JP4281861B2 - Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓポリペプチドおよび対応するｄｎａフラグメント - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、Streptococcus pyogenes(グループＡストレプトコッカス）のポリペプチドに関し、これを使用し、ストレプトコッカス性感染を予防、診断および／または処置し得る。
本発明は、Streptococcus pyogenes(グループＡストレプトコッカス）のポリペプチドに関し、これを使用し、ストレプトコッカス性感染を予防、診断および／または処置し得る。
発明の背景
Streptococciは、細胞表面で見出される、群特異的炭水化物抗原ＡないしＯによって分化されるグラム陽性細菌である。S. pyogenes単離株はさらに、型特異的Ｍタンパク質抗原によって区別される。分子量および配列の両方において高度に変化し得る重要な感染性因子である。実際に、８０より多いＭタンパク質型が、抗原性差異に基づいて同定された。
Streptococciは、細胞表面で見出される、群特異的炭水化物抗原ＡないしＯによって分化されるグラム陽性細菌である。S. pyogenes単離株はさらに、型特異的Ｍタンパク質抗原によって区別される。分子量および配列の両方において高度に変化し得る重要な感染性因子である。実際に、８０より多いＭタンパク質型が、抗原性差異に基づいて同定された。
S. pyogenesは、咽頭炎、丹毒および膿痂疹、猩紅熱および侵入性疾患、例えば菌血症および壊死性筋膜炎を含む、多くの広範な感染型の原因菌である。近年の侵入性疾患の再帰が、北アメリカおよびヨーロッパの国を含む多くの国で報告された。該生物は抗生物質に感受性であるが、高攻撃率および腐敗症の急速な開始は、高発症および死亡率という結果となる。
S. pyogenes感染から宿主を保護するワクチンを開発するため、努力が感染性因子、例えば型特異的Ｍタンパク質に焦点があった。しかし、Ｍタンパク質のアミノ末端部分が、ヒト心筋、トロポミオシン、ミオシン、およびビメンチンと反応した交差反応性抗体を誘導し、これが自己免疫性疾患に関係し得ることが見出された。その他は、種々の血清型からのＭタンパク質のアミノ末端ペプチドを含む複合ハイブリッドタンパク質を生産するための組み換え技法を使用した。しかし、すべてのS. pyogenes血清型を含む安全なワクチンは、生産および標準化するのに高度に複合的である。
血清型特異的抗原に加えて、他のS. pyogenesタンパク質が、ワクチン候補としての興味を生じた。Ｃ５ａペプチダーゼ、これは少なくともS. pyogenes４０血清型によって発現されるものは、マウスで免疫原性であることが示されたが、鼻咽腔転移増殖（colonization）のレベルを減少させる能力は限定的であった。他の研究者はまた、感染の病原性において重要な役割を演ずるようであるストレプトコッカスピロゲニックエキソトキシン（pyrogenic exotoxins）に焦点が合った。これらのタンパク質での免疫化は、毒性ショックの致命的症状を防止したが、定着化（colonization)を防止しなかった。
オクラホマ大学は、S. pyogenes菌株Ｍ１ ＧＡＳのためのゲノム配列決定プロジェクトを設けた（http://dnal/chem.ou.edu/strep.html）。
したがって、S. pyogenes感染の予防および／または治療のため使用されるワクチン成分であり得るS. pyogens抗原の満たされない必要性が残存する。
発明の要約
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、アミノ酸配列配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドに関する。
他の側面では、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、医薬組成物、発現制御領域に作動可能に連結される本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、並びに当該ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞および当該宿主細胞を、発現に好適な条件下で培養することを含むポリペプチドを生産するための方法を提供する。
発明の詳細な記載
本発明は、ストレプトコッカス性感染を診断、予防、および／または処置するために使用し得るストレプトコッカス性ポリペプチドをコードする精製され、かつ単離されたポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、ストレプトコッカス性感染を診断、予防、および／または処置するために使用し得るストレプトコッカス性ポリペプチドをコードする精製され、かつ単離されたポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
本発明の１側面にしたがって：（ａ）配列番号２を含むポリペプチド、（ｂ）（ａ）のポリペプチドの少なくとも１０連続アミノ酸残基を有する抗原性または免疫原性フラグメントを含むポリペプチド、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有する抗原性または免疫原性アナログを含むポリペプチド、（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有する抗原性または免疫原性アナログを含むポリペプチド、（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有する抗原性または免疫原性アナログを含むポリペプチド、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリペプチドのエピトープを有する部分、（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のいずれかのポリペプチド、ここで該Ｎ末端Ｍｅｔ残基は欠失している、および（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のいずれかのポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失されている、から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明の更なる側面にしたがって：（ａ）配列番号２を含むポリペプチド、（ｂ）（ａ）に少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、（ｃ）（ａ）のポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、（ｄ）（ａ）のポリペプチドに結合特異性を有する抗体を生成できるポリペプチド、（ｅ）（ａ）のポリペプチドのエピトープを有する部分、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のいずれかのポリペプチド、ここで該Ｎ末端Ｍｅｔ残基は、欠失されている、および（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のいずれかのポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失されている、から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明の１側面にしたがって：（ａ）配列番号２を含むポリペプチド、（ｂ）（ａ）のポリペプチドの少なくとも１０連続アミノ酸残基を有する抗原性または免疫原性フラグメントを含むポリペプチド、（ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有する抗原性または免疫原性アナログを含むポリペプチド、（ｄ）（ａ）または（ｂ）のポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有する抗原性または免疫原性アナログを含むポリペプチド、（ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有する抗原性または免疫原性アナログを含むポリペプチド、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）のいずれかのポリペプチドのエピトープを有する部分、（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のいずれかのポリペプチド、ここで該Ｎ末端Ｍｅｔ残基は欠失している、および（ｈ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）および（ｇ）のいずれかのポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失されている、から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
本発明の更なる側面にしたがって：（ａ）配列番号２を含むポリペプチド、（ｂ）（ａ）に少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、（ｃ）（ａ）のポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、（ｄ）（ａ）のポリペプチドに結合特異性を有する抗体を生成できるポリペプチド、（ｅ）（ａ）のポリペプチドのエピトープを有する部分、（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）のいずれかのポリペプチド、ここで該Ｎ末端Ｍｅｔ残基は、欠失されている、および（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）のいずれかのポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失されている、から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドに関する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドのエピトープを有する部分に関する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも８０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含むアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドに関する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、配列番号２を含むポリペプチドのエピトープを有する部分に関する。
１側面にしたがって、本発明は、
（ａ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリペプチドに結合特異性を有する抗体を生成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド
から選択されるポリペプチドを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリペプチドに結合特異性を有する抗体を生成することのできるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｅ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号１またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド
から選択されるポリペプチドを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、
（ａ）配列番号２から選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２から選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２から選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２から選択される配列を含むポリペプチドについて結合特異性を有する抗体を惹起する（raise）ことのできるポリペプチドをコードするヌクレオチド
（ｅ）配列番号２から選択される配列を含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１から選択される配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド
から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
