MX2015000789A - Composiciones de virus de la gripe bovina. - Google Patents

Abstract

Se ha aislado un virus de la gripe C de una especie bovina; también se han identificado polinucleótidos y polipéptidos del virus de la gripe C; también se describen composiciones inmunógenas, así como kits de diagnóstico y procedimientos de detección.

Description

COMPOSICIONES DE VIRUS DE LA GRIPE BOVINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente solicitud se refiere al campo de la microbiología y la inmunología, el particular a un virus y a composiciones inmunógenas que lo comprenden. Específicamente, se refiere a un virus de la gripe C aislado de un bóvido. En el presente documento tambien se divulgan polinucleótidos y polipéptidos del virus de la gripe C. Por último, se divulgan kits de diagnóstico y procedimientos de detección.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El complejo de la enfermedad respiratoria bovina (ERB) es el problema de salud más importante de la industria de la carne. En 1991, se produjeron pérdidas estimadas en 624 millones de dólares estadounidenses debidas a los costes del tratamiento, la pérdida de producción y las muertes. El complejo de la ERB es una infección multifactorial a la que contribuyen muchos patógenos, tanto víricos como bacterianos.

Las familias de virus que contienen ARN monocatenario envuelto del genoma de sentido negativo se clasifican en grupos que tienen genomas sin segmentar (paramixovirus, rabdovirus) o aquellos que tienen genomas segmentados (ortomixovirus, buniavirus y arenavirus). La familia de los ortomixovirus contiene solamente los virus de la gripe de los tipos A, B y C.

Los viriones de la gripe consisten en un núcleo interno de ribonucleoproteínas (una nucleocápside helicoidal) que contiene el genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta exterior de lipoproteínas revestida por una proteína de la matriz (M). El genoma segmentado de la gripe A consiste en ocho moléculas (siete para la gripe C) de ARN monocatenarios lineales de polaridad negativa que codifican diez polipéptidos, que incluyen: las proteínas polimerasas de ARN dirigidas al ARN (PB2, PB1 y PA) y una nucleoproteína (NP) que forman la nucleocápside: las proteínas de la matriz (M1, M2); dos glucoproteínas de superficie que proyectan desde la envoltura de lipoproteínas: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que no están presentes en el virus de la gripe C; y proteínas que no son estructurales, cuya función se desconoce (NS1 y NS2). La transcripción y la replicación del genoma se produce en el núcleo y el ensamblaje se produce por medio de brotes sobre la membrana plasmática. Los virus pueden reagrupar los genes durante infecciones mixtas.

El virus de la gripe C tiene una sola especie en su tipo, denominada "virus de la gripe C". Se han aislado virus de la gripe C de seres humanos y de cerdos. Los virus de la gripe A y B son los agentes causantes de una infección que comúnmente se denomina la "gripe", que puede producir síntomas clínicos de escalofríos, fiebre, dolor de garganta, dolores musculares, dolor de cabeza, tos, debilidad/fatiga y malestar general. La infección por el virus de la gripe C, sin embargo, es poco común en comparación con la del tipo A o B y provoca una infección leve de las vías respiratorias altas en los seres humanos o la infección no es evidente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, los solicitantes han identificado, y divulgan en el presente documento, un virus de la gripe C aislado de un bóvido. En el presente documento se divulgan y proporcionan polinucleótidos y polipeptidos de dicho virus C de la gripe bovina, así como composiciones inmunógenas que comprenden dichos polinucleótidos y/o dichos polipéptidos. También se proporcionan kits de diagnóstico y procedimientos de detección de un virus C de la gripe bovina.

En una modalidad, la divulgación proporciona un virus C de la gripe bovina aislado.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un virus de la gripe C aislado, en la que dicho virus comprende al menos uno de los siguientes segmentos génicos: un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 52 % de identidad con la SEQ ID NO: 4; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 72 % de identidad con la SEQ ID NO: 6; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 8; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 54 % de identidad con la SEQ ID NO: 10; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 40 % de identidad con la SEQ ID NO: 12; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 36 % de identidad con la SEQ ID NO: 14; y un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 33 % de identidad con la SEQ ID NO: 16.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un ácido nucleico aislado que comprende uno o más de los ácidos nucleicos: un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 52 % de identidad con la SEQ ID NO: 4; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 72 % de identidad con la SEQ ID NO: 6; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 8; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 54 % de identidad con la SEQ ID NO: 10; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 40 % de identidad con la SEQ ID NO: 12; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 36 % de identidad con la SEQ ID NO: 14; y un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 33 % de identidad con la SEQ ID NO: 16, en la que la SEQ ID NO:4 codifica una proteína "PB2" de la gripe C; la SEQ ID NO:6 codifica una proteína "PB1" de la gripe C; la SEQ ID NO: 8 codifica una proteína "PA" de la gripe; la SEQ ID NO: 10 codifica una proteína "HE" de la gripe C; la SEQ ID NO: 12 codifica una proteína "N" de la gripe C; la SEQ ID NO:14 codifica una proteína "M" de la gripe C; y la SEQ ID NO: 16 codifica una proteína "NS1" de la gripe C.

En aspectos adicionales, la invención proporciona composiciones inmunógenas, vectores de expresión y células huésped que comprenden el virus C de la gripe bovina y/o aminoácidos y/o ácidos nucleicos de acuerdo con los aspectos de la invención mencionados anteriormente.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento o protección de un animal de la enfermedad provocada por un virus de la gripe C, procedimiento que comprende administrar al animal la composición inmunógena que comprende el virus, o la(s) secuencia(s) de ácidos nucleicos o la(s) secuencia(s) de aminoácidos de acuerdo con los aspectos de la invención divulgados anteriormente.

En otros aspectos, la invención proporciona procedimientos y kits de diagnóstico y anticuerpos y/o cebadores nucleotídicos útiles para tales procedimientos y kits. Más específicamente, en algunos aspectos, la invención proporciona un procedimiento de detección de la exposición de un animal al virus de la gripe C que comprende determinar la presencia de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15 en una muestra del animal.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de detección de la exposición de un animal al virus de la gripe C que comprende determinar la presencia de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 en una muestra del animal.

En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo que se une específicamente al virus C de la gripe bovina aislado.

En otro aspecto, la invención proporciona también un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16-20.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una micrografía electrónica del virus C de la gripe bovina aislado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad.

Los siguientes definiciones se pueden aplicar a los términos empleados en la descripción de las modalidades. Las siguientes definiciones reemplazan cualquier definición contradictoria contenida en cada una de las referencias individuales incorporadas en el presente documento por referencia.

A menos que se definan de otro modo en el presente documento, los términos científicos y téenicos usados en relación con las presentes modalidades tendrán los significados entendidos comúnmente por los expertos en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán el plural y los términos en plural incluirán el singular.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "alrededor de" o "aproximadamente" cuando se usan en relación con una variable numérica medióle, significan el valor indicado de la variable y todos los valores de la variable que se encuentran dentro del error experimental del valor indicado (p. ej. , dentro del intervalo de confianza del 95 % para la media) o dentro del 10 por ciento del valor indicado, el que sea mayor.

Tal como se usa en el presente documento, el término "adyuvante" significa un agente farmacológico o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes, tales como un fármaco o una composición inmunógena. Con frecuencia se incluyen adyuvantes en la composiciones inmunógenas para potenciar la respuesta inmunitaria del receptor ante un antígeno suministrado. Para una descripción más detallada de los adyuvantes, véase más adelante. Tal como se usa en el presente documento, el término "aminoácido" se refiere a aminoácido naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de manera similar a los aminoácidos naturales.

Los aminoácidos naturales son aquello codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican después, por ejemplo, la hidroxiprolina, el carboxiglutamato y la O-fosfoserina. Los estereoisómeros (p. ej. , D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a- y a-disustituidos, N-alquilaminoácidos y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, y-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetil lisina, e-N-acetil lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, s-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos.

Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, a grupo amino y un grupo R. Los análogos de aminoácidos ejemplares incluyen, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina y metilsulfonio de metionina. Estos análogos tienen grupos R modificados (p. ej., norleucina) o esqueletos carbonados modificados, pero mantienen la misma estructura química esencial que el aminoácido natural. Los miméticos de aminoácidos se refieren a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funcionan de manera similar a un aminoácido natural.

En el presente documento se puede hacer referencia a los aminoácidos por sus símbolos de tres letras conocidos comúnmente o por sus símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB.

Tal como se usa en el presente documento, el termino "sustitución de aminoácido conservadora" se refiere a la sustitución de cualquier aminoácido por un residuo de aminoácido dado, donde el residuo sustituto es tan parecido químicamente al residuo dado que no se producen disminuciones sustanciales de la función del polipéptido (p. ej. , de la actividad enzimática). Las sustituciones de aminoácidos conservadoras se conocen comúnmente en la téenica y se describen ejemplos de las mismas, p. ej., en las patentes de EE. UU. N.° 6,790,639, 6,774,107, 6,194,167 o 5,350,576. En una modalidad preferente, una sustitución de aminoácido conservadora será cualquiera que se produzca dentro de uno de los siguientes seis grupos: · Residuos pequeños alifáticos sustancialmente apolares: Ala, Gly, Pro, Ser y Thr; • Residuos grandes alifáticos apolares: lie, Leu, Val y Met; • Residuos polares con carga negativa: Asp y Glu; • Amidas de residuos polares con carga negativa: Asn y Gln; · Residuos polares con carga positiva: Arg, Lys e His; y • Residuos grandes aromáticos: Trp, Tyr y Phe.

En una modalidad preferente, una sustitución de aminoácido conservadora será una cualquiera de las siguientes, que se enumeran como pares de residuos nativos (sustituciones conservadoras): Ala (Ser); Arg (Lys); Asn (Gln; His); Asp (Glu); Gln (Asn); Glu (Asp); Gly (Pro); His (Asn; Gln); lie (Leu; Val); Leu (lie; Val); Lys (Arg; Gln; Glu); Met (Leu; lie); Phe (Met; Leu; Tyr); Ser (Thr); Thr (Ser); Trp (Tyr); Tyr (Trp; Phe); y Val (lie; Leu).

Tal como se usa en el presente documento, el termino "animal" significa cualquier animal que es sensible a la infección por el virus C de la gripe bovina, incluidos mamíferos tanto domesticados como salvajes. Preferentemente, tal como se usa en el presente documento, "animal" se refiere a un bóvido.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "anticuerpo" o "anticuerpos" significan una molécula de ¡nmunoglobulina que se puede unir a un antígeno por medio del reconocimiento de un epítopo. Las inmunoglobulinas son proteínas séricas compuestas por cadenas polipeptídicas "ligeras" y "pesadas" que tienen regiones "constantes" y "variables" y que se dividen en clases (p. ej., IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) basándose en la composición de las regiones constantes. Un anticuerpo que es "específico" para un antígeno dado indica que las regiones variables del anticuerpo reconocen y se unen a un antígeno en particular de forma exclusiva. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonal. Pueden ser inmunoglobulinas intactas obtenidas de fuentes naturales o recombinantes, o pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en varias formas, incluidas Fv, Fab’, F(ab’)2, Fe, y también como monocatenarios. Se puede convertir un anticuerpo en una proteína de unión a antígeno, que incluye, pero sin limitación, fragmentos de anticuerpo. Tal como se usan en el presente documento, los términos "proteína de unión a antígeno", "anticuerpo" y similares, que se pueden usar indistintamente, se refieren a un polipéptido o polipéptidos, o fragmento(s) de los mismos, que comprenden un sitio de unión a antígeno. Preferentemente, el término "proteína de unión a antígeno" o "anticuerpo" se refiere a anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos, y a equivalentes de unión inmunológicos de los mismos que se pueden unir a una proteína en particular y a fragmentos de la misma. Tal como se usa en el presente documento, el término no engloba solamente anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos. Para los fines de la presente invención, "anticuerpo" y "proteína de unión a antígeno" incluye también fragmentos de anticuerpo, a menos que se indique lo contrario. Los fragmentos de anticuerpos ejemplares incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, diacuerpos, sus fragmentos de reconocimiento de antígenos, productos inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP), nanocuerpos, moléculas de IgNAR (¡nmunoglobulina receptor nuevo de antígeno) y similares, todos conocidos por un experto en la téenica como proteínas de unión a antígeno o fragmentos de anticuerpo, y cualquiera de los fragmentos mencionados anteriormente y sus equivalentes genomanipulados o manipulados químicamente, así como otros fragmentos de anticuerpo y mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una parte de un anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígenos. Se pueden prepara anticuerpos y proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, por medio de téenicas tradicionales de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495-499 (1975)), procedimientos de ADN recombinante (en la patente de EE. UU. N.° 4,816,567) o técnicas de presentación en fagos usando colecciones de anticuerpos (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). Para diversas otras técnicas de producción de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Coid Spring Harbor Laboratory, 1988, así como otras técnicas que son bien conocidas por los expertos en la técnica.

En el contexto de la unión a anticuerpos, el término "se une específicamente", "específicamente une" o "unión específica" se refiere a una unión con alta avidez y/o alta afinidad de un anticuerpo a un antígeno, es decir, un polipéptido, o epítopo específicos. La unión específica de un anticuerpo a un antígeno es más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a otros antígenos. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos en un grado débil, aunque detectable (p. ej. , el 10 % o menos de la unión que muestran con el polipéptido de interés). Esta unión débil, o unión de fondo, se distingue claramente de la unión específica del anticuerpo a un polipéptido objeto, p. ej., mediante el uso de controles apropiados. En general, los anticuerpos específicos se unen a un antígeno con una afinidad de unión con un Kd de 107 M o menos, p. ej., de 108 M o menos, p. ej., de 109 M o menos, de 101° o menos, de 1011 o menos, de 10 12 o menos o de 10 13 o menos, etc.

Tal como se usa en el presente documento, "antígeno" significa una molécula que contiene uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos) que, tras la exposición a un sujeto, inducirán una respuesta inmunitaria que es específica para ese antígeno. Un epítopo es el sitio específico del antígeno que se une a un receptor de linfocitos T o anticuerpos de linfocitos B específicos y, normalmente, comprende de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 residuos de aminoácido. El término "antígeno" puede referirse también a antígenos de subunidad (antígenos discretos e independientes de un organismo completo con el que al antígeno está asociado en la naturaleza), así como bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios muertos, atenuados o inactivados. El término "antígeno" también se refiere a anticuerpos, tales como anticuerpos antiidiotípicos o fragmentos de los mismos, y a mimótopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o determinante antigénico (epítopo). El término "antígeno" se refiere también a un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno o determinante antigénico in vivo, tal como en aplicaciones de inmunización de ADN. Tal como se usa en el presente documento, un "antígeno" es una molécula o una parte de una molecula que se puede unir específicamente a un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno. En particular, un anticuerpo, o una proteína de unión a antígeno, se unirá a epítopos del antígeno. Tal como se usa en el presente documento, un epítopo se refiere al determinante antigénico reconocido por la región hipervariable, o región determinante de la complementariedad (CDR), de la región variable de un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno. A menos que se indique lo contrario, tal como se usa en el presente documento, el término "epítopo" se refiere a una región del virus C de la gripe bovina que se unirá específicamente a un anticuerpo de la invención.

Tal como se usa en el presente documento, el término "bóvido" significa un grupo diverso de ungulados de tamaño medio a grande, por lo general con pezuñas hendidas, y al menos uno de los sexos tiene cuernos auténticos. Los bóvidos incluyen, pero sin limitación, ganado doméstico, bisontes, el búfalo africano, el búfalo de agua, el yak y los antílopes de cuatro cuernos o de cuernos en espiral.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "diagnosticar", "que diagnostica" o "diagnóstico" significan la identificación de la naturaleza y/o la causa de algo, tal como una enfermedad, o un kit que se útil para realizar una identificación de ese tipo.

Tal como se usa en el presente documento, el término "segmento génico" significa un trozo de ácido nucleico que forma parte de un genoma vírico. En el caso de los virus de la gripe, contienen siete u ocho segmentos génicos, algunos de los cuales contienen más de un gen. Un genoma vírico compuesto por segmentos génicos es todo de ADN o todo de ARN.

Tal como se usa en el presente documento, el término "heterólogo" significa una combinación de elementos que no se produce de forma natural. Por ejemplo, ADN heterólogo se refiere a ADN que no está situado de forma natural en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. El ADN heterólogo puede incluir también un gen ajeno a la célula. Un "elemento regulador de la expresión heterólogo" o "promotor heterólogo" es un elemento asociado de forma funcional con una gen diferente a aquel con el que se asocia en la naturaleza. Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia de nucleótidos heteróloga" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se añade a una secuencia de nucleótidos de la presente invención por procedimientos recombinantes para formar un ácido nucleico que no se forma naturalmente en la naturaleza. Los ácidos nucleicos de este tipo pueden codificar polipéptido/proteínas quiméricos y/o de fusión. Por tanto, la secuencia de nucleótidos heteróloga puede codificar péptidos/proteínas que contienen propiedades reguladoras y/o estructurales.

Tal como se usa en el presente documento, el término "célula huésped" significa una célula procariota o eucariota que alberga un plásmido, un vector o un virus. Las células de este tipo pueden incluir, pero sin limitación, células bacterianas, células de levaduras, células de insectos, celulas animales y células de mamíferos (p. ej., murinas, de rata, de simios o humanas). El término "célula huésped" puede significar cualquier célula individual o cultivo celular capaz de soportar la replicación de un virus. Con respecto a los plásmidos y vectores, una "célula huésped" es cualquier célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido receptor de vectores, o de la incorporación de moléculas de ácido nucleico, polinucleótidos y/o proteínas exógenos. También se pretende que incluya la progenie de una sola célula. La progenie puede no ser necesariamente idéntica por completo en morfología o en el complemento de ADN genómico o total a la célula progenitora original debido a las mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Se pretende que una "célula huésped" incluya cualquier célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido receptor de vectores, o de la incorporación de moléculas de ácido nucleico, polinucleótidos y/o proteínas exógenos. También se pretende que incluya la progenie de una sola célula. La progenie puede no ser necesariamente idéntica por completo (en morfología o en el complemento de ADN genómico o total) a la célula progenitora original debido a las mutaciones naturales, accidentales o deliberadas. Tal como se usan en el presente documento, los términos "célula huésped", "célula", "estirpe celular" y "cultivo celular" se pueden usar indistintamente.

Tal como se usa en el presente documento, el término "identidad" significa el grado en el que dos secuencias de nucleótidos o proteínicas son invariantes. Tal como se usa en el presente documento, el término "similitud" u "homología" significa el grado en el que las secuencias de nucleótidos o proteínicas están relacionadas. El grado de similitud entre dos secuencias se puede basar en el porcentaje de identidad y/o la conservación de las secuencias. Los aminoácidos distintos de los indicados como conservados pueden diferir en una proteína o enzima, de modo que el porcentaje de similitud de la proteína o la secuencia de aminoácidos entre dos proteínas cualesquiera de función similar puede variar y puede ser, por ejemplo, de al menos el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 % y el 95 %, determinado de acuerdo con un esquema de alineación.

Tal como se usa en el presente documento, el término "composición inmunógena" significa una composición que genera una respuesta inmunitaria (es decir, tiene actividad inmunógena) cuando se administra sola, o con un vehículo farmacéuticamente aceptable, a un animal. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular mediada principalmente por linfocitos T citotóxicos o una respuesta inmunitaria humoral mediada principalmente por linfocitos T colaboradores que, a su vez activan los linfocitos B, lo que da lugar a la producción de anticuerpos. Además, se pueden generar anticuerpos o linfocitos T específicos para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "virus de la gripe C", "virus de la gripe de tipo C" o "virus de la gripe C" significan un género dentro de la familia de los ortomixovirus que incluye los virus que pueden provocar lo que comúnmente se denomina la "gripe".

Tal como se usa en el presente documento, el termino "aislado" significa que el material al que se hace referencia se retira del entorno en el que se encuentra normalmente. Por tanto, un material biológico aislado puede no tener componentes celulares, es decir, componentes de las células en las que se encuentra o se produce el material. En el caso de las moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye, por ejemplo, un producto de PCR, un ARNm aislado, un ADNc o un fragmento de restricción. En otro modo de realización, preferentemente, un ácido nucleico aislado se escinde del cromosoma en el que se puede encontrar y, más preferentemente, deja de estar unido a regiones no reguladoras no codificantes o a otros genes situados antes o después de la molécula de ácido nucleico cuando se encuentra en el cromosoma. En otro modo de realización más, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. Por tanto, en una modalidad específico, un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada se puede asociar con otras proteínas o con ácidos nucleicos, o ambos, con los que se asocia en la célula, o con membranas celulares si es una proteína asociada a la membrana. Un orgánulo, una célula o un tejido aislado se retira del sitio anatómico en el que se encuentra en un organismo. Un material aislado se puede purificar, aunque no tiene porqué. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" o "purificado", p. ej., un "polipéptido aislado" o un "polinucleótido aislado", se purifica hasta un estado más allá de aquel en el que existe en la naturaleza. Por ejemplo, el polipéptido o polinucleótido "aislado" o "purificado" puede estar sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la célula o el tejido original de los que proviene la proteína o el polinucleótido, o estar sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. Se considera "sustancialmente libre" la preparación de proteína de unión a antígeno que tiene menos de aproximadamente el 50 % de proteína que no se une a antígeno (también denominada en el presente documento "proteína contaminante") o de precursores químicos. Se considera sustancialmente libre el 40 %, el 30 %, el 20 %, el 10 % y, más preferentemente, el 5 % (en peso en seco) de proteína que no se une a antígeno o de precursores químicos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "enlazado de forma funcional" significa que una molécula de ácido nucleico, p. ej., ADN o ARN, y uno o más elementos reguladores de la expresión (p. ej., un promotor o una parte del mismo con o sin un promotor, un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) u otro elemento regulador de la expresión) están conectados de tal manera que permiten la transcripción de un ARN a partir de la molécula de ácido nucleico, o permiten la expresión del producto (es decir, un polipéptido) de la molécula de ácido nucleico, cuando se unen las moléculas apropiadas a las secuencias reguladoras.

Los elementos reguladores de la expresión se pueden configurar para generar uno o más ácidos nucleicos bicatenarios o monocatenarios, con orientación positiva o negativa.

Tal como se usan en el presente documento, los terminos "péptido", "polipéptido" o "proteína" significan una molécula polimérica orgánica compuesta por dos o más aminoácidos unidos en una cadena. En el presente documento los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente para hacer referencia a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por elementos que no son aminoácidos. Los términos también engloban un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, por la formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente marcador. También se incluyen en la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos artificiales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la téenica.

