FR2645878A1 - Sequences nucleotidiques d'actinomycetales, applications a la synthese ou a la detection d'acides nucleiques, produits d'expression de ces sequences et application en tant que compositions immunogenes - Google Patents
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
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Abstract
Séquences nucléotidiques d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, leurs applications en tant qu'amorces pour la synthèse d'ADN d'actinomycétales et en tant que sondes pour la détection d'ADN et/ou des produits de transcription d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, produits d'expression desdites séquences, leurs applications et anticorps dirigés contre lesdits produits, procédé de détection et d'identification des actinomycétales et ses applications, ainsi que compositions immunogènes comprenant lesdits produits d'expression. La séquence nucléotidique issue d'actinomycétales est constituée par une séquence homologue d'un gène commun à toutes les actinomycétales, à l'intérieur de laquelle existent des régions conservées et des régions variables.
Description
La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, à des oligonucléotides compris dans lesdites séquences, à leurs applications entant qu'amorces pour la synthèse d'ADN d'actinomycétales et en tant que sondes pour la détection d'ADN et/ou des produits de transcription d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, aux produits d'expression desdites séquences, à leurs applications et aux anticorps dirigés contre lesdits produits, à un procédé de détection et d'identification des actinomycétales et ses applications, ainsi qu'à des compositions immunogènes comprenant lesdits produits d'expression.
I1 est connu que la tuberculose et la lèpre sont des problèmes majeurs de santé publique. Il existe actuellement environ 60.106 individus atteints de tuberculose dans le monde (avec une mortalité annuelle de 3.106), et environ 15.106 individus atteints de lèpre. En France, il apparaît environ 10 4 nouveaux cas de tuberculose par an. La vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin, une souche atténuée de M. bovis) est loin d'être efficace au sein de toutes les populations.Cette efficacité varie en viron de 80 % dans les pays occidentaux comme l'Angleterre à o % en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à Chlngleput). L'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aus antituberculeux usuels et l'existence de mycobactérioses dues à d'autres mycobactêries de plus en plus fréquentes comme M. avium, en particulier chez les personnes présentant une m,'-unodépression (SIDA dans le plus grand nombre de cas), ajoutent à l'urgence de mettre au point une méthode rapide de détection et d'identification des mycobactéries.
Le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactérioses apparentées est difficile à réaliser ; en effet, les germes responsables de ces maladies sont souvent présents en faible quantité et lorsqu'ils sont en quantité détectable par les méthodes classiquement utilisées, la ma ladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage. En raison du temps de génération très long de ces bactéries (24 h pour M. tuberculosis comparé à 20 min pour E. coli), la culture de ces organismes est difficile. Ainsi faut-il 6 à 8 semaines pour identifier les germes et davantage pour obtenir un antibiogramme utilisable pour le traitement adéquat des malades.La nécessité d'un test de détection n'exigeant pas de culture des germes et directement utilisable avec les échantillons pathologiques même lorsque les germes y sont présents à de faibles concentrations, est donc indispensable.
Plusieurs techniques sont actuellement utilisées en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne.
Il faut toutd'abord citer la détection directe des microorganismes au microscope ; cette technique est rapide, mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobacterienne observée et manque de sensibilité dans la mesure où un grand nombre de microorganismes doit être présent dans l'échantillon ( > 104/ml) pour permettre une détection fiable (BATES J., CHEST, 1979, 76, (suppl.), 757763).
Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100 8 et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée néanmoins, comme précisé ci-dessus, la croissance des mycobactéries in vitro ne peut être realisée qu'en 3 a 6 se maintes et lorsque peu de mycobactéries sont présentes au site de l'infection, des cultures répétées senrt nllécessaires pour s'assurer d'uc résuitat positif (BATES J., 1979 et
BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986 134, 415 -417).
BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986 134, 415 -417).
Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions r mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles (DANIÈL T.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987-, 135, 1137-1151).
La présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec de 1'ADN ou de 1'ARN en utilisant des sondes spécifiques des séquences d'ADN (KIEHN T.E. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1551-1552 ; ROBERTS M.C. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1239-1243 ; DRAKE T.A. et ai., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442-1445). Cependant, ces méthodes requièrent également la culture des microorganismes.
Certaines séquences d'ADN de différentes mycobactèries notamment certains gènes codant pour des antigènes mycobactériens ont été décrits. On peut citer notamment la Demande Internationale PCT WO 88/00974, qui a pour
Inventeur YOUNG R. et dont le contenu est repris dans un article paru dans Nature, 1985, 316, 450 ; ces publications décrivent les gènes codant pour cinq antigènes de M.
Inventeur YOUNG R. et dont le contenu est repris dans un article paru dans Nature, 1985, 316, 450 ; ces publications décrivent les gènes codant pour cinq antigènes de M.
leprae immunodominants et en particulier le gène codant pour l'antigène de 65 kDA a été séquencé. On peut également citer la Demande Internationale PCT W0 88/05823, qui a pour
Co-Inventeurs HUSSON R., YOUNG R. et SHINNICK T. et dont le contenu est repris dans l'article paru dans J. Bact., 1987, 169, 1080-1088 et qui décrit les gènes de M. tuberculosis codant pour des antigènes protéiques et notamment pour l'antigène de 65 kDa.Cette Demande Internationale précise, en particulier, que les antigènes de M. tuberculosis codant pour cinq protéines immunologiquements actives ont été iso- lés par un criblage systémataque d' une banque d'ADN recom- binant exprimée dans un bactériophage lambda gtll avec une collection d'anticorps monoclonaux diriges zontre les gènes protéiques de cette bactérie. L'un des antigènes de
M. tuberculosis, une protéine 65 kDa présente des détermi- nants communs à M. tuberculosis et M. leprae.
Co-Inventeurs HUSSON R., YOUNG R. et SHINNICK T. et dont le contenu est repris dans l'article paru dans J. Bact., 1987, 169, 1080-1088 et qui décrit les gènes de M. tuberculosis codant pour des antigènes protéiques et notamment pour l'antigène de 65 kDa.Cette Demande Internationale précise, en particulier, que les antigènes de M. tuberculosis codant pour cinq protéines immunologiquements actives ont été iso- lés par un criblage systémataque d' une banque d'ADN recom- binant exprimée dans un bactériophage lambda gtll avec une collection d'anticorps monoclonaux diriges zontre les gènes protéiques de cette bactérie. L'un des antigènes de
M. tuberculosis, une protéine 65 kDa présente des détermi- nants communs à M. tuberculosis et M. leprae.
La Demande Internationale PCT WO 88/06591, qui a notamment pour Co-Inventeur T. SHINNICK, décrit une protéine recombinante de 540 acides aminés (protéine de 65 kDa) ainsi fue la séquence d'ADN et les vecteurs d'expression de ladite protéine, ainsi que les åpplications de ladite protéine recombinée. Cette Demande décrit également des peptides correspondant à des séquences de cette protéine et leurs applications.
Les gènes codant pour les protéines d'autres mycobactéries (M. africanum, M. -smegmatis, M. bovis BCG et
M. avium) ont également été isolés. On peut citer notamment
THOLE et al. (Infect. Immunol., 1987, 55, 1466-1475), qui ont décrit une protéine de 64 kDa de M. bovis BCG exprimée dans E. coli.
M. avium) ont également été isolés. On peut citer notamment
THOLE et al. (Infect. Immunol., 1987, 55, 1466-1475), qui ont décrit une protéine de 64 kDa de M. bovis BCG exprimée dans E. coli.
Cependant, les quantités d'ADN mycobactérien présentes dans la plupart des échantillons biologiques sont insuffisantes pour donner un signal positif ; cette technique s'est donc révélée inadaptée à l'identification d'ADN mycobactérien extrait directement d'échantillons biologiques.
Un certain nombre d'études ont également montré une certaine homologie de structure entre les différentes mycobactéries. Cependant, des différences dans la séquence d'ADN de M. tuberculosis et-M. bovis ont été décrites dans la région 3' du cadre ouvert de lecture de l'antigène 65 kDa (SHINNICK et al., 1987, THOLE et al., 1987), mais une région homologue n'a pas été observée dans l'ADN de M.
leprae (MEHRA et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7013-7017, également PCT 88/000974).
