JP4673974B2 - アジュバントとしての変異コレラホロトキシン - Google Patents
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Description
(技術分野)
発明の分野
本発明は、選択された抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強するためのアジュバントとしての、野生型コレラトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ、免疫原性変異コレラホロトキシンの使用に関する。
【0002】
発明の背景
免疫系は、病原体を攻撃するために種々のメカニズムを使用する。しかしながら、これらのメカニズムのすべてが、免疫感作後に必ずしも活性化はされない。免疫感作によって誘導される防御免疫は、病原体に抵抗するか、またはそれを除去するための適当な免疫応答を誘起するワクチンの能力に依存する。病原体に応じて、これは、細胞媒介性および/または体液性免疫応答を要求するであろう。
【0003】
免疫原もしくは抗原と一緒に投与される場合免疫応答を増強する物質は、アジュバントとして知られている。
【0004】
グラム陰性細菌ビブリオ・コレレ(Vibrio cholerae)は、胃腸疾患コレラの病原因子である。V.コレレによって引き起こされる下痢は、コレラトキシン(CT)の分泌による。
【0005】
CTは、トキシンの酵素活性に関与する1個の単一Aサブユニット(CT−A)、そして腸上皮細胞、ならびに細胞の表面にガングリオシドGM1を含有する他の細胞へのトキシンの結合に係わる5個の同一Bサブユニット(CT−B)を含有する。共同して、CT−AおよびCT−Bサブユニットは、ホロトキシンを含有する。CTの配列は、既に記述されている(文献1)。
【0006】
CTaは、1個のAポリペプチドおよび5個の同一Bポリペプチドからなるヘキサヘテロマー複合体である(2)。Bペンタマーは、細胞表面レセプターガングリオシドGM1への結合に必要とされる(3)。Aサブユニットは、C187およびC199間に単一のジスルフィド結合されたループ内でタンパク質分解的に開裂されて、酵素的に活性なA1ポリペプチド(4)およびより小さいポリペプチドA2を生成することができ、これはBペンタマーにフラグメントA1を結合する(5)。腸細胞(enterocyte)内へ入ることによって、CT−A1は、調節Gタンパク質(Gsα)をADP−リボシル化し、これが、アデニル酸シクラーゼの構成的活性化、cAMPの細胞内濃度の増加、そして小腸の管腔内へ液および電解質の分泌をもたらす(6)。イン・ビトロの、CTのADP−リボシルトランスフェラーゼ活性は、ARFと呼ばれる補助タンパク質(7)、真核生物内の小胞伝達に関与しているGTP結合タンパク質、の存在によって刺激される。
【0007】
効果的な免疫感作操作の必要性は、胃腸、肺、鼻咽頭もしくは性尿器に急性感染症を惹起したり、またそれらを通して体内へ入り込む感染性生物に関して特に大きい。これらの場所は粘液に浸されていて、大部分が分泌IgAからなる免疫グロブリンを含有する(8,9,10)。この抗体は、これらの粘膜下にある固有層領域に浸潤している多数のIgA産生形質細胞に由来する(11,12)。IgAは、特に、分泌成分の作用をとおして管腔表面に輸送される(13)。 しかしながら、非経口的免疫感作養生は、分泌IgA応答を誘導するには、通常は効果的ではない。分泌免疫は、ほとんどが、粘膜に関連するリンパ組織の直接免疫感作を介して達成される。1つの粘膜部位におけるそれらの誘導に続いて、IgA産生形質細胞の前駆体が、高率のIgA合成への最終分化が起きる多様な粘膜組織まで溢出し、播種する(14,15,16)。広範な研究が、この共通する粘膜性免疫系を誘導するための粘膜免疫感作の可能性を例証した(17)、しかし、わずかな例外はあるが、効果的な免疫感作を達成するために求められる大用量の抗原が、精製ワクチン抗原に関してこのアプローチを実際的ではないものにした。CTは、もっとも有力なアジュバントの1つであり、そして無関係な抗原とCTの同時投与が、その抗原に対して同時に起こる循環性および粘膜性抗体応答の誘導をもたらすことが知られている(18)。かくして、CTはアジュバントとして働くことができる。
【0008】
野生型CTによって惹起される下痢という望ましくない症候を減退するために、低下された毒性をもつCTホロトキシンの形態をアジュバントとして使用することは好ましいことであろう。かくして、CTホロトキシンの毒性を低下しつつも免疫応答を増強することができる変異CTホロトキシンを同定するニーズが存在する。
【0009】
発明の概要
したがって、本発明の目的は、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原に対して脊椎動物宿主における免疫応答を増強する抗原組成物において、アジュバントとして野生型CTに比較して低下された毒性をもつ変異形態のCTホロトキシンを利用することである。
【0010】
本発明のこれらの目的は、グルタミン酸残基が、アスパラギン酸以外のアミノ酸によって置換されている、Aサブユニットのアミノ酸29にける点変異を特徴とする変異コレラホロトキシンを用いて達成される。本発明の特定の実施態様では、アミノ酸29はヒスチジンである。変異されたCT(また、CT−CRMと言及される)は、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強するために、抗原組成物においてアジュバントとして有用である。変異CTは、慣用の技術を用いて、野生型CTをコードしているDNAの部位特異的変異誘発によって作成される。抗原組成物は、希釈剤もしくはキャリヤーをさらに含有してもよい。
【0011】
また、本発明は、ホロトキシンが、野生型CTに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのAサブユニットのアミノ酸位置29のグルタミン酸が、アスパラギン酸以外のアミノ酸、特にヒスチジンによって置換されている、有効なアジュバント量の変異コレラホロトキシンを含むことによって、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強する方法に対向される。
【0012】
さらに、本発明は、コレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ免疫原性変異コレラホロトキシンをコードしているDNA配列を含み、そしてそのようなDNA配列がアラビノース誘導プロモーターに操作可能に結合されている単離、精製されたDNA配列を含有するプラスミド、ならびにそのようなプラスミドにより形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションされた適当な宿主細胞に関する。免疫原性変異コレラホロトキシンは、上記プラスミドにより宿主細胞を形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションし、そして宿主細胞による該組み換え免疫原性解毒化タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって生産される。
【0013】
発明の詳細な記述
抗原組成物のためのアジュバントとして変異形態の利用が、本明細書において記述される。大腸菌(E.coli)において変異CTクローン(CT−CRM)のセットが生成された。データは、より優れたアジュバント性をもつCT−CRMが、Aサブユニットにおける位置29に非保存アミノ酸置換(グルタミン酸からヒスチジンへ)をもつ変異体(CT−CRME29H)であることを示している。累積データは、CT−CRME29Hがホロトキシンであり、そして野生型CTより低い毒性であることを例証する。重要なことには、CT−CRME29Hは、全く異なるワクチン抗原の胃内(IG)もしくは鼻内(IN)いずれかの投与に続いて、粘膜性および全身性免疫応答を増大することができる。これらのワクチン抗原は、いずれか細菌もしくはウイルス病原体に由来する。ヘリコバクター・フェリス(Hericobacter felis)、ロタウイルスおよび呼吸シンシチアルウイルス(RSV)感染のマウスモデルにおける結果は、CT−CRME29Hで調製されたワクチンによる胃内もしくは鼻内免疫によって助長される免疫応答は防御的であることを示している。データは、CT−CRME29Hが、野生型CTと少なくとも同様にアジュバントとして活性があることを示している。前以て存在する抗CT免疫応答の存在においてさえも、CT−CRME29Hは、粘膜アジュバントとして役立つことができる。
【0014】
変異CT−Aは、CT−Bと集合して、そのアジュバント性において野生型CTに類似するホロトキシンを形成する能力を保持していたが、野生型CTに比較して低下された毒性を示した。Bサブユニットは、それらの本来の配列をもっていても、またそれ自体変異されていてもよい。
【0015】
得られる低下されたレベルの毒性は、アジュバントとしての使用のための改変されたCTを提供する。本発明による免疫原性変異CTは、抗原組成物により免疫される脊椎動物宿主よって安全に許容される一方、そのタンパク質がアジュバントとして機能するように、低下された毒性と保持されるアジュバント性のバランスを発揮する。
【0016】
本発明の抗原組成物は、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原、およびCTが、野生型CTに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸が、アスパラギン酸以外のアミノ酸によって置換されている変異CTの有効なアジュバント量を含んでなる抗原組成物の投与後、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞媒介免疫応答を改良することによって免疫応答を調節する。本発明の特に好適な実施態様では、アミノ酸29はヒスチジンである。
【0017】
本明細書に使用されるように、用語「ホロトキシンは低下された毒性をもつ」は、CT−CRM変異体、例えばCT−CRME29Hが、野生型CTに比較して、精製トキシンタンパク質の1単位当たり実質的に低い毒性を示すことを意味し、このことは、その変異体を、有意な副作用を惹起することなく抗原組成物においてアジュバントとして使用することを可能にする。
【0018】
本明細書に使用されるように、用語「有効なアジュバント量」は、脊椎動物宿主において増強された免疫応答を誘起するのに適当である、CT−CRM変異体、例えばCT−CRME29Hの用量を意味する。特定の用量は、年令、体重および宿主の医療条件、ならびに投与方法に依存するであろう。適当な用量は、当業者によって容易に決定される。
【0019】
5種のCT−CRMが、Aサブユニットにおける次の変異により、以下の実施例1に記述されるように作成された:
【0020】
【表1】
【0021】
CTの構造および機能に及ぼすこれらの変異の表現型効果が、次に調査された。
【0022】
変異体CT−AのR7K,E29H,E110DおよびE112Dは、ガングリオシドGM1結合アッセイによって決定されるように、免疫反応性ホロトキシンに組み立てることができる(図1)。しかしながら、精製R11Kの一部分は、実施例2において記述されるポリクローナル抗体により試験された場合、ホロトキシンではないように見えた。
【0023】
各ホロトキシン変異体は、Y−1副腎腫瘍細胞アッセイ(19)において試験されて、野生型CTホロトキシンに比較されるその残存毒性を決定された。表2に提示される結果は、CT−CRME29Hおよび市販のCT−B(Sigma)が、1.2%の残存毒性をもつことを例証した。市販のCT−Bに伴う1.2%の残存毒性は、混入しているAサブユニット(約0.5%)によることがもっとも考えられる。アミノ酸位置7,11,110もしくは112に変異をもつ残りのCT−CRMの残存毒性は、0.4%未満もしくは同等であった。
【0024】
CT−CRME29Hは、毒性のイン・ビボ測定として腸管液滞留を評価する開出マウス消化管重量アッセイ(20)において試験された。表3に提示される結果は、CT−CRME29Hが、野生型CTよりもマウスの腸管中への液滞留における増加を刺激することにおいて有意に低い活性があることを例証した。
【0025】
また、各CT−CRMは、ADP−リボシルトランスフェラーゼ活性アッセイにおいてCTに比較された。結果は、一般に、Y−1副腎細胞アッセイにおいて得られたものと一致し、そしてA1サブユニットにおける変異は、野生型CTに比較された場合、種々のCT−CRMによって減少されたADP−リボシルトランスフェラーゼ活性をもたらすことを示唆した(表4)。最大の酵素活性をもつ変異体は、CT−CRME29Hであると考えられる。この活性は、野生型CTの約10%であった。
【0026】
CT−CRME29Hの37℃におけるトリプシン消化は、ウエスタンブロット解析に基づいて、野生型CTの処理とは区別できない様式でフラグメントA1およびA2へのCT−Aの開裂を惹起した。これは、CT−CRME29Hの構造が、野生型CTのそれに類似している証拠をさらに提供する。
【0027】
Y−1副腎腫瘍細胞およびADP−リボシル化活性アッセイにおけるCT−CRME29Hの活性の明らかな差異は、後者のアッセイにおける変異ホロトキシンのトリプシン活性化によっている。かくして、E.コリにおける低下されたプロテアーゼ活性によるA1およびA2サブユニットへのCT−A開裂の欠如は、E.コリ発現CT−CRME29Hの弱毒化に貢献する。総括すると、蓄積されたデータは、CT−CRME29Hは、ガングリオシドGM1に結合するホロトキシンであり、そして野生型CTより有意に低い毒性があることを示す。
【0028】
一連の研究は、次のようなワクチン候補として同定された細菌もしくはウイルス抗原を含有する組成物について、粘膜アジュバントとしてのCT−CRME29Hの有効性を評価するべく導びかれた:(1)型検出不能の(nontypable)ヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)(NTHi)組み換えP4タンパク質、またタンパク質「e」(rP4)として知られる(21)、組み換えNTHiP6タンパク質(rP6)(22)、および精製されたネイティブのヘモフィルス・インフルエンゼ接着および浸透(Hap)タンパク質(23);(2)ヘリコバクター・ピロリ(Hericobacter pylori)組み換えウレアーゼタンパク質(rウレアーゼ)(24);(3)ナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitidis)グループB組み換えクラス1ピリン(25)およびナイセリア・メニンギチジスグループBクラス1外膜タンパク質(26);(4)呼吸シンシチアルウイルス精製ネイティブ融合タンパク質(RSV F)(27);および(5)ロタウイルスの2/6−ウイルス様粒子(28)。
【0029】
CT−CRME29Hは、NTHi rP4およびrP6タンパク質のためのアジュバントとして4種の他のCT変異体および野生型CTと比較された。結果は、5種の異なるCT−CRMrP4およびrP6タンパク質の、全身性体液性免疫応答を誘起する能力を増大することを示した(表5および6)。例えば、3次のIN免疫感作2週後、CT−CRME29HもしくはCT−CRME110Dのいずれかとともに製剤化されたrP4およびrP6タンパク質により免疫感作されたマウスの抗rP4IgG抗体タイターは、PBS単独中の組み換えタンパク質により免疫感作されたマウスのそれよりも40倍高かった(表5)。組み換えタンパク質プラス野生型CTホロトキシンを投与されたマウスの抗体タイターは、20倍に上昇された。CT−CRMR11Kにより免疫感作されたマウスの抗rP4抗体タイターは、10倍上昇された。
【0030】
血清が、抗ネイティブP6抗体タイターについて試験された場合は、より劇的な違いさえ観察された。2次IN免疫感作2週後、ワクチンに製剤化されたCT−CRME29HもしくはCT−CRME110Dのいずれかにより免疫感作されたマウスの血清抗ネイティブP6抗体タイターは、rP6プラスPBSにより免疫感作されたマウスのそれよりも30倍以上大きかった。比較すると、野生型CTを用いて調製されたワクチンは、PBSで調製された製剤によって生じるタイターよりも90倍大きい抗ネイティブP6抗体タイターを誘起した。CT−CRME112D、CT−CRMR7KもしくはCT−CRMR11K製剤のいずれかにより免疫感作されたマウスの抗ネイティブP6抗体タイターは、PBS単独とともに製剤化されたrP4プラスrP6により免疫感作されたレシピエントのそれよりも2〜4倍高いだけであった。 さらに、3次免疫感作2週後の粘膜分泌液におけるタンパク質特異的抗体の試験は、CT−CRMが、rP4タンパク質に対する局所的免疫応答の生成を促進することを示した。さらにまた、抗rP4抗体タイターが、野生型CTによって誘導されるそれらと比較された(表7)。局所的抗体タイターは、ネイティブP6タンパク質に対しては検出されなかった(データ未掲載)。かくして、データは、一緒にすると、rP4およびrP6タンパク質に対する両全身および局所的抗体応答を生成するために、もっとも都合のよい変異CTは、位置29もしくは110において変異を含有するCT−CRMであることを示唆した。
【0031】
付加的研究は、アジュバントとしてのCT−CRME29Hの潜在力を確認し、そしてIN免疫感作のために適当な用量を決定するために遂行された(表8)。その結果は、CT−CRME29H1μgが、rP4タンパク質に対する最大の全身的および局所的体液性免疫応答を促進することを示した。CT−CRME29Hの用量が、1用量当たり1〜10もしくは30μgに増加された場合、両全身および粘膜性免疫応答は減少された。例えば、CT−CRME29H10μgにより免疫感作されたマウスの血清抗P4IgG抗体タイターは、研究48日目においてCT−CRME29H1μgにより免疫感作されたマウスのそれの7分の1であった(表8)。さらにまた、前者のグループの気管支肺胞および膣洗浄液からの局所的抗P4IgA抗体タイターは、49日目のマウスの後者のグループのそれの3〜4分の1および6分の1であった。このデータは、rP4プラスrP6/CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスの局所的および全身的体液性免疫応答は、野生型CTアジュバントのワクチンによる免疫感作後に達成されるものと本質的に同じであった(表8)。
【0032】
Hapタンパク質による免疫感作によって誘起される血清抗体応答に及ぼすCT−CRME29H添加の効果が試験された。CT−CRME29Hの添加は、Hapタンパク質に対する血清抗体応答の誘導を助けた(表9)。免疫応答は、7週の血清において見られた;抗体タイターはより早期の血清には検出されなかった。免疫マウスから得られた血清の抗HapのELISAタイターが表9に示される。応答は用量依存様式で増強し、そしてCT−CRME29H0.1μgの添加によって約3倍増大した。この増大は、両用量レベルにおいて生じた。
【0033】
