FR2824074A1

FR2824074A1 - Sequence du genome streptococcus agalactiae, application au developpement de vaccins, d'outils de diagnostic, et a l'identification de cibles therapeutiques

Info

Publication number: FR2824074A1
Application number: FR0105642A
Authority: FR
Inventors: Philippe Glaser; Christophe Rusniok; Fabien Chevalier; Lionel Frangeul; Lila Lalioui; Mohammed Zouine; Elisabeth Couve; Carmen Buchrieser; Claire Poyart; Cuot Patrick Trieu
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2001-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2002-10-31
Also published as: WO2002092818A8; WO2002092818A3; AU2002319867A1; WO2002092818A2

Abstract

L'invention a pour objet la séquence génomique et des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides de Streptococcus agalactiae, tels que des polypeptides d'enveloppe cellulaire, ou des polypeptides sécrétés ou spécifiques, ou impliqués dans le métabolisme et dans le processus de réplication, ainsi que des vecteurs ou cellules incluant lesdites séquences. L'invention porte également sur leur application au développement de vaccins, d'outils de diagnostic, de puces à ADN et à l'identification de cibles thérapeutiques.

Description

Séquence du génome Streptococcus agalactiae, application au développement

de

vaccins, d'outils de diagnostic, et à l'identification de cibles thérapeutiques.

L'invention a pour objet la séquence génomique et des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides de Streptococcus agalactiae, tels que des polypeptides d'enveloppe cellulaire, ou des polypeptides sécrétés ou spécifiques, ou impliqués dans le métabolisme et dans le processus de réplication, ainsi que des vecteurs ou cellules incluant lesdites séquences. L'invention porte également sur leur application au développement de vaccins, d'outils de diagnostic, de puces à ADN et à l'identification

de cibles thérapeutiques.

Streptococcus agalactiae est un streptocoque p-hémolytique qui constitue la seule espèce appartenant au groupe B de Lancefield (SGB). Les infections néonatales à streptocoques du groupe B posent un important problème de santé publique qui ne se limite pas aux pays en voie de développement. Leur incidence est de 2,5 pour l 000 naissances, avec un taux de mortalité qui varie actuellement dans les pays industrialisés entre 4 et lO % selon les études. Cette bactérie est responsable d'environ 20 % des méningites bactériennes recensces en France et des séquelles neurologiques sont alors

observées dans 25 à 50 % des cas. Elle est également à l'origine de mort foetale in utero.

Le polyoside capsulaire est l'antigène de surface majeur des SGB. Cinq sérotypes (Ia, lb, II, III et V) sont généralement détectés au cours des infections humaines, le sérotype III étant retrouvé dans 75 % des infections néonatales avec atteinte méningée. Au niveau cellulaire et moléculaire, les différentes étapes du processus infectieux du à S. agalactiae sont encore peu connues. Il est vraisemblable que, dans le cas du syndrome précoce (infections survenant dans les 24 premières heures), la bactérie inhalée pénètre dans les cellules de l'épithélium alvéolaire du nouveau-né et traverse cette barrière pour disséminer ultérieurement dans la circulation générale. La genèse du syndrome tardif précoce (infections survenant entre le 7ème jour et le 3ème mois) et des autres infections à SGB reste encore très mal comprise. Le seul facteur de virulence des SGB dont le rôle a été clairement démontré est le polyoside capsulaire qui permet l'échappement au système immunitaire de l'hôte. La contribution exacte de certaines protéines de surface (antigène C, protéine Rib et CSa peptidase) à la virulence de cette

bactérie est encore peu connue.

Une recherche réalisée sur le site EXPASY (http://www.expasy.chl) indique qu'il existe 112 rétérences de séquences protéiques dans les banques Swissprot et

TREMBL. Ce nombre inclut des protéines codées par des plasmides de S. agalactine.

Ces séquences représentent donc une vision partielle d'un nombre limité d'aspect de la biologie de S. agalactine. La biosynthèse de la capsule polysaccharidique est un des aspects les mieux connus de la virulence de cette bactérie. Par ailleurs, les gènes codant

pour 6 protéines exposées à la surface sont également connus (3).

Afin d'appréhender de manière globale les déterminants génétiques impliqués 1 0 dans ces processus ainsi que le métabolisme de Streptococcus agalactine, le séquençage du génome de Streptococcus agalactine a été réalisé. Le génome de la souche Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) qui a été responsable d'une septicémie mortelle a été choisi pour ce séquencage. Cette souche possède un sérotype capsulaire III, ne présente pas de résistance acquise aux antibiotiques, est génétiquement 1 5 modifiable et est virulente dans un modèle d'infection murin. La connaissance complète du génome est une étape cruciale pour la caractérisation des gènes impliqués dans le développement du processus infectieux: adhésion et franchissement des structures épithéliales, échappement au système immunitaire et adaptation à des conditions de culture variées et souvent hostiles (pH, stress oxydatif et carences nutritionnelles), qui 2 0 constituent des cibles potenti el l es pour de nouvell es stratégies thérapeutiques. La comparaison du génome de S. agalactiae avec ceux d'autres pathogènes à Gram positif (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumonine, Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,...) doit permettre d'identifier de nouveaux gènes de virulence ainsi crue nouvelles cibles pour construire des souches de virulence atténuées et des vaccins. Les protéines de surfaces constituent des candidats pour une future préparation vaccinale. Dans le tableau 2 ci-après sont répertoriés 25 nouveaux gènes, nouvellement identifiés, codant pour des protéines potentiellement

liées au peptidoglycane et présentant le motif de liaison LPXTG.

La séquence pratiquement complète du génome de Streptococcus agalactine (CIP 82.45 (ATCC 12403)) a été obtenue. Ce génome est constitué d'un chromosome long d'environ 2,2 Mb identifié ici sous forme de 138 contigs représentés par les séquences SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 136, SEQ ID No. 138 et SEQ ID No. 139, et d'un plasmide long de 45 kbases présent dans la souche séquencée représenté par la

séquence SEQ ID No. 137.

Une liste des phases codantes annotées identifiées par l'analyse des séquences de

ces contigs est donnée au tableau 1.

Une liste des phases codantes pour des protéines de surface nouvellement

identifiées est donnée au tableau 2 comme indiqué précédemment.

La présente invention concerne les séquences nucléotidiques et polypeptidiques

de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403).

1 0 Ainsi, c 'est un obj et de la présente invention que de caractériser la séquence du génome de Streptococcus agalactine, CIP 82.45 (ATCC 12403) contenu dans la banque génomique préparée à partir du génome de cette souche et déposée à la CNCM le 28 décembre 2000 sous le numéro I-2610, ainsi que de tous les gènes et séquences

régulatrices non codantes contenus dans ledit génome.

La présente invention concerne donc une séquence nucléotidique isolée et/ou purifiée de Streptococcus agalactiae, caractérisce en ce qu'elle est choisie parmi les

séquences SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139.

La présente invention concerne également une séquence nucléotidique isolée et/ou purifiée, issue de Streptococc's agalactine, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi: a) une séquence nucléotidique comportant au moins 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec une séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139 et comprenant au moins 20 nucléotides, de préférence 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000 ou 1500 nucléotides; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139 ou complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), ou b), ou une séquence nucléotidique de l'ARN correspondant à l'une des séquences a) ou b); d) une séquence nucléotidique d'un fragment représentatif d'une séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139, ou d'un fragment représentatif d'une séquence nucl éotidique tel le que définie en a), b) ou c) et comprenant au moins 2 0 nucléotides, de préférence 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000 ou 1500 nucléotides; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d); et f) une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e) modifiée, de préférence comportant au plus 10 %, 5 %, 1 % ou 0, 5 % de nucléotides modifiés par

rapport à la séquence de rétérence.

De façon plus particulière, la présente invention a également pour objet les séquences nocléotidiques isolées et/ou purifiées, caractérisées en ce qu'elles sont issues 1 0 de SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139 et en ce qu'elles codent pour un polypeptide choisi parmi les polypeptides de séquence SEQ ID No. 140 à SEQ ID N. 2344. La présente invention concerne aussi de façon plus générale les séquences nucléotidiques issues de SEQ ID No. 1 à SEQ ID No.139 et codant pour un polypeptide de Streptococcus agalactia, telles qu'elles peuvent être isolées à partir de SEQ ID No. I à SEQ ID No. 139. De plus, les séquences nucléotidiques isolées et/ caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique choisie parmi: a) une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID No. 140 à SEQ ID No. 2344; b) une séquence nucléotidique comportant au moins 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité avec une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide choisi parmi les séquences SEQ ID No. 140 à SEQ ID No. 2344; c) une séquence nucléotidique sthybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nocléotidique codant pour un polypeptide, choisi parmi les séquences SEQ ID No. 140 à SEQ ID No. 2344 et comprenant au moins 20 nucléotides, de préférence 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000 ou 1500 nucléotides; d) une séquence nucléotidique complémentaire ou d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c); e) une séquence nucléotidique d'un fragment représentatif d'une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) et comprenant au moins 20 nucléotides, de préférence 25, , 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1000 ou 1500 nucléotides; et f) une séquence telle que définie en a), b), c), d) ou e) modifiée, de prétérence comportant au plus 10 %, 5 %, 1 % ou 0,5 % de nucléotides modifiés par rapport à la séquence de rétérence,

sont également des objets de l'invention.

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront

employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un

enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin qu'à des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon

l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid).

I1 doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. I1 s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides

nucléiques obtenus par synthèse chimique.

Par " pourcentage d'identité " entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci- après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par " fenêtre de comparaison pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981, Ad. App. Math. 2:482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48:443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P. BLAST N. FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de prétérence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les

matrices PAM ou PAM250.

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de rétérence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique dans les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat

obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 75 %, de prétérence 80 %, 85 % ou 90 %, de façon plus préférée 95 % voire 98 %, après alignement optimal avec une séquence de réLérence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 75 %, de préférence 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. I1 s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences de référence. De préLérence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 75 %, de préférence 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et sa séquence complémentaire. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles

permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires.

A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation ADN- ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes: (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaC1 + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e.: 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent étre adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a

laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor).

De plus, par fragment représentatif de séquences selon l'invention, on entend désigner tout fragment nucléotidique présentant au moins 15 nucléotides, de préférence au moins 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 450, 500, 750, 1000 ou

1500 consécutifs de la séquence dont il est issu.

Par fragment représentatif, on entend en particulier une séquence nuclélque

codant pour un fragment biologiquement actif d'un polypeptide, tel que défini plus loin.

Par fragment représentatif, on entend également les séquences intergéniques, et en particulier les séquences nucléotidiques portant les signaux de régulation

(promoteurs, terminateurs, voire enhancers,).

Parmi lesdits fragments représentatifs, on préfère ceux ayant des séquences nucléotidiques correspondant à des cadres ouverts de lecture, dénommés séquences ORFs (ORF pour " Open Reading Frame "), compris en général entre un codon d'initiation et un codon stop, ou entre deux codons stop, et codant pour des polypeptides, de prétérence d'au moins 100 acides aminés, tel que par exemple, sans s'y

limiter, les séquences ORFs qui seront décrites par la suite.

La numérotation des séquences nucléotidiques ORFs qui sera utilisée par la suite

dans la présente description correspond à la numérotation des séquences d'acides

aminés des protéines codées par lesdites ORFs.

Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent êke obtenus par exemple par amplification spécifique telle que la PCR ou après digestion par des euzymes de restriction appropriés de séquences nucléotidiques selon l'invention, cette méthode étant décrite en particulier dans l'ouvrage de Sambrook et al.. Lesdits fragments représentatifs peuvent également être obtenus par synthèse chimique lorsque leur taille

n'est pas trop importante, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

Parmi les séquences contenant des séquences de l'invention, ou des fragments représentatifs, on entend également les séquences qui sont naturellement encadrées par des séquences qui présentent au moins 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %

d'identité avec les séquences selon l'invention.

Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue par motagénèse selon des techniques bien connues de l'homme du métier, et comportant des modifications par rapport aux séquences normales, par exemple des mutations dans les séquences régulakices et/ou promotrices de l'expression du polypeptide, notamment conduisant à une modification du taux d'expression ou de

l'activité dudit polypeptide.

Par séquence nucléotidique modifiée, on entend également toute séquence

nucléotidique codant pour un polypeptide modifié tel que définit ci-après.

Les fragments représentatifs selon l'invention peuvent également être des sondes ou amorces, qui peuvent êke utilisées dans des procédés de détection, d'identification,

de dosage ou d' amplification de séquences nucléiques.

Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acides nucléiques simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant par exemple de 12 bases à quelques kb, notamment de 15 à quelques centaines de bases, de préférence de 15 à 50 ou 100 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hyDridation

avec un acide nucléique cible.

Les sondes et amorces selon l'invention peuvent êke marquces directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable

(brevet FR 78 10975 et bDNA de Chiron EP 225 807 et EP 510 085).

Les séquences non marquées de polynucléotides selon l'invention peuvent êke

utilisées directement comme sonde ou amorce.

Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32p, le 33P, le 3ss, le 3H ou le 2sI. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, I'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents,

bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.

Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR

(amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991, Berlin: Springer-Verlag).

Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d 'ions, puis séquencés. La spécificité de l ' amplification peut être contrôlée en utilisant les séquences nucléotidiques de polynucléotides de 1'invention comme matrice, des plasmides contenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence

complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.

L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus par

amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en _uvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. I1 existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992, Nucleic Acids Res. :1691), la technique TAS (Transcription-based Amplifcation System) décrite par Kwoh et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 1173), la technique 3SR (Self Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87:1874), la technique NASBA (NucleTc Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991, J. Virol. Methods, 35, 273), la technique TMA (Transcription Mediated Amplifcation) , la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988, Science 241, 1077), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992, Kessler C. Springer Verlag, Berlin, New York, 197-205), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990, Biotechniques, 9, 142), la technique d'amplification à la Qbéta-réplicase décrite par Miele et al. (1983, J. Mol. Biol., 171, 281). Certaines de ces techniques ont depuis

1 5 été perfectionnées.

Dans le cas o le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l ' aide des amorces selon l 'invention ou à la mise en _uvre d'un procédé de détection à l 'aide des sondes de l 'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé

d'amplification ou de détection selon l'invention.

La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthows et al., 1988, Anal. Biochem., 169, 1-25). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la

fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

Selon un autre mode de mise en _uvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent étre utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture ", est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nuclélque cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite

" sonde de détection ", marquée par un élément facilement détectable.

Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de 1'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant,

induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.

De façon préférée, les sondes ou amorces selon l'invention sont immobilisées 1 0 sur un support, de manière covalente ou non covalente. En particulier, le support peut étre une puce à ADN ou un filtre à haute ou moyenne densité, également objets de la présente invention (brevets WO 97/29212, WO 98/27317, WO 97/10365 et WO

92/10588).

On entend désigner par puce à ADN ou filtre haute densité, un support sur lequel sont fixées des séquences d'ADN, chacune d'entre elles pouvant étre repérée par sa localisation géographique. Ces puces ou filtres diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de séquences d'ADN qui y sont fixées. On peut fixer les sondes ou amorces selon la première invention sur des supports solides, en particulier les puces à ADN, par différents procédés de fabrication. En particulier, on peut effectuer une synthèse in situ par adressage photochimique ou par jet d'encre. D'autres techniques consistent à effectuer une synthèse ex situ et à fixer les sondes sur le support de la puce à ADN par adressage mécanique, électronique ou par

jet d'encre. Ces différents procédés sont bien connus de l'homme du métier.

Une séquence nucléotidique (sonde ou amorce) selon l'invention permet donc la détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques spécifiques. Enparticulier, la détection de cesdites séquences est facilitée lorsque la sonde est fixée sur une puce à

ADN, ou à un filtre haute densité.

L'utilisation de puces à ADN ou de filtres à haute densité permet en effet de déterminer l'expression de gènes dans un organisme présentant une séquence

génomique proche de Streptocecc?'s agalactine et le typage de la souche en cause.

La séquence génomique de Streptococcus agalactiae, complétée par l'identification des gènes de ces organismes, telle que présentée dans la présente

invention, sert de base à la construction de ces puces à ADN ou filtre.

La préparation de ces filtres ou puces consiste à synthétiser des oligonucléotides, correspondant aux extrémités 5' et 3' des gènes ou à des fragments plus internes pour amplifier des fragments d'une taille adaptée, par exemple comprise environ entre 300 et 800 bases. Ces oligonucléotides sont choisis en utilisant la séquence génomique et ses annotations divulguées par la présente invention. La température d'appariement des ces oligonucléotides aux places correspondantes sur 1'ADN doit être approximativement la même pour chaque oligonucleotide. Ceci permet de préparer des fragments d'ADN correspondant à chaque gène par l'utilisation de conditions de PCR appropriées dans un environnement hautement automatisé. Les fragments amplifiés sont ensuite immobilisés sur des filtres ou des supports en verre, silicium ou polymères synthétiques et ces

milieux sont utilisés pour l'hybridation.

La disponibilité de tels filtres et/ou puces et de la séquence génomique correspondante annotée permet d'étudier l'expression de grands ensembles, voire de la totalité des gènes dans les micro-organismes associés à Streptococcus agalactiae et Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403), en préparant les ADNs complémentaires, et en les hybridant à 1'ADN ou aux oligonucléotides immobilisés sur les filtres ou les puces. De méme, les filtres et/ou les puces permettent d'étudier la variabilité des souches ou des espèces, en préparant 1'ADN de ces organismes et en les

hybridant à 1'ADN ou aux oligonucléotides immobilisés sur les filtres ou les puces.

Les différences entre les séquences génomiques des différentes souches ou espèces peuvent grandement affecter l'intensité de l'hybridation et, par conséquent, perturber l'interprétation des résultats. I1 peut donc être nécessaire d'avoir la séquence précise des gènes de la souche que l'on souhaite étudier. La méthode de détection des gènes décrite plus loin en détail, impliquant la détermination de la séquence de fragments aléatoires d'un génome, et les organisant d'après la séquence du génome de Streptococcus agalactiae, notamment de Streptococcus agalactiae CIP 82. 45 (ATCC

12403) divulguée dans la présente invention, peut être très utile.

Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisces dans des puces à ADN pour effectuer l'analyse de mutations. Cette analyse repose sur la constitution de puces capables d'analyser chaque base d'une séquence nucléotidique selon l'invention. On pourra notamment à cette fin mettre en _uvre les techniques de microséquençage sur puce à ADN. Les mutations sont détectées par extension d'amorces immobilisées hyDridant à la matrice des séquences analysées, juste en position adjacente de celle du nucléotide muté recherché. Une matrice simple brin, ARN ou ADN, des séquences à analyser sera avantageusement préparée selon des méthodes classiques, à partir de produits amplifiés selon les techniques de type PCR. Les matrices d'ADN simple brin, ou d'ARN ainsi obtenues sont alors déposées sur la puce à ADN,

dans des conditions permettant leur hybridation spécifique aux amorces immobilisées.

Une polymérase thermostable, par exemple la Tth ou la Taq ADN polymérase, étend spécifiquement l'extrémité 3' de l'amorce immobilisée avec un analogue de nucléotide marqué complémentaire du nucléotide en position du site variable; par exemple, un cyclage thermique est réalisé en présence des didéoxyribonucléotides fluorescents. Les conditions expérimentales seront adaptées notamment aux puces employées, aux

amorces immobilisées, aux polymérases employées, et au système de marquage choisi.

Un avantage du microséquençage, par rapport aux techniques basces sur l'hybridation de sondes, est qu'il permet d'identifier tous les nucléotides variables avec une discrimination optimale dans des conditions de réactions homogènes; utilisé sur des puces à ADN, il permet une résolution et une spécificité optimales pour la détection

routinière et industrielle de mutations en multiplex.

Une puce à ADN ou un filtre peut être un outil extrêmement intéressant pour la détermination, la détection et/ou l'identification d'un microorganisme. Ainsi, on préfère également les puces à ADN selon l'invention qui contiennent en outre au moins une séquence nucléotidique d'un microorganisme autre que Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou Streptococcus agalactine, immobilisée sur le support de ladite puce. De préPérence, le micro-organisme choisi l'est parmi les bactéries du genre Streptococcus (ci-après désignées comme bactéries associées à Streptococcus

agalactiae), ou les variants de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403).

Une puce à ADN ou un filtre selon l'invention est un élément très utile de certains kits ou nécessaires pour la détection et/ou 1'identification de micro-organismes, en particulier les bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine ou les

micro-organismes associés, également objets de l'invention.

Par ailleurs, les puces à ADN ou les filtres selon l'invention, contenant des sondes ou amorces spécifiques de Streptococcus agalactiae, sont des éléments très avantageux de kits ou nécessaires pour la détection et/ou la quantification de

l'expression de gènes de Streptococcus agalactine (ou de micro-organismes associés).

En effet, le contrôle de l'expression des gènes est un point critique pour optimiser la croissance et le rendement d'une souche, soit en permettant l'expression d'un ou plusieurs gènes nouveaux, soit en modifiant l'expression de gènes déjà présents dans la cellule. La présente invention fournit l'ensemble des séquences naturellement actives chez Streptococcus agalactiae permettant l'expression des gènes. Elle permet ainsi la détermination de l'ensemble des séquences exprimées chez Streptococcus agalactine. Elle fournit également un outil permettant de repérer les gènes dont l'expression suit un schéma donné. Pour réaliser cela, l'ADN de tout ou partie des gènes de Streptococcus agalactiae peut être amplifié grâce à des amorces selon l'invention, puis fixé à un support comme par exemple le verre ou le nylon ou une puce à ADN, afin de construire un outil permettant de suivre le pro fil d' expression de ces gènes. C et outi l, constitué de ce support contenant les séquences codantes sert de matrice d'hybridation à un mélange de molécules marquées reflétant les ARNs messagers exprimés dans la cellule (en particulier les sondes marquées selon l'invention). En répétant cette expérience à différents instants et en combinant l'ensemble de ces donnces par un traitement approprié, on obtient alors les profils d'expression de l'ensemble de ces gènes. La connaissance des séquences qui suivent un schéma de régulation donné peut aussi être mise à profit pour rechercher de manière dirigée, par exemple par homologie, d'autres séquences suivant globalement, mais de manière légèrement différente le même schéma de régulation. En complément, il est possible d'isoler chaque séquence de contrôle présente en amont des segments servant de sondes et d'en suivre l'activité à l'aide de moyen approprié comme un gène rapporteur (lociférase,,B-galactosidase, GFP). Ces séquences isolées peuvent ensuite être modifiées et assemblées par ingénierie

métabolique avec des séquences d'intérêt en vue de leur expression optimale.

L'invention concerne également les polypeptides codés par une séquence nucléotidique selon l'invention, de préférence, par un fragment représentatif des séquences précédentes et correspondant à une séquence ORF. En particulier, les polypeptides de Streptococcus agalactine CIP 82. 45 (ATCC 12403) de SEQ ID No. 140

à SEQ ID No. 2344 sont objet de l'invention.