Il existe également des publications qui décrivent des vaccins contre des mycobactries, réalisés par génie genetique ; on peut citer en particulier la Demande
Internationale PCT WO 88/020a? qui décrit des poxvirus re- combinants capables d'exprimer des antigènes mycobactériens et qui permettent d'obtenir une réponse immunologique protectrice vis-à-vis des mycobactéries.
Internationale PCT WO 88/020a? qui décrit des poxvirus re- combinants capables d'exprimer des antigènes mycobactériens et qui permettent d'obtenir une réponse immunologique protectrice vis-à-vis des mycobactéries.
Les différentes méthodes de détection d'actinomycétales et notamment de mycobactéries de l'Art antérieur ne permettent pas de détecter et d'identifier ra rapidement des mycobacté 1es en faibles quantités, directe- ment dans un échantillon biologique.
Les références complémentaires suivantes constituent également l'état de l'Art préalable à la présente invention.
BAESS I., Acta Path. Microbiol. Scand., 1979, 87, 221-226 ; BEAUCAGE S.L. et al., Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862 ; EISENACH K.D. et al., Am. Rev.
Respir. Dis., 1986, 133, 1065-1068 ; GHEORGHIU M. et al.,
J. Biol. Standardization, 1988, 16, 15-26 ; GLASSROTH J. et al., N. Engl. J. Med., 1980, 302, 1441-1450 ; HAWKINS C.C.
J. Biol. Standardization, 1988, 16, 15-26 ; GLASSROTH J. et al., N. Engl. J. Med., 1980, 302, 1441-1450 ; HAWKINS C.C.
et al., Ann. Intern. Med., 1985, 105,-184-188 ; IMAEDA T.,
Int. J. Systematic Bacteriol., 1985, 35, 147-150 ; IMAEDA
T. et al., Int. J. Systematic Bacteriol., 1988, 38, 151156 ; KOGAN S.C. et al., N. Engl. J. Med., 1987, 317, 985990 ; LI H. et al., Nature (Lond.), 1988, 335, 414-417 ; LU
M.C. et al., Infect. Immun., 1987, 55, 2378-2382 ; MANIATIS
T. et al., 1982, Cold Spring Harbor, New York ; McFADDEN
J.J. et al., Mol. Microbiol., 1987, 1, 283-291 ; PAO C.C.
Int. J. Systematic Bacteriol., 1985, 35, 147-150 ; IMAEDA
T. et al., Int. J. Systematic Bacteriol., 1988, 38, 151156 ; KOGAN S.C. et al., N. Engl. J. Med., 1987, 317, 985990 ; LI H. et al., Nature (Lond.), 1988, 335, 414-417 ; LU
M.C. et al., Infect. Immun., 1987, 55, 2378-2382 ; MANIATIS
T. et al., 1982, Cold Spring Harbor, New York ; McFADDEN
J.J. et al., Mol. Microbiol., 1987, 1, 283-291 ; PAO C.C.
et al., Tubercle, 1988, 69, 27-36 ; PATEL R., J. Gen.
Microbiol., 1986, 132, 541-551 ; SAIKI R.K. et al.,
Science, 1988, 239, 487-491 ; SANGER F. et al., Proc. Natl.
Science, 1988, 239, 487-491 ; SANGER F. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467 ; SMIDA J. et al., Int.
J. Leprosy, 1988, 56, 449-454 ; THEIN S.L. et al., in Human
Genetic Diseases, 1986, IRL Press, 33-50 ; THOLE J.E.R. et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-8C6 ; WATSON E.A,
Canad. J. Pub. Health, 1935, 26. 268-275 ; WOLINSKY E., Am.
Genetic Diseases, 1986, IRL Press, 33-50 ; THOLE J.E.R. et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-8C6 ; WATSON E.A,
Canad. J. Pub. Health, 1935, 26. 268-275 ; WOLINSKY E., Am.
Rev. Respir. Dis, 1979, 119, î07-153.
La présente linvention s'est, en consequense, donné pour but de pourvoir a un procédé de détection et d'identification permettant de détecter de faibles quanti- tés d'ADN extraites de germes eux-mêmes présents en nombre restreint, qui soit rapide et permette l'identificat;on de mycobactéries directement dans des échantillons pathologiques, sans avoir à réaliser une mise en culture.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique d'actinomycétales, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence homologue d'un gène commun à toutes les actinomycétales, à l'intérieur de laquelle existent des régions conservées et des régions variables.
On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple brin que les produits de transcription desdites séquences d'ADN.
On entend, au sens de la présente invention, par actinomycétales aussi bien des actinomycétacées telles que Nocardia, que des mycobactériacées ou des Rhodococcus.
Il existe au moins 50 espèces de mycobactéries réparties en plusieurs groupes. Dans la présente invention, on appelle groupe du bacille de la tuberculose, le groupe qui comprend M. bovis BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M.
africanum et M. microti ; on appelle groupe MAIP, le groupe qui comprend M. avium, M. intracellulare et M. paratuberculosis.
La comparaison des séquences nucléotidiques des différents groupes et/ou espèces a permis de mettre en évidence des fragments identiques ou similaires à l'intérieur d'un gène commun à ces différents groupes et de définir une homologie entre les différentes séquences.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence homologue est incluse dans le gène codant pour l'antigène mycobactérien de 65 kDa.
Selon une dispositon avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence correspond à un fragment dudit gène et comprend entre 250 et 500 paires de bases.
Selon une modalité préférée de cette dispcsi tion, ladite séquence comprend 383 paires de bases homologues chez au moins 5 espèces de mycobactéries, à savoir
M. tuberculosls, M. avium, M. fortultum, M. paratuberculo- sis et BCG.
M. tuberculosls, M. avium, M. fortultum, M. paratuberculo- sis et BCG.
Les 383 paires de bases correspondent au produit d'expression de séquence en acides aminés de formule
(I) suivante
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR-
VAL- LEU-ALA- GLN-ALA- LEU-VAL-ARG-GLU- GLY-LEU-ARG-ASN-VAL
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA-
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-Xi-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-X2-ILE-
SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU-ALA MET-ASP-LyS-VAL-GLy-ASN-GLU-GLY-VAL- ILE-THR-VAL-GLU-GLU-
SER,
dans laquelle X1 représente ASP ou GLU,
X2 représente ALA ou GLY
et dont la séquence présente un pourcentage d'homologie,
entre les cinq souches de mycobactéries, d'au moins 80 %.
(I) suivante
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR-
VAL- LEU-ALA- GLN-ALA- LEU-VAL-ARG-GLU- GLY-LEU-ARG-ASN-VAL
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA-
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-Xi-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-X2-ILE-
SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU-ALA MET-ASP-LyS-VAL-GLy-ASN-GLU-GLY-VAL- ILE-THR-VAL-GLU-GLU-
SER,
dans laquelle X1 représente ASP ou GLU,
X2 représente ALA ou GLY
et dont la séquence présente un pourcentage d'homologie,
entre les cinq souches de mycobactéries, d'au moins 80 %.
Selon une autre modalité avantageuse de cette
disposition, ladite séquence comprend 343 paires de bases,
répond à la formule (II) ci-après
10 20 30 40 S0 60
TACGAGAAGA TCGGCGCTGA GCTCGTCAAG GAAGTCGCCA AGAAGACCGA CGACGTCGCG
ATGCTCTTCT AGCCGCGACT CGAGCAGTTC CTTCAGCGGT TCTTCTGGCT GCTGCAGCGC
70 80 90 100 110 120 GGCGACGGCA CCACCACCGC CACCGTTCTG GCACAGGCCC TGGTTCGTGA AGGTCTGCGC
CCGCTGCCGT GGTGGTGGCG GTGGCAAGAC CGTGTCCGGG ACCAAGCACT TCCAGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCTG CCGGCGCCAA CCCGCTCGGC CTGAAGCGCG GCATCGAGAA GGCCGTCGAG
TTGCAGCGAC GGCCGCGGTT GGGCGAGCCG GACTTC5CGC CGTAGCTCTT CCGGCAGCTC
190 200 210 220 230 24C
AAGGTCACCG AGACGCTGCT GAAGAGCGCC AAGGAGGTGG AGACCAAGGA GCAGATCGCT
TTCCAGTGGC TCTGCGACGA CTTCTCGCGG TTCCTCCACC TCTGGTTCCT CGTCTAGCGA
250 a6v 270 280 290 300
GCCACCGCCG GTATCTCCGC CGGTGACCAG TCCATCGGTG ACCTGATCGC CGAGGCCATG
CGGTGGCGGC CATAGAGGCG GCCACTGGTC AGGTAGCCAC TGGACTAGCG GCTCCGGTAC
310 320 330 340 (ll)
GACAAGGTCG GCAACGAGGG TGTCATCACC GTCGAGGAGA GC
CTGTTCCAGC CGTTGCTCCC ACAGTAGTGG CAGCTCCTCT CG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa de M. fortuitum.