エィッチ・ピロリ(H.pylori)のrウレアーゼによる胃内(IG)免疫感作後、全身および局所的体液性免疫応答を増大する5種の異なるCT−CRMの潜在力が、マウスモデルを用いて調査された。結果は、鼻内投与後にNTHiタンパク質により得られた結果に類似していた。データは、CT−CRME29Hが、IG免疫感作後の全身および局所的体液性免疫応答を増大するために、もっとも強い能力をもつ変異体であることを示した。CT−CRME29Hで製剤化されたワクチンによって誘起された幾何平均血清抗rウレアーゼIgG(表10)およびIgA(表11)抗体タイターは、研究28日目にはCT−CRME110Dによって誘導されるものよりも、それぞれ6および7倍大きかった。さらにまた、CT−CRME29Hで製剤化されたワクチンによって誘起された血清IgGおよびIgA抗体タイターは、野生型CTを含有するワクチンによって生成されるものに等しかった。
【0034】
もっとも重要なことには、CT−CRME29Hとともに製剤化されたrウレアーゼによるIG免疫感作は、最大の局所的体液性免疫応答を生成するようであった(表12)。このことは、気管支肺胞洗浄液の試験後に、もっとも明瞭であった。気管支肺胞洗浄液における抗rウレアーゼIgA抗体タイターは、CT−CRME110Dで調製されたワクチンによって誘起されるものよりも5倍大きかった。野生型CT製剤と比較して、抗rウレアーゼIgG抗体タイターは5分の1のレベルであった。しかしながら、CT−CRME29Hで製剤化されたワクチンにより免疫感作された群の膣洗浄液中のタンパク質特異的IgA抗体タイターは、野生型CTで調製されたワクチンによって誘起されるものに本質的に等しかった(表12)。
【0035】
非経口的免疫感作が、CT−CRME29Hで調製されたワクチンによってIG免疫感作されたマウスにおいて誘起されるものと比較した場合、気管支肺胞洗浄液中の顕著なrウレアーゼ特異的IgA抗体を誘起しなかったことを、データが暗示していることは、注目する価値があった(表12)。
【0036】
したがって、第2の研究は、CT−CRME29Hを用いて製剤化されたrウレアーゼによって生成される免疫応答の有効性を試験するべく導かれた。そのデータは、CT−CRME29Hが、エィッチ・フェリス(felis)に対する防御免疫応答の誘導を支持する上で野生型CTと同様に強力であることを示唆している(表13)。前者の群の血清抗rウレアーゼIgA抗体タイターは、研究の28日目において後者の群のマウスのタイターと等価であった。rウレアーゼ+StimulonTMQs−21により非経口的に免疫感作されたマウスの血清中のタンパク質特異的IgA抗体タイターは、CT−CRME29Hで調製されたワクチンによりIG免疫感作されたマウスのそれよりも12倍大きかった。しかしながら、CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスの気管支肺胞洗浄液中のタンパク質特異的IgA抗体タイターは、非経口的に免疫感作されたマウスのそれよりも10倍以上大きかった(表13)。
【0037】
結果は、IG免疫感作と胃組織からエィッチ・フェリス(felis)を取り除くマウスの能力との間の相関関係を示唆した。最後のチャレンジ後10日目にCTもしくはCT−CRME29Hのいずれかとともに製剤化されたワクチンによりIG免疫感作されたマウスの80%が、胃組織からウレアーゼ含有細菌を取り除くことができた。反対に、ネイティブ対照マウス(10%)、rウレアーゼ+PBS単独でIG免疫感作されたマウス(20%)、またはStimulonTMQs−21と混合されたrウレアーゼにより皮下に免疫感作されたマウス(30%)は、エィッチ・フェリス(felis)を根絶する能力は低いようであった(表13)。データが、有効性と気管支肺胞洗浄液中のタンパク質特異的IgA抗体タイターとの間の関係を示唆しなかったことは、注目に値する。rウレアーゼ+野生型CTによりIG免疫感作されたマウスの気管支肺胞洗浄液中のタンパク質特異的IgA抗体タイターは、CT−CRME29Hで免疫感作されたマウスの10分の1であった(表13)。なお80%の防御は、いずれのワクチンによっても達成された。かくして、肺組織における局所的体液性免疫応答を追跡することは、胃において生じる防御免疫応答にはほとんど関係をもたないかもしれない。
【0038】
C57B1/6マウスは、BALB/cマウスとは異なり、エィッチ・ピロリ(H.pylori)による感染後のヒトにおいて観察されたものに類似する疾患に会うことが、Dr.Jani O’Rourke(University of New South Wales;私信)によって示唆された。胃組織からエィッチ・ピロリ(H.pylori)を除去するべくCT−CRME29Hによって促進される抗rウレアーゼ免疫応答の有効性を試験するため、別の一連の研究がC57B1/6マウスを用いて開始された。その結果は、CT−CRME29Hを用いて製剤化されたrウレアーゼによるIG免疫感作は、野生型CTを用いて製剤化されたrウレアーゼによって誘起されるものに類似する全身および局所的体液性免疫応答を生じることを示唆した(表14)。研究28日目に野生型CTもしくはCT−CRME29Hいずれかで調製されたワクチンによって免疫感作されたマウスの血清および気管支肺胞と膣洗浄液抗rウレアーゼIgA抗体タイターは区別することはできなかった。唯一相違は、CT−CRME29Hで調製されたワクチンにより免疫感作されたマウスからの糞ペレットの抽出液中に検出されたIgA抗体タイターであり、これは3倍高かった(表14)。rウレアーゼ+ミョウバンにより非経口的に免疫感作されたマウスの糞中のタンパク質特異的IgA抗体タイターは、野生型CTかCT−CRME29Hいずれかの製剤でIG免疫感作されたマウスのそれよりも実質的に低かった(それぞれ、38分の1および14分の1)ことは注目に値された。かくして、C57B1/6マウスモデルは、IG免疫後生じる免疫応答をアジュバントするCT−CRME29Hの能力を調査することを可能にすると考えられた。さらにまた、そのモデルが、エィッチ・ピロリ(H.pylori)から粘膜表面を防御する上での局所的および全身的免疫応答の役割を確定することができることを、データは示した。
【0039】
CTが、粘膜性免疫応答のためのアジュバントとして禁忌されるということが報告された(30,31)。CTが、ワクチンを望ましくない高いIgE抗体タイターを誘起させるという仮説があった。IgEは、過敏性およびアレルギー反応に関連する。さらに、E.コリの熱に不安定なトキシン(LT)、またはLT−CRM、は、高いIgE抗体タイターを誘起する能力が低いことが示唆された。それ故、LTもしくはLT−CRMは、粘膜性免疫応答の生成のための、より適当なワクチンアジュバントであることが結論された。この仮説を試験するために、rウレアーゼからなるワクチンが、CT、LTもしくはCT−CRME29Hのいずれかを用いて製剤化され、そしてC57B1/6マウスにおいてIG免疫後のIgE抗体誘起能について試験された(表15)。データは、CT−CRME29Hもしくは野生型CTいずれかで調製されたワクチンは、野生型LTよりも、循環中に総合的またはウレアーゼ特異的IgE抗体を産生する可能性が低いことを示唆した。実際に、CT−CRME29Hによって製剤化されたワクチンは、上昇されたIgE抗体タイターを生成する可能性が低いことが示唆された。両終点の総合およびrウレアーゼ特異的IgE抗体タイターは、野生型LTを用いて調製されたワクチンによって免疫感作されたマウスのそれの4分の1であった(表15)。かくして、これらのデータは、少なくともrウレアーゼ製剤では、CT−CRME29Hが、アジュバントとしてLTよりも好ましいことを示唆する。
【0040】
理論に拘束されることなく、近年、van den Akkerら(32)によって提案されたLT活性のメカニズムは、E29内もしくは周辺において改変されたCT変異体の低下された毒性についてより可能性のある説明を提示している。ジスルフィドループの開裂およびドメインA1とA2に結合しているジスルフィド結合の還元後、A1ドメイン中の残基30−33からなるループは、ドメインA2の長いらせんの動きの結果として位置を変化することが提案されている。E29についての置換は、ループ30−33の行動を変化させ、CT−A1の低い活性化をもたらすであろう。また、CT−Y30WAHおよびCT−G34GGPの低下された毒性に関する可能性のある説明は、CT−A1の活性化に有害である30−33ループへの影響によって解釈できる。提案された活性化経路における次の段階は、全25−36ループの動きであり、これは、R25およびY55間の相互作用を破壊する。CT−R25Gは、CT−R25Wよりも大きい度合で毒性における低下を示したが、多分その理由は、R25およびY55の側鎖が疎水的な相互作用に関与していて、CT−R25Wによっては保持されるが、CT−R25Gでは保持されないからであろう。本発明者らの変異体の表現型は、Van den Akkerら(32)によって提案された熱不安定エンテロトキシンの活性化のモデルと一致する。
【0041】
一連の実験は、ナイセリア・メニンギチジス グループB由来の2種のワクチン候補のための粘膜および非経口アジュバントとしてのCT−CRME29Hの有効性を評価すべく誘導された。第1の候補は、組み換えクラス1ピリン(rピリン)であった(25)。第2の候補は、クラス2/3タンパク質を発現しない変異髄膜球菌株によって発現されるクラス1外膜タンパク質(PorA)であった(26)。
【0042】
粘膜アジュバント効果は、第1の実験において示され、そこではrピリン特異的血清IgG抗体は、CT−CRME29H添加群において増強され、生理食塩水中rピリンを受けているマウスにおいて得られたタイターに比較して3〜19倍の増加にわたった(表16)。また、特異的血清IgAは、CT−CRME29H(両0.1および1.0μgにおいて)において送達されたrピリンにより免疫感作されたマウスでは2〜5倍増強された。CT−CRME29H(1μg)が、鼻、膣および気管支肺胞洗液においてrピリン特異的IgAを3〜10倍増強したことは注目に値する。さらにまた、rピリン+CT−CRME29HによるIN免疫感作は、グループBのN.メニンギチジス同族菌株による鼻コロニー形成を、Swiss−Websterマウスにおいて検出レベルまで有意に低下させた(図2)。
【0043】
第2の実験は、CT−CRME29Hが、同族の髄膜球菌株に対するrピリンの防御を増強することを例証するべく誘導された。表17に示されるように、髄膜球菌Bの全細胞ELISAの血清IgGタイターは、rピリン+CT−CRME29H群において、rピリンのみを受けているマウスかのタイターに比較すると、同族菌株、ならびに異種菌株FAM18およびM982に比べて少なくとも4倍増強された。対照として、KLHプラスCT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスは、全細胞ELISAにおいては試験されたいずれの菌株に対しても血清IgGを誘導しなかった。表18では、rピリン特異的IgGおよびIgA抗体は、アジュバントされなかった群に比較すると、rピリン+CT−CRME29H群において実質的に増強された。さらに、rピリンのための粘膜アジュバントとしてのCT−CRME29Hは、同族のグループB髄膜球菌株による鼻のコロニー形成に対してマウスを防御した(図3)。
【0044】
次に、IN免疫感作におけるPorAプラスCT−CRME29Hの免疫原性が例証された。CT−CRME29HをアジュバントされたPorAを受けている群は、N.メニンギチジスH44/76全細胞に対して増強された血清IgG抗体を産生し、そしてアジュバントされなかったPorA群と比べて7および14倍高いPorA特異的抗体を産生した(表19)。しかしながら、PorAH44/76に対する血清IgA抗体は検出されなかった。また、収集されたいずれの粘膜分泌サンプルにおいても、PorA特異的抗体は検出されなかった(表19)。
【0045】
第4の実験は、CT−CRME29Hが、異種の髄膜球菌株に対するrピリンもしくはPorAいずれかによる防御を増強することを例証するべく誘導された。特に、表20からのデータは、CT−CRME29Hとともに送達されたクラス1rピリンもしくはPorAのIN投与は、抗体および髄膜球菌Bの全細胞に対して高い血清抗体タイターを誘起したのみならず、また、グループBのN.メニンギチジスの異種菌株による鼻コロニー形成に対してSwiss−Websterマウスを防御した。特に、CT−CRME29Hは、アジュバントされなかった群のそれに比べられるようなクラス1rピリンに対する血清抗体応答を増強した。同様に、アジュバントされたクラス1rピリン群は、細菌の増強された鼻クリアランスを提供した。
【0046】
次に、髄膜球菌の非経口免疫感作のためのアジュバントとして用いられるCT−CRME29Hの能力が試験された。図5に示されるように、MPLTMもしくはCT−CRME29HのいずれかによりアジュバントされたPorA H355が、グループB髄膜球菌異種株870227の鼻コロニー形成を有意に低下した。特に、PorAH355プラスCT−CRME29Hにより皮下に免疫感作されたマウスは、鼻の24時間後チャレンジにおいてPorAH355プラスMPLTM群よりも全く有意に少ないコロニーを有した、しかしながら、殺細菌活性は、単にPorAのみで免疫感作した群およびMPLTMでアジュバント化された熱殺菌全細胞で免疫感作された群からのそれぞれの血清において検出された(表22)が、PorAプラスCT−CRME29H群からでは検出されなかった。CT−CRME29HをアジュバントされたPorAは、MPLTMアジュバントのそれに類似する同族の殺細菌活性を誘起しなかったけれども、異種グループB髄膜球菌株によるコロニー形成を低下する上で高度に有効であった。
【0047】
呼吸シンシチアウイルス(RSV)糖タンパク質に対する全身および粘膜性免疫応答を増強するCT−CRME29Hの能力が、精製されたネイティブ融合(F)タンパク質を用いて試験された。さらに、アジュバントとしてのCT−CRME29Hの効力に及ぼす既に存在している抗CT抗体の影響が研究された。その結果は、CTもしくはCT−CRME29HのいずれかでアジュバントされたFタンパク質によってINに免疫感作されたBALB/cマウスは、全身および局所的抗CT IgGおよびIgA抗体タイターを生成することを例証した(表23)。さらにまた、データは、CT−CRME29Hを含有する製剤によって生成された抗体タイターが、野生型CTを含有する製剤によって誘起されるそれに等しいことを示した。例えば、Fタンパク質/CT−CRME29H(1用量当たり1μg)による第2次免疫10日後に、血清抗CT IgAおよびIgG抗体タイターは、Fタンパク質/CT(1用量当たり1μg)により免疫感作されたマウスのそれよりもわずかに低かった。同様の結果が、また、1もしくは10μgCT−CRME29Hとともに調製されたFタンパク質により免疫感作されたマウスからの膣洗浄液の試験後に得られた(表23)。したがって、データは、CT−CRME29Hが野生型CTと同じくらい免疫原性であることを示唆している。
【0048】
抗CT免疫応答がF抗原の免疫原性に悪影響を与えるか否かの問題が、BALB/cマウスが、PBS単独中のいずれか野生型CTもしくはCT−CRME29Hによる2回のIN投与によって1次感作された第2の実験において調べられた(表24)。その後、適当なマウスが、いずれか野生型CTもしくはCT−CRME29Hと混合されたFタンパク質によって2回免疫感作された。最後の投与後2週目(56日目)に回収された血清の検査は、既に存在している抗CT抗体が、局所的もしくは全身的抗Fタンパク質IgAおよびIgG抗体のレベルにおいてネガティブな影響をもたないことを示した。事に、データは、既に存在している抗CT抗体が抗Fタンパク質抗体応答の生成には有利であることを示した。このことは、粘膜表面に誘起された抗Fタンパク質抗体タイターが比較された場合にもっとも明白であった(表24)。第2の免疫感作2週後、CT−CRME29Hで1次感作され、次いでFタンパク質/CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスの気管支肺胞および膣洗浄液中の抗Fタンパク質IgA抗体タイターは、Fタンパク質/CT−CRME29Hのみにより免疫感作されたナイーブマウスのそれよりも、7および17倍それぞれ大きかった(表24)。
【0049】
第3の実験では、RSV Fタンパク質およびCT−CRME29H、CT−BもしくはミョウバンによりIN免疫感作されたBALB/cマウスの全身性および粘膜性免疫応答が検査された。表25は、3次免疫感作後9日に収集された血清の体液性免疫応答を表す。Fタンパク質とCT−CRME29H1もしくは10μgを含有して免疫感作を受けたマウス(それぞれ群777および778)は、F/PBS、F/AlOHもしくはRSV(それぞれ784,785および907)により免疫感作されたマウスに比較した場合IgG、IgG1およびIgG2aについて有意に上昇したタイターを示した。さらに、F/CT−CRME29Hを含有するワクチンによって生成されたタイター(777および778)は、Fタンパク質およびCTBによって刺激されたタイター(779および780)と少なくとも同等であった。
【0050】
気管支肺胞洗浄液、膣および鼻洗液が、最終免疫感作後1週目に免疫感作された動物から収集されてIgGおよびIgA抗体ELISAを遂行した。表26に示されるデータは、マウス5匹のプールからのタイターを示す。CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスは、両膣および鼻洗液(群777および778)において検出しうるIgAを誘起した。IgAは、CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスから得られたBAL中には見られず、そしてこれは、RSVで免疫感作されたマウス(群907)およびF/CTBで免疫感作されたマウス(780)のBALにおいて見られるのとは対照的であった。IgGは、BALからの洗液を含むすべての粘膜洗液において見い出された。CT−CRME29H免疫感作されたマウスからの洗液に見られるIgGのレベルは、CTB(群779および780)および生RSVでの免疫感作によって得られたレベルに匹敵した。
【0051】
第4の実験では、免疫マウス由来のイン・ビトロ刺激された脾細胞によって誘起される細胞溶解活性が調査された。データは図6に提示される。RSV免疫感作マウスは、約60%の抗原特異的細胞溶解を示したのに対して、残りの各マウスのCTL活性は、20%未満に留まった。かくして、CT−CRME29Hは、RSV Fタンパク質に対する両全身性および粘膜性体液性免疫応答を誘導できる(表25および26)けれども、RSV感染した標的細胞に対する細胞媒介免疫応答は、観察されなかった。
【0052】
第5の実験では、F/CT−CRME29Hの鼻内送達が、生RSVチャレンジに対して防御を促進するか否かを研究するために、ウイルス防御アッセイが遂行された。データは図7に提示される。
【0053】
図7に示される結果のANOVAによる統計的解析は、次ぎのとおりである:p<0.05:F/PBS対F/CT−CRME29H(1μgおよび10μgCT−CRME29H)、F/CTB(1μgおよび10μg)、F/AlOH.
p>0.05:PBS/CT−CRME29H対F/PBS
p>0.05:F/CT−CRME29H(1μgおよび10μgCT−CRME29H)対F/CTB(1μgおよび10μg)対F/AlOH.
