JPH06505874A - 遺伝子操作したワクチン菌株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この出願は、１９９１年３月７日に出願した出願番号第０７／６６８．０５８号 の一部継続出願である、１９９１年６月１１日に出願した出願番号第０７／７１ ３．９６７号のさらなる一部継続出願であり、その出願の両方をここに参照文献 として含む。また、米国特許継続出願である、１９９１年６月１４日に出願した 出願番号第７１５．９２１号、１９９１年７月２Ｂ日に出願した出願番号第７３ ８゜２５４号、１９９１年１０月２２日に出願した出願番号第７７６．８８７号 、および１９９２年１月１３日に出願した出願番号第１１２０．０７７号につい ても言及し、これら全てをここに参照文献として含む。

産業上の利用分野 本発明は修飾ポックスウィルス、およびその産生方法、並びにその使用方法に関 するものである。さらに詳しくは、本発明は、様々な病原体に対して保護をする 安全免疫運搬体として使用する異種遺伝子の挿入と発現のための改良ベクターに 関するものである。

この出願においていくつかの刊行物を特徴する請求の範囲の直前で明細書の後に 、または刊行物と記載されているところに、これらの参照文献を完全に列挙する ；これら刊行物のそれぞれをここに参照文献として含む。これらの刊行物は、本 発明が属する従来技術に関する。

発明の背景 ワクシニアウィルスおよびさらに近年の他のポックスウィルスは、異種遺伝子の 挿入と発現に用いられている。異種遺伝子の生感染ポックスウィルスへの挿入の 基礎技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素を側腹に有するボックスＤＮ Ａ配列と救助（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ポックスウィルス中に存在する相同配列との 間の組換えを含む（ピッチｍ：ら、１９８７）。

具体的には、組換えポックスウィルスは従来技術において知られ、米国特許第４ ．７６９．３３０号、第４．７７２，８４８号、および第４．６０３．１１２号 、並びに１９９０年６月１４日に出願された継続出願第０７１５３７．８８２号 に記載されたワクシニアウィルスの合成組換え体の産生方法と類似した２工程で 構成され、これらの開示をここに参照文献として含む。この点において、１９９ ０年Ｂ月１４日に出願された米国特許継続出願第５３７゜８９０号についても言 及し、ここに参照文献として含む。

第一に、ウィルス、特に非ボックス源からの読取り枠に挿入されるＤＮＡ遺伝子 配列は、ポックスウィルスのＤＮＡ部分に相同なりＮＡが挿入されるＥ、ｃｏｌ ｔプラスミド構成中に配される。それとは別に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列は 、プロモーターに繋げられる。プロモーター遺伝子連結は、可欠座を含有するボ ックスＤＮＡの領域を側腹に有するＤＮＡ配列と相同なりＮＡにより両端の側腹 にあるように、プラスミド構成中に位置せしめられる。生成したプラスミド構成 は次いでＥ、ｃｏｌｉ細菌内の成長により増幅されて（フレウェル、１９７２） 単離される（フレウェルら、１９６９　、マニアチスら、１９８２）。

第二に、挿入されるＤＮＡ遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、細胞培養、 例えばひなの胚胎繊維芽細胞中にポックスウィルスとともに移入せしめる。プラ スミド中の相同ボックスＤＮＡとウィルスのゲノムとの間の組換えにより、ゲノ ムの可欠領域中の異種ＤＮＡ配列の存在により修飾されたポックスウィルスが得 られる。［異種Ｊ　ＤＮＡという用語は、外因性のＤＮＡ、特に非ボックス源か らのＤＮＡを示し、これは、外因性ＤＮＡが配されるゲノムにより通常は産生さ れない遺伝子産生物をコードする。

遺伝子組換えは一般的に、ＤＮＡの２つの鎖の間の相同切片の交換である。ある ウィルスにおいてはＲＮＡがＤＮＡを置換する。核酸の相同切片は、ヌクレオチ ド塩基の同一配列を有する核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の切片である。

遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウィルスゲノムの複製中または製造中 に自然に行なわれる。それゆえ、ウィルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上 の異なるウィルスまたは他の遺伝子構造に共感染せしめられる宿主細胞中に生じ るウィルス複製周期中で行なわれる。第１のゲノムからのＤＮＡの切片は、ＤＮ Ａが第１のウィルスゲノムの切片と相同である第２の共感染ウィルスのゲノムの 切片を交換可能に構成する際に用いられる。

いかいながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のＤＮＡの 切片間にも行なわれる。そのような切片の１つが、例えば、相同ＤＮＡの部分中 に挿入される抗原決定因子をコードする遺伝子または遺伝子マーカーの第１の切 片内の存在を除いた別のゲノムの切片と相同な第１のゲノムからのものである場 合、組換えがまた行なわれ、次いでその組換えの産生物は組換えウィルスゲノム 中の遺伝子または遺伝子マーカーの存在により検知できる。

修飾感染ウィルスによる挿入ＤＮＡ遺伝子配列の一連の発現には２つの条件が必 要である。第１に、修飾ウィルスが生存可能であるように、挿入はウィルスの可 欠領域中で行なわなければならない。挿入ＤＮＡの発現の第２の条件は、挿入Ｄ ＮＡに対して適切な関係二にあるプロモーターの存在である。プロモーターは発 現されるＤＮＡは配列から上流に位置するように配されなければならない。

ワクシニアウィルスは、１９８０年に天然痘の世界規模での撲滅となった天然痘 に対する免疫化にうまく用いられた。

その歴史において、多くのワクシニアの菌株が生じた。これらの異なる菌株は、 変化する免疫抗原性を示し、潜在的な複雑さとともに変化する程度に関係し、そ の最も重大なのは、ワクチン後の脳炎と全身性痩地である（ベーベハニ、１９８ ３）。

天然痘の撲滅に関して、異種遺伝子を発現する遺伝子操作したベクターという、 ワクシニアの新たな役割が重要となった。非常に多くの非相同抗原をコードする 遺伝子は、ワクシニア中に発現され、しばしば対応病原による抗原投与に対する 防御免疫となってきた（タータグリアら、１９９０ａに記載されている）。

ワクシニアベクターの遺伝子の背景は、発現された異種免疫原の保護効果に影響 することが示されている。例えば、ワクシニアウィルスのイエスワクチン菌株内 のニブスティンバーウィルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０の発現は、ＥＢＶ’フィルス 誘発リンパ種に対するコットントツブタマリンス（ｃｏｔｔｏｎｔｏｐ　ｔａｍ ａｒｉｎｓ）を防御せず、一方ワクシニアウィルスのＷＲ研究所菌株中の同一の 遺伝子の発現は防御性であった（モルガンら、１９８ｇ）。

ワクシニアウィルスベースの組換えワクチン候補の効能と安全性との間の優れた バランスが特に重要である。組換えウィルスは、ワクチン接種した動物中で棒業 免疫応答を引き出すが、いかなる著しい病原特性も欠如するように免疫原を提供 しなければならない。それゆえ、ベクター菌株の弱毒化は技術の現在の状態では 非常に望ましい進歩である。

組織培養中のウィルス成長に可欠であり、その欠損または不活性化が様々な動物 系における毒性を低減する多くのワクシニア遺伝子が同定されている。

ワクシニアウィルスチミジンキナーゼ（Ｔ　Ｋ）をコードする遺伝子が、地図作 成され（フルビーら、１９８２）　、配列せしめられている（フルビーら、１９ ８３　、ウィアーら、１９８３）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完 全な欠損は、組織培養中の様々な細胞中のワクシニアウィルスの成長を妨げない 。ＴＫ−ワクシニアウィルスはまた、様々な経路により様々な宿主中の接種部位 で生体内複製を行なうことができる。

２型単純ヘルペスウイルスに関して、モルモットのＴＫ−ウィルスの腟内接種は 、ＴＫ＋ウィルスを接種したよりも、を髄中で著しく低いウィルス力価となった ことが示された（スタンベリーら、１９８５）。生体外でＴＫ活性をコードした ヘルペスウィルスは、活性で代謝している細胞におけるウィルスの成長には重要 ではないが、静止状態の細胞中のウィルスの成長には必要であったことが説明さ れている（ジエイミーソンら、１９７４）。

ＴＫ−ワクシニアの弱毒化が、大脳内経路と腹腔内経路により接種したネズミ中 に示された（ブラーら、１９８５）。

ＷＲ神経毒性研究所菌株とイエスワクチン菌株の両者に関して弱毒化が観察され た。皮内経路により接種したネズミ中で、ＴＫ−組換えワクシニアは、親のＴＫ ＋ワクシニアウィルスと比較して等量の抗ワクシニア中和抗体を産生じ、この試 験系において、ＴＫ機能の損失によりワクシニアウィルスベクターの免疫抗原性 を著しくは減少しないことを示した。ネズミにＴＫ−とＴＫ＋組換えワクシニア ウイルス（ＷＲ菌株）を鼻腔内接種することに続いて、脳を含む、他の位置への ウィルスの内転移はそれほど著しくは発見されなかった（ティラーら、１９９１ 　ａ　）。

ヌクレオチドの代謝に関わる別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである 。巨大サブユニットをコードする遺伝子の欠損により単純ヘルペスウィルス（Ｈ ＳＶ）中のウィルス性にコードしたりボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は 、生体外の細胞の分裂におけるＤＮＡ合成とウィルスの成長には効果がないこと が示され、ウィルスの血清欠乏細胞上の成長能力を著しく損なった（ゴールドス タインら、１９８８）。眼の急性Ｈ３Ｖ感染と三又神経節内の再活性化可能潜伏 感染のネズミモデルを使用した場合、野生型ＨＳＶにより示された毒性と比較し て、リボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの欠損したＨＳＶに関し て、毒性が減少したことが示された（ジエイコブソンら、１９８９）。

リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニット（スラボーグら、１９８ｇ ）と巨大ユニット（シュミットら、１９８８）の両方は、ワクシニアウィルス中 で同定される。ワクシニアウィルスのＷＲ菌株中のりボヌクレオチドレダクター ゼの巨大サブユニットの挿入不活性化により、ネズミの頭蓋内接種により測定さ れたようなウィルスの弱毒化となる（チャイルドら、１９９０）。

ワクシニアウィルス血球凝集素遺伝子（ＨＡ）を遺伝子地図作成し、配列した（ シダ、１９８Ｂ）。ワクシニア憂いするのＨＡ遺伝子は、組織培養中の成長に可 欠である（イチハシら、１９７１）。ワクシニアウィルスのＨＡ遺伝子を不活性 化することにより、頭蓋内経路により接種した家ウサギ中の神経毒性を減少せし め、皮内接種の部位での家ウサギの病巣をより小さくする（シダら、１９８８） 。ＷＲ菌株中の異種遺伝子の挿入（シダら、１９８７）　、ワクシニアウィルス のコペンハーゲン菌株（グオら、１９８９）とりスター菌株（シダら、１９８ｇ ）の誘導にＨＡ座を用いた。異種遺伝子を発現する組換えＨＡ−ワクシニアウィ ルスは、免疫抗原性であり（グオら、１９８９　；イタムラら、１９９０　、シ ダら、１９８ｇ　。

シダら、１９８７）　、関連病原による抗原投与に対して防御性である（グオら 、１９８９；シダら、１９８７）ことが示された。

牛痘（プリントンレッド菌株）は、鶏の卵の絨毛尿膜上に赤い（出血性）痘疹を 生じる。牛痘ゲノム内の自発的な欠損により、白色痘疹を生じる変異体を産生ず る（ビカップら、１９８４）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によりコードさ れた３８ｋＤａタンパク質まで遺伝子地図を作成した（ピカップら、１９８Ｂ） 。セリンプロテアーゼ抑制因子に対して相同性を有するこの遺伝子は、牛痘に対 する宿主炎症反応を抑制することが示され（パランボら、１９８９）　、血液凝 固の抑制因子である。

Ｕ遺伝子はワクシニアウィルスのＷＲ菌株中に存在する（コトワルら、１９８９ ｂ）。Ｕ領域が異種遺伝子の挿入により不活性化せしめられたＷＲワクシニアウ ィルス組換え体を接種したネズミは、Ｕ遺伝子が完全である同様の組換えワクシ ニアウィルスを接種したネズミと比較して、異種遺伝子産生物に対して高い水準 で抗体を産生ずる（シーら、１９９０）。ｕ領域はワクシニアウィルスのコペン ハーゲン菌株中に欠損可欠形状で存在する（ゲーベルら、１９９０ａ、、ｂに報 告されている用語法による読取り枠Ｂ１３とＢ１４）。

牛痘ウィルスは、細胞質Ａ型含有ボディ（ＡＴＩ）中の感染細胞内に制限される （カトウら、１９５９）。ＡＴＩの機能は、動物から動物への内転移中の牛痘ウ ィルスピリオンの防御であると考えられる（バーゴインら、１９７１）。牛痘ゲ ノムのＡＴＩ領域は、ＡＴＩボディのマトリックスを形成する１６０ｋＤａタン パク質をコードする（フナハシら、１９８ｇ　、バテルら、１９８７）。ゲノム 中に相同領域を含有するけれどもワクシニアウィルスは一般的にＡＴＩを産生じ ない。ワクシニアのＷＲ菌株において、ゲノムのＡＴＯ領域は９４ｋＤａタンパ ク質として翻訳される（バテルら、１９８８）。ワクシニアウィルスのコンハー ゲン菌株において、ＡＴＩ領域に対応するＤＮＡ配列のほとんどは欠損し、ＡＴ ｌ領域から上流の配列と融合した領域の残りの３′末端は読取り枠（ＯＲＦ）Ａ ２６Ｌを形成する（ゴーベルら、１９９０ａＳｂ）。

様々な自発的で（アルテンバーガーら、１９８９　；ドリリアンら、１９８１　 、ライら、１９８９　；モスら、１９８１　、バエズら、■９８５；パニカリら 、１９８１）操作された（パーカスら、１９９１　；パーカスら、１９９１；バ ーカスら、１９８Ｂ）欠損がツクシニアウイルスゲノムの左末端に近くに報告さ れている。１０ｋｂ自発欠損したワクシニアウィルスのＷＲ菌株（モスら、１９ ８１　；バニカリら、１９８１）が、ネズミの頭蓋内接種により弱毒化されたこ とが示された（ブラーら、１９８５）。この欠損は後に１７の潜在的なＯＲＦを 含むことが示された（コトワルら、１９８８ｂ）。欠損領域内の特異的遺伝子は 、ピロキンＮＩＬおよび３５ｋＤａタンパク質を含有する（ゲーベルら、１９９ ０ａＳｂに報告された用語法によるＣ３Ｌ）。

ＮＩＬの挿入不活性化は、通常のネズミと裸のネズミの両方の頭蓋内接種により 毒性を低減せしめる（コトワルら、１９８９ａ）、３５ｋＤａタンパク質は、Ｎ ＩＬのようにワクシニアウィルス感染細胞の培地中に分泌される。このタンパク 質は、補体対照タンパク質、特に補体４Ｂ結合タンパク質（Ｃ４ｂ　ｐ）の類に 対する相同性を含有する（コトワルら、１９Ｈａ　）。細胞Ｃ４ｂｐのように、 ワクシニア３５ｋＤａタンパク質は補体の４番目の成分と結合し、典型的な補体 カスケードを抑制する（コトワルら、１９９０）。それゆえ、ワクシニア３５ｋ Ｄａタンパク質は、ウィルスが宿主防御機構を避けるのを助けるのに巻き込まれ ると思われる。

ワクシニアゲノムの左末端は、宿主範囲遺伝子、ＫＩＬ（ギラードら、１９８Ｂ ）およびＣ７Ｌ　（バーカスら、１９９０）と同定された２つの遺伝子を含有す る。これらの遺伝子の両方を欠損すると、ワクシニアウィルスの様々なヒト細胞 ライン上に成長する能力を低減せしめる（パーカスら、１９９０）。

鶏痘ウィルス（ＦＰＶ）は、ポックスウィルス類のアビボックス属の基本型ウィ ルスである。ウィルスは、弱毒化ワクチンの使用により１９２０年台から良好に 制御されているかきんの経済的に重要な病気を生じる。アビポックスウィルスの 複製は、アビアン種に制限されており（マチユース、１９８２ｂ）　、人類を含 む非アビアン種における生産的な感染を生じるウィルスの文献には報告されてい ない。この宿主制限は、ウィルスの他の種への伝染に対する固有の安全バリヤを 提供し、かきんにおけるワクチンベクターとしてＦＰｖを使用して魅力的な提案 とする。

ＦＰＶは好ましくはかきん病原からの抗原を発現するベクターとして用いられて いる。毒性アビアンインフルエンザウィルスの血球凝集素タンパク質はＦＰＶ組 換え体中で発現された（ティラーら、１９８８ａ）。組換え体の鶏と七面鳥への 接種後、相同または非相同毒性インフルエンザウィルス抗原投与のいずれかに対 して防御的である免疫応答が誘発された（ティラーら、１９８８ａ）。ニューカ ッスル病ウィルスの表面糖タンパク質を発現するＦＰＶ組換え体もまた発達せし められた（ティラーら、１９９０；エドバウアーら、１９９０）。

弱毒化ベクターワクチンの使用は、多くの潜在的な長所を示す。ワクチンは製造 するのに高価ではなく、多くのかきん病原は潜在的には１つのベクター中に含ま れる。免疫原は、体液および細胞媒介応答が引き起こせるような確実な方法で免 疫システムに提供される。病気剤は複製していないので、ワクチン接種の側面効 果は最小限であり、病気剤の環境への連続的な再導入は除かれる。

安全性が高められた新たなワクチン菌株を提供することが現在の技術状態よりも 非常に望ましい進歩であることが理解できる。例えば、ウィルスによる遺伝子の 発現からのより安全なワクチンまたはより安全な産生物を提供するためである。

発明の目的 それゆえ本発明の目的は、安全性が高められた修飾組換えウィルスを提供するこ とにあり、さらにそのような組換えウィルスを製造する方法を提供することにあ る。

本発明のさらなる目的は、既知の組換えポックスウィルスワクチンと比較して安 全性の水準が増大した組換えポックスウィルスワクチンを提供することにある。

さらに本発明の目的は、宿主中に遺伝子産生物を発現する修飾ベクターであって 、宿主中で毒性か弱毒化されるように修飾されているベクターを提供することに ある。

本発明のもう一つの目的は、安全性の水準が増大した修飾ベクターまたは修飾組 換えウィルスを用いて生体外の細胞培養中で遺伝子産生物を発現する方法を提供 することにある。本発明のこれらと他の目的並びに利点は、以下の検討後には容 易に明確となる。

発明の記載 本発明は、組換えウィルスの毒性か弱毒化され、安全性が高められるようにウィ ルスコード遺伝子機能が不活性化された修飾組換えウィルスに関するものである 。この機能は、可欠であっても、または毒性に関連であってもよい。

ウィルスは好ましくは、ポックスウィルス、特に鶏痘ウィルスおよびカナリヤポ ックスウィルスのようなアビポックスウィルスまたはワクシニアウィルスである 。

本発明は、ワクチン接種した宿主動物中に免疫学的応答を誘発するワクチンに関 し、このワクチンは組換えウィルスが毒性か弱毒化され、安全性が高められるよ うに可欠ウィルスコード遺伝子機能が不活性化された修飾組換えウィルスおよび 担体を含む。本発明によるワクチンに用いられるウィルスは好ましくは、ポック スウィルス、特に鶏痘ウィルスおよびカナリヤポックスウィルスのようなアビポ ックスウィルスまたはワクシニアウィルスである。

本発明は、組換えウィルスの毒性か弱毒化され安全性が高められるように可欠ウ ィルスコード遺伝子機能が不活性化された修飾組換えウィルスを含有する免疫原 組成物に関するものである。修飾組換えウィルスは、ウィルスゲノムの回天領域 内に、病原から誘導された抗原タンパク質をコードする非相同ＤＮＡ配列を含有 する。このとき組成物は、宿主に施された場合、病原によりコードされたタンパ ク質に特異的な免疫応答を誘発できる。

さらに本発明は、毒性か弱毒かされ安全性が高められた修飾組換えウィルスを細 胞中に導入することにより生体外の細胞培養中で遺伝子産生物を発現する方法に 関するものである。

さらに本発明は、ウィルスの毒性か弱毒化されるように可欠ウィルスコード遺伝 子機能が不活性化された修飾組換えウィルスに関し、この修飾組換えウィルスは さらに、ウィルスゲノムの回天領域中に非相同源がらのＤＮＡを含有する。特に 、遺伝子機能は、毒性因子をコードする読取り枠を欠損せしめることにより、ま たは宿主制限ウィルスを自然に用いることにより不活性化せしめられる。本発明 により用いられるウィルスは、好ましくは、ポックスウィルス、特に鶏痘ウィル スおよびカナリヤポックスウィルスのようなアビポックスウィルスまたはワクシ ニアウィルスである。好ましくは、その読取り枠は、Ｊ２Ｒ，Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４ Ｒ，、Ａ２６Ｌ、Ａ３６ＲＳＣ７Ｌ−ＫＩＬ、およびＩ４Ｌからなる群より選択 される（ゲーベルら、１９９０ａ。

ｂに報告された用語法による）。この点に関して、読取り枠は、チミジンキナー ゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型含有ボディ領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲遺伝 子領域または巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼがらな図面の簡 単な説明 以下の詳細な記載は、実施例として与えられたものであり、本発明を記載した特 定の実施態様に制限するものではなく、添付した図面とともに理解されよう。

第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠損したプラスミドｐｓＤ４６０の構成方 法と組換えワクシニアウィルスＶＰ４１０の産生方法を模式的に示すものである 。

第２図は、出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構成方法と組換えワ クシニアウィルスｖＰ５５３の産生方法を模式的に示すものである。

第３図は、ＡＴＩ領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４９４Δの構成方法と組換え ワクシニアウィルスｖＰ６１８の産生方法を模式的に示すものである。

第４図は、血球凝集素の欠損したプラスミドｐＳＤ４６７の構成方法と組換えワ クシニアウィルスｖＰ７２３の産生方法を模式的に示すものである。

第５図は、遺伝子クラスター［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の欠損したプラスミドｐＭＰ　 ＣＳ　Ｋ　１Δの構成方法と組換えワクシニアウィルスｖＰ８０４の産生方法を 模式的に示すものである。

第６図は、巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼの欠損したプラス ミドｐＳＤ５４８の構成方法と組換えワクシニアウィルスｖＰ８８６　（ＮＹＶ ＡＣ）の産生方法を模式的に示すものである。

第７図は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をＴＫ欠損座中に挿入したプラスミドｐ ＲＷ８４２の構成方法と組換えワクシニアウィルスｖＰ８７９の産生方法を模式 的に示すものである。

第８図は、ＥＢＶ）リプル１プラスミド中に挿入されたＥＢＶ暗号領域の遺伝子 地図である。

第９図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１４）を有する修飾合成ワクシニ アウィルスＨ６初期／晩期プロモーターおよび合成ｓｐｓＡｇ遺伝子のＤＮＡ配 列（配列認識番号２１３）を示すものである。

第１０図は、組換えワクシニアウィルスｖＰ８５６の構成方法を模式的に示すも のである。

第１１図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１６）を有するＵプロモーター ／　１　ｐ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１５）を示すもの である。

第１２図は、組換えワクシニアウィルスｖＰ８９６の構成方法を模式的に示すも のである。

第１３図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１７）を有するＩ３Ｌプロモー ター／Ｓ　１２／コア遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号８７）を示すものであ る。

第１４図は、組換えワクシニアウィルスｖＰ９１９の構成方法を模式的に示すも のである。

第１５図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号２１９）を有するＥＰＶ４２ｋＤ ａプロモーター／　１　ｐ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子のＤＮＡ配列（配列認識番号２１ ８）を示すものである。

第１６図は、Ｃ５０ＲＦを含有するカナリヤボックスＰｖｕｌｌ断片のＤＮＡ配 列（配列認識番号２１７）を示すものである。

第１７図は、組換えカナリヤポックスウィルスｖＣＰ６５　（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ ）の構成方法を模式的に示すものである。

第１８図は、ワクシニアウィルスｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ＶＰ９０８、ｖＰ９ ２Ｂ、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に挿入されるＪＥＶ暗号領域の模式図である 。

第１９図は、ワクシニアウィルスｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７ ２９およびｖＰ７２５に挿入されるＹＦ暗号領域の模式図である。

第２０図は、ワクシニアウィルスｖＰ８６７、ｖＰ９６２およびｖＰ９５５に挿 入されるＤＥＮ暗号領域の模式図である。

第２１図は、Ｈ８０ＲＦを含有するＴＲ０ＶＡＣＤＮＡの３６６１塩基対断片の ヌクレオチド配列（配列認識番号２２１）を示すものである。

第２２図は、Ｈ７０ＲＦを含有するＴＲ０ＶＡＣＤＮＡの２３５６塩基対断片の ＤＮＡ配列（配列認識番号２２２）を示すものである。

第２３図は、ＥＩＶ　ＨＡ（ＡＩ／ブラハ１５６）のヌクレオチド配列（配列認 識番号２７９）を示すものである。−第２４図は、ＥＩＶＨＡ（Ａ２／フォンテ ンブルー／７９）のヌクレオチド配列（配列認識番号２８４）を示すものである 。

第２５図は、ＥＩＶ　ＨＡ（Ａ２／サフォーク／８９）のヌクレオチド配列（配 列認識番号３００）を示すものである。

第２６図は、ＦｅＬＶ−Ｂエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番 号３１０）を示すものである。

第２７図は、ＦｅＬＶ−Ａｑａｑおよび部分的ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド配列 （配列認識番号３２４）を示すものである。

ｆｉ２８囚は、ＦＨＶ−ＩＣＯ菌株ｇＳホモログ遺伝子のヌクレオチド配列（配 列認識番号２９０）を示すものである。

第２９図は、ｐＵＲＦ３により表されるコンセンサスＦヌクレオチド配列（おた ふくかぜ）（配列認識番号３７０）を示すものである。

第３０図は、ｐＵＨＮ５により表されるコンセンサスＨＮヌクレオチド配列（お たふくかぜ）（配列認識番号３７１）を示すものである。

第３１図は、ワクシニアウィルスまたはカナリヤボックスウイ／ｌ、スベク９− 　（ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣ）もしくはＨＩＶ　ＩＩＩ　Ｂ　ｅｎｖを発現する ワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウィルス（ｖＰ９１１、ＶＤＰ１１ ２）で免疫化した、ネズミのひ臓細胞の細胞毒性応答を示すものである。

第３２図は、細胞毒性Ｔリンパ球細胞表面抗原Ｔｈｙｌ。

２およびＬｙｔ２，２に対する抗体に対してのｖｃＰ１１２で免疫化したネズミ のひ臓からの細胞毒性作動体細胞の感度を示すものである。

第３３図は、ｇｐ１２０（７）ＨＩＶ　ＩＩＩ　Ｂ超可変Ｖ３ループツチあッテ 、ＨＩＶ　ＭＮまたは５Ｆ２（７）Ｖ３ループのではない細胞毒性Ｔリンパ球抗 原受容体の特異性を示すものである。

第３４図は、ベクター（ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣ）　まｔ：はワクシニアウィル ス組換え体ｖＰ９１１またはＨＩＶ−１ｅｎｖを発現するカナリヤボックス組換 え体ｖｃＰ１２で免疫化したネズミのＨＩＶ　ＩＩＩ　Ｂ　ｇｐ１２０に対する 抗体応答を示すものである（逆三角は、２回目の接種を施した時間を示す）。

第３５図は、狂犬病中和抗体力価（ＲＦＦＩＴ、ＩＵ／ｍｌ）のグラフであって 、同一のワクチンまたは交互のワクチンで事前に免疫化した志願者にＨＤＣおよ びｖＣＰ６５を追加抗原投与した効果（１０５・’ＴＣＩＤ５０）を示すもので ある（ワクチンは０．２８および１８０日目日日え、抗体力価は０．７．２８． ３５．５６．１７３．１８７および２０８日に潴１定した）。

第３６図は、ｖＰ９０８、ｖＰ５５５、ｖＰ９２３およびｖＰ８２９中に含有せ しめられたＪＥＶ　ｃＤＮＡ配列を示すものである。

第３７図は、０日と２８日にｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８６６およびＰＢＳ で免疫化した豚に観察されたＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性を示すものである（矢印 は接種の日を示す）。

第３８図は、ＰＢＳＳｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはＶＰ９２３で免疫化し、Ｊ ＥＶ（７）Ｂ−２３５８／８４菌株で抗原投与した各群の個々の豚に検出したウ ィルス血症の時間の経過を示すものである。

第３９図は、ＮＹＶＡＣを産生ずるのに欠損したＯＲＦを模式的に示したもので ある。

発明の詳細な説明 新たなワクシニアワクチン菌株、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を展開するために、 ワクシニア旨い留守のコペンハーゲンワクチン菌株を、既知のまたは潜在的な毒 性因子をコードするゲノムの６つの回天領域を欠損せしめることにより修飾した 。この配列欠損は以下に詳細に示す。ワクシニア制限断片、読取り枠およびヌク レオチド位置の全ての名称は、ゲーベルらＮ　１９９０ａ、　ｂに報告された用 語法に基づくものである。

欠損座はまた、異種遺伝子の挿入の受容体座として作成された。

ＮＹＶＡＣ中の欠損領域を以下に示す。また、短縮型および欠損領域の読取り枠 の名称（ゲーベルら、１９９０ａ、　ｂ）並びに下記に特性される全ての欠損を 含むワクシニア組換え体（ｖ　Ｐ）の名称も記載する： （１）チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ；Ｊ２Ｒ）ｖＰ４１０； （２）出血性領域（ｕ　；Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ）ｖＰ５５３　；（３）Ａ型含有 ボディ領域（ＡＴＩ　；Ａ２６Ｌ）ｖＰ６１８； （４）血球凝集素遺伝子（ＨＡ　；Ａ３６Ｒ）ｖＰ７２３　；（５）宿主範囲遺 伝子領域（Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ）ｖＰ８０４　；（６）巨大サブユニット、リボヌク レオチドレダクターゼ（１４Ｌ）ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）。

ＤＮＡクローニングおよび合成 プラスミドを構成し、スクリーニングして、標準方法により成長せしめた（マニ アチスら、１９８２；バーカスら、１９８５；ピッチｍ＝ら、１９８７）。制限 エンドグルカナーゼを、ＭＤ、ゲセルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリー ズ；ＭＡ、ビバーリー、ニューイングランドバイオラボ；およびＩＮ、インディ アナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。Ｅ、ｃｏｌｉ ポリメラーゼのフレノウ断片を、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから 得た。ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼおよびファージＴ４　ＤＮＡリガーゼを ニューイングランドバイオラボから得た。様々な供給者により明示された試薬を 用いた。

合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述のようにバイオサーチ８７５０ま たは応用バイオシステム３８０ＢＤＮＡシンセサイザーで調製した（バーカスら 、１９８９）。

前述したように（グオら、１９８９）シーケナーゼを用いて（タボアら、１９８ ７）　、ジデオキシ鎖終了法（サンガーら、１９７７）によりＤＮＡ塩基配列決 定を行なった。自動パーキンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラ−中で、注 文合成オリゴヌクレオチドブライマーとジエネアンブＤＮＡ増幅試薬キット（Ｃ Ｔ、ノルウオーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、配列確認のためのポリ メラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅（エンゲルケら、１９８ｇ）を行な った。制限エンドヌクレアーゼ切断および続いてのＢＡＬ−１３エキソヌクレア ーゼによる制限切断並びに合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マン デツキ、１９８６）によりプラスミドから過剰のＤＮＡ配列を欠損せしめた。

細胞、ウィルス、および移入 ワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株の培養の起源と条件は以前に記載した （グオら、１９８９）。ニトロセルロースフィルターの現場での雑種形成、組換 え、およびＢ−ガラクトシダーゼ活性のスクリーニングによる組換えウィルスの 産生は以前に記載している（バニカリら、１９８２；バーカスら、１９８９）。

説明のために示した以下の実施例により、本発明および多くの利点がよりよく理 解されるであろう。

実施例１−チミジンキナーゼ遺伝子（Ｊ２Ｒ）の欠損したプラスミドｐｓＤ４６ ０の構成 ここで第１図を参照する。プラスミドｐｓＤ４０６はｐＵＣ８中にクローンされ たワクシニアＨｉｎｄｌｌｌ　Ｊ（位置８３３５９−８８３７７）を含有しテイ ル。ｐＳＤ４０６をＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＰｖｕｌｌで切断し、ｐＵＣ８中にク ローンされたＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊの左側からの１゜７ｋｂ断片をＨｉｎｄ／Ｓｍ ａｌで切断し、ｐＳＤ４４７を形成した。ｐＳＤ４４７はＪ２Ｒの完全な遺伝子 を含有している（位置８３８５５−８４３８５）。開始コドンはＮｌａＩｌｌ部 位内に含有され、終止コドンは５ｓｐｌ部位内に含有される。第１図の矢印によ り転写の方向を示す。

左側フランキングアームを得るために、０．８ｋｂＨｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｅｃ ｏＲＩ断片をｐＳＤ４４７から単離し、次いでＮ１ａｌｌＩで切断し、０．５ｋ ｂ　Ｈｉｎｄｌ１１／Ｎ１ａＩＩＩ断片を単離した。アニールした合成オリゴヌ クレオチドＭＰＳＹＮ４３／ＭＰＳＹＮ４４　（配列認識番号１／配列認識番号 ２） をＨｉ　ｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵｃ１８ベクタープラスミ ド中て０．５ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ／Ｎ１ａＩＩＩ断片と連結し、プラスミドｐ ＳＤ４４９を産生じた。

ワクシニア右側フランキングアームとｐＵＣベクター配列を含有する制限断片を 得るために、ワクシニア配列内の５ｓｐｌ　（部分的）とｐＵＣ／ワクシニア接 合部でのＨｉｎｄｌｌｌでｐＳＤ４４７を切断し、２．９ｋｂベクタ一断片を単 離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４ ５／ＭＰＳＹＮ４６　（配列認識番号３／配列認識番号４） と連結し、ｐＳＤ４５９を産生じた。

左側と右側フランキングアームを１つのプラスミド中に結合させるために、０． ５ｋｂ　ＨｉｎｄｌｌＩ／Ｓｍａｌ断片をｐＳＤ４４９から単離し、ＨｉｎｄＩ ＩＩ／Ｓｍａ！で切断したｐＳＤ４５９ベクタープラスミドと連結し、プラスミ ドｐｓＤ４６０を産生じた。ｐｓＤ４６０は、野生型組ワクシニアウイルスコペ ンハーゲン菌株ＶＣ−２との組換えの供与体プラスミドとして用いた。テンプレ ートととしてのＭＰＳＹＮ４５　（配列認識番号３）とプライマーとじての相補 的２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ４７（配列認識番号５）（５’　Ｔ ＴＡＧＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣ３’　）を用いたプライマー延長によ りＪ２ｐ標識プローブを合成した。組換えウィルスｖＰ４１０をプラークハイブ リダイゼーションにより同定した。

実施例２−出血性領域の欠損したプラスミドｐＳＤ４８６の構成（８１３Ｒ＋８ １４） ここで第２図を参照する。プラスミドｐｓＤ４１９はｐＵＣ８中にクローンされ たワクシニア５ａｉｌ　Ｇ（位置１６０．７４４−１７３．３５１）を含有して いる。ｐＳＤ４２２はｐＵＣ８中にクローンされた、右側への隣接ワクシニア５ ａｉｌ断片、５ａｉｌ　Ｊ（位置１７３，３５１−１８２，７４６）を含有して いる。出血性領域、Ｕ。

Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ（位置１７２，５４９−１７３，５５２）の欠損したプラス ミドを構成するために、左側フランキングアームの供給源としてｐｓＤ４１９を 用い、右側フランキングアームの供給源としてｐＳＤ４２２を用いた。

Ｕ領域の転写方向を第２図の矢印で示す。

ｐｓＤ４１９からの不必要な配列を除去するために、Ｎｃｏｌ／Ｓｍａｌにより ｐｓＤ４１９の切断によりＮｅ。

■部位（位置１７２．２５３）の左側までの配列を除去し、続いてＥ、ｃｏｌｔ ポリメラーゼのフレノウ断片によるプラントエンド並びに連結を行ないプラスミ ドｐＳＤ４７６を産生した。Ｂ１４Ｒの終止コドンでのＨｐａＩでのｐＳＤ４２ ２の切断と右側の０．３ｋｂのＮｒｕ　Ｉでの切断によりワクシニア右側フラン キングアームを得た。この０゜３ｋｂ断片を単離して、ｐＳＤ４７６から単離し た３、４ｋｂ　Ｈｉｎｃｌｌベクター断片と連結し、プラスミドｐＳＤ４７７を 産生じた。ｐＳＤ４７７のワクシニアＵ領域の部分的な欠損位置を三角形により 示す。Ｃ１ａｌ／ＨｐａＩでの切断により、ｐＳＤ４７７中の残りのＢ１３Ｒ暗 号配列を除去し、生成したベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチド ＳＤ２２ｍｅ　ｒ／ＳＤ２０ｍｅ　ｒ（配列認識番号６／配列認識番号７） と連結し、ｐＳＤ４７９を産生した。ｐＳＤ４７９は開始コドン（下線）と続い てＢａｍＨ１部位を含有している。

Ｕプロモーターの制御下で８１３−８１４　（ｕ）欠損座中にＥ、ｃｏｌｉベー タガラクトシダーゼを配するために、ベータガラクトシダーゼを含有する３、２ ｋｂ　ＢａｍＨ１断片をｐＳＤ４７９のＢｇｍＨ１部位中に挿入し、ｐＳＤ４７ ９ＢＧを生成した。ｐＳＤ４７９８Ｇは、ワクシニアウィルスｖＰ４１０による 組換えの供与体プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウィルスｖＰ５３３ を、色素基体Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。ｖＰ５３３ において、Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒ領域は欠損しており、ベータガラクトシダーゼに より置換されている。

ｖＰ５３３からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領 域を含有するがＵ欠損接合部には開始コドンを含有しないｐＳＤ４７７の誘導体 、プラスミドｐＳＤ４８６を用いた。最初に上述したｐＳＤ４７７からのＣ１ａ ｌ／ＨｐａＩベクタ一断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドＳＤ４２ｍｅ 　ｒ／ＳＤ４０ｍｅ　ｒ　（配列認識番号８／配列認識番号９） と連結し、プラスミドｐＳＤ４７８を産生じた。次に、ｐＳＤ４７８をＥｃｏＲ Ｉでの切断によりｐＵＣ／ワクシニア接合でのＥｃｏＲ１部位を破壊し、続いて Ｅ、ｃｏｌｔポリメラーゼのフレノウ断片でのプラントエンド並びに連結を行な いプラスミドｐＳＤ４７８Ｅ−を産生した。ｐＳＤ４７８Ｅ−をＢａｍＨＩとＨ ｐａＩで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドＨＥＭ５／ＨＥＭ６　（ 配列認識番号１０／配列認識番号１１） と連結し、プラスミドｐＳＤ４８６を産生じた。ｐＳＤ４８６を、組換えワクシ ニアウィルスｖＰ５３３との組換えのための供与体プラスミドとして用い、ｖＰ ５５３を産生じ、これをＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

実施例３−ＡＴＩ領域（Ａ２６Ｌ）の欠損したプラスミドｐＭＰ４９４Δの構成 ここで第３図を参照する。ｐｓＤ４１４はｐＵＣ８中にクローニングされた５ａ ｌＩ　Ｂを含有している。Ａ２６Ｌ領域の左側の不必要なりＮＡ配列を除去する ために、ｐＳＤ４１４を、ワクシニア配列内のＸｂａｌ（位置１７３゜０７９） およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨｉｎｄＩＩＩで切断し、次いでＥ、ｃｏ ｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドして連結し、プラスミドｐＳ Ｄ４８３を産生じた。Ａ２６Ｌ領域の右側の不必要なりＮＡ配列を除去するため に、ｐＳＤ４８３をＥｃｏＲＩ　（位置１４０．６６５およびｐＵＣ／ワクシニ ア接合部）で切断して連結し、プラスミドｐＳＤ４８４を形成した。Ａ２６Ｌ暗 号領域を除去するために、Ａ２６Ｌ　ＯＲＦからや上流のＮｄｅｌ（部分的）（ 位置１３９．００４）およびＡ２６Ｌ　ＯＲＦのやや下流のＨｐａｌ（位置１３ ７，８８９）で切断した。５．２ｋｂベクタ一断片を単離して、アニールした合 成オリゴヌクレオチドＡＴＩ３／ＡＴＩ４　（配列認識番号１２／配列認識番号 １３） と連結し、Ａ２６Ｌから上流の領域を再構成し、上記したようにＡ２６Ｌ　ＯＲ Ｆを、制限部位Ｂｇｌｌ１％Ｅｃ。

Ｒ１およびＨｐａＩを含有する短いポリリンカー領域と置換した。生成したプラ スミドをｐＳＤ４８５と称した。ｐＳＤ４８５のポリリンカー領域中のＢｇｌｌ ＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特有ではないので、ＢｇｌＩＩ（位置１４０゜１３６ ）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＥｃｏＲＩで切断により望ましくないＢ ｇｌＩＩおよびＥｃｏＲ１部位をプラスミドｐＳＤ４８３　（上述）から除去し 、続いてＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンド並びに連結 した。産生じたプラスミドをｐＳＤ４８９と称した。Ａ２６Ｌ　ＯＲＦを含有す るｐＳＤ４８９からの１．８ｋｂ　Ｃ１ａｌ　（位置１３７，１９８）／Ｅｃｏ ＲＶ（位置１３９，０４８）断片を、ｐＳＤ４８５からの対応０．７ｋｂポリリ ン力−含有Ｃ１ａＩ／ＥｃｏＲＶ断片と置換してｐＳＤ４９２を産生じた。ｐＳ Ｄ４９２のポリリンカー領域中のＢｇｌｌＩおよびＥｃｏＲＩ部位は特有である 。

ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（パートレッドら、１９８５　、 バーカスら、１９９０）　Ｅ、ｃ　ｏ　１　ｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（ シャピラら、１９８３）を含有する３、３ｋｂ　ＢｇｌｌＩカセツテをｐＳＤ４ ９２のＢｇ１１１部位に挿入し、ｐＳＤ４９３ＫＢＧを形成した。プラスミドｐ ＳＤ４９３ＫＢＧは救助（ｒｅｓｃｕｉｎｇ）ウィルスｖＰ５５３との組換えに 用いた。Ａ２６Ｌ欠損領域中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシ ニアウィルス、ｖＰ５８１を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離 した。

ワクシニア組換えウィルスｖＰ５８１からのベータガラクトシダーゼを除去した プラスミドを産生ずるために、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ１７７　（配 列認識番号１（５’　ＡＡＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡ ＴＡＴＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＴｒＧＡｌｌｋＴＡ’ｒＡＣ３’）を用いた突然変 異誘発（マンデツキ、１９８Ｂ）によりプラスミドｐＳＤ４９２のポリリンカー 領域を欠損した。産生じたプラスミド、ｐＭＰ４９４Δにおいて、完全なＡ２６ ＬＯＲＦを含存し、位置［１３７，８８９−１３８，９３７］を包含するワクシ ニアＤＮＡは欠損している。ｐＭＰ４９４Δとワクシニア組換え体、ｖＰ５８１ を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体 ｖＰ６１８を産生じ、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した 。

実施例４−血球凝集素遺伝子（Ａ　５６　Ｒ）の欠損したプラスミドｐＳＤ４６ ７の構成 ここで第４図を参照する。ワクシニア５ａｉｌ　Ｇ制限断片（位置１６０．７４ ４−１７３．３５１）はＨｉｎｄ１１１Ａ／Ｂ接合部（位置１６２，５３９）と 交差している。ｐｓＤ４１９はｐＵＣ８中にクローニングされたワクシニア５ａ ｌｌ　Ｇを含有している。血球凝集素（ＨＡ）遺伝子の転写方向を第４図に矢印 で示す。Ｉ）ＳＤ４１９をワクシニア配列内とｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＨ ｉｎｄｌｌｌで切断することにより、Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｂから誘導したワクシニ ア配列を除去し、続いて連結した。産生じたプラスミドｐＳＤ４５６は、左側の ０．４ｋｂのワクシニア配列と右側の０．４ｋｂのワクシニア配列を側腹に有す るＨＡ遺伝子、Ａ３６Ｒを含有している。ｐＳＤ４５６を、Ａ３６Ｒ暗号配列か ら上流のＲｓａｌ（部分的；位置１６１，０９０）、および遺伝子の末端近くの ＥａｑＩ（位置１６２．９５４）で切断することによりＡ３６Ｒ暗号配列を除去 した。ｐＳＤ４５６からの３，６ｋｂＲｓａｌ／ＥａｑＩベクタ一断片を単離し 、アニールした合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ５９　（配列認識番号１５） 、ＭＰＳＹＮ６２　（配列認識番号１６）　、ＭＰＳＹＮ６０（配列認識番号１ ７）、およびＭＰＳＹＮ６１　（配列認識番号１８） ＭＰＳＹＮ６２　ＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴ５會と連結し、Ａ３６ＲＯＲＦから上流 のＤＮＡ配列を再構成し、上記のごとく示したようにＡ３６ＲＯＲＦをポリリラ ンカー領域で置換した。産生じたプラスミドはｐＳＤ４６６”Ｃ−ある。ｐＳＤ ４６６中のワクシニア欠損は、位置［１６１，１８５−１６２，０５３］を包含 する。ｐＳＤ４６６中の欠損部位を第４図に三角形で示す。

ワクシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、１９８５　； グオら、１９８９）　Ｅ、ｃ　ｏ　ｌ　ｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャ ビラら、１９８Ｂ）を含有する３゜２ｋｂ　ＢｇｌｌＩ／ＢａｍＨＩ（部分的） カセツテを、ｐＳＤ４６６のＢｇ１１１部位に挿入し、ｐＳＤ４６６ＫＢＧを形 成した。プラスミドｐＳＤ４６６ＫＢＧは、救助ウィルスｖＰ６１８との組換え に用いた。Ａ３６Ｒ欠損中にベーカダラクトシダーゼを含有する組換えワクシニ アウィルス、ｖＰ７０８を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離し た。

供与体プラスミドｐＳＤ４６７を用いてベータガラクトシダーゼ配列をｖＰ７０ ８から欠損した。；　Ｉ）ＳＤ４６６をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＧＩで切断すること により、ｐＵＣ／ワクシニア接合部からＥｃｏＲＩ、Ｓｍａ　ＩおよびＢａｍＨ Ｅ部位を除去し、続いてＥ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエ ンドし、連結したことを除いては、ｐＳＤ４６７はｐＳＤ４６６と同一である。

ｖＰ７０８とｐＳＤ４６７との間の組換えにより、組換えワクシニア欠損変異体 、ｖＰ７２３を産生じ、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとし単離した 。

実施例５−読取り枠［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の欠損したプラスミドｐＭＰｃｓＫ１Δ の構成 ここで第５図を参照する。ｐＭＰｃｓＫ１Δの構成に、以下のワクシニアクロー ンを用いた。ｐｓＤ４２０はｐＵＣ８中にクローニングされた５ａｉｌ　Ｈであ る。ｐＳＤ４３５はｐＵｃ１８中にクローニングされたＫｐｎＩ　Ｆである。ｐ ＳＤ４３５をｓｐｈ　！で切断し、再連結し、ｐＳＤ４５１を形成した。ｐｓＤ ４５１において、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｍ中のｓｐｈ　１部位（位置２７，４１６） の左側のＤＮＡ配列を除去する（バーカスら、１９９０）。ｐｓＤ４０９はｐｔ ｒｃｓ中にクローニングされたＨｉｎｄｌｌｌＭである。

ワクシニアからの［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］遺伝子クラスターの欠損した基体を提供す るために、Ｅ、ｃｏｌｉベータガラクトシダーゼを以下のようにワクシニアＭ２ Ｌ欠損座（グオら、１９９０）中に最初に挿入した。ｐ　Ｓ　Ｄ　４０　’にの Ｂｇｌ１１部位を除去するために、ワクシニア配列のＢｇｌＩＩ（位置２８，２ １２）およびｐＵＣ／ワクシニア接合部でのＢａｍＨＩで切断し、次いで連結し 、プラスミドｐＰｖＩＰ４０９Ｂを形成した。ｐＭＰ４０９Ｂを特有ｓｐｈ　１ 部位（位置２７，４１６）で切断した。合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ８２ 　（配列認識番号１９）を用いた突然変異誘発（グオら、１９９０　；マンデツ キ、１９８Ｂ）によりＭ２Ｌ暗号配列を除去した。産生じたプラスミド、ｐＭＰ ４０９Ｄは、上記のようにＭ２Ｌ欠損座中に挿入された特有Ｂｇｌ１１部位を含 有した。１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレットら、１９８５）　Ｅ 、ｃ　ｏ　１　ｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャビラら、１９８３）を含 有する３、２ｋｂ　ＢａｍＨＩ　（部分的）／ＢｇｌｌｌカセツテをＢｇｌＩＩ で切断したｐＭＰ４０９Ｄ中に挿入した。

産生じたプラスミドｐＭＰ４０９ＤＢＧ　（グオら、１９９Ｇ）を救助ワクシニ アウィルスｖＰ７２３により組換えの供与体プラスミドとして用いた。Ｍ２Ｌ欠 損座中に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウィル ス、ｖＰ７８４を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離した。

ワクシニア遺伝子［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］の欠損したプラスミドを、Ｓｍａ　Ｉ、Ｈ ｉｎｄＩＩＩで切断したｐＵＣ８中に組み入れ、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼのフ レノウ断片でプラントエンドした。ワクシニアＨｉｎｄｌｌＩ　Ｃ配列からなる 左側フランキングアームを、ｐｓＤ４２０をｘｂａＩ（位置１８，６２８）で切 断することにより得て、Ｅ。

ｃｏｌｉポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドしてＢｇＩｌｌ（位置１ ９，７０６）で切断シタ。ｐＳＤ４５１をＢｇｌｌｌ（位置２９．０６２）とＥ ｃｏＲＶ（位置２９．７７８）で切断することにより、ワクシニアＨｉｎｄｌＩ Ｉ　Ｋ配列からなる右側フランキングアームを得た。産生じたプラスミド、ｐＭ Ｐ５８１ｃＫは、ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｃ中のＢｇｌＩＩ部位（位置１９，７０６） とＨｉｎｄｌｌｌ　Ｋ中のＢｇｌＩＩ部位（位置２９，０６２）の間のワクシニ ア配列が欠損している。プラスミドｐＭＰ５８１ＣＫ中のワクシニア配列の欠損 部位を第５図に三角形で示す。

ワクシニア欠損接合部の過剰のＤＮＡを除去するために、プラスミドｐＭＰ５８ １ｃＫをワクシニア配列内のＮｃ。

１部位（位置１８，８１１　；　１９，６５５）で切断し、Ｂｉｔ−３１エキソ クレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２３３　（配列認識番 号２０）を用いて突然変異誘発（マンデツキ、１９８Ｂ）を行なった。

産生じたプラスミド、ｐＭＰｃｓＫ１Δは、１２ワクシニア読取り忰［Ｃ７Ｌ− ＫＩＬ］を包含する、ワクシニア配列位置１８，８０５−２９．１０８が欠損し ている。ｐＭＰＣ５ＫＩΔとワクシニア組換え体、ｖＰ７８４を含有するベーダ ラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体、ｖＰ８０４が産生 じ、これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

実施例６−巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（Ｉ４Ｌ）の欠損 したプラスミドｐＳＤ５４８の構成 ここで第６図を参照する。プラスミドｐｓＤ４０５は、ｐＵＣ８中にクローンさ れたワクシニアＨｉｎｄＩＩＩＩ　（位置６３．８７５−７０．３６７）を含有 している。

ｐｓＤ４０５をワクシニア配列（位置６７．９３３）内のＥｃｏＲＶおよびｐＵ Ｃ／ワクシニア接合部でのＳｍａ　１で切断し、連結し、プラスミドｐｓＤ５１ ８を形成した。

ｐｓＤ５１８は、ｐＳＤ５４８の構成に用いる全てのワクシニア制限断片の供給 源として用いた。

ワクシニア１４Ｌ遺伝子は、位置６７．３７１−６５゜０５９に亘り延びる。１ ４Ｌの転写方向を第６図の矢印で示した。１４Ｌ暗号配列の部分が欠損したベク タープラスミド断片を得るために、ｐｓＤ５１８をＢａｍＨＩ　（位置６５．３ ８１）とＨｐａｌ（位置６７．００１）で切断し、Ｅ、ｃｏｌｉポリメラーゼの フレノウ断片を用いてプラントエンドした。この４．８ｋｂベクタ一断片を、ワ クシニア１１ｋＤａプロモーターの制御下で（バートレット、１９８５；パーカ スら、１９９０）　Ｅ、ｃ　ｏ　１　ｉベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピ ラら、１９８３）を含有する３、２ｋｂＳｍａｌカセツテと連結し、プラスミド ｐＳＤ５２４ＫＢＧを産生じた。ｐＳＤ５２４ＫＢＧは、ワクシニアウィルスｖ Ｐ８０４との組換えの供与体プラスミドとして用いた。

１４Ｌ遺伝子の部分的欠損中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシ ニアウィルス、ｖＰ８５５を、Ｘ−ｇａｌの存在下でブループラークとして単離 した。

ｖＰ８５５からの１４Ｌ　ＯＲＦの残りとベータガラクトシダーゼを欠損するた めにに、欠損プラスミドｐＳＤ５４８を構成した。以下に示すように左側と右側 のワクシニアフランキングアームをｐＵＣｇ中で別々に組み立て、これを第６図 に模式的に示した。

左側ワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構成する ために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、アニールした合成オリゴ ヌクレオチド５１８Ａ１１５１８Ａ２　（配列認識番号２１／配列認識番号２２ ） と連結し、プラスミドｐｓＤ５３１を形成した。ｐＳＤ５３１をＲｓａＩ（部分 的）とＢａｍＨＩで切断し、２．７ｋｂベクタ一断片を単離した。ｐｓＤ５１８ をＢｇｌｌｌ（位置６４，４５９）／Ｒｓ　ａ　Ｉ　（位置６４，９９４）で切 断し、０．５ｋｂ断片を単離した。２つの断片をともに連結し、ｐＳＤ５３７を 形成した。このｐＳＤ５３７は■４Ｌ暗号配列の左側の完全なワクシニアフラン キングアームを含有する。

右側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構成す るために、ｐＵＣ８をＢａｍＨＩ／　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩで切断し、アニールした 合成オリゴヌクレオチド５１８Ｂ１１５１８Ｂ２　（配列認識番号２３／配列認 識番号２４） と連結し、プラスミドｐＳＤ５３２を形成した。ｐＳＤ５３２をＲｓａＩ（部分 的）／ＥｃｏＲ１で切断し、２．７ｋｂベクタ一断片を単離した。ｐｓＤ５１８ を、ワクシニア配列内のＲｓａｌ（位置６７．４３６）およびワクシニア／　ｐ 　Ｕ　Ｃ接合部のＥｃｏＲｌで切断し、０，６ｋｂ断片を単離した。２つの断片 をともに連結し、ｐＳＤ５３８を形成した。このｐＳＤ５３８は１４Ｌ暗号配列 の右側の完金なワクシニアフランキングアームを含有する。

ｐＳＤ５３８からの０．６ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ断片として右側ワクシ ニアフランキングアームを単離して、ＥｃｏＲＩ／Ｂｇｌｌｌで切断したｐＳ０ ５３７ベクターブラスミド中に連結した。産生じたプラスミド、ｐｓＤ５３９に おいて、１４Ｌ　ＯＲＦ　（位置６５，０４７−６７’、３８６）は、全てｐＵ Ｃバックグラウンドにおいて左側の０．６ｋｂのワクシニアＤＮＡと右側に０． ６ｋｂのワクシニアＤＮＡを側腹に有するポリリンカー領域により置換される。

ワクシニア配列内の欠損部位を第６図に三角形で示す。ｐＳＤ５３９のｐＵＣ誘 導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクシニアウィルスｖＰ８５５ 内のベータガラクトシダーゼ配列との潜在的な組換えを避けるために、ワクシニ アＩ４Ｌ欠損カセツテをｐＳＤ５３９から、全てのベータガラクトシダーゼ配列 が除去されポリリンカー領域と置換されたｐＵＣ誘導体である、ｐＲＣ１１中ニ 移入しｌ’、：（：ＩＩＪナスら、１９９０）　、　ｐＳＤ５３９をＥｃｏＲＩ ／Ｐｓｔｌで切断し、１．２ｋｂ断片を単離した。この断片をＥｃｏＲＩ／Ｐｓ ｔｌで切断したｐＲＣｌｌ　（２，３５ｋｂ）中に連結し、ｐＳＤ５４８を形成 した。ｐＳＤ５４８とワクシニア組換え体、ｖＰ８５５を含有するベータガラク トシダーゼとの間の組換えにより、ワクシニア欠損変異体ｖＰ８６６を産生じ、 これはＸ−ｇａｌの存在下で透明プラークとして単離した。

組換えワクシニアウィルスｖＰ８６６がらのＤＮＡを、制限切断と、続いてアガ ロースゲル上の電気泳動により分析した。制限模様は予期したとうりであった。

テンプレートとしてのｖＰ８６６と上述した６つの欠損塵を側腹に有するプライ マーを用いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（エンゲルケら、１９８８）により 、予期したサイズのＤＮＡ断片が産生された。欠損接合部の区域辺りのＰＣＲ産 生断片の配列分析により、接合部が予期したものであることが確認された。上述 したような６つの作成した欠損を含有する組換えワクシニアウィルスｖＰ８６６ はワクシニアワクチン菌株ｒＮＹＶＡｃＪと称した。

実施例７〜狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子のＮＹＶＡＣへの挿入 ワクシニアＨ６プロモーター（ティラーら、１９８８ａ、、ｂ）の制御下で遺伝 子コード狂犬病糖タンパク質ＧをＴＫ欠撓プラスミドｐｓＤ５１３中に挿入した 。ｐｓＤ５１３は、ポリリンカー領域の存在を除いてはプラスミドｐＳＤ４６０ （第１図）と同一である。

ここで第７図を参照する。ｐｓＤ４６０をＳｍａ　Ｉで切断し、プラスミドベク ターをアニールした合成オリゴヌクレオチドＶＱＩＡ／ＶＱＩＢ　（配列認識番 号２５／配列認識番号２６） と連結することによりポリリンカー領域を挿入し、ベクタープラスミドｐｓＤ５ １３を形成した。ｐｓＤ５１３をｓｍａｌで切断し、ワクシニアＨ６プロモータ ーの制御下で狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をフードする遺伝子を含有するＳｍａ 　Ｉ末端１．８ｋｂカセツテと連結した（ティラーら、１９８８ａ、　ｂ）　。

産生じたプラスミドをｐＲＷ８４２と称する。ｐＲＷ８４２を、ＮＹＶＡＣ救助 ウィルス（ｖＰ８６６）との組換えの供与体プラスミドとして用いた。狂犬病糖 タンパク質Ｇ暗号配列に対する３２ｐ４１［識ＤＮＡプローブを用いてプラーク ハイブリダイゼーションにより同定した。

本発明の修飾組換えウィルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を提供す る。ベクターの毒性か弱毒化したことにより、ワクチン接種した個体のワクチン 接種により手に負えない（ｒｕｎａｗａｙ）感染の可能な機会が減少し、またワ クチン接種した個体からワクチン接種していない個体への伝染または環境の汚染 が減少する。

修飾組換えウィルスはまた好ましくは、細胞中の遺伝子産生物をコードし発現す る異種ＤＮＡを有する修飾組換えウィルスを細胞中に導入することにより、生体 外で培養した細胞中に遺伝子産生物を発現する方法に用いられる。

実施例８−ニューカッスル病ウィルスの血球凝集素ノイラミニターゼ糖タンパク 質と融合を発現するＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶの構成 毒性ＮＤＶ菌株テキサスのＦおよびＨＮ遺伝子の両方を発現する鶏痘ウィルス（ ＦＰＶ）ベクターを構成した。産生じた組換え体はＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶと称し た。ＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶは組換えウィルスに感染したアビアン細胞中の確実に 処理したＮＤＶ糖タンパク質を発現し、生後１日のひなに接種することにより続 いての毒性ＮＤＶ抗原投与に対して保護を与える。

細胞およびウィルス ＮＤＶのテキサス菌株は短潜伏期性菌株である。ＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡ クローンの調製は前に記載してあル（ティラーら、１９９０　；　エドバウアー ら、１９９０）　、　Ｆ　Ｐ　Ｖ選定ＦＰ−１の菌株は前に記載しである（ティ ラーら、１９８８ａ）。生後１日のひなのワクチン接種に有用なのは弱毒化ワク チン菌株である。親つィルス菌株デュベッティは、鶏からの鶏痘かさぶたとして フランスで得られた。ふ化鶏卵における約５０連続の継代接種と続いての鶏繊維 芽細胞の約２５回の継代接種によりウィルスは弱毒化された。ウィルスに４連続 のプラーク精製を施した。１つのプラーク単離体をさらに主要なＣＥＦ細胞中で 増幅し、ＴＲ０ＶＡＣと称する同種菌を作成した。ＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶを産生 する生体内組換え試験に用いられる同種ウィルスに、プラーク単離体からの主要 ＣＥＦ細胞中で１２回継代接種を施した。

ＮＤＶ−Ｆのカセツテの構成 Ｆタンパク質暗号配列の５′末端からの２２ヌクレオチド以外の全てを含有する １、８ｋｂｐ　ＢａｍＨＩ断片をｐＮＤＶ８１　（ティラーら、１９９０）から 切除し、ｐＵｃ１８のＢａｍＨ１部位で挿入し、ｐｃＥ１３を形成した。ｐＣＥ １３を５ａｌＩで切断し、粘着末端をＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのフレノ ウ断片で充填し、ＨｉｎｄｌＩＩで切断することにより、上述したワクシニアウ ィルスＨ６プロモーター（ティラーら、１９８８ａＳｂ　、グオら、１９８９； バーカスら、１９８９）をｐｃＥ１３中に挿入した。Ｈ６プロモーター配列を含 有するＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片をｐｃＥ１３中に挿入し、ｐＣＥ３ ８を形成した。ｐＣＥ３８をＫｐｎｌとＮｒｕ　Ｉで切断し、アニールしキナー ゼした（ｋｉｎａｓｅｄ）オリゴヌクレオチドＣＥ７５（配列認識番号２７）と ＣＥ７６　（配列認識番号２８）を挿入することにより完全な５′末端を産生し 、ｐＣＥ４７を産生した。

ＣＥ７５： ＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴｒＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧ ＡＴＣＴＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴＡＣＣＥ７６： ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＣＣＡ’Ｉ’Ｉ’ＡＣ ＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＮＤＶ−Ｆの３′末端から非暗 号配列を除去するために、ｐｃＥ１３からのＳｍａ　ＩからＰｓｔｌ断片をｐＵ ｃ１８のＳｍａ　ＩとＰｓｔ１部位に挿入し、ｐＣＥ２３を形成した。ｐＣＥ２ ３の５ａｃｌ、ＢａｍＨＩ、エキソフレアーゼＩＩＩ、Ｓｌヌクレアーゼおよび ＥｃｏＲＩでの配列切断により、非暗号配列を除去した。次いで、アニールし、 キナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ４２　（配列認識番号２９）およびＣＥ４ ２　（配列認識番号３０）を挿入し、ｐＣＥ２９を形成した。

次いで、ｐＣＥ２９からのＰｓｔｌ−ＳａｃＩ断片をｐＣＥ２０のＰｓｔｌとＳ ａｃ　Ｉ部位にクローニングすることニヨリ、ＮＤＶ−Ｆ配列の３′末端を、す でｉ：ＮＤＶ−Ｆの５′末端を含有するプラスミドｐｃＥ２０に挿入し、ｐＣＥ ３２を形成した。ｐｃＥ２０の産生は以前にティラーら、１９９０に記載されて いる。

ｐＣＥ４７中に含有されるＮＤＶ−Ｆ　５’配列とＨ６プロモーターをｐＣＥ３ ２中に含有される３’　ＮＤＶ−Ｆ配列と配列させるために、ｐＣＥ４７のＨｉ ｎｄｌＩＩ−Ｐｓｔｌ断片を、ｐＣＥ３２のＨｉｎｄｌｌＩおよびＰｓｔ１部位 に挿入し、ｐＣＥ４９を形成した。次いで、ｐＣＥ４９からのＨｉｎｄＩ　Ｉ　 Ｉ−Ｎｒｕｌ断片まをｐＪＣＡ００２のＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＳｍａ　Ｉ部位（ 上述）中にクローニングすることにより、Ｈ６ブロモートしたＮＤＶ−Ｆ配列を 脱ＯＲＦした（ｄｅ−ＯＲＦｅｄ）Ｈ８座に転移せしめ、ｐＣＥ５４を形成した 。ｐＣＥ５４をＳａｃ　Ｉで、部分的にＢａｍＨＩで切断し、アニールしキナー ゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ１６６　（配列認識番号３１）およびＣＥ１６７ 　（配列認識番号３２）を挿入することにより、転写終止信号をｐＣＥ５４に挿 入し、ｐＣＥ５８を産生じた。

テンプレートとしてのｐＣＥ５４およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチド ＣＥ１８２　（配列認識番号３３）とＣＥ１８３　（配列認識番号３４）による ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより、ＮＤＶ−Ｆの完全３′末端 を得た。

ＣＥ１８２：　ＣＴＴ入ＡＣＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＴＣＣＣＥ１８１：　ＴＡ ＣＧＴＡＧＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴＡＧ ＴＧＧＣＴＣＰＣＲ断片をＰｖｕｌｌとＨｐａｌｌで切断し、Ｈｐａｌと部分的 にＰｖｕ　Ｉ　Ｉで切断したｐＣＥ５８中にクローニングした。産生じたプラス ミドをｐＣＥ６４と称した。完全Ｈ６プロモーターとｐＣＥ６４からのＦ暗号配 列を含有するＨｉｎｄｌ　ＩＩ−ＨｐａＩ断片を、ｐＲＷ８４６のＨｉｎｄｌｌ ｌおよびＨｐａ１部位にクローニングすることにより、翻訳終止信号を挿入し、 ＮＤＶ−Ｆの最終カセツテであるｐｃＥ７１を産生した。プラスミドｐＲＷ８４ ６は実質的にプラスミドｐＪｃＡＯＯ２（以下に記載）と等しいが、Ｈ６プロモ ーターおよび転写ならびに翻訳終止信号を含有する。ｐＲＷ８４６をＨｉｎｄｌ ｌｌとＨｐａｌで切断することによりＨ６プロモーターを除去するが、終止信号 は完全に残す。

ＮＤＶ−ＨＮのカセツテの構成 プラスミドｐ　ＲＷ８０２の構成はエドバウアーら、１９９０に記載している。

このプラスミドはｐＵＣ９ベクター中にワクシニアウィルスＨ６プロモーターの ３′末端に連結したＮＤＶ−ＨＮ配列を含有している。ワクシニアウィルスＨ６ プロモーターの５′末端を包含するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、ｐ　Ｒ Ｗ８０２のＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲＶ部位に挿入し、ｐ　ＲＷ８３０を形 成した。アニールしキナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＥ１６２　（配列認識番 号３５）およびＣＥ１６３　（配列認識番号３６）をｐ　ＲＷ８３０のＥｃｏＲ １部位中に挿入することによりＮＤＶ−ＨＮ（７）３’末端を得て、ＮＤＶ−Ｈ Ｎの最終カセツテであるｐＣＥ５９を形成した。

ＣＥ１６２： ＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＧＴ’ｒＣＣＴｒＴＡＣＴＡＧＴｒＧＡＧＡＴＴＣＴＣ ＡＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＧＡ’Ｉ’ｆｆＡＡＴｒＴＴＴＡＴ入ＡＧＣＴＴＧ ＣＥ１６３： ＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴｒＡＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴｒ ＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＣｒＡＧＴＡＡＡｃｃＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧ ＦＰＶ挿入ベクターの構成 プラスミドｐＲＷ７３１−１５はゲノムＤＮＡからクローニングされた１０ｋｂ 　Ｐｖｕｌｌ−ＰｖｕｌＩ断片を含Ｈしている。３６６０ｂｐ　ＰｖｕｌＩ−Ｅ ｃｏＲＶ断片の両鏡についてヌクレオチド配列を決定した。ここにＦ８として示 した読取り枠の制限を決定した。プラスミドｐＲＷ７６１は２４３０ｂｐ　Ｅｃ ｏＲＶ断片を含有スルｐＲＷ７３１−１５のサブクローンである。Ｆ８　０ＲＦ はｐ　ＲＷ７６１中のＸｂａ１部位と５ｓｐｌ部位との間に完全に含まれた。Ｔ Ｒ０ＶＡＣとの組換えに関してゲノムＤＮＡがＦ８　０ＲＦを除去する挿入プラ スミドを産生ずるために、以下の工程を行なった。プラスミドｐ　ＲＷ７６１を Ｘｂａｌで完全に切断し、５ｓｐｌで部分的に切断した。

３７００ｂｐ　ＸｂａＩ−５ｓｐｌ帯をゲルから単離して、アニールした二重鎖 オリゴヌクレオチドＪＣＡＯ１７（配列認識番号３７）およびＪＣＡＯ１８（配 列認識番号３８）と連結した。

ＪＣＡＯＩフ：５１ ＣＴＡＧＡＣＡＣＴＴＴＡＴＧ實實貫ＡＡＴＡＴＣＣＧＧＴＣＴｒＡＡＡＡｃＣ ＴｒＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＡＣＧＧＧＧＡＡＴＡＡＴ ＪＣ入０１１１：５’ Ａ’！’ｒＡＴｒＣＣＣＣＧＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴ ＴＴＡＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＧＴＧＴ この連結により産生じたプラスミドをｐＪ　ＣＡＯＯ２と称した。

ＮＤＶ　ＦとＨＮの二重挿入ベクターの構成位にクローニングすることにより、 Ｈ６ブロモートしたＮＤＶ−ＨＮ配列をＨ６ブロモートしたＮＤＶ−Ｆカセツテ に挿入し、ｐｃＥ８０を形成した。プラスミドｐｃＥ８０をＮｄｅｌで完全に切 断し、Ｂｇｌｌｌで部分的に切断して、Ｈ６プロモーターによりドライブされＦ ８フランキングアームに連結したＮＤＶ　ＦおよびＨＮ遺伝子を含有するＮｅｅ ｌ−ＢｇｌｌＩ４７６０ｂｐ断片を産生した。ｐＲＷ７３１−１５からの４９０ ０ｂｐ　Ｐｖｕｌｌ−Ｈｉｎｄ１１断片をｐＢＳＳＫ＋のＳｍａ　ＩおよびＨｉ ｎｄｌ１部位に挿入することによりプラスミドｐＪｃＡＯ２１を得ｔコ。次いで プラスミドｐＪｃＡＯ２１をＮｄｅｌとＢｇｋＩＩで切断し、ｐｃＥ８０の４７ ６０ｂｐＮｄｅ　Ｉ−ＢｇｌＩＩ断片に連結し、ｐＪｃＡＯ２４を形成した。そ れゆえ、プラスミドｐＪｃＡＯ２４はＦＰＶフランキングアーム間に隣接する３ ′末端と反対の配位に挿入されたＮＤＶ−ＦおよびＨＮ遺伝子を含有している。

両方の遺伝子をワクシニアウィルスＨ６プロモーターに連結する。ＮＤＶ−Ｆ配 列に隣接した右側フランキングアームは２３５０ｂｐのＦＰＶ配列からなる。Ｎ ＤＶ−ＨＮ配列に隣接した左側フランキングアームは１７００ｂｐのＦＰＶ配列 からなる。

ＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ（７）発達 前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてＴＲ０ＶＡＣ感染主要ＣＥＦ細胞中に プラスミドｐＪｃＡＯ２４を移入した（パニカリら、１９８２；ピッチｍ＝ら、 １９８７）。特異的ＮＤＶ−ＦおよびＨＮ放射線標識プローブに関するハイブリ ダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、これらのプラークに、純粋な 固体群となるまで５回のプラーク精製を行なった。１つの典型的なプラークを増 幅せしめ、産生Ｌ　ｔ：　Ｔ　ＲＯＶ　Ａ　Ｃ組換え体をＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ （ｖＦＰ９６）と称した。

蛍光抗体法 多クローン性抗ＮＤＶ血清と、単特異的試薬として、ＮＤＶ−ＦまたはＮＤＶ− ＨＮを発現するワクシニアウィルス組換え体に対して家ウサギ中で産生された血 清を用いて、間接蛍光免疫法を記載したように行なった（ティラーら、１９９０ ）。

イムノプレシピテーション ＣＮ、ストース、５ＰＡＦＡＳ社から得た多クローン性抗ＮＤＶ血清を用いて記 載したようにイムノブレシピテーション反応を行なった。

株ウィルスを現場でのプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし てＦ８　０ＲＦが欠損していることを確認した。サザンブロットハイプリダイゼ ーションにより、ＮＤＶ遺伝子のＴＲ０ＶＡＣゲノム中への正確な挿入とＦ８　 ０ＲＦの欠損もまた確認した。

ＮＤＶ感染細胞において、Ｆ糖タンパク質を、カルボキシル末端に近い疎水性膜 内外領域により膜中に固定し、これは前駆体、Ｆｏの、２つのジスルフィド連結 ポリペプチドＦ１およびＦ２中への後翻訳開裂を必要とする。ＦＯの開裂は、所 定のＮＤＶ菌株の病原性を決定するのに重要であり（ホンマおよびオーウチ、１ ９７３；ナガイら、１９７８；ナガイら、１９８０）　、開裂部位でのアミノ酸 配列はそれゆえウィルスの毒性を決定するのに重要である。ＦＰＶ中に挿入され 、組換え体ｖＦＰ２９を形成するＮＤＶ−Ｆ配列中の開裂部位でのアミノ酸は、 毒性ＮＤＶ菌株（チャフバーら、１９８Ｂ　、ニスピオンら、１９８７　、リー ら、１９８１１　、マツクギネスおよびそりソン、１１８Ｂ、トヤダら、１９８ ７）に必要条件であることが分かった配列に一致する配列Ａｒ’ｇ−Ａｒｇ−Ｇ Ｉｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　（配列認識番号３９）（ティラーら、１９９０）。ＮＤ Ｖの毒性菌株に感染した細胞中に合成されたＨＮ糖タンパク質は７４ｋＤａの未 開製糖タンパク質である。アルスターおよびクイーンズランドのようなきわめて 無毒性の菌株は、活性化に開裂を必要とするＨＮ前駆体（ＨＮｏ）をコードする （ガーデンら、１９１１０）。

ＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ中１７）ＦオヨびＨＮ遺伝子の発現を分析して、遺伝子産 生物が自発的に処理され存在することを確認した。多クローン性抗ＮＤＶ鶏血清 を用いた間接蛍光抗体法により、免疫半の失せてタンパク質が感染細胞表面に存 在したことが確認できた。両方のタンパク質が血漿膜上に存在することを確定す るために、ＦまたはＨＮ糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換え体 に対する単特異的家ウサギ血清を産生じた。これらの血清を用いた間接蛍光抗体 法により、両方のタンパク質が表面に存在することを確認した。

親および組換えウィルスに感染したＣＥＦ細胞の（”Ｓ）メチオニン標識溶解産 物を用いてイムノブレシピテーション実験を行なった。Ｆ、とＦ２の糖溶解産物 形状のみかけの分子量の予測値はそれぞれ５４．７と１０．３ｋＤａである（チ ャンパースら、１９８６）。多クローン性抗ＮＤＶ血清を用いたイムノブレシピ テーション実験において、適切なサイズの融解特異的産生物をＮＤＶ−Ｆ単一組 換え体ＶＦＰ２９（ティラーら、１９９０）　＃ヨびＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ二重 組換え体ｖＦＰ９６から欠損せしめた。また適切なサイズのＨＮ糖タンパク質を 、ＮＤＶ−ＨＮタンパク質組換え体ｖＦＰ−４７（エドバウアーら、１９９０） 　オヨヒＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶから欠損せしめた。どのＮＤＶ特異的産生物も、 未感染および親ＴＲ０ＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞から欠損されなかった。

ＣＥＦ細胞において、ＦおよびＨＮ糖タンパク質は、ＮＤＶ免疫血清により認識 される感染細胞表面に適切に存在する。イムノプレシピテーション分析により、 Ｆｏタンパク質が毒性菌株中に必要とされるＦ、およびＦ２成分に関して確実に 開裂せしめられることが示された。同様に、ＨＮ＠タンパク質も組換え体ＴＲ０ ＶＡ−ＮＤＶに感染したＣＥＦ細胞中で確実に処理された。

−以前の報告によると（ティラーら、１９９０　、エドバウアーら、１９９０　 、ボースネルら、１９９（ｌ　ａ　ｓ　ｂ　ｓ　ｃ　；オガワら、１９９０）　 、ＨＮまたはＦのいずれかのみの発現はＮＤＶ抗原投与に対する防御免疫を誘発 するのに十分であることが分かっている。しかしながら、他のバラミクソウィル スへの作業により、両方のタンパク質への抗体には十分な防御免疫を必要とする ことが示されている。Ｆ糖タンパク質に対してではなくＨＮ糖タンパク質に対す る抗体の存在下で組織培養中にＳＶ５ウィルスが拡散することが示されている（ マーゾら、１９８０）。加えて、死菌麻疹ウィルスワクチンを伴うワクチンの失 敗は、融解成分の不活性化によるものであることが示唆されている（ノルビーら 、１９７５）。両方のＮＤＶ糖タンパク質がウィルス中和抗体（アベリーら、１ ９７９）を誘発することが示され、両方の糖タンパク質が個々に鶏痘ベクター中 に発現される場合に防御免疫応答を誘発することができるので、最も有効なＮＤ Ｖワクチンは両方の糖タンパク質を発現すべきである。

実施例９−ＮＹＶＡＣ−ＭＶ組換え発現麻疹融解および血球凝集素糖タンパク質 の構成 麻疹ウィルスＭＶ（エドモンストン菌株）のＨＡおよびＦタンパク質をコードす る配列のｃＤＮＡコピーをＮＹＶＡＣ中に挿入してＮＹＶＡＣ−ＭＶと称する二 重組換え体を産生じた。この組換え体は、感染細胞の表面上に両方の糖タンパク 質を確実に発現した。イムノブレシピテーション分析は、両方のＦおよびＨＮ糖 タンパク質の正確な加工を示した。この組換え体はまた融合細胞の形成も誘発す ることが示された。

細胞およびウィルス ＮＹＶＡＣ−ＭＶの産生に使用した救助ウィルスは、ＮＹＶＡＣと称するワクシ ニアウィルスの修飾コベン／−％−ゲン菌株であった。全てのウィルスを成長せ しめ、ベロ細胞単層上で滴定した。

プラスミドの構成 プラスミドｐＳＰＭ２ＬＨＡ　（ティラーら、１９９１　ｃ　）は、前述したワ クシニアウィルスＨ６プロモーター（ティラーら、Ｌ９８８ａ、　ｂ　；グオら 、１９８９　；バーカスら、Ｌ’ｌ［１９）と正確なＡＧ対ＡＴＧの配置に連結 された完全な麻疹ＨＡ遺伝子を含有している。３′側の２６ｂｐを欠如したＨＡ 遺伝子と正確なＡＴＧ　：ＡＴＧ配置に融解したＨ６プロモーターの３′側の２ ４ｂｐを含有する１、８ｋｐｂ　ＥｃｏＲＶ／Ｓｍａｌ断片をｐＳＰＭ２ＬＨＡ から単離した。この断片を、ｐＳＰＭＨＨＡｌ　１の１．８ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ ／Ｓｍａ！断片（ティラーら、１９９１　Ｃ）を置換するのに用い、ｐ　ＲＷ８ ０３を産生じた。プラスミドｐ　ＲＷ８０３は、完全麻疹ＨＡ遺伝子に正確に連 結した完全Ｈ６プロモーターを含有している。

麻疹ＨＡ遺伝子に関する以前の構成を確認するに当たって、コドン１８　（ＣＣ Ｃ）の配列を公表した配列と比較して欠損せしめた（アルハチブら、１９８Ｂ） 。オリゴヌクレオチドＲＷ１１７（配列認識番号４０） を用いたクンケル法（クンケル、１９８５）によりＣＣＣ配列をオリゴヌクレオ チド突然変異誘発で置換した。−重鎖テンプレートを、ｐｌＢＩ２５中のｐ　Ｒ Ｗ８０３からのＨ６／ＨＡカセツテを含有するプラスミドｐ　ＲＷ８１９から誘 導した（ＣＴ、ニューヘブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）。コ ドン１８でのプロリン残留物をコードする挿入された（ＣＣＣ’）を含有する突 然変異誘発したプラスミドをｐ　ＲＷ８２０と称した。ｐＲＷ８２０のｕｉｎｄ ＩＩＩおよびＸｂａＩ部位の間の配列を、ヌクレオチド配列分析により確認した 。ＨＬｎｄＩＩｉ部位はＨ６プロモーターの５′へりに位置し、一方Ｘｂａ１部 位はＩ（Ａ遺伝子の開始コドンから２３０ｂｐ下流に位置する。ｘｂａＩ（上述 ）から下流のＨＡ暗号配列を含有し、終止コドンを含むｐ　ＲＷ８０３からの１ ．６ｋｂｐ　ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を用い、等量のｐ　ＲＷ８２０の断片を 置換してｐ　ＲＷ８３７を産生じた。ＨｉｎｄｌＩＩおよびＥｃ。

Ｒ１で切断し、２ｍＭ　ｃＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼの フレノウ断片を用いたプラントエンドを行ない、ｐｓＤ５１３のＳｍａ　１部位 に挿入することによりｐ　ＲＷ８３７内に含有された突然変異誘発した発現カセ ツテを誘導し、ｐＲＷ８４３を産生した。ポリリンカー配列を添加することによ りプラスミドｐｓＤ４６０からプラスミドｐｓＤ５１Ｂを誘導した。プラスミド ｐＳＤ４６０は、ワクシニアウィルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を欠損でき るように誘導した。

ＨＡ挿入プラスミド中に麻疹ウィルスＦ遺伝子を挿入するために、ｐｓＰＨＭＦ ７上で操作を行なった。プラスミドｐＳＤＨＭＦ７　（ティラーら、１９９１　 ｃ　）は、以前に記載したワクシニアウィルスＨ６プロモーターに近位の麻疹Ｆ 遺伝子３′を含有している。ＡＴＧ配置のための完全なＡＴＧを達成し、プロモ ーターの３′末端と麻疹ウィルスＦ遺伝子のＡＴＧとの間の介在配列を除去する ために、オリゴヌクレオチドＳＰＭＡＤ　（配列認識番号４１）ＳＰＭＡＤ：　 ５１−　ＴＡＴＣＣＧＴｌ’ＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＧＴＣＴＣ ＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＣＴ−３’を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異 誘発を行なった。産生じたプラスミドをｐ　Ｓ　ＰＭＦ　７５Ｍ２０と称した。

Ｈ６プロモーターと正確なＡＴＧ　：　ＡＴＧ配置に連結した麻疹Ｆ遺伝子を含 有するプラスミドｐ　Ｓ　ＤＭＦ　７５Ｍ２０をＮｒｕ　ＩおよびＥａｇｌで切 断した。Ｈ６プロモーターの３′側の２７ｂｐと完全な融解遺伝子を含有する、 産生じた１、７ｋｂｐ鈍端断片を単離し、ＮｒｕｌとＸｂａｌで切断し、鈍端と した中間プラスミドｐ　ＲＷ８２３に挿入した。産生じたプラスミドｐＲＷ８４ １は、ｐｌＢＩ２５プラスミドベクター中の麻疹Ｆ遺伝子に連結したＨ６プロモ ーターを含有している（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノ ロジー社）。Ｓｍａ　Ｉで切断することにより、Ｈ６／麻疹ＦカセツテをｐＲＷ ８４１から切除して産生じた１、８ｋｂ断片をｐＲＷ８４３（麻疹ＨＡ遺伝子を 含有する）に挿入した。プラスミドｐＲＷ８４３を、最初にＮｏｔＩで切断し、 ２ｍＭ　ｃＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片 で鈍端とした。それゆえ、産生じたプラスミド、ｐ　ＲＷ８５７は、尾対尾の配 置に連結した麻疹ウィルスＦおよびＨＡ遺伝子を含有する。両方の遺伝子はワク シニアウィルスＨ６プロモーターに連結している。

ＮＹＶＡＣ−ＭＶの展開 前述したリン酸カルシウム沈殿法（バニカリら、１９８２；ピッチｍ＝ら、１９ ８７）を用いて、プラスミドｐ　ＲＷ８５７をＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞に移入し た。特異的ＭＶ　ＰおよびＨＡ放射線標識プローブに関して現場でのプラークハ イブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるま で、６回のプラーク精製を行なった。

１つの代表的なプラークを増幅し、産生じた組換え体をＮＹＶＡＣ−ＭＹと称し た（ｖＰ９１３）。

蛍光抗体法 前述したように間接蛍光抗体法を行なった（ティラーら、１９９０）。使用した 単特異的試薬は、家ウサギに麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナ リヤボックス組換え体を接種することにより産生じた血清であった。

イムノブレシビテーション モルモット抗麻疹血清（ＭＤ、ウォーカースピル、ライタツカーＭ、Ａ、バイオ プロダクツ）を用いて前述したようにイムノブレシビテーション反応を行なった 。

細胞融解実験 ６０ｍｍの皿中のベロ細胞単層に、細胞当たり１ｐｆｕの多重度で親または組換 えウィルスを接種した。３７℃で１時間の吸収後、接種物を取り出し、重るい媒 体を配置し、皿を３７℃で一晩接種した。２０時間後の感染で、皿を試験した。

麻疹ＦおよびＨＡ遺伝子の両方の発現産生物が感染細胞表面上に存在することを 確定するために、麻疹ＦまたはＨＡ遺伝子のいずれかを発現するカナリヤボック ス組換え体に対して家ウサギ中に産生じた単特異的血清を用いて間接蛍光抗体法 を行なった。その結果により、両方の単特異的血清に関して強い表面蛍光によっ て示されたように、ＦおよびＨＡ遺伝子産生物の両方が感染細胞表面上に発現さ れたことが分かった。親ＮＹＶＡＣ菌株を接種した細胞のいずれの細胞にもバッ クグラウンドの染色はなく、また単特異的血清をＨＡまたはＦ遺伝子のいずれか を発現するワクシニア単一組換え体に対して試験した場合にも交差反応染色は見 られなかった。

ＮＹＶＡＣ−ＭＶにより発現されたタンパク質が、麻疹ウィルス特異的血清と免 疫活性であり、感染細胞中で確実に加工されたことを確定するために、イムノプ レシピテーション分析を行なった。ベロ細胞単層を、３５Ｓメチオニンの存在下 で親または組換えウィルスの１０ｐｆｕ／細胞の多重度で接種した。イムノプレ シビテーション分析は、約７６ｋＤａのＨＡ糖タンパク質およびそれぞれ分子量 が４４ｋＤａおよび３３ｋＤａの開裂融解産生物Ｆ１とＦ２を示した。麻疹特異 的産生物は、未感染細胞まは親ＭＹＶＡＣウィルスに感染したベロ細胞中には全 く検出されなかった。

ＭＶ細胞病理学の特性は、周辺の感染または未感染細胞と感染細胞の融解と続い ての融合細胞の中心への核の移動により生じた融合細胞の形成である（ノービー ら、１９８２）。

これはパラミクソウルイスに関して、ＨＡ特異的ウィルス中和抗体の存在により 生じ得るウィルスの拡散の重要な方法であることが示された（マーゾら、１９１ １０）。ワクシニアウィルス中で発現されたＭＹタンパク質が機能的に活性であ ることを確定するために、ベロ細胞単層にＭＹＶＡＣとＮＹＶＡＣ−ＭＶを接種 し、細胞病理効果を観察した。強い細胞融解活性が、感染から約１８時間後にＮ ＹＶＡＣ−ＭＶ感染ベロ細胞中で明確であった。親ＮＹＶＡＣに感染した細胞中 には細胞融解活性は見られなかった。

実施例１〇−仮性狂犬病の糖タンパク質を発現するＭＹＶＡＣ組換え体の構成 ＰＲＶ　ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５０糖夕：ｚバク質を、個々または 組合せのいずれかで発現するワクシニアウィルス組換え体が有効なワクチン候補 であること、すなわち、生ＰＲＶの毒性抗原投与から豚を保護することが示され た。ＭＹＶＡＣベクターが豚の細胞培養中で生産的に複製できないこと、および 既知の潜在的な毒性遺伝子の欠損によるベクター固有の安全性を考慮して、ＰＲ ＶｇｐＩ　Ｌ　ｇｐｌ　Ｉ　Ｉ、およびｇｐｓｏを単体または様々な組合せで含 有するＮＹＶＡＣベースの組換え体を産生じた。これらの組換え体は、豚に安全 であり、環境への伝染を減少または著しく制限したＰＲＶに対して効果的なワク チン候補を提供するために産生じた。

ウィルスおよび細胞 ＮＹＶＡＣの操作と分子クローニングを標準技術により行なった（ピッチｍ＝ら 、１９８７；マニアチスら、ＬＨ２）。

ＮＹＶＡＣおよびＭＹＶＡＣベースの組換え体の培養は以前に記載した（ピッチ ｍ＝ら、１９８７）。

ＰＲＶ　ｇｐＩＩ、ｇｐ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、およびｇｐ５０遺伝子のクローニング ＰＲｖの成長、ＰＲＶゲ／　ムＤＮＡ＋７）抽出、およびＰＲＶ　ｇｐＩＩ、ｇ ｐＩＩＩ、およびｇｐ５０遺伝子の同定は以前に記載した。

仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）遺伝子のＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）へのクローニ ングおよび発現人および豚宿主範囲遺伝子（Ｃ７ＬおよびＫＩＬ）を法含有する 領域が欠如したＮＹＶＡＣ欠損変異体、ｖＰ８６６は、ＰＲＹ遺伝子を挿入する のに用いたベースベクターであった。このベクターはまた、ワクシニアウィルス ｔｋ遺伝子、血球凝集素遺伝子、出血性遺伝子、リボヌクレオチドレダクターゼ （巨大サブユニット）遺伝子、およびＡ型含有遺伝子が欠如している。重要なこ とは、ｖＰ８６６は、人または豚肝臓（ＬＬＣ−ＰＫＩ）細胞については少しも 効果的には複製しない。単純ヘルペスウィルスｇＢ（ロビンソンら、１９８７） 　、ｇ　Ｃ（ロビンソンら、１９８６ｂ）、およびｇＤ（ワッソンおよびワッソ ン、１９Ｂ４）にそれぞれ相同なＰＲＶ遺伝子ｇｐｌ　Ｉ、ｇｐｌ　Ｉ　Ｉ、お よびｇｐ５０を下記に概略示したようにｖＰ８６６に挿入した。

ＰＲＹ　ｇｐｌＩ遺伝子をｖＰ８６６の血球凝集素座に挿入 ＰＲＹ　ｇｐＨ遺伝子をコードするＤＮＡ配列ハＰＲ■ゲノムのＢｍａＨＩ断片 にある（メツテンライターら、１９８Ｂ）。

ｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に挿入されたＰＲＶ　ＢａｍＨＩ断片１を含有す る、ｐＰＲ９，２５と称するプラスミドをＮｃｏｌで切断した。産生じた制限断 片を９．８％のアガロースゲル上で分画し、ジエネクリーン（ＣＡ。

ラジョラ、バイ第１０１社）を用いて６．２ｋｂ　Ｎｃ。

Ｉ　ＤＮＡ断片を精製し、続いてＣ１ＡＰで処理したｐＢＲ３２８（ＩＮ、イン ディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルス）のＮｃｏＩ部位に 挿入した。精製したプラスミド、ｐＰＲ２，１５をｓｐｈ　Ｉで切断し、アガロ ースゲル上で分画した。２．７ｋｂと１．８ｋｂ断片を精製して、ｐＵｃ１８の ｓｐｈ　１部位に挿入し、ｐＰＲｌおよびｐＰＲ２をそれぞれ産生じた。

ｐＰＲｌから（７）１０６０ｂｐ　ＰＲＶ　５ｐｈｌ／Ｎｈｅｌ断片をアガロー スゲルから単離して、アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳＹＮＩ　（配列認 識番号４２）　′（５’−ＧＡＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧ−３１）および ＭＲ３ＹＮ２　（配列認識番号４３）（５１−ＴＡＧＣＡＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴ Ｇ−３＋）によりｐｌＢＩ２５のＢａｍＨＩ／５ｐｈＩ部位に挿入し、ｐＰＲ６ を産生じた。ｐＰＲ６をＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩおよびＡｐａＩで切断した。Ａｐａ １部位は、ＰＲＶ　ｇｐＩＩのＡＴＧ開始コドンから３２ｂｐ下流に位置する。

この３９２０ｂｐ断片をアニールしたオリゴヌクレオチドＭＲ８ＹＮ３（配列認 識番号４４） およびＭＲ５ＹＮ４　（配列認識番号４５）（５’−ＣＧＣＧＣＣＡＡＡＧＡＣ ＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＣＧＧＧＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴｒＡ＾ＣＧＧＡ Ｔ入ＴＣ八−３１）と連結し、ｐＰＲ９を産生じた。これらのアニールしたオリ ゴヌクレオチドは、ＥｃｏＲＶ部位へらＡＴＧを通じてＰＲＶ　ｇｐＨ暗号配列 に続くワクシニアウィルスＨ６プロモーターを特定するＤＮＡ配列を提供する。

プラスミドｐＰＲ９をＢａｍＨＩとＮｈｅＩで切断し、子牛の腸のアルカリ性ホ スファターゼ（Ｃｉ　ＡＰ）で処理し、アニールしたオリゴヌクレオチドＭＲＳ ＹＮ７　（配列認識番号４（５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＣＴＴＧ−３當）およ びＭＲ５ＹＮ８　（配列認識番号４７）（５１−ＧＴＡＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＧ ＧＡＡＣＣＴＡＧ−３１）並びにｐＰＲｌから得た１６４０ｂｐ　５ｐｈｌ／Ｎ ｈｅ■断片と連結し、プラスミドｐＰＲ１２を産生じた。

ｐＰＲ２からの１０３０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌ／Ｓｐｈ！断片をアガロースゲルか ら単離し、ＨｉｎｃＩＩ／５ｐｈＩ　ｐＵｃ１８ベクターに挿入した。産生じた プラスミド、ｐＰＲｌｏをＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＮａｅｌで切断し、Ｃ１ＡＰで 処理した。Ｎａｅ１部位は終止コドン（ＴＡＧ）の４４ｂｐ上流である。アニー ルしたオリゴヌクレオチドＭＲ３ＹＮ９（配列認識番号４８）　（５’−ＧＧＣ ＡＣＴＡＣＣＡＧＣＧＣＣＴＣＧＡＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣ ＴＧＴＡＧＡＡ’ｆｆｆｆ１’ＡＴＣＧＧＣＣＧＡ−３’　）およびＭＲ８ＹＮ ＩＯ（配列認識番号４９　）　（５’−ＡＧＣＴＴＣＧＧＣＣＧＡＴＡＡＡＡＡ ＴＴＣＴＡＣＡＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＧＴＣＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧＡＧＧＣＧＴ ＡＧＴＧＣＣ−３’　）をｐＰＲｌｏからの３７２０ｂｐ　Ｎａｅｌ／Ｈｉｎｄ ｌＩＩ断片と連結し、プラスミドｐＰＲ１１を産生じた。ｐＰＲ２からの７７０ ｂｐ　５ｐｈｌ／Ｈｉｎｃｌｌ断片をアガロースゲルから精製し、ＢａｍＨＩ／ ５ｐｈＩリン酸化リンカ−ＭＲ８ＹＮ７　（配列認識番号４６）およびＭＲＳＹ Ｎ８　（配列認識番号４７）を用いてＣ１ＡＰ処理したｐＰＲｌｌのＢａｍＨＩ ／Ｈｉｎｃ１１部位に挿入し、ｐＰＲ１３を産生じた。ＥｃｏＲＩおよび５ｐｈ ｌで切断したプラスミドｐＰＲ１２を、ＭＲＳＹＮ１９　（配列認識番号５０） （５’−ＡＧＣ？ｒＣＴＧＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＡＴＣＧＧ−３’）およびＭ ＲＳＹＮ２０　（配列認識番号５１）（５’　−ＡＡＴＴＣＣＧＡＴＣＧＣＣＡ ＴＧＧＣＴＧＣＡＧＡ−３’　）を用いてｐＰＲ１３からの９９０ｂｐ　Ｈｉｎ ｄＩＩＩ／ｓｐｈ　Ｉ断片と連結し、プラスミドｐＰＲ１５を産生じた。

プラスミド、ｐＰＲ１５をＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ／ＥｃｏＲＶで切断し、２７８０ ｂｐ断片を産生じた。この断片を、ＸｍａＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで切断したｐ ＴＰ１５　（グオら、１９８９）に挿入し、ｐＰＲｌｇを産生じた。ｐＰＲｌｇ において、ｐＲＶｇｐ　Ｉ　ＩをＨＡ欠損プラスミド中のワクシニアウィルスＨ ６プロモーターと連結する。救助ウィルスとしてｖＰ８６６による生体外組換え 実験にｐＰＲｌｇを用いてｖＰ８８１を産生じた。

ＰＲＶ　ｇｐＨｌ遺伝子をＮＹＶＡＣのＴＫ座に挿入ＰＲＶ　ｇｐＩＩＩ遺伝子 をコードする配列がＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ２および９断片に遺伝子地図を作 成する（ロビンスら、１９８８ｂ）。プラスミドｐＰＲ９，９およびｐＰＲ７， ３５は、それぞれｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位に挿入されるＰＲＹ　ＢａｍＨ Ｉ断片２および９を含有する。ＰＲＶ　ｇｐＨｌ遺伝子の５′末端を含有する５ ｐｈＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＰＲ９，９から単離した。ｇｐＨｌ遺伝子の残りを 含有するＮ　ｃ　ｏ　Ｉ　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片をｐＰＲ７，３５から単離 した。完全なＰＲＶ　ｇｐＩＩＩ遺伝子は、これら２つの断片をｐＩＢＩ２５に 連結することにより組み立て、ｐＰＲ１７を産生じた。

ＰＲＶ　ｇｐＨｌ遺伝子を、ＢｉｎｄｌｌＩ　Ｂ領域に位置する初期ワクシニア ウィルス出血性プロモーターの制御下で発現されるように操作した（ゲーベルら 、１９９０　ａ　。

ｂ）。部位定方向突然変異誘発を用いて、ＰＲＶ　ｇｐＩＩＩ中の配列ＣＧＣ（ 塩基１９２−１９４）をＡＴＧに変化せしめることによりＮ５ｉｌ部位を導入し 、配列ＧＴＣＡＣＧＴをＴＴＣＴＡＧＡ　（塩基１６３２−１６３８）に変化せ しめることによりＸｂａ１部位を導入した。突然変異誘発反応を行なうために、 ヘルパーファージＲ４０８（ＣＡ、ラジジラ、ストラタジェネ）を用いることに より一本鎖ＤＮＡをプラスミドｐＰＲ１７から産生じた。ＭＲＳＹＮ５　（配列 認識番号５２） （５１−ＧＣＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＴＣＧＴＧＣＧＡＡＴＧＧＣＣＣ Ｃ−３＠）およびＭＲＳＹＮ６　（配列認識番号５３）（５’−ＧＧＧＧＧＧＡ ＣＧＣＧＣＧＧＧＴＣＴＡＧＡＡＧＧＣＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣ圀−３１）並びに Ｅ、ｃｏｌｔ　ｄｕｒ−ｕｎｇ−菌株ＣＪ２３６（ＣＴ、ニューハブン、バイオ テクノロジー社）を用いて部位定方向突然変異誘発を行なった。クンケルの実験 記録（１９８５）にしたがって突然変異誘発を行なった。これらの突然変異誘発 により、プラスミドｐＰＲ２８が産生じた。

プラスミドｐＰＲ２８をＮ５ｉｌおよびＸｂａＩで切断して、マング豆ヌクレア ーゼで処理した。１４４０ｂｐ断片を精製して、マング豆ヌクレアーゼと子牛腸 あるか理性ホスファターゼで処理し多後にｐｓＤ４７８Ｖｃで切断したＢｇｌＩ Ｉ／ＨｐａＩに挿入した。産生じたプラスミドをｐＰＲ２４と称した。

プラスミドｐＰＲ２４を５ｎａＢ１とＤｒａ　Ｉで切断し、ＵプロモーターとＰ ＲＶ　ｇｐＨｌ遺伝子をかゆうする１５００ｂｐ鈍端断片を雌牛じた。この断片 をｐｓＤ５１３ｖＣで切断したＳ　ｍ　ａ　Ｉ　Ｌ連結し、ｐＰＲＶＩ　Ｉ　Ｉ ＶＣＴＫを産生した。救助ウィルスとしてのｖＰ８６６およびｐＰＲＶＩ　Ｉ　 ＩＶＣＴＫに関して、生体外組換え実験を行なってｖＰ８８３を産生じた。ｖＰ ８８３において、ゲノムに関して、１２０ｂｐワクシニアＵプロモーター要素の 制御下で右から左の方向にそうにゆうしたＰＲＶ　ｇｐＩＩＩ遺伝子によりワク シニアｔｋ暗号配列を置き換えた。

ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子をＮＹＶＡＣのＡｒ１座へ挿入ＰＲＶ糖タンパク質ｇｐ ５ｏの遺伝子をコードするＤＮＡはＰＲＶゲノムのＢａｍＨＩ断片７に位置して いる（ベトロフスキスら、１９８６ａＳｂ）　。プラスミドｐＰＲ７，１はｐＢ Ｒ３２２のＢａｎＨＩ部位に挿入されたＰＲＶ　ＢａｍＨＩ断片７を含有してい る。完全なｇｐ５０遺伝子を含有するｐＰＲ７，１の５ｔｕｌ／Ｎｄｅｌサブ断 片はｐＩ　Ｂ　Ｉ　２５にサブクローニングされてプラスミド＃８５６を産生じ た。

初期／中間ワクシニアプロモーター、１３Ｌの制御下でＰＲＶ　ｇｐ５０の暗号 配列を配した（シュミットおよびスタネンベルグ、１９８８；ボスおよびスタネ ンベルグ、１９８ｇ）。このプロモーター要素は、以前にワクシニア組換え体中 の異種遺伝子を発現するのに用いた（パーカスら、１９８５゜バッチャ−ら、１ ９８９）。合成オリゴヌクレオチドＰ５０ＰＰＢＡＭ　（配列認識番号５４） （５１−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＣＡＴＴＣＣＧ−３＠ 　）およびＰ５０ＰＰＡＴＧ　（配列認識番号５５）（５＠−ＧＡＴＴＡ＾入Ｃ ＣＴＡＡＡＴ入＾ＴＴＧ−３’）並びにテンプレートとしてのコペンハーゲンＨ ｉｎｄｌｌＩＩ領域のサブクローンであるｐＭＰ　ＩＶＣを用いてＰＣＲ（ササ キら、１９８ｇ）により、Ｉ３Ｌ読取り枠から上流のプロモーター配列に対応す るＤＮＡ　（シュミットおよび断片をＢａｍＨＩで切断し、プロモーター配列の ５′末端でのＢａｍＨＩ粘着末端を産生じた。３′末端は鈍端のままであった。

ＰＲＶ　ｇｐ５０暗号領域をプラスミド＃８５６がう切除した。プラスミド＃８ ５６を、ＡＴＣがら７ｂｐ上流を切断し、３′懸垂となるＮ５ｉｌで最初に切断 した。３′懸垂を、２ｍＭ　ｄＮＴＰの存在下でＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで鈍 端とした。産生じたＤＮＡを部分的にＢｇｌｌ■で切断し、ＰＲＶ　ｇｐ５０遺 伝子を含有する１、３ｋｂプラント／ＢｇｌｌＩ断片を単離した。

１２６ｂｐ　１３Ｌプロモ一ター断片（ＢａｍＨＩ／プラント）および１．３ｋ ｂ　ｇｐ５０遺伝子含有断片（プラント／ＢｇｌＩＩ）をＢａｍＨＩで切断した ｐＢＳ−ＳＫ　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に連結した。産生じたプラ スミドをｐＢｓＰＲＶ５０１３と称した。ＰＲＶｇｐ５０遺伝子に連結したＩ３ Ｌプロモーターを含有スる発現カセツテをＢａｍＨＩ／部分的Ｓｍａ　Ｉ切断に より切除した。Ｉ３Ｌプロモーター／ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子を含有する１、４ ｋｂ断片を単離して、２ｍＭ　ｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメ ラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンドした。

Ｉ３Ｌプロモーター／ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子を含有する１、４ｋｂ鈍端断片を ＡＴＩ挿入プラスミドｐＳＤ５４１に挿入した。ＡＴＩ領域のフランキングアー ムを、テンプレートとしてのコペンハーゲンＨｉｎｄｌｌＩ　Ａ領域のサブクロ ーンを用いたＰＣＲにより産生じた。オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２６７　（ 配列認識番号５６）およびＭＰＳＹＮ２６８　（配列認識番号５７　）　（５’ −ＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＴＡＡＴＴＡＡＴｒＡＡＴＴＴ！ＴＡ ＴＴＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＧＧＣＴＴＧＡＧＡＴＣ−３’）を用いてＡＴ Ｉ欠損の右側に４２０ｂｐワクシニアアームを誘導した。合成オリゴヌクレオチ ドＭＰＳＹＮ２６９（配列認識番号５８）　（５１−ＴＡＡＴＴＡＣＴＧＡＧお よびＭＰＳＹＮ２７０　（配列認識番号５９）（５’−ＴＡＴＣＴＣＧＡＡＴＴ ＣＣＣＧＣＧＧＣＴＴＴＡＡＡＴＧＧＡＣＧＧＡＡＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣ−３雪 ）を用いて欠損の左側に４２０ｂｐワクシニアアームを誘導した。左右のアーム ＰＣＲによりともに融解して、Ｂｇｌｌ　１％　Ｓｍａ　ＩｓおよびＸｈｏｌの 制限部位を特定するポリリンカー領域により分離した。ＰＣＲ産生断片をＨｉｎ ｄｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断して粘着末端を産生じ、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉお よびＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８に連結してｐｓＤ５４１を産生じた。

１３Ｌ／ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子を含有するｐＳＤ５４１プラスミドをｐＡＴＩ ｇｐ５０と称した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてｖＰ９００を産 生じた。ＶＰ９００はＡＴＩ遺伝子の位置にＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子を含有して いる。

ＮＹＶＡＣ内の二重および三重ＰＲＶ組換え体の産生生体外組換え実験を行なっ て、多重ＰＲＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベース組換え体を産生じた。供与体 プラスミド、ｐＡＴＩＰ５０を用いた生体外組換え実験を、ｖＰ８８１、ｖＰ８ ８３、およびｖＰ９１５に行なって、それぞれｖＰ９１２、ｖＰ９１６、および ＶＰ９２５を産生した（表１）。実験は救助ウィルスとしてのｖＰ８８３および プラスミドｐＰＲ１８に関して行なってｖＰ９１５を産生じた（表１）。

ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体感染細胞からのイムノブレシピテーション ベロ細胞について、細胞光たり１０ｐ　ｆ　ｕのｍ、ｏ、ｉ。

で、個々の組換えウィルス、ＮＹＶＡＣ親ウィルスを感染せしめるか、または疑 似（ｍｏｃｋ）感染せしめた。１時間の吸収期間の後、接種物を除去して、感染 細胞を３５８メチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するメチオニン不含有媒体 で重るいした。全ての試料を感染８時間後に収穫した。ヒツジ抗ｇｐＨ血清で分 析した試料に関して、遠心分離により細胞を収穫し、ＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ −４０，１％Ｎａ−デオキシクロレート、０．１％ＳＤＳ、０゜０１Ｍメチオニ ン、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭ　２−メルカプト−エタノール、１ｍ／ｍｌ　Ｂ ＳＡ、および１００ｕ／ｍｌアプロチニン）で分離した。ヒツジ抗ｇｐＩＩＩで 分析した試料およびｇｐ５０に特異的な単クローンをＩＸ緩衝液Ａ（１％ＮＰ４ ０．１０ｍＭ）リス（ｐＨ７，４）１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ０．　０％Ｎａアジド、０．２ｍｇ／ｍｌＰＭｓＦ）中に溶解せしめた。

全ての血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着し、全ての溶解産物を通常の血清 （ヒツジまたはネズミ）および第２の抗体に連結したタンパク質Ａセファロース で前吸着した。

感染細胞からの溶解産物を、ヒツジ抗ｇｐｌＩ血清を用いたＰＲＶ　ｇｐＩＩ発 現に関して分析した。この主要抗血清を、家ウサギ抗ヒツジＩｇＧ（ベーリンガ ーマンハイム）に接合したタンパク質Ａセファロースで培養した。４℃での一晩 の培養後、試料をＩＸＲＩＰＡ緩衝液で４回、ＬｉＣ１−尿素（０，２Ｍ　Ｌｉ Ｃ１，２Ｍ尿素、１０ｍＭトリス、ｐＨ８，０）で２回洗浄した。マイクロ遠心 分離により沈殿物を収穫した。２Ｘラエムリの緩衝液（１２５ｍＭ）リス（ｐＨ ６，８）　、４％（ＳＤＳ）　、２０％グリセロール、１０％　２−メルカプト −エタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、免疫複合体から沈殿 したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％のドレイファスゲルシステム（ ドレイフィスら、１９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのために ＩＭＮａ−サリチル酸塩で処理した。

ヒツジ抗ｇｐＨ血清を用いたＰＲＶ　ｇｐＩＩ発現に関して溶解産物を分析した 。この主要抗血清を家ウサギ抗ヒツジＩｇＧに接合したタンパク質Ａセファロー ス（ベーリンガーマンハイム）で培養した。４℃での一晩の培養後、試料をＩＸ 緩衝液Ａで４回、ＬｉＣ１−尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿物を処理し、上述 したようにフルオログラフィーにより分析した。

溶解産物を、単クローン性抗体、２２Ｍ４（フランス、リヨン、ローンメリオク スにより供給された）を用いたＰＲＶ　ｇｐ５０発現に関して分析した。この主 要抗体を、山羊抗ネズミＩｇＧおよびＩｇＭ（ベーリンガーマンハイ殿物を回収 し、上述したようにＰＲＶ　ｇｐＨＩイムノブレシピテーションに関して分析し た。

ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞中のＰＲＶ糖タンパク質の発現 ＰＲＶ　ｇｐＨ％ｇｐＩＩＩ、およびｇｐ５ｏ産生物は、ＰＲＶ感染感染細胞膜 構造に関連した典型的な糖タンパク質である。抗ｇｐＨ，抗ｇｐＩＩＩおよび抗 ｇｐ５０特異的体りローン性抗体および続いてのフルオロセイン接合ヒツジ抗ネ ズミＩｇＧを用いて、組み得たい感染ベロ細胞の表面上のＰＲＶ糖タンパク質発 現を分析した。ｇｐ２、ｇｐＩＩＩ、またはｇｐｓｏの表面発現はいずれも、疑 似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）親ウィルスに感染した細胞の表面に は検知できなかった。ＰＲＶ　ｇｐＩＩ発現がｖＰ８８１、ｖＰ９１２、および ｖＰ９２５感染細胞の表面に観察された。ＰＲＶ　ｇｐＩＩＩ表面発現が、ｖＰ ８８３、ｖＰ９１５、ｖＰ９１６、およびｖＰ９２５感染細胞中に観察された。

ＰＲＶ　ｇｐ５０表面発現が、ｖＰ９００、ｖＰ９１２、ｖＰ９１６、およびｖ Ｐ９２５感染細胞中に観察された。要約すると、特定のＰＲＶ糖タンパク質の表 面発現は、適切なＰＲＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染し た細胞中のみに検知可能であった。

ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染した細胞からのＰＲＶ糖タンパク質のイムノ ブレシビテーシッンＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染したベロ細胞中の発現Ｐ ＲＶ　ｇｐＩＬｇｐｌＩＩ、およびｇｐ５０糖タンパク質の確実性をイムノブレ シピテーションにより分析した。ＰＲＶ　ｇｐｌＩ遺伝子産生物は、ＰＲＶ感染 感染細胞膜−ドされた主要糖タンパク質の１つである。熟成タンパク質は、ジス ルヒド結合により連結した糖タンパク質の複合体からなる（ハンベルら、１９８ ４．ルーカスら、１９８５）。

還元条件下で、３つの種がこの複合体から分解した。これら３つの種（Ｉｌａ− Ｃ）は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で、それぞれ１２０ｋＤａ、７４− ６７ｋＤａ。

および５８ｋＤａの適切なサイズで移動した（ハングルら、１９ｇ４）。

抗ＰＲＶｇｐ　Ｉ　Ｉ特異的血清を用いたイムノブレシビテーション分析におい て、どのＰＲＶ特異的タンパク質種も、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ（ｖＰ８ ６６）親細胞に感染した細胞からは沈殿しなかった。ＰＲＶ　ｇｐＩＩもまた、 ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体ｖＰ９１６、ｖＰ８８３、およびｖＰ９００を含有 する非ｇｐＨに感染した細胞中では検知できなかった。ＰＲＶ　ｇｐＩＩがＰＲ Ｖ　ｇｐＩＩ遺伝子をハーバ−する全てのＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体中で発現 されたことが明確である。これらはｖＰ９２５、ｖＰ９１２、ｖＰ９１５、およ びｖＰ８８１である。

組換え体を含有するＰＲＶ　ｇｐＩＩに感染したベロ細胞からの溶解産物は、適 切な発現に調和し、ｇｐＩＩをｇｐｌ　１ａ　（１２０ｋＤａ）　、ｇりＩ　ｌ 　ｂ　（７４−６７ｋＤａ）、およびｇ　Ｉ　Ｉ　ｃ　（５８ｋＤａ）に加工す るタンパク質種を含有した。４５ｋＤａと１０ｋＤａの２つの追加のタンパク質 種を抗ｇｐＩＩ血清により特異的に沈殿せしめた。

これらのタンパク質種は、組換え感染細胞中の晩期にＰＲＶ　ｇｐＩＩの変型の タンパク質分解工程により現れるように思われる。

ＰＲＶ　ｇｐＩＩＩ産生物は、もう１つの主要ＰＲＶ糖タンパク質である。ｇｐ ｌＩＩは、９２ｋＤａの明確な分子量で移動する他のウィルスタンパク質とは複 合体をなさない単量体単位として存在する（ハングルら、１９８４．ロビンスら 、１９８６ｂ）。ｇｐｌＩＩに特異的な抗血清を用いたＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換 え体感染細胞からのイムノプレシピテーション分析において、抗ｇｐＨｌ特異的 タンパク質種は、疑似感染細胞、弁組換え体感染細胞、またはｇｐＩＩＩを含有 しないＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体（それぞれ、ｖＰ９１２、ｖＰ８８１、およ びｖＰ９００）に感染した細胞からの溶解産物中には全く存在しなかった。ｖＰ ９２５、ｖＰ９１５、ｖＰ９１６．およびｖＰ８８３感染細胞からの溶解産物は 全て９２ｋＤａ　ＰＲＶ　ｇｐｌＩｌ遺伝子産生物を含有した。

熟成ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子産生物は、約５０から６０ｋＤａ　（ベトロフスキ スら、１９８８ａ　；ワラセンら、１９８４）であり、そのほとんどは０連結炭 化水素を含有しそうである（ペトロフスキスら、１９８８ｂ）、ＰＲＶ　ｇｐ５ ０遺伝子産生物に特異的な抗血清を用いた、ＮＹＶＡＣ／ＰＲＶ組換え体に感染 した細胞の溶解産物からのイムノブレシピテーションにおいて、ｇｐ５０は、疑 似感染細胞、弁組換え体感染細胞、またはｇｐ５０遺伝子を含有しない組換え体 （それぞれ、ｖＰ９１５、ｖＰ８８１、およびｖＰ８８３）に感染した細胞から の溶解産物中には全く存在しなかった。ＰＲＶ　ｇｐ５０遺伝子を含有する組換 えＮＹＶＡＣウィルス（それぞれ、ｖＰ９２５、ｖＰ９１２、ｖＰ９１６、およ びｖＰ９００）に感染した細胞からの溶解産物は全て、抗ＰＲＹ　ｇｐ’３ｏ血 清により特異的に沈殿した５Ｏ−６０ｋＤａタンパク質種を発現した。

表　１ ＰＲＶ糖タンパク質ｑｐＨ，ｑｐＨｌ 実施例１１−ニブスティン−バーウィルスのｇｐ３４０、ｇＢおよびｇＨ遺伝子 を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構成 ＥＢＶ　ｇｐ３４０、ｇＢ、およびｇＨ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ供与体プラ スミドを構成した。この供与体プラスミドを用いて２つの組換え体、ｖＰ９４１ およびｖＰ９４４を産生した。