Tal como se usa en el presente documento, el término "plásmido" significa un elemento genético que se hereda de forma estable sin que forme parte del cromosoma de su célula huésped. Los plásmidos pueden comprender ADN o ARN y pueden ser lineales o circulares. Los plásmidos codifican moleculas que garantizan su replicación y su herencia estable durante la replicación celular y pueden codificar productos de importancia médica, agrícola y medioambiental. El uso de los plásmidos está extendido en la biología molecular como vectores para clonar y expresar genes recombínantes.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "polinucleótido" o "molécula polinucleotídica" significan una molécula polimérica orgánica compuesta por monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. El ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos con función biológica evidente. En el presente documento, se pueden usar indistintamente los términos "ácido nucleico", "polinucleótido", "molécula de ácido nucleico" y similares y hacen referencia a una serie de bases nucleotídicas (también llamadas "nucleótidos") del ADN y el ARN. El ácido nucleico puede contener desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. El término "ácido nucleico" incluye, por ejemplo, moléculas monocatenarias y bicatenarias. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un gen o un fragmento génico, exones, intrones, una molécula de ADN (p. ej., ADNc), una molécula de ARN (p. ej. , ARNm), ácidos nucleicos recombinantes, plásmidos y otros vectores, cebadores y sondas. Se incluyen polinucleótidos tanto de 5' a 3' (sentido) como de 3' a 5' (antisentido). Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, nucleótidos o bases modificados, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que se pueda incorporar en un polímero por una polimerasa de ADN o ARN. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Si están presente, la modificación de la estructura del nucleótido se puede introducir antes o después del ensamblaje del polímero. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes que no son nucleótidos. Un polinucleótido se puede modificar adicionalmente después de la polimerización, tal como por conjugación con un componente marcador. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo, "terminaciones" (sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo), modificaciones entre nucleótidos tales como, por ejemplo, aquellos con enlaces sin carga (p. ej. , metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces cargados (p. ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen restos laterales, tales como, por ejemplo, proteínas (p. ej., nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, ply-L-lisina, etc.), aquellos con intercalantes (p. ej., acridina, psoraleno, etc ), aquellos que contienen quelantes (p. ej., metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, aquellos con enlaces modificados (p. ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas del/de los polinucleótido(s) sin modificar. Además, se puede reemplazar cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en los azúcares, por ejemplo, con grupos fosfonato, grupos fosfato, protegerlos con grupos protectores estándar o activarlos para preparar enlaces adicionales con nucleótidos adicionales, o se pueden conjugar con soportes sólidos. El OH 5' y 3' terminal se puede fosforilar o sustituir con aminas o restos de grupos orgánicos terminadores de desde 1 hasta 20 átomos de carbono. Tambien se pueden derivatizar otros hidroxilos para dar grupos protectores estándar. Los polinucleótidos pueden contener también formas análogas de ribosa o desoxirribosa conocidas en general en la téenica, incluidas, por ejemplo, la 2'-O-metil-, la 2'-0-alil, la 2'-fluoro- o la 2'-azido-ribosa, análogos carbocíclicos de azúcares, azúcares anoméricos, azúcares epiméricos tales como la arabinosa, la xilosa o la lixosa, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos abásicos de nucleósidos tales como la metil ribosa. Se pueden reemplazar uno o más enlaces fosfodiéster con grupos enlazadores alternativos. Estos grupos enlazadores alternativos incluyen, pero sin limitación, modalidades en los que se reemplaza el fosfato por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), "(0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o sin sustituir (1-20 C), que opcionalmente contienen un enlace éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces de un polinucleótido son necesariamente idénticos. La descripción anterior se aplica a todos los polinucleótidos a los que se hace referencia en el presente documento, incluidos el ARN y el ADN.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "evitar", "que evita" o "prevención" y similares significan la inhibición de la replicación de un microorganismo, la inhibición de la transmisión de un microorganismo o la inhibición de que el propio microorganismo se establezca en su huesped. Estos términos, y similares, pueden significar también la inhibición o el bloqueo de uno o más signos o síntomas de infección.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "proteína recombinante" o "recombinante" significan proteínas, péptidos o polipéptidos derivados, y las téenicas usadas para producirlos, de células transformadas con una construcción de ADN exógeno que codifica la proteína, el péptido o el polipéptido deseados.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" (o "cantidad eficaz") se refiere a una cantidad de un principio activo, p. ej. , un agente de acuerdo con la invención, suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados cuando se administra a un sujeto o un paciente. Una cantidad eficaz se puede administrar en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones. Un experto en la técnica puede determinar con facilidad una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de acuerdo con la invención.

Tal como se usan en el presente documento, los términos "terapéutico" o "tratamiento" engloban el espectro completo de tratamientos para una enfermedad o trastorno. A modo de ejemplo, un agente "terapéutico" de la invención puede actuar de un modo, o un tratamiento puede dar lugar a un efecto que es profiláctico o preventivo , incluidos los que incorporan procedimientos diseñados para dirigirse a animales que se pueden identificar como en riesgo (farmacogenética); o de una manera que es de naturaleza paliativa o curativa; o puede actuar para ralentizar la velocidad o el grado de progresión de al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno que se está tratando.

Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula polinucleotídica que puede portar y transferir otra secuencia o un fragmento de polinucleótido al que se ha enlazado, desde una ubicación (p. ej., un huésped, un sistema) a otra. El término incluye vectores para sistemas de expresión in vivo o in vitro. Por ejemplo, los vectores de la invención pueden estar en forma de "plásmidos", que se refieren a bucles de ADN bicatenario circular que, normalmente, se mantienen episómicos, pero también se pueden integrar en el genoma del huésped. Los vectores de la invención también pueden estar en forma lineal. Además, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores que realizan funciones equivalentes y que como consecuencia del presente documento son conocidas en la téenica.

Tal como se usa en el presente documento, el término "vehículo veterinariamente aceptable" se refiere a sustancias que, en el ámbito del criterio médico razonable, son adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica y similares indebidas, conmensuradas con una proporción razonable de beneficio y riesgo, y eficaces para su uso pretendido.

La siguiente descripción se proporciona para ayudar a los expertos en la téenica a poner en práctica la presente invención. Aun así, no debe interpretarse que esta descripción limita indebidamente la presente invención, ya que los expertos en la técnica pueden realizar modificaciones y variaciones en las modalidades analizados en el presente documento sin alejarse del espíritu o el alcance del presente hallazgo inventivo.

Virus: Composiciones inmunóaenas En determinadas modalidades de la presente invención, se ha identificado y aislado un virus de la gripe C de un bóvido y también se ha caracterizado. Se depositó un aislado de virus de la gripe C en la ATCC y se le ha asignado el número de acceso PTA-13105.

En un aspecto, el virus de la gripe C de la invención se caracteriza por comprender al menos una de las siguientes secuencias de ácidos nucleicos: una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteina PB2, la proteína PB1, la proteína PA, la proteína HE, la proteína N, la proteína M y la proteína NS1. La presente invención también engloba cualquier combinación de estas siete.

La proteína HE de la presente invención comprende la SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que es al menos el 93.2 % idéntica, o al menos el 95.5 % idéntica, o al menos el 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 20.

En algunas modalidades, la proteína HE de la presente invención comprende la SEQ ID NO: 18 o una secuencia que es al menos el 78 % idéntica y el 84 % similar. En algunas modalidades, la identidad con la SEQ ID NO: 18 es de al menos el 80 %, o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, y la similitud con la SEQ ID NO: 18 es de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, opcionalmente, con la condición de que los aminoácidos 36-79 de la SEQ ID NO: 18 sean al menos el 93.2 % idénticos, o al menos el 95.5 % idénticos, o al menos el 98 %, o el 100 % idénticos a la SEQ ID NO: 20.

En otras modalidades adicionales, la proteína HE de la presente invención comprende la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que es al menos el 63 % idéntica y el 85 % similar. En algunas modalidades, la identidad con la SEQ ID NO: 19 es de al menos el 65 %, o de al menos el 70 %, o de al menos el 75 %, o de al menos el 80 %, o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, y la similitud con la SEQ ID NO: 19 es de al menos el 90 %, o de al menos el 95 % o de al menos el 99 %.

En otras modalidades, la proteína HE de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 54 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, preferentemente, con la condición de que los aminoácidos 58-136 de la SEQ ID NO: 10 comprendan la SEQ ID NO: 18 o una secuencia que es al menos el 78 % idéntica y el 84 % similar. En algunas modalidades, la identidad con la SEQ ID NO: 18 es de al menos el 80 %, o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, y la similitud con la SEQ ID NO: 18 es de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, opcionalmente, con la condición de que los aminoácidos 36-79 de la SEQ ID NO: 18 sean al menos el 93.2 % identicos, o al menos el 95.5 % idénticos, o al menos el 98 %, o el 100 % idénticos a la SEQ ID NO: 20.

La proteína HE se puede caracterizar además por la condición adicional o alternativa de que sus aminoácidos 539-598 comprendan la SEQ ID NO: 19 o una secuencia que es al menos el 63 % idéntica y el 85 % similar. En algunas modalidades, el porcentaje de identidad con la SEQ ID NO: 19 es de al menos el 65 %, o de al menos el 70 %, o de al menos el 75 %, o de al menos el 80 %, o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, y la similitud con la SEQ ID NO: 19 es de al menos el 90 %, o de al menos el 95 % o de al menos el 99 %.

Preferentemente, la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína HE comprende una secuencia que es al menos el 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 10, o al menos el 65 %, o al menos el 70 %, o al menos el 75 %, o al menos el 80 %, o al menos el 85 %, o al menos el 90 %, o al menos el 95 %, o al menos el 99 % o el 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 10.

En otro aspecto, la proteína M se caracteriza por comprender la SEQ ID NO: 17 o una secuencia que es el 67 % idéntica y el 92 % similar. En algunas modalidades, la identidad con la SEQ ID NO: 17 es de al menos el 70 %, o de al menos el 75 %, de al menos el 80 %, o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 %, y la similitud con la SEQ ID NO: 17 es de al menos el 95 % o de al menos el 99 %. Además, la proteína M del virus de la gripe C se puede caracterizar por comprender una secuencia de aminoácidos que es al menos el 36 % idéntica a la SEQ ID NO: 14. En diferentes modalidades, la identidad puede ser de al menos el 40 % o de al menos el 45 %, o de al menos el 50 % o de al menos el 55 %, de al menos el 60 % o de al menos el 65 %, de al menos el 70 % o de al menos el 75 %, de al menos el 80 % o de al menos el 85 %, de al menos el 90 % o de al menos el 95 %, de al menos el 99 % o del 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 14.

El aminoácido que codifica la proteína PB2 se caracteriza por tener al menos el 52 % de identidad con la SEQ ID NO: 4. En determinadas modalidades, el porcentaje de identidad es de al menos el 55 % o de al menos el 60 % o de al menos el 65 %, o de al menos el 70 % o de al menos el 75 %, de al menos el 80 % o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 % o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 % o del 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

El aminoácido que codifica la proteína PB1 se caracteriza por tener al menos el 72 % de identidad con la SEQ ID NO: 6. En determinadas modalidades, el porcentaje de identidad es de al menos el 75 %, o de al menos el 80 %, o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 %, o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 % o del 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 6.

El aminoácido que codifica la proteína PA se caracteriza por tener al menos el 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 8. En determinadas modalidades, la identidad es de al menos el 55 % o de al menos el 60 % o de al menos el 65 %, o de al menos el 70 % o de al menos el 75 %, de al menos el 80 % o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 % o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 % o del 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 8.

El aminoácido que codifica la proteína N se caracteriza por tener al menos el 40% de identidad con la SEQ ID NO: 12. En determinadas modalidades, la identidad es de al menos el 45 %, o de al menos el 50 %, o de al menos el 55 % o de al menos el 60 % o de al menos el 65 %, o de al menos el 70 % o de al menos el 75 %, de al menos el 80 % o de al menos el 85 %, o de al menos el 90 % o de al menos el 95 %, o de al menos el 99 % o del 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 12.