F/CT−CRME29HもしくはF/CTBを含有するINワクチンを受けたマウスは、F/AlOHにより筋肉内に免疫感作されたマウスにおいて達成されたタイターに匹敵する肺ウイルスタイターを有した(p>0.05)。さらにまた、F/CT−CRME29Hによる鼻内免疫感作は、F/PBSもしくはPBS/CT−CRME29HそれぞれによるIN免疫感作に比較してLog101.6およびLog101.4まで肺ウイルスタイターを低下するのが見られた。F/CT−CRME29HおよびF/PBSもしくはPBS/CT−CRME29H間の差異は、統計的に有意であることが分かった(p<0.05)。
【0054】
第6の実験では、RSV Fタンパク質およびCT−CRME29HもしくはミョウバンによりINに免疫感作されたBALB/cマウスの全身性および粘膜性免疫応答が調査された。表27は、3次免疫後2週目に回収された血清の体液性免疫応答を示した。Fタンパク質およびCT−CRME29H1μgを含有する免疫感作を受けたマウス(群256)は、F/PBSもしくはPBS/CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウス(それぞれ群250および257)に比較した場合、IgG、IgG1およびIgG2aについて有意に上昇されたタイターを表した。F/CT−CRME29H(256)およびF/AlOH(258)の間のIgG1タイターにおいては、有意な差異は観察されなかった。しかしながら、F/CT−CRME29HによるIN免疫感作は、F/AlOH(258)による免疫感作によって見られるものに比較して有意に上昇したIgG2aタイターを誘起した。総括すれば、これらの結果は、表25に提示された結果と一致する。血清IgAは、F/CT−CRME29Hを受けているマウス群において検出されるけれども、そのタイターは、これまで観察されたよりも非常に低かった(群777について16,202±2,031および群256について444±1,458)。明らかな差異の理由は分からない。それにもかかわらず、IN送達F/CT−CRME29Hの血清IgA誘導能は、両研究において一致しており、そして有利には、これに関してはF/AlOHの能力とは対照的である。
【0055】
気管支肺胞洗浄液、膣および鼻洗液が、最終免疫感作後2週目に免疫感作された動物から収集されてIgGおよびIgA抗体ELISAを遂行した。表28に示されるデータは、マウス5匹のプールからのタイターを示す。表26に見られる結果に類似して、CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスは、両膣および鼻洗液(群256)において検出しうるIgAを誘起した。また表26に示されたデータに類似して、IgAは、CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスから得られたBAL中には見られなかった。しかしながら、IgGは、BALからの洗液を含むすべての粘膜洗液において見い出された。F/CT−CRME29H免疫感作されたマウスからの洗液に観察されるIgGのレベルは、生RSVでの免疫感作によって得られたレベルに少なくとも匹敵した(表28、群256対259)。
【0056】
第7の実験では、免疫マウス由来のイン・ビトロ刺激された脾細胞によって誘起される細胞溶解(CTL)活性が調査された。データは図8に提示される。RSV免疫感作マウスは、約45%の抗原特異的細胞溶解を示したのに対して、残りの各マウスのCTL活性は、10%未満に留まった。データは、脾臓リンパ球集団におけるRSV感染標的細胞に対して細胞媒介免疫防御を誘導する、F/CT−CRME29HによるIN免疫感作の能力がないことを確認した。これは、以前の観察を確認した(図8)。
【0057】
第8の実験では、F/CT−CRME29HのIN送達が、生RSVチャレンジに対して防御を促進するか否かを研究するために、さらなるウイルス防御アッセイが遂行された。図9に示される結果のANOVAによる統計的解析は、次ぎのとおりである:
p<0.05:F/PBS対F/CT−CRME29H、F/AlOH、RSV.
p<0.05:ナイーブ対F/CT−CRME29H、F/AlOH、RSV
p>0.05:F/CT−CRME29H対F/AlOH、RSV.
図7に示された結果と同様に、F/CT−CRME29Hを含有するINワクチンを受けたマウスは、F/AlOHにより筋肉内か、または生RSVによりINに免疫感作されたマウスにおいて達成されたものに統計的に匹敵する(p>0.05)程度に肺におけるウイルス複製を防御した(それぞれLog101.87対Log101.99およびLog101.94)。F/PBSによるIN免疫感作、または免疫されなかったマウス(ナイーブ)は、それぞれLog104.5およびLog104.3の肺ウイルスタイターを示した。さらにまた、これらの群は、F/CT−CRME29H、F/AlOHもしくはRSVにより免疫感作されたマウスから得られたウイルスタイターに比較して、統計的に上昇されたことが分かる(p<0.05)肺ウイルスタイターを有した。したがって、このデータは、F/CT−CRME29HのIN点滴が、感染性RSVのチャレンジに対して防御するという結論を支持する。
【0058】
第9の実験では、抗F血清抗体応答が調べられた。結果は、抗Fタンパク質IgGが、PBS単独において送達されたそれらの特定のFタンパク質に比べて、F/CT−CRME29H(0.1もしくは1.0μg)により免疫感作されたマウスにおいて有意に増加されることを示した。その上、CT−CRME29H0.1もしくは1.0μgのいずれかでアジュバントされたFタンパク質は、抗Fタンパク質IgG応答を刺激する上で、少なくともF/AlOH(筋肉内)か、またはRSVによる実験的感染のいずれとも同じくらいに効果的であった。タイターが、CT−CRME29H0.01μgに対して1.0μgを受けたマウスにおいて有意により大きいように、抗Fタンパク質抗体タイターの大きさは、製剤におけるCT−CRME29Hの用量に依存した。F/PBSに対する比較では、抗Fタンパク質IgG1およびIgG2aの両タイターは、0.1もしくは1.0μgいずれのCT−CRME29Hによっても増強された。CT−CRME29Hは、タイプ1および2免疫コンパートメント(compartment)の両方を刺激した。有意に高い血清抗Fタンパク質IgA応答は、RSVによる実験的感染に比較して、F/CT−CRME29H(0.1もしくは1.0μg)によるIN免疫感作によって刺激された。反対に、血清IgA抗Fタンパク質抗体は、F/PBS(IN)もしくはF/AlOHの非経口投与への応答においては観察されなかった(表29)。
【0059】
また、抗CTタイターは、抗Fタンパク質タイターと一致する用量依存パターンに従った(表29)。統計的に等価の抗CTタイターは、いずれかCT−CRME29H(1.0μg)もしくはF/CT−CRME29H(1.0μg)により免疫感作されたマウスから得られた血清中に観察された。しかしながら、これらのタイターは、F/CT−CRME29H(0.1もしくは0.01μg)に比べて有意に上昇された。さらに、F/CT−CRME29H(0.1μg)により免疫感作されたマウスの血清中の抗CTタイターは、F/CT−CRME29H(0.01μg)により免疫感作されたマウスからのタイターに比べて統計的に高められた。したがって、抗Fタンパク質抗体応答のためのCT−CRME29Hのアジュバント効果は、変異コレラホロトキシンへの抗体応答と相関された(r=0.97)。
【0060】
この第9実験では、また、粘膜性免疫が調べられた。粘膜IgAは、いずれかF/CT−CRME29H(1.0μg)もしくはF/CT−CRME29H(0.1μg)により免疫感作されたマウスからのプールされた鼻洗液中にのみ観察された(表30)。その上、また、精製Fタンパク質およびCT−CRME29H(0.01〜1.0μg)を含有するIN免疫感作を受けたマウスは、膣洗液(VW)中に抗Fタンパク質IgAを有した。Fタンパク質特異的IgGは、F/CT−CRME29H(0.1および1.0μg)もしくはF/AlOHを受けたマウスの気管支肺胞洗液(BAL)、VWおよび/またはNW中に観察された。反対に、抗Fタンパク質IgAは、F/AlOHによりIM免疫感作されたマウスにおいては検出されなかった。
【0061】
第10実験では、CT−CRME29Hとともに製剤化されたFタンパク質により免疫感作されたマウスにおける機能性免疫が調査された。補体の存在下で、統計的に高められた抗RSV中和抗体が、F/PBSもしくはCT−CRME29H単独投与に比較して、Fタンパク質およびCT−CRME29H、F/AlOHもしくはRSV A2のいずれか0.1もしくは1.0μgを受けたマウスの血清中に検出された(表31)。補体の不在下では、検出しうる中和抗体は、いずれの群においても観察されなかった(log10<1.3)。血清および粘膜抗体データ(表29および30)と一致して、F/CT−CRME29H(0.01μg)による免疫は、抗RSV中和抗体を産生するのに十分ではなかった。
【0062】
第11実験では、免疫マウスは、続いての感染に対するF/CT−CRME29Hの防御能を決定するために、3次免疫感作後2週目にチャレンジされた。結果は、F/CT−CRME29H(0.1もしくは1.0μg)により免疫感作されたマウスが防御されることを例証した(表32)。ナイーブマウス、またはF/PBSもしくはCT−CRME29H単独で免疫感作されたマウスに比べて、Fタンパク質およびいずれか0.1もしくは1.0μgCT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスの肺は、有意に低下されたウイルスレベルを有した。その上、有意に低下されたウイルスレベルは、未免疫ナイーブマウスまたはF/PBSにより免疫感作されたマウスに比較して、F/CT−CRME29H(0.1および1.0μg)により免疫感作されたマウスの鼻組織中に観察された。これに対して、F/AlOHにより非経口的に免疫感作されたマウスは、F/PBS免疫マウスに比べて、肺組織における低下されたウイルスレベルを示したが、鼻組織では有意な低下はなかった。総括すると、F/CT−CRME29H(0.1もしくは1.0μg)のIN投与は、続く生RSVのチャレンジに対する呼吸組織の防御に貢献するであろう両局所および全身体液性免疫応答を生成するには十分であった。
【0063】
実施例10において提示されるデータは、RSV Fタンパク質のためのINワクチン開発への成長可能なアプローチを具体的に説明した。そのデータは、両体液性および粘膜性IgGおよびIgAの産生が、F/CT−CRME29HのIN送達によって刺激されることを示している。観察された抗体タイターが有意であることは、2つの方法で例証される:第1、F/CT−CRME29Hにより免疫感作されたマウスにおいて分析される各体液性および粘膜性抗体応答は、F/PBSにより免疫感作されたマウスに比較して、質的には類似しており、そして量的には上昇された。第2、上昇されたタイターは、図7および9に示される観察された防御レベルによって示されるように、生物学的に関連する免疫応答に翻訳される。F/CT−CRME29Hによる免疫感作は、F/PBSもしくはPBS/CT−CRME29Hによる免疫感作に比べて生RSVチャレンジに対して有意に防御を増強した。 総括すれば、データは、F/CT−CRME29Hを含有するIN免疫感作プロトコールに応じて刺激されるいずれか粘膜性もしくは体液性免疫グロブリンによる、感染性ウイルスの中和を伴うメカニズムを示唆する。
【0064】
マウスは、組み換え的に発現されるVP2およびVP6タンパク質の形態において、その他のウイルス抗原、ロタウイルスにより免疫感作された。SA11ロタウイルスVP2およびVP6を発現する組み換えバキュロウイルス・ベクターが、既に記述されているように構築された(28);組み換え的に発現されるロタウイルス構造タンパク質が、形態的にビリオンと区別できない粒子に自己集合することが知られている。そのように発現されたタンパク質は、2/6ウイルス様粒子(VLP)へと共に集合した。
【0065】
相同性遺伝的背景をもつ近交系BALB/cマウスが使用されたが、それらのすべてが免疫感作に応答性であり、かくして、VLP単独およびCT−CRME29Hアジュバントと組み合わせた場合に、VLP対する全身性および粘膜性免疫グロブリンのプロフィルを明らかにできることが期待される。また、遺伝的に異種の非近交系CD−1マウスが、免疫および防御の誘導に必要な因子に及ぼす遺伝的多様性の影響を決定するために使用された。
【0066】
2匹の非応答性の経口的に免疫感作されたCD−1マウスを除いて、すべて免疫感作されたBALB/cおよびCD−1マウスの血清は、両VP2およびVP6に対する抗体を含有した。免疫前の血清ならびに免疫されなかったマウスの血清は、mockおよび/またはVP2−6バキュロウイルス感染細胞においてウイルス抗原を検出しなかった。2/6−VLPで免疫感作された血清または未感染細胞に曝露されたVP6およびVP2に特異的なmAbは、反応性を示さなかった(データ未掲載)。また、2/6−VLPの免疫原性は、2/6−VLPならびにロタウイルスのSA11株に対する各マウスからの、チャレンジ前および免疫感作された血清を用いてウエスタンブロット解析によって確認された(データ未掲載)。
【0067】
2/6−VLP単独によりIN免疫感作された群におけるロタウイルス特異的血清IgG、IgMおよびIgAのパターンは、2/6−VLPおよびCT−CRME29Hにより免疫感作された群におけるそれに類似していた(図10)。しかしながら、3種の血清抗体イソタイプの13週目のレベルは、CT−CRME29Hとともに2/6−VLPを受けている動物において有意により高かった(図10)(それぞれIgG、IgMおよびIgAについてP=0,P=0.004およびP=0.02)。このことは、CT−CRME29Hが、2/6−VLPに対する体液性応答を有意に増強することを示した。13週目は、2回の免疫感作の後であるがチャレンジ前に生成された抗体レベルの指標として選択された。
【0068】
図11Aに示されるように、VLP INを与えられたBALB/cマウスは、経口的に免疫感作されたマウスよりも大きいロタウイルス特異的全身性IgG応答を生じた。2群間の血清IgGタイターにおける統計的に有意な差異は、13週目において明らかであった(P=0)。同様に、血清IgMレベルは、チャレンジ前(13週目)の値が分析された場合、経口群とは反対にIN群においてより高かった(P=0)(図11B)。血清IgMレベルは、2週目にピークに達し、そしてINおよび混合群においては4週目に減少したが、一方、経口群では、低いが比較的一定の血清IgMレベルが、研究をとおして検出された。経口的およびIN免疫感作された動物におけるピークの血清IgAは、4週目に起きた。血清IgAレベルにおける有意な差異は、13週目の検査時点では3つの実験群では区別されなかった(図11C)。総括すれば、IN免疫感作は、経口的免疫感作よりも高いレベルの全身性IgGおよびIgM応答を生成した。IN群における有意に高いレベルのIgGおよびIgMの誘導は、IN免疫感作が、将来のワクチン候補の投与のための好適な経路であろうという考え方を支持する。かくして、強い全身性中和応答へと導くIN免疫感作は、粘膜バリヤーに浸透するウイルス病原体に対して効果的であろう。
【0069】
両IgG1およびIgG2aは、INおよび経口的に免疫感作されたBALB/cマウスの血清において見い出された(ず12)。IN群は、経口群に比べて統計的に有意なより高いレベルの両IgGサブクラスをもっていた(IgG1,P=0.005,IgG2a,P=0.05)。しかしながら、各群内のサブクラス間には有意な差異はなかった。これらのデータは、両Tヘルパー経路(TH−1およびTH−2)の効果的誘導のためのIN免疫感作の利用を確定する。
【0070】
すべて3実験群についての糞IgAのピークレベルは、最初の免疫感作後4週目に起き、血清IgAレベルが経口的およびIN免疫感作された動物において最大である時点と一時的に一致した(図11C)。統計的に有意な差異は、チャレンジ前の糞IgAレベルが試験された場合には、3つの免疫感作プロトコール間には見いだされなかった(図13A)。また、糞IgGは、4週目に最大であった(図13B);しかしながら、IN群は、経口もしくは混合群に比べて、13週目において有意に多いIgGを有した(それぞれP=0およびP=0.002)。一般に、すべての2/6−VLP免疫マウスは、血清IgG、IgMおよびIgA、ならびに糞IgGおよびIgAを産生した。糞IgMは、いずれの動物においても検出されなかった。
【0071】
2/6−VLP INを受けているすべてのCD−1マウス(n=4)および経口的に免疫感作された4匹のマウスのうち2匹は、ロタウイルス特異的抗体応答を生じた(データ未掲載)。抗体応答のプロフィルをより正確に決定するために、血清および糞サンプルが、26週間毎週分析された。CD−1マウスにおける血清および糞抗体の誘導パターンは、BALB/cマウスにおけるものと類似していた(図11および13)。
【0072】
BALB/cマウスにおいて、2/6−VLPおよびCT−CRME29Hによる2回のIN免疫感作(PRAS=98.7%)は、2/6−VLP単独によるIN免疫感作(PRAS=39%)(P=0.007)とは対照的に防御的であることが証明された。混合免疫感作、INに続く経口的免疫感作は、経口およびIN群と同じ程度にマウスを防御したが、これは、BALB/cマウスにおいて、混合免疫感作がまた効果的であることを示している。このことは、CT−CRME29Hによる防御的免疫応答における有意な増大を例証した。すべて3免疫群におけるBALB/cマウスは、チャレンジからのほとんど完全な防御を示した。PRASは、それぞれ経口、INおよび混合群について99.6%、98.8%および98.8%であった(図14B)。免疫されなかった対照群は、3つの免疫感作群よりも有意に多いウイルス抗原を脱落した(P=0)。3免疫感作群についてPRAS値間の有意な差異はなかった。
【0073】