（ａ）配列番号２から選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号２から選択される配列を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号２から選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｄ）配列番号２から選択される配列を含むポリペプチドについて結合特異性を有する抗体を惹起する（raise）ことのできるポリペプチドをコードするヌクレオチド
（ｅ）配列番号２から選択される配列を含むポリペプチドのエピトープを有する部分をコードするポリヌクレオチド
（ｆ）配列番号１から選択される配列を含むポリヌクレオチド
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリヌクレオチドに相補的であるポリヌクレオチド
から選択されるポリヌクレオチドを含む単離ポリヌクレオチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、
（ａ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドに結合特異性を有する抗体を惹起することのできるポリペプチド
（ｅ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドのエピトープを有する部分
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該Ｎ末端メチオニン残基は欠失している、
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失している、
から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
（ａ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド
（ｂ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドに結合特異性を有する抗体を惹起することのできるポリペプチド
（ｅ）配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドのエピトープを有する部分
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該Ｎ末端メチオニン残基は欠失している、
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失している、
から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
１側面にしたがって、本発明は、
（ａ）配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド
（ｃ）配列場号２を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドに結合特異性を有する抗体を惹起することのできるポリペプチド
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープを有する部分
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該Ｎ末端メチオニンは、欠失している、
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失している、
から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
（ａ）配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも７０％同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）配列番号２を含む第２ポリペプチドに少なくとも９５％同一性を有するポリペプチド
（ｃ）配列場号２を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２を含むポリペプチドに結合特異性を有する抗体を惹起することのできるポリペプチド
（ｅ）配列番号２を含むポリペプチドのエピトープを有する部分
（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該Ｎ末端メチオニンは、欠失している、
（ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）のポリペプチド、ここで該分泌アミノ酸配列は欠失している、
から選択されるポリペプチドを含む単離ポリペプチドを提供する。
当業者は、本発明が、本特許出願にここに記載されるように、本発明がＤＮＡ分子、すなわちアナログ、例えばそのようなポリペプチドの突然変異体、変異体、ホモログ、および誘導体をコードする、ポリヌクレオチドおよびそれらの相補的配列を含むことを認識する。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子に対応するＲＮＡ分子を含む。ＤＮＡおよびＲＮＡ分子に加えて、本発明は、対応するポリペプチドおよびそのようなポリペプチドに特異的に結合するモノ特異的抗体を含む。
さらなる実施態様では、本発明にしたがうポリペプチドは、抗原性である。
さらなる実施態様では、本発明にしたがうポリペプチドは、免疫原性である。
さらなる実施態様では、本発明にしたがうポリペプチドは、宿主の免疫応答性を誘起できる。
さらなる実施態様では、本発明にしたがうポリペプチドは、免疫原性である。
さらなる実施態様では、本発明にしたがうポリペプチドは、宿主の免疫応答性を誘起できる。
さらなる実施態様では、本発明はまた、前定義のような本発明のポリペプチドに結合特異性を有する抗体を惹起することのできるポリペプチドに関する。
「結合特異性を有する」抗体は、選択されたポリペプチドを認識し結合するが、サンプル、例えば生物学的サンプル中の他の分子を実質的に認識し結合しない抗体である。特異的結合は、選択されたポリペプチドが抗原として使用されるＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定できる。
本発明にしたがって、生物学的研究における「保護」は、生存曲線、速度または期間の有意な増加によって定義される。それぞれ生存曲線を比較するためＬｏｇ順位試験を使用する、および生存率および死亡ヘの日数を比較するためフィッシャーの直接法を使用する統計学的分析は、Ｐ値を計算し、そして２群の間の相違が統計定に有意であるか決定しりために有用であり得る。０．０５のＰ値は有意でないとみなされる。
本発明の追加的側面では、本発明のポリペプチドの、またはそのアナログの抗原性／免疫原性フラグメントを提供する。
本発明のフラグメントは、１または２以上のそのようなエピトープ性領域を含み、またはそれらの抗原性／免疫原性特性を保持するそのような領域に十分に類似するべきである。こうして、本発明に従うフラグメントについて、同一性の程度は恐らく無関係であり、なぜならこれらがここに記載のような、ポリペプチドの特定部分またはそのアナログに１００％同一であり得るからである。本発明はさらに、本発明のポリペプチド配列に由来する少なくとも１０連続アミノ酸残基を有するフラグメントを提供する。１実施態様では、少なくとも１５連続アミノ酸残基。１実施態様では、少なくとも２０連続アミノ酸残基。
主要な問題は、再び、フラグメントが抗原性／免疫原性特性を保持することである。
当業者は、本発明のポリペプチドのアナログがまた、本発明の文脈で用途、すなわち抗原性／免疫原性材料としての用途を見出すことを認識する。こうして、例えば１または２以上の付加、欠失、置換またはその他を含むタンパク質またはポリペプチドは、本発明に含まれる。
当業者は、本発明のポリペプチドのアナログがまた、本発明の文脈で用途、すなわち抗原性／免疫原性材料としての用途を見出すことを認識する。こうして、例えば１または２以上の付加、欠失、置換またはその他を含むタンパク質またはポリペプチドは、本発明に含まれる。
ここで使用するように、本発明のポリペプチドの「フラグメント」、「アナログ」または「誘導体」は、天然または非天然であり得る、１または２以上のアミノ酸残基が保存（同類）または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存）で置換されている、これらのポリペプチドを含む。１実施態様では、本発明のペプチドの誘導体およびアナログは、図に示されるこれらの配列またはそのフラグメントと約７０％同一性を有する。すなわち、残基の７０％は同じである。さらなる実施態様では、ポリペプチドは８０％より大きい同一性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは８５％より大きい同一性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、９０％より大きい同一性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、９５％より大きい同一性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは９９％より大きい同一性を有する。さらなる実施態様では、本発明のポリペプチドのアナログは、約２０より少ないアミノ酸残基置換、修飾または欠失を有し、そしてより好ましくは１０より少ない。
これらの置換は、ポリペプチドの２次構造および水治療的(hydropathic)性質への最小影響を有するものである。好ましい置換は、保存として当業界で知られるものであり、すなわち置換された残基は、物理的または化学的特性、例えば疎水性、大きさ、荷電または官能基をともに持つ。これらは、置換、例えばAtlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978中Dayhoff, MによっておよびEMBO J. 8, 779-785, 1989中Argos, P.によって記載されるものを含む。例えば、以下の群のいずれかに属する、天然または非天然であるアミノ酸は、保存的変化を表す：
好ましい置換はまた、対応するＬ−アミノ酸についてのＤ−エナンチオマーの置換を含む。
代替的アプローチでは、本発明のポリペプチドのアナログは、図３に開示の置換を含む。
代替的アプローチでは、アナログは、例えば、望まれるポリペプチドに効率的にタグを付加することによる、精製をより容易にさせる部分を含む、融合タンパク質であり得る。それは「タグ」を除去することが必要であり得、またはそれは融合ポリペプチドが有用であるのに十分な抗原性をそれ自体保持する場合であり得る。
代替的アプローチでは、アナログは、例えば、望まれるポリペプチドに効率的にタグを付加することによる、精製をより容易にさせる部分を含む、融合タンパク質であり得る。それは「タグ」を除去することが必要であり得、またはそれは融合ポリペプチドが有用であるのに十分な抗原性をそれ自体保持する場合であり得る。
相同性のパーセンテージは、アミノ酸型の、同一性のパーセンテージ加えて類似性または保存のパーセンテージとして定義される。
ある実施態様では、本発明のアナログまたはポリペプチドは、図に示されるこれらの配列またはそのフラグメントと約７０％同一性を有する。すなわち、残基の７０％は同じである。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、７５％より大きい相同性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは８０％より大きい相同性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、８５％より大きい相同性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、９０％より大きい相同性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、９５％より大きい相同性を有する。さらなる実施態様では、ポリペプチドは、９９％より大きい相同性を有する。さらなる実施態様では、本発明のポリペプチドのアナログは、約２０より少ないアミノ酸残基置換、修飾または欠失を有し、そしてより好ましくは１０より少ない。
プログラム、例えばＣＬＵＳＴＡＬプログラムを使用し、アミノ酸配列を比較することができる。このプログラムは、アミノ酸配列を比較し、そして適当なようにいずれかの配列中にスペースを挿入することによって至適アラインメントを見出す。至適アラインメントのためにアミノ酸同一性または類似性(アミノ酸型の、同一性加えて保存）を計算することが可能である。ＢＬＡＳＴｘのようなプログラムは、類似配列の最長のストレッチをアラインメントし、そしてフィットに値を割り当てる。こうして、類似性のいくつかの領域が見出される比較であって、それぞれが異なるスコアを有するものを取得することが可能である。同一性分析の両方の型を本発明で企図する。
代替的アプローチでは、アナログまたは誘導体は、例えば望まれるタンパク質またはポリペプチドに効率的にタグ付加することによって、精製をより容易にさせる部分を取りこませる融合ポリペプチドであり得、「タグ」を除去することが必要であり得、またはそれは融合ポリペプチドそれ自体が有用であるのに十分な抗原性を保持する場合であり得る。
