ES2338637T3

ES2338637T3 - Polipeptidos de streptococcus pyogenes y fragmentos de adn correspondiente.

Info

Publication number: ES2338637T3
Application number: ES02701124T
Authority: ES
Inventors: Denis Martin; Stephane Rioux; Bernard R. Brodeur; Josee Hamel; Patrick Rheault
Original assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Current assignee: ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date: 2001-02-21
Filing date: 2002-02-21
Publication date: 2010-05-11
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: US20030049271A1; BRPI0207447B1; BR0207447A; EP1362106A2; JP2004531235A; AU2002234455B2; US7482012B2; CA2438921C; JP4281861B2; DE60235223D1; US7883706B2; WO2002066650A2; EP1362106B1; CA2438921A1; ATE456659T1; US20090186820A1; WO2002066650A3; AU2002234455C1

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, en el que se ha suprimido el péptido líder terminal de 21 restos de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y siendo el polipéptido aislado capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO:

Description

Polipéptidos de Streptococcus pyogenes y fragmentos de ADN correspondientes.

Campo tecnológico

La presente invención se refiere a polipéptidos de Streptococcus pyogenes (estreptococos del grupo 4) que se pueden usar para prevenir, diagnosticar y/o tratar una infección estreptocócica.

Antecedentes de la invención

Los estreptococos son bacterias Gram (+) que se diferencian por los antígenos carbohidratos específicos de grupos A a O que se encuentran en la superficie celular. Los aislados de S. pyogenes se distinguen además por los antígenos de proteína M de tipo específico. Las proteínas M son factores de virulencia importantes que son muy variables tanto en pesos moleculares como en secuencias. Realmente, se han identificado más de 80 tipos de proteína M basándose en las diferencias antigénicas.

S. pyogenes es responsable de muchos tipos de infecciones, incluyendo faringitis, erisipela e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteriemia y fascitis necrotizante. En los últimos años se ha documentado en muchos países un resurgimiento de la enfermedad invasiva, incluyendo en los de América del Norte y Europa. Aunque el organismo es sensible a antibióticos, la alta tasa de ataques y la rápida aparición de septicemias dan como resultado una alta morbosidad y mortalidad.

Para desarrollar una vacuna que proteja a los huéspedes frente a la infección por S. pyogenes, los esfuerzos se han centrado en factores de virulencia tales como las proteínas M de tipo específico. Sin embargo, se ha encontrado que la parte amino terminal de las proteínas M induce anticuerpos de reactividad cruzada que reaccionan con miocardio, tropomiosina, miosina y vimentina humanos, lo cual puede estar implicado en enfermedades autoinmunes. Otros han usado técnicas recombinantes para producir proteínas híbridas complejas que contienen péptidos amino terminales de las proteínas M de diferentes serotipos. Sin embargo, sería muy complejo producir y estandarizar una vacuna segura que contenga serotipos de S. pyogenes.

Además de los antígenos específicos de serotipo, otras proteínas de S. pyogenes han generado interés como potenciales candidatos para vacunas. Se ha mostrado que la peptidasa C5a, que es expresada por al menos 40 serotipos de S. pyogenes es inmunógena en ratones, pero su capacidad para reducir el nivel de colonización nasofaríngea estaba limitada. Otros investigadores también se han centrado en las exotoxinas pirógenas estreptocócicas que parece que tienen una función importante en la patogénesis de la infección. La inmunización con estas proteínas prevenía los síntomas letales del choque tóxico, pero no prevenía la colonización.

La Universidad de Oklahoma ha preparado un proyecto de secuenciación genómica de la cepa de S. pyogenes GAS M1 (http://dnal.chem.ou.edu/strep.html).

Por lo tanto, sigue existiendo una necesidad no satisfecha de antígenos de S. pyogenes que se puedan usar como componentes de vacuna para la profilaxis y/o terapia de la infección por S. pyogenes.

Sumario de la invención

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID No: 2, o fragmentos o análogos del mismo.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos SEC ID No: 2, o fragmentos o análogos del mismo.

En otros aspectos, se proporcionan polipéptidos codificados por nucleótidos de la invención, composiciones farmacéuticas, vectores que comprenden polinucleótidos de la invención operativamente unidos a una región de control de la expresión, así como células huésped transfectadas con dichos vectores, y procedimientos para producir polipéptidos que comprenden cultivar dichas células huésped en condiciones adecuadas para la expresión.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de ADN del gen BVH-P7 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes
ATCC700294; SEC ID NO: 1. La parte subrayada de la secuencia representa la región que codifica el péptido líder;

la Figura 2 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína BVH-P7 del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294; SEC ID NO: 2. La secuencia subrayada representa los 21 restos de aminoácidos del péptido líder;

la Figura 3 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos previstas de los marcos de lectura abiertos de BVH-P7 de las cepas de S. pyogenes Spy74 (SEC ID NO: 3), Spy70 (SEC ID NO: 4), Spy69 (SEC ID NO: 5), Spy68 (SEC ID NO: 6), Spy 60 (SEC ID NO: 7), ATCC12357 (SEC ID NO: 8), ATCC700294 (SEC ID NO: 2), usando el programa de software de análisis de secuencias Clustal W de MacVector (versión 6.5).

Bajo el alineamiento hay una línea de consenso en la que * y los caracteres indican los restos de aminoácidos idénticos y similares, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona polinucleótidos aislados y purificados que codifican polipéptidos estreptocócicos que se pueden usar para diagnosticar, prevenir y/o tratar la infección estreptocócica.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO:2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 80% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO:2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido elegido de: (a) un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2; (b) un polipéptido que comprende un fragmento antigénico o inmunogénico que tiene al menos 10 restos de aminoácidos contiguos del polipéptido de (a); (c) un polipéptido que comprende un análogo antigénico o inmunogénico que tiene una identidad de al menos 70% con el polipéptido de (a) o (b); (d) un polipéptido que comprende un análogo antigénico o inmunogénico que tiene una identidad de al menos 95% con el polipéptido de (a) o (b); (e) un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por el polipéptido de uno cualquiera de (a), (b), (c) y (d); (f) una parte que lleva epítopo del polipéptido de uno cualquiera de (a), (b), (c) y (d); (g) el polipéptido de uno cualquiera de (a), (b), (c), (d) y (f) en el que se ha suprimido el resto Met N-terminal; y (h) el polipéptido de uno cualquiera de (a), (b), (c), (d), (e), (f) y (g), en el que se ha suprimido la secuencia de aminoácidos secretora.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido elegido de: (a) un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2; (b) un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con el polipéptido de (a); (c) un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con el polipéptido de (a); (d) un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por el polipéptido de (a); (e) una parte que lleva epítopo del polipéptido de (a); (f) el polipéptido de uno cualquiera de (a), (b), (c), (d) y (e), en el que se ha suprimido el resto Met N-terminal; y (g) el polipéptido de uno cualquiera de (a), (b), (c), (d), (e) y (f) en el que se ha suprimido la secuencia de aminoácidos secretora.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 90% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 80% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 90% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere a partes que llevan epítopos de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido elegido de:

(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(b): un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(c): un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(d): un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(e): un polinucleótido que codifica una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(f): un polinucleótido que comprende una secuencia elegida de SEC ID NO: 1 o fragmentos o análogos de la misma;

(g): un polinucleótido que es complementario de un polinucleótido en (a), (b), (c), (d), (e) o (f).