IN免疫感作は、すべての免疫CD−1マウスにおいて、両全身性および粘膜性応答を誘導し、そしてこれらの動物を防御した(PRAS=97.9%)(図14C)。経口的免疫CD−1マウス4匹中2匹のみが、全身性および粘膜性抗体応答および防御を示した(3匹中2匹、PRAS=65.8%)(図14C);これに対して、すべての経口的に免疫感作されたBALB/cマウスが、粘膜性および全身性応答を示し、そして防御された。注目すべきは、免疫応答を生じなかったCD−1マウスは、感染から防御されず、一方、免疫応答性マウスは防御された(図14C)。免疫感作に対して抗体応答をもたない経口群の1マウスは、チャレンジ前に死んだ。2匹のCD−1マウスは、抗体応答の解析におけるサンプル数を減らすために対照として使用された。しかしながら、統計的解析は、防御成績が有意であることを明らかに示した(95%信頼レベルにおいて、P=0)。経口的免疫感作実験は、動物が26週よりむしろ13週目にチャレンジされた以外、同じ条件下でCD−1マウスを用いて繰り返された。免疫群では4マウスおよび対照群として5マウスを用いて、類似の防御レベルが観察された(PRAS=71.2%)(データ未掲載)。まとめると、これらの結果は、CD−1マウスにおいて、鼻内免疫感作が経口的免疫感作よりも効果的であることを示唆する、O Nealら(34,35)により近年公表された結果を支持する。
【0074】
ワクチンアジュバントとしてのCT−CRME29Hのこの例証された利用に関して、この材料の適当量の生産が所望される。pIIB29H(実施例1において記述される)を用いて、いくつかの試みが、E.コリにおけるCT−CRME29H発現のために行われた。精製されたCT−CRME29Hホロトキシンの得られる収量は、培養培地1リットル当たり約50μgであった。元来のプラスミド、pIIB29Hに対する改変によってCT−CRME29H収量を増加させる最初の試み、プラスミドpPX2492(実施例1参照)を作成することは、ほとんどまたは全く効果を示さなかった。収量における若干の増加は、ビブリオ・コレレDsbAおよびE.コリRpoHを用いて、pIIB29Hおよび誘導体の発現をとおして達成された。同時発現および精製変法が、1リットル当たり約2mgまでCT−CRME29Hの収量を増加した。
【0075】
CT−CRME29Hの発現を増加させるために、ラクトース誘導プロモーター(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)により置換され、これが、CT−CRME29HをコードしているDNA配列に操作可能に結合された。クローニングにおいて、プラスミドpIIB29Hが、ビブリオ・コレレ2125株由来のctxB遺伝子に結合されたV.c569B株由来のctxA遺伝子を含有することが決定された。これらの遺伝子の交差整列は、2つのctxB遺伝子間の7塩基置換およびctxA遺伝子間の1つの単一塩基変化を指示した。これらの塩基置換の若干は、成熟サブユニットにおけるアミノ酸変化をもたらした。特に注意すべきは、A−2部分、またはAサブユニットのホロトキシン・アッセンブリードメイン内のアミノ酸変化をもたらすctxA遺伝子間の置換であることである。これらの遺伝子間の不均一性が、トキシン発現もしくはホロトキシン・アッセンブリーにネガティブな力をもつか否かは知られていなかった;しかしながら、両トキシンサブユニット遺伝子が同じ起源から生まれるということが、革新的見地から先ず考えられた。それ自体、アラビノース誘導系の構築に使用された両ctxAおよびctxB遺伝子は、ビブリオ・コレレ569B株から生まれた。プラスミドpPX2490の構築は実施例12に記述される。pPX2490からのCT−CRME29Hの生産は、培養液1リットル当たり精製物質約30mgである。
【0076】
さらに、本発明は、コレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ免疫原性変異コレラホロトキシンをコードしているDNA配列を含み、そしてそのDNA配列がアラビノース誘導プロモーターに操作可能に結合されている単離、精製されたDNA配列を含有するプラスミド、ならびに慣用技術によってそのようなプラスミドによって形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションされた適当な宿主細胞に関する。
【0077】
種々の宿主細胞−プラスミドベクター系が、免疫原性変異コレラホロトキシンを発現するために使用される。好ましくはアラビノース誘導プロモーターを含むベクター系は、使用される宿主細胞と適合性である。適当な宿主細胞は、プラスミドDNA、コスミドDNAもしくはバクテリオファージDNAにより形質転換された細菌;ワクシニアウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス;ピヒア(Pichia)細胞のような酵母;sf9もしくはsf21細胞のような昆虫細胞;またはチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のような哺乳類細胞:ならびに他の慣用の生物を含む。
【0078】
種々の慣用の転写および翻訳要素が、宿主細胞−ベクター系のために使用することができる。CT−CRMをコードしているDNAは、発現系中に挿入され、そしてプロモーター(好ましくはアラビノース誘導プロモーター)および他の調節要素は、プラスミドベクターが宿主細胞中に挿入された(使用される宿主細胞−ベクター系に応じた形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションによって)場合、CT−CRMをコードしているDNAが宿主細胞によって発現されるように、ベクター内の特定の部位中に連結される。
【0079】
変異原性変異コレラホロトキシンは、上記プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションし、そして宿主細胞による該組み換え変異原性解毒化タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって生産される。
【0080】
本発明は、アミノ酸29にヒスチジンをもつCT−CRM変異体によって代表されるけれども、野生型グルタミン酸残基の他の非保存変異もまた、本発明の範囲内にはいる。グルタミン酸は、酸性(負電荷の)分子である。したがって、非保存変異は、置換が、また酸性分子であるアスパラギン酸以外のアミノ酸に対してなされる変異であってもよい。適当な代替アミノ酸は、ヒスチジンのような、塩基性(正電荷の)分子であるアミノ酸リジンおよびアルギニンを含む。さらに、適当な代替アミノ酸は、非極性官能基をもつアミノ酸、例えばアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリン、そして非電荷の極性官能基をもつアミノ酸、例えばアスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニンおよびチロシンを含む。
【0081】
病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原との組み合わせにおいて、ホロトキシンが、野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ、変異コレラホロトキシンの有効量は、該ホロトキシンが、該抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強する抗原組成物を製造するために使用される。
【0082】
また、本発明の抗原組成物は、アミノ酸29以外の位置における少なくとも1つのさらなる変異を含有するCT−CRMを含む。引用によって本明細書に組み入れられている国際特許出願WO93/13202(36)は、コレラホロトキシンの毒性を低下するために用いられるAサブユニットにおける一連の変異を記述している。これらの変異は、アミノ酸7のアルギニン、位置9のアスパラギン酸、位置11のアルギニン、位置44のヒスチジン、位置53のバリン、位置54のアルギニン、位置61のセリン、位置63のセリン、位置70のヒスチジン、位置97のバリン、位置104のチロシン、位置106のプロリン、位置107のヒスチジン、位置110のグルタミン酸、位置112のグルタミン酸、位置114のセリン、位置127のトリプトファン、位置146のアルギニンおよび位置192のアルギニンについて置換を作成することを含む。コレラホロトキシンのAサブユニットをコードしているヌクレオチド配列は、国際特許出願WO93/13202に記述される。引用によって本明細書に組み入れられている国際特許出願WO98/42375(37)は、コレラホロトキシンの毒性を低下するために用いられるAサブユニットにおけるアミノ酸109のセリンについて置換することを記述している。したがって、慣用の技術を用いて、1つ以上のこれらの付加的な位置における変異が生成される。
【0083】
本発明の抗原組成物は、限定されるものではないが、鼻内、経口、膣内、肛門内、非経口、皮内、経皮(例えば、引用によって本明細書に組み入れられている国際特許出願WO98/20734(38)参照)、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を含む、種々の経路によって、ヒトもしくは非ヒト脊椎動物に投与される。抗原成分または抗原組成物の成分の量は、抗原の特性に応じて、ならびに宿主の年令、体重および医療条件に応じて、ならびに投与方法に応じて変わるであろう。また、適当な用量は、当業者によって容易に決定される。必ずしも必要ではないけれども、抗原および変異CTが同時に投与されることが好ましい。また、抗原組成物についての用量数および投薬処方は、当業者によって容易に決定される。防御は、抗原組成物の単回用量によって与えられてもよく、または防御を維持すべきより遅い時間における増加用量に加えて、数回の用量の投与を求めてもよい。いくつかの例では、変異CTのアジュバント性が、必要な用量数もしくは投薬処方の時間経過を減少できる。
【0084】
本発明の抗原組成物は、CT−CRME29Hに加えてさらなるアジュバントを含んでもよい。そのようなアジュバントの例は、限定されるものではないが、StimulonTMQS−21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc.,Framingham,MA)、MPLTM(3−o−デアシル化モノホスホリルリピドA;RIBI ImmunoChem Reseach,Inc.,Hamilton,MT)、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびIL−12(Genetics Institute,Cambridge,MA)を含む。また、抗原組成物は、慣用の方法において免疫学的に許容しうる希釈剤もしくはキャリヤーと混合されてもよい。
【0085】
本発明の免疫原性変異コレラホロトキシンは、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する、限定されるものではないが細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生微生物を含む、広範な種々の病原性微生物からの広範な種々の抗原を含有する抗原組成物において、アジュバントとしての使用に適している。抗原は、全細胞もしくはウイルス、または1種以上のサッカリド、タンパク質、タンパク質サブユニットもしくはフラグメント、ポリ−もしくはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分を含んでもよい。所望であれば、抗原組成物は、同じか異なる病原性微生物からの1種以上の抗原を含有してもよい。
【0086】
アジュバントとしてのCT−CRM変異体を含む望ましい細菌ワクチンは、限定されるものではないが、ヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)(検出可能型および検出不能型の両方)、ヘモフィルス・ソムナス(Haemophilus somnus)、モラキセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalaciae)、ストレプトコッカス・フェカリス(Streptococcus faecalis)、ヘリコバクター・ピロリ(Hericobacter Pylori)、ナイセリア・メニンギチジス(Neisseria meningitidis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミジア・シタチ(Chlamydia psittaci)、ボルデテラ・ペルツッシア(Bordetella pertussia)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、サルモネラ・コレレスイス(Salmonella choleraesuis)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、シゲラ(Shigella)、ビブリオ・コレレ(Vibrio cholerae)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(Corynebacterium diphtheriae)、ミコバクテリウム・ツベルクロシス(Mycobactrium t uberculosis)、ミコバクテリウム・アブウム(Mycobactrium avium)−ミコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobactrium intracellulare)複合体、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、レプトスピラ・インテロガンス(Leptospira interrogans)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレア・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、アクチノバチルス・プルーロニューモニエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)およびマイコプラズマ・ガリセプチカム(Mycoplasma gallisepticum)によって引き起こされる疾病の予防および/または治療に対向されるワクチンを含む。
【0087】
アジュバントとしてのCT−CRM変異体を含む望ましいウイルスワクチンは、限定されるものではないが、呼吸シンシチアルウイルス、パラインフルエンザウイルス1−3型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ感染性粘液嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、Marek病ウイルス、ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスによって引き起こされる疾病の予防および/または治療に対向されるワクチンを含む。
【0088】
アジュバントとしてのCT−CRM変異体を含む真菌病原体に対する望ましいワクチンは、限定されるものではないが、アスペルギルス(Aspergillus)、ブラストミセス(Blastomyces)、カンジダ(Candida)、コクシジオイデス(Coccidioides)、クリプトコッカス(Cryptococcus)およびヒストプラズマ(Histoplasma)によって引き起こされる疾病の予防および/または治療に対向されるワクチンを含む。
【0089】
アジュバントとしてのCT−CRM変異体を含む寄生虫に対する望ましいワクチンは、限定されるものではないが、ライシュマニア・マヨール(Leishmania major)、アスカリス(Ascaris)、トリクリス(Trichuris)、ギアルジア(Giardia),シストソマ(Schistosoma)、クリプトスポリジウム(Cryptosporidium)、トリコモナス(Trichomonas)、トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplasma gondii)およびニューモシスチス・カリニイ(Pneumocystis carinii)によって引き起こされる疾病の予防および/または治療に対向されるワクチンを含む。
【0090】
また、CT−CRM変異体は、ポリヌクレオチドワクチン(また、DNAワクチンとして知られている)におけるアジュバントとしての含有に適している。そのようなワクチンは、bupivicaine(ブピビカイン)(引用によって本明細書に組み入れられている米国特許第5,593972号(39)、参照)のような促進剤をさらに含んでもよい。
【0091】
CT−CRME29Hは、ブピビカインとともに製剤化された、単純ヘルペスウイルス(HSV)2型の全長糖タンパク質D(gD2)をコードしているプラスミドDNA(pDNA)の投与のためのアジュバントとして野生型CTと比較された(40)。その結果は、皮内経路によってHSV−2についてのpDNAワクチンとともにCT−CRME29Hを受けたBALB/cマウスが、皮内経路によってpDNA HSVgD2ワクチンそれだけを受けたマウスよりも高い平均細胞応答を生成した(表34)。それに加えて、CT−CRME29HとともにpDNA HSVgD2ワクチンを受けたマウスの血清における平均抗体応答は、アジュバントなしでpDNA HSVgD2ワクチンを受けたマウスについて見られる応答とほぼ同じレベルであった(表35)。
【0092】
同様に、pDNA HSVgD2ワクチンは、皮内もしくは筋肉内経路によって無アジュバントワクチンの送達後に見られるものに匹敵するレベルにおいて、膣洗浄サンプル中にgD2特異的抗体応答を生じた(表36)。
【0093】
CT−CRME29HもしくはCTでアジュバントされ、そして皮内経路によって送達されたpDNA HSVgD2ワクチンにより免疫感作されたマウスは、アジュバントなしでpDNA HSVgD2ワクチンを受けたマウスよりも実質的に高いγ−インターフェロンのレベルを生じた(表37)。また、CT−CRME29Hを受けたマウスはIL−5を産生した。
【0094】
かくして、CT−CRME29Hは、HSVに対するプラスミドDNAワクチンを投与された場合、増殖性およびγ−インターフェロン応答を増強した。
【0095】
本発明が、より良く理解されるために、次の実施例が記述される。実施例は、例示の目的のためにのみあり、そして本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。
【0096】
実施例
例1 CT変異体の発現
細菌菌株、プラスミドおよび増殖条件