抗原性ポリペプチドをスクリーニングし、エピトープ性領域、すなわちポリペプチドの抗原性または免疫原性の原因となるこれらの領域を同定することが可能であることが周知である。そのようなスクリーニングを実施するための方法が、当業界で周知である。こうして、本発明のフラグメントは、１または２以上のそのようなエピトープ性領域を含むべきであり、またはそれらの抗原性／免疫原性特性を保持するそのような領域に十分に類似であるべきである。
こうして、本発明のフラグメントのために、同一性の程度は恐らく重要でなく、なぜなら、これらはここに記載のようなポリペプチド、アナログの特定の部分に１００％同一であり得るからである。
こうして、アナログ、誘導体およびフラグメントとに重要であるのは、これらが、これらが誘導されるタンパク質またはポリペプチドの抗原性／免疫原性の少なくともある程度を保有することである。
こうして、アナログ、誘導体およびフラグメントとに重要であるのは、これらが、これらが誘導されるタンパク質またはポリペプチドの抗原性／免疫原性の少なくともある程度を保有することである。
またポリペプチドは、それに混合された、ポリペプチド生物学的または薬理学的特性を変化させる他の化合物、すなわち半減期を増加させるためポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；精製の容易さのためリーダーまたは分泌アミノ酸配列；ｐｒｅｐｒｏ−またはｐｒｏ−配列；および（多）糖類を含む。
さらに、アミノ酸領域が多型性であると見出される場合のこれらの状況では、ことなるストレプトカッカス菌株の異なるエピトープをより効率的に模倣する１または２以上の特定のアミノ酸を変化することが望ましくあり得る。
さらに、本発明のポリペプチドは、末端、−ＮＨ２アシル化（例えばアセチル化、またはチオグリコール酸アミド化、末端カルボキシアミド化、例えばアンモニアまたはメチルアミンによる）によって修飾し、支持体または他の分子ヘの連結または結合のための、安定性、増加された疎水性を提供できる。
またポリペプチドフラグメントおよびアナログのへテロおよびホモポリペプチドマルチマーを企図する。これらのポリマー性形態は、例えば架橋剤、例えばアビジン／ビオチン、グルタルアルデヒド（gluteraldehyde）またはジメチルスーパーイミデートで架橋された１または２以上のポリペプチドを含む。そのようなポリマー性形態はまた、組み換えＤＮＡ技法によって生成されたマルチシストロン性ｍＲＮＡから生産された、２または３以上のタンデムまたは逆連続配列を含むポリペプチドを含む。さらなる実施態様では、本発明はまた、本出願の図に定義のような１または２以上のポリペプチドそのフラグメントまたはアナログを含むキメラポリペプチドに関する。
さらなる実施態様では、本発明はまた、配列番号２、またはそのフラグメントまたはアナログから選択される配列を有する、２または３以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチドに関する。ただし、該ポリペプチドがキメラポリペプチドを形成するように連結されることを条件とする。
さらなる実施態様では、本発明はまた、配列番号２から選択された配列を有する２または３以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチドに関する。ただし、ポリペプチドがキメラポリペプチドを形成するように連結されることを条件とする。
好ましくは、本発明のポリペプチドのフラグメント、アナログまたは誘導体は、少なくとも１つの抗原性領域、すなわち少なくとも１つのエピトープを含む。
抗原性ポリマー（すなわち合成マルチマー）の形成を達成するために、ビスハロアセチル基、ニトロアリールハライドなどを有するポリペプチドを利用し得、ここで該試薬は、チオ基に特異的である。したがって、異なるポリペプチドの２つのメルカプト基の間の連結は、一重結合であり得、または少なくとも２、典型的には少なくとも４、かつ１６を超えないが、通常は約１４を超えない炭素原子連結基からなり得る。
特定の実施態様では、本発明のポリペプチドフラグメントおよびアナログは、メチオニン（Ｍｅｔ）出発残基を含まない。好ましくは、ポリペプチドは、リーダーまたは分泌配列（シグナル配列）を取りこまない。本発明のポリペプチドのシグナル部分は、確立された分子生物学的技法にしたがって決定し得る。一般に、目的のポリペプチドは、ストレプトコッカス性培養物から単離され、そしてその後に配列決定され、成熟タンパク質の当初残基そしてしたがって成熟ポリペプチドの配列を決定し得る。
ポリペプチドは、それらの開始コドン（メチオニンまたはバリン）なくおよび／または組み換え体ポリペプチドの生産および精製に資するためのこれらのリーダーペプチドなく生産および／または使用することができることが理解される。リーダーペプチドをコードする配列なく遺伝子をクローニングすることは、E. coliの細胞質へポリペプチドを制限し、そしてこれらの回収を容易化することが知られる（Glick, B.R. and Pasternak, J.J.(1998)Manipulation of gene expression in prokaryotes. In''Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA'' 2nd edition, ASM Press, Washington DC, p.109-143）。
本発明の別の側面では、また（ｉ）本発明のポリペプチドを、担体、希釈剤またはアジュバントとともに含む事項の組成物、（ｉｉ）本発明のポリペプチドおよび担体、希釈剤またはアジュバントを含む医薬組成物、（ｉｉｉ）本発明のポリペプチドおよび担体、希釈剤またはアジュバントを含むワクチン、（ｉｖ）宿主において、ストレプトコッカスに対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫応答、例えばストレプトコッカスへの保護的免疫応答を誘起するのに免疫原的に有効量の本発明のポリペプチドを投与することによる方法、および（ｖ）ストレプトコッカス感染を予防および／または処置するための方法であって、必要のある宿主に本発明のポリペプチドの予防または治療的量を投与することによる方法、を提供する。
本発明のさらなる側面にしたがってまた、（ｉ）本発明のポリヌクレオチドを、担体、希釈剤またはアジュバントといっしょに含む事項の組成物、（ｉｉ）本発明のポリペプチドおよび担体、希釈剤またはアジュバントを含む医薬組成物、（ｉｉｉ）宿主の、ストレプトコッカスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、宿主に、免疫応答、例えばストレプトコッカスへの保護的免疫応答を誘起するための本発明のポリヌクレオチドの免疫原性有効量を投与することによる方法、および特に、（ｉｖ）ストレプトコッカス感染を予防および／または処置するための方法であって、必要のある宿主に本発明のポリペプチドの予防または治療的量を投与することによる方法、を提供する。
免疫化の前に、本発明のポリペプチドをまた、担体タンパク質、例えば破傷風毒素、ジフテリア毒素、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、小児麻痺ウイルスＶＰ１抗原または任意の他のウイルスまたは細菌性毒素または抗原またはより強い免疫応答の発生を刺激するための任意の好適なタンパク質へカップリングまたはコンジュゲートできる。このカップリングまたはコンジュゲーションを、化学的または遺伝子的に実施できる。ペプチド−担体コンジュゲーションのより詳細な記載は、Van Regenmortel, M.H.V.,Briand J.P., Muller S., Plaue S.. <<Synthetic Plypeptides as antigens>> in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 19(ed.) Burdou, R. H. & Van Knippenberg P.H.(1988), Elsevier New Yorkに利用可能である。
さらなる側面にしたがって、１または２以上の本発明のストレプトコッカス性ポリペプチドを、薬学的に許容されるアジュバントとの混合物として含む医薬組成物を提供する。好適なアジュバントは、（１）水中油型エマルジョン製剤、例えばＭＦ５９（登録商標）、ＳＡＦ（登録商標）、Ｒｉｂｉ（登録商標）；（２）フロイントの完全または不完全アジュバント；（３）塩、すなわちＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）２、Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＰＯ４、シリカ、カオリン；（４）サポニン誘導体、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（登録商標）またはそれから生成された粒子例えばＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）；（５）サイトカイン、例えばインターロイキン、インターフェロン、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；（６）他の物質例えばカーボンポリヌクレオチド、すなわちポリＩＣおよびポリＡＵ、解毒化コレラ毒素（ＣＴＢ）および粘膜性免疫の誘導のためのE.coli熱不安定性毒素を含む。アジュバントのより詳細な記載は、M.Z.I Khan et al.によるPharmaceutical Research, vol. 11, No. 1 (1994). pp2-11中のレビューおよびまた Gupta et al., によるVaccine, vol. 13, No. 14, pp1263-1276(1995)の別のレビューおよび引用によりここに全体を含めるＷＯ９９／２４５７８に利用可能である。好ましいアジュバントは、ＱＵＩＬＡ（登録商標）、ＱＳ２１（登録商標）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）およびＡｄｊｕｐｈｏｓ（登録商標）を含む。
本発明の医薬組成物を、注射、急速点滴、鼻咽喉吸収、皮膚吸収によって非経腸にまたは口内または経口投与し得る。
本発明の医薬組成物を、ストレプトコッカス性感染および／またはストレプトコッカス性感染によって仲介される疾患または症状の処置または予防のために使用し、引用によりここに含める、P.R. Murray(Ed, in chef), E.J. Baron, M.A.Phaller, F.C.Tenover and R.H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. sixthe edition, 1995, 1482に記載される通りである。１実施態様では、本発明の医薬組成物を、咽頭炎、丹毒および膿痂疹、しょう紅熱、および侵入性疾患、例えば菌血症および壊死性筋膜炎およびまた毒性ショックの予防または処置のために使用する。１実施態様では、本発明の医薬組成物を、ストレプトコッカス感染および／またはストレプトコッカス感染、特にグループＡストレプトコッカス（Streptococcus pyogenes)、グループＢストレプトコッカス（ＧＢＳまたはS. agalactinae)、S. pneumoniae、S. dysgalactinae、S. uberis、S. nocardia並びにStaphylococcus aureusによって仲介される疾患または症状の処置または予防のために使用する。さらなる実施態様では、該ストレプトコッカス感染は、S. pyogenesである。
さらなる実施態様では、本発明はストレプトコッカス感染に感受性の宿主においてストレプトコッカス感染の予防または処置のための方法であって、当該宿主に本発明の組成物の治療または予防的量を投与することを含む方法を提供する。
本出願で使用するように、用語「宿主」は、哺乳動物を含む。さらなる実施態様では、該動物はヒトである。
特定の実施態様では、医薬組成物をストレプト感染のリスクのあるこれらの宿主、例えば幼児、年輩および免疫妥協宿主に投与する。
特定の実施態様では、医薬組成物をストレプト感染のリスクのあるこれらの宿主、例えば幼児、年輩および免疫妥協宿主に投与する。
医薬組成物は好ましくは、約０．００１ないし１００μｇ／ｋｇ（抗原／体重）およびより好ましくは、０．０１ないし１０μｇ／ｋｇおよび最も好ましくは０．１ないし１μｇ／ｋｇの単位用量形態で、免疫化の間約１ないし６週間間隔の間隔で１ないし３回である。
医薬組成物は好ましくは、約０．１μｇないし１０ｍｇ、そしてより好ましくは１ないし１ｍｇそして最も好ましくは１０ないし１００μｇの単位用量形態で、免疫化の間約１ないし６週間間隔の間隔で１ないし３回である。
さらなる側面にしたがって、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントまたはアナログによって特徴付けられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
１実施態様では、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る、配列番号１に示されるものである。