制限酵素は、ベセスダリサーチラボラトリーズ社（ＭＤ。

ゲイサースブルグ）、ニューイングランドバイオラボ社（ＭＡ、ビバーリ−）、 またはベーリンガーマンハイム（ＩＮ、インディアナポリス）から得た。Ｔ４　 ＤＮＡリガーゼおよびＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片を、ニューイングラン ドバイオラボ社から得た。クローニング、スクリーニングおよびプラスミド精製 の少しの修飾には、標準組換えＤＮＡ技術を用いた（マニアチスら、１９８２） 。アルカリ性変性二本鎖プラスミドテンプレートに標準ジブオキソ鎖−終止反応 （サンガー、１９７７）を用いて核酸配列を確認した。Ｍ１３ｍｐ１８ファージ 、ｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　２４およびｐｌＢＩ２５プラスミドをＣＴ、インターナショ ナルバイオテクノロジー社から得た。

細胞系およびウィルス菌株 救助ウィルスとしてＮＹＶＡＣを用いて組換え体を産生じた。５−１０％の新生 子牛血清を補給したタカのＭＥＭ媒体中のベロ（ＡＴＣＣＣＣＬ８１）細胞（Ｖ ｌ、マクリーン、フローラボラトリーズ）において、全てのワクシニアウィルス 株を産生じた。

オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発突然変異誘発反応に用いたウラシル置換 −重鎖ＤＮＡテンプレートはＣＪ２３６転換細胞からのものであった。変異は、 クンケルらの（１９８７）プロトコールを用いて行なわれた。標準化学物質を用 いて様々なオリゴヌクレオチドを合成した（ＣＡ、サンラフアニル、バイオリサ ーチ８７００；ＣＡ、フォスターシティ−、アプライドバイオシステム３８０Ｂ ）。

ワクシニアウィルス組換え体の構成 救助ワクシニアウィルスに感染した組織培養細胞への組換え供与体プラスミドの 移入および現場でのニトロセルロースフィルター上のハイブリダイゼーションに よる組換え体の同定の工程は前述したようなものであった（パニヵリら、１９８ ２　、ピッチｍ＝ら、１９８７）。

ＥＢＶ遺伝子ｇｐ３４０、ｇＢ、　お、Ｊ：びｇＨ（７）７クシー１−ア組換え 体における修飾および発現 ｇｐ３４０遺伝子は、完全ＥＢＶ配列の読取り枠ＢＬＬＦｌａに対応する（ベア ーら、１９８４）、ｇｐ２２０遺伝子は、内部スプライシングイベント（読取り 枠ＢＬＬＦ１ｂ）によりｇｐ３４０　ｍＲＮＡから由来する。ｇｐ３４０および ｇｐ２２０遺伝子を、Ｄｒ、ペリコーデット（Ｃｅｎｔｒｅｄｅ　Ｒｅｃｈｅｒ ｃｈｅ　ｓｕｒ　Ｉｅ　Ｃａｎｃｅｒ−ＩＲ８Ｇ、７　ｒｕｅ　Ｇｕｙ　Ｍｏｃ ｑｕｅｔ、９４８０２　Ｖｌｌｌｅｊｕｉｆ、Ｆｒａｎｃｅ　）により提供され たｃＤＮＡクローン（それぞれ、プラスミドｐＭＬＰｇｐ３４０、ｐＭＬＰｇｐ ２２０）から単離した。

ｐＭＬＰｇｐ２２０の２１００ｂｐ　Ｘｍａｌ／Ｃ１ａ■断片をＸｍａｌ／Ｃ１ ａＩ　Ｍ１３　ｍｐ１８に挿入し、産生じたプラスミドをｍｐ１８ｇｐ２２０と 称した。オリゴヌクレオチドＣＭ４およびＣＭ５を用いた生体外突然変異誘発に より、ｇｐ２２０遺伝子の５′および３′端を、ワクシニアＨ６プロモーターの 制御下で発現に関して修飾した。修飾ｇｐ２２０遺伝子を含有するプラスミドを ｍｐ１８ｇｐ２２０　（４＋５）と称した。０Ｍ４　（配列認識番号６０）およ びＣＭ５　（配列認識番号６１）のヌクレオチド組成は以下のとうりであった。

０Ｍ４：　ＴＡＡＡＧＴＣＡＡＴＡＡＡＴｒＴｒＴＡＴＴ９ツにΩＱ匹ＪＡＣＣ ＧＡＧＣＴＣＧ入Ａ’ｆＴＣＧ６浅工 ｍｐ１８ｇｐ２２０　（４＋５）の２３００ｂｐ　Ｎａｒ１／ＥｃｏＲＶ断片を 、Ｎａｒｌ／ＥｃｏＲＶプラスミド５Ｐ１３１Ｎｏｔｌ中にクローニングした。

５Ｐ１３１Ｎｏｔｌは、前に定義したように完全なＨ６ワクシニアプロモーター を含有している（ティラーら、１９８８ａＳｂ）。産生じたプラスミドをＳＤ１ ３１ｇｐ２２０と称した。

ｐＭＬＰｇｐ３４０の２３６０ｂｐ　５ｃａＩ／Ｘｈ。

■断片を、５ｃａｌ／ＸｈｏＩ　ＳＰ１３１ｇｐ２２０プラスミド中にクローニ ングした。産生じたプラスミドをＳＰ１３１ｇｐ３４０と称した。

ＳＰ１３１ｇｐ３４０の２８００ｂｐ　Ｎｏｔｌ／Ｎ。

ｔ！断片を、Ｓｍａ　Ｉ切断ワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ４８６中にクロ ーニングした。産生じたプラスミドを４８６Ｈ６３４０と称した。ＥＢＶ　ｇＢ 遺伝子ハ、完全ＥＢＶ配列の読取り枠ＢＡＬＦ４に対応する（ベアーら、１９ｇ ４）、３５００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｘｍｎ　Ｉ断片を、ＥＢＶ　ＢａｍＨＩ　Ａ 断片から単離して、Ｈｉｎｃｌｌ／ＥｃｏＲ１プラスミドｐｌＢＩ２５中にクロ ーニングした。

産生じたプラスミドをｐ２５ｇＢと称した。

生体外突然変異誘発により、オリゴヌクレオチドＥＢＶＭ５（配列認識番号６２ ）およびＥＢＶＭ３　（配列認識番号６３）を用いて、ワクシニアＨ６プロモー ターの制御下でＥＢＶ　ｇＢ遺伝子を発現に適用した。ＥＢＶＭ５　（配列認識 番号６２）およびＥＢＶＭ３　（配列認識番号６３）のヌクレオチド組成は以下 のとうりである。

ＫＢＶＭ５： ＣＣＣＴＡＣＧＣＣＧＡＧＴＣＡ？ｒＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡ ＴＡＴＣＡＧＡＧＴＣＧＴＡＣＧＴＡＧＧＥＢＶＭ３：　ＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣ ＴＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＡＴＡＡＪＩＪｉＡＧＧＧＴＴＡＴＡＧＡ ＡＧＡＧＴＣＣ産生したプラスミドをｐ２５ｇＢ　（５＋３）と称した。

ｐ２５ｇｂ　（５＋３）　の２６００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ断片を、Ｅ ｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ　５ｐ１３１プラスミド中にクローニングした。産生じた プラスミドをＳＰ１３１ｇＢと称した。

ＥＢＶ　ｇＨ遺伝子は、完全ＥＢＶ配列（７）ＢＸＬＦ２読取り枠に対応する（ ベアーら、１９ｇ４）。完全ＢＸＬＦ２読取り枠は、２つのＢａｍＨＩ　ＥＢＶ 断片、ＢａｍＨＩＸおよびＢａｍＨＩ　Ｔに含有される。ＥＢＶ　ＢａｍＨＩＴ 断片の８３０ｂｐ　Ｓｍａｌ／ＢａｍＨＩ断片をＳｍａ　Ｉ／ＢａｍＨ１ｐ　Ｉ 　Ｂ　Ｉ　２４プラスミド中にクローニングすることにより、完全ＢＸＬＦ２読 取り枠を再構成した。産生じたプラスミドを２４ｇＨ５と称した。ＥＢＸＢａｍ ＨＩ　Ｘ断片の１８５０ｂｐ　ＢａｍＨＩ／ＷｉｎｄＩ１１断片を、Ｂａｍ１（ Ｉ／Ｈｉｎｄｌ１１　２４ｇＨ５プラスミド中にクローニングした。産生じたプ ラスミドを２４ｇＨと称した。

オリゴヌクレオチドＨＭ５、ＨＭ４、およびＩ（Ｍ３を用いた生体外突然変異誘 発により、ＥＢＶ　ｇＨ遺伝子を修飾して、ワクシニア８１３Ｒ出血性プロモー ターの制御下で発現した（ゲーベルら、１９９０ａＳｂ）。オリゴヌクレオチド ＨＭ４を用いて、ワクシニア初期転写終止信号に対応する配列を修飾した。ＨＭ ５　（配列認識番号６４）　、ＨＭ４（配列認識番号６５）、およびＨＭ３　（ 配列認識番号６６）のヌクレオチド組成は以下のとうりである。

修飾ｇＨを含有する産生じたプラスミドを２４ｇＨ（５＋４＋３）と称した。

ワクシニア出血性プロモーターは、他のボックスプロモーターと比較して強力な プロモーターであるとは思われない。４２ｋＤａエントモボツクスプロモーター の制御下でＥＢＶ　ｇＨ遺伝子を配した。これは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ ）、特異的オリゴヌクレオチド４２ｇＨ（配列認識番号６７）およびＢＡＭｇＨ （配列認識番号６８）並びにテンプレートとしてのプラスミド２４ｇＨ（５＋４ ＋３）を用いることにより行なわれた。

ＢＡＭｇＨ：　ＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＧＡＧＡＣＡＧ（最初のＡ残留物は、 ｇＨ暗号配列の位置２９２に対応する） ＰＣＲ反応は、サーマルサイクラ−（ＣＴ、ノルウオーク、パーキンエルマーセ タス）中において、９４℃で１分間、４２℃で１．５分間、および７２℃で３分 間の３６サイクルを行ない、最後に７２℃で５分間の延長工程を行なった。

ＰＣＲ産生物を精製し、ＢａｍＨｌで切断し、２４ｇＨ（５＋４＋３）の４５５ ０ｂｐ　ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ断片中にクローニングした。産生じたプラスミド を２４ＢＸＬＦ２．４２にと称した。

ＥＢＶ　ｇｐ３４０、ｇＢｌおよびｇＨ遺伝子のワクシニア供与体プラスミドｐ ＳＤ５４２への挿入およびｖＰ９４１とｖＰ９４４の単離 ワクシニア供与体プラスミドｐＳＤ５４２は、延長ポリリンカー領域を有するｐ ｓＤ４６０の誘導体であり、異種遺伝子をワクシニア組換座に組換えるのに用い る。４８６Ｈ６３４０プラスミドの２８２０ｂｐ　ＢａｍＨＩ／ＢｇＩＩＩ断片 を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ　ｐＳＤ５４２プラスミド中にクローニングした。

産生じたプラスミドを５４２．３４０と称した。

２４ＢＸＬＦ２．４２の２１５０ｂｐ　Ｓｍａｌ／ＢｇＩＩＩ断片を、Ｓｍａ　 Ｉ／Ｂｇ　１１１５４２．３４０プラスミド中にクローニングした。産生じたプ ラスミドを５４２．３４０ｇＨと称した。

ＳＰ１３１ｇＢプラスミドの２７００ｂｐ　Ｈｉｎｄ１１１／Ｈ’１ｎｄｌｌｌ 断片を、Ｂｇ　ｌ　Ｉ　１５４２．３４０ｇＨプラスミド中にクローニングした 。産生じたプラスミドをＥＢＶ）リプル１と称した。ＥＢＶ）リプル１中に挿入 されたＥＢＶ暗号領域の遺伝地図を第８図に示す。第８図の矢印により、転写方 向を示す。

ＥＢＶ）リプル１プラスミドをＮｏｔｌにより切断し、ＮＹＶＡＣまたは３つの ＨＢＶ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースのワクシニア組換え体に感染したベロ 細胞中に移入せしめた。対応する組換えワクシニアウィルスｖＰ９４４およびｖ Ｐ９４１を単離した。

実施例１２−２型単純ヘルペスウイルスのｇＢＳｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現す るＮＹＶＡＣ組換え体の構成 Ｈ５Ｖ２　ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスを 構成した。

細胞およびウィルス Ｈ５Ｖ２（菌株Ｇ）をベロ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８１）中で増殖せしめ、サクロ ース勾配上の遠心分離により精製した（ポウエルら、１９７５）。

ワクシニアウィルス（コペンノ１−ゲン）およびそれから誘導された組換え体を 前述したようにベロ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ８１）中で増殖せしめた（パニカリら 、１９８２　；グオら、１９８９）。

Ｈ５Ｖ２　ｇＢ遺伝子の単離 Ｈ８Ｖ２　ｇＢ遺伝子を含有する１２ｋｂ　ＢｇｌｌＩ断片を、ＨＳＶ２ゲ／ム ＤＮＡから単離し、ｐＳＤ４８ｐＵｃ１９のＢａｍＨ１部位に挿入した。産生じ たプラスミドをｐＪ４と称した。

次いでｇＢ遺伝子をワクシニアウィルスのフランキングアーム間にクローニング した。これは、ｐＪ４の２，７００ｂｐ　Ｓｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−８ａｃ　Ｉ　（部 分的）断片をｐＭＰ４０９ＤＶＣのＳｓ　ｔ　Ｉ　ｌ−３ａｃ　Ｉ断片中にクロ ーニングすることにより達成された（グオら、１９８９）。これはＭ２Ｌ遺伝子 を側腹に有するワクシニアウィルス配列間にｇＢ遺伝子を配した。この操作によ り産生されたプラスミドをｐＧＢｌと称した。

次いでインフレーム（ｉｎ−ｆ　ｒａｍｅ）終止コドンをｇＢ遺伝子の３′末端 に加えた。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＢＬ３　（配列認識番号６９）５’ 　−ＣＴＡＡＴＡＧ−３′およびＧＢＬ４　（配列認識番号７０）５’　−ＧＡ ＴＣＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴ−３’をｐＧＢｌの６．３００ｂｐ　ＢａｍＨＩ− ＳａｃＩ　（部分的）断片中にクローニングすることにより達成された。この操 作により産生じたプラスミドをｐＧＢ２と称した。

次いでワクシニアウィルスＨ６プロモーター（ティラーら、１９８８ａ　；バー カスら、１９８９）をｇＢ遺伝子の上流にクローニングした。これは、Ｈ６プロ モーターを含有する、ｐＢＬＶＨ１１７）３７０ｂｐ　ＢｇｌｌＩ断片（ポーチ テレら、１９９１）をｐＧＢ２の８ｇｌｌｌ中にクローニングすることにより達 成された。この操作により産生じたプラスミドをｐＧＢ３と称する。

次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＢ遺伝子の開始コドンと配列せしめた 。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＢＬＩ　（配列認識番号７１） およびＧＢＬＩ　（配列認識番号７２）をｐＧＢ３の６．３００ｂｐ　５ｓｔｌ ｌ−ＥｃｏＲＶ（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＧＢ５と称した。

次いでＨ６プロモートしたｇＢ遺伝子を異なるワクシニアウィルス供与体プラス ミド中にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子を含有する 、ｐＧＢ５の２，８００ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５１３ ＶＣＶＱのＢｇｌ１１部位中にクローニングすることにより行なった。（ｐｓＤ ５１３ＶｃＶＱは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子がポリリンカー領域により 置換されたワクシニアウィルスＨｉｎｄｌＩＩ　Ｊ断片のサブクローンである。

）これにより、Ｈ６プロモートしたｇＢ遺伝子をｔｋ遺伝子を側腹に有するワク シニアウィルス配列間に配した。この操作により産生じたプラスミドをｐＧＢ６ と称した。

ＨＳＶ２　ｇＣ遺伝子の単離 Ｈ５Ｖ２　ｇＣ遺伝子を含有する、２．９００ｂｐ　５ａｌｌ断片を、Ｈ８Ｖ２ ゲノムＤＮＡから単離し、ｐｌＢＩ２５の５ａｌＩ部位に挿入した。産生じたプ ラスミドをｐＧＣ３と称した。

次いでｇＣ遺伝子をワクシニアウィルスフランキングアーム間にクローニングし た。これは、ｐＧＣ３の２，９００ｂｐ　Ｘｈｏｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＧＣ２ のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより達成された。Ｈ６プ ロモーターを含有する、ｐＢＬＶＨ１４の３７０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ断片（ポーチ テレら、１９９１）を、ｐＳＤ４８６のＢｇｌｌＩ部位にクローニングすること によりｐＧＣ２を産生じた（第２図）。これにより、Ｕ遺伝子を側腹に有するワ クシニアウィルス配列間にｇＣ遺伝子を配した。この操作により産生じたプラス ミドをｐＧＣ５と称した。

次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＣ遺伝子の開始コドンと配列せしめた 。これは、オリゴヌクレオチド、Ｇ　ＣＬ　１　（配列ｆ、識番号７３　）　５ ’−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴ？−ｒＧＴＡＴＣＧＴＭＴＧＧＣＣＣ’ＩＴＧＧ入 ＣＧＧＧＴＧＧＧＣＣＴＡＧＣＣＧＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧ−３’およびＧＣＬ２ 　（配列認識番号７４）５１−ＡＧＧＣＣＣＡＣＧＧＣｒＡＧＧＣＣＣＡＣＣＣ ＧＴＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡ　。

ＣｒＴＡＡＣＧＧＡＴ−３’ を、ｐＧＣ５の５，４００ｂｐ　Ｎｒｕｌ−８ｆ　ｉ　Ｉ断片中にクローニング することにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＧｃｌｏと称 した。

次いでｐＧｃｌｏから、外来の３′−非暗号配列を除去した。これは、ｐＧｃｌ ｏの４，９００ｂｐ　Ｓａ　ｌ　Ｉ　−３ｍａｌ（部分的）断片が満たされたＥ 、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片）を再び環状とすることによ り行なわれた。この操作により産生じたプラスミドをｐＧＣｌｌと称した。

次いでさらに３′−非暗号配列をｐＧＣｌｌから除去した。これは、オリゴヌク レオチド、ＧＣＬ３　５’−ＣＴＡＧＧＧＣＣ−３’をｐＧｃｌｌの４，９００ ｂｐ　Ｘｂａｌ−ＡｐａＩ（部分的）断片中にクローニングすることにより行な った。この操作により産生じたプラスミドをｐＧＣ１２と称した。

Ｈ８Ｖ２　ｇＤ遺伝子の単離 ＨＳＶ２　ｇＤ遺伝子を含有する、７．５ｋｂ　ＸｂａＩ断片を、ＨＳＶ２ゲノ ムＤＮＡから単離し、ｐＩＢＩ２５のＸｂａＩ部位に挿入した。産生じたプラス ミドをｐＧＤｌと称した。

次いでｇＤ遺伝子をＨ６プロモーターの下流とワクシニアウィルスフランキング アームの間にクローニングした。

これは、ｐＧＤ１の１，　５００ｂｐ　Ｄｒａ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片をｐ”ｒ ｐ１５の３，　７００ｂｐ　Ｓｍａ　Ｉ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片中にクローニングす ることにより行なった（グオら、１９ｇ９）。これにより、ｇＤ遺伝子をＨ６プ ロモーターの下流とＨＡ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配し た。この操作により産生じたプラスミドをｐＧＤ２と称した。

次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＤ遺伝子の開始コドンと配列せしめた 。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＤＬＩ　（配列認識番号７５） ５１−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧｆｆｒＧＴＡＴＣＧＴ入ＡＴＧＧＧＧＣＧＴＴＴＧ ＡＣＣＴＣＣＧＧ−：ｌ　’およびＧＤＬ２　（配列認識番号７６）５’−ＣＧ ＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＡＡＣＧＣＣＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡ ＣＧＧＡＴ−３’を、ｐＧＤ２の５，１００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ａｈａ　Ｉ　Ｉ （部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたブラスミドをｐＧＤ５と称した。

次いで外来の３′一非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＧＤ Ｌ３　（配列認識番号７７）５１−ＧＧＣＡＧＴＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＣＧＣＴ ＧＧＴＣＡＴＣＧＧＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧｆｆ！’ＴＧＧＧＴ入ＣＧＣＣＧＣＣ ＧＧＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＧＣＣＴＡＣＧＴＣＴＣＣＣＣＣ ＡＣＡＴＣＣＧＧＧ入ＴＧ入ＣＧＡＣＧＣＧＣＣＣＣＣＣＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣ ＣＡＴＴＧ？ｒＴＴＡＣＴＡＧＣＴＧＣＡ−３’およびＧＤＬ４　（配列認識番 号７８）５’−ＧＣＴＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＣＧＡＧＧＧＧ ＧＧＣＧＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＣＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＧＡＧＡＣＧＴＡＧＧ ＣＧＣＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＣＣＡＡ ＡＡＣＧＣＡＡＴＡＣＣＧＣＣＧ入ＴＧＡＩ：ＣＡＧＣＧＣＣＧＣＣ入ＧＧＧ’ ｌ’ＡＣＴＧＣＣ−３讐をｐＧＤ５の４．８００ｂｐ　Ｎａｅｌ−Ｐｓｔｌ断片 中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたブラスミド をｐＧＤ７と称した。

次いで追加の配列をＨ６プロモーターの上流に加えた。

これは、ｐＧＢ６の１５０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−ＥｃｏＲＶ断片（上記参照）をｐ ＧＤ７の４，８００ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ１　−Ｅ　ｃ　ｏＲＶ断片中にクローニン グすることにより行なった。この操作により産生じたブラスミドをｐＧＤ８と称 した。

｝ＩＳＶ２　ｇＢＳｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するワクシニアウイルス供与体 ブラスミドの構成ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するブラスミドを構成した。

これは、Ｈ６ブロモートしたｇＣ遺伝子を含有する、１．８５０ｂｐ　Ｐｓｔｌ 断片を、ｐＧＤ８のＰｓｔ１部位にクローニングすることにより行なった。この 操作により産生じたプラスミドをｐＧｃＤ１と称した。

次いでｇＢ，ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するブラスミドを構成した。これは、 Ｈ６ブロモートしたｇＢ遺伝子を含有する、ｐＧＢ６の２．８００ｂｐ　Ｂｇｌ 　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＧｃＤ１の６，８００ｂｐ　ＢａｍＨＩ（部分 的）断片中にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたブラスミドをｐＧＢｃＤ１と称し゛た。

次いで外来のＤＮＡを除去した。これは、Ｈ６ブロモートしたｇＢ，ｇＣおよび ｇＤ遺伝子を含有する、ｊｐＧＢＣＤＩの６，０００ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂ ａｍＨＩ（部分的）断片が満たされたＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡボリメラーゼｌ　（ クレノウ断片）を、ｐＭＰ８３１のＳｍａ　１部位にクローニングすることによ り行なった。この操作書こより産生じたブラスミドをｐＧＢｃＤｃ１と称した。

次いでＨ６ブロモートしたｇＢＳｇＣおよびｇＤ遺伝子をワクシニアウイルスフ ランキングアーム間にクローニングした。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＳＶ ＬＩ　（配列認識番号７９）５’−ＴＣＧＡＴＣＴＡＧＡ−３’およびＨＳＶＬ ２　（配列認識番号８０）５’　−ＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡ−３’　、並びにＨ６ ブロモートしたｇＢＳｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する、ｐＧＢｃＤｃ１の５， ７００ｂｐＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ　（部分的）断片を、ｐＳＤ５４１ の３，６００ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｂｇｌｌｌ断片中にクローニングすることにより 行なった。これにより、Ｈ６プロモートしたｇＢ，ｇＣおよびｇＤ遺伝子を、Ａ ＴＩ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。

この操作により産生されたブラスミドをｐＧＢＣＤ４と称した。

ｖＰ９１４の構成 ＨＳＶ２　ｇＢ，ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有する、ワクシニアウイルス組換え 体、ｖＰ９１４を構成した。ワクシニアウイルス組換え体を構成するのに用いた 工程は以前に記載している（バニカリら、１９８２　．グオら、１９８９；グオ ら１９９０）．ｐＧＢＣＤ４をｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中に移入す ることにより、ワタシニアウイルス組換え体、ｖＰ９１４を産生じた。この組換 え体のＨＳＢ２遺伝子ハ、ワクシニアウイルスＨ６プロモーターの転写制御下に ある。

ｖＰ９１４感染細胞の蛍光抗体法およびイムノブレシビテーション 前述したように、蛍光抗体法およびイムノブレシピテーションを行なった（グオ ら、１９８９）。ＨＳＶ２に対する家ウサギ抗血清をダコ社（コード番号Ｂ１１ ６）から得た。

ＨＳＶ２　ｇＢ　（Ｈ２３３）　およびＨＳＶ２　ｇＤ　（ＨＤ１）に対する単 クローン性抗体（メイグニアら、１９８７）を、Ｂ．メイグニア（フランス、リ ヨン、インステイテユートメリオクス）から得た。

ＨＳＶ２感染細胞ニオイテ、ｇＢ，ｇＣおよびｇＤ（他のＨＳＶ２糖タンパク質 と同様に）は細胞表面上に表現される。ＨＳＶ２　ｇＢ　（Ｈ２３３）およびＨ ＳＶ２　ｇＤ（ＭＤＩ）に特異的な単クローン性抗体を使用した、ｖＰ９１４感 染細胞に関する蛍光抗体法により、これらの細胞中で産生されたＨＳＶ２　ｇＢ およびｇＤ糖タンパク質はまた細胞表面に発現されることが示された。

）ＩＳＶ２感染細胞１．ニオ１．Ｎテ、ｇＢＳｇＣおよびｇＤは、それぞれ約１ １７ｋＤａ、６３ｋＤａおよび５１ｋＤａの分子量を有する（マースデンら、１ ９８７；マースデンら、１９８４；ラウェイブら、１９８３）、ｖＰ９１４感染 細胞のｇＢ特特異的ツクローン性抗体Ｈ２３３）によるイムノブレシピテーショ ンにより、約１１７ｋＤａ、１１０ｋＤａおよび１００ｋＤａの分子量を有する ３つの主要なタンパク質、並びに他の少量のタンパク質が沈殿した。ｇＤ特特異 的ツクローン性抗体ＨＤｌ）によるイムノブレシピテーションにより、約５１ｋ Ｄａの分子量を有する主要なタンパク質および約５５ｋＤａと４６ｋＤａの分子 量を有する少量のタンパク質が沈殿した。加えて、ＶＰ９１４感染細胞のＨＳＶ ２に対する多クローン性抗血清によるイムノプレシピテーションにより、ｇＣに 同様の６３ｋＤａの分子量を有するタンパク質（８５ｋＤａタンパク質と同様） およびサイズでｇＢとｇＤに対応するタンパク質が沈殿した。それゆえ、ｖＰ９ １４に感染した細胞は、ｇＢＳｇＣおよびｇＤと同一の分子量を有するＨＳＶ２ タンパク質を発現するように思われた。

実施例１３−Ｂ型肝炎ウィルス遺伝子を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構成 りＮＡクローニングおよび合成 プラスミドを構成し、スクリーニングし、標準方法により成長せしめた（マニア ラスら、１９Ｂ２；バーカスら、１９８５；ピッチｍ＝ら、１９８７）。制限エ ンドヌクレアーゼを、ベセスダリサーチラボラトリーズ（ＭＤ、ゲイサースブル グ）、ニューイングランドバイオラボ（ＭＡ、ビバーリー）、およびベーリンガ ーマンハイムバイオケミカルス（ＩＮ、インディアナポリス）から得た。Ｔ４　 ＤＮＡリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。Ｔ４ポリヌクレオチ ドキナーゼをベセスダリサーチラボラトリーズから得た。

プラスミドｐＧＥＭ−３２をプロメガ（ＷＬマジソン）から得た。ｐＢＲ３２２ 中にクローニングされたＨＢＶＢノムを含有するプラスミドｐＴＨＢＶの起源は 以前に記載されている（パオレッティら、１９１１４）。

合成オリゴブオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ８７５０ またはアプライドバイオシステム３８０Ｂ　ＤＮＡシンセサイザーにより調製し た（パーカスら、１９８９）。前述したように（グオら、１９８９）　、シーケ ナーゼ（タバーおよびリチャードソン、１９８７）を用いたジデオキシ鎖終止法 （サンガーら、１９７７）により、ＤＮＡ塩基配列決定を行なった。自動バーキ ンエルマーセタスＤＮＡサーマルサイクラ−中で注文合成オリゴヌクレオチドプ ライマーおよびジエネアンブＤＮＡ増幅試薬キット（ＣＴ。

ノルウオーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、クローニングと配列確認（ エンゲルケら、１９８ｇ）のためのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ 増幅を行なった。

ウィルスおよび移入 ワクシニアウィルスのＮＹＶＡＣ菌株およびその中間祖先、ｖＰ８０４　（第５ 図）を用いた。組換えウィルスの産生と加工は前述したようなものである（バニ カリら、１Ｈ２）。

イムノブレシピテーション ベロ細胞を、細胞当たり１０ｐｆｕのｍ、ｏ、ｔ、で、組換えワクシニアウィル ス、ＮＹＶＡＣ親ウィルス（ｖＰ８６６）に感染せしめたか、または疑似感染せ しめた。１時間の吸着期間後、接種物を除去して、感染細胞を３５３メチオニン （２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するメチオニン不含有媒体で重るいした。全ての試 料を感染８時間後に収穫した。試料を、トリトンを含有する３×緩衝液Ａおよび ５０ｕ１のアプロチニン（ＭＯ，セントルイス、シグマケミカル社、＃Ａ６２７ ９）を含有するＤＯＣ（３％　ＮＦ−４０，３％　トリトン、３％　ＤＯＣ，３ ０ｍＭ　）リスｐＨ７，４，４５０ｍＭ　ＮａＣ１，３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０゜０ ３％　ＮａＡｚｉｄｅ、０．６ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ）中に溶解せしめた。全て の溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに連結した通常の家ウサギ血清に対し て前浄化した。

ＨＢＶ：７ア抗原とＨＢＶ　Ｓ２ペプチド（ａａ１２０−１５３）に対して生じ た家ウサギ抗血清をＲ，ニューラスから得たにューヨーク血液センターのリント スレーＦ。

キンボールリサーチインスティテユート）。抗Ｓ２抗血消をｖＰ８６６感染ベロ 細胞で前吸着せしめた。電気泳動と続いてのオートラジオグラフィーのために、 ＨＢＶタンパク質を、抗コアまたは抗Ｓ２抗血清を用いてイムノブレシピテーシ ョンを行ない、２×ラエムリ試料緩衝液（ラエムリ、１９７０）中で再懸濁せし めた。

血清学 家ウサギおよびモルモットに、皮肉、皮下または筋肉内の経路により、２つずつ １０”ｐｆｕの組換えワクシニアウィルスｖＰ９１９を接種せしめた。最初の接 種から６週間後、同じ経路と接種量で家ウサギに追加抗原投与した。

最初の接種から７週間後、同じ経路と接種量でモルモットに追加抗原投与した。

１２匹のネズミの群に、皮肉、皮下または筋肉内の経路により、１０’ｐｆｕの 組換えワクシニアウィルスｖＰ９１９を接種せしめた。最初の接種から７週間後 、同じ経路と接種量でネズミに追加抗原投与した。

１週間ごとに血清を採取した。ネズミの各群からの毎週の出血を集積した。ＡＵ ＳＡＢラジオイムノアッセイキット（ＩＬ、北シカゴ、アボット）を用いて全て の血清をＨＢＶＢ面抗原に対する抗体に関して分析した。標準技術を利用したＣ ０ＲＡＢコンベテイテイブラジオイムノアツセイキツト（アボット）を用いてＨ ＢＶＢア抗原に対する抗体に関して分析した。

ｖＰ９１９の構成 ワクシニア組換え体ｖＰ９１９は、ＮＹＶＡＣワクシニアウィルスベクターに挿 入されたＢ型肝炎からの３つの遺伝子を含有している。この遺伝子は、ウィルス の３つの異なった部位に個々に挿入された。３つのＨＢＶ遺伝子は以下のタンパ ク質産生物をコードする：　（１）ＨＢＶ　Ｍタンパク質、（ここではスモール ブレＳ抗原、またはｓｐｓＡｇと称した）、（２）ＨＢＶ　、Ｉ、タンパク質（ ここではラージブレＳ抗原、またはｌ　ｓ　ｐＡｇと称した）、（３）コア抗原 のアミノ末端に連結した完全なブレＳ領域（Ｓｌ＋８２）からなる融解タンパク 質、（ここではＳ１２／コアと称した）。

ワクシニアウィルスは、単一ワクシニアゲノム中に連続して挿入された同一の非 相同ＤＮＡ配列の多重コピーを保持しない（バニカリら、１９８２）。ｓｐｓＡ ｇの暗号配列は１ｐｓＡｇの暗号配列内に含有されるので、単一ワクシニアゲノ ムへの両方の遺伝子の挿入によりゲノムが不安定となると思われる。同様に、ハ イブリッドＳ１２／コア遺伝子中に存在するＳ１＋５２　ＤＮＡ領域１ｐｓＡｇ の等量の５１＋５２領域との組換えを経る。潜在的な問題は２つの方法で防いだ 。（１）３つの遺伝子は、必須遺伝子を含有するワクシニアＤＮＡの大きな領域 により互いに離れたワクシニアゲノム中の３つの異なる座に挿入した。それゆえ 、ＨＢＶ遺伝子間のいかなる組換えによっても、生存可能なワクシニア後代を産 生じない不完全なワクシニアゲノムとなる。（２）ＳｐｓＡｇ遺伝子とＳ１２／ コアハイブリツド遺伝子のＳ１＋３２領域をコードするＤＮＡを、ｌｐｓＡｇを コードする原生ＨＢＶ遺伝子と互いとのＤＮＡ相同性を最小限とする異なるコド ンの用法で化学的に合成した。ｌｐｓＡｇをコードする原生ＨＢＶ遺伝子とｓｐ ｓＡｇをコードする合成遺伝子は、ａｙｗ亜型である；融解Ｓ１２／コア遺伝子 のＳ１＋５２領域をａｄｗ２亜型に対応するように合成した（バレンズエラら、 １９７９）。

ポックスウィルスプロモーターの制御下で３つのここのＨＢＶ遺伝子を含有する カセツテを、異なるワクシニア供与体プラスミド中で組み立てて続いて以下に記 載するようにワクシニアウィルスに挿入した。

ＨＢＶ　ｓｐｓＡｇをコードする遺伝子の合成型を、以下の変更によるワクシニ アに好ましいコドンを用いて合成した。（１）ｓＡｇ　（ＨＢＶ　Ｓタンパク質 ）のアミノ酸１９から２１に生じた７５ＮＴ初期転写終止ＴＴＴＴＴＣＴをＴＴ ＣＴＴＴＣに変更し、他のＴ５ＮＴ終止信号を産生じないようにコドンの用法を 調整した（ユエンら、１９８７）。（２）潜在的な変型翻訳産生物を避けるため に、いずれの方向にもフレームＡＴＧ開始コドンからの産生を防ぐようにコドン の用法を調整した。合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を、修飾ワクシニアウィルスＨ６初期 ／晩期プロモーターに正確に連結した（パーカスら、１９８９）。プロモーター と遺伝子の完全な配列を第９図に示す。アミノ酸配列は、プラスミドｐＴＨＢＶ 中に配列に基づき、これはＳ２領域の２つのアミノ酸位置：ガリバート、ａａ　 ３１　ｔｈｒ；ａａ３６　１ｅｕ；ｐＴＨＢＶ、ａａ　３１　ａｌａ；ａａ３６ 　ｐｒｏで発表されているａｙｗ配列とは異なる（ガリバートら、１９７９）。

プラスミドｐＧＪ１５は、ワクシニアＡＴＩ挿入座にＨ６プロモーター／合成ｓ ｐｓＡｇ遺伝子を含有している（バーカスら、１９９０）　、　ｐ　Ｇ　ＥＭ− ３Ｚ中の合成ｓｐｓＡｇ遺伝子の部分を組み立て、組み立てた遺伝子を、ＡＴＩ 欠損欠損台成Ｈ６プロモーターを含有するｐＳＤ４９２の誘導体である、挿入プ ラスミドｐＭＰ４９４Ｈに運搬することによりｐＧＪ１５を構成した。

ここで第１０図を参照する。合成ＨＢＶ　ｓｐｓＡｇを３つの部分で組み立てた 。プラスミドｐＧＪ　５、ｐＧＪ　３、およびｐＧＪ７を、以下のようにそれぞ れ相補オリゴヌクレオチドの６．５、および８対からそれぞれ産生じた。標準化 学物質により合成した相補オリゴヌクレオチド対を、標準条件下で、６５℃に加 熱し、アニーリングに効果のあるように室温までゆっくりと冷却することにより キナーゼした。各断片からなるアニールした対のアリコートを、適切に切断した ｐＧＥＭ−３２（プロメガ）と組み合わせ、標準条件下で連結した。５ｐｈｌお よびＸｂａｌ制限部位により制限された断片ＳＸ（黒塗りの四角で示す）を、プ ラスミドｐＧＪ　５を産生ずるそれらの酵素で切断したｐｃＥＭ−３２ベクター プラスミドと連結した。ベクタープラスミド配列を開いた領域で示す。同様に、 断片ＸＢ（斜線）とＢＨ（横線）を、それぞれＸｂａｌとＢａｍＨＩ、またはＢ ａｍＨＩとＨｉｎｄｌｌｌのいずれかで切断したプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚ中で 組み立て、プラスミドｐＧＪ　３およびｐＧＪ７を産生した。各プラスミド中の 挿入の完全性を、ＤＮＡ配列の決定により確認した。

ＳＸ％ＸＢおよびＢＨ遺伝子断片を側腹に有する適切な制限酵素でプラスミドｐ ＧＪ　５、ｐＧＪ３およびｐＧＪ　７を切断することにより合成ＨＢＶ遺伝子断 片を単離し、続いてｓｐｈ　ＩとＨｉｎｄｌｌｌで切断したｐＧＥＭ−３２に連 結し、連続ＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ配列を含有するプラスミドｐＧＨ９を産生じた 。開始メチオニンから最初のコドンより９ｂｐ下流のＥｃｏＲ１部位で合成ｐＳ ｐＡｇに付加されたＨ６プロモーターの３’　２８ｂｐ（斜線）を含有するオリ ゴヌクレオチドＨ６ＬＩＮＫ（配列認識番号８（５’−ＣＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣ ＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＡＧＴＧＧ−３１）およびＨ６ ＬＩＮＫ２（配列認識番号８２）（ｓ’−ＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＣＡＴｒＡＣＧ ＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＧＧＴＡＣ−３”）を、Ｋ ｐｎｌ　（ｐＧＥＭ−３２から誘導された多重クローニング領域内の５′から５ ｐｈｌ部位）とＥｃｏＲＩで切断したｐＧＪ　９と連結し、プラスミドｐＧＪ１ ２を産生じた。ＮｒｕＩ／ＨｐａＩ断片をｐＧＨ１２から単離して、同様に切断 したｐＭＰ４９４Ｈに連結し、プラスミドｐｃＪ１５を産生じた。ｐＭＰ４９４ Ｈは、ＡＴＩ欠損領域にワクシニアＨ６プロモーターを含有するＡＴＩ挿入プラ スミドである。ｐＧＪ１５は、ＡＴＩ座を囲うワクシニア配列（点領域）により フランクされたＨ６プロモータードリブンＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有し ている。

ワクシニア組換え体ｖＰ８０４との組換えの供与体プラスミドとしてｐＧＪ１５ を用いて組換え体ワクシニアウィルスｖＰ８５６を産生じた。ｖＰ８０４は、Ｔ Ｋ、ＨＡ。

Ｕおよび［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＩのＮＹＶＡＣ欠損を含有する。

組換えウィルスｖＰ８５６は、ＡＴＩ領域を置換したＨＢＶ合成ｓｐｓＡｇ遺伝 子を挿入した上述欠損を含有する。

以下に記載する１４Ｌ領域中に挿入を含有する後代ウィルス組換え体は、欠損に 関してＮＹＶＡＣと等量である（ＴＫ、ＨＡ、ＡＴＩ、１４Ｌ、ｕ、［Ｃ７Ｌ− ＫＩＬＩ　）。

ＨＢＶ　１ｐｓＡｇをコードする遺伝子をプラスミドｐＴＩ（ＢＶから誘導した 。上述したＳ２領域のアミノ酸変化に加えて、ｐＴＨＢＶは、Ｓ１領域の１つの アミノ酸位置での発表されたａｙｗ亜型とは異なる：ガリバートら１．１９７９ 、ａａ　９０　ｓｅｒ；ｐＴＨＢＶ　ａａ９０　ｔｈｒ０上述したｓＡｇ中の初 期翻訳終止信号を、ＴＴＴＴＴＣＴからＴＴＣＴＴＣＴに変更した。１０５ｂｐ 　牛痘Ｕプロモーターの制御下で、完全なｌｐｓＡｇ遺伝子を配した（ピカップ ら、１９８Ｂ）　、　ｕプロモーター／　１　ｐ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子カセツテを 第１１図に示す。

プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐｓは、ワクシニアＩ４Ｌ欠損塵にＵプロモーター ／１ｐｓＡｇ遺伝子を含有している。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓの構成を第１２図に 模式的に示す。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ中のＩ４Ｌ欠損は、ＮＹＶＡＣ中の１４Ｌ 欠損と等量である。

ここで第１２図の（Ａ）を参照する。合成オリゴヌクレオチドブライマーＭＰＳ ＹＮ３２２　（配列認識番号８３）、ＭＰＳＹＮ３２３　（配列認識番号８４） およびテンプレートプラスミドｐＢＳｃｏｗを使用するＰＣＨにより、ＨＢＶ　 ｌｐｓＡｇ遺伝子の５′末端を牛痘Ｕプロモーター（矢印で示した方向）に加え 、ｐＭＰｕｓｌを産生じた。

（黒い四角がＵプロモーターを示し、線の四角がＨＢＶ配列を示す。）ｐｓＤ５ ５０は、Ｉ４Ｌ欠損領域のワクシニア挿入プラスミドである。（三角形は欠損の 部位を示し、四角はワクシニア配列を示す。）Ｕプロモーター／ＨＢＶ接合部を 含有する５ｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ断片を単離し、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩで切断し たｐｓＤ５５０に挿入して、ｐＭＰ５５０ｕを産生した。

ここで第１２図（Ｂ）を参照する。完全ＨＢＶ　ｌｐｓＡｇを含有する１、１ｋ ｂ　Ｄｒａｌ断片をｐＴＨＢＶから単離し、ｐＵＣ８中に挿入し、ｐＭＰ８Ｓを 形成した。

翻訳開始コドンおよび終止コドンを示す。（＊）は７５ＮＴ転写終止信号の部位 を示す（ユエンら、１９８７）。示したようにＰＣＲ突然変異誘発により転写終 止信号をｐＭＰ８Ｓから除去し、ｐＭＰ８ＳＴを産生じた。１ｐｓＡｇのバルク を含有する１、１ｋｂ　ＢａｍＨＩ　（部分的）断片をｐＭＰ８ＳＴから単離し て、ＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＭＰ５５０ｕに挿入し、ｐＭＰ５５０ｕ ｌｐｓを産生じた。ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓはワクシニア組換え体ＶＰ８５６との 組換えに用いて、ｖＰ８９６を産生じた。合成オリゴヌクレオチド配列は以下の とおりである：ＭＰＳＹＮ３２２　（配列認識番号８３）ＭＰＳＹＮ３２３　（ 配列認識番号８４）ＭＰＳＹＮ３３０　（配列認識番号８５）ＭＰＳＹＮ３３１ 　（配列認識番号８６）ＭＰＳＹＮ３２２　（配列認識番号８３）１７）ＨＢＶ 開始コドンに下線を引き、ＭＰＳＹ８３３１　（配列認識番号８６）の変異した 塩基にも下線を引き、制限部位を表示した。

上述したように救助ウィルスｖＰ８５６により組換えの供与体プラスミドとして ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓを用いて組換えウィルスｖＰ８９６を産生じた。ｖＰ８９ ６は、ＮＹＶＡＣ（７）バックグラウンド（ＴＫ、ＨＡＳＡＴＩ、１４Ｌ。

ｕ、［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＩが欠損）にＨＢＶ　ｓｐｓＡｇおよびＨＢＶ　１ｐｓＡ ｇの両方の遺伝子を含有している。

多価ＨＢＶワクシニア組換え体との比較目的のためにＨＢＶ　１ｐｓＡｇ遺伝子 のみを含有する組換え体を産生ずるために、ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）との組 換えにｐＭＰ５５０ｕｌｐｓを用いて、組換えウィルスｖＰ８９７を産生じた。

ワクシニアウィルスに挿入された３番目のＧＢＶ遺伝子は融解タンパク質をコー ドする。ＨＢＶ　ＳｌおよびＳ２領域を特定する合成りＮＡを、ＨＢＶコア抗原 を特定する遺伝子の５′末端にクローニングした。ａｄｗ亜型のＳ１＋Ｓ２領域 をコードしくバレンズエラら、１９７９）　、ａ　ａ位置１２のｍｅｔ　（ａｙ ｗ亜型の位置１に等しい）により開始するように合成りＮＡを設計した（ガリバ ートら、１９７９）。Ｓ１＋５２の合計翻訳領域は１６，３コドンである。多価 ＨＢＶワクシニア組換えウィルス中のＨＢＶ遺伝子の中で望ましくない分子内組 換えを防ぐために、ｐＴＨＢＶ中に存在する原生ａｙｗｓ１＋３２領域を有する 合成Ｓ１＋Ｓ２領域、並びにｐＧＪ１５中の合成Ｓ２領域のＤＮＡ相同性を最小 限にするためにコドンの用法を調整した。

コア抗原をコードする金縁遺伝子をｐＴＨＢＶから得た。

ｐＴＨＢＶによりコードされたコア抗原のアミノ酸配列は発表されたａｙｗ配列 と一致する（ガリバートら、１９７９）。

ワクシニア１３Ｌ初期／中間プロモーターの制御下でｓ１２／コアをコードする 肝炎融解遺伝子を配した（フォスら、１９８８　、ゲーベルら、１９９０ｂ位置 ６４，９７３−６５，０７４）。１３Ｌプロモーター／Ｓ　１２／コア遺伝子カ セツテの金縁配列を第１３図に示す（配列認識番号８７）。

プラスミドｐＭＰ５４４Ｉ３ｓ１２ｃは、ＨＡ欠損座に１３Ｌプロモーター／Ｓ １＋８２／コア遺伝子を含有している（グオら、１９ｇ９）。ｐＭＰ５４４Ｉ３ ｓ１２ｃの構成を第１４図に模式的に示す。

ここで第１４図を参照する。プラスミドｐＭＰＣＡ−Ｂは、ｐＵＣ９のＳｍａ　 Ｉ部位に挿入されたｐＴＨＢＶからのｌｋｂ　Ｈｈａｌ断片を含有している。ｐ ＭＰ９ＣＡ−Ｂは、ＨＢＶコア抗原、並びに遺伝子の上流と下流のフランキング ＨＢＶ　ＤＮＡの金縁暗号配列を含有している。

ｐＭＰ９ＣＡ−Ｂを、遺伝子の３′末端から３０ｂｐ上流のＢｇｌｌＩ（部分的 ）およびＨＢＶ／ｐＵＣ接合部でのポリリンカー領域のＥｃｏＲＩで切断した。

ＨＢＶ遺伝子のバルクを含有する３、４ｋｂベクタ一断片を単離し、アニールし た合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ２７５　（配およびＭＰＳＹＮ２７６　（ 配列認識番号８９）３１　ＡＧＴ！’ＡＧＡＧＣＣＣＴＴＡＧＡＧＴＴＡＣＡ− 人ＴＣＴＡＴＴＧＡＴＴ入入入入ＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡ？ｒ入入　５１と連結し 、ｐＭＰ９ＣＡ−Ｃを産生した。制限部位を表示し、翻訳終止コドンに下線を引 き、初期ワクシニア転写ターミネータ−には上に線を引いた。

ｐＭＰ９ＣＡ−Ｃは、ＨＢＶコア抗原の金縁暗号配列を含有し、上述したように 遺伝子のバルクの供給源として用いた。

以下に示すように、合成オリゴヌクレオチド、ＭＰＳＹＮ２９０からＭＰＳＹＮ ３０８　（配列認識番号９ｏ）−（配列認識番号９９）を用いて上述したような ５つの二本鎖セクションＡからＥにおいて合成Ｓ１＋Ｓ２領域を組み立てた。オ リゴヌクレオチドは、４がら８ｂｐの粘着末端とともに、４６ｍｅ　ｒから７１ ｍａｒのサイズに亘った。

セクション内の内部位置にあるオリゴヌクレオチドの５′末端は、セクションを アニールする前にキナーゼした。セクションＡからＥを構成するのに用いた合成 オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。暗号鎖のみを示す。関連制限部位を示 す。Ｓｌ（セクションＡ）、Ｓ２（セクションＣ）およびコア（セクションＥ） の開始コドンに下線を引いた。

セクションＡ　ＭＰＳＹＮ２９０−２９４　（配列認識番号９０）−（配列認識 番号９２）ｌＬｉｎｄエエｘ’ＥｍＸ　（Ｉ３Ｌ）　（５１）ＭＰＳＹＮ２９０ 　（配列認識番号９０）　５’ＡＧＣＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴＴ ＴＡＡＴＣ躯２刀ＡＡＴＡＧＡｅＣＣｒＧＣＴＴＴＣ３１ ＭＰｓＹＮ２９４　（配列認識番号９２）　５１ＧＧＡＧＣＣＡＡＣＴＣＡＡＡ ＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴセクシヨンＢ　ＫＰ５ＹＮ２９６−２９ ９ＭＰＳＹＮ２９Ｂ　（配列認識番号９４）　５’ＡＴＡ？ｒＡＧＧＴｒＧＧＴ ＣＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＣＡＡＧＧ−セフ’／　！！ｌ　ンＣＫＰＳＹ）１３０ ０−３０３）Ｇ’１９ＹＮ３０２　（配列認識番号９　Ｂ　）　５１　ＡＧＡＣ ＡＧＣＣＡＡＣＴＣＣ（ＪＴＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡ−セクションＤ　ＫＰ １９ＹＮ３０４−３０５セクシヨンＥ　ＭＰＳＹＮ３０６−３０８シルＩ ＭＰＳＹＮ３０６　（配列認識番号９８）　５１ＧＧＴＧＧＡＴＣＴＡＧＴｒＣ ＴＧＧＡＡＣＴＧＴＡＡＡＣＣＣＡＧＣＴ−ＣＣＧＡＡＴＡＴＴＧＣＣＡＧＴＣ ＡＣＡＴＣＴＣ３１ＭＰＳＹＮ３０Ｂ　（配列認識番号９９）　５１　ＧＴＣＴ ＡＴＣＴＣＣＧＣＧＡＧＧＡＣＴＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＴＧＡＣテンプレートと して、ＨＬｎｄｌｌｌ　Ｉのサブクローンである、ｐＭＰｌ、およびＰＣＲプラ イマーとして合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３１０　（配列認識番号１０ｏ ）、ＭＰＳＹＮ３１１　（配列認識番号１０１）を用いて、ワクシニア１３Ｌプ ロモーターを合成した。制限部位を示す。

ＭＰｓＹＮ３１ｏ（配列認識番号１００）ｓ曽Ｉ３ブｏモー９−／ＨＢＶ　Ｓ１ ＋Ｓ２／：ｌＴ７発現カセツテを上述した中間プラスミドクローンを用いて段階 でｐＵＣ８とｐＵＣ９において組み立て、ｐＭＰ９Ｉ３Ｓ１２コアを産生じた。

関連する場合のみに制限部位を示す。プラスミドｐＭＰ９Ｉ３Ｓ１２コアをＳｍ ａ　Ｉで切断し、金縁プロモーター／遺伝子カセツテを含有する１、２ｋｂ断片 を単離した。ワクシニアＨＡ欠損プラスミドｐＳＤ５４４をＳｍａ　Ｉで切断し 、１．２ｋｂ断片と連結してプラスミドｐ’ＭＰ５４４１３ｓ１２ｃを産生した 。

ｐＭＰ５４４Ｉ３ｓ１２ｃを、上述したワクシニア組換え体ｖＰ８９６との組換 えの供与体プラスミドとして用いて、組換えワクシニアウィルスｖＰ９１９を産 生じた。ＶＰ９１９は、ＮＹＶＡＣバックグラウンド中に全て３つのＨＢＶ挿入 物：　ｓｐｓＡｇ、ｌｐｓＡｇおよびＳ１２コア融解を含有する。ｖＰ９１９中 の全てのＨＢＶ挿入物の配列は、テンプレートとしてｖＰ９１９を用いたポリメ ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）と、続いてのＰＣＲ産生物質のジデオキシ配列決定によ り確認した。加えて、上述したようにＶＰ８０４との組換えにおいて、ｐＭＰ５ ４４１３ｓ１２ｃを用いて、ＨＢＶ　５１２／コア融解のみを含有する組換えワ クシニアウィルスｖＰ８５８を産生じた。また組換えワクシニアウィルスｖＰ８ ５６との組換えにｐＭＰ５４４１３Ｓ１２Ｃを用いて組換えワクシニアウィルス ｖＰ８９１を産生じた。ｖＰ８９１は、２つのＨＢＶ遺伝子挿入物、ｓｐｓＡｇ およびＳ１２／コアを含有している。

ｖＰ９１９によるＨＢＶタンパク質の発現三重ＨＢＶ組換え体により合成された 様々なＨＢＶタンパク質をアッセイするために、ｖＰ９１に感染した代謝標識し た溶解産物および一重と二重ＨＢＶ遺伝子挿入物を含有する適切なワクシニア組 換え体に、イムノブレシビテーションを施し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動と続いてのラジオオートグラフィーにより分析した。未感染細胞と、ｖＰ ８６６　（ＮＹＶＡＣ）　、ｖＰ８５６　（ｓｐｓＡｇ）　、ｖＰ８９６　（ｓ 　ｐｓＡｇ＋　ｌ　ｐｓＡｇ）またはＶＰ９１９　（ｓｐｓＡｇ、１ｐｓＡｇＳ Ｓ１２／：＋ア）に感染した細胞におけるタンパク質を家つサギ抗Ｓ２抗血清を 用いてイムノブレシビテーションした。さらに未感染細胞と、ｖＰ９１９　（ｓ ｐｓＡｇ、１ｐｓＡｇ、Ｓ１２／コア）、ｖＰ８５８　（Ｓ１２／コア）または ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）に感染した細胞におけるタンパク質を家つサギ抗コ ア抗血清を用いてイムノブレシピテーションした。抗Ｓ２血清は、ｓｐｓＡｇの 遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体ｖＰ８５６からの３３ｋＤａの主要タ ンパク質を沈殿せしめた。これは、ＨＢＶ　ｓｐｓＡｇの単独にグリコジル化し た形状に予期したサイズに対応する。ｓｐｓＡｇの二重にグリコジル化した形状 に予期されるサイズに対応するタンパク質３６ｋＤａは少量沈殿した。抗Ｓ２血 清は、ｓｐｓＡｇと１ｐｓＡｇの遺伝子を含有するツクシニア二重組換え体ｖＰ ８９６からの同一のタンパク質を沈殿せしめる。加えて、１ｐｓＡｇの予期した サイズに良好に対応する（３９ｋＤａ未グリコジル化および４２ｋＤａグリコジ ル化）３８と４１ｋＤａの２つの大きなタンパク質が沈殿する。ｖＰ８５６とｖ Ｐ８９６からの抗Ｓ２血清により沈殿した全てのタンパク質はまた、ワクシニア ＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９からも沈殿する。

ＨＢＶ　５１２／コア融解タンバグ質の予期したサイズは３８ｋＤａである。家 つサギ抗コア抗血清は、予期したサイズのタンパク質、並びに、ＨＢＶ融解遺伝 子Ｓ１２／コアを含有するワクシニア単独組換え体である、ｖＰ８５８からの様 々な小さなタンパク質を沈殿せしめた。抗コア血清によりｖＰ８５８から沈殿し た最も豊富なタンパク質は、２７ｋＤａのサイズを有した。これは、融解タンパ ク質遺伝子が２番目の（３２）ＡＴＧまで開始する場合に予期される翻訳産生物 にサイズで対応する。ｖＰ８５８から沈殿した２９ｋＤａタンパク質は、２７ｋ Ｄａタンパク質のグリコジル化された形状である。コアタンパク質のみの翻訳産 生物にサイズで対応する２０ｋＤａの小さなタンパク質もまた、少量ｖＰ８５８ から沈殿した。３つのＨＢＶ遺伝子全て（ｓｐｓＡｇＳ　ｌｐｓＡｇおよびＳ１ ２／コア融解）を含有するワタシニア組換え体ｖＰ９１９は、抗コア抗血清によ るイムノブレシピテーションによりｖＰ８５８に観察された模様と同一の模様を 与えた。抗コア抗血清によりｖＰ８５８とｖＰ９１９から沈殿した２７ｋＤａお よび２９ｋＤａタンパク質もまた予期したように、抗Ｓ２抗血清によりｖＰ９１ ９から沈殿した。

ｖＰ９１９に対する抗体応答 ｖＰ９１９により産生されたＨＢＶタンパク質に対する血清学的応答を試験する ために、ウィルスを家ウサギ、モルモットおよびネズミに接種した。家ウサギと モルモットには皮肉、皮下および筋向経路により、ｌｏ”ｐｆｕで２セツトの組 換えワクシニアウィルスｖＰ９１９を接種した。

最初の接種から６週間後、家ウサギに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与 した。最初の接種から７週間後、モルモットに同一経路と摂取量でもう一度追加 抗原投与した。

１２匹のネズミの群に皮肉、皮下および筋向経路により、１０’ｐｆｕで組換え ワクシニアウィルスｖＰ９１９を接種した。最初の接種から７週間後、ネズミに 同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。血清を１週間ごとに採取した。

ネズミの群のそれぞれから１週間の出血を集積した。ＡＵＳＡＢラジオイムノア ッセイキット（アボット）を用いてＨＢＶ表面抗原に対する抗体について、全て の血清を分析した。Ｃ０ＲＡＢ比較ラジンイムノアツセイキツト（アボット）を 用いてＨＢＶコア抗原に対する抗体に関して、全ての血清を分析した。標準技術 を用いてアッセイを行なった。これらの分析の結果を表２（家ウサギ）、３（モ ルモット）および４（ネズミ）に示す。

表２に示した結果を要約すると、６匹の家ウサギは全て、１度のｖＰ９１９の接 種の後に抗コア抗体応答を示した。

６匹のうち５匹の家ウサギにおいて、抗コア抗体応答は、ｖＰ９１９の２度の接 種により追加抗原投与された。６匹のうち４匹の家ウサギは、１度のｖＰ９１９ の接種の後に抗ｓＡｇ応答を示した。これらの４匹の家ウサギと追加の１匹のウ サギは、２度の接種の後に抗ｓＡｇ応答の増大を示した。

表３に示した結果を要約すると、１匹のモルモットは、最初のｖＰ９１９の接種 後に抗コア応答を示し、７週間後の追加抗原投与後には合計３匹のモルモットが 抗コア応答を示した。３匹のうち１匹が８週間後に抗ｓＡｇ抗体応答を示した。

表４の結果を要約すると、ネズミの３つの群は全てｖＰ９１９の接種後様々な時 期に抗コア抗体応答を示、３つの群のうち２つの群が抗ｓＡｇ応答を示した。

ＡＵＳＲＩＡアッセイ ＨＢＶ含有ポックスウィルス組換え体に感染した細胞からの微粒子ＨＢＶ表面抗 体の発現を、市販されているＡＵＳＲＩＡ　ｌｌ−１２５キツト（ＩＬ、ノース ジカゴ、アボットラボラトリーズ）を用いてアッセイした。２Ｘ１０６のベロ細 胞を含有する皿に、２ｐ　ｆ　ｕ／細胞で３重に組換えワクシニアウィルスで感 染せしめた。２４時間後、培養培地を除去し、細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、 洗浄物を培地と組合せ、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離した。

上澄みを培地分画と称した。２ｍｌのＰｖＳを皿に加え、細胞を削り取り、上記 からの細胞ベレットと組み合わせることにより細胞分画を調製した。培地と細胞 分画の両方の最終容積をＰＢＳで４ｍｌに調節した。細胞分画をアッセイの前に ２分間音波処理した。細胞分画と培地分画を、ＡＵＳＲＩＡキットを用いて１： ５に希釈したＨＢＶ表面抗体の存在下でアッセイした。キットにより供給された 負の対照の２．１倍のカットオフ値より低い試料を負であると考えた。全ての皿 からの細胞分画と培値分画の出力ウィルスをベロ細胞上で滴定した。結果を表５ に示す。

ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーターの制御下でＨＢＶ　ｌｐｓＡｇを発現するワクシ ニア組換え体の構成ワクシニア組換えｖＰ９１９は、感染後の初期に機能する３ つの異なるポックスウィルスプロモーターの制御下で３つの異なるＨＢＶ遺伝子 を含有している。同一のワクシニアバックグラウンドで感染後初期に異種遺伝子 を発現する様々なポックスウィルスプロモーターの相対強度を比較するために、 試験遺伝子として狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を用いて、サンドイッチＥＬ　Ｉ 　ＳＡアッセイを行なった。

この試験システムを用いると、ワクシニアＨ６プロモーターおよびワクシニア１ ３Ｌプロモーターは、牛痘Ｕプロモーターよりも強いプロモーターであることが 分かった。ＶＰ９１９において、Ｈ６プロモーターはＨＢＶ　ｓｐｓＡｇの発現 を指示し、Ｉ３ＬプロモーターはＨＢＶ　Ｓ１２／コア融解の発現を指示し、Ｕ プロモーターはＨＢＶ　ｌ　ｐｓＡｇの発現を指示する。ｌｐｓＡｇの共発現は 粒子の形成とｓＡｇまたはｓｐｓＡｇの分泌を妨害することが示されたので、相 対的に弱いＵプロモーターはＨＢＶ　ｌｐｓＡｇの発現のために故意に選択され る（オウら、１９Ｈ；チェンら、１９１１Ｂ、マツクラクランら、１０７；チサ リら、１９８Ｂ）。

ＨＢＶ遺伝子を発現する組換えワクシニアウィルスによりｓ　Ａ　ｇまたはｓｐ ｓＡｇを含有する粒子の生体外での産生を測定するためにＡＵＳＲＩＡラジオイ ムノアッセイキットを用いた。予備実験により、ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の形成 と分泌はｖＰ８５６　（ｓｐｓＡｇを含有）、ｖＰ８９６　（ｓｐｓＡｇ＋１ｐ ｓＡｇを含有）およびｖＰ９１９（ｓｐｓＡｇ＋１ｐｓＡｇ＋８１２／コアを含 有）中に生じたことが示された。ｖＰ８９６およびｖＰ９１９において、ＡＵＳ ＲＩＡ反応性粒子の相対水準は、ｖＰ８５６に観察された水準よりも低かった。

ＡＵＳＲＩＡ反応性粒子の形成と分泌が高水準のｌｐｓＡｇ発現の存在下で観察 されることを決定するために、エトモボックス（ＥＰＶ）４２ｋＤａプロモータ ーの制御下でｌｐｓＡｇを配した。上述した比較ＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験により、ワ クシニア組換えウィルス中のＥＰＶ　４２ｋＤａプロモーターは、ワクシニアＨ ６プロモーターまたはワクシニアＨ６プロモーターに観察された水準と等しい水 準で異種遺伝子の発現を指示した。

プラスミドｐＭＰ５５０ｕｌｐ８は、ワクシニア１４Ｌ欠損座に牛痘Ｕプロモー ターの制御下で１ｐｓＡｇ遺伝子を含有している（第１２図）。プラスミドｐＭ Ｐ５５０ｕｌｐｓ中に存在する牛痘Ｕプロモーターを以下のようにしてＥＰＶ　 ４２ｋＤａプロモーターにより置換した：相補オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３ ７１−３７４を内部５′末端でキナーゼして（ＭＰＳＹＮ３７２　、ＭＰＳＹＮ ３７３）、アニールして、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐｔｒｃｓ中にク ローニングし、プラスミドｐＭＰ３７１／３７４を形成した。ＭＰＳＹＮ３７１ 　（配列認識番号１０２）、ＭＰＳＹＮ３７３　（配列認識番号１０３）　、Ｍ ＰＳＹＮ３７２　（配列認識番号１０４）、およびＭＰＳＹＮ３７４（配列認識 番号１０５） ＴＡＡＡＪ工ＱＧＧＧＣ：ｌ’ ＭＰ５ＹＮ３フ３　３’　ＧＴＣＴＡＧＡＧＴＴｒＴＡＡＣＴＴＴ’ｒＡＴＡＴ ＡＴＴＡＡＴＧＴＴＡＴＡＴｆｆｒＡＣＣＣＣＧＴＣＴＴ　５１ ＡＡＣＣＴＡＧ　５１ は、ＨＢＶ　Ｓｌ領域（ＡＴＧ下線）からＢａｍＨ１部位の後に３１ｂｐ　ＥＰ Ｖ　４２ｋＤａプロモーター要素を含有している。ＤＮＡ配列の確認に続いて、 挿入物をＢａｍＨＩ／Ｂｇｌｌｌでの切断によりｐＭＰ３７１／３７４から単離 し、以下のようにｐＭＰ５５０ｕｌｐｓ中の対応Ｕプロモーター／ＨＢＶ配列を 置換するのに用いた；ｐＭＰ５５０ｕｌｐｓｆ−Ｂａｒｒ＋ＨＩ　（部分的）／ ＢｇｌＩＩで切断し、適切な５ｋｂベクタ一断片を単離して、ｐＭＰ３７１／３ ７４からのＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ断片と連結した。産生じたプラスミド、ｐＭ Ｐ５５０Ｅ３１１ｐｓにおいて、ＨＢＶ　ｌｐｓＡｇは、ＥＰＶ　４２ｋＤａプ ロモーターの制御下にある。ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター／ｌｐｓＡｇ遺伝子 カセツテの金縁配列を第１５図に示す。

ｓｐｓＡｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体ｖＰ８５６に関する供与体プラ スミドとしてｐ　Ｍ　Ｐ　５５０　Ｅ　３１１ｐｓを用いて、二重ＨＢＶ組換え ワクシニアウィルスＶＰ９３２を産生じた。Ｓ１２／コア融解を含有する供与体 プラスミドｐＭＰ５４４１３ｓ１２ｃに関する救助ウィルスとしてｖＰ９３２を 用いて、三重ＨＢＶ組換えワクシニアウィルスｖ　Ｐ　９７５を産生じた。ＥＰ Ｖ　４２ｋＤａプロモーター／　１　ｐ　ｓ　Ａ　ｇのみを含有するワクシニア 組換え体を産生ずるために、ｖＰ８６６に関する供与体プラスミドとしてｐＭＰ ５５０Ｅ３１１ｐｓを用いて組換えワクシニアウィルスｖＰ９３０を産生じた。

組換えワクシニアウィルスによる生体外ＨＢＶ表面抗原の分泌 ベロ細胞を含有する皿を、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）またはＨＢＶ　ｓｐｓＡｇ および／またはＨＢＶ　１ｐｓＡｇを発現する組換えワクシニアウィルスを三重 に感染せしめた。感染細胞に関連するＨＢＶ表面抗原粒子の相対量を、ＡＵＳＲ ＩＡ　ｌｌ−１２５キツトを用いて培地（こ分泌された量と比較した（表５）。

培地中のＨＢＶ表面抗原の存在は、ウィルス感染度の９９．８％以上が細胞関連 にとどまっていたので、感染細胞の溶解によるものではなかった。

細胞ペレットと培地の容積は、直接の比較のために等しくした。ｓｐｓＡｇを発 現する組換えワクシニアウィルスＶＰ８５６に感染した細胞において、ＡＵＳＲ ＩＡ反応性表面抗原の４２％が培地に分泌された。比較的弱いＵプロモーター（ ｖＰ８９６）の制御下でのｌｐｓＡｇの共発現は、細胞関連ＡＵＳＲＩＡ反応性 材料の量を著しくは変化せしめなかったが、分泌した材料の相対量を合計の２４ ％まで減少せしめた。比較的強いＥＰＶ　４２ｋＤａプロモーター　（ｖＰ９３ ２）の制御下でのｌｐｓＡｇの共発現は、分泌された材料の相対量を合計の６％ まで低下せしめた。ＶＰ８９６に関しては、ｖＰ９３２中のｓ　ｐｓＡｇによる ｌｐｓＡｇの共発現は、ＡＵＳＲＩＡ反応性細胞関連材料の量を低下せしめなか った。興味をひくことに、ＥＰＶ４２ｋＤａプロモーター（ｖＰ９３０）の制御 下で１ｐｓＡｇのみの発現は、アッセイのためのバックグラウンドより著しく高 い細胞関連ＡＵＳＲＩＡ反応性材料の水準の産生となり、一方でＵプロモーター （ｖＰ８９７）の制御下でのｌ　ｐ　ｓ　Ａ　ｇの発現はそうならなかった。こ れは、内部（Ｓ２またはＳ）開始コドンでの開始によるｖＰ９３０感染細胞中に 産生された高水準のｓｐｓＡｇまたはｓＡｇによるようである。

ムシＪ＋ 実施例１４−Ｂ型肝炎ウィルスおよびニブスティン−バーウィルスを発現するＮ ＹＶＡＣ組換え体の構成 ニブスティン−バーウィルス（ＥＢＶ）およびＢ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）は 、アフリカを含む類似の地理的区域に亘る地方特有のものであるので、両方の病 原の免疫原を発現する組換えワクシニアウィルスを産生ずることが好ましい。こ の目的に関して、ＮＹＶＡＣバックグラウンドで３つのＥＢＶ遺伝子と３つのＨ ＢＶ遺伝子を含有する組換えワクシニアウィルス、ｖＰ９４１を産生じた。

ＨＢＶタンパク質のイムノブレシピテーションＨＢＶタンパク質のイムノブレシ ピテーションと代謝標識付けは、実施例１３のｖＰ９１９に記載したものに以下 の変更を行なったものであった。組換えワクシニアウィルス、親ＮＹＶＡＣウィ ルス（ｖＰ８６６）による感染および疑似感染を、ベロ細胞ではな（ＲＫ−１３ 細胞に行なった。抗Ｓ２と抗コア抗血清の両方に、ｖＰ８６６感染ＲＫ−１３細 胞を吸着せしめた。

組換えワクシニアウィルスｖＰ９１４の産生ワクシニアウィルス組換え体ＥＢｖ トリブレットｖＰ９４４を産生ずるのに用いた３つのＥＢＶ遺伝子を含有する供 与体プラスミドであるプラスミドＥＢＶトリプル１を、救助ウィルスとして、ワ クシニアウィルス組換え体ＨＢＶトリブレットである、ｖＰ９１９による組換え に用いた。

産生じたウィルス、ｖＰ９４１を、３２ｐ標識ＥＢＶ　ＤＮＡにより同定した。

ｖＰ９４４のように、ｖＰ９４１は、エントモポックスウィルス４２ｋＤａプロ モーターの制御下でＥＢＶ遺伝子を、ワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇ Ｂを、そしてワクシニアＨ６プロモーターの制御下でｇｐ３４０を含有し、全て をワクシニアＴＫ欠損座に挿入した。ｖＰ９１９のように、ｖＰ９４１は、ＡＴ Ｉ欠損座に挿入されたワクシニアＨ６プロモーターの制御下で合成ＨＢＶ　ｓｐ ｓＡｇを、１４Ｌ欠損座に挿入された牛痘Ｕプロモーターの制御下でＨＢＶ　１ ｐｓＡｇを、そしてＨＡ欠損座に挿入された１３Ｌプロモーターの制御下でＨＢ Ｖ　Ｓ１２／コア融解を含有した。組換えワクシニアウィルスｖＰ９４１のゲノ ムの完全性は、ＤＮＡの制限分析により確認された。

ｖＰ９４１によりＨＢＶタンパク質の発現６組（７）ＨＢＶ／ＥＢＶ７クシニア 組換え体ｖＰ９４１により合成された様々なＨＢＶタンパク質をアッセイするた めに、ｖＰ９４１に感染したＲＫ−１３細胞中で合成された代謝的標識タンパク 質および適切な単一、二重および三重のＨＢＶ組換え体に、イムノプレシテーシ ョンを行なった。未感染細胞と、ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）　、ｖＰ８５６　 （ｓｐｓＡｇ）　、ｖＰ８９６　（ｓｐｓＡｇ＋ｌｐｓＡｇ）、ｖＰ９１９　（ ｓｐｓＡｇ＋１ｐｓＡｇ＋ｓ１２／コア）、またはｖＰ９４１に感染した細胞中 のタンパク質を、家つサギ抗Ｓ２抗血清を用いてイムノブレシビテーシジンを行 なった。さらに未感染細胞およびさらにｖＰ９４１、ｖＰ９１９、ｖＰ８５８　 （Ｓ１２／コア）、またはｖＰ８６６に感染した細胞中のタンパク質を、抗コア 抗血清を用いてイムノブレシピテーションを行なった。

抗Ｓ２血清により、ｓｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体ｖＰ ８５６から３３ｋＤａと３６ｋＤａの２つのタンパク質が沈殿する。これらはＨ Ｂｖ　ｐｓｐＡｇの単一と二重にグリコジル化された形状の予期サイズに対応し ている。抗Ｓ２血清により、ｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの遺伝子を含有するワクシ ニア二重組換え体ｖＰ８９６が沈殿する。加えて、１ｐｓＡｇの単一グリコシル 化形状に対応する４２ｋＤａのタンパク質が、４５ｋＤａと４８ｋＤａの大きな タンパク質と同様に沈殿する。ｌｐｓＡｇの未グリコジル化形状に対応する３９ ｋＤａのタンパク質は、グリコジル化形状と比較して少量で沈殿する。抗Ｓ２血 清によりｖＰ８５６とｖＰ８９６から沈殿した全てのタンパク質はまた、ＨＢＶ 三重組換え体ｖＰ９１９およびＨＢＶ／ＥＢＶ６重ｖＰ９４１から沈殿する。ラ ジオオートグラムにおいて、ＨＢＶタンパク質は、ワクシニア組換え体に感染し たＲＫ−１３細胞からの抗Ｓ２によりイムノブレシピテーションせしめられる。

ＨＢＶタンパク質が、同一のワクシニア組換え体（ｖＰ８５６、ｖＰ８９６およ びｖＰ９１９）に感染したベロ細胞からイムノブレシピテーションせしめられる 場合、同一のタンパク質が観察されたが、異なる相対量であった。一般的に、こ れらの組換えワクシニアウィルスにより発現されたｓｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの両 者は、ベロ細胞中よりもＲＫ−１３細胞中でより完全にグリコジル化せしめられ ているように思われる。

ｖＰ８５８に感染したベロ細胞に見られるように、ｖＰＳ５８に感染したＲＫ− １３細胞から抗コア血清により沈殿せしめられた最も豊富なタンパク質は、２７ ｋＤａのサイズを有する。これは、Ｓ１２／コア融解遺伝子が第２の（Ｓ２）Ａ ＴＧで始まる場合に予期される翻訳産生物のサイズに対応する。ベロ細胞のｖＰ ８５８感染後に観察された状況とは異なって、抗コア血清によるイムノブレシピ テーション後のＲＫ−１３細胞のｖＰ８５８感染は、完全Ｓ１２／コア翻訳産生 物に予期される３８ｋＤａのサイズに対応する可視帯とはならない。ＨＢＶ単一 組換え体ｖＰ８５８から抗コア血清により沈殿せしめられた全てのタンパク質ハ マタ、ＨＢＶ三重組換え体ｖＰ９１９とＨＢＶ／ＥＢＶ６重ｖＰ９４１からも沈 殿せしめられる。

実施例１５−狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するＡＬＶＡＣの構成 この実施例は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）と称するカナリヤボックス狂 犬病組換え体の開発およびその安全性並びに効果を記載するものである。

細胞およびウィルス 親カナリヤポックスウィルス（レントシュラー菌株）はカナリヤのワクチン菌株 である。ワクチン菌株を野生型単離体から得て、ひなの胚胎繊維芽細胞の２００ 連続以上の継代により弱毒化した。マスターウィルス種子についてアガーで４連 続のプラーク精製を行ない、１つのプラーククローンを、株ウィルスが後に生体 外組換え試験の親ウィルスとして用いられる５連続の追加の継代により増幅せし めた。プラーク精製カナリヤボックス単離体をＡＬＶＡＣとカナリヤボックス挿 入ベクターの構成 ８８０ｂｐのカナリヤボックスＰｖｕＩＩ断片をｐＵＣ９のＰｖｕ　Ｉ　１部位 の間にクローニングしてｐＲＷ７６４゜５を形成した。この断片の配列を第１６ 図の位置１３７２と２２５１の間に示す。Ｃ５と称する読取り枠の制限を規定し た。読取り枠は、断片内の位置１６６で開始し、位置４８７で終止することを決 定した。読取り枠を妨害することなく、Ｃ５欠損を行なった。位置１６７から位 置４５５の塩基を、配列（配列認識番号１０６）ＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴ ＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＴＴＴと置換した。

この置換配列は、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｓｍａ　ＩおよびＥｃ。

Ｒ１挿入部位を含有し、この後にワクシニアウィルスＲＮＡポリメラーゼにより 認識される翻訳停止および転写終止信号が続く　（ユエンら、１９８７）。Ｃ５ ０ＲＦの欠損を以下に記載するように行なった。プラスミドｐ　ＲＷ７６４゜５ を部分的にＲｓａｌで切断し、線状産生物を単離した。

Ｒｓａｌ線状断片をＢｇｋｌｌで再切断し、今では位置１５６から位置４６２ま までのＲｓａｌからＢｇｌｌｌが欠損したｐＲＷ７６４．５断片を単離して、以 下の合成オリゴヌクレオチドのベクターとして用いた：ＲＷ１４５（配列認識番 号１０７） ＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＧＣＴ’ｒＣＣＣＧＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡ ＧＴＴＴ？ｒＡＴＡＡＡＲＷ１４６（配列認識番号１０８） ＧＡＴＣＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＡ入ＴＴＣＣＣＧＧＧ ＡＡＧＣＴＴＴＴＧ入ＧＡＧＴオリゴヌクレオチドＲＷ１４５およびＲＷ１４６ をアニールして、上述したｐＲＷ７６４．’５Ｒｓ　ａ　ＩおよびＢｇｌＩＩベ クターに挿入した。産生じたプラスミドをｐ　ＲＷ８３１と称する。

狂犬病Ｇ遺伝子を含有する挿入ベクターの構成ｐ　ＲＷ８３８の構成を以下に説 明する。狂犬病ＧのＡＴＧを有するＨ６プロモーターの翻訳開始コドンと重複す るオリゴヌクレオチドＡからＥをｐ　ＲＷ７３７としてｐＵＣ９中にクローニン グした。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Ｎｒｕ　Ｉで始まり、Ｂｇｌｌｌが後 に続く狂犬病ＧのＨｉｎｄｌ１１部位までのＨ６プロモーターを含有する。オリ ゴヌクレオチドＡからＥ（配列認識番号１０９）から（配列認識番号１１３）の 配列を以下に示す：Ａ　（配列認識番号１０９　）　ＣＴＧＡＡＡＴＴＡＴＩ’ ｒＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧ’ｆｆｒＧＴＡＴＣＧＴＡＡ ＴＧＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＩ’ｒＧＴＢ　（配列認識番号１ １０　）　ＣＡＴＴＡＣＧＡ’ｒＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧ ＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＡＴ’ｌ’ｒＣＡＧ Ｃ（配列認識番号Ｉｌｌ　）　ＡＣＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴＴＴＩ’ｒＣＣＧＴＴ ＧＴＧ’ｌ’ｒＴｒＧＧＧＡＡＡＴ’ｒＣＣＣＴＡＴＴｒＡＣＡＣＧＡＴＣＣＣ ＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＧ Ｄ　（配列認識番号１１２　）　ＣＴＧＡＧＡＴＣＴＡＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＧ ＧＡＴＣＧＴＧＴＡｊ講ＴＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＡＣＡ Ｅ　（配列認識番号１１３　）　ｃＡＡｃａａＡＡＡＡＡｃｃｐｈａｙａａａｔ ａｒｈｃ思ｃｐｈａａｈａｈＧＣＣＴＧＡＧＧＡＡＣ アニールしたオリゴヌクレオチドＡからＥのダニアゲラムは以下のとおりである ： Ｂ　Ｅ　Ｄ オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼして、アニールしく５分間９５℃で加熱 し、次いで室温まで冷却せしめる）、ｐＵＣ９のＰｖｕ１１部位の間に挿入した 。産生じたプラスミド、ｐ　ＲＷ７３７をＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩおよびＢｇｌｌｌ で切断し、ｐｔｇ１５５ＰＲｏの１．６ｋｂｐ　Ｈｉｎｄｉ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇｌ　 Ｉ　Ｉ断片のベクター（キニーら、１９８４）として用い、ｐＲＷ７３９を産生 した。ｐｔｇ１５５ＰＲＯＨｉｎｄｌｌＩ部位は、狂犬病Ｇ翻訳開始コドンの８ ６ｂｐ下流にある。Ｂｇｌ　１１はｐｔｇ１５５ＰＲｏ中の狂犬病Ｇ翻訳停止コ ドンの下流にある。ｐ　ＲＷ７３９を部分的にＮｒｕ　Ｉで切断し、Ｂｇｌｌｌ で完全に切断し、前述したＨ６プロモーターの３′末端（ティラーら、１９８８ １ｂ；グオら、１９８９　；パーカスら、１９８９）がら金縁狂犬病Ｇ遺伝子を 含有する１、７ｋｂｐ　Ｎｒｕｌ−Ｂｇｌｌｌ断片をｐ　ＲＷ８２４のＮｒｕ　 １部位とＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。産生じたプラスミドをｐ　ＲＷ８３２ と称する。

ｐ　ＲＷ８２４への挿入は、ＮｒｕｌのＨ６プロモーター５′を加えた。Ｓｍａ 　Ｉが後に続＜ＢａｍＨＩ（７）ｐＲＷ８２４配列は：　ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧ Ｇである。ｐ　ＲＷ８２４は、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターに正確に連 結した非関連遺伝子を含有する。ＮｒｕｌとＢａｍＨＩによる切断は完全にこの 非関連遺伝子を切除した。Ｈ６ブロモートした狂犬病Ｇを含有する１、８ｋｂｐ 　ｐＲＷ８３２Ｓｍａ　Ｉ断片をｐ　ＲＷ８３１のＳｍａ　Ｉに挿入して、プラ スミドｐ　ＲＷ８３８を形成した。

ＡＬＶＡＣ−ＲＧの開発 前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いて、プラスミドｐ　ＲＷ８３８をＡＬＶ ＡＣ感染主要ＣＥＦ細胞に移入した（バニカリら、１９８２；ピッチ一二ら、１ ９８７）。特異的狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて 陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるまで６連続のプラーク精製を行なっ た。次いで１つの典型的なプラークを増幅し、産生じたＡＬＶＡＣ組換え体をＡ ＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）と称した。続いて突然変異しない狂犬病Ｇ遺伝 子のＡＬＶＡＣゲノムへの正確な挿入を配列分析により確認した。

蛍光抗体法 熟成狂犬病ウィルス粒子のアッセンブリの最終段階中に、糖タンパク質成分はゴ ルジ体から血漿膜に運搬され、そこで、細胞膜の外面のタンパク質のバルクと細 胞質中に延びるカルボキシ末端により蓄積する。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ中で発現され た狂犬病糖タンパク質が正確に存在することを確認スルタメニ、ＡＬＶＡＣ＊た はＡＬＶＡＣ−ＲＧＩ：感染した主要なＣＥＦ細胞に、蛍光抗体法を行なった。

前述したように（ティラーら、１９９０）狂犬病Ｇ単りローン性抗体を用いて蛍 光抗体法を行なった。強い表面蛍光がＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したＣＥＦ細胞に 検出されたが、親ＡＬＶＡＣには検出されなかった。

イムノブレシビテーション 主要ＣＥＦ細胞、ベロ細胞（アフリカ緑猿肝臓細胞ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１の系統 ）およびＭＲＣ−５細胞（通常の人の胎児の肺組織ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７Ｉから 誘導した繊維芽細胞状細胞形状）の前形成単層に、放射線標識した）ラメチオニ ンの存在下で親ウィルスＡＬＶＡＣおよび組換えウィルスＡＬＶＡＣ−ＲＧを細 胞あたり１０ｐ　ｆ　ｕで接種し、前述したように処理した（ティラーら、１９ ９Ｇ）。イムノブレシピテーション反応を、狂犬病Ｇ特異的単りローン性抗体を 用いて行なった。約６７ｋＤａの分子量を有する狂犬病特異的糖タンパク質の効 果的な発現を組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧに関して検出した。未感染細胞または親Ａ ＬＶＡＣウィルスに感染した細胞中には、狂犬病特異的産生物は検出されなかっ た。

系列継代実験 非アビアン種の範囲のＡＬＶＡＣウィルスに関する研究において、増殖性感染ま たは顕著な病気はなにも観察されなかった（ティラーら、１９９１ｂ）。しがし ながら、非アビアン細胞中の成長には親または組換えウィルスのいずれも適応で きないことを確証するために、系列継代実験を行なった。

２つのウィルス、ＡＬＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ−ＲＧを、３つの細胞系列におけ る１０連続のブラインド継代に接種した： （１）生後１１日の白のレグホン種のひなから産生された主要ひな胚胎繊維芽細 胞（ＣＥＦ）。

（２）ベロ細胞−アフリカ緑猿肝臓細胞の連続系列（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１）； および （３）ＭＲＣ−５細胞−人間の胎児肺組織から誘導した複相細胞系列（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ１７１）容器２Ｘ１０’の細胞を含有する各細胞系列の３つの６０ｍｍ 皿を用いて、細胞膜たり０．１ｐｆｕのｍ、ｏ、ｉ。

で最初の接種を行なった。ＤＮＡ複製の阻害因子であるシトシンアラビノシド（ Ａｒａ　Ｃ）４０ｐｇ／ｍｌの存在下で１つの皿を接種せしめた。３７℃の１時 間の吸着期間後、接種物を取り出して、単層を洗浄して未吸着ウィルスを除去し た。この時点で、培地を、２つの皿の５ｍｌのＥＭＥＭ＋２％１７）ＮＢＣＳ　 （試料ｔＱおよびｔ７）および第３の４０μｇ／ｍｌのＡｒａ　Ｃを含有する５ ｍｌのＥＭＥＭ−１−２％のＮＢＣＳ　（試料ｔ７Ａ）と置換した。試料ｔｏを 一７０℃で凍結せしめ、残留入力ウィルスの徴候を与えた。試料ｔ７およびｔ７ Ａを３７℃で７日間インキュベートし、その後成分を収穫して感染音波処理によ り細胞を破壊した。

各細胞系列の試料ｔ７の１ｍｌを希釈せずに、同一の細胞系列の３つの皿（試料 ｔｏ、ｔ７およびｔ７Ａを提供する）および主要ＣＥＦ細胞の１つの皿に接種し た。試料ｔｏ、ｔ７およびｔ７Ａを、継代１としての処理を施した。

非アビアン細胞中に存在するウィルスのより敏感な検出のための増幅工程を提供 するために、ＣＥＦ細胞への追加の接種を行なった。

この方法を、１０回（ＣＥＧおよびＭＲＣ−５）＊たは８回（ベロ）の連続した ブラインド継代について行なった。

次いで試料を凍結せしめ、３回溶かし、主要ＣＥＦ単層での滴定によりアッセイ した。

次いで各試料のウィルス産生を、アガロースでのＣＥＧ単層でのプラーク滴定に より測定した。実験の要約結果を表６と７に示す。

その結果により、親ＡＬＶＡＣと組換えＡＬＶＡＣ−ＲＧの両者は、力価を損失 することなくＣＥＦ単層で一様の複製ができることが示されている。ベロ細胞に おいて、ウィルスの水準は、ＡＬＶＡＣの２回の継代およびＡＬＶＡＣ−ＲＧの １回の継代の後に検出水準より低下した。ＭＲＣ−５細胞において、同様の結果 が明確であり、１回の継代後にはウィルスは検出されなかった。表６と７におい て、４回の継代の結果のみを示しているが、一連の結果は、８回（ベロ）および １０回（ＭＲＣ−５）の継代に関して、いずれのウィルスも非アビアン細胞にお ける成長への適応は検出不可能であった。

継代１において、ＭＲＶ−５細胞とベロ細胞のｔ７試料では比較的高い水準ウィ ルスが存在した。しかしながら、この水準のウィルスは、ウィルスの複製が生じ ないシトシンアラビノシドの存在下でインキュベートされたｔＱ試料とｔ７Ａ試 料に見られる水準と等しかった。これにより、非アビアン細胞中の７日で見られ るウィルスの水準は、残留ウィルスを表し、新たに複製されたウィルスは表さな いことが示された。

アッセイをより敏感に行なうために、各細胞系列から収穫した７日の部分を任意 のＣＥＦ単層に接種し、細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）となったときに、またはＣＰ Ｅが不明確な場合は７日後に収穫した。この実験の結果を表８に示す。

任意の細胞系列により増幅後でさえも、ウィルスは２回の追加の継代のＭＲＣ− ５とベロ細胞に検出されたのみであった。これらの結果により、使用した条件下 では、ベロ細胞とＭＲＣ−５細胞にはいずれのウィルス成長も適応しないことが 示された。

マカクの接種 表９に記載したように、４つのＨＩＶ漿陽性（ｓｅｒ。

ｐｏｓｉｔｉｖｅ）ｖカフに最初にＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。１００日後、 これらの動物に再接種し、追加抗原投与効果を測定し、追加の７匹の動物を供給 量を変えて接種した。適切な間隔で血液を採取し、５６℃で３０分間の熱不活性 化後、急速蛍光焦点抑制アッセイ（ＲａｐｉｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｆｏｃ ｕｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｌ　Ａｓ５ａｙ）を用いた抗狂犬病抗体の存在につい て血清を分析した（スミスら、１９７３）。

チンパンジーの接種 ２匹の大人のメスのチンパンジー（５０から６５ｋｇの範囲）に、ｌＸ１０’ｐ ｆｕのｖＣＰ６５を筋向または皮下に接種した。反応に関して動物を監視し、Ｒ ＦＦＩＦＦ−よる抗狂犬病抗体の存在の分析のために規則的な間隔で採血した（ スミスら、１９７３）。最初の接種から１３週間後に等量の供給量で動物を再接 種せしめた。

ネズミの接種 ネズミの群に、５０から１００μｌの範囲のｖＣＰ６５の異なるバッチの希釈物 を接種した。ネズミは足踵で接種した。１４日目に、狂犬病ウィルスの毒性Ｃｖ Ｓ菌株の１５から４３ネズミＬＤ、ｏをネズミに皮肉接種で抗原投与した。ネズ ミの生存を監視し、接種後２８日での保護供給量５０％（ＰＤｓｏ）を計算した 。

イヌとネコの接種 生後４か月の１０匹のピーグル大と生後４か月の１０匹のネコに、ＡＬＶＡＣ− ＲＧを６．７または７．７１ｏｇ＋ｏＴ　ＣＩ　Ｄ　５０で頭蓋内に接種した。

接種後１４日と２８日に動物の採血を行ない、ＲＦＦＩＦＦ−おいて抗狂犬病抗 体を評価した。６．７　ｌ　ｏｇ、ｏＴＣＩＤ５ｏのＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種し た動物に、ワクチン接種後１４日目に、３゜７１ｏｇＨネズミＬＤｓｏ（イヌ） または４．３１０ｇ＋ｏネズミＬＤ、。（ネコ）のＮＹＧＳ狂犬病ウィルス抗原 投与菌株を抗原投与した。

リスサル（ｓｑｕｉｒｒｅｌ　ｍｏｎｋｅｙ）の接種４匹のリスサル（３ａｉｍ ｉｒｉ　５ｃｉｕｒｅｕｓ）の３つの群には、（ａ）ＡＬＶＡＣ，親カナリヤポ ックスウィルス、（ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ、狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組 換え体、または（ｃ）ｖＣＰ３７、ネコ白血病ウィルスのエンベロープを発現す るカナリヤポックスウィルス組換え体の３つのウィルスのうちの１つを接種した 。接種はケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）麻酔により行なった。各動物に同時に： 　（１）乱切することなく右目の表面に２０μｍを；　（２）口に数滴として１ ００μｌを；（３）右腕の外面の毛を剃った皮膚の２か所の皮内注射部位のそれ ぞれに１００μｌを；　（４）右腿の前部筋肉に１００μｌを与えた。

４匹のサルに各ウィルスを接種した。２匹には合計５゜０１０ｇ＋ｏｐｆｕを、 他の２匹には合計７．０１０ｇ＋ｏｌ）ｆｕを接種した。動物から規則的な間隔 で採血し、ＲＦＰＩ試験を用いて抗狂犬病抗体の存在に付いて血清を分析した（ スミスら、１９７３）。ワクチン接種に対する反応について動物を毎日観察した 。最初の接種から６か月後、ＬＡＶＡＣ−ＲＧを受けた４匹のサル、ｖＣＰ３７ を受けた２匹のサル、および最初にＡＬＶＡＣを受けた２匹のサル、並びに１匹 の未接種のサルに、６．５　ｌＯｇ＋ｏｐ　ｆ　ｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを皮下に 接種した。ＲＦＦＩ試験において、狂犬病中和抗体の存在について血清をモニタ した（スミスら、１９７３）。

人細胞系列へのＡＬＶＡＣ−ＲＧの接種異種遺伝子の効果的な発現が、ウィルス が生産的に複製する非アビアン細胞中に得られるか否かを決定するために、１つ のアビアンと４つの非アビアンの５つの細胞型を、ウィルス産生、異種狂犬病Ｇ 遺伝子の発現およびウィルス特異的ＤＮＡ蓄積に関して分析した。接種した細胞 は＝（ａ）ベロ、アフリカ緑サルの肝臓細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ８１　。

（ｂ）ＭＲＣ−５、ヒトの胎児の肺、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１； （Ｃ）ＷＩ　ＳＲヒト羊膜、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ２５　；（ｄ）デトロイト−５３ ２、ヒト包皮、ダウン症候群、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ５４　；および Ｃｅ）主要ＣＥＦ細胞であった。

生後１１日の白レグホンの胚胎から産生されたひな胚胎繊維芽細胞を陽性対照と して含む。全ての接種は、以下に記載するように２Ｘ１０’細胞の前形成単層上 で行なった。

Ａ、ＤＮＡ分析の方法 各細胞系列の３つの皿に、５ｐｆｕ／細胞のウィルスを接種し、未接種の各細胞 系列の余分の１つの皿を容易した。

１つの皿を、４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシド（Ａｒａ　Ｃ）の存在下で インキュベーションした。３７℃での６０分間の吸着期間の後、接種物を除去し 、単層を２回洗浄して未吸着ウィルスを除去した。次いで培地（ＡｒａＣの有無 に関わらず）を置き換えた。皿からの細胞（Ａｒａ　Ｃのない）を時間ゼロ試料 として収穫した。残りの皿を３７℃で７２時間インキュベーションし、その後細 胞を収穫し、ＤＮＡ蓄積を分析するのに用いた。各試料の２×１０６細胞を、４ ０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０、５ｍｌの食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中に再 懸濁せしめ、５分間３７℃でインキュベーションした。４２℃に予熱し、１２０ ｍＭのＥＤＴＡを含有する等容積の１．５％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏 やかに混合した。懸濁をアガロースプラグモールドに運搬し、少なくとも１５分 間硬化せしめた。次いでアガロースプラグを取り出し、そのプラグを完全に覆う 容積の溶菌緩衝液（１％サーコシル、１０Ｑμｇ／ｍｌのプロテイナーゼに、１ ０ｍＭのトリス）ＩＣ１ｐＨ７，５，２００ｍＭのＥＤＴＡ）中において５０℃ で１２−１６時間に亘りインキュベーションした。次いで溶菌緩衝液を５．Ｏｍ ｌのステリル０．　５Ｘ　ＴＢＥ（４４，５ｍＭのトリスホウ酸塩、０．５ｍＭ のＥＤＴＡ）と置き換え、ＴＢＥ緩衝液の３回の交換により４℃で６時間平衡せ しめた。パルスフィールド電気泳動システムを用いて細胞ＲＮＡとＤＮＡからプ ラグ内のウィルスＤＮＡを分画せしめた。０．５Ｘ　ＴＢＥ中で１５℃の５０− ９０秒のランプでの１８０Ｖで２０時間に亘り電気泳動を行なった。ＤＮＡは、 ラムダＤＮＡ分子量標準で展開せしめた。

電気泳動後、ウィルスＤＮＡ帯を、臭化エチジウムで染色することにより視覚化 した。次いでＤＮＡをニトロセルロース膜に運搬し、精製ＡＬＶＡＣゲノムＤＮ Ａから調製した放射線標識プローブでプローブした。

Ｂ、ウィルス産生の評価 入力多重度が０．１ｐｆｕ／細胞であることを除いて、上述したように皿を正確 に接種した。感染の７２時間後、凍結と解凍の３連続のサイクルにより細胞を溶 解せしめた。

ＣＥＦ単層のプラーク滴定により、ウィルス産生を評価した。

Ｃ２狂犬病Ｇ遺伝子の発現分析 皿に１０ｐｆｕ／細胞の多重度で組換えウィルスまたは親ウィルスを接種し、未 感染ウィルス対照としての追加の皿を用意した。１時間の吸着時間後、培地を除 去し、メチオニン不含有培地と置き換えた。３０秒後、この培地を、２５ｕＣｉ ／ｍｌの３５８−メチオニンを含有するメチオニン不含有培地と尾側か得た。感 染細胞を１晩標識しく約１６１間）、次いで緩衝液Ａ溶菌緩衝液の添加により溶 解せしめた。狂犬病Ｇ特異的単りローン性抗体を用いて、前述したようにイムノ ブレシビテーションを行なった。

結果：ウィルス産生の評価 細胞当たり０．１ｐｆｕの接種７２時間後の産生の滴定の評価を表１０に示す。

この結果により、生産的な感染がアビアン細胞においては達成されるが、４つの 非アビアン細胞系においてはこの方法によりウィルスの産生の増大は検出されな かつた。

ウィルスＤＮＡ蓄積の分析 非アビアン細胞中の生産的ウィルス複製に対するブロックが、ＤＮＡ複製の前ま たは後に生じるか否かを決定するために、細胞溶解産物からのＤＮＡを、電気泳 動により分画し、ニトロセルロースに運搬し、ウィルス特異的ＤＮＡの存在下で プローブした。おそらくは放射線標識した＋ＶＡＣＤＮＡプローブ調製における ＣＥＦ細胞ＤＮＡの汚染のために、未感染ＣＥＦ細胞、時間ゼロでのＡＬＶＡＣ −ＲＧ感染ＣＥＦ細胞、感染から７２時間後（７）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ 細胞および４０μｇ／ｍ１のシトシンアラビノシドの存在下での感染から７２時 間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥＦ細胞からのＤＮＡは全て、バックグラウンド 活性を示した。しかしながら、感染から７２時間後のＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ＣＥ Ｆ細胞は、ＡＬｖＡＣ特異的ウィルスＤＮＡ蓄積を示す約３５０ｋｂｐの領域に 強い帯を示した。培地がＤＮＡ合成抑制因子、シトシンアラビノシドの存在下で インキュベーションされる場合には、そのような帯は検知不可能である。ベロ細 胞中で産生された等量の試料は、時間ゼロでのＡＬＶＡＣ−ＲＧ感染ベロ細胞に おいて約３５０ｋｂｐでは非常にわずかな帯を示した。この水準は、残留ウィル スを示す。ウィルス後代の増大とはならないベロ細胞に生じたウィルス特異的Ｄ ＮＡ複製の水準を示す帯の強度は、感染７２時間後に増幅された。ＭＲＣ−５細 胞中に産生された等量の試料により、この細胞系列におけるこれらの条件下では ウィルス特異的ＤＮＡ蓄積が検出されないことが示された。次いでこの実験を、 追加のヒト細胞系列、特にＷＩＳＨおよびテトロイト−５３２細胞を含むまでに 広げた。ＡＬＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞は、陽性対照として作用した。ＡＬＶＡＣを 接種したＷＩ　ＳＨまたはデトロイト細胞においてはウィルス特異的ＤＮＡ蓄積 は生じなかった。この方法の検出限界は完全に確認され、ういる（　ＤＮＡ蓄積 が生じるが、方法の感度より低い水準である。ウィルスＤＮＡ複製が３チミジン 含有により測定された他の実験は、ベロ細胞とＭＲＶ−５細胞に得られた結果を 支持する。

狂犬病遺伝子発現の分析 ウィルス遺伝子発現、特に挿入された異種遺伝子の発現が、ウィルスＤＮＡ複製 のないヒト細胞系列でさえ生じるか否かを決定すルタめに、ＡＬＶＡＣとＡＬＶ ＡＣ−ＲＧに感染したアビアンと非アビアン細胞の３５メチオニン標識溶解産物 にイムノブレシピテーションを行なった。狂犬病Ｇ特異的単りローン性抗体を用 いたイムノブレシピテーションの結果は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに感染したＷＩ　Ｓ Ｈおよびデトロイト細胞、ＣＥＦ、ベロおよびＭＲＶ−５細胞中の６７ｋＤａ糖 タンパク質の特異的イムノブレシビテーションを説明した。未感染、および親感 染細胞溶解産物のいずれにもそのような特異的狂犬病遺伝子産生物を検出されな かった。

この実験の結果により、分析したヒト細胞系列において、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ組換 え体は感染を開始し、Ｈ６初期／晩期ワクシニアウィルスプロモーターの転写制 御下で異種遺伝子産生物を発現できるけれども、複製はＤＮＡ複製をとはならず 、または検出可能なウィルス後代は産生されなかった。ベロ細胞において、ある 水準のＡＬＶＡＣ−ＲＧ特異的ＤＮＡ蓄積が観察されたが、これらの方法によっ てはウィルス後代は検出されなかった。これらの結果により、分析したヒト細胞 系列において、ウィルス複製に対するブロックは、ＤＮＡ複製の着手の前に生じ 、一方ベロ細胞においてはブロックはウィルスＤＮＡ複製の着手の後に生じる。

ＡＬＶＡＣ−ＲＧに発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性であるか否かを決 定するために、多くの動物種を組換え体の接種により試験した。現在の狂犬病ワ クチンの硬化は、ネズミモデルシステムにおいて評価される。それゆえ、同様の 試験をＡＬＶＡＣ−ＲＧを用いて行なった。１ｍ１当たり６，７から８．４　ｌ 　ｏ　ｇ　ｒｏＴ　ＣＩ　Ｄ　５６の範囲に亘る感染力価を有する９つの異なる ウィルスの調製物（種子ウィルスの１０連続の組織培地継代後に産生された１つ のワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を連続的に希釈し、生後４から６週間のネズミ の足蹟に５０から１００μｌの希釈物を接種した。１４日後に、対照ネズミ群の 致死率滴定により決定されるような１５から４３ネズミＬＤ、、を含有する狂犬 病ウィルスのＣｖＳ菌株３００μｌをネズミに頭蓋内経路により抗原投与した。

ＰＤｓｏ（保護的供給量５０％）として表される効力は、抗原投与１４日後に計 算した。実験結果を表１１に示す。結果により、ＡＬＶＡＣ−ＲＧは、平均値が ３．７３　（ＳＴＤｏ、４８）である３、３３から４．５６に亘るＰＤ、、値で の狂犬病ウィルス抗原投与に対して矛盾なくネズミを保護することができたこと が示された。この研究の延長として、おすのネズミに、６．０１゜ｇ　ｒｏＴ　 ＣＩ　Ｄ　ｓｏのＡＬＶＡＣ−ＲＧを含有する５０μｌのウィルスまたは等容積 の未感染細胞懸濁液を頭蓋内で接種した。ネズミを接種から１．３および６日後 に乱切し、ネズミの脳を取り出し固定して切り分けた。組織病理学的実験により 、ネズミのＡＬＶＡＣ−ＲＧの神経毒性の証拠は見られなかった。

イヌとネコのＡＬＶＡＣ−ＲＧの安全性と効果を評価するために、生後１４．５ か月のピーグル犬と生後１４．４ネコの群を分析した。各種において４匹をワク チン接種しなかった。５匹の動物に６．７１ｏｇ□。ＴＣＩＤ、。を皮下に接種 し、５匹の動物に７．７のｌｏｇｌ。ＴＣＩＤ、。を同一経路で接種した。抗狂 犬病抗体についての分析のために、動物から採血した。接種しなかった、または ６．７１ｏｇ＋　ｏ　Ｔ　ＣＩ　Ｄ　ｓｏのＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物に 、ワクチン接種から２９日後に、３，７１０ｇ＋ｏネズミＬＤ、。

（イヌ、こめかみの筋肉に）または４．３１ｏｇ、。ネズミＬＤｓｏ（ネコ、首 に）のＮＹＧＳ狂犬病ウィルス抗原投与菌株を抗原投与した。この実験結果を表 １２に示す。

いずれの接種ウィルスの供与量のネコまたはイヌにも接種に対して副作用は見ら れなかった。６．　７　ｌ　ｏ　ｇ＋。ＴＣＩＤｓｏで免疫化した５匹のうち４ 匹のイヌがワクチン接種から１４日後に抗体力価を有し、全てのイヌが２９日後 には力価を有した。全てのイヌは、４匹のうち３匹の対照を殺した抗原投与から 保護された。ネコにおいて、６．７１０　ｇ　ｒｏＴ　ＣＩ　Ｄ５゜で免疫化し た５匹のうち３匹のネコは、１４日後に特異的抗体力価を有し、全てのネコが２ ９日後には陽性であったが、平均抗体力価は２．９１Ｕと低かった。５匹のうち ３匹のネコが、全ての対照を殺した抗原投与にも生き残った。７．７１ｏｇ、。

ＴＣＩＤ、。で免疫化した全てのネコが１４日後に抗体力価を有し、２９日後の 幾何学平均力価は８．１国際車位として計算された。

ＡＬＶＡＣ，ＡＬＶＡＣ−ＲＧおよび未関連カナリヤホックスウィルス組換え体 による接種に対するリスサル（Ｓａｉｍｉｒｉ　５ｃｉｕｒｅｕｓ）の免疫応答 を実験した。

サルの群に上述したように接種を行ない、狂犬病特異的抗体の存在に関して血清 を分析した。皮肉経路による接種に対するわずかな典型的な皮膚反応を別にして 、どのサルにも副作用は見られなかった。皮肉接種から２および４日後のみに、 少量の残留ウィルスを皮膚の傷から単離した。全ての種が７日後以降に陰性であ った。筋向注射に対する局部的な反応は見られなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧを接 種した４匹全てのサルは、ＲＦＦＩ試験に測定された抗狂犬病血清中和抗体を発 達せしめた。最初の接種から約６か列後に、全てのサルと１匹の追加の純粋なサ ルに、皮下経路により、６−　５１０　ｇ　＋ｏＴ　ＣＩ　Ｄ５ｏのＡＬＶＡＣ −ＲＧを左腿の外面に再接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した 。結果を表１３に示す。

狂犬病を未経験な５匹のサルのうち４匹が、ＡＬＶＡＣ−ＲＧの感染から７日後 に免疫学的応答を発達せしめた。

接種から１１日後には５匹全てのサルが検知可能な抗体を有した。狂犬病等タン パク質に以前に露出した４匹のサルのうち全てが、ワクチン接種後３から７日の 間に血清中和力価に著しい増大を示した。その結果により、ＡＬＶＡＣｐＲＧに よるリスサルのワクチン接種は、簡単の側面効果を与えず、主要な抗体応答が誘 発せしめられたことが示される。アムナネスティック（ａｍｎａｎｅｓｔｉｃ） 応答もまた再ワクチン接種により誘発せしめられる。ＡＬＶＡＣまたは未関連異 種遺伝子を発現するカナリヤボックス組換え体への事前の露出は、再ワクチン接 種により抗狂犬病免疫応答の誘発を妨害しない。

ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（７）接種に対すルＨＩ　Ｖ−２漿陽性マカクの免疫学的応答 を評価した。上述したように動物を接種し、ＲＦＦＩ試験において抗狂犬病血清 中和抗体の存在を評価した。表１４に示した結果により、皮下経路により接種し たＨＩＶ−２陽性動物は、１回の接種から１１日後に抗狂犬病抗体を発達せしめ た。最初の接種から約３が列後に与えられた追加抗原投与の接種後に既往反応が 検知された。口頭経路により組換え体を接種した動物にはどのような反応も検知 されなかった。加えて、一連の６匹の動物に、筋向または皮下経路のいずれかに より与えたＡＬＶＡＣ−ＲＧの減少した供給量を接種した。接種した６匹のうち ５匹の動物は、ワクチン接種間から１４日後にそれほど違わない抗体力価で反応 した。

ＨＩＶに事前に露出した２匹のチンパンジーに、皮下または筋向経路により７． 　０　ｌｏｇ、、ｐ　ｆ　ｕのＡＬＶＡＣ−ＲＧを接種した。接種から３か列後 、両方の動物は各様式で再ワクチン接種した。結果を表１５に示す。

皮下または筋向経路のいずれの経路によっても、接種に対して副作用は示されな かった。両方のチンパンジーは、１４日後に最初の接種に反応し、強く上昇する 反応が再ワクチン接種後に検知された。

表　６ アビアン細胞および非アビアン細胞におけるＡＬＶＡＣの系列継代口よ　３旦　 瓜につ 継代１ 試料　ｔｏ”　２　、４　３　、０　２　、６ｔ７ｂ７．０　１．４　０．４ ｔ７Ａｃ１．２　１．２　０．４ 継代２ 試料　ｔｏ　５．０　０．４　Ｎ、Ｄ、’ｔ７　７．３　０．４　Ｎ、Ｄ。

ｔ７Ａ　３．９　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

継代３ 試料　ｔｏ　５．４　０．４　Ｎ、Ｄ。

ｔフ　°　フ、４　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｔ７Ａ　３．８　Ｎ、Ｄ＋　Ｎ、Ｄ。

継代４ 試料　ｔｏ　５．２　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｔ７　フ、ｉ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｔ７Ａ　３．９　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ａ：この試料は０時間で収穫し、残留入力ウィルスを示す。力価を１１当たりの １０ｇ＋ｏ　ｐｆｕで示す。

ｂ：この試料は感染から７日後に収穫した。

Ｃ：の試料は４０ｍｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下で接種し、感染か ら７日後に収穫した。

ｄ：検出不可能。

表　７ 試料　ｔｏ”　３．０　２．９　２．９ｔ７ｂ７．１　１０　１．４ ｔ７ＡｃＬ８　１．４　１．２ 継代２ 試料　ｔｏ　５．１　０．４　０．４ ｔ７　７．１　Ｎ、Ｄ、’　Ｎ、Ｄ。

ｔ７Ａ　：１．８　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

継代３ 試料　ｔｏ　５．１　０．４　Ｎ、Ｄ。

ｔ７　７．２　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｔ７Ａ　３．６　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

継代４ 試料　ｔｏ　５．Ｉ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｔ７　７．ＯＮ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｔ７Ａ　４．ＯＮ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ ａ：この試料は０時間で収穫し、残留入力ウィルスを示す。力価を１ａ＋ｌ当た りの１０ｇ＋ｏ　ｐｆｕで示す。

ｂ：この試料は感染から７日後に収穫した。

Ｃ：の試料は４０ｍｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下で接種し、感染か ら７日後に収穫した。

ｄ；検出不可能。

表　８ ＣＥＰ細胞中の継代による残留ウィルスの増幅ＣＥＦ　べＯＭＲＣ−５ ａｌＡＬＶＡＣ 継代２”　７．０ｂ６．０　５．２ ３　７．５　４．１　４．９ ４　７．５　Ｎ、Ｄ、ｃ　Ｎ、Ｄ。

５　７．１　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

ｂ）ＡＬＶＡＣ−ＲＧ 継代２”　？、２　５．５　５．５ ３　７．２　５．０　５．１ ４　７．２　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

５　’Ｌ２　Ｎ、Ｄ、　Ｎ＋Ｄ。

ａ、継代２は、継代１からの７日の試料のＣＥＰ細胞における増幅を示す。

ｂ、力価を１１当たりのｌｏｇ、。ｐｆｕで示す。

ｃ、＠山王可能。

表　９ 動　物　接　種 １７ＢＬ　第１：舌による　Ｉ　Ｘ　１０８ｐｆｕのｖｃＰ６５第２：ＳＣ経路 によるＩ　Ｘ　１０’　ｐｒｕのｖＣＰ６５と１×１０７ｐｆｕのｖＣＰ８２” １８５Ｌ　第１＝舌による　Ｉ　Ｘ　１０’　ｐｆｕのｖｃＰ６５第２：ＳＣ経 路によるＩ　Ｘ　１０７ｐｆ’ｕのｖｃＰ８５とｌＸｌ０’ｐｆｕのｖＣＰ８２ １７７Ｌ　第１：ＳＣ経路による５ＸｌＯ’ｐｆｕのｖｃＰ６５第２：ＳＣ経路 によるＩ　ＸＩＯ’　ｐｆｕのｖｃＰ６５と１×１０７ｐｆｕのｖＣＰ８２ １８６Ｌ　第１：ＳＣ経路による５　ｘ　１０’　ｐｒｕのｖｃＰ６５第２：Ｓ Ｃ経路によるＩ　Ｘ　１０’　ｐｆｕのｖＣＰ８５と１×１０７ｐｆｕのｖｃＰ ８２ １７８Ｌ　第１：ＳＣ経路によるＩ　ＸＩＯ’　ｐｆｕのｖｃＰ６５１Ｂ２Ｌ　 第１：１Ｍ経路によるＩ　ＸＩＯ”　ｐｆｕのｖｃＰ８５１７９Ｌ　第１：ＳＣ 経路によるＩ　Ｘ　１０６ｐｒｕのｖｃＰ８５１８３Ｌ　第１：１Ｍ経路による Ｉ　Ｘｌ０６ｐｆｕのｖｃＰ６５１１１（ＩＬ　第１：ＳＣ経路によるＩ　Ｘｌ ０６ｐｆｕのｖｃＰ８５１８４Ｌ　第１＝ＩＭ経路によるＩ　ＸＩＯ’　ｐｆｕ のｖＣＰ［１５１８７Ｌ　第１＝経口による　Ｉ　ＸＩＯ’　ｐｆｕのｖＣＰ６ ５ａ：ｖＣＰ８２は、麻疹ウィルス融と血球凝集素遺伝子を発現するカナリアポ ックスウィルス組換体 表　ｌＯ 試料時間 細胞の種類　ｔｏ　ｔ７２　ｔ７２Ａｂ実験Ｉ ＣＥＦ　３．３’　７．４　１．７ ベロ　３．０　１．４　１．７ ＭＲＣ−５３，４２＋０　１．７ 実験２ ＣＥＦ　２＋９　７．５　＜Ｌ７ ＷＸＳＨ３＋３　２．２　２．０ デトロイト−５３２２，８Ｌ７　＜Ｌ７ａ、１１当たりのｌｏｇ、。ｐｆｕで表 した力価す、４０μｇ／ｍｌのシトシンアラビノシドの存在下でインキュベート した培地表　１１ 試　験　抗原投与供給量・　ＰＤ５゜′最初の種子　４３　４．５６ 主要な種子　２３　３．３４ ワクチンバツチＨ２３４，５２ ワクチンバツチ！　２３　１３３ ワクチンバツチＫ　１５　３．６４ ワクチンバツチＬ　１５　４．０３ ワクチンバッチＭ　１５　３．３２ ワクチンバツチＮ　１５　３．３９ ワクチンバツチＪ３・４２ ａ：ネズミＬＤ、。とじて表す ｂ：　ｌｏｇ＋ｏＴ　ＣＩ　Ｄ５ｏとして表す表　１２ イヌとネコにおけるＡＬＶＡＣ−ＲＧの効果供給量　抗体“　生存″　抗体生存 ６．７　１１．９　５１５　２．９　３７５７．７　１０．Ｉ　Ｎ、Ｔ、　８． １　Ｎ、Ｔ。

ａ：国際単位の幾何学平均力価で表した接種から２９日後での抗体ｂ：抗原投与 した動物の生存率として表した表　１３ カナリヤボックス組換え体を接種したリスサルの抗−狂犬病血清学応答Ｉ　事前 の露出−１９６ｂＯコ　７　１１　２１　２Ｂ２Ｚ　ＡＬＶＡＣ’　Ｎ’ｒｇ　 ＜１．２　＜Ｌ２　（Ｌ２　２．１　２．３　２．２５１　ＡＬＶＡＣ’″　ｎ 　＜１２　＜Ｌ２　１．７　２．２　２．２　２．２コ９　ｖＣＰコア’　ＮＴ 　＜１．２　＜１．２　１．）　２．１　２．２　Ｎ、？、９５５　ｖＣＰコア ’　ＮＴ　＜１．２　＜１．２　Ｌフ　２．２　２．Ｉ　Ｎ、Ｔ。

コア　ＡＬＶＡＣ−ＲＧ＠　２．２　＜Ｌ２　＜１．２　３．２　３．５　３． ５　３．２５３　ＡＬＶＡＣ−ＲＧ”２．２　＜１．２　＜１２　３．６　３． ６　３．６　３．４３８　ＡＬＶＡＣ−ＲＧ’２．７　＜１．７　＜１．７　３ ．２　３．８　３．６　Ｎ、？。