XL1 blue由来FTc,lacIq(Stratagene,LaJolla,CA;(41))およびCJ236(FTc,lacIq)(Bio−Rad,Hercules,CA)を担持しているE.コリ TG1(Amersham−Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)、およびTX1、TG1のナリジキシン酸耐性誘導株が、組み換えプラスミドをクローニングし、そして変異されたタンパク質の発現のための宿主として使用された。プラスミド含有菌株は、必要とされる抗生物質(アンピシリン50μg/ml;カナマイシン25μg/ml;テトラサイクリン10μg/ml)を含むLB寒天プレート上に維持された。V.コレレ0395からの完全CTオペロンが、lacプロモーターの調節下のファージミドベクターpSKII-中にサブクローニングされて、pMGJ67と命名されたIPTG誘導プラスミドを作成した(42)。
【0097】
ctxA遺伝子の変異誘発
Kunkelの方法(43)が、プラスミドpMGJ67において作成されるオリゴヌクレオチド由来変異体を選択するために使用された。5種の変異CT−CRMを作成するために使用されたオリゴヌクレオチドは表1に記述される。
【0098】
【表2】
【0099】
簡単に言えば、各一本鎖オリゴヌクレオチドがリン酸化され、そしてE.コリdut ung CJ236株(F’Tc,pMGJ67)からレスキューされたウラシル含有の一本鎖DNA鋳型において第2鎖合成を導くために使用された。連結およびung’TX1株の形質転換の後、一本鎖DNAが、AmpR形質転換株からレスキューされ、そしてジデオキシ・チェインターミネーター法(44)によって配列決定された。
【0100】
CT−CRM E29H をコードしているプラスミドの構築
CT−CRME29HをコードしているプラスミドはpIIB29Hと命名される。プラスミドは、CTをコードするV.コレレ遺伝子ctxAおよびctxBのポリシストロンを含有する。このプラスミド中のctxA遺伝子は、CT−Aのアミノ酸位置29のヒスチジンをコードするために、前記のように変異誘発された。野生型ポリシストロンが、また、ネイティブToxR誘導プロモーターを除去し、そしてラクトース誘導プロモーターによりそれを置換することによって変化された。さらにまた、ctxAおよびctxBシグナル配列をコードしている領域が、CT−CRME29Hの分泌を促進する目的で、E.コリLT(LTIIb−Bリーダー)のシグナル配列コーディング領域により置換された。次いで、プラスミドpIIB29Hが、CT−CRME29Hの発現を増加する試みで改変された。得られるpPX2492と呼ばれるプラスミドは、各ctxAおよびctxBの上流に合成シャインダルガルノ配列を含有した。2個の遺伝子は、遺伝子が重複しているV.コレレにおけるのとは異なり、pPX2492では遺伝的に分離されている。また、2遺伝子は、各上流にLTIIb−Bリーダー配列をもつ。
【0101】
変異ctxAアレレの発現
各変異ホロトキシンの生産は、37℃で振盪(200rpm)しつつ125mlエルレンマイヤーフラスコ中TB培地の5ml培養液において試験された。対数増殖期細胞(A600=0.8−1.0)が、IPTGの0.4mMまでの添加に続く一夜増殖によって誘導された。ポリミキシンBが1mg/mlまで添加され、続いて37℃で10分間インキュベートされた。細胞が遠心によって除去され、そして上澄液は、下記のようにホロトキシンおよびBペンタマーの濃度を決定するためにアッセイされた。
【0102】
具体的には、E.コリにおけるCT−CRME29Hの生産は、遺伝子E.コリ由来rpoHおよびV.コレレ由来のdsbAの同時発現を伴う。これらの遺伝子産物は、CTの両AおよびBサブユニットの配座成熟に関与する。
【0103】
例2 インタクトホロトキシンのGM1結合アッセイ
CT−CRMが、ガングリオシドGM1依存性固相ラジオイムノアッセイ(42)において試験されて、インタクトホロトキシンが、精製後存在するか否か決定された。酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)は、ELISAプレートミクロウェルが、ガングリオシドGM1(10μg/ml)により4℃で一夜コーティングされて使用された。その後、次の試薬が、室温における1時間のインキュベーション間隔で順に添加された:CT−CRME29H(3μg/ml〜0.00137μg/mlに滴定された)、ウサギ抗CT−A血清(1:1,000)およびアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体(1:2,000)100μl。反応を可視化するために、ジエタノールアミン中1μg/mlのリン酸p−ニトロフェニル100μlが添加され、そして30分間インキュベートされた。反応は、2NNaOH 100μlを添加して停止され、そして直ちにMicroelisaオートリーダーによって読まれた。野生型CTと比較した場合、データは、位置7,29,110もしくは112にアミノ酸置換をもつCT−CRMがインタクトホロトキシンであることを示した(図1)。しかしながら、その結果は、精製されたCT−CRMR11Kの一部がホロトキシンではなさそうであることを暗示した。
【0104】
例3 CT−CRMの残存毒性についてのY−1副腎細胞アッセイ
変異CT−CRMが、マウスY−1副腎腫瘍細胞アッセイにおいて毒性について野生型ホロトキシンと数回比較された。Y−1副腎細胞(ATCC CCL−79)が、96穴平底プレートに1ウェル当たり104細胞の濃度で接種された。その後、CT−CRMの3倍連続希釈液が、腫瘍細胞に添加され、そして37℃(5%CO2)で48時間インキュベートされた。次いで、細胞は、毒性の証拠について光学検鏡法によって検査された(丸まっている細胞)。終点タイターは、丸まっている細胞50%超を与えるのに必要なトキシンの最小濃度として定義された。残存毒性のパーセントは、野生型CTの終点タイター/CT−CRMによって誘起されたタイターX100を用いて算出される。表2は、Y−1副腎細胞アッセイにおいて試験された数種の精製変異ホロトキシンの残存毒性を示す。
【0105】
【表3】
【0106】
例4 開放マウス消化管重量アッセイ
このアッセイでは、野生型CTもしくはCT−CRME29H10μgが、BALB/cマウスの各群に胃内投与された(1群当たり3マウス)。腸は、3時間後に注意深く取り出され、秤量された。結果が表3に提示される。データは、1群当たりの平均消化管/死体重量比として表される。
【0107】
【表4】
【0108】
例5 ADP−リボシルトランスフェラーゼ・アッセイ
NAD+:アグマチンADP−リボシルトランスフェラーゼ活性は、放射能標識されたNAD+からの[カルボニル−14C]ニコチンアミドの遊離として測定された。簡単には、CTおよびCT−CRMが、トリプシン活性化され、そしてTEANバッファー(TrisTM/EDTA/アジ化ナトリウム/塩化ナトリウム)(pH8.0)中50mMグリシン/20mMジチオトレイトールを用いて30℃で30分間インキュベートされた。その後、次の物質が反応に添加された:ダイズ・トリプシンインヒビター0.1mg、50mMリン酸カリウム、10mMアグマチン、20mMジチオトレイトール、10mM塩化マグネシウム、100μMGTP、3mMジミリストイルホスファチジルコリン、0.2%胆汁酸塩、卵白アルブミン0.03mg、100μM[アデニン−U−14C]NAD(Dupont NENTM,Boston,MA)および最終容量300μlまでの水。30℃で90分間のインキュベーション後、サンプル100μlが、AG1−X2のカラム(0.64x5cm)(Bio−Rad)に適用され、これは、蒸留/脱イオンH2O 1.0mlにより5回洗浄された。[14C]ADP−リボシルアグマチンを含有する溶出液が放射能アッセイのために収集された。溶出液中の14C平均回収率は、カラムに適用されたそれのパーセントとして表される。結果は表4に提示される。
【0109】
【表5】
【0110】
例6 型検出不能ヘモフィルス・インフルエンゼ(NTHi)の組み換え(r)P4およびP6外膜タンパク質により免疫感作されたBALB/cマウスの免疫応答
第1の実験では、1群当たり5匹のBALB/cマウスが、rP4 5μgもしくはrP6 10μg、プラス 表5および6(1群はアジュバントを受けなかった)に示されるアジュバント1μgを含有する10μl用量を用いて、0,21および35日目に鼻内に免疫感作された。抗rP4 IgG抗体タイターは、0,21,35および48日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定され、そして結果は表5に示された。抗rP6 IgG抗体タイターは、0,21,35および48日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって別に決定され、そして結果は表6に示された。また、rP4に対する粘膜性抗体応答は、最後の免疫感作2週後に測定された。表7は、それぞれ鼻、気管支肺胞および膣洗液からのIgAおよびIgGタイターを記す。
【0111】
第2の実験では、1群当たり5匹のBALB/cマウスが、rP4 5μgもしくはrP6 10μg、プラス 表8(他の群は、各々CTもしくはCT−Bを受け;1群はアジュバントを受けなかった)に示されるようにCT−CRME29Hの増加用量を含有する30μl用量を用いて、0,21および35日目に鼻内に免疫感作された。血清抗rP4 IgAおよびIgG抗体タイターは、21,35および48日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定され、そして結果は表8に示された。また、49日目の気管支肺胞および膣洗液からのIgAおよびIgGタイターが決定され、そして表8に示される。
【0112】
【表6】
【0113】
a マウスは、0,21および35日目に鼻内に(IN、10μl容量)免疫感作された。
【0114】
b 組み換えP4およびP6タンパク質は、それぞれ1用量当たり5および10μgにおいて投与された。
【0115】
c 抗組み換えP4 IgG抗体タイターは、指示された時間において収集された保存サンプルにおけるELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0116】
d CTおよびCT変異体は、1用量当たり1μgにおいて投与された。
【0117】
【表7】
【0118】
a マウスは、0,21および35日目に鼻内に(IN、10μl容量)免疫感作された。
【0119】
b 組み換えP4およびP6タンパク質は、それぞれ1用量当たり5および10μgにおいて投与された。
【0120】
c 抗組み換えP6 IgG抗体タイターは、指示された時間において収集された保存サンプルにおけるELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0121】
d CTおよびCT変異体は、1用量当たり1μgにおいて投与された。
【0122】
【表8】
【0123】
a マウスは、0,21および35日目に鼻内に(IN、10μl容量)免疫感作された。
【0124】
b 組み換えP4およびP6タンパク質は、それぞれ1用量当たり5および10μgにおいて投与された。
【0125】
c 抗組み換えP4 IgGおよびIgA抗体タイターは、最後の免疫感作(49日目)後2週目に収集された保存サンプルにおけるELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0126】
d NW,BAWおよびVWは、それぞれ鼻洗液、気管支肺胞洗液および膣洗液を指す。
【0127】
e CTおよびCT変異体は、1用量当たり1μgにおいて投与された。
【0128】
【表9】
【0129】
a マウスは、組み換えP4(5μg)およびP6(10μg)タンパク質により、0,21および35日目に鼻内に(IN、30μl容量)免疫感作された。抗組み換えP4 IgGおよびIgA抗体タイターは、指示された時間において収集された保存サンプルにおけるELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0130】
b BAWおよびVWは、それぞれ気管支肺胞洗液および膣洗液を指す。
【0131】
例7 NTHiのネイティブHapタンパク質により免疫感作されたBALB/cマウスの免疫応答
NTHi菌株P860295(46)は、Dr.Charles(Brinton,University of Pittsburgh)から得られた。それは、NTHi誘導中耳炎を有する小児の鼻咽腔から得られた。NTHi菌株TN106(47)は、Dr.Eric Hansen(University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas)から得られた。TN106のストレプトマイシン耐性変異株は、ストレプトマイシン(Sigma,St.Lous,MO)100μg/mlを含有するBHI−XVプレート上での選択によって得られた。この変異株は、BALB/cマウスの鼻咽腔において2回継代され、そして菌株TN106.P2として凍結された。
【0132】
NTHi菌株P860295由来のHapタンパク質は、次のように精製された。NTHi菌株P860295は、BHI−XV培地において通気しつつ35℃で18時間増殖された。細菌細胞は、4℃で10Kxgの遠心によって沈殿され、そして廃棄された。上澄液が、固体(NH4)2SO4により60%飽和にされ、室温で2−3時間保持され、そして沈殿が遠心によって回収された。沈殿は、50mMリン酸ナトリウムバッファー,pH5.8、1mMEDTA、50mMNaCl(バッファー1)中に溶解され、そして前記バッファーに対して透析された。ベッドボリューム10mlのCM SepharoseTMカラム(Pharmacia,Piscataway,NJ)が、バッファー1によって平衡化され、そして上記溶解材料30mlが、流速1ml/minにおいてカラムに負荷された。カラムは、OD280がベースラインに達するまでバッファー1によって洗浄された。通過する材料は廃棄された。結合されたタンパク質は、3段階濃度勾配:(1)リン酸ナトリウムバッファー,pH7.0、1mMEDTA、50mMNaCl;(2)リン酸ナトリウムバッファー,pH8.0、1mMEDTA、50mMNaCl;および(3)リン酸ナトリウムバッファー,pH8.0、0.5MNaCl、1mMEDTAを用いて樹脂から溶出された。各段階で溶出されたタンパク質は保存され、そして分析のために使われた。保存液のSDS−PAGE(48)分析は、Hapタンパク質が勾配段階2と3において溶出することを示した。これらの保存液は、高度に精製されたHapを含有し、そして合体された。
【0133】
次いで、6週令のメスBalb/cマウス(1群当たり10匹)が、NTHi菌株P860295から精製されたHapによりIN免疫感作された。Hapタンパク質は、CT−CRME29Hを含んでも含まなくても、D−PBSにおいて5もしくは15μg/40μlに希釈された。使用する場合、CT−CRME29Hは0.1μg/マウスの用量で使用された。また、D−PBS中CT−CRME29Hを含有する対照製剤、D−PBS単独およびホルマリン固定TN106.P2(NTHiチャレンジ菌株)が、40μl容量においてマウスに投与された。
【0134】
IN免疫感作前に、マウスは麻酔され、次いで、ピペットから20μl/鼻孔の鼻内接種によって免疫感作された。ピペットは、先端が鼻孔の開口部に触れるように保たれ、そして製剤は、吸気の間に鼻孔内に自動的に注入された。マウスは、製剤もしくはチャレンジの投与後、鼻が何物にも触れないように仰臥位に置かれた。マウスは、0,1,3および5週目に免疫感作された。血清は7週目に抜き取られた。結果は表9に示される。
【0135】
【表10】
【0136】
例8 ヘリコバクター・ピロリの組み換え(r)ウレアーゼタンパク質により免疫感作されたBALB/cおよびC57Bl/6マウスの免疫応答
第1の実験では、1群当たり5匹のBALB/cマウスが、次のように免疫感作された:7群は、rウレアーゼ100μgプラス表10−12に示されるようなアジュバント10μgを用いて、0,2,14および16日目に胃内に免疫感作された。1群は、臀部の皮下にrウレアーゼ10μgにより免疫され;他の群は、首の皮下にrウレアーゼ10μgにより免疫され;また、両群は、0および16日目にアジュバントとしてのSimulonTMQS−21 20μgを受けた。抗rウレアーゼ抗体タイターは、28日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。IgG結果は表10に示され、そしてIgA結果は表11に示される。また、rウレアーゼに対する粘膜性抗体応答は、29日目に測定された。表12は、それぞれ気管支肺胞および膣洗液からのIgAおよびIgGタイターを記す。
【0137】
第2の実験では、エィッチ・フェリス(felis)によるチャレンジに対してマウスを防御するrウレアーゼ+アジュバントの能力が調べられた。1群当たり10匹のBALB/cマウスが、次のように免疫感作された:2群は、rウレアーゼ100μgプラス表13に示されるようなアジュバント10μgを用いて、0,2,14および16日目に胃内に免疫され;対照群は、rウレアーゼの代わりにPBS+アジュバント10μgを受けた。1群は、0および16日目にrウレアーゼ+SimulonTMQS−21 20μgにより皮下に免疫感作された。抗rウレアーゼ抗体タイターは、28日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。また、マウスは、29,31および34日目にエィッチ・フェリス(felis)108個の3用量によりチャレンジされ、そして44日目に防御についてアッセイされた。防御は、急速ウレアーゼ試験によって調査された。急速ウレアーゼ試験では、2分の1の胃が、尿素2%およびフェノールレッド、pH指示薬7μg/mlを含有するウレアーゼ試験媒質0.5ml中で、37℃で5時間インキュベートされた。ウレアーゼ活性は、尿素からアンモニアおよび重炭酸塩を生じ、かくして、pHを上昇させ、そして550nmにおいて、より高い吸光度をもつ溶液の発色変化を誘起する。ウレアーゼ活性のレベルは、分光測光分析によって測定された。吸光度値の平均が、未感染マウスの胃組織について得られる平均以上の2つの標準偏差である場合に、試験は、エィッチ・フェリス(felis)についてポジティブと見なされた。結果は表13に示される。
【0138】
第3の実験では、C57BL/6マウスの2群(1群当たり5匹)が、rウレアーゼ100μgプラス表14に示されるようなアジュバント10μgを用いて、0,2,14および16日目に胃内に免疫感作された。第3群は、rウレアーゼ10μg+ミョウバン100μgにより0および16日目に皮下に免疫感作された。第4群は、rウレアーゼ10μgによりアジュバントなしで0,2,14および16日目に胃内に免疫感作された。抗rウレアーゼ抗体タイターは、28日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。表14は、それぞれ血清、気管支肺胞洗液、糞ペレット抽出液および膣洗液からのIgAおよびIgGタイターを記す。
