ES2316458T3 - Antigeno de streptococcus pyogenes. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16, en el que el polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes.
Description
Antígeno de Streptococcus pyogenes.
La presente invención se refiere a antígenos,
más particularmente a un polipéptido antígeno del agente patógeno
bacteriano Streptococcus pyogenes (también llamado
Estreptococo grupo A (GSA)) que puede ser útil para
profilaxis, diagnóstico y/o terapia de infección estreptocócica.
Los Estreptococos son bacterias gram (+)
que se diferencian mediante antígenos de carbohidratos específicos
de grupo A a O que se encuentran en la superficie celular. Los
aislados de Streptococcus pyogenes se distinguen
adicionalmente mediante antígenos de proteínas M específicas para
cada tipo. Las proteínas M son factores de virulencia importantes
que son altamente variables tanto en pesos moleculares como en
secuencias. Efectivamente, se han identificado más de 80 tipos de
proteínas M sobre la base de diferencias antigénicas.
El Streptococcus pyogenes es responsable
de muchos tipos de infecciones diversas, que incluyen faringitis,
erisipela e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales
como bacteremia y fascitis necrosante y también síndrome tóxico. Se
ha documentado un resurgimiento de la enfermedad invasiva en los
años recientes en muchos países, incluyendo los de América del
Norte y Europa. Aunque el organismo es sensible a los antibióticos,
la velocidad de ataque alta y la rápida aparición de sepsis dan como
resultado morbilidad y mortalidad altas.
Para desarrollar una vacuna que proteja a los
individuos de la infección de Streptococcus pyogenes, se han
concentrado esfuerzos sobre los factores de virulencia tales como
las proteínas M específicas para cada tipo. Sin embargo, se
encontró que la porción amino-terminal de las
proteínas M inducía anticuerpos de reacción cruzada que
reaccionaban con miocardio, tropomiosina, miosina y vimentina
humanas, que podían estar implicadas en enfermedades autoinmunes.
Otros han usado técnicas recombinantes para producir proteínas
híbridas complejas que contienen péptidos
amino-terminales de proteínas M de serotipos
diferentes. Sin embargo, una vacuna segura que contenga todos los
serotipos de Streptococcus pyogenes será altamente compleja
de producir y someter a normalización.
Además de los antígenos específicos a los
serotipos, otras proteínas de Streptococcus pyogenes han
generado interés como candidatos a vacunas potenciales. Se ha
puesto de manifiesto que la C5a peptidasa, que se expresa mediante
al menos 40 serotipos de Streptococcus pyogenes, era
inmunogénica en ratones, aunque su capacidad para reducir el nivel
de colonización nasofaríngea era limitada. Otros investigadores
también se han enfocado hacia exotoxinas pirogénicas
estreptocócicas que parece que desempeñan un papel importante en
patogénesis de infección. La inmunización con estas proteínas
prevenía los síntomas mortales del síndrome tóxico, aunque no
prevenía la colonización.
Queda por lo tanto una necesidad insatisfecha de
que los antígenos de Streptococcus pyogenes se puedan usar
como componentes de vacuna para profilaxis, diagnóstico y/o terapia
de infección de Estreptococos.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 70% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos 95% de identidad con un segundo polipéptido que
comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
En otros aspectos, se proporcionan nuevos
polipéptidos codificados por polinucleótidos de la invención,
vectores que comprenden polinucleótidos de la invención unidos
operativamente a una región reguladora de la expresión, así como
células hospedadoras transfectadas con dichos vectores,
composiciones farmacéuticas o de vacunas y procedimientos para
producir polipéptidos que comprenden cultivar dichas células
hospedadoras bajo condiciones adecuadas para la expresión.
La Figura 1 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 de cepa ATCC12384 de S. Pyogenes
serotipo 3 con una señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID
NO:1.
La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 de cepa ATCC12384 de S.
Pyogenes serotipo 3 con una señal de secreción en posición 1 a
25; SEQ ID NO:2.
La Figura 3 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 de cepa LSPQ2699(ATCC19615) de S.
Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID
NO:3.
La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 de cepa LSPQ2699(ATCC16915)
de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 25;
SEQ ID NO:4.
La Figura 5 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 de cepa SPY57 de S. Pyogenes con una
señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID NO:5.
La Figura 6 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 de cepa SPY57 de S. Pyogenes
con una señal de secreción en posición 1 a 25; SEQ ID NO:6.
La Figura 7 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 de cepa B514 de S. Pyogenes con una
señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID NO:7.
La Figura 8 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 de cepa B514 de S. Pyogenes
con una señal de secreción en posición 1 a 25; SEQ ID NO:8.
La Figura 9 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 sin señal de secreción de cepa ATCC12384 de
S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:9.
La Figura 10 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa
ATCC12384 de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:10.
La Figura 11 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 sin señal de secreción de cepa
LSPQ2699(ATCC19615) de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID
NO:11.
La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa
LSPQ2699(ATCC19615) de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID
NO:12.
La Figura 13 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 sin señal de secreción de cepa SPY57 de S.
Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:13.
La Figura 14 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa SPY57
S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:14.
La Figura 15 es la secuencia de ADN del gen
BVH-P1 sin señal de secreción de cepa B514 de S.
Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:15.
La Figura 16 es la secuencia de aminoácidos de
proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa B514
de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:16.
La Figura 17 representa la comparación de las
secuencias de nucleótidos de los genes BVH-P1 de
cepas
ATCC12384, LSPQ2699(ATCC19615), SPY57, B514, ATCC 70029 (Oklahoma) y T28/51/4 (UO9352) de S. Pyogenes usando el programa informático de análisis de secuencia Clustal W de MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación hay una línea de consenso. Los nucleótidos sombreados son idénticos entre las secuencias y los espacios de separación en la secuencia introducida mediante alineación se indican mediante guiones.
ATCC12384, LSPQ2699(ATCC19615), SPY57, B514, ATCC 70029 (Oklahoma) y T28/51/4 (UO9352) de S. Pyogenes usando el programa informático de análisis de secuencia Clustal W de MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación hay una línea de consenso. Los nucleótidos sombreados son idénticos entre las secuencias y los espacios de separación en la secuencia introducida mediante alineación se indican mediante guiones.