図に示されるポリヌクレオチド配列が本発明のポリペプチドをなおもコードする縮重コドンで変化させ得ることが認識される。よって、本発明はさらに、配列間の５０％同一性、１実施態様では配列間の少なくとも７０％同一性、１実施態様では配列間の少なくとも７５％同一性、１実施態様では配列間の少なくとも８０％同一性、１実施態様では配列間の少なくとも８５％同一性、１実施態様では配列間の少なくとも９０％同一性を有する、前記のここのポリヌクレオチド配列（またはその相補的配列）にハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供する。さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、ストリンジェント条件下でハイブリダイズ可能、すなわち少なくとも９５％同一性を有するものである。更なる実施態様では、９７％同一性より高い。
ハイブリダイゼーションのための好適なストリンジェント条件は、当業者によって容易に決定できる（例えば、Sambrook et al., (1989)Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editea by Ausbel F.M. te al.,john Wiley & Sons, Inc., N.Y.）。
さらなる実施態様では、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む。
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含む。
さらなる実施態様では、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは配列番号２を含む。
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは配列番号２を含む。
さらなる実施態様では、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドからの少なくとも１０連続アミノ酸残基を含む。
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログを含むポリペプチドからの少なくとも１０連続アミノ酸残基を含む。
さらなる実施態様では、本発明は、
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２を含むポリペプチドからの少なくとも１０連続アミノ酸残基を含む。
（ａ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列または
（ｂ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の相補物
にストリンジェント条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドを提供し、ここで当該ポリペプチドは、配列番号２を含むポリペプチドからの少なくとも１０連続アミノ酸残基を含む。
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２またはそのフラグメントまたはアナログに示される本発明のポリペプチドをコードするものである。
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする配列番号１に示されるものまたはそのフラグメントまたはアナログである。
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２に示される本発明のポリペプチドをコードするものである。
さらなる実施態様では、ポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードする配列番号１に示されるものである。
当業者によって容易に認識されるように、ポリヌクレチドはＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含む。
本発明はまた、本出願に記載のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレチドを含む。
さらなる側面では、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメント、アナログまたは誘導体をコードするポリヌクレオチドを、ＤＮＡ免疫化方法で使用し得る。すなわち、これらを、注射すると複製可能および発現可能であるベクターに取りこませ、それによってインビボで抗原性ポリペプチドを生産し得る。例えばポリヌクレオチドを、真核細胞で機能的であるＣＭＶプロモーターの制御下でプラスミドベクターに取り込ませ得る。好ましくはベクターを筋肉内に注射する。
さらなる側面にしたがって、組み換え技法による本発明のポリペプチドを生産するための方法を提供し、ここで当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞へ発現させること、および発現されたポリペプチド産物を回収することによる。代替的にポリペプチドを、確立された合成的化学技法、すなわち完全ポリペプチドを生産するためにライゲートされる、オリゴペプチドの溶液相または固相合成にしたがって生産することができる（ブロックライゲーション）。
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの取得および評価のための一般方法は、以下の引用文献に記載される：引用によりここに含めるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F. M. et al., Johon Wiley and Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, Edited by White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 pages ;Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R. K., Springer-Verlag, New York, 3rd Edition, 1993, 380 pages; Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan J.E. et al., John Wiley & Sons Inc., New York。
組み換え体生産のために、宿主細胞を、ポリペプチドをコードするベクターでトランスフェクトし、それからプロモーターを活性化する、形質転換体を選択するまたは遺伝子を増幅するために適当に修飾された栄養培地で培養する。好適なベクターは、選択された宿主で生存可能および複製可能であるものであり、そして染色体的、非染色体的および合成ＤＮＡ配列、例えば細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、コウボプラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクターを含む。ポリペプチド配列を、制限酵素を使用して適当な部位えベクターに取りこませ得、その結果それはプロモーター、リボゾーム結合部位（コンセンサス領域またはシャインダルガノ配列）、および所望によりオペレーター（制御エレメント）に作動可能に連結されている。所定の宿主およびベクターに適当である発現制御領域の個々の構成要素を、確立された分子生物学原理にしたがって選択できる（引用によりここに含めるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Edited by Ausubel F.M. et al., Johon Wiley and Sons, Inc. New York）。好適なプロモーターは限定しないが、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、E. coli lac、ｔａｃまたはｔｒｐプロモーターおよびファージラムダＰＬプロモーターを含む。ベクターは好ましくは複製開始点並びに選択マーカー、すなわちアンプリコン抵抗性遺伝子を取りこむ。好適な細菌性ベクターは、ｐＥＴ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９、ｐＤ１０ phargescript、ｐｓｉＸ１７４、pbluescript SK、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ptrc99a、pkk223-3、pkka233-3、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５、および真核ベクターpBlueBacIII、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ＰＸＴ１、ｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬを含む。宿主細胞は、細菌性、すなわちE. coli、Bacillus subtilis、Streptomyces；真菌性すなわちAspergillus niger、Aspergillus nidulins；コウボすなわちSaccharomycesまたは真核性すなわちＣＨＯ、ＣＯＳであり得る。
培養でポリペプチドを発現すると、細胞を典型的には、遠心分離によって収集し、次いで物理学的または化学的手段によって分解し（もし発現されたポリペプチドが、培地中に分泌されていないならば）、そして得られた粗抽出物が保持され、所望のポリペプチドを単離する。粗培地または細胞溶解物からのポリペプチドの精製を、ポリペプチドの特性に依存して確立された技法によって達成し得、すなわち硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン荷電クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを使用する。最終精製を、ＨＰＬＣを使用して達成し得る。
ポリペプチドを、リーダーまたは分泌配列を有してまたは有しないで発現させ得る。前者の場合、リーダーを、翻訳後プロセシングを使用して除去し（引用によりここに含めるUS4431739;US4425437およびUS4338397参照）または発現されたポリペプチドを精製するに続いて化学的に除去し得る。
さらなる側面にしたがって、本発明のストレプトコッカス性ポリペプチドを、ストレプトコッカス感染、特にS. pyogenes感染についての診断試験において使用し得る。いくつかの診断方法、例えば生物学的サンプル中のストレプトコッカス生物を検出することが可能であり、以下の手法に従う：
ａ）宿主から生物学的サンプルを取得する
ｂ）本発明のストレプトコッカスポリペプチドと反応性の抗体またはそのフラグメントと、生物学的サンプルをインキュベートし混合物を形成する、および
ｃ）混合物中の特異的に結合した抗体または結合フラグメントを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する。
ａ）宿主から生物学的サンプルを取得する
ｂ）本発明のストレプトコッカスポリペプチドと反応性の抗体またはそのフラグメントと、生物学的サンプルをインキュベートし混合物を形成する、および
ｃ）混合物中の特異的に結合した抗体または結合フラグメントを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する。
代替的に、当該抗体を含むまたは含むと疑われる生物学的サンプル中のストレプトコッカス抗原に特異的な抗体の検出方法は、以下のように実施され得る：
ａ）宿主から生物学的サンプルを取得する、
ｂ）１または２以上の本発明のストレプトコッカスポリペプチドまたはそのフラグメントを、生物学的サンプルとインキュベートし、混合物を形成する、および
ｃ）混合物中の特異的に結合した抗原または結合フラグメントを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する。
当業者は、この診断試験が、免疫的試験、例えばエライザアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイまたはラテックス接合アッセイを含む幾つかの形態をとり、タンパク質に特異的な抗体が生物中に存在するか本質的に決定し得る。
ａ）宿主から生物学的サンプルを取得する、
ｂ）１または２以上の本発明のストレプトコッカスポリペプチドまたはそのフラグメントを、生物学的サンプルとインキュベートし、混合物を形成する、および
ｃ）混合物中の特異的に結合した抗原または結合フラグメントを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する。
当業者は、この診断試験が、免疫的試験、例えばエライザアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫アッセイまたはラテックス接合アッセイを含む幾つかの形態をとり、タンパク質に特異的な抗体が生物中に存在するか本質的に決定し得る。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をまた使用し、そのような細菌を含むまたと疑われる生物学的サンプル中のストレプトコッカスの存在を検出することにおける使用のためのＤＮＡプローブを設計し得る。この発明の検出方法は
ａ）宿主から生物学的サンプルを取得する、
ｂ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を有する１または２以上のＤＮＡプローブを、生物学的サンプルとインキュベートし、混合物を形成する、および
ｃ）混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する、
を含む。
ａ）宿主から生物学的サンプルを取得する、
ｂ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を有する１または２以上のＤＮＡプローブを、生物学的サンプルとインキュベートし、混合物を形成する、および
ｃ）混合物中の特異的に結合したＤＮＡプローブを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する、
を含む。
本発明のＤＮＡプローブはまた、例えばストレプトコッカス感染を診断する方法として、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、サンプル中の循環するストレプトコッカス、すなわちS. pyogenes核酸を検出するために使用し得る。プローブを、慣行技法を使用して合成し得、そして固相上に固定化し、または検出可能標識で標識し得る。この適用のための好ましいＤＮＡプローブは、本発明のS. pyogenesポリペプチドの少なくとも約６連続ヌクレオチドに相補的な配列を有するオリゴマーである。
宿主中のストレプトコッカスの検出のためのさらなる診断方法は、
ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントと反応性の抗体を、検出可能標識で標識すること
ｂ）該標識した抗体または標識されたフラグメントを、宿主に投与すること、および
ｃ）宿主中の特異的に結合した標識された抗体または標識されたフラグメントを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する、
を含む。
ａ）本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントと反応性の抗体を、検出可能標識で標識すること
ｂ）該標識した抗体または標識されたフラグメントを、宿主に投与すること、および
ｃ）宿主中の特異的に結合した標識された抗体または標識されたフラグメントを検出し、それはストレプトコッカスの存在を指摘する、
を含む。
さらなる側面にしたがって、本発明は、ストレプトコッカス性感染の処置および／または予防のための抗体の使用（用途）を提供する。
本発明のさらなる側面は、診断のため、および特にストレプトコッカス感染の処置における特異的抗体の生産のための免疫原として本発明のストレプトコッカスポリペプチドの使用である。好適な抗体は、適当なスクリーニング方法を使用して、例えば特定の抗体の、試験モデルでストレプトコッカス感染に対して受動的に保護する能力を測定することによって決定し得る。動物モデルの１例は、ここでの例で記載するマウスモデルである。抗体は全体抗体または抗原に結合するそのフラグメントであり得、そして任意の免疫グロブリンクラスに属し得る。該抗体またはフラグメントは、動物起源の、具体的には哺乳動物起源の、より具体的にはマウス、ラットまたはヒト起源のものであり得る。それは天然抗体またはそのフラグメント、または望まれれば、組換え抗体または抗体フラグメントであり得る。用語組換え抗体または抗体フラグメントは、分子生物学的技法を使用して生産された抗体または抗体フラグメントを意味する。抗体または抗体フラグメントは、ポリクローナルまたは好ましくはモノクローナル抗体であり得る。それは、S. pyogenesポリペプチドに付随するエピトープのある数に特異的であり得るが、好ましくは１つに特異的である。
本発明のさらなる側面は、受動的免疫化のための本発明のポリペプチドに指向化された（directed）抗体の使用である。本出願で記載された抗体を使用し得る。
本発明のさらなる側面は、免疫化の方法であって、ここに本発明のポリペプチドによって惹起された(raised)抗体を、受動的免疫化を提供するのに十分量で宿主に投与する。
さらなる実施態様では、本発明は、ストレプトコッカス性感染の予防または治療的処置のための医薬の製造における医薬組成物の使用を提供する。
更なる実施態様では、本発明は、ストレプトコッカス感染の検出または診断のための本発明のポリペプチドを含むキットを提供する。
特に定義しない場合、ここの全ての技術および科学用語は、本発明の属する当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。すべての刊行物、特許出願、特許および他のここに述べた引用は、引用により全体を含める。抵触の場合は、定義を含む本明細書が制御する。加えて材料、方法および例は、例示のみであり、限定を意図しない。
実施例１
この例は、ＢＶＨ−Ｐ７遺伝子および対応するポリペプチドのクローニングおよび分子特徴を示す。
この例は、ＢＶＨ−Ｐ７遺伝子および対応するポリペプチドのクローニングおよび分子特徴を示す。
S.pyogenes BVH-P7（配列番号１）遺伝子のコード領域を、血清型Ｍ１ S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ／００２９４のゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅する（Robocycler Gradient 96 Temperature cycler, Stratagene, Lajolla, CA）。表１に示す、制限部位ＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ）およびＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）の付加のための塩基伸長物を含ませる以下のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する：ＤＭＡＲ２９３（配列番号９）およびＤＭＡＲ２９４（配列番号１０）。ＰＣＲ産物を、製造者の指示（Chatsworth, CA）にしたがって、QIAgenからのQIAquickゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製し、そしてＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化する（Amersham Pharmacia Biotech Inc, Baie d'Urfe, Canada）。ｐＥＴ−２１（＋）ベクター（Novagen, Madison, WI)を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてQIAgen(Chatsworth, CA)からのQIAquickゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製した。ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩ ＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩ−ＮｏｔＩ ｐＥＴ−２１ｂ（＋）発現ベクターにライゲートさせた。ライゲートされた産物を、Simanisの方法（Hanahan, D. DNA Cloning, 1085, D.M. Glover(ed), pp.109-135）にしたがって
に移入した。ＢＶＨ−Ｐ７遺伝子を含む組み換え体ｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミド（ｒｐＥＴ２１ｂ（＋））をQIAgenプラスミドキット（Chatsworth, CA）を使用して精製し、そしてＤＮＡインサートを配列決定した（Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA）。
表１ ＰＣＲ増幅またはS. pyogenes BVE-P7遺伝子のために使用されるオリゴヌクレオチドプライマー
ＢＶＨ−Ｐ７のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）停止コドン（ＴＡＡ）を含む３０２７ｂｐは、６．１８の予測されたｐＩおよび１１１４９４．４４Ｄａの予測された分子量を有する１００８アミノ酸残基ポリペプチドをコードする。PSORTIIソフトウェア（Real World Computing Partnership(http://psort.nibb.ac.jp)を使用する予測されたアミノ酸残基配列（配列番号２）の分析は、アスパラギンとグルタミン残基の間に位置する切断部位で終わる２１アミノ酸残基シグナルペプチド
の存在を示唆した。アミノ酸残基配列の分析は、残基９７４６と９８１の間に位置する細胞壁アンカーモチーフ（ＬＰＸＴＧＸ）の存在をあきらかにした。
ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子のＰＣＲ増幅によって存在を確認するために、以下の４つの血清学的に明瞭なS. pyogenes菌株を使用した：血清型Ｍ１ S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ７００２９４および血清型M3 S.pyogenes菌株ＡＴＣＣ１２３８４を、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Rockville, MD)から取得した；血清型Ｍ６ S. pyogenes SPY67臨床的単離株は、Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier de l' universite Laval, Sainte-Foyによって提供された;およびマウスから当初単離されたS. pyogenes菌株Ｂ５１４は、University of Alabama, BirminghamからSusan Hollingsheadによって提供された。E. coli菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦを、ネガティブコントロールとしてこれらの実験で使用した。染色体性ＤＮＡを、以前記載されたようにそれぞれのS. pyogenes菌株から単離した（Jayarao EM et al., 1991. J. Clin. Microbiol. 29:2774-2778）。ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子を、４つのS. pyogenes菌株から精製されたゲノムＤＮＡからＰＣＲ（Robocycler Gradient 96 Temperature cycler, Stratagene, Lajolla, Ca）によって、そしてコントロールE. coli菌株をオリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ２９３（配列番号９）およびＤＭＡＲ２９４（配列番号１０）（表１）を使用して増幅した。ＰＣＲを、４５秒間の９５℃、４５秒間の５０℃および２分間の７２℃の３０サイクルおよび７分間の７２℃の最終伸長期間で実施した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル中でサイズ分画化し、そして臭化エチジウム染色によって可視化した。これらのＰＣＲ増幅の結果を表２に表す。増幅産物の分析は、ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子が試験された４つのS. pyogenes菌株のすべてのゲノム中に存在した。そのような産物を、コントロールE. coli ＤＮＡがこれらのオリゴヌクレオチドプライマーと同一のＰＣＲ増幅に服するとき検出した。
表２ ４つの血清学的に明瞭なS. pyogenes菌株のゲノムにおける、ＰＣＲ増幅によるS. pyogenes BVH-P7遺伝子の同定
実施例２
この例は、ＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨにおけるS. pyogenes BVH-P7遺伝子のクローニングを示す。
S.pyogenesタンパク質のＤＮＡコード領域を、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨ（Tang et al., Nature, 1992, 356:152）のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の下流の相(phase）に挿入した。該ＣＭＶプロモーターは、E. coli細胞において非機能性プラスミドであるが、真核細胞においてプラスミドを投与すると活性である。該ベクターはまた、アンシピリン抵抗性遺伝子を取りこんだ。
