FR2686604A1 - Polypeptides contenant des sequences caracteristiques de pyrrolidone carboxylyl peptidases, polynucleotides contenant une sequence codant pour de tels polypeptides, et leur utilisation. - Google Patents

Abstract

Polypeptides purifiés contenant des séquences caractéristiques communes aux pyrrolidone carboxylyl peptidases (PYRases) de bactéries, par exemple de Streptococcus pyogenes, ou contenant des fragments de ces séquences; anticorps reconnaissant ces polypeptides; polynuléotides codant pour de tels polypeptides ou fragments. Application notamment à la surproduction de PYRases par insertion, dans un vecteur d'un polynucléotide codant pour une PYRase, puis culture d'un cellule-hôte transformée à l'aide d'un tel vecteur, ou à la réalisation de sondes nucléiques spécifiques d'une bactérie ayant un gène, exprimé ou non, de PYRase. Ces sondes nucléiques peuvent être utilisées comme sondes de capture ou de détection, selon les techniques classiques d'hybridation.

Description

La présente invention a pour objet des polypeptides contenant des séquences caractéristiques de pyrrolidone carboxylyl peptidases, des polynucléotides contenant une séquence codant pour de tels polypeptides, et leur utilisation, notamment à des fins diagnostiques.

Les Pyrrolidone Carboxylyl Peptidases sont des exopeptidases qui enlèvent spécifiquement les résidus acide-2-pyrrolidone-5-carboxylique (PCA) de l'extrémité
NH2-terminale des chaînes polypeptidiques et des protéines (Doolittle et Armentrout,
Biochemistry, 1968, 7, 516-521). Ces enzymes sont également appelées pyrrolidonyl peptidases (Szewczuk et Mulczyk, Eur. J. Biochem, 1969, 8, 63-67) ou plus conmunément
PYRases (Mitchell et al., Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1987, 6, 283-286). Ces enzymes sont spécifiques des isomères optiques L-PCA-L-acide aminé (Uliana et Doolittle, Arch. Biochem.

Biophys., 1969, 131, 561-656) et la vitesse d'hydrolyse dépend de l'acide aminé adjacent au résidu PCA (fi;ujiwara et al., Biochim. Biophys. Acta, 1979, 570, 140-148). Ces enzymes appartiennent également au groupe des arylamidases puisqu'elles sont capables d'hydrolyser la liaison peptidique du substrat chromogène synthétique L-pyroglutamyl-ss-naphtylamide (Patterson et al., J. Biol. Chem., 1963, 238, 3611-3620). Ces enzymes ont tout d'abord été décrites chez les bactéries (Mulczyk et Szewczuk, J. Gen. Microb., 1970, 61, 9-13) mais on les trouve également présentes dans des tissus animaux, végétaux et chez l'homme (Szewczuk et
Kwiatkowska, Eur. J. Biochem., 1970, 15, 92-96).Les PYRases s'avèrent en outre être un moyen spécifique pour enlever les résidus pCA bloquant l'extrémité NH2-terminale des peptides et très utiles pour la détermination de la séquence d'acides aminés des protéines, puisque les peptides ne possédant pas de groupement A-NH2 libre ne peuvent étre séquencés selon la méthode usuelle de dégradation d'Edman. Les propriétés biochimiques et physicochimiques des PYRases sont assez bien connues, puisque cela fait plus d'une vingtaine d'années qu'on les étudie. Des enzymes ayant une activité PYRase ont été isolées et partiellement purifiées à partir de plusieurs microorganismes, notamment de bactéries telles que pseudomonas fluorescens (Armentrout et Doolittle, Arch. Biochem. Biophys., 1969, 132, 80-90 ; Doolittle, Meth. Enzymql. 1970, 19, 555-569), Bacillus subtilis (Szewczuk et Mulczyk,
Eur. J.Biochem., 1969, 8, 63-67), Bacillus amyloliquefaciens CIsuru et al., J. Biochem, 1978, 84, 467-476), Kiebsiella cloacae Kwiatkowska et al., J. Biol. Chem., 1974, 249, 7729-7736) et
Enterococcus faecium (Sullivan et al., Aust. J. Biol. Sci., 1977, 30, 543-552). Les méthodes de purification conventionnelles n'ont jusqu'à présent pas permis de purifier les Pyrrolidones
Carboxylyl Peptidases jusqu'à homogénéité à partir de ces divers organismes. Leur séquençage peptidique n'a par conséquent pas pu être effectué. On constate par ailleurs que les masses moléculaires des PYRases sont très variables selon les microorganismes dont elles sont issues .A titre d'exemple, on peut citer la PYRase d'Enterococcus faecium, qui présente une masse moléculaire d'environ 42 kDa, alors que la PYRase de Bacillus amyloliquefaciens présente une masse moléculaire d'environ 24 1:Da.

