ES2316458T3 - Antigeno de streptococcus pyogenes. - Google Patents

Antigeno de streptococcus pyogenes. Download PDF

Info

Publication number
ES2316458T3
ES2316458T3 ES01951286T ES01951286T ES2316458T3 ES 2316458 T3 ES2316458 T3 ES 2316458T3 ES 01951286 T ES01951286 T ES 01951286T ES 01951286 T ES01951286 T ES 01951286T ES 2316458 T3 ES2316458 T3 ES 2316458T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
baselineskip
polypeptide
polynucleotide
seq
pyogenes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES01951286T
Other languages
English (en)
Inventor
Denis Martin
Josee Hamel
Bernard Brodeur
Stephane Rioux
Martine Boyer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
ID Biomedical Corp of Quebec
Original Assignee
ID Biomedical Corp of Quebec
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ID Biomedical Corp of Quebec filed Critical ID Biomedical Corp of Quebec
Application granted granted Critical
Publication of ES2316458T3 publication Critical patent/ES2316458T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04Antibacterial agents
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16, en el que el polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes.

Description

Antígeno de Streptococcus pyogenes.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a antígenos, más particularmente a un polipéptido antígeno del agente patógeno bacteriano Streptococcus pyogenes (también llamado Estreptococo grupo A (GSA)) que puede ser útil para profilaxis, diagnóstico y/o terapia de infección estreptocócica.
Antecedentes de la invención
Los Estreptococos son bacterias gram (+) que se diferencian mediante antígenos de carbohidratos específicos de grupo A a O que se encuentran en la superficie celular. Los aislados de Streptococcus pyogenes se distinguen adicionalmente mediante antígenos de proteínas M específicas para cada tipo. Las proteínas M son factores de virulencia importantes que son altamente variables tanto en pesos moleculares como en secuencias. Efectivamente, se han identificado más de 80 tipos de proteínas M sobre la base de diferencias antigénicas.
El Streptococcus pyogenes es responsable de muchos tipos de infecciones diversas, que incluyen faringitis, erisipela e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteremia y fascitis necrosante y también síndrome tóxico. Se ha documentado un resurgimiento de la enfermedad invasiva en los años recientes en muchos países, incluyendo los de América del Norte y Europa. Aunque el organismo es sensible a los antibióticos, la velocidad de ataque alta y la rápida aparición de sepsis dan como resultado morbilidad y mortalidad altas.
Para desarrollar una vacuna que proteja a los individuos de la infección de Streptococcus pyogenes, se han concentrado esfuerzos sobre los factores de virulencia tales como las proteínas M específicas para cada tipo. Sin embargo, se encontró que la porción amino-terminal de las proteínas M inducía anticuerpos de reacción cruzada que reaccionaban con miocardio, tropomiosina, miosina y vimentina humanas, que podían estar implicadas en enfermedades autoinmunes. Otros han usado técnicas recombinantes para producir proteínas híbridas complejas que contienen péptidos amino-terminales de proteínas M de serotipos diferentes. Sin embargo, una vacuna segura que contenga todos los serotipos de Streptococcus pyogenes será altamente compleja de producir y someter a normalización.
Además de los antígenos específicos a los serotipos, otras proteínas de Streptococcus pyogenes han generado interés como candidatos a vacunas potenciales. Se ha puesto de manifiesto que la C5a peptidasa, que se expresa mediante al menos 40 serotipos de Streptococcus pyogenes, era inmunogénica en ratones, aunque su capacidad para reducir el nivel de colonización nasofaríngea era limitada. Otros investigadores también se han enfocado hacia exotoxinas pirogénicas estreptocócicas que parece que desempeñan un papel importante en patogénesis de infección. La inmunización con estas proteínas prevenía los síntomas mortales del síndrome tóxico, aunque no prevenía la colonización.
Queda por lo tanto una necesidad insatisfecha de que los antígenos de Streptococcus pyogenes se puedan usar como componentes de vacuna para profilaxis, diagnóstico y/o terapia de infección de Estreptococos.
Resumen de la invención
Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
En otros aspectos, se proporcionan nuevos polipéptidos codificados por polinucleótidos de la invención, vectores que comprenden polinucleótidos de la invención unidos operativamente a una región reguladora de la expresión, así como células hospedadoras transfectadas con dichos vectores, composiciones farmacéuticas o de vacunas y procedimientos para producir polipéptidos que comprenden cultivar dichas células hospedadoras bajo condiciones adecuadas para la expresión.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 de cepa ATCC12384 de S. Pyogenes serotipo 3 con una señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID NO:1.
La Figura 2 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 de cepa ATCC12384 de S. Pyogenes serotipo 3 con una señal de secreción en posición 1 a 25; SEQ ID NO:2.
La Figura 3 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 de cepa LSPQ2699(ATCC19615) de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID NO:3.
La Figura 4 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 de cepa LSPQ2699(ATCC16915) de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 25; SEQ ID NO:4.
La Figura 5 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 de cepa SPY57 de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID NO:5.
La Figura 6 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 de cepa SPY57 de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 25; SEQ ID NO:6.
La Figura 7 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 de cepa B514 de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 75; SEQ ID NO:7.
La Figura 8 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 de cepa B514 de S. Pyogenes con una señal de secreción en posición 1 a 25; SEQ ID NO:8.
La Figura 9 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 sin señal de secreción de cepa ATCC12384 de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:9.
La Figura 10 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa ATCC12384 de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:10.
La Figura 11 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 sin señal de secreción de cepa LSPQ2699(ATCC19615) de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:11.
La Figura 12 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa LSPQ2699(ATCC19615) de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:12.
La Figura 13 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 sin señal de secreción de cepa SPY57 de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:13.
La Figura 14 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa SPY57 S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:14.
La Figura 15 es la secuencia de ADN del gen BVH-P1 sin señal de secreción de cepa B514 de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:15.
La Figura 16 es la secuencia de aminoácidos de proteína BVH-P1 sin señal de secreción de cepa B514 de S. Pyogenes serotipo 3; SEQ ID NO:16.
La Figura 17 representa la comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes BVH-P1 de cepas
ATCC12384, LSPQ2699(ATCC19615), SPY57, B514, ATCC 70029 (Oklahoma) y T28/51/4 (UO9352) de S. Pyogenes usando el programa informático de análisis de secuencia Clustal W de MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación hay una línea de consenso. Los nucleótidos sombreados son idénticos entre las secuencias y los espacios de separación en la secuencia introducida mediante alineación se indican mediante guiones.
La Figura 18 representa la comparación de las secuencias de aminoácidos pronosticadas de los marcos de lectura abierta de BVH-P1 de cepas ATCC12384, LSPQ2699(ATCC19615), SPY57, B514, ATCC 70029 (Oklahoma) y T28/51/4 (UO9352) de S. Pyogenes usando el programa informático de análisis de secuencia Clustal W de MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación hay una línea de consenso. Los restos aminoácido sombreados son idénticos entre las secuencias y los espacios de separación en la secuencia introducida mediante alineación se indican mediante guiones.