La Figura 18 representa la comparación de las
secuencias de aminoácidos pronosticadas de los marcos de lectura
abierta de BVH-P1 de cepas ATCC12384,
LSPQ2699(ATCC19615), SPY57, B514, ATCC 70029 (Oklahoma) y
T28/51/4 (UO9352) de S. Pyogenes usando el programa
informático de análisis de secuencia Clustal W de MacVector (versión
6.5). Por debajo de la alineación hay una línea de consenso. Los
restos aminoácido sombreados son idénticos entre las secuencias y
los espacios de separación en la secuencia introducida mediante
alineación se indican mediante guiones.
La Figura 19 es la secuencia de ADN de un gen de
S. pneumonia; SEQ ID NO:17.
La Figura 20 es la secuencia de aminoácidos de
una proteína de S. pneumonia; SEQ ID NO:18.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido
que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la
misma.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido
que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8,
10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la
misma.
Según un aspecto, la presente invención se
refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de
aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20
ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
Según un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión para
un polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs:
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de
la misma.
En conformidad con la presente invención, se
proporciona, una secuencia de nucleótidos de consenso que se
representa en la Figura 17. Como se puede ver mediante la
alineación, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la
invención está bien conservado. Sin restringir el alcance de la
invención, la siguiente tabla 1 muestra las posibles modificaciones.
SEQ ID NO: 19 cubre la secuencia de nucleótidos de consenso que se
representa en la Figura 17 con las modificaciones que se ilustran en
la Tabla 1:
\newpage
(Continuación)
\newpage
En conformidad con la presente invención, se
proporciona una secuencia de aminoácidos de consenso que se
representa en la Figura 18. Como se puede ver mediante la
alineación, el polipéptido de la invención está bien conservado. Sin
restringir el alcance de la invención, la siguiente tabla 2 muestra
las posibles modificaciones. SEQ ID NO: 20 cubre la secuencia de
nucleótidos de consenso que se representa en la Figura 18 con las
modificaciones que se ilustran en la Tabla 2:
\newpage
(Continuación)
En conformidad con la presente invención, todos
los polinucleótidos que codifican polipéptidos están dentro del
alcance de la presente invención.
En una realización adicional, los polipéptidos
en conformidad con la presente invención son antigénicos.
En una realización adicional, los polipéptidos
en conformidad con la presente invención son inmunogénicos.
En una realización adicional, los polipéptidos
en conformidad con la presente invención pueden suscitar una
respuesta inmunitaria en un individuo.
En una realización adicional, la presente
invención también se refiere a polipéptidos que pueden generar
anticuerpos que tienen especificidad de unión con los polipéptidos
de la presente invención según se han definido anteriormente.
Un anticuerpo que "tiene especificidad de
unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido
seleccionado pero que sustancialmente no reconoce ni se une a otras
moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica. La
unión específica se puede medir usando un análisis ELISA en el que
el polipéptido seleccionado se usa como antígeno.
En conformidad con la presente invención, se
define "protección" en los estudios biológicos mediante un
aumento significativo en la curva, tasa o período de supervivencia.
El análisis estadístico que usa la prueba
log-intervalo para comparar las curvas de
supervivencia, y la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas
de supervivencia y el número de días hasta la muerte,
respectivamente, podrían ser útiles para calcular los valores de P y
determinar si la diferencia entre los dos grupos es
estadísticamente significativa. Valores de P de 0,05 se consideran
no significativos.
Según se usan en este documento,
"fragmentos", "análogos" o "derivados" de los
polipéptidos de la invención incluyen aquellos polipéptidos en los
que uno o más de los restos se sustituyen con un resto aminoácido
conservado o no conservado (preferiblemente conservado) y que
pueden ser naturales o no naturales. En una realización, derivados
y análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente
70% de identidad con las secuencias que se ilustran en las figuras
o fragmentos de las mismas. Esto es, 70% de los restos son iguales.
En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 75%
de homología. En una realización adicional, los polipéptidos
tendrán más de 80% de homología. En una realización adicional, los
polipéptidos tendrán más de 85% de homología. En una realización
adicional, los polipéptidos tendrán más de 90% de homología. En una
realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 95% de
homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán
más de 99% de homología. En una realización adicional, los derivados
y análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de
aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o supresiones de
aminoácidos y más preferiblemente menos de 10. Sustituciones
preferidas son las que se conocen en la técnica como conservadas,
es decir los restos que sustituidos comparten propiedades físicas o
químicas tales como hidrofobia, tamaño, carga, o grupos
funcionales.
Una persona experta apreciará que fragmentos,
análogos o derivados de las proteínas o polipéptidos de la invención
también encontrarán uso en el contexto de la presente invención, es
decir, como material antigénico/inmunogénico. Así, por ejemplo
proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones,
supresiones, sustituciones o similares están abarcados por la
presente invención. Además, puede que sea posible sustituir un
aminoácido con otro de "tipo" similar. Por ejemplo, sustituir
un aminoácido hidrófobo con otro aminoácido hidrófobo.
Se puede usar un programa tal como el programa
CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa
compara secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima
insertando espacios en una u otra secuencia según sea apropiado. Es
posible calcular identidad o similitud de aminoácidos (identidad más
conservación de tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un
programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias
similares y asignará un valor al ajuste. Es así posible obtener una
comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud,
teniendo cada una diferente puntuación. En la presente invención se
contemplan ambos tipos de análisis de identidad.
En una aproximación alternativa, los análogos o
derivados podrían ser proteínas de fusión, que incorporen restos
que hagan más fácil la purificación, por ejemplo agregando una
etiqueta eficazmente a la proteína o polipéptido deseado, puede ser
necesario retirar la "etiqueta" o puede ser el caso que la
propia proteína de fusión retenga suficiente propiedad antigénica
para que sea útil.
En un aspecto adicional de la invención se
proporcionan fragmentos antigénicos/inmunogénicos de las proteínas o
polipéptidos de la invención, o de análogos o derivados de las
mismas.
Los fragmentos de la presente invención deberían
incluir una o más regiones epitópicas o ser suficientemente
similares a regiones de este tipo para retener sus propiedades
antigénicas/inmunogénicas. Así, para fragmentos según la presente
invención el grado de identidad quizás sea irrelevante, puesto que
pueden ser 100% idénticas a una parte particular de una proteína o
polipéptido, homólogo o derivado según se describe en este
documento. La cuestión clave, una vez más, es que el fragmento
retenga las propiedades antigénicas/inmunogénicas.
Así, lo que es importante para análogos,
derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de la
propiedad antigénica/inmunogénica de la proteína o polipéptido de la
que se derivan.