【0139】
第4の実験では、1群当たり5匹のC57BL/6マウスが、次のように免疫感作された:マウスの3群は、rウレアーゼ100μgプラス表15に示されるようなアジュバント10μgを用いて、0,2,14および16日目にIG免疫され;第4群はアジュバントを受けなかった。抗rウレアーゼ抗体タイターは、29日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。IgAおよびIgG結果は表15に示される。また、表15は、IgE(PCA)および総IgEタイターを提示する。PCAは、IgE抗体タイターが、受動皮膚アナフィラキシー反応によって決定されることを指す。PCAは、メスSpraque−Dawleyラットにおいて行われた。ラットは、ケタミン/キシラジンにより鎮静にされ、剃毛され、そしていずれかCT,LTもしくはCT−CRME29Hとともに製剤化されたrウレアーゼにより免疫感作されたC57B1/6マウスからの血清(連続的に4倍希釈された)0.1mlにより皮内に注射された。ラットは、48〜60時間後に鎮静にされ、次いで、1%Evan’sブルー染料を含有するPBS中rウレアーゼ2μgを用いて尾静脈をとおして静脈内に注射(0.1ml)された。
【0140】
【表11】
【0141】
a 幾何平均抗組み換えウレアーゼ抗体タイターは、28日目に収集された血清サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0142】
b マウスは、0および16日目に臀部(R)もしくは首(N)における皮下(SC)に、rウレアーゼ10μgにより免疫感作された。胃内(IG)に免疫感作されたマウスは、0,2,14および16日目にrウレアーゼ100μgを受けた。アジュバントは、SimulonTMQS−21(20μg)、CT(10μg)もしくはCT変異体(10μg)のいずれかであった。
【0143】
【表12】
【0144】
a 幾何平均抗組み換えウレアーゼIgA抗体タイターは、28日目に収集された血清サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0145】
b マウスは、0および16日目に臀部(R)もしくは首(N)における皮下(SC)に、rウレアーゼ10μgにより免疫感作された。マウスは、0,2,14および16日目にrウレアーゼ100μgを受けて胃内(IG)に免疫感作された。アジュバントは、SimulonTMQS−21(20μg)、CT(10μg)もしくはCT誘導体(10μg)のいずれかであった。
【0146】
【表13】
【0147】
a 抗rウレアーゼIgGおよびIgA抗体タイターは、29日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0148】
b BAWおよびVWは、それぞれ気管支肺胞および膣洗液を指す。
【0149】
c マウスは、0および16日目に臀部(R)もしくは首(N)において皮下(SC)に、rウレアーゼ10μgにより免疫感作された。マウスは、0,2,14および16日目にrウレアーゼ100μgを受けて胃内(IG)に免疫感作された。アジュバントは、SimulonTMQS−21(20μg)、CT(10μg)もしくはCT誘導体(10μg)のいずれかであった。
【0150】
【表14】
【0151】
a 抗組み換え(r)ウレアーゼIgA抗体タイターは、28日目に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり10マウスであった。
【0152】
b マウスは、0,2,14および16日目に1用量当たりrウレアーゼ100μgにより胃内(IG)に免疫感作された。対照マウスは、0および16日目に1用量当たりrウレアーゼ10μgを皮下(SC)に注射された。
【0153】
c rウレアーゼは、1用量当たりCTもしくはCT−CRM10μgのいずれかを用いて製剤化されるか、または1用量当たりSimulonTMQS−21 20μgと混合された。
【0154】
d BAWは、気管支肺胞洗液を指す。
【0155】
e マウスは、29,31および34日目にエィッチ・フェリス(felis)108個の3用量によりチャレンジされ、そして44日目に防御についてアッセイされた。防御は、急速ウレアーゼ試験によって調査された。
【0156】
【表15】
【0157】
a 終点抗rウレアーゼ抗体タイターは、28日目に収集された保存血清サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0158】
b BAW、FPおよびVWは、それぞれ気管支肺胞洗液、糞ペレット抽出液および膣洗液を指す。
【0159】
c マウスは、0および16日目に皮下(SC)にrウレアーゼ10μgにより免疫感作された。胃内(IG)に免疫感作されたマウスは、0,2,14および16日目にrウレアーゼ100μgを受けた。アジュバントは、ミョウバン(100μg)、CT(10μg)もしくはCT−CRME29H(10μg)のいずれかであった。
【0160】
【表16】
【0161】
a 終点IgAおよびIgG抗体タイターは、29日目に収集された保存血清サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0162】
b マウスは、0,2,14および16日目にrウレアーゼ100μgにより胃内(IG)に免疫感作された。アジュバントは、CT、CT−CRME29HもしくはLT10μgであった。
【0163】
c PCAは、IgE抗体タイターが、受動皮膚アナフィラキシー反応によって決定されることを指す。PCAは、メスSpraque−Dawleyラットにおいて行われた。ラットは、ケタミン/キシラジンにより鎮静にされ、剃毛され、そしていずれかCT,LTもしくはCT−CRME29Hとともに製剤化されたrウレアーゼにより免疫感作されたC57B1/6マウスからの血清(連続的に4倍希釈された)0.1mlにより皮内に注射された。ラットは、48〜60時間後に鎮静にされ、次いで、1%Evan’sブルー染料を含有するPBS中rウレアーゼ2μgを用いて尾静脈をとおして静脈内に注射(0.1ml)された。
【0164】
d 数字は、ng/ml中である。NDは検出不能を指す。
【0165】
例9 ナイセリア・メニンギチジスの組み換えクラス1ピリンおよびクラス1外膜タンパク質により免疫感作されたSwiss−Websterマウスの免疫応答
第1の実験では、6−8週令のSwiss−Websterマウス(1群当たり15匹)が、CT−CRME29H(0.1もしくは1μg/マウス)とともに製剤化された精製組み換えクラス1ピリン(rピリン)5μgにより、0,2および3週目にIN(10μl)免疫感作された。血清サンプル、気管支肺胞洗液(BAW)、鼻洗液(NW)および膣洗液(VW)が、4週目に、ELISAによってN.メニンギチジス・ピリンに特異的な血清および粘膜IgAおよびIgG抗体を決定するために、各群の5マウスから収集された。結果は表16に提示された。平行して免疫感作された各群の残りの10マウスは、4週目に、同族N.メニンギチジス菌株H355P+.p21R(乳児ラットで2回継代される)の2x107CFUによってINチャレンジされた。チャレンジ後24時間目の鼻組織からのグループB N.メニンギチジスの回収は、図2において示されるように定量的培養によって決定された。
【0166】
第2の実験では、同族髄膜球菌株に対するCT−CRME29Hとともに製剤化されたrピリンの防御が、無関係なタンパク質、KLHと混合されたCT−CRME29Hの防御に比較された。5匹のSwiss−Websterマウス(6週令)の群は、CT−CRME29H(0.1μg)の有無におけるrピリン5μgか、またはCT−CRME29H(0.1μg)を含むPorA H355によって、0,2および3週目にIN(10μl容量)免疫感作された。対照群は、免疫されなかった(ナイーブ群)か、またはKLH(5μg)プラスCT−CRME29H(0.1μg)によりIN免疫感作されたかいずれかであった。終点抗体タイターは、髄膜球菌菌株H355P+の1x107CFUによるチャレンジ前4週目に収集された保存血清サンプルにおいて、全細胞および抗原特異的ELISAによって決定された。結果は表17および18に示される。
【0167】
第3の実験では、IN免疫感作についてCT−CRME29Hとともに製剤化された髄膜球菌PorAの免疫原性が調査された。1群当たり5匹のSwiss−Websterマウスが、表19に指示されるように、CT−CRME29H(1μg/用量)の有無における髄膜球菌H44/76株からのPorA 20μg/用量によって、0,2および3週目にIN免疫感作された。抗PorA H44/76抗体タイターおよびIgGについての全細胞ELISAは、実験4週目に収集された保存血清および粘膜サンプルにおいてアッセイされた。結果は表19に示される。
【0168】
第4の実験では、髄膜球菌の異種菌株のチャレンジに対する、CT−CRME29HをアジュバントされたrピリンおよびPorAのマウス防御能が調べられた。1群当たりSwiss−Websterマウス10匹が、CT−CRME29H(0.1μg)とともに製剤化された、いずれかrピリン、菌株H355からのPorAまたは菌株870227からのPorA 5μgによって、0、2および3週目にIN(10μl容量)免疫感作された。対照群は、熱失活された髄膜球菌870227株全細胞またはKLH(5μg)プラスCT−CRME29H(0.1μg)のいずれかであった。終点IgGおよびIgAタイターは、870227株によるチャレンジ前4週目に収集された保存血清サンプルにおいて、全細胞および抗原特異的ELISAによって決定された。結果は表20および21に示される。鼻組織からの細菌回収は、870227株によるチャレンジ後24時間に定量的培養によって決定され、そしてLog10CFU±標準偏差として表された。結果は図4に示される。
【0169】
第5の実験は、非経口免疫感作のためのアジュバントとしてのCT−CRME29Hの能力を検査するために実施された。メスSwiss−Websterマウス、5−6週令10匹の群が、いずれかCT−CRME29H(10μg)もしくはMPLTM(100μg)とともに製剤化されたPorA H355 5μgによって、0および4週目に皮下に免疫感作された。対照群は、熱失活された髄膜球菌870227全細胞またはKLH(5μg)プラスMPLTM(100μg)により皮下に免疫感作された。マウスは、髄膜球菌菌株870227株の1.2x107CFUにより6週目にINチャレンジされた。チャレンジ後24時間目に、マウスは犠牲にされ、そして鼻組織がホモジナイズされ、そして選択培地に塗布された。コロニーは、37℃で一夜培養後にカウントされ、そしてLog10CFU±標準偏差として表された。この実施の結果は、表22および図5に提示される。
【0170】
【表17】
【0171】
【表18】
【0172】
【表19】
【0173】
【表20】
【0174】
ND=データなし
WCE=H44/76菌株に対する全細胞ELISA
PorA=PorA H44/76特異的ELISA。
【0175】
【表21】
【0176】
【表22】
【0177】
【表23】
【0178】
例10 呼吸シンシチアウイルス(RSV)の精製ネイティブ融合(F)糖タンパク質により免疫感作されたBALB/cマウスの免疫応答
第1の実験では、6−8週令のBALB/cマウス(5マウス/群)が、CT−CRME29H(1μgもしくは10μg/マウス)、野生型CT(1μg/マウス)、CT−B(1μgもしくは10μg/マウス)もしくは無アジュバントとともに製剤化された精製ネイティブタンパク質3μgにより、0および14週目に鼻内に(10μl)免疫感作された。終点IgGおよびIgA抗体タイターは、実験24日目にELISAによってアッセイされた。タイターは、血清、気管支肺胞洗液および膣洗液から得られた。結果は表23に提示される。
【0179】
第2の実験では、6−8週令のBALB/cマウス(5マウス/群)が、いずれか野生型CT(1μg/マウス)もしくはCT−CRME29H(1μg/マウス)により、0および14週目に鼻内に(50μl)前免疫感作された。対照群は前免疫されなかった。その後、28および42日目に、全マウスが、同量のCTもしくはCT−CRME29Hとともに製剤化されたFタンパク質3μgにより鼻内に免疫感作された。終点抗体タイターは、56日目(血清)および57日目(気管支肺胞洗液および膣洗液)に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。結果は表24に提示される。
【0180】
第3の実験では、ナイーブなメスBALB/cマウス(6−8週令、5マウス/群)が、RSV A2由来の精製ネイティブ融合(F)タンパク質により0,1および2週目に鼻内に(IN)免疫感作された。免疫感作は、CT−CRME29H(1μgもしくは10μg/マウス)、CT−B(1μgもしくは10μg/マウス)もしくはミョウバン(100μg/マウス)とともにFタンパク質(3μg/マウス)を製剤化することによって用意された。ワクチンは、鼻孔の先端に置かれたワクチンにおいて、麻酔されたマウスに吸気させることによって鼻内に投与された。用量の総容量は、0,1および2週目においてマウス当たり10μlであった(表25)。対照マウスは、F/AlOHを含有する筋肉内の1次免疫感作を受けるか、または鼻内に送達される生存RSV A2の1次および2次免疫感作を受けた。全身性体液性免疫応答は、3次免疫感作後9日目に(表25および26)ELISAによってアッセイされた。また、気管支肺胞洗液、膣洗液および鼻洗液が収集され、そして粘膜性抗体応答の特徴付において利用された。免疫マウスからの脾臓は、MHC適合性RSV感染標的細胞に対する抗原依存性キラー細胞活性をアッセイするために使用された。同一免疫感作スケジュールを受けたマウスの第2の群は、生存RSVによりチャレンジされた。続いて、この群内での肺コンパートメントの防御が、チャレンジ後4日目に、収集され、ホモジナイズされた肺組織におけるウイルスプラークの決定によって分析された。統計的解析はANOVAを用いて行われた。結果は表25および26に提示される。
【0181】
第4の実験では、BALB/cマウスは、CT−CRME29H(1μgもしくは10μg/マウス)、CTB(1μgもしくは10μg/マウス)もしくはPBSと組み合わせにおける精製RSV Fタンパク質(3μg/マウス)により0,1および2週目に鼻内に免疫感作された。また、対照として、マウスは、RSVの鼻内送達またはF/AlOHの筋肉内送達を受けた。脾臓が、最終免疫感作後9日目に単離され、そして同遺伝子型RSV感染スティミュレーター細胞によりイン・ビトロで刺激された。培養6日後、抗原依存性キラー細胞活性が、RSV感染標的細胞による51クロム放出の定量によって決定された。結果は図6に示される。
【0182】
第5の実験、ウイルス防御アッセイでは、免疫感作マウスの肺コンパートメントが、生存RSVによるチャレンジ後4日目に単離され、ホモジナイズされ、そして感染性ウイルスの定量が実施された。BALB/cマウスは、RSV由来精製Fタンパク質およびいずれかCT−CRME29H、CTBもしくはPBSを含有するワクチンにより鼻内に免疫感作された。また、マウス群は、対照としてF/AlOHにより筋肉内に免疫感作された。最終免疫感作後8日目(F/AlOHワクチン後3週目)に、マウスは、生存RSVによりチャレンジされた。4日後、肺組織が採取され、そして感染性ウイルスの定量において利用された。結果は図7に示される。
【0183】
第6の実験では、ナイーブなメスBALB/cマウス(6−8週令、5マウス/群)が、RSV A2由来の精製ネイティブ融合(F)タンパク質により0,1および2週目に鼻内に(IN)免疫感作された。免疫感作は、CT−CRME29H(1μg/マウス)もしくはミョウバン(100μg/マウス)とともにFタンパク質(3μg/マウス)を製剤化することによって用意された。ワクチンは、鼻孔の先端に置かれたワクチンにおいて、麻酔されたマウスに吸気させることによって鼻内に投与された。1用量当たりの総容量は、0,1および2週目においてマウス当たり5μlであった(表27)。対照マウスは、F/AlOHを含有する筋肉内の1次免疫感作を受けるか、または鼻内に送達される生存RSV A2の1次および2次免疫感作を受けた。全身性体液性免疫応答は、3次免疫感作後2週目に(表27および28)ELISAによってアッセイされた。また、気管支肺胞洗液、膣および鼻洗液が収集され、そして粘膜性抗体応答の特徴付において利用された。免疫マウスからの脾臓は、MHC適合性RSV感染標的細胞に対する抗原依存性キラー細胞活性をアッセイするために使用された。同一免疫感作スケジュールを受けたマウスの第2の群は、生存RSVによりチャレンジされた。続いて、この群内での肺コンパートメントの防御が、チャレンジ後4日目に、収集され、ホモジナイズされた肺組織におけるウイルスプラークの決定によって分析された。統計的解析はANOVAを用いて行われた。結果は表27および28に提示される。
【0184】
第7の実験では、第4の実験からのプロトコールが、RSV感染標的細胞に対する抗原依存性CTL活性をアッセイするために使用された。結果は図8に提示される。
【0185】
第8の実験、その他のウイルス防御アッセイでは、BALB/cマウス(5マウス/群)が、CT−CRME29Hの有無において精製RSVFタンパク質を含有する製剤により鼻内に免疫感作された。また、マウス群は、F/AlOHにより筋肉内に免疫され、そして対照として未免疫(ナイーブ)のまま残された。最終免疫感作後2週目(F/AlOH投与後4週目)に、全群が、生存RSVによりチャレンジされた。4日後、肺組織が採取され、そして感染性ウイルスの定量において利用された。結果は図9に示される。
【0186】
第9の実験では、3用量プロトコールが、より詳細にCT−CRME29Hのアジュバント応答を検討するために用いられた。BALB/cマウス5匹の群が、CT−CRME29Hいずれか0.01,0.1もしくは1μgと混合されるFタンパク質(3μg)により0,1および2週目にIN(5μl)免疫感作された。対照マウスは、F/AlOH(筋肉内)もしくはRSV A2(IN)により0日に感作された。血清抗体タイターは、3次免疫感作後2週目に決定された。結果は表29に提示される。データは、log10幾何平均抗体タイター(±1SD)として示される。同様の結果が2つの別の研究において得られた。
【0187】