La Figura 19 es la secuencia de ADN de un gen de S. pneumonia; SEQ ID NO:17.
La Figura 20 es la secuencia de aminoácidos de una proteína de S. pneumonia; SEQ ID NO:18.
Descripción detallada de la invención
Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad con un segundo polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
Según un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
Según un aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido capaz de generar anticuerpos que tienen especificidad de unión para un polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de la misma.
En conformidad con la presente invención, se proporciona, una secuencia de nucleótidos de consenso que se representa en la Figura 17. Como se puede ver mediante la alineación, el polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención está bien conservado. Sin restringir el alcance de la invención, la siguiente tabla 1 muestra las posibles modificaciones. SEQ ID NO: 19 cubre la secuencia de nucleótidos de consenso que se representa en la Figura 17 con las modificaciones que se ilustran en la Tabla 1:
1
\newpage
(Continuación)
3
\newpage
En conformidad con la presente invención, se proporciona una secuencia de aminoácidos de consenso que se representa en la Figura 18. Como se puede ver mediante la alineación, el polipéptido de la invención está bien conservado. Sin restringir el alcance de la invención, la siguiente tabla 2 muestra las posibles modificaciones. SEQ ID NO: 20 cubre la secuencia de nucleótidos de consenso que se representa en la Figura 18 con las modificaciones que se ilustran en la Tabla 2:
5
\newpage
(Continuación)
6
En conformidad con la presente invención, todos los polinucleótidos que codifican polipéptidos están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización adicional, los polipéptidos en conformidad con la presente invención son antigénicos.
En una realización adicional, los polipéptidos en conformidad con la presente invención son inmunogénicos.
En una realización adicional, los polipéptidos en conformidad con la presente invención pueden suscitar una respuesta inmunitaria en un individuo.
En una realización adicional, la presente invención también se refiere a polipéptidos que pueden generar anticuerpos que tienen especificidad de unión con los polipéptidos de la presente invención según se han definido anteriormente.
Un anticuerpo que "tiene especificidad de unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido seleccionado pero que sustancialmente no reconoce ni se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica. La unión específica se puede medir usando un análisis ELISA en el que el polipéptido seleccionado se usa como antígeno.
En conformidad con la presente invención, se define "protección" en los estudios biológicos mediante un aumento significativo en la curva, tasa o período de supervivencia. El análisis estadístico que usa la prueba log-intervalo para comparar las curvas de supervivencia, y la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de supervivencia y el número de días hasta la muerte, respectivamente, podrían ser útiles para calcular los valores de P y determinar si la diferencia entre los dos grupos es estadísticamente significativa. Valores de P de 0,05 se consideran no significativos.
Según se usan en este documento, "fragmentos", "análogos" o "derivados" de los polipéptidos de la invención incluyen aquellos polipéptidos en los que uno o más de los restos se sustituyen con un resto aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente conservado) y que pueden ser naturales o no naturales. En una realización, derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán aproximadamente 70% de identidad con las secuencias que se ilustran en las figuras o fragmentos de las mismas. Esto es, 70% de los restos son iguales. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 75% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 80% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 85% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 90% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 95% de homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de 99% de homología. En una realización adicional, los derivados y análogos de polipéptidos de la invención tendrán menos de aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o supresiones de aminoácidos y más preferiblemente menos de 10. Sustituciones preferidas son las que se conocen en la técnica como conservadas, es decir los restos que sustituidos comparten propiedades físicas o químicas tales como hidrofobia, tamaño, carga, o grupos funcionales.
Una persona experta apreciará que fragmentos, análogos o derivados de las proteínas o polipéptidos de la invención también encontrarán uso en el contexto de la presente invención, es decir, como material antigénico/inmunogénico. Así, por ejemplo proteínas o polipéptidos que incluyen una o más adiciones, supresiones, sustituciones o similares están abarcados por la presente invención. Además, puede que sea posible sustituir un aminoácido con otro de "tipo" similar. Por ejemplo, sustituir un aminoácido hidrófobo con otro aminoácido hidrófobo.
Se puede usar un programa tal como el programa CLUSTAL para comparar secuencias de aminoácidos. Este programa compara secuencias de aminoácidos y encuentra la alineación óptima insertando espacios en una u otra secuencia según sea apropiado. Es posible calcular identidad o similitud de aminoácidos (identidad más conservación de tipo de aminoácido) para una alineación óptima. Un programa como BLASTx alineará el tramo más largo de secuencias similares y asignará un valor al ajuste. Es así posible obtener una comparación en la que se encuentran varias regiones de similitud, teniendo cada una diferente puntuación. En la presente invención se contemplan ambos tipos de análisis de identidad.
En una aproximación alternativa, los análogos o derivados podrían ser proteínas de fusión, que incorporen restos que hagan más fácil la purificación, por ejemplo agregando una etiqueta eficazmente a la proteína o polipéptido deseado, puede ser necesario retirar la "etiqueta" o puede ser el caso que la propia proteína de fusión retenga suficiente propiedad antigénica para que sea útil.
En un aspecto adicional de la invención se proporcionan fragmentos antigénicos/inmunogénicos de las proteínas o polipéptidos de la invención, o de análogos o derivados de las mismas.
Los fragmentos de la presente invención deberían incluir una o más regiones epitópicas o ser suficientemente similares a regiones de este tipo para retener sus propiedades antigénicas/inmunogénicas. Así, para fragmentos según la presente invención el grado de identidad quizás sea irrelevante, puesto que pueden ser 100% idénticas a una parte particular de una proteína o polipéptido, homólogo o derivado según se describe en este documento. La cuestión clave, una vez más, es que el fragmento retenga las propiedades antigénicas/inmunogénicas.
Así, lo que es importante para análogos, derivados y fragmentos es que posean al menos un grado de la propiedad antigénica/inmunogénica de la proteína o polipéptido de la que se derivan.
También se incluyen polipéptidos que han fusionado a ellos otros compuestos que alteran las propiedades biológicas o farmacológicas de polipéptidos, es decir polietilenglicol (PEG) para aumentar el período de semidescomposición; secuencias líder o secretoras de aminoácidos para facilidad de purificación; secuencias prepro- y pro-; y (poli)sacáridos.
Adicionalmente, en aquellas situaciones en que se encuentra que las regiones de aminoácidos son polimórficas, puede ser deseable variar uno o más aminoácidos particulares para imitar más eficazmente los diferentes epítopos de las diferentes cepas de estreptococos.
Asimismo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser modificados mediante acilación NH_{2}-terminal (por ejemplo, mediante acetilación, o amidación con ácido tioglicólico, amidación carboxiterminal, por ejemplo con amoníaco o metilamina) para proporcionar estabilidad, aumento de hidrofobia para unión o enlace a un soporte u otra molécula.
También se contemplan hétero y homo multímeros de polipéptidos de los fragmentos, análogos y derivados de polipéptidos. Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo, uno o más polipéptidos que han sido reticulados con agentes de reticulación tales como avidina/biotina, glutaraldehído o dimetilsuperimidato. Formas poliméricas de este tipo también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias invertidas en tándem o invertidas, producidas a partir de ARNm multicistrónicos generados mediante tecnología de ADN recombinante.
Preferiblemente, un fragmento, análogo o derivado de un polipéptido comprenderá al menos una región antigénica es decir al menos un epítopo.
A fin de lograr la formación de polímeros antigénicos (es decir multímeros sintéticos), se pueden utilizar polipéptidos que tienen grupos bishaloacetilo, nitroarilhaluros, o similares, en los que los reactivos son específicos para grupos tío. Por lo tanto, la unión entre dos grupos mercapto de los diferentes péptidos puede ser un enlace sencillo o puede estar compuesta de un grupo de unión de al menos dos, típicamente al menos cuatro, y no más de 16, pero habitualmente no más de aproximadamente 14 átomos de carbono.
En una realización particular, fragmentos, análogos y derivados de polipéptidos de la invención no contienen ningún resto metionina (Met) de comienzo. Preferiblemente, los polipéptidos no incorporarán una secuencia líder o secretora (secuencia señal). La porción señal de un polipéptido de la invención se puede determinar según técnicas establecidas de biología molecular. En general, el polipéptido de interés puede ser aislado a partir de un cultivo estreptocócico y secuenciado posteriormente para determinar el resto inicial de la proteína madura y por lo tanto la secuencia del polipéptido maduro.
Según otro aspecto, se proporcionan composiciones de vacunas que comprenden uno o más polipéptidos estreptocócicos de la invención en mezcla con un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Adyuvantes adecuados incluyen aceites, es decir adyuvante completo o incompleto de Freund; sales, es decir AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4})_{2}, sílice, caolín, polinucleótidos de carbono es decir poli IC y poli AU. Adyuvantes preferidos incluyen QuilA y Alhydrogel. Las vacunas de la invención se pueden administrar parenteralmente mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral. Vehículos farmacéuticamente aceptables también incluyen toxoide de tétanos.
El término vacuna también significa que incluye anticuerpos. En conformidad con la presente invención, también se proporciona el uso de uno o más anticuerpos que tienen especificidad de unión para los polipéptidos de la presente invención respecto al tratamiento o profilaxis de infección de estreptococos y/o enfermedades y síntomas intermediados por infección de estreptococos.
Se usan composiciones de vacunas de la invención para el tratamiento o profilaxis de infección estreptocócica y/o enfermedades y síntomas intermediados por infección estreptocócica según se describen en P. R. Murray (ed, ejecutivo), E. J. Baron, M. A. Pfaller, F. C. Tenover y R. H. Yolken. Manual of Clinical Microbiology, ASM Press, Washington, D. C. sexta edición, 1995, 1482p que se incorpora a este documento por referencia. En una realización, se usan composiciones de vacunas de la presente invención para la profilaxis o tratamiento de faringitis, erisipelas e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteremia y fascitis necrosante y también síndrome tóxico. En una realización, se usan composiciones de vacunas de la presente invención para la profilaxis o tratamiento de infección de estreptococos y/o enfermedades y síntomas intermediados por infección de estreptococos, en particular estreptococos de grupo A (pyogenes), estreptococos de grupo B (GBS o agalactiae), S. pneumoniae, dysgalactiae, uberis, nocardia así como Staphylococcus aureus. En una realización adicional, la infección de estreptococos es de Streptococcus pyogenes.
En una realización particular, se administran vacunas a los individuos en riesgo de infección de estreptococos tales como niños, ancianos e individuos con pocas defensas inmunitarias.
Según se usa en la presente solicitud, el término "individuos" incluye mamíferos. En una realización adicional, el mamífero es un ser humano.
Las composiciones de vacunas están preferiblemente en forma farmacéutica unitaria de aproximadamente 0,001 a 100 \mug/kg (antígeno/peso corporal) y más preferiblemente 0,01 a 10 \mug/kg y lo más preferiblemente 0,1 a 1 \mug/kg 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas de intervalo entre inmunizaciones.
Las composiciones de vacunas están preferiblemente en forma farmacéutica unitaria de aproximadamente 0,1 \mug a 10 mg y más preferiblemente \mug a 1 mg y lo más preferiblemente 10 a 100 \mug 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6 semanas de intervalo entre inmunizaciones.
Según otro aspecto, se proporcionan polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos, análogos o derivados de las mismas.
En una realización, los polinucleótidos son los que se ilustran en SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 que pueden incluir marcos de lectura abierta (ORF), que codifican polipéptidos de la invención.
Se apreciará que las secuencias de polinucleótidos que se ilustran en las figuras pueden ser alteradas con codones degenerados que todavía codifican los polipéptidos de la invención. Por consiguiente, la presente invención proporciona adicionalmente polinucleótidos que hibridan con las secuencias de polinucleótidos anteriormente descritas en este documento (o las secuencias complementarias de los mismos) que tienen 50% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 70% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 75% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 80% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 85% de identidad entre secuencias. En una realización, al menos 90% de identidad entre secuencias. En una realización adicional, se pueden hibridar polinucleótidos bajo estrictas condiciones, es decir teniendo al menos 95% de identidad. En una realización adicional, más del 97% de identidad.
Se pueden determinar fácilmente condiciones estrictas adecuadas para hibridación por un experto en la técnica (véanse por ejemplo Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N. Y.; Current Protocols in Molecular Biology, (1989) Editado por Ausubel F. M. y col., John Wiley & Sons, Inc., N. Y.).
En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas indistintamente con
(a)
una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
(b)
el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos o análogos de la misma.
En una realización adicional, la presente invención proporciona polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas indistintamente con
(a)
una secuencia de ADN que codifica un polipéptido o
(b)
el complemento de una secuencia de ADN que codifica un polipéptido; en el que dicho polipéptido comprende al menos 10 restos aminoácido contiguos de un polipéptido que comprende una secuencia elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20 ó fragmentos o análogos de la misma.
En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos que codifican polipéptidos de la invención que se ilustran en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20.
En una realización adicional, los polinucleótidos son aquellos que se ilustran en SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 19 que codifican polipéptidos de la invención.
Como se apreciará fácilmente por un experto en la técnica, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.
La presente invención también incluye polinucleótidos complementarios a los polinucleótidos que se describen en la presente solicitud.
En un aspecto adicional, los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la invención ó fragmentos, análogos o derivados de los mismos, se pueden usar en un procedimiento de inmunización de ADN. Esto es, se pueden incorporar en un vector que es replicable y expresable tras inyección produciendo de este modo el polipéptido antigénico en vivo. Por ejemplo se pueden incorporar polinucleótidos en un vector plásmido bajo el control del promotor de CMV que es funcional en células eucariotas. Preferiblemente el vector se inyecta intramuscularmente.