El aminoácido que codifica la proteína NS1 se caracteriza por tener al menos el 33% de identidad con la SEQ ID NO: 16. En determinadas modalidades, la identidad es de al menos el 40 % o de al menos el 45 %, o de al menos el 50 % o de al menos el 55 %, de al menos el 60 % o de al menos el 65 %, de al menos el 70 % o de al menos el 75 %, de al menos el 80 % o de al menos el 85 %, de al menos el 90 % o de al menos el 95 %, de al menos el 99 % o del 100 % de identidad con la SEQ ID NO: 16.

Los virus de la gripe C de la presente invención se pueden propagar en células, estirpes celulares y células huésped. Dichas células, estirpes celulares o células huésped pueden ser, por ejemplo, pero sin limitación, células de mamíferos y células que no son de mamíferos, incluidas células de insectos y células vegetales. Las células, estirpes celulares y células huésped en las que se pueden propagar los virus de la gripe C de la presente invención se conocen y son accesibles fácilmente para los expertos en la téenica.

Los virus de la gripe C se pueden atenuar o inactivar antes de su uso en una composición inmunógena. Los expertos en la técnica conocen bien los procedimientos de atenuación e inactivación. Los procedimientos de atenuación incluyen, pero sin limitación, pases en serie en cultivo celular, irradiación ultravioleta y mutagénesis química. Los procedimientos para la inactivación incluyen, pero sin limitación, el tratamiento con formalina, betapropiolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI), u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La inactivación por formalina se puede realizar mezclando la suspensión de virus con formaldehído al 37 %, hasta una concentración final de formaldehído del 0.05 %. Se agita la mezcla de virus y formaldehído de forma constante durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. Despues, se somete a prueba la mezcla de virus inactivados para detectar virus vivos residuales con la realización de un ensayo de proliferación en una estirpe celular adecuada. La inactivación por BEI se puede realizar mezclando la suspensión de virus con BEI (2-bromo-etilamina en NaOH 0.175 N) 0.1 M, hasta una concentración final de BEI de 1 mM. La mezcla de virus y BEI se agita de forma constante durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente, seguido de la adición de tiosulfato de sodio 1.0 M hasta una concentración final de 0.1 mM. Se continúa mezclando durante dos horas más. Se somete a prueba la mezcla de virus inactivados para detectar virus vivos residuales con la realización de un ensayo de proliferación en una estirpe celular adecuada.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos veterinariamente aceptables, tales como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros conocidos por los expertos en la téenica. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros conocidos por el experto en la técnica. Los conservantes incluyen mertiolato, entre otros conocidos por el experto en la técnica.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención pueden incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitación, el sistema de adyuvantes RIBI (Ribi Inc.; Hamilton, MT), alumbre, hidróxido de aluminio en gel, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, p. ej., los adyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímeros en bloque (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, CA), el adyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL) u otras fracciones de la saponina, monofosforil lípido A, adyuvante de amina lipoidal Avridine, la enterotoxina termolábil de Escherichia coli (recombinante o de otro modo), la toxina colérica o el dipéptido de muramilo, entre otros mucho conocidos por los expertos en la téenica.

El experto en la técnica puede determinar fácilmente las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención. En una modalidad, la presente invención contempla composiciones inmunógenas que comprenden de desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 2000 pg de adyuvante. En otro modo de realización, se incluye el adyuvante en una cantidad de desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 1500 mg, o desde aproximadamente 250 pg hasta aproximadamente 1000 pg, o desde aproximadamente 350 pg hasta aproximadamente 750 pg. En otra realización, se incluye el adyuvante en una cantidad de aproximadamente 500 mg/2 mi de dosis de la composición inmunógena.

Se ha demostrado que una serie de citocinas o linfocinas tienen actividad inmunomoduladora, y por tanto se pueden usar como adyuvantes, e incluyen, pero sin limitación, las interleucinas 1-a, 1-b, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 5,723,127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes), los interferones a, b y g, el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (véanse, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 5,078,996 y el número de acceso de la ATCC 39900), el factor estimulador de colonias de macrófagos, el factor estimulador de colonias de granulocitos, GSF, y los factores de necrosis tumoral a y b. Otros adyuvantes adicionales útiles en la presente invención incluyen una quimiocina, incluidas, sin limitación, MCP-1 , MIR?a, MIR-1b y RANTES. Las moléculas de adhesión, tales como la selectina, p. ej., la L-selectina, la P-selectina y la E-selectina, también pueden ser útiles como adyuvantes. Otros adyuvantes útiles adicionales incluyen, sin limitación, una molécula de tipo mucina, p. ej., CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1 , un miembro de la familia de las integrinas tal como LFA-1 , VLA-1 , Mac-1 y p150.95, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas tal como PECAM, ICAM, p. ej., ICAM-1 , ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3, moléculas coestimuladoras tales como CD40 y CD40L, factores de crecimiento, incluidos el factores de crecimiento vascular, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento fibroblástico, el factor de crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1 y el factor de crecimiento endotelial vascular, moleculas receptoras, incluidas Fas, el receptor TNF, Flt, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6. Otra molécula adyuvante adicional incluye la caspasa (ICE). Véanse también las publicaciones de patente n.° W098/17799 y W099/43839, incorporadas en el presente documento por referencia.

Los adyuvantes adecuados usados para potenciar una respuesta ¡nmunitaria incluyen, sin limitación, MPL™ (monofosforil lípido A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT), que se describe en la patente de EE. UU. N.° 4,912,094, que se incorpora en el presente documento por referencia. También son útiles para su uso como adyuvantes los análogos sintéticos del lípido A o compuestos de aminoalquil glucosamino fosfato (AGP), o derivados o análogos de los mismos, que están disponibles de Corixa (Flamilton, MT), y que se describen en la patente de Estados Unidos N.° 6,113,918, que se incorpora en el presente documento por referencia. Uno de tales AGP es el 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-desoxi-4-O-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que también se conoce como 529 (anteriormente conocido como RC529). Este adyuvante 529 se formula como una forma acuosa o como una emulsión estable.

Otros adyuvantes adicionales incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glucósido, polioles plurónicos, dipéptido de muramilo, Bordetella ¡nactivada, saponinas, tales como Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA), descrita en la patente de EE. UU. N.° 5,057,540, que se incorpora en el presente documento por referencia, y partículas generadas a partir de los mismos, tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacterianos, polinucleótidos sinteticos, tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (en la patente de EE. UU. N.° 6,207,646, que se incorpora en el presente documento por referencia), una toxina pertúsica (PT) o una toxina termolábil de E. coli (LT), en particular la LT-K63, la LT-R72, la PT-K9/G129; véanse, p. ej. , las publicaciones de patente internacional N.° WO 93/13302 y WO 92/19265, incorporadas en el presente documento por referencia.

También son útiles como adyuvantes las toxinas coléricas y mutantes de las mismas, incluidos los descritos en la publicación de patente internacional número WO 00/18434 (en los que se reemplaza el ácido glutámico de la posición de aminoácido 29 con otro aminoácido distinto del ácido aspártico, preferentemente una histidina). En la solicitud de patente internacional publicada número WO 02/098368 se describen toxinas de CT o mutantes similares (en los que se reemplaza la isoleucina de la posición de aminoácido 16 con otro aminoácido, bien sola o en combinación con el reemplazo de la serina de la posición de aminoácido 68 con otro aminoácido; y/o en las que se reemplaza la valina de la posición de aminoácido 72 con otro aminoácido). En la solicitud de patente internacional publicada número WO 02/098369 se describen otras toxinas de CT (en las que se reemplaza la arginina de la posición de aminoácido 25 con otro aminoácido; y/o se inserta un aminoácido en la posición de aminoácido 49; y/o se insertan dos aminoácidos en las posición de aminoácido 35 y 36).

Las composiciones inmunógenas de la invención pueden incluir tambien sustancias tensioactivas. Las sustancias tensioactivas adecuadas incluyen, sin limitación, análogos de quinona, hexadecilamina, octadecilamina, ásteres de octadecil aminoácidos, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio, metoxihexadecilgilcerol y polioles plurónicos; poliaminas, p. ej., pirano, dextranosulfato, poli IC, carbopol; péptidos, p. ej., péptido y dipéptido de muramilo, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones oleosas; y geles minerales, p. ej., de fosfato de aluminio, etc., y complejos inmunoestimulantes (ISCOM).

Las composiciones inmunógenas de la invención pueden incluir también antibióticos. Tales antibióticos incluyen, pero sin limitación, los de las clases de aminoglucósidos, carbapenémicos, cefalosporinas, glucopéptidos, macrólidos, penicilinas, polipéptidos, quinolonas, sulfonamidas y tetracielinas. En una modalidad, la presente invención contempla composiciones inmunógenas que comprenden de desde aproximadamente 1 mg/ml hasta aproximadamente 60 pg/ml de antibiótico. En otro modo de realización, las composiciones inmunógenas comprenden de desde aproximadamente 5 pg/ml hasta aproximadamente 55 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 50 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 15 pg/ml hasta aproximadamente 45 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 20 pg/ml hasta aproximadamente 40 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 25 pg/ml hasta aproximadamente 35 pg/ml de antibiótico. En otro modo de realización más, las composiciones inmunógenas comprenden menos de aproximadamente 30 pg/ml de antibiótico.

Tambien se pueden incluir otros aditivos en las composiciones inmunógenas de la presente invención, incluidos conservantes, ingredientes estabilizantes y similares. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, vainillina de etilo, glicerol, fenol y paraclorofenol. Los ingredientes estabilizantes adecuados que se pueden usar incluyen, por ejemplo, casaminoácidos, sacarosa, gelatina, rojo de fenol, N-Z-Amine, difosfato de monopotasio, lactosa, lactoalbúmina hidrolizada y leche en polvo. Las composiciones inmunógenas también se pueden incorporar en liposomas para su uso como una composición inmunógena y pueden contener también otros aditivos adecuados para el modo de administración de la composición seleccionado. La composición puede incluir otros excipientes farmacéuticamente aceptables para desarrollar formas farmacéuticas en polvo, líquidas o en suspensión. Véanse, p. ej. , Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vol. 2, 19a edición (1995), p. ej., el capítulo 95 Aerosols; y la publicación de patente internacional N.° W099/45966, cuyas enseñanzas se incorporan en el presente documento por referencia.

Las composiciones inmunógenas de la invención pueden incluir otros antígenos. Los antígenos pueden estar en forma de una preparación completa o parcial inactivada del microorganismo, o en forma de moleculas antigénicas obtenidas por téenicas recombinantes o de síntesis química. Otros antígenos apropiados para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen, pero sin limitación, los derivados de bacterias patógenas, tales como Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Bacillus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Mycoplasma bovis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, especies de Clostridial, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, especies de Chlamydia, especies de Brucella, especies de Vibrio, serotipos de Salmonella entérica y especies de Leptospira. Los antígenos también pueden provenir de hongos patógenos, tales como Candida, protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, especies de Eimeria, especies de Babesia, especies de Giardia, o helmintos tales como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, y Fasciola. Otros antígenos pueden incluir virus patógenos tales, como el coronavirus bovino, el los herpesvirus bovinos, el virus paragripal bovino, el virus respiratorio sincicial bovino, el virus de la leucosis bovina, el virus de la peste bovina, el virus de la fiebre aftosa y virus de la rabia.

En otras modalidades, la composición inmunógena puede comprender secuencias de aminoácidos de la presente invención purificadas, como se describe anteriormente, incluidas, sin limitaciones, las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16-20.