disposition, ladite séquence comprend 343 paires de bases,
répond à la formule (II) ci-après
10 20 30 40 S0 60
TACGAGAAGA TCGGCGCTGA GCTCGTCAAG GAAGTCGCCA AGAAGACCGA CGACGTCGCG
ATGCTCTTCT AGCCGCGACT CGAGCAGTTC CTTCAGCGGT TCTTCTGGCT GCTGCAGCGC
70 80 90 100 110 120 GGCGACGGCA CCACCACCGC CACCGTTCTG GCACAGGCCC TGGTTCGTGA AGGTCTGCGC
CCGCTGCCGT GGTGGTGGCG GTGGCAAGAC CGTGTCCGGG ACCAAGCACT TCCAGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCTG CCGGCGCCAA CCCGCTCGGC CTGAAGCGCG GCATCGAGAA GGCCGTCGAG
TTGCAGCGAC GGCCGCGGTT GGGCGAGCCG GACTTC5CGC CGTAGCTCTT CCGGCAGCTC
190 200 210 220 230 24C
AAGGTCACCG AGACGCTGCT GAAGAGCGCC AAGGAGGTGG AGACCAAGGA GCAGATCGCT
TTCCAGTGGC TCTGCGACGA CTTCTCGCGG TTCCTCCACC TCTGGTTCCT CGTCTAGCGA
250 a6v 270 280 290 300
GCCACCGCCG GTATCTCCGC CGGTGACCAG TCCATCGGTG ACCTGATCGC CGAGGCCATG
CGGTGGCGGC CATAGAGGCG GCCACTGGTC AGGTAGCCAC TGGACTAGCG GCTCCGGTAC
310 320 330 340 (ll)
GACAAGGTCG GCAACGAGGG TGTCATCACC GTCGAGGAGA GC
CTGTTCCAGC CGTTGCTCCC ACAGTAGTGG CAGCTCCTCT CG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa de M. fortuitum.
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants
Accll, AhaII, BanI, BanII, BBVI, Bsp1286,
BstXI, CfOI DDeI, EcoRII, EspI, Fnv4HI, HaeII, HaeIII,
HAPII, HgAI, HinfI, HPHI, MaeIII, MboII, MnlI, NarI, NcoI,
NlaIII, SacI, SacII, Sau3A, Sau96A, SCFRI, STYI, TAQI,
YmAIII.
Accll, AhaII, BanI, BanII, BBVI, Bsp1286,
BstXI, CfOI DDeI, EcoRII, EspI, Fnv4HI, HaeII, HaeIII,
HAPII, HgAI, HinfI, HPHI, MaeIII, MboII, MnlI, NarI, NcoI,
NlaIII, SacI, SacII, Sau3A, Sau96A, SCFRI, STYI, TAQI,
YmAIII.
Selon une autre modalité avantageuse de cette disposition, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (III) ci-après
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCCGA GCTGGTCAAG GAAGTCGCCA AGAAGACCGA CGACGTCGCC
ATGCTCTTCT AGCCGCGGCT CGACCAGTTC CTTCAGCGGT TCTTCTGGCT GCTGCAGCGG
70 80 90 100 110 120
GGTGACGGCA CGACGACGGC CACGGTGCTC GCCCAGGCGT TGGTCCGCGA GGGCCTGCGC
CCACTGCCGT GCTGCTGCCG GTGCCACGAG CGGGTCCGCA ACCAGGCGCT CCCGGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCGG CCGGCGCCAA CCCGCTGGGT CTCAAGCGCG GCATCGAGAA GGCCGTCGAG
TTGCAGCGCC GGCCGCGGTT GGGCGACCCA GAGTTCGCGC CGTAGCTCTT CCGGCAGCTC
190 200 210 220 230 240,
AAGGTCACCG ASACCCTGCT CAAGTCGGCC AAGGAGGTCG AGACCAAGGA CCAGATCGCT
TTCCAGTGGC TCTGGGACGA GTTCAGCCGG TTCCTCCAGC TCTGGTTCCT GGTCTAGCGA
250 260 270 280 290 300 GCCACCGCGG CCANCTCCGC GGGCGACCAG TCGATCGGCG ACCTGATCGC CGAGGCGATG
CGGTGGCGCC GGTAGAGGCG CCCGCTGGTC AGCTAGCCGC TGGACTAGCG GCTCCGCTAC
310 320 330 340
GACAAGGTCG GCAACGAGGG CGTCATCACC GTCGAGGAGT CC (III)
CTGTTCCAGC CGTTGCTCCC GCAGTAGTGG CAGCTCCTCA GG et correspond à un fragment de la séquence du gène pour l'antigène de 6D kDa du groupe MAIP
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants
AccII Afll, Ahall, Bani, BBVLI BGll, Esp1286
BstEII, BstXI, CfOI, EAEI, HaeII, HaeIII, HPHI, MaeIII,
MnlI, NarI, PvuI, Sacll, Sau3A, Sau96A, TAQI.
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCCGA GCTGGTCAAG GAAGTCGCCA AGAAGACCGA CGACGTCGCC
ATGCTCTTCT AGCCGCGGCT CGACCAGTTC CTTCAGCGGT TCTTCTGGCT GCTGCAGCGG
70 80 90 100 110 120
GGTGACGGCA CGACGACGGC CACGGTGCTC GCCCAGGCGT TGGTCCGCGA GGGCCTGCGC
CCACTGCCGT GCTGCTGCCG GTGCCACGAG CGGGTCCGCA ACCAGGCGCT CCCGGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCGG CCGGCGCCAA CCCGCTGGGT CTCAAGCGCG GCATCGAGAA GGCCGTCGAG
TTGCAGCGCC GGCCGCGGTT GGGCGACCCA GAGTTCGCGC CGTAGCTCTT CCGGCAGCTC
190 200 210 220 230 240,
AAGGTCACCG ASACCCTGCT CAAGTCGGCC AAGGAGGTCG AGACCAAGGA CCAGATCGCT
TTCCAGTGGC TCTGGGACGA GTTCAGCCGG TTCCTCCAGC TCTGGTTCCT GGTCTAGCGA
250 260 270 280 290 300 GCCACCGCGG CCANCTCCGC GGGCGACCAG TCGATCGGCG ACCTGATCGC CGAGGCGATG
CGGTGGCGCC GGTAGAGGCG CCCGCTGGTC AGCTAGCCGC TGGACTAGCG GCTCCGCTAC
310 320 330 340
GACAAGGTCG GCAACGAGGG CGTCATCACC GTCGAGGAGT CC (III)
CTGTTCCAGC CGTTGCTCCC GCAGTAGTGG CAGCTCCTCA GG et correspond à un fragment de la séquence du gène pour l'antigène de 6D kDa du groupe MAIP
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants
AccII Afll, Ahall, Bani, BBVLI BGll, Esp1286
BstEII, BstXI, CfOI, EAEI, HaeII, HaeIII, HPHI, MaeIII,
MnlI, NarI, PvuI, Sacll, Sau3A, Sau96A, TAQI.
