WO1990012875A1 - Sequences nucleotidiques d'actinomycetales, applications a la synthese ou a la detection d'acides nucleiques, produits d'expression de ces sequences et application en tant que compositions immunogenes - Google Patents
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Classifications
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-
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-
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Definitions
- NUCLEOTIDE SEQUENCES OF ACTINOMYCETALS, APPLICATIONS FOR THE SYNTHESIS OR DETECTION OF NUCLEIC ACIDS, EXPRESSION PRODUCTS OF SUCH SEQUENCES AND APPLICATION AS IMMUNOGENIC COMPOSITIONS.
- the present invention relates to nucleotide sequences of actinomycetals, in particular mycobacteria, to oligonucleotides included in said sequences, to their applications as primers for the synthesis of actinomycetal DNA and as probes for the detection of DNA and / or actinomycetal transcripts, in particular mycobacteria, to the expression products of said sequences, to their applications and to the antibodies directed against said products, to a method for detecting and identifying actinomycetals and its applications, as well as immunogenic compositions comprising said expression products.
- Tuberculosis and leprosy are known to be major public health problems. There are currently about 60.10 6 individuals with TB in the world (with an annual mortality of 3.10 6), and about 15.10 6 individuals with leprosy. In France, there are approximately 10 4 new cases of tuberculosis per year.
- BCG vaccination Bacille Calmette and Guérin, an attenuated strain of M. bovis
- This effectiveness varies from around 80% in Western countries such as England to 0% in India (results of the last Chingleput vaccination trial). The appearance of strains of M.
- tuberculosis resistant to the usual anti-tuberculosis drugs and the existence of mycobacteriosis due to other increasingly common mycobacteria such as M. avium, in particular in people with immunosuppression (AIDS in the greatest number of cases), add to the urgency of developing a rapid method for the detection and identification of mycobacteria.
- tuberculosis and other related mycobacteriosis are difficult to make; in fact, the germs responsible for these diseases are often present in small quantities and when they are in quantities detectable by the conventionally used methods, the disease is already evolving and the patients are contagious to those around them. Because of the very long generation time of these bacteria (24 h for M. tuberculosis compared to 20 min for E. coli), the culture of these organisms is difficult. Thus it takes 6 to 8 weeks to identify the germs and more to obtain an antibiogram usable for the adequate treatment of the patients. The need for a detection test which does not require the culture of germs and which can be directly used with pathological samples even when the germs are present at low concentrations therein is essential.
- Serological techniques may prove useful under certain conditions, but their use is limited by their low sensitivity and / or specificity (DANIEL T.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987,
- the presence or absence of mycobacteria can also be determined by hybridization with DNA or RNA using probes specific for DNA sequences (KIEHN TE et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1551-1552; ROBERTS MC et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1239-1243; DRAKE TA et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442-1445).
- these methods also require the cultivation of microorganisms.
- M. tuberculosis Bact., 1987, 169 , 1080-1088 and which describes the genes of M. tuberculosis coding for protein antigens and in particular for the 65 kDa antigen.
- This International Application specifies, in particular, that the antigens of M. tuberculosis coding for five immunologically active proteins have been isolated by screening systematization of a recombinant DNA library expressed in a lambda gt11 bacteriophage, with a collection of monoclonal antibodies directed against the protein antigens of this bacterium.
- One of the antigens of M. tuberculosis, a 65 kDa protein has determinants common to M. tuberculosis and M. leprae.
- PCT International Application WO 88/06591 which in particular has the co-inventor T. SHINNICK, describes a recombinant protein of 540 amino acids (65 kDa protein) as well as the DNA sequence and the expression vectors of said protein , as well as the applications of said recombinant protein. This Application also describes peptides corresponding to sequences of this protein and their applications.
- the genes encoding the proteins of other mycobacteria were also isolated. Mention may in particular be made of THOLE et al. (Infect. Immunol., 1987, 55, 1466-1475), who described a 64 kDa protein from M. bovis BCG expressed in E. coli.
- the present invention has therefore given itself the aim of providing a detection and identification method making it possible to detect small quantities of DNA extracted from germs themselves present in a limited number, which is rapid and allows identification of an actinomycetal infection and in particular a mycobacterial infection, a Nocardia infection or a Rhodococcus infection, directly in pathological samples, without having to carry out a culture.
- the subject of the present invention is a nucleotide sequence derived from actinomycetals, characterized in that it consists of a homologous sequence of a gene common to actinomycetals chosen from the group which includes the mycobacteria, Nocardia and Rhodococcus, inside of which there are conserved regions and variable regions and in that it comprises between 250 and 500 base pairs.
- nucleotide sequence means both a double-stranded DNA sequence, a single-stranded DNA sequence and the transcripts of said DNA sequences.
- actinomycetales is understood to mean both actinomycetaceae such as Nocardia, as well as mycobacteriaceae or Rhodococcus.
- the group of the bacillus of tuberculosis is called the group which comprises M. bovis BCG, M. bovis, M. tuberculosis, M. africanum and M. microti; we call group MAIP, the group which includes M. avium, M. intracellulare and M. paratuberculosis.
- said sequence has at least 80% homology with the gene coding for the mycobacterial antigen of 65 kDa.
- said sequence comprises 383 base pairs homologous in at least 8 species of mycobacteria, namely: M. tuberculosis, M. avium, M. fort uitum, M. paratuberculosis, BCG, M. kansasii, M. malmoense and M. marinum.
- the 383 base pairs correspond to the amino acid sequence expression product of the following formula (I):
- X 1 is zero or represents the sequence ASP-PRO
- X 2 represents LYS or GLU
- X 3 represents GLY or ALA
- X4 represents GLY or ARG
- X 5 represents ALA or VAL
- X 6 represents ALA or ARG
- X 7 represents ARG or LYS
- X 8 represents PRO or LEU
- X 9 represents GLY or SER
- X 10 represents LEU or PHE
- X 11 represents ARG or CYS
- X 12 represents LYS or ALA
- X 13 represents GLU or ALA
- X 14 represents THR or LYS
- X 15 represents LYS or ASP
- X 16 represents SER, GLY, PRO or THR
- X 17 represents ASP or GLU
- X 18 represents ALA, GLY or VAL
- X 19 represents ALA or VAL
- X 20 represents GLN or ALA
- X 21 represents ASP or GLU
- X 22 represents LEU or PRO
- X 23 represents ALA or VAL
- X 24 represents GLU or ASP
- X 25 represents ALA or GLY
- X 26 represents ASN or LYS
- X 27 represents VAL or SER
- X 28 represents GLU or GLY
- X 29 is zero or represents the sequence ASN-THR-PHE-GLY-
- said sequence comprises 343 base pairs, corresponds to formula (II) below:
- Said fragment comprises in particular the following restriction sites:
- said sequence comprises 343 nucleotides, corresponds to formula (III) below:
- Said fragment comprises in particular the following restriction sites:
- said sequence comprises 343 nucleotides, corresponds to formula (IV) below:
- Said fragment notably includes the sites of following restrictions:
- said sequence comprises 343 nucleotides, corresponds to formula (V) below:
- Said fragment comprises in particular the following restriction sites:
- said sequence comprises 343 nucleotides, corresponds to formula (VI) below:
- Said fragment comprises in particular the following restriction sites:
- said sequence comprises 343 nucleotides, corresponds to formula (VII) below:
- Said fragment comprises in particular the following restriction sites:
- said sequence comprises 343 nucleotides, corresponds to formula (VIII) below:
- Nocardia asteroides corresponds to a fragment of Nocardia asteroides, similar to the sequence of the mycobacterial gene coding for the 65 kDa antigen.
- Said fragment comprises in particular the following restriction sites:
- the present invention also relates to oligonucleotides, characterized in that they consist of a fragment of a nucleotide sequence according to the invention.