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(a): un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2;

(b): un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2;

(c): un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2;

(d): un polinucleótido que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende una secuencia elegida de: SEC ID NO: 2;

(e): un polinucleótido que codifica una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende una secuencia elegida de SEC ID NO: 2;

(f): un polinucleótido que comprende una secuencia elegida de SEC ID NO: 1;

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De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido aislado que comprende un polipéptido elegido de:

(a): un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(b): un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(c): un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(d): un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(e): una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma;

(f): el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f), en el que se ha suprimido el resto Met N-terminal;

(g): el polipéptido de (a), (b), (c), (d), (e) o (f) en el que se ha suprimido la secuencia de aminoácidos secretora.

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(a): un polipéptido que tiene una identidad de al menos 70% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2;

(b): un polipéptido que tiene una identidad de al menos 95% con un segundo polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2;

(c): un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2;

(d): un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión por un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2;

(e): una parte que lleva epítopo de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2;

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El experto en la materia apreciará que la invención incluye moléculas de ADN, es decir polinucleótidos y sus secuencias complementarias que codifican análogos tales como mutantes, variantes, homólogos y derivados de dichos polipéptidos, como se describe en este documento en la presente solicitud de patente. La invención también incluye moléculas de ARN que corresponden a moléculas de ADN de la invención. Además de las moléculas de ADN y ARN, la invención incluye los correspondientes polipéptidos y anticuerpos monoespecíficos que se unen específicamente a dichos polipéptidos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son antigénicos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención son inmunogénicos.

En una realización adicional, los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden provocar una respuesta inmunitaria en un huésped.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos que son capaces de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión con los polipéptidos de la presente invención, como se ha definido
antes.

Un anticuerpo que tiene "especificidad de unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado pero no reconoce ni se une sustancialmente a otras moléculas en una muestra, p. ej., una muestra biológica. La unión específica se puede medir usando un ensayo ELISA en el que se usa el polipéptido seleccionado como un antígeno.

De acuerdo con la presente invención, la "protección" en los estudios biológicos se define por un aumento significativo de la curva, tasa o periodo de supervivencia. El análisis estadístico que usa el análisis de "Log-rank" para comparar las curvas de supervivencia y el ensayo de Fisher exacto para comparar tasas de supervivencia y número de días hasta la muerte, respectivamente, puede ser útil para calcular los valores de P y determinar si la diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa. Los valores de P de 0,05 se considera que no son significa-
tivos.

En un aspecto adicional de la invención, se proporcionan fragmentos antigénicos/inmunogénicos de los polipéptidos de la invención, o de análogos de los mismos.

Los fragmentos de la presente invención deberían incluir una o más de dichas regiones de epítopo o ser suficientemente similares a dichas regiones para retener sus propiedades antigénicas/inmunogénicas. Por lo tanto, para los fragmentos de acuerdo con la presente invención, posiblemente el grado de identidad no es importante, puesto que pueden tener una identidad de 100% con una parte particular de un polipéptido o análogo del mismo como se describe en el presente documento. La presente invención proporciona además fragmentos que tienen al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de las secuencias de polipéptidos de la presente invención. En una realización, al menos 15 restos de aminoácidos contiguos. En una realización, al menos 20 restos de aminoácidos
contiguos.

El asunto clave, una vez más, es que el fragmento retenga las propiedades antigénicas/inmunogénicas.

El experto en la materia apreciará que los análogos de los polipéptidos de la invención también serán útiles en el contexto de la presente invención, es decir como material antigénico/inmunogénico. Por lo tanto, la presente invención abarca por ejemplo proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones, deleciones, sustituciones o simi-
lares.

Como se usa en el presente documento, "fragmentos", "análogos" o "derivados" de los polipéptidos de la invención incluyen los polipéptidos en los que uno o más restos de aminoácidos están sustituidos por un resto de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente conservado) y que puede ser natural o no natural. En una realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán una identidad de aproximadamente 70% con aquellas secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de las mismas. Es decir, 70% de los restos son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán una identidad mayor de 80%. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán una identidad mayor que 85%. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán una identidad mayor que 90%. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán una identidad mayor que 95%. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán una identidad mayor que 99%. En una realización adicional, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de restos de aminoácidos y más preferiblemente menos de 10.

Estas sustituciones son aquellas que tienen una influencia mínima en la estructura secundaria y naturaleza hidropática del polipéptido. Las sustituciones preferidas son las que se conocen en la materia como conservadas, es decir, los restos sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga o grupos funcionales. Estas incluyen sustituciones tales como las descritas por Dayhoff, M. en Atlas of Protein Sequence and Structure 5, 1978 y por Argos, P. en EMBO J. 8, 779-785, 1989.

Por ejemplo, los aminoácidos, naturales o no naturales, que pertenecen a uno de los siguientes grupos representan cambios conservativos:

\quad: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr, val;

\quad: cys, ser, tyr, thr;

\quad: val, ile, leu, met, ala, phe;

\quad: lys, arg, orn, his; y

\quad: phe, tyr, trp, his.

Las sustituciones preferidas también incluyen sustituciones de enantiómeros D por los correspondientes aminoácidos L.

En un procedimiento alternativo, los análogos de los polipéptidos de la invención comprenden las sustituciones descritas en la Figura 3.

En un procedimiento alternativo, los análogos podrían ser proteínas de fusión que incorporan restos que hacen que la purificación sea más fácil, por ejemplo por marcado eficaz del polipéptido deseado. Puede ser necesario quitar el "marcador" o puede darse que el propio polipéptido de fusión retenga suficiente antigenicidad para ser útil.

El porcentaje de homología se define como la suma del porcentaje de identidad más el porcentaje de similitud o conservación del tipo de aminoácido.

En una realización, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán una identidad de aproximadamente 70% con las secuencias ilustradas en las figuras o fragmentos de las mismas. Es decir, 70% de los restos son los mismos. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 75% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 80% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 85% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 90% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 95% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 99% de homología. En una realización adicional, los análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o deleciones de aminoácidos y más preferiblemente menos de 10.

Se puede usar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara las secuencias de aminoácidos y encuentra el alineamiento óptimo insertando espacios en las secuencias, según sea adecuado. Se puede calcular la identidad o similitud de aminoácidos (identidad más conservación del tipo de aminoácido) para un alineamiento óptimo. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Por lo tanto, se puede obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, cada una con una puntuación diferente. En la presente invención se contemplan ambos tipos de análisis de identidad.

En un procedimiento alternativo, los análogos o derivados podrían ser polipéptidos de fusión que incorporan restos que hacen que la purificación sea más fácil, por ejemplo por marcado eficaz del polipéptido o proteína deseados. Puede ser necesario quitar el "marcador" o puede darse que el propio polipéptido de fusión retenga suficiente antigenicidad para ser útil.