Ces enzymes, outre leur activité connue de peptidase, constituent un critère majeur pour la différenciation des entérobactéries (Mutczyk et Szewczuk, J. Gen. Microbiol., 1970, 61, 9-13), des staphylocoques (Mulczyk et Szewczuk, J. Gen. MicrobioL, 1970, 70, 383-384 ainsi qu'un élément important de présomption des streptocoques du groupe A et des entérocoques (Ellner et al. J. Clin. Microbiol., 1985, 22, 880-881).

En étudiant la génétique de ces enzymes la demanderesse a découvert, de façon surprenante, que les séquences nucléotidiques codant pour les PYRases sont très différentes pour chacune des espèces de microorganisme étudié, et qu'en outre, les gènes codant pour des
PYRases provenant d'organismes microbiens distincts, bien qu'ayant des séquences nucléotidiques très divergentes, codent en fait pour des protéines séquences peptidiques très convergentes.

On observe en effet une homologie importante entre les séquences peptidiques de
PYRases extraites par exemple de Streptococcus pyogenes et de Bacillus subtilis. Cette découverte présente un double intérêt. D'une part, l'obtention d'anticorps spécifiques dirigés contre les séquences peptidiques fortement homologues des PYRases fournit des réactifs capables de détecter toutes espèces microbiennes capables de synthétiser une PYRase. D'autre part, des sondes nucléiques comprenant des fragments du gène codant pour la PYRase d'une espèce microbienne particulière constituent des réactifs spécifiques de I'espèce considérée.

Les séquences peptidiques fortement conservées présentes dans les PYRases de diverses espèces microbiennes sont celles qui correspondent notamment aux peptides de formules I à III données ci-après. La présente invention a donc pour objet un polypeptide purifié contenant au moins une séquence peptidique d'au moins six acides aminés choisie dans la séquence peptidique représentée à la figure 3, 5 ou 6, ou par le fait qu'il présente au moins 40 % d'homologie avec la séquence peptidique représentée à la figure 3, 5 ou 6.

L'invention concerne notamment un polypeptide purifié tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il présente au moins 20 % d'identité avec la séquence peptidique représentée à la figure 3, 5 ou 6.

L'invention concerne en particulier un polypeptide tel que défini ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il contient au moins une séquence peptidique d'au moins six acides aminés choisie parmi les séquences suivantes: Glu-Arg-Val-Ala-Ile-Asn-X-X-Asp-Ala-Arg-Ile-Pro-Asp-Asn-X-Gly-X- Gln-Pro
Ile-Asp (I);
Gly-X-X-Ala-X- Val-Ser-X-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn-X-X-X
Tyr (II);
Leu-X-Thr-Gly-Phe-X-Pro-Phe (III); dans lesquelles X est un acide aminé.

Les valeurs de X dans les peptides I, II et III, respectivement, sont notamment données ci-après pour Z1, Z2, Z3, Z4 et en particulier celles qui sont aisément repérables sur la
Figure 9.

L'invention concerne notamment un polypeptide contenant une séquence peptidique d'au moins six acides aminés choisie parmi les suivantes:
Gly-Zl-Zl-Ala-X-Val-Ser-Z2-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn-