｖを有しない）、またはＥｎｖ、Ｇａｇ、プロテアーゼまたはＧａｇ−プロテアーゼ（Ｅｎｖを有しない）またはＥｎｖ、Ｇａｇ、ＰｏｌまたはＰｏｌの一部分および補助的機能体（例えば、Ｔａｔ、Ｒｅｖ）またはＧａｇ、ＰｏｌまたはＰｏｌの一部分（この場合、Ｐｏｌの部分は、プロテアーゼおよび補助的な機能体（Ｅｎｖを有しない）またはＥｎｖ、Ｇａｇプロテアーゼおよび補助的な機能体またはＧａｇ−プロテアーゼおよび補助的な機能体（Ｅｎｖを有しない）を含むことができる）；特に、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶのものである）。それ故、本発明は他のレンチウイルス系に関し、これには、ヒト免疫不全症ウイルス−１、−２（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）、ウシ免疫不全症ウイルス（ＢＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ならびに他の哺乳動物のレンチウイルスが含まれる。
これらの実施態様および他の実施態様は開示される、あるいは以下の詳細な説明から明らかであり、そしてそれにより包含される。
寄託
以下のものは、ブタペスト条約の条件下でＡＴＣＣに寄託されている。

従って、本発明は核酸分子を包含する。これには、寄託された物質内の配列を有するコード産物、ならびにそれらに実質的な（例えば、少なくと８５％の相同性で）相同性を有する核酸分子が含まれる。
【図面の簡単な説明】
実施例の方法によって示されるが、記述される実施態様にのみ本発明を限定することが意図されない以下の詳細な説明は、ここに参照して組込まれる付随の図面と関連して理解するのが最もよい。ここで、
図１は、上に記述のとおりプラーク精製カナポックスの結果を示す。
図２は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから得たＦＩＶ ｅｎｖのヌクレオチド配列（配列番号：１）（ＦＩＶ ｅｎｖ開始コドンは、位置１にあり、そして停止コドンは位置２５６９にある。ＦＩＶ ｅｎｖのコーディング配列を含有するプラスミドｐｔｇ６１８４は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ（フランス国、リオン（Lyon、France）から得た。ｐｔｇ６１８４にあるＦＩＶ ｅｎｖコーディング配列を、シーケンシングし、そして以下の配列を示す以下の差異を観察した。位置１２１８Ｔは、ｐｈｅをｌｅｕに変えるｐｔｇ６１８４にあるＧである；位置１２２０ＧからＡを、ｇｌｙからｇｌｕに変え；そして位置２２０１ＣからＡは、ａｌａからｇｌｕに変わる。）を示す。
図３は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから得たＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列のヌクレオチド配列（配列番号：２）（ｇａｇ開始コドンは、位置１にあり、そしてｇａｇ停止コドンは、位置１４１４にある。リボソーム枠シフト部位は、位置１２５５の近くにある。枠シフトは、ｇａｇ開放読取枠に対して−１である。枠シフトは、ｐｏｌ開放読取枠に加わる。ｐｏｌ開始コドンは、位置４６１４にある。Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから得たプラスミドｐｔｇ８１３３は、ＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコーディング配列を含有する。ｐｔｇ８１３３の一部をシーケンシングした。そして以下の位置５７７−５７８にあるＣＧは、ｐｔｇ８１３３中のＧＣであり、ａｒｇからａｌａまでのコドンを変化する。）を示す。
図4は、Ｃ６供与プラスミドｐＣ６Ｌ（配列番号：３）（プラスミドｐＣ６Ｌは、Ｃ６挿入部位ＳｍａＩ（位置４０９）およびＥｃｏＲＩ（位置４２５）を含有する）に含まれるＡＬＶＡＣ−ヌクレオチド配列を示す。
図５は、ｖＣＰ２４２挿入の推定ヌクレオチド配列（配列番号：４）（Ｈ６プロモーターは、位置５５で開始する。ＦＩＶｅｎｖ開始コドンは、位置１７９にあり、そしてＦＩＶｅｎｖ停止コドンは、位置２７４９にある。位置１から５４および位置２７５０から２８７９は、Ｈ６／ＦＩＶｅｎｖ発現カセットの両端を挟む）を示す。
図６は、ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カセットを促進し、ｖＣＰ２５３にある領域（配列番号：５）を挟むＩ３Ｌの推定ヌクレオチド配列（Ｉ３Ｌプロモーターは、位置１３５で始まる。ｇａｇ開始コドンは、位置２３５にあり、そしてプロテアーゼ停止コドンは、位置１６４８にある）を示す。
図７は、ＦＩＶｅｎｖ／Ｉ３Ｌ促進ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カセットを促進し、そしてｖＣＰ２５５にある領域（配列番号：６）を挟むＨ６の推定ヌクレオチド配列（Ｈ６プロモーターは、位置１２９で開始し、ＦＩＶｅｎｖ開始コドンは、位置２５３にあり、そしてＦＩＶｅｎｖ停止コドンは、位置２８２３にある。Ｉ３Ｌプロモーターは、位置２８３０で開始し、ＦＩＶｇａｇ開始コドンは、位置２９３０あり、そしてＦＩＶｇａｇ停止コドンは、位置４２８２にある。リボソーム枠シフト部位は、位置４１８４の近くにある。枠シフトは、ｇａｇ開放読取枠に対して−１である。枠シフトは、ｐｏｌ開放読取枠に加わる。プロテアーゼ遺伝子のための停止コドンは、位置４６４１にある。位置１から１２８および位置４６４２から４７２７は、Ｈ６ＦＩＶｅｎｖ／Ｉ３Ｌ ＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カセットを挟む）を示す。
図８は、ｖＣＰ３２９挿入物の推定ヌクレオチド配列（配列番号：７）（H6プロモーターは、位置２１４６で開始する。ＦＩＶ９７ＴＭについてのコーディング配列は、位置２０２２から位置４２である。Ｉ３Ｌプロモーターは、位置２２５３で開始する。ＦＩＶｇａｇ開始コドンは、位置２３５３あり、そしてｐｏｌ停止コドンは、位置３７６６にある。）を示す。
発明の詳細な説明
上で述べられているとおり、本発明は、好ましいポックスウイルスベクターとしてＴＲＯＶＡＣ、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣは、最も好まれ、そしてＡＬＶＡＣは、特に好ましい）のような弱毒化ポックスウイルスと共に、ベクター基礎のレンチウイルス、レトロウイルス、または免疫欠損ウイルス、例えばＥＩＡＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶまたはＳＩＶ、好ましくはネコの免疫欠損ウイルス（ＦＩＶ）組換え体、好ましくは目的のエピトープ（類）をコードするＤＮＡを含有する組換え体、さらに好ましくはＥｎｖ、ＧａｇまたはＰｏｌ、またはＧａｇおよびＰｏｌまたはＰｏｌの一部、またはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌ、またはＰｏｌまたはＧａｇの一部およびプロテアーゼ、またはＥｖｎ、Ｇａｇ、およびプロテアーゼのようなそれらの組合せ；そして発明の組換え体およびそれらの発現産物を含有する組成物；および発明の組換え体、それらの発現産物、およびその組換え体および／または発現産物を含有する組成物を製造する方法および使用する方法に関する。
したがって、一般的方法で、本発明は、少なくとも1種のレンチウイルス・エピトープをコードする外因性ＤＮＡを包含するベクターを提供する。エピトープは、ＳＩＶ以外のレンチウイルスから得ることができる。さらに好ましくは、エピトープは、ＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌまたはＥｎｖ、ＧａｇおよびＰｏｌまたはＧａｇの一部およびＰｏｌまたはＧａｇ−プロテアーゼの一部、またはＥｎｖ、Ｇａｇおよびプロテアーゼのもの；そして最も好ましくは、エピトープは、Ｇａｇ上のＧａｇおよびプロテアーゼまたはエピトープ（類）、およびＧａｇおよびプロテアーゼと同じかまたは類似する反応を引出すＧａｇおよびプロテアーゼである。そして、標的種（標的種は、テンチウイルスにに罹りやすい宿主であり、例えば、家ネコおよび小ネコのようなネコは、ＦＩＶに対する標的種である）に投与した場合、ベクターは、好ましくは免疫反応を、さらに好ましくは保護的免疫反応を導入する。
ベクターまたは組換え体を造る方法は、米国特許第４，６０３，１１２号、４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第５，５０３，８３４号、第４，７２２，８４８号、第５，５１４，３７５号、英国特許ＧＢ２ ２６９ ８２０ Ｂ、国際公開ＷＯ９２／２２６４１号、国際公開ＷＯ９３／０３１４５号、国際公開ＷＯ９４／１６７１６号、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０６６５２号、Ｐａｏｌｅｔｔｉの「ポックスベクターをワクチン化する使用法」の１９９４年１月１９日に出願された特許が付与された米国特許出願番号第０８／１８４，００９号；Ｍｏｓｓの「組換え体遺伝子発現、ワクチン化および安全性についての遺伝子操作されたポックスウイルス；現状」のＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：１１３４９−１１３５３、１９９６年１０月、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｃ．Ｄ．（編集者）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３９、１９９６年１０月のＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３４１−１１３４８；「バキュロウイルス発現プロトコール」（１９９５年、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、Ｓｍｉｔｈら、「バキュロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞でのヒト・ベータインターフェロンの生成」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻、１２号、２１５６−２１６５頁、１９８３年１２月；Ｐｅｎｎｏｃｋら、「バキュロウイルスベクターに感染した細胞でのエッシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のＢ−ガラクトシダーゼの強力なそして制御された発現」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４巻、３号、３９９−４０６頁、１９８４年３月；欧州特許ＥＰＡ ０ ３７ ０ ５７３号、１９８６年１０月１６日に出願された米国特許出願番号第９２０，１９７号、欧州特許公報番号第２６５７８５号、米国特許第４，７６９，３３１号、Ｒｏｉｚｍａｎの「単純ヘルペスウイルス遺伝子の機能：新規ベクターの遺伝子操作のためのプライマー」、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１３０７−１１３１２、１９９６年１０月；Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、「実験的な脳腫瘍の治療への遺伝子操作された単純ヘルペスウイルスの使用法」ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：１１３１３−１１３１８頁、１９９６年１０月；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、「Ｂリンパ球への遺伝子送出のためのエプスタイン−バール・ウイルスベクター」ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：１１３３４−１１３４０頁、１９９６年１０月；Ｆｒｏｌｏｖら、「アルファウイルス基礎の発現ベクター：攻略法および使用法」ＰＮＡＳ ＵＳＡ９３：１１３７１−１１３７７頁、１９９６年１０月；Ｋｉｔｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５巻、３０６８−３０７５頁、１９９１年；Ｇｒｕｈａｕｓら、１９９２、「クローニングベクターとしてのアデノウイルス」Ｓｅｍｉａｒｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（３巻）、２３７−５２頁、１９９３年、Ｂａｌｌａｙら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、４巻、３８６１−６５頁、Ｇｒａｈａｍ、Ｔｉｂｔｅｃｈ ８、８５−８７頁、１９９０年４月；Ｐｒｅｖｅｃら、Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ． ７０、４２９−４３４頁；１９９６年７月３日に出願された米国出願番号第０８／６７５，５５６号および第０８／６７５，５６６号；ＰＣＴのＷＯ９１／１１５２５号、Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻、２５５０−２５６１頁（１９９４年）：Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９頁：１７４６−４９頁、１９９３年、およびＭｃＣｌｅｍｅｎｔｓら、「単独でまたは組合せで糖タンパクＤまたは糖タンパクＢをコードするＤＮＡワクチンを用いた免疫化が、単純ヘルペス疾患の動物モデルでの保護的免疫性を誘導する」ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３：１１４１４−１１４２０、１９９６年１０月に開示される方法によるものであるか、またはそれに類似する。
ワクシニアウイルスおよびさらに最近の他のポックスウイルスが、外来遺伝子の挿入および発現のために使用された。外来遺伝子を生きた感染性ポックスウイルスに挿入する基本技術が、供与プラスミドでの外来遺伝子要素を隣接するポックスＤＮＡ配列と、奪取ポックスウイルスに存在する相同の配列との間の組換えに関与する（Ｐｉｃｃｉｎｉら、１９８７年）。
特に、組換え体ポックスウイルスは、当業界で知られ、そして米国特許第４，７６９，３３０号、第４，７７２，８４８号、第４，６０３，１１２号、第５，１１０，５８７号、第５，１７９，９９３号、第５，５０５，９４１号、および第５，４９４，８０７号に記述されたワクシニアウイルスおよびアビポックスウイルスのような合成組換え体のポックスウイルスを造る方法に類似する２つの段階で構築できる。これらの開示は、ここに引用される全ての文献の開示と同様に、参照してここに組込まれる。
第一に、ウイルスに挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列、例えばポックスウイルスのＤＮＡの区分に相同なＤＮＡが挿入された非ポックスウイルスから得た開放読取枠を、イー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミド構築物のようなプラスミド構築物に入れる。別に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列は、プロモーターにライゲートできた。プロモーター遺伝子連結は、プラスミド構築物に位置決めされ、その結果プロモーター遺伝子連結は、ポックスＤＮＡの領域を挟むＤＮＡ配列に相同なＤＮＡによって両方の末端で挟まれる。例えば、ポックスＤＮＡは、必須でない遺伝子座を含む（基礎的な遺伝子座も、使用できる）。その後、生じるプラスミド構築物を、例えば、イー．コリ細菌内での成長によって増幅し（Ｃｌｅｗｅｌｌ、１９７２年）、そして単離する（Ｃｌｅｗｅｌｌら、１９６９年；Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年）。代わりに、プロモーターと別のライゲーションなしのＤＮＡ遺伝子配列は、単にプラスミド構築物内に入れて、その結果ＤＮＡ遺伝子配列は、ポックスＤＮＡの領域を挟むＤＮＡ配列に相同なＤＮＡによって両方の末端に挟まれる；例えば、したがって、遺伝子配列の発現が、プロモーターの制御下であるような外因性プロモーターから下流の領域、およびＤＮＡ遺伝子配列のコーディング部分が隣接する。
第二に、挿入されるべきＤＮＡ遺伝子配列を含む単離プラスミドを、ポックスウイルスと一緒に、トリの胚フィブロブラストのような細胞培養物にトランスフェクトさせる。プラスミド中の相同のポックスＤＮＡと、ウイルスのゲノムとの間の組換えは、それぞれ、外来ＤＮＡ配列の、例えばそれのゲノムの必須でない領域での存在によって修飾されたポックスウイルスを付与する。語句「外来」ＤＮＡは、外因性ＤＮＡが入れられるゲノムによって元来生成されない遺伝子産物についてコードする外因性ＤＮＡ、特に非ポックス源から得たＤＮＡを意図する。
しかし、先述のものは、ベクターまたは組換え体、例えばポックスウイルス−レンチウイルス、レトロウイルスを得るためのあらゆる方法として、本発明のベクターまたは組換え体を得るための手段を限定することを意図せず、および／または免疫欠損ウイルス、例えばネコの免疫欠損ウイルス、組換え体は、本発明を得るのに使用できる。
したがって、遺伝的組換えは、一般に、２つのＤＮＡの株の間のＤＮＡの相同な画分の交換である。ある種のウイルスでは、ＲＮＡは、ＤＮＡを置換できる。核酸の相同の画分は、ヌクレオチド塩基の同一の配列を示す核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の画分である。
遺伝的組換えは、感染した宿主細胞内の新規ウイルスのゲノムの複製または製造のあいだに自然に生じうる。したがって、ウイルス遺伝子の間の遺伝的組換えは、２つまたはそれ以上の様々なウイルスまたは他の遺伝子構築物と同時感染される宿主細胞に起こるウイルスの複製サイクルの間に生じる可能性がある。第一のゲノムから得たＤＮＡの画分は、ＤＮＡが第一のウイルスゲノムのものと相同である第二の同時感染ウイルスのゲノムの画分を構築する時に相互に交換可能に使用される。
しかし、組換えは、完全に相同でない様々なゲノムでのＤＮＡの画分の間でも起りうる。１つのそのような画分が、例えば相同なＤＮＡの一部に挿入された抗遺伝子決定基をコードする遺伝子マーカーまたは遺伝子の第一の画分内に存在することを除き、別のゲノムの画分と相同な第一のゲノムから由来する場合、組換えは、依然として生じることができ、そしてその後、その組換えの産物は、組換えウイルスゲノム中のその遺伝子マーカーまたは遺伝子の存在によって検出できる。したがって、組換えワクシニアウイルスのような組換えポックスウイルスを生成する更なる攻略法が、最近報告され、そしてこれらの攻略法は、本発明の実施に使用できる。
修飾感染性ウイルスによって挿入されたＤＮＡ遺伝子の配列を首尾よく発現するのは、２つの条件下で起こりうる。第一に、挿入は、修飾されたウイルスが、生存できるままにするためにウイルスの必須でない領域に、またはそれにより必須の機能が中断されないか、またはその機能が全ての条件下で生存可能なために必須でない領域にできる。
挿入ＤＮＡの発現のための第二の条件は、挿入ＤＮＡと適切な関係にあるプロモーターの存在である。そのプロモーターは、発現されるべきＤＮＡ配列のコーディング領域から上流に位置しうる。