Es conocido que se puede seleccionar un polipéptido antigénico para identificar regiones epítopas, es decir aquellas regiones que son responsables de la antigenicidad o inmunogenicidad del polipéptido. Los procedimientos para llevar a cabo esta selección son conocidos en la materia. Por lo tanto, los fragmentos de la presente invención deberían incluir una o más de dichas regiones epítopas o ser suficientemente similares a dichas regiones para retener sus propiedades antigénicas/inmunogénicas.

Por lo tanto, para los fragmentos de acuerdo con la presente invención, quizás el grado de identidad no es importante, puesto que pueden ser 100% idénticos a una parte particular de un polipéptido o análogo, como se describe en el presente documento.

Por lo tanto, lo que es importante para los análogos, derivados y fragmentos es que tengan al menos un grado de la antigenicidad/inmunogenicidad de la proteína o polipéptido del cual derivan.

También están incluidos los polipéptidos que se han fusionado con otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicos de los polipéptidos, es decir, polietilenglicol (PEG) para aumentar la semivida; secuencias de aminoácidos líder o secretoras para facilitar la purificación; prepro y prosecuencias y (poli)sacáridos.

Además, en las situaciones en las que se encuentra que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede ser conveniente variar uno o más aminoácidos para imitar más eficazmente los diferentes epítopos de las diferentes cepas de estreptococos.

Además, los polipéptidos de la presente invención se pueden modificar por acilación del -NH_{2} terminal (p. ej., por acetilación, o amidación de ácido tioglicólico, amidación de carboxi terminal, p. ej., con amoniaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, mayor hidrofobicidad para el enlace o unión a un soporte u otra molécula.

También se contemplan los multímeros de hetero y homopolipéptidos de los fragmentos y análogos del polipéptido. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que se han reticulado con agentes de reticulación tales como avidina/biotina, glutaraldehído o superimidato de dimetilo. Dichas formas poliméricas también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias contiguas invertidas o en tándem, producidas a partir de ARNm multicistrónicos generados por tecnología de ADN recombinante. En una realización adicional, la presente invención se refiere también a polipéptidos quiméricos que comprenden uno o más polipéptidos o fragmentos o análogos de los mismos, como se definen en las figuras de la presente solicitud.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen la secuencia elegida de la SEC ID NO: 2, o fragmentos o análogos de la misma; con la condición de que los polipéptidos estén unidos formando un polipéptido quimérico.

En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprenden dos o más polipéptidos que tienen una secuencia elegida de la SEC ID NO: 2, con la condición de que los polipéptidos estén unidos formando un polipéptido quimérico.

Preferiblemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido de la invención, comprenderá al menos una región antigénica, es decir, al menos un epítopo.

Con el fin de lograr la formación de polímeros antigénicos (es decir, multímeros sintéticos), se pueden usar polipéptidos que tengan grupos bishalogenoacetilo, haluros de nitroarilo, o similares, donde los reactivos son específicos para los grupos tio. Por lo tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los diferentes polipéptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar compuesto por un grupo de unión de al menos 2, típicamente al menos 4, y no más de 16, pero habitualmente no más de aproximadamente 14 átomos de carbono.

En una realización particular, los fragmentos y análogos de polipéptido de la invención no contienen un resto metionina (Met) inicial. Preferiblemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora (secuencia señal). La parte de señal de un polipéptido de la invención se puede determinar de acuerdo con técnicas de biología molecular establecidas. En general, el polipéptido de interés se puede aislar de un cultivo estreptocócico y posteriormente secuenciar para determinar el resto inicial de la proteína madura y por lo tanto la secuencia del polipéptido maduro.

Se entiende que los polipéptidos se pueden producir y/o se pueden usar sin su codón inicial (metionina o valina) y/o sin su péptido líder para favorecer la producción y purificación de polipéptidos recombinantes. Se sabe que la clonación de genes sin secuencias que codifican los péptidos líder restringirá los polipéptidos al citoplasma de E. coli y facilitará su recuperación (Glick, B.R. y Pasternak, J.J. (1998) Manipulation of gene expression in prokaryotes. En "Molecular biotechnology: Principles and applications of recombinant DNA", 2ª edición, ASM Press, Washington DC, pág.109-143).

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan también (i) una composición de materia que contiene un polipéptido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iii) una vacuna que comprende un polipéptido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iv) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra estreptococos en un huésped, administrando al huésped una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido de la invención para provocar una respuesta inmunitaria, p.ej., una respuesta inmunitaria protectora contra Streptococcus; y en particular (v) un procedimiento para prevenir y/o tratar una infección por estreptococos administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un polipéptido de la invención al huésped que lo
necesite.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan también (i) una composición de materia que contiene un polinucleótido de la invención, junto con un vehículo, diluyente o adyuvante; (ii) una composición farmacéutica que comprende un polinucleótido de la invención y un vehículo, diluyente o adyuvante; (iii) un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria contra estreptococos en un huésped, administrando al huésped una cantidad inmunológicamente eficaz de un polinucleótido de la invención para provocar una respuesta inmunitaria, p.ej., una respuesta inmunitaria protectora contra Streptococcus; y en particular (iv) un procedimiento para prevenir y/o tratar una infección por estreptococos administrando una cantidad profiláctica o terapéutica de un polinucleótido de la invención al huésped que lo necesite.

Antes de la inmunización, los polipéptidos de la invención también se pueden acoplar o conjugar con proteínas vehículo tales como toxina tetánica, toxina de la difteria, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, antígeno VP1 del virus de poliomielitis o cualquier otra toxina o antígeno vírico o bacteriano o cualquier proteína adecuada para estimular el desarrollo de una respuesta inmunitaria más fuerte. Este acoplamiento o conjugación se pueden hacer química o genéticamente. Se encuentra disponible una descripción más detallada de la conjugación de péptido-vehículo en Van Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller S., Plaué S., "Synthetic Polypeptides as antigens" en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 19 (ed.) Burdou, R.H. & Van Knippenberg P.H. (1988), Elsevier New York.

De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más polipéptidos estreptocócicos de la invención en una mezcla con un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes adecuados incluyen (1) formulaciones en emulsión de aceite en agua tales como MF59^{TM}, SAF^{TM}, Ribi^{TM}; (2) adyuvante completo o incompleto de Freund; (3) sales, es decir AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4})_{2}, Al(OH)_{3}, AlPO_{4}, sílice, caolín; (4) derivados de saponina tales como Stimulon^{TM} o partículas generadas a partir de las mismas tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (5) citocinas tales como interleucinas, interferones, factor estimulante de colonia de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF); (6) otras sustancias tales como carbono-polinucleótidos, es decir poli IC y poli AU, toxina del cólera detoxificada (CTB) y toxina de E. coli térmicamente lábil para la inducción de inmunidad de las mucosas. Hay una descripción más detallada del adyuvante en una revisión de M.Z.I Khan y col., en Pharmaceutical Research, vol. 11, No. 1 (1994) pág. 2-11, y también en otra revisión de Gupta y col., en Vaccine, Vol. 13, No. 14, pág. 1263-1276 (1995) y en el documento WO 99/24578, que se incorpora en el presente documento por referencia. Los adyuvantes preferidos incluyen Qul 1 A^{TM}, QS21^{TM}, Alhydrogel^{TM} y
Adjuphos^{TM}.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar por vía parenteral por inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, absorción dérmica, o vía bucal u oral.