Formas, dosificaciones, vías de administración Las composiciones inmunógenas de la presente invención se pueden administrar a animales para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra los virus de la gripe C. En consecuencia, la presente invención proporciona procedimientos de estimulación de una respuesta inmunitaria eficaz contra los virus de la gripe C mediante la administración a un animal de una cantidad terapeuticamente eficaz de una composición inmunógena de la presente invención descrita en el presente documento.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención se pueden preparar con diversas formas, en función de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones inmunógenas se pueden preparar en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para usos inyectables, o se pueden preparar en formas liofilizadas usando téenicas de criodesecación. Normalmente, las composiciones inmunógenas liofilizadas se mantienen a aproximadamente 4 °C y se pueden reconstituir en una solución estabilizante, p. ej. , solución salina o HEPES, con o sin adyuvante. Las composiciones inmunógenas también se pueden preparar en forma de suspensiones o emulsiones.

Estas composiciones inmunógenas pueden contener aditivos adecuados para su administración por cualquier vía de administración convencional. Las composiciones inmunógenas de la invención se pueden preparar para su administración a sujetos, por ejemplo, en forma de líquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, cápsulas, comprimidos o cápsulas con recubrimiento entérico o supositorios. Por tanto, las composiciones inmunógenas pueden incluir también, pero sin limitación, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación mantenida o biodegradables. En una modalidad de una formulación para su administración parenteral, se proporciona el principio activo en forma seca (es decir, en polvo o granulado) para su reconstitución con un vehículo adecuado (p. ej., agua estéril sin pirógenos) antes de la administración por vía parenteral de la composición reconstituida. Otras formulaciones útiles que se pueden administrar por vía parenteral incluyen las que comprenden el principio activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica o como componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones de liberación mantenida o para implante pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble o una sal escasamente soluble.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus de la gripe C. Los virus purificados se pueden usar directamente en una composición inmunógena o se pueden atenuar adicionalmente o inactivar. Normalmente, una composición inmunógena contiene entre aproximadamente 1c102 y aproximadamente 1x1012 partículas víricas, o entre aproximadamente 1c103 y aproximadamente 1x1011 partículas víricas, o entre aproximadamente 1x104 y aproximadamente 1x1010 partículas víricas, o entre aproximadamente 1c105 y aproximadamente 1c109 partículas víricas, o entre aproximadamente 1c106 y aproximadamente 1c108 partículas víricas. Un experto en la téenica puede determinar la cantidad precisa de un virus en una composición inmunógena eficaz para proporcionar un efecto protector.

En general, las composiciones inmunógenas comprenden un vehículo veterinariamente aceptable en un volumen de entre aproximadamente 0.5 mi y aproximadamente 5 mi. En otro modo de realización, el volumen del vehículo está entre aproximadamente 1 mi y aproximadamente 4 mi, o entre aproximadamente 2 mi y aproximadamente 3 mi. En otro modo de realización, el volumen del vehículo es de aproximadamente 1 mi, o es de aproximadamente 2 mi, o es de aproximadamente 5 mi. Pueden ser vehículos veterinariamente aceptables adecuados para su uso en composiciones inmunógenas todos los descritos en el presente documento.

Estos vehículos incluyen, sin limitación, agua, solución salina, solución salina tamponada, tampón fosfato y soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas. Se pueden añadir otros diluyentes, adyuvantes y excipientes empleados convencionalmente de acuerdo con teenicas convencionales. Tales vehículos pueden incluir etanol, polioles y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales y ásteres orgánicos inyectables. También se pueden emplear tampones y agentes de ajuste del pH. Los tampones incluyen, sin limitación, sales preparadas a partir de un ácido o una base orgánicos. Los tampones representativos incluyen, sin limitación, sales de ácidos orgánicos, tales como sales de ácido cítrico, p. ej., citratos, ácido ascórbico, ácido glucónico, histidina-Hel, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, ácido itálico, Tris, clorhidrato de trimetilamina o tampones fosfato. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa, trehalosa, sacarosa, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en la dextrosa de Ringer, y similares. En los vehículos farmacéuticos también se pueden proporcionar conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antibióticos, antioxidantes, agentes quelantes (p. ej., EDTA), gases inertes y similares. La presente invención no queda limitada por la selección del vehículo. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables a partir de los componentes descritos anteriormente, con el pH, la isotonicidad, la estabilidad y otras características convencionales apropiadas, forma parte de los conocimientos de la teenica. Véanse, p. ej. , textos tales como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Lippincott Williams & Wilkins, pub., 2000; y The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a edición, eds. R. C. Rowe et al., APhA Publications, 2003.

Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente si es necesario atenuar o inactivar un virus antes de su administración. En otro modo de realización de la presente invención, se puede administrar directamente un virus de la gripe C a un animal sin atenuación adicional. La cantidad de un virus que es terapéuticamente eficaz puede variar en función del virus usado en particular, el estado del animal y/o el grado de infección, y la puede determinar un experto en la técnica.

De acuerdo con los procedimientos de la presente invención, se puede administrar a los animales una dosis individual o, de forma alternativa, pueden tener lugar dos o más inoculaciones con intervalos de desde aproximadamente dos hasta aproximadamente diez semanas. Pueden ser necesarios tratamientos de refuerzo y se puede ajustar la pauta posológica para proporcionar una inmunización óptima. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente la pauta posológica óptima.

Las composiciones inmunógenas se pueden administrar directamente en el torrente circulatorio, en el músculo o en las visceras. Los medios adecuados para administración parenteral incluyen intravenosos, intraarteriales, intraperitoneales, intratecales, intraventriculares, intrauretrales, intrasternales, intracraneales, intramusculares y subcutáneos. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores de aguja (incluidos los de microaguja), inyectores sin aguja y téenicas de infusión.

Normalmente, las formulaciones parenterales son soluciones acuosas que pueden contener excipientes tales como sales, hidratos de carbono y agentes tamponadores (preferentemente a un pH de desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 9, o desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8, o desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 7.5, o desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 7.5, o aproximadamente 7 a aproximadamente 7.5), pero, para algunas aplicaciones, se pueden formular más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma desecada para su uso junto con un vehículo adecuado, tal como agua sin pirógenos estéril. La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, por liofilización, se puede llevar a cabo fácilmente usando técnicas farmacéuticas ordinarias bien conocidas por los expertos en la técnica.

La solubilidad de los compuestos usados en la preparación de soluciones parenterales se puede aumentar mediante el uso de técnicas de formulación apropiadas conocidas por el experto en la técnica, tales como la incorporación de agentes potenciadores de la solubilidad, incluidos tampones, sales, tensioactivos, liposomas, ciclodextrinas y similares.

Las formulaciones para administración parenteral se pueden formular para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada. Por tanto, los compuestos de la invención se pueden formular como un sólido, un semisólido o un líquido tixotrópico para su administración como un depósito implantado, lo que permite la liberación modificada del compuesto activo. Los ejemplos de formulaciones de este tipo incluyen endoprótesis vasculares recubiertas de fármaco y microesferas de poli(ácido d/-láctico-co-glicólico) (PLGA).

Las composiciones inmunógenas de la presente invención tambien se pueden administrar por vía tópica en la piel o las mucosas (es decir, por vía dérmica o transdérmica). Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, cremas, pomadas, polvos espolvoreables, apósitos, espumas, películas, parches dérmicos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendajes y microemulsiones; también se pueden usar liposomas. Los vehículos típicos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina filante, glicerol, polietilenglicol y propilenglicol. Se pueden incorporar potenciadores de la penetración; véase, por ejemplo, Finnin y Morgan, J. Pharm Sci, 88 (10):955-958 (1999). Otros medios de administración por vía tópica incluyen la administración por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis y la inyección con microaguja o son aguja (p. ej., Powderject™, Bioject™, etc.). Las formulaciones para administración tópica se pueden diseñar para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.

Las composiciones inmunógenas tambien se pueden administrar por vía intranasal o por inhalación, normalmente en forma de polvo seco (bien solas o como una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lactosa o como partículas de componente mixto, por ejemplo, mezcladas con fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina), desde un inhalador de polvo seco o como una pulverización de aerosol desde un recipiente presurizado, una bomba, un pulverizador, un atomizador (preferentemente un atomizador que use la electrohidrodinámica para producir una niebla fina). También se puede administrar por medio de un nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado, tal como el 1,1,1,2-tetrafluoroetano o el 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano. Para uso intranasal, el polvo puede comprender un agente bioadhesivo, por ejemplo, quitosano o ciclodextrina. El recipiente presurizado, la bomba, el pulverizador, el atomizador o el nebulizador contiene una solución o suspensión del/de los compuesto(s) de la invención que comprende, por ejemplo, etanol, etanol acuoso o un agente alternativo adecuado para dispersar, solubilizar o prolongar la liberación del activo, un/unos propulsor(es) como disolvente(s) y un tensioactivo opcional, tal como trioleato de sorbitano, ácido oleico o un ácido oligoláctico.

Por lo general, antes de su uso en una formulación de polvo seco o suspensión se microniza el medicamento hasta un tamaño adecuado para su administración por inhalación (normalmente, menos de aproximadamente 5 micrómetros). Esto se puede lograr por cualquier procedimiento de trituración, tal como por molienda de chorro en espiral, molienda de chorro en lecho fluidizado, procesamiento de fluidos supercríticos (para formar nanopartículas), homogeneización a alta presión o secado por pulverización.

Se pueden formular cápsulas (fabricadas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), envases alveolados y cartuchos para su uso en un inhalador o en insufladores, que contengan una mezcla en polvo del compuesto de la invención. Una base en polvo adecuada podría ser la lactosa o el almidón, y un modificador del comportamiento podría ser la /-leucina, el manitol o el estearato de magnesio. La lactosa puede ser anhidra o estar en forma de monohidrato. Otros excipientes adecuados incluyen dextrano, glucosa, maltosa, sorbitol, xilitol, fructosa, sacarosa y trehalosa.

Una formulación de solución adecuada para su uso en un atomizador, con el uso de la electrohidrodinámica para producir una niebla fina, puede contener de desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 20 mg del compuesto de la invención por descarga y el volumen de descarga puede variar de desde aproximadamente 1 ml hasta aproximadamente 100 pl. En otro modo de realización, la cantidad de compuesto por descarga puede variar de desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 15 mg, o de desde aproximadamente 500 pg hasta aproximadamente 10 mg, o de desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 10 mg, o de desde aproximadamente 2.5 mg hasta aproximadamente 5 mg. En otro modo de realización, el volumen de descarga puede variar de desde aproximadamente 5 mI hasta aproximadamente 75 mI, o de desde aproximadamente 10 mI hasta aproximadamente 50 mI, o de desde aproximadamente 15 mI hasta aproximadamente 25 mI. Una formulación típica puede comprender el compuesto de la invención, propilenglicol, agua esteril, etanol y cloruro de sodio. Los disolventes alternativos que se pueden usar en lugar de propilenglicol incluyen el glicerol y el polietilenglicol.

Las formulaciones para administración inhalada/intranasal se pueden formular para que sean de liberación inmediata y/o modificada usando, por ejemplo, PLGA. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.

