MXPA06013448A

MXPA06013448A - Proteina alterada que liga a la fibronectina en staphylococcus aureus.

Info

Publication number: MXPA06013448A
Application number: MXPA06013448A
Authority: MX
Inventors: Steven Morris Baker; Yury Vladimirovich Matsuka; Elizabeth Teremy Anderson
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-17
Publication date: 2007-01-23
Also published as: IL179282A0; EP2301957A3; US20070218075A1; BRPI0511429A; JP2010279391A; CN1953991A; EP2301957A2; CA2562037A1; ZA200609647B; JP2008502363A; WO2005116064A3; AU2005247910A1; KR20070029708A; EP1749024A2; US7771731B2; WO2005116064A2; TW200540182A; AR049182A1

Abstract

Una proteina (Fnb) aislada y alterada del S. aureus que liga a la fibronectina que tiene por lo menos una mutacion en un aminoacido seleccionado de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus se ha descrito. El reemplazo de estos residuos reactivos dentro de la proteina que liga a la fibronectina convierte esta proteina en menos capaz que la Fnb tipo natural de reticular covalentemente con fibronectina y fibrina. La proteina alterada que liga con la fibronectina que interfiere efectivamente con la adhesion del S. aureus a la fibronectina y fibrina, y por lo tanto, un composicion inmunogenica que comprende tal Fnb alterado que exhibe propiedades inmunogenicas mejoradas y es mas seguro para usar.

Description

el ligado del Fnb a estas proteínas humanas, y por lo tanto mejora la adherencia bacteriana al tejido anfitrión. Esto indica que el ligado reversible a proteínas humanas sirve solamente como una fase inicial en el proceso de la adhesión stafilococcal al tejido anfitrión En un estudio reciente, se demostró que la proteína stafilococcal que liga a la fibronectina a (FnbA) sino como un sustrato para la enzima humana llamada plasma transglutaminasa (Matsuka et al. 2003). Esta es una función novedosa, previamente desconocida para la FnbA. El plasma transglutaminasa también conocido como Factor Xllla es una enzima que cataliza la reticulación covalente (irreversible) de un número muy limitado de proteínas humanas (Tabla 1 ) resultando en la formación de homo- y heteropolímeros de alta masa molecular. El Factor XIII es un miembro de la familia de la transglutaminasa de enzimas que catalizan la formación del enlace isopéptido sea dentro o entre cadenas de polipéptidos. El Factor XIII circula en la sangre y por lo tanto se considera que es una enzima extracelular, mientras que los tejidos de transglutaminasas (TG) (por ejemplo, el hígado TG, queratinocito TG, TG epidérmico, el TG de próstata y el eritrocito TG) están localizados al interior de las células, y por lo tanto, actúan como enzimas intracelulares (Aeschlimann et al. 1994). Distintas transglutaminasas reconocen la misma proteína como sustrato, pero frecuentemente con una afinidad diferente y/o especificidad diferente. En general la especificidad del sustrato para el Factor Xllla es más en general, la especificidad del sustrato para el Factor Xllla es más escasa que para el tejido de transglutaminasas (Gorman et al. 1981 ; Gorman et al. 1984; Fesus et al. 1986).

Las reacciones de reticulación catalizadas por el Factor Xllla son pasos importantes en diversas reacciones fisiológicas normales incluyendo la coagulación de la sangre, la cicatrización de heridas, y la fibrinolisis. La reticulación de la proteína catalizada por el Factor Xllla tiene lugar mediante la formación de enlaces covalentes entre los residuos aminoácidos específicos de glutamina (GIn) y lisina (Lys). Se ha demostrado que la Fnba puede ser reticulada fácilmente en fibronectina humana y fibrina por el Factor Xllla (Matsuka et al. 2003). Así, luego de la inmunización con Fnba, el Fnba queda sometido a reticulación covalente inmediata (irreversible) con la fibronectina y la fibrina. Esta formación de un complejo irreversible de un antígeno con proteínas humanas muy probablemente compromete la respuesta inmune y lleva a la producción de anticuerpos que carecen de actividad inhibitoria/neutralizante.

Así, existe una necesidad de identificar residuos de aminoácidos reactivos específicos (GIn y Lys) dentro de la proteína stafilococcal tipo silvestre que liga la fibronectina que estén involucrados directamente en la reticulación covalente catalizada por el Factor Xllla con proteínas humanas, y que sustituyen esos residuos para producir una forma alterada de Fnb que tenga una reactividad reducida a la coagulación del Factor Xllla y que inhiba efectivamente la reticulación y ligue de manera irreversible a la fibronectina y a la fibrina.

DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN De acuerdo a lo anterior, esta invención pertenece a una proteína alterada que liga a la fibronectina de S. aureus en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos correspondientes a glutamina (Gln)103, Gln105, lisina (Lys)157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 de la FnbA del S. aureus cepa ATCC49525,en donde la Fnb alterada es menos capaz que la Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirvan como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, y las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, en una modalidad, estos aminoácidos son mutados a la alanina. En una modalidad adiciónalo la Fnb alterada aislada es derivada de la FnbA o FnbB.

La invención también se relaciona con una Fnb alterada como se describió antes, en donde la alteración es una mutación del aminoácido Lys702.

La invención también se relaciona con un Fnb alterado según se describió, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de la proteína y la cepa S. aureus como sigue: Proteína Cepa Residuos FnbA Mu50 Gln134, Gln136. Lys188, Lys534, Lys651, Lys793, Gln814, Gln861 FnbA N315 Gln134, Gln136. Lys188. Lys534, Lys651. Lys793, Gln814, Gln861 FnbA MW2 Gln139. Gln141. Lys539. Lys656, Lys798, Gln819, Gln866 FnbA SSA- Gln147. Gln149. Lys547, Lys664, Lys806, Gln827, Gln874 476 FnbA COL Gln139, Gln141. Lys655, Lys797, Gln865 FnbA 8325-4 Gln139, Gln141 , Lys655, Lys797, Gln865 FnbA EMRSA- Gln147, Gln 49, Lys549, Lys666, Gln791 , Gln838 16 FnbB Mu50 Gln111, Lys602. Gln765, Gln812 FnbB N315 Gln111, Lys602, Gln765, Gln812 FnbB MW2 Lys598, Lys740, Gln808 FnbB MSSA- Lys598, Lys740, Gln808 476 FnbB COL Lys591, Lys733, Gln801 FnbB 8325-4 Lys591, Lys733 Gln801 Esta invención pertenece también pertenece a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína alterada que liga la fibronectina del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys 57, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 de la FnbA a partir de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde la proteína alterada que liga la fibronectina retiene la inmunogenicidad y, cuando es incorporada en una composición inmunogénica y administrada a invertebrado, es menos capaz que la Fnb tipo silvestre de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, el Factor Xllla o el tejido de transglutaminasa, y las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina.

La invención también se relaciona con una molécula de ácido nucleico aislado como ya se describió, en donde la alteración es una mutación del aminoácido Lys702.

La invención también pertenece o se relaciona con una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico aislada descrita aquí operativamente ligada a una secuencia reguladora.

La invención también se relaciona con una célula anfitriona recombinante que comprende una construcción de ácido nucleico descrita aquí, lo mismo que un método para producir una proteína alterada que liga a la fibronectina del S. aureus descrita aquí, el método comprende mantener una célula recombinante de la invención bajo condiciones adecuadas para la expresión de la proteína alterada que liga a la fibronectina.

La invención también pertenece al uso de la proteína alterada que liga a la fibronectina, o la célula anfitriona recombinante para la expresión de la misma, para composiciones inmunogénicas que producen una respuesta inmune contra el S. aureus.

La invención se relaciona adicionalmente con una composición inmunogénica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una proteína alterada que liga a la fibronectina del S. aureus que retiene la inmunogenicidad y, cuando se incorpora en la composición inmunogénica y es administrada a un vertebrado, es menos capaz que la Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven coo sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, tal como la fibronectina y la fibrina, la Fnb alterada no mejora el ligado de la Fnb tipo natural a la fibronectina y a la fibrina luego de infección subsiguiente fdel vertebrado con S. aureus. La alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que cosiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus. La composición inmunogénica también puede comprender un adyuvante.

La invención también se relaciona con un vehículo fisiológicamente aceptable y una molécula de ácido nucleico que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes al Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. Aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogenicidad y, cuando se incorpora en la composición inmunogénica y es administrado a un vertebrado, el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina., y no mejoran el ligado de la Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

La invención se relaciona también con composiciones inmunogénicas como se describieron antes, en donde la alteración es una mutación del aminoácido Lys702.

La invención también se relaciona con un método para inmunizar un vertebrado contra el S. aureus, que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunológicamente efectiva de una proteína alterada que liga a la fibronectina del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos una aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos correspondientes al Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde la proteína alterada que liga a la fibronectina retiene la inmunogenicidad y, cuando se incorpora a una composición inmunogénica y es administrada a un vertebrado, es menos capaz que la Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o el tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina., y no mejoran el ligado de la proteína que liga la fibronectina tipo natural a dichas proteínas humanas luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

La invención se relaciona adicionalmente con un método para inmunizar un vertebrado contra el S. aureus, que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunológicamente efectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína alterada que liga a la fibronectina del S. aureus, opcionalmente con un agente facilitador de transfección, en donde la alteración es una mutación de por lo menos una aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes al Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde la proteína alterada que liga a la fibronectina retiene la inmunogenicidad y, cuando se incorpora a una composición inmunogénica y administrada a un vertebrado, es menos capaz que la Fnb tipo natural de ligar covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor XI Na o tejido de transglutaminasa, tal como fibronectina y fibrina, y no mejoran el ligado de la proteína que liga la fibronectina natural a dichas proteínas humanas luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

En una modalidad el vertebrado es un humano seronegativo.

La invención también se relaciona con métodos para inmunizar, como ya se describió, en donde la alteración es una mutación del aminoácido Lys702.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra la incorporación catalizada por el Factor Xllla de la dansilcadaverina (paneles A y C) y dansil-PGGQQIV (paneles B y D) como muestras en el rFnbA. Las reacciones de modificación fueron llevadas a cabo entre 4 y 18 horas. Después de la remoción de las muestras que no reaccionaron modificadas durante 4 horas (pista 1 ) y 18 horas (pista 3) las muestras de rFnbA fueron analizadas por SDS-PAGE. Alternativamente, las muestras de rFnbA modificadas durante 4 y 18 horas fueron sometidas a proteólisis limitada por trombina y luego se analizaron por SDS-PAGE (pistas y 4). Después de la electroforesis los geles fueron fotografiados bajo luz ultravioleta (paneles C y D) y luego manchados con Coomassie Brilliant Blue (paneles A y B). Las flechas muestran las posiciones de las rFnbA modificadas en probeta y sus fragmentos generados por trombina. La pista 5 en cada panel contiene estándares de masa molecular como se indicó.

La figura 2 muestra la separación HLPC de los péptidos marcados con dansilcadaverina de la digestión de la tripsina del rFnbA modificado por el Factor Xllla. La incorporación catalizada por el Factor Xllla de la dansilcadaverina en el rFnbA se llevó a cabo entre 4ó a cabo entre 4 (paneles A y B) y 18 horas (paneles C y B). Las preparaciones de rFnbA marcadas con dansilcadaverina fueron digeridas por tripsina y los péptidos fueron separados sobre un Aquapore RP-300 C8 que es una columna de fase inversa. La elusión fue monitoreada por absorbancia en 210 nm lo mismo que por fluorescencia en 550 nm. Los picos fluorescentes (paneles B y D) 2, y 3 (panel B) fueron recolectados, y después de una segunda ronda de cromatografía de fase inversa sometida a secuencia de terminal NH2 y análisis espectral de masa.

La figura 3 ilustra la separación HPLC de los péptidos marcados con dansilcadaverina de la digestión de la proteasa Glu-C del rFnbA modificado por el Factor Xllla. La incorporación de dansilcadaverina en rFnbA catalizada por el Factor XIII fue llevada a cabo durante 4 (paneles A y B) y 18 horas (paneles C y D). Las preparaciones de rFnbA marcadas con dansil-PGGQQIV fueron digeridas por la proteasa Glu-C y los péptidos fueron separados sobre una Aquapore RP-300 C8 de columna de fase inversa. La elusión fue monitoreada por absorbancia en 210 nm lo mismo que por fluorescencia en 550 nm. Los picos fluorescentes 1 (paneles B y D) 2, 3, 4, 5, 6 y 7 (panel D) fueron recolectados, y después de una segunda ronda de cromatografía de fase inversa se sometió a secuencia de terminal NH2 y análisis espectral de masa.

La figura 4 ilustra la separación HPLC de los péptidos marcados con dansil-PGGQQIV de la digestión de la proteasa Glu-C del rFnbA modificado por el Factor Xllla. La incorporación de la dansil-PGGQQIV en la rFnbA catalizada por el Factor Xllla se llevó a cabo durante 4 (paneles A y B y 18 horas). Las preparaciones de rFnbA marcadas con dansilcadaverina fueron digeridas con la proteasa Glu-C y los péptidos fueron separados sobre una columna de fase inversa Aquapore RP-300 C8. La elusión fue monitoreada por absorbancia en 210 nm lo mismo que por fluorescencia en 550 nm. El pico fluorescente ilustrado por un * (panel B) u los picos 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7 (panel D) fueron recolectados, y después de la segunda ronda de cromatografía de fase inversa, se sometieron a secuencia de terminal NH2 y análisis espectral de masa.

La figura 5 ilustra la localización de los residuos Gln y Lys reactivos con el Factor Xllla dentro de la secuencia de aminoácido del Fnba tipo natural. Esta es una ilustración esquemática de la organización estructural del rFnbA (residuos Ala1-Pro839) de la cepa ATCC49525 del S. aureus usada en este estudio (arriba) y su secuencia de aminoácido (abajo) (SEQ ID NO:1). La figura 5 muestra la localización de las regiones principales: A-región de ligado a fibrinogen; B1 y B2-repetidos homólogos de función desconocida; Du, D1 , D2, D3, y D4 repetidos de ligado de fibronectina. Las flechas muestran las posiciones del Gln reactivo al Factor Xllla-(103, 105, 783, y 830) y residuos de Lys (157, 503, 620, y 762) dentro de las regiones A, Du, D2, y D4 del FnbA. Las letras en negrilla denotan los mismos residuos de Gln y Lys que reaccionan con el Factor Xllla en la secuencia principal de FnbA. Las letras subrayadas ilustran la localización de los sitios de división de trombina predichos Arg202-Gly203.

La figura 6 ilustra la alineación de las secuencias de aminoácido del FnbA y el FnbB de diversas cepas del S. aureus, (SEQ ID NOS: 1-14). Las regiones que rodean los residuos de Gln y Lys reactivos al Factor Xllla son mostradas. Las posiciones de los residuos Gln y Lys reactivos identificados en la parte superior corresponde a aquellas moléculas del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus. Las letras en negrilla de las secuencias principales de las especies FnbA y FnbB resaltan los sitios aceptor GIn y donor Lys reactivos con el Factor Xllla conservados. Los alineamientos de las secuencias múltiples se llevan a cabo utilizando el programa CLUSTAL W (1.81 ).

La figura 7 ilustra una representación esquemática del tipo natural y mutado de las especies Fnba usadas en este estudio (arriba) y el análisis SDS-PAGE de las proteínas aisladas (abajo). Esta figura muestra la localización de las regiones principales en el FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus: región-A ligado con fibrin(ogen); repetidos B1 y B2 homólogos de función desconocida; y Du, D1 , D2, D3, y repetidos D4 de ligado con fibronectina. Las posiciones de los residuos GIn y de las mutaciones Gln?Ala introducidas son indicadas por triángulos cerrados mientras que las posiciones de los residuos Lys reactivos y las mutaciones Lys?Ala introducidas son mostradas por diamantes abiertos. Las representaciones esquemáticas de as especies de FnbA y el análisis SDS-PAGE (4-20% gel) de las proteínas purificadas se muestran en el siguiente orden: 1-FnbA tipo natural; 2-1 Q FnbA mutante; 3-4Q4K FnbA mutante. Las pistas externas en el gel contienen los estándares de masa molecular como se indicó.

La figura 8 ilustra la incorporación catalizada por Factor Xllla de dansilcadaverina (A) y la probeta de dansil-PGGQQIV (B) en el tipo natural y las formas mutadas de FnbA. La incorporación de la dansilcadaverina fue llevada cabo en 20 mm Tris, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 5 mM de DTT, 5 mM de CaCI2, mientras que la incorporación del dansil-PGGQQIV fue llevada a cabo en 20 mM de Tris, pH 8.5, 15 mM de NaCI, 5 mM de DTT, 5 mM de CaCI2. las reacciones de control fueron llevadas a cabo también en los mismos amortiguadores que contenían 2 mM de EDTA. Se removieron alícuotas en los tiempos de punto indicados, se mezclaron con SDS, se calentaron y se analizaron por SDS-PAGE sobre 4 a 20 gradientes de gel. Las alícuotas removidas de las reacciones de control a 60 (A) y 120 min (B) son macadas con asteriscos. Después de la electroforesis los geles fueron fotografiados bajo luz ultravioleta (A y B abajo) yn luego se marcaron con Coomassie Brilliant Blue (A y B, arriba). Las pistas externas en los geles contienen los estándares de masa molecular como se indicó.

La figura 9 ilustra la reticulación catalizada por el Factor XI lia del tipo natural y la forma mutada del FnbA a la fibrina. Como se indicó en los puntos de tiempo, las reacciones fueron terminadas y analizadas por SDS-PAGE sobre un gradiente de gel de 3 a 8% bajo condiciones de reducción. Después de la electroforesis los geles fueron marcados con Coomassie Brilliant Blue (A) o sometidos a transferencia de membranas de nitrocelulosa seguido por inmunomarcado anti-FnbA (B) y un anticuerpo de anti-fibrinogen a de cadena (C). Is flechas muestran las posiciones del FnbA y las cadenas a, ß, y ? de fibrina, y las cadenas reticuladas ?? de fibrina. El producto principal de mayor movilidad de la reticulación entre FnbA y la cadena de fibrina a se ha designado como a, mientras que los productos de baja movilidad de reticulación se han ilustrado como b, c, y d. La pista izquierda en cada panel contiene los estándares de masa molecular que tienen, desde la parte superior a la parte inferior, los siguientes valores Mr. 250, 150, 100, 75, 50, y 37 kDa.

La figura 10 ilustra la proporción la de reticulación catalizada por Xllla del tipo natural y las formas mutadas de FnbA a la cadena a de fibrina. La cantidad de FnbA tipo natural monomérico remanente (no reticulado) (círculos llenos), 1 Q FnbA (círculos vacíos), y 4Q4K FnbA (triángulo llenos) fueron ensayados como se describió en Materiales y Métodos y se gráfico como una función del tiempo.