Las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para el tratamiento o profilaxis de una infección estreptocócica y/o enfermedades y síntomas mediados por una infección estreptocócica, como describen P.R. Murray (editor jefe), E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. 6ª edición, 1995, 1482p, que se incorporan en el presente documento por referencia. En una realización, se usan composiciones farmacéuticas de la presente invención para la profilaxis o tratamiento de la faringitis, erisipelas e impétigo, escarlatina y enfermedades invasivas tales como bacteriemia y fascitis necrotizante y también choque tóxico. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención se usan para la profilaxis o tratamiento de una infección por Streptococcus y/o enfermedades y síntomas mediados por una infección por Streptococcus, en particular el grupo A de Streptococcus (Streptococcus pyogenes), grupo B de Streptococcus (GBS o S. agalactiae), S. pneumoniae, S. dysgalactiae, S. uberis, S. nocardia así como Staphylococcus aureus. En una realización adicional, la infección por Streptococcus es por S. pyogenes.

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En una realización adicional, la invención proporciona un procedimiento para la profilaxis o tratamiento de la infección por Streptococcus en un huésped susceptible a la infección por estreptococos, que comprende administrar a dicho huésped una cantidad terapéutica o profiláctica de una composición de la invención.

Como se usa en la presente solicitud, el término "huésped" incluye mamíferos. En una realización adicional, el mamífero es humano.

En una realización particular, las composiciones farmacéuticas se administran a los huéspedes que tienen riesgo de infección por Streptococcus tales como niños, ancianos y huéspedes inmunocomprometidos.

Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en una forma farmacéutica monodosis de aproximadamente 0,001 a 100 \mug/kg (antígeno/peso corporal) y más preferiblemente de 0,01 a 10 \mug/kg y lo más preferiblemente de 0,1 a 1 \mug/kg, de 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.

Las composiciones farmacéuticas están preferiblemente en forma farmacéutica monodosis de aproximadamente 0,1 \mug a 10 mg y más preferiblemente de 1 \mug a 1 mg y lo más preferiblemente de 10 a 100 \mug, de 1 a 3 veces, con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas entre inmunizaciones.

De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de la misma.

En una realización, los polinucleótidos son los ilustrados en la SEC ID NO: 1 que pueden incluir los marcos de lectura abierta (ORF) que codifican los polipéptidos de la invención.

Se observará que las secuencias de polinucleótidos ilustradas en las figuras se pueden alterar con codones degenerados que todavía codifican los polipéptidos de la invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona además polinucleótidos que hibridan con las secuencias de polinucleótidos del presente documento, antes descritas (o secuencias complementarias de las mismas), que tienen una identidad entre secuencias de 50%. En una realización, una identidad entre secuencias de al menos 70%. En una realización, una identidad entre secuencias de al menos 75%. En una realización, una identidad entre secuencias de al menos 80%. En una realización, una identidad entre secuencias de al menos 85%. En una realización, una identidad entre secuencias de al menos 90%. En una realización adicional, los polinucleótidos pueden hibridar en condiciones restrictivas, es decir teniendo una identidad de al menos 95%. En una realización adicional, una identidad de más de 97%.

Las condiciones restrictivas para la hibridación las puede determinar fácilmente un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook y col., (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1999) Editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley & Sons, Inc.,
N.Y.).

En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que hibridan en condiciones restrictivas con

(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

comprendiendo dicho polipéptido la SEC ID NO: 2, o fragmentos o análogos de la misma.

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(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

comprendiendo dicho polipéptido la SEC ID NO: 2.

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(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

comprendiendo dicho polipéptido al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2, o fragmentos o análogos de la misma.

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(a): una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o

(b): el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido;

comprendiendo dicho polipéptido al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la SEC ID NO: 2.

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En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos que codifican polipéptidos de la invención ilustrados en la SEC ID NO: 2 o fragmentos o análogos de los mismos.

En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos ilustrados en la SEC ID NO: 1 que codifican polipéptidos de la invención o fragmentos o análogos de los mismos.

En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos que codifican polipéptidos de la invención ilustrados en la SEC ID NO: 2.

En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos ilustrados en la SEC ID NO: 1 que codifican polipéptidos de la invención.

Como apreciarán fácilmente los expertos en la materia, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.

La presente invención también incluye polinucleótidos complementarios de los polinucleótidos descritos en la presente solicitud.

En un aspecto adicional, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención, o fragmentos, análogos o derivados de los mismos, se pueden usar en un procedimiento de inmunización con ADN. Es decir, se pueden incorporar en un vector que se puede replicar y expresar tras inyección, produciendo así el polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo, los polinucleótidos se pueden incorporar en un vector plasmídico bajo el control del promotor de CMV que es funcional en células eucariotas. Preferiblemente, el vector se inyecta por vía intramuscular.

De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes, expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y recuperando el producto polipeptídico expresado. Alternativamente, los polipéptidos se pueden producir de acuerdo con técnicas de química sintética establecidas, es decir, síntesis en fase de disolución o en fase sólida de oligopéptidos que están ligados para producir el polipéptido entero (ligado de bloques).

En la siguiente bibliografía se describen procedimientos generales para obtener y evaluar polinucleótidos y polipéptidos:

Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley and Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 páginas; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R.K., Springer-Verlag, New York, 3ª edición, 1993, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan J.E. y col., John Wiley & Sons Inc., New York, que se incorporan en el presente documento por referencia.

Para la producción recombinante, las células huésped se transfectan con vectores que codifican el polipéptido y después se cultivan en un medio nutriente modificado según sea adecuado, activando promotores, seleccionando transformantes o amplificando los genes. Los vectores adecuados son los que son viables y se pueden replicar en el huésped elegido e incluyen secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas, p. ej., plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago. La secuencia de polipéptido se puede incorporar en el vector en el sitio adecuado usando enzimas de restricción, de modo que esté operativamente unido a una región de control de la expresión que comprende un promotor, el sitio de unión al ribosoma (región de consenso o secuencia de Shine-Dalgarno), y opcionalmente un operador (elemento de control). Se pueden seleccionar componentes individuales de la región de control de la expresión que son adecuados para un huésped y vector dados de acuerdo con los principios de biología molecular establecidos (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. y col., John Wiley and Sons, Inc. New York incorporados en el presente documento por referencia). Los promotores adecuados incluyen, pero sin limitación, el promotor LTR o SV40, promotores de E. coli lac, tac o trp y el promotor del fago lambda P_{L}. Los vectores preferiblemente incorporarán un origen de replicación así como marcadores de selección, es decir, gen de resistencia a ampicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pD10 phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH1oa, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y vectores eucariotas pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células huésped pueden ser bacterianas, es decir E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas, es decir, Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; de levaduras, es decir, Saccharomyces o eucariotas, es decir CHO, COS.

Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células normalmente se recogen por centrifugación y después se alteran por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no es secretado al medio) y el extracto bruto resultante es retenido para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido del medio de cultivo o de lisado se puede lograr por técnicas estabilizadas dependiendo de las propiedades del polipéptido, es decir, usando sulfato de amonio o precipitación en etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía por interacción hidrófoba, cromatografía en hidroxiapatito y cromatografía en lecitina. La purificación final se puede lograr usando HPLC.

Los polipéptidos se pueden expresar con o sin una secuencia líder o de secreción. En el último caso, la secuencia líder se puede eliminar usando procesamiento postraduccional (véase los documentos US 4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397 incorporados en el presente documento por referencia) o se pueden eliminar químicamente después de purificar el polipéptido expresado.

De acuerdo con un aspecto adicional, los polipéptidos estreptocócicos de la invención se pueden usar en un ensayo de diagnóstico para la infección por Streptococcus, en particular infección por S. pyogenes. Son posibles varios procedimientos de diagnóstico, por ejemplo, para detectar un organismo estreptocócico en una muestra biológica se puede seguir el siguiente procedimiento:

a): obtener una muestra biológica de un huésped;

b): incubar un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con un polipéptido estreptocócico de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c): detectar el anticuerpo unido o fragmento unido específicamente en la mezcla, lo que indica la presencia de estreptococos.

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Alternativamente, un procedimiento para detectar un anticuerpo específico de un antígeno estreptocócico en una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo se puede realizar como sigue:

a): obtener una muestra biológica de un huésped;

b): incubar uno o más polipéptidos estreptocócicos de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c): detectar específicamente el antígeno unido o fragmento unido en la mezcla, lo que indica la presencia de anticuerpo específico de estreptococo.

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Un experto en la materia reconocerá que este ensayo de diagnóstico puede tomar varias formas, incluyendo un ensayo inmunológico tal como un ensayo de inmunoabsorción con enzimas ligadas (ELISA), un radioinmunoensayo o un ensayo de aglutinación con látex, esencialmente para determinar si están presentes anticuerpos específicos para la proteína en el organismo.

Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de la invención también se pueden usar para diseñar sondas de ADN para usar para detectar la presencia de estreptococos en una muestra biológica que se sospecha que contiene dichas bacterias. El procedimiento de detección de esta invención comprende:

a): obtener la muestra biológica de un huésped;

b): incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y

c): detectar la sonda de ADN específicamente unida en la mezcla, lo que indica la presencia de bacterias estreptocócicas.

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Las sondas de ADN de esta invención también se pueden usar para detectar ácidos nucleicos de estreptococos, es decir de S. pyogenes en una muestra, por ejemplo usando una reacción en cadena de la polimerasa, como un procedimiento de diagnóstico de infecciones por estreptococos. La sonda se puede sintetizar usando técnicas convencionales y se puede inmovilizar en una fase sólida, o se puede marcar con un marcador detectable. Una sonda de ADN preferida para esta aplicación es un oligómero que tiene una secuencia complementaria de al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de S. pyogenes de la invención.

Otro procedimiento de diagnóstico para detectar estreptococos en un huésped comprende:

a): marcar un anticuerpo reactivo con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con un marcador detectable;

b): administrar el anticuerpo marcado o fragmento marcado al huésped; y

c): detectar el anticuerpo marcado o fragmento marcado unido específicamente en el huésped, lo que indica la presencia de estreptococos.

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De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo para el tratamiento y/o profilaxis de infecciones estreptocócicas.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de los polipéptidos de estreptococos de la invención como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para el diagnóstico y en particular para el tratamiento de la infección por estreptococos. Los anticuerpos adecuados se pueden determinar usando procedimientos de selección adecuados, por ejemplo, midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger de forma pasiva frente a la infección por estreptococos en un modelo de ensayo. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón descrito en los ejemplos del presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o humano. Puede ser un anticuerpo natural o fragmento del mismo, o si se desea un anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo. La expresión anticuerpo recombinante o fragmento de anticuerpo significa anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales o preferiblemente monoclonales. Puede ser específico para una serie de epítopos asociados con los polipéptidos de S. pyogenes pero preferiblemente es específico para uno.

Un aspecto adicional de la invención es el uso de anticuerpo dirigidos a los polipéptidos de la invención para la inmunización pasiva. Se pueden usar los anticuerpos descritos en la presente solicitud.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para la inmunización por el cual un anticuerpo generado por un polipéptido de la invención se administra a un huésped en una cantidad suficiente para proporcionar una inmunización pasiva.

En una realización adicional, la invención proporciona el uso de una composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección estreptocócica.

En una realización adicional, la invención proporciona un kit que comprende un polipéptido de la invención para detectar o diagnosticar una infección estreptocócica.

Salvo que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente el experto en la materia a la que pertenece esta invención. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento, se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, controlará la presente memoria descriptiva, incluyendo definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

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Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la clonación y características moleculares del gen BVH-P7 y el polipéptido correspondiente.

La región codificante del gen BVH-P7 de S. Pyogenes (SEC ID NO: 1) se amplificó por PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96, Stratagene, LaJolla, CA) a partir de ADN genómico del serotipo M1 de la cepa de S. pyogenes ATCC700294 usando los siguientes cebadores oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción NdeI (CATATG) y NotI (GCGGCCGC): DMAR293 (SEC ID NO: 9) y DMAR294 (SEC ID NO: 10), que se presentan en la Tabla 1. Los productos de la PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se hicieron digerir con NdeI y NotI (Amersham Pharmacia Biotech Inc, Baie D'Urfé, Canadá). El vector pET-21b(+) (Novagen, Madison, WI) se hizo digerir con NdeI y NotI usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de la PCR NdeI-NotI se ligaron al vector de expresión pET-21b(+) NdeI-NotI. Los productos ligados se transformaron en la cepa de E. coli DH5\cdot[\Phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta (lacZYA-argF) U169 endA1 recA1 hsdR17 (r_{K}-m_{K}+) deoR thi-1 supE44 \lambda^{-} gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), pág. 109-135). El plásmido pET-21b(+) recombinante (rpET21b(+)) que contiene el gen BVH-P7 se purificó usando un kit de plásmido de QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenció el inserto de ADN (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA).

TABLA 1 Cebadores oligonucleótidos usados para amplificaciones por PCR del gen BVH-P7 de S. pyogens

1

Se determinó que el marco de lectura abierto (ORF) de BVH-P7 de 3027 pb que incluye un codón de parada (TAA) codifican un polipéptido de 1008 restos de aminoácidos con un pl previsto de 6,18 y una masa molecular prevista de 111.949,44 Da. El análisis de secuencia de los restos de aminoácidos previstos (SEC ID NO: 2) usando el software PSORTII (Real World Computing Partnership (http://paort.nibb.ac.jp)) sugería la existencia de un péptido señal de 21 restos de aminoácidos (MKKHLKTVALTLTTVSVVTHN), que termina con un sitio de escisión situado entre un resto de asparagina y un resto de glutamina. El análisis de la secuencia de restos de aminoácidos puso de manifiesto la presencia de un patrón de anclaje de la pared celular (LPXTGX) situado entre los restos 974 y 981.

Para confirmar la presencia por amplificación por PCR del gen BVH-P7 (SEC ID NO: 1), se usaron las siguientes 4 cepas de S. pyogenes serológicamente distintas: la cepa de S. pyogenes de serotipo M1 ATCC700294 y la cepa de S. pyogenes de serotipo M3 ATCC12384 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD); el aislado clínico de la cepa de S. pyogenes de serotipo M6 SPY67 lo proporcionó el Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier de l'université Laval, Sainte-Foy; y la cepa de S. pyogenes B514 que se aisló inicialmente de un ratón la proporcionó Susan Hollingshead, de la University of Alabama, Birmingham. La cepa de E. coli XL1-Blue MRF' se usó en estos experimentos como control negativo. El ADN cromosómico se aisló de cada una de las cepas de S. pyogenes como se ha descrito previamente (Jayarao BM y col. 1991. J. Clin. Microbiol. 29:2774-2778). El gen BVH-P7 (SEC ID NO: 1) se amplificó por PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96, Stratagene, LaJolla, CA) a partir del ADN genómico purificado a partir de las 4 cepas de S. pyogenes, y la cepa de control de E. coli usando los cebadores oligonucleótidos DMAR293 (SEC ID NO:9) y DMAR294 (SEC ID NO: 10) (Tabla 1). La PCR se realizó con 30 ciclos de 45 s a 95ºC, 45 s a 50ºC y 2 min a 72ºC y un periodo final de alargamiento de 7 min a 72ºC. Los productos de la PCR se fraccionaron por tamaños en geles de agarosa al 1% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Los resultados de esta amplificación por PCR se presentan en la Tabla 2. El análisis de los productos de amplificación puso de manifiesto que el gen BVH-P7 (SEC ID NO: 1) estaba presente en el genoma de las 4 cepas de S. pyogenes ensayadas. No se detectó dicho producto cuando el ADN de E. coli de control se sometió a lo mismo: amplificaciones por PCR con estos cebadores oligonucleótidos.

TABLA 2 Identificación del gen BVH-P7 de S. pyogenes por amplificación de la PCR en el genoma de 4 cepas serológicamente diferentes de S. pyogenes

2

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Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la clonación del gen BVH-P7 de S. pyogenes en el plásmido de CMV pCMV-GH. La región de ADN codificante de la proteína de S. pyogenes se insertó en fase secuencia abajo de un gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) que estaba bajo el control transcripcional del promotor de citomegalovirus en el vector plasmídico pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992, 356:152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en células de E. coli pero activo cuando se administra el plásmido en células eucariotas. El vector también incorporaba el gen de resistencia a la ampicilina.

Las regiones codificantes del gen BVH-P7 (SEC ID NO: 1) sin su región de péptidos líder se amplificó por PCR (ciclador térmico Robocycler Gradient 96, Stratagene, LaJolla, CA) a partir del ADN genómico del la cepa S. pyogenes de serotipo M1 ATCC700294 usando los cebadores oligonucleótidos DMAR480a (SEC ID NO: 11) y DMAR481a (SEC ID NO: 12) que contenían extensiones de bases para la adición de los sitios de restricción BamHI (GGATCC) y SalI (GTCGAC) que se describen en la Tabla 1.

Los productos de la PCR se purificaron en gel de agarosa usando un kit de extracción en gel QT-Aquick de QIAgen (Chatsworth, CA), se hicieron digerir con enzimas de restricción (Amersham Pharmacia Biotech Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas) se digirió con BamHI y SalI y se purificó en gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). El fragmento de ADN BamHI-SalI se ligó al vector BamHI-SalI-pCMV-GH para crear la proteína de fusión hGH-BVH-P7 bajo control del promotor de CMV. El producto ligado se transformó en la cepa de E. coli DH5\cdot[\varphi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{K}-m_{K}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), pp. 109-135). El plásmido pCMV recombinante se purificó usando el kit de plásmido de QIAgen (Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN se verificó por secuenciación de ADN.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra el uso de ADN para provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno de proteína BVH-P7 de S. pyogenes.

Se inmunizaron grupos de 8 ratones hembra BALB/c (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) por inyección intramuscular de 100 \mul, 3 veces en intervalos de 2 ó 3 semanas con 50 \mug de pCMV-GH recombinante que codifica el gen BvH-P7 (SEC ID NO: 1) en presencia de 50 \mug del plásmido pCMV-GH-GM-CSF que expresa el factor de estimulación de las colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas). Como grupos de control, se inyectaron a grupos de ratones 50 \mug de pCMV-GH en presencia de 50 \mug de pCMV-GH-GM-CSF. Se recogieron muestras de sangre del seno orbital antes de cada inmunización y 7 días después de la tercera inyección, y se determinaron las respuestas de anticuerpos en el suero por ELISA usando la proteína recombinante BVH-P7 de S. pyogenes marcada con His como antígeno de recubrimiento. La producción y purificación de esta proteína recombinante BVH-P7 de S. pyogenes marcada con His se presenta en el ejemplo 4.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la producción y purificación de la proteína recombinante BVH-P7 de S. pyogenes.

Se usó el plásmido recombinante pET-21b(+) con el gen BVH-P7 (SEC ID NO: 1) para transformar por electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) la cepa de E. coli Tuner (DE3) (F^{-}ompT hsdS_{B} (r^{-}_{B}m^{-}_{B}) gal dcm lacYI (DE3)) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli, el promotor T7 que controla la expresión de la proteína recombinante es reconocido específicamente por la ARN polimerasa T7 (presente en el profago \lambdaDE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que es inducible por el isopropil-\beta-d-tiogalactopiranósido (IPTG). Los transformantes de Tuner (DE3)/rpET21 (+) se cultivaron a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contenía 100 \mug de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canadá Ltd., Oakville, Canadá) por ml, hasta que la A_{600} alcanzó un valor de 0,6. Con el fin de inducir la producción de la proteína recombinante BVH-P7 de S. pyogenes marcada con His, las células se incubaron durante 3 horas adicionales en presencia de IPTG con una concentración final de 0,1 mM. Las células inducidas de un cultivo de 500 ml se sedimentaron por centrifugación y se congelaron a -70ºC.

La purificación de la proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His de la fracción no soluble de (DE3)/rpET21 (+) de Tuner inducido por IPTG se hizo por cromatografía de afinidad basada en las propiedades de la secuencia His-Tag (6 restos de histidina consecutivos) para unirse a cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados en la resina de quelación de metales His\cdotBind. Brevemente, las células sedimentadas obtenidas de un cultivo de 500 ml inducido por IPTG se volvieron a suspender en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contenía Guanidina-HCl 6 M, se trataron con ultrasonidos y se centrifugaron a 12.000 X g durante 20 min para separar los residuos. El líquido sobrenadante se incubó con resina de agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá) durante 45 min a 4ºC. La proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His se eluyó de la resina con una disolución que contenía Guanidina-HCl 6 M e imidazol 250 mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM, pH 7,9. La separación de la sal y el imidazol de las muestras se hizo por diálisis contra Tris 10 mM y NaC 0,9%, pH 7,9 durante la noche a 4ºC. La cantidad de proteína recombinante se calculó por MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la reactividad de la proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His con sueros humanos y sueros recogidos de ratones después de inmunización con preparaciones antigénicas de S. pyogenes.