También se incluyen polipéptidos que han
fusionado a ellos otros compuestos que alteran las propiedades
biológicas o farmacológicas de polipéptidos, es decir
polietilenglicol (PEG) para aumentar el período de
semidescomposición; secuencias líder o secretoras de aminoácidos
para facilidad de purificación; secuencias prepro- y pro-; y
(poli)sacáridos.
Adicionalmente, en aquellas situaciones en que
se encuentra que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede
ser deseable variar uno o más aminoácidos particulares para imitar
más eficazmente los diferentes epítopos de las diferentes cepas de
estreptococos.
Asimismo, los polipéptidos de la presente
invención pueden ser modificados mediante acilación
NH_{2}-terminal (por ejemplo, mediante
acetilación, o amidación con ácido tioglicólico, amidación
carboxiterminal, por ejemplo con amoníaco o metilamina) para
proporcionar estabilidad, aumento de hidrofobia para unión o enlace
a un soporte u otra molécula.
También se contemplan hétero y homo multímeros
de polipéptidos de los fragmentos, análogos y derivados de
polipéptidos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o
más polipéptidos que han sido reticulados con agentes de
reticulación tales como avidina/biotina, glutaraldehído o
dimetilsuperimidato. Formas poliméricas de este tipo también
incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias invertidas
en tándem o invertidas, producidas a partir de ARNm
multicistrónicos generados mediante tecnología de ADN
recombinante.
Preferiblemente, un fragmento, análogo o
derivado de un polipéptido comprenderá al menos una región
antigénica es decir al menos un epítopo.
A fin de lograr la formación de polímeros
antigénicos (es decir multímeros sintéticos), se pueden utilizar
polipéptidos que tienen grupos bishaloacetilo, nitroarilhaluros, o
similares, en los que los reactivos son específicos para grupos
tío. Por lo tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los
diferentes péptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar
compuesta de un grupo de unión de al menos dos, típicamente al menos
cuatro, y no más de 16, pero habitualmente no más de
aproximadamente 14 átomos de carbono.
En una realización particular, fragmentos,
análogos y derivados de polipéptidos de la invención no contienen
ningún resto metionina (Met) de comienzo. Preferiblemente, los
polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora
(secuencia señal). La porción señal de un polipéptido de la
invención se puede determinar según técnicas establecidas de
biología molecular. En general, el polipéptido de interés puede ser
aislado a partir de un cultivo estreptocócico y secuenciado
posteriormente para determinar el resto inicial de la proteína
madura y por lo tanto la secuencia del polipéptido maduro.
Según otro aspecto, se proporcionan
composiciones de vacunas que comprenden uno o más polipéptidos
estreptocócicos de la invención en mezcla con un vehículo,
diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Adyuvantes
adecuados incluyen aceites, es decir adyuvante completo o
incompleto de Freund; sales, es decir
AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2},
AlNH_{4}(SO_{4})_{2}, sílice, caolín,
polinucleótidos de carbono es decir poli IC y poli AU. Adyuvantes
preferidos incluyen QuilA y Alhydrogel. Las vacunas de la invención
se pueden administrar parenteralmente mediante inyección, infusión
rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral.
Vehículos farmacéuticamente aceptables también incluyen toxoide de
tétanos.
El término vacuna también significa que incluye
anticuerpos. En conformidad con la presente invención, también se
proporciona el uso de uno o más anticuerpos que tienen especificidad
de unión para los polipéptidos de la presente invención respecto al
tratamiento o profilaxis de infección de estreptococos y/o
enfermedades y síntomas intermediados por infección de
estreptococos.
Se usan composiciones de vacunas de la invención
para el tratamiento o profilaxis de infección estreptocócica y/o
enfermedades y síntomas intermediados por infección estreptocócica
según se describen en P. R. Murray (ed, ejecutivo), E. J. Baron, M.
A. Pfaller, F. C. Tenover y R. H. Yolken. Manual of Clinical
Microbiology, ASM Press, Washington, D. C. sexta edición, 1995,
1482p que se incorpora a este documento por referencia. En una
realización, se usan composiciones de vacunas de la presente
invención para la profilaxis o tratamiento de faringitis,
erisipelas e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales
como bacteremia y fascitis necrosante y también síndrome tóxico. En
una realización, se usan composiciones de vacunas de la presente
invención para la profilaxis o tratamiento de infección de
estreptococos y/o enfermedades y síntomas intermediados por
infección de estreptococos, en particular
estreptococos de grupo A (pyogenes), estreptococos de
grupo B (GBS o agalactiae), S. pneumoniae, dysgalactiae, uberis,
nocardia así como Staphylococcus aureus. En una
realización adicional, la infección de estreptococos es de
Streptococcus pyogenes.
En una realización particular, se administran
vacunas a los individuos en riesgo de infección de estreptococos
tales como niños, ancianos e individuos con pocas defensas
inmunitarias.
Según se usa en la presente solicitud, el
término "individuos" incluye mamíferos. En una realización
adicional, el mamífero es un ser humano.
Las composiciones de vacunas están
preferiblemente en forma farmacéutica unitaria de aproximadamente
0,001 a 100 \mug/kg (antígeno/peso corporal) y más preferiblemente
0,01 a 10 \mug/kg y lo más preferiblemente 0,1 a 1 \mug/kg 1 a 3
veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas de intervalo
entre inmunizaciones.
Las composiciones de vacunas están
preferiblemente en forma farmacéutica unitaria de aproximadamente
0,1 \mug a 10 mg y más preferiblemente \mug a 1 mg y lo más
preferiblemente 10 a 100 \mug 1 a 3 veces con un intervalo de
aproximadamente 1 a 6 semanas de intervalo entre inmunizaciones.
Según otro aspecto, se proporcionan
polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por la
secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10,
12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de las mismas.
En una realización, los polinucleótidos son los
que se ilustran en SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 que
pueden incluir marcos de lectura abierta (ORF), que codifican
polipéptidos de la invención.
Se apreciará que las secuencias de
polinucleótidos que se ilustran en las figuras pueden ser alteradas
con codones degenerados que todavía codifican los polipéptidos de
la invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona
adicionalmente polinucleótidos que hibridan con las secuencias de
polinucleótidos anteriormente descritas en este documento (o las
secuencias complementarias de los mismos) que tienen 50% de
identidad entre secuencias. En una realización, al menos 70% de
identidad entre secuencias. En una realización, al menos 75% de
identidad entre secuencias. En una realización, al menos 80% de
identidad entre secuencias. En una realización, al menos 85% de
identidad entre secuencias. En una realización, al menos 90% de
identidad entre secuencias. En una realización adicional, se pueden
hibridar polinucleótidos bajo estrictas condiciones, es decir
teniendo al menos 95% de identidad. En una realización adicional,
más del 97% de identidad.