La figura 11 ilustra la reticulación catalizada por el Factor Xllla de las formas de tipo natural y mutada del FnbA a la fibronectina. Como se indicó en los puntos de tiempo, las reacciones fueron terminadas y analizadas por SDS-PAGE sobre un gradiente de 4-20% de gel bajo condiciones de reducción. Después de la electroforesis los geles fueron marcados con Coomassie Brilliant Blue (A), o sometidos a transferencia a membranas de nitrocelulosa seguido por inmunomanchado con anticuerpos anti-FnbA (B) y anti-fibronectina (C). Las flechas muestran las posiciones del FnbA y la fibronectina. Los productos de reticulación entre FnbA y fibronectina son ilustrados como a, b, c, y d. La pista de mano izquierda en cada panel contiene los estándares de masa molecular que tienen desde, la parte superior a la inferior, los siguientes valores Mr: 250, 150, 100, 75, y 50 kDa.

La figura 12 ilustra la proporción de reticulación catalizada por Xllla de las formas tipo natural y mutadas del FnbA a la fibronectina. La cantidad de FnbA tipo natural monómerica remanente (no reticulada) (círculo llenos), 1Q FnbA (círculos vacíos), y 4Q4K FnbA (triángulo llenos) fueron ensayados como se describió en Materiales y Métodos y se gráfico como una función del tiempo.

La figura 13 muestra el espectro de masa MALDI-TOF del péptido aislado marcado con dansil-PGGQIV- (pico fluorescente 3 (Anderson et al. 2004)) a partir de la digestión de la proteasa Glu-C del FnbA tipo molecular modificado por el Factor Xllla.

La figura 14 muestra una alineación de las secuencias de aminoácido de las especies FnbA y FnbB de diversas cepas de S. aureus. La región que rodea el Lys702 que reacciona al Factor Xllla se muestra. La posición del residuo Lys reactivo identificado en la parte superior corresponde con aquella del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus. La alineación de secuencia múltiple fue llevada a cabo usando el programa CLUSTAL W (1.81) (Thompson et al. 1994).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El FnbA es reticulado covalentemente hacia la fibronectina o la fibrina por la acción de la transglutaminasa del Factor Xllla, resultando en la formación de homo y heteropolímeros que se ligan al receptor. El Factor de coagulación Xllla o el plasma transglutaminasa (EC 2.3.2.13) pertenece a la clase transamidasa de enzimas que catalizan la reticulación covalente de sustratos de proteína específicos mediante la formación de enlaces intramoleculares de E-(Y-glutamil)lisina isopéptido. La reticulación ocurre por vía de una reacción de transferencia de acilo en el cual el grupo ? carboxiamida de la glutamina sirve como el donor de acilo (aceptor de amina) y el grupo e-amino de la lisina sirve como el aceptor de acilo (donor) de amina (Henschen y McDonagh 1986; Lorand 2001 ).

El Factor XIII circula en la sangre como un precursor de tetrámero no activo, A2B2 que está compuesto de dos subunidades catalíticas A y dos subunidades reguladoras B. Luego de la exposición a la trombina el zimogen de Factor XIII es sometido a activación dependiente de Ca2+-al Factor Xllla (Factor XIII activado) que cataliza subsiguientemente la formación de los enlaces covalentes entre las cadenas ? y las cadenas a de un coágulo de fibrina. Esta reacción representa el evento final en la cascada de coagulación de sangre y es esencial para la hemostasis normal. El Factor Xllla también está involucrado en la incorporación covalente de diferentes proteínas humanas en coágulos de fibrina por el mismo mecanismo. Ver Tabla 1. Entre ellas están la fibronectina y la a2-antiplasmina cuyas reticulaciones en el coágulo juegan un importante papel en la cicatrización de heridas y al fibronilisis.

Las reacciones de reticulación proteína-proteína catalizadas por el Factor Xllla representa un proceso de dos etapas. Primero, las proteínas se asocian específicamente una con otra para formar un complejo reversible (no covalente), y segundo, ellas se reticulan covalentemente por medio del Factor Xllla. En general, la reticulación de proteína catalizada por el Factor Xllla produce una variedad de estructura homo- y heteropoliméricas fundidas que juegan un papel importante en un número de reacciones fisiológicas (Lorand y Graham 2003). El hallazgo reciente de que la S. aureus puede utilizar la actividad de transglutaminasa para la adhesión a las moléculas humanas de matriz extracelular (ECM) (Matsuka et al. 2003), indica que la reticulación de la proteína está involucrada en reacciones patológicas asociadas con la infección bacteriana.

La mayor parte de las cepas S. aureus expresan un (FnbA) o dos (FnbA y FnbB) proteínas ligadas a fibronectina codificadas por dos genes diferentes pero muy cercanamente relacionados (Signas, Raucci et al. 1989; Jonsson, Signas et al. 1991 ). La región de terminal NH2 de la proteína madura ligada a la fibronectina está formada de cerca de 500 residuos largos de la región A responsable por la actividad de ligado fibrinogen/fibrina del receptor. La región A del FnbA contiene una copia doble de B1-B2 de una repetición de 30 residuos de larga de función desconocida que está faltando en la versión FnbB de la proteína. La región terminal COOH de la proteína que liga a la fibronectina contiene 5 repeticiones conservadas de cerca de 40 residuos de largo Du, D1 , D2, D3 y D4 que forman la región de ligado de la fibronectina del receptor. El terminal COOH de la proteína que se liga a la fibronectina está ligado covalentemente a la pared celular del peptidoglicán por la actividad de transpeptidasa de la sortasa (Schneewind, Fowler et al. 1995). El ligado reversible de la FnbA a la fibronectina o fibrina es un prerrequisito para la reticulación covalente intermolecular eficiente. La asociación del FnbA con la fibronectina o la fibrina resulta en residuos de lisina donora y glutamina aceptora posicionados apropiadamente que se vuelven subsecuentemente reticulados por el Factor Xllla. El Factor Xllla también cataliza la formación de un enlace isopéptido entre el grupo ?-carboxamida de los residuos de glutamina reactivos al enlace del péptido y los grupos amino de una variedad de aminas primarias, incluyendo aquellas de putrecina, espermidina, y cadaverina (Lorand, Rule et al. 1968; Lorand, Siefring et al. 1979). La incorporación del donor de amina alternativo inhibe la reticulación de la proteína y lleva a una marcación dirigida a enzima específica a sitio de los residuos de glutamina participantes en la proteína aceptora (Lorand 2001 ). Similarmente, por medio de utilizar péptidos patronados después de que la secuencia de terminal N de la fibronectina o del a2-antiplasmina, contienen residuos de glutamina reactivos, marcados específicamente de los residuos de lisina participante en la proteína donora pueden ser logrados (Parameswaran, Velasco et al. 1990; Lorand, Parameswaran et al. 1992; Sobel y Gawinowicz 1996). Recientemente se ha determinado que en la presencia del Factor Xllla, el rFnbA estafilococcal podría ser modificado por la probeta sintética donora de amina del péptido dansilcadaverina y dansilado patronado después de la secuencia N terminal de la fibronectina, que actúa como una probeta aceptora de amina (Matsuka et al. 2003).

En la presente invención se han identificado dentro del FnbA estafilococcal residuos reactivos de Gln y Lys que son objetivados por el Factor Xllla de coagulación humana o el tejido de transglutaminasa. Este es el primer informe sobre la localización de los sitios aceptor y donor de amina que reaccionan al Factor Xllla en una proteína bacteriana. La marcación específica a sitio de as glutaminas que reaccionan con el Factor Xllla se llevó a cabo usando la dansilcadaverina análoga a la Usina fluorescente (Lorand, Rule et al. 1968; Lorand, Siefring et al. 1979). El Factor Xllla que reaccionó con solamente 4 de los 48 residuos de Gln presentes en el receptor rFnbA. Los residuos Gln103, Gln 05, Gln783, y Gln830 sirven como sitios aceptares de mina en el FnbA, cuando este último es incubado con dansilcadaverina y el Factor Xllla de coagulación. La rata y grado de la modificación de dansilcadaverina del Gln103 fue significativamente mayor que aquella del Gln105, Gln783, y Gln830 (figura 2, B, D y Figura 3 B, D), sugiriendo que el Gln103 actúa como un sitio aceptor de amina principal. Los residuos reactivos Gln103, y Gln105 están localizados dentro de la región A de terminal NH2 del receptor FnbA (figura 5), mientras que los residuos Gln783, y Gln830 están situados en la parte del terminal COOH de la molécula y pertenecen a las repeticiones D1 y D4, respectivamente. La identificación del Gln103 como un sitio aceptor principal de amina del FnbA es consistente con los resultados de los experimentos de proteólisis limitados. La división del rFnbA modificadoa por dansilcadaverina mediante la trombina resulta en la liberación de un fragmento de terminal NH2 de baja masa molecular, exhibe una alta intensidad e fluorescencia sobre la iluminación UV, debido a la presencia del sitio aceptor GI103 principal. La banda de masa molecular alta correspondiente al fragmento de terminal COOH y que contiene los sitios menores Gln783, y Gln830 (figura 5) produjeron una señal de baja emisión (figura 1A y C). Así, la proteólisis limitada y los datos SDS-PAGE obtenidos pr el rFnbA modificado por dansilcadaverina suministró otra línea de evidencia que sugiere varios grados de reactividad de los sitios aceptores identificados. Luego del análisis SDS-PAGE los fragmento de rFnbA generados por trombina y el rFnbA pariente exhibieron una movilizad electroforética más baja que lo esperado. Muy probablemente esto es causado por un alto contenido de residuos cargados en el FnbA, que son conocidos en cuanto a que disminuyen la capacidad del ligado SDS y, por lo tanto, disminuyen la movilidad electroforética. Cuando la muestra de rFnbA fue sometida a análisis espectral de masa, su valor de masa molecular determinado experimentalmente fue esencialmente no distinguible del valor calculado.

La probeta del péptido dansil-PGGQQIV patronada sobre la secuencia del terminal NH2 de fibronectina que contiene residuos de glutamina reactiva, fue utilizada para marcar los residuos del lisina reactivos al Factor XI lia (Parameswaran, Velasco et al. 1990; Lorand, Parameswaran et al. 1992). El procedimiento de marcación revelo que 4 de los 56 residuos de donor lisina potenciales dentro del rFnbA incorporaron la probeta del péptido. Estos residuos son Lys157, Lys503, Lys620, y Lys762. Los sitios de lisina reactiva el Factor Xllla identificados son distribuidos entre la región A que liga al fibrina (ogen) y en las repeticiones de que ligan a la fibronectina. Lys157 esta localizado dentro de parto del terminal NH2 de la región A, mientras Lys503 esta localizado en su segmento del terminal COOH adyacente a las repeticiones B11 B2. Las repeticiones Du y D2 que ligan a la fibronectina contienen los sitios Lys620 y Lys762 reactivos al Factor Xllla, respectivamente (FIGURA. 5). De manera muy interesante, sin importar que la localización del terminal NH2 del Lys157 reactivo, la división trombina del rFnbA decorado con dansil- PGGQQIV no produce un fragmento fluorescente de baja masa molecular (FIG.1 D, vistas 2 y 4). El fragmento de baja masa molecular no fue detectable luego de manchado del gel con Coomasiie Brilliant Blue (FIG. 1 B, vistas 2 y 4). Estas observaciones indican la modificación de Lys157 con la probeta de dansil PGGQQIV fue inducir mayor susceptibilidad de la región del terminal NH2 del FnbA al ataque de la trombina resultando en la generación de péptidos pequeños que no son detectables bajo SDS-PAGE.

En general, todos los residuos aceptares de Gln y donores de Lys reactivos identificados para agruparse en las áreas de terminal NH2 y COOH del FnbA que forma los sitios de ligados a fibrina (ogen) - y fibronectina. La existencia de residuos aceptores de Gln y donores de Lys adicionales dentro del receptor FnbA estafilococcal, sin embargo, no puede ser excluido ya que el trasador fluorescente que contiene los péptidos correspondientes al pico 2 (FIG. 2 D), picos 2, 3, 5 (FIG.3 D) y picos 3 (FIG. 4 D) no fueron identificados positivamente. Sin embargo, la marcación especifica a sitio permitió la localización de las posiciones exactas de los residuos Gln y Lys reactivos que participan en las reacciones de reticulación catalizadas por el Factor XI lia con fibronectina, fibrina, y posiblemente, otras proteínas anfitrionas humanas. Luego del secuenciamiento, diversos picos produjeron más de un residuo en cada ciclo, indicando la heterogeneidad de la fracciones HPLC. La heterogeneidad de estas muestras se hizo también evidente de los resultados del análisis espectral de masa. La comparación de los residuos en cada ciclo contra la secuencia conocida de FnbA y el mapa disponible con los sitios de división de tripsina o Glu-C generados por proteinaza entre dichos permitió que la mayoría de secuencias individuales fueran identificadas. Los resultados del análisis de la secuencia del terminal Nh2 en este estudio siempre con relaciono con los datos de espectrales de masa, lo que mostró la presencia de señales correspondientes a los péptidos modificados de probeta de dichos.

Hasta hora, solamente un poco más de una docena de substrato de proteína han sido identificados para la coagulación del Factor Xllla. Entre los substratos que contiene glutamina conocidos para el Factor Xllla, existe poca homología de secuencia y la reactividad es difícil sino imposible de predecir. Las glutaminas reactivas identificadas son usualmente localizadas en las regiones de superficie expuestas al disolvente o extensiones flexibles (Cottrell, Strong et al. 1979; McDonagh, McDonagh et al. 1981 ; Matsuka, Medved et al. 1996). Sin querer estar ligados por una teoría, ambas la estructura primaria y la conformación de una proteína parecen determinar si un residuo de glutamina puede ser reactivo. Estas observaciones son consistentes con los datos mostrados aquí para el receptor del FnbA estafilococcal.

Los sitios receptores de Gln783 y Gln830 reactivos se sitúan en las repeticiones de ligado fibronectina D2 y D4, que, de acuerdo con diversos informes, no tienen una estructura compacta y existen en un estado algo desdoblado (House-Pompeo, Xu et al. 1996; Penkett, Redfield et al. 1997; Penkett, Redfield et al. 998). Los sitios Gln103 y Gln105 reactivos son localizados en la región determinal NH2 del FnbA que parece ser sensitivo a la Proteólisis y, por lo tanto, nuevamente puede indicar carencia de una estructura ordenada. La selectividad del Factor Xllla hacia los residuos de lisina donora de amiga en las proteínas no es suficientemente entendida tampoco. Sin importar la noción común de que el Factor Xllla es menos selectivo a hacia los residuos de lisina que hacia los residuos de glutamina, solamente un numero restringido de sitios donores de amina pueden participar en un una reacción de reticulación proteína-proteína particular y sufrir modificaciones con una probeta de péptido. Se mostró que el Factor Xllla exhibe una tolerancia diferenciada claramente amplia con respecto al residuo que precede la lisina donora de amina en los estrados de proteína. El análisis de los extractos de proteína para el Factor Xllla obtenido de transglutaminasa revelo que los residuos preceden directamente al sitio donor de amina que incluye residuos polares no cargados y básicos, lo mismo que aquellos pequeños alifáticos (Grootjans, Groenen et al. 1995). El dato descrito aquí para el receptor de FnbA estafilococcal soporta adicionalmente estas observaciones. Entre los cuatro identificados el Factor Xllla -lisina reactiva, Vál precede a Lys157, Ala precede Lys503, y Thr precede Lys620. La sola excepciones Glu, que precede Lys762 (FIGURA.5).

Para poder investiga si los sitios reactivos al Factor Xllla identificados son conservados en otras proteínas que ligan la fribronectina de cepas diferentes de S. aureus, de secuencias de aminoácidos fueron analizadas usando un alineamiento de secuencia múltipla. La secuencia de aminoácido de FnbA de la Z ATCC49525 de S aureus (SED ID NO:1 ) fue comparada con la secuencias del FnbA y FnbB de la cepas 8325-4 (SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:14) (Signas, Rauci et al. 1989; Jonsson, Signas et al. 1991 ), MW2 (SEQ ID NO:4 and SEQ ID NO:11 ) (Baba, Takeuchi et al. 2002), EMRSA-16 (SEQ ID NO:8), MSSA-476 (SEQ ID NO:5 y SEQ ID NO:12), COL (SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:13), Mu50 (SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:9), y N315 (SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:10) (Kuroda, Ohta, et al. 2001 ).La secuencia de aminoácido del FnbA y el FnbB de las cepas EMRSA -16 y MSSA-476 fueron obtenidas del Wellcome Trust Sanger Institute. La secuencias COL del S. aureus fue obtenida del Institute for Genomic Research. El alineamiento de secuencia múltiple fue llevado a cabo cursando el programa CLUSTAL W (1.81 ) (Thompson, Higgins, et al. 1994).

La Figura 6 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácido de la regiones que rodean los residuos Gln y Lys reactivos identificados en FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus. Un alineamiento múltiple revelo que los residuos Gln103, Gln105, Gln830, y Lys620 reactivos son conservados en todas las secuencias FnbA analizadas. El FnbA de las cepas MW2, MSSA-476, COL, 8325-4, y EMRSA-16 el Lys157 reactivo es reemplazado con un residuo Thr. En las cepas COL y 8325-4, el Lys503 reactivo es substituido con un residuo Asn. El segmento de la cadena del polipéptido que contiene el Lys762 reactivo que falta en la secuencia de FnbA de la cepa EMRSA-16 y el Gln783 reactivo es substituido por His en las cepas COL y 8325-4 (FIG. 6). Esta observación indica que la reactividad del FnbA de cepas diferentes de S. aureus hacia la acción de la transglutaminasa del Factor Xllla puede variar.

También, es evidente que los sitios aceptor y donor del reactivo al Factor Xllla son menos preservados dentro de la familia FnbB de los receptores. Ninguno de las secuencias FnbB analizadas posee los Gln 03, Lys157, y Lys503, reactivos, mientras que Lys762 falta en las cepas Mu50 y N315. Los Gln105 y Gln783 reactivos no son preservados en la secuencia FnbB de la cepas MW2, MSSA-476, COL , y 8325-4. Entre todos los otros sitios reactivos al Factor Xllla identificados, solamente los residuos Lys620 y Gln830 son altamente conservados y están presentes en todas las secuencias FnbA y FnbB analizadas (FIG.6).

De manera muy interesante, luego del tratamiento de FnbA con el Factor Xllla, el residuo Lys620 reactivo conservado consistentemente exigió la más alta reactividad hacia la probeta dansil-PGGQQIV (FIG. 4 B pico* y D pico 5, Tabla 3). Esto indica adicionalmente la constancia fisiológica del sitio donor de Lys en la posición 620. El hecho de que el sitio aceptor principal Gln103 junto con los sitios donores Lys157 y Lys503 están ausentes en todas las secuencias FnbB evaluadas sugiere que la forma B de la proteína que liga la fibronectina juega un papel menos prominente en la reacciones de raticulización catalizadas por el Factor XI lia. Estas diferencias también indican que las formas A y B de la proteína que liga la fibronectina exhibe diferente selectividad hacia sus socios reticulantes de proteína anfitrionas humanas.