L'invention comprend également les polypeptides caractérisés en ce qu'ils comprennent un polypeptide choisi parmi: a) un polypeptide selon l'invention; b) un polypoptide présentant au moins 80 % de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 98 % d'identité avec un polypeptide selon l'invention; c) un fragment d'au moins S acides aminés, de préférence d'au moins lO, lS, 20, 25, 3O, 40, SO, 75 et lOO acides aminés d'un polypeptide selon l'invention, ou tel que défini en b); d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide selon l'invention, ou tel que défini en b) ou c); et e) un polypeptide selon l'invention, ou tel que défini en b), c) ou d) modifié et comportant au plus lO /0, S % ou l % d'acides aminés modifiés par rapport à la

séquence de rétérence.

Les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides décrits

précédemment sont également objet de l'invention.

Dans la présente description, les termes polypeptides, séquences

polypeptidiques, peptides et protéines sont interchangeables. Le terme polypeptide

comprend toute séquence d'acides aminés permettant de générer une réponse anticorps.

Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel. En revanche, elle concerne ceux qui ont pu être isolés ou obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, ou par synthèse chimique, et qu'ils peuvent alors comporter des acides aminés non naturels comme cela

sera décrit plus loin.

Par polypeptide présentant un certain pourcentage d'identité avec un autre, que l'on désignera également par polypeptide homologue, on entend désigner les polypoptides présentant par rapport aux polypeptides naturels, certaines modifications, en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation, un allongement, une solution chimérique et/ou une mutation, ou les polypeptides présentant des modifications post-traductionnelles. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présentent au moins %, de préférence 85 %, 90 /0, 9S % et 98 % d'homologie avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acide(s) aminé(s) consécutif(s) ou non consécutif(s) sont remplacés par des acides aminés " équivalents ". L'expression "acides aminés équivalents " vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les activités biologiques des

peptides correspondant telles qu'elles seront définies par la suite.

Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur des résultats d'essais comparatifs d'activité biologique entre les différents polypeptides

susceptibles d'être effectués.

A titre d'exemple' on mentionne les possibilités de substitution susceptibles d'être effectuées sans qu'il résulte en une modification approfondie de l'activité biologique du polypoptide modifié correspondant. On peut remplacer ainsi la leucine par la valine ou l'isolencine, l'acide aspartique par l'acide glutamine, la glutamine par l'asparagine, l'arginine par la lysine, etc., les substitutions inverses étant naturellement

envisageables dans les mêmes conditions.

Les polypeptides homologues correspondent également aux polypoptides codés par les séquences nucléotidiques homologues ou identiques, telles que définies précédemment et comprennent ainsi dans la présente définition des polypeptides mutés ou correspondant à des variations inter ou intra espèces, pouvant exister chez Streptococcus, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions,

délétions et/ou additions, d'au moins un résidu d'acides aminés.

Il est entendu que l'on calcule le pourcentage d'identité entre deux polypeptides de la même façon qu'entre deux séquences d'acides nucléiques. Ainsi, le pourcentage d'identité entre deux polypeptides est calculé après alignement optimal de ces deux séquences, sur une fenêtre d'homologie maximale. Pour définir ladite fenêtre d'homologie maximale, on peut utiliser les mêmes algorithmes que pour les séquences

d'acide nucléique.

Par fragment biologiquement actif d'un polypeptide selon l'invention, on entend désigner en particulier un fragment de polypeptide, tel que défini ci-après, présentant au moins une des caractéristiques biologiques des polypeptides selon 1'invention, notamment en ce qu'il est capable d'exercer de manière générale une activité même partielle, telle que par exemple: - une activité enzymatique (métabolique) ou une activité pouvant être impliquée dans la biosynthèse ou la biodégradation de composés organiques ou inorganiques; - une activité structurelle (enveloppe cellulaire, molécule chaperonne, ribosome); une activité de transport (d'énergie, d'ion); ou dans la sécrétion de protéine; - une activité dans le processus de réplication, amplification, préparation, transcription, traduction ou maturation, notamment de l'ADN, de l'ARN ou des protéines. Par fragment de polypeptide selon l'invention, on entend désigner un polypeptide comportant au minimum 5 acides aminés, de préférence d'au moins 10, l S.

, 25, 30, 40, 50, 75, 100 et 150 acides aminés.

Les fragments de polypeptides peuvent correspondre à des fragments isolés ou purifiés naturellement présents dans les souches de Streptococc?ls, ou à des fragments qui peuvent être obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolitique telle que la trypsine ou la chymotrypsine ou la collagénase, par un réactif chimique (bromure de cyanogène, CNBr) ou en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide (par exemple à pH = 2,5). Des fragments polypeptidiques peuvent également être préparés par synthèse chimique, à partir d'hôtes transformés par un vecteur d'expression selon l'invention qui contiennent un acide nucléique permettant I'expression dudit fragment, et placé sous le contrôle des éléments de régulation et/ou

d'expression appropriés.

Par " polypeptide modifié " d'un polypeptide selon l'invention, on entend désigner un polypoptide obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique comme décrit plus loin, qui présente au moins une modification par rapport à la séquence normale. Ces modifications peuvent être notamment portées sur des acides aminés nécessaires pour la spécificité ou l'efficacité de l'activité, ou à l'origine de la conformation structurale, de la charge, ou de l'hydrophobicité du polypeptide selon l'invention. On peut ainsi créer des polypeptides d'activité équivalente, augmentée ou diminuée, ou de spécificité équivalente, plus étroite ou plus large. Parmi les polypeptides modifiés, il faut citer les polypeptides dans lesquels jusqu'à cinq acides aminés peuvent être modifiés, tronqués à l'extrémité N ou C-terminale, ou bien délétés,

ou ajoutés.

Comme cela est indiqué, les modifications d'un polypeptide ont pour objectif notamment: - de permettre sa mise en _uvre dans des procédés de biosynthèse ou de biodégradation de composés organiques ou inorganiques, de permettre sa mise en _uvre dans des procédés de réplication, d'amplification, de réparation et règle de transcription, de traduction, ou de maturation notamment de l'ADN, I'ARN, ou de protéines, - de permettre sa sécrétion améliorée, - de modifier sa solubilité, l'efficacité ou la spécificité de son activité, ou

encore de faciliter sa purification.

La synthèse chimique présente également l'avantage de pouvoir utiliser des acides aminés non naturels ou des liaisons non peptidiques. Ainsi, il peut étre intéressant d'utiliser des acides aminés non naturels, par exemple sous forme D, ou des

analogues d'acides aminés, notamment des formes souffrées.

La présente invention fournit la séquence nucléotidique du génome de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) sous forme de contigs, ainsi que

1 0 certaines séquences polypeptidiques.

D'une manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans la

biosynthèse des acides aminés.

1 5 De manière prétérée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans la

biosynthèse des cofacteurs, groupes prosthétiques et transporteurs.

De manière prétérée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide d'enveloppe cellulaire ou présent à la surface de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou pour

un de ses fragments.

De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans la

machinerie cellulaire.

De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans le

métabolisme intermédiaire central.

De manière prétérée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans le

métabolisme énergétique.

De manière préférce, I'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans le

métabolisme des acides gras et des phospholipides.

De manière prétérce, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans le

métabolisme des nucléotides, des purines, des pyrimidines ou nucléosides.

De manière préLérée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans les

fonctions de régulation.

De manière préférée, I'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments impliqué dans le processus

de réplication.

De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypoptide de Streptococcus agalactine CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments impliqué dans le processus

de transcription.

De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisce en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments impliqué dans le processus

de traduction.

de transport et de liaison des protéines.

De manière prétérée, I'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments impliqué dans l'adaptation

aux conditions atypiques.

De manière préférée, I'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments dans la sensibilité aux

médicaments et analogues.

De manière préférée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué dans les

fonctions relatives aux transposons.

De manière préDérée, l'invention est relative à une séquence nucléotidique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide spécifique de

Streptococcus agalactiae CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments.

Sous un autre aspect, de manière préférce, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP82.45(ATCC 12403)ou un de ses fragments impliqué

dans la biosynthèse des acides aminés.

Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP82.45(ATCC 12403)ou un de ses fragments impliqué

dans la biosynthèse des coLacteurs, groupes prosthétiques et transporteurs.

Sous un autre aspect, de manière préLérée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide d'enveloppe cellulaire ou de surface de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC

12403)ou un de ses fragments.

Sous un autre aspect, de manière préférce, I'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP82.45(ATCC 12403)ou un de ses fragments impliqué

dans la machinerie cellulaire.

Sous un autre aspect, de manière prétérée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP82.45(ATCC 12403)ou un de ses fragments impliqué

dans le métabolisme intermédiaire central.

Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP82.45(ATCC12403)ou un de ses fragments impliqué

dans le métabolisme énergétique.

Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué

dans le métabolisme des acides gras et des phospholipides.

Sous un autre aspect, de manière prétérée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué

dans le métabolisme des nucléotides, des purines, des pyrimidines ou nucléosides.

Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un 1 0 polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragrnents impliqué

dans les fonctions de régulation.

dans le processus de réplication.

Sous un autre aspect, de manière préLérée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué

dans le processus de transcription.

Sous un autre aspect, de manière prétérée, I'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué

dans le processus de traduction.

Sous un autre aspect, de manière prétérée, I'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué

dans le processus de transport et de liaison des protéines.

dans l'adaptation aux conditions atypiques.

Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments dans la

sensibilité aux médicaments et analogues.

Sous un autre aspect, de manière préférée, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments impliqué

dans les fonctions relatives aux transposons.

Sous un autre aspect, de manière prétérce, l'invention a pour objet un polypeptide selon l'invention, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polypeptide spécifique

de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un de ses fragments.

L'invention a également pour objet les opérons impliqués dans la synthèse

d'antibiotiques et/ou de toxines.

Le tableau 1 fournit la liste de certains polypeptides selon l'invention, ainsi que leur localisation dans les séquences SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139, et les analogies

observées après comparaison dans les bases de données.

Il est important de noter toutefois qu'un organisme vivant est un tout et doit être pris comme tel. Ainsi, afin de pouvoir se développer et exhiber ses propriétés, tout organisme a besoin d'interactions entre les différentes voies métaboliques. Ainsi, la classification énoncée cidessus ne doit pas être considérée comme limitative, un gène

pouvant être impliqué dans deux voies métaboliques distinctes.

La présente invention a également pour objet les séquences nucléotidiques et/ou de polypeptides selon l'invention, caractérisées en ce que lesdites séquences sont enregistrces sur un support d'enregistrement dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et/ou l'exploitation de ladite ou desdites séquence(s). Ces supports peuvent également contenir d'autres informations extraites de la présente invention, notamment lesanalogies avec des séquences déjà connues, et/ou des informations concernant les séquences nucléotidiques et/ou de polypeptides d'autres micro

* organismes afin de faciliter l'analyse comparative et l'exploitation des résultats obtenus.

Parmi cesdits supports d'enregistrement, on prétère en particulier les supports lisibles par un ordinateur, tels les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides, en particulier les disquettes informatiques, les CD-ROM, les serveurs

informatiques. De tels supports d'enregistrement sont également objet de l'invention.

Les supports d'enregistrement selon l'invention, avec les informations apportées, sont très utiles pour le choix d'amorces ou de sondes nucléotidiques pour la détermination de gènes dans Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou souches proches de cet organisme. De même, l'utilisation de ces supports pour l'étude du polymorphisme génétique de souches proches de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403), en particulier par la déterrnination des régions de colinéarité, est très utile dans la mesure o ces supports fournissent non seulement la séquence nucléotidique du génome de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403), mais également l'organisation génomique dans ladite séquence. Ainsi, les utilisations de

supports d'enregistrement selon l'invention sont également des objets de l'invention.