Se pueden determinar fácilmente condiciones
estrictas adecuadas para hibridación por un experto en la técnica
(véanse por ejemplo Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N. Y.; Current
Protocols in Molecular Biology, (1989) Editado por Ausubel F. M. y
col., John Wiley & Sons, Inc., N. Y.).
En una realización adicional, la presente
invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo
condiciones estrictas indistintamente con
- (a)
- una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
- (b)
- el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos o análogos de la misma.
En una realización adicional, la presente
invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo
condiciones estrictas indistintamente con
- (a)
- una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
- (b)
- el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende al menos 10 restos aminoácido contiguos de un polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos o análogos de la misma.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son aquellos que codifican polipéptidos de la
invención que se ilustran en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
20.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son aquellos que se ilustran en SEQ ID NOs: 1, 3, 5,
7, 9, 11, 13, 15, 19 que codifican polipéptidos de la invención.
Como se apreciará fácilmente por un experto en
la técnica, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.
La presente invención también incluye
polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos que se
describen en la presente solicitud.
En un aspecto adicional, los polinucleótidos que
codifican polipéptidos de la invención ó fragmentos, análogos o
derivados de los mismos, se pueden usar en un procedimiento de
inmunización de ADN. Esto es, se pueden incorporar en un vector que
es replicable y expresable tras inyección produciendo de este modo
el polipéptido antigénico en vivo. Por ejemplo se pueden incorporar
polinucleótidos en un vector plásmido bajo el control del promotor
de CMV que es funcional en células eucariotas. Preferiblemente el
vector se inyecta intramuscularmente.
Según otro aspecto, se proporciona un
procedimiento para producir polipéptidos de la invención mediante
técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica
dicho polipéptido en una célula hospedadora y recuperando el
producto de polipéptido expresado. Alternativamente, los
polipéptidos se pueden producir según técnicas químicas sintéticas
establecidas, es decir síntesis en fase solución o fase sólida de
oligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido entero
(ligación de bloques).
Se describen procedimientos generales para
obtención y evaluación de polinucleótidos y polipéptidos en las
siguientes referencias: Sambrook y col., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Current
Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel F. M. y col.,
John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; PCR Cloning Protocols, from
Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White B. A.
Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1997, 490 páginas; Protein
Purification, Principles and Practices, Scopes R. K.,
Springer-Verlag, Nueva York, 3rd Edition, 1993, 380
páginas; Current Protocols in Immunology, Editado por Coligan J. E.
y col., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York que se incorporan a
este documento por referencia.
Para producción recombinante, se transfectan
células hospedadoras con vectores que codifican el polipéptido, y
luego se cultivan en un medio nutriente modificado según sea
apropiado para activar los promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los genes. Son vectores adecuados aquellos que son
viables y replicables en el hospedador elegido e incluyen
secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético por
ejemplo plásmidos bacterianos, ADN fago, baculovirus, plásmidos de
levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN
fago. La secuencia de polipéptidos se puede incorporar en el vector
en el sitio apropiado usando enzimas de restricción tales que se
una operativamente a una región reguladora de la expresión que
comprende un promotor, sitio de unión de ribosoma (región de
consenso o secuencia de Shine-Dalgamo), y
opcionalmente un operador (elemento de control). Se pueden
seleccionar componentes individuales de la región reguladora de la
expresión que sean apropiados para uno hospedador y un vector dados
según principios de biología molecular establecidos (Sambrook y
col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring
Harbor, N. Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology,
Editado por Ausubel F. M. y col., John Wiley and Sons, Inc., Nueva
York que se incorporan a este documento por referencia). Promotores
adecuados incluyen, pero no se limitan, promotor de LTR o SV40,
promotores de E. coli lac, tac o trp y el promotor de fago
lambda P_{L}. Los vectores incorporarán preferiblemente un origen
de replicación así como marcadores de selección es decir gen de
resistencia a ampicilina. Vectores bacterianos adecuados incluyen
pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10phagescript,
psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A,
ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540,
pRIT5 y vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44,
pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células hospedadoras pueden
ser bacterianas es decir E. coli, Bacillus subtilis,
Streptomyces; fúngicas es decir Aspegillus niger, Aspergillus
nidulins; levaduras es decir Saccharomyces o eucariotas
es decir CHO, COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo,
las células se recolectan típicamente mediante centrifugación,
luego se desintegran por medios físicos o químicos (si el
polipéptido expresado no se segrega al medio) y se retiene el
extracto bruto resultante para aislar el polipéptido de interés. La
purificación del polipéptido del medio de cultivo o lisato se puede
conseguir mediante técnicas establecidas que dependen de las
propiedades del polipéptido es decir usando precipitación con
sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de
intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de
hidroxilapatito y cromatografía de lectinas. La purificación final
se puede conseguir usando HPLC.
El polipéptido se puede expresar con o sin
secuencia líder o de secreción. En el primer caso el líder se puede
retirar usando procesado de post-traducción (véase
US 4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397 que se incorporan a este
documento por referencia) o se puede retirar químicamente tras
purificar el polipéptido expresado.
Según un aspecto adicional, los polipéptidos
estreptocócicos de la invención se pueden usar en una prueba de
diagnóstico respecto a infección de estreptococos, en particular
infección de Streptococcus pyogenes.
Son posibles varios métodos de diagnóstico, por
ejemplo para detectar un organismo de estreptococos en una muestra
biológica, se puede seguir el siguiente procedimiento:
- a)
- obtener una muestra biológica de un individuo;
- b)
- incubar un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con un polipéptido de estreptococo de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y
- c)
- detectar anticuerpo unido o fragmento unido específicamente en la mezcla que indica la presencia de estreptococos.
Alternativamente, un método para la detección de
anticuerpo específico a un antígeno de estreptococo en una muestra
biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo
se puede realizar como sigue:
- a)
- obtener una muestra biológica de un individuo;
- b)
- incubar uno o más polipéptidos de estreptococo de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica para formar una mezcla; y
- c)
- detectar antígeno unido o fragmento unido específicamente en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo específico a estreptococos.
Un experto en la técnica reconocerá que esta
prueba de diagnóstico puede adoptar varias formas, que incluyen una
prueba inmunológica tal como un análisis con sustancias
inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), un radioinmunoanálisis
o un análisis de aglutinación de látex, esencialmente para
determinar si hay presentes en un individuo anticuerpos específicos
para la proteína.
Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos
de la invención también se pueden usar para designar sondas de ADN
para uso en la detección de la presencia de estreptococos en una
muestra biológica de la que se sospecha que contiene bacterias de
este tipo. El método de detección de esta invención comprende:
- a)
- obtener la muestra biológica de un individuo;
- b)
- incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y
- c)
- detectar la sonda de ADN unida específicamente en la mezcla que indica la presencia de bacterias de estreptococos.
Las sondas de ADN de esta invención también se
pueden usar para detectar estreptococos en circulación, es decir
ácidos nucleicos de Streptococcus pyogenes en una muestra,
por ejemplo usando una reacción en cadena de polimerasa, como
método para diagnosticar infecciones de estreptococos. La sonda
puede ser sintetizada usando técnicas convencionales y puede ser
inmovilizada sobre una fase sólida, o puede ser etiquetada con una
etiqueta detectable. Una sonda de ADN preferida para esta solicitud
es un oligómero que tiene una secuencia complementaria al menos con
aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de
Streptoccus pyogenes de la invención.
Otro método de diagnóstico para la detección de
estreptococos en un individuo comprende:
- a)
- etiquetar un anticuerpo que reacciona con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con una etiqueta detectable;
- b)
- administrar el anticuerpo etiquetado o el fragmento etiquetado al paciente; y
- c)
- detectar el anticuerpo etiquetado o el fragmento etiquetado unido específicamente en el paciente que indica la presencia de estreptococos.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de polipéptidos de estreptococos de la invención como inmunógenos
para la producción de anticuerpos específicos para la diagnosis y en
particular el tratamiento de infección de estreptococos. Se pueden
determinar anticuerpos adecuados usando métodos de selección
apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo
particular para proteger pasivamente contra la infección de
estreptococos en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo
animal es el modelo de ratón que se describe en los ejemplos de
este documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un
fragmento del mismo que se une a un antígeno y puede pertenecer a
cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede
ser de origen animal, específicamente de origen de mamífero y más
específicamente de origen murino, de rata o de ser humano. Puede
ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo o, si se desea,
un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión
anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa
anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando
técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de
anticuerpo pueden ser policlonales, o preferiblemente monoclonales.
Puede ser específico para un cierto número de epítopos asociados con
los polipéptidos de Streptococcus pyogenes pero es
preferiblemente específico para uno.
Un aspecto adicional de la invención es el uso
de los anticuerpos dirigidos a los polipéptidos de estreptococos de
la invención para inmunización pasiva. Se podrían usar los
anticuerpos descritos en la presente solicitud. Se pueden
determinar anticuerpos adecuados usando métodos de selección
apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo
particular para proteger pasivamente contra la infección de
estreptococos en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo
animal es el modelo de ratón que se describe en los ejemplos de
este documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un
fragmento del mismo que se une a un antígeno y puede pertenecer a
cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede
ser de origen animal, específicamente de origen de mamífero y más
específicamente de origen murino, de rata o de ser humano. Puede
ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo o, si se desea,
un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión
anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa
anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando
técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de
anticuerpo pueden ser policlonales, o preferiblemente monoclonales.
Puede ser específico para un cierto número de epítopos asociados con
los polipéptidos de Streptococcus pneumoniae pero es
preferiblemente específico para uno.
Salvo que se defina otra cosa, todas las
expresiones técnicas y científicas que se usan en este documento
tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un
experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta
invención.
Este ejemplo ilustra la clonación de gen de
S. pyogenes.
La región de codificación de gen
BVH-P1 de S. pyogenes (SEQ ID NO:1) se
amplificó mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400
Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de cepa
ATCC12384 S. pyogenes serotipo 3 usando los siguientes
oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición
se sitios de restricción NcoI(CCATGG) y XhoI
(CTCGAG): DMAR16
(5'-CAGGCCATGGAGTG-GA
CACCACGATCGGTTAC-3'); DMAR17 (5'-GCCGCTCGAGAGCATTAAAG-GAGACATGAACATGATC-3'). Se purificaron los productos de PCR de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se sometieron a digestión con NcoI y XhoI (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET-21d(+) (Novagen, Madison, WI) se sometió a digestión con NcoI y XhoI y se purificó de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR de NcoI y XhoI se ligaron al vector de expresión de NcoI y XhoI pET-21d(+). Los productos ligados se transformaron en cepa de E. coli cepa de E. coli DH5\alpha [\phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{k}-m_{k}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó gen recombinante BVH-P1 24 que contenía pET-21d(+)plásmido (rpET21d(+)) usando un kit de plásmido QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA).
CACCACGATCGGTTAC-3'); DMAR17 (5'-GCCGCTCGAGAGCATTAAAG-GAGACATGAACATGATC-3'). Se purificaron los productos de PCR de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se sometieron a digestión con NcoI y XhoI (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET-21d(+) (Novagen, Madison, WI) se sometió a digestión con NcoI y XhoI y se purificó de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR de NcoI y XhoI se ligaron al vector de expresión de NcoI y XhoI pET-21d(+). Los productos ligados se transformaron en cepa de E. coli cepa de E. coli DH5\alpha [\phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{k}-m_{k}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó gen recombinante BVH-P1 24 que contenía pET-21d(+)plásmido (rpET21d(+)) usando un kit de plásmido QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA).
Se determinó que el marco de lectura abierta
(ORF) que codifica para BVH-P1 contiene
1170-pb y codifica un polipéptido de 389 restos
aminoácido con un pl pronosticado de 4,37 y una masa molecular
pronosticada de 41054 Da.
El análisis de la secuencia pronosticada de
restos aminoácido (SEQ ID NO:2) usando el programa informático
Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer
Group) sugirió la existencia de un péptido señal de 25 restos
aminoácido (MIITKKSLFVTSVALSLAPLATAQA), que termina con un sitio de
desdoblamiento situado entre un resto alanina y uno glutamina. El
análisis de este ORF no reveló la presencia de estructuras
repetitivas, motivo de anclaje de pared celular (LPXTG), ni motivo
de unión a IgA (MLKKIE).
Un ORF que comparte 62% con el gen
BVH-P1 de S. pyogenes se presentó
inicialmente en la solicitud de patente PCT/CA99/00114 que
describía antígenos de estreptococos de Grupo B. También se encontró
que el gen BVH-P1 compartía homología (62%
de identidad) con un ORF presente en el genoma de S.
pneumoniae (The Institute for Genomic Research).