Selon une autre modalité avantageuse de cette disposition, ladite séquence comprend 343 nucléotides, ré
pond à la formule (IV) ci-après
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCCGA GCTGGTCAAA GAGGTAGCCA AGAAGACCGA TGACGTCGCC
ATCGTCTTCT AGCCGCGGCT CGACCAGTTT CTCCATCGGT TCTTCTGGCT ACTGCAGCGG
70 80 90 100 110 120
GGTGACGGCA CCACGACGGC CACCGTGCTG GCCCAGGCGT TGGTTCGCGA GGGCCTGCGC
CCACTGCCGT GGTGCTGCCG GTGGCACGAC CGGGTCCGCA ACCAAGCGCT CCCGGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCGG CCGGCGCCAA CCCGCTCGGT CTCAAACGCG GCATCGAAAA GGCCGTGGAG
TTGCAGCGCC GGCCGCGGTT GGGCGAGCCA GAGTTTGCGC CGTAGCTTTT CCGGCACCTC
190 200 210 220 230 240
AAGGTCACCG AGACCCTGCT CAAGGGCGCC AAGGAGGTCG AGACCAAGGA GCAGATTGCG
TTCCAGTGGC TCTGGGACGA GTTCCCGCGG TTCCTCCAGC TCTGGTTCCT CGTCTAACGC
250 260 270 280 290 300
GCCACCGCAG CGATTTCGGC GGGTGACCAG TCCATCGGTG ACCTGATCGC CGAGGCGATG
CGGTGGCGTC GCTAAAGCCG CCCACTGGTC AGGTAGCCAC TGGACTAGCG GCTCCGCTAC
310 320 330 340
GACAAGGTGG GCAACGAGGG CGTCATCACC GTCGAGGAGT CC (IV)
CTGTTCCACC CGTTGCTCCC GCAGTAGTGG CAGCTCCTCA GG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose.
pond à la formule (IV) ci-après
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCCGA GCTGGTCAAA GAGGTAGCCA AGAAGACCGA TGACGTCGCC
ATCGTCTTCT AGCCGCGGCT CGACCAGTTT CTCCATCGGT TCTTCTGGCT ACTGCAGCGG
70 80 90 100 110 120
GGTGACGGCA CCACGACGGC CACCGTGCTG GCCCAGGCGT TGGTTCGCGA GGGCCTGCGC
CCACTGCCGT GGTGCTGCCG GTGGCACGAC CGGGTCCGCA ACCAAGCGCT CCCGGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCGG CCGGCGCCAA CCCGCTCGGT CTCAAACGCG GCATCGAAAA GGCCGTGGAG
TTGCAGCGCC GGCCGCGGTT GGGCGAGCCA GAGTTTGCGC CGTAGCTTTT CCGGCACCTC
190 200 210 220 230 240
AAGGTCACCG AGACCCTGCT CAAGGGCGCC AAGGAGGTCG AGACCAAGGA GCAGATTGCG
TTCCAGTGGC TCTGGGACGA GTTCCCGCGG TTCCTCCAGC TCTGGTTCCT CGTCTAACGC
250 260 270 280 290 300
GCCACCGCAG CGATTTCGGC GGGTGACCAG TCCATCGGTG ACCTGATCGC CGAGGCGATG
CGGTGGCGTC GCTAAAGCCG CCCACTGGTC AGGTAGCCAC TGGACTAGCG GCTCCGCTAC
310 320 330 340
GACAAGGTGG GCAACGAGGG CGTCATCACC GTCGAGGAGT CC (IV)
CTGTTCCACC CGTTGCTCCC GCAGTAGTGG CAGCTCCTCA GG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose.
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants
AccII, Ahall Bans, BBVI, BstXI, CfOI, EAEI,
HaeIII, HPHI, MaeIII, MnlI, NarI, NrVI, SacII, Sau3A,
Sau96A, TAQI.
AccII, Ahall Bans, BBVI, BstXI, CfOI, EAEI,
HaeIII, HPHI, MaeIII, MnlI, NarI, NrVI, SacII, Sau3A,
Sau96A, TAQI.
La présente invention a également pour cet des oligonucleotides caractérisés en ce qu' s sort constitués par un fragment f'ulne slequence nucleotidique conforme a l'invention.
Parmi ces fragments, on peut citer en particulier
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule suivante (V)
5' GAGATCGAGCTGGAGGATCC (V).
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule suivante (V)
5' GAGATCGAGCTGGAGGATCC (V).
Une telle séquence correspond en particulier à la séquence de bases 397-416 après le codon de début du brin "+" du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose ; cette séquence est ci-après dénommée TB-1
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VI) suivante
5' AGCTGCAGCCCAAAGGTGTT (VI).
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VI) suivante
5' AGCTGCAGCCCAAAGGTGTT (VI).
Une telle séquence est complémentaire de la séquence de bases 535-554 après le codon de début du brin "+" du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose ; cette séquence est ci-après dénommée TB-2
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VII) suivante
5' GCGGCATCGAAAAGGCCGTG (VII) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-3
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VIII) suivante
5' CGAAATCGCTGCGGTGGCCG (VIII) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-4
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (lX) suivante
5' CTGCCACCGCGGCCATCTCC (IX) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles du groupe MAIP et est ci-apres dénommée TB-5 ; cet oligo nucléotide comprend avantageusement un site de restriction unique Bg~I
- un oligonucléotide, craracterisé en ce qu'il présente la séquence de formule (X) suivante
5' CTGCCACCGCCGGTATCTCC (X) laquelle séquence permet de reconnaître M. fortuitum et est ci-après dénommée TB-6
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XI) suivante
5' AACGTCGCGGCCGGCGCCAA 3' (XI) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-7
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XII) suivante
5' GACTCCTCGACGGTGATGAC 3' (XII) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-8
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XIII) suivante
5' CCTGCTCAAGGGCGCCAAG 3' (XIII) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-9 ; cet oligonucléotide TB-9 comprend avantageusement un site de restriction unique Bans.
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VII) suivante
5' GCGGCATCGAAAAGGCCGTG (VII) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-3
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VIII) suivante
5' CGAAATCGCTGCGGTGGCCG (VIII) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-4
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (lX) suivante
5' CTGCCACCGCGGCCATCTCC (IX) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles du groupe MAIP et est ci-apres dénommée TB-5 ; cet oligo nucléotide comprend avantageusement un site de restriction unique Bg~I
- un oligonucléotide, craracterisé en ce qu'il présente la séquence de formule (X) suivante
5' CTGCCACCGCCGGTATCTCC (X) laquelle séquence permet de reconnaître M. fortuitum et est ci-après dénommée TB-6
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XI) suivante
5' AACGTCGCGGCCGGCGCCAA 3' (XI) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-7
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XII) suivante
5' GACTCCTCGACGGTGATGAC 3' (XII) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-8
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XIII) suivante
5' CCTGCTCAAGGGCGCCAAG 3' (XIII) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-9 ; cet oligonucléotide TB-9 comprend avantageusement un site de restriction unique Bans.
Selon encore un autre mode de réalisation, lesdits nucléotides sont obtenus par synthèse, en utilisant notamment un appareil commercialisé par APPLIED BIOSYSTEMS (USA).
La présente invention a également pour objet des paires d'amorces pour la synthèse d'un ADN ou d'un ARN d'actinomycétale, caractérisée en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
De telles amorces permettent la synthèse d'une séquence d'ADN ou d'ARN ou d'un fragment de celle-ci présente dans un gène codant pour un antigène présent dans toutes les actinomycétales et notamment le gène codant pour l'antigène de 65 kDa.
Selon un mode de realisaton desdites paires d'amorces, elles sont avanta-euserent ~cnst tuées par Ün oligonucléotide de formule (V) (TB-1) apparié à un cligonucléotide de formule (VI) (TB-2).
Selon un autre mode de réalisation des-dites paires d'amorces, elles sont avantageusement constituées par un oligonucléotide de formule (XI) (TB-7) apparié à un oligonucléotide de formule (XII) (TB-8).
Les amorces TB-1 et TB-2 permettent la synthèse drune séquence d'ADN ou d'ARN présente chez les mycobactéries ou apparentés comme Nocardia ou Rhodococcus.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci telle que définie ci-dessus, éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée, un fluorochrome, un anticorps ou un analogue de base tel que celui décrit dans le brevet fran çais n' 81 24131.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite sonde -est choisie dans le groupe qui comprend les oligonucléotides de formules VII (TB-3), VIII (TB-4), IX (TB-5), X (TB-6) et XIII (TB-9).
La sonde TB-6 permet en particulier de détecter
M. fortuitum: la sonde TB-5 permet de détecter les mycobactéries du groupe MAIP ; les sondes TB-3, TB-4 et TB-9 permettent de détecter les mycobactéries du groupe des bacilles de la tuberculose.
M. fortuitum: la sonde TB-5 permet de détecter les mycobactéries du groupe MAIP ; les sondes TB-3, TB-4 et TB-9 permettent de détecter les mycobactéries du groupe des bacilles de la tuberculose.