５４　ｋＬＶｋｃ−ＲＧ’３．２　＜１．７　＜１．５　３．６　４．２　４． ０　コ、６５７　無　にＴ　＜１２　＜１．２　１．フ　２．フ　２＋７　２． コａ９表示した日数においてＲＰＦ　ｌ試験により測定し、国際単位で表したす ０日−１９６は、最初のワクチン接種から２８日後の血清を示すＣ，５，ＯＩＯ ｇ＋ｏ　ＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣを接種した動物ｄ、５．ＯＩＯｇ＋ｏ　ＴＣ ＩＤ５０のｖｃＰ３７を接種した動物ｅ、５．ＯＩＯｇ＋ｏ　ＴＣＩＤｓｏのＡ ＬＶＡＣ−ＲＧを接種した動物ｆ、７．０　１０ｇ＋ｏ　ＴＣＩＤ５０のＡＬＶ ＡＣ−ＲＧを接種した動物ｇ、試験せず 表　１４ ５５　３２　３２　コ２　１６　− 表　１５ チンパンジーの＾ＬＶＡＣ−ＲＧによる接種１２ｂ１０　１６　８ １３／ｌ　１２８ ａ：ＲＰＰＩ試験における蛍光阻害を示す最終希釈の逆数として示した力価・。

ｂ：再接種の日 実施例１６−フラビウイルスタンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体の構成 この実施例は、日本脳炎ウィルス（ＪＥＶ）、黄熱病ウィルス（ｙｖ）および１ 型デング熱がらの遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ供与体プラスミドの構成、対応Ｎ ＹＶＡＣフラビウイルス組換え体の単離、および相同ウィルスによる致死抗原投 与に対してネズミを保護するＪＥＶまたはＹＦのゲノムの部分を発現するワクシ ニア組換え体の能力を記載している。

細胞系列およびウィルス菌株 ワクシニアウィルスｖＰ４１０のコペンハーゲン菌株のチミジンキナーゼ変異体 （グオら、１９８９）を用いて組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７お よびｖＰ８６４を産生した（下記参照）。ｖＰ５５５の産生は以前に記載してい る（メイソンら、１９９１）。ＦＢＳと抗生物質を補給したイーグルス最小限基 礎培地中に３７℃で成長せしめられたヘラ（ＨｅＬａ）細胞を用いて生合成研究 を行なった。

全ての生体外実験で用いたＪＥＶウィルスは、ＪＥｖのナカヤマ菌株の継代５５ 哺乳ネズミ脳懸濁液に感染したｃ６／３６から調製した浄化培養液体であった（ メイソン、１９８９）。ＪＥＶの高度病原Ｐ３菌株を用いて動物抗原投与実験を 行なった（下記参照）。

ＪＥＶ遺伝子のワクシニアウィルス供与体プラスミド中へのクローニング ＪＲＶワクシニア組換えウィルスを構成するのに用いたＪＥＶ　ｃＤＮＡは、Ｊ ＥＶのナカヤマ菌株から誘導した（マックアダら、１９１ｉ７）。

ｐＵＣ８のＳｍａ　ＩとＥｃｏＲ１部位にＪＥＶ　ｃＤＮＡ（ヌクレオチド−２ ８から１０００）を含有するプラスミドｐＤｒ２０をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで 切断し、ＪＥＶ　ｃＤＮＡ挿入物をｐ　Ｉ　Ｂ　！　２５　（ＣＴ、　＝ユーハ ブン、インターナショナルバイオテクノロジーズ社）中にクローニングしてプラ スミドＪＥＶ１８を産生じた。ＪＥＶ１８をＪＥ配列（ヌクレオチド２３）内の ＡｐａＩとｐｌＢＩ２５内のＸｈｏｌで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチ ドＪ９０（配列認識番号１１４）およびＪ９１（配列認識番号１１５）（Ｘｈｏ ｌ粘着末端、Ｓｍａ　１部位、およびＪＥヌクレオチド１から２３を含有する） と連結し、プラスミドＪ　ＥＶＩ　９を産生じた。ＪＥＶ１９をｐｌＢ！２５内 のＸｈｏｌとＪＥ配列（ヌクレオチド６０２）内のＡｃｃｌで切断し、産生じた ６１３ｂｐ断片を、プラスミド起点と、カルボキシ末端４０％ｐｒＭおよびＥの ３分の２のアミノ末端（ヌクレオチド６０２から２１２４）をコードするＪＥＶ 　ｃＤＮＡとを含有するＪ　ＥＶ２のＸｈｏｌとＡｃｃｌ断片（メイソンら、１ ９９１）中にクローニングし、ＣのＡＴＧからＥの最後の３分の１に発見された Ｓａｃ、Ｉ部位（ヌクレオチド２１２４）のＪＥ配列を含有するプラスミドＪ　 ＥＶ２０を産生じた。

ＴＴＴＴＴＧＴヌクレオチド１３０４から１３１０がＴＣＴＴＴＧＴに変更せし められ、Ｅの最後の３分の１からＮ５２Ｂの最初の２つのアミノ酸（ヌクレオチ ド２１２４から４１２６）までのＪＥ配列、プラスミド起点およびワクシニア配 列を含有するＪＥＶ８からのＳｍａｌ−ＳａｃＩ断片をＪ　ＥＶ２０からの精製 ＳｍａＩ−８ａｃＩ挿入物に連結し、ＪＥＶ２２−１を産生じた。オリゴヌクレ オチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発（マンデツキ、１９８Ｂ）を用いて、ＪＥ Ｖ２２−１を構成するのに用いたユニークＳｍａ１部位に対応する６ｂｐを除去 し、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンに先立つＪＥＶ２４を産生じた。

プラスミドＪＥＶ７（メイソンら、１９９１）をＪＥ配列内の５ｐｈＩ　（ヌク レオチド２１８０）とＩ　Ｂ　Ｉ　２４内のＨＬｎｄＩＩＩで切断した。アニー ルしたオリゴヌクレオチドＪ９４とＪ９５　［５ｐｈＩ粘着末端、翻訳停止、ワ クシニア初期転写終止信号（ＴＴＴＴＴＡＴ　、ユエンら、１９８７）翻訳停止 、ＥａｇＩ部位およびＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端を含有する］への連結により、Ｅ の最後の３分の１のＳａｃ１部位（ヌクレオチド２１２４）からＥのカルボキシ 末端に亘るＪＥ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶ２５が産生された。ＪＥ Ｖ２５からのＳａｃＩ−Ｅａｇｌ断片をＪＥＶ８のＳａｃｌ−ＥａｇＩ断片（１ ５ａａＣＳｐｒＭおよびＥヌクレオチド３３７から２１２４の３分の２のアミノ 末端をコードするＪＥ　ｃＤＮＡ、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有 する）に連結し、プラスミドＪＥＶ２６を産生じた。ＡＴＧ開始コドンを先行す るユニークＳｍａ　１部位を上述したように除去し、Ｈ６プロモーターが直接Ａ ＴＧ開始コドンを先行するＪＥＶ２７を産生じた。

オリゴヌクレオチドＪ９６、Ｊ９７、Ｊ９８およびＪ９９（Ｓｐｈｌ粘着末端を 有するＪＥヌクレオチド２２４３から２３８０を含有する）をキナーゼし、アニ ールし、ＳｍａＩ−８ｐｈｌ切断してアルカリ性ホスファターゼ処理したｐｌＢ Ｉ２５に連結し、プラスミドＪ　ＥＶ２８を産生じた。ＪＥＶ２８をＪＥ配列内 のＨｐａｌ（ヌクレオチド２３０１）とｐＩＢＩ２５配列内のＨｉｎｄｌ　Ｉ　 Ｉで切断し、アルカリ性ホスファターゼ処理した。ＪＥＶｌがらのＨｐａｌ−Ｈ ｉｎｄｌＩＩ断片またはＪＥＶ７がらのＨｐａｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片（メイソ ンら、１９９１）への連結により、ＪＥＶ２９　（Ｓｍａ　１部位とそれに続く 、３０ａａＥＳＮＳＩ、Ｎ５２Ａ、ヌクレオチド２２９３がら４１２６をコード するＪＥ　ｃＤＮＡを含有する）およびｊｅｖ３０（Ｓｍａ１部位とそれに続＜ ３０ａａＥ％ＮＳＩ、Ｎ５２Ａ、、Ｎ５２Ｂ、ヌクレオチド２２９３がら４５１ ２をコードするＪＥ　ｃＤＮＡを含有する）を産生じた。

ＪＥＶ２９からのＳｍａＩ−ＥａｇＩ断片をＳｍａｌ−してＪ　ＥＶ３１を産生 じた。ＪＥＶ３１を産生するのに用いたユニークＳｍａ　１部位に対応する６ｂ ｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモーターが直接ＡＴＧ開始コドンを先行 するＪＥＶ３３を産生じた。

ＪＥＶ３０がらのＳｍａｌ−ＥａｇＩ断片をＳｍａｌ−ＥａｇＩ切断したｐＴＰ １５と連結してＪＥＶ３２を産生じた。ＪＥＶ３２を産生するのに用いたユニー クＳｍａ　１部位に対応する６ｂｐを上述したように除去して、Ｈ６プロモータ ーが直接ＡＴＧ開始コドンを先行するＪＥＶ３４を産生じた。オリゴヌクレオチ ドＪ９０（配列認識番号１１４）　、Ｊ９１　（配列認識番号１１５）　、Ｊ９ ４　（配列認識番号１１６）、Ｊ９５　（配列認識番号１１７）、Ｊ９６と１９ ７（配列認識番号１１８）およびＪ９９とＪ９８（配列認識番号１１９）を以下 に示す：ワクシニアウィルスＪＥＶ組換え体の構成プラスミドＪＥＶ２４、Ｊ　 ＥＶ２７、ＪＥＶ３３およびＪＥＶ３４をｖ　Ｐ４１０感染細胞に移入して、そ れぞれワクシニア組換え体ｖＰ８２５、ｖＰ８２９、ｖＰ８５７およびｖＰ８６ ４を産生した（第１８図）。

生体外ウィルス感染および標識材は ヘラ細胞単層を３５ｍｍの直径の皿に調製し、放射線標識付けの前にワクシニア ウィルス（細胞当たり２ｐｆｕのｍ、ｏ、ｔ、）またはＪＥＶ（細胞当たり５ｐ ｆｕのｍ。

ｏ、ｉ、）に感染せしめた。細胞を”Ｓ−Ｍｅｔを含有する培地で瞬間標識し、 メイソンらに記載されたように（１９９１）正確に過剰の未標識Ｍｅｔの存在下 で６時間追跡した。

ラジオイムノブレシビテーション、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびエ ンドグリコシダーゼ処理放射線標識細胞溶解産物と培地液体を収穫し、ウィルス タンパク質をイムノブレシビテーションし、エンドグリコシダーゼで切断し、メ イソンにより記載されているように（１９８９）　ＳＤＳ含有ポリアクリルアミ ドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で分離した。

動物保護実験 メイソンらにより記載されているように（１９９１）　、ネズミ保護実験を正確 に行なった。手短に言うと、生後３週間のネズミの群を、１０’ｐｆｕのワクシ ニアウィルス組換え体で腹腔内（ｉｐ）注射により免疫化せしめ、３週間後に血 清を選択したネズミから集積した。次いでネズミに組換えウィルスを再接種せし めるか、またはＪＥＶのＰ３菌株に感染した哺乳ネズミ脳の懸濁液を腹腔内によ り１．３Ｘ１０’ＬＤ５゜で抗原投与した。３週間後、追加免疫した動物をレブ ル（ｒｅｂｌｅｄ）Ｌ、４．９Ｘ１０’　ＬＤ、。

のＪＥＶのＰ３菌株で抗原投与した。抗原投与に続いて、３週間に亘り毎日ネズ ミを観察し、実験動物の同腹兄弟を用いて各抗原投与実験において致死救急量滴 定を行なった。

加えて、抗原投与後４週間後の全ての生存した血清集積した。

組換えウィルスの免疫応答 メイソンらに記載されたよう（１９９１）に正確に　３５５−Ｍｅｔ標識ＪＥＶ 感染細胞から得た培養液体または洗浄剤処理細胞溶解産物からのＪＥＶタンパク 質を沈殿せしめる能力に関して血清を試験した。ＮＥＵＴ試験においてカルボキ シメチルセルロースを重るい培地に用いたことを除いてメイソンらに記載された よう（１９９１）に、血球凝集素阻害（ＨＡＩ）および中和（ＮＥＵＴ）試験を 行なった。

組換えワクシニアウィルスの構造 ＣからＮ５２Ｂに亘るＪＥＶ暗号領域の部分を発現した４つの異なるワクシニア 組換え体（ＨＡ座における）を構成した。これらの組換えウィルス中に含有され たＪＥＶｃＤＮＡ配列を第１８図に示す。４つの組換えウィルス全てにおいて、 ＪＥＶ　ｃＤＮＡの感覚鎖はワクシニアウィルス初期／晩期Ｈ６プロモーターの 背後に位置し、翻訳はウィルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置する自然発生ＪＥ ＶＭｅｔコドンから開始されると予期された。

組換え体ｖＰ８２５は、カプシドタンパク質、構造タンパク質前駆体ｐｒｙ、構 造糖タンパク質Ｅ１非構造糖タンパク質ＮＳＩ、および非構造タンパク質Ｎ５２ Ａをコード下（マツクエイダら、１９８７）。組換え体ｖＰ８２９は、ｐｒＭの アミノ末端に先行する推定１５ａａ信号配列、ｐ「ＭおよびＥをコードした（マ ツクエイダら、１９８７）。組換え体ＶＰ８５７は、Ｅの３０ａａ疎水性カルボ キシ末端、した。組換え体ｖＰ８６４は、ｖＰ８５７と同様のタンパク質と追加 にＮ５２ＢをコードするｃＤＮＡを含有した。

組換え体ｖＰ８２５とｖＰ８２９において、Ｅ中の潜在的なワクシニアウィルス 初期転写終止信号（ＴＴＴＴＴＧＴ。

ヌクレオチド１３０４−１３１０）を、ａａ配列を変更することなくＴＣＴＴＴ ＧＴに変更した。この配列は生体外転写アッセイにおける転写終止を増大するの が示されているので、Ｅの発現の水準を増大せしめるためにこの変更を行なった （ユエンら、１９８７）。

組換えワクシニアウィルスにより発現される場合には、ＥおよびｐｒＭは正確に 処理される 瞬間標識実験により、Ｅとサイズが同一のタンパク質が、Ｅ遺伝子を含有する全 ての組換えワクシニアウィルスに感染した細胞中で合成されたことが示された（ 表１６）。ＪＥＶ、ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞において、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ中で遅く移動したＥタンパク質はまた、感染細胞から収穫された培 養液体中にも観察された（表１６）。ＪＥＶおよびｖＰ５５５感染細胞により産 生されたＥの細胞外形状は、ｖＰ８２９感染細胞により産生されたＥの細胞外形 状に確認されるように、熟成したＮ連結グリカンを含有した（メイソン、１９８ ９；メイソンら、１９９１）。興味のあることに、ｐｒＭとＥに加えてＣ暗号領 域を含有したｖＰ８２５は、細胞外液体中に放出されない形に特有なＭＡｂを用 いた放射線標識組換えワクシニア感染細胞から調製したイムノブレシピテーショ ンにより、ｐｒＭはｖＰ５５５、ｖＰ８２５、およびｖＰ８２９に感染した細胞 中で合成され、ＭはｖＰ５５５またはｖＰ８２９に感染した細胞の培養液体中に 検出されたことが分かった（表１６）。

ｖＰ５５５およびｖＰ８２９に感染した細胞から収穫した細胞外液体は、ｖＰ４ １０、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７またはｖ　Ｐ　８６４に感染した細胞の培養液体 には検出されなかったＨＡ活性を含有した。このＨＡは、抗ＪＥｖ抗体とそのｐ Ｈ最適条件によるその阻害に基づいてＪＥＶ感染細胞中に産生されたＨＡと同一 であるように思われた（メイソンら、１９９１）。ワクシニアウィルスＪＥＶＡ ｆｔ換え体ｖＰ８２９、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細 胞からの培養液体に関してショ糖密度勾配を調製した。勾配の分析により、ＪＥ Ｖ培養液体に見られた遅い沈降血球凝集素（ＳＨＡ）のピークとともに移動した ｖＰ８２９感染試料のＨＡ活性のピークを同定した（データは示さず）。この結 果により、ｖＰ８２９感染細胞は、ｖＰ５５５感染細胞から収穫された培養液体 中に観察されたＥおよびＭを含有する空のウィルスエンベロープに同一の細胞外 粒子を産生ずることが示された（表１６およびメイソンら、１９９１）。

組換えワクシニアウィルスにより発現される場合、ＮＳ１は正確に処理され分泌 される 瞬間標識実験により、真正ＮＳＩおよびＮＳＩ’　とサイズが同一なタンパク質 がｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４に感染した細胞中で合 成されることが示された。ｖＰ５５５感染細胞により産生されたＮＳＩは、高分 子量形状の感染細胞の培養液体中に放出された。

ＮＳＩはまた、ｖＰ８５７およびｖＰ８６４感染細胞の培養液体中に放出される が、一方でＮＳＩは、ｖＰ８２５に感染した細胞からは放出されなかった（表１ ６）。Ｎ５２Ａ（ｖＰ８５７）暗号領域またはＮ５２ＡおよびＮ５２Ｂ暗号領域 を含有する組換えワクシニアウィルスからのＮＳ１の合成の比較により、Ｎ５２ Ｂ暗号領域の存在または不在は、ＮＳＩの発現には影響せず、Ｎ５２Ａ遺伝子の みがＮＳＩの真正処理に必要であることを示す以前のデータと首尾一貫している ことが分かった（ファルゴートら、ｌＨ９；メイソンら、１９９１）。

組換えワクシニアウィルスはＪＥＶ抗原に対する免疫応答を誘発した 各群から選択した動物から集積した前抗原投与した血清を、放射線標識したＥと ＮＳ１をイムノブレイビテーションする能力に関して試験した。これらの研究の 結果により以下のことが示された（表１６）：　（１）Ｈに対して誘発せしめら れた免疫応答の大きさは、ｖＰ８２９＞ｖＰ５５５＞ｖＰ８２５であった、（２ ）ＮＳＩおよびＮ５２Ａをコードする全てのウィルスはＮＳＩに対する抗体を誘 発した、（３）全ての免疫応答は、組換えウィルスの２回目の接種により増大せ しめられた。これらの動物から集積した血清に関する中和とＩＡＩデータの分析 により（表１７）、イムノブレシピテーション分析の結果が確認でき、ＲＩＰに より示されたようにＥに対する免疫応答は、他の血清学的試験と良好に相関関係 にあることを示す（表１７）。

組換えウィルスによるワクチン接種は致死ＪＥＶ感染からの保護を提供した 全ての組換えワクシニアウィルスは、ＪＥｖの末梢病原Ｐ３菌株による致死感染 からの保護をネズミに与えることができた（ハング、１９Ｂ２）　（表１７）。

これらの研究によりｖＰ５５５の保護潜在能力が確認され（メイソンら、１９９ １）ｖＰ８２５とｖＰ８２９に感染した動物において同様の保護を示した。ＮＳ Ｉに対する強い免疫応答を誘発した組換えウィルスｖＰ８５７およびｖＰ８６４ は、低水準の保護を示したが、これらの組換え体を接種したネズミは、対照ウィ ルス、ｖＰ４１０を接種したネズミと比較してまだ十分に保護された（表１７） 。

後抗原投与免疫応答はＪＥＶ複製の水準を示すこれらの組換えウィルスを接種し た動物の致死抗原投与からの保護の機構をよりよく理解するために、後抗原投与 血清における抗体のＪＥＶを認識する能力を評価した。これらの研究に関して、 放射線標識したＪＥＶ感染細胞の溶解産物に存在する抗原を用い、高度免疫した ネズミ（メイソンら、１９８７　ａ　）中の高水準の抗体を誘発するＮＳ３タン パク質に対する応答を試験した。これらの研究結果（表１８）は、高水準の保護 を誘発した組換えウィルス（ｖＰ８２９、ｖＰ５５５、およびｖＰ８２５）でワ クチン接種した動物の群がＮＳ３に対する低い後抗原投与応答を示したが、一方 でＮＳＩのみを発現した組換え体（ｖＰ８５７およびｖＰ８６４）でワクチン接 種した群の生存者からの血清はＮＳ３に対して高い後抗原応答を示したという生 存データと相関性がある。

ｒＪｔ　ｌｋ 表　１７ ＪＥＶタンパク質を発現する組換えワクシニアウィルスの免疫ウィルス８ 保護ｂｖＰ５５５　ｖＰ８２９　ｖＰ８２５　ｖＰ８５７　ｖＰ８６４１回目の 接種　７／１０　１０／１０　８／１０　０／１０　１／１０２回目の接種　１ ０／１０　９／１０　９／１０　５／１０　６／１０ニユ一トカ価、　ｉ １１回目接種　１＋２０　１：１６０　１：１０　＜１＝１０　＜１＝ｌＯ１２ 回目の接種　１：３２０　１：２５６０　１！３２０　＜１：１０　＜１ｒ１゜ ＨＡＩ力価１ １回０の接種　１：２０　１：４０　１：１０　＜１＝１０　＜１：１０２回目 の接種　１：８０　１＝１６０　１：４０　＜１＝１０　＜１＝１０ａ：２０匹 のネズミの群に、１０’　ｐｆｕの表示したワクシニアウィルスＪＥＶ組換え体 をｌｐ経路により接種した。３週間後に血清を採取した。このときに各群から１ ０匹のネズミに本文に示したようにＪＥＶを抗原投与した（１回目の接種）。

各群の残りの１０匹のネズミに同一の組換えワクシニアウィルスＪＥＶ組換え体 を追加抗原投与した（２回目の接種）。３週間後、血清を採取し、ネズミにＪＥ Ｖを抗原投与した。全てのネズミを、抗原投与後２１日間に亘り観察した。

ｂ：保護は、抗原投与から２１日後の生存数／合計の数として示す。

Ｃ：中和力価は、９０％のＪＥＶプラークの減少となる最高の希釈の逆数として 示す。

ｄ：ＨＡＩ力価は、赤血球の測定可能な血球凝集の抑制反応となる最高の希釈の 逆数として示す。

表　１８ ＪＥＶタンパク質を発現する組換えワクシニアウィルスの免疫ウィルス １回目　＋＋＋　十＋　−”　＋＋＋＋２回目　＋ｌ−５−−＋＋　＋十＋ ＋　抗原投与後の血清中に存在するＮＳ３抗体ａ　ネズミが生存しなかった ｂ　抗原投与後の血清中に存在する非常に近い水準のＮＳ３抗体ワクシニアウィ ルスＪＥＶ組換え体の１回目または２回目の接種後のＪＥＶ抗原投与に生存した ネズミからの抗原投与２１日後の血清（表１７）を、ＪＥＶ　Ｈ８３に対する抗 体の存在について分析した。

ＪＥＶ遺伝子のワクシニア（ＮＹＶＡＣ）供与体プラスミド中へのクローニング プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ　（ＫＩＬ宿主範囲遺伝子の上流のワクシニア配列内 にポリリンカー領域を含有する）をポリリンカー内のＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩとＸｈ ｏｌで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチド５ＰＨＰＲＨＡ　ＡからＤと連 結し、ＨｉｎｄｌＩＩ部位、Ｈ６プロモーター−１２４から−１（バーカスら、 １９８９）　、並びにＸｈｏ　Ｉ、ＫｐｎｌＳＳｍａＩＳＳａｃｌおよびＥｃｏ ＲＩ部位を含有する５Ｐ１２６を産生じた。

プラスミドｐＳＤ５４４ＶＣ（ポリリンカー領域と置換されたＨＡ遺伝子の部位 を包囲するワクシニア配列および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを含有する ）をポリリンカー領域内のＸｈｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ 断片を充填し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。５Ｐ１２６をＨｉｎｄｌ 　Ｉ　Ｉで切断し、フレノウで処理し、Ｓｍａ　Ｉの切断によりＨ６プロモータ ーを単離した。Ｈ６プロモーター断片のｐＳＤ５４４ＶＣへの連結により、ポリ リンカー領域（ＨＡ転写方向内）にＨ６プロモーターを含有した５ＰＨＡ−Ｈ， ６を産生した。

プラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣをＨ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとＪＥＶ配列内 の５ａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、１７８９ｂｐ断片を単離した。

Ｊ　ＥＶＬ　１４ＶＣ（メイソンら、１９９１）をＴＳＮＴ後のＥａｇＩ部位で のＥｃ　ＩＸＩ″？′−切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片で充填し 、ＪＥＶ配列内の５ａｃＩ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、２００５ｂｐ断 片を産生じた。１７８９ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−３ａｃｌおよび２００５ｂｐ　（Ｓ ａｃｌ充填Ｅｃ　ＩＸＩ）断片をＥｃｏＲＶ（Ｈ６内）に連結し、ＳｍａＩ（ポ リリンカー内）で切断し、５ＰＨＡ−Ｈ６をアルカリ性ホスファターゼ処理しＪ ＥＶ３５を産生じた。ＪＥＶ３５をｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中に移 入し、ワクシニア組換え体ＶＰ９０８を産生じた（第１８図）。

ＪＥＶ３５を５ａｃｌ（ＪＥ配列ヌクレオチド２１２４内）とＥｃｌＸＩ　（Ｔ ５ＮＴの後）で切断し、５４９７ｂｐ断片を単離し、ＪＥＶ２５の５ａｃｌ　（ ＪＥＶヌクレオチド２１２４）からＥａｇｌ断片（Ｅの残りの３分の２、翻訳終 止およびＴ５ＮＴを含有する）に連結し、Ｊ　ＥＶ３６を産生じた。ＪＥＶ３６ をｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）感染細胞中に移入し、ワクシニア組換え体ｖＰ９ ２３を産生じた（第１８図）。５ＰＨＰＲＨＡ　ＡからＤオリゴヌクレオチド５ ＰＨＰＲＨＡ　：　Ａ＋Ｂ　（配列認識番号１２ｏ）および５ＰＨＰＲＨＡ：　 Ｃ＋Ｄ　（配列認識番号１２１）を以下に示す ＣＣＣＡＡＣＡＣＡＡＴｌｆ’ＴＡＡＣＴＴＴＣＧＣＴＣＴＴＴＡ’Ｉ’ｆ’Ａ ＧＴＡＴｒＴＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＧＣＴＡＴＡＧfＣ ＹＦワクシニア組換えウィルス（クローンｌ０ＩＩＩおよびクローン２８１　Ｉ 　Ｉ）を構成するのに用いたＹＦ１７Ｄ　ｃＤＮＡクローンをチャールスライス （ＭＯ，セントルイス、ワシントン大学スクールオブメデイスン）から得た。全 てのヌクレオチド座標はライスら１９８５に存在した配列データから誘導した。

カルボキシ末端８０％ｐｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％Ｎ５Ｉ（ヌクレオチド ５３７−１６５９）をコードするＹＦ　ＣＤＮＡを含有するプラスミドＹＦＯを 、ＹＦ　ｃＤＮＡのＡｖａｌからＮ５ｉｌ断片（ヌクレオチド５３７−１６５９ ）とＹＦ　ｃＤＮＡのＮ５ｉｌからＫｐｎｌ断片（ヌクレオチド１６６０−３２ ６６）をＡｖａｌとＫｐｎｌで切断したＩＢＩ２５（ＣＴ、二ニー）１ブン、イ ンターナショナルバイオテクノロジー社）中にクローニングすることにより誘導 した。Ｃおよびアミノ末端２０％ｐｒＭをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有する プラスミドＹＦＩを、ＹＦ　ｃＤＮＡのＲｓａｌからＡｖａｌ断片（ヌクレオチ ド１６６−５３６）とアニールしたオリゴヌクレオチド５Ｐ４６と５Ｐ４７　（ 不能Ｈｉｎｄｌｌ！粘着末端、ＸｈｏｌとＣｌａｌ部位およびＹＦヌクレオチド １１９−１６５を含有する）をＡｖａｌとＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断したＩＢＩ ２５中にクローニングすることにより誘導した。Ｅのカルボキシ末端６０％とＮ ＳＩのアミノ末端２５％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ ３を、ＹＦ　ｃＤＮＡのＡｐａｌからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４− ２７２５）をＡｐａＩとＢａｍＨＩで切断したＩＢＩ２５中にクローニングする ことにより産生じた。

カルボキシ末端２０％ＮＳＩ、Ｎ５２ａ、Ｎ５２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ ３をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ８を、ＹＦ　ｃＤＮＡ のＫｐｎＩからＸｂｎＩ断片（ヌクレオチド３２６７−４９４０）をＫｐｎｌと Ｘｂａｌで切断したＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カル ボキシ末端６０％Ｎ５２Ｂおよびアミノ末端２０％ＮＳ３をコードするＹＦ　ｃ ＤＮＡを含有するプラスミドＹＦ９を、ＹＦ　ｃＤＮＡの５ａｃｌからＸｂａｌ 断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）をＳａｃ　ＩとＸｂａＩで切断したＩ ＢＩ２５中にクローニングすることにより産生じた。Ｃのカルボキシ末端２５％ 、ｐｒＭおよびＥのアミノ末端４０％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するプ ラスミドＹＦ１３を、ＹＦ　ｃＤＮＡのＢａＩＩからＡｐａｌ断片（ヌクレオチ ド３８４−１６０３）をＡｐａｌとｓｍａ　Ｉで切断したＩＢＩ２５中にクロー ニングすることにより誘導した。

オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、１９８５）を用いて、以下 の潜在的なワクシニアウィルス初期転写終止信号（ユエンら、１９８７）　（１ ）　ＹＦＩ中のＣ遺伝子のアミノ末端からの４９ａａ　（ＴＴＴＴＴＣＴヌクレ オチド２６３−２６９およびＴＴＴＴＴＧＴヌレオチド２６９−２７５）を（配 列認識番号１２２）ＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴに変更してプラスミドＹＦＩＢ を産生じ、ＹＦ３中のＥ遺伝子において（ヌクレオチド１８８６−１８９３ＴＴ ＴＴＴＴＧＴからカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＴＧＴ１８９ａａおよびヌク レオチド２４２９−２３５ＴＴＴＴＴＧＴをカルボキシ末端からのＴＴＣＴＴＧ Ｔ８ａａ）に変更することにより、それぞれ￥Ｆ３ＢとＹＦ３Ｃを産生した。Ｙ Ｆ３ＣからのＰｓｔｌからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１９６５−２７２５） をＹＦ３Ｂの対応断片と交換し、両者とも突然変異誘発転写終止信号を有するカ ルボキシ末端６０％Ｅとアミノ末端２５％ＮＳＬをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを 含有するＹＦ４　（ヌクレオチド１６０４−２７２５）を産生じた。ＹＦ４から のＡｐａｌからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦＯ中 の相当領域と置換して、両者とも突然変異誘発転写終止信号を有するカルボキシ 末端８０％ｐｒＭＳＥとアミノ末端８０％ＮＳＩをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを 含有するＹＦ６　（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生じた。プラスミドＹ Ｆ６をＩＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとヌクレオチド５３７でのＡｖａｌで切断し、 ＹＦＩＢからのＥｃｏＲＶからＡｖａｌ断片（Ｉ　Ｂ　Ｉ　２５内のＥｃｏＲＶ からヌクレオチド５３６でのＡｖａｌ）と連結し、１１９にＸｈ。

ＩおよびＣｌａＩ部位並びに４つの突然変異誘発終止信号を有するＣからＮＳＩ のアミノ末端８０％をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ２（ヌクレオチ ド１１９−３２６６）を産生じた。

上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）Ｅのカルボキ シ末端からのＡＴＧ１７ａａに先行するＸｈｏＩおよびＣｌａｌ部位（ヌクレオ チド２４０２−２４０４）をプラスミドＹＦ３Ｃに挿入してＹＦ５を産生じ、（ ２）ｐｒＭのカルボキシ末端からのＡＴＧ１９ａａに先行するＸｈｏｌおよびＣ ｌａｌ部位（ヌクレオチド９１７−９１９）をプラスミドＹＦ１３に挿入してＹ Ｆ１４を産生じ、（３）Ｅのカルボキシ末端からのＡＴ０２３ａａに先行するＸ ｈｏ１部位（ヌクレオチド２３８４−２３８６）をプラスミドＹＦ３Ｃに挿入し てＹＦ２５を産生じ、（４）Ｃのカルボキシ末端からのＡＴＧ２１ａａおよびＸ ｈｏ１部位（ヌクレオチド４１９）をプラスミドＹＦ１に挿入してＹＦ４５を産 生じた。　ＹＦ５からのＡｐａｌからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４− ２７２５）をＹＦＯの対応領域と交換して、２４０２でＸｈｏｌおよびＣｌａｌ 部位（Ｅのカルボキシ末端からの１７ａａ）並びに２４２９−２４３５での突然 変異誘発転写終止信号（Ｅのカルボキシ末端からの８ａａ）を有するカルボキシ 末端８０％ｐｒＭＳＥおよびアミノ末端８０％ＮＳＩをコードするＹＦ　ｃＤＮ Ａを含有するＹＦ７（ヌクレオチド５３７−３２６６）を産生した。ＹＦ２５か らのＡｐａＩからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド１６０４−２７２５）をＹＦＯ の対応領域と交換して、２３８４でＸｈｏＩ部位（Ｅのカルボキシ末端からの２ ３８ａ）および２４２８−２４３５での突然変異誘発転写終止信号（Ｅのカルボ キシ末端からの８ａａ）を有するカルボキシ末端８０％ｐｒＭＳＥおよびアミノ 末端８０％ＮＳ１をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ２６　（ヌクレオ チド５３７−３２６６）を産生じた。

ＹＦ１４からのＡｖａｌからＡｐａｌ断片（ヌクレオチド５３７−１６０３）を ＹＦ６の対応領域と交換して、ヌクレオチド９１７でＸｈｏＩおよびＣｌａｌ部 位（ｐｒＭのカルボキシ末端からの１９ａａ）および２つの突然変異誘発転写終 止信号を有するカルボキシ末端８０％ｐ　ｒ　ＭｓＥおよびアミノ末端８０％Ｎ Ｓ１をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ２６　（ヌクレオチド５３７− ３２６６）を産生じた。ＹＦ６をＩＢＩ２５内のＥＣ０ＲｖとＹＦ内のヌクレオ チド５３７でのＡｖａｌで切断し、ＹＦ４５のＥｃｏＲＶ　（ＩＢＩ２５内）か らＡｖａＩ断片に連結して４１９でＸｈｏ１部位（Ｃのカルボキシ末端からの２ １ａａ）および除去し２つの転写終止信号を有するＣからアミノ末端８０％ＮＳ ＩをコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ４６　（ヌクレオチド１１９−３ ２６６）を産生じた。

上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、Ｎ５２Ｂのカルボキ シ末端でのＳｍａ　Ｉ部位（ヌクレオチド４５６９）をプラスミドＹＦ９に挿入 してＹＦｌｌを産生し、Ｎ５２Ａのカルボキシ末端のＳｍａＩ部位（ヌクレオチ ド４１８０）をプラスミドＹＦ８に挿入してＹＦｌｏを産生じた。ＹＦｌｌから の５ａｃｌからＸｂａｌ断片（ヌクレオチド４３３９−４９４０）およびＹＦ８ からのＡｓｐ７１８からＳａｃ　Ｉ断片（ヌクレオチド３２６２−４３３８）を Ａｓｐ７１８とＸｂａｌで切断したＩＢＩ２５に連結して、Ｎ５２Ｂのカルボキ シ末端の後にあるＳｍａＩ部位（ヌクレオチド４５６９）を有するカルボキシ末 端２０％ＮＳＩ、Ｎ５２Ａ、Ｎ５２Ｂおよびアミノ末端２０％Ｎ５２Ｂまをコー ドするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ１２（ヌクレオチド３２６２−４９４０） を産生した。

ＹＦ遺伝子のｐＨＥＳシステムワクシニアウィルス供与体プラスミドへのクロー ニング ＹＦクローニング配列のＮＹＶＡＣ供与体プラスミドへの挿入の前に、ＹＦ暗号 配列をワクシニアプラスミドｐＨＥＳ４に挿入した（パーカスら、１９８９）。

カルボキシ末端２０％ＮＳＩ、Ｎ５２ＡおよびＮ５２ＢをコードするＹＦ１２か らのＫｐｎ　ＩからＳｍａ　Ｉ断片（ヌレオチド３２６７−４５６９）　、１９ ａａｐ　ｒＭ、Ｅおよびアミノ末端８０％ＮＳＩをコードするＹＦ１５からのＸ ｈｏｌからＫｐｎｌ断片（ヌクレオチド９１７−３２６６）およびＸｈ。

１−Ｓｍａ　Ｉで切断したｐＨＥＳ４を連結してＹＦ２３を産生じた。２３ａａ Ｅ、アミノ末端２５％ＮＳＬをコードするＹＦ２６からのＸｈｏｌからＢａｍＨ Ｉ断片（ヌクレオチド２３８４−２７２５）をＹＦ２３　（カルボキシ末端７５ ％ＮＳＩ、Ｎ５２ＡおよびＮ５２Ｂ、複製の起点並びにワクシニア配列を含有す る）からのＸｈｏｌからＢａｍＩＩ断片と連結してＹＦ２８を産生じた。

ＸｈｏＩ−３ｍａＩ切断したｐＨＥＳ４を、１７ａａＥおよびアミノ末端８０％ ＮＳＩをコードするＹＦ７からのＸｈｏｌからＫｐｎＩ断片（ヌクレオチド２４ ０２−３２６６）およびカルボキシ末端２０％ＮＳＩおよびＮ５２Ａをコードす るＹＦｌｏからのＫｐｎからＳｍａＩ（ヌクレオチド３２６７−４１８０）を連 結することにより、ＹＦ１８を産生じた。Ｃ，ｐｒＭＳＥおよびアミノ末端２５ ％ＮＳＩをコードするＹＦ２からのＸｈｏ　ＩからＢａｍＨＩ断片をＹＦ１８の ＸｈｏｌからＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％ＮＳＩおよびＮ５ＩＡ、不 正の起点並びにワクシニア配列を含有する）に連結し、ＹＦ１９を産生じた。

ＹＦ２からの同一のＸｈｏｌからＢａｍＨＩ断片をＹＦ２８からのＸｈｏｌから ＢａｍＨＩ断片（カルボキシ末端７５％ＮＳＩおよびＮ５２Ａ、複製の起点並び にワクシニア配列を含有する）に連結し、ＹＦ２０を産生じた。２１ａａＣ％ｐ ｒＭＳＥおよびアミノ末端２５％ＮＳＬをコードするＹＦ４６からのＸｈｏｌか らＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド４１９−２７２５）をＹＦ１８からのＸｈｏＩ からＢａｍＨＩ断片と連結し、ＹＦ４７を産生じた。オリゴヌクレオチド５Ｐ４ ６　（配列認識番号１２３）およびＳＰ（配列認識番号１２４）は以下のとおり である：組換え体ＹＦワクシニアウィルスの構成ＣからＮ５２Ｂに亘るＹＦ暗号 領域の部分を発現した５つの異なるワクシニアウィルス組換え体を、宿主範囲選 択システムを用いて構成した（バーカスら、１９８９）。プラスミドＹＦ１８、 ＹＦ２３、ＹＦ２０、ＹＦ１９およびＹＦ４７をｖＰ２９Ｂ感染細胞中に移入し 、ワクシニア組換え体ｖＰ７２５、ＹＦ７２９、ＹＦ７６４、ＹＦ７６６および ＹＦ８６９を産生した。これらの組換え体中に含まれたＹＦ　ｃＤＮＡ配列を第 １９図に示す。５つの組換えウィルス全てにおいて、ＹＦ　ｃＤＮＡの間隔鎖は 、ワクシニアウィルス初期／晩期Ｈ６プロモーターの背後に位置し、翻訳は、ウ ィルスｃＤＮＡ配列の５′末端に位置するＭｅｔコドンから開始すると予期され た（第１９図）。

組換え体ｖＰ７２５は、非構造タンパク質ＮＳＩのＮ末端に先行する推定１７− ａａ信号配列および非構造タンパク質ＮＳＩとＮ５２Ａをコードした（ライスら 、１９８５）。

組換え体ｖＰ７２９は、ＥのＮ末端に先行する推定１９−ａａ信号配列、Ｅ、Ｎ ＳＩ、Ｎ５２ＡおよびＮ５２Ｂをコードした（ライスら、１９８５）　、組換え 体ｖＰ７６４は、Ｃ１ｐ　ｒＭ、ＥＳＮＳ　１、Ｎ５２ＡおよびＮ５２Ｂをコー ドした（ライスら、１９８５）　、組換え体ｖＰ７６６は、ＣＳｐｒＭ、、Ｅ、 ＮＳ１およびＮ５２Ａをコードした（ライスら、１９８５）。組換え体ｖＰ８６ ９は、ｐｒＭ構造構造タンパク側前駆体末端に先行する推定２ｌ−ａａ信号配列 、並びにｐ　ｒＭ、Ｅ、、ＮＳ　１、およびＮ５２Ａをコードした（ライスら、 １９８５）。

致死ＹＦ抗原投与からの保護 ＹＦ８６９は、他の組換え体に感染した培養液体中に見られなかったＨＡ活性を 分泌した。このＨＡは、抗ＹＦ抗体により抑制とｐＨ最適条件に基づいてＹＦ感 染細胞中に産生されたＨＡと同一であるように思われた。

生後３週間のネズミに、１０７ｐｆｕのＹＦ８６９、ＹＦ７６４、またはＹＦ− １７Ｄを腹腔内に接種し、３週間後に１００ＬＤ、。のＹＦのフレンチ神経親和 性菌株を抗原投与した。ＹＦ８６９は著しい保護を提供したが（表１９）一方で ＹＦ７６４は、ＹＦ遺伝子を欠如した対照ワクシニアウィルスよりも良好な保護 を提供しなかった（ｖ　Ｐ４５７）。

表　１９ ＹＦ抗原投与に対する組換えワクシニアウィルスによるネズミの保護 免疫ウィルス　生存／合計 ｖＰ８６９　９／１０ １７Ｄ　５／１０ ＹＦ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミド中へのクローニング ２１アミノ酸Ｃ，ｐ　ｒＭＳＥＳＮＳ　１、Ｎ５２Ａ　（ＮＳ１が掛けたヌクレ オチド２９６２を有する）をコードするＹＦ　ｃＤＮＡを含有するＹＦ４７から のＸｈｏＩからＳｍａｌ断片（ヌクレオチド４１９−４１８０）をＸｈｏＩ−Ｓ ｍａ　Ｉで切断した５ＰＨＡ−Ｈ６（ＨＡ領域供与体プラスミド）と連結し、Ｙ Ｆ４８を産生じた。ＹＦ４８を５ａｃＩ（ヌクレオチド２４９０）で切断し、Ａ ｓｐ７１８（ヌクレオチド３２６２）で部分的に切断し、６７００ｂｐ断片を単 離し、（複製のプラスミド起点、ワクシニア配列、２１アミノ酸Ｃ，ｐ　ｒＭ、 Ｅ、アミノ末端３．５％ＮＳ１、カルボキシ末端２３％ＮＳ１、Ｎ５２Ａを含有 する）ＹＦ１８からの５ａｃｌ−Ａｓｐ７１８断片（２９６２に存在する塩基と ともにＮＳＩの残りを含有する）に連結し、ＹＦ３１を産生じた。オリゴヌクレ オチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発（マンデツキ、１９８Ｂ）を用いて、ＹＦ ３１中の特有のＸｈｏ１部位に対応する６ｂｐを除去し、ＨＡ座供与体プラスミ ド中にＹＦ２１アミノ酸Ｃ，ｐｒＭ％Ｅ１ＮＳＩ、Ｎ５２Ａをコードするプラス ミドを産生じた。供与体プラスミドＹＦ３０をＹＦ８６６　（ＮＹＶＡＣ）感染 細胞中に移入してワクシニア組換え体ｖＰ９８４を産生じた。

オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発を用いて、ＹＦ４８中の特有 のＸｈｏ１部位に対応する６ｂｐを除去してＹＦ４９を産生じた。オリゴヌクレ オチド定方向突然変異誘発を用いて、Ｅのカルボキシ末端でのＳｍａ１部位をＹ Ｆ４中に挿入し、ＹＦ１６を産生じた。ＹＦ４９のＡｐａＩ−８ｍａｌ断片（２ １アミノ酸ＣＳｐｒＭおよびアミノ末端４３％ＥをコードするＹＦ　ｃＤＮＡ、 並びに複製のプラスミド起点、ワクシニア配列を含有する）をＹＦ１６からのＡ ｐａｌ−５ｍａｌ断片（カルボキシ末端５７％Ｅを含有するヌクレオチド１６０ ４−２４５３）に連結し、ＨＡ座にＥ、ｐｒＭ、Ｃの２１アミノ酸を含有するＹ Ｆ３３を産生じた。供与体プラスミドＹＦ３３をＹＦ９１３　（ＮＹＶＡＣ−Ｍ Ｖ）ｌ：感染シタ細胞中ニ移入シてワクシニア組換え体ｖＰ９９７を産生じた。

１型デング熱のワクシニアウィルス供与体プラスミド中へのクローニング カルボキシ末端８４％ＮＳＩおよびアミノ末端４５％Ｎ５２ＡをコードするＤＥ Ｎ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮＩ　（ヌクレオチド２５５９−３７４ ５、メイソンら、１９８７ｂ）を、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ■断 片（ヌクレオチド２５５９−３７４０）およびアニールしたオリゴヌクレオチド ＤＥＮ１（配列認識番号１２５）とＤＥＮ２　（配列認識番号１２６）（Ｘｂａ ｌ粘着末端、翻訳終止コドン、ＴＳＡＴワクシニアウィルス初期転写終止信号（ ユエンら、１９８７）、Ｅａｇ１部位およびＨｉｎｄＩＩＩ粘看末端を含有する ）をＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲｌで切断したｐＵＣｇ中にクローニングする ことにより誘導した。ＤＥＮＩからのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片（ヌ クレオチド２５５９−３７４５）およびＥのカルボキシ末端３６％とアミノ末端 １６％ＮＳＩをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡの５ａｃｌ−ＥｃｏＲＩ断片をＨｉ ｎｄｌＩＩ−３ａｃｌで切断したＩ　Ｂ　Ｉ　２４　（ＣＴ、　＝、−ハブン、 インターナショナルバイオテクノロジー社）に連結し、カルボキシ末端６４％Ｅ からアミノ末端４５％Ｎ５２Ａをコードし、ＮＳ１に塩基の欠けた（ヌクレオチ ド２４６７）ＤＥＮ３を産生した。

ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｘｂａｌで切断したＩ　Ｂ　Ｉ　２４をアニールしたオリゴヌ クレオチドＤＥＮ９　（配列認識番号１２７）およびＤＥＮＩＯ（配列認識番号 １２８）［ＨｉｎｄＩＩＩ粘着末端、Ｓｍａ　１部位、ＤＥＮヌクレオチド３７ ７−４２８　（メイソンら、１９＋１７ｂ）およびＸｂａｌ粘着末端を含有する ］に連結し、５ＰＤ９１０を産生した。５ＰＤ９１０を５ａｃｌ　（ＩＢＩ２４ 内）とＡｖａｌ（ヌクレオチド４２３のＤＥＮ内）で切断し、ＤＥＮ　ｃＤＮＡ のＡｖａｌ−５ａｃｌ断片（ヌクレオチド４２４−１４４７メイソンら、１９８ ７）に連結し、カルボキシ末端１１ａａＣｓｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅを コードするＤＥＮ４を産生じた。

カルボキシ末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳＩをコードするＤＥＮ　ｃ ＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ６（ヌクレオチド２４６７が存在するヌクレ オチド１４４７−２５７９、メイソンら、１９８７ｂ）を、ＤＥＮ　ｃＤＮＡの ５ａｃｌ−ＸｈｏＩ断片をＩ　Ｂ　Ｉ　２５　（ＣＴ、ニューハブン、インター ナショナルバイオテクノロジー社）中にクローニングすることにより誘導した。

ＤＥＮ５’未翻訳領域の５１塩基、ＣＳｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅをコー ドするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ１５を、ＤＥＮ　ｃＤＮＡ のＨｉｎｄｌｌＩ−ＳａｃＩ断片（ヌクレオチド２０−１４４７、メイソンら、 １９８７ｂ）をＨｉｎｄｌｌ　ｌ−８ａｃｌで切断したＩＢＩ２５中にクローニ ングすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％Ｎ５２Ａおよびアミノ末端 ２８％Ｎ５２ＢをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＥＮ２３ を、ＤＥＮ　ｃＤＮＡのＸｂａｌ−Ｓｐｈｌ断片をＸｂａｉ−８ｐｈＩで切断し たＩＢＩ２５中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端５５％ Ｎ５２Ａ、Ｎ５２Ｂおよびアミノ酸ＮＳ３をコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有 するプラスミドＤＥＮ２０　（ヌクレオチド３７４５−４５６３）を、ＤＥＮ　 ｃＤＮＡのＸｂａｌがらＥｃｏＲＩ断片をＸｂａｌ−ＥｃｏＲＩで切断したＩＢ Ｉ２５中にクローニングすることにより誘導した。

オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、１９８５）を用いて以下の 潜在的なワクシニアウィルス初期転写終止信号を変更せしめた（ユエンら、１９ ８７）。ＤＥＮ４中のｐｒＭ遺伝子における２つのＴ５ＮＴ配列、（１）カルボ キシ末端からの２９ａａ　（ヌクレオチド８２２−８２８ＴＴＴＴＴＣＴをＴＡ ＴＴＴＣＴに）および（２）カルボキシ末端からの１３ａａ　（ヌクレオチド８ ７０−８７５ＴＴＴＴＴＡＴからＴＡＴＴＴＡＴに）を突然変異誘発せしめてプ ラスミドＤＥＮ４７を産生じた。ＤＥＮ６中のＮＳ１遺伝子における単一のＴ５ ＮＴ配列、アミノ末端からの１７ａａを突然変異誘発せしめて（ヌクレオチド２ ４４８−２４５４ＴＴＴＴＴＧＴからＴＡＴＴＴＧＴに）プラスミドＤＥＮ７を 産生じた。

上述したようにオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）ＮＳ２ Ａのカルボキシ末端でのＥａｇｌとＥｃｏＲ１部位（ヌクレオチド４１０２）を プラスミドＤＥＮ２３に挿入してＤＥＮ２４を産生じ、（２）Ｅのカルボキシ末 端らのＡＴＧ１５ａａとＳｍａ　１部位をＤＥＮ７（ヌクレオチド２３４８）に 挿入してＤＥＮＩＯを産生じ、（３）ＮＳ２Ｂのカルボキシ末端でのＥａｇｌと ＨｉｎｄＩ１１部位（ヌクレオチド４４９２）をプラスミドＤＥＮ２０に挿入し てプラスミドＤＥＮ２１を産生じ、そして（４）プラスミドＤＥＮ１５中のヌク レオチド６３−６７をワクシニアウィルス初期／晩期Ｈ６プロモーター（位置− １から−２１、パーカスら、１９８９）と置換してＤＥＮＬ６（ＤＥＮヌクレオ チド２０−５９、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１およびＤＥＮヌク レオチド６８−１４４７を含有する）を産生じた。

ＤＥＮ７からの５ａｃｌ−Ｘｈｏｌ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を 、ＤＥＮ１３中の対応領域と置換して、カルボキシ末端６４％Ｅとアミノ末端４ ５％ＮＳ２人をコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有しくヌクレオチド１４４７− ３７４５）　、ヌクレオチド２４６７が存在し修飾転写終止信号（ヌクレオチド ２４４８−２４５４）を有するＤＥＮＬ９を産生じた。ＤＥＮＬ９からのＸｈｏ Ｉ−Ｘｂａｉ断片（ヌクレオチド２５７９−３７４５）およびＤＥＮ２４からの Ｘｂａｌ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片（ＸｂａＩヌクレオチド３７４５ＤＥＮから ＩＢＩ２４中のＨｉｎｄＩＩＩ）をＸｈｏｌ−Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断したＩ ＢＩ２５に連結して、カルボキシ末端８２％ＮＳＬ、Ｎ５２Ａおよびアミノ末端 ２８％Ｎ５２ＢをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有しくヌクレオチド２５７９ −４２１３）　、４１０２でのＥａｇ１部位、ヌクレオチド２４６７が存在し、 突然変異誘発転写終止信号を有する（ヌクレオチド２４４８−２４５４）ＤＥＮ ２５を産生じた。ＤＥＮＬ９がらのＸｈｏｌ−Ｘｂａｌ断片（ヌクレオチド２５ ７９−３７４５）をＸｈｏＩ　（ＩＢＩ２５内）とＸｂａｌ　（ＤＥＮヌクレオ チド３７４５）で切断したＤＥＮ２１に連結し、カルボキシル末端８２％ＮＳＩ 、Ｎ５２ＡＳＮＳ２Ｂおよびアミノ末端２４ａａＮＳ３をコードしくヌクレオチ ド２５７９−４５６４）　、ヌクレオチド２４６７が存在し、修飾転写終止信号 （ヌクレオチド２４４８−２４５４）および４４９２でのＥａｇＩ部位を有する ＤＥＮ２２を産生じた。

ＤＥＮＬ６からのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片（ヌクレオチド２Ｏ−４９４） をＤＥＮ４７からのＨｉｎｄＩｌｌ−Ｐｓｔｌ断片（Ｅのカルボキシ末端８３％ ｐｒＭとアミノ末端３６％ヌクレオチド４９４−１４４７および複製のプラスミ ド起点をコードする）と連結し、ＣｓｐｒＭおよびアミノ末端３６％Ｅ並びにＣ のアミノ末端に先行するＥｃｏＲＶ部位とＨ６プロモーターの部分をコードする ＤＥＮＬ７を産生した。

カルボキシ末端１３ａａＣ，ｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥ ＮＬ７からのＨｉｎｄｌｌｌ−ＢｇＩＩＩ断片（ヌクレオチド３７０−１４４７ ）をアニールしたオリゴヌクレオチド５Ｐ１１１および５Ｐ１１２（不能Ｈｉｎ ｄｌＩＩ粘着末端、ＥｃｏＲＶ部位からＨ６プロモーターの−１、およびＢｇｌ ｌＩ粘着末端を有するＤＥＮヌクレオチド３５０−３６９）に連結し、ＥｃｏＲ Ｖ部位からＨ６プロモーターの−１、カルボキシ末端２０ａａＣ，ｐｒＭおよび アミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ３３を産生した。

Ｓｍａｌ−Ｅａｇｌで切断したｐＴＰ１５　（メイソンら、１９９１）を、カル ボキシ末端１１ａａＣＳｐｒＭおよびアミノ末端３６％ＥをコードするＤＥＮ４ からのＳｍａＩ−３ａｃｌ断片（ヌクレオチド３７７−１４４７）と、カルボキ シ末端６４％ＥＳＮＳＩおよびアミノ末端４５％Ｎ５２ＡをコードするＤＥＮ３ からのＳａｃｌ−ＥａｇＩ断片とに連結し、ＤＥＮＬを産生じた。カルボキシ末 端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳＩをコードするＤＥＮ７からの５ａｃｌ −ＸｈｏＩ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９）を、ＤＥＮ４７からのＢｓ 　ｔＥＩ　ｌ−８ａｃ　Ｉ断片（カルボキシ末端５５％ｐｒＭおよびアミノ末端 ３６％ヌクレオチド６３１−１４４７をコードする）とＤＥＮＬからのＢｓｔＥ ＩＩ−ＸｈｏＩ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ，アミノ末端４５％ｐｒＭ、カ ルボキシ末端８２％ＮＳＬ、カルボキシ末端Ｎ５２Ａ、複製の起点およびワクシ ニア配列をコードする）とに連結し、ＤＥＮ８を産生じた。オリゴヌクレオチド 定方向二本鎖開裂突然変異誘発（マンデツキ、１９８Ｂ）を用いて特有のＳｍａ 　１部位（Ｈ６プロモーターとＡＴＧの間に位置する）を除去し、Ｈ６プロモー ターが直接ＡＴＧ開始コドンに先行するＤＥＮ８ＶＣを産生じた。

ＤＥＮＬ７からのＥｃｏＲＶ−５ａｃｌ断片（位置−２１から−ＩＨ６プロモー ターＤＥＮヌクレオチド６８−１４４７）をＤＥＮ８ＶＣのＥｃｏＲＶ−５ａｃ ｌ断片（ワクシニア配列、−２１から−１２４のＨ６プロモーター、複製の起点 およびアミノ末端６４％Ｅ１ＮＳ１、アミノ末端４５％Ｎ５２Ａヌクレオチド１ ４４７−３７４５）に連結し、ＤＥＮＬ８を産生じた。ＤＥＮ２５からのＸｈｏ ｌ−ＥａｇＩ断片（ヌクレオチド２５７９−４１０２）をＤＥＮＬ８のＸｈｏＩ −ＥａｇＩ断片（複製の起点、ワクシニア配列およびＤＥＮ　ＣＳｐｒＭ、Ｅお よびアミノ末端１８％ＮＳＩを含有する、ヌクレオチド６ｇ−２５７９）に連結 し、ＤＥＮ２６を産生じた。ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−５ａｃｌ断片（位 置−２１から−ＩＨ６プロモーター、ヌクレオチド３７７−１４４７）をＤＥＮ ２６からのＥｃｏＲＶ−３ａｃｌ断片（カルボキシル末端６４％Ｅ、ＮＳＩおよ びＮ５２Ａをコードしヌクレオチド２８９４でＮＳ１に塩基の欠けたＤＥＮ領域 、複製の起点およびワクシニア配列を含有する）に連結し、ＤＥＮ３２を産生じ た。ＤＥＮ３２をｖＰ４１０に感染した細胞中に移入して組換え体ｖＰ８６７を 産生した（第２０図）。

ＤＥＮＩＯからの５ａｃｌ−Ｘｈｏｌ断片（ヌクレオチド１４４７−２５７９） をＤＥＮＢ中の対応領域と置換して、カルボキシ末端６４％Ｅ、ＮＳＩおよびア ミノ末端４５％Ｎ５２Ａをコードし、Ｅのカルボキシ末端がらのＡＴＧ１５ａａ とＳｍａ　１部位を有するＤＥＮ　ｃＤＮＡを含有するＤＥＮｌｌを産生じた。

ＤＥＮＩＩからのＳｍａ　１−Ｅａｇｌ断片（カルボキシ末端１５ａａＥ、ＮＳ Ｉおよびアミノ末端４５％Ｎ５２Ａをコードする、ヌクレオチド２３４８−３７ ４５）をＳｍａｌ−Ｅａｇｌで切断したｐＴＰ１５に連結し、ＤＥＮ１２を産生 じた。

ＤＥＮ２２からのＸｈｏｌ−Ｅａｇｌ断片（ヌクレオチド２５７９−４４９２９ を上述したＤＥＮ１８からのｘｈｏｌ−Ｅａｇｌ断片に連結して、ＤＥＮ２７を 産生じた。

ＤＥＮ１２からのＥｃｏＲＶ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片（位置−２１から−ＩＨ６プロ モーターＤＥＮ、ヌクレオチド２３４８−３４４７）を、ＤＥＮ２７からのＥｃ ｏＲＶ−Ｐｓ　ｔ　１断片（複製の起点、ワクシニア配列、Ｈ６ブロモ−ター− ２１から−１２４およびＮ５２ＡとＮ８２ＢをコードするＤＥＮ　ｃＤＮＡを含 有する）に連結し、ＤＥＮ３１を産生じた。

ＤＥＮ８ＶＣからのＥｃｏＲＶ−Ｘｈｏｌ断片（カルボキシ末端１１ａａＣ，ｐ ｒＭ　Ｅ、アミノ末端１８％ＮＳ１をコードする位置−２１から−ＩＨ６プロモ ーターＤＥＮヌクレオチド）をＤＥＮ３１らのＥｃｏＲＶ−Ｘｈｏｌ断片（カル ボキシ末端８２％ＮＳＩ、Ｎ５２Ａ、Ｎ５２Ｂをコードし、位置２８９４でＮＳ Ｉに塩基が存在するＤＥＮ　ｃＤＮＡ、ワクシニア配列および複製の起点を含有 する）に連結し、ＤＥＮ３５を産生じた。ＤＥＮ３５をｖＰ４１０感染細胞中に 移入して組換え体ｖＰ９５５を産生じた（第２０図）、ＤＥＮ３ＢからのＥｃｏ ＲＶ−Ｓａｃｌ断片（カルボキシ末端２０ａａＣｓ　ｐｒＭおよびアミノ末端３ ６％Ｅをコードする位置−２１から−ＩＨ６プロモーターＤＥＮヌクレオチド３ ５０−１４４７）およびＤＥＮ３２からの５ａｃｌ−Ｘｈｏｌ断片（カルボキシ 末端６４％Ｅおよびアミノ末端１８％ＮＳＩヌクレオチドをコードする）を上述 したＤＥＮ３１からのＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩ断片に連結し、ＤＥＮ３４を産生じ た。ＤＥＮ３４をｖＰ４１０に感染した細胞中に移入して、組換え体ｖＰ９６２ を産生じた（第２０図）。オリゴヌクレオチドＤＥＮＩ（配列認識番号１２５） 　、ＤＥＮ２　（配列認識番号１２６）、ＤＥＮ９　（配列認識番号１２７）　 、ＤＥＮＩＯ（配列認識番号１２８）　、５Ｐ１１１　（配列認識番号１２９） 、およびＳＰ（配列認識番号１３０）を以下に示す：鮎１工　ｘ！２ｊ１１ ゛　凪１工Ｉ 実施例１７−修飾ＮＹＶＡＣウィルスの構成ワクシニアの左側末端に近い［Ｃ７ Ｌ−ＫＩＬ］欠損のサイズを異なる程度に増大せしめ、右側末端に近い欠損をは 、Ｅ、ｃｏｌｉグアニンポスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子とミコフェノ ール酸を一過性選択システムで使用することにより行なった。

一過性優性選択 環状供与体プラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈殿プラスミドＤＮＡをワク シニア感染ベロ細胞へ移入する標準方法によりワクシニアウィルスの組換えを行 なった。２４時間後、感染細胞を収穫して、溶解産物を１マイクログラム／ｍｌ のミコフェノール酸（ＭＰＡ）の存在下で平板培養した。個々のプラークを採取 してＭＰＡの存在下でベロ細胞上で増幅した。ウィルスを収穫して、ＭＰＡが存 在しない条件でプラークの採取を２回行なってプラークを精製した。ＭＰＡなく して各回で採取したプラークをベロ細胞上で平板培養し、適切な遺伝子の存在下 でフィルターをハイブリダイゼーションした。

ＮＹＶＡＣ，１゜ ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）中に存在する［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］欠損を、隣の２つ のＯＲＦから右側のに２Ｌおよびに３Ｌを含有するように拡張せしめた。Ｋ２Ｌ 　ＯＲＦに関する推定の翻訳産生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の類に対する 相同性を示す（ボースネル、１９８Ｂ）。しかしながら、ワクシニアゲノムのこ の領域の転写地図作成は発現されない（マルガンら、１９８４）。

Ｋ３Ｌの翻訳産生物は、セリン（アミノ酸５１）ホスホリル化部位に亘り重複す る８７アミノ酸に亘る真核性阻害因子２アルフア（ｅｌＦ−２アルフア）に対し て２８％の相同性を示す。ｅｌＦ−２アルフアのホスホリル化は、インターフェ ロンにより誘発された抗ウイルス状態における段階であり、ワクシニアがインタ ーフェロンの効果を回避する機構には、ワクシニアに３Ｌ遺伝子産生物が必要で あることを示す。ワクシニアのコペンハーゲン菌株からのに３Ｌ遺伝子を欠損せ しめた（ビーティーら、１９９１）。産生じたウィルスは、タンパク質合成のウ ィルス誘発の阻害とウィルス複製の阻害により測定されるような生体外インター フェロンに対して増大した感度を示した。これにより、ワクシニアウィルスから のに３Ｌの欠損は、ワクチン接種の合併症の場合にはインターフェロンにより制 御されるより安全なワクチン菌株となることが示される。

Ｃ７Ｌからに３Ｌが欠損したプラスミドｐＭＰＣ７に３ＧＰＴの構成 ［Ｃ７Ｌ−に３Ｌ］欠損を側腹に有する左右ワクシニアアームを別々に組み立て た。左アームをｐｓＤ４２０から誘導しくパーカスら、１９９０）　、中間欠損 プラスミドｐＭＰ２５６／２５７中に組み立てた（パーカスら、１９９１）。合 成オリゴヌクレオチドＮＰＳＹＮ３７９　（配列認識番号１３１）　、ＭＰＳＹ Ｎ３８０　（配列認識番号１３２）を、テンプレートとしてプラスミドｐｓＤ４ ２０を用いたＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いた。差錬成した０、１４ ｋｂ断片をＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／ＢｇｌＩ　Ｉで切断し、ｐＭＰ２５６／２５７ に挿入して、プラスミドの左アームを置換した。産生じたプラスミドをｐＭＰ３ ７９／３８０と称した。０．７ｋｂ　５ａｌＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ４２０ から単離して、Ｓａ　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩで切断したｐＭＰ３７９／３８０１． ：連結し、プラスミドｐＭＰＣ７Ｆ４を形成した。

Ｋ３Ｌの右側の配列を含有する右側欠損接合部を構成するために、合成オリゴヌ クレオチドＭＰＳＹＮ３８１／ＭＰＳＹＮ３８２　（配列認識番号１３５／配列 認識番号１３をアニールしてＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＵＣ８に連結 し、プラスミドｐＭＰ３８１／３８２を形成した。

１．０ｋｂ　ＨｐａＩ　（部分的）／ＥｃｏＲＶ断片をクローニングしたワクシ ニアＨｉｎｄｌｌＩ　Ｋから単離して、ｐＰ３８１／３８２に連結し、金縁右側 ワクシニアフランキングアームを含有するプラスミドｐＭＰＫ３Ｒを形成した。

左側ワクシニアフランキングアームを０．８ｋｂＢｇｌｌｌ（部分的）／Ｈｉｎ ｄＩＩＩ断片としてのｐＭＰＣ７Ｆ４から単離して、ＢａｍＨ１／Ｈｉｎｄｌ　 Ｉ　ｌで切断したｐＭＰＫ３Ｒに挿入した。産生じたプラスミド、ｐＭＰＣ７に ３は、１４遺伝子［Ｃ７Ｌ−に３Ｌ］が欠損している。

選択可能なマーカーとしての使用のために、グアニンホスホリボシルトランスフ ェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）をコードするＥ、ｃｏｌｉ遺伝子（ブラットら、１９ ８３）を、ポックスウィルスプロモーターの制御下で配した。昆虫ボックス４２ ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子から直接上流の３１Ｍ＋プロモーター要素 は、感染後の初期に組換えワクシニアウィルスの強力な真プロモーターとして機 能できる。３１ｂｐ　ＥＰＶ４２ｋＤａプロモー９−を含−Ｋするアニールした 合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３６９／３７０（配列認識番号１３５／配列 認識番号１３６）ＴＡＴｆｆＩ’ＡＴＣＴＡＧ　５１ を、ｐＢＳ−ＳＫバックグラウンドのＥｃｏｇｐｔ遺伝子ら上流に連結し、プラ スミドｐＭＰ４２ＧＰＴを産生した。

４２ｋＤａプロモーター／　Ｅ　ｃ　ｏ　ｇ　ｐ　を遺伝子発現カセツテを含有 するＳｍａ　Ｉ断片をｐＮＰ４２０ＰＴから単離して、ｐＵＣ／ワクシニア接合 部でのＳｍａ　Ｉ部位のワクシニア欠損プラスミドｐＭＰＣ７に３に挿入した。

産生じたプラスミド、ｐＭＰＣ７に３ＧＰＴをｖＰ８６６　（ＮＹ’ＶＡＣ）中 に移入した。一過性優性選択システムにおける組換えの中間産生物の選択に関し て培養培地にミコフェノール酸を用いた（フォーフナ−ら、１９９０）。選択的 な圧力の除去後に、Ｋ２Ｌ　ＤＮＡ配列の損失したプラークハイブリダイゼーシ ョンとに４Ｌの保持により、後代ウィルスをスクリーニングした。欠損接合部の 適合度をＰＣＲおよびＤＮＡ制限および配列分析により確認した。組換えワクシ ニアウィルスｖＰ９５４　（ＮＹＶＡＣ，１，）は、［Ｃ７Ｌ−に３Ｌ］欠損、 並びにＮＹＶＡＣに仔在する池の欠損（ＴＫ、　ＨＡ、　ＡＴ　Ｉ、１４Ｌ、［ ８１３−８１４］）も含有する。

ＮＹＶＡＣ，２゜ Ｎ　Ｙ　Ｖ　Ａ　Ｃ１，：存在する［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＩ欠損を、３８のＯＲＦ、 ［Ｃ２３Ｌ　−Ｆ　４　Ｌｌの合計を含有するように両方向に拡張した。これは 以前にワクシニア欠損変異体ＶＰ７９６に報告した同一の欠損である（パーカス ら、１９９１）。拡張した欠損領域で除去した著しいＯＲＦは、ＮＹＶＡＣ欠損 の左側に位置するワクシニア成長因子（ＶＧＦ　；　Ｃ１１Ｒ）をがんゆうする 。ＶＧＦの２つのコピーをがんゆうするワクシニアのＷＲ菌株と対称的に、Ｃ１ １Ｒは、ワクシニアのコペンハーゲン菌株中のＶＧＦをコードする唯一のＯＲＦ である。ＷＲからのワクシニア成長因子の両方のコピーの欠損は、家ウサギの皮 肉接種で皮膚の外傷のひどさを除去し、ネズミのウィルスの神経毒性を減少する ことが示されている（バラ−ら、１９８８）。［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損におけ る右側のＯＲＦ、Ｆ４Ｌは、リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニ・ ントの遺伝子をコードする（スラボーら、１９８ｇ）。この欠損にはＯＲＦ　Ｆ ２Ｌが含まれ、これは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｄＵＴＰａｓｅ、ヌクレオチド配列に必 要な別の酵素に対する相同性を示す（ゲーベルら、１９９０ａ、　ｂ）。Ｆ２Ｌ はまたレトロウィルスプロテアーゼに対する相同性を示す（スラボーら、１９８ ９）。

Ｃ２３ＬからＦ４Ｌの欠損したプラスミドｐＭＰＴＲＦ４０ＰＴの構成 ワクシニア欠損変異体ｖＰ７９６の産生に中間体として使用したプラスミドｐＭ ＰＬＥＮＤΔ（バーカスら、１９９ｋ）を、ｐＵＣ／ワクシニア接合部でＥＰＶ ４２ｋＤａプロモーター／　Ｅ　ｃ　ｏ　ｇ　ｐ　を遺伝子を含有するＳｍａ　 Ｉ発現カセツテを添加することにより変更した。産生じたプラスミド、ｐ〜ＩＰ ＴＲＦ４ＧＰＴをＮＹＶＡＣ中に移入した。ＭＰＡを用いた選択後に、Ｆ４Ｌ　 ＤＮＡ配列の損失のためのプラークハイブリダイゼーションとＦ５Ｌの保持によ りスクリーニングした。ＰＣＲおよびＤＮＡ制限分析により、欠損接合部の適合 度を確認した。組換えウィルスｖＰ９３８（ＮＹＶＡＣ，２，）は、［Ｃ２３Ｌ −Ｆ４Ｌ］欠損並びにＮＹＶＡＣ中に存在する他の欠損を含有する。

ＯＲＦ　Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒの欠損 ＮＹＶＡＣ中に存在するＵ欠損［Ｂ１３Ｒ−Ｂ１４Ｒコを、右側の全てのＯＲＦ 、１７のＯＲＦ　［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］の合計を含有するように拡張せしめた 。これは、以前に報告したワクシニア欠損変異体ｖＰ７５９中の同一の欠損であ る（パーカスら、１９９１）。拡張欠損領域は、その産生物が互いに２０％のア ミノ酸同一性を示す２つの遺伝子を含有する（スミスら、１９９１）。これらの 遺伝子産生物をコードするＯＲＦは、コペンハーゲンのＢ１６ＲとＢ１９Ｒを示 しくゲーベルら、１９９０ａ、　ｂ）　、これらはそれぞれＷＲ菌株中のＯＲＦ 　Ｂ１５ＲとＢ１８Ｒに対応する（スミスら、１９９１）。両方の遺伝子産生物 が典型的な信号配列を含有するワクシニアのＷＲ菌株とは違って、コペンハーゲ ンＯＲＦ　Ｂ１６の予期した翻訳産生物をアミノ末端で切断されている。Ｂ１９ Ｒは、感染後初期に発現されたワクシニア表面タンパク質（Ｓ抗原）をコードし た（ウェブら、１９９０）。Ｂ１６ＲとＢ１９Ｒの両者は、免疫グロブリン上材 、特にＩＬ−１受容体に対する相同性を示す。

ワクシニア遺伝子産生物の１つまたは両方は、ワクシニアが、シトキン（ｃｙｔ ｏｋｉｎｅｓ）を結合せしめ、それゆえ宿主炎症応答を減少せしめることにより 免疫システムを避けるのを助けることが示唆されている（スミスら、■９９１） 。

Ｂ１３ＲからＢ２９Ｒの欠損したプラスミドｐＮＰＴＲＢ１３ＧＰＴの構成 ワクシニア欠損変異体ｖＰ７５９およびｖＰ８１１の産生に中間体として用いた プラスミドｐＭＰＨＥＮＤΔ（パーカスら、１９９１）を、ｐＵＣ／ワクシニア 接合部でＥＰｖ４２ｋＤａプロモーター／　Ｅ　ｃ　ｏ　ｇ　ｏ　を遺伝子を含 有するＳｍａ１発現カセツテの添加により変更した。産生じたプラスミド、ｐＭ ＰＴＲＢ１３ＧＰＴをＮＹＶＡＣ中に移入した。ＭＰＡを用いた選択の後に、Ｂ １５ＤＮＡ配列の損失したプラークハイブリダイゼーションと８１２の保持によ り、後代ウィルスをスクリーニングした。ＰＣＲとＤＮＡ制限分析により欠損接 合部の適合度を確認した。組換えウィルスｖＰ９５３は、［Ｂ１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ ］欠損並びにＮＹＶＡＣ中にｔ／：在する他の欠損をコーする。

左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］欠損と右側［Ｂ１３Ｒ−８２９Ｒ］欠損の結合 ワタシニアウイルスの左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］と右側［８１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］ 末端の両方で欠損を自存する、真ワタシニア欠損変異体ｖＰ８１１の産生を記載 した（ノクーカスラ、１９９１）。ｖＰ８１１は、ワクシニア宿主範囲遺伝子、 Ｃ７Ｌおよび選択可能マーカーＥｃｏｇｐｔの両者を含有する。ＮＹＶＡＣバッ クグラウンド中にＣ７ＬまたはＥｃｏｇｐｔを有さない巨大末端欠損を含有する ウィルスを産生するために、ｖＰ９５３による組換えの供与体プラスミドとして ｐＭＰＴＲＦ４ＧＦＴを用いた。後代ウィルスは上述した一過性優性選択システ ムにおいてＭＰＡにより選択され、Ｆ４Ｌ　ＤＮＡ配列の損失したブラークツ＼ イプリダイゼーションとＦ５Ｌの保持によりスクリーニングされている。組換え ウィルスｖＰ９７７は、［８１３Ｒ−Ｂ　２９　Ｒ１および［Ｃ２３Ｒ−Ｆ４Ｌ ］の欠損並びにＮＹＡＶＣ中に存在する他の欠損を含有する。ｖＰ８１１のよう に、ｖＰ９７７は、ワクシニア末端反復のコピーの両方からの全ての遺伝子が欠 損している。

実施例１８−宿主制限ポックスウィルスによるＨＩＶ遺伝子産生物の発現 この実施例は、ＨＩＶ−１遺伝子産生物を発現する宿主制限ポックスウィルスの 産生を記載するものである。使用したベクターはＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣである 。

細胞およびウィルス ＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣウィルスベクターおよびそれらの誘導体を前述したよう に繁殖せしめた（ピッチｍ＝ら、１９８９　；ティラーら、１９８８ａＳｂ）。

ベロ細胞と主要ひな胚胎繊維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）を前述したように増殖せしめた （ティラーら、１９８８ａ、ｂ）　。Ｐ８１５ネズミの肥満細胞種（Ｈ−２’） をＡＴＣＣ（＃ＴＩＢ６４）から得て、１０％の胎児の子牛血清ＣＦＢＳおよび １００１ｕ／ｍｌペニシリンおよび１ｍｌ当たり１００μｇのストレプトマイシ ンを補給したイーグルＭＥＭ中に保持した。

ネズミ メスＢＡＬＢ／ｃ　Ｊ　（Ｈ−２’　）ネズミをジャクソン研究所（ＭＥ、バー ハーバ−）から購入し、不断給餌で保持した。全てのネズミは、生後６から１５ 週間のものを用いた。

培地 免疫学的アッセイのアッセイ培地は、１０％のＦＢＳ。

４ｍＭのし一グルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒドロキシエチル ピペラジン−Ｎ′　−２−二タンスルホネート）　、５Ｘ　１０−５Ｍの２−メ ルカプトエタノール、１ｍｌ当たり１００ＩＵのペニシリン、および１００μｇ ／ｍｌのストレプトマイシンを補給したＲＰＭ１１６４０培地からなるものであ った。スチム（ｓ　ｔ　ｉｍ）は、４ｍＭのし一グルタミン、１０−’Ｍの２− メルカプトエタノール、１ｍｌ当たり１００ＩＵのペニシリン、および１ｍｌ当 たり１００μｇのストレプトマイシンを補給したイーグル最小必須培地からなる 。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　エンベローブノエピトーブオヨびｖ３ループを含 有するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ組換え体 ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　のＶ３ループを包含する１５０ｂｐ（アミノ酸２ ９９−３４４　、ジャブヘリアンら、１９８９）を、テンプレートとしてのｐＨ ＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）を有するオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ５　（配 列認識番号１（５市−人ＴＧＧＴＡＧＡＡＡＴＴＡＡＴｒＧＴＡＣ−３’）およ びＨＩｖ３ＢＬ３（配列認識番号１３８）（５雷−ＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡ ＡＧＣＴ’ｒＡＴＴＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＡＡＴＧＴｒＡＣ−３１）（Ｍ Ｄ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガロにより供給された）を用い たＰＣＨにより誘導した。オリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ａ（配列認識番号１３ ９）オヨびＨＩＶ８８Ｂ（配列認識番号１４０）をともにアニールして、ＨＩＶ −１エピトープ８８を含有ファーマンら、１９８９）。相補性配列の（ｊ在によ るＰＣＲにより、エピトープを含有する１５０ｂｐ　Ｖ３含有ＰＣＲ断片および ８８工ピトープ配列を含有する４２ｂｐ断片をともに融解せしめた。この反応は オリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃ（配列認識番号１４１）（５’　−ＡＧＴＡＡ ＴＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＣ−３’　）およびＨＩＶ３ＢＬ３　（ 配列認識番号１３８）を用いて行なった。１９２ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片は、ｖ３ ループ配列の上流で融解したエピトープ８８配列を含有する。終止コドン（ＴＡ Ａ）をオリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３Ｐに含有せしめ、読取り枠の翻訳を終 止し、開始コドンを翻訳の開始として機能するオリゴヌクレオチドＨＩＶ８８Ｃ に含有せしめ、エピトープ８８／Ｖ　３ループ融解タンパク質を発現した。

加えて、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３ＢＬ３を、ＥｃｏＲ■部位が１９２ｂ、Ｐ ＣＲ断片の３′末端に存在するように合成した。テンプレートとしてプラスミド 、ｐＡＭ１２とともに、オリゴヌクレオチドＲＧ２７３　（配列認識番号１４２ ）（５’　−ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴ Ｃ−３’　）およびＲＧ２７４（配列認識番号１４３）（５’　−ＴＴＴＡＴＡ ＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣ−３’　）を用いたＰＣＨにより、昆虫 ポックスウィルス４２ｋＤａ　（初期）プロモーターを産生じた。４２ｋＤａプ ロモーターを含有する１０８ｂｐ断片を、５′末端にＨｉｎｄｌ１１部位を含Ｈ するように合成した。断片を含ａする４２ｋＤａをキナーゼして、ＥｃｏＲＩて 切断したエピトープ８８／Ｖ３断片とＨｉｎｄｌＩＩとＥｃｏＲＩで切断したｐ 　ＲＷ８３１に連結する前にＨｉｎｄｌＩ’ｌで切断した。産生じたプラスミド をｐＣ５ＨＩＶＬ８８と称した。このプラスミドを、治療ウィルスとしてのＣＰ ｐｐとともに生体外組換えアッセイに落ちいてｖＣＰ９５を産生じた。ＡＬＶＡ Ｃ組換え体、ｖＣＰ９５は、ＣＰｐｐのｄｅ−ＯＲＦｅｄ　Ｃ５座にエピトープ ８８／Ｖ　３ループを含有する。

プラスミドｐＣ５ＨＩＶＬ８８をＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩとＥｃｏＲＩで切断して、 叙述したエピトープ８８／Ｖ　３発現カセツテを含有する３００ｂｐ断片を雌牛 じた。この断片をＬＭＰ−アガロースゲルから切除して、フェノール抽出（２× ）とエーテル抽出（１×）により単離した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃ ｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いて、単離した断片をプラント エンドした。断片をｐｓＤ５５０に連結し、ｐＳＤ５４８からの誘導体（第６図 ）をＳｍａ　Ｉで切断してプラスミドｐＨＩＶＬ８８ＶＣを産生じた。このプラ スミドを治療ウィルスとしてのｖＰ８６６とともに用いてｖＰ８７８を産生じた 。

ｖＰ８７８は、ＮＹＶＡＣのｄｅ−ＯＲＦｅｄ　Ｉ４Ｌ座にエピトープ８８／Ｖ ３ループカセツテを含有する。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）エンベロープ糖タンパク質を発現するＡＬＶＡＣお よびＮＹＶＡＣベースの組換え体ワクシニアウィルスＨ６プロモーターに３′が 隣接したＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）ｅｎｖ遺伝子からなる発現カセツテ（グオ ら、１９８９　、ティラーら、１９８８ａＳｂ）を、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡ ＣベクターニヨリＨＩＶ−１からｇｐ１６０の発現に関して操作した。オリゴヌ クレオチドＨＩＶ　３　Ｂ　１　（配列認識番号１４４）（５”　−ＧＴＴＴＴ ＡＡ？ｒＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴｒＣ’！’ｒｃＴＡｃＴＧＴＡＡＴＴｃ−３ ’　）およびＨＩＶ３Ｂ５　（配列認識番号１４５）（５”　−ＡＴＣＡＴＣＴ ＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＧＣＡＡＡＡＴＣＣＴｒＴＣ−３’　）を 用いて１．４ｋｂ断片をｐＨＸ８．２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）（ＭＤ１ベセスダ、Ｎ ＣＩ−ＮＩＨ，Ｄｒ、Ｒ，Ｃ，ガロにより供給された）から増幅せしめた。この 断片は、ｅｎｖ遺伝子の３′部分を含有する。これらのプライマーによるＰＣＲ 増幅は、暗号配列の後にワクシニアウィルス初期転写終止Ｔ５ＮＴ配列モチーフ を配し、アミノ酸配列を変更することなく位置６１４６から６１５２に位置した Ｔ５ＮＴモチーフ（ラトナー、１９８５）を除去した。この変化（ＴからＣ）は 、この位置にＥｃｏＲＩ　（ＧＡＡＴＴＣ）を産生ずる。この１．４ｋｂ　んべ んをＥｃｏＲＩ　（５’末端）とＸｂａｌ（３’末端）で切断し、ＥｃｏＲＩと Ｘｂａｌで切断したｐＢＳ−８Ｋ　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に挿入 した。産生じたプラスミドをｐＢＳＨＩＶＥＮｖｌ、５と称した。この断片のヌ クレオチド配列分析により、配列は位置７８４８でのＴからＣの塩基転移を除い て完坐に正確であることが示された。この塩基転移は以下のようにｔ確であった ：テンプレートとしてのｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）とともにオリゴヌクレ オチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４） （５１−ＧＴＴＴＴＡＡＴＴＧＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＴＴ（？ｒＣＴＡＣＴＧＴ ＡＡＴＴＣ−３’　）オヨびＨＩＶ３Ｂ１７　（配列認識番号１４６）（５’　 −ＴＧＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＧＧＴｆ’Ｃ−３’　）を用いてＰＣＨにより２ ５０ｂｐ断片を誘導した。この断片をＢｇｌｌｌとＥｃｏＲＩで切断した。この 断片を、Ｇｇ１ｌｌとＥｃｏＲＩで切断したｐＢｓＨＩＶ３Ｂ１．５に挿入し、 それゆえ不正確なヌクレオチドノ領域と置換してプラスミドｐＢｓＨＩＶ３ＢＢ Ｐを産生した。

テンプレートとしてのｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ　Ｉ）とともにオリゴヌクレオ チドＨＩＶ３Ｂ９　（配列認識番号１４７）（５菅−ｃｘｒｈＴｃ；ＣＴＴｗｒ ｈａｃｐｈＴｃｒａｈＴａ−３＋　）およびＨＩＶ３Ｂ１０　（配列認識番号１ ４８）（５＋−人ＴＧ入入ＡＧＡＧＣＡＧ入ＡＧＡＣＡＧＴＧ−３１）を用いた ＰＣＨにより、ｅｎｖ遺伝子の５′部分を含有する１５０ｂｐ断片を誘導した。

オリゴヌクレオチドＶＶＨ６５Ｐ（配列認識番号１４９） （５＋−人ＴＣＡＴＣＧＧＴＡＣＣＧＡＴＴＣＩ’ＴＴＡＴＴＣＴＡＴＡＣ−３ ’）オヨびＶＶＨ６３Ｐ　（配列認識番号１５０）（５１−ＴＡＣＧＡＴＡＣＡ ＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧ−３１）を用いたＰＣＲによりｐＣ３ＦＧＡＧからのワク シニアウィルスＨ６プロモーターを３自゛する１２８ｂｐ断片を産生じた。両方 の断片をＫｐｎＩで切断し、これらの断片をＫｐｎＩで切断したｐＢＳ−５Ｋに 挿入する前に、１５０ｂｐ断片をキナーゼした。産生じたプラスミドをｐＢｓＨ ６ＨＩＶ３Ｂ５Ｐと称した。

オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２　（配列認識番号１５１）（５’−ＧＡＡＴｒ ＡＣＡＧＴＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＡＡＡＡＣ−３’） オヨびＨＩＶ３Ｂ７　（配列認識番号１５２）（５“ｌ−（入ＡＴＡＧＡＴＡＡ ＴＧＡＴＡＣＴＡＣ−３’）を用いたＰＣＨにより、ｐＨＸＢ、２Ｄ　（Ｉ　Ｉ 　りがらの６００ｂｐ断片を産生じた。この断片をＥｃｏＲｌで切断し、キナー ゼした。同一のテンプレートであるが、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ６　（配 列認識番号１５３）（５’−ＧＴＡＴＴＡＴＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＴＡＴＡＡＴ ＡＡＴＧＣＡＴＡＴｒＣ−３’）およびＨＩＶ３Ｂ８（配列認識番号１５４）（ ５１−Ｇ’ｆ’ｒＧＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧＴＧＣ−３普）を用いたＰＣＨによ り、５００ｂｐ断片を誘導した。この断片をＫｐｎＩで切断した。これらの断片 は、ヌクレオチド５８７８から６３６８にともに対応するものである（ラトナー ら、１９８５）。これらのプライマーによりこれらの断片の操作はまた、アミノ 酸配列を変更することなく、ヌクレオチド６３３２から６３２８に位置するＴ５ ＮＴ配列を除去する。これらの２つの断片をＫｐｎｌとＥｃｏＲＩで切断したｐ ＢｓＨＩＶ３Ｂ３Ｐに挿入した。このプラスミドをｐＢｓＨＩＶ３ＢＰ２７６８ と称した。

プラスミドｐＢｓＨ６ＨＩＶ３Ｂ５ＰをＫｐｎｌで切断し、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺 伝子の５′部分（１５０ｂｐ）およびＨ６プロモーターを含有する３６０ｂｐ断 片を雌牛じた。このＫｐｎｌ断片をＫｐｎｌで切断したｐＢｓＨＩＶ３ＢＰ２７ ６８に連結し、プラスミドｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＡＩＩを産生した。Ｘｂａｌの切 断と続いての部分的なＫｐｎｌの切断により２．８ｋｂ断片をｐＢＳＨＩＶ３Ｂ ＥＡＩＩから誘導した。この断片をプラントエンドし、Ｓｍａｌで切断したｐｓ Ｄ５５０に挿入した。プラスミドｐＩ４ＬＨ４ＨＩＶ３Ｂを産生じ、治療ウィル スとしてのＶＰ８６６とともに生体外組換え実験に用いた。これにより、ＮＹＶ ＡＣゲノムのＩ４Ｌ座にＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子を含有するｖＰ９１１が産生せ しめられた。

ＨＩＶ−１ｅｖｎ遺伝子をＡＬＶＡＣベクターに挿入するために、ｐＢｓＨＩＶ ３ＢＥＡＩ　ＩをＮｒｕｌとＸｂａＩで切断した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片で誘導した２、７ｋｂ断片を プラントエンドした。この断片は、ワクシニアＨ６プロモーターの３′末端側の ２１ｂｐ（Ｎｒｕ１部位に対して）に３′が隣接した金縁ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝 子を含有する。ｐ　ＲＷ８３８のＮｒｕ　ＩとＥｃｏＲＩによる切断と続いての フレノウによるプラントエンドにより誘導した３、１ｋｂ断片に、この断片を連 結した。ｐ　ＲＷ８３８誘導断片は、カナリヤボックスから誘導した相同アーム を含有し、異種遺伝子を０５座に向ける。この断片はまた、Ｈ６プロモーターの ５′末端側の１００ｂｐを含有する。それゆえ、これらの断片の連結により、Ｈ ＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の発現カセツテを含有する挿入プラスミドが産生され、こ れをｐＣ５ＨＩＶ３ＢＥと称した。治療ウィルスとしてとＡＬＶＡＣによる生体 外組換え実験にこのプラスミドを用いてｖｃＰ１１２を産生じた。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）ｇｐ１２０を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体 プラスミドｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＡＩ　ＩをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、４． ３ｋｂ断片を雌牛じた。この断片は、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子に連結したワクシ ニアウィルスＨ６プロモーターからヌクレオチド６９４６を含有する（ラトナー ら、１９８５）　、　４．　３　ｋ　ｂ断片を、ｇｐ１２０暗号配列の３′部分 に対応する３００ｂｐのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｘｂａｌ切断ＰＣＲ誘導断片に 連結した。テンプレートとしてのｐＨＸ８．２ＤとともにオリゴヌクレオチドＨ ＩＶＩ−１２０Ａ（配列認識番号１５５　）　（５’−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧ ＡＡＴＡＡＡＡＡ’Ｉ’ｒＡＴＧＧＴＴＣＡＡ？ｒｒ’ｒｒＡＣｒＡＣ’ｆ’ｆ ｆ！’ＡＴＡＴｒＡＴＡＴＡＴＩＴＣ−３’　）オヨびＨＩＶＩ−１２０Ｂ　（ 配列認識番号１５６）（５雪−ＣＡＡＴＡＡＴＣｒＴＴＡＡＧＣＡＡＡＴＣＣｒ Ｃ−３’　）を用いて３００ｂｐ　ＰＣＲ断片を誘導した。４．３ｋｂＸｂａｌ ／ＥｃｏＲＩ断片と３００ｂｐ　Ｘｂａｌ／ＥｃｏＲＩ断片の連結により、プラ スミドｐＢＳＨＩＶＢＩ２０を産生した。

最初にプラスミドをＸｂａｌで線状化して続いて部分的にＫｐｎｌ切断により１ ，６ｋｂのＫｐｎｌ／Ｘｂａｌ断片をｐＢｓＨＩＶＢ１２０から誘導した。２ｍ ＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片によ る処理でプラントエンドした。この断片をＳｍａＩで切断したｐＳＤ５４ＩＶＣ に挿入し、ｐＡＴＩＨＩＶＢ１２０を産生じた。このプラスミドを生体外組換え 実験に用いてｖＰ９２１を産生じた。この組換え体は、ＮＹＶＡＣ（７）ＡＴＩ 座においてｇｐ１２０をコードす６ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の部分を含有する。

イムノブレシピテーション ｖＰ９１１、ｖＰ９２１およびｖｃＰ１１２により発現されたＨＩＶ−１遺伝子 産生物の真正を決定するために、イムノブレシピテーション分析を行なった。ベ ロ細胞単層を、ｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で、疑似感染、親ウィルスｖＰ ８６６、または組換えウィルスに感染せしめた。

１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、細胞を２ｍｌのＭＥＭ　（２％のＦＢ Ｓおよび［”Ｓ］−メチオニン（２０ｕＣｉ／ｍｌ）を含有するマイナスメチオ ニン）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０，３０ｍＦｖ１ のトリス　ｐＨ７，４，１５０ｍＭのＮａ、ＣＩ、３ｍＭのＥＤＴＡｌｏ、０３ ９６のＮａ　Ａｚｉｄｅ、および０゜６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）を添加して続い て細胞単層を書き取ることにより、感染から１８時間後に細胞を収穫した。

感染細胞から誘導した溶解産物を、ＨＩＶ−１血清陽性個体（ＭＤ、　ＮＣＩ　 −Ｎ　Ｉ　ＨＳＤ　ｒ、ゲノベファフランチー二から得た）から集積した血清を 用いてＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。この血清をｖＰ感染ベロ 細胞で前に吸着せしめた。前に吸着せしめたヒトの血清を４℃の１晩のインキュ ベーションによりタンパク質Ａプロテアーゼに結合せしめた。ある場合には、ｇ ｐ１２０に特異的な単クローン性抗血清（デュポン）を主要血清とて用い、第２ の抗体としてラット抗ネズミを用いた。このインキュベーション期間の後に、物 質を１×の緩衝液Ａで４回洗浄した。次いでタンパク質Ａセファロースに結合し た血清陽性の個体からのヒトの血清とともに、通常のヒト血清とタンパク質Ａセ ファロースにより前に浄化した溶解産物を４℃でインキュベーションした。１晩 のインキュベーション期間の後に、試料を、１×緩衝液Ａと２ＸＬ　ｉ　Ｃ１２ ／尿素緩衝液で４回洗浄した。２Ｘのラエムリス緩衝液（１２５ｍＭのとリス（ ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール；１０％の２−メルカプ トエタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質 を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ド リファスら、１９８４）上で分画し、固定し、蛍光光度法のためにＩＭのＮａ− サリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体から集積した血ｔＮを用いたイムノブレシピテーション の結果により、ｖＰ９１１巻戦災房溶解産物からのｇｐ１６０エンベロープ糖タ ンパク質のｇｐ１２０およびｇｐ４１熟成形状の特異的な沈殿が示された。親（ ＮＹＶＡＣ；　ｖＰ８６６）感染細胞溶解産物にはそのような特異的遺伝子産物 を検出されなかった。ｇｐ１２０の特異的沈殿はまたｖＰ９２１感染細胞溶解産 物にも見られた。

同一の血清によるイムノプレシビテーション分析により、それぞれｖＰ９１１お よびｖＰ９２１により発現されたｇｐ１６０およびｇｐ１２０種は、感染細胞の 表面に存在したことが示された。

イムノブレシピテーションを、ｖｃＰ１１２感染細胞に関しても行なった。ＡＬ ＶＡＣ親ウィルスに感染した細胞および未感染細胞からのｇｐ１２０細胞外部分 に対して向けられた単クローン性抗体に関しては、ＨＩＶ−特異的ポリペプチド は沈殿しなかった。しかしながら、２つのＨＩＶ特異特異的ポリペトチ１種ｖｃ Ｐ１１２感染細胞がらは沈殿した。これらの種は、それぞれ前駆体ｅｎｖ遺伝子 産生物および熟成細胞外形状に対応する１６０ｋＤａおよび１２０ｋＤａの明確 な移動度で移動した。

接種 外側の尾の静脈により、０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中５Ｘ１０’プラーク 形成単位（ＰＦＵ）をネズミに静脈接種せしめた。

ひ臓細胞調製 頚部の脱臼による安楽死の後に、ハンクス平衡塩溶液を含有する無菌のプラスチ ックバッグに、ネズミのひ臓を移した。単一の実験群からの個々のひ臓または集 積したひ臓を、ストマツチャーブレンダ−中での１分間のサイクルにより１つの 細胞懸濁液に処理した。ひ臓細胞懸濁液を、アッセイ培地またはスチム培地のい ずれかで適切に数回洗浄した。血球計算盤および顕微鏡を用いて、トリバンブル ー染料排除により、またはカトラーカウンターの使用によりひ臓細胞を枚挙した 。

血清 ネズミにエーテルで軽く麻酔をかけ、血液をレトロオービタル集網から集積した 。実験群からなるネズミからの血液を集積し、凝固せしめた。血清を集積し、使 用まで一７０℃で貯蔵した。

第２の細胞毒性１９２８球（ＣＴＬ）の産生のための生体外刺激 様々な実験群（応答細胞）からの集積したひ臓細胞まをスチム培地中で５Ｘ１０ ６細胞／ｍｌまで希釈した。同系の未経験のネズミ（刺激要因）からのひ臓細胞 を、１ｍｌ当たり１ｘ１０７まで希釈して、細胞光たり２５ｐ　ｆ　ｕのｍ、ｏ 、ｉ、で適切なワクシニアウィルスにより３７℃で２％のＦＢＳを含有する組織 培養培地中において１時間、感染せしめた。感染後、刺激要因細胞をスチム培地 中で数回洗浄し、スチム培地により１ｍｌ当たり１×１０６細胞まで希釈した。

５ｍｌの刺激要因細胞と５ｍｌの反応細胞を、２５Ｃｍ３の組織培養フラスコに 加え、５％のＣＯ２中で３７℃、直立して５日間インキュベーションした。アッ セイの日に、ひ臓細胞をアッセイ培地中で数回洗浄し、顕微鏡を使用したトリパ ンブルーの血球計算盤で数えた。

標的細胞の調製 ワクシニア特異的ＣＴＬ活性に関して、組織培養細胞を、３７℃で１時間に細胞 当たり２５ｐ　ｆ　ｕのｍ、ｏ、ｉ、での２％のＦＢＳを含有する組織培養培地 中に１ｍｌ当たりＩ　Ｘ　１０’細胞でのインキュベーションにより一晩感染せ しめる。インキュベーション後、細胞を、１０％のＦＢＳを含有する組織培養培 地により１　ｍ　１当たり１−２Ｘ１０６細胞の間に希釈し、使用するまでさら に５％のＣＯ２中してζ組織培養細胞を、それぞれＨＩＶ−１単離体ＩＩＩ、、 ＳＦ２、およびＭＮのｇｐ１２０のｖ３ループ領域に対応する２０ｐｇ／ｍｌの ペプチドＨＢＸ２　（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンバイオチクノロシーズ） 、ＳＦ２（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンノくイオテクノロジーズ）、または ＭＮ　（ＭＡ、ケンブリッジ、アメリカンノくイオテクノロジーズ）で−晩イン キユベーションした。ア・ソセイの日に、アッセイ培地中での遠心分離により標 的を数回洗浄した。最後の洗浄後、約１００ＢＣｉのＮａ２”Ｃｒ０ａ　（”Ｃ ｒ）中で再懸濁せしめた。３７℃での１時間のシンキュベーション後、遠心分離 によりアッセイ培地中で少なくとも３回洗浄し、血球計算盤上で計測し、アッセ イ培地中でｌＸｌ０’／ｍｌに希釈した。

細胞毒性アッセイ 第１のＣＴＬアッセイに関して、新鮮に調製したひ臓細胞を１ｍｌ当たりｌＸｌ ０’細胞までアッセイ培地で希釈した。第２のＣＴＬアッセイに関して（生体内 接種または生体外刺激のいずれかの後の）、ひ臓細胞をアッセイ培地中で２Ｘ１ ０’／ｍｌまで希釈した。０．１ｍｌのひ臓細胞懸濁液を、９６ウエル（ｗｅｌ ｌ）の丸底マイクロタイタ板（ＥＸＰ）のウェル中で５ＩＣ，標識標的細胞に加 えた。

はとんどの場合、第１のＣＴＬ活性に関してアッセイされるひ臓細胞は、標的細 胞の添加の前に、マイクロタイタ委のウェル中でさらに２倍に希釈した。”Ｃｒ 　（ＳＲ）の自発的放出の測定の場合、標的細胞をアッセイ培地のみでインキュ ベーションした。”Ｃｒ　（ＭＡＸ）の最大放出を測定するために、アッセイの 初めに、０．１ｍｌの１０％ナトリウムドデシル硫酸塩を適切なウェルに加える ことにより、標的細胞を慎重に溶解せしめた。アッセイを開始するために、マイ クロタイタ板を２分間２００Ｘｇで遠心分離し、５％のＣＯ２中、３７℃で４． ５時間インキュベーションした。インキュベーション後、各ウェルの培養上澄み を、スカトロン上澄み集積システムを用いて集積した。ベックマン５５００Ｂガ ンマカウンターにより放出した５１Ｃｒを測定した。特異的細胞毒性のパーセン トは、以下の式によるカウントから決定した： 細胞毒性％−（ＥＸＰ−５Ｒ）／　（ＭＡＸ−３Ｒ）ｘ１００単クローン性抗Ｃ Ｄ４と単りローン性抗ＣＤ８を用いたＴヘルパー細胞と細胞毒性Ｔリンパ球の欠 損抗ＣＤ４　（単クローン性抗体１７２．４）の１：５の希釈物または抗ＣＤ８ 　（単りローン性抗体抗Ｌｙｔ２．２）の１　：　２００の希釈物およびセダー レインロー−ドックス家ウサギ補体の１＝１６の希釈物を含有する細胞毒性培地 （０，２％のＢＳＡおよび５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するＲＰＭ１１６４０）中 で１０’／ｍｌの密度にひ臓細胞懸濁液を希釈した。単一成分の適切な対照（補 体、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８）を含有した。

抗ＨＩＶ−１ｇｐ１６０　ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡ板のウェル（イムロン１１）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中で１１ ００ｎの精製ＨＩＶ−１ｇｐ１６０　（ＮＣ，ダーハム、デューク大学、Ｄｒ、 Ｄ、ポログネシーにより提供された）により４℃で一晩被膜した。次いでその板 を、０．０５％トイーン２０を含有する食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳＴ）により 洗浄した。次いでその板を、１％の子牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰ ＢＳＴで３７℃で２時間ブロックした。ＰＢＳＴによる洗浄後、０．１％のＢＳ Ａを含有するＰＢＳＴ　（希釈緩衝液）で血清を最初に１：２０に希釈した。Ｅ ＬＩＳＡ板のウェル中で血清をさらに２倍に希釈した。板を３７℃で２時間イン キュベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。ウサギ抗ネズミイムノグロブリン（Ｄ ＡＫＯ）に接合したホースラディツシュペルオキシダーゼを、希釈緩衝液出１　 ：　２０００に希釈史、ＥＬＳＡ板のウェルに加え、３７℃で１時間シンキュベ ーションした。ＰＢＳＴでの洗浄後、基質緩衝液中のσＰＤ　（ｏ−フェニレン ジアミンジヒドロクロライド）を加え、約２０分間周囲温度で色を呈させた。２ ．５ＭのＨ，ＳＯ，の添加により、反応を終わらせた。バイオチックＥＬ−３０ ９ＥＬ　Ｉ　ＳＡリーダーで４９０ｎｍでの吸収を測定した。血清の終端は、１ ．０の吸収値を与えた希釈の逆数として定義した。

リンパ球増殖反応測定 各ネズミからのひ臓細胞の単一の細胞懸濁液をアッセイ培地で２Ｘ１０’／ｍｌ まで希釈し、アッセイ培地のみ、１．５、または１０ｐｇ１７）ＨＩＶ−１ペプ チドＴ１．１．５、または１０ｐｇのＨＩｖ−１ペプチドＴ２、オヨび１、また は１０ｐｇの精製ＨＩＶ−１ｇｐ１６０　（イムノ）を含有する９６ウエル、平 底マイクロタイタ板のウェルに加えた。細胞を５％のＣＯ２中、３７℃で５日間 インキュベーションした。最終の６時間のインキュベーションのために、１．０ はμＣｉの［３Ｈ］−チミジンまを各ウェルに加え、ケンブリッジＰＨＤ細胞収 穫器を用いてベックマンレディーフィルター上で収穫した。フィルターディスク を液体シンチレーションカウンター中でドライカウントした。

刺激指数−ＣＰ　Ｍｇｘｐ　／　ＣＰ　Ｍｖｇｏ＋ｕＭ結果：ＨＩＶ　ｇｐ１２ ０を発現する組換えワクシニアウィルスは、主要ＨＩＶ特異的細胞毒性Ｔリンパ 球活性を誘発する ５７１ｏｔ　ＰＦＵのワクシニアウィルス組換え体ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、ま たはｖＰ９２１、または、対照としてのＮＹＶＡＣベクターでのｉｖ投与の後に 、ペプチドＨＢＸ２で一晩インキユベーションした有性生殖Ｐ８１５細胞に対し て、Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミのひ臓ＣＴＬ活性を評価した（表２０）、Ｈ ＩＶ　ｇｐ１２０を発現するｖＰ９２１を投与したネズミのひ臓において、適度 であるが、著しい（Ｐ＜０．０５）の主要ＣＴＬ活性が産生された。どの法の組 換えワクシニアウィルスまたはＮＹＶＡＣ親ベクターも、主要ＨＩＶ特異的ＣＴ Ｌ活性を誘発できなかった。

これは、主要ワクシニア特異的ＣＴＬ活性に応答したワクシニアウィルスをネズ ミの各群に投与したときの不適切な感染のためではなかった。対照である、免疫 しなかったネズミも標的には応答しなかった。

ＨＩＶ　ｅｎｖペプチドを発現する組換えポックスウィルスは、ＨＩＶ特異的記 憶細胞毒性Ｔリンパ球を産生ずる組換えワクシニアウィルスの１つを１同棲種し てから少なくとも１か列後、ネズミひ臓細胞を、ＮＹＶＡＣまたは各ＨＩＶ組換 えワクシニアウィルスに事前に感染した有性生殖未経験ひ臓細胞で生体外刺激し た（表２１）。ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、またはｖＰ９２１で免疫化したネズミ のひ臓細胞培養中のみに強いＩ（ＩＶ特異的ＣＴＬ活性を検出され、この培養は 、同一のワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体（ｖＰ８７８、ｖＰ９１１、または ｖＰ９２１）のうちみ１つに感染した細胞で生体外で再刺激された。）ＩＩＶ　 ｇｐ１２０またはｇｐ１６０を発現するワクシニアウィルス組換え体は、８８エ ピトープに融合されるｖ３ループのみを発現するワクシニアウィルス組換え体よ りも良好に記憶ＣＴＬを産生できた。ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性は、免疫化し なかった対照またはＮＹＶＡＣ免疫化ひ臓細胞からは誘発できなかった。使用し たいかなるワクシニアウィルスに感染したひ臓細胞での生体外刺激の後に明確で あったので、ワクシニア特異的記憶ＣＴＬ活性がベクター免疫したネズミにはな いことは乏しい免疫化のためではなかった。

同様の研究において、８８エピトープ（ｖ　ＣＰ　９５）に融合されるｖ３ルー プ領域を発現するカナリヤボツクス組換え体のＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬを産生ず る能力を試験した（表２２）、１０’　ＰＦＵのｖＣＰ９５またはＡＬＶＡＣベ クターの１回の接種から３週間後、ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ応答、ＣＰｐｐを、 組換えワクシニアウィルスアナログ、ｖＰ８７８により誘発された応答と比較し た。ワクシニアおよびカナリヤボックスＣＴＬ応答は、適切な免疫化の対照とし て含んだ。ｖＰ８７８およびｖＣＰ９５面液化ネズミかネズひ臓細胞のみが、ｖ Ｐ８７８により刺激されたＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性を示した。機能的な細胞 溶解性ＣＴＬに対して、存在する記憶ＣＴＬを刺激するＶＣＰ９５の不能は、ワ クシニアウィルス組換え体の使用に基づ責て最大にせしめられた生体外条件に関 連する。いうまでもな（、ｖＣＰ９５は、免疫化ネズミのひ域中に著しいＨＩＶ 特異的記憶ＣＴＬを産生ずることができた。

生体外刺激細胞毒性細胞の特徴付け ＨＩＶペプチド瞬間標的細胞に対して細胞毒性を介在する細胞が、ナチュラルキ ラー細胞のようなＣＴＬに関連のない非特異的エフェクター細胞の個体群を表す ことが考えられる。このことを試験するために、ｖＰ９２１で免疫化し、νＰ９ ２１感染ひ臓細胞で生体外刺激したネズミのひ臓細胞は、Ｔヘルパーリンパ球（ ＣＤ４）または細胞毒性リンパ球（ＣＤ８）のＴリンパ球結果表面抗原特性が枯 渇しており、Ｖ３ループペプチド瞬間標的細胞に対してアッセイした（表２３） 。前述したように、ｖＰ９１１面液化したネズミのみが、ＶＰ９２１感染有性生 殖ひ臓細胞で生体外刺激できる記憶ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性を示した。補体調製 （Ｃ′）および単りローン性抗ＣＤ４および抗ＣＤ８はある程度毒性効果を示し たが、ＣＤ８結果細胞（抗ＣＤ８＋Ｃ’　）が枯渇した培養のみがＨＩＶ特異的 細胞毒性エフェクター細胞が枯渇している。それゆえ、ＨＩＶペプチド瞬間標的 細胞に対する細胞介在細胞毒性活性は、その細胞膜上に、ＭＨＣ科■制限ＣＴＬ の特性である、ＣＤ８抗原を有した。

ＨＩ　Ｖ　ｇ　ｐ　１２０（７）Ｖ　３／ｌ／−フ領ｔ’ＡノＣＴ　Ｌ抗原受容 体認識の特異性 Ｔｖンバ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列における小さな変 更に対して鋭敏に感度を有する。

ＨＩＶ　ｇｐ１２０のｖ３領域は、超可変性であり、免疫学的にＨＩＶ単離体の 中でも異なる。この超可変性は、いくつかのアミノ酸の置換および添加にある。

ＨＩＶワクシニアウィルス組換え体により産生された細胞毒性細胞の特異性を試 験するために、ＨＩＶ単離体Ｉ　Ｉ　ＩＢ、ＳＦ２、およびＭＮのｖ３ループ領 域に対応するペプチドをパルスしたＰ８１５標的細胞の中でＣＴＬ活性に対する 感受性を比較した。ｖＰ９１１およびｖＰ９２１による免疫化のみがＨＩＶ特異 的主要ＣＴＬ活性を誘発した（表２４）。さラニ、ＨＩＶ特異的ＣＴＬ活性は、 ＨＩＶ単離体１１１ＢのＶ３ループに対応するペプチドでパルスしたＰ８１５標 的細胞のみに限られた。ワクシニアウィルス組換え体ｖＰ８７８７、ｖＰ９１１ およびｖＰ９２１による免疫化により誘発された生体外刺激したＨＩＶ特異的第 ２のＣＴＬ活性に関して同様の結果が得られた（表２５）。それゆえ、）１１Ｖ 単離体ＩＩＩＢのｅｎｖ遺伝子の様々な部分を発現する組換えワクシニアウィル スにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗原単離体から誘導された標 的エピトープのみを認識する。

ワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体により免疫化後のＨＩＶエピトープに対する リンパ球増殖応答抗原に対するリンパ球増殖は、細胞介在免疫性の生体外体性’ ［ｃｏｒｒｅｌａｔｅ）である。適切な抗原の提示は、抗原の受容体を発現する 細胞の免疫個体群において細胞増殖を誘発する。増殖の開始と継続には、溶性媒 介物によるＴヘルパーリンパ球の介在が必要である。ＨＩＶ抗原を発現する組換 えワクシニアウィルスで免疫化したネズミ中のＨＩＶ抗原に対する細胞媒介免疫 性を評価するために、２７日前に免疫化したネズミからのひ臓細胞を、Ｔ１およ びＴ２と称するＴヘルパーリンパ球エピトープに関連するペプチＦ１並びに精製 ＨＩＶ　ｇｐ１６０で５日間インキュベーションした（表２６）。ひ臓細胞培養 中には、Ｔヘルパー細胞エピトープＴ１およびＴ２に対する増殖応答は観察され なかった。しかしながら、ｖＰ９２１で事前に免疫化したネズミのひ臓細胞は、 ［３Ｈ］−チミジンの包含により測定されるように、ＨＩＶ　ｇｐ１６０に活発 に応答した。２．０より大きな刺激指数（Ｓｌ）は免疫性を示すと考えられる。

それゆえ、ｖＰ９２１によるネズミの接種は、ＨＩＶ　ｇｐ１６０に対する細胞 媒介免疫性を誘発した。

ワクシニアウィルスＨＩＶ組換え体を接種したネズミの抗体応答 ＨＩＶに対する体液性応答を評価するために、ネズミを０日にワクシニアウィル スＨＩＶ組換え体の１つで免疫化し、第５週に２回目の免疫化を行なった。ネズ ミを最初の免疫化から９週間に亘り様々な間隔で採血した。各処理群から菓積し た血清を、抗原として精製ｇｐ１６０を用いたＥＬ　Ｉ　ＳＡによりＨＩＶに対 する抗体についてアッセイした（表２７）。第１回の抗体応答は、一般的に適度 であったが、ｖＰ９１１により誘発された最高水準は、検出可能であった。第２ 回の免疫化後に、ｖＰ９１１およびｖＰ９２１で免疫化したネズミの抗体力価は 増大し、第９週にやや減少するまで、それぞれ４．６００と３，２００を越え２ １は、著しい抗体応答を誘発することができた。

表　２０ ワクシニアウィルス感染標的、およびＨＩＶ−１ｇｐ１２０の■３ループ領域に 対応するペプチドでパルスした標的に対する、ワクシニアウィルス組換え体で免 疫化したネズミからのひ臓細胞の第１のＣＴＬ活性Ｅ＝Ｔ■　１００：１ ＋ｌＩＰ＜０．０５対適切な対照、学生のｔ試験表　２１ ワクシニアウィルス組換え体での生体外刺激後のひ臓細胞の第２のＣ比活性 表示したワクシニアウィルス組換え体で約１ケ月前に免疫化したネズミからのＢ ＡＬＢ／ｃＪひ臓細胞を５日間に亘り感染有性生殖ひ臓細胞でインキュベーショ ンし、２０：ｌの標的細胞に対するエフェクター比で細胞毒性をアッセイした。

０対照と比較したＰ＜０．０５、学生のｔ−試験表　２２ 組換えウィルス、または旧Ｖ　ｇｐ１２０のｖ３ループを発現するカナリヤポッ クスウィルスを１回接種したネズミのび繊細胞の既往ＣＴＬ反応 免疫化から２３日後、ウィルス感染またはペプチドパルス有性生殖ひ臓細胞で５ 日間生体外刺激し、次いで２０：１の標的細胞対エフェクター比で、ウィルス感 染またはペプチドパルスしたＰ８１５標的細胞に対して、特異的細胞毒性に関し てアッセイした。

。適切なに・１照と比較したＰ（０，０５、学生のｔ−試験衣　２３ ＣＤ８と補体に対する単クローン性抗体による細胞毒性活性の枯渇衣　２４ １１１ｖ組換えワクシニアウィルスの１回の接種後の旧？１単離体１１１Ｂのｖ ３ループの第１のＣＴＬ活性の特異性ネズミに表示したワクシニアウィルス組換 え体を１回１ｖ接種し、７８後１：Ｐ８１５標的、オヨびＨＩＶ−Ｌ単離体１１ ＋８　、　ＳＦ２　、オヨびＭＮのＶ３ループ領域に対応する３つのペプチドの うち１つでパルスし、たＰ８１５標的に対するＣＴＬ活性に関してアッセイした 。１００：ｌ　。