この例は、ＣＭＶプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨにおけるS. pyogenes BVH-P7遺伝子のクローニングを示す。
S.pyogenesタンパク質のＤＮＡコード領域を、プラスミドベクターｐＣＭＶ−ＧＨ（Tang et al., Nature, 1992, 356:152）のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの転写制御下にあるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の下流の相(phase）に挿入した。該ＣＭＶプロモーターは、E. coli細胞において非機能性プラスミドであるが、真核細胞においてプラスミドを投与すると活性である。該ベクターはまた、アンシピリン抵抗性遺伝子を取りこんだ。
リーダーペプチド領域を欠くＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子のコード領域を、表１に記載の、制限部位ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）およびＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）の付加のための塩基伸長物を含んだオリゴヌクレオチドプライマーＤＭＡＲ４８０ａ（配列番号１１）およびＤＭＡＲ４８１ａ（配列番号１２）を使用して、血清型Ｍ１ S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ７００２９４のゲノムＤＮＡからＰＣＲ（Robocycler Gradient 96 Temperature cycler, Stratagene, Lajolla, CA)によって増幅した。ＰＣＲ産物を、QIAgen(chatsworth, CA)からのQIAquickゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製し、制限酵素（Amersham Pharmacia Biotech Inc, Baied'Uefe, Canada）で消化した。ｐＣＭＶ−ＧＨベクター（Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)を、ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、そしてＱＩＡｇｅｎ（Chatsworth, CA)からのQIAquickゲル抽出キットを使用してアガロースゲルから精製した。ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ−ｐＣＭＶ−ＧＨベクターにライゲートし、ＣＭＶプロモーターの制御下のｈＧＨ−ＢＶＨ−Ｐ７融合タンパク質を創出した。ライゲートした産物を、Simanisの方法（Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover(ed), pp. 109-135）にしたがって、
に形質転換した。組み換え体ｐＣＭＶプラスミドを、ＱＩＡｇｅｎプラスミドキット（Chatsworth, CA）を使用して精製しそしてＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
実施例３
この例は、S. pyogenes BVH-P7タンパク質抗原への免疫応答を誘起するＤＮＡの使用を記載する。
８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River, St-Constant, Quebec, canada）の群を、５０μｇの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)の存在下の、ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子をコードする組み換え体ｐＣＭＶ−ＧＨの５０μｇでの２または３週間間隔での、１００μｌ３回の筋肉内注射によって免疫化した。コントロールとして、マウスの群に、５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦの存在下の５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨを注射した。血液サンプルを、それぞれの免疫化に先立ちおよび第３注射の７日後に眼窩洞（orbital sinus）から収集し、コート抗原としてBVH-P7 Hisタグ付加標識したS. pyogenes組み換え体タンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって決定した。このBVH-P7 Hisタグ付加標識したS. pyogenes組み換え体タンパク質の生産および精製を実施例４に提示する。
この例は、S. pyogenes BVH-P7タンパク質抗原への免疫応答を誘起するＤＮＡの使用を記載する。
８匹のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（Charles River, St-Constant, Quebec, canada）の群を、５０μｇの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するプラスミドｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦ(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas)の存在下の、ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子をコードする組み換え体ｐＣＭＶ−ＧＨの５０μｇでの２または３週間間隔での、１００μｌ３回の筋肉内注射によって免疫化した。コントロールとして、マウスの群に、５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨ−ＧＭ−ＣＳＦの存在下の５０μｇのｐＣＭＶ−ＧＨを注射した。血液サンプルを、それぞれの免疫化に先立ちおよび第３注射の７日後に眼窩洞（orbital sinus）から収集し、コート抗原としてBVH-P7 Hisタグ付加標識したS. pyogenes組み換え体タンパク質を使用してＥＬＩＳＡによって決定した。このBVH-P7 Hisタグ付加標識したS. pyogenes組み換え体タンパク質の生産および精製を実施例４に提示する。
実施例４
この例は、S. pyogenes ＢＶＨ−Ｐ７組み換え体タンパク質の生産および精製を示す。
ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子での組換え体ｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミドを使用し、エレクトロポレーション（Gene Pulser II apparratus, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada）によって、E. coli菌株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）(F-ompT hsdSB(r- Bm- B)gel dcm lacYI(DE))(Novagen, Madison, WI)を形質転換した。E. coliのこの菌株において、組み換え体タンパク質の発現を制御するＴ７プロモーターは、遺伝子が、イソプロピル−β−ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能であるｌａｃプロモーターの制御下である、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージ上に存在する）によって特異的に認識される。形質転換体Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１（＋）を、ｍｌあたり１００μｇのカルベニシリン（Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada）を含むＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、コウボエキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ）中で２５０ｒｐｍで撹拌しつつ３７℃で、Ａ５００が０．６の値に達するまで成長させた。ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加S. pyogenes組み換え体タンパク質の生産を誘導するために、細胞を０．１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧの存在下もう３時間インキュベートした。５００ｍｌ培養物から誘導された細胞を、遠心分離によってペレット化し、そして−７０℃で凍結した。
この例は、S. pyogenes ＢＶＨ−Ｐ７組み換え体タンパク質の生産および精製を示す。
ＢＶＨ−Ｐ７（配列番号１）遺伝子での組換え体ｐＥＴ−２１ｂ（＋）プラスミドを使用し、エレクトロポレーション（Gene Pulser II apparratus, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canada）によって、E. coli菌株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）(F-ompT hsdSB(r- Bm- B)gel dcm lacYI(DE))(Novagen, Madison, WI)を形質転換した。E. coliのこの菌株において、組み換え体タンパク質の発現を制御するＴ７プロモーターは、遺伝子が、イソプロピル−β−ｄ−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能であるｌａｃプロモーターの制御下である、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（λＤＥ３プロファージ上に存在する）によって特異的に認識される。形質転換体Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１（＋）を、ｍｌあたり１００μｇのカルベニシリン（Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canada）を含むＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、コウボエキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ）中で２５０ｒｐｍで撹拌しつつ３７℃で、Ａ５００が０．６の値に達するまで成長させた。ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加S. pyogenes組み換え体タンパク質の生産を誘導するために、細胞を０．１ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧの存在下もう３時間インキュベートした。５００ｍｌ培養物から誘導された細胞を、遠心分離によってペレット化し、そして−７０℃で凍結した。
不溶性分画またはＩＰＴＧで誘導したＴｕｎｅｒ（ＤＥ３）／ｒｐＥＴ２１ｂ（＋）からのＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の精製を、Ｈｉｓ・Ｔａｇ配列（６連続ヒスチジン残基）の、Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ金属キレート化樹脂上に固定化された２価カチオンに結合する特性に基づいてアフィニティークロマトグラフィーによって実施した。簡単には、ＩＰＴＧで誘導された５００ｍＬ培養物から取得されたペレット化細胞を、６Ｍ グアニジン−ＨＣｌを含む溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ イミダゾール、ｐＨ７．９）中に再懸濁し、超音波処理し、そして１２０００Ｘｇで２０分間遠心分離し、細胞残骸を除去した。上清を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada）と45分間4℃でインキュベートした。BVH-P7Ｈｉｓタグ付加S. pyogenes組み換え体タンパク質を、６Ｍ グアニジノ−ＨＣｌおよび２５０ｍＭ イミダゾール−５００ｍＭ ＮａＣｌ−２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９を含む溶液で樹脂から溶出させた。サンプルからの塩およびイミダゾールの除去を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ７．９で終夜４℃に対する透析によってなした。組み換え体タンパク質の量を、ＭｉｃｒｏＢＣＡ（Pierce, Rockford, Illinois）によって評価した。