Como se muestra en la Tabla 3, la proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His purificada se reconoció en ensayos de inmunotransferencia con anticuerpos presentes en la mezcla de sueros normales. Este es un resultado importante, puesto que indica claramente que los seres humanos que normalmente están en contacto con S. pyogenes desarrollan anticuerpos que son específicos para esta proteína. Estos anticuerpos humanos particulares pueden estar implicados en la protección contra la infección por S. pyogenes. Además, estos ensayos de inmunotransferencia también pusieron de manifiesto que los sueros recogidos de ratones inmunizados con preparaciones antigénicas de S. pyogenes enriquecidas con proteínas de membrana que protegían a los ratones frente a la estimulación letal, también desarrollaban anticuerpos que reconocían la proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His. Estos resultados indican que esta proteína estaba presente en la preparación antigénica de S. pyogenes que protegía a ratones frente a la infección y que esta proteína estreptocócica inducía anticuerpos que reaccionaban con la correspondiente proteína recombinante marcada con His.

TABLA 3 Reactividad en inmunotransferencias de sueros humanos y sueros recogidos de ratones después de inmunización con preparaciones antigénicas de S. pyogenes con proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His

3

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la accesibilidad a anticuerpos de la proteína BVH-P7 de S. pyogenes en la superficie de células estreptocócicas intactas

Se hicieron crecer bacterias en caldo Tood Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Detroit, MI) con extracto de levadura al 0,5% (Difco Laboratories) y extracto de peptona al 0,5% (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 8% para dar una DO_{490\ nm} de 0,600 (\sim10^{8} UFC/ml). Después se añadieron diluciones de anti-BVH-P7 o sueros de control y se dejó que se unieran a las células, que se incubaron durante 2 h a 4ºC. Las muestras se lavaron 4 veces en tampón de bloqueo [disolución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía albúmina de suero bovino al 2% (BSA)], y después 1 ml de IgG anti-ratón-conjugada con fluoresceína (FITC) de cabra + IgM diluida en tampón de bloqueo. Después de una incubación adicional de 60 min a temperatura ambiente, las muestras se lavaron 4 veces en tampón de bloqueo y se fijaron con formaldehído al 0,25% en tampón de PBS durante 18-24 h a 4ºC. Las células se lavaron 2 veces en tampón de PBS y se volvieron a suspender en 500 \mul de tampón de PBS. Las células se mantuvieron en la oscuridad a 4ºC hasta analizarlas por citometría de flujo (Epics® XL; Beckman Coulter, Inc.). Se analizaron 10.000 células intactas de S. pyogenes por muestra y los resultados se expresan como porcentaje de células marcadas e índice de fluorescencia. El índice de fluorescencia se calculó como el valor de fluorescencia medio obtenido después de marcar las células estreptocócicas con un suero inmune dividido entre el valor de fluorescencia obtenido para un suero de ratón de control. Un valor de fluorescencia de 1 indicaba que no había unión de anticuerpos en la superficie de las células estreptocócicas intactas.

Se analizaron los sueros recogidos de 8 ratones inmunizados con la proteína recombinante de S. pyogenes BVH-P7 marcada con His por citometría de flujo y los resultados se presentan en la tabla 4. Todos los sueros recogidos de ratones inmunizados con proteína BVH-P7 marcada con His purificada, contenían anticuerpos específicos de BVH-P7 que reconocían eficazmente sus correspondientes epítopos de superficie expuestos en la cepa de S. pyogenes (ATCC12384; serotipo M3) heteróloga ensayada. El índice de fluorescencia variaba de 10 a 18. Se determinó que más de 97% de las 10.000 células de S. pyogenes analizadas estaban marcadas con los anticuerpos presentes en los antisueros específicos de BVH-P7. Estos sueros también se juntaron y se hicieron reaccionar con las siguientes cepas de S. pyogenes: la cepa de S. pyogenes de serotipo M1 ATCC700294, la cepa de S. pyogenes de serotipo M3 y serotipo M18 ATCC12357 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD); los aislados clínicos de S. pyogenes de serotipo M6 SPY69 y de S. pyogenes M2 SPY68 los proporcionaron el Centre de recherche en infectiologie du Centre hospitalier de l'université Laval, Sainte-Foy. Los anticuerpos específicos para BVH-P7 presentes en la mezcla de sueros recogidos después de inmunización con la proteína recombinante BVH-P7 marcada con His se unieron a cada una de las superficies de bacterias de estas cepas estreptocócias con índice de fluorescencia entre 4 y hasta 9. Por el contrario, no se observó unión a las células estreptocócicas cuando se usaron mezclas de sueros recogidos de ratones no inmunizados o con simulación de inmunización. Estas observaciones demuestran claramente que la proteína BVH-P7 es accesible en la superficie donde puede ser reconocida fácilmente por anticuerpos. Se mostró que los anticuerpos anti-S. pyogenes tenían una función importante en la protección contra la infección por S. pyogenes.

TABLA 4 Evaluación de la unión de anticuerpos específicos de BVH-P7 a la superficie de células intactas de la cepa de S. pyogenes ATCC12384 (serotipo M3)

4

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Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra la protección contra la infección por S. pyogenes mortal inducida por inmunización pasiva de ratones con sueros hiperinmunes de conejo.

Se inyectaron a conejos de Nueva Zelanda (Charles River laboratories, St-Constant, Canadá) por vía subcutánea en múltiples sitios, 50 \mug y 100 \mug de la proteína recombinante BVH-P7 marcada con His que se produjo y purificó como se describe en el ejemplo 4 y se adsorbió en adyuvantes de Alhydrogel (Superfos Biosector a/s). Los conejos se inmunizaron 3 veces en intervalos de 3 semanas con la proteína recombinante BVH-P7 marcada con His Se recogieron muestras de sangre 3 semanas después de la tercera inyección. Los anticuerpos presentes en el suero se purificaron por precipitación usando disolución saturada de sulfato amónico al 40%. Se inyectaron por vía intravenosa a grupos de ratones CD-1 hembra (Charles River) 500 \mul de suero purificado recogido de los conejos inmunizados con la proteína recombinante BVH-P7 marcada con His, o de conejos inmunizados con una proteína recombinante de control no relacionada. Después de 18 horas los ratones se estimularon con aproximadamente 2x10^{7} UFC de la cepa de S. pyogenes de tipo 3 ATCC12384. Se cultivaron en placa muestras de inóculo de estimulación de S. pyogenes en placas de agar sangre para determinar las UFC y verificar la dosis de estimulación. Se registraron las muertes durante un periodo de 5 días.