L'analyse d'homologie entre différentes séquences s'effectue en effet avantageusement à l'aide de logiciels de comparaison de séquences, tels le logiciel

Blast, ou les logiciels de la trousse GCG, décrits précédemment.

L'invention vise également les vecteurs de clonage et/ou d'expression, qui

contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention.

Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui 1 5 permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule

hôte détermince.

Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir étre maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein

de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.

De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que la lipofection, l'électroporation, le choc

thermique, ou des méthodes chimiques.

Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner

ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention.

L'invention comprend également les cellules hôtes transforrnées par un vecteur

selon l'invention.

L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animal es, en p articulier les cellules de mammi fères. On peut également utili ser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont en particulier les cellules procaryotes, de prétérence les bactéries appartenant au genre Streptococcus, à l'espèce Streptococcus agalactine, plus

particulièrement Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403), ou les micro-

organismes associés à l'espèce Streptococcus agalactine.

L'invention concerne également les végétaux et les animaux, excepté l'homme, qui comprennent une cellule transformée selon l'invention. Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en _uvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression dudit

polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant.

Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifer des séquences nucléotidiques selon 1'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilitée par le fait qu'elles sont présentent dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à

l'intérieur des cellules hôtes.

On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse

chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention.

L'homme du métier connait les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en _uvre des phases solides (voir notamment Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants

sont également compris dans l'invention.

L'invention est en outre relative à des polypeptides hybrides présentant au moins un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention, et une séquence d'un

polypeptide susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal.

Avantageusement, le déterminant antigénique est tel qu'il est susceptible d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire. Un tel déterminant pourra comprendre un polypeptide ou un de ses fragments selon l'invention sous forme glycosylée, utilisé en vue d'obtenir des compositions immunogènes susceptibles d'induire la synthèse d'anticorps dirigés contre des épitopes multiples. Lesdits polypeptides ou leurs fragments glycosylés font également partie de

1 0 l'invention.

Ces molécules hybrides peuvent être constituces en partie d'une molécule porteuse de polypeptides ou de leurs fragments selon l'invention, associée à une partie éventuellement immunogène, en particulier un épitope de la toxine diphtérique, la toxine tétanique, un antigène de surface du virus de l'hépatite B (brevet FR 79 21811), l'antigène VP1 du virus de la poliomyélite ou toute autre toxine ou antigène viral ou bactérien. Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des séquences nucléotidiques hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines

de fusion décrite par Minton en 19&4.

Lesdites séquences nucléotidiques hybrides codant pour un polypeptide hybride ainsi que les polypeptides hybrides selon l'invention, caractérisés en ce qu'il s'agit de polypeptides recombinants obtenus par l'expression desdites séquences nucléotidiques

hybrides, font également partie de l'invention.

L'invention comprend également les vecteurs caractérisés en ce qu'ils contiennent une desdites séquences nucléotidiques hybrides. Les cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs, les animaux transgéniques comprenant une desdites cellules transformées ainsi que les procédés de préparation de polypeptides recombinants utilisant lesdits vecteurs, lesdites cellules transformées et/ou lesdits

animaux transgéniques font également partie de l'invention.

Le couplage entre un polypeptide selon l'invention et un polypeptide immunogène peut être effectué par voie chimique, ou par voie biologique. Ainsi, selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs élément(s) de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter l es réactions de coupl age entre le pol ypeptide selon l'invention, et le polypeptide immunostimulateur, le couplage covalent de l'antigène immunostimulateur pouvant être réalisé à l'extrémité N ou C-terminale du polypeptide selon l'invention. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage sont déterminés en fonction de 1'extrémité choisie pour réaliser ce couplage, et les techniques de couplage

sont bien connues de l'homme du métier.

Les conjugués issus d'un couplage de peptides peuvent être également préparés par recombinaison génétique. Le peptide hybride (conjugué) peut en effet être produit par des techniques d'ADN recombinant, par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour le polypeptide selon 1'invention, d'une séquence codant pour le ou les peptide(s) antigène(s), immunogène(s) ou haptène(s). Ces techniques de préparation de peptides hybrides par recombinaison génétique sont bien connues de l'homme du métier

(voir par exemple Makrides, 1996, Microbiological Reviews 60,512-538).

De prétérence, ledit polypoptide immunitaire est choisi dans le groupe des peptides contenant les anatoxines, notamment le toxoide diphtérique ou le toxoide tétanique, les protéines dérivées du Streptocoque (comme la protéine de liaison à la séralbumine humaine), les protéines membranaires OMPA et les complexes de protéines de membranes externes, les vésicules de membranes externes ou les protéines

de chocs thermiques.

Les polypeptides hybrides selon l'invention sont très utiles pour obtenir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux, capables de reconnaître spécifiquement les polypeptides selon l'invention. En effet, un polypeptide hybride selon l'invention permet la potentialisation de la réponse immunitaire, contre le polypeptide selon l'invention couplé à la molécule immunogène. De tels anticorps monoclonaux ou polyclonaux, leurs fragments, ou les anticorps chimériques, reconnaissant les

polypoptides selon l 'invention, sont également objet de l 'invention.

Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridome décrite par Kohler et Milstein (1975, Nature 256, 495). Les anticorps selon l'invention sont par exemple des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab, ou F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal

détectable et/ou quantifiable.

Ainsi, les anticorps selon l'invention peuvent être employés dans un procédé pour la détection etlou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine ou à un micro-organisme associé dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention;

b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.

Les anticorps selon la présente invention sont également utilisables afin de détecter une expression d'un gène de Streptococcus agalactiae ou de micro-organismes associés. En effet, la présence du produit d' expression d'un gène reconnu par un anticorps spécifique dudit produit d'expression peut être détectée par la présence d'un complexe antigène-anticorps formé après la mise en contact de la souche de Streptococcus agalactiae ou du micro-organisme associé avec un anticorps selon l'invention. La souche bactérienne utilisée peut avoir été "préparée", c'est-à-dire centrifugée, lysée, placée dans un réactif approprié pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique. En particulier, on préfère un procédé de détection de l'expression dans le gène, correspondant à un Western blot, pouvant être effectué après une électrophorèse sur gel de polyacrylamide d'un Iysat de la souche bactérienne, en présence ou en l'absence de conditions réductrices (SDS-PAGE). Après migration et séparation des protéines sur le gel de polyacrylamide, on transfère lesdites protéines sur une membrane appropriée (par exemple en nylon) et on détecte la présence de la protéine ou du polypeptide d'intérêt, par mise en contact de ladite membrane avec un

anticorps selon l'invention.

Ainsi, la présente invention comprend également les kits ou nécessaires pour la mise en _uvre d'un procédé tel que décrit (de détection de l'expression d'un gène de Streptococcus agalactiae ou d'un microorganisme associé, ou pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine ou un microorganisme associé), comprenant les éléments suivants: a) un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention; b) éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes antigène

anticorps produits par la réaction immunologique.

Les polypeptides et les anticorps selon l'invention peuvent avantageusement être immobilisés sur un support, notamment une puce à protéines. Une telle puce à protéines est un obJet de l'invention, et peut également contenir au moins un polypeptide d'un micro-organisme autre que Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou un anticorps dirigé contre un composé d'un micro-organisme autre que Streptococcus

agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403).

Les puces à protéines ou filtres à haute densité contenant des protéines selon l'invention peuvent être construites de la même manière que les puces à ADN selon l'invention. En pratique, on peut effectuer la synthèse des polypeptides directement fixés sur la puce à protéines, ou effectuer une synthèse ex situ suivie d'une étape de fixation sur ladite puce du polypeptide synthétisé. Cette dernière méthode est prétérable, lorsque l'on désire fixer des protéines de taille importante sur le support, ces protéines étant avantageusement préparées par génie génétique. Toutefois, si l'on ne désire fixer que des peptides sur le support de ladite puce, il peut être plus intéressant de procéder à

la synthèse desdits peptides directement in situ.

Les puces à protéines selon l'invention peuvent être avantageusement utilisées 1 5 dans des kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries associces à l'espèce Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un micro organisme, ou de façon plus générale dans des kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de micro-organismes. Lorsque l'on fixe les polypeptides selon l'invention sur les puces à ADN, on recherche la présence d'anticorps dans les échantillons testés, la fixation d'un anticorps selon l'invention sur le support de la puce

à protéines permettant l'identification de la protéine dont ledit anticorps est spécifique.

De préférence, on fixe un anticorps selon l'invention sur le support de la puce à protéines, et on détecte la présence de l'antigène correspondant, spécifique de

Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou d'un micro-organisme associé.

Une puce à protéines ci-dessus décrite peut être utilisée pour la détection de produits de gènes, pour établir un profil d'expression desdits gènes, en complément

d'une puce à ADN selon l'invention.

Les puces à protéines selon l'invention sont également extrémement utiles pour les expériences de protéomique, qui étudie les interactions entre les différentes protéines d'un micro-organisme donné. De façon simplifiée, on fixe des peptides représentatifs des différentes protéines d'un organisme sur un support. Puis, on met ledit support en contact avec des protéines marquées, et après une étape optionnelle de rinçage, on détecte des interactions entre lesdites protéines marquées et les poptides fixés sur la ,.

puce a protemes.

Ainsi, les puces à protéines comprenant une séquence polypeptidique selon l 'invention ou un anticorps selon l 'invention sont objet de l 'invention, ainsi que les kits

ou nécessaires les contenant.

La présente invention couvre également un procédé de détection et/ou d'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un micro-organisme associé dans un échantillon biologique, qui

met en _uvre une séquence nucléotidique selon l'invention.

I1 doit être entendu que le terme échantillon biologique concerne dans la présente invention les échantillons prélevés à partir d'un organisme vivant (en particulier sang, tissus, organes ou autres prélevés à partir d'un mammifère) ou un échantillon contenant du matériel biologique, c'està-dire de l'ADN ou de l'ARN. Un tel échantillon biologique comprend aussi les compositions alimentaires contenant des bactéries (par exemple les fromages, les produits laitiers), mais également des compositions alimentaires contenant des levures (bières, pains) ou autres. Le terme 1 5 échantillon biologique concerne aussi les bactéries isolées à partir de ces prélèvements

ou compositions alimentaires.

Le procédé de détection et/ou d'identification mettant en _uvre les séquences

nucléotidiques selon l'invention peut être de diverse nature.

On préfère un procédé comportant les étapes suivantes: a) éventuellement, isolement de 1'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de 1'ARN de l'échantillon blologique; b) amplification spécifique de 1'ADN de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un micro-organisme associé à l'aide d'au moins une amorce selon l'invention;

c) mise en évidence des produits d'amplification.

Ce procédé est basé sur l'amplification spécifique de 1'ADN, en particulier par

une réaction d'amplification en châîne.

On préfère également un procédé comprenant les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde nucléotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un micro organisme associé; b) mise en évidence de l'hybride éventuellement formé entre la sonde nucléotidique et

l'ADN de l'échantillon biologique.

Un tel procédé ne doit pas étre limité à la détection de la présence de l'ADN contenu dans l'échantillon biologique à tester, il peut être également mis en _uvre pour détecter 1'ARN contenu dans ledit échantillon. Ce procédé englobe en particulier les

Southern et Northern blot.

Un autre procédé préLéré selon l'invention comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde nucléotidique immobilisée sur un support selon l'invention avec un échantillon biologique, I'acide nucléique de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un micro-organisme associé; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde nucléotidique immobilisée sur un support et l'acide nucléique contenu dans 1'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de 1'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde nucléotidique marquée selon l'invention;

c) mise en évidence du nouvel hybride formé à l'étape b).

Ce procédé est avantageusement utilisé avec une puce à ADN selon l'invention, l'acide nucléique recherché s'hybridant avec une sonde présente à la surface de ladite puce, et étant détecté par l'utilisation d'une sonde marquée. Ce procédé est avantageusement mis en _uvre en combinant une étape préal able d ' amplification de l'ADN ou de l'ADN complémentaire obtenu éventuellement par transcription inverse, à

l'aide d'amorces selon l'invention.

Ainsi, la présente invention englobe également les kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un microorganisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde nucléotidique selon l'invention; b) éventuellement, les réactifs nécessaires à la mise en _uvre d'une réaction d'hybridation; c) éventuellement, au moins une amorce selon l'invention ainsi que les réactifs

nocessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.

De méme, la présente invention englobe également les kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identifcation de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un microorganisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde nucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, selon l'invention; c) éventuellement, au moins une amorce selon l'invention ainsi que les réactifs

nécessaires à une réaction d'amplification de 1'ADN.

Enfin, les kits ou nécessaires pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) ou à un micro-organisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) au moins une amorce selon l'invention; b) éventuellement, les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN; c) éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique selon l'invention,

sont également objet de la présente invention.

De préférence, lesdites amorces et/ou sondes et/ou polypeptides et/ou anticorps selon la présente invention utilisés dans les procédés et/ou kits ou nécessaires selon la présente invention sont choisis parmi les amorces et/ou sondes et/ou polypeptides et/ou

anticorps spécifiques de l'espèce Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403).

De manière préférée, ces éléments sont choisis parmi les séquences nucléotidiques codant pour une protéine sécrétée, parmi les polypeptides sécrétés, ou parmi les anticorps dirigés contre des polypeptides sécrétés de Streptococcus agalactine CIP

82.45 (ATCC 12403).

La présente invention a également pour objet les souches de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) et/ou de micro-organismes associés contenant une ou plusieurs mutation(s) dans une séquence nucléotidique selon l'invention, en

particulier une séquence ORF, ou leurs éléments régulateurs (en particulier promoteurs).

On prélère, selon la présente invention, les souches de Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) présentant une ou plusieurs mutation(s) dans les séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides impliqués dans la machinerie cellulaire, en particulier la sécrétion, le métabolisme intermédiaire central, le métabolisme énergétique, les processus de synthèse des acides aminés, de transcription et de

traduction, de synthèse des polypeptides.

Lesdites mutations peuvent mener à une inactivation du gène, ou en particulier lorsqu'elles sont situées dans les éléments régulateurs dudit gène, à une surexpression de celui-ci. L'invention concerne en outre l'utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'invention, d'un polypeptide selon l'invention, d'un anticorps selon l'invention, d'une cellule selon l 'invention, et/ou d 'un animal transformé selon l 'invention, pour la sélection de composé organique ou inorganique capable de moduler, de réguler, d'induire ou d'inhiber 1'expression de gènes, etlou de modifier la réplication cellulaire de cellules eucaryotes ou procaryotes ou capables d'induire, d'inhiber ou d'aggraver une pathologies liées à une infection par Streptococcus agalactine ou un de ses micro

organismes associés.

L'invention comprend également une méthode de sélection de composés capables de se lier à un polypeptide ou un de ses fragments selon 1'invention, capables de se lier à une séquence nucléotidique selon l'invention, ou capables de reconnaître un anticorps selon l'invention, et/ou capables de moduler, de réguler, d'induire ou d'inhiber l'expression de gènes, et/ou de modifier la croissance ou la réplication cellulaire de cellules eucaryotes ou procaryotes, ou capables d'induire, d'inhiber ou d'aggraver chez un organisme animal ou humain une pathologie liée à une infection par Streptococcus, par exemple par Streptococcus agalactine, ou un de ses micro-organismes associés, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide, ladite séquence nucléotidique, avec une cellule transformée selon l'invention et/ou administration dudit composé à un animal transformé selon 1'invention; b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence nucléotidique, ou de moduler, de réguler, d'induire ou d'inhiber l'expression de gènes, ou de moduler la croissance ou la réplication cellulaire, ou d'induire, d'inhiber ou d'aggraver chez ledit animal transformé les pathologies liées à une infection par Streptococcus, par exemple Streptococcus agalactine ou un de ses

micro-organismes associés.

Les cellules et/ou les animaux transformés selon l'invention, pourront avantageusement servir de modèle et être utilisés dans des procédés pour étudier, identifier et/ou sélectionner des composés susceptibles d'être responsables de pathologies induites ou aggravées par Streptococcus agalactine, ou susceptibles de prévenir et/ou de traiter ces pathologies. En particulier, les cellules hôtes transformées, notamment les bactéries de la famille des Streptococcus dont la transformation par un vecteur selon l'invention peut par exemple accroître ou inhiber son pouvoir infectieux, ou moduler les pathologies habituellement induites ou aggravées par l'infection, pourront être utilisées pour infecter des animaux dont on suivra l'apparition des pathologies. Ces animaux non transformés, infectés par exemple avec des bactéries Streptococcus transformoes, pourront servir de modèle d'étude. De la même manière, les animaux transformés selon l'invention pourront être utilisés dans des procédés de sélection de composés susceptibles de prévenir et/ou de traiter les maladies dues à Streptococcus. Lesdits procédés utilisant lesdites cellules transformées et/ou animaux

transformés, font partie de l'invention.

Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de carbone ou tous autres composés organiques ou inorganiques déjà connus, ou des composésorganiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthèse

chimique ou biochimique, ces techniques étant connues de l'homme de l'art.

Lesdits composés sélectionnés pourront être utilisés pour moduler la croissance et/ou la réplication cellulaire de Streptococcus agalactine ou tout autre micro-organisme associé et ainsi pour contrôler l'infection par ces micro-organismes. Lesdits composés selon l'invention pourront également être utilisés pour moduler la croissance et/ou la réplication cellulaire de toutes cellules encaryotes ou procaryotes, notamment les cellules tumorales et les micro-organismes infectieux, pour lesquelles lesdits composés s'avéreront actifs, les méthodes permettant de déterminer lesdites modulations étant

bien connues de l'homme de l'art.

On entend désigner par composé capable de moduler la croissance d'un micro organisme tout composé permettant d'intervenir, de modifier, de limiter et/ou de réduire le développement, la croissance, la vitesse de prolifération et/ou la viabilité dudit micro organisme. Cette modulation peut être réalisée par exemple par un agent capable de se lier à une protéine et ainsi d'inhiber ou de potentialiser son activité biologique, ou capable de se lier à une protéine membranaire de la surface extérieure d'un micro-organisme et de bloquer la pénétration dudit micro-organisme dans la cellule hôte ou de favoriser l'action du système immunitaire de l'organisme infecté dirigé à l'encontre dudit micro organisme. Cette modulation peut être également réalisée par un agent capable de se lier à une séquence nucléotidique d'un ADN ou ARN d'un micro-organisme et de bloquer par exemple l'expression d'un polypeptide dont l'activité biologique ou structurelle est

nécessaire à la croissance ou à la reproduction dudit micro-organisme.

On entend désigner par micro-organisme associé dans la présente invention, tout micro-organisme dont l'expression de gène peut être modulée, régulée, induite ou inhibée, ou dont la croissance ou la réplication cellulaire peut être également modulée par un composé de l'invention. On entend désigner également par micro-organisme associé dans la présente invention, tout micro-organisme comportant des séquences nucléotidiques ou des polypeptides selon 1'invention. Ces micro-organismes peuvent dans certains cas comporter des polypeptides ou des séquences nucléotidiques identiques ou homologues à celles de l'invention et pourront également être détectés etlou identifiés par les procédés ou kit de détection et/ou d'identification selon l'invention et également servir de cible pour les composés de l'invention. On entend aussi désigner par micro-organisme tout micro-organisme Streptococcus agalactine de

tout sérotype.

L'invention concerne les composés susceptibles d'être sélectionnés par une

méthode de sélection selon l'invention.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un composé choisi parmi les composés suivants: a) une séquence nucléotidique selon l'invention; b) un polypeptide selon l'invention; c) un vecteur selon l'invention; d) un anticorps selon l'invention; et e) un composé susceptible d'être sélectionné par une méthode de sélection selon l'invention,

éventuellement en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

La présente invention concerne en outre une composition pharmaceutique selon l'invention pour la prévention et le traitement d'une infection par une bactérie

appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine.

La présente invention concerne en outre une composition pharmaceutique selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend des anticorps dirigés contre les

polypeptides spécifques de Streptococcus agalactiae.

On entend désigner par quantité efficace, une quantité suffisante dudit composé ou anticorps, ou de polypeptide de l'invention, permettant de moduler la croissance de

Streptococcus agalactine ou d'un micro-organisme associé.

L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique selon l'invention pour la prévention ou le traitement d'une infection par une bactérie appartenant au genre

Streptococcus ou par un micro-organisme associé.

L'invention vise en outre une composition immunogène et/ou vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides selon l'invention et/ou

un ou plusieurs polypeptides hybrides selon l'invention.

L'invention comprend aussi l'utilisation d'une cellule transformée selon

l'invention, pour la préparation d'une composition vaccinale.

L'invention vise également une composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence nucléotidique selon l'invention, un vecteur selon l'invention

et/ou une cellule transformée selon l'invention.

L'invention concerne en outre une composition immunogène capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou humorale pour la prévention ou le traitement d'une infection par une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine, caractérisée en ce qu'elle comprend une composition immunogène ou une composition vaccinale selon l'invention, en association avec un véhicule pharmaceutiquement

acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants de l'immunité appropriés.

L'invention concerne également les compositions vaccinales selon l'invention, pour la prévention ou le traitement d'une infection par une bactérie appartenant au genre

Streptococcus ou par un micro-organisme associé.

De manière préférée, les compositions immunogènes et/ou vaccinales selon l'invention destinces à la prévention et/ou au traitement d'infection par Streptococcus ou par un micro-organisme associé seront choisies parmi les compositions immunogènes et/ou vaccinales comprenant un polypeptide ou un de ses fragments correspondant à une protéine, ou un de ses fragments, de l'enveloppe cellulaire de Streptococcus. Les compositions vaccinales comprenant des séquences nucléotidiques comprendront de préférence également des séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide ou un de ses fragments correspondant à une protéine, ou un de ses fragments, de l'enveloppe

cellulaire de Streptococcus.

Les polypeptides de l'invention ou leurs fragments entrant dans les compositions immunogènes selon l'invention peuvent être sélectionnés par des techniques connues de I'homme de l'art comme par exemple sur la capacité desdits polypeptides à stimuler les cellules T. qui se traduit par exemple par leur prolifération ou la sécrétion d'interleukines, ou qui aboutit à la production d'anticorps dirigés contre lesdits polypeptides. Chez la souris, chez laquelle une dose pondérale de la composition vaccinale comparable à la dose utilisée chez l'homme est adminiskée, la réaction anticorps est testée par prélèvement du sérum suivi d'une étude de la formation d'un complexe entre les anticorps présents dans le sérum et l'antigène de la composition vaccinale, selon les

techniques usuelles.

Selon l'invention, lesdites compositions vaccinales seront de préférence en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et, le cas échéant, avec un

ou plusieurs adjuvants de l'immunité appropriés.