- Such a sequence corresponds in particular to the base sequence 397-416 after the start codon of the "+" strand of the gene coding for the 65 kDa antigen from the group of tuberculosis bacilli; this sequence is hereinafter called -TB-1;
- Such a sequence is complementary to the base sequence 535-554 after the start codon of the "+" strand of the gene coding for the 65 kDa antigen from the group of tuberculosis bacilli; this sequence is hereinafter called TB-2;
- TB-4 5 'CGAAATCGCTGCGGTGGCCG (XII) which sequence makes it possible to recognize the bacilli of tuberculosis and is hereinafter called TB-4;
- oligonucleotide characterized in that it has the following sequence of formula (XIII):
- this oligonucleotide advantageously comprises a unique restriction site Bgl1;
- TB-10 3 'CGAAATCGCTGCGGTGGCCGCAATCTGCTC 5' (XVIII), which sequence makes it possible to recognize the bacilli of the tuberculosis group and is hereinafter called TB-10.
- said oligonucleotides are obtained by synthesis, in particular using an apparatus marketed by APPLIED BIOSYSTEMS (USA).
- the present invention also relates to pairs of primers for the synthesis of a DNA or of an RNA of actinomycetal, characterized in that each primer comprises a sequence or a fragment of nucleotide sequence as defined above.
- Such primers allow the synthesis of a DNA or RNA sequence or a fragment thereof present in a gene coding for an antigen present in all actinomycetales and in particular the gene coding for the 65 antigen. kDa.
- pairs of primers they advantageously consist of an oligonucleotide of formula (IX) (TB-1) paired with an oligonucleotide of formula (X) (TB-2).
- pairs of primers they are advantageously constituted with an oligonucleotide of formula (XV) (TB-7) paired with an oligonucleotide of formula (XVI) (TB-8).
- the primers TB-1 and TB-2 allow the synthesis of a DNA or RNA sequence present in mycobacteria or related like Nocardia or Rhodococcus.
- the present invention also relates to nucleotide probes, characterized in that they comprise a nucleotide sequence or a fragment thereof as defined above, optionally labeled with the aid of a marker such as an isotope radioactive, an appropriate enzyme, a fluorochrome, an antibody or a basic analog such as that described in French patent n ° 81 24131.
- a marker such as an isotope radioactive, an appropriate enzyme, a fluorochrome, an antibody or a basic analog such as that described in French patent n ° 81 24131.
- said probe is chosen from the group which comprises the oligonucleotides of formulas XI (TB-3), XII (TB-4), XIII (TB-5), XIV (TB-6 ), XVII (TB-9), XVIII (TB-10), XIX (TB-11) and XX (TB-12).
- the TB-6 probe makes it possible in particular to detect M. fortuitum; probes TB-5 and TB-11 are used to detect mycobacteria from the MAIP group; the probes TB-3, TB-4, TB-9 and TB-10, make it possible to detect mycobacteria of the group of bacilli of tuberculosis and the probe TB-12 makes it possible to detect M. kansasii.
- the present invention also relates to the peptides or fragments of peptides encoded by any one of the sequences defined above. We can notably cite:
- the present invention also relates to polyclonal or monoclonal antibodies, characterized in that they are obtained by immunization of an appropriate animal with a peptide or a peptide fragment in accordance with the invention.
- Such antibodies can in particular find application for the demonstration of the presence of mycobacteria in an appropriate sample obtained from a patient to be tested, according to a known method of ELISA or RIA type.
- the present invention also relates to a method for rapid detection and identification by amplification and hybridization, of small quantities of actinomycetals chosen from the group which includes the mycobacteria, Nocardia and Rhodococcus, possibly present in a biological sample suitably treated to extract DNA and / or the transcription products of said actinomycetales, which method is characterized in that said sample:
- (1) is brought into contact with a pair of primers according to the invention, to amplify at least one fragment of said DNA or RNA,
- the method implemented in (1) is in particular one of the genetic amplification techniques such as the so-called Q ⁇ replicase method (LIZARDI P.M. et al.,
- Such a method has the advantage of making it possible to carry out a specific, direct and rapid test, distinguishing the different groups of actinomycetals and in particular of mycobacteria by using, on the one hand, non-specific primers which amplify a DNA fragment or RNA and using, on the other hand, group or gender specific probes.
- said method further comprises:
- the restriction enzyme is advantageously chosen from the group which comprises BanI and BglI.
- Such an embodiment has the advantage of allowing the detection of a genus or group of actinomycetales.
- the detection of the DNA or amplified RNA sequence is carried out using two appropriate nucleotide probes, said method further comprising:
- the DNA is isolated from the biological sample, during a step prior to the detection and identification steps, by suspending the centrifugation pellet of said biological sample, in an appropriate lysis solution, followed by an incu bation at about 95 ° C, for a suitable time, itself followed by the addition to the medium, of a buffer solution, after which the DNA is extracted by appropriate extraction means.
- the lysis solution used is a 0.1N NaOH solution, 2M NaCl, 0.5% SDS.
- the incubation is carried out at a temperature of approximately 95oC for approximately 15 minutes.
- the present invention further relates to a kit, box or coordinated set, ready to use for the implementation of the method for detecting at least one actinomycetal, in particular at least one mycobacterium, characterized in that that it comprises, in addition to the useful quantities of buffers and of reagents suitable for carrying out said detection:
- the invention also comprises other arrangements, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
- Example 1 Screening and comparative identification of M. tuberculosis, M. bovis, M. avium and M. fortuitum.
- the biological extracts are treated as appropriate, then centrifuged.
- the centrifugation pellet is resuspended in 50 ⁇ l of 0.1 N NaOH containing 2 M NaCl and 0.5% SDS, incubated at 95 ° C. for 15 min (occasional gentle shaking), then after the addition of 0.4 ml of 0.1 M Tris- HCl at pH 7, the DNA is extracted by three passages in a phenol / chloroform mixture, precipitated with ethanol and dissolved in 50 ⁇ l of Tris -HCl 10 mM at pH 8 containing 0.1 mM EDTA.
- the amplification is carried out as described in SAIKI et al. (Science, 1988, 239, 487-491), as well as in European Patent Application No. 200,362: 0.1 ml of a reaction mixture containing: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8, 3), 1.5-2.4 mM of MgCl 2 , 100 ⁇ g / ml of gelatin, 300 ⁇ M of deoxyribonucleotides (mixture of the 4 deoxyribonucleotides dA, dG, dC and dl), 50 ⁇ M of the primers in accordance with the invention called TB-1 and TB-2, two units of Taq polymerase and 10-50 ⁇ l of an extract of a mixture of human cells and mycobacteria or 50 ng of DNA extracted from mycobacteria is maintained at 94oC (1.5 min ), 50 ° C (2 min) and 72 ° C (2 min) for approximately 40 cycles. After the last
- Filters with the DNA are then washed in a 2X SSPE solution (the 20X SSPE solution corresponds to: 3.0 M NaCl, 200 mM NaH 2 PO 4 and 20 mM EDTA) then treated with a prehybridization mixture at 63 ° C in a solution comprising 5X SSPE and 5X Denhardt (an IX Denhardt solution corresponds to: 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone and 0.02% bovine serum albumin) for 2 hours then hybridized in the same solution containing three probes in accordance with the invention TB-4, TB-5 and TB-6 marked at their 5 ′ end at 32 p (2.10 5 cpm / ml, specific activity 1-3 ⁇ Ci / pmole) overnight at 63 ° C.
- the blots or deposits obtained are washed for 2 hours at room temperature in a 0.1X SSC solution (IX SSC corresponds to 0.15 M NaCl and 0.015 M Na citrate) containing 0.5% SDS, 2 to 4 minutes at 67-72 ° C in a solution of 5X SSPE containing 0.5% SDS and 2 hours at room temperature in 0.1X SSC containing 0.5% SDS.
- the deposits obtained are dried and any hybrids present are revealed by exposure to an XAR-5 film.