La présente invention a également pour objet un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (II) ci-dessus et répond à la formule (XIV) ci-après
TYR-GLU-LYS- ILE-GLY-AtA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-AP-A3P-VAL-ALA-GtY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL- LEU-ALA-GLN-ALA -LEU-VAL -.G-GLU -GLY-LEU-AR & ASN-VAL-
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-GLY
ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU ALA-MET-ASP-LYS -VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL- ILE-THR-VAL-GLU-
GLU-SER. (XIV)
La présente invention a également pour objet tin peptide et/ou un fragment de peptide,- caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de for mule (III) ci-dessus et répond à la formule (XV) ci-après TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-ssLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR
VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA-
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-ASP-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-ALA
ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU-
ALA-MET -ASP -LYS -VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL- I LE-THR-VAL-GLU-
GLU-SER. (XV)
La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide et/ou un fragment de peptide tel que défini ci-dessus, éventuellement associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
TYR-GLU-LYS- ILE-GLY-AtA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-AP-A3P-VAL-ALA-GtY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL- LEU-ALA-GLN-ALA -LEU-VAL -.G-GLU -GLY-LEU-AR & ASN-VAL-
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-GLY
ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU ALA-MET-ASP-LYS -VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL- ILE-THR-VAL-GLU-
GLU-SER. (XIV)
La présente invention a également pour objet tin peptide et/ou un fragment de peptide,- caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de for mule (III) ci-dessus et répond à la formule (XV) ci-après TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-ssLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR
VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA-
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-ASP-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-ALA
ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU-
ALA-MET -ASP -LYS -VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL- I LE-THR-VAL-GLU-
GLU-SER. (XV)
La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide et/ou un fragment de peptide tel que défini ci-dessus, éventuellement associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié avec un peptide ou un fragment de peptide conforme à l'invention.
De tels anticorps peuvent notamment trouver application pour la mise en évidence de la présence de mycobactéries dans un échantillon approprié obtenu chez un pa tient à tester, selon un procédé connu de type ELISA ou
RIA.
RIA.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identilfication rapide de faibles quantités d'actinomycétales, notamment de mycobactéries présentes dans un échantillon biologique caractérisé en ce que ledit échantillon cor.;enablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de transcription des actinomycétales, éventuellement présentes,
(1) est mis en contact avec une paire d'amorces conforme à l'invention, pour amplifier au moins un fragment dudit ADN ou ARN,
(2) après quoi la séquence d'ADN ou d'ARN am plifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique conforme à l'invention.
(1) est mis en contact avec une paire d'amorces conforme à l'invention, pour amplifier au moins un fragment dudit ADN ou ARN,
(2) après quoi la séquence d'ADN ou d'ARN am plifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique conforme à l'invention.
Le procédé mis en oeuvre en (1) est notamment lune des technique d'amplification génétique telles que la méthode dite Os réplicase (LIZARDI P.M. et al.,
Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite P.C.R. (polymerase chain reaction) décrite dans les demandes de brevets européens n 200 363, n 201 184 et n' 229 701 déposées par
CETUS CO.
Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite P.C.R. (polymerase chain reaction) décrite dans les demandes de brevets européens n 200 363, n 201 184 et n' 229 701 déposées par
CETUS CO.
Un tel procédé a l'avantage de permettre de réaliser un test spécifique, direct et rapide, distinguant les différents groupes d'actinomycétales et notamment de mycobactéries en utilisant, d'une part des amorces non spécifiques qui amplifient un fragment d'ADN ou d'ARN et en utilisant, d'autre part des sondes spécifiques de groupe ou de genre.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit procédé, il comprend en outre
(3) le clivage de la sonde éventuellement hybridée au cours de l'étape (2) précédente, par une enzyme de restriction appropriée
(4) la détection du fragment de sonde, éventuellement obtenu.
(3) le clivage de la sonde éventuellement hybridée au cours de l'étape (2) précédente, par une enzyme de restriction appropriée
(4) la détection du fragment de sonde, éventuellement obtenu.
Selon une disposition de ce mode de réalisation, l'enzyme de restriction est avantageusement choisit dans le groupe qui comprend BanI et Bgll
Un tel mode de réalisation a 1' avantage de permettre la détection d'un genre ou d'un groupe d' actinom'1ctales
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé, la détection de la séquence d'ADN ou d'ARN amplifié est réalisée à l'aide de deux sondes nucléotidiques appropriées, ledit procédé comprenant en outre
(3) le couplage enzymatique des deux sondes hybridées
(4) la détection du fragment comportant les deux sondes associées, éventuellement obtenu.
Un tel mode de réalisation a 1' avantage de permettre la détection d'un genre ou d'un groupe d' actinom'1ctales
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé, la détection de la séquence d'ADN ou d'ARN amplifié est réalisée à l'aide de deux sondes nucléotidiques appropriées, ledit procédé comprenant en outre
(3) le couplage enzymatique des deux sondes hybridées
(4) la détection du fragment comportant les deux sondes associées, éventuellement obtenu.
La présente invention a, en outre, pour objet
un kit, coffret ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'au moins une
actinomycétale, notamment d'au moins une mycobactérie, ca
ractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles
de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre
de ladite détection
- des doses appropriées d'une paire d'amorces
conforme à l'lilnvention
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou
un fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention.
un kit, coffret ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'au moins une
actinomycétale, notamment d'au moins une mycobactérie, ca
ractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles
de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre
de ladite détection
- des doses appropriées d'une paire d'amorces
conforme à l'lilnvention
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou
un fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent,
l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res
sortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples de mise en oeuvre du procédé, objet de la pré
sente invention.
l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui res
sortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples de mise en oeuvre du procédé, objet de la pré
sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces
exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de
l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de
l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Dépistage et identification compa
rée de M. tuberculosis, M. bovis, M. avium et M. fortuitum
a) Isolement de 1'ADN mycobactérien.
rée de M. tuberculosis, M. bovis, M. avium et M. fortuitum
a) Isolement de 1'ADN mycobactérien.
On traite les extraits biologiques de manière
appropriée, puis on centrifuge. Pour extraire 1'ADN, le cu
lot de centrifugation est remis en suspension dans 50 l de NaOF. 0,1 M contenant du N CX 2 M et du SDS 0,5 %, incubé
95 C pedant 15 mlin (aglitatlion douce accasionelle), puis après l'addition de 0,4 ml de Tris-HCl 0,1 M à pH 7, l'ADN
est extrait par trois passages dans un melange phénol/chloroforme, précipité avec de l'éthanol et dissous
dans 50 pl de Tris-HCl 10 mM à pH 8 contenant 0,1 mM d'EDTA.
appropriée, puis on centrifuge. Pour extraire 1'ADN, le cu
lot de centrifugation est remis en suspension dans 50 l de NaOF. 0,1 M contenant du N CX 2 M et du SDS 0,5 %, incubé
95 C pedant 15 mlin (aglitatlion douce accasionelle), puis après l'addition de 0,4 ml de Tris-HCl 0,1 M à pH 7, l'ADN
est extrait par trois passages dans un melange phénol/chloroforme, précipité avec de l'éthanol et dissous
dans 50 pl de Tris-HCl 10 mM à pH 8 contenant 0,1 mM d'EDTA.
Ab)Amplification de l'ADN
L'amplwfication est réalisée comme décrit dans
SAIKI et al. (Science, 1988, 239, 487-491), ainsi que dans la Demande de Brevet européen n 200 362 : 0,1 ml d'un mélange réactionnel contenant : 50 mM de KCl1 10 mM de Tris
HCl (pH 8,3), 1,5-2,4 mM de ngCl2, 100 g/ml de gélatine, 300 M de déoxyribonucléotides (mélange des 4 déoxyribonucléotides dA, dG, dC et dI), 50 pM des amorces conformes à l'invention dénommées TB-1 et TB-2, deux unités de Taq polymérase et 10-50 wl d'un extrait d'un mélange de cellules humaines et de mycobactéries ou 50 ng d'ADN extrait de mycobactéries est maintenu à 94iC (1,5 min), 50'C (2 min) et 72'C (2 min) pendant environ 40 cycles.Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 37'C pendant 10 min, puis stockés à 4 C
c. Analyse des échantillons amplifiés par ana
en Southern blot.