Con la excepción del receptor FnbA estafilococcal, todos los estratos de proteína de Factor Xllla actualmente conocidos están involucrados en la coagulación de la sangre, la fibrionolisis, el ensamblé de matriz extracelular, y las reacciones de cicatrización de heridas. Los hallazgos de los inventores de que el FnbA del S. aureus sirve como un substrato bifuncional para el Factor Xllla y que se ve sometido a articulación a fibronectina o fibrina (Matsuka et al.2003) sugiere que el Factor Xllla de coagulación también juega un papel importante en la patogénesis molecular. La habilidad del S. aureus patogénico para utilizar la actividad de la transglutaminasa del Factor Xllla para ligar covalentemente a moléculas anfitrionas humanas explica la eficiencia extremadamente alta de la colonización bacteriana luego del daño del tejido. Luego del daño, la formación de un coagulo de sangre sirve tanto para restaurar la integridad muscular y para suministrar una matriz provisional para la iniciación de la reparación de la herida (Mosesson 1992). Los componentes de la proteína principal de los coágulos, fibrina y plasma fibronectina son esenciales para estas funciones. Ambos la fibrina y fibronectina también sirven como ligandos para los receptores de este FnbA asociados a superficie del S. aureus, y por lo tanto, responsables para el ligado de la bacteria al sitio de la herida. A medida que el coagulo madura, el Factor Xllla de coagulación inicia la catálisis de reticulación intermolecular entre las moléculas de fibrina y entre la fibrina y fibronectina. La reticulación covalente entre las moléculas de fibrina incrementa la estabilidad estructural del coagulo (Henschen y McDonagh 1986), mientras que la reticulación de la fibronectina en fibrina es importante para la adhesión celular y los eventos de migración requeridos para el proceso de curación o cicatrización de la herida (Grinnel, Feld et al. 1980; Knox, Crooks et al. 1986; Corbett, Lee et al. 1997). El receptor FnbA estafilococcal que es asociado reversiblemente con la fibrina o fibronectina en esta etapa puede ser reticulado covalentemente en sus ligandos por el Factor XI lia. En incorporación covalente del FnbA a la fibrina o fibronectina incrementa la probabilidad de la colonización estafilococcal y el establecimiento de la infección. Esto también compite con las reacciones de reticulación fibrina-fibrina y fibrina-fribronectina (Matsuka, Medved et al. 1994; Matsuka, Migliorini et al.1997) (Matsuka et al.2003), y por lo tanto, puede afectar la integridad estructural del coagulo en inhibir la reacción de la cicatrización de la herida. Tales implicaciones de la reticulación catalizada por el Factor XII la del FnbA estafilococcal en proteínas de matriz extracelular humana muy posiblemente sirven como una fuerza directora para la evolución molecular del receptor FnbA, resultando eventualmente en su adquisición de una nueva y útil propiedad. La reactividad evolucionada de FnbA hacia el Factor Xllla a provisto una ventaja significativa en la colonización del anfitrión y subsecuentemente pudo un impacto positivo en la supervivencia del S. aureus.

En adicción a identificar los residuos de aminoácido reactivos (Gln y Lys) dentro del FnbA estafilococcal tipo natural que están directamente involucrados en la reacción de reticulación covalente catalizada por el Factor Xllla descripta aquí, la presente invención se relaciona con la síntesis de proteínas derivadas de Fnb que son menos capaces que el Fnb tipo natural de reticularse covalentemente con la fibronectina y la fibrina luego de infección subsiguiente con S. aureus. Específicamente, el trabajo descrito aquí esta dirigido a composiciones y métodos de preparación de proteínas y/o polipéptidos que comprenden proteínas alteradas que ligan a la fibronectina o polipéptidos que pueden ser usados como inmunogenes en formulaciones de composición inmunogénica, que incluyen composiciones inmunogénicas multivalentes, y que puede ser usados para una inmunización activa. La estrategia involucra la alteración de uno o más aminoácidos en una secuencia de Fnb, resultando en una proteína polipéptido derivado del Fnb que es inmunogénico sin inducir un ligado mejorado del Fnb tipo natural a la fibronectina y la fibrina luego de la infección subsiguiente con S. aureus. Las mutaciones de dos, tres más de los residuos de aminoácidos identificados aquí están dentro del alcance de la invención.

El nucleótido tipo nativo o natural y la secuencia de aminoácido de Fnb son conocidas en la técnica (Patente Estadounidense Nos. 5,320,951 ; 5,571 ,514; 5,175,096; 5,652,217). Como se usa aquí, "alteración" y sus derivados tiene el propósito de significar una secuencia de aminoácido que es diferente de la secuencia tipo natural, lo mismo que una secuencia nucleótido que codifica una secuencia aminoácido que es diferente de la secuencia de aminoácido tipo natural. La alteración incluye inserción, eliminación y/o substitución de uno o más nucleotidos o aminoácidos.

Por ejemplo, la alteración puede ser la inserción o la eliminación de un solo nucleótido, o de más de un nucleótido, resultando en una mutación de cambio de cuadro; el cambio de por lo menos un nucleótido, resulta en un cambio de uno o más aminoácidos codificados; el cambio de por lo menos un nucleótido, resulta la generación de un codon de pare prematuro; la eliminación de varios nucleotidos, resulta en una eliminación de uno o más aminoácidos codificados por los nucleotidos; la inserción de uno o varios nucleotidos, resulta en una interrupción de la secuencia codificadora del gen; la duplicación de todo o parte del gen; transposición de todo o parte del gen; o la redisposición de todo o parte del gen. Más de una de tales mutaciones puede estar presente en un solo gen. Tales cambios de secuencia causan una alteración en el Fnb codificado por el gen. Por ejemplo, si la alteración es la mutación de cambio de cuadro, el cambio de cuadro puede resultar en un cambio en los aminoácidos codificados, y/o puede resultar en las generación de un codon de pare prematuro, causando la generación de una proteína truncada.

Por ejemplo, la alteración o alteraciones pueden preservar preferiblemente la configuración tridimensional del Fnb nativo. Más aun, los aminoácidos que son esenciales para la función de Fnb, particularmente para su inmunogeneicidad, puede ser identificados por métodos conocidos en la técnica. Métodos particularmente útiles incluyen la identificación de aminoácidos conservados, mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis de barrido de alanina (por ejemplo, Cunningham y Wells 1989), cristalización y resonancia magnética nuclear. Los polipéptidos alterados producidos por estos métodos pueden ser ensayados en cuanto a sus actividades biológicas, incluyendo inmunogenicidad y antigenicidad.

Específicamente, las alteraciones apropiadas de aminoácidos puede ser hechas sobre la base de diversos criterios, incluyendo hidrofibilicidad, carácter mágico o acidico, carga, polaridad, tamaño, la presencia o ausencia de un grupo funcional (por ejemplo, -SH o un sitio de glicosilación), y carácter aromático. La asignación de diversos aminoácidos a grupos similares con base en las propiedades anteriores serán evidentes y fácilmente para aquellos versados en la técnica; cambios en aminoácidos apropiados adicionales pueden también encontrarse en Bowie et al. (Science 247:1306-1310(1990)).

Por ejemplo la alteración puede tomar la forma de mutación dirigida a sitio conservativa (por ejemplo glicina por alanina; valina por isoliucina; histidina por lisina; asparagina por glutamina) de los residuos de glutamina y lisina (FIG. 6) que retiene atributos de la región de FnbA involucrada en la respuesta inmune protectora pero elimina o modifica epitopes involucrados en la estimulación de las infecciones S. aureus ( es decir, un equivalente biológico). La alteración también puede tomar la forma de mutaciones no conservativas (por ejemplo, lisina por treonina; alanina por lisina; alanina por glutamina) en donde la estimulación perjudicial de las infecciones S. aureus es reducida o abolida. La alteración también puede tomar la forma de una eliminación completa de cualquiera de los residuos de glutamina o lisina identificados aquí, con el uso continuado de Fnb con la parte derivada restante de Fnb. Las eliminaciones pueden ser reemplazadas por regiones enlazadoras que retienen la especialidad del Fnb o polipéptido restante para poder tener una traducción óptima y/o inmunogenisidad óptima. Las alteraciones puede ser hechas usando cualquier mutagen estándar o proceso mutagenico, de modo que la mutación dirigida a sitio que involucra pagos o el uso de reacción de cadena polimerasa (PCR) e involucra oligonucleótidos sintéticos.

De acuerdo con lo anterior, la invención se relaciona con una secuencia de nucleotido aislada que codifica un Fnb alterado del S. aureus, o una porción de el, en donde el Fnb alterado o la porción de el retiene la inmunogenisidad. Como se usa aquí, el término "Fnb alterado" tiene el propósito de significar un Fnb (porción del mismo) del S. aureus que retiene la inmunogenisidad y que, cuando se incorpora en una composición inmunogénica y se administra a un vertebrado, no mejora el ligado de la fibronectina o fibrina sobre luego de la infección subsiguiente con S aureus. En una modalidad particular, el Fnb alterado comprende una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus. En una modalidad, estos aminoácidos son mutados a alanina.

Aunque la invención ha sido descrita específicamente con relación a los aminoácidos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 de FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus; el propósito es que las metodologías descritas usadas aquí para identificar estos residuos pueden ser aplicadas a residuos adicionales del Fnb tipo natural para identificar residuos adicionales para su alteración.

Como es apropiado, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser a ARN, por ejemplo, mARN, o ADN, tales como cADN y ADN genomico. Las moléculas de ADN pueden ser de doble hélice o de una sola hélice; el ARN o ADN de hélice única puede ser la hélice de codificación o de sentido o la hélice de no codificación antisentido. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico comprende por lo menos cerca de 14 nucleótidos; en otra modalidad, por lo menos cerca de 50 nucleótidos; y aun en otra modalidad por los menos cerca de 200 nucleótidos. La secuencia de nucleótido puede ser solamente aquella que codifica por lo menos un fragmento de la secuencia de aminoácido del Fnb alterado; alternativamente, la secuencia del nucleótido puede influir por lo menos un fragmento de la secuencia que codifica aminoácido Fnb alterado junto con secuencias no codificadoras adicionales tales como intrones y secuencias no codificadoras 3' y 5' (incluyendo secuencias regulatorias, por ejemplo). Adicionalmente, la secuencia de nucleótido puede ser fusionada con una secuencia marcadora, por ejemplo, una secuencia que codifica un polipéptido para ayudar en el aislamiento con la purificación del polipéptido.

El término "secuencia de nucleótido" puede incluir una secuencia de nucleótido que es sintetizada químicamente o por medios recombinantes. Así, el ADN recombinante contenido en un vector es influido en la invención. También, la secuencia de nucleótido incluye moléculas de ADN recombinantes en células anfitrionas heterologas, lo mismo que moléculas de ADN parcial o substancialmente purificadas en solución. Transcriptos de ARN in vivo e in vitro de las moléculas de ADN en la presente invención también están comprendidas por la secuencia de nucleótido de la invención. Tales secuencias de nucleótidos son útiles, por ejemplo en la fabricación de Fnb alterado codificado.

La invención también comprende variaciones de secuencias de nucleótido de la invención, tales como aquellas porciones que codifican, análogos o derivados el Fnb alterado, que suministran la porción, análogo derivada que comprende el Fnb alterado. Tales variaciones pueden ser variaciones de ocurrencia natural en la porción no alterada de la secuencia de nucleótido, tal como en el caso de variaciones alelicas, o de ocurrencia no natural, tales como aquellas inducidas por diversos mutagenos o procesos mutagénicos. Las variaciones propuestas incluyen, pero no se limitan a, adicción, eliminación y substitución de uno o más nucleótidos que pueden resultar en cambios de aminoácidos conservativos o no conservativos, incluyendo adicciones y eliminaciones.

La invención descrita aquí también se relaciona con fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente. El término "fragmento" tiene el propósito de comprender una porción de una secuencia de nucleótidos descrita aquí que es de por lo menos cerca 14 nucleótidos continuos a al menos cerca de 50 nucleótidos continuos o mayor en longitud, siempre que tales fragmentos codifiquen un polipéptido Fnb alterado; tales fragmentos son útiles como iniciadores. Ciertos iniciadores y probetas hibridiza selectivamente a la molécula de ácido nucleico que codifica el Fnb alterado descrito aquí. Por ejemplo, fragmentos que codifican porciones antigénicas el Fnb alterado descritas aquí son útiles.

La invención también se relaciona con secuencias de nucleótidos que hibridiza bajo medio y condiciones de hibridización altamente estrictos. (Por ejemplo, para hibridización selectiva) a una secuencia de nucleótidos descrita aquí. Las condiciones estrictas apropiadas son aquellas conocidas aquellos basados en la técnica o pueden ser encontradas en textos estándar tales como Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6.

De acuerdo con lo anterior, la invención se relaciona con secuencia de nucleótido que tienen una identidad sustancial con la secuencia de nucleótido alterada descrita aquí, tal como, por ejemplo, por lo menos 90% de identidad o por lo menos 95% de identidad con estas secuencias. Las secuencias de nucleótido particulares que codifican polipéptidos que tienen una actividad inmunogénica sustancialmente similar a la del Fnb alterado descrito aquí.

Esta invención también se relaciona con un Fnb alterado o un polipéptido del mismo de S. aureus. EL Fnb alterado o polipéptido es un Fnb (o porción del mismo) del S. aureus que retiene la inmunogenisidad, y que, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que Fnb tipo natural de reticularse con la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente con el S. aureus. En una modalidad particular, el Fnb alterado comprende una mutación por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos que corresponden a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus. El Fnb alterado de la invención es substancialmente purificado (por ejemplo, purificado hasta su homogeneidad), y es sustancialmente libre de otras proteínas.

La invención también suministra vectores de expresión, por ejemplo, construcciones de ácidos nucleicos tales como plásmidos y cósmidos, que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un Fnb o polipéptido, alterado, operativamente ligado a por lo menos una secuencia regulatoria. Muchos de tales vectores están disponibles comercialmente, y los artesanos versados pueden preparar fácilmente otros vectores adecuados. "Ligado operativamente" significa que en la secuencia de nucleótidos esta ligada a una secuencia regulatoria de una manera que permite la expresión de la secuencia de ácido nucleico; este término tiene propósito de incluir tanto enlace físico y directo como enlace por medio de un enlazador o de una secuencia interviniente. La secuencia regulatorias son reconocidas en la técnica y son seleccionadas para producir un polipéptido que es un Fnb o polipéptido alterado. De acuerdo con lo anterior, el término "secuencia regulatoria" incluye promotores, mejoradores, y otros elementos de control de expresión que están descritos en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods en Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Por ejemplo, las secuencias regulatorias nativas o secuencias regulatorias nativas en las células anfitrionas transformadas pueden ser empleadas. Debería entenderse que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la escogencia de la célula anfitriona a ser transformada y/o el tipo de proteína deseada para hacer expresado.

Por ejemplo, los Fnb y polipéptidos alterados de la presente invención pueden ser producidos por medio de ligar en la molécula de ácido nucleico, o una porción de ella, en un vector adecuado para la expresión sea en células procarióticas, células eucarióticas o ambas (ver, por ejemplo Broach, et al.1983, Sambrook et al. 1989).

Las células anfitrionas Procarióticas y eucarióticas transfectadas por los vectores descritos son también suministrados por esta invención. Por ejemplo, las células que pueden ser transformadas, transfectadas o infectadas con los vectores de expresión de la presente invención incluyen pero no se limitan a, células bacterianas tales como E. coli (por ejemplo las cepas K12 E coli), Estreptomisos, Seudomonas, Serratia marcescens y Salmonella tifimurium, células de insectos (bacuolovirus), incluyendo Drosofila, Sf9 y Sf21 , células de hongos, tales como células de levadura, células de planta y células de mamíferos, tales como timocitos, células de ovario de hámster Chino (CHO), células de HEp-2, células Vero y células COS.

Así, una secuencia de nucleótido que codifica el Fnb alterado descrito aquí puede ser usado para producir una forma recombinante de la proteína mediante el proceso celulares microbianos o eucarióticos. Ligar la secuencia del poli nucleótido en una construcción de gen, tal como un vector de expresión, y transformaron a transfectar en anfitriones, sean eucarióticos (levadura, aves, insectos, plantas o mamíferos) o procarióticas (células bacterianas), son procedimientos estándar usados en la producción de otras proteínas bien conocidas. Los vectores virales pueden también ser usados, incluyendo, pero sin limitarse a, adenovirus, virus asociados adeno, virus de herpes simplex, retrovirus, lentivirus, poxivirus, incluyendo virus de vaccinia, alfavirus, tales como el virus sindbis, el virus de los bosques semliki, y el virus de la encefalitis equina Venezolana, y el virus ARN de hélices negativas no segmentadas, tales como el virus cirticircosis, en virus de las paperas, y el virus de la estomatitis vesicular. De acuerdo a lo anterior, la invención se relaciona con la producción de Fnb alterado por tecnología recombinante.

En adicción a lo anterior los sistemas de células anfitrionas en los cuales el Fnb alterado de estas invenciones es producido in vitro, una variedad de sistemas son apropiados para la expresión y suministro de tal Fnb alterado in vivo. Estos sistemas se utilizan patógenos atenuados tales como bacterias o virus como agentes de suministro. Estos patógenos atenuados virus han sido insertados dentro de ellos como un segmento de acido nucleico heterólogo la secuencia de ácido nucleico que codifica el Fnb alterado deseado de esta invención. Usando estos sistemas, el Fnb alterado deseado se expresa por un virus o bacteria atenuada viva dentro del cuerpo de un vetebrado.

Las proteínas de la presente invención pueden ser aisladas o purificadas (por ejemplo, la homogeneidad) de cultivos de células recombinantes mediante una variedad de procesos. Estos incluyen, no se limitan a, cromatografía de intercambio de anión o catión, precipitación de etanol, cromatografía de afinidad y cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC). El método particular usado dependerá de las propiedades de polipéptido y la selección de la célula anfitriona; los métodos apropiados serán fácilmente visibles aquellos basados en la técnica.

La presente invención también se relaciona con composiciones inmunogénicas que comprenden el Fnb alterado descrito aquí. Por ejemplo, un Fnb alterado de la presente invención puede ser formulado con un vehículo fisiológicamente aceptable para preparar una composición inmunogénica. El vehículo particular fisiológico puede incluir, pero sin limitarse a, agua, salina amortiguada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y soluciones de dextrosa. La concentración óptima de los ingredientes activos en el vehículo escogido pueden determinarse empíricamente, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y dependerá en ultimas de la formulación farmacéutica deseada.

El Fnb alterado puede ser usado como un antígeno para producir una respuesta inmune antígeno en un vertebrado, tal como un anfitrión mamífero.

El método de la presente invención comprende administrar al vertebrado una dosis inmunológicamente efectiva de una composición inmunogénica que comprende una mezcla de un Fnb alterado y cualquier ayudante adecuado. Como se usa aquí, "ayudante" tiene el propósito de significar cualquier agente que sea suficiente para promover o modificar la respuesta inmune al antígeno. Como se usa aqui, "dosis inmunológicamente efectiva" de la composición inmunogénica es una dosis que es adecuada para producir una respuesta inmune. La dosificación particular dependerá de la edad, peso y condición medica del vertebrado que va hacer dotado, lo mismo que en el método de administración. Los artesanos versados determinaran fácilmente las dosis adecuadas. La composición inmunogénica puede ser administrada opcionalmente en un vehículo farmacéutica o fisiológicamente aceptable, tal como una salina fisiológica o etanol polioles tales como glicerol o propilenglicol.