- FIG. 1 shows the hybridization of the amplified DNA of M. bovis (B), M. avium (A) and M. fortuitum (F) with the specific probes TB-4, TB-5 and TB-6, respectively.
- Example 2 Comparison of the sequences obtained in Example 1 with the DNA sequences as described in the literature.
- the DNA is extracted with phenol, precipitated with ethanol and redissolved in 10 mM Tris-HCl (pH 8) containing 1 mM EDTA.
- the DNA is then digested with the restriction endonucleases PstI and BamHI, cloned into phages M13mp18 and M13mp19 and sequenced according to the SANGER method using T7 polymerase or Taq polymerase in the presence of d-azaGTP in place of the dGTP.
- the amplified DNA corresponds to the expected region of the gene coding for the 65 kDa mycobacterial antigen as shown in FIG. 2, in which the DNA sequences of the amplified fragments obtained from the gene coding for the antigen 65 are specified. kDa from M. bovis, M. avium, M. paratuberculosis and M. fortuitum.
- the sequence of the amplified DNA of M. bovis is identical to the corresponding region of the sequence coding for the 65 kDa antigen of M. bovis (THOLE et al. 1987) and M. tuberculosis (SHINNICK et al. 1987).
- the DNA sequences amplified from M. avium, M. paratuberculosis and M. fortuitum are very similar to those of M. bovis, M. tuberculosis and the deduced translation products corresponding to these sequences are also very similar to l 'antigen
- FIG. 3 shows a certain number of restriction sites for the 343 nucleotide fragments included in the gene coding for the 65 kDa antigen of M. avi um (FIG. 3a), M. fortuitum (FIG. 3b), M. paratuberculosis ( figure 3c), M. bovis BCG (figure 3d).
- Example 3 Evolution of the sensitivity of the method.
- the sensitivity of the method was tested using BCG diluted in a biological medium, pleural fluid. It was possible to detect about 10 bacilli per ml of liquid; this represents a considerable improvement compared to direct examination tests, which require 10 3 to 10 4 bacilli / ml for the detection of mycobacteria, without identification.
- this test can be performed much faster than the detection and identification of mycobacteria after enrichment and culture.
- FIG. 4 shows the results obtained from DNA extracted from samples containing 10 6 human blood mononuclear cells and 6.10 5
- Example 4 Detection of amplified sequences of the group of tuberculosis bacilli by the restriction test of an oligonucleotide.
- the gel is then exposed to an X-ray film for 3-18 hours and the positive samples identified by the presence of a band corresponding to the 11 ′ nucleotide fragment 5 ′ of the oligonucleotide TB-9, produced by the cleavage of TB -9 by the restriction enzyme.
- Example 5 Synthesis of the oligonucleotides in accordance with the invention.
- oligonucleotides are synthesized using the phosphoramidite method (BEAUCAGE, 1985, cited) with a 380 D DNA synthesizer (APPLIED BIOSYSTEMS, CA).
- Example 6 Detection of amplified sequences of the MAIP group by the restriction test of an oligonucleotide.
- the 10X buffer contains 500 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM MgCl 2 and 400 mM NaCl;
- the positive samples are identified by the presence of a band corresponding to a fragment of 9 nucleotides resulting from the cleavage of the oligonucleotide TB-5 by the restriction enzyme Bgl1.
- Figure 5 shows the detection of mycobacterial DNA sequences amplified by the oligonucleotide restriction test.
- the purified mycobacterial DNA is amplified and equivalent amounts of the product amplified from M. avium (column 1-5), M. bovis BCG (column 6) and M. fortuitum (column 7) are evaluated as described above. using the 32 P-labeled oligonucleotide TB-5 and the restriction enzyme Bgl1.
- An amount of enzyme corresponding to an enzymatic activity is added: of 1 unit (samples 1, 6 and 7); 5 units (sample 2); 10 units (sample 3); 20 units (sample 4); 50 units (sample 5).
- FIG. 5 clearly shows that only columns 1-5 make it possible to highlight the cleaved oligomer, thus making it possible to identify M. avium.
- Example 7 Detection of mycobacterial DNA in a sputum.
- DNA purified from M. tuberculosis ( Figure 6, T), M. avium ( Figure 6, A), M. fortuitum (Figure 6, F) and DNA extracted from sputum samples which provided a negative culture ( Figure 6, column 1-6) or sputum samples which provided a positive culture for M. tuberculosis ( Figure 6, columns 7 and 8), was amplified using the Taq polymerase in the case of PCR or another polymerase and the oligonucleotides TB-1 and TB-2. Samples of the amplified sequences are fixed on filters (dot blots) and hybridized with the oligonucleotides TB-4, TB-5 and TB-6 labeled at their 5 'end with 32 P.
Abstract
Séquences nucléotidiques d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, oligonucléotides compris dans lesdites séquences, leurs applications en tant qu'amorces pour la synthèse d'ADN d'actinomycétales et en tant que sondes pour la détection d'ADN et/ou des produits de transcription d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, produits d'expression desdites séquences, leurs applications et anticorps dirigés contre lesdits produits, procédé de détection et d'identification des actinomycétales et ses applications, ainsi que compositions immunogènes comprenant lesdits produits d'expression. La séquence nucléotidique issue d'actinomycétales est constituée par une séquence homologue d'un gène commun à toutes les actinomycétales, à l'intérieur de laquelle existent des régions conservées et des régions variables.
Description
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES D'ACTINOMYCETALES, APPLICATIONS A LA SYNTHESE OU A LA DETECTION D'ACIDES NUCLEIQUES, PRODUITS D'EXPRESSION DE CES SEQUENCES ET APPLICATION EN TANT QUE COMPOSITIONS IMMUNOGENES.
La présente invention est relative à des séquences nucléotidiques d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, à des oligonucleotides compris dans lesdites séquences, à leurs applications en tant qu'amorces pour la synthèse d'ADN d'actinomycétales et en tant que sondes pour la détection d'ADN et/ou des produits de transcription d'actinomycétales, notamment de mycobactéries, aux produits d'expression desdites séquences, à leurs applications et aux anticorps dirigés contre lesdits produits, à un procédé de détection et d'identification des actinomycetales et ses applications, ainsi qu'à des compositions immunogènes comprenant lesdits produits d'expression.
Il est connu que la tuberculose et la lèpre sont des problèmes majeurs de santé publique. Il existe actuellement environ 60.106 individus atteints de tuberculose dans le monde (avec une mortalité annuelle de 3.106), et environ 15.106 individus atteints de lèpre. En France, il apparaît environ 104 nouveaux cas de tuberculose par an. La vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin, une souche atténuée de M. bovis) est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ de 80 % dans les pays occidentaux comme l'Angleterre à 0 % en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à Chingleput). L'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aux antituberculeux usuels et l'existence de mycobactérioses dues à d'autres mycobactéries de plus en plus fréquentes comme M. avium, en particulier chez les personnes présentant une immunodépression (SIDA dans le plus grand nombre de cas), ajoutent à l'urgence de mettre au point
une méthode rapide de détection et d'identification des mycobactéries.
Le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactérioses apparentées est difficile à réaliser ; en effet, les germes responsables de ces maladies sont souvent présents en faible quantité et lorsqu'ils sont en quantité détectable par les méthodes classiquement utilisées, la maladie est déjà en évolution et les malades sont contagieux pour leur entourage. En raison du temps de génération très long de ces bactéries (24 h pour M. tuberculosis comparé à 20 min pour E. coli) , la culture de ces organismes est difficile. Ainsi faut-il 6 à 8 semaines pour identifier les germes et davantage pour obtenir un antibiogramme utilisable pour le traitement adéquat des malades. La nécessité d'un test de détection n'exigeant pas de culture des germes et directement utilisable avec les échantillons pathologiques même lorsque les germes y sont présents à de faibles concentrations, est donc indispensable.