ワクシニアウイルスは、疱瘡に対して首尾よく免疫化するのに使用され、それにより１９８０年以来疱瘡の世界規模の撲滅を完了させた。その歴史の経路で、多くのワクシニアの株が作られた。これらの様々な株は、免疫原性が変化することを示し、そして潜在的複雑さを示す可変の程度まで影響され、それらの最も重大なのは、後期ワクシニア脳炎および全身化ワクシニアである（Ｂｅｈｂｅｈａｎｉ、１９８３年）。
痘瘡の撲滅について、外来遺伝子の発現のための遺伝子操作されたベクターものであるワクシニアの新たな役割は、重要になった。莫大な数の異種の抗原をコードする遺伝子が、ワクシニアで発現され、しばしば対応の病原による対抗に対する保護的免疫性を生じた（Ｔａｒｔａｇｌｉａらで再検討された、１９９０ａ）。
ワクシニアベクターの遺伝的背景は、発現外来免疫原の保護効率に影響されることが示されてきた。例えば、ワクシニアウイルスのウエイスのワクチン株内でのエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０の発現は、ＥＢＶウイルス誘発リンパ腫に対してコットントップ・タマリンを保護しなかった一方で、ワクシニアウイルスのＷＲの実験室株にある同じ遺伝子の発現は、保護的であった（Ｍｏｒｇａｎら、１９８８年）。
ワクシニアウイルス基本の組換え体ワクチン候補の効力および安全性との間の細かなバランスは、厳密に重要である。組換えウイルスは、ワクチンを与えたが、なんら顕著な病原特性を欠く動物での保護的免疫反応を引出する方法で、免疫原を表すに違いない。したがって、ベクター株の弱毒化は、技術の現状を超えて非常に望ましい利点である。
組織培養中のウイルスの成長に必須でなく、その欠失または不活性化が様々な動物系で毒性を減少させた、多くのワクシニア遺伝子が確認された。
ワクシニアウイルス・チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする遺伝子がマッピングされ（Ｈｒｕｂｙら、１９８２年）、そしてシーケンシングされた（Ｈｒｕｂｙら、１９８３年；Ｗｅｉｒら、１９８３年）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完全な欠失は、組織培養中の広範な細胞中のワクシニアウイルスの成長を避けない。ＴＫ^-ワクシニアウイルスは、様々な経路により、様々な宿主での接種の部位でインビボで複製する能力もある。
ＴＫ^-ウイルスでモルモットを膣内接種すると、ＴＫ⁺ウイルスで接種したものより脊椎で明かに低いウイルス力価を生じることが、単純ヘルペスウイルス２型について分かっている（Ｓｔａｎｂｅｒｒｙら、１９８５年）。ヘルペスウイルスコード化ＴＫ活性が、細胞を活発に代謝する上でウイルスの成長にとって重要でないが、静止細胞でのウイルス成長が必要とされないことが例示された（Ｊａｍｉｅｓｏｎら、１９７４年）。
ＴＫ^-ワクシニアの弱毒化は、大脳内および腹膜内経路によって接種したマウスで示された（Ｂｕｌｌｅｒら、１９８５年）。ＷＲの神経毒性の実験室株について、そしてウエイスのワクシニア株についての両方の弱毒化が観察された。皮膚内経路によって接種されたマウスでは、ＴＫ^-組換えワクシニアは、親のＴＫ⁺ワクシニアウイルスと比較して抗体を中和する同等の抗ワクシニアを生成し、それによりこの試験系で、ＴＫ機能の欠損は、ワクシニアウイルスベクターの免疫原性を明かには減少しないことを示した。マウスにＴＫ^-およびＴＫ⁺組換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）を鼻腔内接種することに続いて、脳を含めた他の場所へのウイルスの散在は明かに少ないことが分かった（Ｔａｙｌｏｒら、１９９１ａ）。
ヌクレオチド代謝に関与した別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。大きなサブユニットをコードする遺伝子を欠失させることによる、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）でのウイルスでコードされたリボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を分割する際のウイルス成長およびＤＮＡ合成に何の影響も及ぼさないことが示されたが、しかし血清を欠乏させた細胞での清澄に対するウイルスの能力を重篤に傷つけた（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９８８年）。目の急性ＨＳＶ感染および三叉神経節での反応しうる潜在性感染のマウスモデルを用いて、野生型ＨＳＶによって示された毒性と比較して、リボヌクレオチドリダクターゼの大きなサブユニットの欠失されたＨＳＶについて毒性が減少させたことが例示された（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、１９８９年）。
リボヌクレオチドリダクターゼの小さな（Ｓｌａｂａｕｇｈら、１９８８年）および大きな（Ｓｃｈｍｉｄｔｔら、１９８８年）サブユニットの両方が、ワクシニアウイルスで確認された。マウスの頭蓋内接種によって測定した場合、ＷＲ株のワクシニアウイルスにあるリボヌクレオチドリダクターゼの大きなサブユニットの挿入的不活性化が、そのウイルスの弱毒化に至る（Ｃｈｉｌｄら、１９９０年）。
ワクシニアウイルス・ヘマグルチニン遺伝子（ＨＡ）は、マッピングされそしてシーケンシングされている（Ｓｈｉｄａ、１９８６年）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子は、組織培養での成長には必須でない（Ｉｃｈｉｈａｓｈｉら、１９７１年）。ワクシニアウイルスのＨＡ遺伝子を不活性化すると、頭蓋内経路によって接種されたウサギで神経毒性が減少する（Ｓｈｉｄａら、１９８８年）。ＨＡ遺伝子座は、ワクシニアウイルスのＷＲ株（Ｓｈｉｄａら、１９８７年）、リスター株（Ｓｈｉｄａら、１９８８年）およびコペンハーゲン株（Ｇｕｏら、１９８９年）の外来遺伝子の挿入のために使用した。外来遺伝子を発現する組換え体ＨＡ^-ワクシニアウイルスは、免疫原性であること（Ｇｕｏら、１９８９年；Ｉｔａｍｕｒａら、１９９０年；Ｓｈｉｄａら、１９８８年；Ｓｈｉｄａら、１９８７年）、そして同等の病原による対抗に対して保護的であること（Ｇｕｏら、１９８９年；Ｓｈｉｄａら、１９８７年）が示された。
牛痘（ブライトン・レッド株）は、ニワトリの卵の漿尿膜の赤い（出血性）痘疹を生じる。牛痘ゲノム内の突発性欠失が、白色痘疹を生じる突然変異体を発生させる（Ｐｉｃｋｕｐら、１９８４年）。出血機能（ｕ）は、初期遺伝子によってコードされた３８ｋＤａのタンパク質にマッピングする（Ｐｉｃｋｕｐら、１９８６年）。セリンプロテアーゼ阻害剤に相同性を示すこの遺伝子は、牛痘に対する宿主の炎症反応を阻害することが示され（Ｐａｌｕｍｂｏら、１９８９年）、そして血液凝固の阻害剤である。
ｕ遺伝子は、ワクシニアウイルスのWR株に存在する（Ｋｏｔｗａｌら、１９８９年ｂ）。ｕ領域が、外来遺伝子の挿入によって不活性化されたＷＲワクシニアウイルス組換え体を接種したマウスは、ｕ遺伝子が不活性である同様の組換え体ワクシニアウイルスを接種したマウスと比較して、外来遺伝子産物に高いレベルの抗体を生じる（Ｚｈｏｕら、１９９０年）。ｕ領域は、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株で欠乏性の機能しない形態で存在する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年ａ、ｂに報告された技術による開放読取枠Ｂ１３およびＢ１４）。
牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型封入体（ＡＴＩ）中の感染細胞に位置する（Ｋａｔｏら、１９５９年）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への伝播の間牛痘ウイルスビリオンの保護であると考えられる（Ｂｅｒｇｏｉｎら、１９７１年）。牛痘ゲノムのＡＴＩ領域は、ＡＴＩ体のマトリックスを形成する１６０ｋＤａのタンパク質をコードする（Ｆｕｎａｈａｓｈｉら、１９８８年；Ｐａｔｅｌら、１９８７年）。そのゲノムに相同な領域を含むが、ワクシニアウイルスは、一般にＡＴＩを生成しない。ワクシニアのＷＲ株では、ゲノムのＡＴＩ領域を、９４ｋＤａタンパク質として翻訳する（Ｐａｔｅｌら、１９８８年）。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株では、ＡＴＩ領域に対応するＤＮＡ配列のほとんどが、ＡＴＩ領域から上流の配列と融合した領域の残りの３’末端と一緒に欠失されて、開放読取枠（ＯＲＦ）Ａ２６Ｌを形成する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年ａ、ｂ）。
様々な自発的（Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒら、１９８９年；Ｄｒｉｌｌｉｅｎら、１９８１年；Ｌａｉら、１９８９年；Ｍｏｓｓら、１９８１年；Ｐａｅｚら、１９８５年；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８１年）および遺伝子操作された（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９１年；Ｐｅｒｋｕｓら、１９８９年；Ｐｅｒｋｕｓら、１９８６年）欠失が、ワクシニアウイルスゲノムの左末端に隣接することが報告された。１０ｋｂの自発性欠失を示すワクシニアウイルスのＷＲ株（Ｍｏｓｓら、１９８１年；Ｐａｎｉｃａｌｉら、１９８１年）は、マウスで頭蓋内接種することによって弱毒化されることが示された（Ｂｕｌｌｅｒら、１９８５年）。この欠失は、１７個の潜在的ＯＲＦを含むことが後に示された（Ｋｏｔｗａｌら、１９８８年ｂ）。欠失領域内の特異的遺伝子は、バイロキンＮ１Ｌおよび３５ｋＤａタンパク質を包含する（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年ａ、ｂで報告された技術によってＣ３Ｌ）。Ｎ１Ｌの挿入不活性化は、正常およびヌードマウスの両方に頭蓋内接種することによって毒性を減少させる（Ｋｏｔｗａｌら、１９８９年ａ）。３５ｋＤａタンパク質は、ワクシニアウイルス感染細胞の培地に、Ｎ１Ｌのように分泌される。そのタンパク質は、相補な対照タンパク質、特に相補な４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のファミリーと相同性を含む（Ｋｏｔｗａｌら、１９８８年ａ）。細胞性Ｃ４ｐｂのように、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は、相補物の４番目の要素を結合し、そして古典的相補カスケードを阻害する（Ｋｏｔｗａｌら、１９９０年）。したがって、ワクシニアの３５ｋＤａタンパク質は、宿主の防御機構をすり抜ける上でウイルスを助けることに関与するように見える。
ワクシニアゲノムの左の末端は、宿主範囲の遺伝子Ｋ１Ｌ（Ｇｉｌｌａｒｄら、１９８６年）およびＣ７Ｌ（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９０年）と同定された２つの遺伝子を包含する。これらの遺伝子の両方を欠失されることは、様々なヒト・セルラインで清澄するワクシニアウイルスの能力を減少させる（Ｐｅｒｋｕｓら、１９９０年）。
新たなワクシニアワクチン株ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を開発するために、ワクシニアウイルスのコペンハーゲンワクチン株は、公知または潜在性毒性因子をコードするゲノムの６つの非必須領域の欠失によって修飾された。連続欠失は、米国特許番号第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８０７号に詳説される。ワクシニア制限断片、開放読取枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年ａ、ｂで報告された技術に基づく。
欠失遺伝子座は、外来遺伝子の挿入のための授与遺伝子座としても操作された。
ＮＹＶＡＣ中で欠失された領域は、下に列記される。さらに列記されるのは、略号および欠失領域のための開放読取枠の名称であり（Ｇｏｅｂｅｌら、１９９０年ａ、ｂ）、そしてワクシニア組換え体（ｖＰ）の名称は、特定化された欠失による全ての欠失を含む：
（１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０；
（２）出血性領域（ｕ；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３；
（３）Ａ型封入体領域（ＡＴＩ、Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８；
（４）ヘマグルチニン領域（ＨＡ；Ａ５６Ｒ）ｖＰ７２３；
（５）宿主範囲遺伝子領域（Ｃ７Ｌ−Ｋ１Ｌ）ｖＰ８０４；
および
（６）大きなサブユニットのリボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）。
ＮＹＶＡＣは、一般に、毒性に関連した遺伝子産物をコードする１８個の開放読取枠および宿主範囲の特定の欠失によって生じた遺伝子操作ワクシニアウイルス株である。ＮＹＶＡＣは、ｉ）、新生マウスで大脳内接種後毒性が減少したこと、ｉｉ）遺伝的に（ｎｕ ⁺／ｎｕ ⁺）または化学的に（シクロホスファミド）免疫を発揮できないマウスでの接種性、ｉｉｉ）免疫を発揮できないマウスでの散在性感染を起こすのに失敗すること、ｉｖ）ウサギの皮膚に目立った硬化および腫瘍化を欠くこと、ｖ）接種の部位からの迅速なクリアランスおよびｖｉ）ヒト起源のものを含めた多数の組織培養セルラインでの複製能力が非常に減少されたことを含めた多くの条件によって高度に弱毒化される。それにもかかわらず、ＮＹＶＡｃ基本ベクターは、固有の免疫原に対する素晴らしい反応を誘導し、保護的免疫を提供した。
２つのさらなるワクシニアベクター系は、自然に宿主を制限したポックスウイルス、アビポックスウイルスを使用することに関連する。鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）およびカナリア痘ウイルス（ＣＰＶ）の両方は、外来遺伝子産物を発現するように操作された。鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）は、ポックスウイルスファミリーの鳥類のポックスウイルスのプロトタイプのウイルスである。ウイルスは、生の弱毒化ワクチンを使用することによって、１９２０年代以来十分に制御された家禽の経済的に重要な疾患を引起こす。鳥類ポックスウイルスの複製は、鳥類の種に限定され（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、１９８２年）、そしてヒトを含めた全ての非鳥類の種での生産的感染を引起こす鳥類ポックスウイルスの文献についての報告はない。この宿主制限は、他の種に対するウイルスの伝達に対する遺伝的安全性防御を提供し、そして獣医学およびヒト用途でのワクチンベクターを、魅力的な計画にする。
ＦＰＶは、家禽の病原から得た抗原を発現するベクターとして有利に利用された。毒性の鳥類インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質は、ＦＰＶ組換え体内で発現された（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８年ａ）。組換え体をニワトリおよび七面鳥に接種した後、同種または異種のいずれかの毒性インフルエンザウイルス対抗に対して保護的である免疫反応が、導入された（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８年ａ）。ニューキャッスル病ウイルスの表層糖タンパクを発現するＦＰV組換え体も、開発されてきた（Ｔａｙｌｏｒら、１９９０年；Edbauerら、１９９０年）。
鳥類系に対するＦＰＶおよびＣＰＶの複製のための宿主制限の代わりに、これらのウイルスから誘導さ敗る組換え体が、非鳥類起源の細胞中の固有のタンパク質を発現することが分かった。さらに、このような組換え体ウイルスは、外来遺伝子産物に向けて指示され、そして対応の病原に対する対抗から保護できることが適切であると示された免疫学的反応を引起こすことが示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ、ｂ；Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年；１９９１年ｂ；１９８８年ｂ）。
ＡＬＶＡＣ組換え体は、Ｐｉｃｃｉｎｉら、１９８３年；Ｐｅｒｋｕｓら、１９９５年に詳述された方法、例えば、新規で非自明な産物がそれから生じるとき、新規で、そして本発明に関して非自明である組換え体によってできる。
ＴＲＯＶＡＣは、１日齢のニワトリのヒナのワクチン化として許可されている鶏痘のＦＰ−１ワクチン株から誘導されたプラーク−クローン化単離物である弱毒化鶏痘に該当する。
ＡＬＶＡＣは、許可されたカナリヤポックスウイルス、カナポックス（Ｋａｎａｐｏｘ）のプラーク−クローン化誘導体であった弱毒化カナリヤポックスウイルス基本のベクターである（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９２年）。ＡＬＶＡＣは、カナポックスのある種の一般的特性と同じ、ある種の一般的特性を示す。ＡＬＶＡＣは、単モルのカナリアポックスウイルス種である。
固有の免疫原を発現するＡＬＶＡＣ基本の組換えウイルスは、ワクチンベクターとして有効であることも示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ、ｂ）。この鳥類ポックスウイルスは、生産的複製について鳥類の種に限定される。ヒト細胞培養で、カナリアポックスウイルス複製は、ウイルス性ＤＮＡ合成の前にウイルスの複製サイクルで初期に中断される。それにもかかわらず、固有の免疫原を発現するように操作される時に、真正な発現および経過が、哺乳類の細胞中、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察され、そして多数の哺乳類の種に接種することが、固有の免疫原に対する抗体および細胞免疫反応を導入し、そして同種の病原との対抗に対して保護を供する（Ｔａｙｌｏｒら、１９９２年；Ｔａｙｌｏｒら、１９９１年）。
カナリポックス／狂犬病の糖タンパク組換え体（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）のＡＬＶＡＣ組換え体の欧州および米国の両方での最近のフェースＩの臨床治験は、ＡＬＶＡＣワクチンが安全で、充分に耐性があることを示し、そして例えば、抗体力価を中和する狂犬病ウイルスの保護レベルを誘導した（Ｆｒｉｅｓら、１９９６年；Ｐｉａｌｏｕｘら、１９９４年；Ｃａｄｏｚら、１９９２年）。さらに、ＡＬＡＣ−ＲＧワクチンから誘導される末梢血の単核細胞（ＰＢＭＣ）は、精製した狂犬病ウイルスで刺激された時に、際立ったレベルのリンパ球増殖を例示した（Ｆｒｉｅｓら、１９９６年）。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣは、ウイルスまたはベクターのような遺伝的材料の物理的混入についての指針、すなわち特定のウイルスまたはベクターの病理学性に基づいたこのようなウイルスおよびベクターを使用する安全手段についての指針を発行するナショナル・インスティテュート・オブ・ヘルス（「ＮＩＨ」）（米国公衆衛生局）、組換えＤＮＡ助言委員会は、ＢＳＬ２からＢＳＬ１までの物理的混入レベルでの減少を授与するという点で全ポックスウイルスのなかでも特徴的であるとして認識された。他のポックスウイルスは、ＢＳＬ１物理的混入レベルを示すものはない。ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株でさえ、共通の疱瘡ワクチンは、高い物理的混入レベル、すなわちＢＳＬ２を示す。したがって、当業者は、他のポックスウイルスより低い病理原性を示すことを認識している。
ＡＬＶＡＣ−基本の組換え体ウイルスは、ヒトＰＢＭＣから得たｉｎ ｖｉｔｒｏでの特定のＣＤ８⁺ＣＴＬを刺激することが示された（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ）。種々の形態のＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクを発現するＡＬＶＡＣ組換え体で免疫されたマウスは、二次接種によって呼起こすことができる一次および記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ反応の両方を発生した（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ；Ｃｏｘら、１９９３年）。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ組換え体（ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパクを発現する）は、ＨＩＶ−１感染個体の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの強力なＨＩＶ−特異的ＣＴＬ反応を刺激する（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ；Ｃｏｘら、１９９３年）。急性に感染した自己ＰＢＭＣを、残りのＰＢＭＣのための刺激細胞として使用した。外因性ＩＬ−２の不在下で１０日インキュベーションした後、細胞を、ＣＴＬ活性について評価した。ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖは、マウスでの高いレベルの抗−ＨＩＶ活性を刺激した。これらの、そして類似の研究（米国特許出願番号第０８／４１７，２１０号参照）は、特に免疫欠損ウイルスに対するＡＬＶＡＣ−基本の組換え体の利用性を示す。特に、ＡＬＶＡＣの高度に弱毒化された特徴は、このような研究で免疫感応および免疫を発揮できない動物モデルの両方で表される。そしてＡＬＶＡＣ−基本の組換え体の安全性も示された。
したがって、本発明では、カナリアポックスウイルス基本のＡＬＶＡＣベクターが好まれる。
明らかに、ＡＬＶＡＣベクターの弱毒化プロフィール、および固有の免疫原に対するヒトのおよび細胞の免疫学上の反応の両方を引出すその例示の能力に基づいて（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年ａ；Ｔａｙｌｅｒら、１９９２年）、このような組換え体ウイルスは、先に記述されるワクシニア基本の組換え体ウイルスより際立った利点を供する。
おそらくＦＩＶにさらに関連して（ネコが関与している場合）、ＦｅＬＶ（サブグループＡ）ｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子産物を発現するＡＬＶＡＣ−基本の組換え体ウイルス（ＡＬＶＡＣ−ＦＬ；ｖＣＰ９７）は、口鼻のＦｅＬＶ対抗照射に対してネコを完全に保護できることが見られる（Ｔａｒｔａｇｌｉａら、１９９３年）。明かに、保護は、対抗の前に検出可能なＦｅＬＶ−特異的血清中和活性の不在下で可能にされた。
本発明の特定の実施態様で、出願人らは、数種のＡＬＶＡＣ−ＦＬ組換え体を操作し、そして実験的ＦＩＶ照射に対してネコの保護を可能にするそれらの能力を評価した。要約すると、出願人らは、ＡＬＶＡＣ−ＦＬのＧａｇ−プロテアーゼ組換え体を用いてネコのワクチン化によって、相同のＦＩＶ対抗照射から保護を示した。ＦＩＶ Ｅｎｖ単独またはＧａｇ−プロテアーゼと組合せて発現する組換え体は、保護のレベルを際立たせなかった。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ｅｎｖ／ｇａｇ−プロテアーゼでプライマー化すること、そしてアジュバント化した不活性化全細胞ワクチン製造で上昇させることから構成されるワクチン化計画は、完全な保護を提供し、それにより、Ｅｎｖ単独またはＧａｇ−プロテアーゼと組合せて発現する組換え体の活用が示されたが、それにもかかわらず、これらの組換え体は、それ自身目立ったレベルの保護をできなかった（そしてさらに、これらの組換え体は、本発明の他の局面、例えばそれにもかかわらず、例えば有用な抗体、またはキット、試験、アッセイなどで得るのに有用でありうる産物を発現するのに使用できる）。
興味深いことに、ELISAによって測定したFIV固有の体液反応およびウェスタンブロットは、必ずしも防御性を予測するわけではない。しかも、Env固有の体液反応は、認められた防御性とは関連付けられなかった。
さらに、ここでのデータは、ネコにおける、特に、発明による組換え体（ALVAC-FIV組換え体など）およびICVを含むプライム/ブーストプロトコルでの、異種FIV抗原投与に対する本発明の組換え体のFIV効率を示す。
その上、ここでのデータは、FIVおよびネコについて、他のレンチウィルス、レトロウィルス、およびEIAV、FIV、BIV、HIVあるいはSIVなどの免疫不全ウィルスに拡張可能である。したがって、Env、Gag、プロテアーゼなどこれらの他のウィルスから対象とするエピトープをコード化する核酸分子に関する当業界内の知識は、ここで例証されたFIVデータに類似した、対象とするエピトープを発現する組換え体を作成および使用するのに利用できる。また特に、他のレンチウィルス、レトロウィルス、EIAV、FIV、BIV、HIVあるいはSIVなどの免疫不全ウィルス用の、Env、Gag、Pol、または、プロテアーゼ、付属官能基/タンパク質、あるいはそのエピトープを含む部分などのPolの一部をコード化する核酸分子の当業界内の知識を用い、ベクターシステムの当業界内の知識を用いると、当業者は、随意に付属官能基/タンパク質とともに、これらの他のウィルスの、Env、GagおよびPolまたはPolの一部、あるいはGagおよびPolまたはPolの一部、あるいはEnv、Gagおよびプロテアーゼ、Gagおよびプロテアーゼ、あるいはそのエピトープを発現するベクターまたは組換え体を作成でき、FIVに関してここで例証したように、プライム/ブースト処置などの免疫処置においてベクターまたは組換え体を、必要以上の実験を行わずに使用できる。したがって、本発明は、レンチウィルス、レトロウィルスおよびFIV以外（FIVは他のレンチウィルス、レトロウィルスおよび免疫不全ウィルスのモデルであるため）の免疫不全ウィルスのベクターまたは組換え体と、これらのベクターおよび組換え体の作成および使用方法を包む。
発明によるベクターまたは組換え体が産生する発現生成物は、感染細胞または形質移入細胞から単離し、サブユニット・ワクチン形状（組成物、あるいは抗原または免疫組成物）で宿主に接種することもできる。ベクターまたは組換え体が産生するタンパク質、およびそれから導出される抗体も、レンチウィルス、レトロウィルス、またはFIVなどの免疫不全ウィルスの有無を検出するアッセイに使用できる。
したがって、本発明は、レンチウィルス、レトロウィルスまたは免疫不全ウィルス免疫源などの、対象とする免疫原またはエピトープ、あるいは、EIAV、FIV、BIV、HIV、またはSIV免疫原などの対象とするエピトープ、あるいは対象とするエピトープを含む。実際には、本発明は、HIV-1、-2、EIAV、BIVを含むがこれに限定されない、レンチウィルスの対象とする免疫原またはエピトープを含む。すべてのレンチウィルスは、FIV、Env、Gag-プロテアーゼの機能同族体発現する。これらの機能同族体をコード化する核酸配列の識別、クローニング、利用の技術は当業者に既知であり、本開示に照らして実施するのに必要以上の実験は不要である。
最新技術に関しては、特に以下を参照する：Gondaら（1990）レンチウィルス疾患のモデルとしてのウシ免疫不全様ウィルス．Dev，Biol．Stand．72：97-110；Garveyら（1990）生物活性ウシ免疫不全様ウィルスヌクレオチド配列およびゲノム構造．Virology 175：391-409；Gondaら（1987）ヒト免疫不全ウィルスに関連したウシレンチウィルスのキャラクタリゼーションおよび分子クローニング．Nature 330：388-391；Ballら（1988）EIAVゲノム構造：精製糖タンパク質およびcDNAの配列による、さらなるキャラクタリゼーション．Virology 165：601-605；Kawakamiら（1987）ウマ伝染性貧血症ウィルスプロウイルスDNAのヌクレオチド配列分析．Virology 158：300-312；Yanivら（1986）統合ウマ伝染性貧血症ウィルスの分子クローニングおよび物理キャラクタリゼーション：ヒツジおよびヤギレンチウィルスとの密接な関係についての分子的および免疫学上の証拠．Virology 154：1-8；Stephensら（1986）ウマ伝染性貧血症ウィルスgagおよびpol遺伝子：ビズナおよびAIDSウィルスとの関係．Science 231：589-594；Chiuら（1985）AIDSレトロウィルスのレンチウィルスに対する関係のヌクレオチドの証拠．Nature 317：366-368；はもちろんのこと、Retrovirus Biology and Human Disease、Gallo，R．C and Wong−Stall，F．編、Marcel Dekker，Inc．New York、1990の多数の総説。
さらに、発明のベクターまたは組換え体から、このような対象とする免疫原またはエピトープをコード化するDNAは、他のポックスウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウイルス、アルファウィルスに基づく方法、および、裸または調整されたＤＮＡに基づく免疫原を含むがこれに限定されない、代わりの適切に処理された哺乳類発現システムを用いて、免疫処置により投与できる。このような組換え体サブユニットの処理技術は、当業者に既知である。
これらの免疫処置の媒質および最新知識に関する技術については、特に以下を参照する：Hormaeche and Kahn，Perkus and Paoletti，ShiverらConcepts in Vaccine Development、Kaufman，S．H．E．編、Walter deGruytes，New York，1996、のすべて、および、Viruses in Human Gene Therapy，Vos，J．-M．H編、Chapman and Hall，Carolina Academic Press，New York，1995およびRecombinant Vectors in Vaccine Development，Brown，F．編，Karger，New York，1994で述べられたベクター。
さらに本発明は、組換えウィルスまたはその発現生成物を含む抗原性、免疫原性、免疫性またはワクチン組成物、および、許容できる担体または希釈剤を提供する。ベクターまたは組換えウィルス（またはその発現生成物）免疫組成物は、局所的または系統的な免疫反応を誘発する。この反応は、必要はないが、防御的になり得る。同様に抗原組成物は、局所的または系統的な免疫反応を誘発する。この反応は、必要はないが、防御的になり得る。したがって、”免疫組成物”、”抗原組成物”および”免疫原組成物”という語は、（この3つの語は防御的組成物になり得るため）”ワクチン組成物”を含む。防御反応は、体液性および/または分泌性および/または細胞媒介反応などの反応と理解され、免疫を付与する。免疫とは、感染に抵抗または感染を克服する能力、あるいは、発明組成物が処方されない被験者と比べて感染を容易に克服する能力、あるいは、発明組成物が処方されない被験者と比べて感染に耐える、すなわち感染への耐性の向上と理解される。
対象とするエピトープに関し、当業者は、アミノ酸とペプチドまたはポリペプチドの該当するDNA配列の知識はもちろんのこと、特定のアミノ酸の性質（サイズ、電荷など）およびコドンディクショナリから、必要以上の実験を行わずに、ペプチドまたはポリペプチド、したがって、そのためにコード化DNAのエピトープまたは免疫優性領域を決定できる。
免疫組成物にタンパク質の使用部分を決定する一般的な方法では、対象とする抗原のサイズと配列に注目する。”一般に、大型のタンパク質は、潜在的な決定因子を多く持っているため、小型のタンパク質よりも優れた抗原である。抗原が異質になればなるほど、すなわち、耐性を生じさせる自己の配置に最も類似しなくなると、免疫反応が効果的に起こる。”Ivan Roitt，Essential Immunology，1988。
サイズに関して：当業者は、哺乳類ベクターに挿入されるDNA配列がコード化するタンパク質のサイズを最大限にできる（ベクターの挿入限界に留意する）。発現されるタンパク質のサイズを最大限にしながら、挿入するDNAを最小限にするために、DNA配列は介在配列（転写されるが、引き続きプライマリRNAから実施される遺伝子の領域）を除くことができる。
DNA配列は、最低で、少なくとも8または9個のアミノ酸長のペプチドをコード化できる。これは、ペプチドが（ウィルス感染細胞または癌性細胞を認識する）CD4+T細胞反応を促進するために必要な最小限の長さである。アミノ酸が13〜25個の最低ペプチド長は、（病原体を取りこんだ、特殊な抗原を示す細胞を認識する）CD8+T細胞反応を促進するのに有効である。KendrewのThe Encyclopedia of Molecular Biology（Blackwell Science Ltd 1995）を参照のこと。しかし、これらのペプチドは最小限の長さであるため、免疫反応、すなわち、抗体またはT細胞反応を生成しやすい；しかし、（ワクチン組成物などによる）防御反応の場合は、さらに長いペプチドが好ましい。
配列に関して、DNA配列は、少なくとも、抗体反応またはT細胞反応を生成するペプチドの領域をコード化することが好ましい。TおよびB細胞エピトープを決定するひとつの方法として、エピトープマッピングがある。対象とするタンパク質は"タンパク質分解酵素を用いて重複ペプチドに断片化される。そして各ペプチドについて、未変性のタンパク質が誘発した抗原への結合能力、あるいは、T細胞またはB細胞活性化を引き起こす能力を試験する。この手法は、T細胞によって、MHC分子と結合した短い線形のペプチドが認識されるため、T細胞エピトープのマッピングに特に有効である。この方法は、B細胞エピトープの決定にはあまり有効ではない。"なぜなら、B細胞エピトープは、たいてい線形アミノ酸配列ではなく、折れ曲がった3次元タンパク質の三次構造から生じるからである。Janis Kuby，Immunology，pp．79-80（1992）。
対象とするエピトープを決定するもうひとつの方法は、親水性のタンパク質の領域を選択することである。親水性残基は、通常、タンパク質表面にあるため、たいてい、抗原に到達可能なタンパク質領域である。Janis Kuby，Immunology，p．81（1992）。
対象とするエピトープを決定するさらにもうひとつの方法は、抗原（全長）-抗体複合体のX線結晶解析を行うことである。Janis Kuby，Immunology，p．80（1992）。
T細胞反応を産生可能な対象とするエピトープを選択するまた別の方法は、MHC分子に結合しやすいことが知られているペプチド配列である、タンパク質配列電位HLAアンカー結合モチーフから識別することである。
T細胞反応を産生するには、対象とする推定上のエピトープであるペプチドが、MHC複合体中に示されることが望ましい。このペプチドは、好ましくは、MHC分子に結合するための適切なアンカーモチーフを含み、免疫反応を産生するのに十分な高さの親和力によって結合する。考慮可能な因子は次のとおりである：免疫化される（脊椎動物、動物またはヒト）患者のHLA型、タンパク質の配列、適切なアンカーモチーフの存在、他の生体細胞のおけるこのペプチド配列の発生。
免疫反応は、一般に、以下のように産生する：T細胞は、タンパク質がさらに小さいペプチドに切断され、別の細胞表面に位置する"主組織適合性複合体MHC"と呼ばれる複合体の形で現れた場合のみに、タンパク質を認識する。MHC複合体には、クラスＩとクラスIIの2つのクラスがあり、各クラスは、多くの種々の対立遺伝子で構成される。それぞれの患者は、異なる型のMHC複合体対立遺伝子を持つ；すなわち、'異なるHLA型'を持つと言われる。
クラスＩMHC複合体は、本質的にすべての細胞に見られ、細胞内で生成されたタンパク質からペプチドを生じさせる。したがって、クラスＩMHC複合体は、ウィルスに感染した細胞や発ガン遺伝子の発現の結果として癌化した細胞を殺すのに有効である。表面にCD4というタンパク質を持つT細胞は、MHCクラスＩ細胞に結合し、リンフォカインを分泌する。リンフォカインは、反応を促進する；細胞がウィルス感染細胞に到達し、これを殺す。
クラスII MHC複合体は、抗原を示す細胞のみに見られ、抗原を示す細胞により形質膜陥入された循環病原体からペプチドを生じさせるのに用いられる。CD8と呼ばれるタンパク質を持つT細胞は、MHCクラスＩ細胞に結合し、溶菌顆粒の開口分泌により細胞を殺す。
タンパク質が、T細胞反応を促進する対象とするエピトープを含むかどうかを判定するための、あるガイドラインは、以下の事項を含む：ペプチド長-ペプチドは、MHCクラスＩ複合体に適合させるには少なくともアミノ酸8〜9個の長さで、MHCクラスII複合体に適合させるには少なくともアミノ酸13〜25個の長さであることが望ましい。この長さは、MHC複合体に結合するペプチドにとっては最小限の長さである。細胞が、発現されたペプチドを切断することがあるため、ペプチドはこれ以上の長さであることが好ましい。ペプチドは、そのペプチドを、免疫反応を生じさせるのに十分に高い特異性によって種々のクラスＩまたはクラスII分子に結合させる、適切なアンカーモチーフを含むことが望ましい（Bocchia，M．ら、Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Peptides to HLA Class I Molecules，Blood 85：2680-2684；Englehard，VH，Structure of peptide associated with class I and class II MHC molecules Ann．Rev．Immunol．12：181（1994）を参照）。これは、必要以上の実験をせずに、対象とするタンパク質の配列を、MHC分子に結合するペプチドの公表された構造と比較することにより実施できる。T細胞レセプタが認識するタンパク質エピトープは、タンパク質分子の酵素分解によって生成するペプチドであり、クラスＩまたはクラスII MHC分子に結合して、細胞表面に現れる。