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Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra la protección de ratones frente a la infección por S. pyogenes mortal inducida por inmunización con proteína recombinante BVH-P7 purificada.

Se inmunizaron grupos de 8 ratones Balb/c hembra (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) por vía subcutánea 3 veces en intervalos de 2 semanas con 20 \mug de una proteína recombinante BVH-P7 marcada con His purificada por afinidad, en presencia de 10 \mug de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá), o como control con adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogieron muestras de sangre del seno orbital los días 1, 14 y 28 antes de cada inmunización y 2 semanas (el día 42) después de la tercera inyección. Una semana después los ratones se estimularon con aproximadamente 3x10^{6} UFC de la cepa de S. pyogenes de tipo 3 ATCC12384. Se cultivaron en placa muestras de inóculo de estimulación de S. pyogenes en placas de agar sangre para determinar las UFC y verificar la dosis de estimulación. Se registraron las muertes durante un periodo de 7 días. Cuatro de 8 ratones inmunizados con proteína recombinante BVH-P7 purificada estaban protegidos frente a la estimulación letal, comparado con solo 12% (1/8) de los ratones que recibieron el adyuvante solo (Tabla 1).

TABLA 5 Capacidad de la proteína recombinante BVH-P7 para provocar la protección contra la cepa GAS ATCC12384 (Tipo 3)

5

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<110> Shire Biochem Inc.

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<120> Polipéptidos de Streptococcus pyogenes y fragmentos de ADN correspondientes

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<130> 74872-76

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<140> PCT/CA02/00207

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<141> 2002-02-21

\vskip0.400000\baselineskip

<150> USSN 60/269.840

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<151> 2001-02-21

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<160> 12

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<170> PatentIn versión 3.0

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<210> 1

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<211> 3027

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<212> ADN

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes ATCC700294

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<400> 1

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\hskip0,8cm

6

\hskip0,8cm

60

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<210> 2

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<211> 969

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<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes ATCC700294

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<400> 2

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\hskip0,8cm

7

\hskip0,8cm

8

\hskip0,8cm

9

\hskip0,8cm

10

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<210> 3

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<211> 951

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<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes Spy74

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

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\hskip0,8cm

11

\hskip0,8cm

12

\hskip0,8cm

13

\hskip0,8cm

14

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<210> 4

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<211> 970

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<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes Spy70

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<400> 4

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\hskip0,8cm

15

\hskip0,8cm

16

\hskip0,8cm

17

\hskip0,8cm

18

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 963

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<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes Spy69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\hskip0,8cm

19

\hskip0,8cm

20

\hskip0,8cm

21

\hskip0,8cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 971

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes Spy68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip0,8cm

23

\hskip0,8cm

24

\hskip0,8cm

25

\hskip0,8cm

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 971

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<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes Spy60

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

27

\hskip0,8cm

28

\hskip0,8cm

29

\hskip0,8cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 8

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<211> 969

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Cepa de Streptococcus pyogenes ATCC12357

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

31

\hskip0,8cm

32

\hskip0,8cm

33

\hskip0,8cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 29

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<212> ADN

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<213> Artificial/Desconocido

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(29)

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<223> cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtagtcaccc accatatgga agtttttag

\hfill

29

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial/Desconocido

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(28)

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<223> cebador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttttttcttt gcggccgcag ttattagt

\hfill

28

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

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<212> ADN

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<213> Artificial/Desconocido

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(22)

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<223> cebador

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<400> 11

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggggatccca cccacaatca gg

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Artificial/Desconocido

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1)..(28)

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<223> cebador

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggttgtcgac agtaaagcaa cgctagtg

\hfill

28

Claims

1. Un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, en el que se ha suprimido el péptido líder terminal de 21 restos de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y siendo el polipéptido aislado capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2.

2. Un polinucleótido aislado que consiste en (a) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de la reivindicación 1, o (b) una secuencia de nucleótidos que es complementaria del polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

3. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable y un polipéptido aislado, en la que el polipéptido aislado se elige de:

(a): un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(b): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(c): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(d): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(e): un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(f): un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, en el que se ha suprimido el resto metionina N-terminal, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2; y

(g): el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2.

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4. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable y un polipéptido aislado, en la que el polipéptido aislado se elige de:

(a): un polipéptido aislado que comprende un fragmento que consta de al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(b): un polipéptido aislado que comprende un fragmento que consta de al menos 15 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2; y

(c): un polipéptido aislado que comprende un fragmento que consta de al menos 20 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

en la que el polipéptido aislado es capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2.

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5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 o reivindicación 4, en la que el polipéptido aislado induce una respuesta inmune contra Streptococcus pyogenes.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en la que el polipéptido aislado se produce por un procedimiento que comprende cultivar una célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido, en el que la célula huésped es transfectada con un vector que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido, y en el que el polinucleótido está operativamente unido a una región de control de la expresión.

7. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, siendo la composición farmacéutica una vacuna.

8. Uso del polipéptido de la reivindicación 1 o la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 en la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la faringitis, erisipela, impétigo, escarlatina, bacteriemia, fascitis necrotizante o choque tóxico.

9. Uso del polipéptido de la reivindicación 1 o de la composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 3-7 en la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección estreptocócica en un huésped.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9 en el que la infección estreptocócica es una infección por Streptococcus pyogenes.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 o reivindicación 10 en el que el huésped es un mamífero.

12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 en el que el mamífero es un ser humano.

13. Un procedimiento in vitro para detectar estreptococos en una muestra biológica, que comprende:

(a): incubar (i) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, y (ii) una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene estreptococos, para formar una mezcla; y

(b): detectar el anticuerpo unido específicamente, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en la mezcla, indicando así la presencia de estreptococos.

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14. Un procedimiento in vitro para detectar un anticuerpo específico para estreptococos en una muestra biológica, que comprende:

(a): incubar (i) un polipéptido seleccionado de

(A): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(B): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 70% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(C): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(D): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(E): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(F): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, en el que se ha suprimido el resto de metionina N-terminal, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(G): el polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(H): un polipéptido que comprende un fragmento que consta de al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(I): un polipéptido que comprende un fragmento que consta de al menos 15 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2; y

(J): un polipéptido que comprende un fragmento que consta de al menos 20 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, y (ii) una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene estreptococos para formar una mezcla; y

(b): detectar el polipéptido o polipéptido quimérico específicamente unido en la mezcla, que indica la presencia de anticuerpo específico de estreptococo.

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15. El procedimiento de la reivindicación 13 o reivindicación 14, en el que el estreptococo es Streptococcus pyogenes.

16. Kit que comprende un polipéptido aislado elegido de

(f): un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, en el que se ha suprimido el resto de metionina N-terminal, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2; y

(g): el polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(h): un polipéptido aislado que comprende un fragmento que consta de al menos 10 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2;

(i): un polipéptido aislado que comprende un fragmento que consta de al menos 15 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2; y

(j): un polipéptido aislado que comprende un fragmento que consta de al menos 20 restos de aminoácidos contiguos de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, siendo el polipéptido capaz de producir un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID NO: 2, para detectar o diagnosticar la infección estreptocócica.