En el caso de inhaladores y aerosoles de polvo seco, por lo general, la unidad de dosificación se determina por medio de una válvula que suministra una cantidad medida. Normalmente, las unidades de acuerdo con la invención se configuran para administrar una dosis medida o "disparo" que contiene de desde aproximadamente 10 ng hasta aproximadamente 100 pg del compuesto de la invención. En otro modo de realización, la cantidad de compuesto administrada en una dosis medida es de desde aproximadamente 50 ng hasta aproximadamente 75 mg, o de desde aproximadamente 100 ng hasta aproximadamente 50 mg, o de desde aproximadamente 500 ng hasta aproximadamente 25 pg, o de desde aproximadamente 750 ng hasta aproximadamente 10 pg, o de desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 5 pg. Normalmente, la dosis diaria total estará en el intervalo de desde aproximadamente 1 pg hasta aproximadamente 100 mg, que se pueden administrar en una única dosis o, más habitualmente, como dosis divididas a lo largo del día. En otro modo de realización, la dosis diaria total puede variar de desde aproximadamente 50 pg hasta aproximadamente 75 mg, o de desde aproximadamente 100 pg hasta aproximadamente 50 mg, o de desde aproximadamente 500 pg hasta aproximadamente 25 mg, o de desde aproximadamente 750 pg hasta aproximadamente 10 mg, o de desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 5 mg.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención tambien se pueden administrar por vía oral o peroral (es decir, en el organismo del sujeto a través de o por medio de la boca), e implica que se tragan o se transportan a través de la mucosa oral (p. ej., absorción sublingual o bucal, o ambas). A las formulaciones de la invención destinadas a administración oral o peroral se les pueden añadir aromas adecuados, tales como el mentol y el levomentol, o edulcorantes, tales como la sacarina o la sacarina sódica.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención se pueden administrar por vía rectal o vaginal, por ejemplo, en forma de un supositorio, un óvulo vaginal o un enema. La manteca de cacao es una base tradicional para supositorios, pero se pueden usar diversas alternativas igual de apropiadas. Las formulaciones para administración rectal/vaginal se pueden formular para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.

La composiciones inmunógenas de la presente invención también se pueden administrar directamente en los ojos o los oídos, normalmente en forma de gotas de una suspensión micronizada o solución en solución salina estéril isotónica con el pH ajustado. Otras formulaciones adecuadas para la administración ocular y auricular incluyen pomadas, implantes biodegradables (p. ej. , esponjas de gel absorbióles, de colágeno) y no biodegradables (p. ej., de silicona), obleas, lentillas y sistemas particulados o vesiculares, tales como niosomas o liposomas. Se puede incorporar un polímero tal como poli(ácido acrílico) reticulado, poli(alcohol vinílico), ácido hialurónico, un polímero celulósico, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa o metil celulosa, o un polímero heteropolisacárido, por ejemplo, goma gelan, junto con un conservante, tal como cloruro de benzalconio. Las formulaciones de este tipo también se pueden administrar por iontoforesis. Las formulaciones para administración ocular/auricular se pueden formular para que sean de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, dirigida y programada.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención no quedan limitadas por la selección de los vehículos, adyuvantes u otros ingredientes convencionales fisiológicamente aceptables útiles en las preparaciones farmacéuticas de los tipos descritos anteriormente. La preparación de estas composiciones farmacéuticamente aceptables a partir de los componentes descritos anteriormente, con el pH, la isotonicidad, la estabilidad y otras características convencionales apropiadas, forma parte de los conocimientos de la téenica.

En general, la selección de la "cantidad eficaz" o dosificación apropiada para los componentes de las composiciones inmunógenas de la presente invención también se basará en la identidad del antígeno de la(s) composición/composiciones inmunógena(s) empleada(s), así como en el estado físico del sujeto, que incluye muy especialmente el estado general de salud, la edad y el peso del sujeto inmunizado. El procedimiento y las vías de administración, y la presencia de componentes adicionales en las composiciones inmunógenas también puede afectar a las dosificaciones y las cantidades de las composiciones. Esta selección, y el ajuste por aumento o disminución de la dosis eficaz, forman parte de los conocimientos de la técnica. La cantidad de composición necesaria para inducir una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta protectora, o para producir un efecto exógeno en el sujeto sin efectos secundarios adversos significativos, varía en función de estos factores. Los expertos en la téenica determinan con facilidad las dosis adecuadas.

De forma similar, un experto en la técnica puede seleccionar el orden de administración de la composición inmunógena y los periodos de tiempo entre las administraciones individuales basándose en las características físicas y las respuestas precisas del huésped frente a la aplicación del procedimiento. Se espera que esta optimización forme parte de los conocimientos de la técnica.

Las composiciones inmunógenas de la presente invención también se pueden usar en la preparación de un medicamento para tratar y/o evitar la infección por el virus de la gripe C en un animal.

Técnicas recombinantes En otras modalidades más de la invención, la composición inmunógena puede comprender una vacuna recombinante. En general, estas vacunas recombinantes comprenderían un vector y un inserto heterólogo que comprende un antígeno. Los insertos heterólogos de algunas modalidades comprenden una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos de la presente invención, como se describe anteriormente, p. ej. , las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16-20. Opcionalmente, el inserto puede comprender un promotor heterólogo, tal como, por ejemplo, promotores sintéticos conocidos en la técnica. De forma alternativa, los promotores del vector huésped pueden ejercer un control transcripcional sobre la expresión de los insertos. Los ejemplos no limitantes de promotores adecuados (que pueden ser nativos o heterólogos, en función de la elección del vector) son el promotor H6 variolovacunar, el promotor I3L variolovacunar, el promotor 42K poxvírico, el promotor 7.5K variolovacunar y el promotor Pi variolovacunar.

En otros puntos de la presente solicitud se han descrito vectores adecuados. En algunas modalidades, los vectores pueden ser vectores víricos, incluidos, sin limitaciones, vectores variolovacunares y poxvíricos, tales como los vectores de la paraviruela, la viruela del mapache, la viruela porcina y diferentes vectores de viruelas aviares (p. ej. , cepas de viruela del canario y difteria aviar). Las cepas víricas que se contemplan actualmente incluyen cepas D1701, ALVAC, TROVAC y NYVAC. En general, las secuencias que no son esenciales para el huésped vírico son sitios de inserción adecuados para los insertos de la presente invención. Las cepas mencionadas anteriormente están bien caracterizadas en la téenica y algunos sitios de inserción en estos vectores son bien conocidos. Véanse, p. ej., la patente de EE. UU. N.° 5,174,993, la patente de EE. UU. N.° 5,505,941, la patente de EE. UU. N. °: 5,766,599, la patente de EE. UU. N. 05,756,103, la patente de EE. UU. N.07,638,134, la patente de EE. UU. N.° 6,365,393.

Existen varios procedimientos o técnicas conocidos que se pueden usar para clonar y expresar las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden aislar las secuencias como fragmentos de restricción y clonarlas en vectores de clonación y/o expresión. Tambien se pueden amplificar las secuencias por PCR y clonarlas en vectores de clonación y/o expresión, o se pueden clonar por una combinación de estos dos procedimientos. En general, se pueden seguir téenicas estándar de biología molecular conocidas en la técnica, y no descritas específicamente, como las descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Spríng Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wilcy and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds.) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, vols. 1-4 Coid Spríng Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); y la metodología descrita en las patentes de EE. UU. N.° 4,666,828, 4,683,202, 4,801,531, 5,192,659 y 5,272,057. En general, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se lleva a cabo como se describe en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).

La presente invención engloba el uso de sistemas de expresión procariotas y eucariotas, incluidos vectores y células huésped, que se pueden usar para expresar formas tanto truncadas como de longitud completa de los polipéptidos recombinantes expresados por las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Para expresar los polipéptidos de la presente invención se pueden utilizar varios sistemas de vectores de expresión en huespedes. Tales sistemas de expresión en huéspedes también representan vehículos mediante los que las secuencias codificantes de interés se pueden clonar y purificar posteriormente. La presente invención proporciona además células huésped que, cuando se transforman o transfectan con el vector o la secuencia de nucleótidos apropiados, pueden expresar el producto génico codificado por el polipéptido de la invención. Estas células huésped incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli , B. subtilis ) transformadas con vectores de expresión recombinantes de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen secuencias codificantes; levaduras (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión en levaduras recombinantes que contienen las secuencias codificantes del producto génico; sistemas de células de insectos infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen las secuencias codificantes; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión víricos recombinantes (p. ej., el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; el virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes (p. ej., el plásmido Ti) que contiene secuencias codificantes; o sistemas de células de mamíferos (p. ej., COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (p. ej., el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío del adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la variolovacuna).

En general, los vectores de la invención puede derivar de, pero sin limitación, plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levaduras, de elementos cromosómicos de levaduras, de virus (p. ej., como se describe anteriormente), de cromosomas de mamíferos y de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos geneticos de plásmidos y bacteriófagos incluidos, pero sin limitación, cósmidos y fagémidos.

Los vectores de la presente invención se pueden usar para expresar polipéptidos. En general, los vectores de la invención incluyen regiones reguladoras que actúan en cis enlazadas de forma funcional al polinucleótido que codifica los polipéptidos que se quieren expresar. Las regiones reguladoras pueden ser constitutivas o inducibles. El huésped aporta factores que actúan en trans apropiados mediante un sistema de traducción ¡n vitro, por un vector complementario o mediante el propio vector tras introducirse en el huésped.

Los vectores de la invención pueden incluir cualquier elemento que se incluye normalmente en un vector de expresión o de presentación, incluidos, pero sin limitación, secuencias de orígenes de replicación, uno o más promotores, genes de resistencia a antibióticos, secuencias de péptidos líder o señal, secuencias de marcas diversas, secuencias de relleno que pueden codificar un gen cuyo polipéptido confiere resistencia a antibióticos, sitios de restricción, sitios de unión a ribosomas, potenciadores de la traducción (secuencias que pueden formar estructuras de tallo y lazo para la estabilidad del ARNm despues de la transcripción), secuencias que codifican aminoácidos que carecen de un codón de detención y secuencias que codifican un proteína de envuelta bacteriana.

Detección; Procedimientos de diagnóstico La presente invención proporciona procedimientos de diagnóstico de la infección por un virus C de la gripe bovina en un animal. Este diagnóstico se puede realizar por medio de cualquiera de diversos procedimientos de diagnóstico, incluidos, pero sin limitación, ELISA, transferencia de bandas Western, PCR, ensayos basados en ácidos nucleicos, incluidos análisis de transferencia de bandas de Southern o Northern, y secuenciación. De forma alternativa, se pueden emplear ensayos basados en proteínas. En los ensayos basados en proteínas, se pueden aislar del animal células o tejidos que se sospecha que están infectados. Se pueden preparar extractos celulares a partir de tales células o tejidos y se pueden someter, p. ej. , a transferencia de bandas Western, usando anticuerpos apropiados que pueden detectar claramente la presencia del virus.

El alcance y la naturaleza de las respuestas inmunitarias inducidas en el animal se pueden evaluar usando varias téenicas. Por ejemplo, se pueden tomar sueros de los animales inoculados y someterlos a pruebas para detectar la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para el virus, p. ej., en un ensayo convencional de neutralización de virus. Se puede lograr la detección de linfocitos T citotóxicos sensibles (LTC) en tejidos linfáticos mediante ensayos tales como la proliferación de linfocitos T, que es indicativa de la inducción de una respuesta inmunitaria celular. Las téenicas pertinentes están bien descritas en la técnica, p. ej., en Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wilcy & Sons Inc. (1994).

Kits Dado que puede ser deseable administrar una composición inmunógena de forma individual o en combinación con compuestos adicionales (por ejemplo, con el fin de tratar una enfermedad o afección en particular), está dentro del alcance de la presente invención que, por comodidad, se puede incluir o combinar una composición inmunógena en forma de un kit adecuado para la administración o la coadministración de las composiciones. Los kits de la presente invención pueden comprender una o más composiciones farmacéuticas independientes, al menos una de las cuales es una composición inmunógena de acuerdo con la presente invención, y un medio para mantener separadas dichas composiciones, tal como recipientes, un frasco dividido o un envase de lámina metálica dividido. Un ejemplo de un kit de este tipo es una jeringuilla y una aguja, y similares. Un kit de la presente invención es particularmente adecuado para administrar diferentes formas farmaceuticas, por ejemplo, orales o parenterales, para administrar las composiciones independientes a intervalos de dosificación diferentes, o para valorar las composiciones independientes una frente a la otra. Para ayudar a la administración de una composición de la presente invención, normalmente, el kit comprende instrucciones para la administración.