さらに、当業者は、タンパク質配列を、タンパク質データベースに示された配列と比較することによって、対象とするエピトープを確認できる。わずかしか、あるいは全く一致しないタンパク質の領域を、そのタンパク質のエピトープとして選択したほうがよく、ワクチンまたは免疫組成物に有効である。生体細胞に存在する、広範に見られる配列と大部分が一致する領域は、避けることが望ましい。
またさらに、別の方法は、対象とするタンパク質の部分を生成または発現させ、対象とするタンパク質のこの部分に対するモノクローナル抗体を産生して、これらの抗体が、タンパク質が誘導された病原体の生体外での成長を阻害するかどうかを確認するだけである。当業者は、本開示および当業界で公表されたもうひとつのガイドラインを用いて、抗体による生体外での成長の阻害の有無を分析するために、対象とするタンパク質の一部を生成または発現させることができる。
たとえば、当業者は、対象とするタンパク質の一部を、以下の手順によって生成できる：タンパク質のアミノ酸長が8〜9個または13〜25個の部分を選択、親水性領域を選択、抗原（全長）-抗体複合体のX線データから、結合するために、示された部分を選択、他のタンパク質による配列と異なる領域を選択、潜在的なHLAアンカーモチーフを選択、あるいは、これらの方法または当業者に既知の他の方法の組み合わせ。
抗体によって認識されたエピトープをタンパク質の表面上で発現させた。ある技巧的な技術で抗体応答を刺激しそうなタンパク質の領域を決定するには、上記の一般的な方法又は技術的に公知の他のマッピング方法を用いて、エピトープマップを好ましく実施することが可能である。
前記の記述、この公報及び技術的知見を参照することが可能であるので、当業者は、過度の実験なしに、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び／又は抗体反応を得るための関心のレンチウイルスエピトープのアミノ酸とそれに対応するＤＮＡ配列を確認することが可能である。加えて、参考文献として、Ｇｅｔｔｅｒらの１９９１年５月２８日発行の米国特許第５，０１９，３８４号とそれに引用された文献があり、ここに、参考文献として組み込んだ。（この特許の「関連する文献」の項と開示したこの特許の１３欄を特に注意すること。そこには、次の記述がある。
「多数のエピトープを広範囲の様々なの関心のある有機体に対して明らかにした。格別の関心は、抗体を中和するそれらのエピトープである。それらのエピトープの記述は、関連文献の欄に引用した多くの文献にある。」
発明のベクター又は組換え体又はその発現産生物、免疫組成物、抗原組成物又はワクチンの組成物、あるいは治療組成物に対する投与処置は、皮内、筋肉内又は皮下のような非経口的経路を介して行うことができる。そのような投与は、全身性の免疫学的応答に利用できる。投与は、口、鼻、生殖器等のような粘膜を通じても可能である。そのような投与は、局所的な免疫学的応答に利用できる。
さらに広くは、本発明の抗原組成物、免疫学組成物又はワクチン組成物あるいは治療の組成物（本発明のベクター又は組換え体又は発現産物を含んでいる組成物）は、製薬あるいは獣医学技術の当業者によく知られている標準的技術に従って調製することが可能である。そのような組成物は、投薬で投与することができ、薬学及び／または獣医学の当業者がよく熟知している技術によって、品種又は種類、年齢、性別、体重、特定の患者の状態及び投薬経路のような因子を考慮して、そのような組成物を投与することができる。その組成物は、単独で投与するか、他と一緒に投与するか、本発明の他の組成物又は他の免疫組成物、抗原組成物、ワクチン組成物又は治療組成物と一緒に順序的に投与することができる。そのような別の組成物として、精製された天然の抗原又はエピトープ、あるいはボックスウイルス組換え体又は他のベクター系による発現からの抗原又はエピトープを含むことが可能であり、そして、前述の要素を考慮して投与される。
本発明の組成物の実施例は、口、鼻、肛門、膣のような生殖器等の開口部に対する液体調製物；懸濁液、シロップ剤又はあるいはエリキシルのような投与；また、非経口、皮下、皮内、筋肉内又は例えば注射可能な静脈内投与用の滅菌した懸濁液又はエマルジョンのような調整、を含んでいる。そのような組成物では、組換え体が、滅菌水、生理的食塩水、グルコース又はその類似物のような、適当な担体、希釈剤、賦形剤とともに混合剤中に入っていてもよい。
抗原組成物、免疫組成物又はワクチン組成物は、典型的に、補助剤と望ましい応答を生じるような量の組換え体又は発現産物を含むことができる。ヒトへの適用においては、燐酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムのようなアルムが典型的な補助剤である。サポニン及びその精製成分Ｑｕｉｌ Ａ、Ｆｒｅｕｎｄの完全な補助剤と他の補助剤は、研究や獣医学の応用において用いられている。ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピッドＡ、リン脂質の調製は化学的に定義されており、それらは、Goodman-Snilkoffらによって、J．Immunol．147:410-415（1991）に記載されており、ここに文献として組み込んだ。また、MillerらによるJ．EXP．Med．176:1739-1744（1992）に記載されたプロテオリポソーム中へのタンパク質のカプセル充填の文献があり、ここに文献として組み込んだ。さらに、NovasomeTM脂肪小胞（Micro Vesicular Systams，Inc．，Nashua，NH）のような脂肪小胞中でのタンパク質のカプセル化もまた使用可能である。
本発明の組成物は、非経口投与（すなわち、筋肉内、皮内又は皮下）か、例えば舌経由（すなわち、経口、）胃、口腔内、肛門内、膣内を含む粘膜及びその類似体へのオリフィス投与によって免疫処置するために、単一の剤形中にパッケージしてもよい。また、再び、投与の有効薬量と経路は、その組成物の性質、発現産物の性質、直接ベクターや組換え体を利用する場合はその発現レベル、品種、種類、年齢、体重、状態及び宿主の性質並びにＬＤ₅₀及び公知で過度の実験を要しない他のスクリーニング法などによって決定する。
発現産物の薬量は、例えば、５〜５００μｇのように、微量から数百マイクログラムに及ぶことが可能である。本発明のベクター又は組換え体は、これらの薬量レベルで発現を達成するような適当量で投与することができる。本発明のベクター又は組換え体は、少なくとも約１０^3.5ｐｆｕの投与量で、動物へ投与し、感染させ、細胞に形質転換することが可能である。例えば、本発明のベクター又は組換え体は、好ましくは、少なくとも１０⁴〜約１０⁶ｐｆｕで、動物へ投与し、感染させ、細胞に形質転換することが可能である。しかしながら、下記の実施例に示すように、動物は少なくとも約１０⁸ｐｆｕ投与しなければならない。さらに好ましい投与量は、少なくとも約１０⁷ｐｆｕから約１０⁹ｐｆｕである。他の適当な担体又は希釈剤には、水、緩衝食塩水を用いることができ、防腐剤を用いても用いなくてもよい。発現産物又はベクター又は組換え体は、投与時に再懸濁するために凍結乾燥してもよく、溶液中に存在させることもできる。
担体は、また、ポリマー性遅延遊離系統であってもよい。合成ポリマーは、制御された遊離を有する化合物と剤型において特に有用である。この初期の例としては、いわゆるナノ粒子を形成するために１ミクロン未満の直径を持っている球体へメタクリル酸メチルの重合があり、それは、Kreuterによって、J．，Microcap-sules and Nanoparticles in Madieine and Pharmacology．（M．Donbrow，ed．）CRC Press，p．125-148に報告されている。
制御した遊離を行うために、マイクロカプセル化した薬剤の注射が適用された。マイクロカプセル化のために特別のポリマーの選択に多くの因子が寄与する。ポリマー合成及びマイクロカプセル化工程の再現性、マイクロカプセル化の原料と工程の費用、毒性学の性質、可変解放動力学のための必要条件及びポリマーと抗原の物理化学的な適合性が考慮されるべきすべての因子である。有用なポリマーの実施例は、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリウレタンである。ポリオルトエステルとポリアミドは、特に生物分解性のものである。
薬剤と最近の抗原に対する担体の頻繁な選択は、ポリ（ｄ、ｌ−ラクチド-ｃｏ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）である。これは、生物分解性のポリエステルであり、縫合、骨折治療用プレート、他の治療人口器官において医薬用途の長い歴史があり、毒性は示されなかった。ペプチド及び抗原を含む薬剤の幅広い種類は、ＰＬＧＡマイクロカプセル中に調製した。例えば、Eldridge，J．H．らによるCurrent Topics in Microbiology and Immunology．1989，146:59-65にあるように、抗原の制御された遊離に対するＰＪＧＡの適応に関して、データ主要部を蓄積した。経口で投与された場合、直径で１〜１０ミクロンのＰＬＧＡ微粒子中の抗原の包括が、注目すべき補助剤効果を持っていることが示された。ＰＬＧＡマイクロカプセル化工程は、オイルの中の水のエマルジョンの相分離を使用する。水溶液とＰＬＧＡで調製した関心のある化合物を、塩化メチレン、酢酸エチルのような適当な有機溶媒に溶解した。これらの混合しない２つの溶液を高速撹拌によって乳化した。その後、ポリマーに対し非溶剤を加え、未成熟のマイクロカプセルを形成するため、水性小滴のまわりにポリマーの析出を生じさせた。マイクロカプセルを収集し、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ゼラチン、アルギナート、ポリビニルピロリドン（ｐｖｐ）、メチルセルロースの様々な試剤のうち１つで固定させ、溶媒を真空乾燥、溶媒抽出のいずれかで除去した。
その後、固体、液体含有の固体、液体及びゲル（「ゲル・キャップ」を含む）組成物を組成物）固形物含んでいる液体を含む固形物、液体およびゲル（「ゲル・キャップ」を含む）組成物を形成した。さらに、本発明のベクター又は組換え体及びそれらからの発現産物は、動物中で免疫性又は抗体応答を刺激することが可能である。公知の技術によって、それらの抗体からモノクローナル抗体を調節し、それらのモノクローナル抗体が抗原が存在するか否か、それらから抗原の天然の原因因子が存在するか否かを判定する、あるいは、試剤に対する免疫応答が刺激された抗原に対する免疫応答かを判定する、よく知られている結合測定、診断キット又はテストに供することができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生されたイムノグロブリンである。モノクローン抗体はシングルの抗原決定基抗原決定要素と反応し、従来よりも特異的に大きい血清由来抗体を提供する。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることによって、希望する特異性、結合活性及びアイソタイプを伴う個々の抗体を選択することが可能である。ハイブリドーマ細胞系は、化学上同一の抗体の恒常的で低費用の源を提供し、容易にそのような抗体の調製を標準化することが可能である。モノクローナル抗体を産生する方法は従来技術において通常の技術として十分に知られており、例えば、Koprowski，H．らの１９８９年４月１日発行の米国特許第４，１９６，２６５号があり、ここに文献として組み込んだ。
モノクローナル抗体の利用はよく知られている。そのような１つの利用は、診断方法である。例えば、David，G．とGreene，Kの１９８３年３月８日発行の米国特許第４，３７６，１１０があり、ここに文献として組み込んだ。
モノクローナル抗体は免疫吸着クロマトグラフィーによって物質を回収するのに用いられてきた。例えば、Milstein，Cによる1980年発行のScientific American 243:66，70の文献があり、ここに文献として組み込んだ。
更に、本発明のベクター又はそれからの組換え体発現産物は、患者への継続的な自家輸血法のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ又は半ビボ中の細胞に応答を刺激することができる。もし、患者が血清陰性であれば、時下輸血法は、例えば活動免疫のような免疫学的な又は抗原応答免疫応答を刺激する。血清陽性の患者においては、自家輸血法は、レンチウイルス、レトロウイルス又は免疫欠如ウイルス（例えばＦＩＶ）に対する免疫システムを刺激するか増加させる。
さらに、本発明のベクターあるいは組換え体はいくつかの有用性を持っている。血清陰性の動物やヒト（ヒトを含む患者に加えて、獣医が動物に対して称する患者を含める）に投与するような抗原組成物、免疫組成物又はワクチン組成物。レンチウイルス、レトロウイルス又はネコ不全ウイルスのような免疫欠如ウイルスに対する免疫システムを刺激するか増加させる治療の要求における血清陽性の動物又はヒトへの治療組成物。さらに、抗原組成物、免疫組成物、ワクチン組成物又は治療組成物を利用することができる、抗原、免疫原、対象とするエピトープを産生するｉｎ ｖｉｔｒｏ。さらに利用することができる、直接投与によるか本発明のベクター又は組換え体の発現産物の投与による抗体の産生。血清のような試料中に抗原又はエピトープが存在するか否を確認するための診断、テスト又はキット。例えば、血清のような試料中の、レンチウイルス、レトロウイルス、又はネコ免疫不全ウイルスのような免疫欠如ウイルスの存在有無の確認。あるいは、レンチウイルス、レトロウイルス、又はネコ免疫不全ウイルスのような免疫欠如ウイルスに対し免疫応答が誘発されたかどうかを検出するための、あるいは特定の抗原又はエピトープのための診断、テスト又はキット。あるいは、クムノクロマトグラフィー。ハイブリダイゼーションプローブとして利用するためのＤＮＡの産生又はＰＣＲプライマーの調製又はＤＮＡ免疫処置。そして、本発明のベクター又は組換え体、それらからの発現産物、免疫原、抗原あるいは本発明のベクター又は組換え体からのエピトープは、刺激された命令を引き起こすために用いることができ、それは、さらに、免疫応答（抗原応答又は免疫学的応答あるいは活動免疫）を刺激するか、免疫系（例えば、免疫無防備状態又血清陽性の動物又はヒトの免疫系）を刺激するか増加させるために用いることが可能である。他の有用性は、また本発明の実施例において説明する。
本発明についてのさらなる理解と多くの有用性が、下記の実施例によって実例を通じて得られるであろう。
実施例
ＤＮＡのクローニングおよび合成
プラスミドは標準的手法により構築してスクリーニングし、育成した（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２；Pｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。制限エンドヌクレアーゼは、ベセスダ・リサーチラボラトリー（Ｂｅｔｈｅｓａｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびベーリンガー・マンハイムバイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ．）より入手した。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼのKlenow fragmentは、ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ社（Boehringer Mannheim Biochemicals）より入手した。BAL-81エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４ＤＮＡリガーゼは、New England Biolabsより入手した。使用した試薬は多様な提供者から得たものをspecifiedした。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述（Perkus et al．，1989）のようにBiosearch 8750またはアプライド・バイオシステムズ社製（Applied Biosystems）380B DNAシンセイサイザにより調製した。ＤＮＡの塩基配列決定は、後述（Guo et al．，1989）のように、シーケナーゼ（Tabor et al．，1987）を使用してジデオキシ鎖ターミネーション法（Sanger et al．，1977）により実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による塩基配列補正（Engelke et al．，1988）を使ったＤＮＡの増幅は、カスタム合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびＧｅｎｅ Ａｍｐ ＤＮＡ増幅試薬キット（パーキン・エルマー・シータス社（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を自動化パーキン・エルマー・シータスＤＮＡサーマルサイクラー（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｋ，ＣＴ））に入れて使用した。過剰のＤＮＡ配列は、制限エンドヌクレアーゼ消去法によりプラスミドから消去し、続いてＢＡＬ−１エキソヌクレアーゼによる制限消去法にて消去し、合成オリゴヌクレオチドにより突然変異生成（Ｍａｎｄｅｃｋｉ，１９８６）を起こした。
細胞、ウイルスおよび形質転換
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株の起源および培養条件は前述のとおり（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）とした。組み換えによる組み換えウイルスの発生、ニトロセルロースフィルターを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＢーガラクトシダーゼ活性を指標とするスクリーニングは前述のとおり（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）である。
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン株、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの起源および培養条件は前述のとおり（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｔａｒｔａｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；米国特許第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８８７号）である。組み換えによる組み換えウイルスの発生、ニトロセルロースフィルターを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびＢーガラクトシダーゼ活性を指標とするスクリーニングは前述のとおり（Ｐａｎｉｃａｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）である。