L'amplwfication est réalisée comme décrit dans
SAIKI et al. (Science, 1988, 239, 487-491), ainsi que dans la Demande de Brevet européen n 200 362 : 0,1 ml d'un mélange réactionnel contenant : 50 mM de KCl1 10 mM de Tris
HCl (pH 8,3), 1,5-2,4 mM de ngCl2, 100 g/ml de gélatine, 300 M de déoxyribonucléotides (mélange des 4 déoxyribonucléotides dA, dG, dC et dI), 50 pM des amorces conformes à l'invention dénommées TB-1 et TB-2, deux unités de Taq polymérase et 10-50 wl d'un extrait d'un mélange de cellules humaines et de mycobactéries ou 50 ng d'ADN extrait de mycobactéries est maintenu à 94iC (1,5 min), 50'C (2 min) et 72'C (2 min) pendant environ 40 cycles.Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 37'C pendant 10 min, puis stockés à 4 C
c. Analyse des échantillons amplifiés par ana
en Southern blot.
On prélève des aliquots de 10 l dans les échantillons amplifiés, qui subissent une électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %. L'ADN est ensuite transféré sur des filtres en nylon (technique standard : REED K.L. et al, Nucleic Acid Research, 1985, 13, 7207). Les filtres avec l'ADN sont ensuite lavés dans une solution de 2X SSPE (la solution 20X SSPE correspond à : 3,0 M NaCl, 200 mM NaH2PO4 et 20 mM EDTA) puis traités par un mélange de préhybridation à 63 C dans une solution comprenant du 5X SSPE et du 5X Denhardt (une solution 1X Denhardt correspond à 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine) pendant 2 heures puis hybridé dans la meme solution contenant trous sondes conformes à l'invention TB-4, TE-5 et TB-6 marquées à leur extrémité 5' au 32p (2.10 5 lcpm/ml, activité spécifique 1-3 CiL/pmole) pendant une nuit à 63 C Les blots ou dépôts obtenus sont lavés pendant 2 heures à température ambiante dans une solution 0,1X SSC (1X SSC correspond à 0;;15 M NaCl et 0,015 M citrate de Na) contenant du SDS 0,5 %, 2 à 4 minutes à 67l7l2 C dans une solution de 5X SSPE contenant du SDS 0,5 % et 2 heures à température ambiante dans du SSC 0,1X conte nant du SDS 0,5 %. Les dépôts obtenus sont séchés et les hybrides éventuellement présents sont révélés par exposition à un film XAR-5.
En analyse dot-blot, 10 d'aliquots d'échantillons amplifiés sont dénatures par chauffage à 95 C pendant 2 min dans 0,2 ml de NaOH 0,4 M contenant 25 mM EDTA. Les échantillons sont refroidis rapidement et chargés dans les puits d'un manifold (BIORAD, (USA)) ou d'un minifold (CERA LABO (France)), ajusté avec une membrane de nylon. Chaque puits est lavé deux fois avec 0,4 ml de SSPE 20X, la membrane est chauffée à 80'C pendant une heure et l'hybridation est réalisée comme décrit ci-dessus.
On obtient les résultats tels que visibles dans la figure 1.
La figure 1 montre l'hybridation de l'ADN amplifié de M. bovis (B), M. avium (A) et M. fortuitum (F) avec respectivement les sondes spécifiques TB-4, TB-5 et
TB-6.
TB-6.
Exemple 2 : Comparaison des séquences obtenues dans l'exemple 1 avec les séquences d'ADN telles que décrites dans la littérature
a) Séquencage des séquences mycobacteriennes ampliffies obtenues.
a) Séquencage des séquences mycobacteriennes ampliffies obtenues.
L'ADN est extrait avec du phénol, précipité à
I'éthanol et redissous dans du Tris-HCl 10 mM (pH 8) conte- nant 1 mM d'EDTA.
I'éthanol et redissous dans du Tris-HCl 10 mM (pH 8) conte- nant 1 mM d'EDTA.
L'ADN est ensuite digéré aec les endonucléases de restriction PstI et BamH1, Ion dans les phages M13mp18 et M13mpl9 et séquencé selon la méthode de SANGER en utili- sant de la T7 polymérase ou de la Taq polymérase en présence de d-azaGTP à la place du dGTP.
L'ADN amplifié correspond à la région attendue du gène codant pour l'antigène mycobactérien de 65 kDa comme le montre la figure 2, dans laquelle sont précisées les séquences d'ADN des fragments amplifiés obtenus à partir du gène codant pour l'antigène 65 kDa de M. bovis, M.
avium, M. paratuberculosis et M. fortuitum.
La séquence de l'ADN amplifié de M. bovis est identique a la région correspondante de la séquence codant pour l'antigène 65 kDa de M. bovis (THOLE et al. 1987) et
M. tuberculosis (SHINNICK et al. 1987).
M. tuberculosis (SHINNICK et al. 1987).
Les séquences de I'ADN amplifié à partir de M.
avium, M. paratuberculosis et M. fortuitum sont très similaires à celles de M. bovis, M. tubercuiosis et les produits de traduction déduits correspondant à ces séquences sont également très similaires à l'antigène 65 kDa de M.
bovis/M. tuberculosis comme le montre la figure 2.
La figure 3 montre un certain nombre de sites de restriction des fragments de 343 nucléotides compris dans le gène codant pour l'antigène de 65 kDa de M. avium (figure 3a), M. fortuitum (figure 3b), M. paratuberculosis (figure 3c), M. bovis BCG (figure 3d).
Exemple 3 : Evolution de la sensibilité de la méthode.
La sensibilité de la méthode a été testée en utilisant du BCG dilué dans un milieu biologique, le liquide pleural. Il a été possible de détecter environ 10 bacilles par ml de liquide ; ceci représente une amélioration considérable par rapport aux tests d'examen direct, qui nécessitent 109 à 104 bacillesSml pour la détection des myco bactériens, et ce, sans identification.
De plus, ce test peut être accompli beaucoup plus rapidement que la détection et l'identification des mycobactéries après enrichissement et culture.
La figure 4 montre les résultats obtenus pour de lyADN extrait à partir d'échantillons contenant 106 cellules mononucléaires sanguines humaines et 6.105 (colonne 1), 6.104 (colonne 2), 6.103 (colonne 3), 600 (colonne 4), 60 (colonne 5), 6 (colonne 6) bacilles M. bovis, et amplifié en utilisant la Taq polymérase et les amorces oligonucléotidiques TB-1 et TB-2 (figure 4a : gel ; figure 4b dot blot).
Exemple 4 : Détection de séquences amplifiées du groupe des bacilles de la tuberculose par le test de restriction d'un oligonucléotide.
Pour détecter la présence de séquences amplifiées de mycobactéries appartenant au groupe des bacilles de la tuberculose, par le test de restriction, 4.10 cpm d'oligonucléotide TB-9 marqué au 32p à son extrémité 5' est mélangé avec 2 l d'un tampon 10X (40 mM Tris HCl pH 7,0, 60 m MgCl2 et 60 mM de 2-mercaptoéthanol) dans un volume final de 15 pl. 4 l de produit amplifié est ajouté et le tube est incubé à 95 C pendant 5 minutes, transféré dans de la glace, puis incubé à 52 C pendant 2 heures. 1 l de BanI (25 unités) est ajouté et les tubes sont incubés à 37*C pendant 1-2 heures. 4 l de formamide à 95 % contenant du Ficoll à 20 %, 25 mM d'EDTA, 25 g(ml de bleu de bromophénol et 25 g/ml de xylène cyanol sont ajoutés, les tubes sont chauffés à 65 C pendant 10 minutes et 12 l sont soumis à une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 30 % (340 V pendant 1-2 heures). Le gel est alors exposé à un film à rayons X pendant 3-18 heures et les échantillons positifs identifiés par la présence d'une bande correspondant au fragment de 11 nucléotides 5' de l'oligonucléotide TB-9, produit par le clivage de TB-9 par l'enzyme de restriction.
Exemple 5 : Synthèse des oligonucléotides conformes à l'invention.
Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la méthode au phosphoramidite (BEAUCAGE, 198, cité) avec un sinthétisateur d'ADN 380 D (APPLIED BIOSYSTEMS, CA).