F/CT−CRME29HによるIN免疫感作後、また、第9の実験におけるマウスは、Fタンパク質に対するそれらの局所抗体応答について試験された。粘膜洗浄サンプルが、3次免疫感作後2週目に犠牲にされたマウスから採取され、そして抗Fタンパク質特異的IgGおよびIgAについてELISAによって分析された。結果は表30に示される。データは、log10幾何平均終点タイターとして示され、OD4100.03であった。同様の結果が2つの別の研究において得られた。
【0188】
第10の実験では、F/CT−CRME29Hによって誘導される体液性免疫応答の機能性を検討するために、血清が、RSV A2に対する中和抗体タイターについてプラーク減少アッセイにおいて試験された。結果は表31に示される。幾何平均中和抗体タイター(log10)は、補体起源としての5%モルモット血清の存在(+C’)もしくは不在(−C’)下で個々の血清(5マウス/群)において決定された。同様の結果が2つの別の研究において得られた。
【0189】
第11の実験では、マウス(5匹/群)は、0,7および14日目にCT−CRME29H0.01,0.1もしくは1μgとともに製剤化されたFタンパク質のIN免疫感作を受けた。対照マウスは、F/AlOH(筋肉内)もしくはRSV A2(IN)により免疫感作された。免疫感作されたマウスは、3次免疫感作後2週目にチャレンジされて、続く感染に対するF/CT−CRME29Hの防御能を決定された。感染後4日目に、ウイルスレベルが、個々のマウスのホモジナイズされた肺および鼻組織において決定された。結果は表32に提示される。データは、組織1g当たりの幾何平均ウイルスタイター(±1標準偏差)として示される。
【0190】
【表24】
【0191】
a 終点抗体タイターは、研究24日目に収集された保存サンプルにおいて決定された。BAWおよびVWは、それぞれ気管支肺胞および膣洗液を指す。1群当たり5マウスであった。
【0192】
b マウスは、いずれか野生型CT、市販CT−BもしくはCT−CRME29Hの指示量と混合されたネイティブFタンパク質3μgによって、0および14日目に鼻内に(10μl)免疫感作された。
【0193】
c ND=データなし
【0194】
【表25】
【0195】
a 終点抗体タイターは、56日目(血清)および57日目(気管支肺胞(BAW)および膣(VW)洗浄液)に収集された保存サンプルにおいてELISAによって決定された。1群当たり5マウスであった。
【0196】
b マウスは、いずれか野生型CT(1μg)もしくはCT−CRME29H(1μg)により、0および14日目に前免疫(鼻内に、50μl)された。その後、28および42日目に、全マウスは、いずれか野生型CTもしくはCT−CRME29Hの同量(1μg)とともに製剤化されたFタンパク質(3μg)により免疫(鼻内に、50μl)された。いずれか野生型CTもしくはCT−CRME29Hにより前免疫され、続いてFタンパク質によって免疫感作されたマウスの終点抗CT抗体タイターは、42日目に1,000,000を超えていた。
【0197】
【表26】
【0198】
総IgGについて:
p<0.05:777〜780対784;780対779;777〜780対785;777,778,780対907(779対907 p=0.7)
p>0.05:778対777(p=0.125);
IgG1について:
p<0.05:777〜780対784;777〜780対907;777〜780対785
p>0.05:781〜780対907
IgG2aについて:
p<0.05:777〜780対784
【0199】
【表27】
【0200】
【表28】
【0201】
総IgGについて:
p<0.05:256対250および257
p>0.05:256対258および259
IgG1について:
p<0.05:256対250および257
p>0.05:256対258
IgG2aについて:
p<0.05:256対250、257および258
p>0.05:256対259
IgAについて
p<0.05:256対259
【0202】
【表29】
【0203】
【表30】
【0204】
a p<0.05 F/PBSもしくはF/CT−E29H(0.01μg)に比較される
b p>0.05 F/CT−E29H(0.01μg)もしくはF/AlOHに比較される
c p<0.05 F/CT−E29H(0.1および0.01μg)およびF/PBSに比較される.p>0.05 CT−E29H(1.0μg)に比較される
d p<0.05 F/PBSおよびF/CT−E29H(0.01μg)に比較される
e p>0.05 F/PBSに比較される
f p<0.05 F/CT−E29H(0.1および1.0μg)に比較される
g ND=実施せず
【0205】
【表31】
【0206】
【表32】
【0207】
a p<0.05 F/PBSもしくはF/CT−CRME29H(0.01μg)に比較される
p>0.05 F/CT−CRME29H(0.1μg)、F/AlOHもしくはRSV A2に比較される
b p<0.05 F/PBSもしくはF/CT−CRME29H(0.01μg)に比較される.
p>0.05 F/CT−CRME29H(1μg)、F/AlOHもしくはRSV A2に比較される
【0208】
【表33】
【0209】
a p<0.05 F/PBS、F/CT−CRME29H(0.01μg)、CT−CRME29Hもしくはナイーブに比較される、 p>0.05 F/AlOHもしくはRSV A2に比較される
b p>0.05 F/CT−CRME29H(0.1μg)に比較される.
c p<0.05 F/CT−CRME29H(0.01μg)、F/PBS、CT−CRME29Hもしくはナイーブ、p>0.05 F/CT−CRME29H(0.1μg)、F/AlOHもしくはRSV A2に比較される.
d p<0.05 F/PBS、F/CT−CRME29H(0.01μg)、CT−CRME29Hもしくはナイーブに比較される、 p>0.05 F/CT−CRME29H(1μg)、F/AlOHもしくはRSV A2に比較される
例11 ロタウイルス組み換えウイルス様粒子により免疫感作されたマウスの免疫応答
スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(sf−9)細胞(American Type Culture Collection,Manassas,VA)は、SF−900 II血清不含培地(Gibco−BRL,Grand Island,NY)において維持された。sf9細胞は、サル・ロタウイルスSAll株由来のVP2およびVP6遺伝子を発現する組み換えバキュロウイルス構築物により同時感染された(32)。
【0210】
放出される2/6−VLPは、次のように、これらの感染されたsf9細胞の増殖培地から精製された。細胞が、室温で830xg、30分間の遠心によって清澄にされた。次いで上澄液が、8000xg、30分間の遠心によってさらに清澄にされた。VLPは、TNCバッファー(10mMTris、140mMNaCl、10mM)CaCl2、pH8.0)中35%スクロースをとおして、96500xg、2時間で、2回の遠心によって上澄液から精製され、次いで、TNCバッファーに懸濁され、そして4℃で保存された。精製VLPは、SDS−PAGEによって、続いて銀およびコマシーブリリアントブルー染色によって解析されて純度を決定し、ウエスタンブロット解析でタンパク質組成を解析し、電子顕微鏡で粒子の姿を決定し、そしてBCAタンパク質アッセイで総タンパク質濃度を測定した。
【0211】
精製2/6−VLPのコマシーブリリアントブルー、銀染色およびウエスタンブロット解析は、VP2およびVP6タンパク質の存在、ならびにそれらの純度および特異モノクローナル抗体との免疫反応性を確認した。VLPの純度は、ゲルにおけるバンド強度から約95%であると評価された。さらに、これらの精製2/6−VLPの電子顕微鏡解析は、それらの形態学的姿を確認した(データ未掲載)。
【0212】
マウスは、次のように免疫感作された。この研究において使用されたBALB/cおよびCD−1マウスは、Charles River Laboratories(Storeridge,NY)から購入され、ロタウイルスの存在しない環境において飼育された。4週令BALB/cマウスは、0および2週目に、それぞれ2/6−VLP 100および10μgにより、いずれか経口(n=4)もしくはIN(n=5,n=4)に2回免疫感作された;各用量が、CT−CRME29H10μgとともに製剤化された。BALB/cマウスの第3群(n=4)は、CT−CRME29Hとともに2/6−VLPをINに受け、続いて経口ブースター免疫感作された(すなわち、混合群)。この実験における対照マウスは、CT−CRME29H(n=10)、1xTNCバッファー(n=5)もしくは2/6−VLPプラス1xTNCバッファー(n=5)により免疫感作された。各マウスは、1分間隔で交替に鼻孔中に、接種量20μl、1回に2μlをIN免疫感作された。血清および糞サンプルは、0,1,2,4,6,8,10,13週に全動物から収集され、そして産生されたロタウイルス特異的血清IgG、IgMおよびIgA抗体、ならびに糞IgGおよびIgAのレベルが、ELISAによって決定された。血清抗体結果は、図10および11に提示され;糞抗体結果は図13に提示される。13週目の血清サンプルは、IgG1およびIgG2aサブクラスを決定するために使用された。抗体サブクラスの結果は、図12に提示される。
【0213】
1:100希釈された免疫感作前血清および免疫感作前糞サンプルの1:2希釈液は、ELISAにおいて反応性を示さなかった。TNCバッファーもしくはCT−CRME29Hのみを受けている対照からの血清および糞が並行して解析された。対照群は、研究をとおしてロタウイルス特異的血清もしくは糞抗体を示さなかった。
【0214】
4週令CD−1マウスは、アジュバントとしてCT−CRME29Hを用いて上記のように0、2および13週目に、経口(n=4)もしくはIN(n=4)に3回免疫感作された。対照群(n=2)は、CT−CRME29Hのみを受けた。血清および糞サンプルは、0−9,11−14,26−28週に収集され、そしてロタウイルス特異的血清および糞抗体のレベルが決定された。
【0215】
糞および血清サンプルにおけるIgG、IgMおよびIgAの検出および定量では、96穴塩化ポリビニルミクロタイタープレート(Dynex Technologies,Chantilly,VA)が、リン酸バッファー食塩水(PBS)中に希釈された高免疫モルモット抗SAllロタウイルス血清によってコーティングされ、そして37℃で4時間または室温で一夜インキュベートされた。次いで、プレートは、5%BLOTTO(PBS中5%w/v無脂肪粉乳)を用いて37℃で2時間ブロックされた。懸濁保存サンプルは、1%BLOTTO中1:1希釈され、そしてプレートに添加された。次いで、プレートは、4℃で一夜インキュベートされ、その後、TNCバッファー+0.05%TweenTm20(TNC−T)を用いて3回洗浄された。ウサギ抗アカゲザル・ロタウイルス高免疫血清は、1%BLOTTO+2.5%正常モルモット血清(NGPS)中に希釈され、そして37℃で1時間プレートに添加された。次いで、プレートは、TNC−Tで3回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギIgG、IgMおよびIgA(Kirkegaad and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)が、1%BLOTTO+2.5%NGPS中に希釈され、そしてプレートに添加され、37℃で1時間インキュベートされた。次いで、プレートは、TNC−Tで4回洗浄された。TMB基質(Kirkegaad and Perry Laboratories)が添加され、生成される呈色反応が、室温で7分間発色させられた。反応は、1Mリン酸の添加によって停止された。ODは、ミクロプレートリーダー(BIO−TEK Instrument,Winooski,VT)を用いて450nmにおいて決定された。ブランクを超える0.1の測定値は、有意と見なされた。SAll保存ウイルスは、1%BLOTTO中に希釈され、そしてプレートに添加され、次いで、プレートは、4℃で一夜インキュベートされた。プレートは、TNC−Tを用いて3回洗浄された;その後、1%BLOTTO中1:1希釈された糞サンプル、または1%中連続希釈された血清サンプルが適用された。ネガティブ対照として、2並列の保存サンプルが、抗SAll抗体コーティングされてないウェルに添加された。プレートは37℃で2時間インキュベートされ、次いで、TNC−Tで3回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgG、IgMおよびIgAが、1%BLOTTO+2.5%NGPS中に希釈され、そしてウェルに添加され;免疫感作前抗体検出のために、ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgA+IgG+IgM(H+L)抗体が、同様に希釈され、そしてウェルに添加された。プレートは、37℃で1時間インキュベートされ、次いで、TNC−Tで4回洗浄された。プレートは、抗原検出ELISAのために上記のように発色された。IgGサブクラスを決定するために使用されたELISAプロトコールは、第2の抗体としてHRP標識ラット(モノクローナル)抗マウスIgG1およびIgG2a(Biosource International,Camarillo,CA)を用いるよう記述されたプロトコールの変法であった。
【0216】
Ishidaらによって記述されている免疫組織化学的アッセイが改変され、使用されて、2/6−VLPにより免疫感作されたマウスの血清中の抗ロタウイルスVP2およびVP6抗体を検出した。簡単に言えば、振盪フラスコにおける早期の対数増殖期sf9細胞が、濃度2.5x104細胞/ウェルにおいて96穴組織培養プレート中に接種され、次いで室温(RT)で1時間インキュベートされた。続いて、細胞は、感染多重度10においてVP2およびVP6遺伝子をコードしている組み換えバキュロウイルスにより感染され、そして感染は、28℃で3日間進行させられた。次いで、培養基が廃棄され、プレートは、真空オーブン中でRTで1時間乾燥され、そしてPBS中10%ホルマリン(10−15%メタノールを含有する37%ホルムアルデヒド溶液;Sigma)によりRTで30分間固定された。続いて、細胞は、RTで5分間、TNCバッファー中1%TritonX−100(Sigma)により透過性にされた。
【0217】
指定されたロタウイルスタンパク質を発現している感染細胞の各セットが、各BALB/cもしくはCD−1マウスからのチャレンジ前もしくは免疫感作後の血清に対して曝露され、続いて免疫学的に染色された。マウス血清サンプルは、5%FCSを用いてPBS中に連続希釈された。サンプルがウェルに添加され、そしてプレートは、37℃で2時間インキュベートされた。次いで、プレートはPBSによって4回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスIgG、IgMもしくはIgA抗体(Kirkegaad & Perry Laboratories)が、5%FCSとともにPBS中に添加され、そして37℃で1時間インキュベートされた。染色された細胞は、PBSによって2回ウェルを洗浄後、3−アミノ−9−エチル−カルバゾール基質(AEC)(Sigma)を用いて検出された。未感染sf9細胞、未免疫マウスからの血清、および免疫マウスからの免疫感作前血清が、ネガティブ対照として使用された。VP6(7D9,5E6)およびVP2(BP2)に対するモノクローナル抗体が、ポジティブ対照として使用された(50)。
【0218】
未免疫動物および2/6−VLPにより免疫感作された動物が、26週目(CD−1マウス)もしくは13週目(BALB/cマウス)に野生型マウスEDIMロタウイルス(51)のSD5010を用いて摂食によってチャレンジされた。EDIM株のタイターは、脱落(shedding)用量50(SD50)、成熟マウスの50%において糞のウイルス脱落を誘導するのに必要な用量として決定された。トリプシン活性化チャレンジウイルス(100μl)が、胃の酸性を中和するための4%重炭酸ナトリウム溶液100μlの経口投与後に投与された。ウイルスは、M199培地(Irvine Scientific,Santa Ana,CA)において希釈され、そしてウイルス保存溶液1ml当たりトリプシン保存液(1mg/ml)(Sigma Chemical Co,St.Louis,MO)10μlにより活性化された。チャレンジに続いて、糞サンプルが、9日間全動物から収集された。
【0219】
糞サンプル中に脱落するロタウイルス抗原が、ELISAによって測定され、そしてネットの光学濃度(OD)値、すなわちチャレンジ後の糞サンプルのODマイナス同じマウスからのチャレンジ前サンプルのOD、として表された。各動物についての脱落曲線下の面積が決定され、そして各動物の抗原脱落におけるパーセント減少(PRAS)が、対照動物の平均面積に対する各動物の曲線下の面積を比較することによって計算された。次いで、平均PRASが、各免疫群について計算された。50%以上のPRASレベルのみが、防御的と見なされた。結果は図14に提示される。
【0220】
統計的解析が、Windowsのバージョン8.0用SPSS(SPSS,Inc.,Chicago,IL)を用いて実施された。独立t検定が、チャレンジ前の幾何平均タイター値および群間のPRASを比較するために使用された。小数点以下3桁までが、P値を算出することに考慮された(0.000=0)。
【0221】
例12 アラビノース誘導プロモーターの使用によるCT−CRM E29H の発現増強
アラビノース誘導系の構築は、次のとおりであった:PCRプライマーは、pIIB29Hからの二シストロン(bicistron)をコードしているトキシンを増幅するために合成された。
プライマー #1, CT29 正 NheI: 5′-
TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATG AGC-3′ (配列番号:6);
プライマー #2, CT29 逆 HindIII: 5′-
GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3′ (配列番号:7)。
PCRフラグメントをコードしているCT−CRME29HctxAおよびctxBが、エンドヌクレアーゼ部位NheIおよびHindIIIを用いてpBAD18−Cm中にクローン化されて、構築物pCT18を得た。pCT18からのctxB(V.コレレ2125)遺伝子が、ClaIおよびHindIIIを用いて除去され、そしてV.コレレ569B株由来のctxB遺伝子をコードしていることが分かっているプラスミドpMGJ142からの類似するフラグメントにより置換された。得られる構築物、pPX7490は、アラビノースプロモーターの調節下で菌株569B由来のCT−CRME29HctxAおよびctxB遺伝子をコードしていて、そしてLTIIb−Bリーダー配列をもつ。