親株のカナリポックスウイルス（Ｒｅｎｔｓｃｈｌｅｒ株）は、カナリアのワクチニアル株である。ＡＬＶＡＣワクチン株は、前述のように、ニワトリ胎児線維芽細胞を連続２００回経代して単離しアテニュエートした野生株から得た、マスターのウイルス播種は、寒天上で４回連続してプラーク精製にかけ、１つのプラーククローンを保存用ウイルスを親ウイルスとしてｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換え試験にてさらに５回経代して増幅させた。プラーク精製によるカナリポックス単離体をＡＬＶＡＣと命名した。
ＦＰ−１と命名したファウポックスウイルス（ＦＰＶ）株は前述のとおり（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ）である。これは、１日齢のニワトリにおいてワクチン接種をする場合に有用なアテニュエートされたワクチン株である。親ウイルス株であるＤｕｖｅｔｔｅは、ニワトリからＦｏｗｌｐｏｘ ｓｃａｂとしてフランスより入手した。このウイルスは連続約５０回の経代に続き、ニワトリ胎児線維芽細胞を２５回経代してアテニュエートした。このウイルスを連続４回プラーク精製にかけた。１個のプラーク単離体をさらに初代ＣＥＦ細胞内で増幅させ、保存用ウイルス（ＴＲＯＶＡＣ）と命名し確立した。
ＮＹＶＡＣ、ＡＬＶＡＣおよびＴＲＯＶＡＣウイルスベクターとその単離体を、前述のように（Ｐｉｃｃｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｔａｉｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ，米国特許第５，３６４，７７３号および第５，４９４，８０７号）にて増殖させた。Ｖｅｒｏ細胞およびニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥＦ）を前述のように（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ，ｂ）増殖させた。
実施例１−ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ（ｅｎｖ）の構築
プラスミドｐｔｇ６１８４中にコードされた配列であるＦｅｌｉｎｅ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｅｎｖと、ＦＩＶヌクレオチド配列をＲｈｅｎｓ Ｍｅｒｉｃｕｘ（Ｌｙｅｎ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。このｃＤＮＡクローンをＦＩＶのＶｉｌｌｅｆｒａｎｃｈｅ株から誘導した。ＦＩＶｅｎｖヌクレオチド配列を図２（配列番号１）に示す。
ＦＩＶｅｎｖコード配列を、初期／後期ワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）の管理下においた。ＦＩＶｅｎｖコード配列は、未成熟の初期転写終了用に提供される２つのＴ₅ＮＴ配列にモチーフを含有する（Ｙｕｅｎ ａｎｄ Ｍｏｓｓ，１９８７）。Ｔ₅ＮＴ配列は、予想されるアミノ酸コード配列を変化させることなくＰＣＲ誘導画分と置き換わることにより改変される。図２の２０５９と２０６５の間の位置にあるＴＴＴＡＴは、ＴＴＣＴＴＡＴに変化し、２１１０と２１１６の間に位置するＴＴＴＴＴＣＴは、ＴＴＣＴＴＣＴに変化する。
重複する２つのＰＣＲ画分は、ｐｔｇ６１８４テンプレートより誘導され、Ｔ₅ＮＴ配列の変化した画分が得られる。５８５ｂｐのＰＣＲ画分は、オリゴヌクレオチドプライマーＭＭ０４０（配列番号５）（５’−ＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡ−ＧＧＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴ ＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴ−３’）と、ＭＭ０４２（配列番号１０）（５’−ＣＣＣＡＴＧｇａｇＴＧＧＧＣＴＡＣ−３’）を使って発生させた。３’側が大半を占める配列から得たＭＭ０４２は、５’側がほとんどを占める配列に向かう。ＭＭ０４１（配列番号１１）を伴う２番目のＰＣＲは、（５’−ＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＣＣＴＡＡＴＴＣＴＴ−３’）とＭＭ０４３（配列番号１２）（５’−ＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＣＡＴＣ−３’）は、１８７ｂｐ画分を発生させた。ＭＭ０４１は２１１８の位置に始まり、ｅｎｖの５’側が大半を占める配列方向へ向かい、ＭＭ０４３は、１９３１の位置（図２）から続くｅｎｖコード配列の３’側が大半を占める配列へ向かう。二つのＰＣＲ生成物をプールし、ＭＭ０４３とＭＭ０４２とでプライムさせ、図２の２０２０のＦＩＶコード配列位置でＳｃａ１にて消去し、ｅｎｖコード配列の３’部分をＥｃｏＲ１で消去した。こうしてできた５６４ｂｐのＳｃａ１−ＥｃｏＲ１−ＰＣＲ画分は、Ｔ₅ＮＴモチーフの変化したＦＩＶｅｎｖコード配列を含む。
プラスミドｐｔｇ６１８４をＥｃｏＲ１で消去し、部分的にＳｃａ１で消去した。この、Ｓｃａ１消去した（図２の２０２０の位置）５’−ＦＩＶｅｎｖからｅｎｖコード配列のＥｃｏＲ１−３’までを含むｐｔｇ６１８４由来画分を、５６４ｂｐのＳｃａＩ−ＥｃｏＲ１によるＰＣＲ誘導画分（前述）に結合させた。こうしてできたプラスミドｐＭＮ１２０は、Ｔ₅ＮＴモチーフの変化したＦＩＶｅｎｖを含む。このヌクレオチド配列を、標準的手順（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ）にて確認した。ＦＩＶｅｎｖコード配列を含む２．６ｋｂｐのｐＭＮ１２０ ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ１画分を、ｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ｃｓｌｉｆｏｒｎｉａ）ＰｓｔＩとＥｃｏＲ１部位に挿入してｐＭＭ１２２を発生させた。
改変した初期／後期ワクシニアウイルスＨ６プロモーター（Ｐｅｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）を、Ｈ６転写開始コドンとＦＩＶｅｎｖ転写開始コドンの重複したｐＭＭ１２２に添加した。Ｈ６をプロモートしたほぼ５’−側の配列からなるｅｎｖコード配列を、プライマーＭＭ０３７（配列番号１３）（５’−ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴ−３’）、ＭＭ０３８（配列番号１４）（５’−ＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣ−３’）、ＭＭ０６５（配列番号１５）（５’−ＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＴＧＣＡＧＣＣ−３’）、およびＭＭ０３６（配列番号１６）（５’−ＣＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＣＧＴＴＣＣ−３’）を使って発生させた。ｐＭＭ１０８は、Ｈ６プロモーター配列を含み、ＭＭ０３７およびＭＭ０３８のテンプレートとなり、Ｈ６プロモーターと５’−側のほとんどからなるＦＩＶｅｎｖコード配列を含む１６６ｂｐの画分を創出した。ｐＭＭ１２２は、ＭＭ０６５とＭＭ００３６のテンプレートとなり、３’−Ｈ６プロモーターおよび５’−ｅｎｖ末端部を伴う２３５ｂｐの画分を創出した。二つのＰＣＲ生成物をプールし、ＭＭ０３６とＭＭ０３７でプライムし、こうしてできた画分すなわちＦＩＶｅｎｖコード配列の５’側の大半から成るｂｐに融合したＨ６プロモーターを、ＰｓｔＩおよびＫｐｎＩで消去して２６６ｂｐの画分を創出した。ｐＭＭ１２２をＰｓｔＩで消去し、部分的にＫｐｎＩで消去してＦＩＶｅｎｖコード領域の５’側の大半からなる配列を消去し、前述のＰｓｔＩ−ＫｐｎＩによるＰＣＲ由来画分を挿入した。こうしてできたプラスミドｐＭＭ１２５は、pＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のワクシニアＨ６プロモーターの３’側に近接してＦＩＶｅｎｖを含む。
ｐＭＭ１２５の配列解析により、Ｈ６プロモートＦＩＶｅｎｖ５’−側を大半とする配列が正しくＰＣＲによって構築されたことが示されたが、ＰＣＲ挿入部の３’側にフレームシフト突然変異が認められた。このフレームシフトはｐＭＭ１２２には認められなかった。ｐＭＭ１２５のクローンはすべてフレームシフトを含んでいた。これらフレームシフトは、おそらく最近記述されたコピー数の多いプラスミド（Ｗａｍｇ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｓ，１９９５）中にｅｎｖ配列が組み込まれたことによる。別個のｐＭＭ１２５クローンは、異なるフレームシフトを有する。フレームシフトをもたないＨ６プロモートＦＩＶｅｎｖを、次の方法により構築した。
簡単にいえば、これは、フレームシフトを有しないＨ６プロモートＦＩＶｅｎｖについての詳細な記述を要約したものである。フレームシフトを有しない、ＦＩＶｅｎｖコード配列の、Ｈ６プロモート５’側を大半とするｐＭＭ１２５の１個のクローン由来の配列を、別のｐＭＭ１２５クローンから得た３’側を大半とするＦＩＶｅｎｖ末端部のフレームシフトしていない残りのｂｐに結合させた。最初の画分は、Ｈ６プロモータの５’側のＳｍａＩ部位からＦＩＶｅｎｖコード配列のＡｆｌＩＩ部位までとした（図１の１７０７の位置）。２番目の画分は、同一のＡｆｌＩＩ部位からｅｎｖコード配列の３’側のＳｍａＩ部位であった。結合による生成物をＳｍａＩで消去し、３つの画分を遊離させた。一方の画分は、２つの５’側を大半とする配列を含み、他方の画分は、２つの３’側を大半とする配列を含んでいた。ＦＩＶｅｎｖ発現カセットを含む３つ目のＳｍａＩ消去画分を単離して、Ｈ６プロモートベクターに挿入し、ｐＲＷ９４５を作った。フレームシフトの可能性を排除するために、ｐＲＷ９４５はバクテリア内で増幅させなかった。ｐＲＷ９４５の構築については後で詳しく記す。
１個のｐＭＭ１２５クローンｐＭＭ１２５＃１１は、Ｈ６プロモーターのＳｍａＩの５’側からＡｆｌＩＩ部位を、１７０７の位置において正しい配列を有していた。別のｐＭＭ１２５クローンであるｐＭＭ１２５＃１０は、１７０７の位置におけるＡｆｌＩＩ部位からｅｎｖコード配列のＳｍａＩ３’までの正しい配列を含んでいた。Ｈ６プロモート５’側を大半とするｅｎｖ配列を含む１．８ｋｂｐのｐＭＭ１２５＃１１のＳｍａＩ−ＡｌｆＩＩ画分を、０．９ｋｂｐのｐＭＭ１２５＃１０のＳｍａＩ−部分的ＡｆｌＩＩ画分に結合した。結合によってできた生成物を、ＳｍａＩで消去し、２．７ｋｂｐの画分を、Ｃ６ベクターｐＭＭ１１７に挿入し、ｐＲＷ９４５を得た。
Ｃ６挿入プラスミドｐＭＭ１１７を以下の方法で構築した。３ｋｂｐのＡＬＶＡＣ・ＨｉｎｄＩＩＩクローンの塩基配列を決定し、オープン読取りフレームを定義した。オープン読取りフレームと、ＤＮＡ挿入における制限部位とを置き換えるため、ＰＣＲ由来画分を使用した。ＰＣＲ由来画分は、プライマＣ６Ａ１（配列番号１７）（５’−ＡＴＣＡＴＧｇａｇＣＴＶＶＣＶＶＣＣＶＣＣＴＡＴＶＡＡＡＡＧＴＣＴＴＡＡＴｇａｇＴＴ−３’）、Ｃ６Ｂ１（配列番号１８）（５’−ＧＡＡＴＴＣＣＴＣｇａｇＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＴＴＴＴＴＣＧＴＡＡＧＴＡＡＧＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＡ−３’）、Ｃ６Ｃ１（配列番号１９）（５’−ＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣｇａｇＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＡＡＴｇａｇＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＡ−３’）、およびＣ６Ｄ１（配列番号２０）（５’−ＧＡＴＧＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＣＴＴＡＡＧＴＴＧ−３’）を使用して作った。オリゴヌクレオチドＣ６Ａ１とＣ６Ｂ１を使ったＰＣＲのテンプレートにはＡＬＶＡＣを使用し、３８０ｂｐの画分を得た。２回目のＰＣＲ反応では、ＡＬＶＡＣテンプレートと、プライマーＣ６Ｃ１およびＣ６Ｄ１を使用し、１１５５ｂｐの画分を得た。このＰＣＲ反応生成物をプールし、最終ＰＣＲとしてプライマーＣ６Ａ１、Ｃ６Ｄ１にプライムし、１６１３ｂｐの画分を得た。最終ＰＣＲ生成物をＳａｃＩとＫｐｎＩで消去し、ｐＢＳ−ＳＫのＳａｃＩとＫｐｎＩ部位の間に挿入した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。こうして生成したＣ６挿入プラスミドを、ｐＣ６Ｌと命名した。このＣ６挿入プラスミドｐＭＭ１１７を、ｐＣ６Ｌ（図４、配列番号３）のＳｍａＩ、ＥｃｏＲ１部位の間の配列ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣ（配列番号２１）を添加することにより構築した。
前述のプラスミドｐＲＷ９４５は、Ｃ６挿入プラスミドにおいてＴ₅ＮＴモチーフの変化したＨ６プロモートＦＩＶｅｎｖコード配列を含む。ｐＲＷ９４５を使用して、ウイルスのレスキュー用にＡＬＶＡＣを使い、ｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換え実験を実施し、組み換え体ＶＣＲ２４２を誘導した。図５は、ＶＣＰ２４２（配列番号４）に挿入された予想されるヌクレオチド配列を示す。
実施例２−ＦＩＶｇａｇおよびｐｒｏを発現する組み換えＡＬＶＡＣの構築
プラスミドｐｔｇ８１３３中のＦｅｌｉｎｅ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ｇａｇおよびｐｏｌコード配列と、プラスミドｐｔｇ６１８４内のＦＩＶｅｎｖコード配列を、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ（Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）より入手した。このｃＤＮＡクローンは、ＦＩＶのＶｉｌｌａｆｒａｎｃｈｅ株に由来した。図３（配列番号２）は、Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘから入手したＦＩＶｇａｇおよびｐｏｌコード配列に相当するヌクレオチド配列を含む。
コア抗原をコードするＦＩＶｇａｇ配列、そしてプロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼをコードするｐｏｌ配列を、初期／中期ワクシニアＩ３Ｌプロモータ（Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｊ ａｎｄ Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ，１９８８；Ｖｏｓ，Ｊ ａｎｄ Ｓｔｕｎｎｅｕｂｅｒｇ Ｈ．，１９８８）の管理下においた。Ｉ３Ｌプロモーターは、Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ，ｂ．では、６５０７３から６４９７１の位置に相当する。単一転写ユニット中で、ｇａｇおよびｐｏｌコード配列を合成した。ｇａｇとＰｏｌオープン読取りフレーム（ＯＲＦＳ）はたがいに異なり、ＰｏｌＯＲＦの翻訳は、通常、ＦＩＶ感染細胞中で行われるように、リボゾーム・フレームシフトメカニズム（Ｍｏｒｉｋａｗａ ａｎｄ Ｂｉｓｈｏｐ，１９９２）を介在して起こる。
ＰＣＲ由来画分を使用し、Ｉ３ＬプロモートＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌカセットを構築した。ＰＣＲ由来画分はまた、未成熟の初期転写終了を提供するＴ₅ＮＴ配列モチーフを変化させる目的でも使用した（Ｙｕｅｎ ａｎｄ Ｍｅａｓ，１９８７）。４６７から４７３（図３）の間に位置するＴＴＴＴＴＡＴは、予想されるアミノ酸コード配列を変化させなくても、ＴＴＴＴＣＡＴに変化した。以下の方法により、Ｉ３ＬプロモートＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ発現の構築をマニピュレートした。
ＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード配列を含むｐｔｇ８１３３をテンプレートに使い、プライマーとしてＭＭ０２７（配列番号２２）（５’−ＣＡＡＡＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＧＣＡＡｇａｇＡＡＧＧＡＣ−３’）とＭＭ０２８（配列番号２３）（５’−ＣＴＧＣＴＧＣＡＧＴＡＡＡＡＴＡＧＧ−３’）を使って、ＰＣＲを実施し、２４５ｂｐの画分を作成した。ＭＭ０２７は、４５２の位置（図３）からプライムし、Ｔ₅ＮＴ配列モチーフにヌクレオチドの変化を含んでいる３’側を大半とする配列へ向かった。ＭＭ０２８は、ＨｉｎｄＩＩＩより下流の６９７の位置からプライムし、ｇａｇの５’側を大半とする配列に向かった。２４５ｂｐのＰＣＲ由来画分は、４５２の位置から、変化の生じたＴ₅ＮＴモチーフの存在する６９７の位置にあるＦＩＶｇａｇコード配列を含む。
２回目のＰＣＲでは、ｐｔｇ８１３３をテンプレートとし、ＭＭ０２９（配列番号２４）（５’−ＣＴＴＣＴＣＴＴＧＣＣＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＴＴＴＴＴＧＧＧＴＣ−３’）とＭＭ０３０（配列番号２５）（５’−ＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴＴＴＡＡＴＣＡＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＣＡＧＧＧＧＣ−３’）をプライマーに使用して、５０８ｂｐの画分を作成した。ＭＭ０２９は４９０の位置（図３）からプライムして、ｇａｇコード配列の５’側を大半とする配列に向かい、Ｔ₅ＮＴ配列モチーフを変化させる。ＭＭ０３０はＩ３Ｌプロモーターの３’側配列をほとんど含み、ｇａｇ開始コドンからプライムして、ｇａｇコード配列の３’側を大半とする配列に向かう。５０８ｂｐのＰＣＲ由来画分は、Ｉ３Ｌプロモーターの３’側の大半と、４９０の位置まで続くＴ₅ＮＴモチーフが変化したＦＩＶｇａｇコード配列とを含む。
Ｉ３Ｌプロモーター配列を含むプラスミドテンプレートｐＭＭ１００を、ＭＭ０３１（配列番号２６）（５’−ＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣ−３’）とＭＭ０３２（配列番号２７）（５’−ＣＧＣＣＣＣＴＧＴＣＣＡＴＴＣＣＣＣＡＴＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＣ−３’）とをプライマーとして１３７ｂｐのＰＣＲ由来画分を作成した。このＭＭ０３１は、５’側を大半とし、続いてＩ３Ｌプロモーターの３’側を大半とする配列からプライムして、Ｉ３Ｌプロモーターの５’側を大半とする配列へ続くｂｐを含む。ＭＭ０３２はＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位を有し、Ｉ３Ｌプロモーター５’側を大半とする配列がこれに続き、３’側を大半とする配列に続く。１３７ｂｐのＰＣＲ由来画分は、Ｉ３ＬプロモートＦＩＶｇａｇの５’側を大半とする画分を含む。