Plusieurs techniques sont actuellement utilisées en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne.
Il faut tout d'abord citer la détection directe des microorganismes au microscope ; cette technique est rapide, mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque de sensibilité dans la mesure où un grand nombre de microorganismes doit être présent dans l'échantillon (> 104/ml) pour permettre une détection fiable (BATES J., CHEST, 1979, 76, (suppl.), 757-763).
Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100 % et permettent l'identification de l'espèce mycobactérienne isolée ; néanmoins, comme précisé ci-dessus, la croissance des mycobactéries in vitro ne peut être réalisée qu'en 3 à 6 semaines et lorsque peu de mycobactéries sont présentes
au site de l'infection, des cultures répétées sont nécessaires pour s'assurer d'un résultat positif (BATES J., 1979 et BATES J. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986,
134, 415-417).
Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles (DANIEL T.M. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1987,
135, 1137-1151).
La présence ou l'absence de mycobactéries peut également être déterminée par hybridation avec de l'ADN ou de l'ARN en utilisant des sondes spécifiques des séquences d'ADN (KIEHN T.E. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1551-1552 ; ROBERTS M.C. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1239-1243 ; DRAKE T.A. et al., J. Clin. Microbiol., 1987, 25, 1442-1445). Cependant, ces méthodes requièrent également la culture des microorganismes.
Certaines séquences d'ADN de différentes mycobactéries et notamment certains gènes codant pour des antigènes mycobactériens ont été décrits. On peut citer notamment la Demande Internationale PCT WO 88/00974, qui a pour Inventeur YOUNG R. et dont le contenu est repris dans un article paru dans Nature, 1985, 316, 450 ; ces publications décrivent les gènes codant pour cinq antigènes de M. leprae immunodominants et en particulier le gène codant pour l'antigène de 65 kDA a été séquence. On peut également citer la Demande Internationale PCT W0 88/05823, qui a pour Co-Inventeurs HUSSON R., YOUNG R. et SHINNICK T. et dont le contenu est repris dans l'article paru dans J. Bact., 1987, 169, 1080-1088 et qui décrit les gènes de M. tuberculosis codant pour des antigènes protéiques et notamment pour l'antigène de 65 kDa. Cette Demande Internationale précise, en particulier, que les antigènes de M. tuberculosis codant pour cinq protéines immunologiquement actives ont été isolés par un criblage
systématique d'une banque d'ADN recombinant exprimée dans un bactériophage lambda gt11, avec une collection d'anticorps monoclonaux dirigés contre les antigènes protéiques de cette bactérie. L'un des antigènes de M. tuberculosis, une protéine 65 kDa présente des déterminants communs à M. tuberculosis et M. leprae.
La Demande Internationale PCT WO 88/06591, qui a notamment pour Co-Inventeur T. SHINNICK, décrit une protéine recombinante de 540 acides aminés (protéine de 65 kDa) ainsi que la séquence d'ADN et les vecteurs d'expression de ladite protéine, ainsi que les applications de ladite protéine recombinée. Cette Demande décrit également des peptides correspondant à des séquences de cette protéine et leurs applications.
Les gènes codant pour les protéines d'autres mycobactéries (M. africanum, M. smegmatis, M. bovis BCG et M. avium) ont également été isolés. On peut citer notamment THOLE et al. (Infect. Immunol., 1987, 55, 1466- 1475), qui ont décrit une protéine de 64 kDa de M. bovis BCG exprimée dans E. coli .
Cependant, les quantités d'ADN mycobactérien présentes dans la plupart des échantillons biologiques sont insuffisantes pour donner un signal positif ; cette technique s'est donc révélée inadaptée à l'identification d'ADN mycobactérien extrait directement d'échantillons biologiques.
Un certain nombre d'études ont également montré une certaine homologie de structure entre les différentes mycobactéries. Cependant, des différences dans la séquence d'ADN de M. tuberculosis et M. bovis ont été décrites dans la région 3' du cadre ouvert de lecture de l'antigène 65 kDa (SHINNICK et al., 1987, THOLE et al., 1987), mais une région homologue n'a pas été observée dans l'ADN de M. leprae (MEHRA et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1986, 83, 7013-7017, également PCT 88/000974).
Il existe également des publications qui décrivent des vaccins contre des mycobactéries, réalisés par génie génétique ; on peut citer en particulier la Demande Internationale PCT WO 88/02027 qui décrit des poxvirus recombinants capables d'exprimer des antigènes mycobacteriens et qui permettent d'obtenir une réponse immunologique protectrice vis-à-vis des mycobactéries.
Les différentes méthodes de détection de l'Art antérieur ne permettent pas d'une part la détection et l'identification rapide d'une infection à actinomycetales directement à partir d'un échantillon biologique et d'autre part l'identification spécifique de groupes, d'espèces ou de souches, même présents en faibles quantités.
Les références complémentaires suivantes constituent également l'état de l'Art préalable à la présente invention.
BAESS I., Acta Path. Microbiol. Scand., 1979, 87, 221-226 ; BEAUCAGE S.L. et al., Tetrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862 ; EISENACH K.D. et al., Am. Rev. Respir. Dis., 1986, 133, 1065-1068 ; GHEORGHIU M. et al., J. Biol. Standardization, 1988, 16, 15-26 ; GLASSROTH J. et al., N. Engl. J. Med., 1980, 302, 1441-1450 ; HAWKINS C.C. et al., Ann. Intern. Med., 1985, 105, 184-188 ; IMAEDA T., Int. J. Systematic Bacteriol., 1985, 35, 147- 150 ; IMAEDA T. et al., Int. J. Systematic Bacteriol., 1988, 38, 151-156 ; KOGAN S.C. et al., N. Engl. J. Med., 1987, 317, 985-990 ; LI H. et al., Nature (Lond.), 1988, 335, 414-417 ; LU M.C. et al., Infect. Imrnun., 1987, 55, 2378-2382 ; MANIATIS T. et al., 1982, Cold Spring Harbor, New York ; McFADDEN J.J. et al., Mol. Microbiol., 1987, 1, 283-291 ; PAO C.C. et al., Tubercle, 1988, 69, 27-36 ; PATEL R., J. Gen. Microbiol., 1986, 132, 541-551 ; SAIKI R.K. et al., Science, 1988, 239, 487-491 ; SANGER F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467 ; SMIDA J. et al., Int. J. Leprosy, 1988, 56, 449-454 ;
THEIN S.L. et al., in Human Genetic Diseases, 1986, IRL Press, 33-50 ; THOLE J.E.R. et al., Infect. Immun., 1985, 50, 800-806 ; WATSON E.A., Canad. J. Pub. Health, 1935, 26, 268-275 ; WOLINSKY E., Am. Rev. Respir. Dis, 1979, 119, 107-159.
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à un procédé de détection et d'identification permettant de détecter de faibles quantités d'ADN extraites de germes eux-mêmes présents en nombre restreint, qui soit rapide et permette l'identification d'une infection à actinomycetales et notamment d'une infection mycobactérienne, d'une infection à Nocardia ou d'une infection à Rhodococcus, directement dans des échantillons pathologiques, sans avoir à réaliser une mise en culture.
La présente invention a pour objet une séquence nucléotidique issue d'actinomycétales, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence homologue d'un gène commun aux actinomycetales choisies dans le groupe qui comprend les mycobactéries, Nocardia et Rhodococcus, à l'intérieur de laquelle existent des régions conservées et des régions variables et en ce qu'elle comprend entre 250 et 500 paires de bases.
On entend par séquence nucléotidique, dans la présente invention, aussi bien une séquence d'ADN double brin, une séquence d'ADN simple brin que les produits de transcription desdites séquences d'ADN.
On entend, au sens de la présente invention, par actinomycetales aussi bien des actinomycétacées telles que Nocardia, que des mycobactériacées ou des Rhodococcus.
Il existe au moins 50 espèces de mycobactéries réparties en plusieurs groupes. Dans la présente invention, on appelle groupe du bacille de la tuberculose, le groupe qui comprend M. bovis BCG, M. bovis, M. tubercul osis, M. africanum et M. microti ; on appelle groupe MAIP,
le groupe qui comprend M. avium, M. intracellulare et M. paratuberculosis .
La comparaison des séquences nucléotidiques des différents groupes et/ou espèces a permis de mettre en évidence des fragments identiques ou similaires à l'intérieur d'un gène commun à ces différents groupes et de définir une homologie entre les différentes séquences.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite séquence présente une homologie d'au moins 80 % avec le gène codant pour l'antigène mycobactérien de 65 kDa.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 383 paires de bases homologues chez au moins 8 espèces de mycobactéries, à savoir : M. tuberculosis, M. avium, M. fort uitum, M. paratuberculosis, BCG, M. kansasii, M. malmoense et M. marinum.
Les 383 paires de bases correspondent au produit d'expression de séquence en acides aminés de formule (I) suivante :
X1-TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-X2-GLU-VAL-ALA- LYS-LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-X3-ASP-X4-THR-THR-THR-ALA- THR-VAL-LEU-X5-GLN-X6-LEU-VAL-X7-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL- ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-X8-LEU-X9-X10-LYS-X11-GLY-ILE-GLU- LYS-ALA-VAL-GLU-X12-VAL-THR-X13-X14-LEU-LEU-X15-X16-ALA- LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-X17-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-X18-
ILE-SER-X19-GLY-ASP-X20-SER-ILE-GLY-X21-X22-ILE-X23-X24-
X25-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-X26-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-X27-X28-
GLU-SER-X29
dans laquelle :
X1 est nul ou représente la séquence ASP-PRO,
X2 représente LYS ou GLU,
X3 représente GLY ou ALA,
X4 représente GLY ou ARG,
X5 représente ALA ou VAL,
X6 représente ALA ou ARG,
X7 représente ARG ou LYS,
X8 représente PRO ou LEU,
X9 représente GLY ou SER,
X10 représente LEU ou PHE,
X11 représente ARG ou CYS,
X12 représente LYS ou ALA,
X13 représente GLU ou ALA,
X14 représente THR ou LYS,
X15 représente LYS ou ASP,
X16 représente SER, GLY, PRO ou THR
X17 représente ASP ou GLU,
X18 représente ALA, GLY ou VAL,
X19 représente ALA ou VAL,
X20 représente GLN ou ALA,
X21 représente ASP ou GLU,
X22 représente LEU ou PRO,
X23 représente ALA ou VAL,
X24 représente GLU ou ASP,
X25 représente ALA ou GLY,
X26 représente ASN ou LYS,
X27 représente VAL ou SER,
X28 représente GLU ou GLY,
X29 est nul ou représente la séquence ASN-THR-PHE-GLY-
LEU-GLN.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 paires de bases, répond à la formule (II) ci-après :
et correspond à un fragment de M. fortuitum, similaire à la séquence du gène mycobactérien codant pour l'antigène de 65 kDa .
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants :
AccII, Ahall, BanI, Banll, BBVI, Bsp1286,
BstXI, CfOI, DDel, EcoRII, Espl, Fnu4HI, Haell, HaelII, HAPII, HgAI, Hinfl, HPHI, MaelII, MboII, Mnll, Narl, Ncol, NlalII, Sacl, SacII, Sau3A, Sau96A, SCFRI, STYI, TAQI, YmAIII.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (III) ci-après :
et correspond à un fragment commun au groupe MAIP, similaire à la séquence du gène mycobactérien codant pour l'antigène de 65 kDa.
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants :
AccII, Afll, Ahall, BanI, BBVI, Bgll, Bsp1286, BstEII, BstXI, CfOI, EAEI, Haell, HaelII, HPHI, MaelII, Mnll, Narl, Pvul, SacII, Sau3A, Sau96A, TAQI.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (IV) ci-après :
Ledit fragment comprend notamment les sites de
restriction suivants :
AccII, Ahall, BanI, BBVI, BstXI, CfOI, EAEI, HaelII, HPHI, MaelII, Mnll, Narl, NrVI, SacII, Sau3A, Sau96A, TAQI.
Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (V) ci-après :
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants :
AccII, Ahall, AluI, AosI, BanI, Bgll, Bsp1286, BstEII, CfOI, EAEI, HAPII, Hgal, HPHI, MboII, Mnll, Nael, NlalII, RsAI, Sau3A, Sau96A, SfanI, STYI, TAQI, TthlIII.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (VI) ci-après :
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants :
AccII, Ahall, AluI, AosI, BanI, BstEII, EaEI, Espl, Fnu4HI, Haell, Hinfl, HPHI, MboII, Mnll, Nael, Sau3A, STYI, TAQI.
Selon encore une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (VII) ci-après :
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants :
AaTI, Aosl, Ahall, AluI, BbVI, BstEII, CfOI, EaEI, Fnu4HI, Haell, HapII, Hinfl, MboII, Mnll, NaeI, Pvul, Sau3A, STYI, TAQI, TthlIII.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ladite séquence comprend 343 nucléotides, répond à la formule (VIII) ci-après :
et correspond à un fragment de Nocardia asteroides, similaire à la séquence du gène mycobactérien codant pour l'antigène de 65 kDa.
Ledit fragment comprend notamment les sites de restriction suivants :
AccII, Ahall, AluI, AosI, BanI, Bspl286, CfOI,
EaEI, Fnu4HI, HaelII, HgAI, HPHI, MaelII, MboII, Mnll, NlalII, SacII, Sau3A, Sau96A, SfanI, STYI, TAQI, TthlIII.
La présente invention a également pour objet des oligonucleotides, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par un fragment d'une séquence nucléotidique conforme à l'invention.
Parmi ces fragments, on peut citer en particulier :
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule suivante (IX) :
5' GAGATCGAGCTGGAGGATCC (IX).
Une telle séquence correspond en particulier à la séquence de bases 397-416 après le codon de début du brin "+" du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose ; cette séquence est ciaprès dénommée -TB-1 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (X) suivante :
5' AGCTGCAGCCCAAAGGTGTT (X) .
Une telle séquence est complémentaire de la séquence de bases 535-554 après le codon de début du brin "+" du gène codant pour l'antigène de 65 kDa du groupe des bacilles de la tuberculose ; cette séquence est ci- après dénommée TB-2 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il
présente la séquence de formule (XI) suivante :
5' GCGGCATCGAAAAGGCCGTG (XI) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-3 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XII) suivante :
5' CGAAATCGCTGCGGTGGCCG (XII) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-4 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XIII) suivante :
5' CTGCCACCGCGGCCATCTCC (XIII) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles du groupe MAIP et est ci-après dénommée TB-5 ; cet oligonucleotide comprend avantageusement un site de restriction unique Bgll ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XIV) suivante :
5' CTGCCACCGCCGGTATCTCC (XIV) laquelle séquence permet de reconnaître M. fortuitum et est ci-après dénommée TB-6 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XV) suivante :
5' AACGTCGCGGCCGGCGCCAA 3' (XV) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-7 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XVI) suivante :
5' GACTCCTCGACGGTGATGAC 3' (XVI) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-8 ;
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XVII) suivante :
5' CCTGCTCAAGGGCGCCAAG 3' (XVII) laquelle séquence est ci-après dénommée TB-9 ; cet oligonucléotide TB-9 comprend avantageusement un site de restriction unique BanI.
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XVIII) suivante :
3' CGAAATCGCTGCGGTGGCCGCAATCTGCTC 5' (XVIII), laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles du groupe de la tuberculose et est ci-après dénommée TB-10.