Otro kit de la presente invención puede comprender uno o más reactivos útiles para la detección de un virus de la gripe C. El kit puede incluir reactivos para analizar una muestra para detectar la presencia del virus de la gripe C completo o de polipéptidos, epítopos o secuencias polinucleotídicas del virus de la gripe C. En determinadas modalidades, los kits pueden incluir un juego de instrucciones impresas o una etiqueta que indica que el kit es útil para la detección de animales infectados con el virus de la gripe C.

Anticuerpo; Anticuerpos Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales o recombinantes. Los anticuerpos se pueden preparar contra el inmunógeno o contra una parte del mismo. Por ejemplo, se pueden aislar y usar como inmunógenos un péptido sintético basado en la secuencia de aminoácidos del inmunógeno o preparado de forma recombinante por téenicas de clonación, o el producto génico natural y/o partes del mismo. Se pueden usar inmunógenos para producir anticuerpos mediante teenología estándar de producción de anticuerpos bien conocida por los expertos en la tecnica, tal como la descrita de forma general en Harlow y Lañe, "Antibodies: A Laboratory Manual", Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY, (1988), y Borrebaeck, "Antibody Engineering - A Practical Guide", W.H. Freeman and Co. (1992). También se pueden preparar fragmentos de anticuerpo a partir de los anticuerpos, e incluyen fragmentos Fab, F(ab')2 y Fv, por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Los ejemplos no limitantes de inmunógenos adecuados incluyen proteínas o fragmentos de proteínas del virus C de la gripe bovina, tales como, p. ej., las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16-20.

En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo de la invención proporciona además una inmunoglobulina intacta que puede unirse específicamente a un objetivo, tal como un hidrato de carbono, un polinucleótido, un lípido, un polipéptido, etc., a través de al menos un sitio de reconocimiento de antígeno situado en la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Un anticuerpo intacto tiene dos cadenas ligeras y dos pesadas. Por tanto, un único anticuerpo intacto puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo sintético, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo heteroquimérico.

En la producción de anticuerpos, se puede llevar a cabo la selección del anticuerpo deseado por procedimientos estándar en inmunología conocidos en la técnica. Por lo general, se siguen técnicas no descritas específicamente como las de Stites, et al. (eds.), "Basic and Clinlcal Immunology" (8a edición), Appleton and Lange, Norwalk, CT (1994), y en Mishell y Shiigi (eds.), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., Nueva York (1980). En general, los ELISA y las transferencias de bandas Western son los tipos de inmunoensayo preferentes; ambos ensayos son bien conocidos por los expertos en la téenica. En los ensayos se pueden usar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Como es bien sabido en la técnica, se puede unir el anticuerpo a un sustrato de soporte sólido o conjugarlo con un resto detectable, o unirlo y conjugarlo. (Para un análisis general de la conjugación de restos fluorescentes o enzimáticos, véase Johnstone y Thorpe, "Immunochemistry in Practice", Blackwell Scientific Publications, Oxford (1982).) La unión de anticuerpos a un sustrato de soporte sólido también es bien conocida en la técnica. (Para un análisis general, véanse Harlow y Lañe (1988) y Borrebaeck (1992).) Los restos detectables que se contemplan para su uso en la presente invención pueden incluir, pero sin limitación, marcadores fluorescentes, metálicos, enzimáticos y radioactivos tales como biotina, oro, ferritina, fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, peroxidasa, ureasa, fluoresceína, rodamina, tritio, 14C y yodación.

La presente invención se ilustra adicionalmente, pero en modo alguno se limita, mediante los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Aislamiento de virus Para el aislamiento del virus se usó un conjunto de hisopos nasales de un caso de enfermedad respiratoria bovina. El aislamiento primario del virus se realizó en celulas HRT-18G. El paso posterior en células HRT-18G dio lugar a una preparación mayor con un mayor valor cuantitativo de virus (~ 1x108 TCID50/ml), que se usó en estudios posteriores. No se observó efecto citopático (CPE) en las células HRT-18G infectadas; sin embargo, se observó la presencia ocasional de células gigantes, lo que indica una fusión celular inducida por el virus. La presencia de virus se confirmó por tinción de anticuerpos inmunofluorescentes indirectos (AIF), usando sueros agrupados de terneros convalecientes como fuente del anticuerpo primario, seguido de anticuerpo secundario anti bovino conjugado con FITC. Inicialmente, se identificó el virus como aislado n.° 14. No se identificaron patógenos víricos exógenos de origen bovino en los fluidos del cultivo.

EJEMPLO 2 Sensibilidad de diversos tipos celulares Se evaluó la sensibilidad de varias estirpes celulares al virus aislado. Tambien se realizaron valoraciones del virus en los fluidos de cultivo recogidos de diversas infecciones celulares productivas. En general, no se observó ECP, excepto en las células NLST (de testículo de cerdo).

TABLA 1 Estirpes celulares sometidas a pruebas de proliferación celular y rendimientos No parece que el tratamiento con tripsina fuera necesario para la propagación del virus. Asimismo, despues de realizar investigaciones adicionales, se llegó a la conclusión de que, a pesar de que el virus infectaba algunas estirpes celulares, no era una infección productiva (en ocasiones se denomina "infección fracasada"). Las células HRT-18G, NLST, MA-104 y BK-6 se infectaron de forma productiva y las células HRT-18G y BK-6 proporcionaron los mayores valores cuantitativos.

EJEMPLO 3 Ensayo de hemaqlutinación Se realizó una prueba de hemaglutinación (HA) estándar, con glóbulos rojos de un gallo, así como de una cobaya. Los resultados (no mostrados) indicaron que el virus bovino era positivo para la HA y que proporcionaba mayores valores cuantitativos en la prueba de HA.

EJEMPLO 4 Microscopía electrónica Se aclararon los fluidos de cultivo celular que contenían el virus y se concentró el virus. Se sometió el virus sedimentado a tinción con fosfovolframato de sodio. Después de este tratamiento, se observó la preparación al microscopio electrónico. Las imágenes del virus con tinción negativa mostraron partículas víricas polimórficas con envuelta y púas, de ~100 nm de diámetro (fig. 1).

EJEMPLO 5 Amplificación de un gen de polimerasa por RT-PCR Se aisló ARN total a partir de los fluidos de cultivo infectados con el virus usando un Viral RNA Mini Kit (Qiagen; Valencia, CA). Se sintetizó un par de cebadores universales, diseñados para amplificar un paramixovirus: Par F1 (GAA GGI TAT TGT CAI AAR NTN TGG AC) y Par R (GCT GAA GTT ACI GGI TCI CCD ATR TTN C). Para configurar las reacciones de RT-PCR se usó el sistema de RT-PCR en una etapa SuperScript® III con la Taq Platinum® (Life Technologies; Grand Island, NY), siendo la única variación el uso de una temperatura de alineación más baja (44 °C). Se generó como producto de PCR un fragmento de 448 nt, se separó en un E-gel (Life Technologies) y se extrajo de la agarosa para secuenciarlo. Se usaron como cebadores de secuenciación los cebadores Par F1 y Par R. Se tradujo la secuencia de ADN obtenida y se usó como secuencia de consulta para buscar secuencias relacionadas en GenBank. El acierto con mayor identidad proteínica (el 57 %) fue una proteína polimerasa básica (PB2) del virus de la gripe C humano.

EJEMPLO 6 Determinación de la secuencia del virus Se recogieron los fluidos de cultivo celular, se aclararon y se concentró el virus por ultracentrifugación. Se extrajo el ARN vírico usando un Viral RNA Mini Kit (Qiagen). Se realizó un control de calidad en dos muestra de ARN (ARN-1; ARN-2) usando espectroscopia NanoDrop (Thermo Scientific; Wilmington, DE). Se empleó teenología de secuenciación de lllumina (San Diego, CA). Se usaron muestras de ARN (de 10.5 pl) para preparar la colección. Se fragmentó el ARN y se construyeron colecciones de ADNc a partir del ARN usando el TruSeq ARNm Sample Prep Kit (lllumina). A las colecciones se les asignaron códigos de barras usando los adaptadores estándar de lllumina. Las colecciones finales resultantes se purificaron y se seleccionaron en función del tamaño usando perlas Agencort AMpure XP (Beckman Coulter: Beverly, MA) y electroforesis en gel de agarosa. Se determinó que las colecciones de muestras duplicadas tenían un tamaño de fragmento promedio de 280 pb. Las colecciones se cuantificaron usando el Library Quantification Kit de KAPA (Kapa Biosystems; Woburn, MA).

Se realizó una evaluación extensa por qPCR con el fin de medir con precisión las cantidades de ADN de entrada, con el fin de facilitar la generación de conglomerados óptimos durante ciclos progresivos de amplificación térmica en la plataforma cBOT (lllumina). Con el fin de generar conglomerados de ADN en el cBOT, se agruparon las colecciones y se cargaron a diferentes concentraciones, que variaban entre 4 y 8 pmol, junto con los reactivos del cBOT Paired-End Cluster Generation Kit (lllumina). Se inmovilizaron las plantillas de secuenciación sobre una superficie de cubeta de lectura propiedad de los inventores y se cargaron las muestras en el analizador de genomas de lllumina para generar lecturas finales pareadas de 150 bases (2 x 150 pb por ciclo). Un ciclo satisfactorio generó densidades del orden de diez millones de conglomerados de moleculas individuales para cada muestra. Con el uso de Bowtie 2 (Langmead y Salzberg; Nature Methods, 9:357-359, 2012), se identificaron y retiraron las lecturas de mapeo del genoma humano. El 13 % de las lecturas del ARN-1 y el 11 % de las lecturas del ARN-2 correspondían al mapeo del genoma humano. Después del filtrado, quedaron 4.6 millones de lecturas para el ARN-1 y 1.9 millones de lecturas para el ARN-2. Con un tamaño del genoma esperado de 15 - 20 kb, esto cubre 21 ,000X - 28,000X para el ARN-1 y 9,000X - 11 ,000X para el ARN-2.

Se ensamblaron las lecturas en cóntigos usando ABySS (Simpson et al., Genome Res., 19:1117-1123, 2009). Para el ARN-1 , se generaron 10 cóntigos con un tamaño total de 13.8 kb. Para el ARN-2, se generaron 16 cóntigos con un tamaño total de 14.7 kb. Estos cóntigos se anotaron usando BlastX (Altschul et al., J Mol Biol. , 215(3):403-410, 1990), realizando una búsqueda en la base de datos de proteínas no redundantes de GenBank. Los cóntigos más grandes tenían una homología sólida con 9 proteínas del virus de la gripe C humano. El virus de la gripe C humano es un virus de ARN segmentado de sentido negativo. Su genoma contiene siete segmentos de ARN que codifican las siguientes proteínas (enumeradas en orden decreciente de PM): las polimerasas víricas PB2, PB1 y PA; la neuraminidasa de hemaglutinina (HE), la proteína de la nucleocápside (N), de la matriz (M) y la proteína no estructural NS1.

TABLA 2 Cóntiqos v su comparación de identidad con el virus de la gripe C humano EJEMPLO 7 Determinación de fragmentos conservados del genoma de la gripe C bovina Dado que, en general, las secuencias conservadas tienen importancia funcional, se realizaron búsquedas adicionales con Blast para determinar la singularidad de fragmentos más cortos del genoma del la gripe C bovina que están conservados entre los virus C de la gripe bovina y humano. Se usaron como ejemplos representativos la proteína M y la proteína HA.