Según otro aspecto, se proporciona un procedimiento para producir polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes expresando un polinucleótido que codifica dicho polipéptido en una célula hospedadora y recuperando el producto de polipéptido expresado. Alternativamente, los polipéptidos se pueden producir según técnicas químicas sintéticas establecidas, es decir síntesis en fase solución o fase sólida de oligopéptidos que se ligan para producir el polipéptido entero (ligación de bloques).
Se describen procedimientos generales para obtención y evaluación de polinucleótidos y polipéptidos en las siguientes referencias: Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel F. M. y col., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York; PCR Cloning Protocols, from Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White B. A. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, 1997, 490 páginas; Protein Purification, Principles and Practices, Scopes R. K., Springer-Verlag, Nueva York, 3rd Edition, 1993, 380 páginas; Current Protocols in Immunology, Editado por Coligan J. E. y col., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York que se incorporan a este documento por referencia.
Para producción recombinante, se transfectan células hospedadoras con vectores que codifican el polipéptido, y luego se cultivan en un medio nutriente modificado según sea apropiado para activar los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes. Son vectores adecuados aquellos que son viables y replicables en el hospedador elegido e incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético por ejemplo plásmidos bacterianos, ADN fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN fago. La secuencia de polipéptidos se puede incorporar en el vector en el sitio apropiado usando enzimas de restricción tales que se una operativamente a una región reguladora de la expresión que comprende un promotor, sitio de unión de ribosoma (región de consenso o secuencia de Shine-Dalgamo), y opcionalmente un operador (elemento de control). Se pueden seleccionar componentes individuales de la región reguladora de la expresión que sean apropiados para uno hospedador y un vector dados según principios de biología molecular establecidos (Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Editado por Ausubel F. M. y col., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York que se incorporan a este documento por referencia). Promotores adecuados incluyen, pero no se limitan, promotor de LTR o SV40, promotores de E. coli lac, tac o trp y el promotor de fago lambda P_{L}. Los vectores incorporarán preferiblemente un origen de replicación así como marcadores de selección es decir gen de resistencia a ampicilina. Vectores bacterianos adecuados incluyen pET, pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y vectores eucarióticos pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células hospedadoras pueden ser bacterianas es decir E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; fúngicas es decir Aspegillus niger, Aspergillus nidulins; levaduras es decir Saccharomyces o eucariotas es decir CHO, COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo, las células se recolectan típicamente mediante centrifugación, luego se desintegran por medios físicos o químicos (si el polipéptido expresado no se segrega al medio) y se retiene el extracto bruto resultante para aislar el polipéptido de interés. La purificación del polipéptido del medio de cultivo o lisato se puede conseguir mediante técnicas establecidas que dependen de las propiedades del polipéptido es decir usando precipitación con sulfato amónico o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio de anión o catión, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectinas. La purificación final se puede conseguir usando HPLC.
El polipéptido se puede expresar con o sin secuencia líder o de secreción. En el primer caso el líder se puede retirar usando procesado de post-traducción (véase US 4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397 que se incorporan a este documento por referencia) o se puede retirar químicamente tras purificar el polipéptido expresado.
Según un aspecto adicional, los polipéptidos estreptocócicos de la invención se pueden usar en una prueba de diagnóstico respecto a infección de estreptococos, en particular infección de Streptococcus pyogenes.
Son posibles varios métodos de diagnóstico, por ejemplo para detectar un organismo de estreptococos en una muestra biológica, se puede seguir el siguiente procedimiento:
a)
obtener una muestra biológica de un individuo;
b)
incubar un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con un polipéptido de estreptococo de la invención con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c)
detectar anticuerpo unido o fragmento unido específicamente en la mezcla que indica la presencia de estreptococos.
Alternativamente, un método para la detección de anticuerpo específico a un antígeno de estreptococo en una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene dicho anticuerpo se puede realizar como sigue:
a)
obtener una muestra biológica de un individuo;
b)
incubar uno o más polipéptidos de estreptococo de la invención o fragmentos de los mismos con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c)
detectar antígeno unido o fragmento unido específicamente en la mezcla que indica la presencia de anticuerpo específico a estreptococos.
Un experto en la técnica reconocerá que esta prueba de diagnóstico puede adoptar varias formas, que incluyen una prueba inmunológica tal como un análisis con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), un radioinmunoanálisis o un análisis de aglutinación de látex, esencialmente para determinar si hay presentes en un individuo anticuerpos específicos para la proteína.
Las secuencias de ADN que codifican polipéptidos de la invención también se pueden usar para designar sondas de ADN para uso en la detección de la presencia de estreptococos en una muestra biológica de la que se sospecha que contiene bacterias de este tipo. El método de detección de esta invención comprende:
a)
obtener la muestra biológica de un individuo;
b)
incubar una o más sondas de ADN que tienen una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o fragmentos del mismo con la muestra biológica para formar una mezcla; y
c)
detectar la sonda de ADN unida específicamente en la mezcla que indica la presencia de bacterias de estreptococos.
Las sondas de ADN de esta invención también se pueden usar para detectar estreptococos en circulación, es decir ácidos nucleicos de Streptococcus pyogenes en una muestra, por ejemplo usando una reacción en cadena de polimerasa, como método para diagnosticar infecciones de estreptococos. La sonda puede ser sintetizada usando técnicas convencionales y puede ser inmovilizada sobre una fase sólida, o puede ser etiquetada con una etiqueta detectable. Una sonda de ADN preferida para esta solicitud es un oligómero que tiene una secuencia complementaria al menos con aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos de Streptoccus pyogenes de la invención.
Otro método de diagnóstico para la detección de estreptococos en un individuo comprende:
a)
etiquetar un anticuerpo que reacciona con un polipéptido de la invención o fragmento del mismo con una etiqueta detectable;
b)
administrar el anticuerpo etiquetado o el fragmento etiquetado al paciente; y
c)
detectar el anticuerpo etiquetado o el fragmento etiquetado unido específicamente en el paciente que indica la presencia de estreptococos.
Un aspecto adicional de la invención es el uso de polipéptidos de estreptococos de la invención como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para la diagnosis y en particular el tratamiento de infección de estreptococos. Se pueden determinar anticuerpos adecuados usando métodos de selección apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger pasivamente contra la infección de estreptococos en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón que se describe en los ejemplos de este documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un fragmento del mismo que se une a un antígeno y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen de mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o de ser humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo o, si se desea, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales, o preferiblemente monoclonales. Puede ser específico para un cierto número de epítopos asociados con los polipéptidos de Streptococcus pyogenes pero es preferiblemente específico para uno.
Un aspecto adicional de la invención es el uso de los anticuerpos dirigidos a los polipéptidos de estreptococos de la invención para inmunización pasiva. Se podrían usar los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Se pueden determinar anticuerpos adecuados usando métodos de selección apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un anticuerpo particular para proteger pasivamente contra la infección de estreptococos en un modelo de prueba. Un ejemplo de un modelo animal es el modelo de ratón que se describe en los ejemplos de este documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo entero o un fragmento del mismo que se une a un antígeno y puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede ser de origen animal, específicamente de origen de mamífero y más específicamente de origen murino, de rata o de ser humano. Puede ser un anticuerpo natural o un fragmento del mismo o, si se desea, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante. La expresión anticuerpo o fragmento de anticuerpo recombinante significa anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se ha producido usando técnicas de biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden ser policlonales, o preferiblemente monoclonales. Puede ser específico para un cierto número de epítopos asociados con los polipéptidos de Streptococcus pneumoniae pero es preferiblemente específico para uno.
Salvo que se defina otra cosa, todas las expresiones técnicas y científicas que se usan en este documento tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra la clonación de gen de S. pyogenes.
La región de codificación de gen BVH-P1 de S. pyogenes (SEQ ID NO:1) se amplificó mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de cepa ATCC12384 S. pyogenes serotipo 3 usando los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición se sitios de restricción NcoI(CCATGG) y XhoI (CTCGAG): DMAR16 (5'-CAGGCCATGGAGTG-GA
CACCACGATCGGTTAC-3'); DMAR17 (5'-GCCGCTCGAGAGCATTAAAG-GAGACATGAACATGATC-3'). Se purificaron los productos de PCR de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA), y se sometieron a digestión con NcoI y XhoI (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pET-21d(+) (Novagen, Madison, WI) se sometió a digestión con NcoI y XhoI y se purificó de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de PCR de NcoI y XhoI se ligaron al vector de expresión de NcoI y XhoI pET-21d(+). Los productos ligados se transformaron en cepa de E. coli cepa de E. coli DH5\alpha [\phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{k}-m_{k}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó gen recombinante BVH-P1 24 que contenía pET-21d(+)plásmido (rpET21d(+)) usando un kit de plásmido QIAgen (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA).
Se determinó que el marco de lectura abierta (ORF) que codifica para BVH-P1 contiene 1170-pb y codifica un polipéptido de 389 restos aminoácido con un pl pronosticado de 4,37 y una masa molecular pronosticada de 41054 Da.
El análisis de la secuencia pronosticada de restos aminoácido (SEQ ID NO:2) usando el programa informático Spscan (Wisconsin Sequence Analysis Package; Genetics Computer Group) sugirió la existencia de un péptido señal de 25 restos aminoácido (MIITKKSLFVTSVALSLAPLATAQA), que termina con un sitio de desdoblamiento situado entre un resto alanina y uno glutamina. El análisis de este ORF no reveló la presencia de estructuras repetitivas, motivo de anclaje de pared celular (LPXTG), ni motivo de unión a IgA (MLKKIE).
Un ORF que comparte 62% con el gen BVH-P1 de S. pyogenes se presentó inicialmente en la solicitud de patente PCT/CA99/00114 que describía antígenos de estreptococos de Grupo B. También se encontró que el gen BVH-P1 compartía homología (62% de identidad) con un ORF presente en el genoma de S. pneumoniae (The Institute for Genomic Research).
Ejemplo 2
Este ejemplo describe la amplificación de PCR y secuenciación de gen BVH-P1 a partir de otras cepas de S. pyogenes y la evaluación del nivel de conservación molecular de este gen.
Se proporcionó LPSQ2296(ATCC 19615) de S. pyogenes de serogrupo A de Lancefield por el laboratorio de la Sanidad Pública de Quebec, Saint-Anne-de-Bellevue; se proporcionó aislado clínico SPY57 de S. pyogenes serotipo 1 por el centro de investigación en infecciología del centro hospitalario de la Universidad Laval, Sainte-Foy; y se proporcionó cepa B514 de S. pyogenes que fue inicialmente aislada a partir de ratón por Susan Hollingshead, de la Universidad de Alabama, Birmingham. Las respectivas regiones de codificación de gen BVH-P1 de S. pyogenes a partir de cepas ATCC 12384 (SEQ ID NO:1), LSPQ2699(ATCC19615) (SEQ ID NO:3), SPY57 (SEQ ID NO:5), y B514 (SEQ ID NO:7) se amplificaron mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de lisatos de células bacterianas usando los siguientes oligonucleótidos DMAR69 (5'-CTGGGAAGATTATCTAGCACATTAATAC-3'); DMAR72 5'-CATAACGTTAAAACTGTCTAAAGGG-3'). Se purificaron productos de PCR de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen siguiendo las instrucciones del fabricante (Chatsworth, CA) y se secuenció la inserción de ADN (Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit, ABI, Foster City, CA). Las secuencias de aminoácidos pronosticadas de cepas ATCC 12384 (SEQ ID NO:2), LSPQ2699(ATCC19615) (SEQ ID NO:4), SPY57 (SEQ ID NO:6), y B514 (SEQ ID NO:8) se presentaron respectivamente en las siguientes figuras 2, 4, 6, y 8.
Las figuras 17 y 18 representan respectivamente el nucleótido de consenso y secuencias de aminoácido pronosticadas que se establecen para BVH-P1 de S. pyogenes. Además de las secuencias presentadas con este documento, también se incluyeron las secuencias de gen BVH-P1 del proyecto de secuenciación de genoma en la Universidad de Oklahoma (cepa ATCC 70029 de S. pyogenes serotipo M1: http://dnal.chem.ou.edu/strep.html) y de (Kil y col., 1994. Infect. Immun. 62: 2440-2449: número de acceso al banco de genes U09352). No se describió por Kil y col., ninguna función ni rol en el patogénesis de las bacterias ni protección contra infección para la secuencia con número de acceso al banco de genes U09352. Se puso de manifiesto que esta última secuencia presentada por Kil y col., estaba colocada corriente arriba de un antígeno de S. pyogenes de reacción cruzada con miosina de 67 kDa.
La comparación por parejas de secuencias de proteínas BVH-P1 pronosticadas reveló entre 95 y 100% de identidad con la excepción de la secuencia de la secuencia de BVH-P1 obtenida del banco de genes bajo el número de acceso U09352. La comparación por parejas de esta secuencia particular con las otras cinco secuencias de BVH-P1 indicó identidad entre 87 y 91%. Esta homología más baja se puede explicar por la presencia de dos regiones (119-124 y 262-281) que son comparativamente más divergentes que otras secuencias de gen BVH-P1. Además de estas dos regiones en la secuencia de BVH-P1 obtenida del banco de genes bajo el número de acceso U09352, los genes BVH-P1 mostraron gran similitud en organización global.
Ejemplo 3
Este ejemplo ilustra la clonación de proteína de gen de S. pyogenes en un CMV plásmido pCMV-GH.
La región de una proteína de S. pyogenes que codifica ADN se insertó en fase corriente abajo de un gen de hormona del crecimiento humano (hGH) que estaba bajo control de transcripción del promotor de citomegalovirus (CMV) en el vector plásmido pCMV-GH (Tang y col., Nature, 1992, 356:152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en células de E. coli pero es activo tras administración del plásmido en células eucariotas. El vector también incorporaba el gen de resistencia a ampicilina.
La región codificadora de gen BVH-P1 (SEQ ID NO:9) sin su región de péptido líder se amplificó mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR System 2400 Perkin Elmer, San Jose, CA) a partir de ADN genómico de cepa ATCC12384 S. pyogenes serotipo 3 usando los siguientes oligonucleótidos que contenían extensiones de bases para la adición se sitios de restricción BamHI (GGATCC) y SalI (GTCGAC): DMAR24 (5'-TACCCGGATCCCCAA
GAGTG-GACACCACGATCGG-3'); DMAR25 (5'-GCGCTCGTCGACGCGTATCTCAGC-CTCTTATAGGGC-3'). El producto de PCR se purificó de gel de agarosa usando un kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA), se sometió a digestión con enzimas de restricción (Pharmacia Canada Inc, Baie d'Urfé, Canadá). El vector pCMV-GH (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas) se sometió a digestión con BamHI y SalI y se purificó de gel de agarosa usando el kit de extracción de gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN BamHI y SalI se ligaron al vector BamHI-SalI pCMV-GH para crear la proteína de fusión hGH-BVH-P1 bajo el control del promotor de CMV. Los productos ligados fueron transformados en la cepa de E. coli DH5\alpha [\phi80dlacZ\DeltaM15 \Delta(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_{k}-m_{k}+) deoR thi-1 supE44 \lambda-gyrA96 relA1] (Gibco BRL, Gaitherburg, MD) según el método de Simanis (Hanahan, D. DNA Cloning, 1985, D. M. Glover (ed), págs. 109-135). Se purificó el plásmido recombinante pCMV usando un kit de plásmido QIAgen (Chatsworth, CA) y se verificó la secuencia de nucleótidos de la inserción de ADN mediante secuenciación de ADN.
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra el uso de ADN para suscitar una respuesta inmunitaria a antígenos de S. pyogenes.
Un grupo de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles River, St-Constant, Quebec, Canadá) fue inmunizado mediante inyección intramuscular de 100 \mul tres veces a intervalos de dos o tres semanas con 50 \mug de pCMV-GH recombinante que codifica gen BVH-P1 en presencia de factor estimulador de colonias granulocito-macrófago ((GM-CSF) que expresa plásmido pCMV-GH-GM-CSF (Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Department of Biochemistry, The University of Texas, Dallas, Texas). Como control, un grupo de ratones fue inyectado con 50 \mug de pCMV-GH-GM-CSF. Se recogieron muestras de sangre de seno orbital antes de cada inmunización y siete días después de la tercera inyección y se determinaron las respuestas de anticuerpos séricos mediante ELISA usando BVH-P1-His\cdotTag purificada de proteína recombinante de S. pyogenes SEQ ID NO:11 como antígeno de revestimiento.
Ejemplo 5
Este ejemplo ilustra la producción y purificación de proteína recombinante BVH-P1 de S. pyogenes.
De usó el plásmido recombinante pET-21d(+) con gen BVH-P1 correspondiente a la SEQ ID NO:9 para transformar mediante electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD Labs, Mississauga, Canadá) cepa BL21 (DE3) de E. coli (F^{-}ompT hsdS_{B} (r ^{-}_{B}m^{-}_{B})gal dcm (DE3)) (Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli el promotor T7 que controla la expresión de la proteína recombinante es reconocido específicamente por la T7 ARN polimerasa (presente en el profago \lambdaDE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que es inducible por isopropil-\beta-d-tiogalactopiranósido (IPTG). Se hizo crecer el transformante BL21(DE3)/rpET a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo de cultivo LB (peptona 10 g/l), extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contenía 100 \mug de carbenicilina (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Canadá) por ml hasta que la A_{600} alcanzó un valor de 0,6. A fin de inducir la producción de proteína recombinante BVH-P1-His\cdotTag de S. pyogenes (de SEQ ID NO:10), las células se incubaron durante 3 horas adicionales en presencia de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células inducidas de un cultivo de 500 ml se precipitaron mediante centrifugación y se congelaron a -70ºC.
La purificación de las proteínas recombinantes de la fracción citoplasmática soluble de BL21(DE3)/rpET21b(+) inducida por IPTG se hizo mediante cromatografía de afinidad basada en las propiedades de la secuencia His\cdotTag (6 restos histidina consecutivos) de unirse a cationes divalentes (Ni^{2+}) inmovilizados sobre la resina de quelación metálica His\cdotBind. En resumen, las células precipitadas que se obtuvieron de un cultivo de 500 ml inducido con IPTG fueron resuspendidas en tampón de lisis (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM, pH 7,9) que contenía PMSF 1 mM, sonicadas y centrifugadas a 12.000 X g durante 20 min para retirar detritus. El material sobrenadante se depositó sobre una columna agarosa Ni-NTA (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canadá). La proteína recombinante BVH-P1-His\cdotTag de S. pyogenes (de SEQ ID NO:10) se eluyó con imidazol 250 mM-NaCl 500 mM-Tris 20 mM pH 7,9. La retirada de la sal y el imidazol de la muestra se hizo mediante diálisis contra PBS a 4ºC. Las cantidades de proteína recombinante que se obtuvieron de la fracción soluble de E. coli se estimaron mediante MicroBCA (Pierce, Rockford, Illinois).
Ejemplo 6
Este ejemplo ilustra la accesibilidad a anticuerpos de la proteína BVH-P1 en la superficie de la cepa de S. pyogenes.
Se hicieron crecer bacterias en caldo de cultivo de Tood Hewitt (TH) (Difco Laboratories, Detroit MI) con 0,5% de extracto de levadura (Difco Laboratories) y 0,5 de extracto de peptona (Merck, Darmstadt, Alemania) a 37ºC en atmósfera con CO_{2} al 8% para dar un OD_{490 \ nm} de 0,600 (\sim10^{8} CFU/ml). Se añadieron a continuación diluciones de anti-BVH-P1 o sueros de control y se dejó que se unieran a las células, que fueron incubadas durante 2 h a 4ºC. Se lavaron las muestras cuatro veces en tampón de bloqueo [solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 2% de albúmina sérica bovina (BSA)] y luego se añadió conjugado de IgG + IgM anti-ratón con fluoresceína de cabra (FITC) en tampón de bloqueo. Después de incubación adicional de 60 min a temperatura ambiente, se lavaron las muestras 4 veces con tampón de bloqueo y se fijaron con formaldehído al 0,25% en tampón PBS durante 18-24 horas a 4ºC. Se lavaron las células 2 veces con tampón PBS y se resuspendieron en 500 \mul de tampón PBS. Se mantuvieron las células en la oscuridad a 4ºC hasta que se analizaron mediante citometría de flujo (Epics®XL; Beckman Coulter, Inc.). El análisis de citometría de flujo reveló que los anticuerpos específicos de BVH-P1 reconocieron eficazmente sus correspondientes epítopos expuestos en la superficie en ambas cepas de S. pyogenes, la homóloga (ATCC12384; serotipo 3) y la heteróloga (SPT57; serotipo 1) probadas. Se determinó que más de 90% de las 10.000 células de S. pyogenes analizadas estaban etiquetadas con anticuerpos presentes en los anti-sueros específicos de BVH-MC1. Estas observaciones demuestran claramente que la proteína BVH-P1 es accesible en la superficie en la que puede ser fácilmente reconocida por anticuerpos. Se puso de manifiesto que los anticuerpos anti- S. pyogenes desempeñaban un papel importante en la protección contra infección de S. pyogenes.