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XIX) suivante :
5' GGTGCTCGCCCAGGCGTTGGTCCGC 3' (XIX) laquelle séquence permet de reconnaître les bacilles du groupe MAIP et est ci-après dénommée TB-11.
- un oligonucléotide, caractérisé en ce qu'il présente la séquence de formule (XX) suivante :
5' TGTGCTCGCGCAGGCGCTGGTCAAA 3' (XX), laquelle séquence permet de reconnaître spécifiquement M. kansasii et est ci-après dénommée TB-12.
Selon encore un autre mode de réalisation, lesdits oligonucleotides sont obtenus par synthèse, en utilisant notamment un appareil commercialisé par APPLIED BIOSYSTEMS (USA).
La présente invention a également pour objet des paires d'amorces pour la synthèse d'un ADN ou d'un ARN d'actinomycétale, caractérisée en ce que chaque amorce comprend une séquence ou un fragment de séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
De telles amorces permettent la synthèse d'une séquence d'ADN ou d'ARN ou d'un fragment de celle-ci présente dans un gène codant pour un antigène présent dans toutes les actinomycetales et notamment le gène codant pour l'antigène de 65 kDa.
Selon un mode de réalisation desdites paires d'amorces, elles sont avantageusement constituées par un oligonucléotide de formule (IX) (TB-1) apparié à un oligonucléotide de formule (X) (TB-2).
Selon un autre mode de réalisation desdites paires d'amorces, elles sont avantageusement constituées
par un oligonucléotide de formule (XV) (TB-7) apparié à un oligonucléotide de formule (XVI) (TB-8).
Les amorces TB-1 et TB-2 permettent la synthèse d'une séquence d'ADN ou d'ARN présente chez les mycobactéries ou apparentés comme Nocardia ou Rhodococcus.
La présente invention a également pour objet des sondes nucléotidiques, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence nucléotidique ou un fragment de celle-ci telle que définie ci-dessus, éventuellement marquée à l'aide d'un marqueur tel qu'un isotope radioactif, une enzyme appropriée, un fluorochrome, un anticorps ou un analogue de base tel que celui décrit dans le brevet français n° 81 24131.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite sonde est choisie dans le groupe qui comprend les oligonucleotides de formules XI (TB-3), XII (TB-4), XIII (TB-5), XIV (TB-6), XVII (TB-9), XVIII (TB- 10), XIX (TB-11) et XX (TB-12).
La sonde TB-6 permet en particulier de détecter M. fortuitum ; les sondes TB-5 et TB-11 permettent de détecter les mycobactéries du groupe MAIP ; les sondes TB-3, TB-4, TB-9 et TB-10, permettent de détecter les mycobactéries du groupe des bacilles de la tuberculose et la sonde TB-12 permet de détecter M. kansasii .
La présente invention a également pour objet les peptides ou fragments de peptides codés par l'une quelconque des séquences ci-dessus définies. On peut notamment citer :
- un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (II) ci-dessus et répond à la formule (XXI) ci-après :
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS- LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL-
ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU- LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA- LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-GLY- ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU- ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-VAL-GLU- GLU-SER. (XXI)
- un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (III) ci-dessus et répond à la formule (XXII) ci-après :
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS- LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL- ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU- LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-SER-ALA- LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-ASP-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-ALA- ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU- ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-VAL-GLU- GLU-SER. (XXII)
- un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (V) et répond à la formule (XXIII) ci-après :
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-GLU-GLU-VAL-ALA-LYS- LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-LYS-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL- ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU- LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-GLY-ALA- LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-ALA- ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-ASP- GLY-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-SER-GLY- GLU-SER. (XXIII)
- un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (VI) et répond à la formule (XXIV)
ci-après :
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS- LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-ARG-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL-LEU-VAL-GLN-ALA-LEU-VAL-LYS-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL- ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-LEU-LEU-SER-PHE-LYS-CYS-GLY-ILE-GLU- LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS-PRO-ALA- LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-VAL- ILE-SER-VAL-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-LEU-ILE-ALA-GLU- ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-VAL-GLU- GLU-SER. (XXIV)
- un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (VII) et répond à la formule (XXV) ci-après :
ASP-PRO-TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL- ALA-XYS-LΥS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-GLY-ASP-ARG-THR-THR-THR- ALA-THR-VAL-LEU-ALA-GLN-ALA-LEU-VAL-LYS-GLU-GLY-LEU-ARG- ASN-VAL-ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY- ILE-GLU-LYS-ALA-VAL-GLU-LYS-VAL-THR-GLU-THR-LEU-LEU-LYS- SER-ALA-LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR- ALA-ALA-ILE-SER-ALA-GLY-ASP-GLN-SER-ILE-GLY-ASP-PRO-ILE- VAL-GLU-ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-ASN-GLU-GLY-VAL-ILE-THR- VAL-GLU-GLU-SER-ASN-THR-PHE-GLY-LEU-GLN. (XXV)
- un peptide et/ou un fragment de peptide, caractérisé en ce qu'il est codé par la séquence de 343 nucléotides de formule (VIII) et répond à la formule (XXVI) ci-après :
TYR-GLU-LYS-ILE-GLY-ALA-GLU-LEU-VAL-LYS-GLU-VAL-ALA-LYS- LYS-THR-ASP-ASP-VAL-ALA-ALA-ASP-GLY-THR-THR-THR-ALA-THR- VAL-LEU-ALA-GLN-ARG-LEU-VAL-ARG-GLU-GLY-LEU-ARG-ASN-VAL- ALA-ALA-GLY-ALA-ASN-PRO-LEU-GLY-LEU-LYS-ARG-GLY-ILE-GLU- LYS-ALA-VAL-GLU-ALA-VAL-THR-ALA-LYS-LEU-LEU-ASP-THR-ALA- LYS-GLU-VAL-GLU-THR-LYS-GLU-GLN-ILE-ALA-ALA-THR-ALA-GLY- ILE-SER-ALA-GLY-ASP-ALA-SER-ILE-GLY-GLU-LEU-ILE-ALA-GLU- ALA-MET-ASP-LYS-VAL-GLY-LYS-GLU-GLY-VAL-ILE-THR-VAL-GLU- GLU-SER. (XXVI)
La présente invention a également pour objet une composition à pouvoir immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un peptide et/ou un fragment de peptide tel que défini ci-dessus, éventuellement associé à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet des anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par immunisation d'un animal approprié avec un peptide ou un fragment de peptide conforme à l'invention.
De tels anticorps peuvent notamment trouver application pour la mise en évidence de la présence de mycobactéries dans un échantillon approprié obtenu chez un patient à tester, selon un procédé connu de type ELISA ou RIA.
La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification rapide par amplification et hybridation, de faibles quantités d'actinomycétales choisies dans le groupe qui comprend les mycobactéries, Nocardia et Rhodococcus, éventuellement présentes dans un échantillon biologique convenablement traité pour extraire l'ADN et/ou les produits de transcription desdites actinomycetales, lequel procédé est caractérisé en ce que ledit échantillon :
(1) est mis en contact avec une paire d'amorces conforme à l'invention, pour amplifier au moins un fragment dudit ADN ou ARN,
(2) après quoi la séquence d'ADN ou d'ARN amplifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique conforme à l'invention.
Le procédé mis en oeuvre en (1) est notamment l'une des technique d'amplification génétique telles que la méthode dite Qβ réplicase (LIZARDI P.M. et al.,
Biotechnol., 1988, 6) ou la méthode dite P.C.R. (polymerase chain reaction) décrite dans les demandes de
brevets européens n° 200 363, nº 201 184 et nº 229 701 déposées par CETUS CO.
Un tel procédé a l'avantage de permettre de réaliser un test spécifique, direct et rapide, distinguant les différents groupes d'actinomycétales et notamment de mycobactéries en utilisant, d'une part, des amorces non spécifiques qui amplifient un fragment d'ADN ou d'ARN et en utilisant, d'autre part, des sondes spécifiques de groupe ou de genre.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit procédé, il comprend en outre :
(3) le clivage de la sonde éventuellement hybridée au cours de l'étape (2) précédente, par une enzyme de restriction appropriée ;
(4) la détection du fragment de sonde, éventuellement obtenu.