３つのＰＣＲ画分をプールし、ＭＭ０３２とＭＭ０２８とをプライマーとしてプライムした。こうしてできた８１４ｂｐの画分を、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで消去し、Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇの５’側を大半とする配列にＴ₅ＮＴモチーフが付加した配列を含む７２６ｂｐの画分を作成した。
ｐｔｇ８１３３をＳａｃＩとＳａｌＩで消去し、７．２ｋｂｐのプラスミド配列を除去して、４．７ｂｐの画分を単離し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分的に消去した。ＦＩＶｇａｇコード配列を６１５の位置からＦＩＶｐｏｌコード配列まで含む、４ｋｂｐのｐｔｇ８１３３ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部分消去生成物を単離した。
ＳａｃＩ−ＳａｌＩ消去したｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、７２６ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩによるＰＣＲ由来画分（前述）と、４ｋｂｐのｐｔｇ８１３３・ＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ画分と共に結合する。こうしてできたプラスミドｐＭＭ１１６は、ｐＢＳ−ＳＫ中において、Ｉ３ＬプロモートＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ発現カセットを含む。
Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード配列を含む４．７ｋｂｐのｐＭＭ１１６・Ａｓｐ７１８−Ｅｃ１１３６ＩＩ画分を、２０ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＫｌｗｎｏｗ処理し、ＳｍａＩ消去したｐＭＭ１１７に挿入して、ｐＭＭ１２１を作成した。ｐＭＭ１１７は前述したＣ６挿入プラスミドである。
Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌ・５’側を大半とする領域を含む１．４ｋｂｐのｐＭＭ１２１・ＥｃｏＲ１画分を、ｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＥｃｏＲ１部位に挿入して、ｐＭＭ１２３を得た。ＰＣＲ由来画分を使い、Ｐｏｌのカルボキシル末端に相当する部分を除去して、ｇａｇ−Ｐｒｏｔｅａｓｅ発現のみを起こすようにした。ＰＣＲ由来画分は終末コドンを誘導し、続いて１７０９の位置において（図３）プロテアーゼコード配列を誘導した。Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列を構築するマニピュレートを、以下の方法で構築した。
Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／ｐｏｌコード配列を含有するテンプレートｐＭＭ１２１を、ＭＭ０６３（配列番号２８）（５’−ＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＡＧＣＡＡＧＡＣ−３’）と、ＭＭ０６４（配列番号２９）（５’−ＧＡＴＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴｇａｇＣＣＡＴＴＡＣＴＡＡＣＣＴ−３’）とをプライマーとしてプライムし、５８０ｂｐのＰＣＲ由来画分を作成した。ＭＭ０６３は１１４８の位置（図３）からプライムして、３’側を大半とする配列へ向かった。ＭＭ０６４は、１７０９の位置からプライムして、５’側を大半とする配列へ向かった。ＦＩＶプロテアーゼコード配列および１７０９の位置（図３）に停止コドンを含む５８０ｂｐのＰＣＲ由来画分を、ＥｃｏＲ１とＳｍａＩで消去して、４７５ｂｐの画分を得た。
ｐＭＭ１２３をＦＩＶ挿入部位のＳｍａＩ３’部位において直線状にし、続いてＥｃｏＲ１で部分的に消去した。４７５ｂｐのＳｍａＩ−ＥｃｏＲ１・ＰＣＲ由来画分（前述）をｐＭＭ１２３・ＳｍａＩ−ＥｃｏＲ１部分消去生成物に挿入し、ＥｃｏＲ１部位を図３における１２４６の位置で消去した。こうして得られたプラスミドｐＭＭ１２７はＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列を含み、続いて停止コドンをｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に含む。ｐＭＭ１２７におけるＰＣＲ由来画分のヌクレオチド配列を、標準的手順（Ｇｏｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ａ）にて確認した。ＦＩＶプロテアーゼコード配列の３’側における１ｂｐのみの消去が観察された。ＭＭ０６４を、ＦＩＶプロテアーゼ停止コドンの後にＴＴＴＴＴＡＴを添加するよう設計した。停止コドンの後ろにあるＴＴＴＴＡＴ配列のＴは、ｐＭＭ１２７から１個喪失し、その結果として配列ＴＴＴＴＡＴとなった。
Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列を含む１．８ｋｂｐのｐＭＭ１２７・ＢａｍＨ１−ＳｍａＩ画分を、部分的に消去したｐＭＭ１１７のＳｍａＩ−ＢａｍＨ１部位に挿入した。Ｃ６挿入プラスミドｐＭＭ１１７は前述のとおりである。ＢａｍＨ１による部分的消去は、ｐＭＭ１１７中のＳｍａＩ部位に隣接するＢａｍＨ１部位を消去する目的で行った。結果として生じたＩ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列をＣ６挿入部位に含むプラスミドを、ｐＭＭ１２９と命名さいた。プラスミドｐＭＭ１２９は、ＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとして使用するｉｎ ｖｉｔｒｏの組み換え実験に使用し、組み換え体ＶＣＰ２５３を誘導した。図６（配列番号５）は、ＶＣＰ２５３におけるＩ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カセットについて予想されるヌクレオチド配列と、フランク領域を示す。
実施例３−ＦＩＶのｅｎｖ，ｇａｇおよびｐｒｏを発現する組み換えＡＬＶＡＣの構築
フレームシフト突然変異を起こしているＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖのプラスミドｐＭＭ１２５は前述のとおりである。ＦＩＶｅｎｖコード配列にフレームシフトを含む計画的挿入を行った結果、バクテリア内部においてＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ構築物の残留部分を安定して維持できるようになった。バクテリアにおける増幅後、挿入部を除去した。Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列を構築するマニピュレーションを、計画的フレームシフト挿入により以下の方法で実施した。
ｐＭＭ１２５＃１１（前述）を、フレームシフトを自発的に修復したＰＣＲ由来画分を挿入することによって修飾し、ＢｓｔＥＩＩ部位によりフランクにした計画的フレームシフトを誘導した。ＢｓｔＥＩＩ挿入部は１９２０の位置（図２）にある。この挿入により、停止コドンが誘導され、続いてフレームシフト、ＮｏＬＴおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位が誘導される。ｐＭＭ１２５にはＢｓｔＥＩＩ部位が一つもない。ＰＣＲ由来画分はまた、図２における１９２０の位置で、ＡをＣに変化させる。ＡからＣへの変化は、予想されるアミノ酸コード配列を変化させないが、この変化はＢｓｔＥＩＩ部位を誘導する。ｐＭＭ１２５＃１０は１６０４の位置（図２）に自発的フレームシフトを有する。ｐＭＭ１２５＃１０をＰＣＲのテンプレートに使い、オリゴヌクレオチドプライマーＲＷ５４２（配列番号３０）（５’−ＧＴＡＧＣＡＴＡＡＧＧＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＴＴＡＣＣＡＴＣＣＣＴＡＴＡＧＣＡＧＴＡ−３’）を使って、ＢｓｔＥＩＩ挿入部を含む３２６ｂｐの画分を作成した。ＲＷ５４２は１６３２の位置からプライムしてＦＩＶｅｎｖの３’側を大半とする配列へ向かい、ＲＷ５４５は１９１９の位置からプライムしてＦＩＶｅｎｖ５’側を大半とする配列へ向かった（図２）。ｐＭＭ１２５＃１０をＰＣＲのテンプレートに使い、ＲＷ５４４（配列番号３２）（５’−ＧＴＡＧＣＡＴＡＡＧＧＴＡＡＣＣＴＡＡＧＣＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＣＣＣＡＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＴＧＧＣ−３’）とＴ３（配列番号３３）（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ−３’）をプライマーに使用して、ＢｓｔＥＩＩ挿入部とＦＩＶｅｎｖコード配列の３’側の大半を含む配列を含む７９１ｂｐの画分を作成した。ＲＷ５４４は１９１４の位置からプライムしてｅｎｖの３’側を大半とする配列に向かう。Ｔ３はｐＢＳ−ＳＫプラスミドにおいて、ＦＩＶｅｎｖ停止コドンの下流からプライムし、ＦＩＶｅｎｖの５’側を大半とする配列に向かう。２つのＰＣＲ生成物をプールし、ＲＷ５４２とＴ３でプライムして、結果として生じた１．１ｋｂｐの生成物をＥｃｏＲ１で消去し、部分的にＡｆｌＩＩで消去して、次のｐＭＭ１２５＃１１ベクターへ挿入する８７６ｂｐの画分を作成した。ＰＣＲ由来画分とｐＭＭ１２５＃１１ベクターを、ＡｆｌＩＩによって１９０７の位置（図２）で消去した。ｐＭＭ１２５＃１１をＥｃｏＲ１とＥｃｏＲＩとで消去して、ＦＩＶｅｎｖコード配列の３’側を大半とする、自発的フレームシフトを含んだ配列を除去した。このＥｃｏＲ１−ＡｆｌＩＩ・ＰＣＲ由来画分である３７６ｂｐの画分を、ｐＭＭ１２５＃１１・ＥｃｏＲ１−ＡｆｌＩＩベクターに挿入した。結果として生じたプラスミドｐＭＭ１３４は、ｐＢＳ−ＳＫ（Ｓｔａｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中においてＨ６プロモーターの３’に近接するＦＩＶｅｎｖコード配列を含む。ｐＭＭ１３４はまた、二つのＢｓｔＥＩＩ部位化に挿入した計画的フレームシフト突然変異を含む。ｐＭＭ１３４におけるＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ配列全体は、ＢｓｔＥＩＩ挿入部を含むことが確認された。期待されたとおり、ＢｓｔＥＩＩ挿入により、Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ構築物の残留物が安定して維持できることがわかった。
ｐＭＭ１３４からＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列をボックスウイルス挿入プラスミドへクローンしたあと、ＢｓｔＥＩＩ挿入部を除去して、ＦＩＶｅｎｖコード配列全長が発現できるようにすること。ＢｓｔＥＩＩ挿入部をＢｓｔＥＩＩ消去により除去し、続いて分子内結合を促進するべく希釈結合反応を行う。分子内結合生成物は、ＢｓｔＥＩＩ挿入を実施しなくても、Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖを含むことになる。ＢｓｔＥＩＩ挿入部を除去したあと、Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列はバクテリア内で安定して維持されるとは予測されず、このプラスミドがバクテリア内で増幅されなかった。結合後、このプラスミドをＮｏｔＩで消去した。ＢｓｔＥＩＩ挿入部を含む結合生成物を、ＢｓｔＥＩＩ挿入部において、ＮｏｔＩ部位において消去されたと考えられる。ＢｓｔＥＩＩ挿入部内でのＮｏｔＩ消去によって、プラスミドが生きたままの組み換えポックスウイルスを発生させる能力が予防されると考えられれる。ＢｓｔＥＩＩ挿入部のないＦＩＶｅｎｖの全長が、ＮｏｔＩ消去によって増えるとは考えられず、ＦＩＶｅｎｖコード配列は影響を受けないまま残ると考えられる。
実施例４−Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼ高度配列を伴うＣ６におけるＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列の構築
ＢｓｔＥＩＩ挿入部を伴ったＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列を含むｐＭＭ１３４は前述のとおりであった。ＢｓｔＥＩＩを伴うｐＭＭ１３４由来の、２．７ｋｂｐのＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列を有するＳｍａＩ画分を、次のｐＭＭ１２９挿入プラスミドへクローン化した。
Ｃ６にＩ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列を有するｐＭＭ１２９は前述のとおりであった。ｐＭＭ１２９における、Ｉ３ＬプロモーターのＳａｌＩ５’部位を、３０ｍＭのｄＮＴＰｓ存在下でＫｌｅｎｏｗ処理によりブラント化した末端部とした。Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列を含み、ＢｓｔＥＩＩ挿入部を伴う２．７ｋｂｐのｐＭＭ１３４ＳｍａＩ画分を、ｐＭＭ１２９のブラント末端化したＳａｌＩ部位に挿入した。Ｈ６プロモーターＦＩＶｅｎｖコード配列は、ｐＭＭ１３８において、Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびプロテアーゼコード配列の５’側に位置する。ＦＩＶコード配列は、同じ方向へ転写される。
ｐＭＭ１３８における２つのＢｓｔＥＩＩ部位は、フレームシフト部分を含む挿入部を取り囲んでいる。ｐＭＭ１３８をＢｓｔＥＩＩで消去して、挿入部を除去し、続いて結合させた。こうしてできたプラスミドｐＭＭ１４６をバクテリア内で増幅させなかった。ｐＭＭ１４６をｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換え試験実施前に、ＮｏｔＩで消去するよう設計した。ＮｏｔＩ消去には２つの目的があった。一つ目は、ＢｓｔＥＩＩ挿入部を含まないようにしたいあらゆるプラスミドを、挿入部においてＮｏｔＩで消去し、ドナープラスミドを排除して生きたままのＡＬＶＡＣ組み換え体を得ることであった。２つ目は、ＮｏｔＩがｐＢＳ−ＳＫバックボーンにおいてｐＭＭ１４６を直線化し、所望するＡＬＶＡＣを効率よく得ることであった。ＡＬＶＡＣをレスキューウイルスとして使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換え試験実施前に、ｐＭＭ１４６をＮｏｔＩで消去して、組み換え体ＶＣＰ２５５を誘導した。図７（配列番号６）は、ＶＣＰ２５５におけるＨ６プロモーターＦＩＶｅｎｖ／Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇ／プロテアーゼ発現カセットと、フランク領域を示す。
実施例５−ＦＩＶ ９７ＴＭ，ｇａｇ，およびｐｒｏを発現する組み換え体ＡＬＶＡＣの構築
ＦＩＶエンベロープグリコプロテインは断裂生成物ｇｐ９７とｇｐ４０から構成される。ＦＩＶｅｎｖコード配列を、ｇｐ４０とＦＩＶｅｎｖコード配列から得た膜透過アンカードメインと交換することによって、続くＦＩＶ ９７ＴＭの構築において修飾した。ｇｐ９７を含有するＦＩＶ ９７ＴＭを、以下の方法で構築した。
ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＴＶ１（２４２ｂｐ）を、ｐＭＭ１２５＃１０（前述のＦＩＶｅｎｖに、ＡｆｌＩＩ部位から３’側の大半からなる配列までの正確な配列を含む）をテンプレートとして使用し、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＭＷ１９６（配列番号３４）（５’−ＡＣＴＴＧＣＣＡＴＣＧＴＣＡＴＧＧＧＧＧ−３’）と、ＭＷ１９５Ａ（配列番号３５）（５’−ＧＡＴＡＣＦＴＣＣＣＡＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＴＴＣＣＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＴＡＴＴＣ−３’）を使用して合成した。ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＩＶ２（１９３ｂｐ）は、ｐＭＭ１２５＃１０をテンプレートとして使い、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＭＷ２９４Ａ（配列番号３６）（５’−ＧＡＡＴＡＴＡＡＡＣＣＴＡＧＡＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＡＴＴＧＧｇａｇＧＴＡＴＣ−３’）とＭＷ１９７（配列番号３７）（５’−ＡＴＣＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＡＣＴＴＣ−３’）を使用して合成した。ＰＣＲ−ＦＩＶ３（３９３ｂｐ）は、ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＴＶ１とＰＣＲ−ＦＩＶ２をテンプレートとし、オリゴヌクレオチドＭＷ１９６ＭＷ１９７をプライマーとして合成した。ＰＣＲ−ＦＩＶ３のＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲ１による完全な消去を実施し、２８４ｂｐの画分を単離した。この画分を、ｐＭＭ１２５＃１１（前述のＦＩＶｅｎｖと、５’側を大半とする配列から前述のＥｃｏＲ１部位までを含む正確な配列を含む）の４．８ｋｂｐからなるＡｆｌＩＩ／ＥｃｏＲ１画分に結合させた。こうして得られたプラスミドｐＭＡＷ１０３は、Ｈ６プロモーターＦＩＶ ９７ＴＭを含む。
ＰｓｔＩ部位をＨ６プロモーターの上流へ、以下の方法により添加した。ＰＣＲ由来画分ＰＣＲ−ＦＩＶ４（３５９ｂｐ）を、ｐＭＡＷ１０３をテンプレートにし、オリゴヌクレオチドＭＷ２０９（配列番号３８）（５’−ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡ−３’）とＭＭ０３６（配列番号１６）（５’−ＣＣＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＣＧＴＴＣＣ−３’）をプライマーとして合成した。ＰＣＲ−ＦＩＶ４のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｒｕＩによる完全消去を実施し、１１０ｂｐの画分をｐＭＡＷ１０３の５．０ｋｂｐからなるＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｒｕＩ画分に挿入し、プラスミドｐＭＡＷ１０３Ａを得た。この２１２６ｂｐからなるｐＭＡＷ１０３の、Ｈ６プロモーターＦＩＶ ９７ＴＭを含むＰｓｔＩ画分を、ｐＭＷ１１７（前述）のＰｓｔＩ部位へ挿入し、プラスミドｐＭＡＷ１０４を得た。
２８５２ｂｐからなるｐＭＡＷ１０４をＢａｍＨ１で部分的に消去して得た、Ｈ６プロモーターＦＩＶ ９７ＴＭ含有の生成物を、ＢａｍＨ１消去したｐＭＷ１２９（Ｉ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびｐｒｏが前述のようにＣ６に含まれる）に挿入した。こうして得られたプラスミドｐＭＡＷ１０５は、Ｃ６においてＨ６プロモーターＦＩＶ ９７ＴＭおよびＩ３ＬプロモーターＦＩＶｇａｇおよびｐｒｏを含む。プラスミドｐＭＡＷ１０５を使用して、ＡＬＶＡＣをレスキュー用ウイルスとして使用するｉｎ ｖｉｔｒｏでの組み換え実験において、組み換え体ＶＣＰ３２９を誘導した。図８（配列番号７）は、ＶＣＰ３２９を作成する上で予測されるヌクレオチド配列を示す。
実施例６ ＡＬＶＡＣ ＦＩＶ 組換体発現分析
ＡＬＶＡＣ組換体であるｖＣＰ２４２、ｖＣＰ２５３、ｖＣＰ２５５やｖＣＰ３２９にコードされた適当なＦＩＶ−特異的遺伝子産物の発現を各種の分析より示した。発現解析は、ＦＩＶ血清陽性のネコより得た適当なモノクローナル抗体または血清を用いて行った。これら抗体、血清のＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ−感染した細胞中の発現を確認する上での性能は同等であった。従って、特に記載されていない限り、血清陽性の個体よりモノクローナル抗体を得て、これを利用して発現を確認した。
ＶＣＰ２４２ ＦＩＶ Ｅｎｖの発現はＥＬＩＳＡ（後述）により確認した。ＦＩＶ Ｅｎｖ特異モノクローナル抗体（Ｒｈｏｎｅ−Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いたＦＡＣＳによる免疫蛍光アッセーではＶＣＰ２４２は表面に発現していた。ＦＩＶに感染したネコから得たポリクローナル血清と２種留のモノクローナル抗体（後述）を用いた免疫沈降では、ＶＣＰ２４２は沈降反応陽性であった。即ち、特別な実験なしに発現確認のためのモノクローナル抗体を血清陽性の個体から得ることができる。
ＦＡＣＳによりＶＣＰ２５３ではＧａｇは内部発現していることが確認された。ＶＣＰ２５３は成熟型Ｇａｇ ｐ２４の発現を調べる免疫沈降試験で陽性であった。主要なＧａｇ前駆体は３７ｋＤａの大きさを示す位置に検出された；Ｇａｇの開裂産物を示す別のシグナルが４９ｋＤａ、４０ｋＤａと３２ｋＤａの位置に確認された。
Ｅｎｖ特異モノクローナル抗体（後述）を用いたＦＡＣＳでは、ＥｎｖはＶＣＰ２５５の表面に発現していた。Ｇａｇ特異抗体を用いたＦＡＣＳではＶＣＰ２５５ではＧａｇは内部で発現していことが示された。ＶＣＰ２５５を各遺伝子産物に対するモノクローナル抗体で免疫沈降させて調べた；Ｇａｇはおよそ４９ｋＤａ、４０ｋＤａ、３７ｋＤａと２４ｋＤａの位置にシグナルを持っていた；ＦＩＶ Ｅｎｖの発現体は１３０ｋＤａと９０ｋＤａの位置にシグナルを持っていた。
ＶＣＰ３２９による９７ＴＭとｇａｇの発現はＦＩＶに感染したネコより集めたプール血清を用いた免疫沈降法により検出した。
ＦＡＣＳ分析：ＶＣＰ２５５はＣ６座の中にネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のｅｎｖ、ｇａｇならびにプロテアーゼをコードしている配列を含んでいる。ｐＭＭ１４６をＡＬＶＡＣを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換体発現実験にレスキューウイルスとして利用し、組換体ＶＣＰ２５５を誘導した。ＶＣＰ２５５ ＦＩＶ−特異遺伝子産物の発現は蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて調べた。ＶＣＰ２５５感染細胞の表面上のＦＩＶのＥｎｖ蛋白質産物を測定した。内部での発現解析のためにＦＩＶ ｐ２４を測定した。ＦＡＣＳ解析に用いたこう血清は次の通りである。
１）モノクローナル抗−ＦＩＡ ｅｎｖ：Ｒｏｈｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘより得た１２８Ｆ１０ ＥＰ１１０５９２（１：２００希釈）
２）モノクローナル抗−ＦＩＡ ｐ２４：Ｒｏｈｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘより得たプール１２５Ａ３、３１４Ｂ５ ＥＰ０７２０９２（１：１００希釈）
３）モノクローナル抗−狂犬病Ｇ：Ｃ，Ｔｒｉｍａｒｃｈｉ、Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｓｔａｔｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔより得た２４−３Ｆ−１００２１３８７（１：２００希釈）
４）Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍより得たイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）が結合したポリクローナルヤギ抗−マウスＩｇＧ、
カタログ番号６０５３４０、ロット番号２４０６４（１：１００希釈）
細胞表面での発現に関するＦＡＣＳ分析：１０％のウシ胎児血清、２０ｍＭグルタミンと０．５％ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた最低必須培地（Ｓ−ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ＃３８０−２３８０ＡＪ）の中で１×１０⁷のＨｅＬａ−Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ２．２）に５×１０⁷ＦＦＵのＶＣＰ２５５を感染させた。細胞を１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで洗浄した。洗浄後、細胞をＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＫＲ遠心分離装置で１０００ＲＰＭ、５分間遠心して沈殿した。感染細胞の沈殿を１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁し、５ｍｌのサーシュタット（Ｓａｒｓｔａｄｔ）チューブに移し、３７℃で一晩ゆっくりと回転した。
一晩反応させた後、この感染細胞の一部１００μｌを５ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。この細胞を３ｍｌの０．２％のＮａＮ₃と０．２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ−ＣＭＦ（１３７ｍＭ、ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ₂ＰＯ₄、８ｍＭ Ｎａ₂ＰＯ₄；ｐＨ７．４）で洗浄した。細胞を沈殿させ、上清を捨てた。次の様にして特異抗体を第一のチューブに、そして非特異抗体（抗狂犬病Ｇ）を第二のチューブに加えた。
０．２％ＮａＮ₃と０．２％のＢＳＡを加えたＰＢＳ−ＣＭＦで希釈された抗体（事前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１００μｌを各沈殿細胞に加え、４℃で３０分間反応させる。細胞を３ｍｌの０．２％ＮａＮ₃と０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ−ＣＭＦで２回洗浄し、沈殿させた。０．２％ＮａＮ₃と０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ−ＣＭＦで１：５０に希釈したＦＩＴＣ結合二次抗体（事前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１００μｌを加え、暗所４℃で３０分間反応させた。細胞を３ｍｌの０．２％ＮａＮ₃と０．２％のＢＳＡを含むＰＢＳ−ＣＭＦで２回洗浄し、沈殿させた。沈殿した細胞を０．２％ＮａＮ₃と０．２％のＢＳＡを含む１ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦに再懸濁し、５ｍｌのポリスチレンチューブに移してからＦＡＣＳにかけて測定した。
内部発現に関するＦＡＣＳＣＡＮ分析：１０％のウシ胎児血清、２０ｍＭグルタミンと０．５％ペニシリン−ストレプトマイシンを加えた最低必須培地（Ｓ−ＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ＃３８０−２３８０ＡＪ）の中で１×１０⁷のＨｅＬａ−Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ２．２）に５×１０⁷ＦＦＵのＶＣＰ２５５を感染させた。感染した細胞は３７℃で３０分間時々混合を加え、反応させた。細胞を１０ｍｌのＳ−ＭＥＭで洗浄した。洗浄後、細胞をＢｅｃｋｍａｎ ＧＰＫＲ遠心分離装置で１０００ＲＰＭ、５分間遠心して沈殿させた。感染細胞の沈殿を１ｍｌのＳ−ＭＥＭに再懸濁し、５ｍｌのサーシュタット（Ｓａｒｓｔａｄｔ）チューブに移し、３７℃で一晩ゆっくりと回転した。
一晩反応させた後、この感染細胞の一部１００μｌを５ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。この細胞を３ｍｌの０．２％のＮａＮ₃を含むＰＢＳ−ＣＭＦで洗浄した。０．２％のＮａＮ₃を含むＰＢＳ−ＣＭＦの４％パラフォルムアルデヒド（Ｐｏｌｙｓｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ。＃００３８０）液、ｐＨ７．４ １００μｌを沈殿した細胞に加え、氷上で１０分間反応させた。次の様にして特異抗体を第一チューブに、そして非特異抗体（抗狂犬病Ｇ）を２番目のチューブ加えた。
パラホルムアルデヒド処理された細胞を０．２％のＮａＮ₃を含む３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦで洗浄した。洗浄後、０．２％ＮａＮ₃と１％のサポニン（ＳＩＧＭＡＳ−７９００）と２０％の加熱不活化したウシ新生児血清（Ｇｉｂｃｏ ＃２００−６０１０ＡＪ）を含むＰＢＳ−ＣＭＦ１００μｌを加えた。細胞を氷上で２０分間反応させてから０．２％のＮａＮ₃を含む３ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦで洗浄した。
０．１％サポニンと２０％の加熱不活化したウシ新生児血清を加えたＰＢＳ−ＣＭＦで希釈された抗体（事前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１００μｌを各沈殿細胞に加え、４℃で３０分間反応させた。細胞を３ｍｌの０．２％ＮａＮ₃と０．１％のサポニンを含むＰＢＳ−ＣＭＦで２回洗浄し、沈殿させた。
０．２％ＮａＮ₃と０．１％のサポニンと２０％の加熱不活化したウシ新生児血清を含むＰＢＳ−ＣＭＦで１：５０に希釈したＦＩＴＣ結合二次抗体（事前にＨｅＬａ細胞で前吸収した）１００μｌを加え、暗所４℃で３０分間反応させた。細胞を３ｍｌの０．２％ＮａＮ₃と０．１％のサポニンを含むＰＢＳ−ＣＭＦで２回洗浄し、沈殿させた。沈殿した細胞を０．２％ＮａＮ₃を含む１ｍｌのＰＢＳ−ＣＭＦに再懸濁し、５ｍｌのポリスチレンチューブに移してからＦＡＣＳにかけて測定した。
ＶＣＰ２５５のＦＡＣＳ分析：抗血清／ＨｅＬａ懸濁液をＢｅｃｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎモデルＦＣ ＦＡＣＳｃａｎフローメーターにかけて測定した。データはＬｙｓｉｓＩＩソフトウエアー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＵＫ）で分析した。抗血清／ＨｅＬａ懸濁液は４８８ｎｍのアルゴンレーザーで励起され、ＦＩＴＣ放射光スペクトラをＦＬ−１チャンネル検出器で特定した。１０，０００細胞について非ゲートデータを集めた。
ＡＬＶＡＣ感染ＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳ分析から得た放射蛍光スペクトラより狂犬病ＧとＦＩＶ−特異遺伝子産物のバックグランドレベルが示された。ｒａｂｉｅｓＧグリコタンパク質のバックグランドレベルは、ＶＣＰ２５５感染ＨｅＬａ細胞のＦＡＣＳ分析によって得られる。
ＦＩＶ特記モノクローナル抗体を用いて得たＶＣＰ２５５が感染したＨｅＬａ細胞の放射蛍光スペクトラからは、ＦＩＶ−特異遺伝子産物の発現が示された。ＦＩＶ ｐ２４をコードする配列の産物はＶＣＰ２５５感染ＨｅＬａ細胞の内部に検出された。ＦＩＶ Ｅｎｖ産物はＶＣＰ２５５感染ＨｅＬａ細胞の表面に検出された。
免疫沈降分析：ＣＥＦあるいはＶＥＲＯ細胞にＡＬＶＡＣ（親ウイルス）、ＶＣＰ２４２，ＶＣＰ２５３，ＶＣＰ２５５あるいはＶＣＰ３２９を１０ｐｆｕ／細胞のｍ．ｏ．ｉで感染させた。１時間吸収させた後、イノキュラムを除き、細胞に、２％の透析したウシ胎児血清と［³⁵Ｓ］−ＴＲＡＮＳラベル（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；３０ｕＣｉ／ｍｌ）を含む２ｍｌの改良型イーグル培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（システインとメチオニンを除いた）を重層した。感染後１８−２４時間目に１ｍｌの３×緩衝液Ａ（４５０ｍＭ ＮａＣｌ、３％ ＮＰ−４０、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４），３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０３％ Ｎａ−アザイドと０．６ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳＦ）を加えて融解物を集め、ＦＩＶ ｅｎｖとｇａｇ遺伝子産物の発現について解析した。上記のポリクローナルネコ血清あるいはＦＩＶ−特異モノクローナル抗体を用い、次の様にして免疫沈降解析を行った。
融解物を一晩４℃でＦＩＶ−特異抗血清−プロテインＡ−セファロース複合体と反応させた。サンプルを１×の緩衝液Ａで４回洗浄し、さらにＬｉＣｌ₂／尿素緩衝液（２００ｍＭ ＬｉＣｌ、２Ｍ 尿素と１０ｍｍＴｒｉｓ、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１２４ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、４％ＳＤＳ、２０％グリセロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を加えて５分間煮沸し、沈殿した蛋白質を解離させた。この蛋白質を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分画してからメタノールで固定し、１ＭのＮａ−サリチル酸で処理してフルオログラフィーにかけた。ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組換体に感染した細胞からは適当な大きさを持つ蛋白質が沈殿してきたが、感染していない細胞やＡＬＶＡＣ感染細胞では沈殿してこなかった。この結果はＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組み換え体ではＦＩＶ遺伝子産物が適切に発現していることを示している。
ＥＬＩＳＡ 分析：一次ニワトリ胚繊維芽（ＣＥＦ）細胞にＶＣＰ２１９，ＶＣＰ２４２，あるいはＡＬＶＡＣを感染させた。感染細胞を次のＦＩＶ−特異的モノクローナル抗体を用いて分析した（Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）。
ＦＩＶ ｇａｇ：０１２６Ｂ４（抗−Ｐ１５）
３１４Ｂ５（抗−Ｐ２４）
１２５Ａ３（抗−Ｐ２４）
ＦＩＶ ｅｎｖ：１２８Ｆｌ０
１１７Ｅ５
１１５Ｇ８
ＥＬＩＳＡにより試験した血清サンプル：
１．ＦＩＶ−感染ネコの血清：
Ｒｈｏｎｅ Ｍｅｒｉｅｕｘより得た。
ネコ番号＃３４と＃１０３
２．正常ネコ血清：ネコ番号＃１２２９（Ｓｅｌｅｃｔ Ｌａｂｓ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）
３．ＶＣＰ６５（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ）で免疫し得たウサギ血清：
ウサギ番号Ａ０３９：前採血 １４週
感染細胞融解物は次のようにして調整した。ＣＥＦ細胞のローラーボトルに、無血清培地中細胞当たり５ＰＦＵのＭＯＩでＡＬＶＡＣ，ＶＣＰ２１９、あるいはＶＣＰ２４２を感染させた。感染２０時間後、細胞が完全に円形になるが剥離していない状態で各ローラーボトルから細胞を集めた。採取した細胞を培地中にそそぎ、ＰＢＳで１回洗浄してからアプロチニン（３．６ Ｔ．Ｉ．Ｕ；Ｓｉｇｍａ ＃Ａ−６２７９）を添加された３ｍｌのＰＢＳを加えて細胞を解離させた。採取した細胞を氷上で４分間超音波処理してから１０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を集めたところ、各調整サンプルの蛋白濃度はおよそ７ｍｇ／ｍｌであった。
カイネティックＥＬＩＳＡを次の様にして行った。血清サンプル（前記）をサンドイッチカイネティックＥＬＩＳＡを用いて測定し、ＦＩＶ ｅｎｖとｇａｇ遺伝子の産物を検出した。マイクロタイタープレートは上記一覧したＦＩＶ ｅｎｖまたはＦＩＶ ｇａｇに特異的なプールしたモノクローナル抗体を用いて２または５μｇ／ウエルで固相化した。感染した細胞の融解物を０．２、１または５μｇ／ウエルの割合で加え、モノクローナル抗体により補足させた。各血清サンプルは１：１００に希釈して３重測定した。抗体は１：２００に希釈された西洋ワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）標識抗ネコ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ カタログ番号１０２−０３５−００３）あるいはＨＲＰ標識抗ウサギ血清（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ２１７）と、ＨＲＰ基質であるｏ−フェニレンジアミン ジヒチロクロライド（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｄｉｈｙｃｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＯＰＤ）を用いて検出した。Ａ４５０の最適密度を15分間測定し、各サンプルについて１分当たりのｍＯＤとして速度を計算した。
これらＥＬＩＳＡの結果よりＦＩＶ Ｅｎｖが感染したネコの血清ではＦＩＶがＥｎｖとＧａｇの発現が検出できるが、正常ネコ血清では検出できないことが明瞭に示された（データ未提示）。ＥｎｖはＥｎｖ−特異的ＭＡｂで調整したプレートを利用した場合ＶＣＰ２４２に感染した細胞に由来する融解物には示されたが、ＡＬＶＡＣからの融解物またはＶＣＰ２１９に感染した融解物については検出されなかった。同様にＧａｇはＧａｇ−特異Ｍａｂを用いたプレートを利用しＶＣＰ２１９に感染した細胞を調べた場合には検出されたが、ＡＬＶＡＣあるいはＶＣＰ２４２に感染した細胞については検出されなかった。