Aujourd'hui, divers types de vaccins sont disponibles pour protéger l'homme contre des maladies infectieuses: micro-organismes vivants atténués (M. bovis - BCG pour la tuberculose), micro-organismes inactivés (virus de la grippe), des extraits acellulaires (Bordetella pertussis pour la coqueluche), protéines recombinées (antigène de surface du virus de l'hépatite B), des polyosides (pneumocoques). Des vaccins préparés à partir de peptides de synthèse ou de micro-organismes génétiquement modifiés exprimant des antigènes hétérologues sont en cours d'expérimentation. Plus récemment encore, des ADNs plasmidiques recombinés portant des gènes codant pour des antigènes protecteurs ont été proposés comme stratégie vaccinale alternative. Ce type de vaccination est réalisé avec un plasmide particulier dérivant d'un plasmide de

E. coli qui ne se réplique pas in vivo et qui code uniquement pour la protéine vaccinante.

Des animaux ont été immunisés en injectant simplement l'ADN plasmidique nu dans le muscle. Cette technique conduit à l'expression de la protéine vaccinale in situ et à une réponse immunitaire de type cellulaire (CTL) et de type humoral (anticorps). Cette double induction de la réponse immunitaire est l'un des principaux avantages de la

technique de vaccination avec de l'ADN nu.

Les compositions vaccinales comprenant des séquences nucléotidiques ou des vecteurs dans lesquels sont insérées lesdites séquences, sont notamment décrites dans la demande internationale N WO 90/11092 et également dans la demande internationale

N WO 95/11307.

La séquence nucléotidique constitutive de la composition vaccinale selon l'invention peut étre injectée à l'hôte après avoir été couplée à des composés qui favorisent la pénétration de ce polynucléotide à l'intérieur de la cellule ou son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules polymères, comme décrit dans la demande internationale N WO

94/27238 (Medisorb Technologies International).

Selon un autre mode de réalisation de la composition vaccinale selon l'invention, la séquence nucléotidique, de préférence un ADN, est complexée avec du DEAE-dextran, avec des protéines nucléaires, avec des lipides ou encapsulée dans des liposomes ou encore introduite sous la forme d'un gel facilitant sa transfection dans les cellules. Le polynucléotide ou le vecteur selon l'invention peut aussi être en suspension

dans une solution tampon ou être associé à des liposomes.

Avantageusement, un tel vaccin sera préparé conformément à la technique décrite par Tacson et al. ou Huygen et al. en 1996 ou encore conformément à la

technique décrite par Davis et al. dans la demande internationale N WO 95/11307.

Un tel vaccin peut être également préparé sous la forme d'une composition contenant un vecteur selon 1'invention, placce sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son expression chez l'homme ou l'animal. On pourra par exemple utiliser, en tant que vecteur d'expression in vivo de l'antigène polypeptidique d'intérêt, le plasmide pcDNA3 ou le plasmide pcDNA1/nco, tous les deux commercialisés par Invitrogen (R & D Systems, Abingdon, Royaume-Uni). Un tel vaccin comprendra avantageusement, outre le vecteur recombinant, une solution saline, par exemple une solution de chlorure

de sodium.

On entend désigner par véhicule pharmaceutiquement acceptable, un composé ou une combinaison de composés entrant dans une composition pharmaceutique ou vaccinale ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de 1'administration du composé actif, 1'augmentation de sa durée de vie etlou de son efEcacité dans l'organisme, I'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode

d'administration du composé actif choisi.

En ce qui concerne les formulations vaccinales, celles-ci peuvent comprendre des adjuvants de l'immunité appropriés qui sont connus de l'homme de l'art, comme par exemple l'hydroxyde d'aluminium, un représentant de la famille des muramyl peptides comme un des dérivés peptidiques du N-acétyl-muramyl, un Iysat bactérien, ou encore

l'adjuvant incomplet de Freund.

De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en

particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou sous-

cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, la composition vaccinale comprenant des polypeptides selon l'invention, sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps, par voie intradermique ou sous-cutanée. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les

1 0 effets secondaires constatés.

Enfin, l'invention comprend l'utilisation d'une composition selon l'invention, pour le traitement ou la prévention de maladies induites ou aggravées par la présence de

Strep to coccus.

Par ailleurs, la présente invention a également pour objet une banque d'ADN génomique d'une bactérie du genre Streptococcus, de manière prétérée, Streptococcus

agalactiae, de manière prétérée la CIP 82.45 (ATCC 12403).

La banque d'ADN génomique décrite dans la présente invention, en particulier la banque déposée à la CNCM le 28 décembre 2000 sous le numéro d'ordre N I-2610, recouvre en effet Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403). Toutefois, si certaines régions n'ont pas pu être clonées dans ladite banque, en raison de problèmes de létalités chez Escherichia coli, ces régions peuvent facilement être amplifiées et identifiées par l'homme du métier, en utilisant des oligonucléotides spécifiques des

séquences des extrémités des différents clones qui forment les contigs.

La présente invention concerne également les méthodes pour l'isolement d'un polynucléotide d'intérêt présent chez une souche de Streptococcus agalactine et absente chez une autre souche, qui utilise au moins une banque d'ADN basée par exemple sur

un plasmide pSYX34 contenant un fragment du génome de Streptococcus agalactine.

La méthode selon l'invention pour l'isolement d'un polynucléotide d'intérêt peut comprendre les étapes suivantes: a) isoler au moins un polynucléotide contenu dans un clone de la banque d'ADN d'origine de Streptococcus agalactine, b) isoler: - au moins un polynucléotide génomique ou ADNc d'une bactérie Streptococcus, ladite bactérie Streptococcus appartenant à une souche différente de la souche utilisée pour la construction de la banque d'ADN de l'étape a) ou, de façon alternative, - au moins un polynucléotide contenu dans un clone d'une banque d'ADN préparé à partir du génome d'une Streptococcus qui est différente de la souche Streptococcus agalactine utilisée pour la construction de la banque d'ADN de l'étape a); c) hybrider le polynucléotide de l'étape a) au polynucléotide de l'étape b); d) sélectionner les polynucléotides de l'étape a) qui n'ont pas formé de complexe d'hybridation avec les polynucléotides de l'étape b);

e) caractériser le polynucléotide sélectionné.

On peut préparer le polynucléotide de l'étape a) par la digestion d'au moins un clone recombinant avec une euzyme de restriction appropriée, et de façon optionnelle,

l'amplification de l 'insert polynucléotide qui en résulte.

Ainsi, la méthode de l'invention permet à l'homme du métier d'effectuer des études génomiques comparatives entre les différentes souches ou espèces du genre Streptococcus, par exemple entre les souches pathogéniques et leurs équivalents non pathogènes. En particulier, il est possible d'étudier et de déterminer les régions de

polymorphisme entre lesdites souches.

L'invention comprend aussi un procédé d'identification de séquence spécifique de Streptococcus agalactiae, caractérisé par l'alignement de séquences nucléotidiques de Streptococcus agalactine selon l'invention et le traitement de données obtenues par

cet alignement pour isoler les séquences spécifiques.

La présente invention concerne également l'utilisation des séquences nucléiques ou des polypeptides selon la présente invention: - pour la sécrétion de protéines, - comme facteurs de virulence, - pour le contrôle par l'intermédiaire du quorum-sensing, - pour l'identification de cibles pour les maladies humaines dont Streptococcus agalactiae est un modèle, et - pour l'identification de cibles contre les bactéries Gram positives pathogènes par la méthode de génomique soustractive (comme par exemple par comparaison avec

des bactéries Gram positives non pathogènes).

EXEMPLES

1) Matériel et méthode La stratégie de séquençage du génome de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) repose sur un séquençage alléatoire (shot-gun). La première étape de ce travail a consister à cloner 1'ADN génomique de la bactérie Streptococcus agalactiae

dans differents vecteurs (plasmides et BAC).

Matériels et méthodes.

1. Construction des banques: al Banque de petits fragments dans le vecteur pcDNA2.1 L'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) a été préparé par une méthode classique incluant un traitement à la protéinase K et une extraction au phénol (9). Environ 10 1lg d'ADN ont été cassés par nébulisation (1 minute sous une pression de 1 bar) (4). Les extrémités des fragments d'ADN ont été rendues franches en faisant agir la DNA-polymérase du bactériophage T4 pendant 15 minutes à 37 C en présence des 4 nucléotides tri-phosphate. L'enzyme a

été inactivée par une incubation de 15 mn à 75 C. Des adaptateurs (invitrogen Cat.

N 408-18) ont ensuite été ligaturés à ces extrémités. Après ligature, les fragments d'ADN chromosomiques ayant une taille entre 1 000 et 3 000 paires de bases ont été purifiés après électrophorèse sur gel d'agarose. Le vecteur utilisé pour la construction de la banque, pcDNA2.1 (Invitrogen), a été digéré par l'enzyme BstX1 et purifié par geneclean (BIO-101) après électrophorèse sur gel d'agarose. L'ADN chromosomique et le vecteur purifié ont été ligaturés par action de la ligase du bactériophage T4. Le mélange de ligation a été introduit par transformation dans la souche d'Escherichia coli XL2-blue (Stratagene). Environ 4000 colonies sont obtenues par,ul du mélange de ligation. b/ Construction d'une banque de fragments de taille moyenne (banque déposée à la CNCM sous le numéro I-2610) Afin de limiter la fréquence des événements de co-ligation et de clones

sans insert, la méthode du remplissage partiel du site de coupure a été utilisée (7).

L'ADN chromosomique de la souche de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC 12403) a été digéré de manière partielle par 1'enzyme de restriction Sau3A en utilisant une gamme de dilution de l'enzyme. La fraction présentant la gamme de tailles souhaitée (entre 2 et 12 kbases) a été précipitée et les extrémités ont été remplies partiellement par le fragment de Klenow de la DNA polymérase d'l?. coli en présence de dTTP et dCTP. Après purification sur gel d'agarose les fragments d'ADN chromosomique ayant une taille comprise entre 3 et 6 kbases ont été ligués au vecteur pSYX34 (7) digéré par l'enzyme SalI remplie partiellement par l'enzyme de Klenow en présence de dATP et dGTP. Le mélange de ligation a été introduit par transformation dans la souche d'Escherichia coli XLlO-kan (Stratagene) et étalement sur milieu LB contenant du chloramphénicol à une concentration de 20 mg/l. Environ 500 colonies

sont obtenues par,ul du mélange de ligation.

2. Préparation des plasmides et séquençage Les plasmides ont été préparés par une méthode semi-automatique de

préparation développée au laboratoire GMP basé sur la méthode de lyse alcaline (2).

Les inserts chromosomiques ont été séquencés à partir de leurs deux extrémités en

utilisant les primer T7 et universel en suivant les recommandations du fournisseur (PE-

biosystems). Les séquences ont été déterminées en utilisant un séquenceur automatique

de type 3700 (PE-Biosystem).

3. Assemblage des séquences Les séquences ont été assemblées en utilisant l'ensemble de logiciel développé à l'Université de Washington, Phred, Phrap et Consed (5, 8). La finition de la séquence a été réalisée en utilisant l'ensemble de logiciel GMPTB (7). L'étape de finition correspond au reséquençage des régions o la séquence est peu sûre et le séquençage des régions situées entre les contigs. Elle a été réalisée en séquençant des produits de PCR correspondant à ces régions identifiées par un expert en utilisant les logiciels Consed (8) et GMPTB (7). Les séquences des oligonucléotides ont été définies

en utilisant les logiciels Consed et Primo (8, l O).

3. Annotation des séquences L'identification des phases codantes (CDS) a été réalisée en utilisant l'ensemble de logiciel GMPTB (L. Frangeul et al. non publié). Ce programme combine les résultats de différentes méthodes: (i) I'identification de phases ouvertes de lecture et leur tri en fonction de leur taille, (ii) l'analyse de la probabilité d'étre codante en utilisant le logiciel Genemark (l D, (iii) l'identification d'un début de traduction (codon d'initiation et séquence de fixation du ribosome), (iv) similarité de la séquence protéique déduite avec les séquences protéiques contenues dans les banques de séquence en

utilisant le logiciel BLASTP.