５０：’１．および２５：１の標的細胞に対するエフェクターの比でアッセイし たが、１００：ｌのデータのみを示す。

”　Ｐ＜０．０５対適切な対照、学生のｔ−試験衣　２５ １１１Ｖ組換えワクシニアウィルスによる１回の接種後ＨＩＶ−１単離ｌｌｌ５ の■３ループに関する第２　ＣＴＬ活性の特異性実施例１９−ＡＬＶＡＣ，ＴＲ ０ＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中（７）ＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２またハＳ　Ｆ　−２ 菌株）ｅｎｖ遺伝子の発現 プラスミドの構成 金縁ＨＩＶ−１（ＡＲＶ−２またハＳ　Ｆ　−２菌株）ゲノムを含有するラムダ クローンを、Ｊ、レビーにより得て、これは前述したものである（サンチェスー ペスカドールら、１９８５）　ｏ　ｅ　ｎ　ｖ配列をｐＵｃ１Ｂ中にサブクロー ニングし、プラスミドｐＭＰ７ＭＸ３７３を産生した。このプラスミドは、ｅｎ ｖ遺伝子産生物の開始コドン（ＡＴＧ）に対して−１からｅｎｖ遺伝子の終止コ ドン（ＴＡＡ）の７１５ｂｐ下流までの配列を含有している。これらのｅｎｖ配 列をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉによる切断によりｐＭＰ７ＭＸ　３７３か ら切除し、プラスミドベクター、ｐＩＢＩ２５　（ＣＴ、ニューハブン、インタ ーナショナルバイオテクノロジー社）に挿入し、プラスミドｐｌＢＩ２５ｅｎｖ を組換え体プラスミドＩ）ＯＢＯ２５ｅｎｖは、応答能のあるＥ、ｃｏｌｔ　Ｃ Ｊ２３６　（ｄａｔ−ｕｎｇ−）細胞を転換するのに用いた。一本鎖ＤＮＡを、 転換Ｅ、ｃｏｌｉＣＪ２３６細胞のへルバーファージ、ＭＧ４０８による感染に より誘導したファージから単離した。この一本鎖テンプレートは、オリゴヌクレ オチドＭＵＥＮＶＴ１２はいれ１５７） （５’　−ＡＧＡＧＧＧＧＡＡＴ？ＣＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＡＣＡ−３’　 ）により生体外突然変異誘発反応（クンケルら、１９８５）に用いた。このオリ ゴヌクレオチドによる突然変異誘発により、ＴからＣ転移が行なわれ、ＡＲＶ− ２ゲノムのヌクレオチド位置６９２９−６９３５でＴ５ＣＴモチーフを分断する （サンチェスーペスカドールら、１９８５）。この突然変異は、ｅｎｖ遺伝子の アミノ酸配列を変更せず、突然変異誘発したプラスミドクローンのスクリーニン グに用いられるＥｃｏＲ１部位を産生ずる。ジデオキシヌクレオチド鎖終止法し た突然変異誘発プラスミドまをｐｌＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ１１と称した。

１．４５ｋｂのＢｇｌｌｌ断片をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖｌｌから誘導した。

この断片は、突然変異したｅｎｖ配列を含有した。この断片をｐｌＢＩｅｎｖ中 の対応未突然変異断片を置換するのに用いた。産生じたプラスミドを−ｐｌＢＩ ２５ｍｕｔｅｎｖ８と称した。さらに変更をｐＩＢＩ２５ｍｕｔｅｎｖ８に行な った。レックスタンパク質とＬＴＲ配列（ＬＴＲ領域）をコードする配列を遺伝 子の３′末端から除去し、アミノ酸５８３から５９９の推定免疫抑制（Ｉｓ）領 域（配列認識番号１５８）Ｉ、ａｕ−Ｇｉｎ−Ａｌａ−＾ｒｑ−，Ｖａｌ−Ｌ＠ ｕ−ＡＩＪｌ−Ｖ＆１−Ｇｌｕ−Ａｒｑ−’Ｉ’Ｙｒ−Ｌ＠ｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ −Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌ４ｕを欠損するために、生体外突然変異誘発を行なった（ クラッセら、１９８８）。オリゴヌクレオチドＬＴＲ２（配列認識番号１５９） （５’−ＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴｒＴＴＧ−ＧＣＡＴＧＣ（：ＡＣＧＣＧＴＣ− ３１）およびＭＵＥＮＳＶＩ　ＳＲ（配列ａ識番号１６０）（５１−ＡＣＡＧＴ ＣＴＧＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＡＧＧＧＡＴＩＴＧＧＧＧＴｒＧＣＴＣ Ｔ−コｌ）によりｐｌＢＩｍｕｔｅｎｖ８がら誘導した単一標準テンプレートに 関してこれらの反応を行なった。ハイプリダイ識した。ＩＳ領域とＬＴＲ領域の 両方が欠損し、またはＬＴＲが欠損するように突然変異誘発せしめられたクロー ンをヌクレオチド配列により確認し、それぞれｐＩＢＩ２５ｍｕｔ３ｅｎｖ４０ およびｐＩＢＩ２５ｍｕｔ２ｅｎｖ２２と称した。

金縁ｅｎｖ遺伝子を含有する３、４ｋｂのＳｍａｌ／Ｈ−ｉｎｄｌｌｌ断片をｐ ｌＢＩ２５ｍｕｔ３ｅｎｖ４０とｐＩＢ’１ｍｕｔ２ｅｎｖ２２がら誘導腰ｐｃ ＰｃＶ１に挿入し、Ｓｍａｌ／ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。プラスミドｐｃＰｃ Ｖ１は、０２組換え体の産生を可能にする挿入プラスミドである。異種遺伝子は 、０３挿入座に向いていた。

プラスミドｐｃＰｃＶ１とｐ　Ｆ　Ｐ　ＣＶ　２１；ｉ、１９８９年４月２０日 に発行されたＰＣＴ国際出願第ＷＯ３９１０３４２９号に記載され、ここに参照 文献として包含する。　ＶＶＨ６プロモーターとｅｎｖ配列により正確なＡＴＧ 　：　ＡＴＧ構造を構成するために、マンデツキの方法（１９１１［ｉ）による 生体外突然変異誘発反応に、オリゴヌクレオチドＰＲＯＶＥＣＮＳ　（配列認識 番号１６１）（５’−ＣＣＧＴＴＡＡＧＴＩ’ＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＡＡＡ ＧＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＡＧＧ−３會）を用いた。潜在的な変異体を、Ｓｍａ 　Ｉ部位の損失に関してスクリーニングした。Ｓｍａ　１部位の欠如したプラス ミドクローンを認識し、ヌクレオチド配列分析により確認した。適切に突然変異 誘発したプラスミドクローンを認識し、ＰｅｎｖＩＳ＋またはｐＦＰｅｎｖＩＳ −と称した。

Ｎｒｕ　ＩとＨｉｎｄｌＩＩでの切断により、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子をｐＣＰ ｅｎｖ　Ｉ　Ｓ−から切除した。それぞれ２．５ｋｂ　（ｅｎｖｌｓ＋）および ２．４ｋｂ　（ｅｎｖｌｓ−）の２つのｅｎｖ断片を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰ の存在下でＥ、ｃｏＬＬ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノーウ断片との反応により プラントエンドした。これらの断片を、Ｎｒｕ　ＩとＰｓｔｌにょるｐｓＩＶｅ ｎｖＶＶの切断と続いての２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポ リメラーゼのフレノウ断片によるプランティング工程により誘導した３、５ｋｂ の断片に連結せしめた。プラスミドｐＳＩＶｅｎｖＶＶは、ＡＴＩ挿入座のワク シニアウィルスＨ６プロモーターにより規制されるＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子発現カ セツテを含有する。ｐｓＩＶ　ｅｎｖＶＶのＮｒｕｌとＰｓｔｌによる切断は、 金縁ＳＩＶ　ｅｎＶ暗号配列とプロモーター要素の３′末端側の２０ｂｐを切除 する。ｅｎｖ　Ｉｓ−とｅｎｖ　Ｉｓ十断片との連結により、Ｈ６プロモーター の２０ｂｐが保存され、ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子をＡＴＩ挿入プラスミドに挿入 する。

産生じたプラスミドをそれぞれ、ｅｎｖ　ＩＳ＋とｅｎｖＩｓ−ｉ、：関してｐ ＡＴＲ５ＶＶ＋とｐＡＲ６ＶＶと称した。

生体外組換えと組換え体の精製 前述したように（ピッチｍ＝ら、１９８７）　、ＣＰ　（ＡＬＶＡＣ）とＦＰ　 （ＴＲＯＶＡＣ）組換え体の両者のリン酸カルシウム沈殿により、プラスミドＤ ＮＡを感染細胞に導入することにより組換えを行なった。それぞれ組換え体ｖＣ Ｐ６１とｖｃＰ６０を産生するためにプラスミドｐＳＰｅｎｖＩＳ＋とｐｃＰｅ ｎｖｌｓ−（Ｃ５座、第１６図）を用いた。それぞれ組換え体ｖＦＰ６３とｖＦ Ｐ６２を産生−するために、プラスミドｐＦＰｅｎｖ　Ｉ　Ｓ＋とｐＦ＋ｅｎｖ Ｉ’５−（Ｈ７座、第２２図）を用いた。治療としてｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ ）により生体外組換え実験にプラスミドｐＡＲ５ＶＶ＋とｐＡＲ６ＶＶを用いて 、ツレツレｖＰ９３９とｖＰ９４０を産生じた。前述したように、３２ｐ−標識 したｅｎｖ特異的プローブによるハイブリダイゼーション後のオートラジオグラ フィーにより組換えプラークを選択し、純度を確認するために連続して３口締代 を行なった（ピッチー二ら、１９８７）。

ラジオイムノプレシピテーション分析 細胞単層に、１０ｐｆｕ／細胞を修飾イーグルメチオニン不含有培地（ＭＥＭｍ 　ｅ　ｔ−）で感染せしめた。感染から２時間後、２０ｕＣｉ／ｍｌの［”Ｓｌ −メチオニンを２％の透析した牛の胎児の血清（フロー）を含有するＭＥＭ（− ｍｅｔ）中に加えた。それらを溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣ１，１ｍＭのＥ ＤＴＡ　ｐＨ８，１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，４，０，２ｍｇ／ｍｌの ＰＭＳＦ、１％のＮＰ４０．０．０１％のＮａ　Ａｚｉｄｅ）と５０μｌのアプ ロチニン中に再懸濁せしめ、エッペンドルフ管にあき集めることにより細胞を感 染から１５時間後に収穫し、溶解産物を４℃で２０分間回転せしめることにより 精製した。６０ｍｍの直径のベトリ皿の上澄み液の３分の１を、１μｌの通常の ヒトの血清と１００μｍのタンパク質Ａ−セファロースＣＬ−４８（ＳＰＡ）（ ファーマシーア）とともに室温で２時間インキュベーションした。１分間の回転 後、上澄み液を、２μｌの、ＨＩＶ血清陽性の個体（熱不活性化した）からの前 吸着したヒト血清と１００μｌのＳＰＡとともに４℃で１時間と３０分間インキ ュベーションした。

ペレットを、溶解緩衝液で４回、塩化リチウム／尿素緩衝液（０，２Ｍ　ＬｉＣ １，２Ｍ　尿素、ＩＱｍＭ　）リス−ＭＣＩ　ｐＨ８）で２回洗浄し、沈殿した タンパク質を６０μｌのセエムリ緩衝液中に溶解せしめた（ラエムリ、１９７０ ）。１００℃での５分間の加熱と１分間の回転を行ないセファロースを除去した 後、上澄み中のタンパク質を５ＤＳＩＯ％ポリアクリルアミドゲル上で再溶解せ しめ、間接撮影を行なった。

ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の発現 ＡＲＶ−２または５Ｆ−２菌株のＨＩＶ　ｅｎｖ遺伝子がワクシニア初期−晩期 プロモーター、Ｈ６の下流に挿入された６つの異なる組換えウィルスを調製した 。簡単にするために、２つのＡＬＶＡＣベースの組換えウィルス、ＶＣＰ６１お よびｖｃＰ６０をＣＰＩＳ＋およびＣＰ　Ｉ　Ｓ−と称し、２つのＴＲ０ＶＡＣ ベースの組換え体、ｖＦＰ６３およびｖＦＰ６２をＦＰＩＳ＋およびＦＰＩＳ− と称し、２つのＮＹＶＡＣベースの組換え体、ｖＰ９３９およびＶＰ９４０をｖ ｖ−とＶｖ＋と称した。

ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子の開始コドンがワクシニア上１６プロモーターのＡＴＧ と重複している点で、全ての構成を正確であった。さらに、３′から終止コドン までの異種の遺伝子情報は除去されていた。ｇｐ４１遺伝子産生物の５′部分の 近くに位置したアミノ酸５８３−５９９に対応する５１ｂｐ領域を欠損せしめる ことにより、ＣＰＩＳ−１ＦＰＩＳ−１およびｖＶ−を得た。この領域は、他の レトロウィルス糖タンパク質の膜内外ポリペプチド（チアンチオロ、１９８５　 、ルーダら、１９８９ａ、　ｂ）に生じる推定の免疫抑制領域（クラッセら、１ ９８８　；ルーダら、１９８９ｂ）との相同性を有する。

６つの組換えウィルスの発現分析は、ＣＥＦ、ベロ、およびＭＲＣ−５細胞単層 中で行なった。ＨＩＶ血清陽性の個体から集積した血清を用いたイムノブレシピ テーション実験は、材料と方法に記載したように行なった。６つの全ての組換え 体は、ＨＩＶ−１ｇｐ１６１エンベロープ前駆体の合成を指示した。しかしなが ら、ｇｐ１６０からｇｐ１２０およびｇｐ４１への処理の効果は、細胞の種類に よりＫなり、また免疫抑制領域の欠損の影響を受けた。ＨＩＶ血清陽性個体から の集積血清によるｇｐ４１の認識はまた、ウィルスバックグラウンドと細胞の種 類により変化した。

実施例２Ｏ−ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−２（ＩＳＳＹ菌株）ｅｎｖ遺伝子の発現 ｇｐ１６０の発現 ＧＴＧＣＴＴＧＣ？ＴＡ−３・） オヨびＨＩＶ２５ＰＢ　（配列認識番号１６３）（５’　−ＴＡＡＧＣＡＡＧＣ ＡＣＴＡＧＴＴＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＴ？ｒＴ ＡＣＣＡＣＴＣＡＴ−３’　）をアニールして、ＨＩＶ−２ＳＢＬ／ＩＳＹ単離 体（フランチー二ら、１９８９）　ｅ　ｎ　ｖ暗号配列の最初の５４Ｍを構成し た。この断片は、テンプレートとしてｐＴＰ１５を用いてオリゴヌクレオチド） Ｉ６５ＰＨ（配列認識番号１６（５’−ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴ’ｒＣ Ｔ？ｒＡＴｒＣＴＡＴＡＣ−３’）オヨびＨ６３ＰＨＩＶ２　（配列認識番号１ ６５）（５１−ＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＴｒＡＣＣＡＣＴＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣ ＡＡＡＣＴｒＡＡＣＧ−３’　）によるＰＣＨにより誘導した融解３′から１２ ９Ｍ断片である。オリゴヌクレオチドＨＩＶ２５ＰＣ（配列認識番号１６６） （５’−ＴＡＡＧＣＡＡＧＣＡＣＴＡＧＴＴＡＧ−３’）およびＨ６５ＰＨ（配 列認識番号１６４）を用いたＰＣＨによりこれら２つの断片の融解を行なった。

１７４ｂｐＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉと５ａｃｌで切断し、Ｈｉｎｄ ｌ　Ｉ　ＩとＳａｃ　Ｉで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した（ストラタジエネ、 ラジョラ、ＣＡ）。産生じたプラス−ミドをｐＢｓＨ６ＨＩＶ２と称した。挿入 はヌクレオチド配列分析により確認した。

ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の３′部分をＰＣＨにより誘導した。この反応において 、テンプレートとしてｐＩＳＳＹ−ＫＰＮ　（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ　−Ｎ　 ＩＨＳＤ　ｒ、ジエノベファフランチー二により提供された）を用いてオリゴヌ クレオチドＨＩＶ２Ｂ１　（配列認識番号１６７）（５’　−ＣＣＧＣＣｒＣＴ ｒＧＡＣＣＡＧＡＣ−３’　）オヨびＨＩＶ２Ｂ２（配列認識番号１６８）（５ ’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣ′ｒＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡ？ｒＡＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡ ＡＴＴＴσＧ−３１）に関して増幅した。この断片をＢａｍＨＩとＸｂａｌで切 断した。この切断により誘導した１５０ｂｐ断片は、５′ＢａｍＨＩおよび３’ Ｘｂａｌ粘着末端を含有した。ワクシニアウィルス初期転写終止信号として認識 されることが知られているＴ５ＮＴ配列モチーフを、終止コドンの後に含有する ようにこの断片を操作した。

ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の大部分は、Ｓａｃ　ＩとＢａ断により産生された２、 ７ｋｂ断片を、遺伝子の３′末端に対応する１５０ｂｐ　ＢａｍＨＩ／Ｘｂａｌ 断片とともにＳａｃ　ＩとＸｂａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。

産生じたプラスミドをｐＢｓＨＩＶ２ＥＮＶと称した。

ｐＢｓＨ６ＨＩＶ１からの１７４ｂｐ　５ｐｅｌ／ＨｉｎｄｌＩＩ断片とｐＢｓ ＨＩＶ２ＥＮＶからの２．　５ｋｂ−５ｐｅｌ／Ｘｂａｌ断片を、ＨｉｎｄＩＩ ＩとＸｂａＩで切ｍｌしたｐＢＳ−ＳＫに連結し、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮＶを 産生した。ｐＢｓＨ６ＨＩＶ３ＥＮＶから＜７）２，７ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ／ ＸｂａＩ挿入物を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポ リメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドした。このプラントエンドした断片 をＳｍａ　Ｉ切断ｐｓＤ５ＨＩＶｃ挿入ベクターに挿入した。産生じたプラスミ ドをｐＡＴＩＨＩＶ２ＥＮ■と称した。このプラスミドを、治療ウィルスとして の■Ｐ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外組換え実験に用いてｖＰ９２０を 産生じた。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ＶＰ９２０が真正のＨＩＶ−２ｇｐ １６０を発現するか否かを確認した。ベロ細胞単層を、疑似感染か、ｌ０ＰＦＵ ／細胞のｍ、ｏ、ｔ、で親ウィルスｖＰ８６６に感染せしめるか、またはｖＰ９ ２０に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、その細胞を、２％ の牛の胎児の血清と［ＩＳ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍ ｌの修飾イーグル培地（メチオニンのない）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液 Ａ（３％のＮＰ−４０，３０ｍＭのトリスｐＨ７，４，１５０ｍＭのＮａＣ１， ３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰ ＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層のひきかきにより感染から１８時間後に細胞 を収穫した。

−感染細胞からの溶解産物を、ＨＩ　Ｖ−２血清陽性個体（Ｄ　’ｒ　、ジエノ ベツフエフランチ一二から供給された）力４らの集積した血清を用いてＨＩＶ− ２ｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着 した。前吸着したヒト血清を、４℃の一晩のインキュベーションによりタンパク 質Ａセファロースに結合せしめた。

このインキュベーション期間の後に、この物質をＩ×緩衝液Ａで４回洗浄した。

次いで通常ヒト血清とタンノくり質Ａセファロースで前浄化したした溶解産物を 、タンパク質Ａセファロースに結合した血清陽性個体からのヒト血清と、４℃で 一晩インキユベーションした。−晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩 衝液で４回と、ＬｉＣ１ｚ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリス緩衝 液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロー ル、１０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により沈殿タン パク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステ 法のためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９２０感染細胞からのＨＩＶ− ２ｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた。さらに、ｇｐ １６０ポリタンパク質を熟成ｇｐ１２０およびｇｐ４１タンパク質種に処理され るので、発現ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子産生、物の真正が確認された。疑似感染細 胞またはＮＹＶＡＣ親ウィルスに感染した細胞からはＨＩＶ特異的タンパク質種 は全く沈殿しなかった。また、ｖＰ９２０によるＨＩＶ−２ｅｎｖの適切な発現 の平衡は、遺伝子産生物はｖＰ９２０感染細胞の表面上に発現されるということ である。

ｇｐ１２０の発現 ＨＩＶ−２ｅｎｖ遺伝子の５′末端に融解されたワクシニアウィルスＨ６プロモ ーターを含有するプラスミドｐＢＳＨ６ＨＩＶ２を、Ｓｐｅ　ＩとＨｉｎｄｌｌ ｌで切断し、これらの配列を含有する１８０ｂｐ断片を雌牛じた。この断片を） ＩｉｎｄｌｌｌとＸｂａｌで切断したｐＢＳ−ＳＫに、ｐＢｓＨＩＶ２１２０Ａ の１．４ｋｂ　５ｐｅｌ／Ｘｂａｌ断片とともに連結し、ｐｓＨＩＶ２１２０Ｂ を産生じた。

最初にｇｐ１２０暗号配列の３′部分をＰＣＨにより誘導することにより、プラ スミドｐＢｓＨＩＶ２１２ＯＡを誘導した。ＰＣＲは、テンプレートとしてのｐ ＩＳＳＹ−ＫＰＮとともにオリゴヌクレオチドＨＩＶ２１２ＯＡ　（配列認識番 号１６９） （５・−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＪｉＡＡＡＴｒＡＴＣＴＣＴＴＡＴＧ ＴＣＴＣＣＣＴＧＧ−３’　）オヨびＨＩＶ２１２ＯＢ　（配列認識番号１７０ ）（５１−ＡＡ’Ｉ’ｒＡＡＣＴＴｒＡＣＡＧＣＡＣＣ−３１）を用いて行なっ た。ＰＣＲ誘導断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し、５’　ＥｃｏＲＩ粘着末 端と３’Ｘｂａｌ粘着、末端を含有する３００ｂｐ断片を産生じた。この断片を 、翻訳終止配列（ＴＡＡ）と５′からＸｂａＩ部位の７５ＮＴ配列モチーフにつ いて操作した。３００ｂｐのＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ　ＰＣＲ断片を、ｐ　Ｉ　５ ＳＹ−ＫＰＮから誘導された１、４ｋｂの５ａｃｌ／ＥｃｏＲＩ断片とともに５ ａｃｌ／Ｘｂａｌで切断したｐＢＳ−５Ｋに連結した。

プラスミドｐＢｓＨＩＶ２１２０ＢをＨｉｎｄｌｌＩとＸｂａｌて切断し、３′ に隣接したＨＩＶ−２ｇｐ１２０暗号配列からワクシニアウィルスＨ６プロモー ターを含有する１、８ｋｂ断片を産生じた。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存 在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片とプラントエンドした 。プラントエンドした断片をＳｍａ　！で切断したｐｓＤｓＨＩＶｃに連結し、 ｐＡＴＩ　ＨＩＶ２１２０を産生じた。このプラスミドを生体外組換え実験に用 いてｖＰ９２２を産生じた。

ｖＰ９２２感染細胞のイムノブレシピテーション実験を、金縁ＨＩＶ−２ｅｎｖ 遺伝子の発現に関して上述したように行なった。疑似感染細胞またはｖＰ８６６ 感染ベロ細胞からはＨＩＶ特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、１２０ｋ Ｄａのタンパク質種が、ｖＰ９２２に感染した細胞から誘導した溶解産物から沈 殿した。ｖＰ９２２により発現されたＨＩＶ−２ｇｐ１２０は、ｖＰ９２０感染 ベロ細胞の細胞表面上に存在することが分かった。

実施例２ｌ−ＮＹＶＡＣ中のＳＩＶ遺伝子の発現ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇｐ１４ ０組換え体の産生５−ＩＶ　（Ｍａｃ、４２）ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミ ドｐＳＳＩＩＥをＤｒ、ジェノパフランチｍ＝（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩ Ｈ）から得た。このプラスミドをＨｉｎｄｌｌｌとＰｓｔｌで切断し、ＳＩＶ　 ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド２２０から翻訳終止コドンから１６０ｂｐ下流の領 域を含有する２、２ｋｂの断片を雌牛じた。この断片をかゆうする発現カセツテ は、ｇｐ１６０の種よりもｇｐ１４０タンパク質種の発現となる。膜内外領域の ４０％欠損は、ゲノムのヌクレオチド７．９３４での成熟前終止から生じる（フ ランチー二ら、１９８７）。ｅｎｖ遺伝子産生物のそのような成熟前終止は、培 養中のＳＩＶの繁殖後には観察されない（コダマら、１９ｇ９）。

テンプレートとしてのｐｓｓＩＩＥおよびオリゴヌクレオチド５ＩＶＥＮＶＩ（ 配列認識番号１７１）（５’　−ＣＡＡＧＧＣＴｒＴＡＴＴＧＡＧＧＴＣＴＣ− ３’　）を用いたＰＣＨにより遺伝子のアミノ部分を誘導した。産生じた２５０ ｂｐ断片は、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの３′側の２０ｂｐ（Ｎｒｕ Ｉ部位の３′末端）から下流に隣接したＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子の５′側の２３０ ｐｂを含有する。ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子配列の８０ｂｐを一除去するＢｉｎｄｌ 　Ｉ　Ｉの断片の切断により１７０ｂｐの断片番得た。

成熟前終正信号の後のＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子の残りを含有する配列をＰＣＲによ りｐＳＳ３５Ｅ　（Ｄｒ、　ジェノベファフランチー二から得た）から誘導した 。このプラスミドは、ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子のＣ末端部分からｅｎｖ遺伝子から 下流のＬＴＲ領域を含有する配列を含有している。

３６０ｂｐ断片を誘導するのに用いたオリゴヌクレオチドは、Ｓ　Ｉ　ＶＥＮＶ ３　（配列認識番号１７３）（５’　−ＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＡＧＡＴＡＧ −３’　）とＳ　Ｉ　ＶＥＮＶ４Ａ　（配列認識番号１７４）であった。この断 片をＰｓｔｌとＥｃｏＲＩで切断し、５’Ｐｓｔｌ粘着末端と３’ＥｃｏＲＩ粘 着末端を有する２６ｏｂｐ断片を産生じた。

ｐｓｓｌｌＥからの２，２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰｓｔＩ餅片、遺伝子の５′ 末端を含有する１７０ｂｐのＮ「ｕｌ／ＨｉｎｄｌＩＩ断片および遺伝子の３′ 末端を含有する２６０ｂｐ　Ｐｓｔｌ／ＥｃｏＲＩを、ｐ　ＲＷ８３８から誘導 した３、１ｋｂのＮｒｕｌ／ＥｃｏＲＩと連結した。ｐ　ＲＷ８３８は、遺伝子 の０５座への挿入を可能にするカナリヤポックスウィルス配列により側腹に位置 する狂犬病Ｇ遺伝子に連結したワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有して いる。Ｎｒｕ　ＩとＥｃｏＲＩの切断により、狂犬病Ｇ遺伝子を雌牛じ、Ｈ６プ ロモーターの３′側２０ｂｐを除去する。ワクシニアＨ６プロモーターに連結し たＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有する産生じたＣ５挿入プラスミドをｐＣ５Ｓ　Ｉ ＶＥＮＶと称シタ。

プラスミドｐｃ５ｓＩＶＥＮＶをＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＥｃｏＲＩで切断し、Ｓ 　Ｉ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖ遺伝子のヌクレオチド１５０から金縁遺伝子の末端までを 含有する２、２ｋｂ断片を雌牛した。ＰＣＲを用いてｐＣ５Ｓ　ＩＶＥＮＶから のワクシニアＨ６プロモーター／ＳＩＶ　ｅｎｖ結合を、オリゴヌクレオチドＭ ＰＳＹＮ２８６　（配列認識番号１７５）（５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＴｒケ コＡ’１ＴＣＴＡＴＡＣＩ’ｒ−３１）と５ＩＶＥＮＶ２（配列認識番号１７６ ）（５’−ＣＡＡＧＧＣ’ｌ’ｒＴＡＴｒＧＡＧＧＴＣＴＣ−３’）により誘導 した。３２０ｂｐ断片をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２４０Ｍ断片を誘導した。２ ．２ｋｂ　Ｈｉｎｄ１１１／ＥｃｏＲＩと２４０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ断片をＨ 結した。５ＩＶｅｎｖ暗号配列に関して適切な配向のＨｉｎｄｌＩＩ断片を含有 する産生じたプラスミドをｐＣ３ＳＩＮＥＭと称した。プラスミドｐＣ３Ｉは以 下のようにして誘導した。２．５ｋｂのＢｇｌｌｌカナリヤポックスウィルスゲ ノム断片のヌクレオチド配列分析により、金縁Ｃ３読取り枠と５′および３′非 暗号領域が明確となった。

−Ｃ３読取り枠が完全に切除された、異種遺伝子の０３座への挿入のための供与 体プラスミドを構成するために、ＰＣＲプライマーを用いてＣ３に対する５′お よび３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、ＲＧ２７７　（配列認識番 号１７７） （５’−ＣＡＧＴｒＧＧＴＡＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴ！’ｒＴＡｆｆＪ”ｃＡＧ− ３’）およびＲＧ２７８　（配列認識番号１７８）　（５１，ＴＡＴＣＴＧＡＡ ＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧ’！’！’ＩＴＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡＧＴ ＣＡＡＡＴＧＴＧＡＧ　ＴＴＡＡＴＡ實ＡＧ−３’　）であった。

３′配列のプライマーは、ＲＧ２７９　（配列認識番号１（５’−ＴＣＧＣＴＧ ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣｒＴＡＴＣＧＡＴＴＩＴＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴ ＴＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＣＡＡＧＣ−３’　）およびＲＧ２８ ０　（配列認識番号１８０）（５’−ＴＴＡＴＣＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＡＣＡＴ ＣＡＧＴＡＴＣＴ入ＡＣ−３’）であった。ワクシニア転写および翻訳終止信号 により側腹にある多重クローニング部位を含有するようにプライマーを設計した 。また、左側アームと右側アームの５′末端と３′末端には、２つのアームをＡ ｓｐ７１８／５ａｃＩで切断したｐＢＰ−ＳＫプラスミドベクターに連結せしめ る適切な制限部位（左側アームにはＡｓｐ７１ｇとＥｃｏＲｌ、そして右側アー ムにはＥｃｏＲＩと５ａｃｌ）を含有した。産生じたプラスミドをｐＣ３Ｉと称 した。

−ＥｃｏＲＩでの切断により、プラスミドｐｃ３ｓＩＶＥＭを腺状とした。続い ての部分的なＨｉｎｄｌｌｌでの切断により、２，７ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ ／ＥｃｏＲＩ断片を雌牛じた。この断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ。

ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片での処理によりプラントエンドし た。この断片をＳｍａ　Ｉで切断したｐｓＤ５５０Ｖｃに連結した。産生じたプ ラスミドをｐＳＩＶＥＭＶＣと称した。このプラスミドを、治療ウイルスとして のｖＰ８６６により生体外組換え実験に用いて、ＶＰ８７３を産生じた。ｖＰ８ ７３は１４Ｌ座にＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有した。

ＮＹＶＡＣ／ｇａｇ／ｐｏ　ｌおよびｇａｇ組換え体の産生 ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を包含するＳＩＶ　ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミ ド、ｐｓＩＶＡＧｓｓＩＩＧをＤ「、ジエノベファフランチ一二（ＭＤ、ベセス ダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏＴ遺伝 子を、ワクシニアｔｋフランキングアームの間のワクシニア１３Ｌプロモーター に対して３′に隣接せしめた。これは、ｇａｇおよび１３Ｌプロモーターに対応 するオリゴヌクレオチド５ＩＶＬＩ（配列認識番号１８１）、！＝ＳＩＶＬ２（ 配列認識番号１８２）ＣＡＣｆｆｒＡＴＣＴＣＡＣ−：Ｉ　’　）を含有するｐ ｓＩＶＧＡＧｓｓＩ　ＩＧの４．５ｏｏｂｐＣｆｏｌ／ＴａｇＩ断片をｐｓＤ４ ６０の誘導体であるｐＳＤ５４２の４．０７０ｂｐ　ＸｈｏＩ／ＡｃｃＩ断片中 にクローニングすることにより行なった（第１図）。この操作により産生じたプ ラスミドをｐｓＩＶＧｌと称した。

ｐｏｌ遺伝子を除去するために、オリゴヌクレオチド５ＩＶＰ５　（配列認識番 号１８３） （５響−ＡＡＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＧＧＣＴ−３’　）オヨヒＳ　Ｉ　ＶＦ６　 （配列認識番号１８４）（５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴ ＣＴ−３’　）を用いて、２１５ｂｐ（７）ＰＣＴ断片をｐｓＩＶＧＡＧｓｓＩ ＩＧから誘導した。ＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩと５ｔｕＩで切断し、５ＩＶＧ Ｉ（７）５．３７０ｂｐの部分的なりａｍＨｌ、／５ｔｕＩ断片に連結した。こ れにより、ｐｓｉＶＧ２が産生じた。ｐｓＩＶＧ２を、治療ウィルスとしてｇａ ｆとｐｏｌの両者をＮＹＶＡＣベースのベクターに挿入するプラスミドを以下の ようにして操作した。上述したｐｓＩＶＧｌは、ｌｋｂのＰＣＲ断片を用いて除 去した異種３′非暗号配列を含有する。この断片を、オリゴヌクレオチド５ＩＶ Ｐ５と５ＩＶＰ６によりプラスミドｐＳＩ−ＶＧＡＧＳＳＩＩＧから産生じた。

ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有するこのＰＣＲ誘導断片をＢａｍＨＩとＨｐａＩ で切断した。ｌｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈｐａｌ断片をｐＳＩＶＧＩの７．４ｏｏｂ ｐの部分的なりａｍＨＩ／ＨｐａＩ断片に連結し、ｐＳＩＶ４を産生じた。

ｐｓＩＶ４の配列分析により、ｐｏｌ遺伝子内に１つの塩基対欠損が発見された 。このエラーを修正するために、ｐｓＩＶＧｌから（７）２．３００ｂｐ（Ｉｆ ）Ｂｇ　Ｉ　Ｉ／Ｓ　ｔ　ｕ　Ｉ断片をｐｓＩＶＧ４の６，１００ｂｐの部分的 なりｇｌｌ／　Ｓ　ｔ　ｕ　Ｉ断片に挿入し、ｐｓＩＶＧ５を産生した。プラス ミド、ｐＳＩＶＧ５を、治療としてのｖＰ８７３とともに生体外組換え実験に用 いてｖＰ９４３を産生じた。

・ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｐｌ６およびｐ２８組換え体の産生 ｐ２８、ｐ２、ｐ８、ｐｌおよびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分とｐｏｌ 遺伝子をｐｓＩＶＧｌから除去した。これは、オリゴヌクレオチド５ＩＶＬＩＯ （配列認識番号″ｒ８５） （ｓ　Ｉ−ＡＧＡＣＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧ ＧＡＡＡＴＴＡＣＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧ−３１） および５ＩｖＬ１１（配列認識番号１８６）（５’　−にＡＴＣＣＴＣＴＡ ＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＣＴＡＧＡ ＴＧＧＴＧＣＴＧ實シＴ−３’　）をｐｓＩＶＧｌの４，４３０ｂｐ　Ａｃｅ　 Ｉ／ＢａｍＨＩ−ターにより発現されたＳＩＶ　ｐ１７遺伝子産生物の発現カセ ツテを含有する。

昆虫ポックスウィルス４２ｋＤａプロモートした５ＩＶｐ２８遺伝子（５′末端 のみ）を１３Ｌプロモートしたｐ１７遺伝子から下流に挿入した。これは、ｐ２ ８遺伝子の５′末端を含有するｐＳＩＶＧＩ（７）３６０ｂｐ　Ｂｓｌ）Ｍ　Ｉ 　／　Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片、昆虫ボックス４２ｋＤａプロモーターを含有する オリゴヌクレオチドｐｓＩＶＬ１４（配列認識番号１８７） および５ＩｖＬ１５（配列認識番号１８８）（５’−ＧＣＴＴＡＡＴＧＧＣＡＧ ＧＴＧＧＡＣＡＴＡＧＴ’ｒＡＣＣＡＣＣＴＡＴ’ｒＴＧＴＴＧＴＡＣＴＧＧＣ ＡＴＴＴ？ＡＴＡＴＴＧＴＡＡＴｒＡＴＡＴＡＴＴＴＴＣＡＡＴ’ｒ’！ＴＧＴ −３’　）を、ｐｓＩＶＧ３の４，４７０ｂｐの部分的なＸｂａｌ／ＢａｍＨＩ 断片中にクローニングすることにより行なった。

産生じたプラスミドをｐＳＩＶＧ６と称した。

次いで９２８遺伝子の３′部分をｐＳＩＶＧ６中に挿入した。ＳＩＶ　ｐ２８遺 伝子の３′末端を含有する２９０ｂｐ　ＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド５Ｉ ＶＰ１２（配列認識番号１８９） （５１−ＴＧＧＡＴＧＴＡＣＡＧＡＣＡＡＣ−３’　）を用いてｐｓＩＶＧＩか ら誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、ｐｓＩＶＧ７（７）４，８３０ｂ ｐの断片に連結し、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６とｖＰ８７３とともに生体 外組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９４２およびｖＰ９５２を産生した。

発現アッセイ ＳＩＶ　ｇｌ）１４０　ｅｎｖ遺伝子産生物は、感染細胞の形質膜と関連した典 型的な糖タンパク質である。これは１１２ｋＤａの細胞各種と２８ｋＤａの膜内 外領域に対してタンパク質分解的に開裂された１４０ｋＤａのポリタンパク質と して発現される（フランチｍ＝ら、１９８７）。ＳＩＶに血清陽性のアカゲサル マカクからの血清と続いてウサギ抗サルＩｇＧに接合したフルオレセインを用い た免疫発光分析により、組換え体感染ベロ細胞の表面にｅｎｖ遺伝子産生物の発 現が示された。表面発現は、疑似感染細胞またＮ　Ｙ’Ｖ　Ａ　Ｃ（ｖ　Ｐ　８ ６６　）親ウィルスに感染した細胞の表面には観察されなかった。さらに、ｇａ ｇ遺伝子のみを含有する組換え体に感染した細胞は、表面にＳＩＶ成分を発現し たことを示さなかった。ｖＰ８７３、ｖＰ９４３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２ に感染した細胞中の表面発現はすべて表面発現を示し、ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を 著しく含有する。

ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ組換え体に感染したベロ細胞中の発現Ｓｌ・Ｖ遺伝子産生物 （ｅｎｖおよびｅｎｖ）の真正をイムノブレシピテーショにより分析した。１０ のｍ、ｏ、ｔ。

でベロ細胞を個々の組換えウィルス、ＮＹＶＡＣ親ウィルスに感染せしめ、また は疑似感染せしめた。吸着期間の１時間後、接種物を除去し、感染細胞を、［３ ５３］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌのメチオニン不含有 培地で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａの添加により、感染から１７時間後に 全ての試料を収穫した。感染細胞からの溶解産物を、ＳＩＶ血清陽性アカゲサル マカクからの集積血清、またはｇａｇ　ｐ２４遺伝子産生物に特異的な単クロー ン性抗体（両者ともＭＤ、ベセスダ、ＮＩＣ−Ｎ　Ｉ　ＨＳＤ　ｒ、　ジエノベ ファフランチー二から得た）に関して分析した。

ＳＩＶ血清陽性のマカクの血清に関してイムノブレシビテーションを以下のよう にして行なった。マカク血清を、タンパク質Ａセファロースとともに４℃で１６ 時間に亘りり質Ａセファロースに結合した血清を、通常のサル血清とタンパク質 Ａセファロースで前浄化した溶解産物に加えた。

４℃での一晩のインキュベーション後、沈殿物を緩衝液Ａで４回とＬｉＣ１／尿 素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を抗体から分離するために、試料 を８０μｌの２×ラエムリ緩衝液中で５分間沸騰せしめた。ドリファスーゲルシ ステムを用いて１２．５％のゲル上で試料を分画した（゛ドリファスら、１９８ ４）。ゲルを固定して、蛍光光度法のためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理し た。ＳＩｖ遺伝子を含有する全ての組換え体を適切な遺伝子産生物を発現してい た。ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣ組換え体ｖＰ８７３、ｖＰ９４ ３、ｖＰ９４８およびｖＰ９５２は全て真正のｇｐ１４０を発現した。しかしな がら、ｇｐ１４０タンパク質の１１２ｋＤａおよび２ＳｋＤａ熟成形状への処理 を評価するのは困難である。疑似感染ベロ細胞、ｖＰ８６６感染ベロ細胞および ＳＩＶ　ｅｎｖ遺伝子を含有しないＮＹＶＡＣ組Ｓ　ＩＭ組換え体に感染した細 胞からのマカク抗ＳＩＶ血清によっては、１４０ｋＤａのみかけ分子量を有する 種は沈殿しなかった。ＳＩＶに感染したマカクからの集積血清およびｐ２８　ｇ ａｇ成分に特異てきな単クローン性抗体を用いて、ｖＰ９４２、ｖＰ９４３、ｖ Ｐ９４８、およびＶｐ９５２によるＳＩＶｇａｇコード遺伝子産生物の発現が示 された。ベロ細胞中のＮＹＶＡｅ　（ｖＰ９４８）によりプロテアーゼ機能を含 むｐＯ１領域のない金縁ｐ５５　ｇａｇタンパク質の発現は明確である。これら の結果により、ＳＩＶプロテアーゼ発現の欠如はｐ５５の熟成形状への完全なタ ンパク質分解を妨げることが示された。ｐ２８に特異的な単クローン性抗体を用 いてｇａｇ特異的遺伝子産生物をｖＰ９４８感染ベロ細胞から沈殿させる場合、 このことはより明確に示される。

この結果に対して、ｖＰ９４３感染ベロ細胞中にｐｏｌ遺伝子゛（プロテアーゼ を含む）を有するＳＩＶ　ｇａｇの発現により、発現されたｐ５５　ｇａｇ前駆 体ポリペプチドがその熟成形状にタンパク質分解的に開裂させることができた。

ＳＩＶに感染したマカクからの集積血清を用いて、ｖＰ９４２およびｖＰ９５２ 感染ベロ細胞中のｐ１６とｐ２８ＳＩＶ遺伝子産生物の両方の発現が示された。

ｐ２８に特異的な単クローン性抗体は明らかにｐ２８発現成分のみを認識した。

実施例２２−アビアンインフルエンザウィルスの血球凝集集糠タンパク質を発現 するＴＲ０ＶＡＣ組換え体の構成 この実施例は、アビアンインフルエンザウィルスの３つの血清型の血球凝集素遺 伝子を発現する鶏痘ウィルス組換え体の展開を記載するものである。

細胞およびウィルス Ｈｌ、Ｈ５およびＨ７血球凝集素遺伝子のｃＤＮＡクローンを含有するプラスミ ドを、テネシー州、メンフィスのセントシュード小児科研究病院のＤｒ、　ロバ −トウニブスターから得た。ＦＰ−１と称するＦＰＶの菌株は以前に記載した（ ティラーら、１９８８ａ、　ｂ）。これは生後１日の鶏のワクチン接種に有用な 弱毒化ワクチン菌株である。親つィルス菌株デュベツティを、鶏からの鶏痘かい せんとしてフランスから得た。鶏の感染幼虫包蔵卵での５０回の継代と続いての 鶏胚胎繊維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）での２５回の継代によりウィルスを弱毒化した。

このウィルスを、フランス、リヨン、ローンメリクスにより１９８０年の９月に 得て、マスターウィルス種を設立した。１９８９年の９月にウィルスをパイロジ エネティックスが受けとり、ここで４連続のプラーク精製を行なった。主要ＣＥ Ｆ細胞中で１つのプラーク単離体をさらに増幅し、ＴＲ０ＶＡＣと称する株ウィ ルスを設立した。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５　（ｖＦＰ８９）およびＴＲＯＶＡＣ −ＡＩＨ４　（ｖＦＰ９２）を産生ずる生体外組換え試験に用いた株ウイルスを さらに主要ＣＥＦ細胞中で８回の継代により増幅した。ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ７ （ｖＦＰ１００）を産生ずるのに用いた株ウイルスはさらに主要ＣＥＦ細胞中で １２回の継代により増幅した。

Ｆ８座での鶏痘挿入ブラスミドの構成 ブラスミドｐＲＷ７３１．１５は、ＴＲＯＶＡＣゲノムＤＮＡからクローニング された１０ｋｂｐのＰｖｕＩＩ−Ｐｖｕｌｌ断片を含有する。ヌクレオチド配列 を、３６６ｌｂｐ　Ｐｖｕｌｌ−ＥｃｏＲＶ断片の両鎖に決定した。

この配列を第２１図に示す。Ｆ８としてこの研究所で称する読取り枠をこの配列 内に決定した。読取り枠は位置７０４で開始し、位置８８８で終止する。隣接す る読取り枠を妨害しないように、以下に記載するように、位置７８１から位置１ ９２８に欠損を作った。

ー　ブラスミドｐ　ＲＷ７　６　１は、２４３０ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｅ’ｃｏＲ Ｖ断片を含有するｐＲＷ７３１．１５のサブクローンである。Ｆ８　０ＲＦは完 全に、Ｐ　ＲＷ７　６　１のＸｂａ１部位とＳｓｐ１部位の間に含有された。Ｔ ＲＯＶＡＣゲノムＤＮ＾による組偽えにおいてＦ８　０ＲＦを除去する挿入ブラ スミドを産生ずるために、以下の工程を行なった。ブラスミドｐＲＷ７６１をＸ ｂａｌで完全に、Ｓｓｐｉで部分的に切断した。３７００ｂｐ（７）Ｘｂａ　Ｉ −Ｓｓｐ■帯を単離して、アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドＪＣＡＯ１９ （配列認識番号１９１）およびＪＣＡＯ１８（配列認識番号１２９） ＪＣＡＯ１７（配列認識番号１９１）５ｌＣＴＡＧＡＣＡＣＴｗｒｌｒＡＴＧｌ ｒＴＴＴＩＩｗｒ品ＴＡＴＣＣＧＧＴｄｉ入入ＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴ ＣＣＴＴＡＴＡＣＧＧＧＧＭＴＡＡＴ　３’ＪＣＡＯｌＢ　（配列認識番号１’ ｌ　ｌ　）　５　’　ＡＴＴＡＴＴＣＣＣＣＧＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＣＧ ＧＧＡＡＧＣＴｒＴＴＡＡＧＡＣＣＧＧＡＴＡＴｒＡＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＧ ＴＧＴ　３’と連結した。

この連結により産生じたプラスミドをｐＪＣＡＯＯ２とＡ００２中のワクシニア ウイルスＨ６プロモーターに連結した非関連遺伝子を含有する。ワクシニアウイ ルスＨ６プロモーターの配列は以前に記載した（テイラーら、１９８８　ａ　， ｂ；グオら、１９８９　；バーカスら、１９８９）。ブラスミドｐＪＡＣＯＯ４ を、非関連遺伝子とＨ６プロモーターの３′末端の部分を欠損せしめるＥｃｏＲ ＶとＢａｍＨＩで切断し−た。アニールしたオリゴヌクレオチドＲＷ１７８（配 列認識番姶１９３）およびＲＷ１７９（配列認識番号１９４）をＥｃｏＲＶとＢ ａｍＨＩで切断し、ＪＣＡＯＯ４のＥｃｏＲＶとＢａｍ｝１１部位の間に挿入し 、ｐＲＷ８４６を形成した。

ＲＷ１７Ｂ（配列認識番号１９３　）：　５’　ＴＣＡＴＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡ ＴＣＣＧＴＧＴＴＪｌｉＡ口八ＧコＡＧＣＴＡＡＴｒＴＴ’ｒＡＴＴＣＣＣＧＧ ＧＡＴＣＣＴｒＡＴＣＡ　３　１ｉｗｘ７９（配列認識番号Ｉ’ｌＶ−）＝　５ １　ＧＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＧＣＴ入ＧＣＴ ＡＧＴｒＡＡＣＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＡ　３’それゆえ、ブラ スミドｐＲＷ８４６は、ｄｅ−ＯＲＦｅｄＦ８座にＥｃｏＲＶのＨ６プロモータ ー５′を含有する。

ｐＲＷ８４６中のＨ６プロモーターには、終止コドン、ワクシニアウイルス初期 プロモーターにより認識される転写終止配列（ユエンら、１９８７）およびＳｍ ａ　１部位が続いている。

Ｆ７座での鶏痘挿入ブラスミドの構成 起源Ｆ７非ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入ブラスミド、ｐＲＷ７３１．１３は、ｐＵＣ９ のＰｖｕＩＩ部位に５．５ｋｂのＦＰヂノムＰｖｕＩＩ断片を含有した。挿入部 位は、これらの配列内の特有のＨｉｎｃｌ１部位であった。第２２図に示したヌ クレオチド配列は、特有のＨｉｎｃＩ１部位を包含する２３５６ｂｐ領域に関し て決定した。この配列の分析により、特有のＨｉｎｃ部位（第２２図での下線） が９０アミノ酸のポリペプチドをコードするＯＲＦ内に位置することが示された 。ＯＲＦは、位置１５３１でのＡＴＧで開始し、位置８９８で終止する（第２２ 図の矢印により示した位置）。

ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入ブラスミドのアームを、テンプレートとしてのｐＲＷ７３ １．１３を用いたＰＣＲにより誘導した。ＯＲＦから上流の領域に対応する５９ ６ｂｐアーム（ＨＢと称する）を、オリゴヌクレオチドＦ７３ＰＨ２（配列認識 番号１９５） （５１　−ＧＡＣＭＴＣＴＡＡＧＴＣＣＴＡＴＡＴＴＡＧＡＣ−３　１　）およ びＦ７３ＰＢ　（配列認識番号１９６）（５　’　−ＧＧＡＴＴＴｒＴＡＧＧＴ ＡＧＡＣＡＣ−３　１　）で増幅した。ＯＲＦから下流の領域に対応する２７０ ｂｐアーム（Ｅｌと称する）を、オリゴヌクレオチドＦ７５ＰＥ（配列認識番号 １９７） （５　’　−ＴＣＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧ−：ｌ　ｌ　）およびＦ７ ３ＰＨ１　（配列認識番号１９８）（５　’　−ＧＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴｒ ＧＴＡＡＧＧＧＴＡＴＡＣＣＴＧ−３　’　）で増幅した。

断ＷＥａをＥｃｏＲＶで切断し、１２６ｂｐ断片を産生じた。ＥｃｏＲＶ部位は ３′末端であり、５′末端はＨｉｎｃｌＩ部位の３′末端を含有するようにＰＣ Ｈにより形成した。この断片を、ＨｉｎｃｌＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ（ＣＡ， ラジョラ、ストラタジエネ）に挿入し、ブラスミドｐＦ７Ｄ１を形成した。配列 を、ジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドｐＦ７Ｄ１を Ａｐａｌで線状化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてブラン゜トエンドし、５ ９６ｂｐ　ＨＢ断片に連結した。産生じたブラスミドをｐＦ７Ｄ２と称した。金 縁配列と包囲をヌクレオチド配列分析により確認した。

ブラスミドｐＦ７Ｄ２をＥｃｏＲＶとＢｇｌ　Ｉ　Ｉで切断し、６００ｂｐ断片 を産生じた。この断片を、ＡｐａＩで切断されたｐＢＳ−ＳＫに挿入し、Ｔ４　 ＤＮＡポリメラーゼでプラントエンドし、続いてＢａｍＨＩで切断した。

産生じたプラスミドをｐＦ７Ｄ３と称した。このプラスミドは、４０４ＭのＨＢ アームと１２６ｂｐのＥＨアームを含有する。

プラスミドｐＦ７Ｄ３をＸｈｏｌで線状化し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下で、Ｅ 、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片によりプラントエンドした。こ の線状化したプラスミドを、アニールしたオリゴヌクレオチドＦ７ＭＣＳＢ　（ 配列認識番号１９９） およびＦ７ＭＣ５Ａ　（配列認識番号２００）　（５’−ＧＡＣＴＡＡＣＴＡＡ ｃＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＣｒＧＣＡＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＡ ＡαＡＡＣＴＡＡＴＣＧＴＴ−３１） に連結した。これを行なって、ＨｉｎｄＩＩＩＳＰｓｔｌおよびＳｍａ　Ｉの制 限部位を含有する多重クローニング領域をＥＨとＨＢアームの間に挿入した。産 生じたプラスミドをｐＦ７Ｄｏと称した。

Ｈ８座でのＨ４血球凝集素の挿入プラスミドの構成ゲラスミ１９フ ８　３　３／８　０から誘導したアビアンインフルエンザＨ４をコードするｃＤ ＮＡコピーをＤｒ，Ｒ，　ウェブスターから得た。このプラスミドをＨｉ　ｎｄ 　Ｉ　Ｉ　ＩとＮｒｕ　Ｉで切断し、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼの フレノウ断片を用いてプラントエンドした。Ｈ４暗号領域を含有するプラントエ ンドした２．５ｋｂｐのＨｉｎｄｌｌＩ−Ｎｒｕｌ断片をｐｌＢＩ２５（ＣＴ， ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）のＨｉｎｃ１１部位 に挿入した。産生じたプラスミドｐ　ＲＷ８　２　８を部分的にＢａｎ１ｌで切 断し、線状産生物を単離し、Ｂｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで再度切断した。１００ｂｐ　 Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｂａｎｌが欠損したプラスミドｐ　ＲＷ８　２　８を、合成オ リゴヌクレオチドＲＷ１５２（配列認識番号２ｏ１）およびＲＷ１５３（配列認 識番号２ｏ２）のベクターとして用いた。これらの１リゴヌクレオチドは、Ｅｃ ｏＲＶ部位からのＨ６踏めの３′部分を表し、プロモーター（７）ＡＴＧをＨ４ 　ｃＤＮＡのＡＴＧと配列させる。

１ｗ１ｓ２（配列認識番号２０／）：　５１　ＧＣＡＣＧＧＡＡＣＡＡＡＧＣＴ ＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＴＡ ＴＣＡＡＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＡＴＡＧＣＡＧＡＧＧＧＣ ｒＣＡＴＣＴＣＡＧＭＴ　３’１ｗ１５３（配列認識番号２（７７り：　５１　 ＡＴｒＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＣＡＧ ＡＡＴＣＧＴＧＡＴＴＧＡＴＡＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧ ＧＡＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＴＧＴＴＣＣＧＴＧＣ　３’オリゴヌクレ オチドをアニールし、Ｂａｎ１ｌとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、上述したＨｉｎｄ ｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｎＩ　Ｉが欠損したｐ　ＲＷ８　２　８ベクターに挿入する。

産生じたプラスミドｐＲＷ８４４をＥｃｏＲＶとＤｒａ　Ｉで切断し、３’　Ｈ ６ブロモートしたＨ４暗号配列を含有する１．　７ｋｂｐ断片をｐＲＷ８４６　 （前出）のＥｃｏＲＶとＨｉｎｃ１１部位の間に挿入し、プラスミドｐＲＷ８４ ８を形成した。

それゆえ、プラスミドｐＲＷ８４８は、鶏痘ウィルスのｄｅ−ＯＲＦｅｄＦ８座 のワクシニアウィルスＨ６プロモーターに連結したＨ４暗号配列を含有する。

Ｈ８座でのＨ５血球凝集素の挿入プラスミドの構成プラスミドｐＴＨ２９中に、 Ａ／ターキー／アイルランド／１３７８／８３から誘導したアビアンインフルエ ンザＨ５のｃＤＮＡクローンをＤｒ．Ｒ．　ウェブスターから得た。合成オリゴ ヌクレオチドＲＷＩＯ（配列認識番号２０３）からＲＷ１３（配列認識番号２０ ６）を、前述したワクシニアウィルスＨ６プロモーターの翻訳開始コドンとＨ５ 遺伝子のＡＴＧが重複するように設計した。配列はＨ５遺伝子の５’５ａ１１部 位を通じて継続し、Ｈ５終止コドンを含有する３’Ｈ５　ＤｒａＩ部位で再度開 始する。

ＲＷＩＯ（配列認識番号１ｏ３）＝　５’　ＧＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＣＧ ＡＣＣ’１℃ＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＴＴＧＴｒＴＧＣＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＡＴ ＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＴＣＡＣＴ３’ ＡＴ３１ ＲＷ１２　（配列認識番号２０ｆ　）：　５’　ＡＴＣＣＧＴｒＡＡＧＴＴｒＧ ＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴｒＣＴＴ’！ＴｒＧＣＡＡ ＴＡＧＴＣＡＧＴＣＴＴＧＣＴＡＧＡＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＴＴＴＧＣＡ’ｌ’ ｒＧＧＴ　３１ＲＷ１３（配列認識番号Ｚｌ）６）：　５１　ＴＡＣＣＡＣＧＣ ＡＡＡＣＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴｒＴＴ ＣＴＧＣＡ　３・オリゴヌクレオチドを９５℃で３分間アニールし、続いて室温 で徐冷した。これにより、表示した末端を有する以下の二本鎖構造となる。

ｐＲＷ７４２ＢのＥｃｏＲＶおよびＰｓｔ１部位の間のオリゴヌクレオチドのク ローニングによりｐＲＷ７４４が７３１、１５のＨｉｎｃ１１部位に挿入された 非関連遺伝子に連結したワクシニアウィルスＨ６プロモーターを含有する。Ｐｓ ｔｌとＥｃｏＲＶの切断により、Ｈ６プロモーターの３′末端と非関連遺伝子が 除去される。プラスミドｐＲＷ７４４はここで、アビアンインフルエンザＨ５の ＡＴＧと重複するＨ６プロモーターの３′部分を含有する。

このプラスミドはまた、Ｈ５配列から５’５ａｌＩ部位までとＨ５終止コドン（ Ｄｒａ１部位を含有する）からの３、′配列を含有する。Ｄｒａ　１部位を使用 するとＨ５　３′非暗号末端が除去される。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシ ニアウィルスＲＮＡポリメラーゼにより認識される転写終止信号を加える（ユエ ンら．　１９８７）。Ｈ６ブロモートしたＨ５構造を完成するために、Ｈ５暗号 領域をｐＴＨ２９から１．６ｋｂｐ　５ａｌｌ−Ｄｒａｌ断片として単離した。

プラスミドｐ　ＲＷ７　４　４を部分的にＤｒａＩで切断し、線状断片を単離し 、５ａｌｌで再度切断した。ここでＳａｌｌとＤｒａ　Ｉの間の８つの塩基が欠 損したブラスミドを、１．６ｋｂｐのｐＴＨ２９　ＳａｉｌおよびＤｒａ夏断片 のベクターとして用いた。産生じたブラスミドをＥｃｏＲＶとＤｒａＩで切断し た。３′Ｈ６プロモーターおよびＨ５遺伝子を含存する１．７ｋｂｐ　ＰＲＷ７ ５９ＥｃｏＲＶ−Ｄｒａ！断片をｐＲＷ８４６　（前出）のＥｃｏＲＶとＨｉｎ ｃＩ１部位の間に挿入した。産生じたブラスミドｐＲＷ８４９は、ｄｅ−ＯＲＦ ｄｅＦ８座にＨ６プロモートしたアビアンインフルエンザウイルスＨ５遺伝子を 含祢する。

Ｆ７座でのＨ７血球凝集素の挿入ベクターの構成Ａ／ＣＫ／ｖＩＣ／１／８５か らのＨ７血球凝集素を含有するブラスミドｐｃＶＨ７１をＤｒ．Ｒ．　ウェブス ターから得た。Ｈ７遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片をＤＮＡポリ メラーゼのクレノウ断片でプラントエンドし、Ｐ　ＲＷ８　２　７としてｐＩＢ １２５のＨｉｎｃｌＩ部一位に挿入した。合成オリゴヌクレオチドＲＷ１６５（ 配列認識番号２０７）およびＲＷ１６６（配列認識番号２０８）をア二一ルし、 ＨｉｎｃｌＩとＳｔｙｌで切断し、ｐＲＷ８２７のＥｃｏＲＶとＳｔｙ１部位の 間に挿入してｐＲＷ８４５を産生した。

ＲＷ１６５（配列認識番号Ｚ（７’ｌ）：　５１　ＧＴ入ＣＡＧＧＴＣＧＡＣＡ ＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＴＡＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡ ＴＣＧＴ入入τＧＡＡＴＡＣＴＣ入八入ＴＴＣＴ入入ＴＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴＧ ＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＴＣＡＣＡＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡＡＡＴＣＴＧＣＣ ＴＴＧＧＡＣＡＴＣＡＴ　３’ＲＷ１６６（配列認識番号Ｚｏｏ）＝　５’　Ａ Ｔｕπ’ｊ’ｃｃＡＡ（ＪＣＡＧＡ？ｆｆＪ’ＧＴＣＴＧＣＡＴ’Ｉ？ＧＴＧＴ ＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＴＴＡＧＡＡ？ｒＴＧＡＧ ＴＡＴＴ　ＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣ！’ｒＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＣＧ ＡＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＩ’ＴＧＴＣＧＡＣＣＴＧＴＡＣ　３噂オリゴヌク レオチドＲＷ１６５（配列認識番号２０７）およびＲＷ１６６（配列認識番号２ ０８）は、Ｈ６ブロモータ：の３′部分をＨ７遺伝子に連結させる。ｐＲＷ８４ 弓のＡｐａＬＩ切断の線状産生物を単離し、これをＥｃｏＲｌで再度切断し、最 大の断片を単離して合成オリゴヌクレオチドＲＷ２２７（配列認識番号２０９） およびＲＷ２２８（配列認識番号２１０）でア二一ルすることにより、Ｈ７遺伝 子の３′非暗号末端を除去した。産生じたブラスミドはｐ　ＲＷ８　５　４であ った。

ｉｗ２２７（配列認識番号ｚ”７　）　：　５　’　ＡＴＡＡＣＡＴＧＣＧＧＴ ＧＣＡＣＣＡＴ１ｒＴＧＴＡＴＡＴ入ＡＧＴＴＡＡＣＧＡＡＴ’ｒＣＣＡＡＧＴ ＣＡＡＧＣ　３’Ｒ％４２２Ｂ（配列認識番号Ｌ／　ｏ　）＝　５　’　ＧＣＴ ＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＴＴＣＧ？ｒＡＡＣＴＴＡ丁ＡＴＡＣＡＡＡＴＧＧＴＧＣ ＡＣＣＧＣＡＴＧＴＴＡＴ　３’Ｐ　ＲＷ８　５　４中のＨ７の終止コドンの次 にはＨｐａ１部位が続いている。ｄｅ−ＯＲＦｅｄ　Ｆ７座中の中間Ｈ６ブロモ ートしたＨ７構造（以下に記載する）を、ＥｃｏＲＶで切断し、そのＰｓｔ１部 位でプラントエンドしたｐＲＷ８５８中にｐＲＷ８５４　ＥｃｏＲＶ−Ｈｐａｌ 断片を移動せしめることにより産生じた。ブラスミドｐ　ＲＷ８　５　８（以下 に記載する）はＦ７　ｄｅ−ＯＲＦｅｄ挿入ブラスミド中にＨ６プロモーターを 含有する。非関連遺伝子に連結したＨ６プロモーターを含有する８５０ｂｐ　Ｓ ｍａｌ／Ｈｐａｌ断片を前述したｐＦ７ＤｏのＳｍａ　１部位に挿入することに よりブラスミドｐ　ＲＷ８　５　８を構成した。ｐＲＷ８５８をＥｃｏＲＶ（Ｈ ６ブａモ−９−（７）３’末端の２４ｂｐ上流の部位）とＰｓｔＩでの切断によ り非関連配列を切除した。産生じた３．５ｋｂ断片を単離し、２ｍＭのｄＮＴＰ の存在下でＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片を用いてプラント エンドした。このプラントエンドした断片を、ｐＲＷ８５４　（前出）から誘導 した１７００ｂｐのＥｃｏＲＶ／Ｈｐａｌ断片に連結した。このＥｃｏＲＶ／Ｈ ｐａ　Ｉ断片は、ＶＶ　Ｈ６プロモーターの３′側（７）２４ｂｐｌ；ｌ−隣接 した３′の金縁ＡＩＶ　Ｉ｛Ａ（Ｈ７）遺伝子を含有する。産生じたブラスミド をｐＲＷ８６゛１と称した。

１２６ｂｐ　ＥＨアーム（以前に規定した）をｐＲＷ８６１中で延長せしめ、組 換え頻度をゲノムＴＲＯＶＡＣＤＮＡで増大せしめた．このことを達成するため に、５７５ｂｐ　Ａｃｃｌ／ＳｎａＢＩ断片をｐＲＷ７３１．１３（前に規定し た）から誘導した。この断片を単離し、ｐＲＷ８６１のＡｃｃｌとＮａｅ１部位 の間に挿入した。７２５ｂｐのＥＨ７−ムとＡＩＶ　Ｈ７を側腹に有する４０４ ｂｐのＨＢアームを含有する、産生じたブラスミドをｐＲＷ８６９と称した。そ れゆえ、ブラスミドｐ　ＲＷ８　６　９は、５′末端でワクシニアウイルスＨ６ プロモーターに連結したＨ７暗号配列からなる。左側のフランキングアームは、 ４０４ｂｐのＴＲＯＶＡＣ配列からなり、右側フランキングアームは、ｄｅ−Ｏ ＲＦｅｄ　Ｆ７座への挿入を指向する７２５ｂｐのＴＲｖＡＣ配列からなる。

ＴＲＯＶＡＣアビアンインフルエンザウイルスの展開アでアンインフルエンザウ イルスＨＡ暗号配列を含有する挿入ブラスミドを、前述したリン酸カルシウム沈 殿法を用いてＴＲＯＶＡＣ感染主要ＣＥＦ細胞に個々に移入した（パニカリら、 １９８２　．ピッチ一二ら、１９８７）。ＨＡ特異的放射線標識ブローブに対す るハイブリダイゼーションに基づいて陽性ブラークを選択し、純粋な個体群とな るまで、連続したブラーク精製を行なった。次いで１つの代表的なブラークを増 幅して株ウイルスを産生じた。ブラスミドｐＲＷ８４９を生体外組換え試験に用 いてＨ５血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ５　（ｖＦＰ８９ ）を産生じた。ブラスミドｐＲＷ８４８を用いてＨ４血球凝集素を発現する組換 え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ４　（ｖＦＰ９２）を産生じた。ブラスミドｐ　ＲＷ ８　６　９を用いて、Ｈ７血球凝集素を発現する組換え体ＴＲＯＶＡＣ−ＡＩＨ ７（ｖＦＰ１００）を産生じた。

蛍光光度法 インフルエンザウィルス感染細胞において、ＨＡ分子を合成し、粗い小胞体での 前駆体分子としてグリコジル化する。形質膜に通過中に、ジスルヒド連結ＨＡ、 およびＨＡ２サブユニットへのタンパク質分解開裂となる広範囲の後翻訳修飾と 、続いて熟成ウィルスエンベロープに含まれる宿主細胞膜への挿入を経る。ＴＲ ０ＶＡＣ−ＡＩＶ組換えウィルスに感染した細胞中に産生されたＨＡ分子が細胞 表面上に発現されたか否かを測定するために、蛍光光度法を行なった。間接蛍光 光度法を記載したように行なった（ティラーら、１９９Ｇ）。間接蛍光光度法に より、ＴＲ０ＶＡＣ−Ａ　Ｉ　Ｈ５１７）Ｈ５血球凝集素、ＴＲ０ＶＡＣ−Ａｌ Ｈ１７）Ｈ４血球ＭＩＩ素、オヨびＴＲ０ＶＡＣ−ＡｌＨ７１７）Ｈ７血球凝集 素の表面発現を確認した。Ｈ５ＨＡに特異的な単クローン性抗体の貯留を用いて 、Ｈ５血球凝集素の発現を検出した。ヒツジ単特異的抗Ｈ４血清を用いてＨ４Ｈ Ａの発現を分析した。Ｈ７特異的単クローン性抗体標品を用いてＨ７ＨＡの発現 を分析した。

イムノブレシピテーション 血球凝集素ポリペプチドの開裂はウィルス粒子が感染性であるために必要である ので、血球凝集素分子の開裂部位がウィルスの毒性を決定するのに重要な役割を 果たすことが分かっている。毒性Ｈ５およびＨ７ウイルスの血球凝集素タンパク 質はＩＡＩのカルボキシ末端に１つより多くの塩基アミノ酸を有している。これ により、一連の塩基アミノ酸を認識する細胞プロテアーゼが血球凝集素を開裂で き、感染ウィルスが生体外と体内の両方に広がる。Ｈ４無毒性菌株の血球凝集素 分子は、異種トリプシンが加えられるまで、組織培養中で開裂されない。

ＴＲ０ＶＡＣ組換え体により発現された血球凝集素分子が確実に処理されたこと を測定するために、上述した特異的試薬を用いて記載したように（ティラーら、 １９９０）イムノブレシピテーションを行なった。

ＴｌｏｖＡｃ−ＡｌＨ３（ｖＦＰ８９）により発現されたＨ５血球凝集素のイム ノブレシビテーション分析により、糖タンパク質は、それぞれ約４４および２３ ｋＤａの分子量を有する２つの開裂産生物ＨＡ　ｒおよびＨＡ２として明確であ ることが示された。未感染細胞または親ＴＲ０ＶＡＣに感染した細胞からはその ようなタンパク質は沈殿しなかった。ＴＲ０ＶＡＣ−ＡｌＨ３（ｖＦＰｌｏｏ） により発現された血球凝集素の同様のイムノブレシピテーション分析により、Ｈ Ａ２開裂産生物の特異的な沈殿が示された。

ＨＡ　ｌ開裂産生物は確認されなかった。未感染ＣＥＦ細胞またはＴＲ０ＶＡＣ 感染ＣＥＦ細胞からはタンパク質は特異的には沈殿しなかった。これに対して、 ＴＲ０ＶＡＣ−ＡｌＨ３（ｖＦＰ９２）の発現産生物のイムノブレシピテーショ ン分析により、前駆体タンパク質Ｈへ〇のみの発現が示された。これは、組織培 養中の無毒性亜種の血球凝集素に開裂のないことと一致する。未感染ＣＥＦ細胞 またはＴＲ０ＶＡＣに感染した細胞にはＨ４特異的タンパク質は検出されなかっ た。

実施例２３−３つのアビアンインフルエンザ遺伝子を発現する３重組換え体の発 生 プラスミドの構成 プラスミドｐＲＷ８４９は以前に記載しており、Ｈ６ブロモートしたアビアンイ ンフルエンザ遺伝子伝子を含有する。このプラスミドをｖＦＰ８９の発生に用い た。プラスζドｐ　ＲＷ８６１は、ｖＦＰｌｏｏの発生に用いた以前に記載した 中間プラスミドであった。このプラスミドは、Ｈ６ブロモートしたアビアンイン フルエンザ遺伝子伝子を含有する。プラスミドｐＲＷ８４９をＳｍａ　Ｉで切断 し、Ｈ６プロモーターの５′末端からＨ５遺伝子までの産生じた１、９ｋｂｐの 断片をｐ　ＲＷ８６１のＳｍａ　１部位に挿入し、ｐ　ＲＷ８６５を産生した。

Ｈ４暗号配列を挿入するために、プラスミドｐＲＷ８４８を用いた。プラスミド ｐＲＷ８４８をｖＦＰ９２の発生に用いた。このプラスミドをＨ６ブロモートし たＨ４遺伝子を含有する（前述）。プラスミドｐＲＷ８４８をＳｍａ　Ｉで切断 し、Ｈ６ブロモートしたＨ４暗号配列を含有する１、９ｋｂｐの断片をＨ６ブロ モートしたＨ５配列のＳｍａ　１部位５′でｐ　ＲＷ８６５に挿入した。それゆ え、産生じたプラスミドｐＲＷ８７２５およびＨ７暗号配列を含有する。

遺伝子のｄｅ−ＯＲＦｅｄ　Ｆ８座への挿入を１旨向するために、ｐ　ＲＷ８７ ２を部分約１こ３ｍａ　Ｉで切断し、線状断片を単離し、Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで 再度切断した。３つのＨ６ブロモートしたアビアンインフルエンザ遺伝子を含有 する５、７ｋｂｐのＳｍａ■からＨｉｎｄｌｌｌ　ｐＲＷ８７２断片をプラント エンドし、Ｈｉｎａｌｌで切断されたｐｃＥＮｌｏｏに挿入した。プラスミドｐ ｃＥＮ１００番よ、転写および翻訳終止信号および多重挿入部位を含有するｄｅ −σＲＦｅｄ　Ｆ８挿入ベクターである。プラスミドｐＣＥＮ１００を以下のよ うに産生じた。合成第１ノゴヌクレオチドＣＥ２０５　（配列認識番号２１１） およびＣＥ２０６　（配列認識番号２１２）をアニールし、ホスホリルイヒし、 ｐＪｃＡＯＯ２（前述）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌ！部位に挿入し、ｐＣ Ｅ７２を形成した。ｐＣＥ７２力）らのＢｇｌＩＩからＥｃｏＲＩ断片をｐＪｃ ＡＯ２１のＢｇＩＩＩおよびＥｃｏＲ１部位１こ挿入し、ｐｃＥＮｌｏｏを形成 した。

ｐＲＷ７３１−１５　（前述）力）らの４９００ｂｐ　Ｐｖｕ１ｌ−Ｈｉｎｄｌ Ｉ断片をｐＢＳＳＫＴのＳｍａ　ＩおよびＨｉｎｄｌＩ部位に挿入することによ り、プラスミドｐＪＣＡＯ２１を得た。

最終の挿入プラスミドｐ　ＲＷ８７４は、欠損Ｆ８　０ＲＦと同一の方向に転写 した３つのアビアンインフルエンザＨＡ遺伝子を有した。Ｈ４遺伝子に隣接した プラスミドの左側フランキングアームは、２３５０ｂｐの鶏痘配列からなるもの であった。Ｈ７遺伝子に隣接する右側フランキングアームは１７００ｂｐの鶏痘 配列からなるものであった。

このプラスミドの線状表示を以下に示す。

２］５０ｂｐＦＰ　Ｈ６Ｈ４ＨＡ　Ｈ６Ｈ５ＨＡ　Ｈ６Ｈ７ＨＡ　１７００ｂｐ ＦＰ組換え体ｖＦＰ１２２の発生 前述したリン酸カルシウム沈殿法（バニヵリら、１９ｇ２；ピッチｍ＝ら、１９ ８７）を用いて、プラスミドｐ　ＲＷ８７４−をＴＲ０ＶＡＣ感染主要ＣＥＦ細 胞中に移入した。特異的Ｈ４：　Ｈ５およびＨ６放射線標識プローブに対するハ イブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個体群となるま で、５連続のプラーク精製を行なった。

前述した特定の試薬を用いたプラークイムノスクリーンにより、３つの糖タンパ ク質の全ての表面発現を確認した。

２回の増幅後に、挿入遺伝子の安定性を確認し、組換え体をｖＦＰ１２２と称し た。

実施例２４−ＡＬｖＡＣおよびＮＹｖＡｃのＬＤ、。の様々なワクシニアウィル ス菌株との比較 ネズミ オスの非近交スイスウェブスターネズミをタコニック農場（Ｎ　Ｙ、ジャーマン タウン）から購入し、生後３週間までネズミに任意に餌と水を与え続けた（「通 常の」ネズミ）。新生の非近交スイスウェブスターネズミは両方の性であり、タ コニック農場により行なわれた妊娠により得た。使用した全ての新生ネズミは２ 日間で生まれたものであった。

ウィルス カナリヤボックス個体群のプラーク精製によりＡＬＶＡＣを誘導し、主要なひな の胚胎繊維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）において調製した。ショ糖密度勾配の遠心分離に より精製に続いて、ＣＥＦ細胞中でユニットを形成するプラークに関してＡＬＶ ＡＣを列挙した。ＷＲの巨大なプラーク表現型の選択により、ワクシニアウィル スのＷＲ（Ｌ）変形を誘導−した。ワクシニアウィルスのニス（Ｗｙｅｔｈ）ニ ューヨーク州保健局ワクチン菌株を、対照番号３０２００１Ｂとして、製薬中リ ンパ型ワクチンドライパックスから得た。

コペンハーゲン菌株ワクシニアウィルスＶＣ−２を、フランスのインスティテユ ートメリクスから得た。ワクシニアウィルス菌株ＮＹＶＡＣをコペンハーゲンＶ Ｃ−２から誘導した。ニス菌株を除いて全てのワクシニアウィルス菌株はペロア フリカグリーンサル肝臓細胞中で培養し、ショ糖勾配密度遠心分離により精製し 、ベロ細胞上のユニットを形成するプラークに関して列挙した。ニス菌株をＣＥ Ｆ細胞中で成長せしめ、ＣＥＦ細胞中で列挙した。

接種 １０匹の通常のネズミの群に、無菌の食塩加リン酸緩衝液中で株標品を１０倍に 希釈することにより調製したウィルスいくつかの希釈物の１つの０．０５ｍ１を 頭蓋内（ｉＣ）により接種した。ある例においては、未希釈の株ウィルス標品を 接種に用いた。

０．０３ｍ１の接種容量を用いたことを除いて、生後１または２日の１０匹の新 生ネズミの群に頭蓋内に通常のネズミと同様に接種した。

接種後、全てのネズミを１４日間（新生ネズミ）または２１日間（通常のねすみ ）に亘り、死亡率を毎日観察した。

接種後の翌朝に死亡したネズミは、外傷による潜在的な死のために除外した。

実験個体群の５０％の死亡率となるのに必要な致死量（Ｌ　Ｄ　ｓｏ）を、リー ドとミュンヒの比例法により決定した。

ｉｃ経路による通常、若い非近交ネズミに関するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣの ＬＤ、、と様々なワクシニアウィルス菌株との比較 若い通常のネズミにおいて、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの毒性は、試験した他 のワクシニアウィルス菌株よりも数桁低い大きさであった（表２８）。ＮＹＶＡ ＣおよびＡＬＶＡＣは、通常のネズミにおいてニス菌株よりも３．　０００倍も 毒性が弱く；親ＶＣ−２菌株よりも１２，５００倍も毒性が弱＜　；ＷＲ（Ｌ） 変形よりも６３，０００，０００倍も毒性が弱いことが分かった。これらの結果 により、ＮＹＶＡＣは他のワクシニア菌株と比較して非常に弱毒化されており、 ＡＬＶＡＣは頭蓋内に施されたときに若いネズミにとっては一般的に無毒性であ るが、両者とも、この経路による接種の未決定の機構による非常に高い接種量（ ３，８５ｘｌＯ’　ＰＦＵＳＡＬＶＡＣおよび３Ｘ１０８ｐｐｆｆ、ＮＹＶＡＣ ）ではネズミを死に至らせる。

ｉｃ経路による新生非近交ネズミに関するＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣのＬＤ、 。と様々なワクシニアウィルス菌株との比較 頭蓋内（ｉｃ）抗原投与モデルシステムの滴定により、通常の新生ネズミに関し て５ポックスウィルス菌株の相対毒性を試験した（表２９）。最終点での死亡率 に関して、ＬＤ、。値は、ＡＬＶＡＣは、ワクシニアウィルスのエスワクチシ菌 株よりも１００．０００倍も毒性が弱く；ワクシニアウィルスのコペンハーゲン ＶＣ−２菌株よりも２００゜０００倍も毒性が弱く；ワクシニアウィルスＷＲ− Ｌ変形よりも２５，０００，０００倍も毒性が弱いことが示された。言うまでも なく、試験した最高の接種量、６．３Ｘ１０’　ＰＦＵでは、１００％の死亡率 となった。３３．３％の死亡率は、６．３Ｘ１０６ＰＦＵで観察された。最高接 Ｆｆｎのネズミの平均生存時間（ＭＳＴ）（約６．３ＬＤ＝ｏ）は６．７±１． ５日であるので、死亡の原因は、実際には決定されないが、毒性学的性質または 外傷性質によるものではないようである。ＭＳＴが４．８±０．６日である５Ｌ Ｄ、。の抗原投与量でのＷＲ（Ｌ）と比較した場合、ＡＬＶＡＣを抗原投与した ネズミのＭＳＴは著しく長い（Ｐ−０，００１）。

ＮＹＶＡＣと比較して、エスハ、１５．０００倍も毒性が強＜　；ＶＣ−２は３ ５，０００倍す毒性１）＜強＜　、ＷＲ（Ｌ７は３，０００，０００倍も毒性が 強いことが分かった。ＡＬＶＡＣと同様に、ＮＹＶＡＣの２つの最高接種量、６ Ｘ１０’および６Ｘ１０’　ＰＦＵでは１００％の死亡率となった。しかしなが ら、３８０ＬＤ、。に対応する、最高接種量を抗原投与したネズミのＭＳＴは、 ２日のみであった（２日目に９匹死に、４日目に１匹死んだ）。対称的に、５０ ０ＬＤ５゜と等量の、ＷＲ−Ｌの最高接種量を抗原投与量　２８ ｉｃ経路による様々なワクシニアウィルス菌株とカナリヤポックスウィルス（Ａ ＬＶＡＣ）によるネズミの計算５０％致死接種量 ＶＣ−２１，ｔ６ｘｘｏ’ ＷＹＥＴＨ５、０ＯｘｌＯ’ ＮＹＶＡＣ１，５８ｘｌｏ” ｌｃ経路による様々なワクシニアウィルス菌株とカナリヤポックスウィルス（Ａ ＬＶＡのによるネズミの計算５０％致死接種量 ポックスウィルス菌株　計算したＬＤ、ｏ（ＰＰＵ）ＷＹＥＴＨ１＋６ ＮＹＶＡＣ１，５Ｂ）（１０６ 実施例２５−ＥＨＶ−１ｇＢＳｇＣおよびｇＤ糖タンパク質相同物を発現するＮ ＹＶＡＣベースの組換え体の産生 ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターの制御下にＥＨＶ−１ｇＢ相同物遺伝子 を配することにより、ＥＨＶ−１ｇＢ糖タンパク質の発現を行なった。ワクシニ アウィルスＨ６プロモーターの制御下にＥＨＶ−１ｇＣ相同物遺伝子を配するこ とによりＥＨＶ−１ｇＣ糖タンパク質の発現を行なった。昆虫ポックスウィルス ４２に遺伝子プロモニターの制御下にＥＨＶ−１ｇＤ相同物遺伝子を配すること によりＥＨＶ−１ｇＤ糖タンパク質の発現を行なった。

ｖＰ１０２５の産生（ＡＴＩ座におけるｇＢおよびｇＣ；ＨＡ座におけるｇＤ） 供与体プラスミドｐＪｃＡＯ４２の産生１：ＨＶ−１ｇＢ暗号配列＋７）４３０ ｂｐ（７）５’側領域を、テンプレートとしてのプラスミドｐＪｃＡＯ１１（Ａ ＴＩ座カセツテＨ６−ＥＨＶ−１ｇＢ）およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５６ （配列認識番号２２３）（５菅−ＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＧＣＣＧＴｒＣＴ −３’　）とＪＣＡ１５７　（配列認１番号２２４）（５１−ＧＡＣＧＧＴＧＧ ＡＴＣＣＧＧＴＡＧＧＣＧＧ−：ｌ　’　）を用いてＰＣＴ誘導し、ＢａｍＨＩ で切断してキナーゼした。この４３０ｂｌ）の断片を、テンプレートとしてのプ ラスミドｐＭＰ６９１　（Ｉ３Ｌ１０１ＲＡＢ）およびオリゴヌクレオチドＪＣ Ａ１５８（配列認識番号２２５）（５’　−ＴＴｒＴＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧ ＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣ−３’　）とＭＰ２８ ７　（配列認識番号２２６）（５’　−ＧＡＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴ ＧＴ−３’　）を用いて得られた１３Ｌプロモーター要素を含有する１２０ｂｐ のＰＣＴ誘導断片に融合した。この１２０ｂｐ断片をＸｂａｌで切断し、ＥＨＶ −１ｇＢ断片の４３０ｂｐ５′側領域と連結する前にキナーゼした。産生じたブ ラスミ１をｐＪｃＡＯ３４と称し？＝、ｐＪＣＡＯ３４の直接の塩基配列決定法 により、接合１３Ｌ−ＡＴＧおよびＥＨＶ−１５’側領域のＩ３Ｌプロモーター の配列を確認した。プラスミドｐＪｃＡＯ３４をＳｍａ　ＩとＢａｍＨＩで切断 して５５０ｂｐのＳｍａｌ−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ　５’−ＢａｍＨＩ断片（ Ａ）を切除した。プラスミドｐＭＰ’６６５　（ＣＯＰＣＳシステム中のカセツ テＨ６−ＨＥＶ−１ｇＢ）をＢａｍＨＩとＸｈｏｌで切断し、２５３０ｂｐのＢ ａｍＨＩ−ＥＨＶ−１ｇＢ　３’団べな（Ｂ）を切除した。次いで断片Ａおよび Ｂをともに、ＳｍａＩとＸｈｏＩで切断したベクターｐｓＤ５４１Ｖｃ　（ＡＴ ｌ　ｄｅｏｒｆｅｄ座）に連結し、ｐＪｃＡＯ３７を産生した。プラスミドｐＪ ｃＡＯ３７は、ＡＴＩ　ｄｅｏｒｆｅｄ座にカセツテ１３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢを 含有する供与体プラスミドである。プラスミドｐＪｃＡＯ３７をＳｍａｌとＸｈ ｏｌで切断し、３０５０ｂｐのＳｍａｌ−１３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ−Ｘｈｏｌ断 片（Ｃ）を単離した。

２２５ｂｐのＫｐｎ　Ｉ−ＥＨＶ−１ｇＣＢ’末端浄化Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片 を、プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３（ＨＡｄｅｏｒｆｅｄ座のカセツテＨ６−Ｅ ＨＶ−１ｇＣ）およびオリゴヌクレオチドＪＣＡ１５４（配列認識番号２２７） （５１−ＴＡＴＡＧＣＴＧＣＡＴＡＡＴＡＧＡＧ−３’　）とＪＣＡ１６Ｂ　（ 配列認識番号２２８）（５’　−ＡＡＴＴＡＡＧＣＴｒＧＡＴＡＴＣＡＣＪｌＩ ＡＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＣ買Ｇ−３’　）を用いてＰＣＲ誘 導し、ＫｐｎＩとＨｉｎｄｌＩＩで切断し、ＫｐｎｌとＨｌｎｄｌｌｌで切断し たベクターｐＢＳ−３Ｋ＋中に連結し、ｐＪｃＡＯ３３を産生した。ｐＪＣＡ０ ３３の直接の配列塩基決定方により確認した。プラスミドｐＪ　ＣＡＯ３３をＫ ｐｂｌとＥｃｏＲＶで切断し、２２ｂｐＫｐｎ　Ｉ−ＥＨＶ−１ｇＣ’末端Ｅｃ ｏＲＶ断片（Ｄ）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＢｇＩＩＩとＫ ｐｎＩで切断し、１３３０ｂｐのＢｇｌＩＩ−Ｈ６−ＥＨＶ−１ｇＣ５’Ｋｐｎ ｌ断片（Ｅ）を単離した。

断片ＣＳＤおよびＥを最終的に、ＢｇｌｌｌとＸｈｏｌで切断したベクターｐｓ Ｄ５４１Ｖｃ中にともに連結し、プラスミドｐ　Ｊ　ＣＡＯ４２を産生した。プ ラスミドｐＪＣＡＯ４２は、ＮＹＶＡＣＡＴＩ　ｄｅｏｒｆｅｄ座に！３Ｌ−Ｅ ＨＶ−１　ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶ−１ｇＣ二重構造を挿入する供与体プラスミド である。プラスミドｐＪＣＡＯ４２はＩＶＲの前にＮｏｔＩを用いて線状化した 。

供与体プラスミドとしてのｐＪｃＡＯ４２および治療ウィルスとしてのｖＰ８６ ６　（ＮＹＶＡＣ）を用いてベロ細胞上で生体外組換え実験を行なった。標準プ ロトコルを用いて組換えウィルスを同定し精製した（ピッチｍ；ら、１９８７） 。ＡＴＩ　ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１ｇＢおよびｇＣ遺伝子を含有するＮＹ ＶＡＣベースの組換え体をＶＰ９５６と称した。

供与体プラスミドｐＪＣＡＯ６４の産生プラスミドｐＥＨＶＩＢａｍＨＩＤ　（ ＥＨＶ−Ｉ　ＢａｍＨＩ　Ｄ断片を含有する）をＨｔｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断し、 金縁ＥＨＶ−１ｇＤ暗号配列を含有するが１５５′側ｂｐを含有しない１２４０ ｂｐのＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌを切除した。１２４０ｂｐのＨｉｎ ｄＩＩＩ−ＨｉｎｉｉＩＩＩ断片をクレノウボリメラーゼでプラントエンドし、 Ｓｍａ　Ｉで切断したベクターｐｃＯＰｃｓ６５７に連結し、ホスファターゼし た。産生じたプラスミドはｐＪＣＡＯＯ６と称した。プラスミドｐＪｃＡＯＯ６ をＢｇｌＩＩとＨｉｎｄｌｌｌで切断し、１５００ｂｐの）ｌ　ｉ　、ｎ　ｄｌ ｌｌ−Ｈ６−−ＥＨＶ−１ｇＤ−ＢｇｌＩＩ断片を切除した。この断片を、Ｂａ ｍＨＩとＨｉｎｄｌｌｌで切断したベクターｐｌＢＩ２４に連結し、プラスミド ｐ　ＥＨＶＩｇｐ５０ａを産生した。プラスミドｐＥＨＶ１ｇｐ５０ａを、両者 とも特有部位であるＥｃｏＲＶとＮｃｏｌで切断し、４１００ｂｐ断片を切除し た。この断片を、オリゴヌクレオチドＪＣＡＯ５２（配列認識番号２２９）およ びＪＣＡＯ５３（配列認識番号２３０）　（５’−（ＡＴＱＱＣＡＡＡＡＡＣＣ ＡＡＡＣＧＴＣＣＡＴＣＣＡＴＣＡＴＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＡＣＡＴＴ ＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＣＧＡＴ−３１） との間のハイブリダイゼーションにより得た合成二本鎖オリゴヌクレオチドに連 結した。産生じたプラスミドをｐｇｐ５０ａ３−２と称した。４９０ｂｐ　Ｅｃ ｏＲＩ　−ＥＨＶ−１ｇＤ　３’末端浄化−ＨｐａＩを、テンプレートとしての プラスミドｐＪｃＡＯＯ５およびオリゴヌクレオチドＪＣＡＯ４１（配列認識番 号２３１）（５１−ＴＧＴＧＴＧＡ　ＴＧＡＧＡＧＡＴＣＡＧ−３’　）とＪＣ ＡＯ９９（配列認識番号２３２）（５’　−ＡＡＣＴＣＧＡＧＴｒＡＡＣＡＡＡ ＡＡＴＩ’ＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＴＡＴＡＴ’ＰＴＡＡＣＡＴ−３’　）を 用いてＰＣＴ誘導した。プラスミドｐｇｐ５０ａ３−２をＥｃｏＲＩで切断し、 ＨｉｎｄＩ　Ｉ　１で部分的に切断し、８５０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｈ６−Ｅ ＨＶ−１ｇＤ５’−ＥｃｏＲＩ断片を切除した。この断片を４９０ｂｆ）のＥｃ ｏＲＩ−Ｈｐａｌ断片とともにＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＳｍａｌで切断したベクタ ーｐＢＳ−５Ｋ＋に連結し、プラスミドｐＪｃＡＯ２０を産生じた。プラスミド ｐ　Ｊ　ＣＡＯ２０はカセツテＨ６−ＥＨＶ−１ｇＤを含有スル。

ＥＨＶ−１ｇＤ暗号配列の７２０ｂｐの５′側領域を、テンプレートとしてのプ ラスミドｐＪｃＡＯ２０およびオリゴヌクレオチドＪＣＡＯ４４（配列認識番号 ２３３）（５’　−ＣＴＣＴＡＴＧＡＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣ−３１）とＪＣＡ１ ６５　（配列認識番号２３４）（５１−λＴＧＴＣＴＡＣＣ’Ｉ’ｒＣＭＧＣＴ ＴＡＴＧ−３’　）を用いてＰＣＴ誘導した。この断片をＥｃｏＲｌで切断し、 キナーゼした。１０７ｂｐ　４２にプロモーター要素を、テンプレートとしての プラスミドｐＡＭ１２およびオリゴヌクレオチドＲＧ２８６　（配列認識番号２ ３５）（５′−埜ＴＴＡＴＡＴＴＧＴＡＡ？ｒＡＴＡ−３１）とＪＣＡ１６４（ 配列認識番号２３６）（５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＴα緑鮎ＭＴＡ ＡＡＴＧ−３！）を用いてＰＣＲ誘導した。この断片をＢａｍＨＩで切断し、キ ナーゼし、７２０ｂｐ（７）ＡＴＧ−ＥＨＶ−１ｇＤ　５’　−ＥｃｏＲＩ断片 とともにＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断したベクターｐＢＳ−ＳＫ”に連結し、 プラスミドｐＪＣＡＯ３５を産生した。接合４２に−ＥＨＶ−１ｇＤおよびＥＨ Ｖ−１ｇＤ　５’部分（７）４２にブ０モー９−４）配列をｐＪｃＡＯ３５の直 接の塩基配列決定法により確認した。

プラスミドｐＪｃＡＯ３５をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断し、８３０ｂｐのＢ ａｍＨＩ−４２に−ＥＨＶ−１ｇＤ　５’部分−ＥｃｏＲＩ断片（Ｆ）を単離し た。プラスミドｐＪＣＡＯ２０をＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断し、５０″ｒｙｂ ｐのＥｃｏＲＩ−ＥＨＶ−１ｇＤ　３’末端浄化−ＸｂａＩ断片（Ｇ）を単離し た。次いで断片ＦおよびＧを、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで切断したベクターｐＢＳ −５Ｋ＋にともに連結し、プラスミドｐＪＣＡＯ３８を産生した。プラスミドｐ ＪＣＡＯ３８は、ベクターｐＢＳ−５Ｋ＋中１：　カセ−／　テ４２　Ｋ　−Ｅ 　ＨＶ　−１ｇ　Ｄを含有しティる。プラスミドｐＪＣＡＯ３８をＢａｍＨＩと Ｈｐａｌで切断し、１３４０ｂｐのＨｐａ　ｌ−４２に−ＥＨＶ−１ｇＤ”−Ｂ ａｍＨＩ断片を単離した。この断片を、ＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉで切断したプラ スミドｐＳＤ５４４　（ＨＡｄｅｏｒｆｅｄ座）に連結し、プラスミドｐ　Ｊ　 ＣＡＯ６４を産生した。プラスミドｐ　Ｊ　ＣＡＯ６４は、カセツテ４２に−Ｅ ＨＶ−１ｇＤをＮＹＶＡＣＨＡ　ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入する供与体プラスミド である。ＩＶＲの前にＮｔＩを用いてプラスミドｐＪＣＡＯ６４を線状化した。

供与体プラスミドとしてのｐＪ　ＣＡＯ６４および治療ウィルスとしての組換え ワクシニアウィルスｖＰ９５６（ＮＹＶＡＣバックグラウンド）を用いてベロ細 胞上で生体外実験を行なった。これは標準方法に関して行なった（ピッチｍ＝ら 、１９８７）。ＡＴＩ　ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１ｇＢおよびｇＣ遺伝子を 、ＨＡ　ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１ｇＤ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベース ノ組換え体をＶＰ１０２５と称した。

供与体プラスミドｐＪｃＡＯ４３の産生ブ亨スミドｐ　Ｊ　ＣＡＯ１１およびオ リゴヌクレオチドＪＣＡ１５９　（配列認識番号２３７） （５’　−ＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＣ−３’　）とＪＣＡ１ ６０　（配列認識番号２３８）（５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＣＡＣＡ ＡＡＡＡＴｒＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＴＴＣＡＴＴ−３・）を用いて２２０ｂｐの ＨｉｎｄｌＩＩ−ＥＨＶ−１ｇＢ３′側領域をＰＣＲ誘導した。この断片をＢａ ｍＨＩとＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉで切断し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した ベクターｐＢＳ−５Ｋ＋に連結し、プラスミドｐＪＣＡＯ３６を産生した。ｐＪ ｃＡＯ３６の直接の塩基配列決定法ニヨリ、ＥＨＶ−１ｇＢ　３’側領域ＰＣＲ 断片の配列を確認した。

プラスミドｐＪｃＡＯ３３をＥｃｏＲＶとＫｐｎＩで切断し、Ｋｐｎ　Ｉ　−Ｅ ＨＶ−１ｇＣ３’側領域−Ｅｃ。

ＲＶ断片（Ｈ）を単離した。プラスミドｐＪｃＡ０３８をＢａｍＨＩとＨｐａｌ で切断し、１３６０ｂｐのＨｐａｌ−４２に−ＥＨＶ−１ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片 （１）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３をＫｐｎｌとｘｈｏｆで切断 し、９００ｂｐのＸｈｏｌ−ＥＨＶ−１ｇＣ中央部分−Ｋｐｎｌ断片（Ｊ）を単 離した。次いで断片Ｈ１■およびＪを、ＢａｍＨＩとＸｈｏｌで切断したベクタ ーｐＢＳ−５Ｋゝにともに連結し、プラスミドｐ　Ｊ　ＣＡＯ４１を産生した。

プラスミドｐＪ　ＣＡＯ３４をＨｉｎｄｌｌｌとＸｈｏｌで切断し、５９００ｂ ｐの線状化ベクターＸｈｏｌ−ｐＢＳ−５Ｋ”　−Ｉ３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ−Ｈ ｉｎｄＩＩＩ断片（Ｋ）を単離した。プラスミドｐＪｃＡＯ３６をＢａｍＨＩと ＨｉｎｄｌｌＩで切断し、２２０ｂｐのＨｉｎｄｌｌｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ　３− 一側領域−ＢａｍＨＩ断片（Ｌ）を単離した。プラスミドｐＶＨＡＨ６ｇ１３を ＢｇｌｌｌとＸｈｏＩで切断し、４４０ＭのＢｇｌｌｌ−Ｈ６−ＥＨＶ−１ｇＣ ５’部分−Ｘｈｏｌ断片（Ｍ）を単離した。次いで断片ＫＳＬおよびｍをともに 連結し、プラスミドｐＪｃＡＯ４０を産生した。

プラスミドｐＪｃＡＯ４０をＳｍａ　ＩとＸｈｏＩで切断し、３５５０ｂｐのＳ ｍａｌ−１３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ−−ＥＨＶ−１ｇＣ５’部分−Ｘｈｏｌ断片（ Ｎ）を単離した。プラスミドｐＪ　ＣＡＯ４１をＢａｍＨＩとｘｈｏｆで切断し 、２４６０ｂｐのＸｈｏｌ−ＥＨＶ−１ｇＣ３’部分−−４２に−ＥＨＶ−１ｇ Ｄ−ＢａｍＨ１断片（０）を単離した。断片Ｎおよび０を最終的に、ＢｇＩＩＩ とＳｍａ　Ｉで切断したプラスミドｐｓＤ５４１Ｖｃ（ＮＹＶＡＣＡＴＩ　ｄｅ ｏｒｆｅｄ座）にともに連結し、プラスミドｐ　Ｊ　ＣＡ０４Ｂを産生じた。プ ラスミドｐＪＣＡＯ４３は、１３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ　−−Ｈ６−ＥＨＶ−１ｇ Ｃ−−４２に−ＥＨＶ−１ｇＤ三重１造をＮＹＶＡＣＡＴＩ　ｄｅｏｒｆｅｄ座 に挿入する供与体プラスミドである。ＩＶＲの前にＮｏｔＩを用いてプラスζド ｐＪｃＡＯ４３を線状化した。

供与体プラスミドとしてｐＪｃＡＯ４３および治療ウィルスとしてｖＰ８６６　 （ＮＹＶＡＣ）を用いて主要ひな胚胎児繊維芽細胞上に生体外実験を行なった。

標準方法を用いて産生じた組換え体を同定し、精製した（ピッチｍ＝ら、１９８ ７）、ＡＴＩ　ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１ｇＢ。

ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０４３と 称した。

実施例２６−ＥＨＶ−１ｇＢＳｇｃお及びｇＤ糖タンパク質相同物を発現するＡ ＬＶＡＣベースの組換え体の産生 供与体プラスミドｐＪＣＡＯ４９の産生プラスミドｐＪｃＡＯ４０をＳｍａ　１ とＸｈｏＩで切断し、３５５０ｂｐのＳｍａｌ−１３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ−−Ｈ ６−ＥＨＶ−１ｇＣ５’部分−ＸｈｏＩ断片（Ａ）を単離した。プラスミドｐＪ 　ＣＡＯ４１をＢａｍＨＩとＸｈｏｌで切断し、２４６０ｂｐのＸｈｏ　Ｉ　− ＥＨＶ−１ｇＣ３’部分−−４２に−ＥＨＶ−１ｇＤ−ＢａｍＨＩ断片（Ｂ）を 単離した。断片ＡおよびＢを、ＢａｍＨＩとＳｍａ　Ｉで切断したプラスミドｐ ＳＰＶＱＣ３Ｌにともに連結し、プラスミドｐＪｃＡＯ４９を産生した。

皿ｐＪＣＡＯ４９ｉ；ｔ、１３Ｌ−ＥＨＶ−１ｇＢ−−Ｈ６−ＥＨＶＩ　ｇＣ− −４２に−ＥＨＶ−１ｇＤ三重構造をＡＬＶＡＣＣ３ｄｅｏｒｆｅｄ座に挿入す るプラスミドである。ＩＶＲの前に、Ｎｏｔｌを用いてプラスミドｐ　Ｊ　ＣＡ Ｏ４９を線状化した。

供与体プラスミドとしてのｐＪＣＡＯ４９および治療ウィルスとしてのＣＰｐｐ 　（ＡＬＶＡＣ）を用いて、主要ひな胚胎繊維芽細胞上で生体外実験を行なった 。標準方法を用いて産生じた組換え体を同定し精製した（ピッチｍ＝ら、１９８ ７）、Ｃ３ｄｅｏｒｆｅｄ座にＥＨＶ−１ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子を含有す るＡＬＶＡＣベースの組換え体を’ｖ　ＣＰ　１３２と称した。

実施例２７−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースノウマヘルペスウイルス１ 型三重組換え体の発現分析 ＥＨＶ−１ｇＢ　（１６Ｇ５または３Ｆ６）　、ＥＨＶ−１ｇＣ（１４Ｈ７）お よびＥＨＶ−１ｇＤ　（２０Ｃ４）に特異的な単クローン性抗体を用いて、前述 したように（ティラーら、１９９０）蛍光抗体法アッセイを行なった。全ての抗 ＥＨＶ−１単クローンをジョージアレン（４０５４６−００７６、ケンタラキー 州、レキシントン、ケンタラキー大学、獣医科学科）から得た。３つのＥＨＶ− １特異的産生物全ての発現は、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３まはｖｃＰ１３２の いずれに感染した細胞内部に検出可能であった。ＥＨＶ−１ｇＣ糖タンパク質の みが、感染細胞の表面上に良好に発現された。ＥＨＶ−１ｇＢ糖タンパク質の表 面発現は非常に弱く、ＥＨＶ−１ｇＤ糖タンパク質の表面発現は疑わしいもので あった。

同一の単クローン性抗体を用いてイムノブレシビテーションを行ない、発現され たＥＨＶ−１ｇＢ、ｇＣおよびｇＤ遺伝子産生物の真正を測定した。ＥＨＶ−１ ｇＢ糖タンパク質に特異的な単クローン性３Ｆ６は、組換えウィルスｖＰ９５６ 、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２に感染した細胞から誘導され た溶解産物からの１３８ｋＤａ、７０ｋＤａおよび５４ｋＤａの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルシステム上の見かけ分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた。未感染 細胞またはいずれの親ウィルス（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ）感染細胞から誘 導された溶解産物からはどのタンパク質も沈殿しなかった。ＥＨＶ−１ｇＣ糖タ ンパク質に特異的な単クローン性１４Ｈ７は、ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５または ｖＰ１０４３のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物からは９０ｋＤ ａの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。組換え体ｖｃＰ１３ ２により発現されたＥＨＶ−１ｇＣ糖タンパク質は、組換え体ｖＰ９５６、ＶＰ １０２５またはｖＰ１０４３により発現された糖タンパク質よりもやや小さな（ 約２ｋＤａ小さい）見かけ分子質量を有する。

ＥＨＶ−１ｇＤ糖タンパク質に特異てきな単クローン性抗体２０Ｃ４は、ｖＰ１ ０２５、ｖＰ１０４３またはｖＣＰ１３２に感染した細胞から誘導された溶解産 物からは５５ｋＤａの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。

またはＧ、アレンから得たウサギ抗−ＥＨＶ−１高度免疫血清を用いてイムノブ レシピテーションを行なった。この血清は、ｖＰ１０２５、ｖＰ１０４３または ＶＣＰ１３２のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物から３つのＥＨ Ｖ−１産生物全てを沈殿せしめた。

実施例２８−ハムスター抗原投与モデルを用いて得られた防御データ 抗原投与実験（ハムスターモデル）をローンメリクス（フランス、リヨン）で行 ない、ポックスウィルスＥＨＶ−１組換え体ｖＰ９５６、ｖＰ１０２５およびｖ ｃＰ１３２により誘発した防御の相対水準を評価した。ハムスターを０日にワク チン接種し、１４日にＥＨＶ−１組換え体の様々な希釈物を追加抗原投与した。

全て免疫化し、対照の動物に、２８日にハムスター適用ＥＨＶ−１抗原投与気株 を抗原投与した。死亡した動物の最終的な数は３５日（抗原投与後７日）に数え た。抗原投与実験の結果を表３０に示す。

表　３０ 組換え体　ＥＨＶ−１遺伝子　接Ｎｌｋ　ＴＣＩＤ５０１ｏｇｔｏ／死亡／合計 ｖＣＭ３２　ｇＢ　＋　ｇＣ十ｇＤ　Ｂ、８　６．８　４．８対照　無　４／４ 実施例２９−イヌの免疫持続期間の研究この研究の目的は、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　 （ｖＣＰ６５）の１回の接種後のイヌに防御免疫応答が保持される期間を測定す ることにある。抗狂犬病抗体を有さない生後８か月の、４１匹のピーグル大に、 皮下経路により６．７１ｏｇ、ｏＴＣＩＤ５０のＡＬＶＡＣ−ＲＧの１回の接種 量を接種した。

ワクチン接種後、０日と１．２．３．６および１２か月でイヌを採血し、ＲＦＦ Ｉ試験を用いて抗狂犬病抗体の存在について血清をアッセイした。全ての動物を 、ワクチン接種の副作用について監視した。

ワクチン接種から６か月後、５匹のイヌに、狂犬病ウィルスの毒性ＮＹＧＳ菌株 を筋向接種により抗原投与した。

その動物には側頭筋に１０３・４５０％ネズミネズ量を投与した。３匹の未接種 対照動物にも同一の接種を行なった。

１１匹のワクチン接種したイヌと３匹の未接種対し卯よイヌには、ワクチン接種 から１２か月後に同一の方法で抗原投与した。血清学的結果と６および１２か月 での抗原投与の結果を表３１に示す。

ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）でワクチン接種したどのイヌもワクチン接種 に対する副作用は示さなかった。ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖｃＰ６５）を接種した 全てのイヌは、ワクチン接種から７日後に狂犬病ウィルス中和抗体の誘発を示し た。最大の力価は、ワクチン接種後１４から２８日の間に達成され、その後減少 した。ワクチン接種から６まは１２か月後での抗原投与の時に、力ｉは低く、あ る動物においてはゼロに近かった。低い力価にもかかわらず、全ての動物は、ワ クチン接種をしなかった対照イヌが死んだ致死狂犬病抗原投与にも生存した。ワ クチン接種から６か月後の抗原投与に生存した動物のＲＦＦＩ力価を８かガロ（ 抗原投与から２か月後）に評価した。これらの動物の血清力価は、７．４．７． ４．２．３．１．８、および７゜４国際車位であった。狂犬病中和抗体のこれら の上昇し保持された水準は、動物が最初の１回の接種により効果的にｙ ｌｉｔＸｂれたことを示す。実験は進行中であり、残りの動物は、ワクチン接種 から２または３年後に抗原投与する。しかしながら、データに関して、実験を成 功であり、本発明の詳細な説明している。

実施例３Ｏ−ＮＹＶＡＣ中のウシヘルペスウィルス１型ＢＨＶＩ遺伝子の発現 ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶＩ　ｇＩＶ組換え体の産生プラスミドｐＢＨＶｇｌＶをロー ンメリクスから得た。

このプラスミドは、３．９ｋｂ　Ｐｓｔ！断片上にコードされ、ｐＢＳ−８Ｋ＋ のＰｓｔ１部位にクローニングされるＢＨＶＩ　ｇｌＶ遺伝子（ストローブ菌株 ）を含有する。

このプラスミドからのｇｌＶ遺伝子（チコーら、Ｊ、ピロル（１９９０）　６４ 　：　５１３２）をワクシニアウィルスフランキングアー１の間にクローニング した。ｇｌＶ遺伝子をかゆうするｐＢＨＶｇｌＶの２．０００ｂｐ　Ｐｓｔｌ− Ｘｈｏｌ断片を、ｐＳＤ５４２のＰｓｔｌ−Ｘｈｏ１部位（実施例３２に定義） にクローニングすることによりこのことを行なった。この操作により産生された プラスミドをｐＢＨＶｌと称する。

次いでπプロモーターの３′末端をｇｌＶ遺伝子の上流、にクローニングした。

これは、πプロモーターの３′末端とｇ’ｌＶ遺伝子の５′末端をコードするオ リゴヌクレオチドＢＨＶＬ７　（配列認識番号２３９）（５曹−ＴＣＧＡＧＣＴ ｒＡＡＧＴＣＴＴＡＴｒＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＡＣＡＴＴＧＧＣＣＧ ＴＧＣＴＧＧＧＣＧＣＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＧＧＴＧＡＧＣＴｒＧＣ ＣＴＡＣＡＣＣＣＧＣＧＣＣＧＣ−３’　）およびＢＨＶＩ８　（配列認識番号 ２４０）（５’−ＧＧＣＧＣＧＧＧＴＧＴＡＧＧＣＡＡＧＣｒＣＡＣＣＧＣＡＡ ＣＧＧＣＧＡＧＣＡＧＣＧＣＧＣＣＣＡＧＣＡＣＧＧＣＣＡＡＴＧＴＣＧＧＣＣ ＣＴＴＧＣＡＴＡＴｒＡＡＴＡＡＧＡＣ’Ｉ’ｒＡＡＧＣ−３１）をｐＢＨＶｌ の５，５００ｂｐの部分的５ｓｔｌＩ−Ｘｈｏ１断片にクローニングすることに より行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。

次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５ 　（配列認識番号２４１）（５’　−ＧＧＧＴＧＡＣＴＧＣＡ−３’　）および ＢＨＶＩ６　（配列認識番号２４２）（５’　−ＧＴＣＡＣＣＣ−３’　）をｐ ＢＨＶ３の５．２００ｂｐの部分的Ｓｍａｌ−Ｐｓｔｌ断片にクローニングする ことにより行なった。この操作により産生でたプラスミドをｐＢＶＨ４と称する 。

次いで異種リンカ−配列を除去した。これはｐＢＨＶ４の５．２００ｂｐ　Ｐｓ 　ｔ　Ｉ断片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラス ミドをｐＢＨＶ５と称する。

次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、π プロモーターの５′末端を含有す−るｐＰＩ４の１３０ｂｐ　Ａｆｌｌｌ−Ｘｈ ｏｌ断片をｐＢＨＶ５の５，２００ｂｐ　Ａｆ　ｌ　Ｉ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片に クローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐ ＢＨＶ６と称する。

ｐＢＨＶ６を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体外 組換え実験に用いてｖＰ１０５１を産生した。

イムノブレシビテーションを行なって、ｖＰ１０５１が真正ＢＨＶＩ　ｇｌＶ糖 タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、ｌ ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖＰ１０ ５１に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、２％の胎児ウシ 血清と［”３１−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イー グル培地（メチオニンのない）を細胞に重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３ ％のＮＰ−４０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　、３ｍＭのＥＤＴＡ、０． ０３％のＮａＡｚ″ｒｄｅおよび０−６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍ１ のアプロチニンの添加と続いての細胞単層のかきとりにより細胞を感染から７時 間後に収穫した。

次いでＢＨＶＩ　ｇＩＶ特異特異的コクローン性抗体３４０２Ｉ、マジソン、ラ イスコンシン大学、Ｄｒ、　ジオフリーリッチワースから得た）を用いて溶解産 物を、ＢＨｖｌ　ｇｌＶ発現に関して分析した。これは以下の方法によって行な った。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結 合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース 結合うット抗ネズミ抗体をｇｌＶ特異特異的ワクローン性抗体３４０２合せしめ た。一方で、通常のネズミ血清およびタンパク質Ａセファロース結合うット抗ネ ズミ抗体を４℃で一晩に亘すインキユベーションすることにより、溶解産物を前 浄化した。この物質をＩ×の緩衝液Ａで５回洗浄した後、ＢＨｖ１セファ０−ス 単クローり性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産 物に加え、４℃で一晩に亘りインキュベーションした。その試料を、１×緩衝液 Ａで５回、ＬｉＣｌ２／尿素緩衝液で２回洗浄した後、２Ｘラエムリ緩衝液（１ ２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０ ％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈 殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリ ファスゲルシステムｌで分画しくドリファスら、１９８４）　、固定し、蛍光光 度法のためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。

ＢＨＶＩ　ｇＩＶ特異特異的コクローン性抗体３４０２ＶＰ１０５１感染細胞か らＢＨＶＩ　ｇｌＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、ＮＹＶＡＣまたは 疑似感染細胞からはＢＨＶＩ−特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶＩ　ｇｌおよびｇＩＶ組換え体の産生 ＢＨＶＩ　ｇｌＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＶは、ローンメリク スから得た。このプラスミドからのｇＩＶ遺伝子をワクシニアウィルスフランキ ングアームの間にクローニングした。これは、ｇｌＶ遺伝子を含有するｐＢＨＶ ｌｇｌＶ（７）２，０００ｂｐ（７）Ｐｓｔｌ−Ｘｈ。

Ｉ断片を、ｐＳＤ５４２のＰｓｔｌ−ＸｈｏＩ部位にクロ−ニングすることによ り行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶｌと称する。

次いでπプロモーターの３′末端をｇｌＶ遺伝子の上流にクローニングした。こ れは、πプロモーターの３′末端とｇｌＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴ ヌクレオチドＢＨＶＬ７　（配列認識番号２３９）およびＢＨＶＩ８（配列認識 番号２４０）をｐＢＨＶ１１７）５．５００ｂｐの部分的５ｓｔｌｌ−Ｘｈｏｌ 断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミ ドをｐＢＨ￥３と称する。

次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ５ 　（配列認識番号２４１）およびＢＨＶＩ６　（配列認識番号２４２）をｐＢＨ Ｖ３の５，２００ｂｐ部分的Ｓｍａｌ−Ｐｓｔｌ断片にクローニングすることに より行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。

次いで異種リンカ−配列を除去した。これし、ｐＢＨＶ４の５．２００ｂｐのＰ ｓｔｌ断片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミ ドをｐＢＨｖ５と称する。

次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、π プロモーターの５′末端を含有するｐｐ　１４の１３０ｂｐのＡｆ　１１　Ｉ− Ｘｈｏｌ断片をｐＢＨＶ５（７）５，２００ｂｐのＡｆ　１１　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ 断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミ ドをｐＢＨＶ６と称する。

次いでＢＨＶＩ　ｇｌ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、Ｈ６ブ ロモートしたｇＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐ（７）Ｂｇ　ｌ 　Ｉ　Ｉ断片ヲｐ　ＢＨｖ６のＢｇｌ１１部位にクローニングすることにより行 なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ９と称する。

ｐＢＨＶ８を以下の方法により産生じた。プラスミドｐＩＢ！Ｓ６をローンメリ クスから得た。このプラスミドは、ＢＨＶ１ｇｌ遺伝子を含有する６、６ｋｂの ５ａｉｌ断片（ストロニブ菌株）を含有する。ｇＩ遺伝子の５′末端（ホワイト ベックら、Ｊ、ピロル（１９８８）　６２　：　３３１９）をＨ６プロモーター の下流と、ワクシニアウィルスＨＡフランキングアームの間にクローニングした 。これは、ｐｌＢＲ８６の５４ｂｐの５ａｉｌ−Ｐｓｔｌ断片をｐＧＤ５の４゜ ４００ｂｐの５ａｌＩ−Ｐｓｔｌ断片にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐ　Ｉ　ＢＨ３と称する。

次いでＨ６プロモーターの開始コドンを、オリゴヌクレオチドＩＢＲＬＩ（配列 認識番号２４３）（５・−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧ ＧＣＣＧＣＴＣＧＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＧＣＣＧＣ−３１） およびＩＢＲＬ２（配列認識番号２４４）（５菅−ＧＧＣＧＣＧＴＴＣＡＧＣＡ ＣＣＧＣＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴ　入入ＣＧ ＧＡＴ−３’　）を、ｐｌＢＲ２（７）３，８００ｂｐ（７）Ｎｒｕｌ−Ｓｓｔ ｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラス ミドをｐＩＢＲ４と称する。　次いで将来の操作に必要なＮｃｏＩ部位をｇＩ配 列の下流に産生じた。これは、オリゴヌクレオチドＩＢＲＬ３（配列認識番号２ ４５） （５’　−ＣＣＡＴＧＧＴＴ’ｒＡＡＴＧＣＡ−３’　）およδＩＢＲＬ４　（ 配列認識番号２４６）（５’−ＴｒＭＡＣＣＡＴＧＧＴＧＣＡ−３１）ヲｐ　Ｉ 　ＢＲ４ノＰ　ｓ　ｔ　１部位にクローニングするこトニより行なった。この操 作により産生じたプラスミドをｐｌＢＲ５と称する。

次いで追加のｇＩ配列をｐＩＢＲ５にクローニングした。

コレハ、ｐｌＢＲ９６１７１１，７４０ｂｐのＴｔｈｌｌｌｌ−−Ｎｃｏｌ断片 をｐ　ＩＢＲ５の３，７００ｂｐのＴｔｈ１１１’１−Ｎｃｏ！断片にクローニ ングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐ　Ｉ　Ｂ Ｈ３と称した。

次いで将来の操作に必要なりｇｌ１１部位をｇＩ配列の下流に産生じた。これは 、オリゴヌクレオチドＩ　ＢＲＬ５（配列認識番号２４７） （５’　−ＣＡＴＧＧＴＴｒＡＡＧＡＴＣＴＣ−３１）およびＩＢＲＬ６（配列 認識番号２４８）（５’−ＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＴＡＡＡＣ−３市）をｐｌＢ Ｒ７のＮｃｏ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産 生じたプラスミドをｐｌＢＲ８と称する。

次いでｇ！遺伝子の３′末端をｐｌＢＲ８にクローニングした。これは、ｐ　Ｉ 　ＢＲＳ６の２．２８５ｂｐ　５ｔｕＩ断片をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラー ゼＩ　（フレノウ断片）が充填されたｐＩＢＲ８の４，３００ｂｐ　５ｔｕＩ− ’ｆｆｇｚｘ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作 により産生じたプラスミドをｐＩＢＲ２０と称する。

次いでＨ６ブロモートしたＢＨＶＩ　ｇｌ遺伝子をワクシニアウィルス供与体プ ラスミドに移動せしめた。これは、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ！　（フ レノウ断片）が充填されたｐ　Ｉ　ＢＨ２０の２．９００ｂｐ　Ｂｇｌｌ−Ｎｃ ｏｌ　（部分的）断片をｐＳＤ５４２のＳｍａ　Ｉ部位にクローニングすること により行なった。これによりＨ６ブロモートしたｇ！遺伝子をｔｋフランキング アームの間に配する。この操作により産生じたプラスミドをｐ　Ｉ　ＢＨ２２と 称する。

次いでＢｇｌｌＩ部位をＨ６プロモーターの下流に産生じた。これは、ｐｌＢＲ ２２の２，８００ｂｐ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＧＤ３の３，５０ ０ｂｐ　Ｈ１ｎｄｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＶ断片にクローニングすることにより行 なった。（ｐＧＤ３は、Ｈ６ブロモートした２型単純ヘルペスウイルス（Ｈ５Ｖ ２）ｇＤ遺伝子から下流のＧｇｌＩＩ部位を含有する。この操作により、ＨＳＶ ２ｇＤ配列をＢＨＶ　Ｉ　ｇ　Ｉ遺伝子が置換され、それゆえＨ６ブロモートし たｇＩＩ伝子から下流にＢｇｌ１１部位を産生ずる）。この操作により産生じた プラスミドをｐＢＨＶ８と称する。

ｐＢＨＶ９を治療ウィルスとして（７）ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣＹとともに生 体外組換え実験に用いてｖＰ１０７４を産生した。

イムノブレシピテーション分析を行ない、ｖＰ１０７４が真正ＢＨＶＩ　ｇＩお よびｇｌＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染し たか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、または ｖＰ１０７４に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、 ２％の胎児ウシ血清および［３５Ｓ］　−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含 有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。１ ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　、 ３ｍＭのＥＤＴＡ、０゜０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０，６ｍｇ／ｍｌのＰ ＭＳＦ）および５０ｍ１のアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとるこ とにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。

次いでＢＨＶｌ　ｇｌｌ特異的ツクローン性抗体５１０６およびｇｌＶ特異特異 的単一ローン性抗体３４０２ｌ、マジソン、ライスコンシン大学、Ｄｒ、　ジオ フェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶＩ　ｇｌおよびｇ ｌＶ発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ 血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝 液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合うット仇ネズミ抗 体をｇＩ特特異的ツクローン性抗体ｇＩＶ特異特異的ワクローン性抗体合せしめ た。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合うット抗ネズミ抗 体を４℃で一晩インキユベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この 物質をＩ×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ｇＩまたはｇＩＶ特異特異的ワクロー ン性抗体ット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４ ℃で一晩インキユベーションした。この試料をＩ×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２／ 尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプ トエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合 体から分離した。

次いでタンパク質を１０％のドリフデスゲルシステム上で分画しくドリファスら 、１９８４）　、固定し、蛍光光度法のためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理 した。

ＢＨＶＩ　ｇｌおよびｇｌＶ特異特異的単一ローン性抗体１０６および３４ｏ２ は、ｖＰ１０７４感染細胞がらＢＨＶＩ　ｇＩおよびｇｌＶ糖タンパク質を特異 的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞がらのＢＨＶｌ− 特異的タンパク質は沈殿しなかった。

ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶＩ　ｇＩＩＩ組換え体の産生プラスミドｐＢＨＶｇ　Ｉ　Ｉ 　Ｉをローンメリクスから得た。

このプラスミドは、ｐＢＳＫ＋のＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌ１１部位にクローニン グされた３、４ｋｂのＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片上にコードされたＢ ＨＶＩ　ｇｌＩＩ遺伝子（ストローブ菌株）を含有する。このプラスミドからの ｇｌＩＩ遺伝子（フィッッパトリックら、ウィルス学、（１９８９）　１７３　 ：　１４Ｂ　）をワクシニアウィルスフランキングアームの間にクローニングし た。これは、ｇＩＩＩＩ伝子の５′末端を含有するｐＢＨＶｇｌ　Ｉ　Ｉ（７） １．ｏｏｏｂｐ、のＮｃ　ｏ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片、およびＩ３Ｌプロモーター をコー′ドするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬＩ　（配列認識番号（５’−ＧＡＴ ＣＣＴＧＡＧＡＴ ＡＡＡＧＴＧＡＭＡＴＡＴＡＴＡＴＣＡｌｒ′ＩＩＡＴＡ買Ａｃ思ＧＴＡ滋貫Ａ 實ｍＧＧγπ品Ｔ−３１）とＢＨＶＩ２　（配列認識番号２５ｏ）（５１−ＣＡ ＴＧＡＴｒＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴｒＧＴＡＣＴＴＴＧＴＡＡＴＡＴ入ＡＴ ＧＡＴＡＴＡＴＡＴｒＴＴＣＡＣ’ｒ’１ＴＡＴＣＴＣＡＧ−３’　）をｐＳＤ ５４４のＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ１部位にクローニングすることにより行なった。こ の操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ２と称する。

次いでｇｉｌｌ遺伝子の３′末端をｐＢＨＶ２にクローニングした。これは、ｇ ｌｌｌ遺伝子の３′末端をコードする、オリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１５　（配 列認識番号２オヨびＢＨＶＩ１６　（配列認識番号２５２）（５’　−ＧＴＡＣ ＣＣＴＡＧＧＧＣＧＣＧＧＡＧＣＣＧＡＧＧＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＧＡＧＴＡＡ ＧＡＣＣＧＧＧＴＩ’ＧＧＡＴＴＡＣＣＣＧＧＧＣ−：Ｉ　’　）をｐＢＨＶ２ の４．７００ｂｐ　ＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより 行なった。この操作により産生じたフラクションをｐＢＨＶ７と称する。

次いでｇｌＩＩ遺伝子の残りをｐＢＨＶ７にクローニン、グした。これは、ｇＩ ＩＩＩ伝子の内側部分を含有するｐｓａｖｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉの５００ｂｐ　部分的 Ｓｍａ　Ｉ−Ｘｈｏ　１断片をｐＢＨＶ７の４，７５０ｂｐの部分的ＳｍａＩ− Ｘｈｏｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じた プラスミドをｐＢＨＶｌｏと称する。

ｐＢＨＶｌｏを治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体 外組換え実験に用いてｖＰ１０７３を産生した。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖＰＩＱ７３が真正ＢＨＶＩ　ｇｉ ｌｌ糖タンパク質を発現するが否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめた か、１０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｔ、でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、またはｖ Ｐ１０７３に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２ ％の胎児ウシ血清および［３５Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有す る２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。１ｍｌ の３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０，３０ｍＭの１リス（ｐＨ７，４）　、３ｍ ＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳ Ｆ）および５０ｍ１のアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることに より、感染から７時間後に細胞を収穫した。

次いでＢＨＶｌ　ｇＩＩＩ特異的特異的−クローン性抗体１５０７、マジソン、 ライスコンシン大学、Ｄｒ、ジオ、フェリーリッチワースから得た）を用いて、 溶解産物をＢＨＶ’１ｇ１ｌＩ発現に関して分析した。これは以下の方法により 行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘すタンバク質Ａセファロース に結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロ ース結合うット抗ネズミ抗体をｇｉｌｌ特異的特異的−クローン性抗体０７に結 合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合うット抗 ネズミ抗体を４℃で一晩インキユベーションすることにより溶解産物を前浄化し た。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ｇＩＩＩ特異的特異的−クロ ーン性抗体ト抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４ ℃で一晩インキユベーションした。この試料をＩ×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２／ 尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２Ｘのラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプ トエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパ）質を免疫複合 体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリフアメゲルシステム上で分画 しくドリファスら、１９８４）　、固定し、蛍光光度法のためにＩＭのＮａ−サ リチル酸塩で処理した。

ＢＨＶＩ　ｇｌｌｌｌｌｌ特異的−クローン性抗体０７は、ｖＰ１０７３感染細 胞からのＢＨＶＩ　ｇＩＩＩ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染 細胞または−ＮＹＶＡＣ感染細胞からのＢＨＶＩ−特異的タンパク質は沈殿せし めなかった。

ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶＩ　ｇｌｌｌおよびｇＩｖ組換え体の産生 ＢＨＶＩ　ｇｌＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇＩＶをローンメリクス から得た。このプラスミドからのｇｌＶ遺伝子をワクシニアウィルスフランキン グアームの間にクローニングした。これは、ｇｌＶ遺伝子を含有するｐＢＨＶｇ ｌＶの２，０００ｂｐ　Ｐｓｔｌ−Ｘｈｏｌ断片をｐＳＤ５４２のＰｓｔｌ−Ｘ ｈｏ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプ ラスミドをｐＢＨＶｌと称する。

次いでπプロモーターの３′末端をｇｌＶ遺伝子の上流にクローニングした。こ れは、π踏めの３′末端およびｇＩＶ遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌク レオチドＢＨＶＬ７　（配列認識番号２３９）およびＢＨＶＬ８　（配列認識番 号２４０）をｐＢＨＶｌ（７）５，５００ｂｐ　部分的５ｓｔＩＩ−Ｘｈｏｌ断 片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミド をｐＢＨＶ３と称する。

次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、折り服ＢＨＶＬ５（配列ＡＩ、 ９番号２４１）　およびＢＨＶＬ６　（配列認識番号２４２）をｐＢＨＶ３の５ ，２００ｂｐ（７）部分的Ｓｍａｌ−ＰｓｔＩ断片にクローニングすることによ り、行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ４と称する。

次いで異種リンカ−配列を除去した。これは、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ　Ｐ ｓ　ｔ　Ｉ断片を連結することにより行なった。この操作により産生じたプラス ミドをｐＢＨＶ５と称する。

次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、π プロモーターの５′末端を含有するｐｐ　！４の１３０ｂｐ　Ａｆｌｌｌ−Ｘｈ ｏｌ断片をｐＢＨＶ５の５．２００ｂｐ　Ａｆ　ｌ　Ｉ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片に クローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐ ＢＨＶ６と称する。

次いでＢＨＶｌ　ｇｌＩＩ遺伝子をｐＢＨＶ６＋：り０−ニングした。これは、 Ｉ３Ｌプロモートしたｇｌｌｌ遺伝子を含有するｐＢＨＶｌｏ（７）１，６００ ｂｐ　Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＨＶ６の５，３００ｂｐ　部分的Ｂ ａｍＨＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作 により産生じたプラスミドをｐＢＨＶＩＩと称する。

ｐＢＨＶｌｌを治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体 外組換え実験に用いてＶＰ１０８３を産生した。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖＰ１０８３が真正ＢＨＶＩ　ｇｌ ｌｌおよびｇｌＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似 感染せしめたかミｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＮＹＶＡＣに感染せしめた か、またはｖＰ１０８Ｂに感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し 、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［３５３］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍ ｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るい した。１ｍｌの３×緩衝液ＡＣ３％のＮＰ−４０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７， ４）　、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０．　６ｍｇ ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍ１のアプロチニンを添加し、続いて細胞単層を かきとることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。

次いでＢＨＶｌ　ｇｉｌｌ特異的特異的−クローン性抗体１５０７びｇｌＶ特異 特異的コクローン性抗体３４０２１１マジソン、ライスコンシン大学、Ｄｒ、ジ オフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶＩｇＩＩＩおよ びｇＩＶＩ現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネ ズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１ｘ 緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合うット抗ネズ ミ抗体をｇｌｌＩ特異的特異的−クローン性抗体ｇＩＶ特異特異的ワクローン性 抗体合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合うッ ト抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキユベーションーすることにより溶解産物を前 浄化した。この物質を１×緩衝液λで５回洗浄した後に、ＢＨＶＩ　ｇｌｌｌま たはｇＩＶ特異特異的ワクローン性抗体ット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロー ス複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキユベーションした。この試料をＩ ×緩衝液で４回、Ｌｉｃ１２／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２Ｘのラエムリ 緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセ ロール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、 沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のド リファスゲルシステム上で分画しくドリファスら、１９８４）　、固定し、蛍光 光度法のためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。

ＢＨＶＩ　ｇＩＩＩおよびｇｌＶ特異特異的単一ローン性抗体５０７および３４ ０２は、ｖＰ１０８３感染細胞からのＢＨＶＩ　ｇＩＩＩおよびｇＩＶ糖タンパ ク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からの ＢＨＶＩ特異的特異的タンパ性質せしめなかった。

ＮｙＶＡＣ／ＢＨＶ１　ｇＩおよびｇＩＩＩ組換え体の産生 ＢＨＶＩ　ｇＩＩＩＩ伝子を含有するプラスミドｐＢＨＶｇｌｌｌをローンメリ クスから得た。このプラスミドからのｇＩＩＩＩ伝子を、ワクシニアウィルスフ ランキング−アームの間にクローニングした。これは、ｇＩＩＩＩ伝子の５′末 端を含有するｐＢＨＶｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ（７）１．ｏｏｏｂｐＮｃ　ｏ　Ｉ−Ｘｈ ｏ　Ｉ断片、およびＩ３ＬプロモーターをコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶ ＬＩ　（配列認識番号２４９）　とＢＨＶＩ２　（配列認識番号２５０）ｔ−ｐ ＳＤ５４４ＶＣのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏ１部位にクローニングすることにより行な った。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ２と称する。

次いでｇｌｌｌ遺伝子の３′末端をｐＢＨＶ２にクローニングした。これは、ｇ ｉｌｌ遺伝子の３′末端をコードするオリゴヌクレオチドＢＨＶＬ１５　（配列 認識番号２５１）およびＢＨＶｌ１６　（配列認識番号２５２）をｐＢＨｖ２の ４，７００ｂｐ　ＸｈｏＩ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行 なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ７と称する。

次いてｇｉｌｌ遺伝子の残りをｐＢＨＶ７にクローニングした。これは、ｇｉｌ ｌ遺伝子の内側部分を含有するｐＢＨＶｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉの５００ｂｐ　部分的Ｓ ｍａＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＢＨＶ７の４，７５０ｂｐ部分的Ｓｍａ　Ｉ　−Ｘｈ ｏＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラ スミドをｐＢＨＶｌｏと称する。

次いでＢＨｖｌ　ｇ■遺伝子をｐＢＨＶ１０＋、：り０−キングした。これは、 Ｈ６ブロモートしたｇｌ遺伝子を含有するｐＢＨＶｇの２，９００ｂｐ　Ｂｇｌ ＩＩ断片をｐＢ−ＨＶＩＯのＢａｍＨ１部位にクローニングすることにより行な ゛った。この操作により産生じたプラスミドをｐ　ＢＨＶｌ２と称する。

ｐＢＨＶ１２を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体 外組換え実験に用いてｖＰ１０８７を産生した。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖＰ１０８７が真正ＢＨＶＩ　ｇｌ およびｇｌＩＩ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感 染せしめたか、ｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＮＹＶＡＣに感染せしめたか 、またはｖＰ１０８７に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、 細胞に、２％の胎児ウシ血清および［３５］　−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいし た。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４ ）　、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍ ｌのＰＭＳＦ）および５０ｍ１のアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかき とることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。

次いでＢＨＶＩ　ｇｌｌ特異的ツクローン性抗体５１０６およびＢＨＶＩ　ｇＩ ＩＩ特異的特異的−クローン性抗体１５０７、マジソン、ライスコンシン大学、 Ｄｒ、　ジオフ工り・−リッチワースから得た）を用いて、溶解産物をＢＨ−Ｖ ｌｇＩおよびｇＩＩＩＩ現に関して分析した。これは以下め方法により行なった 。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘すタンバク質Ａセファロースに結合せ しめた。

Ｉ×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合うット抗 ネズミ抗体をｇＩ特特異的ツクローン性抗体よびｇｌＩＩ特異的特異的−クロー ン性抗体せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合う ット抗ネズミ抗体を４℃で−晩インキュベーションすることにより溶解産物を前 浄化した。この物質をＩ×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、ＢＨＶＩ　ｇｌまたは ｇｌＩＩ特異的特異的−クローン性抗体ト抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース 複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキユベーションした。この試料を１× 緩衝液で４回、Ｌｉｃ１２／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩 衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロ ール、１０％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈 殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリ フアメゲルシステム上で分画しくドリファスら、１９８４）　、固定し、蛍光光 度法のためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。

ＢＨＶＩ　ｇｌおよびｇｌｌｌｌｌｌ特異的−クローン性抗体０６および１５０ ７は、ｖＰ１０８７感染細胞からＢＨＶＩ　ｇｌおよびｇｌｌＩ糖タンパク質を 特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞からＢＨＶＩ 特異的特異的タンパ性質せしめなかった。

ＮＹＶＡＣ／ＢＨＶＩ　ｇＩＳｇｌｌｌおよびｇｌＶ組換え体の産生 ＢＨＶｌ　ｇｌＶ遺伝子を含有するプラスミド、ｐＢＨＶｇＩＶをローンメリク スから得た。このプラスミドからのｇｌＶ遺伝子をワクシニアウィルスフランキ ングアームの間にクローニングした。このは、ｇＩｖ遺伝子を含有する２、００ ｂｐ　Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱのＰｓｔｌ−Ｘｈ ｏ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプ ラスミドをｐＢＨＶｌと称する。

次いでπプロモーターの３′末端をｇＩＶ遺伝子の上流にクローニングした。こ れは、πプロモーターの３′末端およびｇｌＶ遺伝子の５′末端をコードするオ リゴヌクレオチド、ＢＨＶｌ７およびＢＨＶＩ８を、ｐＢＨＶｌ（７）５゜５ｏ ｏｂｐ　部分的５ｓｔｌ−Ｘｈｏｌ断片にクローニングすることにより行なった 。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＨＶ３と称する。

次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、ＢＨＶｌ ５　（配列認識番号２４１）およびＢＨＶＩ６　（配列認識番号２４２）をｐＢ ＨＶ３（７）５，２００ｂｐの部分的ＳｍａＩ−ＰｓｔＩ断片にクローニングす ることにより行なった。この操作により産生じたプラス−ミドをｐＢＨＶ４と称 する。

次（１で異種リンカ−配列を除去した。これは、ｐＢＨＶ４の５，２００ｂｐ　 ＰｓｔＩ断片を連結することにより行なった。この操作により産生じたプラスミ ドをｐＢＨＶ５と称する。

次いでπプロモーターの５′末端をｐＢＨＶ５にクローニングした。これは、π プロモーターの５′末端を含有するｐｐ　１４の１３０ｂｐ　Ａｆｌｌｌ−Ｘｈ ｏｌ断片をｐＢＨＶ５の５，２００ｂｐ　Ａｆｌｌｌ−ＸｈｏＩ断片にクローニ ングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶ６ と称する。

次いでＢＨＶｌ　ｇｉｌｌ遺伝子をｐＢＨＶ６にクローニングした。これは、１ ３ＬプロモートしたｇＩＩＩ遺伝子を含有するｐＢＨＶｌｏの１，６００ｂｐ　 Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＨＶ６の５．３００ｂｐ　部分的ＢａｍＨ Ｉ−Ａｓｐ７１８断片にクローニングすることにより行なった。この操作により 産生じたプラスミドをｐＢＨｖｌｌと称する。

次いでＢＨＶＩ　ｇｌ遺伝子をｐＢＨＶｌｌにクローニングした。これは、Ｈ６ ブロモートしたｇｌ遺伝子を含有するｐＢＨＶ８の２，９００ｂｐ　ＢｇｌＩＩ 断片をｐＢＨＶｌｌのＢｇ１１１部位にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＢＨＶｌ３と称する。

−ｐＢＨＶｌ３を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡｅ）とともに生 体外組換え実験に用いてｖＰ１０７９を産生した。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖＰ１０７９が真正ＢＨＶＩ　ｇｌ 、ｇｌｌｌおよびｇｌＶ糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を 、疑似感染せしめたか、ｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＮＹＶＡＣに感染せ しめたか、またはｖＰ１０７９に感染せしめた。

１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［３ ５Ｓ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグルス培 地（メチオニンを含まない）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ −４０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％の Ｎａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）および５０ｍ１のアプロ チニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細 胞を収穫した。

次いでＢＨＶＩ　ｇｌｌ特異的ツクローン性抗体５１０６ＢＨＶＩ　ｇｌｌｌｌ ｌｌ特異的−クローン性抗体１５０７びｇｌＶ特異特異的ワクローン性抗体４０ ２（Ｗｌ、マジソン、ライスコンシン大学、Ｄｒ、ジオフェリーリッチワースか ら得た）を用いて、溶解産物をＢＨＶＩ　ｇｌ、ｇＩＩＩおよびｇＩＶ発現に関 して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で ４時−間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝ＭＡで物質 を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合うット抗ネズミ抗体をｇｌ、 ｇＩＩＩおよびｇｌＶ特異特異的ワクローン性抗体合せしめた。一方で、通常ネ ズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合うット抗ネズミ抗体を４℃で一晩イン キユベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａ で５回洗浄した後に、ＢＨＶＩ　ｇｌＳｇＩＩｌ、及びｇｌＶ特異的単クローン 性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、 ４℃で一晩インキユベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣｌ２ ／尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス （ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカ プトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複 合体から分離した。次いでタンパク質を１０％のドリフアメゲルシステム上で分 画しくドリファスら、１９８４）、固定で、蛍光光度法のためにＩＭのＮａ−サ リチル酸塩で処理した。

ＢＨＶＩ　ｇＩＳｇｌ　Ｉ　ＩおよびｇｌＶ特異特異的ワクローン性抗体１０６ ．１５０７および３４０２は、ｖＰ１０７９に感染した細胞から、ＢＨＶＩ　ｇ ｌＳｇＩＩｌよびｇＩＶ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞 またはＭＹＶＡＣ感染差異簿からはＢＨＶＩ特異的タンパク質を沈殿せしめなか った。

実施例３ｌ−ＮＹＶＡＣ中のウシウィルス性下痢性ウィルス（ＢＶＤＶ）の発現 ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ　ｇＥ１／ｇＥ２組換え体の産生ＢＶＤＶ　ｇＥｌ　（ｇ ｐ４Ｂ／ｇｐ２５）ｒ遺伝子」（オスロス菌株）をｐＩＢＩ２５にクローニング した。これは、ｐＳＰ６５−ｇＥｌの１，３７０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ 断片（ベルギー、リーグ、ユーロジエネティックから得た；レナードら、欧州特 許第８８８７００９５号）をＥｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断 片）でプラントエンドし、その末端にＸｈｏｌリンカ−を連結し、産生じたプラ スミドをｐｌＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じた　′プラスミドをｐＢＤＶｌと称する。

次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＥｌ　ｒ遺伝子」の「開始コドン」に 配列した。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ１ｒ遺伝子」の５′ 末端をコードする、１リゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ４　（配列認識番号２５（５ ’　−ＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧ ＧＣＡＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＴ−３’）オヨびＢＤＶＭ５　（配 列認識番号２５４）（５’　−ＧＧＧＣＴ′Ｉ’ｒＣＴＣＴＡＧＴｒＴＧＣＣＣ ＡＴｒＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＡ−３’　）を、ｐＢ Ｄｖｌの４．２５０ｂｐ　ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｈ−ｇｌｌ（部分的）断片にクロ ーニングすることにより行なったｇこの操作により産生じたプラスミドをｐＢＤ Ｖ６と称する。

次いでｇＥ１ｒ遺伝子」を、Ｈ６＋ＡＴＩ　＋ＨＡ三重プロモーター（ポーチテ レら、ワクチン（１９９１）　９　：　１９４　）の下流およびＨＡフランキン グアームの間にクローニングした。これは、ｇＥｌ　ｒ遺伝子」を含有するｐＢ ＤＶ６の１．３８０ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｐｓｔｌ　（部分的）断片を、ｐＡＴＩ ２５の３，７００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片にクローニングすること により行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ７と称する。

次いで、将来の操作に必要なりａｍＨ１部位をＢＶＤＶ配列の下流に産生じた。

これは、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ６　（配列認識番号２５５） （５’　−ＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’　）を、ｐＢＤＶ７のＸｈｏＩ部位にク ローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢ ＤＶｌと称する。

次いでｇ　Ｅ　２　（ｇ　ｐ　５３）配列（オスロス菌株）の約８３０ｂｐをｇ Ｅ１配列の下流にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２ の９８０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リーグ、ユーロジエネ ティックから得た；レナードら、欧州特許第８６８７００９５号）を、ｐＢＤＶ ８の５，１００ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ（部分的）断片にクローニン グすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ９と称する。

次いでＨ６ブロモートしたｇＥ１／ｇＥ２配列をＡＴＩフランキングアームの間 にクローニングした。これは、ｇＥｌ／ｇＥ２配列を含有する、ｐＢＤＶ９の２ ，２００ｂｐ　Ｎｒｕｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＧＩ７の４，９００ｂｐ　Ｎｒ ｕｌ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。これにより、ｇ Ｅ１／ｇＥ２配列がＨ６プロモーターの転写制御下に置かれ、挿入ベクターに配 される。この操作により産生したプラスミドをｐＢＤＶ２３と称する。

次いで約２７０ｂｐの追加のｇＥ２配列（オスロス菌株）を存在するＢＶＤＶ配 列の下流にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐｓＰ６５Ｅ１ ＋Ｅ２−１の１．２６０ｂｐ　Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（ベルギー、リ ーグ、ユーロジエネティックから得た；レナードら、欧州特許第８８８７００９ ５号）を、ｐＶＤＶ２３の６．１００ｂｐ断片にクローニングすることにより行 なわれた。この操作により産生されたプラスミドをｐＢＤＶ２４と称する。

ｐＢＤＶ２４を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体 外組換え実験に用いて、ｖＰ９７２を産生じた。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖＰ９７２が真正ＢＶＤＶ　ｇＥｌ およびｇＥ２糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染 せしめたか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、でＮＹＶＡＣに感染せしめたか、 またはｖＰ９７２に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞 に、２％の胎児ウシ血清および［”Ｓ］−メチオニン（２０μｃｉ／ｍｌ）を含 有する２ｍｌの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。１ ｍｌの３×緩衝液ＡＣ３％のＮＰ−４０，３ＱｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　、 ３ｍＭのＥＤＴＡ、０゜０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰ ＭＳＦ）および５０ｍ１のアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとるこ とにより、感染から１８時間後に細胞を収穫した。

次いでＢＶＤＶ　ｇｐ４８特異的特異的−クローン性抗体Ｃ１６およびＮＹ１２ Ｂ１、およびＢＶＤＶ　ｇｐ５３特異的特異的−クローン性抗体９Ｄ３　（フラ ンス、リヨン、ローンメリクスから得た）を用いて、溶解産物をＢＶＤＶｇＥｌ およびｇＥ２発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット 抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。

１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合うット抗 ネズミ抗体をｇＥ１特異特異的ワクローン性抗体ＹＣ１６およびＮＹ１２Ｂ１、 およびｇＥ２特異特異的コクローン性抗体０９Ｄ３に結合せしめた。一方で、通 常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合うット抗ネズミ抗体を４℃で一晩 インキユベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝 液Ａで５回洗浄した後に、ＢＶＤＶ　ｇＥｌまたはｇＥ２特異特異的コクローン 性抗体ット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃ で一晩インキユベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、ＬｉＣ１，／尿 素緩衝液で２回洗浄した後に、２Ｘのラエムリ緩衝液（１２５ｍＭのトリス（ｐ Ｈ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカプト エタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体 から分離した。次いでタンパク質を１０２６のドリフアメゲルシステム上で分画 しくドリファスら、１９８４）　、固定し、蛍光光度法のためにＩＭのＮａ−サ リチル酸塩で処理した。

ＢＶＤＶ　ｇＥｌまたはｇＥ２特異特異的コクローン性抗体ｖＰ９７２感染細胞 からＢＶＤＶ特異的糖タンパク質を沈殿せしめたが、ＮＹＶＡＣ感染細胞または 疑似感染細胞かりはＢＶＤＶ特異的特異的タンパ性質せしめなかった。

ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ　カプシド／ｇＥ１／ｇＥ２組換え体の産生 ＢＶＤＶｇＥ１ｒ遺伝子」をｐｌＢＩ２５にクローニングした。これは、ｇＥｌ 　ｒ遺伝子」を含有する、ｐＳＰ６５−ｇＥｌの１．３７０ｂｐ　ＥｃｏＲＩ− ＢａｍＨＩ断片をＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ断片）でプ ラントエンドし、その末端にＸｈｏＩリンカ−を連結し、産生じたプラスミドを ｐＩＢＩ２５のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作 により産生じたプラスミドをｐＢＤＶｌと称する。

次いでｇＥｌ　ｒ遺伝子」をＵフランキングアームの間にクローニングした。こ れは、ｇＥ１配列を含有する、ｐＢＤＶｌの１，４００ｂｐ　Ｘｈｏｌ断片をｐ ＳＤ４８６のＸｈｏ１部位にクローニングすることにより行なった。この操作に より産生されたプラスミドをｐＢＤＶｌｌと称する。

次いでｇＥｌ　ｒ遺伝子」の「開始コドン」をＵプロモーターの開始コドンに配 列した。これは、Ｕプロモーターの３′末端およびｇＥ１配列の５′末端をコー ドする、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ７　（配列認識番号２５６）（５’　− ＣＧＡＴｒＡＣＴＡＴＧＧＧＣＡＡＡＣｌｒＡＧＡＧＡＡＡＧＣＣＣＴＧＴ−３ ’　）およびＢＤＶＭ８　（配列認識番号２５７）（５１−ＧＧＧＣＴＴＴＣＴ ＣＴＡＧＴＴＴＧＣＣＣＡＴＡＧＴＡＡＴ−３１）を、７ＢＤＶ１１の４，８０ ０ｂｐ　部分的Ｂｇｌｌ−Ｃ１ａｌ断片にクローニングすることにより行なった 。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶｌ２と称する。

次いでＢｖＤｖ　ｇＥ２「遺伝子」の一部をｇＥ１配列から下流のｐＢＤＶｌ２ にクローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の１，０００ｂ ｐ　ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶｌ２の４，６５０ｂｐり行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶｌ４と称する。

次いでｇＥ２　ｒ遺伝子」の残りをｐＢＤＶｌ４にクローニングした。これは、 ｇＥ２　ｒ遺伝子」を含有する、ｐＳＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１の１，２６０ｂｐ　 Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶｌ４の４．６５０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−Ｂ ａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なつた。この操作により産生じた プラスミドをｐＢＤＶｌ７と称する。

次いでカプシド「遺伝子」　（オスロス菌株）をｇＥ１配列の上流のｐＢＤＶｌ ７にクローニングした。これは２工程で行なった。最初の工程では、Ｕプロモー ターの開始コドンをカプシド「遺伝子」の「開始コドン」と配列せしめた。これ は、Ｕプロモーターの３′末端およびカプシド配列の５′末端をコードする、オ リゴヌクレオチド、ＶＤＶＬ１２（配列認識番号２５８） オヨびＢＤＶＬ１３　（配列認識番号２５９）を、ｐＢＤＶｌ７の５．２００ｂ ｐ　Ｃ１ａｌ−Ｘｂａｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作 により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ２５と称する。第２の工程で、カプシド「 遺伝子」の残りをｐＢＤＶ２５にクローニングした。これは、カプシド「遺伝子 」を含有する、ｐＳＰ６５Ｃ−Ｅｌ−Ｅ２の１．８７０ｂｐ　ＢｓｔＥｌｌ−Ｂ ｇｌｌｌ断片（ベルギー、リーグ、ユーロジエネティックから得た；レナードら 、欧州特許第８８８７００９５号）を、ｐＢＤＶ２５の４，７００ｂｐ　Ｂｓｔ ＥＩＩ−Ｂｇｌｌ■断片にクローニングすることにより行なった。この操作によ り産生じたプラスミドをｐＢＤＶ２６と称する。

次いでロブロモートしたカプシド／ｇＥ１／ｇＥ２配列をｔｋフランキングアー ムの間にクローニングした。これは、Ｕプロモートしたカプシド／ｇＥ１／ｇＥ ２配列を含有する、ｐＢＤＶ２５の３．２００ｂｐ　ＳｎａＢＩ−ＢａｍＨＩ断 片を、ｐＳＤ５４２の４，０ＯＯｂｐ　ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニン グすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ２７ と称する。

ｐ　ｆｆＤＶ　２７を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）ととも に生体外組換え実験に用いてＶＰ１０１７を産生した。ｖＰ９７２の発現に関し て、ｖＰ１０１７感染細胞のイムノブレシピテーション実験を上述したように行 なった。疑似感染ベロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＢＶＤＶ特異的 タンパク質は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０１７の溶解産物からは、 ＢｖＤｖ特異的タンパク質が沈殿した。

ＮＹＶＡＣ／ＢＶＤＶ　ｇＥ２ｍ換、を体の産生ＢＶＤＶ　ｇＥｌ　ｒ遺伝子」 をｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　２５＋、：クローニングした。これは、ｇＥｌ　ｒ遺伝子」 を含有するｐｓＰ６５−ｇＥｌの１，３７０ｂｐ　ＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩ断片 をＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼ！　（フレノウ断片）でプラントエンドし 、その末端にＸｈｏｌリンカ−を連結し、産生じたプラスミドをｐｌＢＩ２５の ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じた プラスミドをｐＢＤＶｌと称する。

次いでＨ６プロモーターの開始コドンをｇＥｌ　ｒ遺伝子」の推定「開始コドン 」と配列せしめた。これは、Ｈ６プロモーターの３′末端およびｇＥ１ｒ遺伝子 」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＭ４　（配列認識番号 ２５３）およびＢＤＶＭ５　（配列認識番号２５４）を、ｐＢＤＶｌの４，２５ ０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＢｇｌＩ（部分的）断片にクローニングすることによ り行なった。

この１作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ６と称する。

次いでｇＥｌ　ｒ遺伝子」をＨ６＋ＡＴＩ＋ＨＡ三重プロモーターの下流とＨＡ フランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇＥｌ　ｒ遺伝子」を含 有する、ｐＢＤＶ６の１．３８０ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩ　（部分的）断片 を、ｐＡＴＩ２５の３，７００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｐｓｔｌ断片にクローニング することにより行なった。この−操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ７と 称する。

次０で、将来の操作に必要なりａｍＨＩ部位をＢＶＤＶ配列の下流に産生じた。

これは、オリゴヌクレオチドＢＤＶＭ６　（配列認識番号２５５）をｐＢＤＶ７ のＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じ たプラスミドをｐＢＤＶ８と称する。

次い’？’ＢＶＤＶ　ｇＥ２配列の約８３０ｂｐをｇＥｌ「遺伝子」の下流にク ローニングした。これは、ｇＥ２配列を含有する、ｐ７Ｆ２の９８０ｂｐ　Ｂｇ ｌｌｌ−Ｂ、ｉ−ｍＨＩ断片をｐＢＤＶ８の５，１００ｂｐ　ＢａｍＨＩ−Ｂｇ ｌｌＩ（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により 産生じたプラスミドをｐ　ＢＤＶ９と称する。

次いでｇＥ１／ｇＥ２配列をＡＴＩフランキングアームの間にクローニングした 。これは、Ｈ６ブロモートしたｇＥｌ／ｇＥ２　ｒ遺伝子」を含有するｐＢＤＶ ９の２，２００ｂｐ　Ｎｒｕｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＰＧＩ７の４，９ｏｏｆｐ 　Ｎｒｕｌ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作 により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ２３と称する。

次いで、約２７０Ｍの追加のｇＥ２配列を存在するＢＶＤＶ配列の下流にクロー ニングした。これは、追加のｇＥ２配列を含有する、ｐｓＰ６５Ｅ１＋Ｅ２−１ の１，２６０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＤＶ２３の、６．１００ ｂｐ　ＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ　Ｃ部分的）断片にり６−ニングすることにより 行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＢＤＶ２４と称する。

次いでｇＥ１配列をＢＤＶ２４から欠損せしめた。これは、Ｈ６プロモーターの ３′末端およびｇＥ２　ｒ遺伝子」の５′末端を含有する、１３０ｂｐ　Ｎｒｕ Ｉ−ＰｓｔＩＰＣＲ断片をｐＢＤＶ２４の５，９００ｂｐ　ＮｒｕＩ−Ｐｓｔｌ 断片にクローニングすることにより行なった。

このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＢＤＶＰ１４（配列認識番号２６０） （５’　−ＴｒＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴｒＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡ ＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＡＡＡＣＣＣ−３’　）オヨびＢＤＶＰ１５　（ 配列認識番号２６１）（ｓ　’　−ＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＣＣＡＣＡＣ Ｔ−３’　）によりプラスミド、ｐＢＤＶｌ７から産生した。この操作により産 生されたプラスミドをｐＢＤＶ２８と称する。

配列分析により、Ｉ）ＢＤＶ２８中のＨ６プロモーターは２ｂｐ挿入物を含有す ることが分かった。この誤りを直すために、Ｈ６プロモーターの３′末端および ｇＥ２　ｒ遺伝子」の５′末端を含有スル、ｐＢＤＶ２８の１３０ＭＮｒｕｌ− ＰｓｔＩ断片をｐＢＤＶ２４の５，９００ｂｐＮｒｕＩ−Ｐｓｔｌ断片にクロー ニングした。この操作向より産生じたプラスミドをｐＢＤＶ２９と称する。

ｐＢＤＶ２９を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体 外組換え実験に用いてｖＰ１０９７を産生した。

上述したようにｖＰ１０９７感染細胞に関するイムノプレシピテーションを行な って、細胞または溶解産物からＢＶＤＶタンパク質を産生じた。

実施例３２−ポックスウィルスベクター中のヒトサイトメガロウィルス（ＨＣＭ Ｖ）糖タンパク質抗原のクローニングおよび発現 ＨＣＭＶ　ｇＢ遺伝子のＮＹＶＡＣ供与体プラスミド。

ｐＳＤ５４２へのクローニング Ｈ，ＣＭＶ　ＤＮＡのＨｉｎｄＤプラスミド４．８００ｂｐ　Ｈｉｎｄ−Ｂａｍ ＨＩ断片をプラスミドｐｌＢＩ２４の２８００ｂｐ　ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片にクローニングした。オリゴヌクレオチドＣＭＶＭ５　（配列認識番号２ ６２　）　（５’−ＧＣＣＴＣＡＴＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴＣＣＧＴｒＡＡ Ｇ’！’！’ｒＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧ−３’） オヨびＣＭＶＭ３　（配列認識番号２６３）を用いた生体外突然変異誘発（クン ケル、１９８５　、ラッセルら、１９８Ｂ）により、ワクシニアＨ６プロモータ ーの制御下でｇＢ遺伝子を変更して発現せしめた（ティラーら、１９８８ａ、ｂ ；パーカスら、１９８９）。変更ｇＢを含有するブラスミドヲ２４　ＣＭ　Ｖ　 ｇ　Ｂ　（５＋　３　）と称した。

２４ＣＭＶｇＢ　（５＋３）　の２９００ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｂ−ａｍＨＩ断片 をｐｓＰ１３１の３１００ｂｐ　Ｅｃ。

ＲＶ−Ｂｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ断片にクローニングした。このクローニング工程により 、ｇＢ遺伝子がＨ６プロモーターの制御下におかれた。産生じたプラスミドをｓ Ｐ１３１ｇＢと称した。

ＳＰ１３１ｇＢ中のＨ６ブロモートしたｇＢを側腹に有する制限部位を変更する ために、以下の工程を行なった。

プラスミドｐ　Ｍ　Ｐ　２２　Ｂ　ＨＰは、ＢａｍＨ１部位でのポリリンカー領 域にＨＢＶ　ｓＡｇの部分を含有するワクシニアのＨｉｎｄｌｌｌ　Ｆ断片（Ｗ Ｒ菌株）のサブクローンを含有する。ｐＭＰ２２８ＨＰをポリリンカー内でＨｉ ｎｄＩＩＩに、Ｉｋり切断し、ＳＰ１３１ＣＭＶｇＢからノＨ１ｎｄｌｌｌ断片 （Ｈ６ブロモートしたｇＢ遺伝子を含有する）に連結し、プラスミドＳＡｇ２２ ＣＭＶｇＢを産生した。ＳＡｇ２２ＣＭＶｇＢをＢａｍＨＩで切断し、部分的に ＨｉｎｄｌｌＩで切断し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉの切砿によりｐｌＢ Ｉ２４から誘導したポリリンカーに連結し、Ｈ６ブロモートしたｇＢ遺伝子を含 有するがＨＢＶｓＡｇを有さないプラスミド２２ＣＭＶｇＢを産生した。

実施例７に記載したようにベクタープラスミドｐＳＤ５１３を形成することによ り、プラスミドｐｓＤ４６０からプラスミドｐＳＤ５４２　（ＮＹＶＡＣＴＫ座 供与体プラスミド）を誘導した（タータグリアら、１９９２）。ｐＳＤ５１３の ポリリンカー領域を、Ｐｓｔｌ／ＢａｍＨＩで切断し、アニールした合成オリゴ ヌクレオチドＭＰＳＹＮ２８８（配列認識番号２６４） （５’　ＧＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＴ　）’）およびＭＰＳＹＮ２８９　（配 列認識番号２６５）（５’　ＧＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡ　 ］’）に連結することにより変更し、プラスミドｐＳＤ５４２を産生じた。

２２ＣＭＶｇ１３を、ＢａｍＨＩとＮ５ｉＩで切断してＨ６プロモーターおよび ｇＢ遺伝子の一部を含有する断片を産生し、Ｎ５ｉＩとＰｓｔｌで切断してｇＢ 遺伝子の残りを含有する断片を産生じた。これら２つの断片を、ポリリンカー内 のＢａｍＨＩとＰｓｔｌで切断したｐＳＤ５４２と連結し、ＮＹＶＡＣ供与体プ ラスミド５４２ＣＭＶｇＢを産生した。

ＨＣＭＶ　ｇＢサイズのＡＬＶＡＣ洪与体プラスミドＣＰ３ＬＶＱＨ６へのクロ ーニング ８．５ｋｂのカナリヤボックスＢｇｌＩＩ断片をｐＢＳ−３Ｋプラスミドベクタ ーのＢａｍＨＩ部位にクローニングしてｐＷＷ５を形成した。ヌクレオチド配列 分析により、Ｃ３と称する読取り枠が示された。異種遺伝子を、Ｃ３読取り枠を 完全切除した０３座に挿入するための供与体プラスミドを構成するために、ＰＣ Ｒプライマーを用いてＣ３に関連した５′および３′配列を増幅した。５′配列 のブーライマーは、ＲＧ２７７　（配列認識番号１７７）およびＲＧ２′７８（ 配列認識番号１７８）であった。

３′配列のプライマーは、ＲＧ２７９　（配列認識番号１７９）およびＲＧ２８ ０　（配列認識番号１８０）であった。

ワクシニア転写および翻訳終止信号を側腹に有する多重クローニング部位を含有 するようにプライマーを設計した。

また、左側アームおよび右側アームの５′末端および３′末端に、２つのアーム をＡＳｐ７１８／５ａｃＩ切断したｐＢＳ−ＳＫプラスミドベクターに連結させ る適切な制限部位（左側アームにはＡｓｐ７１８とＥｃｏＲＩ、右側アームには ＥｃｏＲＩと５ａｃｌ）を含んだ。産生じたプラスミドをｐｃ３１と称した。

プラスミドｐＷＷ５のＮ５ｉｌと５ｓｐｌの切断により０３座から直接上流のカ ナリヤボックスの９０８ｂｐの断片を得た。テンプレートとしてのプラスミドｐ ＷＷ５およびオリゴヌクレオチドＣＰ１６（配列認識番号２６６）とＣＰ１７　 （配列認識番号２６７） （５’　−ＴＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＧ　ＧＡＴＡＣＣＴＡＣＣＴＡＣｒＡＣＣＴ ＡＣＧ−３１）を用いたＰＣＲ（エンゲルケら、１９１１８）によりカナリヤボ ックスとＤＮＡの６０４ｂｐ断片を得た。６０４ｂｐの断片をＡｓｐ７１８とＸ ｈｏｌ（それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ１６とＣＰ１７の５′末端に存在する 部位）で切断し、Ａｓｐ７１８−Ｘｈｏｌで切断しアルカリ性ホスファターゼ処 理したＩ　Ｂ　Ｉ　２５　（ＣＴ、ニューハブン、インターナショナルバイオテ クノロジー社）にクローニングしてプラスミド５ＰＣ３ＬＡを産生じた。５ＰＣ ３ＬＡを、１ＢＩ２５内のＥｃｏＲＶとカナリヤボックスＤＮＡ内のＮ５ｉ１で 切断し、９０８ｂｐのＮ５ｉｌ−５ｓｐｌ断片に連結し、０３座の上流の１４４ ４ｂｐのカナリヤボックスＤＮＡを含有する５ＰＣＰＬＡＸを産生した。

カナリヤボックスＤＮＡの２１７８ｂｐ　ＢｇｌｌＩ−ｓｔｙｔ断片をプラスミ ドｐＸＸ４　（ｐＢＳ−８ＫのＰｓｔ１部位にクローニングされたカナリヤボッ クスＤＮＡの６．５ｋｂ　Ｎ５ｉｌ断片を含有する）がら単離した。テンプレー トとしてのプラスミドｐＸＸ４およびオリゴヌクレオチドＣＰ１９　（配列認識 番号２６８）（５１−ＴＣＧＣ！’ＣＧＡＧＣＴｒＴＣＴ’ｒＧＡＣＡＡＴＡＡ ＣＡＴＡＧ−３１）とＣ″ｐｆ２０（配列認識番号２６９）（５’　−ＴＡＧＧ ＡＧＣＴＣＴｒＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＧＧＴＴＡＣＡＡＣ−３’　）を用いたＰ ＣＲ（エンゲルケら、１９８Ｂ）によりカナリヤボックスＤＮＡの２７９ｂｐ断 片を単離した。２７９ｂｐ断片をＸｈｏｌと５ａｃｌ　（それぞれオリゴヌクレ オチドＣＰ１９とＣＰ２Ｏの５′末端に存在する部位）で切断し１．５ａｃｌ− Ｘｈｏｌで切断しアルカリ性ホスファターゼ処理したＩＢＩ２５にクローニング して、プラスミド５ＰＣ３ＲＡを産生じた。

ポリリンカーに追加の特有の部位を加えるために、ｐＣ３■をポリリンカー領域 内のＥｃｏＲＩとＣ１ａｌで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナ ーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ１２　（配列認識番号２７２）と ＣＰ１３　（配列認識番号２７３）（ＥｃｏＲＩ粘着末端、Ｘｈｏ１部位、Ｂａ ｍＨ１部位およびＣ１ａＩに一致する粘着末端を含有する）に連結し、プラスミ ド５ＰＣＰ３Ｓを産生じた。

５ＰＣＰＢＳを、０３座の下流のカナリヤボックス配列内の５ｔｙｌと５ａｃｌ 　（ｐＢＳ−５Ｋ）で切断し、５ＰＣ３ＲＡからの２６１ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−３ ａｃＩ断片とｐＸＸ４からの２１７８ｂｐ　ＢｇｌｌＩ−Ｓｔｙｌ断片に連結し 、０３座の下流の２５７２ｂｐのカナリヤボックスＤＮＡを含有するプラスミド ＣＰＲＡＬを産生じた。５ＰＣＰ３Ｓを、Ｃ３座の上流のカナリヤボックス配列 内のＡｓｐ７１８　（ｐＢＳ−５Ｋ内）とＡｃｃｌで切断し、５ｐＣＰＬＡＸか らの１４３６ｂｐ　Ａｓｐ７１８−Ａｃｃｌ−断片に連結し、０３座の下流の１ ４５７ｂｐのカナリヤボックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰＬＡＬを産生じ た。

ＣＰＬＡＬを、０３座の下流のカナリヤボックス配列内の５ｔｙｔと５ａｃＩ　 （ｐＢＳ−ＳＫ内）で切断し、ＣＰＲＡＬからの２４３８ｂｐ　５ｔｙｌ−Ｓａ ｃＩ断片に連結し、Ｃ３座の上流の１４５７ｂｐのカナリヤボックスＤＮＡ、６ つの読取り枠の終止コドン、初期転写終止信号、ポリリンカー領域、初期転写趣 旨信号、６つの読取り枠の終止コドン、および０３座の下流の２５７２ｂｐのカ ナリヤボックスＤＮＡを含有するプラスミドＣＰ３Ｌを産生じた。

産生じたプラスミドを５ＰＣＰ３Ｌと称した。

テンプレートとしてのｐ　ＲＷ８３８およびオリゴヌクレオチドＣＰ２１　（配 列認識番号２７０）（５１−ＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＩ’ＡＡＴＴＡＡＴＴ ＡＧＴＴＡＴＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＧ−３’）とＣＰ２２　（配列認識番号２７ １） （５’　ＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧ ＣＧＧＡＴＡＴＣＧ−３’　）を用心たＰＣＲ（エンゲルケら、１９８ｇ）によ り、初期／晩期Ｈ６ワクシニアウィルスプロモーター（グオら、１９８９；バー カスら、１９８９）を誘導した。ＰＣＲ産生物を、Ｂａｍ１（１とＥｃｏＲＩ　 （それぞれオリゴヌクレオチドＣＰ２１とＣＰ２２の５′末端に存在する部位） で切断し、ポリリンカー内のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで切断されたＣＰ３Ｌに連 結し、プラスミドＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを産生した。ＡＬ−ＶＡＣ供与体プラスミド ＶＱＨ６ＣＰ３Ｌを、ポリリンカー内めＸｈｏｌとＨ６プロモーター内のＮｒｕ ｌで切断し、Ｈ６プロモーターとｇＢ遺伝子を含有する２２ＣＭｇＢからのＮｒ ｕｌ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片並びにＸｈｏｌとＨｉｎｄｌｌｌの切断によりｐ　Ｉ 　Ｂ　Ｉ　２４から誘導したポリリンカーに連結し、ＡＬＶＡＣ供与体プラスミ ドＣＰ３ＬＣＭＶｇＢを産生した。

実施例３３−組換えウィルス：サイトメガロウィルスの構成 ＣＭＶ　（サイトメガロウィルス）　ｇＢ遺伝子をＮＹＶＡＣのＴＫ部位に挿入 した。組換えウィルスをｖＰｌｏｏｌと称した。ＣＭＶ　ｇＢ遺伝子をＡＬＶＡ ＣのＣ３座に挿入した。組換え体をｖｃＰ１３９と称した。

実施例３４−組換えウィルス感染細胞中のＣＭＶ　ＧＢタンパク質の蛍光抗体法 モルモット多クローン性血清と続いてフルオレセインイソチオシアネートヒツジ 抗モルモットを用いて、蛍光抗体法研尭を前述したように行なった（ティラーら 、１９９Ｇ）。

ｖＰｌｏｏｌに感染した細胞は、形質膜上に発現されたｇＢを示した。ｖｃＰ１ Ｂ９に感染した細胞内では弱い内側発現が検出された。

実施例３５−組換え体感染細胞中にＣＭＶ　ＧＨのイムノブレシピチーシラン 前述したようにイムノブレシピテーション実験を行なった（ティラーら、１９９ ０）。ＣＭＶ感染細胞中で産生されたＣＭＶ　ｇＢ糖タンパク質は、１３０ｋＤ ａの前駆体形状とともに５５ｋＤａの分子量を有する（グレッチら、１９８８） 、ｖＰｌｏｏｌとｖｃＰ１３９に感染した細胞は、約１１６ｋＤａと約５５ｋＤ ａの２つのＣＭＶ　ｇＢ暗号タンパク質を産生ずる。

実施例３６−中和抗体 ｖＰｌｏｏｌ　（ＮＹＶＡＣ−ＨＣＮＶ　ｇＢ）によるＣＢＡネネズの免疫化の 後で、接種したネズミの血清の中和抗体力価を評価した（ゴンクゾル、１９８Ｂ ）。ヒトサイテメガロウイルスを中和できる抗体をネズミの血清中に、免疫化後 １４−２１日（１：１６の幾何学平均力価（ｇｍｔ））および２８と６０日の間 （ｇｍｔ−１：　２６）で検出した。

ＣＢＡネズネズＡＬＶＡＣ−ＨＣＭＶ　ｇＢｌ、：、、にる免疫化１こより、１ 　：６４ｇｍｔ　（１４−２１日のｐｉ、２１と２８日のｐｉでは１　：　９１ ｇｍｔ）および２８と６０日の間のｐｉでは１：１１１のＨＣＭＶ中和抗体力価 を示した。

それゆん、ＨＣＭＶ　ｇＢを発現するカナリヤポックスウィルス組換え体または ワクシニアウィルスでのネズミの免疫化は、ＨＣＭＶの感染性を中和できる抗体 を誘発した。

実施例３７−細胞媒介免疫 ＨＣＭＶ中和抗体力価以外にも、ｖｃＰ１３９はまた、ＨＣＭＶ　ｇＢを発現す る組換えワクシニアウィルス（ワクシニアＷＲ−ｇＢ）に感染したネズミＬ９２ ９細胞を殺すことのできる細胞毒性１９２８球を誘発できる。ＣＢＡネズ′ミに 、２．５Ｘ１０’　ｐｆｕのｖｃＰ１３９を腹腔内により免疫化した。１６から ３０日後、ネズミのひ臓細胞の懸濁液を２：１の比率でｖＰｌｏｏｌに事前に感 染せしめた同系ひ臓細胞とともにコインキュベーションすることにより生体外で 再刺激した。５日後、ひ臓細胞を数え、′１Ｃ「−放出アッセイ（ジンカーナゲ ルら、１９８４）を用いて、未感染し９２９細胞またはアデノウィルスＡｄ５ｄ 　ｌ　Ｈ３、ＨＣＭＶ　ｇＢを発現する組換えアゾノウルイス（Ａｄ−ｇＢ）、 ワクシニアウィルス、およびＨＣＭＶ　ｇＢを発現する組換えワクシニアウィル スに感染したＬ９２９細胞に対する細胞毒性を評価した。未感染標的並びにＡｄ ５ｄｌＥ３に感染した標的に対して、反応性のバックグラウンド水準のみが測定 された。これに反して、生体外刺激ひ臓細胞は、ＨＣＭＶ　ｇＢを発現するＡｄ −ｇＢに感染したＬ９２９細胞を用意に殺した。ワクシニアウィルスベクターに 感染した標的に対して溶菌がある程度観察されたが、ｇＢを発現する組換えワク シニアウィルスに感染した標的に対してはより高い細胞溶解が測定された。これ により、ＨＣＭＶ　ｇＢ内に位置するエピトープに特異的な細胞毒性１９２８球 は、ＨＣＭＶ　ｇＢを発現する組換えカナリヤポックスウィルス（ｖｃＰ１３９ ）の接種により産生されることが明確に示された。

実施例３８−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ供与体プラスミド構成：イヌパルボウ イルス イヌバルボウイルスＶＰ２カプシド遺伝子を発現するポックスウィルス組換え体 を産生ずるために、ＶＰ２遺伝子がＣＰＶ−ｄ単離体のゲノム（ＣＰＶ−２抗原 型）から増幅され、ワクシニアＨ６プロモーターに結合せしめられ（パーカスら 、１９８９）　、ＮＹＶＡＣまはＡＬＶＡＣ挿入ベクターに挿入された供与体プ ラスミドを構成した。ＮＹＶＡＣ挿入部位はｄｅｏｒｆｅｄＡＴＩ座であり、Ａ ＬＶＡＣ挿入部位はｄｅｏｒｆｅｄＣＢ座である。

ＶＰ２遺伝子配列は、プラスミドｐＢ　Ｉ　２６５　（１）からＰＣＨにより得 た。ＮＹ、イタ力、コーネル大学、ジ工−ムズＡ６ベーカー研究所、Ｄｒ、コリ ンＲ，バリツシュ、から得たこのプラスミドは、ＣＰＶ−ｄ単離体のゲノムを含 有スル（コーネル７９０３２０）　（抗原型ＣＰＶ−２）、、１ｍの単離体から のＶＰ２遺伝子のＤＮＡ配列は公表されている（パリッシュら、１９８ｇ）。

テンプレートとしてのｐＢ１２６５　（１）およびプライマーτしてのオリゴヌ クレオチドＲＧ４５１　（配列認識番号２７４　）　（５’−ＴＣＧＧＧＴ ＡＣＣＴＣＧＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧ’！ＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＡ ＧＴＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴ−３曾）とＲＧ４５２　（配列認識番号２７５）（ ５’　−ＴＡＧＧＡＡＴｒＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＴＡＴＡＡＴｒＴＴＣＴＡＧ ＧＴＧＣ−３１）を用いて、ＰＣＨにより完全ＶＰ２読取り枠（ＯＲＦ）を増幅 した。精製したＤＮＡ断片をＡｓ　ｐ７１８とＥｃｏＲ■で切断し、ｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋中のＡｓｐ７１８およびＥｃｏＲ１部位にクローニングし 、ｐＤＴ４を産生じた。ＤＮＡ配列分析によりＶＰ２遺伝子を確認した。

ＶＰ２遺伝子は、初期転写終止信号として機能できるＯＲＦ内に２つのＴＴＴＴ ＴＮＴ配列を含有する（ユエンら、１９８７）。これらの信号を除去するために 、ＰＣＲ部位定方向突然変異誘発を用いて、正確なアミノ酸配列を保持しながら 、ヌクレオチド配列を変更した。合成オリゴヌクレオチドＲＧ４５３　（配列認 識番号２７６）（５’　−ＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＣＡＴｒＧＧＧＴｒＴＣ ＴＡＴＣＣＡＴＧ−３’　）およびＲＧ４５４　（配列認識番号２７７）（５’ −ＴＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣＡＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴＩ ’ＣＣＴＧ−３’　）を用いてｐＢ　Ｉ　２６５　（１）から２５０Ｍの断片を 増幅せしめた。精製した断片をＢｇｌｌｌとＡｃｃｌで切断し、ＢｇＴＩＩ／Ａ ｃｃｌ　ＶＰ２断片をｐＤＴ４に配するのに用いた。産生じたプラスミドｐＥＤ ３は、ＴＴＴＴＴＮＴ配列がＴＴＴＣＴＡＴおよびＴＴＣＴＴＣＴに変更された 変更ＶＰ２遺伝子を含有した。

ｐＭＰＡＴＩＨ６ＨＳＶＴＫは、Ｈ６ブ０−ｔ−−９−（７）制御下でＨ８Ｖ− １チミジンキナーゼ遺伝子の暗号配列を含有する発現カセツテがポリリンカー領 域のＨｐａＩとｘｈｏｆ部位の間に挿入されたｐＳＤ５５２　（この明細書の別 の箇所に記載されている）の誘導体である。このプラスミドをＮｒｕＩとＸｈｏ １部位で切断してｔｋ遺伝子を切除するがＨ６プロモーターの５′末端を保持す る。上述したこのベクターへの変更ＶＰ２遺伝子の挿入によりｐＡＴＩ−ＶＦ６ が産生される。このＮＹＶＡＣ供与体プラスミドは、ＡＴＩ挿入アームを側腹に 有するＨ６ブロモートしたＶＰ２遺伝子である。

ＣＰＶ　ＶＰ２カプシド遺伝子を含有するＡＬＶＡＣ供与体プラスミドを以下の ように構成した。変更ＶＰ２遺伝子をＮｒｕＩとＸｈｏｌによりｐＥＤ３から切 除し、精製したプラスミドをＮｒｕ　ＩとＸｈｏＩで切断したｐＶＱＨ６ＣＰ３ Ｌ　（フラビウイルスのセクションに記載されたプラスミド）にクローニングし た。産生じたプラスミド、ｐＣ３−ＶＦ６は、Ｃ３挿入アームを側腹に有するＨ ６ブロモートしたＶＰ２遺伝子を含有する。

実施例３９−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ組換え体：イヌバルボウイルス（ＣＰ Ｖ）の構成 供与体プラスミドｐＡＴ　Ｉ−ＶＦ６を、治療ウィルスとして（７）ＮＹＶＡＣ （ｖＰ８６６）とＮＹＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＰ８７９）とともにベロ細胞において 生体外組換え実験に用いて、それぞれｖＰ９９８とｖＰ９９９を産生した（ター タグリアら、１９９２）。放射線標識したＶＰ２特異的ＤＮＡプローブを用いて 現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッチｍ＝ら、１９８７）により組換え ウィルスを同定した。

３回めプラーク精製により組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅 した。

供与体プラスミドｐＣ３−ＶＰ２を、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡｃ　（ＣＰ ｐｐ）とＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５Ａ）をＣＥＦ細胞において生体外組換 え実験に用いて、それぞれｖｃＰ１２３とｖｃＰ１３６を産生した。放射線標識 したＶＰ２特異的プローブ（陽性信号）とＣ３０ＲＦ特異的プローブ（陰性信号 ）を用いた現場でのハイブリダイゼーション方法により組換えウィルスを同定し た。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、さらなる分析のために 増幅した。

実施例４Ｏ−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースノＣＰＶ　ＶＦ６組換え体 の発現分析 多クローン性ＣＰＶイヌ血清またはＶＰ２エピトープに特異的な単クローン性抗 体を用いる前述したような蛍光抗体法（ティラーら、１９９０）　ｌ：ｌ：より 、ＣＰＶ　ＶＰ２遺伝子を食前する全ての組換え体を発現に関して試験した。全 ての血清は、ＮＹ、イサ力、コーネル大学、ジェームズＡ。

ベーカー研究所、Ｄｒ、コリンＲ，バリッシュから得た。

ＮＹＶＡＣベースの組換え体をベロ細胞上で試験し、一方ＡＬＶＡＣベースの組 換え体はＣＥＦ細胞上で試験した。

組換え体ｖＰ９９８、ｖＰ９９９、ｖｃＰ１２３、およびｖｃＰ１３６は全て、 核内に局在した内部蛍光を示した。

表面には蛍光は検出されなかった。加えて、狂犬病Ｇ遺伝子を含有する２つの組 換え体（ｖＰ９９９およびｃｃＰ１３６）は、狂犬病Ｇエピトープに特異的な単 クローン性抗体でスクリーニングした。両者とも細胞の表面に強い蛍光を示した 。

上述した組換え体中の真正ＶＰ２遺伝子産生物の発現をさらに特徴付けるために 、同一の抗血清を用いてイムノブレシピテーションを行なった（ティラーら、１ ９９０）。ＮＹＡＶＣベースの組換え体をベロ細胞上で試験し、一方ＡＬＶＡＣ ベースの組換え体はＣＥＦ細胞上で試験した。全ての組換え体（ｖＰ９９８、ｖ Ｐ９９９、ｖｃＰ１２３、およびｖｃＰ１３６）において、抗血清は６５ｋＤａ のタンパク質を沈殿せしめ、これは天然ＶＰ２遺伝子のサイズと一致する。この サイズのタンパク質は、細胞溶解産物またはいずれの親ウィルス（ＮＹＶＡＣま たはＡＬＶＡＣ）からは検出されなかった。

実施例４１−エプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入 供与体プラスミドＥＢＶ三重２の構成 プラスミドＥＢＶ）リプル（Ｔｒｉｐｌｅ）１　（実施例１１）は、全てワクシ ニアＴＫ座挿入プラスミドに挿入されたＥＢＶ遺伝子ｇＨＳｇＢおよびｇｐ３４ ０の発現カセツテを含有する。プラスミドＥＢＶ）リプル１をＳｍａＩ／Ｂａｍ ＨＩで切断し、４２ｋＤａ昆虫ポツクスウイルスプロモーターとＥＢＶ　ｇＨ遺 伝子の５′末端を含有する０゜３ｋｂ断片を単離した。またＥＢｖトリプルプラ スミドをＢａｍＨＩで切断し、ＥＢＶ　ｇＨ遺伝子の３′末端、ＥＢＶ　ｇＢ発 現カセツテ、オヨびＥＢＶ　ｇｐ３４０発現カセツテを含有する７、３ｋｂの断 片を単離した。次いでこれら２つの断片を、Ｓｍａｌ／ＢａｍＨＩで切断したＡ ＬＶＡＣＣＪ座挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７（テタナスの実施例参照） に連結した。産生じたプラスミドをＥＢｖトリプル２と称した。

ＥＢＶ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入 Ｃ５挿入座に、３つのＥＢｖ遺伝子、ｇＨ，ｇＢおよびｇｐ３４０の発現カセツ テを含有するプラスミドＥＢＶトリプル２をＡＬＶＡＣによる組換えの供与体プ ラスミドとして用いてＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６７を産生した。

ｖＰ９４４およびｖＣＰ１５７によるＥＢＶタンパク質の発現 ＡＬＶＡＣ組換え体ｖＣＰ１６７とｖＰ９４４、同一の３つゐ遺伝子を含有する ＮＹＶＡＣベースの組換え体（実施例１１）に感染した細胞からの代謝標識した 溶解産物に、ＥＢＶに対してはヒト多クローン性血清、並びにＥＢＶｇＢとｇｐ ３４０に対してはネズミ単りローン性抗体を用いたイムノブレシピテーションを 行なった。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラ フィーにより沈殿物を分析した。ＮＹＶＡＣベースの組換え体ｖＰ９４４および ＡＬＶＡＣベースの組換え体ｖＣＰ１６７について、正確な分子量のタンパク質 とＥＢＶ　ｇＢ。

ｇＨおよびｇｌ）３４０の特異性を観察した。

実施例４２−ウマインフルエンザＨＡ（Ａｌ／ブラ／Ｘ１５６）（７）ＮＹＶＡ ＣおよびＡＬｖＡＣへの挿入のための発現カセツテの構成 産生１ｊ、：ＥＩＶ（ＡＩ／ブラ／’１５６）ゲ／　ムＲＮＡをローンメリクス （フランス、リヨン）から得た。ガブラーとホフマンにより記載されたように（ １９８３）　、Ｅ　Ｉ　Ｖ−特異的ｃＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドＥ ＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８） （５’−ＡＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ−３’　）を用い て第１の鎖ｃＤＮＡを合成した。このオリゴヌクレオチド（配列認識番号２７８ ）は、各ゲノムＲＮＡ断片の３′末端に相補的である。ガブラーとホフマン（１ ９８３）によると、ｃＤＮＡはｄＧテイルされ（ｔａｉｌｅｄ）、ＥｃｏＲＶで 切断された９ＭＧ５に挿入され、ｄＣテイルされる７この方法によるｃＤＮＡの ９ＭＧ５への挿入により、両方のプラスミド／　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列縁にＢａｍ Ｈ１部位が産生される。

このＥＩＶ　ｃＤＮＡライブラリーからの５００のコロニーを、アンピシリン（ ５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ−アガープレートに二通りに運搬した。コロニ ーを放射線標識したＥＩＶ　ＨＡ特異的プローブとともにハイブリダイゼーショ ンのためにニトロセルロースに運搬した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配 列認識番号２７８）により合成した放射線標識した第１の鎖ｃＤＮＡおよびテン プレートとしての精製ＨＡゲノムＲＮＡを用いてこのプローブを誘導した。ＨＡ ゲノム断片を１．２％の低融点アガロースゲル（ＭＤ、ゲイサルスバーグ、ベセ スダリサーチラボラトリーズ）から精製した。このゲルシステムにおいてＩＸの ＴＢＨの２ボルト／　ｃ　ｍで展開して合計ゲノムＲＮＡを分画した。ＨＡ帯を 切除し、アガロースを７５℃で融解し、続いて２回のフェノール抽出と１回のエ ーテル抽出とＥＴＯＨ沈殿によりＨＡ　ＲＮＡを収穫した。

標準方法（マニアチスら、１９９１）にしたがってコロニーハイブリダイゼーシ ョンンを行ない、１．４ｋｂＨＡｃＤＮＡ挿入物を含有するｃＤＮＡクローンを 同定した。

そのクローンは、ゲノムＲＮＡに対するノーザンプロット分析とヌクレオチド配 列分析により、ＨＡ特異的であることが分かった。この１．４ｋｂの断片を用い て、続いてのｃＤｎＡライブラリースクリーニングのための放射線標識したＨＡ 特異的ＤＮＡプローブを産生じた。

このプローブを用いて、他のＨＡ特異的ｃＤＮＡクローンを同定した。最大のも のは、１．０ｋｂ、１．２ｋｂ。

オヨび１．４ｋｂであり、それぞれ、ｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−１、−１０、および −８と称した。集団的に、これらのコロニーは、ヌクレオチド配列分析により決 定される金縁ＥＩＶ　ＨＡ暗号配列を含有する。これらの分析により決定すれた ＥＩＶ　ＨＡ（７）金縁配列（Ａ１／ブラハ１５６）を第２３図に示す（（配列 認識番号２７９）。

次に、異なるｃＤＮＡクローンからの断片をスプライシングすることによりＥＩ Ｖ　ＨＡの全長のｃＤＮＡクローンを産生じた。ＨＡ暗号配列の５′側の１２０ ０ｂｐを、テンプレートとしてのこのプラスミドおよびオリゴヌクレ、１チドＥ ＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８）とＥ　Ｉ　ＶＡ　１Ｐ７Ａ　（配列認識番号 ２８０） （５１−ＧＴＴＧＧ’ｌ’ｒ’ｒ’ｆｆｒＣＴＡＴｒＡＧ−：Ｉ　１　）を用い たＰＣＲによりｐ　Ｅ　Ｉ　ＶＡ　Ｉ　ＰＨＡ−８カラ誘導した。この１２００ ｂｐの断片をＰｓｔｌで切断し、５′と３′の両末端にＰｓｔｌ粘着性末端を産 生じた。ＨＡ暗号配列の３′側の６００ｂｐを、ＢａｍＨＩとＰｓｔｌでの切断 によりｐＥＩＶＡＩＰＨＡ−１０から誘導した。これら２つの断片を、Ｐｓｔｌ とＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−５Ｋ　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に 挿入した。

金縁″Ｆ：ＩＶ　ＨＡ（Ａｌ／ブラハ１５６）暗号配列を含有する産生じたプラ スミドをｐＢＳＥＩＶＡＩＰＨＡと称した。

オリゴヌクレオチドＥＩＶＡＩＰＨＡ５Ｐ　（配列認識番号２８１） オヨヒＥ　Ｉ　ＶＡ　Ｉ　ＰＨＡ３Ｐ　（配列認識番号２８２）（５’−ＡＴＣ ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＴＡＧＴＧＣＡＣＣ Ｇ−３雷）を用いて、ｐＢＳＥＩＶＡＩＰＨＡからＰＣＲｌ、：よりＥＩＶ　Ｈ Ａ暗号配列（ＡＴＧからＴＡＡ）を誘導した。オリゴヌクレオチドＥＩＶＡＩＰ ＨＡ５Ｐ　（配列認識番号２８１）は、枠ウィルスＨ６プロモーター（ゲーベル ら、１９９０ａＳｂ）の３′側 ２６ｂｐ（Ｎｒｕ１部位）を提供した。１．７ｋｂのｐｃＲ誘導断片をＮｒｕ　 Ｉ切断ｐｃＰｃＶ１に挿入し、ｐＣ３−Ｅ　Ｉ　ＶＡ　Ｉ　ＰＨＡを産生した。

ｐｃＰｃＶｌは、Ｈ６プロモーターを含有する挿入ベクターである。適切な方向 で１゜７ｋｂのプラントエンドした断片を挿入することにより、Ｈ６プロモータ ーに対してＥＩＶ　ＨＡ３’を配した。プラスミドｐｃＰｃＶ１を以下のように して誘導した。ｐＴＰ１５（グオら、１９８９）のＰｓｔＩ部位にＦｅＬＶ　ｅ ｎＶ遺伝子（ギルホットら、１９８７）を含有する２、４ｋｂの断片を含有する プラスミドｐＦｅＬＶＩＡをＰｓｔｌで切断して、ＦｅＬＶ配列を切除し、再結 合せしめてプラスミドｐＦｅＬＶＦを産生じた。ポリリンカー領域の次のワクシ ニアウィルスＨ６プロモーター要素は、ＫｐｎＢ−Ｈｐａｌの切断によりｐＦｅ ＬＶＦ４から雌牛じた。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５０ｂｐの断片を プラントエンドし、カナリヤボックスＤＮＡの３．３ｋｂ　Ｐｖｕｌ■ゲノム断 片を含有するプラスミド、ｐＲＷ７６４．２に挿入した。ｐＲＷ７６４．２を、 カナリヤボックス配列内の特有のＥｃｏＲ１部位を認識するＥｃｏＲＩで線状化 し、Ｅ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンド した。産生じたプラスミドをｐＣＰＣＶｌと称した。このプラスミドは、ポリリ ンカー領域が続き、カナヤボックスウイルス相同配列を側腹に有するワクシニア ウィルスＨ６プロモーターを含有する。

実施例４３−Ｅ　ＩＶ　ＨＡ　（Ａ２／７ｔンテインブル−（ＦＯＮＴＡ　Ｉ　 ＮＥＢＬＥＡＵ）　／７９）をＮＹＶＡＣとＡＬＶＡＣに挿入するための発現カ セツテの構成 精製ＥＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ゲノムＲＮＡをローンメリクス （フランス、リヨン）から得た。

ガブラーとホフマン（１９８３）により記載され、ＥＩＶ（Ａ１／ブラハ１５６ ）ｃＤＮＡ調製に記載されたように、ＥＩＶ特異的ｃＤＮＡを調製した。第１の 鎖ｃＤＮＡ合成には、オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＰ（配列認識番号２７８） 巻周いた。

ＨＡ遺伝子の全長ｃＤＮＡクローンを含有する細菌コロニーをスクリーニングす るために、転換したコロニーの８つのプールを５００ｍ１の培養中で増幅し、標 準方法により（サムプルツクら、１９８９）プラスミドＤＮＡ標品を得た。

オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩＦ（配列認識番号２７８）およびＥＩｖＳＩＰ（ 配列認識番号２８３）（５會−ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴｒＡＧＴＡＧＡＡＡＣＡ ＡＧＧ−３’　）による標準ＰＣＲ反応において全プラスミドＤＮＡをテンプレ ートとして用いた。これらのプライマーはこれらの８つの断片の５′および３′ 末端での保存した（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）配列に相補的であったので、そのよう な反応は、潜在的に８つのＥＩＶゲノム断片の全長ｃＤＮＡ配列のみを増幅する 。

テンプレートとしてのプラスミド標品、ｐＰＥＩＶＡ２Ｆ−０５は、全長ＨＡ特 異的断片のサイズと一致する１゜８ｋｂのＰＣＲ誘導断片を産生じた。このＰＣ Ｒ誘導断片を、ｃＤＮＡライブラリーの残りに対するプローブとしての使用のた めに、ＰＣＨにより再度増幅した。このプローブを用いて、クローンｐＥＩＶＡ ２ＦＨＡ−７および−８を同定し、注文合成したオリゴヌクレオチド（ゲーベル ら、１９９０　＆　）を用いたヌクレオチド配列分析によりｃＤＮＡ挿入物を分 析した。

ヌ〉レオチド配列分析により、クローン＃７および＃８は、Ｅ　ＩＶ　（Ａ２／ ７ｔンテインブルー／７９）ＨＡ暗号配列（第２４図）（配列認識番号２８４） の３′側１２００ｂｐを表すことが分かった。

オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ　（配列認識番号２８５）（５１−人丁ＣＡＴＣ 入ＣＴＡＧＴＡＴＪＩＡＡＡＡＴＣ入入入ＴＧＣＡ入入ＴＧＴＴＣＣ入ＴＣＴＧ ＡＴＧ？Ｉ’ＧＣＣ−コｌ　）およびＡ２ＦＢＡＭ２　（配列認識番号２８６） を用いたＰＣＲＩ：：より、１２００ｂｐ　ＥＩＶ　（配列認Ｘｍ番号をクロー ン＃７から増幅した。ＢａｍＨＩによる切断後のこの１２００ｂｐの断片の５′ 末端は、第２４図の完全ＥＩＶ（Ａ２／フォンテインブルー／７９）ＨＡ暗号配 列（配列認識番号２８４）のヌクレオチド６１７に対応する。またこの断片を、 オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ　（配列認識番号２８５）を用いて暗号配列に対 して操作した３′であるＳｐｅ　！で切断した。この１２００ｂｐ断片を、５′ 側６１６ｂｐを含有する断片（以下に定義する）とともにＳｍａｌ／５ｐｅｌで 切断したｐＢＳ−ＳＫ　（ＣＡ。

ラジョラ、ストラタジエネ）にともに挿入した。しかしながら、潜在的な転換体 のスクリーニングは、１２００ｂｐの断片が挿入されたことのみを示した。ヌク レオチド配列分析のために多くのクローンを選択した。

多てのクローンのヌクレオチド配列分析後、さらなる操作ツタめに、ｐＢＳＥ　 ＩＶＡ２ＦＨＡ−１９を選択した。

このクローンは、ヌクレオチド６１７（第２４図）（配列認識番号２８４）およ びヌクレオチド１５７０（第２４図）（配列認識番号２８４）でのＢａｍＨ１部 位の近くにエラーを含有する。これらのエラーを訂正するために、以下の操作を 行なった。プラスミドｐＢｓＥＩＶＡ２ＦＨＡ−１９をＢａｍＨＩとｓｐｈ　Ｉ で切断し、切除した９００ｂｐの断片を単離した。この断片を、ＨＡ暗号配列の ３′側領域を包含する２５０ｂｐ　５ｐｈｌ／５ｐｅｌ断片とともに５ｐｅｌ／ ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−ＳＫにともに挿入した。テンプレートとしてのク ローン＃７（上記）およびオリゴヌクレオチドＡ２Ｆ３Ｐ　（配列認識番号２８ ５）（５’−ＴＴＧＡＣ’ｌ’ｒＡＡＣＡＧＡＴＧＣＡＧ−３１）を用いて、こ の２５０ｂｐ　ＰＣＲ断片を誘導した。産生じたプラスミドをｐＥＩＶＨ３３Ｐ と称する。

ＥＩＶ　ＨＡ（７）ＨＡ暗号配列ノ５′側６１６ｂｐを以下の方法により産生じ た。最初に、第１の鎖ｃＤＮＡを上述したように産生じた。次いでこの第１の鎖 ｃＤＮＡ標品をテンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ５Ｐ（配列 認識番号２８８） （５１−ＡＴＧＡＡＧＡＣＭＣＣＡ’ｒ’ＦＡＴ！’ＴＴＧ−３１）とＡ２ＦＢ ＡＭ１　（配列認識番号２８９）（５１＞ａ實ＧＡＧＡσＧ實ＡσＣＧ−３１） を用いたＰＣＨによりこれらの配列を増幅した。この断片をＨｉｎｃｌＩ切断し たｐＢＳ−８Ｋ　（ＣＡ、ラジョラ、シスラタジエネ）に挿入し、産生じたプラ スミドをｐＥＩＶＨ３５Ｐと称した。

ワクシニアウィルスＨ６プロモーター配列（ゲーベルら、１９９０ａ、　ｂ）お よびＨＡ暗号配列の５′側領域を、以下のように増幅し、融解せしめた。ｐＢＳ Ｅ６　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ＢＥと称するＨ６プロモーターに正確に連結したＨＩＶ−１ （Ｉ　ＩＩＢ）ｅｎｖ遺伝子を含有するｐＢＳベースのプラスミドからＨ６配列 を誘導した。これらの配列を、オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１ ６４）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＴＴＣＴＴｒＡＴＴＣＴＡＴＡ Ｃ−３’　）およびＨ６３Ｐ　（配列認識番号２９１）（５１−ＴＡＣＧＡＴＡ ＣＡＡＡＣＴＴＭＣＧＧ−：ｌ　ｌ　）を用いたＰＣＲにより増幅した。オリゴ ヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）およびＥＩＶ５ＰＡＣＣ（配列 認識番号２９２　）　（５’−ＧＧＴＴＧＧＧ’！’！’！’ＴＧＡＣＴＧＴＡ ＧＡＣＣＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＡＧＴＡＴＣ入入入Ａτ入ＡＴＧＧ’ｒ’ｒ ＧＴＣ’ｌ’ｒＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴs ＡＡｃＧＧ−３’） とともに１２０ｂｐのＨ６断片をテンプレートとして用い、Ｈ６プロモーターお よびＨＡＡ号配列の最初の４１ｂｐからＡｃｃＩ制限部位を含有する１６１ｂｐ 断片を産生じた。

この断片をＨｉｎｄＩｌｌとＡｃｃＩで切断し、ｐＥＩＶＨ３″ｒ５ｐからの５ ５０ｂｐ　Ａｃｃｌ／ＢａｍＨＩ断片とともにＨｉｎｄ／ＢａｍＨ１で切断した ｐＢＳ−３Ｋにともに挿入した。産生じたプラスミドをｐＨ６Ｅ　ＩＶＨ３５Ｐ と称した。

ｐＨ６ＥＩＶＨ３５Ｐからの７１０ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ１１／ＢａｍＨＩ断片およ びｐＥＩＶＨ３３Ｐからの１２００ｂｐ　ＢａｍＨＩ／５ｐｅｌ断片をＨｉｎｄ とＳｐｅ　１で切断したｐＢＳ−ＳＫにともに挿入することにより、金縁ＨＡ発 現カセツテを誘導した。誘導プラスミドをｐＢＳＡ２ＦＨＡＢと称した。

ヌクレオチド位置６１７でのＢａｍＨ１部位の近くの上述した塩基変化を訂正す るために、マンデツキ方法（マンデツキ、１９８Ｂ）を用いた。ｐＢｓＡ２ＦＨ ＡＢをＢａｍＨＩで線状化し、オリゴヌクレオチドＡ２Ｆ７　（配列認識番号２ ９３） （ｓ”−ｃ入入ＴＴＴＣＧＡＴＡＡＡＣＴＡＴＡＣＡＴＣＴＧＧＧＧを用いて突 然変異誘発方法を行なった。ＨＡの訂正変形を含有するプラスミドをｐＢｓＡ２ ＦＨＡと称した。

実施例４４−それぞれｖｃＰ１２８およびｖＰ９６１を産生するのに使用する挿 入プラスミドｐＥＩＶＣ５ＬおよびｐＥ　ＩＶＨＡＶＱＶＶ（１）構成プラスミ ドｐｃ３ＥＩＶＡＩＰＨＡをＮｒｕＩとＢｉｎｄｌｌｌで切断し、Ｈ６プロモー ターの３′側２６ｂｐおよび奎縁ＥＩＶ（ＡＩ／プラハ１５６）ＨＡＡ号配列を 含有する１、７ｋｂの断片を切除した。フレノウによるプラントエンドの後に、 この断片を、ＮｒｕＩ／ＥｃｏＲＩで切断しフレノウでプラントエンドしたプラ スミドｐ　ＲＷ８３８に挿入してプラスミドｐｃ５ＡＩＰＨＡを産生じた。

プラスミドｐ　ＲＷ８３８は、カナリヤボックス挿入プラスミド（Ｃ５座）中の ワクシニアＨ６プロモーターに融合された狂犬病Ｇ遺伝子（キエ二一ら、１９８ ４）を含有する。Ｎ「０丁とＥｃｏＲＩによる切断により、Ｉ（６プロモーター の５′側１ｏｏｂｐとＣ５フランキングアームを残して狂犬病Ｇ遺伝子を切除し た。

プラスミドｐＣ５ＡＩＰＨＡをＳｍａ　Ｉと５ａｃｌで切断し、Ｈ６プロモータ ーとＥＩＶ（Ａｌ／プラハ１５６）暗号配列の５′側６４５ｂｐを含有する８２ ０ｂｐ断片を切除した。この断片を、ＨＡＡ号配列の残りを含有するｐＣＢＥＩ ＶＡＩＰＨＡらの１．ｌｋｂ　５ａｃｌ／Ｈｉｈｄｌｌｌ断片とともに、Ｈｉｎ ｄＩＩＩとＳｍａＩで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生じたプラスミドを ｐＢＳＡ　Ｉ　ＰＨＡＶＱと称した。

次イテブラスミドｐＢｓＡＩＰＨＡＶＱを、Ｓｐｅ　ＩとＳｍａ　Ｉで線状化し た。この４．７ｋｂの断片をｐＢＳＡ２ＦＨＡから誘導した１、８ｋｂ　５ｐｅ Ｉ／部分的ＨｉｎｃｌＩ断片に連結した。ＥＩＶ（ＡＩ／ブラ／Ｘ１５６）およ び（Ａ２／フオンテインブルー／７９）ＨＡＡ伝子を頭対１の配置で含有する、 産生じたｐＢＳベースのプラスミドを、ｐＢｓＡＩＰＡ２ＦＨＡＱと称した。

２つのＨＡ遺遺伝子金含有るｐＢｓＡＩ　Ｐ２ＦＨＡＶＱから誘導したＮｏｒＩ ／ＸｈｏＩ断片（３，５ｋｂ）を単離し、ｐＳＤ５４２　（ＥＩＶ　（Ａ２／サ フオーク／８９）に関して以下に記載する）とｐＣ５Ｌに挿入し、それぞれ挿入 プラスミドｐ　Ｅ　Ｉ　ＶＨＡＶＱＶＶオヨＣＦｐ　Ｅ　Ｉ　ＶＣ５Ｌを産生し た。

Ｃ’５Ｌ挿入プラスミドは以下のように誘導した。コスミドベクターｐＶＫ１０ ２　（ノフおよびネスター、１９８２）を用いて、ｖＣＰ６５のゲノムライブラ リー（Ｃ５座に狂犬病を有するＡＬＶＡＣベースの狂犬病Ｇ組換え体）を構成し た。このライブラリーに、ｐＲＷ７６４．５　（Ｃ５座）内に含有される０、９ ｋｂのＰｖｕｌｌカナリヤポ・ソクスウイルスゲノム断片をプローブした。これ らのカナ１ツヤボックスＤＮＡ配列は、起点挿入座を含有している。２８ｋｂの 挿入物を含有するクローンが成長せしめられ、ｐＨｃ０５１と称した。Ｃ５配列 を含有するこのコスミドから３゜３ｋｂのＣ１ａ断片をサブクローンした。この Ｃ１ａｌ断片らの配列分析を用いて、１−１３７２のＣ５座の遺伝子地図を延長 した。

Ｃ５挿入ベクター、ｐＣ５Ｌを、２段階で構成した。オリゴヌクレオチドＣ５Ａ （配列認識番号２９４）を用いたＰＣＲ増幅により、１５３５ｂｐの左側アーム を産生じた。テンプレートＤＮＡはｖＣＰ６５ゲノムＤＮＡでありた。この断片 をＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ切断ｐＵＣ８にクローニングした。標準塩基配列決定プ ロトコルにより配列を確認した。オリゴヌクレオチドＣ５Ｃ（配列認識番号２つ ６） （５１−人ＴＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡ’Ｉ’ｒＣＴＡＡＡＣＴＡＧＧＡＡＴ ＡＧＡＴＧ−３’　）およびＣ３ＤＡ　（配列認識番号２９７）（５１−ＡＴＣ ＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧ−３１） を用いたＰＣＲ増幅により、４０４ｂｐの右側アームを産生じた。次いでこの断 片を、以前に産生じ、Ｓｍａｌ／Ｐｓｔｌで切断した左側アームを含有するベク ターにクロ−ニングした。金縁構成を、標準配列分析により確認し、ｐＣ５Ｌと 称した。この挿入プラスミドは異種遺伝子の０５座への挿入を可能にする。

実施例４５−インフルエンザウィルス（Ａ２／サフォーク／８９）血球凝集素遺 伝子を発現するＡＬＶＡＣ−およびＮＹＶＡＣベースの組換え体を産生ずる挿入 プラスミドの構成 ウマインフルエンザウィルス（Ａ２／サフォーク／８９）からの血球凝集素（Ｈ Ａ）遺伝子を過含有するＭ１３クローン？Ｄｒ、Ｍ、ビンス（イギリス、ＣＢＳ 　７ＤＷ、サフォーク、ニューマーケット、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ５、アニマルヘルス トラスト）から得た。このクローンは、ＨｉｎｄＩ１１部位によりＭ１３ベクタ ーに挿入されたこのＨＡＳ遺伝子を含有する全長１．７ｋｂ　ｃＤＮＡ断片を含 有する。

最初に、オリゴヌクレオチドＥＩＶＳＩ　（配列認識番号およびＥＩｖＳ２（配 列認識番号２９９）（５’−ＴＣＡＡＡＴＧＣＡＡＡＴＧ’！’ｒＧＣＡＴＣＴ −３’）を用いたＰＣＨにより上述したＭ１３クローンからウマインフルエンザ ウィルス（ＥＩＶ）ＨＡ遺伝子を増幅した。

この１．７ｋｂの断片を、Ｓｍａ　Ｉで切断したｐｓｓ−ｓＫ　（ＣＡ、ラジョ ラ、ストラタジェネ）に連結した。２つの陽性クローンを誘導し、ヌクレオチド 配列分析により分析した（ゲーベルら、１９９０ａ）。クローンＡは１つの非保 存塩基変化を含有し、一方クローンＢは、第２５図に示した配列と比較した３つ の変化を含有した（配列認識番号３００）。Ｅ　ＩＶＨＡ遺伝子の全長訂正変形 を産生ずるために、り０−　ンＢを５ａｃｌとＭｓｃｌで切断し、３９０ｂｐの 断片を切除した。この断片をクローンＡから誘導した４、３ｋｂのＭｓｃｌ／部 分的５ａｃｌ断片に連結した。

これにより訂正されたＥ　ＩＶＨＡが得られ、ｐＢＳＥＩＶＨ５と称した。

Ｅ　ＩＶＨＡ暗号配暗号配列側５′側３６０ｂｐリゴヌクレオチド１３Ｌ５ＥＩ Ｖ（配列認識番号３０１）（５’−Ｇ’ｆｆＬ”ＡＡＴＣＡＴＧ入入ＧＡＣＡＡ ＣＣＡＴＴＡＴ’！ＴｒＧＡＴＡＣ−：ｌ’）ｔｉｊ、［ＦＥ　Ｉ　ＶＰＶＵ　 （配列認識番号３０２）（５’　−ＡＧＣＡＡＴ’ｒＧＣｒＧＡＡＡＧＣＧＣ− ３’　）を用いたＰＣＨにより、ｐＢＳＥＩＶＨ５から誘導した。

オリゴヌクレオチド１３Ｌ５Ｂ５　（配列認識番号３０３）（５１−人ＴＣＡＴ ＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴｃＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡｃ−３’）オ ヨびＥＩＶ５１３Ｌ（配列認識番号３０４）を用いたＰＣＲにより金縁１３Ｌプ ロモーター領域（ゲーベルら、１９９０ａＳｂ）をｐＭＰＩ３Ｌ１０１から誘導 した。

オリゴヌクレオチド１３Ｌ５Ｂ５　（配列認識番号３０３）オヨびＥＩＶＰＶＵ （配列認識番号３０２）１．：よるＰＣＲによって、オリゴヌクレオチドｌ３Ｌ ５ＥＩＶ（配列認識番号３０１）およびＥＩＶ５１３Ｌ（配列認識番号３０４） による操作により協議された相補にしたがってこれらの断片を融合し、４８０ｂ ｐの断片を産生じた。

プラスミドｐＭＰＩ３Ｌ１０１は、１３Ｌプロモーターの制御下で狂犬病糖タン パク質をコードする遺伝子からなる発現カセツテを含有し、全てはＯＲＦ　Ｃ６ Ｌ−ＫＩＬが欠損したワクシニア挿入プラスミドに挿入された（ゲーベルら、１ ９９０ａ、ｂ）、Ｉ　３Ｌプロモーターは、０ＲＦ１３Ｌの開始コドンから直ち に上流の１０１塩基（ｎｔ６４．９７３−６５．０７４　ゲーベルら、１９９０ ａＳｂ）からなる。

１３ＬプロモーターをＥ　ＩＶＨＡ暗号配列の５′領域に正確に連結せしめる上 述のように誘導した融合断片をＢａｍＨ丁（５′末端）とＡｃｃＩ（３’末端） で切断し、４００ｂｐの断片を単離した。この断片をｐＢｓＥＩＶＨ８から誘導 した４、６ｋｂのＢ　ａｍＨＩ　／部分的Ａｃｃｌ断片に連結し、産生じたプラ スミドをｐＢｓＥＩＶＨｓＩ３Ｌと称した。

Ｅ　Ｉ　ＶＨＡ発現カセツテを含有する１、８ｋｂ　Ｓｍａ１／Ｘｈｏｌ断片を ｐＢｓＥＩＶＨ３Ｉ３Ｌから誘導した。

この断片をＳｍａｌ／Ｘｈｏｌ切断ｐＳＤ５４２　（実施例３２に記載した）挿 入ベクターに挿入し、ｐＴＫＥ　ＩＶＨＳＩ３Ｌを産生した。

ｐＢｓＥＩＶＨＥＩ３Ｌ　（上記）からの１．８ｋｂ　Ｓｍａｌ／Ｘｈｏｌ断片 を、Ｓｍａｌ／ＸｈｏＩで切断した、ＣＰｐｐ　（ＡＬＶＡＣ）挿入プラスミド 、ＶＱＣＰ３Ｌｌ：挿入した。産生じたプラスミドをｐＣ３Ｅ　ＩＶＨ３Ｉ　３ Ｌと称した。

挿入プラスミドＶＱＣＰ３Ｌを以下のように誘導した。

Ｘｍａｌによる切断と、線状化したプラスミドのホスファターゼ処理と、アニー ルし、キナーゼしたオリゴヌクレオチドＣＰ２３　（配列認識番号３０５）およ びＣＰ２４　（配列認識番号３０６）＋、Ｊｌ結スルコとニヨリ、ＶＱＣＰＣＰ ３ＬをｐＳＰＣＰ３Ｌから誘導した。

実施例４６−ＡＬＶＡＣウマインフルエンザウィルス組換え体の発生 プラスミドｐＥＩＶｃ５Ｌ４；Ｌ、ウマ−１、ＡＩ／プラハ１５６　（Ｈ７）お よびウマ−２、Ａ２／フオンテインブルー／７９　（Ｈ３）の血球凝集素暗号配 列を含有する。両方の遺伝子をワクシニアウィルスＨ６プロモーターに連結し、 ｄｅ−ｏｒｆｅｄ　Ｃ５座に挿入する。ＡＬＶＡＣウィルスは、生体外組換えに おいて治療ウィルスとして用い、挿入されたＤＮＡを治療した。Ｈ７およびＨ３ 暗号配列に対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択した。

両方の異種遺伝子を含有する純粋な個体群が得られるまで、組換え体プラークに プラーク精製した。この時点で組換え体はｖｃＰ１２８と判明し、株ウィルスを 設立した。ウマからの多クローン抗体Ｈ７血清およびＨ３血球凝集兼に特異的な 単クローン性抗体を用いて、蛍光抗体法を行なった。両方の試薬を用いてｖｃＰ １２８感染ベロ細胞に表面蛍光が検出され、両方の抗原が感染細胞表面に適切に 存在することが示された。

Ｈ３特異的単クローン性抗体を用いたイムノブレシピテーション分析により、ｖ ｃＰ１２ｇ感染ＣＥＦ細胞中に約７５ｋｄのタンパク質の存在が示された。これ は潜在的にＨＡ前駆体糖タンパク質を表すものである。開裂産生物は検出゛され なかった。Ｈ７特異的多クローン性血清を用いたイムノブレシビテーション分析 により、約７５ｋｄの前駆体糖タンパク質の存在が示された。それぞれ約４５お よび３０ｋｄの分子量を有するＨＡ、およびＨＡ２開裂産生物もまた視覚化され た。

プラスミドｐｃ３ＥＩＶＨｓ１３Ｌｉ；ｔ、ウマ−２Ａ２／サフオーク／８９亜 型の血球凝集素暗号配列を含有する。

遺伝子は、ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターに連結され、ｄｅ−ｏｒｆｅ ｄＣ３挿入部位に挿入される。生体外組換えにおいて、ＡＬＶＡＣウィルスは治 療ウィルスとして用いられ、異種遺伝子を治療する。Ｈ３特異的放射線標識プロ ーブに対するハイブリダイゼーションに基づいて組換え体プラークを選択した。

純粋な組換え体側体群となるまで、陽性プラークをプラーク精製した。この時点 で、組換え体はｖｃＰ１５９であると判明し、ウィルス株を設立した。鶏からの Ｈ３特異的血清多クローンを用いたｖＣに認識したタンパク質が感染細胞表面に 発現されたことが示された。

実施例４７−ウマインフルエンザウィルス亜型の血球凝集素糖タンパク質を含有 するＮＹＶＡＣ組換え体の発生 プラスミドｐＥ　ＩＶＨＡＶＱＶｖは、ウマ−１、ＡＩ／プラハ１５６　（Ｈ７ ）およびウマ−２、Ａ２／フォンティンブルー／７９　（Ｈ３）をコードする配 列を含有する。両方の遺伝子をワクシニアウィルスＨ６プロモーターに連結し、 ＴＫ部位に挿入する。ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）を生体外組換えにおいて治療ウ ィルスとして用い、異種遺伝子を治療する。放射線標識したＨ３およびＨ７特異 的タンパク質に対するハイブリダイゼーションに基づいて組換えプラークを選択 した。純粋な個体群が得られるまで、組換え後代ウィルスをプラーク精製した。

この時点で組換え体はｖＰ９６１であると判明し、ウィルス株を設立した。Ｈ３ 特異的単クローン性行為およご多クローン抗体Ｈ７血清を用いた蛍光抗体法によ り、両方の糖タンパク質が感染細胞表面に発現されたことが分かった。同一の試 薬によるイムノブレシビテーション分析により、Ｈ３糖タンパク質は、約７５ｋ ｄの分子量を有する前駆体糖タンパク質として発現されたことが示された。開裂 産生物は証明されなかった。

Ｈ７糖タンパク質は、約７５ｋｄの前駆体糖タンパク質として証明され、ＨＡ、 およびＨＡ２開裂産生物はそれぞれ約４５および３０ｋｄの分子量を有した。

プラスミドｐＴＫＥＩＶＨ９Ｉ３Ｌは、ウマ−２Ａ２／サフォーク／８９血球凝 集素糖タンパク質の暗号配列を含有する。暗号配列を、Ｉ３Ｌプロモーターに連 結し、ＴＫ部位に挿入する。ＮＹＡＶＣ（ｖＰ８６６）を治療ウィルスとして用 い、組換え体プラークは、Ｈ３特異的放射線標識したプローブに対するハイブリ ダイゼーションに基づいて選択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え体プ ラーク後代をプラーク精製した。この時点で組換え体は■Ｐ１０６３であること が判明し、ウィルス株を設立した。

鶏からの多クローン性抗Ｈ３を用いた蛍光抗体法により、免疫的に認工されたタ ンパク質が感染細胞表面に発現された子とが分かった。

実施例４８−ワクシニアウィルス／ＦＥＬＶ挿入プラスミドの構成 ＦｅＬＶ（ネコ白血病ウィルス）ｅｎｖ　ＤＮＡ配列を、Ｍ１３ｍｐ（ベクター に挿入された２、４ｋｂｐ　ＦｅＳＶ−３Ｍ　ＤＮＡ　（ギルホットら、１９８ ７）の形状でＤｒ。

Ｆ、ゲイルバート（フランス、パリ、セントルイス、血液実験病院の研究所）か ら得た（メリック、１９８３）　、金縁読取り枠を含有するこの２．４ｂｐ　Ｐ ｓｔＩ／ＫｐｎＩ断片（ＦｅＬＶ　ｐ７０＋ｐ１３Ｅ）を単離し、都合よくｐＵ Ｃ１８に挿入した（メリック、１９８３）　、　ｅ　ｎ　ｖ配列の３′末１での ＫｐｎＩ部位をＰｓｔ１部位に変換し、２．４ｋｂｐ　Ｐｓｔｌ断片を単離して Ｐｓｔｌ切断したｐＴｐ１５に連結した（グオら、１９８９）。産生じたプラス ミドをｐＦｅＬＶ、ＩＡと称した。

生体外突然変異誘発を用いて（マンデツキら、１９８Ｂ）、ｐＦｅＬＶＩＡをｐ ＦｅＬＶＩＢに変換した。これは、オリゴヌクレオチド５ＰＢＧＬＤ　（配列認 識番号３０７）（５’　−ＡＡＴＡＡＡＴＣＡＣ 賀ＴケＡＴＡＣＴＡＡ？Ｘ’ＣＴＴＴＡＴ！’ＣＴＡＴＡＣＴＴＡＡＪＩＡＡＧ Ｔ−３”　）を用いて行なった。このオリゴヌクレオチドにより突然変異誘発に より、Ｈ６プロモーターの境界でのＢｇｌＩＩ部位およびＨＡ配列を除去するこ とができた。これにより、ウィルス中に発見されたこれらのＤＮＡ断片の実際の 配列が提供される。

次いでプラスミドｐＦｅＬＶＩＢを、オリゴヌクレオチドＦｅＬＶ５Ｐ　（配列 認識番号３ｏ８）（５’−ＣＧＣＴＡ’ｒＡＧＧ ＣＡＡＴｒＣＡＡＡＣＡＴＡＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＡＪｋＣＧＣＡＣＣ ＣＡ−３’）で突然変異誘発せしめ、ｐＦｅＬＶｌｃを産生した。以下の変更に 関して、生体外突然変異誘発をマンデツキ（１９８Ｂ）に記載されたように行な った。特有のＳｍａ　１部位でのｐＦｅＬＶＩＢの切断後、ＤＮＡをＢａ　１３ １で切断した。

５秒、１０秒、２０秒、４０秒および８０秒の時間に、アリコートを採取し、Ｅ ＧＴＡを２０ｍＭの最終濃度に加えるこτにより、反応を終了せしめた。アリコ ートを集積し、突然変異誘発反応に用いた。産生じたプラスミド、ｐＦｅＬＶＩ Ｃは、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの３′で隣接したＦｅＬＶ　ｅｎｖ 遺伝子およびＡＴＧ：ＡＴＧ置換を含有した。プラスミドｐＦｅＬＶ１ｃを、治 療ウィルスとしてのｖＰ４２５とともに生体外組換え試験に用い、金縁ＦｅＬＶ エンベロープ糖タンパク質を発現する組換えワクシニアウィルス（ｖ　Ｐ４５３ ）を産生じた。

プラスミドｐＦｅＬＶ１ｃを試薬として用いてｐＦｅＬＶＩＤを産生じた。この 組換えプラスミドは、推定免疫抑制領域を欠如することを除いては金縁ＦｅＬＶ 　ｅｎｖ遺伝子を含有する（シアンシオロら、１９８５　、マセスら、１９７８ ）。免疫抑制領域をコードする配列（ギホットら、１９８７におけるヌクレオチ ド２２５２−２３３２の配列）を以下の方法により生体外突然変異誘発により欠 損せしめた（マンデツキ、１９８Ｂ）　、プラスミドｐＦｅＬＶ１ｃをＢｓｍ１ で線状化した。線状化したプラスミドをＢａ　ｌ　３１で処理し、１分、２分、 ４分および８分でアリコートを採取し、突然変異誘発反応の使用のために集積し た。オリゴヌクレオチドＦｅＬＶＩＳＤ　（配列認識番号３ｏ９）（５１−ＡＣ ＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＡＧＧＴＡＧＴＣＴＡＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＡＣＣＧＧ ＡＣＴＣＧＴＣＣＧＡＧＡＣＭＴＡＴＧＧＣＴＡＡＡＴＴＡＡＧＡＧ入入ＡＧＡ ＣＴＡＡＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＡＣｒＧＴＴＴＧＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧ −３１） を用いて生体外突然変異誘発を行なった。産生じたプラスミド”、ｐＦｅＬＶＩ Ｄを、治療ウィルスとしてのｖＰ４１０とともに生体外組換え試験に用いて、ｖ Ｐ４５６を産生じた。このワクシニアウィルス組換え体は、推定免疫抑制領域が 欠如した金縁エンベロープ糖タンパク質を発現するように産生された。

実施例４９−アビポックスウィルス／　Ｆ　ｅ　Ｌ　Ｖ挿入プラスミドの形成 ＦＰ−１組換え体の構成のために、２．４ｋｂｐのＨ６／Ｆｊ’ＬＶ　ｅｎｖ配 列を、ＢｇｌｌＩの切断とＰｓｔｌの部分的な切断により、ｐＦＥＬＶＩＡ　（ 上記）から切除した。Ｂｇ１１１部位は、Ｈ６プロモーター配列の５′境界にあ る。ＰｓｔＩ部位は、エンベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止信号から４ ２０ｂｐ下流に位置する。

２．４ｋｂｐ　Ｈ６／ＦｅＬＶ　ｅｎｖ配列をＢａｍＨ■とＰｓｔｌで切断した ｐｃＥｌｌに挿入した。多重クローニング部位を不可欠ＨｉｎｄｌＩ部位に挿入 することにより、ＦＰ−１挿入ベクターｐｃＥ１１をｐＲＷ７３１゜１３から誘 導した。この挿入ベクターにより、ＦＰ−１ゲノムが産生される。次いで組換え 体ＦＰ　１／ＦｅＬＶ挿入プラスミドをｐＦｅＬＶＦｌで切断した。この構成で は、ＡＴＧ置換のための正確なＡＴＧが提供されない。

正確なＡＴＧ　：　ＡＴＧ構成を達成するために、約１．４ｋｂｐのＮｒｕｌ／ ５ｓｔｌＩ断片をワクシニアウィルス挿入ベクターｐＦｅＬＶ１ｃ　（上述）か ら誘導した。Ｎｒｕｒｉ位は、ＡＴＧから２４ｂｐ下流の位置にあるＨ６プロモ ーター内に生じる。５ｓｔＩＩ部位は、ＡＴＧから１゜４ｋｂｐ下流で、翻訳終 止コドンから１ｋｂｐ上流に位置する。ｐＦｅＬＶＦｌの５ｓｔｌｌによる切断 とＮｒｕＩによる部分的な切断によって産生された９、９ｋｂｐの断片に、Ｎｒ ｕｌ／５ｓｔＩＩ断片を連結した。この９．９ｋｂｐの断片は、５．５ｋｂｐ　 ＦＰ−１フランキングアーム、ｐＵＣベクター配列、ｅｎｖ遺伝子の下流部分に 対応する１、４ｋｂｐのＦｅＬＶ配列、およびＨ６プロモーターの５′側部分（ 約１００ｂｐ）を含有する。産生じたプラスミドをｐＦｅＬＶＦ２と称した。ヌ クレオチド配列分析により、正確なＡＴＧ　：　ＡＴＧ構成が確認された。

推定免疫抑制領域（上述）に対応するＦｅＬＶ　ｅ（１ｖ配列を序供することに より、ＦｅＬＶＦ２からさらなるＦＰ−１挿入ベクター、ｐＦｅＬＶＦ３を誘導 した。これは、ワクシニアウィルス挿入ベクター、ｐＦｅＬＶＩＤ（上述）から 得た約１ｋｂｐのＰｓｔｌ／５ｓｔｌＩ断片を単離し、この断片を、ｐＦｅＬＶ Ｆ２のＰｓｔｌと５ｓｔＩＩによる切断によって誘導された残りのＨ５／ＦｅＬ Ｖ　ｅｎｖ遺伝子を含有する１０．４ｋｂｐ　Ｐｓｔｌ／５ｓｔｌｌ断片に挿入 することにより行なった。

挿入プラスミド、ｐＦｅＬＶＦ２およびｐＦｅＬＶＦ３を、治療ウィルスとして のＦＰ−１とともに、生体外組換え試験に用いた。後代ウィルスを、生後１０日 の感染幼虫包蔵棒から得た主要ひな胚胎繊維芽細胞（ＣＥ　Ｆ）単層に塗布し、 ＣＥＦ単層のプラークハイブリダイゼーションにより組換えウィルスをスクリー ニングした。ハイブリダイゼーションにより同定した組換え体後代を選択し、４ 回のプラーク精製を行なって均質な個体群を得た。金縁ＦｅＬｖ　ｅｎｖ遺伝子 をハーバリング（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）するＦＰ−１組換え体は、ｖＦＰ２５と 称し、それを含有するＦＰ−１組換え体は、ｖＦＰ３２と称した。

ｃｐ組換え体を構成するために、Ｈ６／ＦｅＬＶ　ｅｎＶ遺伝子配列を含有する ２、２ｂｐ断片を、ＫｐｎＩとＨｐａｌでの切断によりｐＦｅＬＶＦ２とｐＦｅ ＬＶＦ３から切除した。Ｋｐｎ１部位は、Ｈ６プロモーター配列の５′境界にあ る。Ｈｐａ１部位は、エンベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止信号から１ ８０ｂｐ下流にある。これらの単離した断片をプラントエンドした。これらの２ ゜２ｋｂｐ　Ｈ６／ＦｅＬＶ　ｅｎｖ配列を挿入プラスミドｐＲＷ７６４．２の 不可欠ＥｃｏＲ１部位に挿入し、次いでＥｃｏＲ１部位でプラントエンドした。

これらの挿入ベクターにより、ＣＰゲノムの０３座において異種遺伝子をハーバ リングする０２組換え体が産生できる。次いで組換え体ＣＰ挿入プラスミドをそ れぞれｐ　Ｆ　ｅ　Ｌ　Ｖ　ＣＰ　２とｐＦｅＬＶＣＰ３と称した。

挿入プラスミド、ｐＦｅＬＶｃＰ２とｐＦｅＬＶＣＰ３を、治療ウィルスとして のＣＰとともに生体外組換え試験に用いた。組換え体の後代を、生後１０日の感 染幼虫包蔵卵（ＣＴ、スト−１ＳＰＡＦＡＳ）から得た主要ひな胚胎繊維芽細胞 （ＣＥ　Ｆ）単層に塗布し、プローブとしての放射線標識したＦｅＬＶ　ＤＮＡ を用いてハイブリダイゼーションにより組換えウィルスを選択した。陽性雑種形 成プラークを選択し、４回のプラーク精製を施し、均質な個体群を得た。金縁Ｆ ｅＬＶ　ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ３５と称し、免疫抑制領域を 欠いて金縁ｅｎｖ遺伝子を発現する組換え体をｖＣＰ３７と称した。

実施例５Ｏ−ＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ遺伝子を含有するＡＬＶＡＣベースの組換え 体の産生 プラスミドｐＦｅＬＶ　ｅｎｖ２４は、ローンメリクス（フランス、リヨン）か ら得て、これはＦｅＬＶ−Ｂｅｎｖ遺伝子を含有する。このプラスミドは、ＮＣ Ｅ１６１ＦｅＬＶ菌株から誘導した４、２ｋｂのｃＤＮＡ誘導断片を含有する。

プラスミドｐＦｅＬＶｅｎｖ３４は、ｐＢＳ−５Ｋ　（ＣＡ、ラジョラ、ストラ タジエネ）のＳｍａ　１部位に４．２ｋｂのＦｅＬＶ−Ｂ特異的挿入物を含有す る。

ＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ遺伝子の配列を第２６図に示す（配列認識番号３１０）。

この配列において、開始コドン（ＡＴＧ）と終止コドン（ＴＧＡ）に下線が引い である。

ＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖの発現カセツテは、以下のようにして構成した。オリゴヌ クレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４） およびＨ６３ＰＰＢ　（配列認識番号３１１）（５’−ＧＧＧＴＧＣＧＴｒＧＧ ＡＣＣＴＴＣＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＧＡＡＡＣＴＴＡｋＣＧＧ−３１） を用いたＰＣＲＩ：よりプラスミドｐ　ｌ４ＬＨ６ＨＩＶ３Ｂ（ＨＩＶに関して 上述した）から、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターを誘導した。これらのオ リゴヌクレオチドによるこれらの配列の増幅は、最初の２０ｂｐのＦｅＬＶ−Ｂ 　ｅｎｖ暗号配列を含有する３′末端と５’ＨｉｎｄＩ１１部位を有するＨ６プ ロモーターを産生じた。

オリゴヌクレオチドＦＢ５Ｐ　（配列認識番号３１２）（５’　−ＣＣＧＴＴＡ ＡＧＴＩ’ＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＡＧＣＧ−３’　）お よびＦＢ５ＰＡ　（配列認識番号３１３）（５’−ＧＧＧＴＡＡＡＴＴＧＣＡＡ ＧＡＴＣＡＡＧＧ−３’　）を用いたＰＣＨによりｐＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ３４ からＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ遺伝子の５′部分を誘導した。このＰＣＲ誘導断片は 、Ｈ６プロモーターの３′側２３ｂｐの相同性（５′末端）および位置５４６で の特有のＡｐａ１部位を含有する。テンプレートとして上記のように定義した２ つのＰＣＲ断片と、オリゴヌクレオチドＦＢ５ＰＡ　（配列認識番号３１３）お よびＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６４）を用いたＰＣＨにより、Ｈ６プロモータ ーをＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ遺伝子に融合した。ＰＣＲ融合断片をＨｉｎｄＩＩＩ とＡｐａｌで切断し、６８０ｂｐ断片を産生じた。

プラスミドｐＦｅＬＶ　−Ｂ　ｅｎｖ３４をＡｐａＩとＮｃｏＩで切断し、ｅｎ ｖ遺伝子の中間部分を含有する７４０ｂｐの断片を雌牛じた。テンプレートとし てｐＦｅＬＶ−ｂ　ｅｎｖ３４およびオリゴヌクレオチド（配列認識番号　３１ ４）　（５雷−ＣＣＣＣＡＴＧＣＡＴＩ？ＣＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＣＴＣＡＡＴ ＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＧＴＣｒＴＡＡＴＡＧ−３’　）とＦＢ ３ＰＸ　（配列認識番号３１５）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡ ＡＡＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＧＴＣＣＧ　ＧＡＴＣ−３’　）を用いたＰＣＨによ り、遺伝子の３′末端を誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによるｅｎｖ遺 伝子の３′末端のＰＣＲ増幅により、位置１３２６−１３３２での７５ＮＴ要素 を除去した。位置１３２９でのＴからＣの置換を行なうことにより、この配列を 変更した（第２６図）。このＰＣＲ誘導断片の５′末端はまた、特有のＮｃｏ１ 部位を含有する（位置１２９８での部位に一致する；第２６図）。

この断片をＮｃｏｌとＸｂａｌで切断し、７０７ｂｐの断片を産生じた。

７４０ｂｐのＮｃｏＩ／Ａｐａｌ断片と７０７ｂｐのＮｃ　ｏ　Ｉ　／　Ｘ　ｂ 　ａ　Ｉ断片をともに、ＡｐａＩとＸｂａｌで切断したｐＢＳ−５Ｋに挿入した 。産生じたプラスミドをｐＢＳＦ８３Ｐと称した。次いでｐＢＳＦ８３Ｐからの １゜５ｋｂのＡｐａｌ／Ｘｂａｌ断片を、ＦｅＬＶ−ＢｅｎＶ遺伝子（上述）の Ｈ６ブロモートした５′末端を含有する６８０ｂｐのＰＣＲ断片とともに、Ｈｉ ｎｄＩＩＩとＸｂａｌで切断したｐＢＳ−ＳＫに挿入した。産生じたプラスミド をｐ８５ＦＥＢと称した。

Ｈ６ブロモートしたＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＢ５ＦＥＢから の２．２ｋｂ　ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片を単離し、フレノウ断片でプラン トエンドした。このプラントエンドした断片を、ＳｍａＩで切断したｐＣ５Ｌ　 （ここのＨＩＶに関する議論を参照）に挿入し、ｐＣ５ＬＦＥＢを産生した。

プラスミドｐＣ５ＬＦＥＢを、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）と ともに、標準生体外組換えアッセイに用いた。ＦｅＬＶ−Ｂ　ｅｎｖ特異的ＤＮ Ａプローブを用いて、組換え体プラークを同定した。３回のブラーク精製後、ウ ィルスを繁殖せしめ、ｖｃＰ１７７と称した。

実施例５ｌ−ＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ　ＥＮＶ組換えウィルスの産生 ＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ配列を誘導したプラスミドｐＦＧＡ−５はＤｒ、Ｊ、ネイ ル（グラスゴー大学）から得て、以前に記載したものである（スチュワードら、 １９８Ｂ）。最初に、ヌクレオチド１から５３１ｂｐに対応する５３１ｂｐ　Ｐ ｓｔｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌ断片（スチュワードら、１９８６）を切除して、Ｐｓｔ ’ｌとＨｉｎｄｌｌｌで切断したｐＣＰＣＶＩに連結し、ｐＣ３ＦＡ−１と称し た。このプラスミドｐｃＰｃＶ１は以下のように誘導した。プラスミドｐＦｅＬ ＶＩＡをＰｓｔｌで切断し、ＦｅＬＶ配列を切除して再度連結し、プラスミドｐ ＦｅＬＶＦ４を産生じた。

ワクシニアウィルスＨ６プロモーター要素（ティラーら、１９８ｇ）と続くポリ リンカー領域を、ＫｐｎｌとＨｐａｌでの切断により、ｐＦｅＬＶＦ４がら雌牛 した。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて１５０ｂｐの断片をプラントエンドし 、カナリヤボックスＤＮＡの３．３ｋｂ　Ｐｖｕｌｌゲノム断片を含有するプラ スミド、ｐＲＷ７６４．２に挿入した。カナリヤボックス配列内で特有のＥｃｏ ＲＩ部位を認識するＥｃｏＲＩでｐＲＷ７６４．２を線状化し、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンドした。産 生じたプラスミドは、ｐｃＰｃＶｌと称した。このプラスミドは、ポリリンカー 領域が続き、側腹にカナリヤポックスウィルス相同配列を有する、ワクシニアウ ィルスＨ６プロモーターを含有する。

プラスミドｐＣ３ＦＡ−１を、Ｐｓｔｌで線状化し、オリゴヌクレオチドＦＥＮ ＶＡＨ６−１（配列認識番号３１（５’　−ＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣ ＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＣＡＡＣＧＣＡｅ−３’　）を用いたマンデツキ法 （１１８６）により生体外組換えにおいて突然変異誘発を行なった。生体外突然 変異誘発により、ワクシニアＨ６プロモーター要素の正確なＡＴＧ　：ＡＴＧ配 列１なる異種５′非暗号配列およびＦｅＬＶ−ＡｅｎＶ配列を除去した。産生じ たプラスミドをｐＨ６ＦＡ−１と称した。

注文合成したオリゴヌクレオチド（ＣＡ、サンラフアニル、アプライドバイオシ ステムス）を用いた標準ＰＣＲによりＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ遺伝子の残りをｐＦ ＧＡ−５から誘導した。テンプレートとしてのｐＦＧＡ−５およびオリゴヌクレ オチドＦＥＮＶＡ−２（配列認識番号３１７）（５’−ＣＣＡＴＡＡＴＴＣＧ ＡＴＴＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡ？ｒＣＡＧＡＧＧＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣ −３’　）とＦＥＮＶＡＨ（配列認識番号２３１）（５’　−ＣＡＡＧＡＴＧＧ ＧＴＴＩＴＧＴＧＣＧ−３”　）ヲ用いて、８３６ｂｐ　ＰＣＲ断片を誘導した 。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド４８８がら１３２７ と一致する（スチュワードら、１９８Ｂ）。オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−２ （配列認識番号３１７）の使用により、位置１３０１から１３０９でのヌクレオ チド配列をＧＡＴ５　ＧＴをＧＡＡＴＴＣＴＧＴに変更する。この変更により、 ポックスウィルス初期転写終止信号（ユエンとモス、１９８７）として認識され るＴ５ＮＴ配列モチーフを除去し、この位置でのＥｃｏＲＩ制限部位を導入する 。これらのヌクレオチド操作は、グルタミン酸からアミノ酸４１４を保存アミノ 酸アスパラギン酸に変化せしめる（スチュワードら、１１８Ｂ）。これらのヌク レオチド変化によりアミノ１！Ｒ４１５は変更されない。この８３６ｂｐの断片 をＨｉｎｄｌｌｌとＥｃｏＲＩで切断し、ＦｅＬＶ−ＡｅｎＶ遺伝子のヌクレオ チド５３２から１３０２に対応する７７０ｂｐの断片を産生じた。テンプレート としてのｐＦＧＡ−５およびオリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−３（配列認識番号 ３１９） （５’　−ＧＧＴＧＣＴＣＡＡＴＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＡＡＴｒＣｒＧＴＧＴＣ ＴＴＡＡＴＣＧＡＡＴＸ’ＡＴＧＧ−３’　）とＦＥＮＶＡ−４（配列認識番号 ３２０）（５１−＾ＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＧ’Ｊ’ＣＧＧＴＣＣＧ Ｇ−３’　）を用いて、７０９ｂｐのＰＣＲ断片を誘導した。この断片は、Ｆｅ ＬＶ−Ａ　ｅｎｖ遺伝子のヌクレオチド１２８１から１９９０と一致する（スチ ュワードら、１９８Ｂ）。この断片を増幅するためにオリゴヌクレオチドＦＥＮ ＶＡ−３（配列認識番号３１９）を用いて、Ｔ５ＮＴ要素を変更し、上述したよ うに、８３６ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片のためにＥｃｏＲ１部位を導入する。７０９ ｂｐの断片をＥｃｏＲ’１／Ｈｉｎｄｌｌｌで切断し、産生じたプラスミドを、 ８３６ｂｐ断片（上記）から誘導した７７０ｂｐ　Ｈｉｎｄ１１１／ＥｃｏＲＩ 断片とともに、ＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＢＳ−ＳＫ　（ＣＡ、ラジョラ、ス トラタジエネ）に挿入した。産生じたプラスミドをｐＦ３Ｂｓ１−Ｂと称し、Ｆ ｅＬＶ　ｅｎｖ配列をヌクレオチド配列分析により確認した。

ワクシニアウィルスＨ６プロモーターに正確に連結した金縁”ＰｅＬＶ−Ａ　ｅ ｎｖ遺伝子を再構成するために、１゜５ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩ！断片をｐＦ３ＢＡ １−Ｂがら単離した。この断片は、ＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖのヌクレオチド５３２ から１９９０と一致する（スチュワードら、１９８Ｂ）。

１．５ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩ！断片をＨｉｎｄｌｌｌで切断したｐＨ６ＦＡ−１に 連結した。１．５ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩＩ断片を含有するプラスミド構成物を、制 限分析により適切な配位でスクリーニングし、Ｈ６プロモーターに連結した金縁 無傷ＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ遺伝子を含有するプラスミドクローンをｐＨ６ＨＡ− ３と称した。

２．２ｋｂ　Ｈ６／ＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ発現カセツテを、ＥｃｏＲＩでの部分 的な切断と、Ｈｉｎｄｌｌｌでの部分的な切断によりｐＨ６ＦＡ−３から切除し た。この断片を、ＨｉｎｄｌｌｌとＥｃｏＲＩで切断したｐ　ＲＷ８３１に挿入 した。産生じたプラスミドをｐＣ５ＦＡと称した。

ｐ　ＲＷ８３１は、異種遺伝子を０５読取り枠に挿入させるＡＬＶＡＣ（ＣＰｐ ｐ）挿入プラスミドを指す。この領域への挿入工程において、ｐＲＷ８３１の使 用により、Ｃ５読取り枠のほとんどが欠損せしめられる。ｐ　ＲＷ８３１を産生 するために、以下の操作を行なった。カナリヤポックスウィルスゲノムからの８ ８０ｂｐ　ＰｖｕｌＩゲノム断片をｐＵＣ９のＰｖｕＩＩ部位の間に挿入した。

産生じたプラスミド、ｐＲＷ７６４．５内に含有されたカナリヤポックスウィル ス配列をヌクレオチド配列分析により分析し、で５読取り枠を定義した。この座 で組換え体を操作するために、事前に、Ｃ３０ＲＦ内に位置する１対のＢｇＩ１ １部位の間の挿入を用いた（ティラーら、１９９２）。金縁領域の配列を第１６ 図に示す（配列認識番号２２０）。

ヌクレオチド配列（配列認識番号２２０）はＰｖｕｌＩ部位で開始する。Ｃ５０ ＲＦは位置１６６で開始し、ヌクレオチド４８７で終止する。これらの配列の正 確な操作により、ヌクレオチド１６７から４５５の欠損をすることができる。そ のような欠損は、他のウィルス遺伝子の発現を妨害しないように行なった。

ｐ　ＲＷ８３１を誘導する方法を以下のように行なう。ｐＲＷ７６４．５をＲｓ ａｌで部分的に切断し、線状化された断片を単離する。Ｒｓａｌ線状断片をＢｇ ｌｌＩＩで再切断した。産生じた２、９ｋｂ　Ｒｓａｌ／ＢｇｌＩＩ断片（ヌク レオチド１５６から４６２が欠損した）を単離し、アニールしたオリゴヌクレオ チドＲＷ１４５（配列認識番号１０７）およびＲＷ１４６（配列認識番号１０８ ）ｌ：ｌ：連結した。産生じたプラスミドはｐＲＷ８３１と称し、ｃ５配列の場 所に、特有のＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩ部位を有する配列を 含有する。

プラスミドｐＣ５ＦＡを、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）ととも に生体外組換え実験に用いた。放射線標識したＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ特異的プロ ーブを用いた現場でのプラークハイブリダイゼーションにより組換えプリダイゼ ーション確認後、組換え体をｖＣＰ８３と称した。

実施例５２−ｐ１５Ｅの推定免疫抑制領域が欠如したＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ 　ＥＮＶ組換エウイルスの産生 推定免疫抑制領域は、ＦｅＬＶエンベロープ糖タンパク質のｐｌｓＥ膜内外領域 内に位置する（シアンシオロら、１９８Ｂ　、マセスら、１９７ｇ）。この領域 は以下の方法により欠損せしめた。ヌクレオチド１２８２から１６０２のＦｅＬ Ｖ−Ａｅｎｖ配列（スチュワードら、１９８Ｂ）は、オリゴヌクレオチドＦＥＮ ＶＡ−３（配列認識番号３２０）およびｌ５−Ａ（配列認識番号４６８） （５’　−ＴＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧ−３’　）を用いたＰＣＨに よりｐＦＧＡ−５から増幅した。ヌクレオチド１６８４から１９９０のｅｎｖ配 列（スチュワードら、１９８Ｂ）は、オリゴヌクレオチドＦＥＮＶＡ−４（配列 認識番号３２０）およびｌ５−Ｂ　（配列認識番号３２３）（５１−ＧＣＧＧＡ ＴＣＡＣＡ　ＣＣＧＧＡＣＴＣ−３１）を用いたＰＣＲによりｐＦＧＡ−５から 増幅した。前者のＰＣＲ誘導断片は、ＥｃｏＲＩで切断し、後者はＨｉｎｄＩＩ Ｉで切断し、続いてＡＴＰＡＴ４キナーゼでキナーゼした。これらの断片を、） ＩｉｎｄｌＩＩとＥｃｏＲｉで切断したｐＢＳ−５Ｋにともに連結した。産生じ たプラスミドは＝ヌクレオチド配列分析により確認し、ｐＢｓＦＡＩＳ−と称し た。上述した断片の連結は、配列５′および３′を、推定免疫抑制領域をコード する８１ｂｐのＤＮＡ断片に結合させ、それゆえ、免疫抑制ペプチドをコードす る配列を欠損せしめる。

免疫抑制領域をコードする領域が欠如したＦｅＬＶ−Ａ配列を５ｓｔｌＩ／Ａｐ ａＩでの切断によりｐＣ５ＦＡから切除した。この３８１ｂｐの断片をｐＢｓＦ ＡＩｓ−からの３００ｂｐ　５ｓｔｌＩ／ＡｐａＩ断片により置換した。行なっ た連結は、ｐＣ５ＦＡからの４．８ｋｂ　５ｓｔｌＩ／ＡｐａＩ断片と上述した ３００ｂｐ断片によるものであった。産生じたプラスミドをｐｃ５ＦＡＩｓＤと 称した。

プラスミドｐｃ５ＦＡＩ　ＳＤは、治療ウィルスとしてのＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ ）とともに組換え実験に用いた。放射線標識したＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ特異的プ ローブを用いた現場でのハイブリダイゼーションにより組換えウィルスを同定し た。３回のプラーク精製後、組換え体をｖＣＰ８７と称した。この組換え体は、 推定２７アミノ酸免疫抑制領域をコードする領域が欠如したＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎ ｖ遺伝子を含有する。この遺伝子を０５座に挿入した。

実施例５３−ＡＬＶＡＣ−ＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇ組換えウィルスの産生 ＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇ／ｐｏｌ配列をプラスミドｐＦＧＡ−’Ｉ　ｇａｇから誘 導した。このプラスミドは、ＬＴＲ（６５１ｂｐ）配列の部分、金縁ｇａｇ遺伝 子、およびｐｏ１遺伝子の１２７２ｂｐを含有する３、５ｋｂ　Ｐｓｔｌサブ断 片をサブクローニングすることによりＦｅＬＶ−Ａ感染クローンｐＦＧＡ−２（ スチュワードら、１９８Ｂ）から誘導した。３．５ｋｂ断片をＰｓｔＩで切断し たｐＵＣ８（ＭＤ、ゲイサースブルグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ）に挿 入した。最初にこの３．５ｋｂ　ＰｓｔｌＦｅＬＶ−Ａ　ＤＮＡ断片を単離し、 ｐＢｓ−３Ｋ　（ＣＡ。

ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生じたプラスミドをｐ　Ｂ　Ｓ　Ｇ ＡＧと称した。ヌクレオチド配列（配列認識番号３２４）（第２７図）分析によ り金縁３．５ｋｂ挿入物を分析し、開始コドン（第２７図に下線を引いたヌクレ オチド６５２から６５４）およびＦｅＬＶ−Ｂ（レプロベツテら、１９８４）に 関して以前に記載したｇａｇ領域のヌクレオチド配列内に定義された関連制限部 位の位置を確認した。

プラスミドｐＦＧＡ−２ｇａｇをＢｇｌＩＩとＰ、ｓｔＩで切断し、２．５ｋｂ 断片を雌牛じた。ＢｇｌＩＩは、ヌクレオチド位置１０７６　（配列認識番号３ ２４）での部位を認識し、一方Ｐｓｔｌは、ＦｅＬＶ−Ａ挿入物の末端での部位 を認識する。２．５ｋｂ団便を単離し、共移動プラスミド配列内の部位を認識す るＰｓｔＩとＨｉｎｄｌｌＩで再切断した。これにより、プラスミド配列の続い ての連結反応を競合する能力が除去された。

ＰＣＲを用いてＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇ暗号配列の５′末端を誘導した。プラスミ ドｐＦＧＡ２　ｇａｇは、オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＢＧＬ　（配列認識番号 ３２５）（５１−ＧＡＴＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＴＡＡＴＧ−３’　）およびＦＧ ＡＧＡＴＧ　（配列認識番号３２６）（５’−ＣＧＡＴＡＴＣＣＧＴ’ｒＡＡＧ ＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＣＴＡＧＴＧ）とともにテ ンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＡＴＧ　（配列認識番号 ３２６）は、ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの３′側の２５ヌクレオチド を含有し、その５′末端でのＮｒｕ１部位の３′側３ｂｐを含有する。これらの Ｈ６配列は、ＡＴＧ　（開始コドン）で正確に結合し、ヌクレオチドはｇａｇ暗 号配列の最初の１６ヌクレオチドに一致する。オリゴヌクレオチドＦＧＡＧＢＧ Ｌ（配列認識番号３２５）は、ｇａｇ配列中の特有のＢｇ１１１部位から５９ｂ ｐ下流の配列の逆補体と一致する（レブレボッテら、１９８４）。これらの試薬 を用いたＰＣＨにより、続いてＢｇｌＩＩで切断されて４５０ｂｐ断片を産生す る５００ｂｐ断片を産生じた。

４５０ｂｐ　ＢｇｌＩＩ切断ＰＣＲ誘導断片を、ｇａｇ遺伝子の残りとｐｏｌ遺 伝子の部分を含有する２、５ｋｂＢｇｌｌｌ／Ｐｓｔｌ断片、およびＮｒｕｌと Ｐｓｔｌで切断したｐｃＰｃＶｌ　（上記ｅｎｖ構造）と共連結した。

ｐｃＰｃＶｌ　（Ｎｒｕ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ）は、Ｎｒｕ　Ｉ認識信号の５′側 の３ｂｐを含有するワクシニアウィルスＨ６プロモーターの５′部分を含有する 。産生じたプラスミドをｐ　Ｃ３Ｆ　ＧＡＧと称した。

プラスミドｐＣ３ＦＧＡＧを、ＰｓｔＩで線状化し、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ でプラントエンドし、ｐｓＤ５１３（実施例７に定義した）から切除した１００ ｂｐ　５ｓｐｉ／Ｓｍａｌ断片に連結した。１ｏｏｂｐの５ｓｐｌ／Ｓｍａ　Ｉ 断片により、ＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇ／ｐｏｌ配列の３′末端で終止コドンが提供 される。産生じたプラスミドをｐＣ３ＦＧＡＧＶＱと称した。

ＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇ／ｐｏ１発現カセツテを、Ｅｃ。

Ｒ１とＨｉｎｄｌＩＩでの切断によりｐＣ３ＦＧＡＧＶＱから切除した。産生じ た３、４ｋｂ断片を単離し、Ｅｃ。

Ｒ１とＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉで切断したｐＣ３Ｉ　（実施例３２に定義した）に連 結し、ｐｃ３ＤＯＦＧＡＦＶＱを産生じた。

プラスミドｐｃ３ＤＯＦＧＡＧＶＱを、治療ウィルスと−してのｖＣＰ８３とｖ ＣＰ８７とともに生体外組換え実験に用いた。ＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇ／ｐｏｌ配 列および金縁ＦｅＬＶ−Ａ　ｅｎｖ遺伝子を含有する組換え体はｖＣＰ９７と称 し、一方同一のｇａｇ／ｐｏｌ配列および免疫抑制領域が欠如した金縁ＦｅＬＶ −Ａ　ｅｎｖを含有する組換え体をｖＣＰ９３と称した。

実施例５４−ＦｅＬＶ−Ａ　ｇａｇのワクシニアウィルスバックグラウンドへの 挿入 ｐ’ｃ：３ＦＧＡＧ（上記）からの３．３ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ１１１断 片をｐＳＤ５５３（７）ＳｍａＩ部位ニ部位−クローニングとにより、挿入プラ スミドｐｃＥＮ１５１を産生した。２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でのＥ、ｃｏｌｉ 　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片によりその断片をプラントエンドした後に 、この挿入を行なった。

プラスミドｐＳＤ５５３は、Ｃ０ＰＡＫシリーズのワクシニア欠損／挿入プラス ミドである。このプラスミドは、フランキングコペンハーゲンワクシニアアーム 内のワクシニアＫＩＬ宿主域遺伝子（ギラードら、１９８Ｂ　、パーカスら、１ ９９０）を含有し、ＡＴＩ領域（ＯＲＦ　Ａ２５ＬＳＡ２６Ｌニゲ−ベルら、１ ９９０ａ、　ｂ）を置換する。ｐＳＤ５５３は以下のようにして構成した。プラ スミドｐＳＤ５４１のワクシニアＡＴＩ欠Ｉｉ座に位置するポリリンカー領域（ 実施ＮＩＯに定義した）を以下のように拡張した。ｐＳＤ５４１をＢｇ　１１１ ／Ｘｈｏ　Ｉで切断し、アニールした相補合成デオキシオリゴヌクレオチドＭＰ ＳＹＮ３３３　（配列認識番号３２９） およびＭＰＳＹＮ３３４　（配列認識番号３３ｏ）に連結し、プラスミドｐＳＤ ５５２を産生じた。ＫＩＬ宿主域通伝子を、プラスミドｐＳＤ４５２がらのｌｋ ｂ　Ｂｇｉｌｌ（部分的）／ＨｐａＩ断片として単離した（バーカスら、１９９ ０）、ｐＳＤ５５２を、Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ／Ｈｐａ　Ｉで切断し、断片を含有す るＫＩＬに連結し、Ｉ）ＳＤ５５３を産生じた。

プラスミドｐｃＥＮ１５１を、治療ウィルスとしてのＶＰ８６６とともに生体外 組換え実験に用いてｖＰｌｏｌｌを産生した。

実施例５５−ＡＬＶＡＣ組換えウィルスにおけるＦｅＬＶＥＮＶおよびｇａｇ遺 伝子の蛍光抗体法およびイムノブレシピテーション分析 イムノブレシピテーション ベロ細胞単層を、１０ｐｆｕ／細胞に等しいｍ、ｏ、ｉ。

で親または組換えウィルスに感染せしめた。感染がら１時間後、接種物を吸引し 、（３５Ｓ）−メチオニン（ＭＡ。

ボストン、デュポン；１０００　Ｃｉ／ｍモル）、２ｏμＣｉ　／　ｍ　ｌを補 給したメチオニン不含ａ培地を加え、さらに感染から１８時間後までインキュベ ーションした。ウシ抗ＦｅＬＶ血清（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）または ｐ２７コアタンパク質に特異的な単クローン性抗体（ＧＡ１アテネ、ローンメリ クスから得た）を用いて、イムノブレシビテーションおよび蛍光抗体法分析を前 述したように行なった。

ＦｅＬＶウィルスの単離 １°白目に、３Ｘ１０’　ＱＮＩＯ細胞／ウェルを、ＨＥＦＰＥＳ緩衝液（ＤＦ Ｂ）　、１０％のＦＢＳ、および４μｇ／ｍｌのポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎ ｅ）を含有する１ｍｌのダルベツコＭＥＭ中の１２ウエル板に展開した。細胞を ３７℃で一晩インキユベーションした。培地を取り除くことなく、２００μｌの 試料（ネコ血漿）を各ウェルに加えた。３７℃の２時間のインキュベーション後 、培地を１．５ｍｌ新鮮なのＤＦＢと置き換えて、さらに３７℃でシンキュベー ションした。５日目に、板を転換に関して検査した。陰性の場合には、培地を１ ．５ｍｌの新鮮なりＦＢと置き換えて、さらに３７℃でシンキュベーションした 。

８日目に、板を転換に関して再検査した。陰性の場合には、トリプシン−ＥＤＴ Ａでの２回の洗浄により細胞を分散せしめ、５ｃｍの板への接種のための４ｍｌ のＤＦＢ中に配することにより、細胞を５ｃｍの板に継代培養せしめた。

転換の検査の前に、細胞を３７℃で４時間に亘りインキュベーションせしめた。

蛍光抗体法によるＦｅＬＶ抗原の検出 血液スミアを一２０℃で５分間Ｍ　ｅ　ＯＨ中に固定し、ｄＨ２０中で洗浄し、 次いで空気乾燥せしめた。２４μｌのウサギ抗ＦｅＬＶ抗体を、ダイアモンドベ ンでスミア上に記した円内に血液スミアを施した。ＰＢＳで３回、ｄＨ２０で１ 回の洗浄の前に、抗体の存在下で加湿器中、１時間、３７℃でスミアをインキュ ベーションした。次いでスミアを空虹感想せしめた。２５μｍのヒツジ抗ネコＩ 　ｇＧ−ＦＩＴＣを円に施し、主要抗血清とともに上述したようにインキュベー ションした。紫外線光源での顕微鏡による蛍光抗体法の検査の前に、試料を洗浄 し、主要抗血清について上述したように乾燥せしめた。

ＦｅＬＶ抗体中和アッセイ １日目に、５ｘｌＯ’　ＱＮＩＯ細胞／ウェルを、１ｍｌのＤＦＢと４μｇ／ｍ ｌのポリブレン中の１２ウエル板に展開した。細胞を３７℃でインキュベーショ ンした。５０μｌのレイボウィッッ培地を用いて、１：２から１：２５６までの 血清希釈物を丸底９６ウエル板中に調製した。１ｍｌ当たり４Ｘ１０’フオ一カ ス形成単位（ｆｆｕ）での５０μｌのＦｅＬＶ−Ａを加えた。２つのウェルをウ ィルス対照として血清のない培地とともにインキュベーションした。板を３７℃ で２時間インキュベーションした。２時間の吸着期間後、２５μｌの各希釈物を ＱＮＩＯ細胞のウェル中に配した。ＱＮＩＯ細胞への２５μｌの接種の前に、９ ６ウエル板中のレイボウィッッ培地の５０μｌ中で１：２、に４．１：８および １：６で希釈することによりウィルス対照を滴定した。３日間、３７℃で板をイ ンキュベーションした。１日目に培地を１ｍｌのＤＦＢ／ウェルと置き換えた。

２日後に、フォーカスを顕微鏡で数えた。ウィルス対照と比較したフォーカスの 数が７５％減少した血清の希釈物として、中和抗体抗体滴定を評価した。

ＶσＰ８３およびｃｃＰ８７により発現されたｅｎｖ遺伝子産生物が感染細胞の 形質膜に運搬されたか否かを決定するために、前述したように蛍光抗体性実験を 行なった（ティラーら、１９９０）　、主要ＣＥＦ単層を、親（ＡＬＶＡＣ）ま たは組換えウィルス、ｖＣＰ８３およびｖＣＰ８７に感染せしめ、感染から２４ 時間後に、ウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いて蛍光抗体法を行なった。結果により、ｖ ＣＰ８３に感染した細胞は、強い表面蛍光着色を示し、ｖＣＰ８７または親ＡＬ ＶＡＣに感染した細胞は著しい表面着色は示さなかったことが分かった。

ウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いて、イムノブレシピテーション分析により、ＦｅＬＶ 　ｅｎｖ遺伝子産生物の発現もまた分析した。未感染ＣＥＦまたは親ＡＬＶＡＣ ウィルスに感染したＣＥＦから誘導した溶解産物からはＦｅＬＶ特異的タンパク 質踵は沈殿しなかった。ｖＣＰ８３感染細胞からは、８５ｋＤａ、７０ｋＤａ、 および１５ｋＤａの見かけの分子量を有する３つのＦｅＬＶ特異的特異的タンパ 性質した。この結果は、前駆体ｅｎｖ遺伝子産生物（８５ｋＤａ）および熟成開 裂産生物ｐ７０およびｐ１５Ｅの発現と一致するものである。ｖＣＰ８８感染細 胞から誘導した溶解産物からのイムノブレシピテーションにより、８３ｋＤａの 見かけの分子量を有する１つのＦｅＬＶ特異的タンパク質種が示された。これは 、推定免疫抑制領域の欠損後に予期されたサイズの非タンパク質分解加工ｅｎｖ 遺伝子産生勃の発現に一致するものである。手順にいうと、免疫抑制領域の欠如 したｅｎｖの発現は、感染細胞の表面には明らかに適切には運搬されず、または 熟成ｅｎｖ特異特異的タンパ形質形状タンパク質分解的に開裂されない。

ｐ２７コアタンパク質（Ｄ５）内のエピトープに特異的な単クローン性抗体およ びウシ抗ＦｅＬＶ血清を用いたイムノブレシピテーションにより、ＦｅＬＶ　ｇ ａｇ特異的遺伝子産生物の発現を分析した。未感染細胞または親ウィルスに感染 した細胞から誘導した溶解産物からは、ＦｅＬＶ特異的特異的タンパ性質しなか った。Ｄ５およびウシ抗ＦｅＬＶ血清により、ｖＰｌｏｌｌ、ｃｃＰ９３、およ びｖＣＰ９７に感染した細胞からは、５５ｋＤａのＦｅＬＶ特異的タンパク質種 が沈殿した。これらの見かけの分子量のタンパク質種は、ｇａｇ特異的前駆体形 状と一致する。

熟成ｐ２７コアタンパク質のサイズに一致する低水準の２７ｋＤａタンパク質種 もまた明確であった。

実施例５６−ｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７の体内評価組換えウィルスの２回の接 種後のネコの生ＦｅＬＶ抗原投与によりｖＣＰ９３およびｖＣＰ９７の防御効果 を評価した。０日と２８日の皮下経路の１０’ＰＦＵにより、ＡＬＶＡＣベース のＦｅＬＶ組換え体を投与した。追加抗原投与接種後から７日目に、相同ＦｅＬ Ｖ−Ａ菌株（グラスゴー１）を目鼻投与によりネコに抗原投与した。ＦｅＬＶ抗 原血症（ｐ２７検出）、ＦｅＬＶ単離、蛍光抗体法による白面法（ＷＢＣ）スミ ア中のＦｅＬＶ抗原の存在、およびＦｅＬＶ中和活性の誘発の評価のために、抗 原投与の前と後に、血液試料を得た。

ＡＬＶＡＣ（カナリヤポックスウィルス）ベースの組換えウィルス、ｖＣＰ９３ およびｖＣＰ９７によるワクチン接種後には、副作用は観察されなかった。６つ の非ワクチン接種対照の全ては、ＦｅＬＶ抗原投与のために死亡し、抗原投与の 露出後３週間で持続性のウィルス血症を発達せしめた。これは、血液中のｐ２７ 抗原の検出、ＦｅＬｖの単離およびＷＢＣスミアの蛍光抗体法によるＦｅＬＶ抗 原の検出により証拠付けられた（表３２）。非ワクチン接種の対照は、研究の残 りの期間に亘り感染し続けた（抗原投与後１２週間まで）。

持続性のウィルス血症は、抗原投与から３週間後にｖＣＰ９３をワクチン接種し た６匹のネコのうち３匹に発達した。この時点で、これらの３匹のネコからの血 液のサンプリングにより、ｐ２７抗原および／または生ＦｅＬＶを含有すること が示された（表３２）。これらのネコのうち１匹（２番）は、感染から６週間後 にこの感染がら解放され、抗原投与から１２週間後までウィルス血症のないまま でいた。他の２匹のネコ（１番と５番）は、３つの分類基準、ｐ２７抗原血症、 ＦｅＬＶの単離、およびＷＢＣ中のＦｅＬＶ抗原検出により持続的に感染したま まであった。ｖＣＰ９３をワクチン接種した６匹のネコのうち３匹（３番、４番 −′および６番）は、抗原投与から９週間に亘り持続性ウィルス血症には感染し ないままでいた（表３２）。これらのネコのうち２匹（３番と６番）は、抗原投 与後から１２週間に亘り循環ウィルスのないままであったが、一方で１匹のネコ （４番）は、１２週間目に突然感染した。ｖＣＰ９３でのワクチン接種により、 持続性ウィルス血症に対して部分的な防御（６匹のネコのうち３匹）が与えられ た。

最も印象的なことには、ｖＣＰ９７をワクチン接種した６匹のネコ全てが、Ｆｅ ＬＶ−Ａ（グラスゴー１）による相同抗原投与に対して完全に防御された。これ らのネコのうち１匹のみ（１２番）が、持続性ウィルス血症の様子を示した。ｐ ２７抗原が血液試料中に検出された（表３２）抗原投与から３週間後に生じた。

抗原投与後に、このネコの血液からは生ＦｅＬＶは決して単離されなかった。他 のネコは、抗原投与露出から１２週間に亘り、ｐ２７抗原血症がなく、生ＦｅＬ Ｖがなく、ＷＢＣスミア中にＦｅＬＶ抗原を決して示さなかった（表３２）。

ＦｅＬＶ中和抗体の進化 ＦｅＬＶ感染に対する防御における中和抗体の潜在的な役割のために（ラッセル およびジャレット、１９７８；ラップら、１９８０）　、そのような応答の発生 は抗原投与の前後に監視された。ｖＣＰ９３またはｖＣＰ９７のいずれかでワク チン接種された研究におけるネコは、ＦｅＬＶ抗原投与前には、中和抗体力価を 示さなかった（表３３）。抗原投与後に、′持続性ウィルス血症を発達せしめた どのネコも、検出可能な中和抗体力価を示したものはいなかった。驚くべきこと に、持続性感染に対して防御されたネコは、ＦｅＬＶ特異的血清中和力価を発達 せしめた（表３３）。これらの力価は、抗原投与後に防御された全てのネコにお いて著しく増大し、研究の終止時点である抗原投与から１２週間後に、高水準で あることが観察された（表３３）。

表　３２ ネコ白血病ウィルスの抗原投与に対するネコの応答１こ　文・・な　日　“ １、　ｖＣＰ９３：　１　−−　−−　＋＋　−◆◆　＋＋＋　＋＋＋Ｆｅｌか Ａ２−−−−−−　−１−−一一−−−−−鉦ｙ（ＩＳ−）　３　−−　−−　 −−　−−　−−−　−−一　−−−５−一　−−−一　＋＋　”◆◆　＋＋＋ 　＋＋＋２、　ｖＣＰ９７：　７　−−　−−　−−　−一　−−一　＋＋＋　 ＋＋−Ｆｅｌｖ−Ａ、　１３　−−　−−　−−　−−　＋＋＋　＋＋＋　＋＋ ＋東ｗ（ＩＳ＋）　９　−−　−−　−−　−−　−−−　−−−　−−−十９ 旦ｑ八２Ｑｌ　１０　−−　−−　−−　−−　−’−−−−−−−１２−−− −−一　奉−−−−−−−−−−表　３２（続き） 抗原投与に相対的な時間（週） −５−２０＋３　＋６　＋９　＋１２ 群　ネコノ番号Ｅ’Ｖ’　ＥＶ　ＥＶ　Ｅｌｉ／　Ｆ３ＥＶ　ＦＥＶ　ＦＥＶ３ 　ワクチン未接種の対照 １Ｅ−血しょう中ｃ７）ＰｅＬＶｐ２７抗原（ＥＬＩＳＡ）■−血しょう中の感 染ウィルス（ウィルス単離）Ｆ−血液スミア中のＰｅＬＶ抗原（蛍光抗体法）表 　３３ 抗原投与に相対的な週 群　ネコの番号　−５−２０＋３　＋６　＋９　＋１２１フオーカスの数が７５ ％減少せしめた血清の希釈として示した実施例５７−ＦＨＶ−１ｇＤ糖タンパク 質を発現するＮＬＶＡＣベースの組換え体の産生 ワクシニアウィルスＩ３Ｌプロモーターの制御下で、ＦＨＶ−１ｇＤ相同遺伝子 のＡＬＶＡＣベクターへの挿入により、１型ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ−１ ）　ｇＤ糖タンパク質の発現を行なった。カセツテＩ　３Ｌ−ＦＨＶ−１ｇＤを ＡＬＶＡＣに挿入するのに必要とされる供与体プラスミドを以下のように産生じ た。

ＦＨＶ−Ｉ　ＣＯ菌株ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで完全に切耐し、断片Ｍ（４４ ８０ｂｐ）をアガロースゲルから切除しく遺伝子洗浄方法）、ＥｃｏＲＩで切断 してホスファターゼしたベクターｐＢＳ−ＳＫ＋にクローニングした。

ＦＨＶ−Ｉ　ＥｃｏＲＩ　Ｍ断片を含有する、産生じたプラスミドをｐＨＦｅＭ ２と称した。修飾Ｔ７酵素シーケナーゼ（米国バイオケミカル社）を用いて、両 鏡のＦＨＶ−Ｉ　ＥｃｏＲＩ　Ｍ断片完全ヌクレオチド配列を、ベクターｐＢＳ −８Ｋ＋に挿入されたＦＨＶ−Ｉ　ＥｃｏＲＩＭ断片のいくつかのサブクローン から得た（ティパーおよびリチャードソン、１９８７）、０．４Ｍ−ＮａＯＨ中 で変性せしめられた二本鎖テンプレートを用いて、標準ジデオキシヌクレオチド 鎖終止反応（サンガーら、１９７７）を行なった（ハラトリおよびササキ、１９ ８Ｇ）。Ｍ１３順および逆プライマーを用いて、各クローンの最初の配列を得た 。標準化学Ｍ（バイオリサーチ８７００およびアプライドバイオシステム３８０ Ｂ）を用いて合成した、注文プライマー（１８ｍａｒ）を続いての配列反応に用 いた。続発性断片間の接合の配列を、最初のクローン、ｐＨＦｅＭ２で確認した 。全ての配列データ分析に、Ｐｃ＼ＧＥＮＥ　（インテリジエネティックス）お よびＩＢＩパステルソフトウェア−パッケージを用いた。スイスプロトリリース １８．。

（インテリジエネティックス）に対するＰＡＳＴＰプログラム（リップマンおよ びベアーソン、１９８５）に関して、相同探求を行なった。ＦＨＶ−Ｉ　Ｃｏ菌 株ｇＤ相同遺伝子テンプレートとしてのプラスミドｐＨＦｅＭ２およびオリゴヌ クレオチドＪＣＡ２３４　（配列認識番号３３１）（５１−ＡＴＧＡＴＧＡＣＡ ＣＧＴＣＴＡＣＡＴｒＴｒ−３雪）とＪＣＡ２３５　（配列認識番号３３２）（ ５’　−ＴＧＴＩ’ＡＣＡＴＡＡＣＧＴＡＣＴＴＣＡＧＣ−３１）を用いて、Ｆ ＨＶ−１ｇＤ暗号配列１７）１８５ｂｌ）　５’側領域を誘導し、ＢａｍＨＩで 切断した。この１８５ｂｐ断片を、プラスミドｐＭＰ６９１　（１３Ｌ１０１Ｒ ＡＢ）およびオリゴヌクレオチドＭＰ２８７　（配列認識番号２２（５’−ＧＡ ＴＴＡＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴｒＧＴ−３１）とＪＣＡ１５８（配列認識番号 ２２５）（５’　−ＴＩＴｒＴＣＴＡＧＡＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＡＣＡＴＣ ＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＪ野Ｃ−：ｌ　’　）を用いて得た１３Ｌプロモータ ー要素を含有する１２０ｂｐのＰＣＲ誘導断片に融合し、Ｘｂａｌで切断した。

１８５ｂｐおよび１２０ｂｐ断片を、ＸｂａｌとＢａｍＨＩで切断したベクター ｐＢＳ−５Ｋ＋中にともに連結し、プラスミドｐＪｃＡＯ７１を産生した。接合 部１３Ｌ−ＡＴＧおよびＦＨＶ−１ｇＤ５’側領域のＩ３Ｌプロモーターの配列 を、ｐＪｃＡＯ７１の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドｐＪｃＡ Ｏ６７は、ＦＨＶ−Ｉ　ＥｃｏＲＩ　Ｍ断片のサブクローンである。以下のよう にしてそのプラスミドは産生された。プラスミドｐＨＦｅＭ２をＢａ”ｍＨ！で 切断し、１８５０ｂｐ　ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨ１断片をアガロースゲルから切除 し、ＢａｍＨＩで切断したｐＢＳ−５Ｋ“に連結した。このクローンは、ＦＨｖ −１ｇＤの３′領域およびさらなる下流の配列を含有する。プラスミドｐＪｃＡ Ｏ６７をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、１２７０ｂｐのＢａｍＨＩ−ＦＨＶ− １ｇＤ３′−領域−ｇＩ　５’領域−Ｘｈｏｌ断片を切除した。

この断片をＢａｍＨＩとＸｈｏｌで切断したベクターｐＢＳ−３Ｋ＋に連結し、 ｐＪｃＡＯ７２を産生した。テンプレートとしてのプラスミドｐＨＦｅＭ２およ びオリゴヌクレオチドＪＣＡ２３７　（配列認識番号３３３）（５１−ＡＡ胃胃 ＣＴＣＧＡに入ＡＧＣＴＴＧＴＴ入入Ｃ入入入入ＡＴＣＡＴＴＡＡＧＧ入ＴＧＧ Ｔ入Ｇ入ＴｒＧＣ入ＴＧ−３曹）とＪＣＡ２４２　（配列認識番号３３４）（５ １−ＧＡＧＧＡＴｒＣＧＭＡＣＧＧＴＣＣ−３・）を用いたＰＣＲにより３′側 ２９０ｂｐ（７）ＦＨＶ−０１ｇＤ暗号配列を誘導した。これら注文合成したオ リゴヌクレオチドによるこの断片の合成は、１）ＦＨＶ−１ｇＤの３′側の配列 および５′末端でのＸｂａ１部位を含有し、２）ＦＨＶ−１ｇＤ暗号配列ノ３′ 末端に、７５　ＮＴ要素および特有のＨｐａｌ、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　１並びにＸｈ ｏ１部位を加える。この断片をＸｂａｌとＸｈｏｌで切断し、ＸｂａＩとＸｈｏ ｌで切断したプラスミドｐＪｃＡＯ７２から得た３５７５ｂｐ　Ｘｂａｌ−Ｘｈ ｏｌ断片１；：より連結しｈ０産生じたプラスミドをｐ　Ｊ　ＣＡＯ７３と称し た。

ＦＨＶ−１ｇＤの２９０ｂｐ　Ｘｂａｌ−−＞Ｘｈ。

１部分の配列を、ｐＪｃＡ０７３の直接塩基配列決定法により確認した。プラス ミドｐＪｃＡＯ７１をＳｍａ　ＩとＢａｍＨＩで切断し、３０５ｂｐ　Ｓｍａｌ −Ｉ３Ｌ−ＦＨＶ−１ｇＤ　５’側領域−ＢａｍＨＩ断片を切除した。

プラスミドｐＪｃＡＯ７３をＢａｍＨＩとＸｈｏｌで切断し、９７０ｂｐのＢａ ｍＨＩ−ＦＨＶ−１ｇＤ　３’領域−Ｘｈｏｌ断片を切除した。Ｓｍａｌ−Ｂａ ｍＨＩ　３０５ｂｐ断片とＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ　９７０ｂｐ断片を最終的にベ クターｐＣＰＣ６Ｌ　（Ｃ６ｄｅｏｒｆｅｄ座；ｐｃＰｃ６Ｌ１７）産生の他＋ ７）ＡＬＶＡＣＣ６供与体プラスミドを参照）中にともに連結し、ＳａｍｌとＸ ｈｏｌで切断した。この連結により産生じたプラスミドをｐ　Ｊ　ＣＡＯ８４と 称した。

プラスミドｐＪｃＡＯ８４を、治療ウィルスとしてのＣｐｐｐとともに主要ひな 胚胎繊維芽細胞における生体外組換え実験に用いてｖｃＰ１６２を産生した。放 射線標識ＦＨＶ−１ｇＤ特異的プローブを用いた標準方法（ピッチｍ＝ら、１９ ８７）にしたがった現場でのハイブリダイゼーションにより組換えウィルスを同 定した。組換え体プラークを３回のプラーク精製により精製し、さらなる分析の ために増幅した。組換えウィルスｖｃＰ１６２は、カナリヤポックスウィルスの ０６座にＦＨＶ−１ｇＤ暗号配列を含有す名。

実施例５８−ｖｃＰ１６２の発現分析 フランス、ローンメリクス、Ｄ、ファーギュードから得たヒツジ抗ＦＨＶ−１ｇ Ｄ多りローン性血清を用いて前述したように（ティラーら、１９９０）　、蛍光 抗体法アッセイを行なった。組換え体ｖｃＰ１６２は、強烈な内部並びに表面蛍 光を示し、感染細胞の表面にＦＨＶ−１ｇＤ糖タンパク質の発現を示した。

同一の抗血清を用いてイムノブレシピテーションを行ない、発現されたＦＨＶ− １ｇＤ産生物の真正を決定した。

この方法は、前述した方法にしたがって行なった（ティラーら、１９９０）。ヒ ツジ抗ＦＨＶ−１ｇＤ血清は、組換えウィルスＶＣＰ１６２に感染した細胞から 誘導した溶解産物から、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上で６０ｋＤａの見かけ の分子質量を有する産生物を沈殿せしめた（ドリファスら、１９ｇ４）。未感染 細胞または親カナリヤポックスウィルス（ＣＰ　ｐ　ｐ）に感染した細胞からは タンパク質はまったく沈殿しなかった。

実施例５９ＬＨＡＮＴＡＡＮウイルスＧ１およびＧ２糖タンパク質を発現するＮ ＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣベースの組換え体の産生 昆虫ポックスウィルス４２ｋＤａプロモーターの制御下で、Ｍ断片をＮＹＶＡＣ とＡＬＶＡＣベクターに挿入することにより、ハンターン（Ｈａｎｔａａｎ）ウ ィルスＧ１およびＧ２糖タンパク質の発現を行なった。これらのウィルスベクタ ーに挿入するポックスウィルス発現カセツテは以下のようにして産生じた。

ハンターンウイルスＭ断片のｃＤＮＡクローンをシュマルジョンらにより記載さ れたように（１９＋１７）誘導し、Ｄｒ。

Ｊ、ダルリンプル（ＭＤ、フレデリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウィル ス学部門）から得て、プラスミドベクターｐＴＺ１９Ｒ（ＮＪ、ピスキャタウエ イ、ファーマシア）に挿入した。ｃＤＮＡの全配列は、以前にシュマルジョンら により示した（１９８７）。テンプレートとしてＭ断片ｃＤＮＡを含有するプラ スミドｐ’ｒｚ　１９ＲおよびオリゴヌクレオチドＨＭ５Ｐ　（配列認識番号３ ３５）（５’　−ＡＴＧＧＧＧＡＴＡＴＧＧＡＡＧＴＧＧ−３’　）とＨＭ３Ｐ （配列認識番号３３６） （５’　−ＣＡＴＧＴＴＣＣＴＴｒＣＡＡＧＴＣＡＡＣ−３’　）を用いて、Ｍ 断片暗号配列の３２６ｂｐ　５’側領域を誘導した。この３２６Ｍ１断片を、テ ンプレートとしてのｐＡＭ１２およびオリゴヌクレオチドＲＧ２７３　（配列認 識番号１４２） （５’−ＡＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＧＡＴｒＣ− ３’）とＲＧ２７４　（配列認識番号１４３）（５１−ＴＴＴＡＴＡ？ｒＧＴＡ ＡＴＴＡＴＡＴＡ’！’！ＴｒＣ−３１）を用いて得た４２ｋＤａプロモーター 要素を含有する１０７ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片に融合した。テンプレートとしてド ＲＧ２７３　（配列認識番号１４２）とＨＭ３Ｐ（配列認識番号３３６）の等モ ル混合物を用いて、ＰＣＲ融合を行なった。融合断片をＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ　（ ５’末端）とＢｃｌｌ（３′末端）で切断し、３４３ｂｐ断片を産生じた。

プラスミドｐＡＭ１２を以下のように誘導した。Ａｍ５ａｃｔａ　ｍｏｏｒｅｉ 昆虫ポックスウィルス（Ａｍ　Ｉ　ＰＶ）から単離したゲノムＤＮＡをＣ１ａＩ で切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離した。高度に転写されたＡ ｍＥＰＶ遺伝子を含有することが以前に同定された２、６ｋｂ断片をゲルから精 製し、ｐＢＳ−ＳＫ“のＣｌａｌ部位にクローニングし、ｐＡＭ１２を産生じた 。この断片のＤＮＡ配列分析により、４２ｋＤａの完全ＯＲＦが明らかになった 。この遺伝子からの５′未翻訳配列（ＡｍＥＰＶ　４２ｋＤａプロモーター）は 、ワクシニアとアビポックスウィルスにおける強い、初期プロモーターとして機 能することが続いて示された。

Ｍ断片暗号配列の３′側７４８Ｍを、テンプレートとしてｐＴＺ１９Ｒ中に得ら れたｃＤＮＡクローンおよびオリゴヌクレオチドＨＭＴＳ−５（配列認識番号３ ３７）（５’−ＡＴＣＡＴＧＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＧＧＴＴＴＣ’！ ＴＡＴＧＣＣＣＴＧＡＧ−３’）とＨＭＴＳ−３（配列認識番号３３８）ＴＴＡ ＣＧＧＧＡＣ−３・） を用（箋たＰＣＨにより誘導した。これらの注文合成オリゴヌクレオチドによる この断片の合成は、１）５’末端でのＥｃｏＲＶ部位と３′側配列を含有し、２ ）ヌクレオチド位置２６７８−２６９３でＴ、ＮＴ配列モチーフを分断しくユエ ンおよびモス、１９８７）　、３）暗号配列の３′末端部位でＥｏＲＩ部位およ びＴ、ＮＴ要素を加える。この断片をＥｃｏＲＩで切断し、７４１ｂｐ　Ｅｃｏ ＲＶ／Ｅｃ。

Ｒ１断片を産生じた。７４１ｂｐ　ＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲ■断片をｐＢＳ−８Ｋ 　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に挿入し、プラスミドｐＢＳＨＶＭ３Ｐ を産生した。

ｐＴＺ１９Ｒ中にＭ特異的ｃＤＮＡクローンを含有するプラスミドを用いて、Ｇ Ｍ４８　（Ｄ　ａ　ｍ−）細菌細胞（ＭＤ、ゲイサースブルグ、ＢＲＬ）を転換 した。この細菌菌株から誘導したプラスミドＤＮＡをＢｃｌｌとＥｃｏＲＶで切 断し、２３６２ｂｐ断片を産生じた。この２３６２ｂｐ断片を、暗号配列の５′ 側領域に融合された４２ｋＤｇプロモーターを含有する３４３ｂｐ　Ｈｉｎｄｌ ｌｌ／Ｂｅ１ｌ断片とともに、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩとＥｃｏＲＶで切断したｐＢ ＳＨＶＭ３Ｐに挿入した。金縁Ｍ断片発現カセツテを含有する産生じたプラスミ ドをｐ　Ｂ　Ｓ　ＨＶＭと称した。

制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩおよびＥｃｏＲＩを用いて、ｐＢＳ ＨＶＭから金縁Ｍ断片カセツテを切除した。３５０８ｂｐ誘導断片を、２ｍＭの ｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉのフレノウ断片でプラントエンドした。プラン トエンドした断片をｐｓＤ５５０に挿入して、ｐＨＶＭＶＣを産生した。

プラスミドｐｓＤ５５０を以下のように誘導した。プラスミドｐＳＤ５４８　（ タータグリアら、１９９２）は、１４ＬＯＲＦ　（ゲーベルら、１９９０ａ、　 ｂ）がＢｇｌＩＩとＳｍａ１部位からなるクローニング領域により置換されたワ クシニアベクタープラスミドである。多重クローニング領域を延長するために、 ｐＳＤ５４８をＢｇｌＩＩとＳｍａ　Ｉで切断し、アニールした補体合成オリゴ ヌクレオチド５３９Ａ（配列認識番号３３９　）　（５’　−ＡＧＡＡＡＡＡＴ ＣＡＧＴｒＡＧＣＴＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧ ＡＴＣＣＴＧＡ？Ｉ’ＡＧＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴ−３’　） および５３９Ｂ　（配列認識番号３４０）（５’　−ＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴ ｒＡＡＣｒＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＡＧ ＡＴＣＴＴＡＧＣＴＡＡＣＴＧＡＴｒＴＩＴＣＴ−３’　）に連結した。産生じ たプラスミド、ｐｓＤ５５０において、多重クローニング領域は、Ｂｇｌｌｌ、 Ｓｍａ　Ｉ、Ｘｈ。

■、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を含有する。

プラスミドｐＨＶＭＶＣを治療ウィルスとしてのｖＰ８０４（タータグリアら、 １９９２）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて、ｖＰ８８２を 産生じた。放射線標識したＭ特異的ＤＮＡプローブを用いた標準方法（ピッチｍ ＝ら、１９８７）にしたがって、現場でのハイブリダイゼーションにより、組換 えウィルスを同定した。３回のプラーク精製により、組換えプラークを精製し、 さらなる分析のために増幅した。組換えウィルス、ｖＰ８８２は、ワクシニアウ ィルスの１４Ｌ座にハンターンＭ断片を含有する。１４Ｌ読取り枠とｖＰ８０４ バックグラウンド中のＭ断片カセツテとの置換により、ＮＹＶＡＣ−等量ウイル スパックグラウンドが作られる（タータグリアら、１９９２）。

Ｍ断片カセツテ（上述）を含有する、ｐＢＳＨＶＭから誘導した３５０８ｂｐ　 ＨｉｎｄｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ＩとＥｃｏＲＩで切断し たｐｃ４１に挿入した。プラスミドｐｃ４１を以下のように誘導した。Ｃｐｐｐ からの６．５ｋｂ　Ｎ５ｉＩ断片をｐＢＳ−ＳＫ”のＢａｍＨ１部位にクローニ ングし、ｐＸＸ−４を産生じた。ＤＮＡ配列分析により、座中の０４挿入物を含 有した完全読取り枠ＯＲＦを同定した。Ｃ４０ＲＦが欠損した供与体プラスミド を構成するために、オリゴヌクレオチドＲＧ２８７　（配列認識番号３４１） （５１−ＣＡＧＴｌｒＧＧＴＡＣＣＴＡＴＧＴｒＡＡＧＧλＧＧＡＣＧＡ−：Ｉ ・）ＲＧ２９３　（配列認識番号３４２　）　（ｓＩ−ＴｘＴＣＴＧＡＡＴＴＣ ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＴｌｌ’ｆｆＪ’ＡＴＡＧＣＴＡＡＴｒＡＧＴＣＡＴ ＡＴＧ入ＴＡＴｒＡＴＣＴＣＴ入Ｔ−３’　）ＲＧ２８９　（配列認識番号３４ ３） およびＲＧ２９０　（配列認識番号３４４）（５’−Ｔ’ＴＡＴＣＧＡＧＣＴＣ ＡＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＣ−３’）をプライマーとして用い、ｐＸ Ｘ４からのＣ４０ＲＦの５′および３′未翻訳領域を増幅した。精製したＰＣＲ 断片をＫｐｎｌ−３ａｃ１部位でのｐＢＳ−８Ｋ＋に挿入した。産生じたプラス ミド、１）Ｃ４１は、完全ＯＲＦが翻訳およびワクシニア初期転写終止信号を側 腹に有する多重クローニング部位と置換されたＣ４の５′および３′未翻訳領域 （各２０１ｂｐ）を含有する（ユエンおよびモス、１９８７）。

Ｍ断片カセツテのｐｃ４１への挿入により、プラスミドｐＣ４ＨＶＭが産生じた 。ｐｓＤ５１３から誘導した１００ｂｐの５ＳｐＩ／ＳｍａＩ断片の挿入のため に、プラスミドｐＣ４ＨＶＭをＳｍａ　Ｉで線状化した（実施例７に定義した） 。産生じたプラスミドをｐＣ４ＨＶＭＶＱと称した。プラスミドｐＣ４ＨＶＭＶ ＱをＳｍａ　Ｉで切断し、続いて部分的なＨｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉでの切断により、 Ｍ断片カセツテを含有する３、６ｋｂ断片を回収した。この断片を、２ｍＭのｄ ＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプ ラントエンドした。このプラントエンドした断片を、Ｓｍａ　Ｉ切断したｐＳＰ ＣＰＣ３Ｌ　ニ挿入し、ｐＣ３ＨＶＭＶＱ　（実施例３２に定義した）を産生じ た。

供与体プラスミドとしてｐｃ３ＨＶＭＶＱおよび治療ウィルスとしてＣＰｐｐ　 （ＡＬＶＡＣ）を用いて、主要ひな胚胎繊維芽細胞に、生体外組換え実験を行な った。標準プロトコルを用いて組換えウィルスを同定し、精製した（上述；ピッ チｍ；ら、１９８７）。ハンターンウィルスＭ断片を含有するＡＬＶＡＣベース の組換え体をｖｃＰ１１４と称した。

実施例６０−ハンターンウィルスＳ暗号配列を含有するＮＹＶＡＣ−およびＡＬ ＶＡＣ−ベースの組換え体の産生 ワクシニアウィルスＨ６プロモーターの制御下で、Ｓ断片をＮＹＶＡＣおよびＡ ＬＶＡＣベクターに挿入することにより、ハンターンウィルス核タンパク質の発 現を行なった（ゲーベルら、１９９０ａＳｂ）。これらのウィルスベクター中に 挿入したポックスウィルス発現カセツテは以下のように構成した。

ハンターンウイルスＳ断片のｃＤＮＡクローンをシュプルジョンらにより記載さ れたように（１９８７）誘導し、Ｄ「。

ジョエル　ダルリンプル（ＭＤ、フレデリック、Ｆｔ、ブトリック、感染病の米 国陸軍医療研究所、ウィルス学部門）から得て、プラスミドベクターｐＧＥＭ− １（Ｗ■、マジソン、プロメガバイオチック）に挿入した。Ｓ断片の金縁配列は 以前に記載している（シュプルジョンら、１９８Ｂ）。

テンプレートとしてプラスミドｐ１４ＬＨ６ＨＩＶ３Ｂおよびオリゴヌクレオチ ドＨ６５ＰＨ（配列認識番号１６（５’　−ＡＴＣＡＴｃＡＡＧＣ’！？−３’ 　）とＨＴＨ６３Ｐ　（配列認識番号３４６）（５’−ＣＣＣｒＣＴＧＴＡＡＴ ｒＣＣＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＡＴｒＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧ −３’　） を用いたＰＣＨにより、Ｈ６プロモーター要素を増幅した。

この１５０ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片は、５′末端にＨｉｎｄＩ１１部位を含有し、 Ｓ断片暗号配列の５′側領域を含有する３′末端での２８ｂｐの延長部を有する 。

オリゴヌクレオチドＨＴＳ５Ｐ　（配列認識番号３４７）（５・−ＣＣＧＴ’ｒ ＡＡＧＴＩ’ｒＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧ−３嗜）お よびＧＰ５５ＰＮＣＩ　（配列認識番号３４８）（５’−ＧＧＡＣＡＣＧＴ入入 ＡＧＡＴＧＴＴＴｒＧＧ−３＋）並びにテンブレー　トとしてのＳ特異的ｃＤＮ ＡクローンでのＰＣＨにより、Ｓ断片暗号配列の５′末端を合成した。

５６０ｂｐのＰＣＲ誘導断片を、オリゴヌクレオチドＨ６５ＰＨ（配列認識番号 １６４）およびＨＴＳ５ＰＮＣＩ（配列認識番号３４８）を用いたＰＣＨにより 融合した。

ＰＣＲ誘導融合産生物をＨｉｎｄｌｌｌとＮｃｉｌで切断した。

オリゴヌクレオチド７５Ｈ７３ＰＰＳ　（配列認識番号３（５’　−ＧＴＣＣＴ ＧＣＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＣＡＡＧＣ−３’　）およびＨＰ ３５５ＰＮ　（配列認識番号３５０）（５嘗−ＧＧＧＧＧＡＧＧＣＡＭＣＴＡＣ ＣＡＡＧＧ−３１）並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用 いたＰＣＲにより、ハンターンウイルスＳ断片の中央領域を産生じた。５８１ｂ ｐ断片は、その３′末端でＰｓｔ１部位を含有し、５′末端はＳ断片の位置４９ ９のＮｃｉ■部位を含有する（シュプルジョンら、１９８Ｂ）。さらに、オリゴ ヌクレオチドＴ５ＨＴ３ＰＰＳ　（配列認識番号３４９）を使用することにより 、アミノ酸配列を変更することなく、位置１０２９から１０３５までの７５　Ｎ Ｔ要素を除去する。次いでこの断片をＮｃｉｌとＰｓｔｌで切断した。

Ｈ６プロモーターに融合された暗号配列の５′末端を含有するＰＣＲ断片（上述 のようにＨｉｎｄｌｌＩ／Ｎｃｉｌ切断した）を、Ｓ断片の中央領域を含有する ５８１ｂｐＮｃｉｌ／Ｐｓｔｌ断片とともにＨｉｎｄｌｌｌとＰｓｔＩで切断し たｐＢＳ−３Ｋに連結した。産生じたプラスミドをｐＢＳＨＴＳＨ６５Ｐと称し た。

オリゴヌクレオチドＨＴＳ３ＰＸＢＡ　（配列認識番号３およびＴ５ＨＴ５ＰＳ Ｐ　（配列認識番号３５２）（５嘗−ＣＧＣＣＡＧＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ Ｃ−３１）並びにテンプレートとしてのＳ特異的ｃＤＮＡクローンを用いたＰＣ ＲによりＳ断片の３′側４３８ｂｐを誘導した。

この断片の５′末端は、Ｓ断片暗号配列の位置１０３９に位置するＰｓｔ１部位 を含有しくシュプルジョンら、１９８６）、３′末端は、Ｔ、ＮＴ配列モチーフ および特有Ｘｂａ１部位を含有する。Ｐｓｔｌ／ＸｂａＩで切断したｐＢＳ−Ｓ Ｋへの挿入の前に、この断片をＰｓｔＩとＸｂａＩで切断し、ｐＢＳＨＴＳ３Ｐ を産生した。

金縁Ｓ断片発現カセツテを産生するために、１１２２ｂｐ　Ｐｓｔｌ／部分的Ｈ ｉｎｄｌｌｌ断片をｐＢＳＨＴＳＨ６５Ｐから誘導した。この断片を、ｐＢＳＨ ＴＳ３Ｐからの２９０ｂｐ　Ｐｓｔｌ／Ｘｂａｌ断片とともにＨｉｎｄＩＩＩ／ Ｘｂａｌ切断ｐＢＳ−８Ｋに挿入した。産生じたプラスミドを、Ｘｂａｌで線状 化し、続いて部分的なＨｉｎｄｌｌｌでの切断し、ｐＢＳＨＶＳと称した。この 断片を、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレ ノウ断片を用いてプラントエンドし、次いでｐｓＤ５４１のＳｍａ　１部位に挿 入して、ｐＡＴＩ′ＨＶＳを産生した。

プラスミドｐＡＴＩＨＶＳを、治療ウィルスとしてのＶＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ ）とｖＰ８８２とともにベロ細胞における生体外組換え実験に用いた。これは、 標準プロトコルにより行なった（ピッチｍ＝ら、１９８７）。放射線標識したＳ 断片特異的ＤＮＡプローブを用いた前述したプラークハイブリダイゼーション方 法（ピッチｍ＝ら、１９８７）により組換えウィルスから誘導したプラークを同 定した。それぞれ治療ウィルスｖＰ８６６およびｖＰ８８２を用いて回収したウ ィルスに関して、産生じた組換え体をｖＰ９５０およびｖＰ９５１と称した。組 換えウィルス、ｖＰ９５０は、ＡＴ１部位にＳ断片発現カセツテを含有し、ｖＰ ９５１は、同一の座にこのカセツテを含有するが、ｖＰ８８２を含有するＭ断片 による治療のために、１４Ｌ座にもＭ断片を含有する。

プラスミドｐＢＳＨＶＭを５ａｉｌで線状化し、２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ 、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラントエンドした。

このプラスミドを、ハンターンＳ断片発現カセツテを含有するｐＢＳＨＶＳから 誘導した１、４ｋｂ　Ｘｂａｌ／部分的ＨｉｎｄＩＩＩ（上述したようにフレノ ウでプラントエンドした）断片に連結した。誘導したプラスミドをｐＢＳＨＶＭ Ｓと称した。このプラスミドは、頭対頭（ｈｅａｄ　ｔｏ　ｈｅａｄ）の配置で ＭおよびＳカセツテを含有した。プラスミドｐＢＳＨＶＭＳをＸｈｏｌで線状化 し、フレノウでプラントしく上述したように）　、ｐｓＤ５１３　（実施例７で 定義した）からの１００ｂｐ　５ｓｐＩ／ＳｍａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨｖＭ ＳｖＱを産生した。

プラスミドｐＢＳＨＶＭＳＶＱを５１ａＩ／Ａｓｐ７１８で切断し、Ｓ断片発現 カセツテを含有する１、５ｋｂの断片を雌牛じた。この断片を２ｍＭのｄＮＴＰ の存在下でＥ、ｃｏｌｔ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片を用いてプラント エンドし、ｐＳＰＣＰ３Ｌ　（実施例３２に定義した）のＳｍａ　Ｉ部位に挿入 し、ｐＣ３ＨＶＳＶＱを産生した。

プラスミドｐＣ３ＨＶＳＶｇを、治療ウィルスとしてのＣＰｐｐ　（ＡＬＶＡＣ ）とともに主要ひな胚胎繊維芽細胞における生体外組換え実験に用いた。これは 、プラーク同定、プラーク精製、およびウィルス増幅のような標準方法を用いて 行なった（ピッチｍ＝ら、１９８７）。産生じた組換え体をｖｃＰ１１９と称し た。この組換え体は、ＡＬＶＡＣの０３座にＳ断片を含有する。

実施例６ｌ−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣ−ベースのハンターンウイルスＭお よびＳ断片組換え体の発現分析 Ｇ１、Ｇ２、またはウサギ抗ハンターン多りローン性血清に特異的な単クローン 性抗体のプールのいずれかを用いて、前述したように蛍光抗体法アッセイを行な った（ティ　−ラーら、１９９０）。全ての血清は、Ｄｒ、Ｃ，シュプルジジン （ＭＤ、フレデリック、Ｆｔ、ブトリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウィ ルス学部門）から得た。Ｍ断片のみ（ｖＰ８８２、およびｖｃＰ１１４）または Ｓ断片との組合せ（ｖ　Ｐ　９５１）を含有する組換えウィルスは、上述した抗 血清のいずれを用いても強い表面蛍光を示し、感染細胞の表面に０１およびＧ２ の糖タンパク質の両方の発現を示した。核タンパク質が感染細胞の表面には現れ ないので、Ｓ断片のみを含有する組換え体（ｖＰ９５０およびＶＣＰ１１９）を 用いては、表面蛍光は観察されなかった。

しかしながら、ウサギ抗ハンターン血清を用いての組換え体、ｖＰ９５０および ｖｃＰ１１９に関しては、内部蛍光が観察された。

同一の抗血清を用いてイムノブレシピテーションを行なって、発現したＧ１、Ｇ ２、およびＳ遺伝子産生物の真正を測定した。この方法は、前述した方法にした がって行なった（ティラーら、１９９０）。Ｇ１に特異的な単クローン性抗体プ ールは、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルシステム上で、組換えウィルスｖＰ８８２、ｖＰ ９５１、およびｖｃｐＨ５４に感染した細胞から誘導した溶解産物から６４ｋＤ ａの見かけの分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた（ドリファスら、１９ ８４）。未感染細胞、または親（ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣ）に感染した細胞 もしくはＳ断片のみを含有する組換えウィルス（ｖＰ９５０およびｖｃＰ１１９ ）に感染した細胞から誘導した溶解産物からはタンパク質は沈殿しなかった。沈 殿したポリペプチドが約５Ｏ−５５ｋＤａの分子質量を有したことを除いては、 Ｇ２に特異的な単クローン性抗体プールを用いては同様の結果が得られた。

これらのサイズのタンパク質（６４ｋＤａおよび５Ｏ−５５ｋＤａ）は、それぞ れＧ１およびＧ２タンパク質のサイズと一致する（シュプルジョンら、１９９０ ）。

ウサギ抗ハンターンは、ｖＰ９５１に感染した細胞から誘導した溶解産物から、 Ｇ１、Ｇ２および核タンパク質の発現と一致する６４ｋＤａ、５Ｏ−５５ｋＤａ 、および４８ｋＤａの見かけの分子量を有する３つのタンパク質量を沈殿せしめ た。同一の血清は特異的に、ｖＰ８８２およびｖｃＰ１１４感染細胞溶解産物か らはＧ１およびＧ２（６４ｋＤａ、５Ｏ−５５ｋＤａ）種を、ｖＰ９５０および ＶＣＰ１１９感染細胞溶解産物からは核タンパク質（４８ｋＤａ）を沈殿せしめ た。未感染細胞またはＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣ親ウィルスに感染した細胞か ら誘導した溶解産物からはそのようなタンパク質は沈殿しなかった。

実施例６２−Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢ　Ｖ）遺伝子のＡＬＶＡＣ挿入プラスミド への挿入 ＡＬＶＡＣＣ５挿入プラスミドｐＮＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ１８（実施例４４に定義 した）をＢａｍＨＩで切断し、キナーゼしてアニールした合成オリゴヌクレオチ ドＭＰＳＹＮ４３８／ＭＰＳＹＮ４３９　（配列認識番号３５３／３５４）に連 結した。

）ＯＩＳＹＮ４３８　５嘗　ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡ　３１ＭＰＳＹＮ４３９　 ５１　ＧＡＴＣＴＣＣＣＧＧＧ　３１産生じたプラスミド、ｐＭＰＣ５Ｓｍａは 、リンカ−領域のＢａｍＨ１部位の隣にＳｍａ　１部位を含有する。

ｐＭＰ５５０Ｅ３１１ｐｓ　（ここの他のＨＢＶの実施例に定義した）をＢｇｌ 　Ｉ　Ｉ／ＢａｍＨＩ　（部分的）で切断し、ＥＰＶ４２ｋＤａブ０％−ターの 制御下テＨＢＶ　１ｐｓＡｇを含有する１、２ｋｂの断片を単離し、ＢａｍＨＩ で切断したｐＭＰｃ５ｓｍａに連結し、プラスミドｐＭＰＣ５Ｌを産生じた。ｐ ＭＰＣ５ＬをＳｍａｌ（部分的）で切断し、単位長さく４ｋｂ）断片を単離した 。この断片をＮｒｕ　Ｉで切断し、最大の帯（４ｋｂ）を単離した。

ｐＧＪ１５（実施例１３で定義した）をＳｍａＩ（部分的）とＮｒｕｌで切断し 、ＨＢＶ　ｓｐｓＡｇおよびＨ６プロモーターの２４ｂｐを含有する０、９ｋｂ 断片を単離し、ｐＭＰＣ５Ｌからの４ｋｂ　ＳｍａＩ／Ｎｒｕｌベクター断片に 連結し、プラスミドｐＭＰＣ５ＬＳを産生じた。

実施例６３−５ＰＳＡＧおよびＬＰＳＡＧをコードするＨＣ５挿入座にＨＢＶ　 ｌｐｓＡｇおよびｓｐｓＡｇの両方を含釘するｐＭＰＣ５ＬＳを、ＡＬＶＡＣに 関する組換え体の供与体プラスミドとして用い、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖｃＰ１５ ７を産生した。

ｖｃＰ１５７のＨＢＶタンパク質の発現ＡＬＶＡＣ−ＨＢＶ二重組換え体ｖｃＰ １５７に感染した細胞からの代謝的に標識した溶解産物に、ウサギ抗Ｓ２血清を 用いてイムノブレシピテーションを行ない、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電 気泳動と続いてのラジオオートグラフにより分析した。ｌｐｓＡｇ　（４１ｋＤ ａ、３８ｋＤａ）およびｓｐｓＡｇ　（３６ｋＤａ、３３ｋＤａ）の正確なサイ ズのタンパク質を観察した。これらのタンパク質は、対照として用いたｓ　ｐｓ Ａｇまたは１ｐｓＡｇを発現するＮＹＶＡＣ単体ＨＢＶ組換え体により産生され た同一のタンパク質とともに移動した。

実施例６４−８ＰＳＡＧＳＬＰＳＡＧおよびＳ１２／コア融合をコードするＨＢ Ｖ遺伝子のＡＬＶＡＣへの挿入 Ｃ５挿入座にＨＢＶ　１ｐｓＡｇおよびｓｐｓＡｇ遺伝子並びにＳ１２／コア融 合を特定する遺伝子の両方を含有するｐＭＰＣ５ＬＳＣをＡＬＶＡＣに関する組 換えの供与体プラスミドとして用い、ＡＬＶＡＣ組換え体ｖｃＰ１６９を産生し た。

実施例６５−ＨＢＶ遺伝子を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体：ウサギ、ネ ズミおよびモルモットからの免疫学的データ ウサギ、ネズミおよびモルモットに、ＮＹＶＡＣベースのＢ型肝炎ウィルス（Ｈ Ｂ　Ｖ）組換え体ｖＰ８５６、ｖＰ９３０、ｖＰ９３２およびｖＰ９７５を接種 した（実施例１３）。ｖＰ８５６は、表面抗原の中間（Ｍ）形状であるｓｐｓＡ ｇを発現する。ＶＰ９３０は、表面抗原の大型（Ｌ）形状である１ｐｓＡｇを発 現る。ｖＰ９Ｂ２は、ＳｐｓＡｇとｌｐｓＡｇの両方を発現する。ｖＰ９７５は 、ｓｐｓＡｇ、１ｐｓＡｇおよびコア抗原に融合される表面抗原ｐｒｅｓ１＋ｐ ｒｅｓ２領域からなる融合タンパク質を発現する。ＡＵＳＡＢ試験（アボット） を用いて、ＨＢＶ表面抗原に対する抗体について、およびＣ０ＲＡＢ競合ラジオ イムノアッセイキット（アボット）を用いて、ＨＢＶコア抗原に対する抗体につ いて、血清を分析した。ＨＢＶ　ｐｒｅｓｌおよびｐｒｅＳ２領域に対する抗体 をＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果を表３４から４０に示す。

表　３９ Ｐｒｅ−５２ｎＸ５ｋ 表面抗原の中間（Ｍ）形状、表面抗原の大型化）形状および週 ｖＰ　ＨＢＶ遺伝子　０　５　６ 群Ａ　１１５６　Ｍ　＜１０　１３　７０群Ｂ　９３０　ｔ、　＜ｔｏ　９３　 １１２群Ｃ９３２ＭＡＬ　＜１０　９７０　ｘｚａ６群Ｄ　９７５　Ｈ÷Ｌ＋Ｓ ／Ｃ＜１０　１０５４　１０６２８匹または１２匹のネズミの群に、ＩＮ経路に より１０７の表示したＨＢＶ組換えワクシニアウィルスを接種した。その動物に 、同一経路と投与量で４週目に追加抗原投与した。各採血の各群からの血清を集 積した。

ＨＢＶ　ｐｒｅ　Ｓ２領域に対する抗体の検出のために、間接ＥＬＩＳ＾により 血清を分析した。

マイクロタイタ板を、５０ｎｇ／ウェルの濃度の合成Ｓ２ペプチド（亜型ａｄｖ 　、　ａａ　１２０−１４５、バキムバイオサイエンス）で被膜した。■、ｌＯ の最初の希釈から次にはその２倍の希釈で、２重にアッセイした。標準曲線に基 づく力価は、０．２５．　ｌＱ、ｌｌの平均前採血値と比較）の光学密度を与え る希釈要因を示す。

実施例６ローボツクスウイルス中の細菌遺伝子の発現：ボックスウィルス中の破 傷風毒素断片Ｃ（Ｃ。

ＴＥＴＡＮＩ） Ｃ，ｔｅｔａｎｉは、クロストリジウム属、胞子形成様気菌の細菌である；Ｃ， ｂｏｔｕｌｉｎｕｍもまたその属に含まれる。Ｃ，Ｔｅｔａｎｉは、感染に観察 される麻痺効果に主に原因となる毒素、テタノスバスミン（ｔｅｔａｎｏｓｐａ ｓｍｉｎ）（ＴＴ）を産生ずる。ＴＴは、１本の１５０ｋＤａの軽鎖および細菌 から放出された１００ｋＤａの重鎖である。重鎮は、穏やかなタンパク質分解処 理により２つの断片、ＢおよびＣ（４５ｋＤａおよび５５ｋＤａ）を産生ずる。

この実施例は、本発明のウィルスが、Ｃ，ｔｅｔａｎｉの断片Ｃのような免疫原 細菌遺伝子産生物を発現するのに用いられることを示す。

発現カセツテは、一連のポリメラーゼ鎖反応により産生される。この方法は、天 然破傷風毒素配列に存在するＴＴＴＴＴＡＴ初期転写終止信号（ユエンおよびモ ス、１９８７）を除去するのに必要であった（イーゼルら、１９８６；フェアウ ェザ−およびリネス、１９８Ｂ）。

プライマーＨ６ＴＥＴＣ（配列認識番号３５５）およびＴＥＴＦＩＸ２（配列認 識番号３５６）（５’−ＧＴＡＡＴＡＧＴｒＡＴＧ入入ＡＡＣＣＣ−３１）を用 いてプラスミドｐｓｓ１２６１　（ハルバーンら、１９９０）からＰＣＲにより Ｈ６プロモータ一連結した断片Ｃを誘導した。構成の残りの暗号領域は、プライ マーＴＥＴＦ　Ｉ　Ｘｌ（配列認識番号３５７） （５’−ＧＧＧＴ’ｆｆｒＣＡＴＡＡＣＴＡＴＴＡＣ−３・）およびＴＥＴＥＮ Ｄ　（配列認識番号３５８）（５’＝ＧＧＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＴＡＡＴ ＴＴＴＴＡＴＣＴＣＧＡＧＣＣｅＧＧＧ入ＴＧＡＴ　−３”）を用いて、プラス ミドｐｓｓ１２６１のＰＣＲ増幅により、構成の暗号領域の残りを産生される。

これらの暗号配列は、プライマーＨ６ＴＥＴＣ（配列認識番号３５５）およびＴ ＥＴＮＤ　（配列認識番号３５８）を用いた、これら５５３ｂｐおよび８８１ｂ ｐ　ＰＣＲ誘導産生物のＰＣＲ増幅により行なわれた。産生じた１、４ｋｂのＰ ＣＲ誘導産生物をＥｃｏＲＩとＸｈｏｌで切断した。１．４ｋｂの断片をアガロ ースゲルから単離して、同様に単離したｐＢＳ−８Ｋ＋　（ＣＡ、ラジョラ、ス トラタジエネ）に連結した。ヌクレオチド配列分析を行なって、産生じたプラス ミドｐＢＳＴＥＴＣ中に挿入物を確認した。ＴからＣのサイレント置換がこのプ ラスミド中に発見され、これはイーゼルら（１９８Ｂ）の配列における位置３５ ３５に対応する。

ｐＣ５Ｌ　（実施例４４に定義した）をポリリンカーないのＡｓｐ７１８とＮｒ ｕ　Ｉで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールし たオリゴヌクレオチドＣＰ２６　（配列認識番号３５９）（５’−ＧＴＡＣＧＴ ＧＡＣＴＡＡＴｒＡＧＣＴＡＴλυ請ＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＣＴＣＧＡＧ ＴＣＴＡＧＭＴＣＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴ？ＴＴＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＴＡＡＴＣ ＡＣ−３’　）およびＣＰ２７　（配列認識番号３６０）（５’　−ＧＧＣＣＧ ＴＧＡＴＴＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＡＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＧＡＴＴＣＴＡ ＧＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＣＴＡＡＴＴＡ ＧＴＣＡＣ−３１）（不能Ａｓｐ７１８部位、６つの読取り枠中の翻訳終止コド ン、ワクシニア初期転写終止信号（ユエンおよびモス、１９８７）　、ＢａｍＨ Ｉ、Ｋｐｎ　ｌ５Ｘｈｏ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉ、Ｃ１ａＩ、およびＳｍａ　Ｉ制限部 位、ワクシニア初期転写終止信号、６つの読取り枠中の翻訳終止コドン、および 不能Ｎｏｔ１部位を含有する）に連結し、プラスミドｐＣ５ＬＳＰを産生じた。

オリゴヌクレオチドＣＰ３０　（配列認識番号３６１） （５１−ＴＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣＡＧＧ ＣＡＧＧＧＣＧ　−３１）およびＣＦ３Ｉ　（配列認識番号３６２）（５’−Ｔ ＡＧＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣＣＴＡＣＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡ ＴＣＧ　−３１） を用いて、プロモーターを含有するプラスミドからＰＣＨにより初期／晩期Ｈ６ ワクシニアウィルスプロモーター（パーカスら、１９８９）を誘導した。このＰ ＣＲ産生物をＢａｍＨＩとＸｈｏｌ　（ＰＣＲにより５′および３′末端で産生 じた部位）で切断し、同様に切断したｐＣ５ＬＳＰに連結し、ｐＶＱＨ６Ｃ５Ｌ ＳＰを産生じた。ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰをＥｃｏＲＩで切断し、アルカリ性ホス ファターゼで処理し、自己アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９（配列認識 番号３６３） （５１−人ＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ−３菅）に連結し、Ｎｏｔｌで切断し、線状 精製して自己連結した。

この方法によりｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰにＮｏｔＩ部位を導入し、ｐＮＶＱＨ６ｃ ５ＬｓＰ１８を産生した。ｐＢＳＴＥＴＣからの１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＶ／Ｘｈ ｏｌ断片を単離し、同様に切断したｐＮＶＱＨ６ｃ５ＬｓＰ１８１：：連結し、 ｐＣ５ＴＥＴＣを産生した。

ＰＣＲとプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号３６４）（５’　−ＡＣＴＡＣ ＴＡＡＧＣＴ？需ＡＴＴＣＴＡＴＡＣＴＴＡＪＩＪＩＡＡＧＴＧ　−３菅）およ びＨ６ＰＣＲ２（配列認識番号３６５）（５’　−ＴＴＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧ ＣＧＡＴＡＡＴＧ　−３’　）を用いて、合成Ｈ６プロモーター（バーカスら、 １９８９）を含有するプラスミドからＥｃｏＲＶにつながったＨ６プロモーター を誘導し、５’ＨｉｎｄＩ１１部位を産生じた。

この１２２ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶで切断し、同様 に切断したｐＢＳ−ＳＫ＋　（ＣＡ。

ラジョラ、ストラタジエネ）に連結し、プラスミドｐＢＳＨ６をさんせいした。

ヌクレオチド配列分析により挿入物を確認した。ｐＣ５ＴＥＴＣからの１．４ｋ ｂ　ＥｃｏＲＶ／Ｘｂａｌ断片を切除して、同様に切断したｐＢＳＨ６に連結し 、ｐＨ６ＴＥＴＣを産生じた。

次いで金縁Ｈ６断片Ｃカセツテを含有するｐＨ６７ＥＴＣからの１．５ｋｂ　Ｘ ｈｏｌ断片をｐＳＤ５４２　（実施例３２に定義した）に連結し、ｐＴＫＴＥＴ Ｃを産生した。

イムノプレシピテーション分析を行なって、ｖｃＰ１６１およびＶＰ１０７５が 真正断片Ｃを発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、親ウィルス、ＣＰｐ ｐ　（ＡＬＶＡＣ）またはｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）　に感染せしめタカ、ま たは１０ｐｆｕ／細胞のｍ、ｏ、ｔ、でｖｃＰ１６６１またはＶＰ１０７５に感 染せしめた。細胞を、感染せしめ、［３５Ｓコーメチオニン（２０μｃｉ／ｍｌ ）を含有する修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）中でインキュベーショ ンし、溶解せしめ、ティラーらにより記載された（１９９０）ように、ネズミ単 りローン性抗体（ＩＮ、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイム、クロー ン４９゜４）および第２の抗体としてのヤギ抗ネズミ抗血清を用いて沈殿せしめ た。溶解産物を通常のネズミ血清およまびタンパク質Ａセファロースで前浄化し た。

単クローン性抗体は特異的に、約４７ｋＤａに対応する種をｖｃＰ１６１および ｖＰ１０７５感染細胞から沈殿せしめた。ｃｐｐｐ　（ＡＬＶＡＣ）またはＶＰ ８６６　（ＮＹＶＡＣ）感染細胞からは類似のタンパク質量は沈殿しなかった。

４７ｋＤａサイズは、天然破傷風毒素のパパイン切断により産生された断片Ｃ並 びにｖｃＰ１６１およびｖＰ１０７５によりコードされたものと同一のＥ、ｃｏ ｌｉ産生組換え断片ＣＩ関してマコフら（１９ｇ９）による観察と一致する。

実施例６フーブタ中のＮＹＶＡＣベースの仮性狂犬病ウィルス（ＰＲＶ）組換え 体の効果 ４匹の子豚の６つの群に、ＮＹＶＡＣベースのｇＩＩ組換え体（ｖＰ８８１）　 、ｇ　Ｉ　Ｉ　１組換え体（ｖＰ８８３）、ｇｐ５０組換え体（ｖＰ９００）　 、ＮＹＶＡＣ親ウィルス（ｖＰ８６６）　、市販の不活性化仮性狂犬病ウィルス ワクチン、または仮性ワクチンとして胎児ウシ血清を含有するイーグルＭＥＭの いずれかに感染せしめた。全てのブタに、筋向経路により２８日の間隔で２回投 与した。親または組換えＮＹＶＡＣウィルスを投与されたブタに、接種当たり約 １０’ＴＣＩＤ、。で接種した。感染から１２日間に亘り、全てのブタを体温と 臨床の徴候について監視した。組換え体または親ＮＹＶＡＣウィルスでのワクチ ン接種に対しては部分的なまたは全身的な副作用は観察されなかった。

仮性狂犬病ウィルスに対する血清中和抗体を、接種から１．２、および４週間後 に監視した。表４１から明確なように、不活化ワクチン標品のみが１回の接種後 に著しい仮性狂犬病ウィルス血清中和力価を誘発できた。しかしながら、２回の 接種後では、全ての３つのＮＹＶＡＣベースの組換え体が識別できる仮性狂犬病 ウィルス血清中和力価を誘発することができた（表４２）。力価は、仮性狂犬病 ウィルスｇｐ５０糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体について最も著し かった。実際、ＮＹＶＡＣ組換え体を発現するｇｐ５０により誘発された力価は 、市販されている不活化ワクチンの２回の接種に得られた水準に相当した（表４ ２）。

２回の免疫化から４週間後、鼻腔内点滴注入により、全てのブタに約１０’　Ｐ ＦＵの毒性仮性狂犬病ウィルス菌株を抗原投与した。予期したように、仮性およ び親ＮＹＶＡＣワクチン接種対照は全て、最も厳しい臨床症候を示し、鼻と口咽 頭スワブにより単離した仮性狂犬病ウィルスの最高水準は、抗原投与から１４日 後までであった。ＮＹＶＡＣベースの仮性狂犬病ウィルス組換えウィルスは、対 照と比較して、毒性仮性狂犬病ウィルス抗原投与の効果（すなわち、臨床症候お よびウィルス単離）を減少し、組換えウィルスを発現するｇｐ５０が最も有効で あった。実際、この組換え体は、市販の不活化仮性狂犬病ウイルスワクチーンと 同程度に効果的である。

他のヘルペスウィルスのようにＰＲＶは、ストレスまたはコルチコステロイドの 投与により再活性化される潜伏性感染を発達せしめる可能性を有するので（ホイ ットマンおよびシバ、１９１１９）　、そのような感染に対するＮＹＶＡＣ組換 え体の防御効果を評価するために、２匹のブタの群に関して実験を行なった。プ ロトコルには、以下のスケジュー。

ルにおいてブタにデキサメタシンを投与することが必要であった：１日目に静脈 経路により１．２５ｍｇ／ポンドおよび静脈経路により０．２５ｍｇ／ボンド。

以後、４日間に亘り約１２時間ごとにデキサメタシンの投与（０，５ｍｇ／ボン ド）を行なった。鼻（Ｎ）と喉（Ｔ）のスワブを用いてデキサメタシン処理後０ 日から１０日まで、ウィルスの放出（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を評価した。結果を表 ４３に示す。これらの結果は明らかに、潜伏性ＰＲＶ感染の成立に対する防御に おけるＮＹＶＡＣベースのＰＲＶ組換えウィルスの効果を示した。この基準によ り、ＮＹＡＶＣ−ｇ　Ｉ　Ｉ　（ｖＰ８８１）は十分に最も有効である。

表　４１ 最初の免疫化後のＰＲＹ　ＳＮ力価 ブタ　群　０日　１週目　２週目　４週目４　＜２　＜２　＜２　＜２ ８　＜２　＜２　＜２　２ ９　＜２　＜２　８　＜２ １２　＜２　２　２　８ １３　＜２　＜２　＜２　＜２ １４　ＮＹＶＡＣ＜２　＜２　＜２　＜２１５　＜２　＜２　＜２　＜２ １６　＜２　＜２　＜２　＜２ ２０　＜２　２　１６　８ ２１　＜２　＜２　＜２　＜２ ２４　＜２　＜２　＜２　＜２ 表　４２ ２回目の免疫化後のＰＲＹ　ＳＮ力価 ブタ　群　１週目　２週目　４透口 実施例６８−ベクターとしてのＮＹＶＡＣ，１（ｖＰ９５−４）の使用 ＮＹＶＡＣ，１（ｖＰ９５４）（実施例１７）において、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６ ６）中の［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬ］欠損は、Ｋ３Ｌを通じて、その右側の、欠損がイン ターフェロンに対する感度を高める遺伝子まで拡張せしめられる（ビーティーら 、１９９１）。狂犬病糖タンパク質の免疫化ベクター並びに以下に記載するよう な麻疹ＨＡおよびＦ遺伝子の免疫化ベクターとしてＮＹＶＡＣ，１を試験した。

狂犬病糖タンパク質遺伝子のｖＰ９５４への挿入；ワクシニア組換え体ｃＰ１０ ０６の産生 ＴＫ欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセツテを含有する、供与体 プラスミドｐＲＷ８４２（実施例７）を、治療ウィルスとしてのｖＰ９５４とと もに組換えに用いた。狂犬病筒タンパク質Ｇ暗号配列に対する３２ｐ−標識ＤＮ Ａプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウ ィルスｖＰ１００６を同定した。

麻疹ＨＡ％Ｆをコードする遺伝子のｖＰ９５４への挿入；ワクシニア組換え体ｖ Ｐ１０１５の産生ＴＫ挿入座に麻疹Ｆおよび麻疹ＨＡの両方の発現カセツテを含 有する、ｐＲＷ８５７　（実施例９）を、ＶＰ９５４治療ウィルスとともに組換 えのための供与体プラスミドとして用いた。麻疹ＨＡおよび麻疹Ｆの暗号配列の 両方に対するｊ２Ｐ標識プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションによ り組換えウィルスｖＰ１０１５を同定した。

免疫化ビヒクルとしてのに３ＬのないＮＹＶＡＣ，１ベースのベクターの効能； 狂犬病Ｇ組換え体ＶＰ１００６生後４から６週間のネズミ（ウィルスごとで希釈 ごとに１０匹）に、ＶＰ１００６、ｖＰ９５４　（ｖＰ１００６の親）　、ｖＰ ８７９　（ＮＹＶＡＣベースの狂犬病Ｇ、実施例７）、またはワクシニア狂犬病 １８７　ＸＰ１２の未希釈、１０−２．１０−４、または１０−６のいずれかを 接種した。接種は、足のパッドによりネズミごとに５０−１００μｌで行なった 。接種から１４日後に、全てのネズミに、２０ＬＤ５°のＣＶＳ菌株（０，０３ ｍ１中）を大脳半球間接種により抗原投与した。生存したネズミを数え、防御投 与量５０％（ＰＤ、。）を計算した。

表４４に示すように、ｖＰ１００６の親ウィルス、ｖＰ９５４は、最高量の接種 物でさえも生狂犬病抗原投与からネズミを防御しなかった。組換えウィルス１８ ７　ＸＰＩ２（キーニーら、１９８４）　、ｖＰ８７９、およびｖＰ１００６は 全て、生狂犬病抗原投与からネズミを防御する能力を示した。しかしながら、こ の能力におけるこれらのウィルスの相対的な効能は、ＰＤ、。値により示したよ うに（表４４）異なる。

麻疹ウィルス組換え体ｖＰ１０１５ ２匹のウサギに、０日と２８日に皮下経路により８，０１０ｇ＋ｏＰＦＵのＶＰ １０１５を接種した。０．１４．２−１．２８．３５．４２および４９日目に、 連続の採血を行なった。アルブレヒトら（１９８１）により記載されたプラーク 退行（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）中和法を用いたウィルス中和抗体の存在に関して血 清を分析した。

この分析により結果を表４５に示す。両方の動物は、１回のｖＰ１０１５の接種 後に血清転化し、動物Ａ１６９は、接種から２週間後に防御水準の抗体を示した 。抗体水準における著しい増加が２回目の接種後に観察された。等しいプロトコ ルにおける、２匹のウサギのＮＹＶＡＣ−ＭＶ（ｖＰ９１３；実施例９）による 接種の結果を表４５に示す。この結果により、Ｋ２Ｌとに３Ｌの欠損は、効果的 な免疫化ビヒクルとして機能するウィルスの能力には影響しないことが示される 。

実施例６９−ベクターとしてのＮＹＶＡＣ，２（ｖＰ９３’　−８）の使用；狂 犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体ＶＰ９９６の産生 ＮＹＶＡＣ，２（ｖＰ９３８）において（実施例１７）、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６ ６）中の［Ｃ７Ｌ−ＫＩＬＩ欠損が、３８　０ＲＦ　［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］の合 計を含むように両方向に拡張される。ＴＫ欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク 質の発現カセツテを含有する、供与体プラスミドｐＲＷ８４２（実施例７）を、 ｖＰ９３８治療ウィルスとともに組換えに用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇ暗号配 列に対する３２ｐ標識ＤＮＡプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション により組換えワクシニアウィルスｖＰ９９６を同定した。

ベロ細胞およびＭＲＣ−５細胞上の修飾ＮＹＶＡＣウィルスの成長 ワクシニアの左側［Ｃ２３Ｌ−Ｆ４Ｌ］および右側［８１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］末端 に近い大型欠損の、組織培養中の成長への効果を実験するために、ＭＲＣ−５細 胞とベロ細胞上の複製に関してＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）　、ｖＰ９３８、ｖＰ ９９６および以下の追加のＮＹｖＡＣベースのウィルスを試験した。

ｖＰ８７９　（実施例７）は、ＮＹＶＡＣのＴＫ座に挿入された狂犬病糖タンパ ク質遺伝子を含有する。

ｖＰ９５３　（実施例１７）は、ＮＹＶＡＣ欠損およびゲノムの右側末端に近い 追加の欠損［８１３Ｒ−Ｂ２９Ｒ］を含有する。

ｖＰ９９７　（実施例１７）は、ＮＹＶＡＣ欠損に加えゲノムの左右の末端の両 方に近い追加の欠損を含有する。

１．５Ｘ１０’での６０ｍｍ皿中の感染の２日前に、ベロ細胞（アフリカグリー ンサルの肝臓細胞系、ＡＴＣＣＣＣＬ　８１）およびＭＲＣ−５細胞（ヒトの胎 児の肺、ＡＴＣＣＣＣＬ　１７１）に接種した。感染時に、全ての細胞は融合性 であり、皿は２Ｘ１０’の細胞を含有した。

細胞を、ａｒａ　Ｃの有無にかかわらずＭＥＭ＋２％新生ウシ血清（ＮＣ５）で 希釈された（最終濃度４０μｇ　／　ｍｌ）、細胞当たり０．１ｐｆｕの多重度 でのウィルス（表４６）に感染せしめた。ときどきロッキング（ｒｏｃｋｉｎｇ ）Ｌながら、感染単層を３７℃で６０分間インキュベーションせしめた。１時間 の吸着期間後、細胞をＭＥＭ＋２％　ＮＣ８で２回洗浄し、次いで３ｍｌの、ａ ｒａ　Ｃの有無にかかわらずＭＥＭ＋２％で重るいし、３７℃でシンキュベーシ ョンした。３回の凍結と解凍により、感染から１時間後と７２時間後に感染細胞 を収穫した。各試料を、ベロ細胞上で２重に滴定した。

表４６に示すように、ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）は、ヒトＭＲＣ−５細胞上で制 限された成長を行なうことができる。ここに試験した条件下で（０，１ｐｆｕ／ 細胞のｍ０１１７２時間のインキュベーション）　、ＮＹＶＡＣは、約２１ｏｇ の力価の増大を示した。これらの同一の条件下で、ゲノムの左側（ｖＰ９３８） および右側（ｖＰ９５３）末端の近くに欠損を含む修飾ＮＹＶＡＣウィルスは、 約１１ｏｇの力価の増大を示した。両末端の近くに欠損を含有する修飾ＮＹＶＡ Ｃ（ｖＰ９７７）からの収穫は、入力ウィルスと比較して減少し、ＭＲＣ−５細 胞上では増幅を示さなかった。これに対して、これらの条件下では、ベロ細胞上 で試験した全てのウィルスはほぼ同程度増幅した。表４６に示すように、様々な 修飾ＮＹＶＡＣウィルスけつそん変異体に関するベロ細胞上の収穫と比較したＭ ＲＣ−５細胞上のワクシニアウィルス収穫の百分率は、以下のとおりである：　 ｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）３．５％；　ｖＰ９３８（ＮＹＶＡＣ，２、左末端 欠損）１．４２％；ｖＰ９５３（右末端欠損）０．５％；ｖＰ９７７　（左右末 端欠損）０゜０６％。ＭＲＣ−５細胞上のＮＹＶＡＣベースの狂犬病組換え体ｖ Ｐ８７９およびＮＹＶＡＣ，２ベースの狂犬病組換え体ｖＰ９９６の収穫は、そ れぞれの親ウィルスに関して実質的に同一であり、異種遺伝子の発現は、組織培 養中の組換えウィルスの成長には影響しないことを示す。

表　４６ 実施例７０−フランスＦおよびＨＮ遺伝子のｃＤＮＡクローニング フランスウィルスのウラベＡＭ−９菌株は、欧州と日本においてワクチンとして の使用が認可されている生、弱得化ウィルスである。このウィルスは、フランス 、マーシールエトイル、メリクス研究所からワクチン標品（イモバクス　オレイ ロンス）として得た。ウィルスをベロ細胞上で増幅しく２継代）、全ＲＮＡを単 離して感染細胞から精製した（チャーブウィンら、１９７９）。ＡＭＶ逆トラン スクリブターゼと任意のプライマーを用いて、このＲＮＡから第１の鎖ｃＤＮＡ を調製した（ワトソンおよびジャクソン、１９８５）。ＲＷマンブス菌株からの 公表された配列を用いて（ワキサムら、１９８７　、ワキサムら、１９８８）　 、ＦおよびＨＮ遺伝子の５′および３′未翻訳領域から一連の特異的なプライマ ーを合成した。これらのプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に より第１の鎖ｃＤＮＡがらウラベＡＭ−９ＦおよびＨＮ遺伝子を増幅した。合成 オリゴヌクレオチドＲＧ５０３　（配列認識番号３６６）（５’−ＴＣＴＧＡＧ ＣＴＣＧ入入ＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＡＴＣＡＧ−３１）およびＲＧ４９４　（配 列認識番号３６７）（５１−ＴＣＴＧＧＴＡＣＣｌｒｒＴＣＴＧＡＡＴＧＣＡＧ ＧＡＴＧ−３’　）を用いてＦ遺伝子を増幅した。ＲＧ５００　（配列認識番号 （５１−ＴＣＴＧＡＧＣＴＣＣＡＡＴＡＣＡＡＣＡＣＡＧ入入ＣＣ−３１）およ びＲＧ５０１　（配列認識番号３６９）（５１−ＴＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＡＴＴ ＣＡＣＴＡＴｒＡＣＴＣＡ−３１）を用いてＨＮ遺伝子を増幅した。５′プライ マー（ＲＧ５０３およびＲＧ５００）をＳａｃ　１部位で、３′プライマー　（ ＲＧ４９４およびＲＧ５０１）をＡｓ　ｐ７１８部位で切断した。増幅したＦお よびＩＮ断片をＳａｃ　ＩとＡｓｐ７１８で切断し、多重クローニング部位のＳ ａｃ　ＩとＡｓｐ７１８でのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋にクローニングし た。６つのＦ遺伝子クローンと５つのＨＮ遺伝子クローンをＤＮＡ配列していか なる逆トランスクリブターゼまたはＰＣＨのエラーも除去した。第２９図はｐＵ ＲＦ３（配列認識番号３７０）により示されるコンセンサスＦ配列を提供し、第 ３０図はｐＵＲＨＮ５　（配列認識番号３７１）により示されるコンセンサスＨ Ｎ配列を提供する。

実施例７ｌ−ＡＬＶＡＣ供与体プラスミドの構成：フランスＦおよびＨＮ遺伝子 フランスＦおよびＨＮ遺伝子を発現するＡＬＶＡＣ組換え体の産生のためのＡＬ ＶＡＣ供与体プラスミドの全体的な設計を以下に示す。マンプスＦ遺伝子は、昆 虫ボックス４２にプロモーター（実施例５９に記載した）に結合せしめられ、マ ンブスＨＮ遺伝子はワクシニアＨ６プロモーターに結合せしめられている（パー カスら、１９８９）。２つのプロモートされた遺伝子を５′対５′配向に配置し 、ＡＬＶＡＣＣＢ座挿入プラスミドに挿入した。構成の特定の詳細を以下の段落 に示す。

ｐＳＰＣＰ３Ｌの多重クローニング領域（実施例３２に記載した）を、ＥｃｏＲ ＶＳＲｓ　ｒ　Ｉ　Ｉｓ　Ｓｍａ　ＩおよびＰｓｔｌ制限部位を含有する３１Ｍ リンカ−断片を加えることにより変更した。アニーリング合成オリゴヌクレオチ ドＲＧ５６０　（配列認識番号３７２）（５１−ＴｒＡＧＡＴＡＴＣＣＧＧＡＣ ＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＧＣＡＧＭＴ−３１）およびＲＧ５６１　（配列認識番号 ３７３）（５’　−ＡＴＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＴＣＣＧＧＡＴＡＴ ＣＴＡＡ−３’　）によりリンカ−を産生じ、次いでＥｃｏＲＶとＰｓｔｌで切 断した。リンカ−をｐｓＰｃＰ３ＬのＥｃｏＲＶとＰｓｔ１部位にクローニング し、ｐＣ３ＬＲを産生じた。

合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６２　（配列認識番号３７（５’−ＴＡＴＧＡＡ ＴＴＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＴＣＡＴＣ−３曽）およびＲＧ５ ６３　（配列認識番号３７５）（５’　−ＴＣＴＣＣＣＧＧＧＣＧＧＡＴＡＴＣ ＧＣＧＡＴＡＡＴＧ−３’　）を用いたＰＣＲによりｐ　ＲＷ８２３からＨ６プ ロモーターを増幅した。ｐ　ＲＷ８２３は、パーカスら、１９８９により記載し たように、Ｈ６プロモーター配列を含有する。精製した断片をＥｃｏＲＩとＳｍ ａ　Ｉで切断し、ｐＣＢＬＲ中のＥｃｏＲＩとＳｍａ　１部位に連結し、ｐＣ３ ＬＲＶＱＨ６゜を産生した。

マンブスＦ遺伝子を、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／Ａｓｐ７１８断片（Ｎ末端から約５ ０コドンを欠如したＦ遺伝子０ＲＦ）としてｐＵＲＦ３から切除した。この断片 の末端をフレノウポリメラーゼを用いて修復し、ＥｃｏＲＩで切断されフレノウ ポリメラーゼにより修復されたｐＣ３ＬＲＶＱＨ６に連結した。正確な配向のス クリーニングにより、ｐＣ３ＬＲＦＶＱＨ６を産生した。

合成オリゴヌクレオチドＲＧ５６４　（配列認識番号３７（５’　−ＴＡＡＣＣ ＡＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＡＴＴＴ’ＴＧＧＧ ＡＴＴＴＣＡＡＡＡ’ｒｒＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＡＴＡＴＡＡＡ Ａ冗ＡＡＧＧＣＬ−テ買ＡＧ’ｊＴＡＣ−３１） およびＲＧ５６５　（配列認識番号３７７）（５・−ＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧ ＴＣＡＴＡＣ−３１）を用いたＰＣＲによりｐＵＲＦ３から、Ｆ遺伝子のＮ末端 ｐＵＲＦ３および４２にプロモーター配列を含有する断片を増幅した。精製した 断片をＮｃｏｌとＰｓｔｌで切断し、ＮｃｏｌとＰｓｔＩで切断したｐＣ３ＬＲ ＦＶＱＨ６に連結した。産生じたプラスミドｐＣ３ＬＲＦ４２ＫＶＱＨ６を、挿 入断片のＤＮＡ配列分析により確認した。

マンブスＨＮ遺伝子を、５ｓｐｌ／Ａｓｐ７１８断片（Ｎ末端から約３５コドン の欠如したＨＮ遺伝子）とじてｐＵＲＨＮ５から切除した。この断片の末端をク レノウボリメラーゼを用いて修復し、Ｓｍａｌで切断したｐＣ３ＬＲＦ４２ＫＶ ＱＨ６に結合した。正確な配向のスクリーニングによりｐＦＲ２Ａ−３０を産生 じた。Ｈ６踏めの３′部分およびＨＮ遺伝子のＮ末端配列を含有する断片を、合 ＣＣＣＴＣＡＡＡＡＣＴＣ−３１） およびＲＧ５６７　（配列認識番号３７９）（５１−ＡＡＡＣＣＴＡＡＧＧＴＣ ＡＴＴＡＡＣ−３１）を用いたＰＣＲによりｐＵＲＨＮ５から増幅した。精製し た断片をＮｒｕｌとＢｓｕ３６Ｉで切断し、ＮｒｕｌとＢｓｕ３６１で切断した ｐＦＲ２Ａ−３０に連結した。産生したＡＬＶＡＣ供与体プラスミド、ｐＣ３Ｕ ＲＦＨＮを、挿入プラスミドのＤＮＡ配列分析により確認した。

実施例７２−ＡＬＶＡＣ組換え体の産生供与体プラスミドｐＣ３ＵＲＦＨＮを、 ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）とともにＣＥＦ細胞中の生体外組換え実験に用いてｖｃ Ｐ１７１を産生した（ティラーら、１９９２）。放射線標識したＦおよびＨＮ特 異的プローブを用いた現場でのハイブリダイゼーシジン方法（ピッチｍ＝ら、１ ９８７）により、組換えウィルスを同定した。３回のプラーク精製により組換え プラークを精製し、発現分析により増幅した。発現分析により、ＦおよびＨＮを 発現した。

実施例７３−日本脳炎ウィルス（ＪＥＶ）１５ａａＣ，ｐｒＭＳＥＳＮＳ２１、 Ｎ５２Ａを含有する挿入ベクターの構成 ｐ　ＲＶ８３８の構成は前述している（実施例１５参照）。

ｐ　ＲＶ８３８を、狂犬病糖タンパク質遺伝子の３′末端での、Ｈ６プロモータ ー内のＥｃｏＲＶで切断されたＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片が充填され たＥｃｏＲＩで切断し、アルカリ性ホスファーゼで処理し、Ｈ６プロモーターの ５′の１０３ｂｐ、複製のプラスミド起点およびＣ５フランキングアームを含有 する３２０３ｂｐ断片を単離した。ワクシニアウィルス供与体プラスミド中で１ ５アミノ酸Ｃｓ　ｐ　ｒ　Ｍ　ｓ　Ｅ　ｓ　Ｎ　Ｓ　１、Ｎ５２Ａをコードする ＪＥＶ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドＪＥＶＬ１４ＶＣ（メイソンら、１９９ １）　（ヌクレオチド３３７−４１２５、コニシら、１９９１）をＨ６プロモー ター中のＥｃｏＲＩとＪＥＶ配列中の５ａｃｌ（ヌクレオチド２１２４）で切断 し、１８０９ｂｐ断片を単離した。ＪＥＶＬ１４ＶＣを、ＤＮＡポリメラーゼＩ のフレノウ断片が充填され、ＴＳＡＴの後のＥａｇＩ部位でのＥｃｌＸＩで切断 し、ＪＥＶ配列内の５ａｃｌ（ヌクレオチド２１２４）で切断し、２０１１ｂｐ 断片を産生じた。１８０９ｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｓａｃ■、２０１１ｂｐ　５ａｃ ｌ充填ＥｃｌＸＩおよび３２０２ｂｐ　ＥｃｐＲＶ充填ＥｃｏＲＩ断片を連結し 、ＪＥＶＣＰＩを産生じた。

実施例７４−ＪＲＶ　１５ａａＣＳｐｒＭ、Ｅを含有するＣ５挿入ベクターの構 成 プラスミドＪ　ＥＶ３６を、Ｈ６プロモーター内のＥｃ。

ＲＶとＪＥｖ配列内（７）ＳｐｈＩ（ヌクレオチド２３８０）で切断し、２０６ ５ｂｐの断片を単離した。プラスミドＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ　（実施例４４で定義 した）を、Ｈ６プロモーター内のＥｃｏＲＶとポリリンカー内のＸｂａＩで切断 し、２０６５ｂｐ断片とアニールしたオリゴヌクレオチド５Ｐ１３１　（配列認 識番号３８２）および５Ｐ１２３（配列認識番号３８３）（Ｓｐｈｌ粘着末端、 Ｅ暗号領域を補充したＴヌクレオチド、翻訳終止、ワクシニア初期転写終止信号 （ＡＴ５ＡＴ　；ユエンおよびモス、１９８７）　、第２の翻訳終止、およびＸ ｂａｌ粘着末端）に連結し、Ｃ５フランキングアームの間のＨ６プロモーターの 制御下で１５アミノ酸ＣＳｐｒＭおよびＥをコードするプラスミドＪＥＶＣＰ５ を産生じた。

実施例７５−ＡＬＶＡＣベースのＪＥＶ組換え対の構成、ＪＥＶＣＰＩをＡＬＶ ＡＣ感染主要ＣＥＦ細胞に移入し、１５アミノ酸ＣＳｐ　ｒ　ＭＳＥ　ＳＮ　Ｓ 　１、Ｎ５２Ａをコードするカナリヤボックス組換え体ｖｃＰ１０７を産生した 。

ＪＥＶＣＰ５をＡＬＶＡＣ感染主要ＣＥＦ細胞に移入し、ＪＥＶ１５　ａａＣ， ｐｒＭおよびＥをコードするカナリヤボックス組換え体ｖｃＰ１４０を産生した 。

ＳＭ）１　（配列認識番号：　３Ｂ２　）　５’−ＣＴ　ｔｇＬ七貝諜賎ｔｇａ 　’ｆ’　−３’実施例７６−組換え体感染細胞中のＪＥＶタンパク質のイムノ ブレシピテーション 前述したようにイムノブレシピテーション実験を行なりた（コニシら、１９９１ ）、ｖｃＰ１０７およびｖｃＰ１４０感染細胞中に産生じたＥタンパク質を、真 正Ｅタンパク質を産生することが示されているＪＥＶ−ワクシニア組換え体によ り産生されたＥタンパク質とともに移動する（コニシら、１９９１）、ｖｃＰ１ ０７は、真正ＮＳＩタンパク質を産生ずることが示されているＪＥＶ−ワクシニ ア組換え体により産生されたＮＳＩタンパク質とともに移動する（コニシら、１ ９９１）。

実施例７フーネズミのｃｃＰ１０７による免疫化腹腔注射により、生後３週間の スイスネズミを１０７ＰＦＵのｖｃＰ１０７で免疫化し、３週間後に選択したネ ズミから血清を採取した。ネズミの半分にｖｃＰ１０７を再接種せしめ、３週間 後に血清を採取した。前述したように、中和（Ｎｅｕｔ）および血球凝集阻害抗 体（ＩＡＩ）について血清をアッセイした（コニシら、１９９１）。ｖｃＰ１０ ７で１度または２度免疫化したネズミは、高い力価のＮｅｕｔおよびＨＡＩ抗体 を発達せしめ、両方の力価は２度目の免疫化により増大した。親ＡＬＶＡＣを投 与したネズミ゛は抗体力価を発達せしめなかった。ｖｃＰ１０７免疫化ネズミに 得た抗体水準は、ＪＥｖ−ワクシニア組換え体での免疫化により達成された水準 と匹敵した（コニシら、１９９１）実施例７８−ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ　（ｖＦ Ｐ９６）　への効能研究 特定病原体感染防止条件（Ｓ　Ｐ　Ｆ）の鶏と市販のブロイラーノ鶏１．：おＩ するＴＲ０ＶＡｃ−ＮＤＶ　（ｖＦＰ９６）（実施例８）のＮＤＶ　にニーカッ スル病ウィルス）に対する防御効能を測定するために、数多くの研究を行なった 。

研究Ａ。

生後１日のＳＰＦ鶏の４つの群に、０．３から６．３１ｏｇ、、ＴＣＩＤｓｏの 投与量の範囲のＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ（ｖＦＰ９６）または親ＴＲ０ＶＡＣウィ ルスを足に筋向経路により接種した。接種部位での反応について鳥を監視し、抗 ＮＤＶ血清中和抗体および血球凝集素抑制抗体の存在の分析のために、接種から １４日後に血清試料を集積した。接種から２１日後に、鳥に５．０１　ｏ　ｇ　 １ｏ５０％卵感染量の短潜伏期性ＮＤＶ菌株テキサスＧＢを筋向接種により抗原 投与した。健康な鳥が防御されたと考えられる抗原投与から１４日間に亘り鳥を 保持した。６．３または２゜６１　ｏ　ｇ　ｌｏＴ　ＣＩ　Ｄ　５ｏのＴＲ０Ｖ ＡＣ−ＮＤＶ　（ｖＦＰ９６）またはＴＲ０ＶＡＣ親ウイルスの筋向接種により 、接種の時点で、ある場合には死亡する皮膚の病害となることが分かった。病害 のひどさには特定の投与量効果があり、これは、１．１から１．４１０　ｇ１Ｂ ＋ＴＣＩ　Ｄ５ｏの投与量で、接種の時点でのわずかな炎症反応に限られる。全 ての場合において、病害は接種の点に限定され、鶏の他の部分には広カラナイ。

効果はＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ中のＮＤｖ　ＦおよびＨＮ遺伝子の発現によるもの ではなく、同様の効果が親ウィルスにも観察された。他の接種経路が用いられた 場合に、高い投与量のＴＲ０ＶＡＣまたはＴＲ０ＶＡＣベースの組換え体の接種 では有害な副作用が見られるので、反応はこの接種経路に特異的である。

血清学分析と防御効能の結果を表４７に示す。ＴＲ０ＶＡＣ親ウイルスを接種し た全ての鳥は、致死量抗原投与のために死亡した。１．１および２．　６１０　 ｇ　＋ｏＴＣＩ　Ｄｓ。

のＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ　（ｖＦＰ９６）をワクチン接種した全ての鳥は、抗原 投与に生き残り、一方０．３１ｏｇｌ。

ＴＣＩＤ、。を投与した鳥の８２％が生存した。これにより、この経路によるこ の組換え体の５０％の防御投与量（ＰＤｓｏ）は０．　３ＴＣＩ　Ｄ５０である ことが分かった。

表　４７ 特定病原体感染防止条件の生後１日のニワトリにおけるＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶの 防御効能および安全性研究ウィルス投与量°　抗体ｂ　安全性Ｃ防ｉｌｌ’ＳＮ 　）ｉｌ　ワクチン接種後　抗原投与後ＲＯＶＡＣ Ｏ，３ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／１７　１７／１７１．４　ＮＤ　ＮＤ　Ｏ／７　７／７ ２．７　ＮＤ　ＮＤ　ｌ／１７　１６／１６６．２　ＮＤ　ＮＤ　５／７　２／ ２ ＴＲＯＶＡＣ−ＮＤＶ Ｏｊ　）ｒｒ　ＮＴ　Ｏ／１７　コ／１７１．１　ＩＴ　ＮＴ　Ｏ／１７　０／ ７２．６　０．８　４．５　０／１７　０／１７６．３　１＋１　６．０　３／ １４　．２／１１対照 無　ＩＴ　ＮＴ　１０／１０ ａ：生後１　日１．：、筋向［路＋、：、　ヨリ’ｒＲｏｖＡｃ＊　タハＴＲ０ ＶＡＣ−ＮＤＶ（７）　イずレカを、鳥に１同棲種した。投与量はＩＯｇｔｏ　 ’ｒｃｌ［）　ｓ。で示す。

ｂ：血清中和（ＳＮ）力価と血球凝集抑制（Ｈｌ）力価をステトした鳥の平均と して示す。最高の抗体希釈の逆数のｌｏｇ＋ｏとして示したＳＮ力価は、細胞変 性効果の完全な中和を示す。最終の抗体希釈の逆数のｌｏｇ。

とじて示した１１１力価は、凝集の抑制を示す。

Ｃ：ワクチン接種した鳥の数に対する死亡した鳥の数の比率。

ｄ：抗原投与した鳥の数に対する死亡した鳥の数の比率。５．０　ｌｏｇ　１０ ＥＩＤ、。のＮＤＶテキサス菌株ＧＢの筋向接種により鳥に抗原投与した。

ＮＤ：検知せず ＮＴニテストせず 研究Ｂ。

市販のブロイラー鶏の２つの供給源とＳＰＦ鶏におけるＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶ　 （ｖＦＰ９６）の防御効能を評価した。生後１日の鳥の３つの群について研究し た。群１：鶏痘ウィルスによりワクチン接種した経験のないふ化場から得た卵か ら鶏をふ化させた。群２：鶏痘ウィルスによりワクチン接種した経験のあるふ化 場から得た卵から鶏をふ化させた。群３：特定病原体感染防止条件鶏を得た。

２．０または４．　０　ｌ　ｏ　ｇ、、Ｅ　Ｉ　Ｄ５ｏのいずれかのＴＲ０ＶＡ Ｃ−ＮＤＶを皮下で鳥にワクチン接種した。ワクチン接種から２１および２８日 後に鳥から採血し、ＮＤＶＨ１抗体の存抗体評価した。また、アガーゲル沈降試 験を用いてワクチン接種後の鶏痘抗体の存在について血清を評価した。ワクチン 接種から２８日後、各群の１０匹の鳥と１０匹の対照に、４．２１　ｏ　ｇｌ＋ ）Ｅ　Ｉ　Ｄ５．）の短潜伏期性のＮＤＶ菌株テキサスＧＢを筋向接種により抗 原投与し、生存した鳥を評価した。また、各群の１０匹の鳥と１０匹の対照に、 鶏痘ウィルスのＮＶＳＬ菌株を翼に刺す接種により抗原投与した。鶏痘抗原投与 からの防御を、接種部位での病害または生着（ｔａｋｅ）の欠如に基づいて評価 した。

この実験結果を表４８に示す。

この結果により、市販のブロイラー鶏はＴＲ０ＶＡＣ−ＮＤＶにより発現された ＮＤＶ抗原に対する検出可能な免疫応答を発達させず、一方ＳＰＦ鶏は免疫応答 を示したことが分かる。市販の鳥には特異的抗ＮＤＶ抗体の欠如にもかかわらず 、短潜伏期性ＮＤＶ抗原投与後に見られた防御水準には差はなかった。アガーゲ ル沈降試験により検出可能な鶏痘ワクチン接種に対する免疫応答は、どの鳥も示 さなかった。検出可能な抗鶏痘抗体の欠如にもかかわらず、全てのワクチン接種 した鳥は、鶏痘抗原投与から防御され、一方ワクチン未接種の鳥は死亡した。こ れらの結果により、雄鳥の鶏痘ウィルスへの先の露出では、鶏痘ベースのＮＤＶ 組換え体をワクチン接種した鶏におけるＮＤＶまたは鶏痘に対する防御免疫の誘 発を妨げないことが分かる。

ヒト組換え体免疫不全ウィルス−ＮＹＶＡＣまたは−ＡＬＶＡＣウィルス；細胞 系に関する以下の実施例７９がら８１のための材料および方法 Ｐ８１５ネズミ肥満細胞種細胞（Ｈ−２’　）をアメリカ型培養コレクションか ら得て、１０％の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン 並びに１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補給したイーグルＭＥＭ中に保 持した。