Los ayudantes adecuados para promover la efectividad de la composición incluyen, pero sin limitarse a: (1 ) Sales de aluminio (alum), tales como hidroxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio etc; (2) Formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes tales como péptidos de muramilo (ver más adelante) o componentes de pared celular bacteriana), tales como, por ejemplo, (a) MF59 (Publicación PCT No WO90/14837), que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85 (opcionalmente contiene varias cantidades de MTP-PE (ver más adelante; aunque no es requerido)) formulados en partículas de tamaño submicronico usando un microfuidizador tal como el microfluidizador modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). (b) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado con plurónico L121 ,y thr-MDP (ver más adelante) sea microfluidizado en una emulsión submicronica o batido para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande, y (c) El sistema ayudante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamílton, MT) que contiene 2% de escualeno, 0,2% Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana de grupo que consiste de monofosforilipido 3-0 deailatado (MPL™) descrito en la patente Estaunidense No 4,912,094 (Corixa), dimicolato de trealosa (TDM), y esqueleto de pared celular (CWS), o MPL + CWS (Detox™); (3) Ayudante de saponina, tales como Quil A o ESTIMULON ™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente Estaunidense No. 5,057,540) puede ser usado o se pueden generar partículas de ellos tales como ISCOMs (complejos inmunoestimulantes); (4) Lipopolisacaridos bacterianos, análogos de lípidos A sintéticos tales como compuesto de aminoalquilglucosamina fosfato (AGP), o derivados en análogos de ellos, que están disponibles de Corixa, y que están descritos en la Patente Estaunidense No 6,113,918; una de tales (AGP), es 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-Desoxi-4-0-fosfono-3-0-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranosida, que es también conocido como 529 (antes conocido como RC529), que es formulado en una forma acuosa o como una emulsión estable, polinucleotidos sintéticos tales como oblinucleotidos que contienen motivos CpG (Patente Estadounidense No 6,207,646); (5) Citocinas, tales como interleuquinas (por ejemplo, IL-1 , IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferones (por ejemplo, gama interferon), factor estimulante de colonia de macrofagos granolucitos (GM.-CSF), factor estimulante de colonias de macrofagos (M-CSF), factor de necrosis de tumor (TNF), etc.; (6) Mutantes detoxificados de una toxina ADP-ribosilada bacteriana tal como una toxina del colera (CT) sea tipo nativa o forma mutante, por ejemplo, en donde el ácido glutámico en la posición 29 de aminoácido es reemplazado por otro aminoácido, preferiblemente una histidina, de acuerdo con la solicitud patente internacional publicada No WO 00/18434 (ver también WO 02/098368 y WO 02/098369), una toxina pertussis (PT), o una toxina lábil al calor de E. coli (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (ver por ejemplo, WO 93/13302 y WO 92/19265); y (7) Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes para promover la efectividad de la composición Como se menciono anteriormente, los péptidos de muramilo incluyen, pero no están limitados a, N-acetil-muramil-L-threonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1 '-2' dipalmitoil-s 7-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

Las composiciones de esta invención pueden ser administradas a humanos o vertebrados no humanos por medio de una variedad de rutas, incluyendo vías parenteral, intraarterial, intradérmica, transdérmica I (tal como por medio del uso de polímeros de liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutánea, oral o intranasal de administración. La cantidad de Fnb empleado en tales composiciones variedad dependiendo de la vía de administración y las características físicas del vertebrado sujeto. Ajustes y manipulación de los rasgos de dosificación establecidos usados con los antígenos portadores tradicionales para la adaptación a la presente composición esta también dentro de la habilidad de aquellos basados en la técnica. Las composiciones de la presente invención tienen el propósito de ser usadas en el tratamiento tanto de vertebrados inmaduros como adultos, y, en particular humanos.

El Fnb alterado puede ser administrado en conjunto con inmunogenes adicionales; el Fnb alterado puede ser administrado separadamente, secuencialmente o concurrentemente con el inmunogen adicional.

El Fnb alterado de la presente invención puede estar acoplado a una molécula portadora para poder modular o mejorar la respuesta inmune. Las proteínas portadoras adecuadas incluyen toxinas bacterianas que son seguras para la administración a vertebrados e inmunológicamente efectivas como portadores. Ejemplos incluyen la pertussis, diteria, y toxoides de tétanos y proteínas mutantes no toxicas (materiales reacción cruzada (CRM)), tal como la variante no toxica del toxoide de histeria, CRM 97 . Fragmento de las toxinas nativas o de los toxoides, que contienen por lo menos un epítope de célula T, son también útiles como portadores para antígenos. Los métodos para preparar conjugados de antígenos y moléculas portadoras son bien conocidos en la técnica ((Wong 1991 ; Bernatowicz y Matsueda 1986; Frisch et al. 1996; Boeckler et al. 1996).

Adicionalmente, si una región de péptidos particulares eliminada, uno o más epitopes de un antígeno de otro organismo pueden ser insertados en la región eliminada, para poder crear una vacuna bivalente.

La invención también se relaciona con una composición inmunogénica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una molécula de ácido nucleico que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene su inmunogenisidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, no mejora el ligado de Fnb tipo silvestre luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus. Tal composición inmunogénica se ha llamado aquí como una composición inmunogénica de ácido nucleico o composición inmunogénica de ADN y es útil para la inmunización genética de los vertebrados.

El término, "inmunización genética", como se usa aquí, se refiere a la inoculación de un vertebrado, particularmente un mamífero, con una composición inmunogénica de ácido nucleico dirigida contra un agente patogénico, particularmente del S. aureus, resultando en la generación de una respuesta inmune por el vertebrado contra el S. aureus. Una "composición inmunogénica de ácido nucleico" o "composición inmunogénica de ADN" como se usa aquí, es una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un antígeno polipéptido, particularmente un Fnb alterado del S. aureus descrito aquí. La construcción del ácido nucleico puede también incluir elementos promotores transcripciónales, elementos mejoradores, señales de división, terminación y señales de poliadenilación, y otras secuencias de ácido nucleico. La composición inmunogénica de ácido nucleico no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fibronetina o fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

La composición inmunogénica de ácido nucleico es producida por métodos estándar. Por ejemplo, usando métodos conocidos, un ácido nucleico (por ejemplo ADN) que codifica un Fnb alterado de S. aureus, es insertado en un vector de expresión para construir una composición inmunogénica de ácido nucleico (Maniatis et al. 1989).

El vertebrado individual es inmunizado con la composición inmunogénica de ácido nucleico usando estándar. El vertebrado es inmunizado (es decir la composición es administrada) subcutáneamente, intravenosamente, intraperitonealmente, intradermicamente, intramuscularmente, tópicamente, oralmente, rectalmente, nasalmente, bucalmente, vaginalmente, por inhalación de un rociado o por vía de un deposito implantado en formulaciones de dosificación que contienen portadores o vehículos convencionales no tóxicos, fisiológicamente aceptables. Alternativamente, el vertebrado es inoculado con la composición inmunogénica de ácido nucleico mediante el uso de un instrumento de aceleración de partículas (un "revolver de gen"). La forma en la cual es administrada (por ejemplo, capsulas, tabletas, soluciones, emulsiones) dependerá en parte en la vía por medio de la cual se quiere administrar. Por ejemplo, para administración mucosal, gotas en la nariz, inhalantes o supositorios pueden ser usados.

La composición inmunogénica de ácido nucleico puede ser administrada en conjunto con cualquier adyuvante adecuado como se describió anteriormente. El adyuvante es administrado en una cantidad suficiente, que es aquella cantidad que es suficiente para generar una respuesta inmune mejorada de la composición. El adyuvante puede ser administrado antes de, concurrentemente con, contemporáneamente (simultáneamente) con, o después de la inoculación con la composición inmunogénica de ácido nucleico. El adyuvante también puede ser administrado en más de una vez. El adyuvante y la composición inmunogénica de ácido nucleico pueden ser administrados en aproximadamente la misma localización sobre el vertebrado, por ejemplo, ambos pueden ser administrados en un sitio marcado sobre una pierna del vertebrado.

En una modalidad particular, la construcción de ácido nucleico es coadministrada con un agente facilitador de la transfeccion. En una modalidad, el agente facilitador de la transfeccion es dioctilglicilespermina (DOGS) (publicación de solicitud PCT ubicada No. W096/21356). En otra modalidad, el agente facilitador de transfeccion es un anestésico local tal como bupivacaina (Patente estadounidense No. 5,593,972).

La invención también suministra un método para inmunizar un vertebrado, por ejemplo, un humano seronegativo con respeto a S. aureus, contra el S. aureus que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende una cantidad inmunológicamente efectiva de un Fnb alterado de S. aureus descrito anteriormente. Alternativamente, la composición comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una cantidad inmunológicamente efectiva del Fnb alterado que retiene su inmunogenicidad y que, cuando se incorpora en la composición inmunogénica es administrado a un vertebrado, es menos capaz de reticular con la fibronectina y fibrina, y por lo tanto no mejora el ligado del Fnb tipo natural con la fibronectina y la fibrina luego de la infección posterior del vertebrado con el S. Aureus.

Antes de la administración en humanos, las composiciones inmunogénicas de esta invención son evaluadas en un modelo animal. La ilustración de modelos animales no limitantes será ahora descrita.

En un modelo de ratón pielonefritis, ratones de cuatro semanas de nacido CD-1 son inoculados por inyección subcutánea en 0, 3 y 6 semanas con el Fnb alterado en un adyuvante apropiado. Los ratones se les toman muestras de sangre antes de la primera inoculación y sobre la semana 8. Dos días después de la toma de sangre final, los ratones son infectados por inyección intraperitoneal de 3 X 108 cfu S. aureus Reynolds crecidos durante la noche en agar salado Columbia (1X agar Columbia, 0,1% glucosa, 1 % de extracto de levadura, 0,5% de NaCI). Cuarenta y ocho horas luego de la infección los ratones son sacrificados y la bacteria es enumerada en los ríñones.

En un modelo endocarditis de rata, ratas de Sprague-doble macho de tres semanas de nacidos son inoculadas por inyección intramuscular en 0,2 y 4 semanas con el Fnb alterado en un adyuvante apropiado. Las ratas se les toma sangre antes de la primera inoculación, sobre la semana 6 las ratas se les toma sangre y se someten a cirugía para colocar un catéter de polietileno mediante la bacteria carótida y el arco de la aorta en el ventrículo izquierdo del corazón. El catéter es mantenido en su lugar con una sutura de seda y causa la formación de una vegetación estéril. Luego de la infección bacteriana la vegetación actúa como un sustrato para el ligado bacteriano y la infección. Dos días después de la cirugía las ratas son infectadas por inyección intravenosa de 1X 105 cfu de S. aureus Reynolds crecido en fase logarítmica media en un caldo de soya tríptica. Cuarenta y ocho horas luego de la infección, las ratas son sacrificadas y las bacterias enumeradas en el corazón EJEMPLOS La anterior divulgación generalmente describe la presente invención. Un entendimiento mas completo puede ser obtenido con referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos son descritos solamente con el propósito de ilustrar y no tienen la intención de limitar el alcance de la invención.

ABREVIATURAS HPLC cromatografía de líquido de alto rendimiento; MALDI-TOF MS desorción de láser asistida por matriz-ionización del tiempo de duelo de espectrometría de masa; SDS-PAGE electroforesis de gel de poliacrilamida de sulfato de sodio dodecilo; DTT ditiotreitol; TCA acido tricloroacético; Dansil 5-d¡metilaminonataleno-1-sulfonilo; PTH feniltiohidantoino. ECM proteínas de matriz extracelular TBS salina amortiguada TRIS PBS salina amortiguada con fosfato de sodio FXIII Factor XIII o plasma transglutaminasa EDTA sal de sodio de ácido etilenediaminetetraacético 1Q rFnbA es un mutante recombinante Gln103Ala FnbA 4Q4K rFnbA es un mutante recombinante Gln103Ala, Gln105Ala, Gln783Ala, Gln830Ala, Lys 157Ala, Lys 503Ala, Lys 620Ala, y Lys 762Ala wt FnbA es FnbA tipo nativo MATERIALES y MÉTODOS Proteína estafílococal que liga a la fibronectina. La proteína A recombinante que liga la fibronectina (rFnbA) comprende residuos de Alai a Pro839 de la cepa ATCC49525 del S. aureus fue producida en E. coli y aislada de la facción soluble del lisado de célula según se describió previamente (Matsuka et al. 2003). Brevemente, el gen FnbA que codifica los residuos de aminoácido de FnbA 1-839 fue producido por amplificación PCR usando ADN cromosomal de la cepa ATCC49525 del S. aureus como plantilla. La identidad del rFnbA aislado fue confirmada usando SDS-PAGE, coagulación Western, y análisis de secuencia de terminal NH2. Las concentraciones de la proteína en todos los experimentos se determinan usando el ensayo de ácido bicinconinico (BCA) de acuerdo con las instrucciones (Pierce Chemical Company, Rockford, IL).

Incorporación de probetas de Dansilcadaverina y Dansil-PGGQQIV catalizadas por factor Xllla en rFnbA. Para incorporar dansilcadaverina (Sigma, San Luis, MO) o la dansil-PGGQQIV (sintetizada adaptada por New EnGly Péptido, Inc., Fitchburg, MA) en rFnbA, se uso el factor XIII preactivado. Para este propósito 500 µg/ml de factor XIII (Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) fue activado por medio de tratarlo con 0.25 U/ml de trombina (Sigma) en TBS, amortiguador hasta un pH 7.4 que contiene 10 mM de ditiotreitol y 20 mM CaCI2. después de incubación durante 20 min a 37°C, la trombina fue inactivada por la adición de hirudina (Sigma) y esta mezcla fue usada como factor Xllla (Takagi, Aoyama et al. 1995). La marcación catalizada por el factor Xllla de los residuos de glutamina reactiva dentro del rFnbA se llevó a cabo por medio de incubar 1-2 mg de rFnbA durante 4 a 18 horas a 37°C con 2.5 mM dansilcadaverina y con factor Xllla (30 ng/ml) en 20 mM de Tris, pH 7.4, 150 mM de NaCI, 5 mM de DTT, 5 mM de CaCI2 amortiguador. La marcación de los residuos de lisina reactivos al factor Xllla se llevó a cabo 1-2 mg de rFnbA durante 4 a 18 horas a 37°C con 2 mM de dansil-PGGQQIV y factor Xllla (30 ng/ml) en 20 mM de Tris, pH 8.5, 5 mM de NaCI, 5 mM de DTT, 5 mM de CaCI2 como amortiguador. El volumen total de la mezcla de reacción en ambos casos fue de 0.3 mi. al final del periodo de incubación, las proteínas fueron precipitadas con 7% TCA, cosechadas por centrifugación (5 min at 14,000 x g), y los gránulos fueron extraídos repetidamente (8 veces) sean con 1 mi de etanohéter (1 :1 vol/vol) para remover la dansilcadaverina no reaccionada o con 1 mi de N,N-dimetilformamida que contenía 1% N-metilmorfolina y 5% de H20 para remover la probeta de dansil-PGGQQIV que no reaccionó (Clement, Velasco et al. 1998).

Fragmentación del rFnbA marcado con Dansilcadaverina y Dansil-PGGQQIV por Trombina. La Fragmentación proteolítica del rFnbA modificado con dansilcadaverina o con dansil-PGGQQIV se llevó a cabo usando trombina (Sigma). Después de la remosión de las probetas de dansilcadaverina y dansil-PGGQQIV que no reaccionaron, los gránulos de rFnbA modificados fueron disueltos en 0.5 mi de TBS, pH 7.4 con amortiguador que contenía 5 mM de CaCI2. La proteólisis limitada fue llevada a cabo por medio de incubar el rFnbA con trombina durante 1 hora a 25°C a una proporción de enzima / substrato de 1 :200 (p/p). La reacción fue terminada por medio de calentar a 95°C en la presencia de 2% de SDS, y analizada por SDS-PAGE.

Análisis SDS-PAGE. Las preparaciones del rFnbA modificado por Dansilcadaverina o dansil-PGGQQIV y sus fragmentos generados por trombina fueron analizadas por SDS-PAGE usando un gradiente preelaborado de 4 a 20% de geles (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Todos los geles de SDS-poliacrilamida en este estudio fueron examinados bajo luz ultravioleta y luego marcados con Coomassie Brilliant Blue R (BioRad Laboratories).

Digestión del rFnbA marcado Dansilcadaverina y Dansil-PGGQQIV. La hidrólisis enzimática del rFnbA modificado por dansilcadaverina fue lograda por medio de tratar con la proteasa Glu-C (V-8) (Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) y clorometil cetona de L-(tosilamido 2-fenil) etilo (TPCK)-tratado con tripsina (Worthington Biochemical Corp.). La hidrólisis del rFnbA modificado con dansil-PGGQQIV fue llevada a cabo usando solamente la proteasa Glu-C. Seguido por precipitación TCA y extracción, los granúlos rFnbA modificados fueron disueltos en 0.3 mi TBS, pH 7.4 para la división con tripsina o PBS, pH 7.8 para la división con la proteasa Glu-C. La división enzimática fue llevada a cabo por medio de incubar el rFnbA modificado con tripsina o la proteasa Glu-C durante 16 h a 37°C a una proporción de enzima/substrato de 1 :20 (p/p). Una cantidad adicional de tripsina o proteasa Glu-C fue agregada a la mezcla de reacción resultando en una proporción de enzima / substrato final de 1 :10 (p/p) y la digestión fue continuada durante otras 8 horas a 37°C. La mezcla de la digestión fue diluida 1 :1 (vol/vol) con 0.2% de ácido trifluoroacético, centrifugado a 14,000 x g durante 5 minutos, y el sobrenadante fue sometido a HPLC de fase inversa.

Separación De HPLC De Fase Inversa De Péptidos Marcados Con Dansilcadaverina Y Dansil-PGGQQIV. Los péptidos marcados con Dansilcadaverina y dansil-PGGQQIV fueron separados en una columna Aquapore RP-300 C8 (Brownlee Labs, Santa Clara, CA) por erupción de gradiente con acetonitrilo en 0.1 % ácido trifluoroacético. La separación se llevó a cabo usando una estación HPLC Dynamax equipada con un detector de fluorescencia ProStar (Varían, Walnut Creek, CA). Los péptidos fueron eluidos con un gradiente lineal de 0-50% de acetonitrilo sobre un intervalo de 90 minutos a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La erupción de péptidos fue detectada por medio de monitorear la absorbancia a 210 nm y la fluorescencia a 550 nm con excitación a 350 nm. Los picos trazadores de fluorescencia fueron recolectados y luego la concentración a volúmenes pequeños (50 - 200 µ?) fueron reinyectados en la misma columna. La segunda vuelta de elusión se llevó a cabo usando un gradiente lineal de 10-20% o de 20-35% de acetonitronitilo sobre un intervalo de 60 minutos a una velocidad de flujo 0.5 ml/min. Los péptidos ayudados marcados con dansilcadaverina o dansil-PGGQQIV fueron sometidos a análisis espectral de masa y análisis de secuencia de terminal NH2.

Análisis De Secuencia. El análisis de secuencia del terminal NH2 se nev6 a cabo con un secuenciador modelo 490 de Applied Biosystems. Las muestras seleccionadas fueron también sometidas para el análisis de servicio M-Scan Inc. Estas muestras fueron analizadas usando el secuenciador modelo 477a Applied Biosystems. El terminal NH2 de los péptidos aislados fue determinado por secuenciamiento de hasta 18 ciclos.

Estimación Teórica De Las Masas Moleculares De Los Péptidos. El cálculo de las masas moleculares de los péptidos generados por tripsina y por la proteinaza Glu-C se llevó a cabo a partir de la secuencia principal conocida del rFnbA estafilococal usando el software Péptido Companion V1.25. El efecto de la modificación de dansilcadaverina (335.50 Da) o dansil-PGGQQIV (932.00 Da) sobre la masa del péptido fue calculada por medio de agregar la masa molecular de las probetas. Ya que la formación de cada enlace 8-(y-glutamil) lisina isopéptido es acompañado por la liberación de un amoniaco (17,04 Da), los valores de masa molecular finales fueron ajustados de acuerdo a lo anterior.

Análisis De Masa Espectral. La determinación de las masas moleculares de los péptidos aislados se llevó a cabo usando el espectrómetro de masa MALDI-TOF Voyager DE-STR (Perseptive Biosystems, Foster City, CA). Los iones formados por desorción láser a (láser N2) fueron registrados con un puntaje de aceleración de 20 kV en el modo reflector. En general, 200 espectros únicos fueron acumulados para mejorar la proporción señal / ruido y analizados para el uso del software Data Explorer suministrado con el espectrómetro. El acido a-ciano-4-hidroxicinnamico (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wl) fue usado como una matriz absorvedora de ultravioleta. Un µ? de una solución de 10 mg/ml de los compuestos de matriz en 70% de acetonitrilo / 0.1% de ácido trifluoroacetico fue mezclado con 1 µ? de solución de péptido (5 - 10 pmole/µ?). Para MALDI-TOF MS, 1 µ? de esta mezcla fue manchado sobre un objetivo de muestra de acero inoxidable y se seco a temperatura ambiente. La masa espectral fue calibrada usando estándares externos: albúmina de suero bovino, Glu1-fibrinopeptido B humano, angiotensina I humana, y des-Arg1-bradykinina sintética. La precisión de masa esta en el rango de 0.1%.

EJEMPLO 1 Incorporación dirigida al factor Xllla de Dansilcadaverina y Dansil-PGGQQIV en el rFnbA y fragmentación de la proteína decorada por la probeta mediante Trombina Se ha informado que la proteína A que liga la fibronetina de la cepa ATCC49525 del S. aureus sirve como un sustrato bifuncional para el factor de coagulación Xllla que contiene tanto residuos Gln y Lys reactivos (Matsuka et al. 2003). Para determinar la localización de los residuos Gln y Lys reactivos dentro del FnbA, el donante de amina (dansilcadaverina) o el aceptor de amina (dansil-PGGQQIV) como probetas fluorescentes fueron incorporados en el rFnbA mediante acción catalítica del factor Xllla. Las reacciones se llevaron a cabo durante 4 a 18 horas, seguido por la remoción de probetas que no reaccionaron y la fragmentación del rFnbA marcado con el trazador fluorescente mediante trombina. La existencia de un enlace de péptido único de Arg202-Gly203 dentro del FnbA que es sensible al ataque de la trombina permite la generación de dos fragmentos que representan las porciones de terminal N y C del rFnbA con las masa moleculares teóricas estimadas de 22 y 70,7 kDa, respectivamente. Los productos de la división mediada por trombina del rFnbA fueron evaluados por SDS-PAGE con examen subsecuente de los geles bajo luz UV antes de la marcación con Coomassie Brilliant Blue (FIG. 1 ). La incubación del rFnbA decorado dansilcadaverina o con dansil-PGGQQIV con trombina resulto en la aparición de dos fragmentos discretos, consistentes con la hidrólisis de un enlace péptido único. La movilidad de los fragmentos generados por trombina de baja y alta masa molecular sobre el eje de SDS-PAGE fue algo mas bajo que lo esperado para fragmentos de 22 kDa y 70,7 kDa. Esta observación, sin embargo, es consistente con la baja movilidad general sobre el SDS-PAGE de la banda correspondiente al rFnbA pariente (tanto probeta modificada fluorescente y no modificada), que migra entre 120 kDa y 203 kDa estándares (Matsuka et al. 2003). La masa molecular obtenida para el rFnbA usando el análisis de masa espectral fue muy cercana al valor estimado para la secuencia principal (92.656 kDa), por lo tanto, sugiere una migración baja anormalmente de rFnbA y sus fragmentos sobre el SDS-PAGE.

La modificación del rFnbA con dansilcadaverina catalizada por el factor XI lia durante 4 h resulto en la fluorescencia en la banda correspondiente al rFnbA monomérico (FIG. 1 A y C, pista 1 ). La división generada por trombina del rFnbA decorado con dansilcadaverina y el análisis subsecuente de la mezcla de reacción por SDS-PAGE revelo que la fluorescencia estaba localizada casi completamente dentro del fragmento de baja masa molecular. La banda correspondiente al fragmento prominente de alta masa molecular acomodo solamente una pequeña fracción de la fluorescencia total de dansilcadaverina (FIG. 1 A y C, pista 2). Resultados similares fueron observados con el rFnbA modificado con dansilcadaverina durante un periodo de tiempo extendido de 18 horas (FIG. 1 A y C, pistas 3 y 4). La incubación prolongada del rFnbA con dansilcadaverina y el factor Xllla también resulto en la aparición de una banda menor de alta masa molecular correspondiente dímero rFnbA (FIG. 1 A y C, pista 3). La incubación de rFnbA en la presencia del factor Xllla y el péptido dansil-PGGQQIV durante 4 horas o 18 horas resulto en la incorporación de la probeta en el rFnbA monomérico lo mismo que en la aparición de las bandas correspondientes a los dímeros y a los polímeros de alta masa molecular (FIG. 1 B y D). Sin embargo, es evidente que bajo las condiciones experimentales empleadas, la reticulación de la proteína fue casi y completamente inhibida y la incorporación de las probetas de dansilcadaverina y dansil-PGGQQIV ocurre en la forma predominantemente monomérica del rFnbA. Cuando el rFnbA modificado por dansil-PGGQQIV fue sometido a división catalizada mediante trombina, solamente el fragmento de alta masa molecular exhibió fluorescencia bajo iluminación UV (FIG. 1 B y D, pistas 2 y 4). Así, los datos de proteólisis limitados revelaron que los sitios principales de aceptor de glutamina y donante de lisina estaban separados espacialmente dentro de la cadena de polipéptido de la molécula de rFnbA y localizados en las regiones de terminal N y C, respectivamente.

Ejemplo 2 Identificación de los sitios aceptores de glutamina del rFnbA involucrados en las reacciones de reticulación del factor Xllla Para identificar los residuos de Gln reactivos específicos dentro del rFnbA, este último fue incubado durante 4 y 18 horas en la presencia de factor Xllla y un exceso molar de la probeta de dansilcadaverina fluorescente. La reacción de marcación de la dansilcadaverina, las preparaciones de rFnbA modificadas fueron lavadas desde la probeta que no reacciono y luego digeridas con tripsina. La separación HPLC de los péptidos trípticos producidos después de 4 horas de incorporación catalizada por factor Xllla de dansilcadaverina en rFnbA revelo un perfil completo de 210 nm (FIG. 2 A). En contraste solamente un pico mayor con tiempo de retención de aproximadamente de 44 min fue detectado en la misma muestra luego de monitorear fluorescencia a 550 nm (FIG. 2 B, pico 1 ). La extensión del tiempo de incubación del rFnbA en la presencia del factor Xllla y dansilcadaverina desde 4 horas a 18 horas y la digestión subsecuente con tripsina no tuvo un impacto ni en el perfil de elusión a 210 nm (FIG. 2 C) o sobre la intensidad o tiempo de retención del pico principal de fluorescencia (FIG. 2 D, pico 1 ). Al mismo tiempo, extendiendo el tiempo de incorporación de la dansilcadaverina en el rFnbA resulto en el incremento de intensidades de dos picos menores fluorescentes ilustrados como 2 y 3 (FIG. 2 D). Los péptidos decorados con el trazador fluorescente marcados como pico 1 (FIG. 2 B) y picos 1 , 2, 3 (FIG. 2 D) fueron recolectados y después de un segundo pasaje a través de una columna C8 fueron caracterizados por la secuencia de terminal NH2 y el análisis espectral de masa (Tabla 2). El análisis de secuencia del péptido desde el pico 1 fluorescente principal revelo que este corresponde a un fragmento 13-mer derivado de la porción de terminal NH2 del rFnbA. Durante la degradación Edman, el residuo del 12av0 ciclo no fue detectado, aunque el secuenciamiento apropiado fue resumido en el siguiente 13av0 ciclo. El 12av0 residuo, que no produjo un aminoácido convencionalmente reconocido en el procedimiento Edman, corresponde a Gln103 sugiriendo por lo tanto que este fue modificado. Dos otros residuos Gln (Gln95 y Gln97) localizados en este péptido fueron liberados como derivados de PTH (feniltiohidantoino) en ciclos de 4 y 6, respectivamente. Los datos de secuenciamiento obtenidos para el péptido 13-mer tríptico (pico 1 ) son soportados adicionalmente por los resultados del análisis espectral de masa. La masa observada de este péptido mostró m/z 1783.83, correspondiente a la masa calculada del péptido que contenía una modificación única de dansilcadaverina, 1783.07 (Tabla 2). El análisis de secuencia espectral de masa del péptido tríptico del pico 3 menor fluorescente en la FIG. 2 D mostró que este péptido fue también derivado de la región del terminal NH2 de la molécula FnbA. Luego de secuenciar, un residuo único de Gln (Gln105) no fue detectado en le primer ciclo, pero el registro de los derivados de PHT de los residuos mostrados en la tabla 2 fueron resumidos en los siguientes ciclos, sugiriendo que el Gln105 puede ser identificado como otro sitio aceptor. La masa observada de este péptido corresponde al valor teórico con una modificación única de dansilcadaverina (Tabla 2). El material del pico 2 no es suficientemente homogéneo para el secuenciamiento de terminal NH2 aun después de un paso adicional por la columna de fase inversa C8, y por lo tanto, no fue identificado positivamente por la degradación Edman.

Debido a que alguno de los péptidos trípticos predichos eran algo grandes (particularmente aquellos que se originan de la porción de terminal COOH de la proteína), la digestión del rFnbA modificado por dansilcadaverina también se llevó a cabo usando proteinaza Glu-C, que genero péptidos más pequeños y más manejables. El rFnbA y el factor Xllla fueron incubados en la presencia de dansilcadaverina, como se describió en "Materials y Methods", y se digirió con la proteinaza Glu-C. Un pico único fluorescente con tiempo con tiempo de retención de 46 minutos fue observado repetidamente en la mezcla de digestión de la proteinaza Glu-C después de la modificación del rFnbA con dansilcadaverina durante un periodo de 4 horas (FIG. 3 B, pico 1 ). La incorporación de 18 horas extendida de dansilcadaverina en rFnbA, seguida por digestión con Glu-C, produjo el mismo pico 1 principal y múltiples picos menores designados como 2, 3, 4, 5, 6, y 7 (FIG. 3 D). Como se muestra en la tabla 2, cuatro péptidos fueron recuperados de la mezcla de digestión de la proteinaza Glu-C y positivamente identificados. Los péptidos de los picos 1 y 7 contenían los mismos residuos Gln 03 y Gln105 reactivos que aquellos identificados en las digestiones trípticas. Ambos péptidos corresponden a la secuencia 93-107 y difiere solamente en el número de modificaciones de dansilcadaverina. El péptido del pico fluorescente principal 1 contiene un residuo Gln103 modificado, mientras que ambos Gln103 y Gln105 son modificados en el péptido en el pico 7. La digestión con proteinaza Glu-C también produjo dos péptidos fluorescentes derivados de la porción terminal COOH del rFnbA. Los péptidos de los picos 4 y 6 contenían residuos Gln830 y Gln783 modificados, respectivamente (Tabla 2).

El análisis de los varios experimentos marcados con dansilcadaverina separados se llevaron a cabo durante 4 horas y 18 horas seguido por la digestión con tripsina o con proteinaza Glu-C sugirió que el Gln103 sirve como un sitio aceptor de amina principal para el factor Xllla en rFnbA. La alta reactividad del sitio Gln103 es responsable del origen de un pico fluorescente 1 principal único correspondiente al péptido tríptico ETTQSQDNSGDQ103 (FIG. 2 B) o al péptido TTQSQDNSGDQ103RQVD generado con la proteinaza Glu-C (FIG. 3 B). La modificación del Gln103 fue completada totalmente después de 4 horas de reacción (o antes), Ya que la incubación adicional con el factor Xllla no afecta la intensidad del pico 1 (FIG. 2 D y 3 D). En contraste, la recuperación de los péptidos fluorescentes adicionales de la tripsina (picos 2, 3) o de la proteinaza Glu-C (picos 4, 6, y 7) de las mezclas de digestión fue lograda solamente luego del tratamiento extendido con el factor Xllla. Las intensidades de estos picos fluorescentes fueron todavía significativamente bajas, comparadas con aquellas del pico principal 1 indicando que solamente una fracción de los residuos GIn reactivos en las posiciones 105, 783, y 830 sufrieron modificación. Así, los experimentos de modificación con dansilcadaverina revelaron que el rFnbA contiene un sitio aceptor de amina reactivo al factor Xllla principal (Gln103) y tres sitios menores (Gln105, Gln783, y Gln830).

Ejemplo 3 Identificación de los sitios donantes de lisina del rFnbA involucrados en las reacciones de reticulación del Factor Xllla La titulación mediada por el factor Xllla de las cadenas laterales del Lys del rFnbA se llevó a cabo usando el péptido dansil-PGGQQIV patronado sobre la secuencia de terminal N de la fibronectina. El rFnbA fue incubado durante 4 horas en la presencia del factor Xllla y la probeta dansil-PGGQQIV y luego se digirió con la proteinaza Glu-C. La separación HPLC de los péptidos generados por proteinaza Glu-C revelaron nuevamente múltiples picos detectados en 210 nm y solamente unos pocos picos fluorescentes, eluyendo en el rango de aproximadamente 60 minutos (FIG. 4 A y B). Sin embargo, con la excepción del pico marcado por un asterisco (FIG. 4 B), el grado de marcación y consecuentemente el nivel de pureza de los péptidos modificados por probeta no fueron suficientes para el análisis de secuencia requerido. Para mejorar la recuperación de los péptidos modificados por dansil-PGGQQIV, el rFnbA fue incubado con el factor Xllla y la probeta dansil-PGGQQIV durante 18 horas y diferido con las proteinaza Glu-C como se describió en "Materials and Methods". La separación HPLC de esta mezcla de digestión produjo un total de siete picos fluorescentes (FIG. 4 D). El perfil de elusión de los picos fluorescentes 1-7 (FIG. 4 D) fue similar a aquel de la mezcla de digestión generado después de 4 horas de modificación del rFnbA (FIG. 4 B), sugiriendo que la producción de los mismos péptidos con un mayor grado de marcación. Cada uno de estos picos fluorescentes (picos marcados con asterisco de la FIG. 4 B y los picos 1-7 de la FIG. 4 D) fueron purificados adicionalmente sobre una columna de fase inversa C8, y luego sometidos a evaluación por análisis espectral de masa y análisis de secuenciamiento. Los resultados del análisis llevado a cabo se resumen en la tabal 3. Un total de seis péptidos modificados fueron identificados positivamente usando tanto el análisis de masa espectral como el análisis de secuencia. Secuencias de alta confiabilidad fueron obtenidos para los picos de las fracciones 4, 5, y 7, identificando Lys 157, Lys 620, y Lys 503 sin ambigüedad como residuos modificados por la probeta (Tabla 3). Durante la degradación Edman los residuos Lys modificados por dansil-PGGQQIV no fueron reconocidos como derivados de PTH convencionales, y por lo tanto, no pudieron ser detectados. Luego del secuenciamiento del pico 4 este resultado fue observado en el segundo ciclo, mientras que el residuo Val fue liberado como derivado de PTH en el primer ciclo. El secuenciamiento resumió en el siguientes tercer ciclo y continuó sin interrupciones. El residuo Lys obtenido en el noveno ciclo reforzó adicionalmente la conclusión de que la lisina modificada (Lys 157) estaba presente en el ciclo 2. El análisis de los péptidos en los picos 5 y 7 revelo la interrupción del secuenciamiento en los ciclos 3 y 2, respectivamente. Nuevamente, este dato sugiere que Lys 620 (ciclo 3 el péptido 5) y Lys 503 (ciclo 2 en péptido 7) fueron modificados por el factor Xllla. Como puede verse en la tabla 3, los resultados del análisis de secuencia de terminal de NH2 obtenidos para los picos 4, 5, y 7 son consistentes con los valores m/z observados. Cada uno de estas fracciones modificadas por la probeta exhibieron un valor m/z que caza precisamente con la masa calculada del péptido respectivo que contiene una modificación única de dansil-PGGQQIV (Tabla 3). Cada uno de los picos fluorescentes 1 y 2 represento una mezcla de dos péptidos marcados y no marcados, presentes en cantidades esencialmente iguales. La lectura confiable de la secuencia doble fue lograda por medio de utilizar la secuencia principal conocida del FnbA y el mapa de sitios de división predichos. Similarmente, la lectura de una secuencia obtenida para el pico fluorescente fue también llevada a cabo conociendo la secuencia de aminoácido del FnbA y la localización de los sitios de división predichos catalizados por la proteinaza Glu-C. El análisis de fracciones aisladas revelo que algunos péptidos marcados con dansil-PGGQQIV fueron derivados de las mismas regiones de la cadena del polipéptido. La hidrólisis parcial del enlace de péptido Asp160-Val161 por la proteinaza Glu-C resulto en la recuperación de una versión mas corta del péptido 1 modificado por probeta (fragmento 156-160) y un péptido 4 mas largo (fragmento 156-168). Similarmente, la hidrólisis incompleta del enlace del péptido Asp629-His630 resulto en la producción del péptido 5 (fragmento 618-629) y el péptido 6 (fragmento 618-634) (Tabla 3). Así, el Lys 157 y Lys 620 nuevamente fueron identificados como residuos modificados por probeta en los picos fluorescentes 1 y 6, respectivamente. La modificación catalizada por el factor XI lia del Lys 762 fue demostrada por el secuenciamiento de la fracción correspondiente al pico fluorescente 2. El análisis de masa espectral de las fracciones 1 , 2, y 6 suministro otra línea de evidencia que soporta los resultados del secuenciamiento de terminal NH2. Los picos de masa en m/z 1432.37, 1820.22, y 2614.83 estaban presentes entre las fracciones 1 , 2, y 6, respectivamente. Las masa observadas obtenidas por los picos fluorescentes 1 , 2, y 6 correspondieron a los valores teóricos con una modificación única de dansil-PGGQQIV cada una (Tabla 3). El pico fluorescente ilustrado por un asterisco (FIG. 4 B) representó una mezcla de dos péptidos. La lectura de esta fracción fue nuevamente lograda por medio de conocer la secuencia primaria del FnbA. El péptido no marcado fue identificado como el fragmento 266-280 (FIG. 5) mientras que el péptido que contenía el trazador correspondió al pico 5 sobre la FIG. 4 D y contenía el Lys 620 modificado por la probeta único (Tabla 3). La fracción correspondiente al pico 3 (FIG. 4 D) pareció ser una mezcla de diversos péptidos, la secuencia de los cuales no pudieron ser resultas por la degradación Edman. Así, el tratamiento de el rFnbA con el factor Xllla en la presencia de la probeta dansil-PGGQQIV resulto en la modificación especifica del Lys 157, Lys 503, Lys 620, y Lys 762, sugiriendo que estos residuos sirven como sitios donadores de amina.