Este ejemplo describe la amplificación de PCR y
secuenciación de gen BVH-P1 a partir de otras
cepas de S. pyogenes y la evaluación del nivel de
conservación molecular de este gen.
Se proporcionó LPSQ2296(ATCC 19615) de
S. pyogenes de serogrupo A de Lancefield por el laboratorio
de la Sanidad Pública de Quebec,
Saint-Anne-de-Bellevue;
se proporcionó aislado clínico SPY57 de S. pyogenes serotipo
1 por el centro de investigación en infecciología del centro
hospitalario de la Universidad Laval, Sainte-Foy; y
se proporcionó cepa B514 de S. pyogenes que fue inicialmente
aislada a partir de ratón por Susan Hollingshead, de la Universidad
de Alabama, Birmingham. Las respectivas regiones de codificación de
gen BVH-P1 de S. pyogenes a partir de cepas
ATCC 12384 (SEQ ID NO:1), LSPQ2699(ATCC19615) (SEQ ID NO:3),
SPY57 (SEQ ID NO:5), y B514 (SEQ ID NO:7) se amplificaron mediante
PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, San
Jose, CA) a partir de lisatos de células bacterianas usando los
siguientes oligonucleótidos DMAR69
(5'-CTGGGAAGATTATCTAGCACATTAATAC-3');
DMAR72
5'-CATAACGTTAAAACTGTCTAAAGGG-3'). Se
purificaron productos de PCR de gel de agarosa usando un kit de
extracción de gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del
fabricante (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (Taq
Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA).
Las secuencias de aminoácidos pronosticadas de cepas ATCC 12384
(SEQ ID NO:2), LSPQ2699(ATCC19615) (SEQ ID NO:4), SPY57 (SEQ
ID NO:6), y B514 (SEQ ID NO:8) se presentaron respectivamente en las
siguientes figuras 2, 4, 6, y 8.
Las figuras 17 y 18 representan respectivamente
el nucleótido de consenso y secuencias de aminoácido pronosticadas
que se establecen para BVH-P1 de S. pyogenes.
Además de las secuencias presentadas con este documento, también se
incluyeron las secuencias de gen BVH-P1 del proyecto
de secuenciación de genoma en la Universidad de Oklahoma (cepa ATCC
70029 de S. pyogenes serotipo M1:
http://dnal.chem.ou.edu/strep.html) y de (Kil y col., 1994. Infect.
Immun. 62: 2440-2449: número de acceso al banco de
genes U09352). No se describió por Kil y col., ninguna función ni
rol en el patogénesis de las bacterias ni protección contra
infección para la secuencia con número de acceso al banco de genes
U09352. Se puso de manifiesto que esta última secuencia presentada
por Kil y col., estaba colocada corriente arriba de un antígeno de
S. pyogenes de reacción cruzada con miosina de 67 kDa.
La comparación por parejas de secuencias de
proteínas BVH-P1 pronosticadas reveló entre 95 y
100% de identidad con la excepción de la secuencia de la secuencia
de BVH-P1 obtenida del banco de genes bajo el número
de acceso U09352. La comparación por parejas de esta secuencia
particular con las otras cinco secuencias de BVH-P1
indicó identidad entre 87 y 91%. Esta homología más baja se puede
explicar por la presencia de dos regiones (119-124
y 262-281) que son comparativamente más divergentes
que otras secuencias de gen BVH-P1. Además de estas
dos regiones en la secuencia de BVH-P1 obtenida del
banco de genes bajo el número de acceso U09352, los genes
BVH-P1 mostraron gran similitud en organización
global.
Este ejemplo ilustra la clonación de proteína de
gen de S. pyogenes en un CMV plásmido
pCMV-GH.
La región de una proteína de S. pyogenes
que codifica ADN se insertó en fase corriente abajo de un gen de
hormona del crecimiento humano (hGH) que estaba bajo control de
transcripción del promotor de citomegalovirus (CMV) en el vector
plásmido pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992,
356:152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en células
de E. coli pero es activo tras administración del plásmido en
células eucariotas. El vector también incorporaba el gen de
resistencia a ampicilina.
La región codificadora de gen
BVH-P1 (SEQ ID NO:9) sin su región de péptido líder
se amplificó mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System
2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de cepa
ATCC12384 S. pyogenes serotipo 3 usando los siguientes
oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición
se sitios de restricción BamHI (GGATCC) y SalI
(GTCGAC): DMAR24 (5'-TACCCGGATCCCCAA
GAGTG-GACACCACGATCGG-3'); DMAR25 (5'-GCGCTCGTCGACGCGTATCTCAGC-CTCTTATAGGGC-3'). El producto de PCR se purificó de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), se sometió a digestión con enzimas de restricción (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas) se sometió a digestión con BamHI y SalI y se purificó de gel de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN BamHI y SalI se ligaron al vector BamHI-SalI pCMV-GH para crear la proteína de fusión hGH-BVH-P1 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados fueron transformados en la cepa de E. coli DH5\alpha [\phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{k}-m_{k}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó el plásmido recombinante pCMV usando un kit de plásmido QIAgen (Chatsworth, CA) y se verificó la secuencia de nucleótidos de la inserción de ADN mediante secuenciación de ADN.
GAGTG-GACACCACGATCGG-3'); DMAR25 (5'-GCGCTCGTCGACGCGTATCTCAGC-CTCTTATAGGGC-3'). El producto de PCR se purificó de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), se sometió a digestión con enzimas de restricción (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas) se sometió a digestión con BamHI y SalI y se purificó de gel de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN BamHI y SalI se ligaron al vector BamHI-SalI pCMV-GH para crear la proteína de fusión hGH-BVH-P1 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados fueron transformados en la cepa de E. coli DH5\alpha [\phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{k}-m_{k}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó el plásmido recombinante pCMV usando un kit de plásmido QIAgen (Chatsworth, CA) y se verificó la secuencia de nucleótidos de la inserción de ADN mediante secuenciación de ADN.
Este ejemplo ilustra el uso de ADN para suscitar
una respuesta inmunitaria a antígenos de S. pyogenes.
Un grupo de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles
River, St-Constant, Quebec, Canadá) fue inmunizado
mediante inyección intramuscular de 100 \mul tres veces a
intervalos de dos o tres semanas con 50 \mug de
pCMV-GH recombinante que codifica gen
BVH-P1 en presencia de factor estimulador de
colonias granulocito-macrófago
((GM-CSF) que expresa plásmido
pCMV-GH-GM-CSF
(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry,
The University of Texas, Dallas, Texas). Como control, un grupo de
ratones fue inyectado con 50 \mug de
pCMV-GH-GM-CSF. Se
recogieron muestras de sangre de seno orbital antes de cada
inmunización y siete días después de la tercera inyección y se
determinaron las respuestas de anticuerpos séricos mediante ELISA
usando BVH-P1-His\cdotTag
purificada de proteína recombinante de S. pyogenes SEQ ID
NO:11 como antígeno de revestimiento.
Este ejemplo ilustra la producción y
purificación de proteína recombinante BVH-P1 de
S. pyogenes.
De usó el plásmido recombinante
pET-21d(+) con gen BVH-P1
correspondiente a la SEQ ID NO:9 para transformar mediante
electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD
Labs, Mississauga, Canadá) cepa BL21 (DE3) de E. coli
(F^{-}ompT hsdS_{B} (r ^{-}_{B}m^{-}_{B})gal dcm
(DE3)) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli el
promotor T7 que controla la expresión de la proteína recombinante es
reconocido específicamente por la T7 ARN polimerasa (presente en el
profago \lambdaDE3) cuyo gen está bajo el control del promotor
lac que es inducible por
isopropil-\beta-d-tiogalactopiranósido
(IPTG). Se hizo crecer el transformante BL21(DE3)/rpET a
37ºC con agitación a 250 rpm en caldo de cultivo LB (peptona 10
g/l), extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contenía 100
\mug de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd.,
Oakville, Canadá) por ml hasta que la A_{600} alcanzó un valor de
0,6. A fin de inducir la producción de proteína recombinante
BVH-P1-His\cdotTag de S.
pyogenes (de SEQ ID NO:10), las células se incubaron durante 3
horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración final de
1 mM. Las células inducidas de un cultivo de 500 ml se precipitaron
mediante centrifugación y se congelaron a -70ºC.
La purificación de las proteínas recombinantes
de la fracción citoplasmática soluble de BL21(DE3)/rpET21b(+)
inducida por IPTG se hizo mediante cromatografía de afinidad basada
en las propiedades de la secuencia His\cdotTag (6 restos
histidina consecutivos) de unirse a cationes divalentes (Ni^{2+})
inmovilizados sobre la resina de quelación metálica His\cdotBind.
En resumen, las células precipitadas que se obtuvieron de un cultivo
de 500 ml inducido con IPTG fueron resuspendidas en tampón de lisis
(Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contenía PMSF
1 mM, sonicadas y centrifugadas a 12.000 X g durante 20 min para
retirar detritus. El material sobrenadante se depositó sobre una
columna agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga,
Ontario, Canadá). La proteína recombinante
BVH-P1-His\cdotTag de S.
pyogenes (de SEQ ID NO:10) se eluyó con imidazol 250
mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM pH 7,9.
La retirada de la sal y el imidazol de la muestra se hizo mediante
diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de proteína recombinante
que se obtuvieron de la fracción soluble de E. coli se
estimaron mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
Este ejemplo ilustra la accesibilidad a
anticuerpos de la proteína BVH-P1 en la superficie
de la cepa de S. pyogenes.
Se hicieron crecer bacterias en caldo de cultivo
de Tood Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Detroit MI) con 0,5% de
extracto de levadura (Difco Laboratories) y 0,5 de extracto de
peptona (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37ºC en atmósfera con
CO_{2} al 8% para dar un OD_{490 \ nm} de 0,600 (\sim10^{8}
CFU/ml). Se añadieron a continuación diluciones de
anti-BVH-P1 o sueros de control y se
dejó que se unieran a las células, que fueron incubadas durante 2 h
a 4ºC. Se lavaron las muestras cuatro veces en tampón de bloqueo
[solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 2% de
albúmina sérica bovina (BSA)] y luego se añadió conjugado de IgG +
IgM anti-ratón con fluoresceína de cabra (FITC) en
tampón de bloqueo. Después de incubación adicional de 60 min a
temperatura ambiente, se lavaron las muestras 4 veces con tampón de
bloqueo y se fijaron con formaldehído al 0,25% en tampón PBS
durante 18-24 horas a 4ºC. Se lavaron las células 2
veces con tampón PBS y se resuspendieron en 500 \mul de tampón
PBS. Se mantuvieron las células en la oscuridad a 4ºC hasta que se
analizaron mediante citometría de flujo (Epics®XL; Beckman Coulter,
Inc.). El análisis de citometría de flujo reveló que los anticuerpos
específicos de BVH-P1 reconocieron eficazmente sus
correspondientes epítopos expuestos en la superficie en ambas cepas
de S. pyogenes, la homóloga (ATCC12384; serotipo 3) y la
heteróloga (SPT57; serotipo 1) probadas. Se determinó que más de
90% de las 10.000 células de S. pyogenes analizadas estaban
etiquetadas con anticuerpos presentes en los
anti-sueros específicos de BVH-MC1.
Estas observaciones demuestran claramente que la proteína
BVH-P1 es accesible en la superficie en la que puede
ser fácilmente reconocida por anticuerpos. Se puso de manifiesto
que los anticuerpos anti- S. pyogenes desempeñaban un papel
importante en la protección contra infección de S.
pyogenes.
Este ejemplo ilustra la protección contra
infección fatal de S. pyogenes inducida mediante inmunización
pasiva de ratones con sueros de conejo
hiper-inmune.
Conejos de Nueva Zelanda (Charles River
Laboratories, Montreal, Canadá) fueron inyectados subcutáneamente
en sitios múltiples con aproximadamente 50 \mug y 100 \mug de
proteína BVH-P1-His\cdotTag (de
SEQ ID NO:10) que se había producido y purificado según se ha
descrito en el Ejemplo 5 y se absorbió en adyuvante de Alhydrogel
(Superfos Biosector a/s). Los conejos fueron inmunizados tres veces
a intervalos de tres semanas con la proteína
BVH-P1-His\cdotTag (de SEQ ID
NO:10). Se recogieron muestras de sangre tres semanas después de la
tercera inyección. Los anticuerpos presentes en el suero se
purificaron mediante precipitación usando sulfato amónico saturado
al 40%. Grupos de 10 hembras de ratones CD-1
(Charles River) fueron inyectados intravenosamente con 500 \mul
de suero purificado recogido tanto de conejos inmunizados con
BVH-P1-His\cdotTag (de SEQ ID
NO:10) como de conejos inmunizados con una proteína recombinante de
control sin relación. Dieciocho horas más tarde los ratones fueron
provocados con aproximadamente 2x10^{7} CFU de cepa ATCC12384 de
S. pyogenes de tipo 3. Muestras del inóculo de provocación
de S. pyogenes fueron chapadas sobre placas de agar sangre
para determinar las CFU y para verificar la dosis de provocación. Se
registraron las muertes durante un período de 5 días.