【0222】
CT−CRME29Hの大規模発現および精製のためのプロトコールが開発され、そして次のとおりであった:3Lのひだ付きフェルンバッハ(fluted Fernbach)フラスコが使用され、1フラスコ当たりHy−Soy増殖培地(1リットル当たり:Hy−Soy 10g;酵母エキス 12.5g;塩化ナトリウム 5g;リン酸ナトリウム、1塩基性 3.3g;リン酸ナトリウム、2塩基性 13.1g)1Lが入れられた。スターター保存調製物では、クロラムフェニコール20μg/mlおよび滅菌50%グルコース20mlが、1個のフラスコに添加された(1%最終グルコース濃度)。次いで、フラスコは、pPX7490により形質転換され、−70℃で凍結保存されていたDH5α300μlを用いて植菌された。フラスコは、200rpmにおいて振盪しつつ30℃で一夜培養された。使用される全増殖培地が、翌日、200rpmにおいて37℃一夜の振盪によって予め暖められた。翌日、一夜培養液の1:40希釈は、クロラムフェニコール20μg/mlおよび炭素源として滅菌グリセロール10ml(1%最終グリセロール濃度)を補足されたHy−Soy増殖培地中に作成された。この培養は、Fernbachフラスコ中でOD6004.5−5.5(バイオリアクターにおけるよりも高い)まで37℃で発芽後増殖された。次いで、培養は、L−アラビノース20ml(0.5%最終濃度)を用いて誘導され、そしてさらに3時間インキュベートされた。3時間のインキュベーション後、多量のトキシンは細胞に結合されていた。細胞が遠心によって収穫され、そしてペレットは、10mMNaPO4、1mMEDTA(pH7.0)バッファー中に、元の培養液容量9%に再懸濁された。細胞懸濁液は、ミクロフルーダイザーをとおして機械的に破壊され、そして8500xgで10分間遠心されて細胞破片が除去された。細胞溶解液(上澄液)は、さらに、45Tiローターにおいて42,000rpm1時間、160,000xgAVで清澄化された。清澄細胞溶解液は、10mMNaPO4(pH7.0)で平衡化されたカルボキシメチル(CM)−SepharoseTMカラム(Pharmacia)上に負荷された。約300mlのCM−SepharoseTMが、培養液容量10リットル当たり使用された。細胞溶解液は、カラム上に速度0.102cm/min(2ml/min)において負荷された。カラムは、10mMNaPO4(pH7.0)の10−15カラム容量を用いて0.255cm/min(5ml/min)において十分に洗浄されて混入物が除去された。CT−CRME29Hホロトキシンは、10mMNaPO4(pH8.3)の4カラム容量を用いて0.255cm/minにおいて溶出された。CT−CRME29H含有溶出液は、濾過によってバッファー交換されるか、またはPBSに対して透析され、次いで4℃で保存された。
【0223】
例13 単純ヘルペスウイルス2型の全長糖タンパク質DをコードしているプラスミドDNAにより免疫感作されたBALB/cマウスの免疫応答
6−8週令メスBALB/cマウスが、0.25%ブピバカイン(bupivacaine)とともに製剤化され、そして野生型CT、CT−CRME29Hによってアジュバントされるか、またはアジュバントなしで、単純ヘルペスウイルス2型の全長糖タンパク質D(gD2)をコードしているプラスミドDNA(pDNA)により免疫感作された(gD2遺伝子を含有しているプラスミドは、引用によって本明細書に組み入れられている、Pachukらにより記述されている(40))。動物は、1次後3週目に2次免疫感作を与えられ、最後の注射後2週目に安楽死された。免疫感作プロトコールは次のとおりであった。
【0224】
【表34】
【0225】
024=gD2遺伝子を含有するpDNA;023=gD2遺伝子インサートのないpDNA骨格
ID=皮内;IM=筋肉内
群4はポジティブ対照として使われ;群5はネガティブ対照として使われた。
【0226】
増殖アッセイは、次のとおり実施された:1x105脾細胞が、10%FCSを含む完全RPMI培地においてgD2タンパク質200ng/mlの存在もしくは不在下で培養された。5%CO2存在下で37℃4日の培養後、培養は、3[H]によって一夜パルスされた。3[H]取り込みがβカウンターにおいて測定された。カウントは、SI(刺激指数=抗原刺激存在下のカウント割る抗原刺激不在下のカウント)として報告された。結果は表34に提示される。
【0227】
ELISAは、血清および膣洗液における抗原特異的体液性応答を測定するために実施された。簡単に言えば、96穴平底プレート(Maxisorb,Nunc)が、濃度0.4μg/mlにおいて精製gD2タンパク質によって4℃で一夜コーティングされた。プレートは、PBSで3回洗浄され、そして室温で1時間4%BSAによってブロックされた。血清サンプル50μl(1:100希釈)または膣洗液サンプル50μlがプレートに添加された。血清については1時間そして膣洗液については4℃で一夜インキュベーション後、プレートはPBSによって5回洗浄され、そしてペルオキシダーゼ共役抗マウスIg(Sigma,St.Lous,MO)1:3000希釈液が添加され、そしてプレートは1時間インキュベートされた。プレートは、基質3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)−H2O(Biotecx,Houston,TX)を添加する前に、PBSによって洗浄された。呈色は、30分間発色させられ、その後EMAXミクロプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyale,CA)において450nmで読み取られた。結果は、表35(血清)および表36(膣洗液)に提示される。
【0228】
サイトカインは、上記のように標準ELISAを用いて測定された。プレートは、それぞれ24時間もしくは72時間のgD2−刺激培養液の上澄液からのいずれかIL−5もしくはγ−インターフェロンを補足するために適当にコーティングされた。結果は表37に提示される。
【0229】
【表35】
【0230】
【表36】
【0231】
【表37】
【0232】
【表38】
【0233】
【表39】
【0234】
【表40】
【0235】
【表41】
【0236】
【表42】
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、CT−CRMのガングリオシドGM1への結合能力を示す。各CT−CRMは、初発濃度3μg/mlにおいて3倍希釈され、そして2並列で試験された。結合能力は、各希釈について410nmにおける平均吸光度として表された。
【図2】 図2は、CT−CRME29Hアジュバントの有無における髄膜球菌の(meningococcal)組み換えピリン(rピリン(rpilin))により鼻内に免疫感作されたマウス(n=10/群)、または免疫されなかったマウスであって、各群が、次いで、同族の髄膜球菌菌株によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり平均Log10cfuにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図3】 図3は、CT−CRME29Hアジュバントの有無における髄膜球菌rピリン、CT−CRME29Hアジュバントとともに髄膜球菌クラス1外膜タンパク質(PorA)、CT−CRME29HアジュバントとともにKLHにより鼻内に免疫感作されたマウス(n=5/群)、または免疫されなかったマウスであって、各群が、次いで、同族の髄膜球菌菌株によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり平均Log10cfuにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図4】 図4は、各々CT−CRME29Hでアジュバントされた、髄膜球菌のrピリン、髄膜球菌H355株由来PorA、髄膜球菌870227株由来PorA、熱失活された髄膜球菌870227株全細胞またはKLHにより鼻内に免疫感作されたマウス(n=10/群)であって、各群が、次いで、異種の髄膜球菌菌株(870227)によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり髄膜球菌870227株の平均Log10cfuにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図5】 図5は、CT−CRME29HもしくはMPLTMアジュバントとともに髄膜球菌H355株由来PorA、MPLTMアジュバントとともにKLH、またはMPLTMアジュバントとともに熱失活された髄膜球菌870227株全細胞により皮下に免疫感作されたマウス(n=10/群)であって、各群が、次いで、異種の髄膜球菌菌株(870227)によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり髄膜球菌870227株の平均Log10cfuにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図6】 図6は、呼吸シンシチアルウイルス(RSV)感染標的細胞に対する抗原依存性細胞溶解活性の第1アッセイを、細胞溶解%対エフェクター:標的比として示す。
【図7】 図7は、Fタンパク質+アジュバントを用いる免疫感作による、RSVチャレンジに対するマウス肺の防御の第1アッセイであって、肺のウイルスタイターが、1g当たりLog10PFUとして測定されるアッセイを示す。
【図8】 図8は、RSV感染標的細胞に対する抗原依存性細胞溶解活性の第2アッセイを、細胞溶解%対エフェクター:標的比として示す。
【図9】 図9は、Fタンパク質+アジュバントを用いる免疫感作による、RSVチャレンジに対するマウス肺の防御の第2アッセイであって、肺のウイルスタイターが、1g当たりLog10PFUとして測定されるアッセイを示す。
【図10】 図10は、CT−CRME29Hアジュバントの有無における2/6−VLPにより鼻内に免疫感作されたBALB/cマウスにおけるロタウイルス特異的血清抗体応答を示す。BALB/cマウスは、CT−CRME29Hを含む(n=4)か、または含まない(n=5)2/6−VLPにより鼻内に免疫され、そしてロタウイルス特異的IgG(図10A)、IgM(図10B)およびIgA(図10C)のレベルが測定された。標準偏差が示される。
【図11】 図11は、2/6−VLPにより免疫感作されたBALB/c近交系マウスにおけるロタウイルス特異的血清抗体応答を示す。BALB/cマウスの群は、0および2週目に2/6−VLPプラスCT−CRME29Hにより、経口的に(四角、n=4))、鼻内に(ひし形、n=5)または組み合わせ(鼻内プラス経口、丸、n=4)において免疫感作された。血清サンプルが、示された週において各群の個々のマウスから採取され、そして血清IgG(図11A)、IgM(図11B)およびIgA(図11C)のレベルが、ELISAによって各マウスについて決定された。幾何平均タイター(GMT)が各群について計算され、そして週後の免疫感作に対してプロットされた。
【図12】 図12は、BALB/cマウスにおけるIgG1およびIgG2抗体サブクラスを示す。ロタウイルス2/6−ウイルス様粒子(VLP)プラスCT−CRME29Hにより経口もしくはINに免疫感作されたBALB/cマウスのチャレンジ前血清が、IgGサブクラスを決定するために使用された。標準偏差が示される。
【図13】 図13は、2/6−VLPにより免疫感作された近交系BALB/cマウスにおけるロタウイルス特異的腸管抗体応答を示す。BALB/cマウスの群は、図11について記述されたように2/6−VLPプラスCT−CRME29Hにより免疫され、そして腸管IgA(図13A)およびIgG(図13B)のレベルが測定された。ロタウイルス特異的腸管IgMは、いかなるマウスにも検出されなかった。
【図14】 図14は、マウスロタウイルスによるチャレンジ後の、2/6−VLPで免疫感作されたBALB/cおよびCD−1マウスの防御を示す。図14Aは、CT−CRME29Hを含む(n=5)か、または含まない(n=4)2/6−VLPにより免疫感作されたマウス間の抗原脱落における減少パーセント(PRAS)の比較を示す。各マウスについてのPRAS(○)および各群の平均値(−)が計算された。図14Bは、指示される異なる経路によって、2/6−VLPプラスCT−CRME29Hにより免疫感作されたBALB/cマウスの群を示し、防御レベルが、上記のように決定された。図14Cは、上記のように経口的および鼻内に、2/6−VLPプラスCT−CRME29Hにより免疫感作された非近交系CD−1マウスの群を示す。26週目において、免疫および対照マウスがチャレンジされ、そしてPRASが、上記のように計算された。経口群(n=4)では、1マウスが、チャレンジ前に死んだ(防御についてはn=3)。
【配列表】
Claims (17)
- 病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原および有効なアジュバント量の変異コレラホロトキシンを含んでなる抗原組成物であって、該コレラホロトキシンが、野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そして該コレラホロトキシンのAサブユニットの位置29におけるグルタミン酸残基がヒスチジン残基により置換されており、かつ、該ホロトキシンが、該抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強する、抗原組成物。
- 選ばれる抗原が、ヘモフィルス・インフルエンゼ(Haemophilus influenzae)P4外膜タンパク質、ヘモフィルス・インフルエンゼP6外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ(Hericobacter Pylori)ウレアーゼタンパク質または呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質である、請求項1記載の抗原組成物。
- 選ばれる抗原が、ヘモフィルス・インフルエンゼP4外膜タンパク質またはヘモフィルス・インフルエンゼP6外膜タンパク質である、請求項2記載の抗原組成物。
- 選ばれる抗原が、ヘリコバクター・ピロリ ウレアーゼタンパク質である、請求項2記載の抗原組成物。
- 選ばれる抗原が、呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質である、請求項2記載の抗原組成物。
- 希釈剤もしくはキャリアーをさらに含有する、請求項1記載の抗原組成物。
- 変異コレラホロトキシンに加えて第2のアジュバントをさらに含む、請求項1記載の抗原組成物。
- 少なくとも1つのさらなる変異が、アミノ酸29以外の位置でコレラホロトキシンのAサブユニットになされている、請求項1記載の抗原組成物。
- 少なくとも1つのさらなる変異が、アミノ酸の位置7のアルギニン、位置9のアスパラギン酸、位置11のアルギニン、位置44のヒスチジン、位置53のバリン、位置54のアルギニン、位置61のセリン、位置63のセリン、位置70のヒスチジン、位置97のバリン、位置104のチロシン、位置106のプロリン、位置107のヒスチジン、位置110のグルタミン酸、位置112のグルタミン酸、位置114のセリン、位置127のトリプトファン、位置146のアルギニンおよび位置192のアルギニンについての置換としてなされている、請求項8記載の抗原組成物。
- 請求項1記載の抗原組成物を有効成分として含んでなる病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
- 請求項2記載の抗原組成物を有効成分として含んでなるヘモフィルス・インフルエンゼ抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
- 請求項4記載の抗原組成物を有効成分として含んでなるヘリコバクター・ピロリ抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
- 請求項5記載の抗原組成物を有効成分として含んでなる呼吸合胞体ウイルス抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
- コレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸残基がヒスチジン残基で置換されている免疫原性変異コレラホロトキシンをコードしているDNA配列を含み、かつ、該DNA配列がアラビノース誘導プロモーターに操作可能に結合されている、単離、精製されたDNA配列を含有するプラスミド。
- 請求項14記載のプラスミドにより形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションされた宿主細胞。
- 野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸残基がヒスチジン残基で置換されている、免疫原性変異コレラホロトキシンの製造方法であって、請求項14記載のプラスミドにより宿主細胞を形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションする工程、およびこうして得られた宿主細胞を該宿主細胞により該免疫原性解毒化タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程を含んでなる、上記方法。
- 抗原組成物を製造するための、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原と併用される、有効なアジュバント量の変異コレラホロトキシンの使用であって、該ホロトキシンホロトキシンが、野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのAサブユニットの位置29のグルタミン酸残基がヒスチジン残基により置換されており、かつ、該ホロトキシンが、該抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強する、上記使用。
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