Les fonctions des protéines codées par les phases codantes identifiées indiquées au tableau 1 ont été prédites par 1'analyse des résultats de recherche de

similarités dans les banques en utilisant le logiciel BLASTP (1).

Description scientifique de la banque de BAC de Streptococcus agalactine CIP

82.45 (ATCC 12403) déposée à la CNCM le 28 décembre 2000 sous le numéro I2610.

Collection de clones d'Escherichia coli DH lOB_ (Calvin et al., J. Bacteriol.

, 2796, 1988) contenant des fragments d'ADN génomique de la bactérie Streptococcus agalactine souche NEM 316,CIP 82.45 (ATCC 12403), clonés dans le vecteur pSYX34 (Xu et al., Biotechniques, 17:57, 1990). Le vecteur a été digéré SalI et partiellement rempli à l'aide de 1'ADN polymérase afin de produire des extrémités '-TC. Des fragments génomiques aléatoires de 3-6 kb provenant de Streptococcus agalactine (souche NEM 316, CIP 82-45, ATCC 12403) ont été digérés partiellement par Sau3A et partiellement remplis afin de produire des extrémités 5'-GA. Après ligature in vitro et transformation, des clones résistant au chloromphénicol ont été sélectionnés. Environ 5000 clones ont été assemblés, suspendus dans 15 ml de milieu L

et congelés.

TABLEAU 1

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TABLEAU 2

Protéines de surface de Streptococcus agalactine SEQ ID N [PF ÉPXTG % identité/ similitude 1 886 18 LPHTG 24/37: Sec (Surface exclusion protéine) E. faccalis 2 386 1250 LPSTG 22/40:SeclO (Surface exclusion protéine) Enterococcus faecals plasmd pCF 10 3 1669 280 LPKTG 50/65: pullulanase S. pnenmonine 4 1895 523 LPATG 90/91: alpha like protéine S. agalactine 806 1716 LPSTG 31/46: M-like protéineS. equi 6 1183 2140 LPLTG 36/60: cell-division protein homolog ywcF B. subtilis 34/56: stage V sporulation protein E B. halodurans 7 1346 2337 LPKTG 25/38: Unknown B. halodurans 8 1942 571 LPSTG 50/60: Hemagglutinine S. gordonii 9 2129 765 LPNTG 28/43: sdrc S. aureus 2046 678 LPKTG 57/70: putative cyclo-nucleotide phosphodiesterase Strep. dysga la ctin e su sp. equ is m ilis 11 618 1503 LPKTG 49/65: celle envelope proteinase S. thermophilus 12 1227 220 LPSTG 30/43: SSDB (adhesion) S. ordonii , 1 3 1954 584 LPKTG 26/48: hyDothetica1 serine riche reDeat Drot S. vombe A A 14 1493 2495 LPKTG 23/47: cene drosoDhile _. 1 5 1 955 585 LPKTG 30/46: 6-aminohexanoate-cyclic-dimer hydrolase

Deinococcus radiodurans.

16 943 1861 LPKTG 50/62: hypothetical protein 2 S. matans 17 1221 2192 LPKTG 35/48: C. elecans UNC-89 (6642 aa) 18 613 15 LPSTG 37/52: SDaA: Ade surface de S. sobrinus _ 19 382 1247 LPSTG 38/52: SDaA: A de surface de S. sobrinus _ 792 17 LPKTG 30 /47 hypothetical protéine iota de S. pyogènes P P 21 383 1248 LPRTG 38/52: hypothetical protéine iota de S. pyogènes plasmid pDB 101 22 1418 2414 LPSTG 33/47: orfC E. faecalis, plasmid pAMbeta -1 Autres orotéines nossibies (IPXTG, FPXTG) , 31/43: InconnueB. Halodurans 23 2171 807 IPQTG 29/41: fimbrial SU Actinomyces nueslundii 24:41: putative cell-surface adhesin SdrF [Staphylococcus epidermidis] 24 1343 2334 IPQTG 27/38: hypothetical protein 2 L. Ieichmanii 23/38: fimbral SU Actinomyces nueslundii 659 1551 FPKTG 37/50: fibronectin binding protein I S. pyogenes

REFERENCES

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REVE ND I CAT I O N S

1. Séquence nucléotidique isolée de Streptococcus agalactiae, caractérisée en

ce qu'elle est choisie parmi les séquences SEQID No.1 à SEQID No.139.

2. Séquence nucléotidique isolée de Streptococcus agalactiae, caractérisce en ce qu'elle est choisie parmi: a) une séquence nucléotidique comportant au moins 75 % d'identité avec une séquence choisie panni SEQID No.1 à SEQID No.139; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139 et comprenant au moins 20 nucléotides; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence choisie parmi SEQID No. 1 à SEQID No.139 DU complémentaire d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), ou b), ou une séquence nucléotidique de 1'ARN correspondant à l'une des séquences a) ou b); d) une séquence nucléotidique d'un fragment représentatif dune séquence choisie parmi SEQ ID No. 1 à SEQ ID No. 139,ou d'un fragment représentatif d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b) ou c) et comprenant au moins 20 nucléotides; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d); et f) une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c3, d3 ou e) modifiée et comportant au plus 10 % de nucléotides modifiés par rapport à la séquence de ,, reference. 3. Séquence nucléotidique selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une séquence issue d'une séquence choisie parmi SEQID No.1 à SEQID No. 139, et en ce qu'elle code pour un polypeptide, choisi de prétérence parmi les séquences

SEQID No.140 à SEQID No.2344.

4. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi: a) une séquence nucléotidique selon la revendication 3; b) une séquence nucléotidique comportant au moins 75 % d'identité avec une séquence nucléotidique selon la revendication 3; c) une séquence nucléotidique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléotidique selon la revendication 3 et comprenant au moins 20 nucléotides; d) une séquence nucléotidique complémentaire ou d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c); e) une séquence nucléotidique d'un fragment représentatif d'une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) et comprenant au moins 20 nucléotides; et f) une séquence telle que définie en a), b), c), d) ou e) modifiée et comportant au plus

% de nucléotides modifiés par rapport à la séquence de référence.

5. Polypoptide codé par une séquence nucléotidique selon l'une des

revendications 2 à 4.

6. Polypeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi

les polypeptides choisis parmi SEQ ID No. 140 à SEQ ID No. 2344.

7. Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un polypoptide choisi parmi:

a) un polypoptide selon l'une des revendications 5 et 6;

b) un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité avec un polypeptide selon l'une

des revendications 5 et 6;

c) un fragment d'au moins 5 acides aminés d'un polypeptide selon l'une des

revendications 5 et 6, ou tel que défini en b);

cl) un fragment biologiquement actif d'un polypoptide selon l'une des revendications 5

et 6, ou tel que défini en b) ou c); et

e) un polypeptide selon l'une des revendications 5 et 6 ou tel que défini en b), c) ou d)

modifié et comportant au plus 10 % d'acides aminés modifiés par rapport à la

séquence de référence.

8. Séquence nucléotidique codant pour un polypoptide selon la revendication 7. 9. Séquence nucléotidique isolée codant pour un polypeptide spécifique de Streptococcus agalactiae choisi parmi les polypeptides de séquence SEQ ID No. 140 à

SEQ ID No. 2344.

10. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypoptide de Streptococcus agalactiae

impliqué dans la biosynthèse des acides aminés ou l'un de ses fragments.

11. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypoptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans la biosynthèse des cofacteurs, groupes prosthétiques et transporteurs ou

l'un de ses fragments.

12. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypoptide d'enveloppe cellulaire ou situé à la surface de Streptococcus agalactine ou l'un de ses fragments.

13. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisce en ce qugelle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae

impliqué dans la machinerie cellulaire ou l'un de ses fragments.

14. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisce en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalachae

impliqué dans le métabolisme intermédiaire central ou l'un de ses fragments.

15. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine

impliqué dans le métabolisme énergénique ou l'un de ses fragments.

16. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans le métabolisme des acides gras et des phospholipides ou l'un de ses fragments. 17. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypoptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans le métabolisme des nucléotides, des purines, des pyrimidines ou

nucléosides ou l'un de ses fragments.

18. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypoptide de Streptococcus agalactine

impliqué dans les fonctions de régulation ou l'un de ses fragments.

19. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

impliqué dans le processus de réplication ou l'un de ses fragments.

20. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisce en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine

impliqué dans le processus de transcription ou l'un de ses fragments.

21. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisce en ce qu'elle code pour un polypoptide de Streptococcus agalactiae

impliqué dans le processus de traduction ou l'un de ses fragments.

22. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactine impliqué dans le processus de transport et de liaison des protéines ou l'un de ses fragments.

23. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide de Streptococcus agalactiae

impliqué dans l' adaptation aux conditions atypiques ou l'un de ses fragments.

24. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

impliqué dans la sensibilité aux médicaments et analogues ou l'un de ses fragments.

25. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 et 9,

impliqué dans les fonctions relatives aux transposons ou l'un de ses fragments.

26. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine impliqué dans la biosynthèse des

acides aminés ou l'un de ses fragments.

27. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

cofacteurs, groupes prosthétiques et transporteurs ou l'un de ses fragments.

28. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide d'enveloppe cellulaire ou situé à la surface de Streptococcus

agalactine ou l'un de ses fragments.

29. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine impliqué dans la machinerie

cellulaire ou l'un de ses fragments.

30. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine impliqué dans le métabolisme

intermédiaire central ou l'un de ses fragments.

31. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans le métabolisme

énergétique ou l'un de ses fragments.

32. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

* s'agit d'un polypoptide de Streptococcus agalactine impliqué dans le métabolisme des

acides gras et des phospholipides ou l'un de ses fragments.

33. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptocaccus agalactine impliqué dans le métabolisme des

nucléotides, des purines, des pyrimidines ou nucléosides ou l'un de ses fragments.

34. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans les fonctions de

régulation ou l'un de ses fragments.

35. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans le processus de

réplication ou l'un de ses fragments.

36. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

transcription ou l'un de ses fragments.

37. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactine impliqué dans le processus de

traduction ou l'un de ses fragments.

38. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

transport et de liaison des protéines ou l'un de ses fragments.

39. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans l'adaptation aux

conditions atypiques ou l'un de ses fragments.

40. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans la sensibilité aux

médicaments et analogues ou l'un de ses fragments.

41. Polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisé en ce qu'il

s'agit d'un polypeptide de Streptococcus agalactiae impliqué dans les fonctions

relatives aux transposons ou l'un de ses fragments.

42. Séquence nucléotidique utilisable comme amorce ou comme sonde, caractérisée en ce que ladite séquence est choisie parmi les séquences nucléotidiques

selon l'une des revendications 2 à 4, 8 à 25.

43. Séquence nucléotidique selon la revendication 42, caractérisée en ce qu'elle

est marquce par un compo s é radio actif ou par un composé non radio actif.

44. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 42 et 43, caractérisée

en ce qu'elle est immobilisce sur un support, de manière covalente ou noncovalente.

45. Séquence nucléotidique selon la revendication 44, caractérisée en ce qu'elle

est immobilisée sur un support tel qu'un filtre à haute densité ou une puce à ADN.

46. Séquence nucléotidique selon l'une des revendications 43 à 45 pour la

détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques.

547. Puce à ADN ou filtre, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une

séquence nucléotidique selon la revendication 45.

48. Puce à ADNou filtre selon la revendication 47, caractérisée en ce qu'elle contient en outre au moins une séquence nucléotidique d'un microorganisme autre que

Streptococcus agalactiae, immobilisée sur le support de ladite puce.