ネズミ 雌ＢＡＬＢ／ｃ　Ｊ　（Ｈ−２’　）ネズミをジャクソン研究所（ＭＥ、バーハ ーバ−）から購入し、任意に餌と水を与え続けた。全て生後６から１５週間のネ ズミを用いた。

接種 外側尾静脈により０．１ｍｌの食塩加リン酸緩衝液中の５Ｘ１０’プラ一ク形成 単位（ｐ　ｆ　ｕ）を、ネズミに静脈接種した。

血清 ネズミをエーテルで軽く麻酔して、レトロオービタル（ｒｅｔｒｏｏｒｂｉｔａ ｌ）ＩＦから血液を採取した。実験群よりなるネズミからの血液を集積し、凝固 せしめた。

血清を集積し、使用まで一７０℃で貯蔵した。

細胞毒性１９２３球のアッセイおよび細胞毒性１９２３球の記憶前駆体の生体外 刺激 生後６週間の雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃネズミに、５Ｘ１０’ｐｆＵのワクシニ アウィルス（ＮＹＶＡＣ）　、ＨＩＶ−１（１’１１Ｂ）　ｅｎｖを発現する組 換えワクシニアウィルス（ｖＰ９１１）、カナリヤポックスウィルス（ＡＬＶＡ Ｃ）、またはＨＩＶ−１（ＩＩＩＢ）　ｅｎｖを発現する組換えカナリヤポック スウィルス（ｖｃＰ１１２）を静脈接種した。７日後、ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　Ｉ Ｂ）ｇｐ１２０の超可変ｖ３ループ領域に対応するペプチドで一晩インキユベー ションしたＰ８１５細胞または未修飾Ｐ８１５細胞に対する主要ＣＴＬ活性に関 して、ひ臓細胞をアッセイした。最初の免疫化から２２日後、実験ネズミのひ臓 細胞をポックスウィルス感染刺激要因ひ臓細胞でインキュベーションし、前述の ようにペプチド瞬間標識した標的に対する記憶ＣＴＬ活性に関してアッセイした 。第２のＣＴＬ活性を測定するために、最初の接種から２９日後、主要免疫化ネ ズミに最初と同量で同成分の第２の接種を行なった。５日後、ペプチド瞬間標識 棟内に対する細胞毒性活性に関してひ臓細胞をアッセイした。細胞毒性アッセイ に関して、Ｈ−２１Ｐ８１５ネズミ肥満細胞種細胞を、２０μｇ／ｍｌのｖ３ペ プチド（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＧＫ。

アメリカンバイオテクノロジー社）（配列認識番号４５７）の有無のかかわらず 培地中（アール塩を含有し、１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのしグルタミン、１ ００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補 給した）で−晩インキユベーションした。次の朝、遠心分離によりＰ８１５細胞 を洗浄し、２Ｘ１０’の細胞当たり１００μＣｉのＮａ、”Ｃｒｙ、中３７℃で １時間標識した。無傷ひ臓を、安楽死させたネズミから除去して、氷冷したハン クス平衡塩溶液中に入れ、ストマツチャーブレンダ−を用いて１つの細胞懸濁液 に粉砕した。ひ臓細胞懸濁液を低速遠心分離により散会戦場史、アッセイ培地（ １０％の胎児ウシ血清、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのしグルタミン、５Ｘ１ ０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１ ００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ　１６４０）中に再懸 濁せしめた。記憶ＣＴＬ活性に関して、免疫化したネズミからのひ臓細胞を刺激 培地中に再懸濁せしめ（１０％の胎児ウシ血清、２ｍＭのしグルタミン、１０− ’Ｍの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００ μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するアール塩を有するＭＥＭ）、ポック スウィルスまたはポックスウィルス組換え体の１つに感染した未経験同系刺激要 因ひ臓細胞により、りょくりつした２５ｃｍ２組織培養フラスコ中で生体外刺激 した。３７℃での５日間の後、細胞を洗浄し、数え、アッセイ培地中に再懸濁し た。５！クロム標識標的細胞を、４時間の５１Ｃ「放出アッセイのための９６ウ エルマイクロタイタ板中の滴定した効果器細胞に加えた。３つのアッセイに見ら れた標的細胞に対する効果器の比率（Ｅ　：　Ｔ）は、１００：１（主要）、２ ０：１（記憶）および５０：１（第２）であった。細胞毒性のパーセントは、（ 実験５１Ｃ，放出−自発的５１Ｃ，放出）／（最大５１ｃｒ放出−自発的５ＩＣ 「放出）Ｘ１００により計算した。最大放出は、５％のドデシル硫酸ナトリウム を標的細胞に句吠えることにより測定し、一方自発的放出は、効果器細胞の不在 下で標的細胞をインキュベーションすることにより測定した。どの実験において も、最大５１Ｃｒ放出の２０％を超える標的細胞からの５１Ｃ「の自発的な放出 は存在しなかった。誤差のバーは、平均からの１標準偏差を示す。

（＊）Ｐ＜０．０５、スチューデントを検定を適切なワタシニアまたはカナリヤ ワクシニア免疫化ネズミと比較した。

細胞毒性効果器細胞の細胞表面表現型 方法は実質的に、ワクシニアウィルス、カナリヤポックスウィルスベクター（Ｎ ＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣ）またハＨＩＶ　ＩＩＩＢ　ｅｎｖを発現するワクシニア ウィルスまたはカナリヤポックスウィルス組換え体（ｖＰ９１１、ＶＣＰ１１２ ）で免疫化したネズミひ臓細胞に関して行なった。２回目の接種は、最初の接種 から３０日後に行なった。

ｖ３ペプチド瞬間標識した標的に添加する前に、ひ臓細胞を、２段階プロトコル においてネズミＴリンパ球表面抗原に対する単クローン性抗体または同種異系抗 血清で処理した。手順にいうと、ひ臓細胞を、同種異系Ｔｂｙ１．２（セダーレ ーン）、単りローン抗体ＣＤ−４（１７２，４、デューク大学医療センター、Ｋ 、Ｊ、ワインホールドからのギフト）、または単りローン抗体Ｌｙｔ２．２（セ ダー−レーン）が加えられる細胞毒性培地（０，２％のＢＳＡおよび５ｍＭのＨ ＥＰＥＳを含有するＲＰＭＩ　１６４０）に１ｍｌ当たり１０７の生存可能細胞 で再懸濁せしめた。５℃での３０分後、細胞を洗浄し、補体（セダーレーン、ウ サギ　ロートクスＭ）の有無にかかわらず２つの等しい部分に分けた細胞毒性培 地の元の容積に再懸濁せしめ、３７℃で４５分間インキュベーションした。次い で細胞をアッセイ培地中で洗浄し、前処理細胞密度に基づいて、５時間の５ＩＣ ，放出アッセイに添加する前に、１００：１（主要）、１０：１（記憶）、また は８０：１（第２）の標的細胞に対する効果器の比率を近似するアッセイ培地の 容積中に再懸濁した。誤差のバーは平均からの１標準偏差を示す。

ＨＩＶ　ＩＩＩＢ　ｇｐ１２０の■３ループ領域のＣＴＬ抗原受容体認識の特異 性 細胞毒性１９２８球および細胞毒性１９２８球の記憶前駆体を、前述したように ネズミのｖｃＰ１１２による接種により産生じた。Ｐ８１５標的細胞を、ＨＩＶ −Ｉ　ＩＩＩ　Ｂ　（ＣＮＴＲＫＲＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＧＫ）（配列認 識番号３８４）　、ＭＮ　（ＣＮＫＲＫＲＩＨＩＧＰＧＲＡＦＹＴＴＫＮ）（配 列認識番号３８５）、またはＳＦ２　（ＣＮＴＲＫＳＩＹＩＧＰＧＲＡＦＨＴＴ ＧＲ）（配列認識番号３８６）からのｖ３ペプチドで一晩瞬間標識したことを除 いては、上述したように、細胞毒性１９２８球のアッセイを行なった。標的細胞 に対する効果器の比率は、１００：１（主要）、２０：１（記憶）、および５０ ：１（第２）であった。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｇｐ１２０に対する抗体応答ＥＬ　Ｉ　ＳＡ板の ウェル（イムロンＩＩ）を、炭酸塩緩衝液、ｐＨ９，６中の０．５μｇの部分的 に精製したＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｇｐ１２０　（ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄｒ 。

Ｇ、フランチｍ；）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を０．０５％のト イーン２０　（ＰＢＳＴ）を含有する食塩加リン酸緩衝液で洗浄した。次いで板 を、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳＴにより３７℃で２ 時間遮断した。ＰＢＳＴにより洗浄後、最初に血清を、０．１％のＢＳＡを含有 するＰＢＳＴ　（希釈緩衝液）で１＝２０に希釈した。さらに血清をＥＬ　Ｉ　 ＳＡ板のウェル中で２倍に連続的に希釈した。この板を３７℃で２時間インキュ ベーションし、ＰＢＳＴで洗浄した。ウサギ抗ネズミイムノグロブリン（ダコ） に接合されたホースラディツシュペルオキシダーゼを希釈緩衝液中で１　：　２ ０００に希釈して、ＥＬＩＳＡ板のウェルに加え、３７℃で１時間インキュベー ションした。ＰＢＳＴでの洗浄後、基体緩衝液中のＯＰＤ　（ｏ−フェニレンジ アミンジヒドロクロライド）を加え、周囲温度で約２０分間に亘り呈色せしめた 。

反応を、２６５ＭのＨ２ＳＯ，の添加により停止せしめた。

４９０ｎｍでの吸収を、バイオチックＥＬ−３０９ＥＬ　ＩＳＡリーダーで測定 した。０，４の吸収値を与えた希釈の逆数として血清の終点を定義した。

実施例７９−ＨＩＶ　ｅｎｖを発現する組換え体カナリヤポックスウィルスはＨ ＩＶ特異特異的細胞毒性シリ２８球活性発する ＨＩＶカナリヤポックスウィルス組換え体（ｖｃＰ１１２；実施例１８で定義し た）での最初の接種から７日後、ＨＩＶ　Ｖ３ペプチド瞬間標識標的細胞に対す るひ臓細胞の細胞毒性応答を、同一の投与量、５Ｘ１０’ｐｆｕの同一のＨＩＶ 　ｅｎｖ遺伝子を発現するワクシニアウィルス組換え体（ｖＰ９１１）（実施例 １８）により誘発した細胞毒性応答に粗く等しくした（第３１図）。適切な生体 外刺激または第２の接種後に、カナリヤポックスウィルス組換え体を与えたネズ ミのひ臓細胞の細胞毒性の水準は増大し、同様にワクシニアウィルス組換え体を 投与したネズミからのひ臓細胞と一致した。それぞれ、弁組換えワクシニアウィ ルスまたはカナリヤポックスウィルスベクター、ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣを 接種したネズミのひ臓細胞からはそのような細胞毒性応答は検出されず、ＨＩＶ 　ｅｎＶ遺伝子を発現するポックスウィルス組換え体での免疫化の必要性を確認 した。さらに、接種養生にもかかわらず、どのようなネズミからのひ臓細胞から の未修飾Ｐ８１５細胞に対しては細胞毒性反応性は検出されなかった。それゆえ 、組換えワクシニアウィルスまたは、より著しくは、ＨＩＶ−１からのｅｎｖ暗 号配列を発現する組換えカナリヤポックスウィルスを接種したネズミのみが、ｖ ３特異的細胞毒性応答を示した。

実施例８〇−細胞毒性効果器細胞の特徴付けＨＩＶ−Ｉ　Ｖ３ペプチド瞬間標識 標的の溶菌に関するひ臓細胞の同一性を測定するために、ネズミをｖｃＰ１１２ で免疫化した。それぞれを免疫化した後に、または最初の接種から２１日後に生 体外刺激したときに、２段階枯渇方法を行ない、ひ臓細胞を、ｖ３ペプチド瞬間 標識Ｐ８１５細胞に対する細胞毒性に関して評価した。カナリヤボックスベクタ ーＡＬＶＡＣを接種したネズミは、ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできるひ 臓細胞を産生じなかった。

１回の免疫化後、ｖｃｐＨ２は、ｖ３ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできる ひ臓細胞を誘発した。溶菌効果器細胞は、抗ネズミＴｈｙ１．２またはＬｙｔ２ ．２および補体による処理に感度があり、第３２図に示すように抗ＣＤ４に対し て抵抗があった。この図は、細胞毒性Ｔリンパ球細胞表面抗原”ｒｈｙｌ、２お よびＬｙｔ２．２に対する抗体に対しての、ｖｃＰ１１２で免疫化したひ臓細胞 からの細胞毒性効果器細胞の感度を示す。補体またはいずれの単クローン性抗体 または同種異系抗血清のみのどれもこれらの細胞の細胞溶解性作用に影響しなか った。３００回目投与した２回目の免疫化から５日後にも同様の結果が得られた 。１０目の接種から２１日後、ｖｃＰ１１２感染同系ひ臓細胞による生体外刺激 により、抗Ｔｈｙ１．２に部分　−的に感度があるが、抗Ｌｙｔ２．２に完全に 感度があり。

抗ＣＤ４には抵抗がある溶菌効果器細胞となる。ｖｃＰ１１２を接種したネズミ からのひ臓細胞のｖＰ９１１による生体外刺激後には、これらのＴｈｙｌ、２− １ＣＤ４−１Ｌｙｔ２．２＋効果器細胞は見られない。いうまでもなく、ＨＩＶ 　Ｖ３ループ特異的細胞毒性は、ＣＤ４ではなくＴｈｙｌ、２およびＬｙｔ２． ２を発現するＴリンパ球の個体群により媒介されたことが明確である。

実施例８ｌ−ＨＩＶ　ｇｐ１２０（７）Ｖ３ループ領域（７）ＣＴＬ抗原受容体 の特異性 Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列中の小さな変更に 対して精巧に感度がある。ＨＩＶｇｐ１２０のｖ３ループ領域は超可変性であり 、ＨＩＶ単離体の中で免疫学的に異なる。超可変性は、置換といくつかのアミノ 酸の添加にある。ＨＩＶカンリヤポックスウィルス組換え体により産生された細 胞毒性細胞の特異性を試験するために、ＣＴＬ活性に対する感受性は、ＨＩＶ単 離体１１１　Ｂ、　ＭＮ、またはＳＦ２＋７）ｇｌ）１２０＋７）Ｖ３ループ領 域に対応するペプチドで瞬間標識したＰ８１５標的細胞の中で比較した。ＨＩＶ 特異的主要ＣＴＬ活性は、第３３図に示したように、ＨＩＶ単離体ＭＮまたはＳ Ｆ２のｇｐ１２０のｖ３ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識した標的細胞 ではなく、ＨＩＶ単離体１１１Ｂのｖ３ループに対応するペプチドで瞬間標識し たＰ８１５標的細胞のみに限定された。第３３図は、ＨＩＶＭＮまたはＳＦ２の ｖ３ループのではなく、ｇｐ１２０のＨＩＶ　ＩＩＩＢ超可変ｖ３ループの細胞 毒性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を説明するものである。生体外刺激された、 ＨＩＶ特異的記憶ＣＴＬ活性およびカナリヤポックスウィルス組換え体ｖｃＰ１ １２による免疫化により誘発された第２のＣＣＴＬ活性に関して、同様の結果が 得られた。それゆえ、ＨＩＶ単離体１１１Ｂのｅｎｖ遺伝子を発現する組換えカ ナリヤポックスウィルスにより誘発されたＨＩＶ特異的ＣＴＬは、同一の抗原単 離体から誘導された標的エピトープのみを認識する。これらの結果は明確に、Ｈ ＩＶカナリヤポックスウィルス組換え体により産生されたリンパ球効果器細胞の 精巧な特異性を示し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性としての非特異的効果 器機構を除外する。これらの結果は、ＨＩＶ　Ｖ３特異的ネズミ細胞毒性Ｔリン パ球によるエピトープ認識の正確さを特徴付ける他の報告と完全に一致する。

実施例８２−ＮＹＶＡＣ−およびＡＬＶＡＣベースノＨＩＶ組換え体を接種した ネズミの抗体応答ＨＩＶに対する体液性応答を評価するために、０日にワクシニ アウィルスＨＩＶ組換え体またはカナリヤポックスウィルス組換え体でネズミを 免疫化し、４週間目に２回目の免疫化を行なった。最初の免疫化から２０週間に 亘り、様々な間隔でネズミを採血した。各処理群から集積した血清を、抗原とし て精製したｇｐ１２０を使用したＥＬＩＳＡによりＨＩＶに対する抗体に関して アッセイした；ベクター（ＮＹＶＡＣ，ＡＬＶＡＣ）またはワクシニアウィルス 組換え体ｖＰ９１１またはＨＩＶ−１ｅｎｖを発現するカナリヤボックス組換え 体（ｖｃＰ１１２）で免疫化したネズミのＨＩＶ　ＩＩＩ　Ｂ　ｇｐ１２０に対 する抗体応答を提供する第３４図に結果を示す。ここで逆三角形は、２回目の接 種の投与時間を示す。主要抗体応答は、一般的に穏やかであったが検出可能であ った。２回目の接種後に、ｖＰ９１１およびｖｃＰ１１２の両方出免疫かしたネ ズミの抗体力価は増大し、６週目に１０，０００を超える力価でピークとなった 。これらの抗体力価は、研究の期間に亘りほぼ同一の水準で保持された。それゆ え、カナリヤポックスウィルスＨＩＶ組換え体、ｖＰ１１２は、著しい抗体応答 を誘発することができた。

ＨＩＶ−１のｅｎｖ遺伝子を発現するカナリヤポックスウィルスによるネズミの 接種により、細胞毒性Ｔリンパ球の特徴：免疫化の必要条件、細胞表面表現型、 記憶、および簡潔なエピトープ特異性を有するひ臓細胞活性を誘発する。さらに 、この組換えカナリヤポックスウィルスの接種によりＨＩＶ−１ｇＭ２０にいす る抗体応答が誘発される。

実施例８３−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ＋：ｌ：よるＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅ ｎｖを発現するＮ　Ｙ　Ｖ　Ａ　Ｃ−’およびＡＬＶＡＣベースＨＩＶ−１組換 え体の誘導 ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ配列を、それぞれ、ＨＩＶ−１（ＭＮ）のゲノムｃ ＤＮＡからの１７７４ｂｐおよび１８０３ｂｐサブ断片を含有するプラスミドｐ ＭＮ１．８−９およびｐＭＮｌ、８−１０から誘導した。これらのプラスミドは 、Ｄｒ、　Ｒ，Ｃ，ガｏ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）の研究所から得た。オリゴヌクレオ チドＨＩＶＭＮ６（配列認識番号３８７） （５・−〇ＣＧ？ｒＡＴｒＡＡＴＧＡＴＣＴＧＴＡＧ−３’）およびＨＩＶ３Ｂ ２　（配列認識番号１５１）を用いたｐｃＲによりｐＭＮｌ、８−９からのこれ らの配列を増幅し、続いてＫｐｎｌ／ＥｃｏＲ１による切断により、１，０２６ ｂｐ　Ｋｐｎｌ／ＥｃｏＲＩ断片を誘導した。この断片をＫｐｎｌで切断したｐ ＢＳ−５Ｋに挿入し、ｐＢｓＭＩＤＭＮを産生じた。

オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ５Ｃ配列認識番号３８８）（５１−ＡＴＣＡＴＣ ＧＡＧＣＴＣＴＧ？ｒＣＣＴＴＧＧＧ？ｒＣＴＴＡＧ−：ｌ　ｌ　）およびＨＩ ＶＭＮ３Ｐ　（配列認識番号３８９）（５’−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴ入 入入入Ａ？Ｘ’ＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣ−３’）を用い たＰＣＲと、続いてのＳａｃ　ＩとＸｂａＩによる切断により、ｐＭＮｌ、８− １０から１，０２８ｂｐ　Ｓａｌ　１／Ｘｂａ　Ｉ断片を誘導した。この断片を 、４０４Ｍ’ＥｃｏＲＩ／５ａｃｌ断片とともに、ＥｃｏＲＩとｘｂａＩで切断 したｐＢＳ−３Ｋに連結した。テンプレートとしてのｐＭＮｌ、８−９およびオ リゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１（配列認識番号１４４）並び１．：ＨＩＶＭＮ４ （配列認識番号３９０） （５１−人ＴＣＡＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴＣＧＣＴＧＣＴＣ−３彎）を用いた ＰＣＲにより、４０４ｂｐ断片を誘導した。産生じたプラスミドをｐ　Ｂ　Ｓ　 ３ＭＮと称した。

ｐＢｓＭＩＤＭＮからの１，０２６ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｋｐｎｌ断片を、Ｅｃｏ ＲＩ／Ｋｐｎｌで切断した４、３１５ｂｐ　ｐＢＳ３ＭＮに挿入した。このプラ スミドは、５′側領域を除いたｅｎｖ遺伝子のほとんどを含有する。

ｐＨ６ＨＩ　Ｉ　ＩＢＥ　（実施例１８に定義した）から３１８ｂｐ　Ｋｐｎｌ 断片を単離することにより、ワクシニアウィルスＨ６プロモーター（ゲーベルら 、１９９０　ａ％ｂ）およびｅｎｖ遺伝子の５′側領域を得た。この断片を、ｐ ＢＳＭＩＤ３ＭＮからの２．９ｂｐ　Ｋｐｎｌ／ＸｂａＩ断片とともに、Ｋ　ｐ 　ｎ　Ｉ　／　Ｘ　ｂ　ａ　Ｉ切断ｐＢＳ−８Ｋに連結した。産生じたプラスミ ドをｐＨ６ＨＭＮＥと称した。

Ｈ６プロモーターの３′側の２６ｂｐに３′が隣接した金縁ＨＩＶ−１（ＭＮ） 　ｅｎｖ遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥからの２．７ｂｐ　Ｎｒｕｌ／Ｘｂ ａｌ断片をプラントエンドし、Ｎｒｕｌ／ＳｍａＩ切断ｐ　Ｓ　ＰＥＡＲ６に挿 入した。これによりプラスミドｐＨＡＨＩＶＭＮＥを産生じた。プラスミドｐＳ ＰＨＡＢ６を以下のように誘導した。

プラスミドｐＭＰ２ＶＣＬ　（ＫＩＬ宿主範囲遺伝子の上流のワクシニア配列内 にポリリンカー領域を含有する）を、ポリリンカー内のＨｉｎｄｌｌｌとＸｈｏ ｌで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチド５ＰＨＰＲＨＡ　ＡからＤまでに 連結し、 ５ＰＨＰＲＨＡ　Ｇ　（配列認識番号：　３９３　）　３ｌ−ＴｒＡＴｒ入ＧＴ にｆ’ＴＴＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＣＧＣＴＡＴＡＧＧＣＡＡＴＴＣＡＡＡ ＣＡＴＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴ−５’５ＰＨＰＲＩｔＡ　Ｑ　（配列認識番号：　 ３９４　）　３１−ＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＴＡＴＧＡＡＴｆｆｆ’ｌ’ＣＡＣＴ ＴＴτＡＴＴｒＡＴＧＴ’Ｘ’ｒＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＣＡＡａｉ ＡＡＣＴＴ’ｒＣＧＣＴＣｒ−５’　）ＨｉｎｄＩＩＩ部位、Ｈ６プロモーター −１２４から−１（バーカスら、１９８８９　）およびＸｈｏ　Ｉ、Ｋｐｎ　Ｉ ＳＳｍａｌＳＳａｃｌ並びにＥｃｏＲ１部位を含有するｐＳＰ１２６を産生じた 。

プラスミドｐＳＤ５４４　（ポリリンカー領域で置換したＨＡ遺伝子の部位を囲 むワクシニア配列および６つの読取りワクシニア中の翻訳終止コドンを含有する ）をポリリンカー内のＸｈｏｌで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ　Ｉのフレノウ断 片で充填し、アルカリホスファターゼで処理した。

５Ｐ１２６をＨｉｎｄｌＩＩで切断し、フレノウで処理し、Ｓｍａ　Ｉでの切断 によりＨ６プロモーターを単離した。ｐＳＤ５５４へのＨ６プロモーター断片の 連結により、ポリリンカー領域（ＨＡ転写の方向）内にＨ６プロモーターを含有 したｐｓＰＨＡｌ（６を産生した。この挿入プラスミドにより、ワクシニアＨＡ 遺伝子（Ａ５６；ゲーベルら、１９９０ａ、ｂ）の異種遺伝子材料による置換が 可能になった。

ｐＨ６ＨＭＮＥからの２．８ｋｂ　ＸｂａＩ／部分的Ｋｐｎｌ断片を単離し、Ｘ ｂａＩとＫｐｎＩで切断したｐＣ５Ｌ（実施例４４に定義した）に挿入した。産 生じたプラスミドをｐｃ５ＨＩＶＭＮＥと称した。

ブラスミ）’ｐＨＡＨＩＶＭＮＥおよびｐｃ５ＨＩＶＭＮＥを、治療ウィルスと しての、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）　と ともに生体外１１換え実験に用いた。これらは、標準方法により行なった（ピッ チｍ：ら、１９８７）。組換えウィルスから誘導したプラークを、放射線標識し たｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションにより同定した （ピッチｍ：ら、１９８７）。３回のプラーク精製後、組換えウィルスを増幅し た。ＮＹＶＡＣ−ベース（７）ＨＩ　Ｖ　−１（ＭＮ）　ｅｎｖ組換え体をｖＰ １００８と称し、ＡＬＶＡＣベースの組換え体ｖｃＰ１２５と称した。

組換えウィルス、ｖｃＰ１２５およびｖＰ１００８を、前述した方法を用いて蛍 光抗体法およびイムノプレシビテーションによりＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｅｎｖ遺 伝子の発現に関して分析した（ティラーら、１９９０）。ＨＩＶ血清陽性個体か ら集積したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｄｒ、に、ステイマー から得た）をこれらのアッセイに用いた。蛍光抗体法からの結果により、ｖｃＰ １２５またはｖＰｌｏｏｇに感染した細胞は、その表面にＨＩＶ−１（ＭＮ）遺 伝子産生物を発現することが示された。ＶＰ１００８およびｖｃＰ１２５感染細 胞から調製した溶解産物からのイムノブレシビテーションは、それぞれ約１６０ ｋＤａ、１２０ｋＤａ、および４１ｋＤａの見かけの分子質量を有する３つの主 要ＨＩＶ−１−特異的タンパク質を示した。これらは、前駆体エンベロープ糖タ ンパク質（１６０ｋＤａ）りおよびタンパク質分解により誘導した熟成形状（１ ２０ｋＤａおよび４１ｋＤａ）の発現と一致する。

実施例８４−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣｔ：よ６すＩ（ＩＶ−１（ＭＮ）　ｇ ｐ１２０の発現 オリゴヌクレオチドＴ７（配列認識番号３９５）（５１−ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴＡＧ−３’　）オヨびＨＩＶＭＮ１２０（配列認識番号３９６）（５ 雷−ＡＴＣＡＴＣｒＣＴ を用いてｐＢＳ３ＭＮから３９１ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片を増幅し、続 いてＥｃｏＲＩとＸｂａｌで切断した。この断片をｐＨ６ＨＭＮＥ　（実施例８ ３で定義した）から誘導した４、２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片に連結した 。産生じたプラスミドは、ｐＢＳ−３Ｋ中のＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０の ポックスウィルス発現カセツテを含有し、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０と称した。

１．７ｋｂ　Ｘｂａｌ／部分的Ｋｐｎｌ断片を単離し、Ｋｐｎｌ／ＸｂａＩで切 断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生じたプラスミドをｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０と称 した。ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０をＮＹｖＡＣへ組み込む挿入フラスミト ハ、ｆｉ初ｉ：ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０から１．６ｋｂ　ＮｒｕＩ／ＳｍａＩ断 片を単離することにより得た。

この断片をＮｒｕＩとＳｍａ　Ｉで切断したｐＳＰＨＡＨ６ニ挿入シ、ｐＨＡＨ ＩＶＭＮ１２０を得た。

挿入プラスミド、ｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０およびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０を、治 療ウィルスとして（７）ＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６ ）とともに組換え実験に用いた。これらのアッセイおよびプラーク同定と精製は 標準方法により行なった（ピッチｍ：ら、１９８７）。

放射線標識シｆ：ＨＩ　Ｖ　−１（ＭＮ）　ｇ　ｐ　１２０特異的プローブに関 してハイブリダイゼーション分析を行なった。

ＡＬＶＡＣベー、１）ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０組換え体をｖｃＰ１２４ と称し、ＮＹＶＡＣベース（７）ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０組換え体をｖ Ｐ１００４と称した。

ｖｃＰ１２４およびｖＰ１００４に感染した細胞を、蛍光抗体法およびイムノブ レシピテーションにより、ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０を発現した組換え体 の存在に関して分析した。これらのアッセイは、前述したように（ティラーら、 １９９０）　、ＨＩ　Ｖ−血清陽性個体から集積したヒトの血清（ＣＡ、エメリ ービル、シロン社、Ｋ、ステイマーから得た）を用いて行なった。これらの研究 からの結果により、ｖｃＰ１２４およびｖＰ１００４のいずれかに感染シタ細胞 ハ、ＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０を含有したことが分かり、一方ｇｐ１２０ は、親ウィルス、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣに感染した細胞および未感染細胞 には観察されなかった。

実施例８５−ＡＬＶＡＣ＃よびＮＹＶＡＣによるＨＩＶ−１ｇｐ１６０の非開裂 形状の発現 ＨＩＶ−１（１１１Ｂ）　ｇｐ１６０の非開裂形状を発現するために、スレオニ ン突然変異に対するアルギニンをグオらにより示されたように（１９９０）　、 アミノ酸５１１で操作した（ラトナーら、１９８５）。感染細胞の表面からのｇ ｐ１２０の放出を減少するためにこれらの変更を行なった。

これらの操作を以下のように行なった。オリゴヌクレオチド（配列認識番号３９ ７） （５’−ＧＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＡＪｋＴＡＡＴＣ−３’）およびＨＩＶＥ ＣＢ　（配列認識番号３９８）（５１−ＧＣＴＣＣＴＡ’ｒ’ｒＣＣＣＡＣＴＧ ＣＡＧＴ’ｒＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＧＣＡＣ−３１）を用いてｐＨ６ＨＩ　Ｉ　 Ｉ　ＢＥからの配列を増幅し、続いてＰｓｔｌとＸｂａｌでの切断により３７６ ｂｐ　Ｐｓｔｌ／Ｘｂａｌ断片を得た。この断片を、ｐＨ６ＨＩ　Ｉ　Ｉ　ＢＥ からの４．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片と１．ｏ６１ｂｐ　Ｐｓｔｌ／Ｘ ｂａＩ断片に連結し、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＥＣを産生した。

ｇｐ１６０カセツテに連結したＨ６プロモーターの３′側２６ｂｐを含有スル、 ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＥｃがらノ２゜６ｋｂ　Ｎｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片を単離し、 ｐＢＳＨＶＳ（実施例６０で定義した）の３．Ｏｋｂ　ＮｒｕＩ／Ｘｂａｌ断片 に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭを産生した。

Ｎｒｕ　ＩとＸｂａｌでの切断により、Ｈ６プロモーターの３′側２６ｂＤおよ びハンターンウィルスＳ配列を切除した。３．Ｏｋｂ　Ｎｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片 は、ｐＢＳ−３Ｋプラスミド中にＨ６プロモーターの５′側１ｏｏｂｐを含有す る。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＥｃＭからの２．８ｋｂ　Ｘｂａｌ／部分的Ｋｐｎｌ断片を Ｘｂａｌ／Ｋｐｎｌで切断したｐＣ５Ｌ　１．：連結し、ｐｃ５ＨＩＶ３ＢＥＥ ｃを産生した。ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣＭからの２．７ｋｂ　Ｎｒｕｌ／Ｘｂａ ｌ断片をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのフレノウ断片でプラントエンドし 、Ｎｒｕｌ／Ｓｍａｌで切断したｐｓＰＨＡＨ６に挿入し、ｐＨＡＨＩＶ３ＢＥ Ｅｃを産生した。

治療ウィルスとしての、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰｐｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖ Ｐ８６６）を用いた標準方法（ピッチ−ら、１９８７）により、挿入プラスミド 、ｐｃ５ＨＩＶ３Ｂ　Ｅ　Ｅ　ＣオヨびｐＨＡＨＩＶ３ＢＥＥｃを生体外組換元 実験に用いた。ＨＩＶ−１ｅｎｖ遺伝子に特異的な放射線標識プローブを用いた 標準プラークハイブリダイゼーション分析（ピッチ一二ら、１９８７）により組 換えプラークを同定した。３回の精製後に、組換えウィルスを増幅した。ＡＬＶ ＡＣベースのＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｇｐ１６０（非開裂可能）をｖｃＰ １２６と称し、ＮＹＶＡＣベースのものをｖＰ１０２０と称した。

ＨＩＶ血清陽性個体から集積したヒトの血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、 Ｋ、スティマーから得た）を用いてＶＰ１０２０およびｖｃＰ１２６感染細胞に ついて、前述した方法（ティラーら、１９９０）により、蛍光抗体法およびイム ノブレシピテーション分析を行なった。蛍光抗体法の結果により、ｖｃＰ１２６ またはｖＰ１０２０のいずれからに感染した細胞の表面上のＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ 　ＩＢ）ｇｐ１６０　（非開裂可能形状）の表面発現が示された。さらに、イム ノブレシビテーションの結果により、熟成ｇｐ１２０およびｇｐ４１フレームに タンパク質分解的に開裂されなかったこれらの感染細胞中にＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ 　ＩＢ）ｇｐ１６０の存在が示された。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｇｐ１６０の非開裂可能形状を追跡し、組換えウ ィルスを以下のようにして得た。

オリゴヌクレオチドＨＩＶＭＮ３Ｐ（配列認識番号３８（５’−ＡＴＣＡＴＣＴ ＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴ’ｒＡＴＡＧＧＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣ Ｃ−３’）オ、）：、ｒｊＨＩ　ＶＥＣＡ　（配列認識番号３９９）（５’　− ＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＭＡＣＴＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＴ　ＡＧＧＡＧＣ−３雪 ）を用いたｐＨ６ＨＭＮＥからのＰＣＲ増幅と続いてのＰｓｔｌとＸｂａＩでの 切断により、Ｐｓｔｌ／ＸｂａＩ断片を得た。１０６１ｂｐ断片を、ｐＢｓＨＩ ＶＮＮＴかラノ３９１ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ形状（下記）およびｐＨ６Ｈ ＭＮ　Ｅからの４．２ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片（実施例８３に記載した ）に連結した。産生じたプラスミドをｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃｌと称した。ＨＩ Ｖ　ｅｎＶ挿入物の配列分析により、１つのヌクレオチドが失われたことが示さ れた。これを訂正するために、以下の操作を行なった。ｐＨ６ＨＭＮＥからの４ ．６ｋｂ　５ａｃＩ／ＸｂａｌによりｐＢＳＨＩＶＭＮＥＥＣが形成された。

ｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃからの２．６　Ｎｒ、ｕｌ／Ｘｂａｌ断片を挿入し、フ レノウでプラントエンドし、Ｎｒｕ１／Ｓｍａｌで切断したｐＳＰＨＡＨ６（実 施例８３で定義した）に挿入した。産生じたプラスミドをｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥ Ｃと称した。ｐＢｓＨＩＶＭＮＥＥｃからの２゜６ｋｂ　Ｎｒｕｌ／ＸｂａＡＩ 断片もＮｒｕｌ／Ｘｂａｌで切断したｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６　（下記）に挿入 し、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを産生した。

挿入プラスミド、ｐＨＡＨＩＶＭＮＥＥｃおよびｐＣ５ＨＩＶＭＮＥＥＣを、治 療ウィルスとしての、それぞれＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＡＬＶＡＣ（Ｃ Ｐｐｐ）とともに、標準組換え実験（ピッチー二ら、１９８７）に用いた。

放射線標識したＨＩＶ　ｅｎｖ特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイ ブリダイゼーション（ピッチ−二ら、１９８７）より、組換えウィルスを同定し 、プラーク精製した。

次いで精製した組換えウィルスを増幅した。ＥＩＶ−１（ＭＮ）非開裂可能ｇｐ １６０を含有するＮＹＶＡＣベースの組換え体をｖＰ１０７８と称し、ＡＬＶＡ ＣＯものをｖｃＰ１４４と称した。

ｖｃＰ１２６およびＶＰ１０７８の発現分析を上述したように行なった。これら の結果により、発現は、質的に■ＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）対照物、ｖＰ１０２ ０およびｖＣＰ１２６と等しいことが分かった。

実施例８６−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣＩ、Ｊ、るＨＩＶ−１ｅｎｖの非開裂 可能分泌形状の発現 タンパク質分解的に開裂されず、遺伝子産生物のカルボキシ末端の近くの膜内外 配列の除去により分泌されるＨ１’Ｖ−１（ＭＮ）　ｅｎｖを発現するＡＬＶＡ Ｃ−およびＮＹＶＡＣベースの組換えウィルスを産生じた。最初にｐＨ６ＨＭＮ Ｅ　（実施例８３に定義した）からのこれらの配列をオリゴヌクレオチドＨＩＶ ＥＣＡ　（配列認識番号３９９）オヨびＨＩＶＭＮＴＩ（配列認識番号４００） （５’−ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＪＩＡＡＴＴＡＣＡＡＡＣ’！ＴＧ ＣＣＣＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴｒＣＣ−３’　）を用いて増幅し、続いてＰｓｔ Ｉ（５’末端）およびｘｂａｌ（３’末端）での切断により５０２ｂｐ　Ｐｓｔ ｌ／ＸｂａＩ断片を得た。この断片は、ヌクレオチド７２１９から７８０８に対 応する（ラトナーら、１９８５）。この断片は、ｅｎｖ発現カセツテの３′末端 として作用する。それ自体、ｅｎｖ遺伝子産生物は、膜内外領域が欠如し、オリ ゴヌクレオチド（配列認識番号４００）により提供される終止コドンにより終止 せしめられ、オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）を用いて 提供された５１１（上記）でのアミノ酸変化により開裂されない。この５０２ｂ ｐ断片を、オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号１４４）およびＨ ＩＶＥＣＢ　（配列認識番号３９８）、並びにｐＨ６ＨＭＮＥに対する４、２ｋ ｂＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌ断片を用いたＰＣＨによりｐ　Ｈ６ＨＭＮＥから誘導し た３９１ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ断片に、この５０２ｂｐ断片を連結した。

産生じたプラスミドをｐＢＳＨＩＶＭＮＴと称した。

ｐＢｓＨＩＶＭＮＴからの２，２ｋｂ　Ｘｂａｌ／部分的Ｋｐｎｌ断片を単離し 、ＸｂａＩとＫｐｎｌで切断したｐＣ５Ｌに挿入した。産生じたプラスミドをｐ ｃ５ＨＩＶＭＮＴと称した。ｐＢＳＨＩＶＭＮＴがら２．ｌｋｂ　ＮｒｕＩ／Ｘ ｂａｌ断片を単離することにより、ＮＹＶＡＣ挿入プラスミドを誘導した。次い で、この断片を２ｍＭのｄＮＴＰの存在下でＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ のフレノウ断片によりプラントエンドし、ＮｒｕＩとＳｍａＩで切断したｐｓＰ ＨＡＨ６１：挿入し、ｐＨＡＨＩＶＭＮＴを産生した。

挿入プラスミド、ｐＣ５ＨＩＶＭＮＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮＴを、治療ウィル スとしての、それぞれＡＬＶＡＣ（ＣＰ　ｐ　ｐ）およびＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６ ６）とともに標準組換え実験（ピッチｍ＝ら、１９８７）に用いた。放射線標識 したＨＩＶ　ｅｎｖ特異的プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーショ ン（ピッチｍ＝ら、１９８７）により組換えウィルスを同定した。増幅の前に、 組換えウィルスに３回の精製を行なった。ＡＬＶＡＣベースのＨＩＶ−１（ＭＮ ）　ｅｎｖ（非開裂可能；分泌）をｖｃＰ１２０と称し、ＮＹＶＡＣのものをｖ Ｐ９４４と称した。

前述した方法により（ティラーら、１９９０）　、ＨＩ　Ｖ血清陽性個体から集 積したヒト血清を用いて、ＶＣＰ１２０およびｖＰ９９４感染細胞に関してイム ノプレシピテーションを行なった。ｖｃＰ１２０およびｖＰ９９４の両者は、非 開裂可能、切形遺伝子産生物と一致する分子量を有するＨＩＶ−１（ＭＮ）ｅｎ ｖ特異的遺伝子産生物を発現した。

さらに、ｖｃＰ１２０およびｖＰ９９４感染細胞培養からの細胞不含有培地のイ ムノプレシピテーションにより、このｅｎｖ遺伝子産生物の分泌が示された。

ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｅｎｖに関して同様の構成を操作した。これを行 なうために、以下の操作を行なった。

最初にｐＨ６ＨＩ　Ｉ　ＩＢＥ　（実施例１８に定義した）からのこれらの配列 を、オリゴヌクレオチドＨＩＶＥＣＡ（配列認識番号３９９）およびＨＩＶ３Ｂ Ｔ（配列認識番号４（５’　−ＡＴＣＡＴＣｒＣＴＡＧＡＡＴＡＪＩＡＡＡＴＴ ＡＣＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＴＴｒＡＴＣＴＡＡＴＴＣＣ−：ｌ　ｌ　）を用い て増幅し、続いてＰｓｔｌとＸｂａＩでの切断により４８７ｂｐ　Ｐｓｔｌ／Ｘ ｂａｌ断片を得た。ｐＢＳＨＩＶ３ＢＥＥＣから３９７ｂｐ　ＥｃｏＲＩ／Ｐｓ ｔＩ断片を単離して、ｐＨ６ＨＩ　Ｉ　ＩＢＥＭから４．２ｋｂＥｃｏＲＩ／Ｘ ｂａＩ断片を単離した。これの３つの断片をともに連結し、ｐＢｓＨＩＶ３ＢＴ １を産生した。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢＥＥｃＭのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ／Ｘｂａｌ切断により誘導した ２、１ｋｂおよび２，９ｋｂ断片をｐＢＳＨＩＶ３ＢＴ１からの１０５ｂｐ　Ｉ （ｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａｌ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＴを産生じた。

このプラスミドをＮｒｕ　ＩとＸｂａｌで切断し、２，１ｋｂ断片を切除した。

この断片をプラントエンドし、ＮｒｕＩとＳｍａ　Ｉで切断したｐＳＰＨＡＨ６ に挿入し、ｐＨＡＨＩ　Ｖ３ＢＴを産生じた。

プラスミドｐＨＡＨＩＶ３ＢＴを、治療ウィルスとしてのＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６ ６）とともに、上述したように組換え実験に用いた。組換えウィルスを同定し、 上述したように精製し、産生じた組換え体をｖＰ１０３６と称した。

この組換え体はｖｃＰ１２０およびＶＰ９９４に関して上述した発現特徴全てを 有した。

実施例８７−ＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣにより膜内外配列により固定されたＨ ＩＶ−１（ＭＮ）の発現 ｇｐ１２０をコードするｅｎｖ領域を親水性膜内外配列をコードする領域に融合 するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列 認識番号１４４）およびＨＩＶＭＮ１８（配列認識番号４０２）（５’　−ＧＣ ＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴ？ＡＴＧＡＡＴＡＡＴ　。

σ胃買σσσＧ−３’　） を用いてｐ　Ｈ６ＨＭＮ　ＥからＰＣＲにより、ｇＩ）１２０暗号配列の３′側 領域に対応する２００ｂｐ断片を誘導した。

オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ１　（配列認識番号１４４）オヨびＨＩＶＴＭ３ （配列認識番号４０５）（５’−ＡＴＣＡＴ　ＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＡＡＡＴ ＴＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴ入ＡＣＴＣＴＡＴＴＣＡＣ−３０）をも用いて、ＰＣＲ によりこの断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭＩ（配列認識番 号４０３）（５’　−ＴＦＡＴ’！’ＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＣ ＴＴＧＧＴＡＧＧＴＴｒＡＡＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＡＣＴＣＴＣＴ ＧＴＡＧＴＧＡＡＴＡＧＡＧＴｒＡＧＧＣＡＧＧＧＡＴ入Ａ−３１）オヨびＨＩ ＶＴＭ２（配列認識番号４０４）（５’−ＴｒＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＡＡＣＴＣ ＴＡＴｒＣＡＣＴＡＣＡＧＡＧ入ＧＴＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣＴＴＡ ＡＡＣＣＴＡＣＣＡＡＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴｒＡＴＧＡＡＴＡＡ−３ ’　）に融合した。オリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭＩ（配列認識番号４０３）お よびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）は、ヌクレオチド７８５０から７９３ ４に対応しくラトナーら、１９８５）　、ＨＩ　Ｖ　ｅ　ｎ　ｖ親水性固定配列 をコードする領域を示す。ＨＩＶＴＭ３（配列認識番号４０５）による融合は、 終止コドンおよび３’Ｘｂａ１部位を有する最後のカセツテの３′末端を操作す る。誘導断片をＥｃｏＲＩ／Ｘｂａｌで切断し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切断し たｐＨ６）ＩＭＮＨに連結し、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２０Ｔを産生した。

Ｈ６プロモーターの３′側の２６ｂｐおよび金縁ＨＩＶ−１カセツテを含有する 、１．７ｋｂ　Ｎｒｕｌ／ＸｂａＩ断片を単離し、ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６かラ ノ５，１ｋｂ　Ｎｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片に挿入し、ｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０Ｔを 単離した。ｐＶＱＨ６Ｃ５ＬＳＰ６を以下のように誘導した。

ｐＣ５ＬＳＰ　（実施例６６で定義した）をＢａｍＨＩで切断じ、アニールした オリゴヌクレオチドＣＰ３２　（配列認識番号４０６） およびＣＰ３３　（配列認識番号４０７）に連結してｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生 した。

ｐＢｓＨＩＮＭＮ１２０Ｔからの１．７ｋｂ　Ｎｒｕｌ／Ｘｂａｌ断片もまたプ ラントエンドし、ＮｒｕｌとＳｍａｌで切断したｐＳＰＨＡＨ６に挿入した。産 生じたブラスミｌ’をｐＨＡＨＩ　ＶＭＮＩ　２０Ｔと称した。

挿入プラスミド、ｐｃ５ＨＩＶＭＮ１２０ＴおよびｐＨＡＨＩＶＭＮ１２０Ｔを 、治療ウィルスとして、それぞれＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣとともに、標準組 換え実験（ピッチｍ；ら、１９８７）に用いた。放射線標識したＨｌｖ−１ｇｐ １２０特異的ＤＮＡプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピ ッチｍ；ら、１９８７）により、組換えウィルスを同定し、精製した。純粋な個 体群を増幅し、ＡＬＶＡＣベースの固定した（ａｎｃｈｏｒｅｄ）ＨＩＶ−１（ ＭＮ）　ｇｐ１２０組換え体をｖｃＰ１３３と称した。ＮＹＶＡＣベースのもの をｖＰ１０３５と称し標準方法により（ティラーら、１９９０）　、蛍光抗体法 およびイムノブレシピテーション分析を行ない、ｖＰ１３８およびｖＰ１０３５ 感染細胞中のＨＩ　Ｖ−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０の発現を評価した。ＨＩＶ血 清陽性個体から集積したヒト血清（ＣＡ、エメリービル、シロン社、Ｄｒ、Ｋ。

ステイマーから愛得た）を用いて、アッセイを行なった。

表面蛍光抗体法の探求により、ｖｃＰ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞が形質 膜中にＨＩＶ−１（ＭＮ）　ｇｐ１２０を含有したことが分かった。特に、ｖｃ Ｐ１３８およびｖＰ１０３５感染細胞の表面染色は、ｇｐ１６０または非固定ｇ ｐ１２０を発現する組換えウィルス（すなわち、ｖｃＰ１２５、ｖｃＰ１２４、 ｖＰ１００４、およびｖＰ１００８）に感染した細胞と比較して、著しく増大し た。

イムノブレシビテーション分析からの結果により、ｖＣＰ１３８およびＶＰ１０ ３５感染細胞の発現、および発現された産生物が予期した分子質量であったこと が確認された。

実施例８８−ＮＹＶＡＣ／Ｈ１’／−Ｉ　ＧＡＧ（プロテアーゼ−）組換え体の 産生 １型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド、 ｐＨＸＢ２ＤはＤｒ、　Ｒ，Ｃ，ガｏ　（ＮＣＩ−ＮＩＨ）（ＮＣＩ−ＮＩＨ） から得たｏｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ フランキングアームの間にクローニングした。これは、ｇａｇ遺伝子の５′末端 を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄの１．６２５ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ断片をｐＳＤ５４２（ 実ｍＮ３２に定義した）の４，０７５ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ断片にクローニングする ことにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをｐＨＩＶＧ２と称 した。

次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｇａｇ遺伝子の残りの下流にクローニングした 。これは、ｇａｇ遺伝子の３′末端を含有する２８０ｂｐ　ＡｐａＩ−ＢａｍＨ Ｉ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩＶＧ２の５．６２０ｂｐ　Ａｐａｌ−ＢａｍＨＩ断片 にクローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチ ドＨＩＶＰ５　（配列認識番号４０８） （５”　−ＴＧＴＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＧＧＣ−３’　）オヨびＨＩＶＰ６（配 列認識番号４０９）（５１−ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡ？ｒＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧ ＧＴＣ−３１）を有するプラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。この操作によ り産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ３と称した。

次いでＩ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、 ワクシニアウィルス１３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコード するオリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７　（配列認識番号４１０）（５’　−Ｇ ＡＴＣＴＴＧＡＧＡ　ＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴ入Ｔ ＴＡＣＡＡＡＧＴＡＣ入入ＴＴ入’ｆｆ＋’λｃｃ’ｒｒｒＡ入’１’ＣＡＴＧ ＧＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＧＴＡＴｒＡＡＧＣＧＧＧＧＧＡＧＡＡＴＴＡ ＧＡＴ−３’　）オヨびＨＩＶＬ１８　（配列認識番号４１１）（５’　−ＣＧ ＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＣＣＣＣＣＧＣｒＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＣｒＣＴＣＧＣ ＡＣＣＣＡＴＧＡＴＴ入ＡＡＣＣＴＡＡＡＴＡＡＴｒＧＴＡＣＴｒＴＧＴＭＴＡ ＴＡＡＴＧＡＴＡＴＡＴＡＴｆｆｒＣＡＣＴＴＴＡＴαＣＡＡ−３１）を、ｐＨ ＩＶＧ３（Ｄ５，５４０ｂｐ部分的ＢｇｌＩＩ−Ｃ１ａｌ断片にクローニングす ることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称 した。

ｐＨＩＶＧ４を、治療ウィルスとして０）ｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに組 換え実験に用いてＶＰ９６９を産生じた。イムノプレシビテーション分析を行な って、ｖＰ９６９が真正ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質を発現するか否かを 測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染したか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、 で親ウィルスに感染せしめたか、またはｖＰ９６９に感染せしめた。１時間の吸 着期間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［３５Ｓ］−メ チオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニ ンを含まない）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液ＡＣ３％のＮＰ−４０，３０ ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　、３ｍＭのＥＤＴＡ、０゜０３％のＮａ　Ａｚｉ ｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）の添加と続いて細胞単層の削り取りに より、細胞を感染から１８時間後に収穫した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体から集積した血清（ＣＡ、エメリービル、シロンから得 た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体発現について 分析した。

血清を、ｖＰ８６６感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を、４℃での一 晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。この インキュベーション期間後、材料を４回１×の緩衝液Ａで洗浄した。次いで、通 常ヒト血清およびタンパク質Ａセファロースで前洗浄した溶解産物を、タンパク 質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清とともに４℃で一晩イ ンキユベーションした。−晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａ で４回、Ｌ　ｉ　Ｃ１２／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（ １２５ｍＭのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、 １０％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、沈殿したタ ンパク質を免疫複合体から分離した。

タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９８４）上で 分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理 した。

ＨＩ’／−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ９６９感染細胞からのＨＩＶ −１ｇａｇ前駆体タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮ ＹＶＡＣ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

実施例８９−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｔ組換え体の産生 ｇ　ａ　ｇ；１１（？＝子の５′末端をコードする配列を、ワタシニアウイルス ｔｋフランキングアームの間にクローニングした。このは、ｇａｇ遺伝子の５′ 末端を含有する、ｐＨＸＢ２Ｄのｌ、６２５ｂｐ　Ｂｇ　１１　Ｉ断片をｐＳＤ ５４２（実施例３２に定義した）の４，０７５ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ断片にクローニ ングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩ　Ｖ Ｏ２と称する。

次いでｇａｇ遺伝子の３′末端をｐＨＩＶＧ２にクローニングした。これは、ｇ ａｇ遺伝子の３′末端を含有する、２８０ｂｐ　Ａｐａｌ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ 断片をｐＨＩＶＧ２の５，６２０ｂｐ　Ａｐａ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片にクローニ ングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ Ｐ５（配列認識番号４０８）およびＨＩＶＰ６（配列認識番号４０９）を有する プラスミド、ｐＨＸＢ２Ｄから産生じた。この操作により産生じたプラスミドを ｐＨＩＶＧ３と称する。

次いでＩ３Ｌプロモーターをｇａｇ遺伝子の上流にクローニングした。これは、 ワクシニアウィルス［３Ｌプロモーターおよびｇａｇ遺伝子の５′末端をコード する、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１７　（配列認識番号４１０）およびＨＩ ＶＬ１８　（配列認識番号４１１）をｐＨＩ　ＶＯ２の５．５４０Ｍ部分的Ｂｇ ｌｌＩ−Ｃ１ａｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により 産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ４と称する。

次いでｐ２４、ｐ２、ｐ７およびｐ６をコードするｇａｇ遺伝子の部分を除去し た。これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ１９　（配列認識番号４１２）オヨ びＨＩＶＬ２０　（配列認識番号４１３）をｐＨＩＶＧ４の４，４５０ｂｐ部分 的ＰｖｕＩＩ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操 作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ５と称した。

ｐｏｌ遺伝子と同様に、ｇａｇ遺伝子の残りをｐ１７「遺伝子」の下流にクロー ニングした。これは、ｇａｇ遺伝子のほとんどおよびｐｏｌ遺伝子の全てのを含 有する、ｐＨＸＢ２Ｄの４．９５５ｂｐ　Ｃ１ａｌ−Ｓａｌ　Ｉ断片をｐＨＩＶ Ｇ５の４，１５０ｂｐ　Ｃ１ａＩ−Ｓａｃｌ断片にクローニングすることにより 行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ６と称する。

次いで外来３′非暗号配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有 する、３６０ｂｐ　ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ　ＰＣＲ断片を、ｐＨＩ　ＶＯ２の ８，０３０ｂｐ　Ａｆｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片にクローニングすルコとにより行 なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＰ７（配列認識番号４ １４） （５’　−ＡＡＧＡＡＡＡＴｒＡＴＡＧＧＡＣ−］　’　）オヨびＨＩＶＰ８（ 配列認識番号４１５）（５’　−ＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣ ＴＧＴ−３’　）を有するプラスミドｐＨＸＢ２Ｄから産生した。この操作によ り産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ７と称する。

ｐＨＩＶＧ７を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに組 換え実験に用いてｖＰ９８９を産生じた。

上述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９８ ９感染細胞にイムノブレシピテーションを行なった。疑似感染細胞またはＮＹＶ ＡＣ感染ベロ細胞からはＨＩＶ−１特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、 ｖＰ９８９感染細胞からの溶解産物からは、ｇａｇ前駆体タンパク質に対応する タンパク質量、並びに様々な中間帯と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

実施例９Ｏ−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐａｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１２ ０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィ ルス【ｋフランキングアームの間にクローニングした。

これは、最初に、前述したようにプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより 行なった（実施例８９参照）。

ｐＨＩＶＧ７を、治療ウィルスとしてのｖＰ９２１とともに組換え実験に用いて 、ｖＰ９９１を産生じた。

ＨＩＶ　ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように、ｖＰ９９１ 感染細胞のイムノブレシピテーションを行なった。疑似感染ベロ細胞からはＨＩ Ｖ特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９９１感染細胞の溶解産物か らは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質量、並びに様 々な中間体とじゆくせいｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

実施例９ｌ−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌｔ５よびｅｎｖ　（ｇｐ１ ６０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウ ィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。

これは、最初に、前述したよう゛に、プラスミドｐＨＩＶＧ７を産生ずることに より行なった（実施例８９参照）。

ｐＨＩＶＧ７を治療ウィルスとしてのＶＰ９１１　（上記）とともに組換え実験 に用いてｖＰ９９０を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９９ ０感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞から はＨＩＶ０１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９９０感染細胞の溶 解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク質量、 並びに様々な中間体とじゅくせいｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

実施ｆ１９２−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｐ１７．９２４組換え体の産生 ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ、　Ｒ，Ｃ， ガロ（ＮＣＩ　−Ｎ　Ｉ　Ｈ）から得た。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルス【ｋフランキ ングアームの間にクローニングした。

これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ５を調製することにより行なった（ 実施例８９参照）。

次いでｐ２４「遺伝子」の３′末端をｐＨＩＶＧ５に９０−ニングした。これは 、ｐ２４　ｒ遺伝子」の３′末端を含有する、６６０ｂｐのＳａｌｌ−ＢａｍＨ Ｉ　ＰＣＲ断片をｐＨＩＶＧ５の４．４５０ｂｐ　Ｓａｉｌ−ＢａｍＨＩ断片に クローニングすることにより行なった。このＰＣＲ断片は、オリゴヌクレオチド 、ＨＩＶＰ２５　（配列認識番号４１６） （５９−ＡＡＡＧＴ　ＣＧＡＣＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＣ−３・）およ びＨＩＶＰ２６　（配列認識番号４１７）（５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴ’ｒＡ ＣＡＡＡＡＣＴＣ？ｒＧＣＣＴＴＡＴ−３’　）を有する、プラスミドｐＨＸＢ ２Ｄから産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ８と称した 。

次いで昆虫ボックス４２ｋｄプロモーターをｐ２４「遺伝子」の上流にクローニ ングした。これは、昆虫ボックス４２ｋｄプロモーターおよびｐ２４「遺伝子」 の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２１　（配列認識番号 ４１８） （５雷−ＴＣＧＡＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴｒＡＣＡＡＴＡ ＴＡＡＡＡＴＧＣＣＴＡＴＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＴ ＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＧＣ Ａ−３＋）およびＨＩＶＬ２２（配列認識番号４１９）をｐＨＩＶＧ８１７）５ ，０７０ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｎｓｉｌ断片に挿入した。この操作により産生じたプ ラスミドをｐＨＩＶＧ９と称する。

ｐＨＩＶＧ９を、治療ウィルスとしてのＶＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに組 換え実験に用いてｖＰ９７０を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７ ０感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞また はＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかし ながら、ｖＰ９７０感染細胞の溶解産物からはｐ２４に対応するタンパク質量が 沈殿した。

実施例９３−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ　（ｇｐ１２ ０）組換え体の産生ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２ ＤをＤｒ、　Ｒ，Ｃ，ガｏ　（ＮＣＩ−ＮＩＨ）　がら得た。ｇａｇ遺伝子の５ ′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間に クローニングした。これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ９を調製するこ とにより行なった（実施例９２参照）。

ｐＨＩＶＧ９を、治療ウィルスとしてのＶＰ９２１とともに組換え実験に用いて ｖＰ９７３を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７ ３感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞から は、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７３感染細胞の 溶解産物からはｐ２４に対応するタンパク質量が沈殿した。

実施例９４−ＮＹＶ、ＡＣ／ＨＩＶ−１ｐ１７、ｐ２４およびｅｎｖ　（ｇｐ１ ６０）組換え体の産生ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ ２ＤをＤｒ、　Ｒ，Ｃ，ガｏ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′ 末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間にク ローニングした。これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ９を調製すること により行なった（実施例９２参照）。

ｐＨＩＶＧ９を、治療ウィルスとしてのｖＰ９１１とともに組換え実験に用いて ｖＰ９７１を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７ １感染細胞のイムノブレシビテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞から は、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ９７１感染細胞の 溶解産物からはｅｎｖおよびｐ２４に対応するタンパク質量が沈殿した。

実施例９５−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ（プロテアーゼ−）およびｅｎｖ　 （切形の）組換え体の産生 ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＨＸＢ２ＤをＤｒ、　Ｒ，Ｃ， ガｏ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。

ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウィルスｔｋフランキ ングアームの間にクローニングした。

これは、最初に、前述したようにｐＨＩＶＧ９を調製することにより行なった（ 実施例８９参照）。

次いでＨ６ブロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ４に 挿入した。これは、Ｈ６ブロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含 有する、ｐＨＩＶＥＩＯのＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼ！（フレノウ断片 ）充填１，６００ｂｐ　ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片を、ｐＨＩＶＧ４の充填Ｂａｍ ＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラ スミドをｐＨＩＶＧＥｌｌと称する。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢｃＤＴ１からの５ａｃｌ／部分的Ｋｐｎｌ断片をｐｌＢＩ２５ （ＣＴ、ニューハブン、ＩＢＩ）の多重クローニング領域に挿入することとによ りプラスミドｐＨＩＶＥ１０を誘導した。プラスミドｐＢｓＨＩＶ３Ｂ　ＣＤ　 Ｔ　１４；ｔ、ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　Ｉ　Ｂ）　１＞ベロープ（アミノ酸１から ４４７；ラトナーら、１９８５）の著しく切形された形状を発現するＨ６ブロモ ートされたカセツテを含有する。ｖ３ループ領域とＴ１エピトープを保持しなが らＣＤ４結合を除去するために、このカセツテの発現を評価した。

ｐＢｓＨＩＶ３ＢｃＤＴ１を構成するために、以下の操作を行なった。オリゴヌ クレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ（配列認識番号３９７）およびＨＩＶＣＤ４Ａ（配列 認識番号４（５１−ＧＣＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＣＡＴｒＡＴＧＡＡＴＡＡＡＣＴ ＧＡＴＧＧＧＡＧＧＧＧＣＡＴＡＣ−：Ｉ　’　）を用いてｐＨ６ＨＩ　Ｉ　Ｉ ＢＥ　（実施例１８で定義した）から２００ｂｐのＰＣＲ誘導断片を増幅した。

オリゴヌクレオチドＨＩＶ３Ｂ２Ａ　（配列認識番号３９７）およびＨＩＶＴＭ ３　（配列認識番号４０５）を用いてＰＣＲにより、この断片を、アニールした オリゴヌクレオチドＨＩＶＴＭ１（配列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（ 配列認識番号４０４）に融合した。ＨＩＶ−１ｅｎｖ膜内膜内シアンカーミノ酸 ６９１から７１８；ラトナーら、１９８５）、変約柊止コドン（ＴＡＡ）　、お よび３’Ｘｂａ１部位をコードする配列を配することにより、これらの操作で切 形ｅｎｖカセツテの３′末端を産生じた。このＰＣＲ融合産生物をＥｃｏＲＩと Ｘｂａｌで切断し、２４３ｂｐの断片を産生じた。この断片をｐＨ６Ｈ１１１Ｂ Ｈの４．５ｂｐＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片に連結し、ｐＢＳＨＩＶ３ＢＣＤＴ１ を産生した。

ｐＨＩＶＧＥｌｌを、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに 組換え実験に用いてｖＰ９７９を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７ ９感染細胞のイムノブレシビテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞また はＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、）ＩＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しか しながら、ｖＰ９７９感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タン パク質に対応するタンパク質量が沈殿した。

実施例９６−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（切形）組 換え体の産生 ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋフランキン グアームの間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。

次いでＨ６ブロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子をｐＨＩＶＧ７に 挿入した。これは、Ｈ６ブロモートした切形ＨＩＶ−１エンベロープ遺伝子を含 有する、ｐＨＩＶＥｌｏ　（実施例９５に定義した）のＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリ メラーゼエ　（フレノウ断片）充填１，６００ｂｐ　Ｘｈｏｌ−Ｎｏｔｌ断片を 、ｐＨＩＶＧ７の充填ＢａｍＨ１部位にクローニングすることにより行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１２と称スる。

ｐＨＩＶＧＥ１２を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに 組換え実験に用いてｖＰ９７８を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９７ ８感染細胞のイムノブレシビテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞また はＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しながった。しかし ながら、ｖＰ９７８感染細胞の溶解産物がらはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパ ク質に対応するタンパク質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈 殿した。

実施例９７−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｒｌｖ　（ｇｐ１ ２０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋ フランキングアームの間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミド ｐＨＩＶＧ７を調製することにより行なった（実施例８９参照）。

次いで１３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をカナリヤボックス挿入 ベクターに挿入した。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子 を含有する、１）ＨＩＶＧ７１７）４，３６０ｂｐ　部分的Ｂｇｌｌｌ−Ｂａｍ ＨＩ断片をｐＶＱＨ６ＣＰ３ＬのＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより 行なった。この操作により産生じたふらをｐＨＩＶＧＥ１４と称する。

次いでＨ６ブロモートしたＨ　Ｉ　Ｖ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１２０） 遺伝子をｐＨＩＶＧＥ１４に挿入した。

これは、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶＬ２９　（配列認識番号４２１） （５’　−ＧＧＣＣＧＣＡＡＣ−３’）およびＨＩＶＬ３０　（配列認識番号４ ２２）（５’−ＴＣＧＡＧ？ｒＧＣ−３’） 並びにＨ６ブロモートしたｇｐ１２０遺伝子を含有する、ｐＢｓＨＩＶＭＮ１２ ０の１．６００ｂｐ　Ｎｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１４（７）１１ ．５００ｂｐ　Ｎｒｕｌ−Ｎｈｏｌ断片にクローニングすることにより行なった 。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１５と称する。

次いで、Ｈ６ブロモートしたエンベロープ（ｇｐ１２０）遺伝子および１３Ｌプ ロモートしたｇａｇとｐｏｌ遺伝子をワクシニアウィルス挿入ベクターに挿入し た。これは、Ｈ６ブロモートしたｇｐ１２０遺伝子および１３Ｌブロモートシた ｇａｇとｐｏｌ遺伝子を含有する、ｐＨＩＶＧＥ１５の６，４００ｂｐ　Ｎｏｔ ｌ−ＢａｍＨＩ断片をｐＳＤ５４２ＶＣＶＱ（７）４，０００ｂｐ　Ｎｏｔ　Ｉ −Ｂｇｌ　Ｉ■断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産 生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１６と称する。

ｐＨＩＶＧＥ１６を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに 組換え実験に用いてＶＰ９８８を産生じた。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ９８ ８感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞また はＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかし ながら、ｖＰ９８８感染細胞の溶解産物からはｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパ ク質に対応するタンパク質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈 殿した。

実施ｆＦＩＪ９８−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ｇ ｐ１６０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニ アウィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。

これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１６を調製することによ り行なった（実施例９７参照）。

次いでｇｐ１６０遺伝子により、ｇｐ１２０遺伝子を置換した。これは、金縁Ｈ ＩＶ−１（ＭＮ）エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮ Ｈの２゜６００ｂｐ　Ｎｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片をｐＨＩＶＧＥ１６’の８．００ ０ｂｐ　部分的Ｎｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片にクローニングすることにより行なった 。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ１９と称する。

ｐＨＩＶＧＥ１９を、治療ウィルスとしてのｖＰ８６６（ＮＹＶＡＣ）とともに 生体外組換え実験に用いてｖＰ１００９を産生した。

前述したように、ＨＩＶ−１ｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、ｖＰ１０ ０９感染細胞のイムノブレシビテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞ま たはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかし ながら、ｖＰ１００９感染細胞からは、ｅｎＶおよびｇａｇ前駆体タンパク質に 対応するタンパク質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿した 。

実施例９９−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ＧＰ１２ ０）組換え体の産生ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィ ルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。

これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧＥ１５を調製することによ り行なった（実施例９７参照）。

ｐＨＩＶＧＥ１５を治療ウイ／Ｉ、スとしテ（ＤＣＰ　ｐ　ｐ　（ＡＬＶＡＣ） とともに組換え実験に用いてｖｃＰ１１７を産生した。

イムノブレシビテーション分析を行なって、ｖＣＰ　１１７が真正ＨＩＶ−１ｇ ａｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を 、疑似感染せしめたか、ｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で親ウィルスに感染せ しめたか、またはｖｃＰ１１７に感染せしめた。

１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［” Ｓｌ−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（ メチオニンを含まない）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４ ０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ 　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌのＰＭＳＦ）と続いての細胞単層の削り取 りにより、細胞を感染から１８時間後に収穫した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からの血清にューヨーク州保険省から得た）を用いてＨ ＩＶ　ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して感染細胞から溶解産物を分析した 。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃で一 晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。この インキュベーション期間後、材料をＩ×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常の ヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセ ファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩インキユベ ーションした。

−晩のインキュベーション後、試料をＩ×緩衝液Ａで４回、Ｌ　ｉ　Ｃ１２／尿 素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ（７））’Ｊス（ｐ Ｈ６’、８）　、４％のＳＤＳ’、２０％のグリセロール、１０％の２−メルカ プトエタノール）の添加と５分間の沸騰により免疫複合体から沈殿したタンパク 質を分離した。タンパク質を１０％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、 １９８４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭ　Ｎａ−サリ チル酸塩で処理した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖｃＰ１１７感染細胞からはＨＩＶ −１ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞ま たはｃＰｐｐ感染細胞からはＨＩＶ−１特異的タンパク質は沈殿せしめなかった 。

実施例１００−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１ ６０）組換え体の産生 ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋフランキン グアームの間にクローニングした。

これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩ　ＢＧＥ　１５を調製すること により行なった（実施例９７参照）。

次いでｇｐ１２０をｇｐ１６０で置換した。これは、金縁ＨＩ　Ｖ　−１（ＭＮ ）　エンベロープ（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する、ｐＨ６ＨＭＮＥの２．６０ ０ｂｐ　Ｎｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片をｐＨＩＶＧＥ１５（７）９，８００ｂｐ　Ｎ ｒｕｌ−Ｎｏｔｌ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により 産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ’１８と称する。

次いで前の工程で欠損したカナリヤボックスフランキングアームをｐＨＩＶＧＥ １８にクローニングした。これは、Ｃ３フランキングアームを含有する、ｐＨＩ ＶＧＥ１５の１．５００ｂｐ　Ｎｏｔｌ断片を、ｐＨＩＶＧＥ１８の１２．４０ ０ｂｐ　Ｎｏｔ　Ｉ断片にクローニングすることにより行なった。この操作によ り産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧＥ２０と称する。

ｐＨＩＶＧＥ２０を治療ウィルスとしてのｃＰｐｐ　（ＡＬＶＡＣ）とともに組 換え実験に用いてｖｃＰ１３０を産生した。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖｃＰ１３０がＨＩＶ−１ｇａｇお よびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、疑似 感染せしめたか、ｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｔ、で親ウィルスに感染せしめた か、またはｖｃＰ１３０に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し 、細胞を、２％の胎児ウシ血清と［３５３］−メチオニン（２０μｃｉ／ｍｌ） を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。

１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％のＮＰ−４０，３０ｍＭのトリス（ｐＨ７，４）　 、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３％のＮａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌの ＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から１８時 間後に収穫した。

ＨＩＶ−１血清陽性個体から集積した血清（ＣＡ、エメリービル、シロンから得 た）を用いて、感染細胞からの溶解産物を、ＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝 子発現に関して分析した。血清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着せしめた。前 吸着した血清を４℃での一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロ ースに結合せしめた。

このインキュベーション期間後、物質をＩ×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで、 通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク 質Ａセファロースに結合したＨＩＶ−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩イン キユベーションした。−晩のインキュベーション期間後、試料をＩ×緩衝液Ａで ４回、ＬｉＣ１□／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（１２５ｍ Ｍのトリス（ｐＨ６，８）　、４％のＳＤＳ、２０％のグリセロール、１０％の ２−メルカプトエタノール）の添加および５分間の沸騰により、沈殿したタンパ ク質を免疫複合体から分離した。１０％のドリファスゲルシステム（ドリファス ら、１９ｇ４）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａ− サリチル酸塩で処理した。ＨＩＶ−１血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＣＰ１ ３０感染細胞からＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質を沈殿せしめたが、 疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感染細胞からはＨＩｖ−１特異的タンパク質を沈殿 せしめなかった。

実施例１０１−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌ’組換え体の産生 ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ、　Ｒ， Ｃ，ガロ（ＮＣＩ　−Ｎ　Ｉ　Ｈ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコード する配列をワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした 。これは、前述したように最初にプラスミドｐＨＩＶＧ７を調製することにより 行なった（実施例８９参照）。

次いで、ｇａｇおよびｐｏｔ遺伝子をカナリヤボックスフランキングアームの間 にクローニングした。これは、Ｉ３Ｌプロモートしたｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子 、並びにオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号４２３）（５’　 −ＧＧＣＣｊＪｉＡＣ−３’　）とＨＩＶ２Ｌ７　（配列認識番号４２４）（５ １−ＴＣＧＡＧ？ｒＴ−３１） を含有する、ｐＨＩＶＧ７の４．４００ｂｐ　Ｓｍａｌ−Ｎｏｔｌ断片をｐＳＰ ＣＰ３ＬのＳｍａ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ部位にクローニングすることにより行なった 。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶＧ２４と称する。

ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウィルスとしてのＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに組換 え実験に用いてｖｃＰ１５２を産生した。

前述したようにＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖｃ Ｐ１５２感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染または ＡＬＶＡＣ感染細胞からは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。

しかしながら、ＶＣＰ１５２感染細胞の溶解産物からは、ｇａｇ前駆体タンパク 質に対応するタンパク質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿 した。

実施例１０２−ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（切形） 組換え体の産生ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを 、Ｄｒ、　Ｒ，Ｃ，ガロ（ＮＣＩ　−Ｎ　Ｉ　Ｈ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５ ′末端をコードする配列をワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間にク ローニングした。これは、前述したように、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を 調製することにより行なった（実施例１０１参照）。

ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウィルスとしてのｖｃＰ１２０とともに組換え実験に用 いてｖｃＰ１５５を産生した。

前述したようにＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖｃ Ｐ１５５感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞か らは、ＨＩＶ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＣＰ１５５感染細 胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク 質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

実施例１０３−ＡＬＶＡＣ／）ＩＩＶ−１ｇａｇ／ｐｏｔおよびｅｎｖ　（膜内 外アンカーを有するｇｐ１２０）組換え体の産生 ＨＩＶ−１ｃＤＮＡ配列を含有する、プラスミドｐＨＸＢ２Ｄを、Ｄｒ、　Ｒ， Ｃ，ガｏ（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。ｇａｇ遺伝子の５′末端をコードする配 列をワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これ は、前述したように、最初にプラスミドｐＨＩＶＧ２４を調製することにより行 なった（実施例１０１参照）。

ｐＨＩＶＧ２４を、治療ウィルスとしてのｖｃＰ１３８とともに組換え実験に用 いてｖｃＰ１５６を産生した。

前述したようにＨＩＶ−１ｇａｇおよびｅｎｖタンパク質の発現に関して、ｖｃ Ｐ１５６感染細胞のイムノブレシビテーション実験を行なった。疑似感染細胞か らは、Ｈｌｖ−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＣＰ１５６感染細 胞の溶解産物からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に対応するタンパク 質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

ＨＩＶ−１ｇａｇ特異的遺伝子産生物単体またはワクシニアウィルスによりｅｎ ｖとの組合せのいずれかの発現は、非感染ウィルス状粒子の産生となることが示 されている（バッファーら、１９９０；）ら、１９９０）。このバックグラウン ドに関して、ＨＩＶ−１ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎＶ遺伝子を発現するＡＬＶＡ Ｃベースの組換え体に感染した細胞もまたそのような粒子を産生ずるか否かを探 求した。

さらにこれらのＡＬＶＡＣベーす組換え体から非アビアン細胞（すなわち、ベロ 、ＭＲＣ−５、等）を感染せしめるのに用いられる場合、いかなるＨＩＶ−１ウ ィルス状粒子がボックスウィルスビリオン不純物もなく精製できた。

ｖｃＰ１５６に感染したベロ細胞を用いた粒子形成を評価するために、以下の実 験を行なった。ベロ細胞を約５ｐｆｕ／細胞のｍ、ｏ、ｉ、で感染せしめた。２ ４感染期間後、上澄みを収穫し、２００Ｏｒｐｍでの１０分間の遠心分離により 浄化した。次いで上澄みを、３０．０００ｋＤａの分子量をカットオフするフィ ルターを通じて回転せしめた。それゆえ、小さな分子はこれらのフィルターを通 過する。ＨＩＶ血清陽性個体から集積したヒト血清にューヨーク州、保険省、Ｄ ｒ、Ｊ、コーニーから得た）を用いて、標準ウェスターンプロット分析により、 フィルターに保持された物質を分析した。ウェスタンプロット分析の結果により 、フィルターに保持された物質中に主要コアタンハク質ｐ　２４オ、にヒＨＩ　 Ｖ　−１（ＭＮ）固定ｇｐ１２０ｃ７）存在が示された。上述したサイズ排除に 関して、ｐ２４が高等構造立体配置（すなわち、ウィルス状粒子）になければ、 ｐ２４はそのフィルターを通過する。それゆえ、これらの結果は強く、ｇｐ１２ ０エンベロープ成分を含有するＨＩＶ−１ウィルス状粒子はｖｃＰ１５６感染細 胞中で産生されることを示唆している。

実施例１０４−ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣ中ノＨＩ　Ｖ−１ｅｎｖ遺伝子のＴ １、Ｔ２２、およびＴＨ４，１エピトープの発現 組換えポックスウィルスＶＰ１０６２およびｖｃＰ１４６を産生して、個々のペ プチドとしてＨＩＶ−１ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４，１エピトープを発 現した（ホスマリンら、１９９１）。

プラスミドｐ７３１Ｔ１の構成 プラスミドｐＭＰ　１３Ｈは、ｐｔｒｃｓバックグラウンド中にワクシニア１３ Ｌ初期／中間プロモーター要素（シュミットおよびスタネンベルグ、１９８８； ホスおよびスタネルベルグ、１９８ｇ）を含有する。テンプレートとしてのｐＭ ＰＶＣＩ、ワクシニアＨｉｎｄｌＩＩ　Ｉのサブクローンおよびプライマーとし て、合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹ８２８３　（配列認識番号４２５） （５’　−ＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣ’Ｉ’ｒＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴｒＡ ＡＡＣ−３’　）とＭＰＳＹＮ２８７　（配列認識番号４２６）（５’　−ＧＡ ＴＴＡＡＡＣＣｌｒＡＡＡＴＡＡＴＴＧＴ　−３’　）を用いてポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）により、プロモーター要素を合成した。この反応からのＤＮＡ をＨｉｎｄＩＩＩとＲｓａｌで切断し、プロモーター要素を含有する０、１ｋｂ 断片を精製した。補体合成オリゴヌクレオチドＭＰＳＹＮ３９８　（配列認識番 号４２７）（５−ＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴｒＡＡＣＴＧＣＡ　−３’）と ＭＰＳＹＮ３９９　（配列認識番号４２８）（５’　−ＧＴＴＡＡＣＣｒＡＡＡ ＴＡＡ？ｒＧＴ　−３’　）をアニーリングすることにより、リンカ−領域を組 み立てた。ＰＣＲ誘導プロモーター要素およびポリリンカー領域を、Ｈｉｎｄｌ ｌＩとＰｓｔｌで切断したベクタープラスミドｐＵＣ８と連結した。産生じたプ ラスミド、ｐＭＰＩ３Ｈは、開始コドンに対して位置−１００から−６までの１ ３Ｌプロモーター領域と続いての、Ｈｐａ　Ｉ、Ｐｓ　ｔ　ｌ５Ｓａ　１１ＳＢ ａｍＨＩ、Ｓｍａ　ＩおよびＥｃｏＲＩ部位を含有するポリリンカ、−領域を含 有する。Ｈｐａｌでの開裂により、プロモーター中の位置−６で線状化されたプ ラントエンドのＤＮＡが産生される。

補体オリゴヌクレオチドＴｉｃ　（配列認識番４２９）およびＴＩＮ　（配列認 識番号４３ｏ）をＨｐａＩとＢａｍＨＩで切断したプラスミドｐＭＰ　Ｉ　３Ｈ に連結することにより、ワクシニアＨ６プロモーターに誘導されたＴ１ペプチド を含有するカセツテを産生じた。

この連結は、プロモーターの最後の５塩基対を再構成し、Ｔ１ペプチドの完全暗 号配列を提供し、終止コドンとＢａｍＨ１部位の間にＸｈｏ　１部位を産生ずる 。これがプラスミドＩ）７３１７１である。ヌクレオチド配列分析により断片の 配列を確認した。

プラスミドｐＨ６Ｔ２の構成 ワクシニアＨ６プロモーターによりドライブされたＴ２ペプチドを含有するカセ ツテを２工程で産生した：ＰＣＲおよびプライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識番号 ３６４）とＨ６ＰＣＲ２（配列認識番号３６５）を用いて、合成Ｈ６プロモータ ー（パーカスら、１９８９）を含有するプラスミドからＥｃｏＲＶ部位を通じる Ｈ６プロモーターを誘導し、５’ＨｉｎｄｌｌＩ部位を産生じた。この１２２ｂ ｐ　ＰＣＲ誘導断片をＨｉｎｄｌ　Ｉ　ＩとＥｃｏＲＶで切断し、続いて同様に 切断したｐＢＳ−８Ｋ＋　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ）に連結し、プラ スミドｐＢＳＨ６を産生じた。ＥｃｏＲＶ部位からのＨ６プロモーターの３′末 端を完全にし、Ｔ２ペプチドをコードし、遺伝子の３′末端にＢａｍＨＩ部位を 産生ずる補体オリゴヌクレオチド７２Ｃ（配列認識番号４３１） （５’　−ＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＴＡＴＣＧＴＡＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧ ＡＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴπＴＧＧＧＡＴＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＡＴＧＡＣＴ ＡＧＴＴＡＡＴＣＡＧ　−３１）および７２Ｎ　（配列認識番号４３２）（５’ −ＧＡＴＣＣＴＧＡＴｒＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴＴｒＴＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＣＣ ＣＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＡＴＣ’Ｉ’ｒＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣ ＡＡＡＣＴＴＡＡＣＧＧＡＴ　−３’　）をアニールし、ＥｃｏＲＶとＢａｍＨ Ｉで切断したｐＢＳＨ６に連結した。このプラスミドをｐＨ６７２と称し、ヌク レオチド配列分析により断片を確認した。

プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１１７）産生持続性ＰＣＲ反応により、ＡｍＥ ＰＶ　４２にプロモーターによりドライブされたＴＨ４，１ペプチドを含有する カセツテを産生じたニプライマー４２ＫＶＱ１　（配列認識番号４３３） （５’　−ＡＡＴｒＡＡＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＧＧＧＴα緑緑鮎ＴＡＴ ＡＡＡＴＧ　−３’　）オヨび４２ＫＶＱ２　（配列認識番号４３４）（５’− ＣＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＴＴＡＣＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴ ’ｒＧＴＡＡＴｒＡＴＡＴＡＴｒＴＴＣ）を用いて、４２にプロモーターの制御 下で狂犬病糖タンパク質の遺伝子を含有するプラスミドである、プラスミドｐ４ ２ＫＲＡＢＩからＰＣＲにより５’ＰｓｔｌとＳｍａ　１部位を有する１０７ｂ ｐ　４２にプロモーターを誘導した。

このＰＣＲ誘導断片の１０７ｂｐプロモーター領域の配列は（配列認識番号４３ ５） である。この断片と、テンプレートとしての、ＴＨ４，１ペプチドＴＨ４１Ｃ（ 配列認識番号４３６）（５’−ＡＴＧＧ入ＴＡＧ入ＧＴＡＡＴＴＧＡＡＧＴＡＧ ＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＴ入Ｔ入ＧＡＧＣＴＡＴｒＡＧ入ＴＧＡＣｒＡＧＴＴ入 ＾ＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣ−３’）およびＴＨ４１Ｎ（配列認識番号４３ ７）をコードする合成オリゴヌクレオチドと、プライマー４２ＫＴＨ４１（配列 認識番号４３８） （５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡ’ＩＴＡＡＡＣＴＡＧＴ ＣＡＴＣＴＡＡＴＡＧＣＴＣ−３１）および４２ＫＶＱ１　（配列認識番号４３ ３）とを用いて１５９ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片を、第２のＰＣＲでＴＨ４，１の暗 号配列に融合した。プライマー４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３８）およびＢ ＡＭＶＱ　（配列認識番号４４１）（５’−ＴＴＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡ ＡＴＴ入ＡＴｒＡＧＴＴＡＴＴＡＧＡＣ−３１）を用いた第３のＰＣＲのために テンプレートとして合成オリゴヌクレオチドＶＱＣ（配列認識番号４３９）（５ １−ＴＩ’ＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴｒ　入ＡＴＴＡＧ？ｒＡＴｒＡＧ ＡＣ入入ＧＧＴＧＡＡＡＡＣＧＡＡＡＣＴＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＴＡＡＴＩ’Ａ ＡＴｒＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧ　−３１）およびＶＱＮ　（配列認識番号 ４４０）（５’　−ＣＣＣＧＧＧＣＴ　ＧＣＡＧＣＴＡＡＴＴＡＡＴｒＡＡＧＣ ＴＡＣＡＡＡＴＡＧＴＴＴＣＧＴｆｆｒＣＡＣＣＴＴＧＴＣＴＡＡＴ入入ＣＴ入 ＡＴＴ入ＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＡ　−３’）並びに断片を用いて 、５′末端でＢａｍＨ１部位を包含して、この２１０ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片を５ ′末端に伸長した。続いてのヌクレオチド配列分析により、４２ＫＴＨ４１の上 記配列の下線により示したような位置２４後に外来の塩基（Ａ）が挿入されてい るようなオリゴヌクレオチド４２ＫＴＨ４１（配列認識番号４３８）の配列中の エラーが示された。これは、テンプレートとしてのＢＡＭＶＱ入れ４４１）およ び４２ＫＴＨ４１Ａ　（配列認識番号４４２）（５・−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡＴＣ ＣＴＣＧＡＧＴＧＡ’Ｉ’ｒＡＡＣＴＡＧＴＣＡＴｃＴＡＡＴＡＧＣＴＣ−３・ ）による第３のＰＣＲから誘導した２７２ｂｐ断片を用いて最終ＰＣで訂正した 。最終ＰＣＲ後、カセツテは、Ｘｈ。

■とＢａｍＨＩ部位３′を有する４２に−ＴＨ４，１に対してＢａｍＨＩ、Ｐｓ ｔｌ、およびＳｍａ　１部位５′を含有した。この２７１ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片 をＢａｍＨＩで切断し、ｐＢＳ−５Ｋ＋　（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ） のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、プラスミドｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１を産生 じた。このプラスミドのヌクレオチド配列分析により、プロモータ：と暗号領域 の配列を正確であったことが確認された。しかしながら、３ｂｐの欠損が生じ、 ３’　ＢａｍＨ１部位の損失となった。

プラスミドｐＴＩＴ２ＴＨ４，１の構成これらの３つのカセツテを、１３Ｌ−Ｔ ｌが以下の方法の他の２つの遺伝子に対して反対方向となるように特異プラスミ ドｐＴＩＴ２ＴＨ４，１に結合した：１７０ｂｐＨｉｎｄ１１１／Ｘｈｏｌ断片 をｐ７３１Ｔ１から単離し、同様に切断したｐＨ６Ｔ２に連結し、ｐＴＩＴ２を 産生じた。ｐＶＱ４２ＫＴＨ４，１からの２９０ｂｐ　ＢａｍＨ１／５ａｃｌ断 片を同様に切断したｐＴＩＴ２に連結し、ｐＴＩＴ２ＴＨ４，１を産生じた。挿 入物の配列をヌクレオチド配列分析により確認した。

ｐＣ５ＬＳＰ　（実施例６６に定義した）をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホス ファターゼで処理し、Ｎｏｔｌで切断し線状精製して自己連結した自己アニール したオリゴヌクレオチドＣＰ２９　（配列認識番号３６３）（５１−ＡＡＴＴＧ ＣＧＧＣＣＧＣ−３１）に連結した。この方法によりＮｏｔ１部位をｐｃ５Ｌｓ Ｐに導入し、ｐＮＣ５ＬＳＰ５を産生した。

それぞれのプロモーターによりドライブされたエピトープの遺伝子を含有すれる ｐＴＩＴ２ＴＨ４，１からの６０２ｂｐ　Ｘｈｏｌ断片を、供与体プラスミドｐ ＮＣ５ＬＳＰ５およびｐｓＤ５５０　（実施例５９で定義した）のｘｈＯ１部位 にクローニングした。ヌクレオチド配列分析を用いて挿入物の配列と配置を確認 した。産生じたプラスミドｐｃ５ＴＩＴ２ＴＨ４，１およびｐ　１４ＴＩＴ２Ｔ Ｈ４゜１を、ＡＬＶＡＣおよびＮＹＶＡＣとともに生体外組換え実験に用いて、 それぞれ組換えウィルスｖｃＰ１４６およびｖＰ１０６２を産生した。これらの 組換えウィルスは、ウィルスプラークに対する特異的ＤＮＡプローブのハイブリ ダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。

実施例１０５−ＨＩＶ−１ｅｎｖからの形質膜アンカードメイン有するものと有 さないＨＩＶ−１ｅｎｖのＴ１、Ｔ２、およびＴＨ４，１エピトープを含有する ２つの融合ペプチドの発現 組換えポックスウィルスｖＰ１０６０、ｖＰ１０６１、ｖｃＰ１５４およびｖｃ Ｐ１４８を産生し、開裂可能リンカ−領域によるＨＩＶ−１ｅｎｖのＴ１、Ｔ２ 、およびＴＨ４，１に対応する配列に結合したＨＩＶ−１ｅｎｖからの信号配列 からなる融合ペプチドを発現した。ｖＰ１０６０およびｖｃＰ１５４は、ＶＰ１ ０６１およびｖＣＰ１４８とは異なり、これは前者の組換えウィルスがＨＩＶｌ 　ｅｎｖの形質膜領域に対応する配列とともに融合ペプチドを発現する点からで ある。

両方の融合ペプチドは、ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）ｅｎｖの５１アミノ酸Ｎ末 端部分、ラトナーら（１９８５）に基づく残留物１−５０　（開始Ｍｅｔを加え る）を含有する。この信号領域（配列認識番号４４３）のアミノ酸配列は、ＭＩ ＫＥＱＫＴＶＡＭＲＶ’ＫＥＫＹＱＨＬＷＲＷＧＷＲＷＧＴＭＩユ、ＧＫＬＭＩ Ｃ５ＡＴＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰである。これには、互いに信号から離れたＴ １、Ｔ２、およびＴＨ４，１エピトープ（ホスマリンら、１９９１）　、および 存在する場合にはアンカー配列が続き、長さで５のアミノ酸までの開裂可能リン カ−領域が続く。ペプチド（配列：Ｉｌ識番号４４４）のこの領域のアミノ酸配 列は、ＰＰＦ■−ＤＲＶ工ＥＷＱＧＡＹＲＡ工Ｒ−［ＰＰＦＲＸ−アンカー］で ある。アンカごドメインは、ＨＩＶ−１（Ｉ　Ｉ　ＩＢ）　ｅｎｖの２８アミノ 酸形質膜領域、残留物６９１−７１８である。この領域（配列認識番号４４５） のアミノ酸配列は、ＬＦＩＭ工ＶＧＧＬＶＧＬＲＩＶＦＡＶＬ！９ＷＮＲＶＲＱ Ｇ−［終止］である。

融合ペプチドの両方のバージョンに関して、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列認識 番号３６４）およびＰＣＲ３ＩＧＴｌ（配列認識番号４４６） （５１−ＣＡＴＡＴｒＡＡＴＴｒＧＴＴｒＴＣＴＭＭＧＧＡＧＧＴＡＣＣＣＣＡ ＴＡＡＴＡＧＡＣＴＧＴＧ　−３１）を用いてプラスミドｐＨ６Ｈ１１ＩＢＥＭ 　（実施例１８で定義した）からＰＣＨによりＨ６プロモーターおよびＨＩＶ　 １　ｅｎｖ信号配列を誘導した。この３１４ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片は、５’　Ｈ ｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位と続＜Ｈ６プロモーターおよび信号、リンカ−１並びにＴ １ペプチドの最初の６アミノ酸の暗号配列からなる。

プライマーＰＣＲＴＩＴ２　（配列認識番号４４９ンおよびＰＣＲＴ４ＥＮＤ　 （配列認識番号４５ｏ）（５１−ＡＣＴＡＣＴ’ｒＣＴＡＧ入ＴＴＡＴＣＴＡＡ Ｔ入ＧＣＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＣＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣｒＴＣＡＡＴＴＡＣＴＣ −３′）を用いてオリゴヌクレオチドＴ２Ｔ４Ａ　（配列認識番号４およびＴ２ Ｔ４ＴＢ　（配列認識番号４４８）のＰＣＲ増幅により、形質膜領域のない構成 の暗号領域の残りを産生じた。この１７７ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片は、Ｔ１ペプチ ド、リンカ−領域、Ｔ２ペプチド、別のリンカ−領域、およびＴＨ４，１ペプチ ド、それに続＜３’Ｘｂａ■部位をコードする。この断片を、プライマーＨ６Ｐ ＣＲ１（配列認識番号３６４）およびＰＣＲＴ４ＥＮＤ（配列認識番号４５０） のＰＣＲによりプロモーターおよび信号配列を含有する３１４ｂｐ　ＰＣＲ誘導 断片と融合した。

この４７３ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片のＨｉｎｄｌＩＩとｘｂａｌでの切断の後、４ ５５ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳ−３Ｋに連 結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生じたプラスミ ドをｐＢｓＴＩＴ２ＴＨ４，１と称した。

プライマーＰＣＲＴＩＴ２　（配列認識番号４４９）およびＰＣＲＴ４７Ｍ　（ 配列認識番号４５１）を用いてオリゴヌクレオチド、Ｔ２Ｔ４Ａ　（配列認識番 号４４７）およびＴ２Ｔ４ＴＢ　（配列認識番号４４８）のＰＣＲ増幅により、 形質膜アンカーを有するバージョンの暗号領域の残りを産生じ、３′末端を変更 して形質膜領域を収容した。この１９５ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片を、プライマーＰ ＣＲＴＩＴ２　（配列認識番号４４９）およびＰＣＲＴＭＥＮＤ　（配列認識番 号４５０）を用いてアンカーからなるオリゴヌクレオチド、ＨＩＶＴＭＩ　（配 列認識番号４０３）およびＨＩＶＴＭ２（配列認識番号４０４）のＰＣＨにより 融合した。この２７６ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片を、プライマーＨ６ＰＣＲ１（配列 認識番号３６４）およびＰＣＲＴＭＥＮＤ　（配列認識番号４５０）のＰＣＲに よりプロモーターおよび信号配列を含有する３１４ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片と融合 した。この５７２ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片のＨｔｎｄｌｌｌおよびＸｂａｌでの切 断後、５５４ｂｐの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したｐＢＳに 連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生じたプラス ミドをｐＢｓＴＩＴ２ＴＨ４，ＩＡと称した。

ｐＣ５ＬＳＰ　（実施例６６に定義した）をＢａｍＨＩで切断し、アニールした オリゴヌクレオチドＣＰ３２　（配列認識番号４０６）およびＣｒＢ２　（配列 認識番号４０７）に連結し、ｐＶＱＣ５ＬＳＰ６を産生した。ｐＶＱＣ５ＬＳＰ ６をＥｃｏＲＩで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、Ｎｏｔｌで切断し 線状精製して自己連結した自己アニールしたオリゴヌクレオチドＣＰ２９　（配 列認識番号３６３）に連結した。この方法によりＮｏｔ１部位をｐＶＱ　Ｃ５Ｌ 　Ｓ　Ｐ　６１；：導入し、ｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７を産生した。

両カセツテを挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７のＸｈｏｌとＸｂａＩ部位の 間にそれぞれ配した。これらのプラスミドｐｃ５ｓＴＩＴＩＴＨ４，１およびｐ ｃ５ｓＴＩＴ２ＴＨ４，ＩＡを用いて、それぞれ０５座中にカナリヤポックスウ ィルス組換え体、ｖｃＰ１４８およびｖＣＰ　１５４を産生じた。ＢａｍＨＩ− ３ｍａｌ断片をｐＣ５ＳＴＩＴＩＴＨ４，１およびｐｃ５ｓＴＩＴ２ＴＨ４，Ｉ Ａから切除し、同様に切断したｐｓＤ５５０　（実施例５９に定義した）に連結 し、それぞれプラスミドｐ　１４ＳＴＩＴ２ＴＨ４，１およびｐ１４ｓＴＩＴＩ ＴＨ４，ＩＡを産生じた。これらのプラスミドをＮＹＶＡＣの！４座のＩＶＲに 用いて、それぞれ組換え体ｖＰ１０６１およびｖＰ１０６０を産生した。これら の組換え体は、ウィルスプラークに対する特異的ＤＮＡプローブのハイブリダイ ゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。

実施例１０６−ＡＬＶＡＣ，ＴＲ０ＶＡＣ，およびＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−１ｎ ｅｆの発現 ＨＩＶ−１ｎｅｆ　（ＭＮ）を発現する、組換えポックスウィルスＶＰ１０８４ 、ｖＦＰ１７４、およびｖｃＰ１６８を以下のように産生じたニ プライマー１３ＰＣＲ１（配列認識番号４５２）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡ ＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧ　−３１）およびＰ　Ｉ　３ ＮＥＦ２　（配列認識番号４５３）（５’−ｃＧ？ＩＴｒＧＡＣＣＡＴＴｒＧｃ ｃＡｃｃＣＡＴＧＡＴｒＡＡＡｃＣＴＡＡＡＴＡＡＴＴ’ＧＴＡＣＴＴＴＧ　− ３’）を用いて、プラスミドｐＭＰ　Ｉ　３ＨからＰＣＲによりＩ３Ｌプロモー ターを誘導した。プライマーＰＩ３ＮＥＦ１（配列認識番号４５４） （５’−ＡＧＴＡＣＡＡＴＴＡＴＴＩ’ＡＧＧＴｒＴＡＡＴＣＡＴＧＧＧＴＧＧ ＣＡＡＡＴＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧ　−３’） およびＰＮＥＦＢＡＭ　（配列認識番号４５５）（５’　−ＡＴＣＡＴＣＧＧＡ ＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＧＧ　−３１）を用いて、ｐＭＮｌ、 ８−１０　（７７９２と９５９５での５ｓｔ１部位の間のＭＮゲノムのその部分 のクローン）のＰＣＲ増幅により、ｎｅｆの暗号領域を産生じた。暗号領域とプ ロモーターとの融合は、プライマー（配列認識番号４５２）およびＰＮＥＦＢＡ Ｍ　（配列認識番号４５５）を用いて、以前のＰＣＲ産生物の増幅により行なっ た。この産生物のＢａｍＨＩでの切断後に、０．７ｋｂの断片をアガロースゲル から単離し、同様に切断したｐＢＳ−３Ｋ＋（ＣＡ、ラジョラ、ストラタジエネ ）に連結し、プラスミドｐ　Ｉ　３ＮＥＦを産生じた。配列以上が最初に観察さ れたのがこの時点であった。プラスミドｐＭＮ１．８−１０における以上のため に、カセツテの配列は公表された配列（ガーゴら、１９８８、ゲンバンク承認番 号Ｍ１７４４９）とは異なると決定した。これらの違いは、公表された配列と１ 盈　左二乏ｉ　−山上話一精釆一　左皇ユデカセッテ中の２つのサイレント突然 変異（位置８８３４と９１２７で）はＰＣＲ中で明確な誤差である。コードした タンパク質には効果がないので、これらは存続し続けた。

９９３０でのフレームシフトにより、他のＨＩＶ−１単離体をより密接に組み立 てる伸長した読取り枠が生じる。ＮＭ単離体からのｎｅｆの公表されたサイズの ままで０るには、このカセツテには暗号領域の切形３′末端を産生ずる第４のＰ ＣＲが必要である。

位置９９３０での余分な塩基の除去は、プライマーｌ３ＰＣＲＩ　（配列認識番 号４５２）およびＰＮＥＦＦＩＸＩ（配列認識番号４５６） ＧＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＧ　−３’　）によるｐ１３ＮＥＦ中の挿入物のＰＣＲ 増幅により行なった。この６７８ｂｐ　ＰＣＲ誘導断片のＢａｍＨＩでの切断後 、６６０ｂｐの断片をアガロースゲルがら単離して、同様に切断したｐＢＳに連 結し、プラスミドｐＢｓＩ３ＮＥＦを産生した。この挿入物をヌクレオチド配列 分析により確認した。

ｎｅｆ遺伝子を含有するｐＢＳ　Ｉ　３ＮＥＦからの６６０ｂｐ　ＢａｍＨＩ断 片を、挿入プラスミドｐＮＶＱＣ５ＬＳＰ７　（実施例１０５で定義した）のＢ ａｍＨ１部位に配した。産生したプラスミドｐＣ５１３ＮＥＦを、ＡＬＶＡＣの Ｃ５座へのＩＶＲに用いて、組換え体ｖｃＰ１６８を産生した。また同一の６６ ０ｂｐ　ＢａｍＨＩ断片を、挿入プラスミドｐｓＤ５５０Ｖｃ　（実施例５９で 定義した）のＢａｍＨ１部位に配し、プラスミドｐＩ４１３ＮＥＦを産生じた。

ＮＹＶＡＣを有するこのプラスミドに関するＩＶＲにより組換え体ｖＰ１０８４ を産生した。

ＴＲ０ＶＡＣのＦ１６座の挿入プラスミドを以下のように誘導した。７．３ｋｂ 　Ｎａｅｌ／Ｎｄｅｌ断片を、タータグリアら（１９９０）により記載された鶏 痘ウィルスの１０．５ｋｂ　Ｈｉｎｄｌｌｌ断片を含有するプラスミドから単離 し、同様に切断したｐＵＣ９に連結し、プラスミドｐ　ＲＷ８６６を産生じた。

ｐＵＣ９をＰｖｕｌｌで切断し、ＥｃｏＲＩリンカ−をＰｖｕ　Ｉ　１部位の間 に連結し、プラスミドｐＲＷ７１５を産生じた。鶏痘配列を側腹に有するクロー ニング部位を、プライマーＲＷ２６４　（配列認識番号４５７）（５’　−ＡＡ ＴＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＡＴＴＴＴ ＴＡＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣｒＡＴＡＡＴＣＧＴＴＡＡＣＴＴＡ’ＩＴＡＧ　−３ ’　）およびＲＷ２６７（配列認識番号４５８）（５’−ＧＣＴＡＧ入入ＡＴＣ ＴＣＴＴＡＧ’ｆｆｆｆ１’ＡＴＡＧＴＴＧ　−３’）を有する１０．５ｋｂ断 片の部分のＰＣＲ増幅により産生じた。隣接した領域もまた、プライマーＲＷ２ ６６　（配列認識番号４５９） （５’−ＧＴＴＡＣＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＴＧＡＴＣＡＴＡＧ　−３’ ）およびＲＷ２６５（配列認識番号４６０）を用いたＰＣＲにより増幅した。こ れらのＰＣＲ誘導断片を、プライマーＲＷ２６６　（配列認識番号４５９）およ びＲＷ２６７　（配列認識番号４５８）を用いた第３のＰＣＨにより融合した。

産生じたＰＣＲ誘導断片は、５’Ｅｃ。

Ｒ１部位および３’Ｎｄｅ１部位を側腹に有する鶏痘配列からなる。この断片の 中央は、Ｎｏｔ１部位および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを側腹に有し、 Ｓｍａｌ、ＢａｍＨＩ、およびＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ部位を含有するポリクローニ ング領域である。初期転写終止信号（ユエンおよびモス、１９８７）は３’Ｎｏ ｔ１部位に隣接している。ＥｃｏＲｌとＮｄｅｌで切断した、このＰＣＲ誘導断 片を、同様に切断したｐＲＷ７１５に連結し、プラスミドｐ　ＲＷ８６４を産生 じた。ｌｌｋプロモートしたｌａｃ　Ｚ遺伝子を、部分的なりａｍＨＩの切断と 全体的なＰｓｔｌの切断によりｐＡＭｌから切除した。この断片をクレノウボリ メラーゼでプラントエンドし、ＳｍａＩ切断したｐ　ＲＷ８６４に連結し、ｐＲ Ｗ８６７Ａを産生した。ＮｏｔＩ部位が、Ｆｓｐ１部位に連結される場合に再産 生されるように、ｐＲＷ８６７ＡからのＮｏｔＩ断片を、ｄＮＴＰの存在下でク レノウボリメラーゼでプラントエンドし、挿入がタータグリアら（１９９０）に より記載された位置１９５５に対応して行なわれるように部分的にＦｓｐｌで切 断されたｐ　ＲＷ８６６に連結した。次いで産生じたプラスミドｐ　ＲＷ８６８ をＮｏｔｌで切断し、ｌａｃ　Ｚカセツテを除去し、Ｎ。

ｔＩ切断により切除されたｐ　ＲＷ８６４からの６６ｂｐポリリンカーに連結し た。産生じたプラスミドをｐＲＷ６７３と称した。８１ｂｐ　Ｓｍａｌ断片をＩ ）ＶＱ４２ＫＴＨ４，１（実施例１０４で定義した）から誘導し、ＳｍａＩ切断 したｐ　ＲＷ８７３に挿入し、プラスミドｐＶＱ８７３を産生じた。

ｎｅｆカセツテを、ｐＶＱ８７３および続いてＩＶＲによるＴＲ０ｖＡＣのＦ１ ６座ヘノ挿入ツタめの６８４ｂｐＨｉｎｄｌｌ！断片としてｐＢＳ　Ｉ　３ＮＥ Ｆから切除し、ｖＦＰ１７４を産生した。

実施例１０７−ＮＹＶＡＣ中のＨＩＶ−２遺伝子の発現ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２　 ｇａｇ／ｐｏ１組換え体の産生２型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ２）ｇａｇお よびｐｏ１遺伝子を含有する、プラスミド、ｐ　Ｉ　５ＳＹＥＧＰをＤｒ、Ｇ、 フランチ−＝（ＮＣＩ−ＮＩＢ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよび ｐｏｌ遺伝子を、１３Ｌプロモーターの下流とワクシニアウィルスｔｋフランキ ングアームの間に挿入した。これは、ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含 有するｐ　Ｉ　５ＳＹＥＧＰの４．４４０ｂｐ　ＢｓｔＵＩ−ＢｇｌｌＩ断片、 およびＩ３Ｌプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドＨＩＶ２Ｌ１　（配列 認識番号４６１） と５ＩＶＬＩ（配列認識番号１８１）を、ｐＳＤ５４２（実施例３２に定義した ）の４，０７０ｂｐ　Ｘｈｏｌ　−Ｂｇｌｌｌ断片にクローニングすることによ り行なった。

この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２１と称する。

次いで外来３′非暗号配列を除去した。これは、ｐｏｌ遺伝子の３′末端を含有 する２８０ｂｐ　Ｂｃｌｌ　−Ｓｍａｌ　ＰＣＲ断片をｐＨＩ　Ｖ２１の８，１ ００ｂｐ　Ｂｅ１　夏−３ｍａ　ｒ断片にクローニングすることにより行なった 。このＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｐ２（配列認識番号４６２ ） （５’　−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＡＴＴＧＣＡＴ−３’　）およびＨＩＶ２Ｐ３ 　（配列認識番号４６３）（５’　−Ｔ’ｒＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣＴＡＴ ＧＣＣＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴ−３’　）を有する、プラスミドｐ　Ｉ　５ＳＹＥ ＧＰから産生じた。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２２と称する 。

ｐＨＩＶ２２を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに組換 え実験に用いてｖＰ１０４５を産生じた。

イムノブレシピテーション分析を行なって、ｖＰ１０４５が真正ＨＩＶ２　ｇａ ｇ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめ たか、１０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ、ｔ、で親ウィルスに感染せしめたか、または ｖＰ１０４５に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、 ２％の胎児ウシ血清および［３うＳ］−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有 する２ｍｌの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。１ｍｌ の３×緩衝液Ａ（３％　ＮＰ−４０，３０ｍＭ　トリス（ｐＨ７，４）　、３ｍ Ｍ　ＥＤＴＡ、０゜０３％　Ｎａ　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳ Ｆ）の添加と続いての細胞単層の削成りにより感染から１８時間後に細胞を収穫 した。

ＨＩＶ２血清陽性個体から集積した血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄ ｒ、Ｇ、７う”ｙアーム（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞から の溶解産物をＨＩＶ２　ｇａｇ発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６感染ベ ロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに 結合せしめた。このインキュベージシン期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄 した。

次いで通常ヒト血清とタンパク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタン パク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ２血清陽性での４℃で一晩インキユベー ションした。

−晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２ＸＬｉＣ１ｚ ／尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ　）リス（ｐ Ｈ６，８）、４％　ＳＤＳ、２０％　グリセロール、１０％　２−メルカプトエ タノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を 分離した。タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９８ ４）上に分画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａ−サリチル酸 塩で処理した。

ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖＰ１０４５感染細胞からＨＩＶ２　 ｇａｇ前駆前駆体タンパ間質びに様々な中間体および熟成ｇａｇ開裂開裂タンパ ク生産生物異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＮＹＶＡＣ感染細胞から はＨＩＶ２特異的特異的タンパ性質せしめなかった。

実施例１０８−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１ ６０）組換え体の産生ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラスミ ド、ｐＩ　５ＳＹＥＧＰをＤｒ、Ｇ、　フランチー：（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得 た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を１３Ｌプロモーターの下 流とワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。

これは、上述したように最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を調製することにより行 なった（実施例１０７参照）。

ｐＨＩＶ２２を治療ウィルスとしてのｖＰ９２０とともに組換え実験に用いて、 ｖＰ１０４７を産生した。

上述したように、ＨＩＶ２　ｇａｇタンパク質の発現に関してｖＰ１０４７感染 細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞からはＨＩＶ２ 特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖＰ１０４７感染細胞の溶解産物から は、ＨＩＶ２　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆前駆体タンパ間質応するタンパク生捕、 並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

実施例１０９−ＮＹＶＡＣ／ＨＩＶ２　ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎＶ　（ｇｐ１ ２０）組換え体の産生ＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有するプラスミ ド、ｐｌｓｓＹＥＧＰをＤｒ、Ｇ、　フランチ−、：（ＮＣ１−ＮＩＨ）から得 た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を１３Ｌプロモーターの下 流とワクシニアウィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。

これは、上述したように最初にプラスミドｐＨＩＶ２２を調製することにより行 なった（実施例１０７参照）。

ｐＨＩＶ２２を治療ウィルスとしてのｖＰ９２２とともに組換え実験に用いて、 ｖＰ１０４４を産生した。

上述したように、ＨＩＶ２　ｇａｇタンパク質の発現に関してｖ　Ｐ　１０４４ 感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞からはＨＩ Ｖ２特異種は沈殿しなかった。しかしながら、ｖ　Ｐ　１０４４感染細胞の溶解 産物からは、ＨＩＶ２　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆前駆体タンパ間質応するタンパ ク生捕、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿した。

実施例１１Ｏ−ＡＬＶＡＣ中（７）ＨＩＶ２遺伝子の発現ＡＬＶＡＣ／ＨＩＶ２ 　ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ（ｇｌ）１６０）組換え体の産生 プラスミド、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ２ＥＮｖはＨ６プロモートしたＨＩＶ２　ｅｎｖ 　（ｇｐ１６０）遺伝子を含有する。

このプラスミドからのＨ６プロモートしたｅｎｖ遺伝子をカナリヤボックスフラ ンキングアームの間にクローニングした。これは、Ｈ６プロモートしたｅｎｖ遺 伝子を含有する、ｐＢｓＨ６ＨＩＶ３ＥＮＶの２，７００ｂｐ　Ｘｈ。

！−３ａｃｌＩ断片、およびオリゴヌクレオチド、ＨＩＶ２Ｌ４（配列認識番号 ４６４） （５彎−ＧＧＴｒＧ−３１） とＨＩＶ２Ｌ５　（配列認識番号４６５）（５１−ＡＡＴｒＣＡＡＣＣＧＣ−３ ’　）を、ｐＣ６ＬのＸｈｏｌ−ＥｃｏＲ１部位にクローニングすることにより 行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐＨＩＶ２３と称する。

次いでＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をｐＨＩＶ２３にクローニングした 。これは、Ｉ３ＬプロモートしたＨＩＶ２　ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有す る、ｐＨＩＶ２２の４．４５０ｂｐ　Ｘｍａｌ−ＮｏｔＩ断片、およびオリゴヌ クレオチド、ＨＩＶ２Ｌ６　（配列認識番号４２３）とＨＩＶ２Ｌ７　（配列認 識番号４２４）を、ｐＨＩＶ２３の７，０００ｂｐ　Ｘｍａｌ−Ｘｈｏｌ断片に クローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐ ＨＩＶ２５と称する。

ｐＨＩＶ２５を治療ウイ／ｌ／スとして（７）ＣＰｐｐ　（ＡＬＶＡＣ）ととも に組換え実験に用いてｖｃＰ１５３を産生した。

イムノブレシビテーション分析を行なって、ｖｃＰ１５３が真正ＨＩＶ２　ｇａ ｇおよびｅｎｖ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ＣＥＦ細胞単層を、 疑似感染せしめたか、１０　Ｐ　Ｆ　Ｕ／細胞のｍ、ｏ、ｔ、で親ウイルスに感 染せしめたか、またはｖｃＰ１５Ｂに感染せしめた。

１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［３ ９］−メチオニン（２０μＣｉ　／　ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培 地（メチオニンを含まない）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％ＮＰ− ４０，３０ｍＭ　トリス（ｐＨ７，４）　、３ｍＭＥＤＴＡ、０．０３％　Ｎａ 　Ａｚｉｄｅおよび０．６ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ）の添加と続いての細胞単層の 削取りにより感染から１８時間後に細胞を収穫した。

ＨＩＶ２血清陽性個体から集積した血清（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ−ＮＩＨ，Ｄ ｒ、Ｇ、フランチｍ＝（ＮＣＩ−Ｎ　Ｉ　Ｈ）から得た）を用いて、感染細胞か らの溶解産物をＨＩＶ２　ｇａｇおよびｅｎｖ遺伝子発現に関して分析した。血 清をＣＰｐｐ感染ＣＥＦ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパ ク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質をＩ ×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質ＡＡセファロース で前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したＨＩＶ２血清陽性 での４℃で一晩インキユベーションした。−晩のインキュベーション期間後、試 料をＩ×緩衝液Ａで４回、２ＸＬ　ｉ　Ｃ１２／尿素緩衝液で２回洗浄した。２ ×のラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ　）リス（ｐＨ６，８）　、４％　ＳＤＳ、２ ０％　グリセロール、１０％　２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸 騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を１０％ ドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９ｇ４）上に分画し、固定し、フル オログラフィーのためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理した。

ＨＩＶ２血清陽性個体からのヒト血清は、ｖｃＰ１５３感染細胞からＨＩＶ２　 ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成ｇａｇ開 裂開裂タンパク生産生物異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはＣＰｐｐ感 染細胞からは）ＩＩＶ２特異的特異的タンパ性質せしめなかった。

実施例１１１−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｅｎｖ　（ｇｐ１２０−ｇｐ２８）および ｇａｇ　（プロテアーゼ−）組換え体のＮＹＶＡＣ産生におけるＳＩＶ　遺伝子 の発現 イムノブレシビテーション分析を行なって、ｖＰ９４８（実施例２１で定義した ）が真正ＳＩＶｇａｇおよびｅｎＶ遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。

ベロ細胞単層を、疑似感染せしめたか、ｌ０ＰＦＵ／細胞のｍ、ｏ。

ｉ、で親ウィルスに感染せしめたか、またはｖＰ９４８に感染せしめた。１時間 の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［３５３］ 　−メチオニン（２０μＣｉ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの修飾イーグル培地（メ チオニンを含まない）で重るいした。１ｍｌの３×緩衝液Ａ（３％　ＮＰ−４０ ，３０ｍＭ　トリス（ｐＨ７゜４）　、３ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．　０３％　Ｎａ 　Ａｚｉｄｅ’および０１６ｍｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ）の添加と続イテノ細胞単層 の削取りにより感染から１８時間後に細胞を収穫した。

ＳＩＶ血清陽性７７’７り（ＭＤ、ベセスダ、ＮＣＩ　−Ｎ　ＩＨ，Ｄｒ、Ｇ、 フランチー：（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物 をＳＩＶｇａｇおよびｅｎｖ前駆体発現に関して分析した。血清をｖＰ８６６″ ＮＹＶＡＣ）感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク 質Ａセファ０−スに結合せしめた。

このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通 常ヒト血清とタンパク質ＡＡセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａ セファロースに結合したＳＩＶ血清陽性マカクでの４℃で一晩インキユベーショ ンした。−晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２ＸＬ 　ｉ　Ｃ１２／尿素緩衝液で２回洗浄した。２Ｘのラエムリ緩衝液（１２５ｍＭ 　トリス（ｐＨ６，８）　、４％　ＳＤＳ、２０％　グリセロール、１０％　２ −メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿し たタンパク質を分離した。