実施例５
この例は、ヒト血清および、S. pyogenes抗原性調製品での免疫化後のマウスから収集した血清でのＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加S. pyogenes組み換え体タンパク質の反応性を示す。
表３に示すように、精製されたＨｉｓタグ付加ＢＶＨ−Ｐ７組換え体タンパク質を、通常の血清の貯留物中に存在する抗体によるイムノブロットにおいて認識した。これは重要な結果であり、なぜならそれはS. pyogenesと通常接触するヒトが、そのタンパク質へ特異的である抗体を発生させることを明かに示すからである。これらの特定のヒト抗体は、S. pyogenes感染に対する保護を暗示し得る。加えて、イムノブロットはまた、マウスを致死チャレンジに対して保護する、膜タンパク質富化されたS. pyogenes抗原性調製品で、免疫化されたマウスから収集された血清が、ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質を認識する抗体をまた発生させたことを明かにした。この結果は、このタンパク質が感染に対してマウスを保護したS. pyogenes 抗原性調製品中に存在すること、およびこのストレプトコッカス性タンパク質が、対応するＨｉｓタグ付加組換え体タンパク質と反応する抗体を誘導したことを指摘する。
この例は、ヒト血清および、S. pyogenes抗原性調製品での免疫化後のマウスから収集した血清でのＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加S. pyogenes組み換え体タンパク質の反応性を示す。
表３に示すように、精製されたＨｉｓタグ付加ＢＶＨ−Ｐ７組換え体タンパク質を、通常の血清の貯留物中に存在する抗体によるイムノブロットにおいて認識した。これは重要な結果であり、なぜならそれはS. pyogenesと通常接触するヒトが、そのタンパク質へ特異的である抗体を発生させることを明かに示すからである。これらの特定のヒト抗体は、S. pyogenes感染に対する保護を暗示し得る。加えて、イムノブロットはまた、マウスを致死チャレンジに対して保護する、膜タンパク質富化されたS. pyogenes抗原性調製品で、免疫化されたマウスから収集された血清が、ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質を認識する抗体をまた発生させたことを明かにした。この結果は、このタンパク質が感染に対してマウスを保護したS. pyogenes 抗原性調製品中に存在すること、およびこのストレプトコッカス性タンパク質が、対応するＨｉｓタグ付加組換え体タンパク質と反応する抗体を誘導したことを指摘する。
表３ ヒト血清および、ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質でS. pyogenes抗原性調製品で免疫化後の、マウスから収集された血清のイムノブロットの反応性
１実施例７に記載されたように生産および精製されたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質を使用し、イムノブロットを実施した。
２ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に評価した。
３健康ヒトボランティアから収集された血清を一緒に貯留し、そして１／５００に希釈しイムノブロットを実施した。
４膜タンパク質富化S. pyogenes抗原性調製品で免疫化後収集されたマウス血清を貯留し、そして１／５００希釈し、イムノブロットを実施した。これらのマウスは、致死S. pyogenesチャレンジに対して保護された。
１実施例７に記載されたように生産および精製されたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質を使用し、イムノブロットを実施した。
２ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の分子量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に評価した。
３健康ヒトボランティアから収集された血清を一緒に貯留し、そして１／５００に希釈しイムノブロットを実施した。
４膜タンパク質富化S. pyogenes抗原性調製品で免疫化後収集されたマウス血清を貯留し、そして１／５００希釈し、イムノブロットを実施した。これらのマウスは、致死S. pyogenesチャレンジに対して保護された。
実施例６
この例は、インタクトのストレプトコッカス性細胞の表面のS. pyogenes ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質の抗体への接近可能性を示す。
細菌を、０．５％コウボエキス(Difco Laboratories)および０．５％ペプトンエキス（Merck, Darmstadt, Germany）を有するTood Hewitt(TH)培地（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で、３７℃で８％ＣＯ２雰囲気中で成長させ、０．６００のＯＤ４９０ｎｍを与えた（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）。抗ＢＶＨ−Ｐ７またはコントロール血清の希釈品を次いで添加し、そして細胞に結合させ、これを２時間４℃でインキュベートした。サンプルをブロッキングバッファー（２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む燐酸バッファー生食水（ＰＢＳ））で４回洗浄し、それからブロッキングバッファー中に希釈した１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを添加した。室温での追加的６０分のインキュベーション後、サンプルをブロッキングバッファーで４回洗浄し、そしてＰＢＳバッファー中の０．２５％ホルムアルデヒドで１８−２４時間４℃で固定化した。細胞をＰＢＳバッファーで２回洗浄し、そしてＰＢＳバッファーの５００μｌ中に再懸濁した。細胞を、フローサイトメトリー（Epics(登録商標)XL; Beckman Coulter, Inc.)によって分析するまで暗黒で４℃で保持した。サンプルあたり１万のインタクトなS. pyogenes細胞を分析し、そして結果を標識された細胞の存在および蛍光指数として表現した。蛍光指数を、コントロールマウス血清について取得された蛍光値によって割った、免疫血清でストレプトコッカス性細胞を標識した後得られたメジアン蛍光値として算出した。１の蛍光値は、インタクトのストレプトコッカス性細胞の表面の抗体の結合がないことを指摘した。
この例は、インタクトのストレプトコッカス性細胞の表面のS. pyogenes ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質の抗体への接近可能性を示す。
細菌を、０．５％コウボエキス(Difco Laboratories)および０．５％ペプトンエキス（Merck, Darmstadt, Germany）を有するTood Hewitt(TH)培地（Difco Laboratories, Detroit, MI）中で、３７℃で８％ＣＯ２雰囲気中で成長させ、０．６００のＯＤ４９０ｎｍを与えた（〜１０８ＣＦＵ／ｍｌ）。抗ＢＶＨ−Ｐ７またはコントロール血清の希釈品を次いで添加し、そして細胞に結合させ、これを２時間４℃でインキュベートした。サンプルをブロッキングバッファー（２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む燐酸バッファー生食水（ＰＢＳ））で４回洗浄し、それからブロッキングバッファー中に希釈した１ｍｌのヤギフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを添加した。室温での追加的６０分のインキュベーション後、サンプルをブロッキングバッファーで４回洗浄し、そしてＰＢＳバッファー中の０．２５％ホルムアルデヒドで１８−２４時間４℃で固定化した。細胞をＰＢＳバッファーで２回洗浄し、そしてＰＢＳバッファーの５００μｌ中に再懸濁した。細胞を、フローサイトメトリー（Epics(登録商標)XL; Beckman Coulter, Inc.)によって分析するまで暗黒で４℃で保持した。サンプルあたり１万のインタクトなS. pyogenes細胞を分析し、そして結果を標識された細胞の存在および蛍光指数として表現した。蛍光指数を、コントロールマウス血清について取得された蛍光値によって割った、免疫血清でストレプトコッカス性細胞を標識した後得られたメジアン蛍光値として算出した。１の蛍光値は、インタクトのストレプトコッカス性細胞の表面の抗体の結合がないことを指摘した。
ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質で免疫化された８匹のマウスから収集した血清を、サイトフルオロメトリーによって分析し、そして結果を表４に表す。精製されたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加タンパク質で免疫化されたマウスから収集された血清の全ては、試験した異種性（ＡＴＣＣ１２３８４；血清型Ｍ３）S. pyogenes菌株上の、それらの対応する表面曝露エピトープを効率的に認識するＢＶＨ−Ｐ７に特異的抗体を含んだ。蛍光指数は１０から１８まで変化した。分析した１００００このS. pyogenes細胞のうち９７％より多くが、ＢＶＨ−Ｐ７特異的抗血清中に存在する抗体で標識された。これらの血清をまた貯留し、そして以下のS. pyogenes菌株と反応させた：血清型Ｍ１ S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ７００２９４、血清型Ｍ３および血清型Ｍ１８ S. pyogenes 菌株ＡＴＣＣ１２３５７を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Rockville, MD, USA）から取得した；血清型Ｍ６ S. pyogenes ＳＰＹ６９およびＭ２ S. pyogenes ＳＰＹ６８臨床的単離株は、Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier de 1'universite Laval, Sainte-Foyによって提供された。精製されたＨｉｓタグ付加組換え体ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質で免疫化後収集された血清の貯留物中に存在するＢＶＨ−Ｐ７−特異的抗体は、４から９までの間の蛍光指数を有するこれらのストレプトコッカス性菌株のそれぞれの細菌の表面に付着した。反対に、非免疫化または偽免疫化（sham-immunized）マウスから収集した貯留物または血清を使用したとき、ストレプトコッカス性細胞の標識は認められなかった。これらの観察は明白に、ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質が表面に接近可能であり、ここにそれは抗体によって容易に認識されることができることを実証する。抗S. pyogenes抗体は、S. pyogenes感染に対する保護において重要な役割を演ずることを示した。
表４ S. pyogenes ＡＴＣＣ１２３８４菌株（血清型Ｍ３）のインタクトの細胞の表面のＢＶＨ−Ｐ７特異的抗体の付着の評価
１マウスＳ１ないしＳ８を皮下に、QuilAアジュバント（Cedarlane Laboratories, Hornby, Canada)の１０μｇと混合した２０μｇの精製されたＢＶＨ−Ｐ７組換え体タンパク質の２０μｇで３週間間隔で３回注射した。血清を１／５０希釈した。
２蛍光指数を、コントロールマウスについて取得された蛍光値によって分割された免疫血清でストレプトコッカス性細胞を標識した後取得されたメジアン蛍光値として算出した。１の蛍光値は、インタクトなストレプトコッカス性細胞の表面の抗体の結合がないことを示した。
３分析した１００００細胞からのストレプトコッカス標識した細胞の％
４非免疫化または偽免疫化されたマウスから収集された血清を、貯留１／５０希釈し、そしてこのアッセイのためのネガティブコントロールとして使用した。
２０μｇの精製されたストレプトコッカス性組換えＭタンパク質、すなわち周知の表面タンパク質で免疫化されたマウスから取得された血清を、１／２００希釈し、そしてアッセイのためのポジティブコントロールとして使用した。
１マウスＳ１ないしＳ８を皮下に、QuilAアジュバント（Cedarlane Laboratories, Hornby, Canada)の１０μｇと混合した２０μｇの精製されたＢＶＨ−Ｐ７組換え体タンパク質の２０μｇで３週間間隔で３回注射した。血清を１／５０希釈した。
２蛍光指数を、コントロールマウスについて取得された蛍光値によって分割された免疫血清でストレプトコッカス性細胞を標識した後取得されたメジアン蛍光値として算出した。１の蛍光値は、インタクトなストレプトコッカス性細胞の表面の抗体の結合がないことを示した。