1049. Puce à ADNou filtre selon la revendication 48, caractérisée en ce que le micro-organisme autre est choisi parmi un micro-organisme associé à Streptococcus agalactiae, une bactérie du genre Streptococcus, et un variant de Streptococcus agalactiae. 50. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un micro-organisme associé,

caractérisé en ce qu'il comprend une puce à ADNou un filtre selon la revendication 47.

51. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou l'identification d'un micro organisme, caractérisé en ce qu'il comprend une puce à ADNou un filtre selon l'une des

revendications 48 et 49.

2052. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou la quantification de l'expression d' au moins un gène de Streptococcus agalactine, caractérisé en ce qu'il comprend une

puce à ADNou un filtre selon l'une des revendications 47 à 49.

53. Vecteur de clonage, et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il contient une

séquence nocléotidique selon l'une des revendications 1 à 4, 8 à 25.

2554. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon

la revendication 53.

55. Cellule hôte selon la revendication 54, caractérisce en ce qu'il s'agit d'une

bactérie appartenant au genre Streptococcus.

56. Cellule hôte selon la revendication 55, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une

bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine.

57. Végétal ou animal, excepté l'Homme, comprenant une cellule transformée

selon l'une des revendications 54 à 56.

58. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce que l'on cultive une cellule transformée par un vecteur selon la revendication 53 dans des conditions permettant l'expression dudit polypoptide et que l'on recupère ledit polypoptide recombinant. 59. Polypoptide recombinant susceptible d'être obtenu par un procédé selon la

revendication 58.

60. Procédé de préparation d'un polypeptide synthétique selon l'une des

revendications 5 à 7, 26 à 41, caractérisé en ce que l'on effectue une synthèse chimique

dudit polypeptide.

61. Polypeptide hybride, caractérisé en ce qu'il comprend au moins la séquence

d'un polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41 et 59, et une séquence

d'un polypeptide susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal. 62. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide hybride selon la

revendication 61.

63. Vecteur caractérisé en ce qu'il contient une séquence nucléotidique selon la

1 5 revendication 62.

64. Anticorps monoclonal ou polyclonal, ses fragments, ou anticorps chimérique, caractérisé en ce qu'il est capable de reconnaître spécifiquement un

polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61.

65. Anticorps selon la revendication 64, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un

anticorps marqué.

66. Procédé pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un micro-organisme associé dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'une des

revendications 64 et 65;

b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.

67. Procédé pour la détection de l'expression d'un gène de Streptococcus agalactine caractérisé en ce que l'on met en contact une souche de Streptococcus agalactine, avec un anticorps selon la revendication 64 ou 65 et que l'on détecte le

complexe antigène/anticorps éventuellement formé.

68. Kit ou nocessaire pour la mise en _uvre d'un procédé selon la revendication 66 ou 67, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants:

a) un anticorps selon l'une des revendications 64 et 65;

. b) éventuellement, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) éventuellement, les réactifs permettant la mise en évidence des complexes antigène

anticorps produits par la réaction immunologique.

69. Polypeptide selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61, ou

anticorps selon l'une des revendications 64 et 65, caractérisé en ce qu'il est immobilisé

sur un support, notamment une puce à protéine.

70. Puce à protéine, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un polypeptide

selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61, ou au moins un anticorps selon

1 0 I'une des revendications 64 et 65, immobilisé sur le support de ladite puce.

71. Puce à protéine selon la revendication 70, caractérisée en ce qu'elle contient en outre au moins un polypeptide de micro-organisme autre que Streptococcus agalactiae ou au moins un anticorps dirigé contre un composé de micro-organisme autre

que Streptococcus agalactiae, immobilisé sur le support de ladite puce.

72. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un microorganisme associé,

caractérisé en ce qu'il comprend une puce à protéine selon l'une des revendications 70

et71. 73. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou l'identification d'un micro organisme, caractérisé en ce qu'il comprend une puce à protéine selon la revendication 71. 74. Procédé de détection et/ou d' identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine ou à un micro-organisme associé dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il met en _uvre une séquence nocléotidique selon l'une

des revendications 2 à 4, 8, 9, 11 à 13, 17 à 25, 42 à 46 et 62.

75. Procédé selon la revendication 74, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) éventuellement, isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique; b) amplification spécifique de l'ADN de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un micro-organisme associé à l'aide d'au moins une amorce selon

l'une des revendications 42 à 46;

c) mi se en évidence des produits d' ampli fication.

76. Procédé selon la revendication 74, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:

a) mise en contact d'une sonde nucléotidique selon l'une des revendications 42 à 46,

avec un échantillon biologique, l'acide nucléique contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un micro-organisme associé; b) mise en évidence de l'hybride éventuellement formé entre la sonde nucléotidique et

l'acide nucléique de l'échantillon biologique.

77. Procédé selon la revendication 74, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde nucléotidique immobilisce sur un support selon la revendication 44 avec un échantillon biologique, l'acide nucléique de l'échantillon ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'acide nucléique d'une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un micro-organisme associé; b) mise en contact de l'hybride formé entre la sonde nucléotidique immobilisée sur un support et l'acide nucléique contenu dans léchantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'acide nucléique de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde nucléotidique marquée selon la revendication 43;

c) mise en évidence du nouvel hybride formé à l'étape b).

78. Procédé selon la revendication 77, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), 1'ADN de l'échantillon biologique ou l'ADNc obtenu éventuellement par transcription inverse de 1 'ARN de l ' échantillon, est amplifié à l 'aide d' au moins une

amorce selon l'une des revendications 42 à 46.

79. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un microorganisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants:

a) une sonde nucléotidique selon l'une des revendications 42 à 46;

b) éventuellement, les réactifs nécessaires à la mise en _uvre d'une réaction d'hybridation;

c) éventuellement, au moins une amorce selon l'une des revendications 42 à 46 ainsi

que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de 1'ADN.

80. Kit ou nocessaire pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un microorganisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a3 une sonde nucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 44; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, selon la revendication 43;

que les réactifs nocessaires à une réaction d'amplification de 1'ADN.

81. Kit ou nécessaire pour la détection et/ou l'identification de bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae ou à un microorganisme associé, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants:

a) au moins une amorce selon l'une des revendications 42 à 46;

b) éventuellement, les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification : 1 5 d'ADN; c) éventuellement, un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde oligonucléotidique selon l'une des

revendications 42 à 46.

82. Procédé selon les revendications 66, 67 et 74 à 78 ou kit ou nécessaire selon

les revendications 68, 72, 73 et 79 à 81 pour la détection etiou l'identification de

bactéries appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae, caractérisé en ce que ladite amorce et/ou ladite sonde sont choisies parmi les séquences nucléotidiques selon l'une

des revendications 2 à 4, 8 à 25, 42 à 46, et 62 spécifiques de l'espèce Streptococcus

agalactine, en ce que lesdits polypeptides sont choisis parmi les polypoptides selon

l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61 spécifiques de l'espèce Streptococcus

agalactiae et en ce que lesdits anticorps sont choisis parmi les anticorps selon l'une des

revendications 64 et 65 dirigés contre les polypoptides choisis parmi les polypeptides

selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61 spécifiques de l'espèce

Streptococcus agalactiae.

83. Souche de Streptococcus agalactiae, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une mutation dans au moins une séquence nucléotidique selon l'une des

revendications 2 à 4, 8 à 25.

84. Souche de Streptococcus agalactine selon la revendication 83, caractérisce

en ce que la mutation mène à une inactivation du gène.

85. Souche de Streptococcus agalactine selon la revendication 83, caractérisée

en ce que la mutation mène à une surexpression du gène.

86. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à

4, 8 à 25, d'un polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61, d'un

anticorps selon l'une des revendications 64 et 65, d'une cellule selon l'une des

revendications 54 à 56, et/ou d'un animal transformé selon la revendication 57 pour la

sélection de composé organique ou inorganique capable de moduler, de réguler, d'induire ou d'inhiber l'expression de gènes, et/ou de modifier la réplication cellulaire de cellules eucaryotes ou procaryotes ou capables d'induire, d'inhiber ou d'aggraver 1 0 chez un organisme animal ou humain les pathologies liées à une infection par

Streptococcus agalactiae ou par un micro-organisme associé.

87. Méthode de sélection de composé capable de se lier à un polypeptide selon

l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61, capable de se lier à une séquence

nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 à 25, ou capable de reconna^tre un

1 5 anticorps selon l'une des revendications 64 et 65, et/ou capable de moduler, de réguler,

d'induire ou d'inhiber l'expression de gènes, et/ou de modifier la réplication cellulaire de cellules eucaryotes ou procaryotes, ou capable d'induire, d'inhiber ou d'aggraver chez un organisme animal ou humain les pathologies liées à une infection par Streptococcus agalactiae, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide, ladite séquence nucléotidique,

avec une cellule transformoe selon l'une des revendications 54 à 56, et/ou

administration dudit composé à un animal transffirmé selon la revendication 57; b) détermination de la capacité dudit somposé à se lier avec ledit polypoptide ou ladite séquence nucléotidique, ou de moduler, de réguler, d'induire ou d'inhiber l'expression de gènes, ou de moduler la croissance ou la réplication cellulaire, ou d'induire, d'inhiber ou d'aggraver chez ledit organisme animal ou humain les pathologies liées à une infection par Streptococcus agalactiae ou par un micro

organisme associé.

88. Composition pharmaceutique comprenant un composé choisi parmi les composés suivants:

a) une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 2 à 4, 8 à 25;

b) un polypoptide selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59 et 61;

c) un vecteur selon la revendication 53 ou 63; et

d) un anticorps selon la revendication 64 ou 65.

_ 89. Composition selon la revendication 88, éventuellement en association avec

un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

90. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 88 et 89 pour la

prévention et le traitement d'une infection par une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactiae. 91. Composition immunogène, caractérisoe en ce qu'elle comprend un ou

plusieurs polypeptides selon l'une des revendications 5 à 7, 26 à 41, 59, et/ou un ou

plusieurs polypoptides hybrides selon la revendication 61.

92. Utilisation d'une cellule selon l'une des revendications 54 à 56, ou d'un

iO vecteur selon l'une des revendications 53 ou 63 pour la préparation d'une composition

vaccinale. 93. Composition vaccinale, caractérisce en ce qu'elle contient un

polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4, 8 à 25, un vecteur selon l'une des

revendications 53 ou 63, etlou une cellule selon l'une des revendications 54 à 56.

1 5 94. Composition irnmunogène capable d'induire une réponse immunitaire cellulaire ou humorale pour la prévention ou le traitement d'une infection par une bactérie appartenant à l'espèce Streptococcus agalactine, caractérisée en ce qu'elle comprend une composition immunogène selon la revendication 91, ou une composition vaccinale selon la revendication 93, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants de

l'immunité appropriés.

95. Banque génomique de Streptococcus agalactine CIP 82.45 (ATCC

12403).

96. Banque d'ADN génomique selon la revendication 95, caractérisée en ce

que ladite banque d'ADN est clonée dans un plasmide.

97. Banque selon la revendication 95 ou 96, caractérisée en ce qu'il s'agit de

la banque déposée à la CNCM le 28 décembre 2000 sous le N I-2610.

98. Utilisation des banques génomiques selon l'une des revendications 95 à 97

pour isoler des séquences nucléotidiques spécifiques de Streptococcus agalactine, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques de Streptococcus autres que Streptococcus agalactiae CIP 82.45 (ATCC 12403) sont alignées et en ce que les donnces obtenues par cet alignement sont traitées pour isoler lesdites séquences spécifiques. 99. Procédé d'identification de séquence spécifique de Streptococcus agalactiae, caractérisé par l'alignement de séquences nucléotidiques de Streptococcus

agalactiae scion les revendications 1 à 4, 8 à 9 et le traitement des données obtenues par