TABLA 3 Configuración de BLAST Sorprendentemente, usando la configuración de BLAST descrita en la tabla 5, los solicitantes han descubierto que los aminoácidos 145-181 de la proteína M del virus C de la gripe bovina (SEQ ID NO: 17) eran el 67 % identicos y el 92 % similares (33/36 positivos) a los de la cepa Saitama del virus de la gripe C humano (C/Saitama/2/2000). La identidad y el valor de las coincidencias positivas con todas las demás secuencias de ácidos nucleicos era igual o incluso menor. Las demás regiones no solapantes del virus C de la gripe bovina presentaban incluso menos coincidencias positivas que cualquier secuencia de la base de datos.

Cuando los solicitantes analizaron la proteína HE (SEQ ID NO: 10), descubrieron que dos regiones de aminoácidos, los aminoácidos 58-136 (SEQ ID NO: 18) y los aminoácidos 539-598 (SEQ ID NO: 19) presentaban muchas coincidencias positivas con la cepa Ann Arbor del virus de la gripe C humano (C/Ann Arbor/1/50). Sorprendentemente, al analizar cada una de estas secuencias por separado, se descubrió que cada una de ellas era única: La SEQ ID NO: 18 era el 78 % idéntica y tenía el 84 % de coincidencias positivas (66/79 positivos (84 %)) con la cepa Milán del virus de la gripe C humano (C/Milan/1101/2009). La SEQ ID NO: 19 era el 63 % idéntica y tenía el 85 % de coincidencias positivas (51/60 positivos (85 %)) con la cepa Alberta de la gripe C humana (C/Alberta/3502/2011). Aún más sorprendentemente, la SEQ ID NO: 20 (aminoácidos 36 - 79 de la SEQ ID NO: 18) era el 93.1 % (41/44) idéntica a la cepa Milán del virus de la gripe C humano (C/Milan/1101/2009).

EJEMPLO 8 Estudios en animales Estudio en terneros n.° 1. A un ternero de 3 días de edad nacido por cesárea se le inocularon por vía intranasal 10 mi de fluidos de cultivo vírico aclarados. Despues de la exposición, se tomaron a diario hisopos nasales y fecales y se registraron las observaciones clínicas. Posteriormente, se realizaron los aislamientos del virus en los hisopos nasales y fecales, usando células HRT-18G. También se realizaron aislamientos de virus en diversas muestras de tejido pulmonar. Se aisló el virus C de la gripe bovina a partir de hisopos nasales desde el día 1 del estudio hasta el día 7, y también se aisló a partir de muestras de pulmón (tabla 4). Sin embargo, no se aisló el virus a partir de los hisopos fecales.

TABLA 4 Resultados del aislamiento del virus C de la gripe bovina del estudio en terneros no. 1 No se observaron síntomas clínicos después de la inoculación de los terneros con fluidos de cultivo aclarados. En las autopsias no se identificaron cambios patológicos macroscópicos. La evaluación histopatológica indicó que los pulmones presentaban una neumonía intersticial leve, congruente con la infección vírica. No obstante, no cabría esperar que estas lesiones leves se apreciaran a simple vista.

Estudio en terneros no. 2. A un ternero de 3 días de edad nacido por cesárea se le inocularon por administración intranasal 10 mi de muestras agrupadas aclaradas (hisopos nasales y homogeneizados pulmonares) tomadas del ternero del estudio n.° 1. Después de la exposición, se tomaron a diario hisopos nasales y fecales y se registraron las observaciones clínicas. Posteriormente, se realizaron los aislamientos del virus en los hisopos nasales y fecales, usando células HRT-18G. También se realizaron aislamientos de virus en diversas muestras de tejido pulmonar. Se aisló el virus C de la gripe bovina a partir de hisopos nasales desde el día 1 del estudio hasta el día 6, así como a partir de muestras de pulmón (tabla 5). De nuevo, no se aislaron virus a partir de los hisopos fecales.

TABLA 5 Resultados del aislamiento del virus C de la gripe bovina del estudio en terneros no. 2.

ND= No Determinado No se observaron síntomas clínicos después de la inoculación del ternero con muestras agrupadas del estudio anterior. En las autopsias no se identificaron cambios patológicos macroscópicos. Las muestras de pulmón presentaban neumonía broncointersticial multifocal de leve a moderada, con cuerpos de inclusión de esosinófilos intracitoplásmicos intralesionales y algunas celulas sinciciales.

EJEMPLO 9 Estudio seroepidemiolóqico Se evaluaron muestras de suero de diversas manadas/ubicaciones para determinar la presencia de anticuerpos frente al virus C de la gripe bovina, usando un ensayo de anticuerpo fluorescente directo (AF). Se infectaron células HRT-18G con el virus y, después de la incubación, se fijaron en acetona al 80 %. Se diluyeron muestras de suero en PBS, comenzando a 1:40, seguido por diluciones de 4 veces seriadas. Se añadieron las muestras de suero diluidas a los pocilios de células fijadas y se incubaron durante 40 - 60 minutos. Después de varios lavados, se les añadió anticuerpo de cabra anti-bovino conjugado con FITC y se incubaron durante 30 minutos. Se lavaron las placas y se lcyeron con una fuente de luz UV. Se comunicaron los valores cuantitativos como el recíproco de la mayor dilución que resultó positiva para el AF. A continuación se enumeran los resultados de diversos rebaños de los que se tomaron muestras: Rebaño C-1. Se probaron 182 muestras de suero (recogidas en el verano de 2011); 85 presentaron valores cuantitativos mayores que o ¡guales a 40. La prevalencia de anticuerpos anti-virus C de la gripe bovina fue del 47.8 %. Veinte muestras positivas presentaron valores cuantitativos de 2560, lo que indica una infección activa.

Rebaño C-2. Se tomaron 339 muestras de suero del mismo rebaño (C-1), pero 2-3 mese antes. Veinticuatro de 160 muestras (el 15 %) fueron positivas mediante AF. De estas muestras positivas, 2 presentaron valores cuantitativos de 2560, lo que indica una infección activa.

Rebaño D. Se recogieron 173 muestras de suero de bovino; 4 (el 2.3 %) presentaron valores cuantitativos de anticuerpos de 80 - 320 frente al virus C de la gripe bovina, lo que apunta a que el anticuerpo puede ser de origen materno y que, probablemente, estos terneros en edad de destete no habían estado expuestos al virus.

Rebaño X. Se recogieron 72 muestras de suero de terneros en una granja de investigación; 11 (el 15.2 %) tenían valores cuantitativos de AF mayores de 640, con una excepción (valor cuantitativo de AF de 160).

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un virus C de la gripe bovina aislado.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque dicho virus está vivo, inactivado o atenuado.

3. Una composición que comprende un virus de la gripe C aislado, en la que dicho virus comprende al menos uno de los siguientes segmentos genicos un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 52 % de identidad con la SEQ ID NO: 4; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 72 % de identidad con la SEQ ID NO: 6; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 8; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 54 % de identidad con la SEQ ID NO: 10; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 40 % de identidad con la SEQ ID NO: 12; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 36 % de identidad con la SEQ ID NO: 14; y un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 33 % de identidad con la SEQ ID NO: 16.

4. Una composición que comprende un ácido nucleico aislado que comprende uno o más de los ácidos nucleicos: un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 52 % de identidad con la SEQ ID NO: 4; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 72 % de identidad con la SEQ ID NO: 6; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 8; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 54 % de identidad con la SEQ ID NO: 10; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 40 % de identidad con la SEQ ID NO: 12; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 36 % de identidad con la SEQ ID NO: 14; y un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 33 % de identidad con la SEQ ID NO: 16, en donde la SEQ ID NO:4 codifica una proteína "PB2" de la gripe C; la SEQ ID NO:6 codifica una proteína "PB1" de la gripe C; la SEQ ID NO: 8 codifica una proteína "PA" de la gripe; la SEQ ID NO: 10 codifica una proteína "HE" de la gripe C; la SEQ ID NO: 12 codifica una proteína "N" de la gripe C; la SEQ ID NO:14 codifica una proteína "M" de la gripe C; y la SEQ ID NO:16 codifica una proteína "NS1" de la gripe C.

5. La composición de conformidad con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizada además porque comprende uno o más de los siguientes segmentos genicos: un ácido nucleico que codifica la proteína PB2 de la gripe C de SEQ ID NO: 4; un ácido nucleico que codifica la proteína PB1 de SEQ ID NO: 8; un ácido nucleico que codifica la proteína HE de SEQ ID NO: 10; un ácido nucleico que codifica la proteína N de SEQ ID NO: 12; un ácido nucleico que codifica la proteína M de SEQ ID NO: 14 y un ácido nucleico que codifica la proteína NS1 de SEQ ID NO: 16.

6. Una composición que comprende uno o más polipeptidos aislados seleccionados del grupo que consiste en: la proteína PB2 de la gripe C de SEQ ID NO: 4; la proteína PB1 de SEQ ID NO: 8; la proteína HE de SEQ ID NO: 10; la proteína N de SEQ ID NO: 12; la proteína M de SEQ ID NO:14 y la proteína NS1 de SEQ ID NO: 16.

7. Una composición que comprende uno o más de los polipéptidos aislados seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16.

8. Una composición inmunógena seleccionada de entre las composiciones descritas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque comprende adicionalmente un adyuvante.

10. Un vector de expresión que comprende uno o más polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 52 % de identidad con la SEQ ID NO: 4; un ácido nucleico que tiene más del 72 % de identidad con la SEQ ID NO: 6; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 50 % de identidad con la SEQ ID NO: 8; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 54 % de identidad con la SEQ ID NO: 10; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 36 % de identidad con la SEQ ID NO: 12; un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 36 % de identidad con la SEQ ID NO: 14; y un ácido nucleico que codifica una proteína que tiene más del 33 % de identidad con la SEQ ID NO: 16.

11. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque comprende una o más de las SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15.

12. Una celula huésped que comprende el vector de las reivindicaciones 10 u 11.

13. Una célula huésped que comprende un virus C de la gripe bovina.

14. Una composición inmunógena que comprende el virus C de la gripe bovina aislado de las reivindicaciones 1 ó 2.

15. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque comprende adicionalmente un adyuvante y/o un excipiente o un vehículo farmacéuticamente aceptables.

16. La composición inmunógena de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque dicho virus está inactivado, vivo o atenuado.

17. El uso de la composición inmunógena de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 14 a 16 para la elaboración de un medicamento para tratamiento o protección de un animal frente a una enfermedad provocada por un virus de la gripe C.

18. Un método de detección de la exposición de un animal al virus de la gripe C que comprende determinar la presencia de una cualquiera o más de las SEQ ID NO: 4 a 16 en una muestra del animal.

19. Un anticuerpo que se une específicamente al virus aislado de las reivindicaciones 1 ó 2.

20. Un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo de un polipeptido seleccionado de entre los polipéptidos de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16 a 20.

21. Un kit para detectar un virus C de la gripe bovina, el kit comprende un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo específico para el virus C de la gripe bovina y medios para detectar el anticuerpo.

22. Un kit para detectar un virus de la gripe, el kit comprende un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 a 20 y medios para detectar el anticuerpo.

23. Un kit para detectar un virus de la gripe, el kit comprende un ácido nucleico que híbrida uno o más de los ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 y 15.

24. Una composición inmunógena de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 14 a 16 para usarse en el tratamiento o protección de un animal contra la enfermedad causada por un virus de la gripe C.