Selon une disposition de ce mode de réalisation, l'enzyme de restriction est avantageusement choisie dans le groupe qui comprend BanI et BglI.
Un tel mode de réalisation a l'avantage de permettre la détection d'un genre ou d'un groupe d'actinomycetales.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé, la détection de la séquence d'ADN ou d'ARN amplifié est réalisée à l'aide de deux sondes nucléotidiques appropriées, ledit procédé comprenant en outre :
(3) le couplage enzymatique des deux sondes hybridées ;
(4) la détection du fragment comportant les deux sondes associées, éventuellement obtenu.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit procédé, l'ADN est isolé de l'échantillon biologique, au cours d'une étape préalable aux étapes de détection et d'identification, par mise en suspension du culot de centrifugation dudit échantillon biologique, dans une solution de lyse appropriée, suivie d'une incu
bation à 95°C environ, pendant un temps convenable, ellemême suivie de l'addition dans le milieu, d'une solution tampon, après quoi l'ADN est extrait par des moyens d'extraction appropriés.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, la solution de lyse mise en oeuvre est une solution de NaOH 0,1N, NaCl 2M, SDS 0,5 %.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'incubation est réalisée à une température de 95ºC environ pendant 15 minutes environ.
La présente invention a, en outre, pour objet un kit, coffret ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'au moins une actinomycétale, notamment d'au moins une mycobactérie, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en oeuvre de ladite détection :
- des doses appropriées d'une paire d'amorces conforme à l'invention ;
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique conforme à l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé, objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Exemple 1 : Dépistage et identification comparée de M. tuberculosis, M. bovis, M. avium et M. fortuitum.
a) Isolement de l'ADN mycobactérien.
On traite les extraits biologiques de manière appropriée, puis on centrifuge. Pour extraire l'ADN, le culot de centrifugation est remis en suspension dans 50 μl de NaOH 0,1 N contenant du NaCl 2 M et du SDS 0,5 %, incubé à 95°C pendant 15 min (agitation douce occasionnelle), puis après l'addition de 0,4 ml de Tris- HCl 0,1 M à pH 7, l'ADN est extrait par trois passages dans un mélange phénol/chloroforme, précipité avec de l'éthanol et dissous dans 50 μl de Tris-HCl 10 mM a pH 8 contenant 0,1 mM d'EDTA.
b) Amplification de l'ADN.
L'amplification est réalisée comme décrit dans SAIKI et al. (Science, 1988, 239, 487-491), ainsi que dans la Demande de Brevet européen nº 200 362 : 0,1 ml d'un mélange réactionnel contenant : 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8, 3), 1,5-2,4 mM de MgCl2, 100 μg/ml de gélatine, 300 μM de déoxyribonucléotides (mélange des 4 déoxyribonucléotides dA, dG, dC et dl), 50 pM des amorces conformes à l'invention dénommées TB-1 et TB-2, deux unités de Taq polymerase et 10-50 μl d'un extrait d'un mélange de cellules humaines et de mycobactéries ou 50 ng d'ADN extrait de mycobactéries est maintenu à 94ºC (1, 5 min), 50°C (2 min) et 72°C (2 min) pendant environ 40 cycles. Après le dernier cycle, les échantillons sont maintenus à 37°C pendant 10 min, puis stockés à 4°C.
c. Analyse des échantillons amplifiés par analyse en Southern blot.
On prélève des aliquots de 10 μl dans les échantillons amplifiés, qui subissent une électrophorèse sur gel d'agarose à 2 %. L'ADN est ensuite transféré sur des filtres en nylon (technique standard : REED K.L. et al., Nucleic Acid Research, 1985, 13, 7207). Les filtres
avec l'ADN sont ensuite lavés dans une solution de 2X SSPE (la solution 20X SSPE correspond à : 3,0 M NaCl, 200 mM NaH2PO4 et 20 mM EDTA) puis traités par un mélange de préhybridation à 63°C dans une solution comprenant du 5X SSPE et du 5X Denhardt (une solution IX Denhardt correspond à : 0,02 % de Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine) pendant 2 heures puis hybride dans la même solution contenant trois sondes conformes à l'invention TB-4, TB-5 et TB-6 marquées à leur extrémité 5' au 32p (2.105 cpm/ml, activité spécifique 1-3 μCi/pmole) pendant une nuit à 63°C. Les blots ou dépôts obtenus sont lavés pendant 2 heures à température ambiante dans une solution 0,1X SSC (IX SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,015 M citrate de Na) contenant du SDS 0,5 %, 2 à 4 minutes à 67-72°C dans une solution de 5X SSPE contenant du SDS 0,5 % et 2 heures à température ambiante dans du SSC 0,1X contenant du SDS 0,5 %. Les dépôts obtenus sont séchés et les hybrides éventuellement présents sont révélés par exposition à un film XAR-5.
En analyse dot-blot, 10 μl d'aliquots d'échantillons amplifiés sont dénaturés par chauffage à 95ºC pendant 2 min dans 0,2 ml de NaOH 0, 4 M contenant 25 mM EDTA. Les échantillons sont refroidis rapidement et chargés dans les puits d'un manifold (BIORAD, (USA)) ou d'un minifold (CERA LABO (France)), ajusté avec une membrane de nylon. Chaque puits est lavé deux fois avec 0,4 ml de SSPE 20X, la membrane est chauffée à 80°C pendant une heure et l'hybridation est réalisée comme décrit ci-dessus. On obtient les résultats tels que visibles dans la figure 1.
La figure 1 montre l'hybridation de l'ADN amplifié de M. bovis (B), M. avium (A) et M. fortuitum (F) avec respectivement les sondes spécifiques TB-4, TB-5 et TB-6.
Exemple 2 : Comparaison des séquences obtenues dans l'exemple 1 avec les séquences d'ADN telles que décrites dans la littérature.
a) Séquençage des séquences mycobactériennes amplifiées obtenues.
L'ADN est extrait avec du phénol, précipité à l'éthanol et redissous dans du Tris-HCl 10 mM (pH 8) contenant 1 mM d'EDTA.
L'ADN est ensuite digéré avec les endonucléases de restriction PstI et BamHl, clone dans les phages M13mp18 et M13mp19 et séquence selon la méthode de SANGER en utilisant de la T7 polymerase ou de la Taq polymerase en présence de d-azaGTP à la place du dGTP.
L'ADN amplifié correspond à la région attendue du gène codant pour l'antigène mycobactérien de 65 kDa comme le montre la figure 2, dans laquelle sont précisées les séquences d'ADN des fragments amplifiés obtenus à partir du gène codant pour l'antigène 65 kDa de M. bovis, M. avium, M. paratuberculosis et M. fortuitum.
La séquence de l'ADN amplifié de M. bovis est identique à la région correspondante de la séquence codant pour l'antigène 65 kDa de M. bovis (THOLE et al. 1987) et M. tuberculosis (SHINNICK et al. 1987).
Les séquences de l'ADN amplifié à partir de M. avium, M. paratuberculosis et M. fortuitum sont très similaires à celles de M. bovis, M. tuberculosis et les produits de traduction déduits correspondant à ces séquences sont également très similaires à l'antigène
65 kDa de M. bovis/M. tuberculosis comme le montre la figure 2.
La figure 3 montre un certain nombre de sites de restriction des fragments de 343 nucléotides compris dans le gène codant pour l'antigène de 65 kDa de M. avi um (figure 3a), M. fortuitum (figure 3b), M. paratuberculosis (figure 3c), M. bovis BCG (figure 3d).
Exemple 3 : Evolution de la sensibilité de la méthode.