Ejemplo 4 Sustitución de residuos Gln y Lys reactivos al factor Xllla identificados usando la mutagénesis dirigida al sitio Los reemplazos de los residuos identificados Gln y Lys reactivos fueron llevados a cabo por medio de la introducción de cada mutación separadamente. Para este propósito se utilizaron oligonucleótidos sintéticos que abarcan la región de codificación deseada (incluyendo cambios como Gln a Ala o Lys a Ala) para la amplificación PCR del gen rFnbA. La utilización de subclones específicos de los 2520 genes bp (por ejemplo, un subclon que abraca Gln103, Gln105, y Lys 157 y uno que abraca Gln503, Lys 620, Lys 762, Gln783, y Gln830) simplifico la reconstrucción "por pasos modular" del gen alterado que contenía todas las 8 mutaciones. En cada caso, después de que el gen reconstruido fue subclonado en un vector de expresión de E. coli, el gen de rFnbA mutado fue secuenciado para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas. Por ejemplo, el residuo Gln103 del FnbA fue cambiado a Ala usando el oligonucleótido sintético GACAATAGCGGAGATGCAAGACAAGTAGATTTAATAC (y su complemento) para anillarse al plásmido pLP1143, que contiene los nucleótidos correspondientes a la mitad 5' aproximadamente del gen FnbA tipo natural. Este cebador fue extendido usando la polimerasa turbo Pfu para crear copias múltiples no metiladas de la región no alterada del gen FnbA (Gln103Ala). Después de la digestión del ADN de plantilla metilado con Dpnl, la transformación de E coli con los productos de la reacciones anteriores reducen la recuperación de la copia metilada original (tipo natural). Los plásmidos recuperados de la mezcla de transformación fueron entonces secuenciados a los largo de una porción de la región FnbA clonada para confirmar la presencia de la secuencia deseada: GACAATAGCGGAGATGCAAGACAAGTAGATTTAATAC. con el codón GCA (subrayado) sustituyendo una alanzan para el codón original de Gln (CCA) en el plásmido FnbA103A. Para obtener una secuencia de codificación FnbA de longitud completa, la mitad 5' del gen Gln103Ala FnbA mutado contenido en el plásmido FnbA103A fue cortado usando Ncol y Kpnl. El fragmento de ADN resultante fue entonces clonado en los sitios Ncol y Kpnl del pLP1125 (que contiene la longitud FnbA tipo natural). El producto de esta ligación (pl_P1149) contiene la mutación Gln103Ala en el gen FnbA de longitud completa como se determinó por el análisis de secuencia del ADN del gen FnbA de 2.517kb completo.

De una manera similar, el Lys 762 del FnbA tipo natural fu reemplazado por Ala usando el oligonucleotido sintético GAAGATACAGAGGCAGACAAACCTAAG. en el cual el codón para Ala (GCA, subrayado) reemplaza al codón para Lys (AAA). Este cebador fue usado para anillar al plásmido pLP1144, que contiene los nucleótidos correspondientes a aproximadamente la mitad 3' del FnbA tipo natural. Después de la extensión del cebador la transformación del anfitrión E. coli, como se describió anteriormente, la presencia de la región mutada fue confirmada por al análisis de secuencia de ADN mostrando el reemplazo del codón Lys (AAA) por el codón para Ala (GCA, subrayado) en el plásmido FnbA762A. La mutación de Lys 762Ala contenida en el plásmido FnbA762A fue introducida en el gen FnbA de longitud completa por digestión del plásmido FnbA762A con Spel y Notl y se ligo el fragmento resultante en el pLP1125 con las mismas enzimas. El plásmido recombinante resultante, pLP1150 contiene la mutación Lys 762Ala como se determinó por el secuenciamiento de ADN del gen FnbA completo.

La mutación doble, FnbAQ103A,Q105A (Gln en 103 y 105 reemplazados por Ala) fue construida usando la secuencia de oligonucleótido sintético: GGAGATGC>AAGAGCAGTAGATTTAATAC, que contiene el codón para el Alai 05 (GCA, subrayado) en adición a la mutación Gln103Ala (itálicas), este cebador fue anillado al pLP1149 (FnbAQ103A) y el producto de extensión (plásmido 5?03?+5? 05?) secuenciado a lo largo de la porción del gen que contiene la mutación. El fragmento Ncol, Kpnl, que contiene la doble mutación fue entonces usado para reemplazar la secuencia tipo natural en el pLP1125 para crear pLP1155. El gen FnbA completo contenido en el pLP1 155 fue secuenciado para confirmar la presencia de la mutación doble. La mutación doble Lys 620Ala, Lys 762Ala fue construida usando el oligonucleótido: CGAAGAGTCTACAGCAGGTATTGTAACTG para cebar la síntesis de ADN usando la plantilla, el plásmido pLP 150. Este oligonucleótido contenía el codón GCA para el Ala620 (subrayado) en lugar del codón Lys 620 tipo natural. El plásmido resultante contenía la mutación Lys 762Ala original del pLP1150 más la mutación Lys 620Ala como se determino por el secuenciamiento del ADN. La reacción doblemente mutada fue subclonada en el pLP1125 con el Spel, Notl como fragmento de ADN desde el doble muíante que reemplaza la secuencia tipo natural. El plásmido resultante, pLP1156 fue secuenciado a lo largo del gen FnbA completo, confirmando la presencia de las mutaciones Lys 620Ala, Lys 762Ala. Este procedimiento es repetido hasta que todas las mutaciones han sido construidas en las dos mitades del gen FnbA. Cada conjunto de mutaciones es combinado por el procedimiento de subclonación diseñado anterior, resultando que un gen FnbA que contiene todas las ocho mutaciones.

Ejemplo 5 Evaluación y de las propiedades de reticulación del mutante rFnbA La reducción de la reactividad del rFnbA mutado hacia el factor Xllla es demostrada usando diferentes métodos. Las probetas fluorescentes de bajo peso molecular, dansilcadaverina y dansil-PGGQQIV, son utilizadas para la evaluación de la reactividad de la transglutaminasa de el rFnbA mutado. La carencia de incorporación de las probetas anteriores en el rFnbA mutado por el factor Xllla indica la ausencia de los residuos Gln y Lys reactivos. La demostración de la reactividad reducida o eliminada del rFnbA mutado hacia el factor Xllla también se lleva a cabo por la evaluación de su habilidad para someterse a reticulación catalizada por el factor Xllla en la fibronectina y la fibrina humana. La incorporación de las probetas fluorescentes catalizadas por el factor Xllla lo mismo que las reacciones de reticulación hacia la fibronectina o fibrina son también llevadas a cabo con el rFnbA tipo natural como un control positivo.

En los siguientes ejemplos, la mutagénesis dirigida a sitio fue usada para reemplazar los sitios Gln y Lys identificados son reactivos a los residuos Ala y el efecto de estas mutaciones fue evaluado en la reacciones de reticulación de FnbA-fibrina y FnbA-fibronectina. El sitio Gln103 principal reactivo fue reemplazado con Ala en un mutante residuo único de FnbA, que fue destinado como 1Q FnbA. Todos los sitios Gln103, 105, 783, 830 y Lys 157, 503, 620, 762 fueron sustituidos con residuos Ala en el mutante FnbA, el cual fue designado como 4Q4K FnbA. La reactividad al factor Xllla de ambos el 1Q FnbA y el 4Q4K FnbA como mutantes fue comparada con aquellas del receptor FnbA tipo natural y los resultados se discuten con respecto al papel de la transglutaminasa anfitriona en la adhesión y colonización estafilococal.

Ejemplo 6 Generación del mutante 1Q FnbA (mutación Q103A) La 1533 regiones del gen FnbA que codifican la región A del terminal NH2 (residuos 1-511 ) delm FnbA estafilococal fue producido por amplificación PCR usando ADN cromosomal del la cepa ATCC49525 del S. aureus como plantilla. La amplificación se llevó a cabo usando los siguientes cebadores directo 5'-GGCCATGGCATCAGAACAAAAGACAACTACAG-3' y el inverso 5'-CGAGGATCC rLATGTTTCAATTTG CTTG G C-3' del PCR. El cebador directo incorporo un sitio de restricción Neo I (subrayado) y el codón de iniciación ATG inmediatamente antes de la región codificadora de la secuencia madura. El cebador inverso incluye el codón de terminación TAA inmediatamente después del segmento de codificación, seguido por un sitio Bam Hl (subrayado). El fragmento de ADN amplificado fue aislado, tratado con las enzimas de restricción Neo I y Bam Hl y subsecuentemente ligado dentro del vector pET-28a (Novagen, Inc., Madison, Wl). La mutagénesis del gen FnbA fue llevada a cabo usando el kit de mutagénesis dirigido al sitio QuikChange II XL (Stratagene, La Jolla, CA). Para sintetizar la cadena de ADN mutante empleamos el vector pET-28a que contiene 1533 fragmentos bp del gen FnbA como una plantilla. El oligonucleótido sintético 5'-GACAATAGCGGAGATGCAAGACAAGTAGATTTAATAC-3' y su complemento fueron utilizados como cebadores mutagénicos. Los cebadores mutagénicos que contienen el codón GCA que reemplazo el CAA para generar la mutación deseada Gln ? Ala en la posición 103. El ciclado térmico, la extensión de los cebadores usando polimerasa de ADN Pfu Ultr, y la digestión de la plantilla (hemi) metilada con endonucleasa Dpn I (Stratagene, La Jolla, CA) se llevó cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN mutado fue transformado en células XL 10 £ coli Gold competentes (Stratagene) para la reparación de la mella. El ADN del plásmido resultante fue diferido con las enzimas de restricción Neo I y Kpn I y el fragmento de ADN de 680 bp del gen FnbA que contiene la mutación CAA ? GCA fue subclonado en el pET-28a vector que contiene el gen FnbA tipo natural (residuos 1 -839 del FnbA) (Matsuka et al. 2003). La ligación del fragmento de ADN de 680 bp mutado en el pET-28a / vector del gen FnbA usando los sitios de restricción Neo I y Kpn I resulto en la restauración del gen FnbA de 2517 bp que codifica el FnbA mutado (Q103A FnbA). El plásmido pET-28a al resultante (mutante Q103A FnbA) fue transformado en células BL21 (DE3) del E. coli para la expresión de la proteína. La presencia de la mutación Q103A deseada fue confirmada por el secuenciamiento de la región mutada del gen FnbA.

Ejemplo 7 Generación del mutante 4Q4K FnbA (Gln103Ala, Gln105Ala, Gln783Ala, Gln830Ala, Lys 157 Ala, Lys 503Ala, Lys 620Ala, y Lys 762Ala mutaciones) Introducción de la mutación K762A. La región del gen FnbA que codifica la región de terminal COOH (residuos 512-839) del FnbA estafilococal fue producido por amplificación PCR usando ADN cromosomal de la cepa ATCC49525 del S. aureus como plantilla. La amplificación se llevó acabo usando los siguientes cebadores PCR delantero 5'-GAGCCATGGATATTAAGAGTGAATTAGG-3' y el 5'- CG AGGATCCG G CGTTGTATCTTCTTCAATC-3 ' inverso. Los cebadores directo e inverso incorporaron uno sitios Neo I y Bam Hl (subrayado), respectivamente. El fragmento de ADN amplificado fue aislado, tratado con las enzimas de restricción Neo I y Bam Hl y se ligo en el vector pET-28a (Novagen, Inc., Madison, Wl). La síntesis del hilo de ADN mutado fue llevado a cabo usando el vector pET-28a que contiene un fragmento de 984 bp del gen FnbA como una plantilla y el oligonucleótido sintético 5'-GAAGATACAGAGGCAGACAAACCTAAG-3' y su complemento como cebadores mutagénicos. Los cebadores mutagénicos contenían el codón GCA que reemplazo al AAA para generar la mutación deseada Lys -» Ala en la posición 762. El ADN mutado fue transformado en células XL 10-Gold de £ coli competentes (Stratagene, La Jolla, CA). El plásmido resultante fue digerido con las enzimas de restricción Spe I y Not I y el fragmento de ADN mutado de 612 bp fue subclonado en el vector pET-28a que contenía la longitud completa del gen FnbA tipo natural (residuos del FnbA 1-839).

Introducción de las mutaciones Q105A y K157A. Las mutaciones Q105A y K157A fueron generadas consecutivamente usando la plantilla pET-28a que contenía las mutaciones únicas (Q103A) y la doble (Q103A, Q105A) en el gen FnbA, respectivamente. Los oligonucleótidos sintéticos 5'-G G AG ATG C AAG AGCAGTAG ATTTAATAC-3' y su complemento fueron empleadas como cebadores mutagénicos para la mutación Q105A, mientras que 5'-GTTTCAGAAGTCGCAGGTACAGATGTG-3' y su complemento fueron utilizados para la introducción de la mutación K157A. El ADN mutado contenía tres mutaciones (Q103A, Q105A, y K157A) fue transformado en células DH 10B del E. coli competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido fue digerido con las enzimas de restricción Neo I y Kpn I y el fragmento de ADN mutado de 680 bp fue aislado para la subclonación subsiguiente en el vector pET-28a.

Introducción de la mutación K620A. la mutación K620A fue generada usando la plantilla pET-28a que contiene la mutación única (K762A) en el gen FnbA. Esta fue lograda usando el oligonucleótido mutagénico 5'- CG AAG AGTCTAC AG CAG GTATTGTAACTG-3' y su complemento. El ADN mutado contenía dos mutaciones (K620A y K762A) fue transformado en células DH 10B del E. coli competente (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue digerido con la enzimas de restricción Bsr Gl y Spe I y el fragmento de ADN mutado 1119 bp fue aislado y subclonado en el vector pET-28a que contiene el gen FnbA con la mutación única K762A. Introducción de la mutación K503A. La mutación K503A fue generada usando la plantilla pET-28a que contiene las mutaciones dobles (K620A, K762A) en el gen FnbA. El oligonucleótido sintético 5'-GCAGTACGATGCCGCGCAAATTATTGAAAC-3' y su complemento fueron utilizados como cebadores mutagenicos. El ADN mutado fue transformado en las células DH 10B del E. coli competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue digerido con las enzimas de restricción Kpn I y Spe I y el fragmento de ADN mutado con 1256 bp que contiene las mutaciones K503A y K620A fue aislado para la subclonación subsiguiente dentro el vector pET-28a.

Introducción de la mutación Q783A. la mutación Q783A fue generada usando la plantilla pET-28a que contiene las mutaciones dobles (K620A, K762A) en el gen FnbA. El oligonucleótido sintético 5'-GACAGTGTGCCAGCAATTCATGGATTC-3' y su complemento fueron utilizados como cebadores mutagénicos. El ADN mutado fue transformado en las células DH 10B del E. coli competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue digerido con las enzimas de restricción Spe I y Not I y el fragmento de ADN mutado con 612 bp contenía las dos mutaciones (K782A y Q783A) fue aislado para la subclonación subsiguiente en el vector pET-28a.

Tres fragmentos de ADN que contienen las siete mutaciones (680 bp - Q103A, Q105A, K157A; 1265 bp - K503A, K620A; y 612 bp - K762A, Q783A) fueron ligados en el vector pET-28a digeridos con las enzimas de restrccion Neo I y Not I, resultando en la restauración del gen FnbA de 2516 bp que codifica al mutante FnbA Q103A, Q105A, K157A, K503A, K620A, K762A, Q783A.

Introducción de la mutación Q830A. La mutación Q830A fue generada usando la plantilla pET-28a que contiene tres mutaciones (K620A, K762A, y Q783A) en el gen FnbA. El oligonucleótido sintético 5'-CAAAATGAAGGTGCACAAACGATTGAAG-3' y su complemento fueron utilizados como cebadores mutagénicos. El ADN mutado fue transformado en las células DH 10B del E. coli competentes (Invitrogen, Carlsbad, CA). El plásmido resultante fue digerido con enzimas de restricción Spe I y Not I y el fragmento de ADN mutado con 612 bp que contiene las mutaciones K762A, Q783A, y Q830A fue aislado para la subclonación en un vector pET-28a. Esto resulto en la restauración del gen FnbA que codifica al FnbA que contiene un total de ocho mutaciones Q103A, Q105A, K 57A, K503A, K620A, K762A, Q783A, y Q830A.

El ADN de plásmido resultante fue transformado en células BL21 (DE3) de E. coli para la expresión de la proteína. Cada fragmento de ADN generado que contiene la mutación específica fue secuenciado antes de la subclonación en el vector pET-28a. El gen FnbA mutado restaurado fue secuenciado una vez mas para confirmar la presencia de las mutaciones deseadas y la integrada de la región codificadora completa.

Proteínas. La expresión y purificación del FnbA tipo natural, y los mutantes 1Q, y 4Q4K FnbA fueron llevados a cabo de acuerdo con procedimientos descritos en otra parte (Matsuka et al. 2003). Todas las preparaciones del FnbA fueron dializadas contra 20 mM de Tris, pH 7.4, 150 mM NaCI, en alícuotas, y se almaceno congelado a -20 °C.

Anticuerpos. Los anticuerpos policlonales anti-rFnbA fueron generados en conejos como se describió anteriormente (Matsuka et al. 2003). La cadena Aa anti-fibrinogen monoclonal de ratón (Aa 529-539, clon 1C2-2) anticuerpo fue comprada de Accurate Chemical y Scientific Corp. (Westbury, NAND). El anticuerpo anti-fibronectina monoclonal de ratón (clon 2B6-F9) fue obtenido de Cedarlane Laboratories (Hornby, Ontario, Canadá). Los conjugados de de fosfatasa alcalina IgG anti-ratón y de cabra anti-conejo fueron comprados BioRad Laboratories (Hercules, CA).

Estimación teórica de las masas moleculares de los Péptidos. El cálculo de la masa molecular de los péptidos producidos por la proteinaza Glu-C se llevaron a cabo a partir de la secuencia principal conocida del rFnbA estafilococal usando el software Peptide Companion V1.25 (CSPS Pharmaceuticals, Inc., San Diego, CA). El efecto de la modificación dansil-PGGQQIV (930.44 Da) sobre la masa del péptido fue calculada considerando el incremento de masa debido a la probeta. Ya que la formación de cada enlace isopéptido de e-(y-glutamil) Lys ine es acompañado por la liberación de un amoniaco (17.03 Da), los valores de masa molecular finales fueron ajustados de acuerdo a lo anterior.

Separación HPLC de fase inversa de los Péptidos marcados con Dansil-PGGQQIV. Los péptidos marcados con Dansil-PGGQQIV fueron separados sobre una columna Aquapore RP-300 C8 (Brownlee Labs, San Francisco, CA) por elusión de gradiente con acetonitrilo en 0.1% de acido trifluoroacético. La separación se llevó a cabo usando la estación Dynamax HPLC equipada con el detector de fluorescencia ProStar (Varían, Palo Alto, CA). Los Péptidos fueron eluidos con un gradiente lineal de entre 0-50% de acetonitrilo durante un intervalo de 90 minutos a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. La elusión de de los péptidos fue detectada por medio de monitorear la absorbancia en 210 nm y la fluorescencia en 550 nm con excitación en 350 nm. En los picos trazadores fluorescentes fueron recolectados y luego la concentración en volúmenes mas pequeños (50 - 200 µ?) fueron reinyectados en la misma columna. La segunda ronda de elusión se llevó a cabo usando un gradiente lineal entre 10-20% o 20-35% de acetonitrilo durante un intervalo de 60-minute a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. Los péptidos marcados con dansil-PGGQQIV aislados fueron sometidos a análisis espectral de masa.

Análisis espectral de masa. La determinación de las masas moleculares de los péptidos aislados se llevó a cabo usando el espectrómetro de masa MALDI-TOF Voyager DE-STR (Perseptive Biosystems, Foster City, CA). Los iones formados por desorción láser a 337 nm (N2 láser) fueron registrados con un voltaje de aceleración de 20 kV en el modo reflector. En general, 200 espectro únicos fueron acumulados para mejorar la proporción señal/ruido y se analizo mediante el uso del software Data Explorer. El acido alfa-ciano-4-hidroxicinamico (Aldrich Chemical Co., San Louis, MO) fue usado como la matriz. Un µ? de una solución de 10 mg/ml de los compuestos matriz en 70% de acetonitrilo / 0.1% de acido trifluoroacético fueron mezclados con 1 µ? de la solución del péptido (5 - 10 pmole/µ?). Para el MALDI-TOF MS, 1 µ? de esta mezcla fue manchada sobre una muestra de acero inoxidable objetivo y secado a temperatura ambiente. El espectro de masa fue calibrado externamente usando Glu1-fibrinopéptido humano B, angiotensina I humana, y des-Arg1-bradikinina.

Análisis SDS-PAGE y Western Blot. El SDS-PAGE fue llevado a cabo usando unos geles preformados con gradiente de 3-8% de Tris-Acetato (Invitrogen, Carlsbad, CA). Todos los geles SDS-poliacrilamida en este estudio fueron manchados con Coomassie Brilliant Blue R (BioRad Laboratories, Hercules, CA). Para el análisis Western Blot las muestras de proteína fueron electromanchadas en membranas de nitrocelulosa e inmunomarcadas con el anticuerpo policlonal de conejo o monoclonal de rato correspondiente. Las membranas fueron tratadas con anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina anti-conejo o anti-raton de cabra y la actividad de la fosfatasa alcalina fue desarrollada con el substrato conjugado de fosfatasa alcalina (BioRad Laboratories, Hercules, CA).

Activación del factor XIII. La activación fue logrado tratando de 500 µg/ml de Factor XIII (Haematologic Technologies, Inc., Essex Junction, VT) con 0.25 U/ml de trombina (Sigma, San Louis, MO) en TBS, pH 7.4 de amortiguador que contenía 10 miM de ditiotreitol y 20 mM CaCI2. Después de incubación durante 20 min a 37°C, la trombina fue inactivada por medio de agregar un exceso molar de irudina (Sigma, San Louis, MO) y esta mezcla fue usada como factor Xllla (Takagi et al. 1995).

Incorporación de las probetas de Dansilcadaverina y Dansil-PGGQQIV. El factor XIII activado fue empleado para incorporar la dansilcadaverina (Sigma, San Louis, MO) o dansil-PGGQQIV (New EnGly Peptide, Inc., Gardner, MA) en las especies de FnbA. La Dansilcadaverina fue utilizada para probar las glutaminas reactivas al Factor Xllla y el péptido dansil-PGGQQIV fue usado para probar las lisinas reactivas. La incorporación se llevó a cabo por medio de incubar 2 µ? de rFnbA tipo natural o mutado con 30 µg/ml of Factor Xllla en la presencia de 2 mM de dansilcadaverina o 2 mM de dansil-PGGQQIV a 3°C en 20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCI, 5 mM DTT, 5 mM CaCI2 o 20 mM Tris, pH 8.5, 15 mM NaCI, 5 mM DTT, 5 mM CaCI2, respectivamente. Las reacciones de control también se llevaron a cabo en los mismos amortiguadores que contenían 2 mM de EDTA. A diversos tiempos de las reacciones fueron terminadas por la adición de 2% SDS y 10% ß-mercaptoetanol, calentado a 95°C, y analizado por SDS-PAGE. Los geles fueron examinados bajo luz ultravioleta y luego marcados con, Coomassie brilliant blue.

Reticulación a fibrina. La polimerización de la fibrina y la reticulación catalizada por el factor Xllla de fibrina en la presencia o ausencia de 2 µ? de FnbA tipo natural o mutado se inicio por la adición de 0.5 U/ml de trombina a una solución que contenía 5 µ? de fibrinogen humano (Calbiochem, San Diego, CA) y 15 µg/ml del factor XIII. Las reacciones de reticulación fueron llevadas a cabo en TBS, amortiguador a pH 7.4 que contiene 5 mM CaCI2 a 37°C. A diversos tiempos la reacciones fueron terminadas por la adición de 20 mM de Tris, pH 7.2, 9 M de urea, 40 mM ditiotreitol, 2% SDS. Los trombos fueron solubilizados a 37°C durante 30 minutos, calentados a 95°C, y las muestras fueron analizadas por SDS-PAGE / Western blotting.

Reticulación a la fibronectina. La reacción de reticulación con fibronectina fue iniciada por la adición de 15 µg/ml de factor XIII activado a una solución que contenía 1 ?? de FnbA tipo natural o mutado y 2 IHIM de plasma fibronectina humana (Sigma, San Louis, MO). Las reacciones se llevaron a cabo en TBS, amortiguador para pH 7.4 que contiene 5 mM de CaCI2 a 37°C. A diversos tiempos después las reacciones de reticulación fueron terminadas por la adición de 2% de SDS y 10% de ß-mercaptoetanol, calentado a 95°C, y analizado por SDS-PAGE / Western blotting.

Cinemática de la reticulación. La cinemática de la reticulación mediada por el factor Xllla de las especies FnbA a fibrina y fibronectina fue examinada por análisis densitométrico de los geles marcados con Coomassie brilliant blue. La densitometría láser fue llevada a cabo usando un densitometro SI personal (Molecular Dynamics, Piscataway, NJ). Cada gel fue escaneado y las imágenes generadas fueron analizadas usando el software ImageQuant 5.2. La rata de reacciones fue evaluada por la disminución del FnbA sobre su reticulación a fibrina o fibronectina. La cantidad relativa de FnbA en la mezcla de reacción fue determinada usando el área por debajo del pico correspondiente a la banda FnbA y entonces se gráfico como una función del tiempo.

RESULTADOS Incorporación de las probetas de Dansilcadaverina y Dansil-PGGQQIV. Las formas tipo natural y mutadas (1Q, 4Q4K) del FnbA que comprende residuos Alai a Pro839 (FIG. 7 A) fueron producidas en E. coli usando el vector de expresión pET-28a y aisladas de la fracción soluble del lisado bacterial como se describió anteriormente (Matsuka et al. 2003). Cada una de las proteínas aisladas exhibió una banda única sobre el SDS-PAGE (FIG. 7 B) y se mostró una secuencia de terminal NH2 única que se inicia en ASEQKTTTVE. Para examinar si el reemplazo de los sitios Gln y Lys son identificados con los residuos Ala afectaron la reactividad del FnbA hacia el factor Xllla, unas series de experimentos fueron diseñados en los cuales las formas de tipo natural y mutado (1Q y 4Q4K) de FnbA fueron ensayadas como sustratos para el Factor Xllla. La Comparación de la reactividad del Factor Xllla del FnbA tipo natural con aquella de los mutantes FnbA 1Q y 4Q4K fue llevado a cabo inicialmente usando probetas de dansilcadaverina y dansil-PGGQQIV (Figura 8). A diversos tiempos, alícuotas de la mezcla de reacción con dansilcadaverina o dansil-PGGQQIV fueron recolectadas, analizadas por SDS-PAGE, y examinadas bajo los ultravioleta antes de su marcación con Coomassie blue. En la presencia del Factor Xllla y un exceso molar de dansilcadaverina, la banda correspondiente al FnbA tipo natural sufre un incremento continuo de fluorescencia que refleja el ligado enzimático de moléculas incrementantes en la probeta (FIG. 8A). Bajo las mismas condiciones experimentales, la incorporación de la dansilcadaverina en el mutante 1Q FnbA fue drásticamente reducido, sugiriendo que el GIn en la posición 103 realmente actúa como un sitio GIn reactivo principal en el FnbA. Una reducción adicional en la intensidad de la fluorescencia fue observada con el mutante 4Q4K rFnbA en el cual todos los cuatro residuos GIn y reactivos identificados (GIn 103, GIn 105, Gln783, y GIn 830) fueron reemplazados con Ala (FIG. 8A). La incubación del mutante 4Q4K FnbA con dansilcadaverina y el Factor Xllla durante 60 minutos, sin embargo, resulto en una incorporación débil pero detectable de la probeta (FIG 8A). La reactividad residual del mutante 4Q4K FnbA observado en la reacción con dansilcadaverina puede indicar la presencia en el FnbA de un sitio GIn reactivo menor adicional (s).

La incorporación catalizada por el Factor Xllla de la probeta dansil-PGGQQIV en el FnbA tipo natural es demostrada en la Figura 8B. Cuando el mutante 1Q FnbA fue ensayado en la misma reacción, su banda de proteína exhibió una intensidad de fluorescencia que fue ligeramente mayor cuando se comparo con aquella del FnbA tipo natural (FIG. 8). Este resultado sugiere que la sustitución del Gln103 reactivo principal con Ala resulto en una marcación de dansil-PGGQQIV más eficiente de los sitios Lys dentro del mutante 1Q FnbA. El efecto es atribuido a la alta reactividad del sitio Gln103, que puede competir efectivamente con la probeta del péptido dansil-PGGQQIV por medio de participar en reticulación intra y/o intermolecular de proteínas. La ocurrencia de la reticulacióon de la proteína sobre la incorporación de la probeta dansil-PGGQQIV en el FnbA de tipo natural es soportada por la presencia de bandas de baja movilidad detectables bajo luz ultravioleta y sobre le manchado con Coomassie blue (FIG. 8B). El Factor Xllla incorporo la probeta dansil-PGGQQIV en el mutante 4Q4K FnbA a una velocidad reducida y con una eficiencia menor, sugiriendo que el Lys157, Lys503, Lys620, y Lys762 mutados sirven como sitios donores de amina. Es aparente, sin embargo, que la reducción general de la reactividad del Factor Xllla que se observo con el mutante 4Q4K FnbA hacia la probeta dansil-PGGQQIV no fue significativo como hacia la dansilcadaverina. Esto indica que los sitios Lys reactivos adicionales permanecen disponibles para la modificación enzimática con la probeta dansil-PGGQQIV.

Reticulación mediada por el Factor Xlla-hacia fibrina. La reactividad del Factor Xllla de los mutantes 1Q Y 4Q4K de FnbA fue evaluada en una reacción de reticulación a fibrina. En una reacción de control, el FnbA tipo natural se somete a reticulación a la cadena alfa de fibrina lo que resulta en la formación de heterocomplejos de alta masa molecular (Matsuka et al.2003) La reticulación fue acompañada por el agotamiento de la banda correspondiente al FnbA tipo natural y por la aparición de una banda prominente con una masa molecular aparentemente correspondiente al heterodímero de cadena a de FnbA (FIGURA 9 A, B, y C, banda a). Los productos de la reacción de raticulación (bandas a, b, c, y d) reaccionaron tanto con el anticuerpo policlonal anti-FnbA y el anticuerpo monoclonal de la cadena a-fibrinogen (FIG. 9 B y C), sugiriendo que estos complejos están compuestos de FnbA ligada covalentemente y la cadena a de fibrina. Bajo las mismas condiciones experimentales, ambos mutantes de FnbA (1Q y 4Q4K) exhibieron reactividad de reticulación con el Factor Xllla extremadamente baja. Solamente trazas de heterodímero de cadena de fibrina a-FnbA mutante fueron detectados luego del manchado Coomassie blue (FIG. 9 A) o sobre el inmunomarcado con el anticuerpo policlonal anti-FnbA (FIG. 9B) y el anticuerpo monoclonal de cadena a-fibrinogen (FIG.9C). El consumo de las especies tipos naturales y mutados de FnbA luego de la incubación con fibrina y Factor Xllla fue evaluado usando un análisis de densitométrico (FIG. 10). Como se muestra en la FIG.10, el FnbA tipo natural reacciono a una rata mucho mayor que los mutantes 1Q o 4Q4K de FnbA. Después de 120 minutos de incubación, la cantidad de mutante de FnbA 1Q o 4Q4K (sin reticulación restante fue cerca del 85% mas en comparación con aquella de FnbA tipo natural. Estos datos tienen que el sitio Gln en la posición 103 es el mayormente responsable de la sujeción catalizada por el Factor Xllla del FnbA a la cadena a de fibrina. El dato obtenido también indica que tantos los mutantes 1Q y 4Q4K del FnbA exhiben cerca de una reducción del 85% en la reactividad en la reacción de reticulación con la fibrina.

Reticulación Mediada por el Factor Xllla a la Fibronectina. La reactividad de los mutantes 1Q y 4Q4K de FnbA también se ensayo en redacciones con plasma fibronectina. Para este propósito en los análisis de SDS-PAGE y Western blot fueron nuevamente utilizados para ensayar la reactividad de los mutantes del FnbA. Luego de la incubación con fibronectina las bandas correspondientes a las formas de tipo natural o mutadas de FnbA fueron agotadas estáticamente a medidas que las proteínas se reticularon en heterocomplejos de alta masa molecular (FIG. 11 A, B, y C). La formación de complejos de alta masa molecular reticulados covalentemente consiste de FnbA tipo natural o mutado y fibronectina fue evidente de los resultados del análisis muestra blot usando el anticuerpo policlonal anti-FnbA (FIG-11 B) y anticuerpo monoclonal anti-fibronectina (FIG. 11 C). Tanto el SDS-PAGE y Western blot revelaron muy poca diferencia entre la reactividad de las especies de FnbA tipo natural y mutadas (FIG.1 ). Sin embargo, las cinemática de la reacción fue ensayada usando el análisis de densitométrico para la diferencia en la rata de reticulación se volvió evidente (FIG.12). El mutante 1Q FnbA reacciono a una rata cercana a la del FnbA, tipo natural mientras que el mutante 4Q4K FnbA exhibió una rata menor reticulación. Después de 360 minutos de incubación, la cantidad de mutante 4Q4K FnbA libre (no reticulado) remanente fue cerca de 35% menos cuando se comparo con aquella de FnbA tipo natural o del mutante 1Q FnbA. Estos datos sugieren que los sitios Lys en las posiciones 157, 503, 620 y 762 están involucradas en la reticulación mediada por el Factor XI lia del FnbA con fibronectina y contribuye totalmente cerca del 35% de la reactividad del FnbA. Los datos también indican que el residuos Lys reactivos adicionales no identificados de FnbA están involucrados en la reticulación con fibronectina.

Identificación de Lys 702 como un sitio Reactivo Adicional en el FnbA. Los resultados de los experimentos de marcación con la probeta de dansil-PGGQQIV y la reticulación con la fibronectina sugieren que el sitio Lys reactivos adicionales permanecen disponibles para el Factor Xllla en el mutante 4Q4K Fnba. Como se informo anteriormente (solicitud de patente U.S. 60/573,724 y Anderson et al. 2004) para la identificación de los sitios Lys reactivos al Factor Xllla, un procedimiento fue empleado que utiliza la marcación del FnbA con dansil-PGGQQIV (Parameswaran et al.1990; Lorand et al. (1992). Usando el dansil-PGGQQIV como un trasador fluorescente nosotros marcamos el FnbA con la probeta, se digirió la proteína modificada con proteinaza Glu-C y se llevó a cabo la separación HPLC de los péptidos FnbA marcados. Subsecuentemente los análisis espectrales de masa y de secuencia terminal NH2 de los picos fluorescentes aislados (péptidos que contiene el trazador) resulto en la identifcación de todos excepto un pico (designado como pico 3) (Anderson et al.2004).Para identificar el sitio o sitio Lys reactivo adicionales en el FnbA el material correspondiente al pico fluorescente 3 fue purificado adicionaimente usando HPLC fase inversa y entonces se sometió a análisis espectral de masa. El análisis del material modificado por la probeta de pico 3 revelo la presencia de un péptido con una masa observada [M+H]+ de 1941.98 (FIG.13). Este valor corresponde a una masa calculada del péptido 9-merNSHVDIKSE que contiene una modificación única de dansil-PGGQQIV (Tabla 4). El péptido NSHVDIKSE es originado de la región terminal COOH del FnbA y contiene un residuo Lys único en la posición 702. Por lo tanto, el Lys702 fue identificado como el residuo modificado por la probeta que es objetivado por el Factor Xllla. Alineación múltiple de secuencia de las especies FnbA y FnbB conocidas de diferentes cepas del S. aureus revelaron que el Lys702 es extremadamente conservado y presente en todas las secuencias analizadas (FIG.14). El sitio Lys702 esta situado en la región que esta localizada entre las repeticiones Du y D1 del enlace con fibronectina del FnbA (FIG.7) y, por lo tanto, debería estar disponible fácilmente para su reticulación con el Gln3 de la fibronectina. Adicionaimente, el Lys702 recién identificado junto con el Lys620 reactivo (Anderson et al. 2004) son los únicos dos sitios Lys que se han encontrado en todas las secuencias de FnbA y FnbB analizadas. Ambos sitios Lys620 (pico fluorescente 5, FIG. 11 D [7]) y Lys702 (pico fluorescente 3, FIG. 11 D (Anderson et al. 2004)) también exhibieron reactividad más alta hacia la probeta dansil-PGGQQIV. La reactividad alta observada en el recién identificado Lys702 y su alto grado de preservación en la secuencias FnbA y FnbB sugieren la importancia de este sitio para las reacciones de reticulación catalizadas por el Factor XI Na.

Debería entenderse que la discusión anterior y los ejemplos presentados son meramente una descripción detallada de ciertas modalidades. Por lo tanto es evidente para aquellos versados en la técnica que diversas modificaciones y equivalente pueden ser hechos sin salirse del espíritu y alcance de la invención.

Todos los artículos de revistas, otras referencias, patentes y solicitudes de patentes que están identificadas en esta solicitud de patente se incorporan como referencia en su totalidad.

REFERENCIAS Matsuka et al. "Staphyloccoccus aureus Fibronectin-Binding Protein Serves as a Substrate for Coagulation Factor Xllla: Evidence for Factor XI lia-Cata lyzed Covalent Cross-Linking to Fibronectin and Fibrin." Biochemistrv 42, 14643-14652 (2003).

Aeschlimann, D. and Paulsson, M. "Transglutaminases: Protein Cross-Linking Enzymes in Tissues and Body Fluids." Thrombosis and Haemostasis 71. 402-415 (1994).