Cn obtient ainsi TB-1, TB-2 TB-3, TB-4, TB-5,
TB-6, TB-7, TB-8, TB-9.
TB-6, TB-7, TB-8, TB-9.
Exemple 6 : Détection de séquences amplifiées du groupe MAIP par le test de restriction d'un oligonucléotide.
Le protocole est identique à celui de l'exemple 4 ; cependant, un certain nombre de réactifs sont diffé rents
- l'oligonucléotide TB-5 est utilisé ;
- le tampon 10X contient 500 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de MgCl2 et 400 mM de NaCl
- l'enzyme de restriction utilisée est BglI (10 unités).
- l'oligonucléotide TB-5 est utilisé ;
- le tampon 10X contient 500 mM de Tris-HCI pH 8,0, 100 mM de MgCl2 et 400 mM de NaCl
- l'enzyme de restriction utilisée est BglI (10 unités).
Comme dans l'exemple 4, les échantillons posi-.
tifs sont identifiés par la présence d'une bande correspondant à un fragment de 9 nucléotides résultant du clivage de l'oligonucléotide TB-5 par l'enzyme de restriction BglI.
La figure 5 montre la détection de séquences d'ADN mycobactérien amplifiées par le test de restriction d'oligonucléotides.
L'ADN mycobactérien purifié est amplifié et des quantités équivalentes du produit amplifié à partir de M.
avium (colonne 1-5), M. bovis BCG (colonne 6) et M. fortuitum (colonne 7) sont évaluées comme décrit ci-dessus en utilisant l'oligonucléotide TB-5 marqué au 32P et l'enzyme de restriction BglI. On ajoute une quantité d'enzyme correspondant à une activité enzymatique : de 1 unité (échantillons 1, 6 et 7) ; de 5 unités (échantillon 2) ; de 10 unités (échantillon 3) ; 20 unités (échantillon 4) ; 50 unités (échantillon 5).
L'autoradiogramme est exposé pendant 3 heures avec un seul écran d'intensrfication. La figure 5 moa=I; bien que seules les colonnes 1-5 permettent de mettre en évidence l'oligombre clivé , permettant donc d'identifier M.
avium.
Exemple 7 : Détection d'ADN mycobactérien dans un crachat.
De l'ADN purifié à partir de M. tuberculosis (figure 6, T), de M. avium (figure 6, A), de M. fortuitum (figure 6, F) et de 1'ADN extrait d'échantillons de crachats qui ont fourni une culture négative (figure 6, colonne 1-6) ou d'échantillons de crachats qui ont fourni une culture positive pour M. tuberculosis (figure 6, colonnes 7 et 8), a été amplifié à l'aide la Taq polymérase dans le cas de la PCR ou d'une autre polymérase et des oligonucléotides TB-1 et TB-2. Des échantillons des séquences amplifiées sont fixés sur filtres (dot blots) et hybridés avec les oligonucléotides TB-4, TB-5 et TB-6 marqués à leur extrémité 5 au 32p,
On voit que 1'ADN de M. tuberculosis réagit avec TB-4.
On voit que 1'ADN de M. tuberculosis réagit avec TB-4.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (5)
1 ) Séquence nucléotidique issue d'actinomycétales, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence homologue d'un gène commun à toutes les actinomycétales, à l'intérieur de laquelle existent des régions conservées et des régions variables.
2') Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est issue de mycobactéries.
3;) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est issue de Nocardia.
4-) Séquence selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle est issue de Rhodococcus.
5') Séquence selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est incluse dans le gène codant pour l'antigène mycobactérien de 65 kDa.
6') Séquence selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle correspond a un fragment dudit gène et comprend entre 250 et 500 paires de bases.
7') Séquence selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle comprend 383 paires de bases homologues chez au moins 5 espèces de mycobactéries, à savoir : M. tuberculosis, M. avium, M. fortuitum, M. paratuberculosis et
BCG.
8; # Séquence selon la revendication 7, caractérisse en ce qu'elle correspond au produit d'expression de séquence en acides aminés de frrr.ule 'I', suivante
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS
LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-TH-ALA-THR-
VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LwU-ARG-ASN-VAL-
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PO-LEU-GLY-LEU-LYS -ARG-GLY- îLE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-X1-GLN-ILE-ALA-THR-ALA-X2-ILE
SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU-ALA-
MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GtY-VAL- ILE-THR-VAL-GLU-GLU-
SER, dans laquelle Xi représente ASP ou GLU,
X2 représente ALA ou GLY.
9q) Séquence selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend 343 paires de bases, répond à la formula(ll) ci-après
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCTGA GCTCGTCAAG GAAGTCGCCA AGAAGACCGA CGACGTGC
ATGCTCTTCT AGCCGCGACT CGAGCTAGTTC CTTCAGCGGT TCTTCTGGCT GCTGCAGCGC
70 80 90 100 110 120
GGCGACGGCA CCACCACCGC CACCGTTCTG GCACAGGCCC TGGTTCGTGA AGGTCTGCGC
CCGCTGCCGT GGTGGTGGCG GTGGCAAGAC CGTGTCCGGG ACCAAGCACT TCCAGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCTG CCGGCGCCAA CCCGCTCGGC CTGAAGCGCG GCATCGAGAA GGCCGTCGAG
TTGCAGCGAC GGCCGCGGTT GGGCGAGCCG GACTTCGCGC CGTAGCTCTT CCGGCAGCTC
190 200 210 220 230 240
AAGGTCACG AGACGCTGCT GAAGAGCGCC AAGGAGGTGG AGACCAAGGA GCAGATCGCT
TTCCAGTGGC TCTGCGACGA CTTCTCGCGG TTCCTCCACC TCTGGTTCCT CGTCTAGCGA
250 260 270 290 290 300
GCCACCGCCG GTATCTCCGC CGGTGACCAG TCCATCGGTG ACCTGATCGC CGAGGCCATG
CGGTGGCGGC CATAGAGGCG GCCACTGGTC AGGTAGCCAC TGGACTAGCG GCTCCGGTAC
310 320 330 340
(II)
GACAAGGTCG GCAACGAGGG TGTCATCACC GTCGAGGAGA GC
CTGTTCCAGC CGTTGCTCCC ACAGTAGTGG CAGCTCCTCT CG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa de M. fortuitum,
10') Séquence selcn l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend notamment les sites de restriction suivants
Accll, Aball. Banl Banll, BBVI, Bsp1286,
BstXl, CfOl, DDeI, KcoRll, Espl, Fnv4HI, Haell, Halll
HAPII, HgAI, Hinfl, HPHI,Maelll,Mbcll, Mnll,NarI, Nccl
Nlalll Sacl, Sacll, Sau3A, sau 96A, SCFRI; STYI, TAQI,
YnAlll.
11') Séquence selon l'une quelconque des revendications 6 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend 343 nucléotides, répond à la formule(lll) ci-après
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCCGA GCTGGTCAAG GAAGTCGCCA AGAAGACCGA CGACGTCGCC
ATGCTCTTCT AGCCGCGGCT CGACCAGTTC CTTCAGCGGT TCTTCTGGCT GCTGCAGCGG
70 80 90 100 110 120
GGTGACGGCA CGACGACGGC CACGGTGCTC GCCCAGGCGT TGGTCCGCGA GGGCCTGCGC
CCACTGCCGT GCTGCTGCCG GTGCCACGAG CGGGTCCGCA ACCAGGCGCT CCCGGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCGG CCGGCGCCAA CCCGCTGGGT CTCAAGCGCG GCATCGAGAA GGCCGTCGAG
TTGCAGCGCC GGCCGCGGTT GGGCGACCCA GAGTTCGCGC CGTAGCTCTT CCGGCAGCTC
190 200 210 220 230 240
AAGGTCACCG AGACCCTGCT CAAGTCGGCC AAGGAGGTCG AGACCAAGGA CCAGATCGCT
TTCCAGTGGC TCTGGGACGA GTTCAGCCGG TTCCTCCAGC TCTGGTTCCT GGTCTAGCGA
250 260 270 280 290 300
GCCACCGCGG CCATCTCCGC GGGCGACCAG TCGATCGGCG ACCTGATCGC CGAGGCGATG CGGTGGCGCC GGTAGAGGCG CCCGCTGGTC AGCTAGCCGC TGGACTAGCG GCTCCGCTAC
310 320 330 340
GACAAGGTCG GCAACGAGGG CGTCATCACC GTCGAGGAGT CC (III)
CTGTTCCAGC CGTTGCTCCC GCAGTAGTGG CAGCTCCTCA GG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe MAIP.