３分析した１００００細胞からのストレプトコッカス標識した細胞の％
４非免疫化または偽免疫化されたマウスから収集された血清を、貯留１／５０希釈し、そしてこのアッセイのためのネガティブコントロールとして使用した。
２０μｇの精製されたストレプトコッカス性組換えＭタンパク質、すなわち周知の表面タンパク質で免疫化されたマウスから取得された血清を、１／２００希釈し、そしてアッセイのためのポジティブコントロールとして使用した。
実施例７
この例は、ウサギハイパー免疫血清でのマウスの受動的免疫化によって誘導された胎児S. pyogenes 感染に対する保護を示す。
ニュージーランドウサギ（Charles River Laboratories, St-Constant, Canada）を皮下に、実施例４に記載のように生産および精製し、そしてAlhydrogelアジュバント（Superfos Biosector a/s）に吸着させたたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の、５０μｇおよび１００μｇで多重部位に注射した。ウサギをＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質で３週間間隔で３回免疫化した。血液サンプルを、第３注射の３週間後に収集した。該血清中に存在する抗体を、４０％飽和硫酸アンモニウムを使用する沈降によって精製した。１０匹のメスのＣＤ−１マウス（Charles River）の群を静脈内に、ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質で免疫化されたウサギ、または関連のないコントロール組み換え体タンパク質で免疫化されたウサギから収集された精製された血清の５００μｌで注射した。１８時間後、マウスを近似的に２Ｘ１０７ ＣＦＵのタイプ３S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ１２３８４でチャレンジした。S. pyogens チャレンジ接種物のサンプルを、アガープレート上に置き、ＣＦＵを決定し、そしてチャレンジ用量を確認した。死亡を、５日の期間について記録した。
この例は、ウサギハイパー免疫血清でのマウスの受動的免疫化によって誘導された胎児S. pyogenes 感染に対する保護を示す。
ニュージーランドウサギ（Charles River Laboratories, St-Constant, Canada）を皮下に、実施例４に記載のように生産および精製し、そしてAlhydrogelアジュバント（Superfos Biosector a/s）に吸着させたたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の、５０μｇおよび１００μｇで多重部位に注射した。ウサギをＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質で３週間間隔で３回免疫化した。血液サンプルを、第３注射の３週間後に収集した。該血清中に存在する抗体を、４０％飽和硫酸アンモニウムを使用する沈降によって精製した。１０匹のメスのＣＤ−１マウス（Charles River）の群を静脈内に、ＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質で免疫化されたウサギ、または関連のないコントロール組み換え体タンパク質で免疫化されたウサギから収集された精製された血清の５００μｌで注射した。１８時間後、マウスを近似的に２Ｘ１０７ ＣＦＵのタイプ３S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ１２３８４でチャレンジした。S. pyogens チャレンジ接種物のサンプルを、アガープレート上に置き、ＣＦＵを決定し、そしてチャレンジ用量を確認した。死亡を、５日の期間について記録した。
実施例８
この例は、精製された組み換え体ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質での免疫化によって誘導される胎児S. pyogenes感染に対するマウスの保護を示す。
８匹のメスのＢａｌｂ／ｃ（Charles River, St-Constant, Quebec, Canada）の群を皮下に、１０μｇのＱｕｉｌＡアジュバント（Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada）の存在下のアフィニティ精製されたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の２０μｇ、またはコントロールとしてＰＢＳ中のＱｕｉｌＡアジュバント単独で２週間間隔で３回免疫化した。血液サンプルを、それぞれの免疫化の前の第１、第１４および２８日に、第３注射の２週間後（第４２日）に、眼窩洞（orbital sinus）から収集した。１週間後、マウスを、近似的に３ｘ１０ ６ ＣＦＵのタイプ３S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ１２３８４でチャレンジした。S. pyogenes チャレンジ接種物のサンプルを、血液アガープレート上に置き、ＣＦＵを決定しそしてチャレンジ用量を確認した。精製組換え体ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質で免疫化された、８匹のマウスのうち４匹は、致死チャレンジに対して保護され、アジュバント単独を受容したマウスのわずか１２％（１／８）と対比される（表１）。
この例は、精製された組み換え体ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質での免疫化によって誘導される胎児S. pyogenes感染に対するマウスの保護を示す。
８匹のメスのＢａｌｂ／ｃ（Charles River, St-Constant, Quebec, Canada）の群を皮下に、１０μｇのＱｕｉｌＡアジュバント（Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canada）の存在下のアフィニティ精製されたＢＶＨ−Ｐ７ Ｈｉｓタグ付加組換え体タンパク質の２０μｇ、またはコントロールとしてＰＢＳ中のＱｕｉｌＡアジュバント単独で２週間間隔で３回免疫化した。血液サンプルを、それぞれの免疫化の前の第１、第１４および２８日に、第３注射の２週間後（第４２日）に、眼窩洞（orbital sinus）から収集した。１週間後、マウスを、近似的に３ｘ１０ ６ ＣＦＵのタイプ３S. pyogenes菌株ＡＴＣＣ１２３８４でチャレンジした。S. pyogenes チャレンジ接種物のサンプルを、血液アガープレート上に置き、ＣＦＵを決定しそしてチャレンジ用量を確認した。精製組換え体ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質で免疫化された、８匹のマウスのうち４匹は、致死チャレンジに対して保護され、アジュバント単独を受容したマウスのわずか１２％（１／８）と対比される（表１）。
表５ 組換え体ＢＶＨ−Ｐ７タンパク質の、ＧＡＳ菌株ＡＴＣＣ １２３８４（タイプ３）に対する保護を誘起する能力
Claims (19)
- （ａ）配列番号２のアミノ酸２２からアミノ酸１００８までのアミノ酸配列からなる単離ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２からアミノ酸１００８までのアミノ酸配列と少なくとも９９％同一なアミノ酸配列からなる単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができる、単離ポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２２からアミノ酸１００８までのアミノ酸配列において２０以下のアミノ酸置換または欠失を有するアミノ酸配列からなり、（ａ）に記載のポリペプチドのアナログである単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができる、単離ポリペプチド、
から選択される単離ポリペプチド。 - Streptococcus pyogenesに対する免疫応答を惹起することができる、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
- （ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができるポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができるポリペプチド、
から選択される２以上のポリペプチドを含むキメラポリペプチド。 - （ａ）請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列、からなる単離ポリヌクレオチド。 - 該ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
- 該ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
- 該ポリヌクレオチドが発現制御領域に作動可能に連結されている、請求項４または請求項５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項７に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
- 該ポリペプチドの発現に好適な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１に記載のポリペプチドを製造する方法。
- 薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントおよび
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができるポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができるポリペプチド、
から選択されるポリペプチドを含む医薬組成物。 - ポリペプチドが、Streptococcus pyogenesに対する免疫応答を惹起する、請求項１０に記載の医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体、希釈剤またはアジュバントおよび請求項３のキメラポリペプチドを含む医薬組成物であって、該キメラポリペプチドが、Streptococcus pyogenesに対する免疫応答を惹起することができる、医薬組成物。
- 医薬組成物がワクチンである、請求項１０−１２のいずれかに記載の医薬組成物。
- 宿主におけるStreptococcus pyogenes感染の予防または治療的処置のための、請求項１０−１３のいずれかに記載の医薬組成物。
- Streptococcus pyogenes感染が、咽頭炎、丹毒、膿痂疹、猩紅熱、菌血症、毒性ショックまたは壊死性筋膜炎である、請求項１４に記載の医薬組成物。
- 該宿主がヒトである、請求項１４または請求項１５に記載の医薬組成物。
- 生物学的サンプルにおける、Streptococcus pyogenesのインビトロ検出方法であって、該方法が、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドに反応する抗体またはその抗原結合性フラグメントを該生物学的サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；および
（ｂ）該混合物中で、Streptococcus pyogenesの存在を示す、特異的に結合した抗体または結合した抗原結合性フラグメントを検出すること、
を含む、方法。 - 生物学的サンプルにおける、Streptococcus pyogenes抗原に特異的な抗体のインビトロ検出方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドまたは請求項３のキメラポリペプチドを、宿主から取得した生物学的サンプルとインキュベートし、混合物を形成すること；および
（ｂ）該混合物中の、Streptococcus pyogenes抗原に特異的である抗体の存在を示す、特異的に結合したポリペプチドまたはキメラポリペプチドを検出すること、
を含む方法。 - 請求項３のキメラポリペプチドまたは、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチド；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができるポリペプチド；および
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドであって、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を惹起することができるポリペプチド、
から選択される単離ポリペプチドを含む、Streptococcus pyogenes感染の検出または診断のためのキット。
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