Gorman J. J. and Folk, J. E. "Structural features of glutamine substrates for transglutaminases: Specificities of human plasma factor Xllla and guinea pig liver enzyme toward syntheticpeptides.". J. Biol. Chem. 256, 2712-2715 (1981 ).

Gorman J. J. and Folk, J. E. "Structural features of glutamine substrates for transglutaminases: Role of extended interactions in the specificity of human plasma factor Xllla and guinea pig liver enzyme." J. Biol. Chem. 259, 9007-9010 (1984).

Fesus L, Metsis M. L, Muszbek L. and Koteliansky, V. E. "Transglutaminase-sensitive glutamine residues of human plasma fibronectin revealed by studying its proteolytic fragments." Eur. J. Biochem. 154, 371-374 (1986).

Henschen, A. and J. McDonagh. "Fibrinogen, fibrin and factor XIII. " Blood coagulation. H. C. Hemker. Amsterdam, Elsevier science Publishers: 171-241 (1986).

Lorand, L. "Factor XIII: Structure, Activation, and Interactions with Fibrinogen and Fibrin." Ann. N.Y. Acad. Sci. 936: 291-311 (2001 ).

Lorand, L. and R. M. Graham. "Transglutaminases: Crosslinking Enzymes with Pleiotropic Functions." Nature 4: 140-156 (2003).

Signas, C, G. Raucci, et al. "Nucleotide sequence of the gene for a fibronectin-binding protein from Staphylococcus aureus: Use of this peptide sequence in the synthesis of biologically active peptides." Proceedings of the National Academv of Sciences of the United States of America 86: 699-703 (1989).

Schneewind, O., A. Fowler, et al. "Structure of the Cell Wall Anchor of Surface Proteins in Staphylococcus aureus." Science 268(5207): 103 - 106 (1995).

Lorand, L., N. G. Rule, et al. (1968). "Amine Specificity in Transpeptidation. Inhibition of Fibrin Cross-Linking." Biochemistrv 7: 1214-1223 (1968).

Lorand, L., G. E. Siefring, et al. "Dansylcadaverine Specific Staining for Transamidating Enzymes." Analvtical Biochemistrv 93: 453-458 (1979).

Parameswaran, K., P. Velasco, et al. "Labeling of D-lysine crosslinking sites in proteins with peptide substrates of factor Xllla and transglutaminase." Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 8472-8475 (1990).

Lorand, L, K. Parameswaran, et al. "Biotinylated Peptides Containing a Factor Xllla or Tissue Transglutaminase-Reactive Glutaminyl Residue That Block Protein Cross-linking Phenomena by Becoming Incorporated into Amine Donor Sites." Bioconiugate Chem. 3:37-41 (1992).

Sobel, J. H. and M. A. Gawinowicz. "Identification of the Alpha Chain Lysine Donor Sites Involved in Factor Xllla Fibrin Cross-linkinq." J. Biol. Chem. 271: 19288-19297 (1996).

Cottrell, B. A., D. D. Strong, et al. "Amino acid sequence studies on the alpha-chain of human fibrinogen. Exact location of cross-linking acceptor sites." Biochemistry 18: 5405-5410 (1979).

McDonagh, R. P., J. McDonagh, et al. "Amino acid sequence of the factor Xllla acceptor site in bovine plasma fibronectin." FEBS Lett 127: 174-178 (1981 ).

Matsuka, Y., L. Medved, et al. "Factor XII la-Cata lyzed Cross-linking of Recombinant Alpha C Fragments of Human Fibrinogen." Biochemistry 35: 5810-5816 (1996).

House-Pompeo, K., Y. Xu, et al. "Conformational Changes in the Fibronectin Binding MSCRAMMs Are Induced by Ligand Binding." J. Biol. Chem. 271: 1379-1384 (1996).

Penkett, C. J., C. Redfield, et al. "NMR Analysis of Main-chain Conformational Preferences in an Unfolded Fibronectin-binding Protein." J. Mol. Biol. 274: 152-159 (1997).

Penkett, C. J., C. Redfield, et al. "Structural and Dynamical Characterization of a Biologically Active Unfolded Fibronectin-Binding Protein from Staphylococcus aureus." Biochemistrv 37: 17054-17067 (1998).

Grootjans, J. J., P. J. T. A. Groenen, et al. "Substrate Requirements for Transglutaminases. Influence of the Amino Acid Residue Preceding the Amine Donor." J. Biol. Chem. 270: 22855-22858 (1995).

Jonsson, K., C. Signas, et al. "Two different genes encode fibronectin-binding proteins in Staphylococcus aureus: the complete nucleotide sequence and characterization of the second gene." Eur. J. Biochem. 202: 1041-1048 (1991 ).

Baba, T., Takeuchi, F., Yuzawa, H., Aoki, K., Oguchi, A. Nagai, Y., Iwama, N., Asano, K., Naimi, T., Kuroda, H., Cui, L, Yamamoto, K., and Hiramatsu, K. "Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA" The Lancet 359, p.1819-1827 (2002).

Kuroda, M., T. Ohta, et al. "Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus." The Lancet 357: 225-1240 (2001).

Thompson J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive múltiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice." Nucleic Acids Research 22, p. 4673-4680 (1994).

Mosesson, M. W. (1992). "The roles of fibrinogen and fibrin in hemostasis and thrombosis." Semin. Hematol. 29: 177-188 (1992).

Grinnel, F., M. Feld, et al. "Fibroblast Adhesión to Fibrinogen and Fibrin Substrata: Requirement for Cold-lnsoluble Globulin (Plasma Fibronectin)." Cell 19: 517-525 (1980).

Knox, P., S. Crooks, et al. "Role of Fibronectin in the Migration of Fibroblasts into Plasma Clots." The Journal of Cell Bioloqy 102: 2318-2323 (1986).

Corbett, S. A., L. Lee, et al. "Covalent Cross-linking of Fibronectin to Fibrin Is Required for Maximal Cell Adhesión to a Fibronectin-Fibrin Matrix." J. Biol.Chem. 272: 24999-25005 (1997).

Matsuka, Y. V., L. V. Medved, et al. "The N-terminal Fibrin-binding Site of Fibronectin Is Formed by Interacting Fourth and Fifth Finger Domains." The Journal of Biological Chemistrv. 269(13): 9539-9546 (1994).

Matsuka, Y., M. Migliorini, et al. "Cross-Linking of Fibronectin to C-Terminal Fragments of the Fibrinogen D-Chain by Factor Xllla." J Prot Chem 16: 739-745 (1997).

U.S. Patent No. 5,320,951 U.S. Patent No. 5,571 ,514 U.S. Patent No. 5,175,096 U.S. Patent No. 5,652,217 Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989).

Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990).

Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, NY, 6.3.1-6.3.6 (1989).

Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Broach, et al., Experimental Manipulation of Gene Expression. ed. M. Inouye, Academic Press (1983), p. 83.

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. 2nd ed.. Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Chapters 16 and 17.

Wong, Chemistry of Protein Conjugation. CRC Press, Ann Arbor Ml (1991 ).

Bernatowicz and Matsueda, Analvtical Biochemistrv 155:95-102 (1986).

Frisch et al., Bioconiugate Chem. 7:180-186 (1996).

Boeckler et al., J. Immunological Methods 191:1-10 (1996).

Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

WO 96/21356 U.S. Patent No. 5,593,972 Takagi, J., T. Aoyama, et al. "Identification of factor-Xllla-reactive glutaminyl residues in the propolypeptide of bovine von Willebrand factor." Eur. J. Biochem. 232:773-777 (1995).

Clement, S., P. T. Velasco, et al. "The intermedíate filament protein, vimentin, in the lens is a target for cross-linking by transglutaminase." J Biol Chem 273(13): 7604-9 (1998).

R.A.S. Ariens, T.-S. Lai, J.W. Weisel, C.S. Greenberg and P.J. Grant, Blood 100: 743-754 (2002).

L. Lorand, G.E. Siefring, Y.S. Tong, J. Bruner-Lorand and A.J. Gray, Analytical Biochemistrv 93:453-458 (1979).

K. Parameswaran, P. Velasco, J. Wilson and L. Lorand, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:8472-8475 (1990).

U.S. patent application 60/573,724 E.T. Anderson, L. Fletcher, A. Severin, E. Murphy, S.M. Baker and Y.V. Matsuka, Biochemistry 43: 11842-11852 (2004).

J. Takagi, T. Aoyama, S. Ueki, H. Ohba, Y. Saito and L. Lorand, Eur. J. Biochem. 232:773-777 (1995).

L. Lorand, K. Parameswaran, P. Velasco and S. Murthy, Bioconjugate Chem. 3: 37-41 (1992).

J.D. Thompson, D.G. Higgins and T.J. Gibson, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994).

Tabla 1. Substratos Factor XIII TAF indica el inhibidor de fibrinolisis activable por trombina; PAI-2, inhibidor activador de plasminogen 2.

Ariens, R.A. et al Blood (2002) 100, 743-754 Tabla 2. Resumen del análisis de secuencia del terminal NH2 y espectral de masa de los péptidos modificados con dansilcadaverina derivados de rFnbA.

[Q] - Indica un ciclo Edman sin recuperación de un aminoácido conocido y asignado al Gln derivatizado por el factor XI lia. La masa calculada de los péptidos trípticos 1 y 3, y los péptidos de la proteinaza Glu-C 1 , 4, y 6 incluyen la masa de una molécula de dansilcadaverina incorporada. La masa calculada del péptido de proteinaza Glu-C 7 incluye la masa de dos moléculas de dansilcadaverina incorporadas (ver Materials y Methods). El péptido tríptico del pico fluorescente 2 y los péptidos de la proteinaza Glu-C de los picos fluorescentes 2, 3, y 5 no fueron identificados positivamente.

Tabla 3. Resumen del análisis de secuencia en el terminal NH2 y espectral de masa de los péptidos modificados con dansil-PGGQQIV derivados del rFnbA. [k] - Indica un ciclo Edman sin recuperación de un aminoácido conocido y asignado a Lys derivatizado por el Factor Xllla. La masa calculada incluye la masa de una molécula dansil-PGGQQIV incorporada (ver Materials y Methods). Péptido del pico fluorescente 3 no fue identificado positivamente.

Tabla4. Análisis espectral de masa del péptido modificado con dansil-PGGQQIV derivado del rFnbA por la proteinaza Glu-C.

La masa calculada incluye la masa de una molécula de dansil-PGGQQIV incorporada (ver Materials y Methods).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína (Fnb) aislada, alterada del estafilococcal aureus (S. aurius) que se liga a la fibronectina, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en los residuos correspondientes a glutamina (GIn) 103, Gln105, lisina (Lys) 157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 de FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aurius, en donde el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un substrato al Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, y las proteínas humanas son seleccionadas entre el grupo que consiste de fibronectina y fibrina.

2. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , que es derivado de FnbA o FnbB.

3. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es en Gln103.

4. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 3, en donde la mutación es de glutamina alanina.

5. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es en Gln105.

6. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 5, en donde la mutación es de glutamina alanina.

7. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es Lys157.

8. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 7, en donde la mutación es de lisina a alanina.

9. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es Lys503.

10. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 9, en donde la mutación es de lisina a alanina.

11. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es Lys620.

12. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 11 , en donde la mutación es de lisina a alanina.

13. El Fnb aislado y alaterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es Lys762.

14. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 13, en donde la mutación es de lisina a alanina.

15. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es Gln783.

16. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 15, en donde la mutación es de glutamina a alanina.

17. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es Gln830.

18. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 17, en donde la mutación es de glutamina a alanina.

19. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la mutación es en cada uno de los residuos Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830.

20. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 19, en donde la mutación es en cada uno de los residuos Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830. es Ala.

21. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 19, en donde la mutación de uno cualquiera de los residuos Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 es Ala.

22. Una composición inmunogénica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una proteína de S aureus aislada y alterada que liga a la fibronectina (Fnb), en donde la alteración es una mutación de por los menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. Aurius, y en donde el Fnb alterado retiene la inmunogenisidad y, cuando es incorporando en la composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como substrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb alterado no mejora el ligado de Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S aurius.

23. La composición inmunogénica de la reivindicación 22, que comprende adicionalmente un adyuvante.

24. Un método para inmunizar un vertebrado contra el S. aurius, que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunológicamente efectiva de un Fnb aislado y alterado del S aureus en donde la alteración es una mutación de por lo menos de un aminoácido seleccionado entre el grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aurius, y en donde el Fnb alterado retiene la ¡nmunogenesidad y, cuando se incorpora en una composición inmunogénica y se administra a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas para servir como substrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas de grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb aislado y alterado no mejora el ligado de Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado del S. aurius.

25. El método de la reivindicación 24, en donde el vertebrado es un humano seronegativo.

26. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación en por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos de glutamina (GIn) 134, Gln136, lisina (Lys) 188, Lys534, Lys651 , Lys793, Gln814 y Gln861 del FnbA de la cepa Mu50 del S. aureus .

27. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación en por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de glutamina (GIn) 134, Gln136, lisina (Lys) 188, Lys534, Lys651 , Lys793, Gln814 y Gln861 del FnbA de la cepa N315 del S. aureus.

28. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación en por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de glutamina (GIn) 139, Gln141 , lisina (Lys) 539, Lys656, Lys798, Gln819 y Gln866 de la cepa MW2. FnbA del S. aurius.

29. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación en por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de glutamina (GIn) 147, Gln149, lisina (Lys) 547, Lys664, Lys806, Gln827 y Gln874 del FnbA de la cepa MSSA-476 del S. aurius.

30. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación en por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de glutamina (GIn) 139, Gln141 , lisina (Lys) 655, Lys797 y Gln865 del FnbA de la cepa del S. aurius.

31. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación en por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de glutamina (GIn) 139, Gln141 , lisina (Lys) 655, Lys797 y Gln865 del FnbA de la cepa 8325-4 del S. aurius.

32. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos en un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos de glutamina (GIn) 147, Gln149, lisina (Lys) 549, Lys666, Gln791 y Gln838 del FnbA de la cepa EMRSA-16 del S. aurius.

33. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos glutamina (GIn) 111 , lisina (Lys) 602, Gln765 y Gln812 del FnbB de la cepa Mu 50 del S. aureus.

34. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos glutamina (GIn) 111 , lisina (Lys) 602, Gln765 y Gln812 del FnbB de la cepa N315 del S. aureus.

35. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos lisina (Lys) 598, Lys740 y glutamina (GIn) 808 del FnbB de la cepa MW2 del S. aureus.

36. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos lisina (Lys) 598, Lys740, y glutamina (GIn) 808 del FnbB de la cepa MSSA-476 del S. aureus.

37. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos lisina (Lys) 591 , Lys 733 y glutamina (Gln) 801 del FnbB de la cepa COL del S. aureus.

38. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 1 , en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos lisina (Lys) 591 , Lys733 y glutamina (Gln) 801 del FnbB de la cepa 8325-4 del S. aureus.

39. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un Fnb del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a glutamina (Gln) 103, Gln105, lisina (Lys) 157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, y las proteínas humanas se seleccionan del grupo que consiste de fibronectina y fibrina.

40. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 39 ligada operativamente a una secuencia regulatoria.

41. Una célula anfitriona recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 40.

42. Un método para producir un Fnb alterado, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a glutamina (Gln) 103, Gln105, lisina (Lys) 157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, en donde las proteínas humanas se seleccionan del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, el método comprende mantener la célula anfitriona recombinante de la reivindicación 41 bajo condiciones adecuadas para expresión del Fnb alterado.

43. Una composición inmunogénica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del fnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb alterado no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

44. La composición inmunogénica de la reivindicación 43, que comprende adicionalmente un agente facilitador de transfección.

45. Un método para inducir una respuesta inmune en un vertebrado, que comprende administrar al vertebrado la composición inmunogénica de la reivindicación 43 en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune.

46. Un método para inmunizar un vertebrado contra el S. aureus, que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende un vehiculo fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunológicamente efectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys762, Gln783 y Gln830 del fnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, y en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb alterado no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

47. El método de la reivindicación 46, en donde el vertebrado es un humano seronegativo.

48. Una proteína (Fnb) aislada, y alterada del Stafílococcal aureus (S. aureus) que liga a la fibronectina, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a glutamina (GIn) 103, Gln105, lisina (Lys) 157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, y las proteínas humanas se seleccionan del grupo que consiste de fibronectina y fibrina.

49. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 48, en donde la mutación es un Lys702.

50. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 49, en donde la mutación es de lisina a alanina.

51. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 48, en donde la mutación es en cada uno de los residuos Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830.

52. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 51 , en donde la mutación en cada uno de los residuos Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 es a Ala.

53. El Fnb aislado y alterado de la reivindicación 48, en donde la mutación en uno caualquiera de los residuos Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 es a Ala.

54. Una composición inmunogénica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una proteína (Fnb) aislada y alterada del S. aureus que liga a la fibronectina, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del fnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, y en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor XII la o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb alterado no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

55. La composición inmunogénica de la reivindicación 54, que comprende adicionalmente un adyuvante.

56. Un método para inmunizar un vertebrado contra el S. aureus, que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunológicamente efectiva de un Fnb aislado y alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del fnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, y en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutamínasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fíbronectina y fibrina, y el Fnb aislado y alterado no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fíbronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

57. El método de la reivindicación 56, en donde el vertebrado es un humano seronegativo.

58. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a glutamina (GIn) 103, Gln105, lisina (Lys) 157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, y las proteínas humanas se seleccionan del grupo que consiste de fibronectina y fibrina.

59. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 58 ligada operativamente a una secuencia regulatoria.

60. Una célula anfitriona recombinante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 59.

61. Un método para producir un Fnb alterado, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a glutamina (Gln) 103, Gln105, lisina (Lys) 157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del FnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, en donde las proteínas humanas se seleccionan del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, el método comprende mantener la célula anfitriona recombinante de la reivindicación 60 bajo condiciones adecuadas para expresión del Fnb alterado.

62. Una composición inmunogénica que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del fnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, el Fnb alterado es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb alterado no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

63. La composición inmunogénica de la reivindicación 62, que comprende adicionalmente un agente facilitador de transfección.

64. Un método para inducir una respuesta inmune en un vertebrado, que comprende administrar al vertebrado la composición inmunogénica de la reivindicación 62 en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune.

65. Un método para inmunizar un vertebrado contra el S. aureus, que comprende administrar al vertebrado una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y una cantidad inmunologicamente efectiva de una molécula de ácido nucleico que codifica un Fnb alterado del S. aureus, en donde la alteración es una mutación de por lo menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos correspondientes a Gln103, Gln105, Lys157, Lys503, Lys620, Lys702, Lys762, Gln783 y Gln830 del fnbA de la cepa ATCC49525 del S. aureus, y en donde el Fnb alterado retiene la inmunogeneicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un vertebrado, es menos capaz que el Fnb tipo natural de reticular covalentemente con proteínas humanas que sirven como un sustrato para el Factor XIII, Factor Xllla o tejido de transglutaminasa, las proteínas humanas son seleccionadas del grupo que consiste de fibronectina y fibrina, y el Fnb alterado no mejora el ligado del Fnb tipo natural a la fibronectina y fibrina luego de la infección subsiguiente del vertebrado con el S. aureus.

66. El método de la reivindicación 65, en donde el vertebrado es un humano seronegativo.