12") Séquence selon l'une quelconque des reven diction 6 à 8 ou 11, caractérisée en ce qu'elle comprend notamment les sites de restriction suivants
AccII, AflI, AhaIl, BanI, BBVI, Bgll, Bsp1286,
BstEll, BstXI, CfOl, EAEI, HaeII, HaeIII, HPHI, MaeIII,
Mnll, Narl, Pvul, Sacll, Sau3A, Sau96A, TAQI.
13) Séquence selon l'une quelconque des reven Bcations & à à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend 34 nucléotides, répond à la formule (IV) ci-après
10 20 30 40 50 60
TACGAGAAGA TCGGCGCCGA GCTGGTCAAA GAGGTAGCCA AGAAGACCGA TGACGTCGCC
ATGCTCTTCT AGCCGCGGCT CGACCAGTTT CTCCATCGGT TCTTCTGGCT ACTGCAGCGG
70 80 90 100 110 120
GGTGACGGCA CCACGACGGC CACCGCTG GCCCAGGCGT TGGTTCGCGA GGGCCTGCGC
CCACTGCCGT GGTGCTGCCG GTGGCACGAC CGGGTCCGCA ACCAAGCGCT CCCGGACGCG
130 140 150 160 170 180
AACGTCGCGG CCGGCGCCAA CCCGCTCGGT CTCAAACGCG GCATCGAAAA GGCCGTGGAG STGCAGCGCC GGCCGGTT GGGCGAGCCA GAGTTTGCGC CGTAGCTTTT CCGGCACCTC
190 200 210 220 230 240
AAGGTCACCG AGACCCTGCT CAAGGGCGCC AAGGAGGTCG AGACCAAGGA GCAGATTGCG
TTCCAGTGGC TCTGGGACGA GTTCCCGCGG TTCCTCCAGC TCTGGTTCCT CGTCTAACGC
250 260 270 280 29Q 300
GCCACCGCAG CGATTTCGGC GGGTGACCAG TCCATCGGTG ACCTGATCGC CGAGGCGATG
CGGTGGCGTC GCTAAAGCCG CCCACTGGTC AGGTAGCCAC TGGACTAGCG GCTCCGCTAC
310 320 330 340
GACAAGGTGG GCAACGAGGG CGTCATCACC GTCGAGGAGT CC (IV)
CTGTTCCACC CGTTGCTCCC GCAGTAGTGG CAGCTCCTCA GG et correspond à un fragment de la séquence du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose
14') Séquence selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 ou 13, caractérisée en ce qu'elle comprend notamment les sites de restriction suivants
AccII, AhaII, BanI, BBVI, BstXI, CfCI, EAEI,
HaeIII, HPHI, MaeIII, MnlI, NarI, NrVI, Sacll, Sau3A,
Sau96A, TAQI.
15 ) Oligonucléotidique caractérisé en ce qu'il est constitué par un fragment d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications i à 44.
16' ) Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-1, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule suivante (V)
5' GAGATCGAGCTGGAGGATCC (V).
17') Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-2, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VI) suivante
5' AGCTGCAGCCCAAAGGTGTT (VI).
18*) Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-3, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VII) suivante
5' GCGGCATCGAAAAGGCCGTG (VII)
19;) Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-4, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (VIII) suivante
5' CGAAATCGCTGCGGTGGCCG (VIII)
20') Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-5, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (IX) suivante
5' CTGCCACCGCGGCCATCTCC (IX)
21b) Oligonucléotide selon la revendication 20, caractérisé en ce qu'il comprend un site de restriction unique Bgl I.
22 ) Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-6, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (X) suivante
5' CTGCCACCGCCGGTATCTCC (X3
23 ) Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-7, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XI) suivante
5' AACGTCGCGGCCGGCGCCAA 3' (XI)
24 Oligonucléotide selon la revendication 15, dénommé TB-8, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (Xll) suivante
5'GACTCCTCGACGGTGATGAC 3' (Xll)
' ) Oligonucléotide selon la revendicatlon 15,dénommé TB-9, caractérisé en ce qu'il presente la séquence de formule (XIII) suivante
5-' CCTGCTCAAGGGCGCCAAG 3' (XIII)
26 ) Oligonucléotide selon la revendication 25, caractérisé en ce qu'il comprend un site de restriction unique BanI.
27 ) Oligonucléotide selon l'une quelconque des revendications 15 à 26, caractérisé en ce qu'il est obtenu par synthèse.
28 ) Paires d'amorces pour la synthèse d'un ADN ou d'un ARN d'actinomycétale, caractérisée en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 27.
29') Paire d'amorces selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oligonucléotide de formule (V) (TB-1) selon la revendication 16 apparié à un oligonucléotide de formule (VI) (TB-2) selon la revendication 17.
30') Paire d'amorces selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle est constituée par un oligonucléotide de formule (XI) (TB-7) selon la revendication 23 apparié à un oligonucléotide de formule (XII) (TB-8) selon la revendication 24.
31 Sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée, un fluorochrome, un anticorps ou un analogue de base.
32') Sonde selon la revendication 31, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe qui comprend les oligonucleotides de formules VII (IB-3) sels la reven dication 18. VIII T(B-4) selon la revendication 1,, IX (TB-5 > selon l'une quelconque des revendications O OU 21,
X (TB-6) selon la revendication 22 et XII= (TB-9) selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26.
33) Peptide et/ou fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (ll) selon la revendication 9 ou la revendication 10 et répond à la formule (XIV) ci-après TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-A A-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS- LYS -THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THRALA-THR-
VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL-
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA-
LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-G1U-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-GLY-
ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASp-LEU-ILE-ALA-GLU-
ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLy-VAL-ILE-THR-VAL-GLU-
GLU-SER. (XIV)
34') Peptide et/ou fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nu cléotides de formule (III) selon la revendication 11 ou la revendication 12 et répond a la formule (XV) ci-après
TyR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS-
LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR-
VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL-
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU- LYS-ARG-GLY- îLE-GLU-
LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA
LYS -GLU-VAL-GLU-THR-LYS-ASP-GLN- ILE-ALA-ALA-THR-ALA-ALA-
ILE-5ER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU-
ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-VAL-GLU
GLU-SER. (XV)
35') Composition à pouvoir immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide et/ou un fragment de peptide selon l'une quelconque des revendica- tions 33 ou 34, éventuellement associé à au moins un véhicule phariraceutiquement acceptable.
36') Anticorps polyclonaux ou monoclonaux, ca ractérisés en ce qu'ils sont cbtenus par immunisation d'un animal approprié avec un peptide ou un fragment de peptide selon la revendication 33 ou la revendication 34.
37') Procédé de détection et d'identification rapide de faibles quantités d'actinomycétales, notamment de mycobactéries présentes dans un échantillon biologique, caractérisé en ce que ledit échantillon convenablement traité pour extraire 1'ADN et/ou les produits de transcription des actinomycétales, éventuellement présentes,
(1) est mis en contact avec une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 28 à 30, pour amplifier au moins un fragment dudit ADN ou ARN,
(2) après quoi la séquence d'ADN ou d'ARN amplifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique selon la revendication 31 ou la revendication 32.
38 ) Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend en outre
(3) le clivage de la sonde éventuellement hybridée au cours de l'étape (2) précédente, par une enzyme de restriction appropriée
(4la détection du fragment de sonde, éventuellement obtenu.
39 ) Procédé selon la revendication 38, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction est choisie dans le groupe qui comprend BanI et BglI.
40 ) Procédé selon la revendication 37, caractérisé en ce que la détection de la séquence d'ADN ou d'ARN amplifié est réalisée à l'aide de deux sondes nucléotidiques appropriées, ledit procédé comprenant en outre
(3) le couplage enzymatique des deux sondes hybridées
(4) la détection du fragment comportant les deux sondes associées, éventuellement obtenu.
41 ) Kit, coffret ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 37 à 4C. ca ractérisé en Ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection
- des doses appropriées d'une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 28 à 30
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 31 ou 32.
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