実施例７−ネコに於けるＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ組換体効率グループ分けと免疫感作：週齢１２週のＳＰＦ動物を合計３６種類Ｌｉｂｅｒｔｙ（Ｗａｖｅｒｌｙ，ＮＹ）より得て、次の７つの群に分けた：

免疫感作は以下の様に行った：
Ａ群（ネコ６匹）
感作日（日）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ（ＶＣＰ２４２）
０日目
二次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ
２８日目
三次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ
５６日目
Ｂ群（ネコ６匹）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ２５５）
０日目
二次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ
２８日目
三次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ
５６日目
Ｃ群（ネコ６匹）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ−ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ２５３）
０日目
二次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ
２８日目
三次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ
５６日目
Ｄ群（ネコ６匹）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ−９７ＴＭ ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ３２９）
０日目
二次感作：ＡＬＶＡ−９７ＴＭ ｇａｇ／ｐｒｏ
２８日目
三次感作：ＡＬＶＡ−９７ＴＭ ｇａｇ／ｐｒｏ
５６日目
Ｅ群（ネコ６匹／コントロール）
感作日（日）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）
０日目
二次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ
２８日目
三次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ
５６日目
Ｆ群（ネコ３匹／ブースト）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ（ＶＣＰ２５５）
０日目
二次感作：ＡＬＶＡ−ｅｎｖ、ｇａｇ／ｐｒｏ
２８日目
ブースト：不活性化ＦＩＶ細胞ワクチン（ＩＣＶ）
５６日目
Ｇ群（ネコ３匹／コントロール）
一次感作 ：ＡＬＶＡＣ
０日日
二次感作：ＡＬＶＡ
２８日目
ブースト：不活性化ＦＩＶ細胞ワクチン
５６日目
全てのネコに筋注により１ｍｌの滅菌ＰＢＳ注に１×１０⁸ＰＦＵのＡＬＶＡＣ組換体液を投与された。ＩＣＶブーストは２．５×１０⁷固定同種ＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａが感染したネコＴ−細胞に２５０μｇのムラミルジペプチド（Ｆ１−４細胞株）が混合し調整された。ＩＣＶブーストは皮下投与された。
誘発：全てのネコには最終免疫感作終了４週後に５０ＣＩＤ₅₀のＦＩＶ−Ｐｅｔａｌｕｍａ（ＦＩＶ Ｐｅｔａｌｕｍａ株を感染させたＰＢＭＣ培養体から得た無細胞上清）が投与され誘発された。
誘発を受けた動物のＦＩＶ−特異的ウイルス学的状態を調べるために次の検査を行った。これによりＡＬＶＡＣをベースにしたＦＩＶワクチン候補の予防効果を直接測ることができる。
１）ウイルス分離：ＲＴアッセーによる感染性ＦＩＶの検出。ウイルス分離のための誘発を行った後、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）、骨髄（ＢＭ）細胞およびリンパ節（ＬＮ）細胞を分離した（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９９１、１９９３；Ｏｋａｄａら、１９９４）。ウイルス分離は培養上清中の逆転写酵素（ＲＴ）活性をモニタリングして行った。分離した細胞をＩＬ−２存在下に４週間培養した。通常の測定法（レンチウイルス特異的な）に従いＭｇ⁺⁺−依存型ＲＴ活性を測定するために上清の一部１００μｌを取った。
１）ＦＩＶ−特異的ＰＣＲ。ＰＢＭＣ，ＢＭ，およびＬＮ細胞から抽出したＤＮＡについてプロウイルス配列を検出した。感度を上げるために４種類のコンセサンスプライマーを利用して、ｅｎｖ−あるいはｇａｇ−特異的コーディング域を増幅した（Ｙｍａｍｏｔｏら、１９９１；Ｏｋａｄａら、１９９４）。
最初のPCR増幅に続けて、増幅産物の1/25を取りネステッドプライマーペアーを利用して２回目の増幅を行った。誘発前後にサンプルについて行ったウイルス学的アッセーの結果を表３と４に示した。ＲＴ測定またはＦＩＶ−特異的ＰＣＲ分析でも誘発前にＦＩＶウイルス血症を示したネコはいなかった（表３）。誘発後８週までにＡＬＶＡＣ親株ウイルスを３回投与された６匹のネコのうち４匹が持続性のＦＩＶ−特異的血症を発症した（表３）。これらのネコが感染していることは、誘発後に採取した組織サンプルからウイルスが分離されることや、ＰＣＲの結果、そして誘発後に明瞭はＦＩＶ−特異的なセロコンバージョンがみられることからも示された（表４と５）。コントロール群のその他の２匹のネコ（ＱＡ４とＱＥ３）については、感染を示す明確な徴候は観察されなかった。さらに、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ｅｎｖ（ＶＣＰ２４２）、ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ｅｎｖ／ｇａｇ−ｐｒ（ＶＣＰ２５５）、またはＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ９７ＴＭＧ（ＶＣＰ３２９）のいずれかを３回接種された（１０⁸ｐｆｕ／回）ネコの群と上記コントロール群との間に感染効率について差は認められなかった。
ＡＬＶＡＣ−ＦＩＶ ｇａｇ−ｐｒ（ＶＣＰ２５３）を３回接種すると、明らかにＦＩＶ誘発の暴露による感染から完全に防御された。対象となった６匹のネコの全例で感染が防御されたことが、誘発後２９週間にわたって行われた末梢およびリンパ組織を対象としたウイルス分離実験ならびにＦＩＶ−特異的ＰＣＲ測定から明瞭にしめされた（表３と４）。さらに、ウエスタンブロットあるいはＥＬＩＳＡによればこれらのネコではＦＩＶに対し血清反応性となるセロコンバージョンが起きていなかった（表４と５）。ＶＣＰ２５３の感染効率をさらに確認するために、この群の２匹の動物から細胞（ＰＢＭＣｓ、リンパ節と骨髄）を取りＳＰＦ子ネコに移植した。しらべた限りではこれらのネコはウイルス分離（ＲＴおよびＰＣＲ）ならびにＦＩＶ−特異ウエスタンブロットについて陰性であったが、一方感染したコントロールのネコ（Ｐｙ２）から得た同様の細胞を移植されたＳＰＦネコについては、これら検査から明瞭に感染していることが示された。
これらの結果は、Ｇａｇ−ｐｒはレンチウイルスの誘発暴露を十分に防御することを示している。表６に見られる様に、これらの結果は統計的にも有意である。またこの結果はＥｎｖの存在が防御的免疫反応の確立に積極的に干渉する可能性があることも示している。また、ＶＣＰ２５５（２×）を接種され、さらにＩＣＶ免疫源を追加した実験のデータは、一次／ブースト処理によりＥｎｖの干渉に打ち勝てることを示している（表３と４）。ＡＬＶＡＣ親株ウイルスの投与を２回受けてからＩＣＶを追加された群のネコは誘発暴露を受けるとたやすく感染してしまうことから、ＶＣＰ２５５がこのプライミング活性を担っていることは明らかである（表３と４）。
まとめると、本データはＦＩＶ Ｇａｇ−ｐｒだけを含むサブユニット免疫源を利用することでネコをＦＩＶ感染から初めて防御したことを示している。事実、ＥｎＶは感染効率を低下させた。
これらデータの重要点はレンチウイルスワクチンの開発にとって一般的なものとも考えられる。Ｇａｇ−Ｐｒだけを用いた防御はワクチンおよび診断方法にとり重要ないくつかの要素を提供する。第一は、既存のＥｎｖをベースとしたアッセーを行い、ワクチン接種を受けた個体と感染した個体とをたやすく分けることができることである。第二に、Ｇａｇ−ｐｒはＥｎｖ種に比べ各種のレンチウイルス分離株間で変異が少なく、従ってこれら変異株をまたいだ防御反応が展望できることである。

実施例８ − ネコの体内における多様な亜類型FIV誘発（攻撃）試験に対して、ALVAC-FIV組換え型は防御免疫性を引き起こす
材料と方法
動物：特定の遊離病原体（SPF）が、リバティー研究所より購入された。
ワクチン調製：Canaryボックスウイルス（ALVAC）-FIV組換え型を、上記のように生成した（VCP255）。ALVAC VCP255は、感染したCEFの遊離血清溶解物から調製した。ALVAC VCP255免疫を、筋肉内に1×10⁸の割合で投与した。SAF/MDP補佐剤250μg（Hioseら、1995）と混合されたパラホルムアルデヒド不活性化F1-4細胞（長期にわたってFIV Petalumaを感染させたネコのリンパ細胞列）2×10⁸からなる不活性細胞ワクチン（ICV）を皮下投与した。
グループ分けおよび免疫プロトコル：誘発研究では６匹のネコを使った。すなわち、実施例７で記載したFIV Petaluma誘発を受けた、ALVAC-env、gag／pro／ICV免疫処置したグループ（#PY4、#QH3、#QA6）、およびFIV Bangston誘発の前に免疫処置を受けていない、年齢を釣り合わせた３匹のSPFネコ（#EJ2、#DH3、#GU5）の制御（管理）グループ。（表５を参照）。
誘発：第２の誘発接種源は75 ID₅₀遊離細胞FIV Bangston（亜類型B）からなっており、最初のFIV Petaluma誘発後、８匹のマウスに投与された（実施例７を参照）。
免疫原性監視：FIV特殊抗体反応の誘導を、Western blotting（免疫ブロット）により確認した。ウイルス中和抗体反応（VNA）が、先に記載した分析検定を使って確認された（Ｙａｍａｍｏｔｏら、1991）。
ウイルス伝染性監視：ウイルス感染はさまざまな方法で監視が行われた。これには、PBMC内のウイルス反転写酵素活性、先に記載した方法（Ｙａｍａｍｏｔｏら、1991）により、誘発後、数回にわたり採取された骨髄およびリンパ節細胞の評価が含まれる。加えて、プロウイルスDNA（潜在感染）は、PBMCから抽出されたDNA上のFIV-envプライマー、RT活性用培養上の骨髄およびリンパ節細胞（Ｙａｍａｍｏｔｏら、1991、Ｏｋａｄａら、1994）を使った、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により監視された。さらに、FIV感染は、誘発前後に採取された血清中のFIV-特殊体液反応およびウイルス中和（VN）抗体反応の特性を監視・比較して確認された。
結果および討論
ALVAC prime（合成開始）／boost（追加抗原）プロトコルの免疫原性および防御有効性が、明白な異種構造のFIV分離株（Bangston菌種）を使った実験誘発に対して評価が行われた。まず、ALVAC-env、gag／polだけでの免疫処置の防御有効性が、ALVAC-env、gag／polとのpriming（合成開始）、さらに不活性化されたFIV-感染細胞ワクチン（ICV）によるboosting（追加抗原）との比較が行われた。すべてのネコに合計３回の免疫処置を受けさせ、FIV Petalumaの遊離細胞50 ID₅₀による最終免疫処置の４週間後に、誘発実験を行った（実施例７を参照）。ALVAC-FIV組換え型ワクチンを生成するために使われる、FIV Villefranche分離株のような、FIV Petaluma分離株は亜類型Aウイルスとして分類され、FIV Villefrancheとは、Envにおいて３％、Gagアミノ酸暗号部位では１％異なっている。
次に、実施例７で記載したFIV Petaluma誘発に抵抗力のあるALVAC-env、gag／pro／ICV免疫処置されたネコ（#QA6、#QH3、#PY4）が別の亜類型の明確な異種構造を持つFIV分離株による第２の誘発から保護されうるかどうかが評価された。第２誘発は、75 ID₅₀遊離（フリー）FIV Bangston（誘導PBMC）から成り、８匹のマウスに、いかなる中間追加抗原も行わない最初の誘発後に投与された。FIV Bangstonは亜類型B分離株であり、FIV Petaluma（亜類型A）とは、エンベロープ糖蛋白質暗号化部位において２１％異なっている。年齢が合わせられた３匹のSPFネコ（#EJ2、#GU5、#DH3）は、FIV Bangston誘発のために、統制（管理）ネコとして使用された。表７に示したように、すべての統制ネコは誘発でたやすく感染した。対照的に、ALVAC-env、gag／pro／ICV免疫処置したネコ#QH3および#QA6は、誘発後３ヶ月まで、末梢血液のウイルス隔離（RT）およびPCRで確認されたようにウイルス陰性のままであった。ネコ#PY4は、末梢血液のウイルス隔離（RT）により確認されたようにウイルス陰性のままであったが、誘発後３ヶ月の時点でPCRにより陽性という結果が出た。PCR生成物のヌクレオチド連鎖分析で、FIV Bansgton特殊連鎖が明らかになった。このように、ALVAC-env、gag／pro／ICV免疫処置されたネコは、部分的に、異種構造亜類型FIV攻撃から防御された。少なくとも、これらのネコには、すべての統制ネコが誘発後６週間までにウイルス血症になったように感染における遅延を証明し、ALVAC-env、gag／pro／ICV免疫処置された３匹のネコのうち一匹だけが、誘発後１２週間の時点で、PCR分析に基づいて、陽性になったことが明らかである。これは、Env発現組換えに対する潜在的有益性を示すものである。
要約すると、ALVAC組換え型のpriming（合成開始）それに続く不活性化FIV-感染細胞ワクチンのboosting（追加抗原）を伴うを伴うprime／boostプロトコルは、異種構造FIV菌種による実験誘発に対して防御的免疫性を引き出すことが可能である。この免疫性は長期にわたって継続し、また他の亜類型の明確に異種構造をしたFIV-菌種に対して部分的防御性がある。データーでは、ウイルス中和抗体反応やFIV-特殊抗体反応よりもむしろ、仲介細胞に対する役割が裏付けされている。これらの研究結果は、新しい亜類型が次々と出現し、既存の亜類型がますます地理的に新しい範囲に広まっていいるように、多様な亜類型FIV-ワクチンの開発だけでなく、有効な多様亜類型HIVワクチン（他のレンチウイルスおよびレトロウイルスのための多様な亜類型ワクチンだけでなく）の開発にもつながるものである。
フッシャーの精密なテストが行われた。これは、カイ２乗テストを修正したものである。本テストは、２組の断続的な、２者択一（全か無の）データーを比較するときに使われることになっている。分析は次のように準備が行われた。

単一末尾確率に対して、値Pを次のように計算した。
P（確率）＝（A+B）!（C+D）!（A+C）!（B+D）!/N!A!B!C!D!
各グループを、ALVAC-管理グループ（n=6）およびALVAC-管理グループ＋ALVAC-管理＆ICVグループ（n=9）と比較した。0．05または0．05以下のP値は、有意であると見なされた。

実施例９ − 付加的なNYVAC & TROVAC組換え型の生成
プロモーターに連接したDNAを暗号化するFIV生成のために上記で述べた方策を用いること、米国特許第5，494，807およびUSSN 08/417，210における具体化に似通った、これらベクターの部位に挿入するためのNYVAVCおよびTROVAC用のDNAを配置することが、NYVACおよびTROVAC FIV組換え型生成のために使われた。分析により、ベクターへの外来性DNAおよびその発現の組み込みが証明されている。このような付加的組換え型は、同じように、上記のALVACの具体化として有効である。
実施例１０ − 付加的レンチウイルス、および付加的ベクターシステム組換え型の生成 プロモーターに連接したDNA暗号化FIV生成のために上記で述べたことに類似する方策、ここに引用した資料中の、代替の、ボックスウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、エプステイン−バーウイルス、細菌性およびDNAベースシステムを生成するための方策、さらにレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全ウイルス、たとえばEIAV、FIV、BIV、HIVまたはSIVからDNAを、ここに挙げた資料からの代替ボックスウイルス、バキュロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、ポリオウイルス、エプステイン−バーウイルス、細菌性、およびレンチウイルス、レトロウイルスまたは免疫不全ウイルス、たとえば、Env、Gagおよびプロテアーゼのような、EIAV、FIV、BIV、HIV、またはSIVからDNAを含み、表現するDNAベース組換え型を、暗号化する知識を用いて、組換え型を生成する。分析により、外来性DNAおよびそれからの発現のベクターへの組み込みが証明された。このような付加的組換え型は、同様に、上記ALVAC具体化として有効である。
このように、本発明の好ましい具体化を詳細に記述することで追加請求により定義された本発明は、そこからの多くの明白な変化形態が、その意図および範囲を逸脱することなく可能であるように、上記で説明した詳細事項で制限するべきでないことが理解される必要がある。

Claims (6)

1. ＦＩＶエピトープをコードする外因性ＤＮＡを含むベクターであって、前記外因性ＤＮＡが、（ａ）Ｇａｇ−プロテアーゼの全部をコードし、前記ベクターがカナリポックスウイルス、又はカナリポックスウイルスのＡＬＶＡＣ株であり、ヒトを除く動物に前記ベクターと適当な担体とを混合して投与した際に、前記動物に免疫応答を惹起することを特徴とするベクター。
2. ＦＩＶエピトープをコードする外因性ＤＮＡを含むベクターであって、前記外因性ＤＮＡが、（ｂ）Ｅｎｖ，Ｇａｇ−プロテアーゼの全部をコードし、前記ベクターがカナリポックスウイルス、又はカナリポックスウイルスのＡＬＶＡＣ株であり、ヒトを除く動物に前記ベクターと適当な担体とを混合して投与し、引き続き不活性化したＦＩＶ感染細胞を含むワクチンによって処理することにより、前記動物に免疫応答を惹起すること特徴とするベクター。
3. ｖＣＰ２５３である請求項１に記載のベクター。
4. ｖＣＰ２５５である請求項２に記載のベクター。
5. ネコにおいて免疫学的な治療あるいは免疫応答を誘発することが必要とするネコを処置するための方法であって、請求項２に記載のベクターを含む組成物を担体と混合して前記のネコに投与することを含む方法。
6. 請求項２に記載のベクターを適当な担体と混合して含む、免疫応答を誘発するための組成物。

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