Ejemplo 7
Este ejemplo ilustra la protección contra infección fatal de S. pyogenes inducida mediante inmunización pasiva de ratones con sueros de conejo hiper-inmune.
Conejos de Nueva Zelanda (Charles River Laboratories, Montreal, Canadá) fueron inyectados subcutáneamente en sitios múltiples con aproximadamente 50 \mug y 100 \mug de proteína BVH-P1-His\cdotTag (de SEQ ID NO:10) que se había producido y purificado según se ha descrito en el Ejemplo 5 y se absorbió en adyuvante de Alhydrogel (Superfos Biosector a/s). Los conejos fueron inmunizados tres veces a intervalos de tres semanas con la proteína BVH-P1-His\cdotTag (de SEQ ID NO:10). Se recogieron muestras de sangre tres semanas después de la tercera inyección. Los anticuerpos presentes en el suero se purificaron mediante precipitación usando sulfato amónico saturado al 40%. Grupos de 10 hembras de ratones CD-1 (Charles River) fueron inyectados intravenosamente con 500 \mul de suero purificado recogido tanto de conejos inmunizados con BVH-P1-His\cdotTag (de SEQ ID NO:10) como de conejos inmunizados con una proteína recombinante de control sin relación. Dieciocho horas más tarde los ratones fueron provocados con aproximadamente 2x10^{7} CFU de cepa ATCC12384 de S. pyogenes de tipo 3. Muestras del inóculo de provocación de S. pyogenes fueron chapadas sobre placas de agar sangre para determinar las CFU y para verificar la dosis de provocación. Se registraron las muertes durante un período de 5 días.
Ejemplo 8
Este ejemplo ilustra la protección de ratones contra infección fatal de S. pyogenes inducida mediante inmunización con proteína BVH-P1. Grupos de 8 hembras de ratones CD-1 (Charles River) fueron inmunizados subcutáneamente tres veces a intervalos de tres semanas con 20 \mug de proteína recombinante BVH-P1-His\cdotTag de S. pyogenes purificada por afinidad (de SEQ ID NO:10) en presencia de 10 \mug de adyuvante QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control, con adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogieron muestras de sangre de los senos orbitales en los días 1, 22 y 43 antes de cada inmunización y 7 días después (día 50) de la tercera inyección. Análisis mediante ELISA usando proteína recombinante BVH-P1 (de SEQ ID NO:10) indicaron claramente que esta proteína es altamente inmunogénica en animales. Efectivamente se determinaron valoraciones recíprocas de ELISA más altas que 10^{6} para los ratones inmunizados con esta proteína recombinante. Dos semanas más tarde los ratones fueron provocados con aproximadamente 2x10^{7} CFU de cepa ATCC12384 de S. pyogenes de tipo 3. Muestras del inóculo de provocación de S. pyogenes fueron chapadas sobre placas de agar sangre para determinar las CFU y para verificar la dosis de provocación. Se registraron las muertes durante un período de 5 días. Cinco de cada 8 (62%) ratones inmunizados con tres inyecciones de 20 \mug de BVH-P1 recombinante purificada (de SEQ ID NO:10) y adyuvante QuilA sobrevivieron a la provocación bacteriana respecto a sólo 2/7 (28%) en el grupo de control.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3 La inmunización de ratones CD-1 con proteína recombinante BVH-P1 purificada confiere protección contra provocación posterior con cepa ATCC 12384 de S. pyogenes
8
<110> SHIRE BIOCHEM INC. MARTIN, Denis HAMEL, Josée BRODEUR, Bernard
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANTÍGENOS DE STREPTOCOCCUS PYOGENES
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 12806-20PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/216,465
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 2000-07-06
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
10
11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1182
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1170
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
16
17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1149
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 382
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1106
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 368
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
23
24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1095
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 364
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1074
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1113
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pneumonia
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
30
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 370
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pneumonia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
31
310
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1183
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> S. pyogenes
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (428)...(448)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn puede ser ctgatgtccaacgacaccat o estar ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (733)...(744)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> nnnnnnnnnnnn puede ser cagatgttaact o estar ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia__misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (883)...(883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es g o está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> diferencia__misc.
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (943)...(943)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es t o está ausente
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 393
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> s. pyogenes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (18)...(18)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (50)...(50)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (101)...(101),_
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Asn
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (112)...(112)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (132)...(132)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (134)...(134)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (139)...(139)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (143)...(149)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa = Ser Asp Val Pro Thr Thr pro o está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (150)...(150)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (158)...(158)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Phe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (176)...(176)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Leu o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (191) ... (191)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (199)...(199)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Pro o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (211) ... (211)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asp o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (212)...(212)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (222) ... (222)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (228) ... (228)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Val o Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (242)...(245)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa Xaa Xaa Xaa = Glu Thr Ser Gln o está ausente
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (246)...(246)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Met
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (247)...(247)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (248)...(248)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (295) ... (295)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (296)...(296)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (297) ... (297)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Pro
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (298)...(298)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (299)...(299)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (300)...(300)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ile o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (301)...(301)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Thr o Arg
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (302)...(302)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (303)...(303)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe o Leu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (304)...(304)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ser o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (305)...(305)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (306) ... (306)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Tyr o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (307)...(307)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (308)...(308)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (309) ... (309)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (310) ... (310)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asp o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (311)...(311)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Pro o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (312)...(312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Gly o Glu
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (313)...(313)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asn o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (314)...(314)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = His o Ile
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (326)...(326)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (327)...(327)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Asn o Ser
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (329)...(329)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Ala o Thr
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (344)...(344)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Asp
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (345)...(345)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Arg o Gly
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggccatgg agtggacacc acgatcggtt ac
\hfill
32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgctcgag agcattaaag gagacatgaa catgatc
\hfill
37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido señal pronosticado a partir de análisis de SEQ ID NO:2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)...(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de anclaje a pared celular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Pro Xaa Thr Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Motivo de unión a IgA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Lys Lys Ile Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgggaagat tatctagcac attaatac
\hfill
28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cataacgtta aaactgtcta aaggg
\hfill
25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tacccggatc cccaagagtg gacaccacga tcgg
\hfill
34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido DMAR25
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcgctcgtcg acgcgtatct cagcctctta tagggc
\hfill
36

Claims (20)

1. Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16, en el que el polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes.
2. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 1 en el que el polinucleótido codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID Nos: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16.
3. Un polinucleótido aislado que es complementario al polinucleótido de la reivindicación 1 o la 2.
4. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido es ADN.
5. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido es ARN.
6. El polinucleótido según la reivindicación 1 en el que el polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, y 15.
7. El polinucleótido según la reivindicación 1 en el que el polinucleótido consiste en una secuencia de nucleótidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, y 15.
8. El polinucleótido según la reivindicación 7 que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NOs: 9, 11, 13, y 15.
9. Un vector que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 8, en el que dicho polinucleótido está unido operativamente a una región reguladora de la expresión.
10. Una célula hospedadora transfectada con el vector de la reivindicación 9.
11. Un procedimiento para producir un polipéptido codificado por un polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 ó 6 a 8 que comprende cultivar una célula hospedadora según la reivindicación 10 bajo condiciones adecuadas para expresión de dicho polipéptido.
12. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16, en la que el polipéptido es capaz de suscitar una respuesta inmunitaria contra Streptococcus pyogenes.
13. El polipéptido según la reivindicación 12, en el que el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos elegida entre SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16.
14. El polipéptido aislado según la reivindicación 12 ó la reivindicación 13, en el que se suprime el resto Met N-terminal.
15. El polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en el que se suprime la secuencia secretora de aminoácidos.
16. Una composición de vacuna que comprende un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 y un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
17. Uso de una composición según la reivindicación 16 para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de faringitis, erisipelas e impétigo, escarlatina, y enfermedades invasivas tales como bacteremia y fascitis necrosante.
18. Uso de una composición según la reivindicación 16 para la preparación de un medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de infección bacteriana de Streptococcus pyogenes.
19. Uso de una composición según la reivindicación 16 para la preparación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección estreptocócica en un individuo susceptible o infectado con Streptococcus.
20. Uso según la reivindicación 19 en el que Streptococcus es Streptococcus pyogenes.
ES01951286T 2000-07-06 2001-07-06 Antigeno de streptococcus pyogenes. Expired - Lifetime ES2316458T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US21646500P 2000-07-06 2000-07-06
US216465P 2000-07-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2316458T3 true ES2316458T3 (es) 2009-04-16

Family

ID=22807177

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES01951286T Expired - Lifetime ES2316458T3 (es) 2000-07-06 2001-07-06 Antigeno de streptococcus pyogenes.

Country Status (10)

Country Link
US (2) US7247308B2 (es)
EP (1) EP1297145B1 (es)
JP (1) JP4718099B2 (es)
AT (1) ATE412750T1 (es)
AU (1) AU7227001A (es)
BR (1) BR0112497A (es)
CA (1) CA2413576C (es)
DE (1) DE60136360D1 (es)
ES (1) ES2316458T3 (es)
WO (1) WO2002004495A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2413576C (en) * 2000-07-06 2012-11-13 Shire Biochem Inc. Streptococcus pyogenes antigens
EP2189473A3 (en) 2000-10-27 2010-08-11 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Nucleic and proteins from streptococcus groups A & B
AU2002216863B8 (en) * 2000-12-21 2008-03-20 Id Biomedical Corporation Streptococcus pyogenes antigens and corresponding DNA fragments
EP1597348A4 (en) * 2002-08-26 2010-03-31 Novartis Vaccines & Diagnostic GENES OF STREPTOCOCCUS PRESERVED OR SPECIFIC
CA2532369C (en) 2003-07-31 2016-07-26 Chiron Corporation Immunogenic compositions for streptococcus pyogenes
US20070110763A1 (en) * 2003-08-15 2007-05-17 Stephane Rioux Polypeptides of streptococcus pyogenes
US8945589B2 (en) * 2003-09-15 2015-02-03 Novartis Vaccines And Diagnostics, Srl Immunogenic compositions for Streptococcus agalactiae
US20060165716A1 (en) 2004-07-29 2006-07-27 Telford John L Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
CA2583803C (en) * 2004-10-08 2014-11-25 Giuliano Bensi Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes
GB2428006A (en) * 2005-07-07 2007-01-17 Jevgenis Morov AMI-3 vaccine comprising group A Streptococcus pyogenes bacteria
PL2054431T3 (pl) * 2006-06-09 2012-07-31 Novartis Ag Konformery adhezyn bakteryjnych
EP2094297A2 (en) * 2006-10-30 2009-09-02 Novartis AG Immunogenic and therapeutic compositions for streptococcus pyogenes
US8287885B2 (en) 2007-09-12 2012-10-16 Novartis Ag GAS57 mutant antigens and GAS57 antibodies
WO2009081274A2 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o
CA2838981C (en) 2011-06-17 2020-09-08 University Of Tennessee Research Foundation Group a streptococcus multivalent vaccine
CA2898834A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 James B. Dale Group a streptococcal m-related proteins and methods of use

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0916726A1 (en) 1997-11-13 1999-05-19 Rijksuniversiteit te Groningen Attaching substances to micro-organisms
CA2413576C (en) 2000-07-06 2012-11-13 Shire Biochem Inc. Streptococcus pyogenes antigens

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002004495A2 (en) 2002-01-17
JP2004502446A (ja) 2004-01-29
BR0112497A (pt) 2003-11-25
AU7227001A (en) 2002-01-21
US7247308B2 (en) 2007-07-24
US20080038268A1 (en) 2008-02-14
DE60136360D1 (de) 2008-12-11
US20030165528A1 (en) 2003-09-04
CA2413576C (en) 2012-11-13
JP4718099B2 (ja) 2011-07-06
CA2413576A1 (en) 2002-01-17
ATE412750T1 (de) 2008-11-15
EP1297145A2 (en) 2003-04-02
US7811585B2 (en) 2010-10-12
WO2002004495A3 (en) 2002-06-13
EP1297145B1 (en) 2008-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7262024B2 (en) Streptococcus antigens
US7811585B2 (en) Streptococcus pyogenes antigens
ES2480417T3 (es) Antígenos nuevos de estreptococos
ES2278436T3 (es) Antigenos de estreptococos del grupo b.
US20060177465A1 (en) Streptococcus antigens
US7883706B2 (en) Methods for using Streptococcus pyogenes polypeptides
US20160326221A1 (en) Streptococcus pyogenes antigens and corresponding dna fragments
AU2002234455A1 (en) Streptococcus pyogenes polypeptides and corresponding DNA fragments
ES2337773T3 (es) Antigenos de streptococcus del grupo b y fragmentos de adn correspondientes.
ES2432013T3 (es) Composiciones farmacéuticas para usar en el tratamiento de la infección por Streptococcus Pyogenes
ES2382893T3 (es) Antígenos BVH-A2 y BVH-3 de streptococcus del grupo B
AU2001272270B2 (en) Streptococcus pyogenes antigen
WO2002079475A2 (en) Streptococcus pyogenes antigens and corresponding dna fragments
AU2001272270A1 (en) Streptococcus pyogenes antigen