タンパク質を１０％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、１９８４）上に分 画し、固定し、フルオログラフィーのためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で処理し た。

ＳＩＶ血清陽性個体からのカマツは、ｖＰ９４８感染さいぼうからはＳＩＶ　ｇ ａｇ前駆体タンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた が、疑似感染細胞からはＳＩＶ特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。

実施例１１２−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇａｇ／ｐｏ１組換え体の産生 Ｓ　Ｉ　ＶＭＡＣＩ４２ＣＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳ ＳＩＩＧをＤｒ、Ｇ、フランチｍ＝（ＮＣＩ−ＮＩＨ）から得た。このプラスミ ドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を１３Ｌプロモーターの下流およびワクシニ アウィルスｔｋフランキングアームの間にクローニングした。これは前述したよ うにプラスミドｐＳＩＶＧ５を調製することにより行なった（実施例２１参照） 。

次いで外来の３′非暗号配列を除去した。これは、ｐＯ１遺伝子の３′末端を含 有する、１，０００ｂｐ　ＢａｍＨｌ−Ｈｐａｌ　ＰＣＲ断片を、ｐｓＩＶＧｌ の７，４００ｂｐ　部分的ＢａｍＨＩ−Ｈｐａｌ断片にクローニングすることに より行なった。このＰＣＲ断片を、オリゴヌクレオチド、５ＩＶＰ５（配列認識 番号１８３）および５ＯＶＰ６　（配列認識番号１８４）を有するプラスミド、 ｐＳＩＶＧＡＧＳＳｌｌＧから産生じた。この操作により産生じたプラスミドを ｐｓＩＶＧ４と称する。

配列分析により、ｐｓＩＶＧ４がｐｏｌ遺伝子ないに単一の塩基対欠損を含有す ることが分かった。この誤差を訂正すルタメニ、ｐｓＩＶＧｌの２．３２０ｂｐ 　Ｂｇｌｌｌ−５ｔ　ｕ　Ｉ断片をｐｓＩＶＧ４の６．１００ｂｐ　部分的Ｂｇ ｌｌｌ−Ｓｔｕｌ断片にクローニングした。この操作により産生じたプラスミド をｐｓＩＶＧ５と称する。

ｐＳＩＶＧ５を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに組換 え実験に用いてＶＰ１０４２を産生した。

ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質に関して前述したように、ｖＰ１ ０４２感染細胞のイムノブレシビテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞 またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＳＩＶ特異特異性殿しなかった。

しかしながら、ｖＰ１０４２感染細胞の溶解産物からは、ｇａｇ前駆体タンパク 質に対応するタンパク質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈殿 した。

実施例１１３−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ　（ｇｐ１２ ０−ｇｐ４１）組換え体の産生 ｐｓＩＶＧ５（実施例２１）を治療ウィルスとしてのＶＰ１０５０とともに組換 え実験に用いてＶＰ１０７１を産生した。

ｖＰ１０７１感染細胞のイムノブレシビテーション実験によりＳＩＶ遺伝子の発 現が示される。

実施例１１４−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇａｇ／ｐｏｔおよびｅｎｖ　（ｇｐ１２ ０−ｇｐ２８）組換え体の産生 ｐｓＩＶＧ５（実施例２１）を治療ウィルスとしてのＶＰ８７４とともに組換え 実験に用いてｖＰ９４３を産生じた。ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパ ク質の発現に関して、前述したようにｖＰ９４３感染細胞のイムノブレシピテー ション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からはＳＩＶ特異特異性殿しなかった 。しかしながら、ｖＰ９４３感染細胞からは、ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパ ク質に対応するタンパク質量、並びに様々な中間体と熟成ｇａｇ開裂産生物が沈 殿した。

実施例１１５−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｐ１６、ｐ２８組換え体の産生 ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように ｖＰ９４２　（実施例２１）感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なっ た。しかしながら、ｖＰ９４２感染細胞の溶解産物からは、ｐ１６およびｐ２８ に対応するタンパク質量が沈殿した。

実施例１１６−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｐ１６、ｐ２８およびｅｎｖ　（ｇｐ１２ ０　ｇｐ２８）組換え体の産生 ３１Ｖ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、上述したように ｖＰ９５２　（実施例２１）感染細胞のイムノブレシピテーション実験を行なっ た。しかしながら、ｖＰ９５２感染細胞の溶解産物からは、６ｎＶｓ　ｐ１６お よびｐ２８に対応するタンパク’ＥｔＦｆｆｉが沈殿した。　。

実施例１１７−ＮＹＶＡＣ／ＳＩＶ　ｅｎｖ　（ｇｐ１２０−ｇｐ４１）組換え 体の産生 プラスミド、ｐｓＩＶＥＭＶｃは、Ｈ６ブロモートしたＳＩｖＭＡＣＩ４２エン ベロープ遺伝子（生体外選択切形バージョン）を含有する。未熟終止コドンを含 有するエンベロープ遺伝子の領域をｐＢＳＫ＋にクローニングした。これは、ｐ Ｓ　ＩＶＥＭＶＣの１．１２０ｂｐ　Ｃ１ａＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＢＳＫ＋の Ｃ１ａｌ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングすることにより行なった。この操作に より産生じたプラスミドをｐｓＩＶｌｏと称する。

次いで上流の終止コドン、ＴＡＧを起点ＣＡＧコドンに変更した。これは、オリ ゴヌクレオチド、５ＩＶＬ２０（配列認識番号４６６） （５’　−ＣＴＡＧ（ＴＡＡＧＴ’ｒＡＡＧＧＣＡＧＧＧＧＴＡＴＡＧＧＣＣＡ ＧＴＧＴＴＣＴＣ’ｌ’ｒＣＣＣＣＡＣＣＣＴＣＴＴＡＴ？ＴＣＣＡＧＣＡＧＡ ＣＴ　ＣＡＴＡＣＣＣＡＡＣＡＧ−３１）オヨび５ＩＶＬ２１（配列認識番号４ ６７）（５１−ＧＴＣＣＴＧＴＴ　ＧＧＧＴＡＴＧＡＧＴＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡ ＴＡＡＧＡＧＧＧ賀℃ＧＧＡＡＧＡＧＡＡＣＡＣＴＧＧＣＣＴＡＴＡＣＣＣＣＴ ＧＣＣＴＴＡＡＣＴＴＡＧ−３’　）を、り５ＩＶＩＯの４．０００ｂｐ　Ｎｈ ｅｌ−ＰｐｕＭＩ断片にクローニングすることにより行なった。この操作により 産生じたプラスミドをｐｓｌＶｌｌと称する。

次いで修飾コドンを含有する領域をｐｓＩＶＥＭＶｃにクローニングした。これ は、終止コドンを含有する、ｐｓＩｖｌｌの３８０ｂｐ　Ｂｇｌｌｌ−Ｎｈｅｌ 断片をｐＳＩＶＥＭＶＣの５，６００ｂｐ　部分的Ｂｇｌｌｌ−Ｎｋｈｅｌ断片 にクローニングすることにより行なった。この操作により産生じたプラスミドを ｐｓＩＶ１２と称する。

ｐｓＩＶ１２を治療ウィルスとしてのｖＰ８６６　（ＮＹＶＡＣ）とともに生体 外組換え実験に用いてｖＰ１０５０を産生した。

ＳＩＶ　ｅｎｖおよびｇａｇ前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように ＶＰ１０５０感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベ ロ細胞またはＮＹＶＡＣ感染ベロ細胞からはＳＩＶ特異特異性殿しなかった。し かしながら、ｖＰ１０５０感染細胞の溶解産物からは、ｅｎｖに対応するタンパ ク質量が沈殿した。

実施例１１８−ＡＬＶＡＣ中１７）ＳＩＶ遺伝子ノ発現ＡＬＶＡＣ／ＳＩＶ　ｇ ａｇ／ｐｏｔ組換え体の産生Ｓ　Ｉ　ＶＭＡＣ＋４２ＣＤＮＡ配列を含有する、 プラスミド、ｐＳＩＶＧＡＧＳＳｌｌＧは、Ｄｒ、０．７ランチー二（ＮＣＩ− ＮＩＨ）から得た。このプラスミドからのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を、Ｉ３Ｌ プロモーターの下流とワクシニアウィルスフランキングアームの間にクローニン グした。

これは、前述したように最初にプラスミドｐＳＩＶＧ５を調製することにより行 なった（実施例２１参照）。

次いでｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子をカナリヤボックスフランキングアームの間にクロ ーニングした。１３Ｌプロモートしたｇａｇ／Ｉ）０１遺伝子を含有する、ｐｓ ＩＶＧ５の４゜５００ｂｐ　ＳｍａＩ−ＮｏｔＩ断片をｐＣ５Ｌ　（実施例４４ で定義した）のＳｍａ　Ｉ　−Ｎｏ　ｔ　１部位にクローニングすることにより 行なった。この操作により産生じたプラスミドをｐｓＩＶＧ０１３と称する。

ｐｓＩＶＧｃ１３を治療ウィルスとして（７）ＣＰｐｐ（ＡＬＶＡＣ）とともに 組換え実験に用いてｖｃＰ１７２を産生した。

ｖｃＰ１７２感染細胞のイムノブレシピテーション実験によりＳＩＶ遺伝子の発 現が示される。

実施例１１９−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリヤボックスを用いてヒトの 免疫化（ＡＬＶＡＣ−ＲＧ；ｖＣＰ６５） 実施例１５および第１７図に記載したように、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ＶＣＰ６５ ）を産生じた。拡張とワクチン製造のために、特定病原体感染防止条件部から誘 導した主要ＣＥＧ中にＡＬｖＡＣ−ＥＧ　（ｖＣＰ６５）を成長せしめた。

０．０１の多重度で細胞を感染せしめ、３７℃で３日間インキュベーションした 。

感染細胞の血清不含有培地中の超音波分裂により、ワクチンウィルス懸濁液を得 た；次いで細胞デブリを遠心分離と濾過により除去した。産生じた浄化懸濁液に 、１回の投与量のガラスびんに分配され凍結乾燥せしめられた凍結乾燥安定剤（ アミノ酸の混合物）を補給した。凍結乾燥の前に、血清不含有培地と凍結乾燥安 定剤の混合物中のウィルス懸濁液を連続の１０倍希釈により、力価を減少させる ３つのバッチを調製した。

細胞基質、培地およびウィルス種並びに、外来剤の探求と研究所のげっ歯動物の 無害性に重点を置いた最終産生物に品質管理試験を施した。所望の特徴は見られ なかった。

前臨床データ 生体外研究により、ＶＥＲＯまたはＭＲＣ−５細胞はＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣ Ｐ６５）の成長を指示しないこと；一連の８　（ＶＥＲＯ）　および１０　（Ｍ ＲＣ）ブラインド血清継代ではこれらの非アビアン系において成長するウィルス の適応は検出可能とはならなかったことが示された。ヒト細胞系の分析（ＭＣＲ −５、ＷＩ　ＳＨデトロイト５３２、ＨＥＬＳＨＮＫまたはＥＢＣ転換転換リン ８若幼若化ＡＬＶＡＣＧ　（ｖｃＰ６５））は、これらの細胞中で複製のブロッ クがＤＮＡ合成の前に生じることを示唆するウィルス特異的ＤＮＡの蓄積を示さ なかった。しかしながら、試験した全ての細胞系の狂犬病ウィルス糖タンパク質 遺伝子の発現は、カナリヤボックス複製サイクルの不完全工程がウィルスＤＮＡ 複製の前に生じることを目だって示している。

ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）の安全性および効能を動物の一連の実験に報 告した。カナリヤ、鶏、アヒル、ガチョウ、研究所のげっ歯動物（乳獣と成長し たネズミ）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスサル、ア カゲサルマカク、およびチンパンジーを含む多くの種に１０５から１０’ｐｆｕ の範囲の投与量で接種した。

様々な経路を用いたが、通常は皮下、筋向および皮肉であるが、または口頭（サ ルとネズミ）および大脳内（ネズミ）もまた用いた。

カナリヤにおいて、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）は、病気または死の徴候 を示さず乱切の部位で「生着」外傷を生じた。ウサギの皮肉接種は、広がらず７ 日から１０日で直った典型的なポックスウィルス接種反応となった。どの動物試 験においても、カナリヤボックスのための副作用は生じなかった。急速蛍光焦点 阻害試験（Ｒａｐｉｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｆｏｃｕｓ　Ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｏｎＴｅｓ　ｔ　；ＲＦＦＩＴ）により測定したように、げっ歯動物、イヌ、 ネコ、および霊長目動物へのＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖｃＰ６５）の接種後、抗狂 犬病抗体の発達により、免疫抗原性を証明した。また、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖ ＣＰ６５）で免疫化したネズミ、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウィルス抗原 投与実験により防御を証明した。

志願者 狂犬病免疫化の前歴のない２０−４５才の２５人の大人を登録した。志願者の健 康状態を、完全な医学経歴、物理試験、血液学的および血液化学分析により評価 した。除外基準は、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫低下、慢性衰弱病、 癌、過去３か月の免疫グロブリンの注射、およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　 Ｖ）またはＢ型肝炎ウィルス表面抗原に対する血清陽性を含んだ。

研究設計 標準ディプロイド細胞狂犬病ワクチン（ＨＤＣ）バッチＥＯ７５１番（フランス 、リヨン、バスチュアーメリクス血清＆ワクチン）または研究ワクチンＡＬＶＡ Ｃ−ＲＧ（ｖＣＰ６５）のいずれかを接種するように、参加−を任意に分配した 。

その試みを投与量段階的拡大研究と称した。実験ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６ ５）の３つのバッチを、各段階の間が２週間の間隔で、志願者の３つの群（Ａ、 Ｂ、および０群）に連続的に使用した。３つのバッチの濃度は、投与量当たり、 それぞれ１０３・５、ＩＱ４・５、ｌＱ５・５組織培養感染投与量（ＴＣＩＤｓ ｏ）であった。

各志願者に、４週間の間隔で三角領域に皮肉に同一のワクチンを２回接種した。

注射したワクチンの性質は、最初の注射のときには参加者には知られていないが 、試験者は知っていた。

２回目の注射の時に即座の超感受性の危険を最小限にするために、中間投与量の 実験ワクチンを分配したＢ群の志願者に、１時間前に低い投与量を注射し、高い 投与量（Ｃ群）を分配した志願者には、１時間の間隔で低い投与量と中間の投与 量を連続して接種した。

６か月後、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）（Ｃ群）とＨＤＣワクチンの最高 の投与量を接種した者は、３回目のワクチン投与を受けた；次いでその参加者に は前と同一のワクチンたまは変更ワクチンのいずれかを任意に接種した。

結果として、以下の免疫化計画に対応して、４つの群を形成した：　１．ＩＤＣ ，Ｉ（ＤＣ−ＨＤＣ，２，ＨＤＣＳＨＤＣ−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５） ；　３．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）　、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６ ５）−ＨＤＣ；４．ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）　、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　 （ｖＣＰ６５）　、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）。

副作用の監視 注射後１時間に亘り全ての被実験者を監視し、次の５日間毎日再検査した。被実 験者は、次の３週間に亘り局部的および全身的反応を記録するようにめられ、週 に２回電話で質問された。

研究所の研究者 登録の前と、各注射の２．４、および６日後に血液を採取した。分析は、完全血 球細胞算定、肝臓酵素およびクレアチニンキナーゼアッセイを含んだ。

抗体アッセイ 最初の注射の７日前と、研究の７．２８．３５．５６．１７３．１８７、および ２０８日後に、抗体アッセイを行なった。

急速蛍光焦点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）（スミス＆イエーガー、狂犬病の研究所技 術）を用いて、狂犬病に対する中和抗体の水準を測定した。直接ＥＬ　Ｉ　ＳＡ によりカナリヤボックス抗体を測定した。抗原である、０，１％のトリトンＸ１ ００により分断された精製カナリヤポックスウィルスの懸濁液をマイクロ板に被 膜した。固定化した血清の希釈物を室温で２時間反応せしめ、反応抗体は抗ヒト ＩｇＧヤギ血清を標識したとか示された。結果を４９０ｍｎでの光学密度リード として示した。

分析 ２５人の対象を登録し、研究を完了した。この対象は、１０人の男性と１５人の 女性であり、平均年齢は３１．９（２１から４８）才であった。３人を除いた全 ての対象は、前の天然痘ワクチン接種の形跡があった；残りの３人は典型的な跡 およびワクチン接種の経歴がなかった。３人の対象に、低い投与量（１０”およ び１０’・’ＴＣＩＤ、。）の実験ワクチンを投与し、９人の対象には１０５・ ’ＴＣＩＤ、。を投与し、１０人の対象にＨＤＣワクチンを投与した。

安全性（表４９） 最初の一連の免疫中、注射から２４時間以内に、１人のＨＤＣ接種者（３７，８ ℃）および１人のｖ、ｃＰ６５　１０う’ＴＣＩＤｓ。接種者（３８℃）では３ ７．７℃より高い熱が測定された。ワクチン接種に帰する他の全身的な反応はど の参加者にも見られなかった。

皮肉にＩＤＣを注射した接種者の９／１０と、それぞれｖＣＰ６５　１０３　ラ 　、　１　０”　、　１　０’−’　ＴＣＩ　Ｄ５０の接種者の０／３．１／３ および９／９に局部的な反応が見られた。

テンダネス（ｔｅｎｄｅｒｎｅｓｓ）が最も一般的な症状であり、通常は軽かっ た。他の局部的な症状は、赤味（ｒｅｄｎｅｓｓ）および軽く一時的な硬化（ｉ 　ｎｄｕ　ｒａｔｉｏｎ）を含んだ。全ての症状は、通常２４時間以内にやわら ぎ、７２以上は持続しなかった。

血球細胞算定、肝臓酵素またはクレアチニンキナーゼ値には、著しい変化はなか った。

免疫応答：狂犬病に対する中和抗体（表５０）最初の注射から２８日後、全ての ＨＤＣ接種者が防御力価（≧０．５１Ｕ／ｍｌ）を有した。これに対して、Ａお よびＢ群（１０３・５および１０４・うＴＣＩＤｓｏ）では誰もその値に達せず 、Ｃ群（１０う’　Ｔ　ＣＩ　Ｄｓｏ）における２／９のＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ ｖＣＰ６５）接種者のみがこの防御力価に達した。

５６日目に（すなわち、２回目の接種から２８日後）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖ ＣＰ６５）ワクチンの接種者のＡ群の０／３、Ｂ群の２／３およびＣ群の９／９ において、防御力価が達成され、１０人のＨＤＣ接種者全てに保持された。

５６日での幾何学的平均力価は、Ａ、Ｂ、ＣおよびＨＤＣ群においてそれぞれ０ ．０５．０．４７．４．４および１１．５　１Ｕ／ｍｌであった。１８０８０日 目、狂犬病抗体力価は全ての対象において実質的に減少したが、５／１０のＨＣ Ｄ接種者と５／９のＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ５６）接種者においては０．５ 　１Ｕ／ｍｌの最小防御力価より上の値を保持した。ＨＣＤおよびＣ群における 幾何学平均力価は、それぞれ０．５１および０．４５　ＩＵ／ｍｌであった。

カナリヤポックスウィルスに対する抗体（表５１）高い力価を有するそれらの対 象におけるカナリヤ鳥との前の接触の欠如にもかかわらず、観察された前免疫力 価は、０．２２から１．　２３　０．　Ｄ、単位に変化する力価とともに大きく 変化した。前免疫化と２回目の注射力価の間で２倍より大きい増加と定義した場 合、血清転化はＢ群の１／３およびＣ群の９／９に達成されたが、ＡまたはＨＤ Ｃ群においては血清転化された対象はいなかった。

追加抗原投与注射 追加抗原投与注射のときに、ワクチンは６か月後に同様に良好に耐性があった： ２／９のＩＤＣ追加抗原投与接種者および１／１０のＡＬＶＡＣ／ＲＧ　（ｖＣ Ｐ６５）追加抗原投与接種者が熱を生じた。５／９の１（ＤＣ追加抗原投与接種 者と６／１０のＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）追加抗原投与接種者には、局 部的反応が存在した。

観察 第３５図は、狂犬病中和抗体力価のグラフを示すものである（急速蛍光焦点抑制 試験またはＲＦ　Ｆ　Ｉ　Ｔ、　Ｉ　Ｕ／ｍｌ）二同−または変更ワクチンのい ずれかで以前に免疫化した志願者におけるＨＤＣおよびｖＣＰ６５　（１０”　 ＴＣＩＤ、。）の追加抗原投与効果。ワクチンは０．２８および１８０日に与え た。抗体力価は、０．７．２８．３５．５６．１７３、および１８７と２０８日 に測定した。

第３５図に示すように、与えられた追加抗原投与量により、どのような免疫化計 画の対象全てにおいても、狂犬病抗体力価がさらに増大することとなった。しか しながら、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）追加抗原投与は全体的に、ＨＤＣ 追加抗原投与およびＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖｃＰ６５）より低い免疫応答を誘発 し、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）−ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）群 は他の３つの群よりも著しく低い力価を有した。同様に、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ ｖＣＰ６５）追加抗原投与注射により、３１５の以前にＨＤＣワクチンを接種し た対象、および以前にＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＣＰ６５）で免疫化した５大全て の対象において、カナリヤボックス抗体力価の増大となった。

一般的に、ｖＣＰ６５の投与からの局部的などの副作用も、ウィルスの局部的な 複製を示さなかった。特に、ワクチンの注射後に観察されたような皮膚の外傷は なかった。

ウィルスの複製の明確な欠如にもかかわらず、注射により志願者に、カナリヤボ ックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する著しい量の 抗体を産生させた。

ネズミにおける血清中和化試験と良好に相関することが知られている急速蛍光焦 点抑制試験（ＲＦＦＩＴ）により、狂犬病中和抗体をアッセイした。１０５°’ ＴＣＩＤ５ｏの９人の接種者のうち、５人は最初の投与の後に低水準の応答を有 した。試験した最高投与量の接種者全て、および中間の投与量の３人のうち２人 の接種者において、２回目の注射後には、狂犬病抗体の防御力価が得られた。こ の研究において、両方のワクチンは、生ワクチンに通常推奨されているが、不活 化ＨＤＣワクチンに推奨されない皮肉に与えられた。注射のこの経路は、注射部 位の注意深い実験となるように選択されたが、これは、ＩＤＣ接種者における抗 体の遅い発生となる：実際、どのＩＤＣ接種者も７日目荷は抗体の増加とはなら ず、一方ＨＤＣワクチンが筋肉に与えられる研究のほとんどの場合、対象の著し い比率が抗体を増加させる（フレイトマンら、Ｉｎｔ’ｌ　グリーンクロスージ ェネバ、１９８１　、クワートら、Ｉｎｔ’ｌ　グリーンクロスージエネバ、１ ９９１）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の接種に限られたものでは ない。

狂犬病中和抗体のＧＭＴ　（幾何学的平均力価）は、ＨＤＣ対照ワクチンによる ものよりも、本発明のワクチンによるもののほうが低いが、防御に要する最小力 価よりはまだ十分に高い。本研究に用いた３回の投与により得られた明確な投与 量効果応答は、より高い投与量はより強い応答を誘発することを示唆する。この 開示から、当業者は所定の患者に適切な投与量を選択することができる。

抗体応答を増加せしめる能力はこの実施例の別の重要な結果である；実際、狂犬 病抗体力価の増大は、免疫化計画がどのようなものであろうとも、投与から６か 月後に全ての対照に達成され、カナリヤボックスベクターまたは狂犬病糖タンパ ク質のいずれかにより誘発された前から存在する免疫性が、組換えワクチン候補 または従来のＩＤＣ狂犬病ワクチンでの追加免疫への遮断効果を有さないことが 示された。これは、免疫応答が前から存在する免疫性により遮断されるというヒ トのワクシニア組換え体に関する他者の発見と対照的である（コーニーら、ラン セット１９９１．３３７：５８７−７２　、エトリンガ−ら、ワクチン１９９１ ．９：４７０−７２）。

それゆえ、この実施例は明確に、非複製ポックスウィルスは、複製剤が免疫応答 に与える全ての長所を有するが、完全許容ウィルスにより生じた安全性問題なく 、ヒトにおいて免疫化ベクターとして機能できることを示している。

表　４９ ワクチン接種から５日後の反応 １−一並 狂犬病中和抗体（ＲＥＦＩＴ；Ｉυ１１１）帥−ａ、ｏａｒｘチェーデ／Ｈｌ＃ 定 表　５１ カナリヤボックス抗体：　ＥＬＩＳＡ幾何学平均力価８実施例１２０−ＮＹＶＡ Ｃ−ＪＥＶ組換え体（ｖＰ９０８、ｖ　Ｐ　９２３）による日本脳炎ウィルスに 対する防御 ＮＹＶＡＣ−ＪＥＶ組換え体を用いて、日本脳炎ウィルスに対する防御を提供し た。ＮＹＶＡＣｖＰ８６６、ＮＹＶＡＣ組換え体ＶＰ９０８とｖＰ９２３、およ びワクシニア組換え体ｖＰ５５５とｖＰ８２９をここに記載したように産生じた 。

ネズミ防御実験 ネズミ防御実験を前述したように行なった（メイソンら、１９９１）。手足にい うと、生後４週間の非近交スイスネズミの１０から１２匹の群を、１０’ＰＦＵ のｖＰ８２９、ＶＰ８６６、ＶＰ９０８またはｖＰ９２Ｂで腹腔（ｉ、ｐ、　） 注射により免疫化し、血清を３週間後に採取した。ネズミに、ＪＥＶのベイジン （Ｂｅ　ｉ　ｊ　ｉ　ｎｇ）Ｐ３菌株をｉ。

ｐ６　注射により抗原投与した。抗原投与後、３週間後に実験が完了するまで毎 日観察した。実験動物の同腹子を用いて致死量滴定を行なった。

ブタの防御実験 約２５ｋｇの体重のランドレース交雑去勢ブタを用いた。

５匹のブタの群を、食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、または２ｍｌのＰＢＳで希 釈されたｌＸ１０８　ＰＦＵのｖＰ８６６、ｖＰ９０８またはｖＰ９２Ｂで皮下 （ｓ、ｃ、　）注射により免疫化した。接種から２８日後、上述したのと同じ方 法で注射により追加抗原投与し、最初の接種から５６日後に、２Ｘ１０’　ＰＦ Ｕ（７）ＪＥＶ（７）Ｂ−２３５８／８４菌株をＳ、Ｃ，注射により抗原投与し た。０（免疫化前）、７．１４．２８（追加抗原投与前）、３１．３５．４２． ５６（抗原投与前）、５７．５８．５９．６０．６１．６２．６３．６４および ７６（抗原投与後）日に、全ての群の動物から血清を採取した。

免疫応答の評砺 抗ブタイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇで波膜した固定５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ ｓ　ａｕｒｅｕｓ細菌（カリフォールニア、カーピンチリア、ダコー社）を使用 したことを除いては、ボニシら（１９９１）に記載されているように、［３５Ｓ ］Ｍｅｔ−標識ＪＥＶ感染細胞から得た培養液体または洗浄剤処理細胞溶解産物 から、ＪＥＶタンパク質を沈殿せしめる能力に関して、ブタの血清を検定した。

クラーケおよびカサルス（１９５ｇ）の方法の修正方法により、ブタとネズミの 前抗原投与血清のＨＡＩ検定を行なった。ブタの血清を検定するのに新鮮に解凍 したヒトの血清を使用しなかったことを除いては、実質的にメイソンら（１９９ １）に記載されたように、ＮＥＵＴ検定を行なった。

ウィルス血症 ＪＥＶ抗原投与から８日後に採取したを椎血清の新鮮に解凍したアリコートを、 ６ウエルマイクロ板中のＶＥＲＯ単層細胞上の感染ＪＥＶに関してプラーク滴定 した。ウィルス吸着後、細胞単層を、１％のカルボキシメチルセルロースを含有 する培地で重るいし、２０％エタノール中に溶解せしめた０、１％のクリスタル 紫の染色により感染から５日後にプラークを視覚化した。３つ以下のプラークが ３００μｌの血清でインキュベーションしたウェル中に観察された場合には、力 価は＜ｌ０ＰＦＵ／ｍｌと記録した。

組換えワクシニアウィルスの構造 本研究において構成したワクシニア組換え体に含有されたＪＥＶ　ｃＤＮＡ配列 を第３６図に示す。これらの組換えウィルスにおいて、ＪＥＶ　ｃＤＮＡの血清 ストランドを初期／晩期Ｈ６プロモーターの後ろに配した。組換え体ｖＰ９０８ 　（およびｖＰ５５５　；メイソンら、１９９１）は、ｐ　ｒＭ、ｐ　ｒＭ、Ｅ 、ＮＳ１およびＮ５２ＡのＮ末端に選考する推定１５アミノ酸信号配列を含有す る。組換え体ＶＰ９２３　（およびｖＰ８２８　；コニシら、１９９１）は、ｐ 「Ｍ、ｐｒＭ、およびＥの推定信号配列をコードする。

組換えワクシニアウィルスによるＥおよびＮＳＩの合成ＥまたはＮＳＩ遺伝子の イムノブレシピテーションを、ＥまたはＮＳＩに特異的な単クローン性抗体を用 いて行なった。ｖＰ５５５、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３に感染した細胞中でＥ 　ＭＡｂに反応性のあるタンパク質を合成し、ｖＰ９２３に感染した細胞中では な（ｖＰ５５５およびＶＰ９０８に感染した細胞中で、ＮＳＩ　ＭＡｂに反応性 のあるタンパク質を合成した。ｖＰ５５５感染細胞は、細胞の内側と外側でＥお よびＮＳＩの正確な形状を産生じた。

ｖＰ９０８およびｖＰ９２３により産生されたタンパク質は、ＶＰ５５５により 産生されたタンパク質のサイズと等しかった。ＥおよびＮＳＩに関して、細胞外 形状は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ中の細胞内形状より遅く移動し、これは、細胞からの 放出に直ちに先行するＮ連結グリカンの成熟と一致する。加えて、ｖＰ９０８感 染細胞は、ＮＳＩ、ＮＳＩ′の高分子量形状を産生じ、これはＪＥＶゲノムのＮ ５２Ａ領域によりコードされた配列の変更プロセシングにより誘導される（メイ ソンら、１９８７）。Ｍ（およびｐｒＭ）に特異的なＭＡｂを用いて放射線標識 ワクシニア組換え体感染細胞から調製した免疫沈殿物（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉ ｐｔｔａｔｅｓ）により、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３に感染した細胞中でｐｒ Ｍが合成されたことが分かった。

ｖＰ９０８およびｖＰ９２３感染ＨｅＬａ細胞の細胞外液体は、ｖＰ８６６感染 細胞の培養液体中では検出不可能なＨＡ活性を示した。データにより、ｖＰ８２ ９はｖＰ５５５よりも約８倍多い細胞外血球凝集素の合成を誘発したことが分か った。その差異に対応して、ｖＰ９２３に感染した細胞は、ｖＰ９０８に感染し た細胞よりも約８倍のＨＡ活性を産生じた。これらの結果により、ｖＰ９８０お よびｖＰ９２３により産生されたＪＥＶタンパク質の組換え体形状は、それぞれ ｖＰ５５５およびｖＰ８２９により産生されたものと等しいことが示された。

ネズミの免疫化および抗原投与 ＮＹＶＡＣベースの組換えウィルスの防御免疫を誘発する能力をネズミで実験し た。前抗原投与血清のＮＥＵＴおよびＨＡＩデータにより、ＶＰ９０８およびｖ Ｐ９２３は、ｖＰ８２９と同水準の抗体を産生じた（コニシら、１９９１）（表 ５２）。これらの血清学的データと一致して、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３は、 ＪＥＶの病原体Ｐ３菌株による致死量ＪＥＶ感染からの防御をネズミに提供する ことができた（表５２）。防御の水準は、ｖＰ８２９での免疫化により達成され た水準と同様であった（表５２）（コニシら、１９９１）　、これらの研究によ り、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３の２つのＮＹＶＡＣベースの組換え体は、前述 した水準（コニシら、１９９１）と同様の水準でネズミに免疫原性であったこと が確認された。

組換えワクシニアウィルスによるブタのＪＥＶ抗原に対する免疫応答の導入 ７日ごとに収集した各群の全てのブタから集積した前抗原投与血清を、抗ＪＥＶ 　ＮＥＵＴおよびＨＡＩ活性に関して検定した。第３７図に示すように、ｖＰ９ ０８およびｖＰ９２３で免疫化したブタ中にはＮＥＵＴとＨＡＩ活性の両者が観 察されたが、ＰＢＳまたはｖＰ８６６を接種したブタには観察されなかった。ｖ Ｐ９０８およびｖＰ９２３免疫化ブタの両者には、１回目と２回目の接種から７ 日後に比較的高水準のＮＥＵＴ抗体が観察されたが、２１日後にわずかに検出可 能な水準まで減少した。第１の接種と追加抗原投与の両方に関して、ＨＡＩは、 ＮＥＵＴ抗体よりもゆっくりと減少した（第３７図）。ｖＰ９０８は、ＶＰ９２ ３よりもやや高い水準のＨＡＩおよびＮＥＵＴ抗体を提供した。両方の組換え体 のＨＡＩ力価は、１回の接種後に達成されたものよりも、２回目の接種後に達成 されたほうが大きかった。ｖＰ９２３は、１回の接種よりも２回目の接種後のほ うが高いＮＥＵＴ力価を提供し、一方ｖＰ９０８は、１回または２回目の接種後 には等量のＮＥＵＴ力価を誘発した。

ブタを０日と２８日に免疫化し、ＰＢＳまたはｖＰ８５６で免疫化したブタから ５６日目に血清を採取し、ｖＰ９０８またはｖＰ９２３で免疫化したブタがらは ０，７．２８．３５および５６日目に血清を採取した。５の各群の全ての動物か ら集積した血清を、ＪＥＶ感染細胞の培養液体から収穫した放射線標識したタン パク質をイムノブレシビテーシランする能力に関して検定した。

Ｅに対する免疫応答は、ＮＥＵＴおよびＨＡＩ検定の結果と良好に相関性があっ た。ｖＰ９２３で免疫化したブタに観察された３５日目のＥに対するＲＩＰ応答 は、ｖＰ９０８で免疫化したブタ中のＥに対するＲＩＰ応答よりも高かったが、 ３５日目のＨＡＩ力価は、２つの群と等しがった。しかしながら、ｖＰ９２３で 免疫化したブタにおける３５日目のＮＥＵＴ力価は、ｖＰ９０８で免疫化したブ タよりも高かった。ＮＥＵＴまたはＨＡＩに関わる抗体以外の抗体が誘発される が、ＲＩＰ分析の量に関する面はさらには確認できなかった。比較的高いＮＥＵ Ｔ抗体力価にもかかわらず、７回目にＥに対する血清の弱いＲＩＰ応答が、免疫 化後の初期のＩｇＭ抗体により説明できた。ＪＥＶ特異的１ｇＭの水準はさらに は分析しながった。どの集積した血清もＮＳＩに対する免疫応答を示さなかった 。

組換えワクシニアウィルスで免疫化したブタ中のウィルス血症 対照ブタ［ＰＢＳ　（４１５）またはｖＰ８６６　（５１５）］からの抗原投与 後の血清中に、＞ｌ０ＰＦＵ／ｍｌのＪＥウイルス力価が検出され、一方ｖＰ９ ２３を接種した５匹のブタのうち２匹のみが＞ｌ０ＰＦＵ／ｍｌのウィルス血症 を示した（第３８図）。目だったことには、ｖＰ９０８で免疫化した５匹のブタ のうちどれも、＞ｌ０ＰＦＵ／ｍｌの測定可能なウィルス血症を示さなかった。

ＰＢＳおよびｖＰ８６６　（１，２Ｘ１０’　ＰＦＵ／ｍｌ）　で免疫化した群 の個々のブタの最大ウィルス力価の幾何学平均は、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３ 　（１，９Ｘ１０’　ＰＦＵ／ｍｌ；スチューデントを検定によりＰ＜０．００ １；＜１０ＰＦＵ／ｍｌのウィルス血症を有する全てのブタに関して、１０ＰＦ Ｕ／ｍｌの力価であると推定する）で免疫化した群の平均より著しく高かった。

さらに、＞ｌ０ＰＦＵ／ｍｌの細胞を示すブタのウィルス血症の平均期間は、Ｐ ＢＳおよびｖＰ８６６に関しては２．７日であり、＞１０ＰＦＵ／ｍｌの力価を 有する２つのｖＰ９２３免疫化ブタでは２．０日であった。これらの結果により 、ｖＰ９０８およびｖＰ９２３の免疫化は、抗原投与後にＪＥＶウィルス血症を 著しく減少したことが示される。

ＪＥＶ抗原投与に対する免疫応答を評価するために、抗原投与後２０日１に硝石 した個々の血清をＪＥＶに対する抗体に関して検定した。ｖＰ９０８またはｖＰ ９２３をワクチン接種したブタは、ＰＢＳまたはｖＰ８６６を接種したブタより も高いＥに対する応答を有し、抗原投与前に存在したＥに対する抗体活性をＪＥ Ｖ感染により追加抗原投与したことが示された。組換えワクシニアウィルス中で 発現されなかったＪＥＶタンパク質、ＮＳ３およびＮＳ５に対する応答が抗原投 与後の血清全ての検出され、ある水準のＪＥＶ複製が、＜ｌ０ＰＦＵ／ｍｌのウ ィルス血症を有したブタでさえも生じたことを示した。それゆえ、ＮＳ３に対す る抗原投与後の血清の反応性と血清ＪＥＶ力価により測定された感染の欠乏との 間の予期された逆数の関係は観察されなかった。これは、抗原投与後のＮＳ３に 対する集積しネズミの血清の反応性の欠乏が防御と相関するという、ネズミに得 られた以前のデータと対照的である（コニシら、１９９１）。

防御実験中、抗原投与から１２日後に親ワクシニア（ＶＰ８６６）群の１匹のブ タが死亡した。この動物は、抗原投与後の期間に亘り、他のブタより高い体温を 示し、３日間に亘り＞１．０ＯＯＰＦＵのＪＥＶ血清力価を有する唯一の動物で あった。検死時にサンプリングした一検体からはＪＥＶは検出されなかったけれ ども、ＪＥＣ感染により生じた病気により動物は死亡した。

観察 実施例は、ＮＹＶＡＣ−Ｊ　ＥＶがＪ　ＥＶウイ／Ｉ、ス血升対する効果的な防 御を提供することを示し；それゆえ、ＮＹＡＶＣ−Ｊ　ＥＶは有用であり、獣医 用途に安全である。

」Ｌ−」ｌ ネズミの免疫化およびＪＥＶ抗原投与 ａ生後４週間のネズミの群を免疫化するのに用いたワクシニア組換えウィルス ｂプラーク数を９０％減少せしめた血清希釈（メイソンら、　１９９１）Ｃ血清 希釈 ｄ生存数／抗原投与した数（生存％）。

免疫化から３週間後に、各群のネズミにベイジンＰ３菌株を抗原投与した。抗原 投与量は、同腹子のネズミを用いて致死量滴定により測定した３、８　ｘｔｏ’ 　ＬＤｓｏであった。

実施例１２１−ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）およびＮＹＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＰ８７ ９）の評価 イムノブレシピテーション アビアンまたは非アビアン細胞の前形成した単層に、細胞当たり１０ｐ　ｆ　ｕ の親ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）まはＮＹＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＰ８７９）ウィルス を接種した。接種は、メチオニンを含まず、２％の透析胎児ウシ血清を補給した ＥＭＥＭ中で行なった。１時間のインキュベーション後、接種物を除去して、培 地を２０μＣｉ／ｍｌの３５５−メチオニンを含有するＥＭＥＭ　（メチオニン を含まない）と置き換えた。約１６時間の一晩のインキュベーション後、緩衝液 Ａ（１％　ノニデットＰ−４０，１０ｍＭ）リスｐＨ７，４，１５０ｍＭ　Ｎａ Ｃｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．０１％　アジ化ナトリウム、１ｍｌ当たり５００単位のアプロチニン、およ び０．０２％　フェニルメチルスルホニルフッ化物）の添加により、細胞を溶解 せしめた。ニューヨーク週、アルバニー、ニューヨーク州保険省、グリフイス研 究所、Ｄｒ、Ｃ，）リナーチにより提供された２４−３Ｆ１０と称する狂犬病糖 タンパク質特異的単りローン性抗体、およびベーリンガーマンハイム社（ネコ、 ６０５−５００）から得たラット抗ネズミ複合体を用いて、イムノブレシピテー ションを行なった。ニューシャーシー州、ピスキャタウエイ、ファーマシアＬＫ Ｂバイオテクノロジー社から得たタンパク質ＡセファロースＣＬ−４８を、支持 マトリックスとして用いた。免疫沈殿物を、ドリファスら（１９８４）の方法に したがって、１０％のポリアクリルアミドゲル上に分画した。ゲルを固定し、フ ルオログラフィーのためにＩＭのＮａ−サリチル酸塩で１時間処理し、コダック ＸＡＲ−２フィルムに露出して免疫沈殿したタンパク質性を視覚化した。

動物の供給源 ニューシーラント白ウサギをヘアマーランドにニージャージ−１，ヘウイツト） から得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター非近交ネズミ、妊娠時期の雌の スイスウェブスター非近交ネズミ、および生後４週間のスイスウェブスターヌー ド（ｎｕ”ｎｕ”）ネズミをタコニックファーム社にニーヨーク、ジャーマンタ ウン）から得た。ＮＩＨガイドラインにしたがって、全ての動物を保持した。全 ての動物のプロトコルは、ＩＡＣＵＣ協会により認可された。必要と思われる場 合、明らかに末期の病気であるネズミを安楽死させた。

ウサギの病害の評価 ２匹のウサギのそれぞれに、様々な部位に、１０４．１０５．１０６．１０７、 または１０８ｐｆｕの各試験ウィルスを含有する０、１ｍｌのＰＢＳまたＰＢＳ 単体を皮肉に接種した。病害が解決されるまで、４８目から毎日ウサギを観察し た。硬結および潰瘍を測定し、記録した。

接種部位からのウィルスの回収 １匹のウサギに、様々な部位に、１０６．１０７、または１０’ｐｆｕの各試験 ウィルスを含有する０、１ｍｌのＰＢＳまたＰＢＳ単体を皮肉に接種した。１１ 日後、ウサギを安楽死させ、ウィルス回収のために機械的な分断と間接超音波処 理により、各接種部位から採取した皮膚の生検材料を無菌の状態に調製した。Ｃ ＥＦ単層のプラーク滴定により感染ウィルスをアッセイした。

ネズミの毒性 １０匹のネズミの群または５匹のヌードネズミの群に、０．５ｍｌの無菌ＰＢＳ 中のウィルスのいくつかの希釈の１つをｉｐにより接種した。実施例２４を参照 のこと。

シクロホスファミド（ＣＹ）処理 ｉｐ経路により、２日前に４ｍｌ　（０，２ｍ１）のＣＹ（シグマ）をネズミに 注射し、０日にウィルスを注射した。

感染から以下の日に、ネズミにＣＹをｉｐにより注射した：１日１｛こ４ｍｇ； ４．７および１１日に２ｍｇ　；　１４．１８．２１．２５および２８日に３ｍ ｇｏｌ１日目にカルターカウンターで白血球を数え上げることにより免疫抑制を 間接的にモニタした。平均の白血球数は、未処理ネズミでは１μｍ当たり１３． ５００細胞（ｎ−４）であり、ＣＹ処理対照ネネズでは１μｍ当たり４，２２０ 細胞（ｎ　−５）５０％の死亡率（Ｌ　Ｄ　ｓｏ）となるのに必要な致死量を、 リードおよびミュンヒ（リードおよびミュンヒ、１９３１１１）の比率方法によ り測定した。

ネズミのＮＹＶＡＣ−ＲＧの効能検定 生後４から６週間のネズミには、５０から１００μｌの希釈範囲（２，０−８， ０ｌ　ｏ　ｇｔｏ組織培養感染投与量５０％（ＴＣＩ　Ｄ５ｏ）　）のＶＶ−Ｒ Ｇ　（キーニーら、１９８４）、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ　（ティラーら、１９９１ｂ ）　、！たハＮＹＶＡＣ−ＲＧのいずれかをフットバッドで接種した。各群は８ 匹のネズミからなる。ワクチン接種から１４日後、頭蓋的接種により、１５ＬＤ ５゜の狂犬病ウィルスＣｖＳ菌株（０，０３ｍ１）をネズミに抗原投与した。２ ８日目に、生存したネズミを数え、防御投与量５０％（ＰＤ５゜）を計算した。

ＮＹＶＡＣ（ｖＰ８６６）の誘導 コペンハーゲンワクチン菌株のプラーククローン単離体である。ＶＣ−２から、 ワクシニアウィルスのＮＹＶＡＣ菌株を産生じた。ＶＣ−２からＮＹＶＡＣを産 生するために、毒性に関連する多くのウィルス機能を含む、１８のワクシニアＯ ＲＦは、この開示の最初のほうに記載したような一連の配列操作で正確に欠損せ しめた。新たな望ましくない読取り枠の状況を避けるために設計した方法で、こ れらの欠損を構成した。第３９図は、ＮＹＶＡＣを産生ずるために欠損したＯＲ Ｆを模式的に描いたものである。第３９図の上部には、ワクシニアウィルスゲノ ムのＨｉｎｄｌＩＩ制限地図（ＶＣ−２プラ一ク単離体、コペンハーゲン菌株） が描かれている。ＮＹＶＡＣの産生において続発的に欠損せしめられたＶＣ−２ の６つの領域が伸長している。

欠損は、この開示の最初のほうに記載した（実施例１から６）。その座から欠損 され、その遺伝子産生物の分子量および機能または相同性を伴ってＯＲＦがその ような欠損座の下に列記されている。

ヒト組繊細胞系のＮＹＶＡＣおよびＡＬＶＡＣの複製研究 ヒト起源の細胞中のワクシニアウィルス（ｖＰ８６６）のＮＹＶＡＣ菌株の複製 水準を測定するために、６つの細胞系を、液体培養下で細胞当たり０．１ｐｆｕ の入力多重度で接種し、７２時間インキュベーションした。コペンハーゲン親ク ローン（Ｖ　Ｃ−２）を平行して接種した。全てのウィルスの許容細胞基質を代 表するために、主要ひな胚胎繊維芽細胞（ＣＥＦ）（ＣＴ、スパラス社、ＳＰＦ 期限の生後１０−１１日の感染細胞包蔵卵から得た）を含む。

２つの基準に基づいて培養を分析した：生産的ウィルス複製の発生および外因性 抗原の発現。

多くのヒト誘導細胞中のＮＹＶＡＣの複製能力を表５３に示す。ＶＣ−２および ＮＹＶＡＣの両者は、ＣＥＦ細胞中で生産的な複製ができるが、ＮＹＶＡＣは、 やや減少した産生となる。ＶＣ−２はまた、ＥＢＶ転換リンパブラストイド（ｌ ｙｍｐｈｏｂ　ｌａｓ　ｔｏ　ｉｄ）細胞系ＪＴ−１（エプスタインバーウィル スで転換したヒトリンパブライトイド細胞系、リキンソンら、１９８４参照）を 除いて、匹敵する産生物で処理した６つのヒト誘導細胞系において生産的複製が できる。これに対して、ＮＹＶＡＣは、検定したヒト誘導細胞系のいずれにでも 生産的複製能力においては高度に弱毒化されている。ＮＹＶＡＣ感染ＭＲＣ−５ （ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１７１、ヒト胚肺起源）、デトロイト５Ｂ２　（ＡＴＣＣ＃ ＣＣＬ５４、ヒト包皮、ダウン症候群）、ＨＥＬ、２９９（ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ１ ３７、ヒト胚肺起源）、およびＨＮＫ　（ヒト新生児腎臓、ＭＤ、ウォーカース ピル、ウィチカーバイオブロダクッ社、ネコ＃７Ｏ−１５１）細胞から、残留ウ ィルス水準より高い感染細胞の少量の増加が達成された。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ 細胞または親ＶＣ−２感染ＣＥＦ細胞がら得られたウィルス産生物と比較した場 合、これらの細胞系の複製は著しく少ない（表５３）、ＮＹＶＡＣおよびｖｃ− ２両者（７）ＣＥＦ細胞中の２４時間での産生は、７２時間の産生と等しい。そ れゆえ、ヒト細胞系培養を追加に４８時間に亘すインキユベーションすると（さ らなる２つのウィルス成長サイクル）、達成された相対ウィルス産生を増幅させ る。

ヒト誘導細胞系、ＭＲＣ−５およびデトロイト５３２に得られた低水準のウィル ス産生と一致して、検出可能であるがわずかな水準のＮＹＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄 積が認められた。ＮＹＶＡＣ感染ＣＥＦ細胞中に観察されたＤＮＡ蓄積の水準と 相対的なＭＲＣ−５およびテトロイト５３２ＮＹＶＡＣ感染細胞系中のＤＮＡ蓄 積の水準は、相対的なウィルス産生と匹敵する。ＮＹＶＡＣ特異的ウィルスＤＮ Ａ蓄積は、いずれの他のヒト誘導細胞にも観察されなかった。

アビポックスウィルス、ＡＬＶＡＣを用いて、同様の実験を行なった。ウィルス 複製の結果を表５３に示す。どの後代ウィルスも、アビアン種に対するカナリヤ ポックスウィルスの宿主範囲制限と一致してヒト細胞系のいずれにも検出不可能 であった。いずれのヒト誘導細胞系にもＡＬＶＡＣ特異的ＤＮＡ蓄積が検出不可 能であったことは、これらのヒト誘導細胞中のＡＬＶＡＣの生産的複製の欠如と 一致する。

ヒト細胞におけるＮＹＶＡＣ−ＲＧ　（ｖＰ８７９）による狂犬病糖タンパク質 の発現 異種遺伝子の能率的な発現が、生産的ウィルス複製の著しい水準の欠如した状態 で得られるか否かを決定するために、同一の細胞系に、３５Ｓ−メチオニンの存 在下で狂犬病ウィルス糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣ組換え体（ＶＰ８７９ 、実施例７）を接種した。狂犬病糖タンパク質に特異的な単クローン性抗体を用 いて放射線標識した培養溶解産物から、狂犬病糖タンパク質のイムノプレシピテ ーションを行なった。狂犬病糖タンパク質の完全グリコジル化形状と一致する６ ７ｋＤａタンパク質のイムノプレシピテーションが検出された。どの血清学的交 差反応性産生物も、未感染または親ＮＹＶＡＣ感染細胞溶解産物中には検出され なかった。分析した全ての他のヒト細胞系にも同様の結果が得られた。

ウサギの皮膚への接種 皮肉接種後のウサギへの皮膚の外傷の性質と誘発を、枠ウィルス菌株の病原性の 尺度として以前から用いている（バラ−ら、１９８ｇ　、チルドら、１９９０　 、ツェナーら、１９５Ｂ　。

フレクスナーら、１９８７　、ゲンドンおよびチャーノス、１９Ｂ４）。それゆ え、ワクシニア菌株ＷＲ（バニカリら、（１９８１）に記載サレタヨうな、ＡＴ ＣＣ＃ＶＲ１１９ＣＶ−１細胞上で精製したプラーク、ＡＴＣＣ＃ＣＣＬ７０、 およびＬバリアントと称するプラーク単離体、選択したＡＴＣＣ＃ＶＲ２０３５ ）　、ＷＹＥＴＨ（ＰＡ、ｖリエッタ、ニスラボラトリーズによりＤＲＹＶＡＣ として市販されているＡＴＣＣ＃ｖＲ３２５）、コペンハーゲン（ＶＣ−２）、 およびＮＹＶＡＣによるｉｄ接種に関連する外傷の性質を、２匹のウサギの接種 により評価した（ＡＯ６９およびＡ１２８）。２匹のウサギは、ウィルスに対し て全体的に異なる感度を示した。すなわち、ウサギＡ１２８は、ウサギＡ０６９ よりも強烈ではない反応を示した。ウサギＡ１２８において、外傷は比較的小さ く、接種から２７日後に消散した。ウサギＡ０６９では、外傷は酷く、ＷＲ接種 部位では特に酷く、４９日後に消散した。外傷の酷さはまた、リンパ液排液網に 関連する接種部位の位置に依存した。特に、背のを椎（ｂａｃｋｓｐｉｎｅ）よ り上に位置する全ての部位は、より酷い外傷を示し、側腹部に位置する外傷を消 散するのにより長い時間が必要であった。全ての外傷を、４日目から最後の外傷 が消えるまで毎日測定し、最大外傷サイズと消散までの日数の平均を計算した（ 表５４）。対照ＰＢＳを注射した部位からは局部的な反応は観察されなかった。

ＷＲ，、ＶＣ−２、およびＷＹＥＴＨ’７クシニアウイルス菌株を注射した部位 では潰瘍外傷が観察された。特に、ＮＹＶＡＣを接種した部位では、硬結または 潰瘍外傷は観察されなかった。

接種部位での感染細胞の残存率 接種部位でのこれらのウィルスの相対的残存率を評価するために、ウサギに、１ ０６．１０７または１０’ｐｆｕのＶＣ−２、ＷＲ，ＷＹＲＴＨまたはＮＹＶＡ Ｃを含有するＯ、１ｍｌのＰＢＳを様々な部位に皮肉に接種した。各ウィルスに 関して、背のを椎の上の位置に１０’ｐｆｕの投与量と、その側腹に１０６およ び１０８の投与量を与えた。１１日間に亘り、接種部位を毎日観察した。ＷＲは 、最も強烈な応答を誘発し、次にはＶＣ−２とＷＹＥＴＨが続いた（表５５）。

ＷＲとＷＹＥＴＨに関しては、９日目に、ＶＣ−２に関しては１００日目、潰瘍 が観察された。

ＮＹＶＡＣまたは対照ＰＢＳを接種した部位は、硬結また潰瘍を示さなかった。

接種から１１１日目、接種の部位から皮膚の試料を切除し、機械的に分断し、ウ ィルスをＣＥＦ細胞上で滴定した。その結果を表５５に示す。この時魚で、投与 したよりも回収したウィルスが多いことはなかった。投与したウィルスの量にか かわりなく、カーワクシニア菌株ＷＲの回収は、各部位で約１０６ｐｆｕであっ た。

ワクシニア菌株ＷＹＥＴＨおよびＶＣ−２の回収は、投与量にかかわらず１０３ から１０’ｐｆｕであった。ＮＹＶＡＣを接種した部位からは、感染ウィルスは 回収されなかった。

遺伝子的または化学的免疫不全ネズミの接種多量の投与量のＮＹＶＡＣ（５Ｘ１ ０’　ｐ　ｆ　ｕ）またはＡＬＶＡＣ（１０’　ｐ　ｆ　ｕ）のヌードネズミへ の腹腔的接種では、１００日間の観察期間に亘り、死亡、外傷、およ明らかな疾 病とはならなかった。これに対して、ＷＲ（１０３から１０４ｐ　ｆｕ）　、Ｗ ＹＥＴＨ（５ｘ１０７または５Ｘ１０８ｐｆｕ）またはＶＣ−２（１０４から１ ０９ｐｆｕ）を接種したネズミは、最初に爪先、次いで尾のポックスウィルスに 典型的な広がった外傷を示し、続いである動物ではこう丸炎を示した。ＷＲまた はＷＹＥＴＨに感染したネズミにおいて、広がった外傷は一般的に、最終的には 死亡を導き、一方はとんどのＶＣ−２に感染したネズミは最終的には回復した。

計算したＬＤ、。値を表５６に示す。

特に、ＶＣ−２を接種したネズミは、爪先に外傷を示し始め（赤い丘疹）、１か ら２日後には尾に示した。これらの外傷は、最高の投与ｉｌ　（１０’　、１０ ８．１０７および１０’ｐｆｕ）を与えたネズミでは接種後（ｐｉ）１１と１３ 日の間、ｉｏ’ｐｆｕを与えたネズミではｐｉ１６日目、モして１０’ｐｆｕを 与えたネズミではｐｉ２１日目に生じた。１０３および１０２ｐｆｕを接種した ネズミには１００日の観察期間中は、外傷は観察されなかった。１０９から１０ ’ｐｆｕを与えたネズミにはｐｉ２３日目に、こう丸炎が観察され、他の群（１ ０７から１０’ｐｆｕ）では約７日後に観察された。こう丸炎は、１０９と１０ ’ｐｆｕの群に特に強烈であったが、１００日の観察期間の終りには、減退が観 察された。数ひきのネズミの皮膚には、症状の外傷がいくつか観察され、これは ｐｉ３０−３５日辺りに生じた。はとんどの痘外傷は、通常ｐｉ６０−９０日の 間に直った。１０９ｐｆｕを接種した群では１匹のネズミが死亡しくｐ　ｉ　３ ４日）、１０８ｐｆｕを接種した群では１匹のネズミが死亡した（ｐ　ｉ　９４ 日）。ＶＣ−２接種ネズミでは他には死亡は観察されなかった。

１０’ｐｆｕのワクシニアのＷＲ菌株を接種したネズミをｐｉ１７日目に痘外傷 を示し始めた。これらの外傷は、ＶＣ−２注射ネズミ（膨れた爪先、尾）により 示された外傷と同一であった。１０’ｐｆｕのＷＲ菌株を接種したネズミは、ｐ ｉ３４日目まで外傷を示さなかった。ＷＲの最高投与量（１０’ｐｆｕ）を接種 したネズミのみにこう丸炎が観察された。観察期間の後半の段階に亘り、外傷が 口の回りに発生し、ネズミは餌を食べるのをやめた。１０４ｐｆｕのＷＲを接種 した全てのネズミは死亡したが、また−はｐｉ２１と３１日の間に必要な場合に は安楽死させた。

１０’ｐｆｕのＷＲを接種した５匹のネズミのうち４匹は死亡したか、またはｐ ｉ３５と５７日の間に必要な場合には安楽死させた。低い投与量（１から１００ ｐｆｕ）のＷＲを接種したネズミには死亡したものはなかった。

より多量（５Ｘ１０７および５Ｘ１０’ｐｆｕ）の投与量のワクシニアウィルス のＷＹＥＴＨ菌株を接種したネズミは、爪先と尾に外傷を示し、こう丸炎を発達 させ、死亡した。５Ｘ１０６ｐｆｕまたはそれ未満のＷＹＥＴＨを接種したネズ ミは、疾病または外傷の徴候を示さなかった。

表５６に示すように、ＣＹ処理ネネズは、ヌードネズミよりもポックスウィルス の毒性をアッセイするのにより感度のあるモデルを提供した。このモデル系にお いて、ＷＲ。

ＷＹＥＴＨ，およびＶＣ−２ワクシニアウィルス菌株のＬＩ）ｓｏ値は、ヌード ネズミモデルよりも著しく低かった。加えて、以下に記載するように、ＷＹＥＴ ＨＳＷＲおよびＶＣ−２ワクシニアウイルスを接種したネズミには外傷が発達し 、各ウィルスの投与量が多ければ多いほど、外傷の形成が急速であった。ヌード ネズミに見られるように、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを接種したＣＹ処理ネネ ズは外傷を発達せしめなかった。しかしながら、ヌードネズミのようではなく、 投与量にかかわらず、ＮＹＶＡＣまたはＡＬＶＡＣを抗原投与したＣＹ処理ネネ ズはその何匹かが死亡した。これらの偶発的な発生は、死因に関しては、疑わし い。

全ての投与量のＷＹＥＴＨ（９，５Ｘ１０’から９．５Ｘ１０’ｐｆｕ）を接種 したネズミは、尾におよび／または爪先死ｐｉ７と１５日の間に痘外傷を示した 。加えて、尾と爪先は膨れた。尾の外傷の展開は、丘疹、潰瘍および最終的にか さぶたの形成とともに痘外傷の典型であった。

全テノ投与ｆｆｉ＋７）ＶＣ−２（１，６５Ｘ１０’から１．６５ＸＩＯ’）を 接種したネズミもまた、尾および／または爪先に、ＷＹＥＴＨ接種ネズミのネズ と相同な痘外傷を発達させた。これらの外傷は、接種から７−１２日後に観察さ れた。低い投与量のＷＲウィルスを接種したネズミには外傷は観察されなかった が、これらの群には死亡したネズミがいた。

ＮＹＶＡＣ−ＲＧ（７）効力検定 産生したＮＹＶＡＣ菌株が有用なベクターとなる能力を著しくは変更することな く、ワクシニアウィルスのコペンハーゲン菌株の弱毒化が行なわれたことを決定 するために、比較効力検定を行なった。ウィルスを弱毒化するために行なった連 続遺伝子操作に間にベクターの免疫原をモニターするために、レポーター外因抗 原として狂犬病ウィルス糖タンパク質を用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発 現するベクターの防御効能を狂犬病の標準ＮＩＨネズネズ力検定により評価した （セリグマン、１９７３）。表５７は、高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣベクター に得られたＰＤ５０値は、ｔｋ座に狂犬病筒タンパク質遺伝子を含有するコペン ／’％　−アンベースの組換え体を用いて得られたものと同一であり（キーニー ら、１９ｇ４）　、アビアン種への複製に制限されたカナリヤボックスペースの ベクター、ＡＬＶＡＣ−ＲＧに得られたＰＤ５゜値と同様である。

観察 既知の毒性遺伝子が欠損し、制限された生体外成長特性を有する、ＮＹＶＡＣを 、動物モデル系で分析し、その弱毒化特性を評価した。神経毒性ワクシニアウィ ルス研究所菌株、ＷＲ，２つのワクシニアウィルスワクチン菌株、ＷＹＥＴＨに ニーヨーク市保険局）およびコペンノ１−ゲン（ＶＣ−２）　、並びにカナリヤ ポックスウィルス菌株、ＡＬＶＡＣとの比較で、これらの研究を行なった（実施 例２４参照）。これらのウィルスは、ネズミ抗原投与モデルとウサギ皮膚モデル における相対病原能力の範囲を提供し、ＷＲは最も毒性のある菌株であり、ＷＹ ＥＴＨおよびコペンハーゲン（ＶＣ−２）は報告した特性を有する、以前に使用 した弱毒化したワクシニア菌株を提供し、ＡＬＶＡＣは複製がアビアン種に制限 されるポックスウィルスの実施例を提供した。これらの体内分析からの結果は、 ワクシニアウィルス菌株、ＷＲＳＷＹＥＴＨおよびコベン／％−ゲン（ＶＣ−２ ）に関連するＮＹＶＡＣの高度に弱毒化された特性を明確に示す（表２８−２９ ．５３−５７）。特に、ＮＹＶＡＣのＬＤ、。値は、アビアン宿主制限アビポッ クスウィルス、ＡＬＶＡＣに観察された値と一致した。ＮＹＶＡＣ，並びにＡＬ ＶＡＣにより死亡は、頭蓋内経路により非常に多量の投与量のウィルスが投与さ れたときのみに、観察された（実施例２４、表２８．２９．５６）。それでも、 これらの死亡が高いタンパク質質量の接種の非特異的な結果によるものであるか どうかは分かっていない。免疫無防備状態のネズミモデル（ヌードおよびＣＹ処 理）の分析結果は、ＷＲＳＷＹＥＴＨおよびコペンハーゲン菌株と比較して、Ｎ ＹＶＡＣの比較的高度に弱毒化された特性を示す（表５４および５５）。著しく は、ＮＹＶＡＣ接種動物またはＡＬＶＡＣ接種動物には、観察期間に亘り、広が ったワクシニア感染または接種の疾病の証拠は観察されなかった。ＮＹＶＡＣの 多重毒性感染遺伝子の欠損は、病原性に関して相乗効果を示す。ウサギの皮膚へ の皮膚内投与により、ＮＹＶＡＣの無害性の別の測定を提供した（表５４および ５５）。非アビアン種中では複製できないウィルスであるＡＬＶＡＣに関する結 果を考慮すると、接種部位での複製能力は、ＡＬＶＡＣの皮肉接種が投与量依存 方法において硬結の領域を生じるので（未公表の観察）、反応性に相関する唯一 のものではない。それゆえ、ウィルスの複製容量以外の要因が外傷の形成に帰す ると言えそうである。ＮＹＶＡＣ中の遺伝子の欠損は、外傷の発生を妨げる。

これとともに、この実施例と、実施例２４を含む前述した実施例の結果は、ＷＲ ，および以前に用いたワクシニアウィルスワクチン菌株、ＷＹＥＴＨとコペンハ ーゲンに対するＮＹＶＡＣの高度に弱毒化された性質を示す。実際、検定した動 物モデル系における、ＮＹＶＡＣの病原プロファイルは、アビアン種のみにおい て生産的複製をすることが知られているポックスウィルス、ＡＬＶＡＣのプロフ ァイルと同様であった。ヒトおよび、ネズミ、ブタ、イヌおよびウマを含む他の 種から誘導した細胞上で生産的に複製するＮＹＶＡＣの明確に制限された容量に より、ワクチン未接種接触または一般的な環境への潜在的な伝染を制限または妨 げる重要なバリアを提供し、加えて、ワクチン接種した個体内の減少した繁殖の 可能性を有するベクターを提供する。

特に、ＮＹＶＡＣベースのワクチン候補は、有効であることが分かった。多くの 病原から異種遺伝子産生物を発現するＮＹＶＡＣ組換え体は、霊長類を含むいく つかの動物種中の異種遺伝子産生物に対する免疫学的応答を誘発した。

特に、狂犬病糖タンパク質を発現するＮＹＶＡＣベースの組換え体は、致死量狂 犬病抗原投与に対してネズミを防御することができた。ＮＹＶＡＣベースの狂犬 病糖タンパク質組換え体の効力は、ｔｋ座に狂犬病糖タンパク質を過含有するコ ペンハーゲンベースの組換え体のＰＤ、。値に匹敵した（表５７）。ＮＹＶＡＣ ベースの組換え体はまた、ウサギの麻疹ウィルス中和抗体およびブタの仮性狂犬 病ウィルスと日本脳炎ウィルス抗原投与に対する防御を誘発することが示された 。高度に弱毒化されたＮＹＶＡＣ菌株には、ヒトと獣医用途について安全性の利 点がある（タータグリアら、１９９０）。さらに、一般的な研究所発現ベクター 系としてのＮＹＶＡＣの使用は、ワクシニアウィルスのしように関する生物学的 危険を著しく減少する。

以下の基準により、この実施例および実施例２４を含む、前述した実施例の結果 により、ＮＹＶＡＣが高度に弱毒化されていることが分かる：ａ）接種部位に硬 結または潰瘍が検出不可能（ウサギの皮膚）；ｂ）接種の皮肉部位からの感染ウ ィルスの急速な除去（ウサギの皮膚）−Ｃ）精巣炎症がない（ヌードネズミ）； ｄ）著しく低減した毒性（頭蓋内抗原投与、生後３週間と新生ネズミの両者）； ｅ）著しく提言した病原性および免疫不全対象で伝染しないこと（ヌードおよび シクロホスファミド処理したネズミ）；およびｆ）著しく低減した様々なヒト組 織培養細胞上の複製能力。それでも、高度に弱毒化されているにもかかわらず、 ベクターとしてのＮＹＶＡＣは、外因抗原に対して強い免疫応答を誘発する能力 を保持している。

」し−」１ アビアンまたはヒト誘ｌＩｍ胞系におけるコペンＩ−−アン（ＶＣ−２＞。

ａ同−細胞系の７２時間後のＶＡＣ−２の産生百分率として示した感染から７２ 時間後のにＹＶＡＣの産生ｂ＋ｍ　当たりのＬｏｏ　”　ｐ　ｒ　ｕとして示し た力価ｅ＋１８Ｌｑを４０μ（／ｍｌのントシンアラビノノドの存在下でインキ ニ参ＡＴＣＣ’ＣＣＬ２５ヒト羊鱗細胞 表　５４ ウサギの皮膚の皮肉接種部位での硬結および潰瘍ａある部位の陵内接種したＱ、 １ｍｌのＰＯ３中の表示したワクシニアウィルスのｐｆｕ ｂ外傷の平均最大サイズ（ａｓ２） Ｃ外傷が完全に治療する接種後の平均時間ｄ外傷が認められない 表　５５ 陵内接種の部位でのポックスウィルスの持続性季」 ａ：ｌｏｇ　＋ｏｐｆυで表した 表　５Ｂ 免疫無防備状態ネズミの毒性研究 ａ：腹腔内経路からの、表示したワクシニアウィルスおよびＡＬＶＡＣによるヌ ードまたはシクロホスファミド処理ネズミの計算した５０％致死量（ｐｆｕ）。

ｂ：　５　ｘ　１０”　ｐｆｕの最高投与量で１０匹のうち５匹のネズミが死亡 した。

ａ：生後４から６週間のネズミに、２．０−８．ＱＩＯｇｘｏ組識培養感染投与 量５０％（ＴＣＩＤｓｏ）の希釈範囲のＶＶ−ＲＧ　（キーニーら、１９８４） 、ＡＬＶＡＣ−ＲＧ（ｖｃＰ６５）またはＮＹＶＡＣ−ＲＧ（ｖＰ８７９）のい ずれか５０−１００μｌを、フットバットで接種した。１４日ＩＤ、頭蓋内接種 により、ネズミ当たり１５致死量５０％（ＬＤ５゜）に対応する生ＣＶＳ菌株狂 犬病ウィルス３０μｌを各群のネズミに抗原投与した。２８日日目、生存したネ ズミを数え、防御投与量５０％（ＰＤｓｏ）を計算した。

それゆえ、本発明の好ましい実施態様を詳細に記載したが、添付した請求の範囲 により定義された本発明は、多くの様々な変更が本発明の意図と範囲から逸脱す ることなく可能であるので、上記記載に述べた特定の詳細に限定されるものでは ないことが理解されよう。

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１４０、　５３４−５４０　（１９７９）。

フＯ，Ｄ＠、Ｂ、に、、Ｍ、％４．　Ｓｈａｗ、Ｐ、Ａ、Ｒｏｔａ、Ｍ、Ｗ、Ｈ ａｒ！ｌｌ０ｎ＋　Ｊ−Ｊ。

Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、　Ｒ，Ｒｏｔｔ、　Ｎ、Ｊ、　Ｃｏｘ　ａｎｄ　Ａ、Ｐ、　 Ｋａｎｄａｌ、　Ｖａｃｃｉｎｅ　６゜２５７−２６１　（１９Ｂ＋ｉ＋１゜ ７１、Ｄｅｌｐａｙｒｏｕｘ、Ｆ、、　Ｎ、　Ｐ＊１ｌｌｏｎ、　Ｂ、　Ｂｌｏ ｎｄｅｌ、　Ｒ，Ｃｒａｉｎｉｃ　ａｎｄＲ，Ｅ、　Ｓｔｒ＠ａｃｋ、　Ｊ、　 Ｖｉｒｏｌ、、　６２．１１１３６−１８３９　（１９８８１゜〕２．　ＤａＮ ｏｒｏｎｈａ、Ｆ、、５ｃｈａｆ＠ｒ、％４．．　ａｎｄ　Ｅｓｍｅｘ、Ｍ、、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８５゜６１７−６２１　（１９７８１゜ ７４、　Ｄｉａｌｌｏ、Ａ、、Ｖａｔ、Ｍｉｃｒｏ、２コ、１５５−１６３　（ １９９０１゜１０３、　Ｇａｒｔ＊ｎ、　Ｗ、、　Ｋｏｈａｍａ、　Ｔ、、　ａ ｎｄ　Ｈ−Ｄ、　Ｋｌｅｎｋ、　Ｊ、　Ｇｉｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

５１．２０７−２１１　（１９８０）。

１２０、　Ｇｕｏ、Ｐ、、　Ｇｏ＠ｂ＠Ｌ、　Ｓ、、Ｐａｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、 、　ＴａｙＬｏｒ、　Ｊ、、　Ｎ０ｒｔＯｎ。

Ｅ、、Ａｌｌ＠ｎ、Ｇ、、Ｌａｎｇｕｅｔ、Ｂ、、Ｄｅｓｍａｔｔｒｅ、Ｐ、、 ａｎｄＰａｏＬ＠ｔｔｉ、Ｅ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４．２３９９−２４ ０６　（１９９０）。

１２１、　ｃｕｏ、　ｐ、、　Ｇｏ＊ｂａｌ、　５．、　Ｄａｖｉｓ、　Ｓ、、 　Ｐｅｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、、　Ｌａｎｇｕａｔ。

Ｂ、、Ｄ＊ｓａ＋＠ｔｔｒ＊、Ｐ、、Ａ１１ｅｎ、Ｇ、、ａｎｄ　Ｐａｏｌａセ ｔｉ、Ｅ、、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、６コ、４１８９−４１９８　（１９８９１゜１２２、　Ｇｕｏ、　 Ｈ−Ｇ、、　ｄｉＭａｒｚｏ　Ｖ＊ｒｏｎ＊ｓ＠、Ｆ、、　Ｔｓｃｈａｃｈｌａ ｒ、Ｅ、、　Ｐａｌ。

Ｒ，、Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、Ｖ、Ｓ、、Ｇａ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，、ａｎｄ　 Ｒｅ１ｔｚ、Ｊｒ、。

Ｍ、Ｓ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７４，２１７−２２４　（１９９０１゜１２３ 、Ｇｕｐｔａ、Ｒ，に、、Ｍ釉ｒａ、Ｃ，Ｎ、ｒ　Ｇｕｐｔａ、Ｖ、に、、ａｎ ｄ　５ａｘａｎａ。

Ｓ、Ｎ、、ＶａＣＣｉｎｓｔ　９．　８６５−８６７　（１９９１１゜１２４、 Ｇｕｒｇｏ、Ｃ，、Ｇｕｏ、Ｈ，−Ｇ、、Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ、Ｇ、、Ａｌｄｏ ｖｉｎｉ、Ａ、。

Ｃｏ１１ａｌｔｉ、Ｅ、、ＦａｒｒｅｌＬ、に、、Ｗｏｎｑ−５ｔａａｌ、Ｆ、 、ＧａＬＬｏ、Ｒ，Ｃ，。

ａｎｄ　Ｒ＠ｉｔｚ、Ｍ、Ｓ、、Ｊｒ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６４，５３１　 （１９８８）。

０ｔａｋｅ　Ｓ、、Ｊ、Ｖａｔ、Ｍａｄ、Ｓｃｉ、、２７．　コ）ｌ−：ｌ）４ 　（ｉｎ　Ｊａｏａｎａｓｅ１３６、Ｈｏｍｍａ、Ｍ、、ａｎｄ　Ｍ、０ｈｕｃ ｈｉ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、１２．　１４５７−１４６５（１９〕］）。

１コア、Ｆｌｏｓｈｉｋａｗａ、Ｎ、、Ｋｏｊｉｍａ、Ａ、、Ｙａｓｕｄａ、Ａ 、、Ｔａｋａｙａｓｈｉｋｉ、Ｅ、。

Ｍａｓｕｋｏ、　Ｓ、、　Ｃｈｉｂａ、　Ｊ、、　５ａｔａ、　Ｔ、、　ａｎｄ 　Ｋｕｒａｔａ、　Ｔ、、　Ｊ。

ｃａｎ、　ｖｉｒｏｌ、７２．　２５０９−２５１７　＋１９９１１゜１コ９． 　Ｈｒｕｂｙ、Ｄ、Ｅ、、Ｒ，Ａ、Ｍａｋｉ、Ｄ、Ｂ、Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　 Ｌ、Ａ、Ｂａ１ｌ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ５Ａ８０．　コ４１１−３４１５　 （１９８コ）。

１４０、Ｈｒｕｂｙ、Ｄ、Ｅ、ａｎｄ　Ｌ、Ａ、Ｂａ１ｌ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４ ３，４０３−４０９（１９Ｂ２）。

１４１、Ｈｕ、ｓ、−Ｌ、、Ｋｏｓｏｗｓｋｉ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｄａｌｒｙｍｐ ｌｅ、Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ　コ２０゜５３５−５３７．（１９８６１゜ １４２、　Ｈｕ、　５．−Ｉ；、　Ｔｒａｖｉｓ、　Ｂ、Ｍ、、　Ｇａｒｒｉｇ ｕａ＊、　Ｊ、、　Ｚａｒｌｉｎｇ、　Ｊ、Ｍ、。

５ｒｉｄｈａｒ、Ｐ、、Ｄｙｋｅｒｓ、丁、、Ｅｉｃｈｂ＠ｒｑ、Ｊ、％４．． ａｎｄ　Ａｌｐｅｒｓ、Ｃ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７９．　３２１−３２９　（１９９０１゜１４４、Ｈｕ　 Ｓ、Ｌ、、Ｋｏｓｏｗｓｋｉ　Ｓ、Ｇ、ｌ　Ｄａｌｌｙｒｍｐｌａ　Ｊ、Ｍ、、 Ｎａｔｕｒｅ　コ２０゜５３７−５４０　（１９８６１゜ １４７、Ｈｕｎｔ、Ｌ、Ａ、、Ｄ、％４．．Ｂｒｏｗｎ、）１．Ｌ、Ｒｏｂｉｎ ｓｏｎ、Ｃ，％４．Ｈａ＠Ｖ＠、ａｎｄＲ，Ｇ、Ｗｓｂｓｔ＠ｒ、Ｊ、Ｖｉｒｏ ｌ、６２．３０１４−３０１９　（１９８８）。

１４Ｂ、Ｉｃｈｉｈａｓｈｉ、Ｙ、ａｎｄ　Ｄａｉｅｓ、Ｓ、、Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　４６．　５コ３−５４３（１９）１）。

１６９、　）［ａｗｓＯｋ＊−Ｖ−ｐａａｎ−Ｗ−Ｔ−ＷａｈｅｆｍＷ　Ｄ　ｆ ｆ　ｌＩ＋＋＋１＋＋＋＋　Ｎｔｎｗｉｔｈ　Ｅｎｇｌｉｓｈ　Ｓｕ＋ｎｔｎａ ｒ”／ｌ　（１９７４１゜１５〕、工ｔｏｈ、Ｙ、、Ｅ、Ｔａｋａｉ、Ｈ，Ｏｈ ｎｕｍａ、に、Ｘｉｔａｊｉｍａ、Ｆ、Ｔｓｕｄａ。

Ａ、Ｍａｃｈｉｄａ、Ｓ、Ｍｉｓｈｉｒｏ、Ｔ、Ｎａｋａｍｕｒａ、’／、Ｍｉ ｙａｋａｗａ　ａｎｄ　Ｍ。

Ｍａｖｕｍｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、ｈｃａｄ−＜ｒｉ　冨ＩＱΔ　ロ１　０Ｍ −６＋ｊＤ２８コー２９２　（１９８９）。

１７０、Ｒ＠ａｇａｎ、）Ｃ，ａｎｄ　Ｃｏ１１ｅｔｔ、Ｍ、Ｓ、、Ｊ、Ｖｉｒ ｏｌｏｑｙ　５Ｂ、２６３”２う〇（１９８６１゜ １８６、Ｋｏｎｎｏ　Ｊ、、Ｅｎｄｏ　Ｋ、ｒ　八ｑａｔｓｕｍａ　Ｈ，、ａｎ ｄ　ｌ５ｈｉｄａ　Ｎ、Ｃｙｃｌｉｃ。

Ａｍ、　Ｊ、　Ｅｐｉｄａ＋ｎ１ｏ１．８４．２９２−）００　（１９６６）。

２０７、　Ｌａｐｒｅｖｏｔｔ＊、　！、、　Ｒａｍｐｓ、　Ａ、、　５）Ｉｅ ｒｒ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｇａ１ｉｖ＊ｒｔ、　Ｆ、。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５０．８８４−８９４　（１９８４１゜２０９、　Ｌｕｋ ａｃｓ、　Ｎ、、　Ｔｈａｉｌ、　Ｈ，、−３，、Ｍ＠ｔｔ＊ｎｌ＠１ｔａｒ、 　Ｔ、Ｃ，、ａｎｄＲｚｉｈａ、Ｈ，、−Ｊ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、５コ、１６６ −４７２　（１９８５）。

２１０、　Ｌｕｔｚ、　Ｈ，、Ｐｅｄ＊ｒｓ＠ｎ、　Ｎ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｈｉｇ ｇ＊ｎｓ、　Ｊ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｓ。

４０．３６４２−３６５１　（１９８０）。

２１Ｌ　Ｍａｃｆａｒｌａｎ、　Ｒ，工、、　Ｂ、　Ｄｉ＊ｔｚｓｅｈｏＬｄ、 　ａｎｄ　Ｈ，Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ、　、ｙ。

Ｍｏｌ　工ｍｍｕｎｏ１．　２コ、　フ３コーフ４１　（１９１１６１゜２１２ 、　Ｍａｃｋｅｔｔ　Ｍ、、　Ｓｍ１ｔｈ　Ｇ、Ｌ、、　Ｍｏ５ｓ　Ｂ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

７９、　）４１５−７４１９　（１９８２）。

２１コ、Ｍａｋｏｆｆ、＾、Ｓ、、Ｂａ１ｌａｎｔｉｎｅ、Ｓ、Ｐ、、Ｓｍａｌ ｌｖｏｏｄ、Ａ、！、、ａｎｄＦａｉｒｗａａｔｈ＠ｒ、　Ｎ、Ｆ、　Ｂ工ｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　７．１０４３−１０４６　（１９５１９）。

２１フ、Ｍａｒｓｓｄ＊ｎ、Ｈ，、Ｓｔｏｗ、Ｎ、、Ｐｒ＠５ｔｏｎ、Ｖ、、Ｔ ｉｍｂｕｒｙ、Ｍ、ａｎｄｗｉｌｋｉ＊、　Ｎ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２８ ．　６２４−６４２　（１９７８１゜２２１　Ｍａｓｏｎ、Ｐ、Ｗ、、ＭｃＡｄ ａ、Ｐ、Ｗ、、Ｍａｓｏｎ、Ｔ、Ｌ、、ａｎｄ　Ｆｏｕｒｎｉｅｒ。

Ｍ、Ｊ、、Ｖｉｒｏｌ、１６１，２６２−２６７　（１９８７ｂｌ。

２４１、　Ｍｉｌｉｃｈ、Ｄ、Ｒ，、Ａ、　ＭｃＬａｃｈｌａｎ、　Ａ、　Ｍｏ ｒｉａｒｔｙ　ａｎｄ　Ｇ、Ｂ。

Ｔｈｏｒｎｔｏｎ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、０８．　４４５７−４４６５　（１９ ８７ａｌ。

２５８、Ｎ５ｕｒａｔｈ、＾、Ｒ，Ｓ、Ｂ、Ｈ，Ｋａｎｔ、Ｎ、Ｓセｒｉｃｋ　 ａｎｄ　Ｋ、Ｐａｒｋａｒ。

Ｃｅ１ｌ　４ａ、＜２９−４３６　（１９８６）。

２７７、　Ｐａｃｈｌ、Ｃ，、Ｗ、Ｓ、Ｐｒｏｂｅｒｔ、Ｋ、Ｍ、　Ｈｅｒｍｓ ａｎ、Ｆ、Ｒ，Ｍａｓｉａｒｚ、Ｌ。

Ｒａｓ＋＋＋ｕｓｓａｎ、　Ｔ、Ｃ，Ｍｅｒｉｇａｎ、　ａｎｄ　Ｒ，Ｒ，Ｓｐ ａ＠ｔｅ、　Ｖｉｒｏｌｐｇｙ　１６９゜４１８−４２６　（１９８９１゜ ２７Ｂ、Ｐａ５ｚ、Ｅ、、Ｓ、Ｄａｌｌｏ　ａｎｄ　Ｍ、Ｅｓｔ＠ｂａｎ、Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、υＳＡ　８２．　３コロ５−３３６９　（１９８５１゜２〕９．　Ｐａ ｌｕｍｂｏ、Ｇ、Ｊ、、Ｄ、Ｊ、Ｐｉｃｋｕｐ、Ｔ、Ｎ、Ｆｒａｄｒｉｃｋｓｏ ｎ、ＬＪ。

Ｍｃｌｎｔｙｒｅ　ａｎｄ　Ｒ，Ｍ、Ｌ、、Ｂｕｌｌｅｒ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　 １７２．　２６２−２７３（１９８９）。

２８０、　Ｐａｌｕｍｂｏ、　Ｇ、Ｊ、、Ｐｉｃｋｕｐ、　Ｄ、Ｊ、、Ｆｒ１ａ ｄｒｉｃｋｓｏｎ、　Ｔ、Ｎ、。

Ｍｃｉｎｔｙｒｅ、Ｌ、Ｊ、、ａｎｄ　Ｂｕｌｌｅｒ、Ｒ，Ｍ、Ｌ、、Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ　１７２．　２６２−２７３　（１９８９１。

２１１１、Ｐａｎｄｓ、Ｈ，、に、Ｃａｍｐｏ、Ｂ、ｔａｎａｍｕｅｈｉ、ａｎ ｄ　Ｊ、Ａ、Ｚａｉａ。

Ｖｉｒｏｌｏｑｙ　１８２．２２０−２２８　（１９９１１゜２８３、　Ｐａｎ １ｃａｌｉ、　Ｄ、、　Ｇｒｅｚｌａｃｋｉ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ、 　Ｃ，、Ｇａｎｅ４７゜１９３−１９９　（１９８６１＋ ２ｇ４．Ｐａｎ１ｃａｌｉ、Ｄ、、Ｄａｖｉｓ、Ｓ、Ｗ、、Ｍ＠ｒｅｅｒ、Ｓ、 Ｒ，、ａｎｄ　Ｐａｏｌ＠ｔｔｉ。

Ｅ、、：ｓ、Ｖｉｒｏｌ、コア、１０００−１０１０　（１９８１）。

２８５、Ｐａｏｌｓｔｔｉ、Ｅ、、Ｂ、Ｌｉｐｉｎｓｋａｓ、Ｃ，Ｓａｍｓｏｎ ｏｆｆ、Ｓ、Ｍｅｒｃａｒ　ａｎｄＤ、Ｐａｎ１ｃａｌｉ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ 、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　８１，１９３−１９７（１９８４）。

２８６、Ｐａｒｋａｒ、Ｒ，Ｆ、、Ｂｒｏｎｓｏｎ、Ｌ、Ｈ，、ａｎｄ　Ｇｒａ ｅｎ、Ｒ，Ｈ，、Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍａｄ、７４，２６：ｌ−２８１（１９４１）。

２Ｊ７．Ｐａｒｒｉｓｈ、Ｃ，Ｒ，、Ａｑｕａｄｒｏ、Ｃ，Ｆ、、ａｎｄ　Ｃａ ｒｍｉｃｈａｅｌ、Ｌ、Ｅ、。

Ｖｌｒｏｌｏｇｙ　１６６．２９３−３０７　（１９ｓ８）。

２Ｅｌ１１．Ｐａｒｒｉｓｈ、Ｃ，Ｒ，、Ａｑｕａｄｒｏ、（：、Ｆ、、５ｔｒ ａｓｓｈ＊ｉｍ、Ｍ、Ｌ、。

Ｅｖａｒｍａｎｎ、Ｊ、Ｆ、、Ｓｇｒｏ、Ｊ−Ｙ、、ａｎｄ　Ｍｏｈａｍｍｅｄ 、Ｈ，Ｏ，、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６５，６５４４−６５５２゜２８９、Ｐａｒｒｉｓｈ、Ｃ， Ｒ，、Ａｄｖ、Ｖｉｒｕｓ　Ｒａｓ、３８，４０３−４５０　（：Ｌ９９Ｑｌ。

２９０、Ｐａｔ＠ｌ、０．０−、Ｒａｙ、Ｃ，Ａ、、Ｄｒｕｃｋｅｒ、Ｒ，Ｐ、 、ａｎｄ　Ｐｉｃｋｕｐ。

Ｄ、Ｊ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　Ｂ５．　９４コ １−９４コＳ　（１９ＢＢ）。

２９１、Ｐａｔｅｌ、ｏ、ｏ、ａｎｄ　Ｐｉｃｋｕｐ、Ｄ、、７．、ＥＭＢＯ６ ，３７Ｂ７−３７９４　（１９Ｂ７１゜２９４、Ｐｓｒｋｕｓ　Ｍ、Ｅ、、Ｐｉ ｃｃｉｎｉ　Ａ、、Ｌｉｐｉｎｓｋａｓ　Ｂ、Ｒ，、ａｔ　ａｌ、。

Ｓｃｉ＠ｎｃ＠２２９，９８１−９８４　（１９８５１゜２９５、Ｐａｒｋｕ（ Ｍ、Ｅ、、　Ｌｉｌ１ｂａｃｈ、　Ｋ、、ａｎｄ　Ｐａａｌａｔｔｉ、Ｅ、、　 Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

６３、３８２９−コ８コロ　（１９８９１゜２９６、Ｐａｒｋｕｓ、Ｍ、Ｅ、、 Ｄ、Ｐａｎ１ｃａｌｉ、Ｓ、Ｍ＠ｒｃａｒ　ａｎｄ　Ｅ、Ｐａｏｌａｔｔｉ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ工５２，２８５−２９７　（１９８６）。

２９７、ｐａｒｋｕｇ、Ｍ、Ｅ、、Ｓ、Ｊ、Ｇａｍｂｏｌ、Ｓ、Ｗ、ＤａＶｉ！ 、Ｇ、Ｐ、Ｊｏｈｎｓｏｎ。

Ｅ、に、　Ｎｏｒｔｏｎ　ａｎｄ　Ｅ、　Ｐａａｌａｔｔｉ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙニー０．４０６−４１０（１９９１）。

２９Ｂ、　Ｐａｒｋｕｓ、　Ｍ、Ｅ、、　Ｇｏ＠１ｍｌ、　Ｓ、Ｊ、、　Ｄａｖ ｉｓ、　Ｓ、貿、、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｇ、Ｐ、。

Ｌｉｎｋｌａｃｈ、　ＩＣ，、Ｎｏｒｔｏｎ、　Ｅ、に、、　ａｎｄ　Ｐａｏｌ ａｔｔｉ、　！、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙエフ＊、２７６−２８６　（１９９０） −２９９、Ｐａｔｒｏｖｓｋｉｓ、Ｅ、Ａ、、τ１ｍ１ｎｓ、Ｊ、Ｇ、、Ａｒｍ ａｎｔｒｏｕｔ、Ｍ、入、。

Ｍａｒｃｈｉｏｌｉ、Ｃ０Ｃ，、Ｙａｎｃｅｙ、Ｊｒ、、Ｒ，Ｊ、、Ｐｏ５ｔ、 Ｌ、Ｅ、、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、５９，２１６−２２３　（１９８６ｂ）。

コ００．　Ｐａｔｒｏｖｓｋｉｓ、Ｅ、入、、Ｊ、Ｇ、Ｔｉｍ１ｎｓ、ａｎｄ　 Ｌ、Ｅ、ｆ’ｏｓｔ、Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、ｇｏ、１８５−１９３　（１９８６ａ）。

コ０１．　Ｐｉｃｃｉｎｉ、＾、、Ｎ、！、Ｐ＠ｒｋｕｓ、ａｎｄ　Σ、Ｐａａ ｌａｔｔｉ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎｗｎｚｙｍｏｌｏｑｙ　１％３．　５４５− ５６３　（１９８））。

コ０２．　Ｐｉｃｋｕｐ、Ｄ、、７．、Ｂ、Ｓ、工ｎｋ、Ｂ、Ｌ、Ｐａｒｓｏｎ ｓ、Ｗ、Ｍｕ　ａｎｄ　ＷすＫ。

Ｊｏｋｌｉｋ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ＋　入ｃａｄ、Ｓｃｉ、υｓＡ　ｇ工、６８ １７−６８２１（１９８４）。

３０３、Ｐｉｃｋｕｐ、Ｄ、Ｊ、、ＢＪ、Ｘｎｋ、Ｌ　Ｍｕ、Ｃ，入、Ｒａｙ　 ａｎｄ　Ｗ、Ｋ。

Ｊｏｋｌｉｋ、！’ｒｏｅ、Ｎａｔｌ＋　入ｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔＪｓ入−３，１ ６９＠−７７０２（ｚｓｓｇ）。

３０５、　Ｐｌｏｔｋｉｎ、　Ｂ、＾＋、　Ｓ、Ｅ、　５ｔａｒｒ、　Ｈ，Ｍ、 　Ｆｒ１−山ａａｎ、　Ｅ、　Ｇｏｎｃｚｏｌ。

ａｎｄ　Ｒ＋Ｅ、賢ａｉｂ＊ｌ、Ｊ、Ｘｎｔ、Ｄｉｍ、工！ｉｌ、１１６０−１ ６５　（１９ａ９ｂｌ。

３１３、　Ｒａｓｍｕｓｓｓｎ、　Ｌ、、　Ｍ、　Ｎｅ１ｓｏｎ、　Ｍ、　Ｎｅ ｆｆ、　ａｎｄ　Ｔ、Ｃ，Ｍａｒｉｇａｎ。

Ｊｒ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６：ｌ、３０８−３１８　（１９１１８１゜３１ ６、　Ｒｅａ、　Ｔ、Ｊ、、　Ｊ、Ｇ、　Ｔｉｍｍ１ｎｓ、　ｃ、％４．　Ｌｏ ｎｇ、　ａｎｄ　Ｌ、Ｅ、　Ｐｏ５ｔ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、５４．２１−２９　（１９１＋５１゜３１７、Ｒｅｅｄ、Ｌ、Ｊ、 ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈ、Ｈ，、Ａｍ、Ｊ、Ｈｙｇ、２７，４９３−４９７（１９ ：ＩＩＩト ３２０、　Ｒｌｃｅ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｌ＠ｎＣｈ＠ｍ、　Ｅ、　Ｍ、、　Ｅｄｄ ｙ、　ｓ、　Ｒ，、５ｈｉｎ、　ｓ、　Ｊ、。

Ｓｈ＠ｅｔｓ、　Ｒ，Ｌ、、　ａｎｄ　５ｔｒａｕｓｓ、　Ｊ、　Ｈ，、Ｓｅλ ａｎｃａ　２２９．　７２６−７３３（１９８５１゜ ３２２、　Ｒｌｃｆｉａｒｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｄ、、　Ａ、　Ｂｅｒｋｏｖｉｃｆ ｉ＋　Ｓ、　Ｒｏｚｅｎｂｌａｔｔ、　ａｎｄ％ｉ。

Ｂ＠１ｌｉｎｉ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、ｓａ、１８６−１９：Ｉ　（１９８５）。

コ２６．　Ｈ□ｂｂｉｎｓ、＾、に、、　賀ａｔｓｏｎ、Ｒ，Ｊ、、Ｗｈａａｌ ｙ、Ｍ、Ａ、、Ｈａｒｐ、Ｗ、Ｗ、。

ａｎｄ　Ｅｎｑｕｉｓセ、Ｌ、Ｗ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６０．　４３６−４４９ 　（１９１１６ｂｌ　−コ４コ、Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、Ｎ１ｃｋａｌｎ、Ｓ、Ｃ ｏｕｌｓｏｎ、Ａ、Ｒ，、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、７４．　５４６コー５４６７　（１９〕７）。

３４４、Ｓａｒｍａ、Ｐ、Ｓ、、ａｎｄ　Ｌｏｇ、Ｔ、、Ｖｉｒｏｌｏｑｙ　５ ４：１６０−１６９　（１９７コ）。

３５２、　Ｓｃｈｍａｌｊｏｈｎ、　Ｃ，Ｓ、、　Ｊ＠ｎｎｉｎｇｓ、　Ｇ、Ｂ 、、　Ｍａｙ、　Ｊ、、　Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ。

Ｊ、Ｍ、、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５５．　６３３−６４３　（１９８６１。

３６５．５ｈｉｄａ、Ｈ，、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５０，４５１−４６２　（１ ９８６）。

３フ８．　５ｐｅｈｎｅｒ、Ｄ、、Ｒ，Ｄｒｉｌｌｉｅｎ、ａｎｄ　Ｊ、Ｐ、Ｌ ａｃｏｃｑ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

６４．５２７−５３３　（１９９０１゜３８２、５ｔａｒｃｉｃｈ　ａｔ　ａｌ 、、　Ｃａ１ｌ　４５．６３７−６４８　（１９８６１゜３Ｂ３．　５ｔｅｖｅ ｌｙ、Ｗ、Ｓ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２２．　２３２−２３４　４１９７〕）。

３８７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｍ、、ＪＫ、Ｍ＠ｄ、Ｅｎｔｏｍｏｌ、１コ、２ ７５−２８４　（１９７６）。

４０１、Ｔｏｍｌａｙ、Ｆ、、Ｖａｃｃｉｎ＠９．４−５　（１９９１）。

４４９．　Ｗａｔｓｏｎ、Ｒ，、Ｇ＠ｎｇ　２６．　コ０フー３１２　（１９８ ３１゜４２５、Ｗ＠ｉｒ、Ｊ、Ｐ、ａｎｄ　ａ、Ｍｏ５ｓ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４ ６．　５３０−５３７　（１９８３１゜４コＯ，ＷＨＯＭ＠ｔｉｎｇ、Ｇｅｎ＠ ｖａ、Ｊｕｎｅ　１９−２２．　Ｖａｃｃｉｎ＠　Ｂ、４２５−４３７（１９９ ０１。

４３５、Ｗｉｋｔｏｒ、Ｔ、Ｊ、、Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、５ｔａｎｄ　４０．　２ ５５−２６４　（１９フ７）。

４４４、　Ｙａｍａｇｉｓｈｉ　Ａ、、　Ｊ、　Ｖｎｔ、　Ｍａｄ、　８２０． １４−１８　（１９８９）。

４４７、　Ｙ＠１ｖｅｒｔｏｎ、Ｅ、、　Ｓ、　Ｎｏｒｔｏｎ、　Ｊ、Ｆ、　０ ｂｉｊｅｓｋｉ　ａｎｄ　Ｄ、Ｖ、　−Ｇｏｅｄｄｃｌ、５ｃｉｅｎｃｅ　２１ ９，６１４−６２０　（１９８）１ＦＩＧ、　９Ｂ ＦＩＧ、ｌｌＢ ＴＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴ ＣＴＣＡＡＡＴＧＡＧＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＡＡＴＡＦＩＧ、　１３Ａ ＦＩＧ、　１３Ｂ 日Ｇ、１５Ａ ＦＩＧ、　１５Ｂ ＦＩＧ、　２１ ＦＩＧ、　２２ ＦＩＧ、　２５ ＦＩＧ、　２６ ＦＩＧ、　２８ ＦＩＧ、　３０ ＦＩＧ、　３１ ヒー〇−１′ｌＩ刈逢 ＦＩＧ、　３２ ＨＩＶＶ３　Ａ”−）”す’ｌｉ” ＦＩＧ、　３３ −ｅ−ＡＬＶＡＣ／ＮＹＶＡＣ −）−ｖＰ９１１ 一◆−ｖＣＰ　ｌ　１２ ＦＩＧ、３４ Ｂ考良 ＦＩＧ、３５Ａ ＦｊＧ、３５Ｃ ｌ３ｉｔ ＦＩＧ、３５８ Ｂ者灯 ＦＩＧ、３５Ｄ 状層、桜１１＃１日１（ ＦＩＧ、３８４ ＦＩＧ、３８８ ｊｔｔＪＪｔ”＋　’＃Ｌ　＃Ｉａ　ｗＬＦＩＧ、　３８Ｃ 状原壌信′Ｌ鴫β朝〔 ＦＩＧ、３８Ｄ 国際調査報告 ＩＬＩＩ＠ＩＩＩａＩＩＯｎＪ１＾１１１１１ｉｃａ＋１ｅＩＩＮｏ、ＰＣ？／ ぴｓ９２／コ１９す６ｌｍ鯉間−〜窄−・ＩＩ開Ｈ・イル３１調１飢圃フロント ページの続き （５１）Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／３４ （３１）優先権主張番号　８４７，９５１（３２）優先臼　１９９２年３月６日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ’）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、Ｃ Ｈ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＪＰ、ＫＲ （７２）発明者　パーカス、マリオン　イーアメリカ合衆国　ニューヨーク州　 １２００９オルタモント　ウェスタン　ターンパイク　４９７１　アールディー 　ナンバー２　ボックス　２６７エイ （７２）発明者　ティラー、ジル アメリカ合衆国　ニューヨーク州　１２２０３オルバニー　コロニアル　アヴエ ニューＩ （７２）発明者　タータグリア、ジエームズアメリカ合衆国　ニューヨーク州　 １２３０３シエネクタデイ　クリステイーナ　ドライヴ　７ （７２）発明者　ツートン、エリザベス　ケイアメリカ合衆国　ニューヨーク州 　１２１１０ラサム　サリー　ヒル　ドライブ　舛 （７２）発明者　リヴイエール、ミツシェルフランス国　エフ−６９１３０エカ リー　シュマン　ド　チャンスリー　１１ （７２）発明者　ド　テーヌ、シャルルフランス国　エフ−６９００５リヨン　 リュデュ　コマンダンーシャルコ　４８ビス（７２）発明者　リンバッハ、キー ス　ジエイアメリカ合衆国　ニューヨーク州　１２１８０トロイ　ハンプトン　 ブレイス　３２４フロントベージの続き （７２）発明者　ジョンソン、ジェラルド　ピーアメリカ合衆国　ニューヨーク 州　１２１８８ウオーターフオード　デヴイット　ロード　１００ （７２）発明者　ピンカス、スティーヴン　イーアメリカ合衆国　ニューヨーク 州　１２０６１イースト　グリーンブツシュ　トロイ ロード　７８ （７２）発明者　コックス、ウィリアム　アイアメリカ合衆国　ニューヨーク州 　１２１８０トロイ　ワシントン　ブレイス　１ （７２）発明者　フランシス、ジャンークリストフアメリカ合衆国　ニューヨー ク州　１２２０２オルバニー　アパートメント　ナンバー６　ウォーレン　スト リート５９６ （７２）発明者　ゲティング、ラッセル　ロパートアメリカ合衆国　ニューヨー ク州　１２０１８エイヴリル　パーク　ボックス　４２１シー　アールディー　 ２

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. １．変更組換えウイルスであって、該ウイルスが弱毒化された毒性を有するよう に不活化された毒性に関連したウイルスコード化遺伝機能を有することを特徴と するウイルス。
2. ２．前記ウイルスがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第１項 記載のウイルス。
3. ３．前記ポックスウイルスゲノムの不可欠領域中の非ポックスウイルス源からの 外因性ＤＮＡからなることを特徴とする請求の範囲第２項記載のウイルス。
4. ４．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記外因性ＤＮＡが非 ワクシニア源からのものであることを特徴とする請求の範囲第３項記載のウイル ス。
5. ５．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記遺伝機能が、毒性 因子をコードする読取り枠を欠損せしめることにより不活化されることを特徴と する請求の範囲第２項記載のウイルス。
6. ６．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルスであり、前記遺伝機能が、毒性 因子をコードする読取り枠の挿入不活化により不活化されることを特徴とする請 求の範囲第２項記載のウイルス。
7. ７．前記読取り枠が、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７ Ｌ−Ｋ１Ｌ、およびＩ４Ｌ並びにそれらの組合せからなる群より選択されること を特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。
8. ８．前記読取り枠が、Ｊ２Ｒ、Ｂ１３Ｒ＋Ｂ１４Ｒ、Ａ２６Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ｃ７ Ｌ−ＫｌＬ、およびＩ４Ｌ並びにそれらの組合せからなる群より選択されること を特徴とする請求の範囲第６項記載のウイルス。
9. ９．前記読取り枠が、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域、 血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域または巨大サブユニット、リボヌクレオチ ドレダクターゼからなることを特徴とする請求の範囲第５項記載のウイルス。
10. １０．前記読取り枠が、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型封入体領域 、血球凝集素遺伝子、宿主域遺伝子領域または巨大サブユニット、リボヌクレオ チドレダクターゼからなることを特徴とする請求の範囲第６項記載のウイルス。
11. １１．ｖＰ４１０、ｖＰ５５３、ｖＰ６１８、ｖＰ７２３、ｖＰ８０４またはｖ Ｐ８６６であることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。
12. １２．ｖＰ７９６、ｖＰ９３８、ｖＰ９５３、ｖＰ９７７またはｖＰ９５４であ ることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。
13. １３．ＮＹＶＡＣであることを特徴とする請求の範囲第１項記載のウイルス。
14. １４．前記非ワクシニア源が、狂犬病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウ イルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、仮性狂犬病ウイル ス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス 、サル免疫不全ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシ ウイルス性下痢性ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、イヌパルボウイルス、 サルインフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ハ ンターンウイルス、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、鳥類インフルエンザウイルス、おたふく かぜウイルスおよびニューカッスル病ウイルスからなる群より選択されることを 特徴とする請求の範囲第４項記載の組換えワクシニアウイルス。
15. １５．前記非ワクシニア源が、狂犬病ウイルスであり、前記組換えワクシニアウ イルスがｖＰ８７９またはｖＰ９９９であることを特徴とする請求の範囲第１４ 項記載の組換えワクシニアウイルス。
16. １６．前記非ワクシニア源がＢ型肝炎であり、前記組換えワクシニアウイルスが ｖＰ８５６、ｖＰ８９６、ｖＰ８９７、ｖＰ８５８、ｖＰ８９１、ｖＰ９３２、 ｖＰ９７５、ｖＰ９３０、ｖＰ９１９、ｖＰ９４１またはｖＰ９４４であること を特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
17. １７．前記非ワクシニア源が日本脳炎ウイルスであり、前記組換えワクシニアウ イルスが、ｖＰ５５５、ｖＰ８２５、ｖＰ９０８、ｖＰ９２３、ｖＰ８５７、ｖ Ｐ８６４またはｖＰ８２９であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組 換えワクシニアウイルス。
18. １８．前記非ワクシニア源が黄熱病ウイルスであり、前記組換えワクシニアウイ ルスがｖＰ７６６、ｖＰ７６４、ｖＰ８６９、ｖＰ７２９、ｖＰ７２５、ｖＰ９ ９７、またはｖＰ９８４であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換 えワクシニアウイルス。
19. １９．前記非ワクシニア源がデング熱ウイルスであり、前記組換えワクシニアウ イルスがｖＰ８６７、ｖＰ９６２またはｖＰ９５５であることを特徴とする請求 の範囲第１４項記載の組換えワタシニアウイルス。
20. ２０．前記非ワクシニア源が麻疹ウイルスであり、前記組換えワクシニアウイル スがｖＰ９１３またはｖＰ９９７であることを特徴とする請求の範囲第１４項記 載のウイルス。
21. ２１．前記非ワクシニア源が仮性狂犬病ウイルスであり、前記組換えワクシニア ウイルスが、ｖＰ８８１、ｖＰ８８３、ｖＰ９００、ｖＰ９１２、ｖＰ９２５、 ｖＰ９１５またはｖＰ９１６であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の 組換えワクシニアウイルス。
22. ２２．前記非ワクシニア源がエプスタインバーウイルスであり、前記組換えワク シニアウイルスがｖＰ９４１またはｖＰ９４４であることを特徴とする請求の範 囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
23. ２３．前記非ワクシニア源が単純ヘルペスウイルスであり、前記組換えワクシニ アウイルスがｖＰ９１４であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換 えワクシニアウイルス。
24. ２４．前記非ワクシニア源が、ヒト免疫不全ウイルスであり、前記組換えワクシ ニアウイルスが、ｖＰ９１１、ｖＰ９２１、ｖＰ８７８、ｖＰ９３９、ｖＰ９４ ０、ｖＰ９２０、ｖＰ９２２、ｖＰ１００８、ｖＰ１００４、ｖＰ１０２０、ｖ Ｐ１０７８、ｖＰ９９４、ｖＰ１０３６、ｖＰ１０３５、ｖＰ９６９、ｖＰ９８ ９、ｖＰ９９１、ｖＰ９９０、ｖＰ９７０、ｖＰ９７３、ｖＰ９７１、ｖＰ９７ ９、ｖＰ９７８、ｖＰ９８８、ｖＰ１００９、ｖＰ１０６２、ｖＰ１０６１、ｖ Ｐ１０６０、ｖＰ１０８４、ｖＰ１０４５、ｖＰ１０４７またはｖＰ１０４４で あることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
25. ２５．前記非ワクシニア源がサル免疫不全ウイルスであり、前記組換えワクシニ アウイルスが、ｖＰ８７３、ｖＰ９４８、ｖＰ９４３、ｖＰ９４２、ｖＰ９５２ 、ｖＰ９４８、ｖＰ１０４２、ｖＰ１０７１、ｖＰ９４３、ｖＰ９４２、ｖＰ９ ５２またはｖＰ１０５０であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換 えワクシニアウイルス。
26. ２６．前記非ワクシニア源がウマヘルペスウイルスであり、前記組換えワクシニ アウイルスがｖＰ１０４３、ｖＰ１０２５またはｖＰ９５６であることを特徴と する請求の範囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
27. ２７．前記非ワクシニア源がウシヘルペスウイルスであり、前記組換えワクシニ アウイルスがｖＰ１０５１、ｖＰ１０７４、ｖＰ１０７３、ｖＰ１０８３、ｖＰ １０８７、ｖＰ１０７９であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換 えワクシニアウイルス。
28. ２８．前記非ワクシニア源がウシウイルス性下痢性ウイルスであり、前記組換え ワタシニアウイルスがｖＰ９７２、ｖＰ１０１７またはｖＰ１０９７であること を特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
29. ２９．前記非ワクシニア源がヒトサイトメガロウイルスであり、前記組換えワク シニアウイルスがｖＰ１００１であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載 の組換えワクシニアウイルス。
30. ３０．前記非ワクシニア源がイヌパルボウイルスであり、前記組換えワクシニア ウイルスがｖＰ９９８またはｖＰ９９９であることを特徴とする請求の範囲第１ ４項記載の組換えワクシニアウイルス。
31. ３１．前記非ワクシニア源がウマインフルエンザウイルスであり、前記組換えワ クシニアウイルスがｖＰ９６１またはｖＰ１０６３であることを特徴とする請求 の範囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
32. ３２．前記非ワクシニア源がネコ白血病ウイルスであり、前記組換えワクシニア ウイルスがｖＰ１０１１であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換 えワクシニアウイルス。
33. ３３．前記非ワクシニア源がハンターンウイルスであり、前記組換えワタシエア ウイルスがｖＰ８８２、ｖＰ９５０またはｖＰ９５１であることを特徴とする請 求の範囲第１４項記載の組換えワクシニアウイルス。
34. ３４．前記非ワクシニア源がＣ．ｔｅｔａｎｉであり、前記組換えワクシニアウ イルスがｖＰ１０７５であることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組換え ワクシニアウイルス。
35. ３５．ウイルスが弱毒化された毒性を有するように不活化されたウイルスコード 化遺伝機能を有するポックスウイルスであって、該ポックスウイルスが、該ポッ クスウイルスゲノムの可欠領域中に組換えにより挿入された非ワクシニア源から の外因性ＤＮＡからなることを特徴とするポックスウイルス。
36. ３６．前記非ポックスウイルス源が、狂犬病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、日本 脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、仮性狂犬病 ウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウ イルス、サル免疫不全ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス 、ウシウイルス性下痢性ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、イヌパルボウイ ルス、サルインフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコヘルペスウイル ス、ハンターンウイルス、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ、鳥類インフルエンザウイルス、お たふくかぜウイルスおよびニューカッスル病ウイルスからなる群より選択される ことを特徴とする請求の範囲第３５項記載のポックスウイルス。
37. ３７．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源が狂犬病ウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスがｖＣＰ ６５またはｖＣＰ１３６であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポッ クスウイルス。
38. ３８．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がヒト免疫不全ウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスが ｖＣＰ９５、ｖＣＰ１１２、ｖＣＰ６０、ｖＣＰ６１、ｖＣＰ１２５、ｖＣＰ１ ２４、ｖＣＰ１２６、ｖＣＰ１４４、ｖＣＰ１２０、ｖＣＰ１３８、ｖＣＰ１１ ７、ｖＣＰ１３０、ｖＣＰ１５２、ｖＣＰ１５５、ｖＣＰ１５６、、ｖＣＰ１４ ６、ｖＣＰ１４８、ｖＣＰ１５４、ｖＣＰ１６８またはｖＣＰ１５３であること を特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイルス。
39. ３９．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、非ポックスウ イルス源がサルヘルペスウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスがｃＰ １３２であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイルス。
40. ４０．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がヒトサイトメガロウイルスであり、前記カナリヤポックスウイル スがｖＣＰ１３９であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウ イルス。
41. ４１．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がイヌパルボウイルスであり、前記カナリヤポックスイルスがｖＣ Ｐ１２３またはｖＣＰ１３６であることを特徴とするポックスウイルス。
42. ４２．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がエプスタイ、ンバーウイルスであり、前記カナリヤポックスウイ ルスがＶＣＰ１６７であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックス ウイルス。
43. ４３．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がサルインフルエンザウイルスであり、前記カナリヤポックスウイ ルスがｖＣＰ１２８またはｖＣＰ１５９であることを特徴とする請求の範囲第３ ６項記載のポックスウイルス。
44. ４４．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がネコ白血病ウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスがｖ ＣＰ１７７、ｖＣＰ８３、ｖＣＰ３５、ｖＣＰ３７、ｖＣＰ８７、ｖＣＰ９３ま たはｖＣＰ９７であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイ ルス。
45. ４５．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がネコヘルペスウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスが ｖＣＰ１６２であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイル ス。
46. ４６．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がハンターンウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスがｖ ＣＰ１１４またはｖＣＰ１１９であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載 のポックスウイルス。
47. ４７．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がＢ型肝炎ウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスがｖＣ Ｐ１６９またはｖＣＰ１５７であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載の ポックスウイルス。
48. ４８．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がＣ．ｔｅｔａｎｉであり、前記カナリヤポックスウイルスがｖＣ Ｐ１６１であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイルス。
49. ４９．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がおたふくかぜウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスが ｖＣＰ１７１であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイル ス。
50. ５０．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源が日本脳炎ウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスがｖＣ Ｐ１０７またはｖＣＰ１４０であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載の ポックスウイルス。
51. ５１．前記ポックスウイルスがカナリヤポックスウイルスであり、前記非ポック スウイルス源がサル免疫不全ウイルスであり、前記カナリヤポックスウイルスが ｖＣＰ１７２であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウイル ス。
52. ５２．前記ポックスウイルスが鶏痘ウイルスであり、前記非ポックスウイルス源 が鳥類インフルエンザウイルスであり、前記鶏痘ウイルスがｖＦＰ８９、ｖＦＰ ９２、ｖＦＰ１００またはｖＦＰ１２２であることを特徴とする請求の範囲第３ ６項記載のポックスウイルス。
53. ５３．前記ポックスウイルスが鶏痘ウイルスであり、前記非ポックスウイルス源 がヒト免疫不全ウイルスであり、前記鶏痘ウイルスがｖＦＰ６２、ｖＦＰ６３ま たはｖＦＰ１７４であることを特徴とする請求の範囲第３６項記載のポックスウ イルス。
54. ５４．前記ポックスウイルスが鶏痘ウイルスであり、前記非ポックスウイルスが 鶏痘ウイルスであり、前記非ポックスウイルス源がニューカッスル病ウイルスで あり、前記鶏痘ウイルスがｖＦＰ９６であることを特徴とする請求の範囲第３６ 項記載のポックスウイルス。
55. ５５．ｖＣＰ６５であることを特徴とする狂犬病ウイルス組換えカナリヤポック スウイルス。
56. ５６．ｖＣＰ９５、ｖＣＰ１１２、ｖＣＰ６０またはｖＣＰ６１であることを特 徴とするヒト免疫不全ウイルス組換えカナリヤポックスウイルス。
57. ５７．ｖＦＰ６２またはｖＦＰ６３であることを特徴とするヒト免疫不全ウイル ス組換え鶏痘ウイルス。
58. ５８．ｖＦＰ８９、ｖＦＰ９２、ｖＦＰ１００またはｖＦＰ１２２であることを 特徴とする鳥類インフルエンザウイルス組換え鶏痘ウイルス。
59. ５９．ワクチンを接種した宿主動物中で免疫応答を誘発するワクチンであって、 該ワクチンが請求の範囲第４項、第３５項、第５５項、第５６項および第５７項 のうちいずれか１項記載の組換えウイルスおよび担体からなることを特徴とする ワクチン。
60. ６０．ワクチンを接種したヒト中で免疫応答を誘発するワクチンであって、該ワ クチンが請求の範囲第４項、第３５項または第５５項のうちいずれか１項記載の 組換えウイルスおよび担体からなることを特徴とするワクチン。
61. ６１．生体外で培養された細胞中で遺伝子産生物を発現する方法であって、該方 法が、請求の範囲第４項記載のような変更組換えウイルスを前記細胞中に導入す ることからなることを特徴とする方法。
62. ６２．宿主中で遺伝子産生物を発現する変更ベクターであって、該ベクターが、 前記宿主中で弱毒化された毒性を有するように変更され、該変更ベクターが前記 宿主中で遺伝子産生物をコードして発現するＤＮＡからなることを特徴とする変 更ベクター。
63. ６３．前記ベクターがポックスウイルスであることを特徴とする請求の範囲第６ ２項記載のベクター。
64. ６４．前記ポックスウイルスがワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルス または鶏痘ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第６３項記載のベクター 。
65. ６５．ワクチンを接種した宿主動物中で免疫応答を誘発するワクチンであって、 該ワクチンが請求の範囲第６２項記載の変更ベクターおよび担体からなることを 特徴とするワクチン。
66. ６６．生体外で培養された細胞中で遺伝子産生物を発現する方法であって、該方 法が、請求の範囲第６２項記載のような変更ベクターを前記細胞中に導入するこ とからなることを特徴とする方法。