La sensibilité de la méthode a été testée en utilisant du BCG dilué dans un milieu biologique, le liquide pleural. Il a été possible de détecter environ 10 bacilles par ml de liquide ; ceci représente une amélioration considérable par rapport aux tests d'examen direct, qui nécessitent 103 à 104 bacilles/ml pour la détection des mycobactéries, et ce, sans identification.
De plus, ce test peut être accompli beaucoup plus rapidement que la détection et l'identification des mycobactéries après enrichissement et culture.
La figure 4 montre les résultats obtenus peur de l'ADN extrait à partir d'échantillons contenant 106 cellules mononucléaires sanguines humaines et 6.105
(colonne 1), 6.104 (colonne 2), 6.103 (colonne 3), 600
(colonne 4), 60 (colonne 5), 6 (colonne 6) bacilles M. bovis, et amplifié en utilisant la Taq polymerase et les amorces oligonucléotidiques TB-1 et TB-2 (figure 4a : gel ; figure 4b : dot blot).
Exemple 4 : Détection de séquences amplifiées du groupe des bacilles de la tuberculose par le test de restriction d'un oligonucléotide.
Pour détecter la présence de séquences amplifiées de mycobactéries appartenant au groupe des bacilles de la tuberculose, par le test de restriction, 4.104 cpm d' oligonucléotide TB-9 marqué au 32P à son extrémité 5' est mélangé avec 2 μl d'un tampon 10X (40 mM Tris HCl pH 7,0, 60 mM MgCl2 et 60 mM de 2-mercaptoéthanol) dans un volume final de 15 μl. 4 μl de produit amplifié est ajouté et le tube est incubé à 95°C pendant 5 minutes, transféré dans de la glace, puis incubé à 52°C pendant 2 heures. 1 μl de BanI (25 unités) est ajouté et les tubes sont incubés à 37°C pendant 1-2 heures. 4 μl de formamide à 95 % contenant du Ficoll à 20 %, 25 mM d'EDTA, 25 μg/ml de bleu de bromophénol et 25 μg/ml de xylène cyanol sont
ajoutés, les tubes sont chauffés à 65ºC pendant 10 minutes et 12 μl sont soumis à une electrophorese sur un gel de polyacrylamide à 30 % (340 V pendant 1-2 heures). Le gel est alors exposé à un film à rayons X pendant 3-18 heures et les échantillons positifs identifiés par la présence d'une bande correspondant au fragment de 11 nucléotides 5' de l'oligonucléotide TB-9, produit par le clivage de TB-9 par l'enzyme de restriction.
Exemple 5 : Synthèse des oligonucléotides conformes à l'invention.
Les oligonucleotides sont synthétisés en utilisant la méthode au phosphoramidite (BEAUCAGE, 1985, cité) avec un synthétiseur d'ADN 380 D (APPLIED BIOSYSTEMS, CA).
On obtient ainsi TB-1, TB-2, TB-3, TB-4, TB-5,
TB-6, TB-7, TB-8, TB-9.
Exemple 6 : Détection de séquences amplifiées du groupe MAIP par le test de restriction d'un oligonucléotide.
Le protocole est identique à celui de l'exemple 4 ; cependant, un certain nombre de réactifs sont différents :
- l'oligonucléotide TB-5 est utilisé ;
- le tampon 10X contient 500 mM de Tris-HCl pH 8,0, 100 mM de MgCl2 et 400 mM de NaCl ;
- l'enzyme de restriction utilisée est Bgll (10 unités).
Comme dans l'exemple 4, les échantillons positifs sont identifiés par la présence d'une bande correspondant à un fragment de 9 nucléotides résultant du clivage de l'oligonucléotide TB-5 par l'enzyme de restriction Bgll.
La figure 5 montre la détection de séquences d'ADN mycobactérien amplifiées par le test de restriction d'oligonucleotides.
L'ADN mycobactérien purifié est amplifié et des quantités équivalentes du produit amplifié à partir de M. avium (colonne 1-5), M. bovis BCG (colonne 6) et M. fortuitum (colonne 7) sont évaluées comme décrit ci- dessus en utilisant l'oligonucléotide TB-5 marqué au 32P et l'enzyme de restriction Bgll. On ajoute une quantité d'enzyme correspondant à une activité enzymatique : de 1 unité (échantillons 1, 6 et 7) ; de 5 unités (échantillon 2) ; de 10 unités (échantillon 3) ; 20 unités (échantillon 4) ; 50 unités (échantillon 5).
L'autoradiogramme est exposé pendant 3 heures avec un seul écran d'intensification. La figure 5 montre bien que seules les colonnes 1-5 permettent de mettre en évidence l'oligomère clivé, permettant donc d'identifier M. avium .
Exemple 7 : Détection d'ADN mycobactérien dans un crachat.
De l'ADN purifié à partir de M. tuberculosis (figure 6, T), de M. avium (figure 6, A), de M. fortuitum (figure 6, F) et de l'ADN extrait d'échantillons de crachats qui ont fourni une culture négative (figure 6, colonne 1-6) ou d'échantillons de crachats qui ont fourni une culture positive pour M. tuberculosis (figure 6, colonnes 7 et 8), a été amplifié à l'aide de la Taq polymerase dans le cas de la PCR ou d'une autre polymerase et des oligonucleotides TB-1 et TB-2. Des échantillons des séquences amplifiées sont fixés sur filtres (dot blots) et hybrides avec les oligonucleotides TB-4, TB-5 et TB-6 marqués à leur extrémité 5' au 32P.
On voit que l'ADN de M. tuberculosis hybride avec TB-4.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent
venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée , de la présente invention.
Claims
(1) est mis en contact avec une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 35 à
37, pour amplifier au moins un fragment dudit ADN ou ARN,
(2) après quoi la séquence d'ADN ou d'ARN amplifiée est détectée par au moins une sonde nucléotidique selon la revendication 38 ou la revendication 39.
49°) Procédé selon la revendication 48, caractérisé en ce qu'il comprend en outre :
(3) le clivage de la sonde éventuellement hybridée au cours de l'étape (2) précédente, par une enzyme de restriction appropriée ;
(4) la détection du fragment de sonde, éventuellement obtenu.
50°) Procédé selon la revendication 49, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction est choisie dans le groupe qui comprend BanI et Bgll.
51°) Procédé selon la revendication 48, caractérisé en ce que la détection de la séquence d'ADN ou d'ARN amplifié est réalisée à l'aide de deux sondes nucléotidiques appropriées, ledit procédé comprenant en outre :
(3) le couplage enzymatique des deux sondes hybridées ;
(4) la détection du fragment comportant les deux sondes associées, éventuellement obtenu.
52°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 48 à 51, caractérisé en ce que l'ADN est isolé de l'échantillon biologique, au cours d'une étape préalable aux étapes de détection et d'identification, par mise en suspension du culot de centrifugation dudit échantillon biologique, dans une solution de lyse appropriée, suivie d'une incubation à 95°C environ, pendant un temps convenable, elle-même suivie de l'addition dans le milieu, d'une solution tampon, après quoi l'ADN est extrait par des moyens d'extraction appropriés.
53°) Procédé selon la revendication 52, caractérisé en ce que la solution de lyse mise en oeuvre est une solution de NaOH 0,1N, NaCl 2M, SDS 0,5 %.
54°) Procédé selon l'une quelconque des revendications 52 et 53, caractérisé en ce que l'incubation est réalisée à une température de 95°C environ pendant 15 minutes environ.
55°) Kit, coffret ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'une quelconque des revendications 48 à 51, caractérisé en ce qu'il comprend outre des quantités utiles de tampons et de réactifs appropriés pour la mise en
oeuvre de ladite détection :
- des doses appropriées d'une paire d'amorces selon l'une quelconque des revendications 35 à 37 ;
- des doses appropriées d'au moins une sonde ou un fragment de sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 38 ou 39.
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