Este ejemplo ilustra la protección de ratones
contra infección fatal de S. pyogenes inducida mediante
inmunización con proteína BVH-P1. Grupos de 8
hembras de ratones CD-1 (Charles River) fueron
inmunizados subcutáneamente tres veces a intervalos de tres semanas
con 20 \mug de proteína recombinante
BVH-P1-His\cdotTag de S.
pyogenes purificada por afinidad (de SEQ ID NO:10) en presencia
de 10 \mug de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd,
Hornby, Canadá) o, como control, con adyuvante QuilA solo en PBS. Se
recogieron muestras de sangre de los senos orbitales en los días 1,
22 y 43 antes de cada inmunización y 7 días después (día 50) de la
tercera inyección. Análisis mediante ELISA usando proteína
recombinante BVH-P1 (de SEQ ID NO:10) indicaron
claramente que esta proteína es altamente inmunogénica en animales.
Efectivamente se determinaron valoraciones recíprocas de ELISA más
altas que 10^{6} para los ratones inmunizados con esta proteína
recombinante. Dos semanas más tarde los ratones fueron provocados
con aproximadamente 2x10^{7} CFU de cepa ATCC12384 de S.
pyogenes de tipo 3. Muestras del inóculo de provocación de S.
pyogenes fueron chapadas sobre placas de agar sangre para
determinar las CFU y para verificar la dosis de provocación. Se
registraron las muertes durante un período de 5 días. Cinco de cada
8 (62%) ratones inmunizados con tres inyecciones de 20 \mug de
BVH-P1 recombinante purificada (de SEQ ID NO:10) y
adyuvante QuilA sobrevivieron a la provocación bacteriana respecto a
sólo 2/7 (28%) en el grupo de control.
\vskip1.000000\baselineskip
<110> SHIRE BIOCHEM INC. MARTIN, Denis
HAMEL, Josée BRODEUR, Bernard
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTÍGENOS DE STREPTOCOCCUS
PYOGENES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 12806-20PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/216,465
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-07-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 382
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1074
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> S. pneumonia
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pneumonia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (428)...(448)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn puede ser
ctgatgtccaacgacaccat o estar ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (733)...(744)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnnnnnnnnnnn puede ser cagatgttaact
o estar ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia__misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (883)...(883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es g o está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia__misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (943)...(943)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es t o está ausente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> s. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)...(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101)...(101),_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (112)...(112)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (132)...(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (134)...(134)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (139)...(139)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (143)...(149)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa = Ser
Asp Val Pro Thr Thr pro o está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (150)...(150)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (158)...(158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (176)...(176)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Leu o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (191) ... (191)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (199)...(199)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Pro o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (211) ... (211)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asp o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (212)...(212)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (222) ... (222)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (228) ... (228)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (242)...(245)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa Xaa Xaa = Glu Thr Ser Gln o
está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (246)...(246)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (247)...(247)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (248)...(248)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (295) ... (295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (296)...(296)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (297) ... (297)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (298)...(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (299)...(299)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (300)...(300)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ile o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (301)...(301)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (302)...(302)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (303)...(303)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (304)...(304)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (305)...(305)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (306) ... (306)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Tyr o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (307)...(307)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (308)...(308)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (309) ... (309)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (310) ... (310)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asp o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (311)...(311)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (312)...(312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (313)...(313)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asn o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (314)...(314)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = His o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (326)...(326)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (327)...(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asn o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (329)...(329)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (344)...(344)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (345)...(345)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggccatgg agtggacacc acgatcggtt ac
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccgctcgag agcattaaag gagacatgaa catgatc
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido señal pronosticado a partir
de análisis de SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de anclaje a pared
celular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Xaa Thr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a IgA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Lys Lys Ile Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgggaagat tatctagcac attaatac
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcataacgtta aaactgtcta aaggg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacccggatc cccaagagtg gacaccacga tcgg
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR25
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgctcgtcg acgcgtatct cagcctctta tagggc
\hfill36
Claims (20)
1. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95%
idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID Nos: 2,
4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16, en el que el polipéptido es capaz de
suscitar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus
pyogenes.
2. Un polinucleótido aislado según la
reivindicación 1 en el que el polinucleótido codifica un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID Nos:
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16.
3. Un polinucleótido aislado que es
complementario al polinucleótido de la reivindicación 1 o la 2.
4. El polinucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido es ADN.
5. El polinucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido es ARN.
6. El polinucleótido según la reivindicación 1
en el que el polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos
al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en una
cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, y 15.
7. El polinucleótido según la reivindicación 1
en el que el polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos
expuesta en una cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, y
15.
8. El polinucleótido según la reivindicación 7
que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en una
cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 11, 13, y 15.
9. Un vector que comprende el polinucleótido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 8, en el que dicho
polinucleótido está unido operativamente a una región reguladora de
la expresión.
10. Una célula hospedadora transfectada con el
vector de la reivindicación 9.
11. Un procedimiento para producir un
polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 8 que comprende cultivar una célula
hospedadora según la reivindicación 10 bajo condiciones adecuadas
para expresión de dicho polipéptido.
12. Un polipéptido aislado que comprende una
secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de
aminoácidos elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16,
en la que el polipéptido es capaz de suscitar una respuesta
inmunitaria contra Streptococcus pyogenes.
13. El polipéptido según la reivindicación 12,
en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos
elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16.
14. El polipéptido aislado según la
reivindicación 12 ó la reivindicación 13, en el que se suprime el
resto Met N-terminal.
15. El polipéptido aislado según cualquiera de
las reivindicaciones 12-14, en el que se suprime la
secuencia secretora de aminoácidos.
16. Una composición de vacuna que comprende un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 y
un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
17. Uso de una composición según la
reivindicación 16 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento terapéutico o profiláctico de faringitis, erisipelas e
impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como
bacteremia y fascitis necrosante.
18. Uso de una composición según la
reivindicación 16 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento terapéutico o profiláctico de infección bacteriana de
Streptococcus pyogenes.
19. Uso de una composición según la
reivindicación 16 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento profiláctico o terapéutico de infección estreptocócica
en un individuo susceptible o infectado con
Streptococcus.
20. Uso según la reivindicación 19 en el que
Streptococcus es Streptococcus pyogenes.
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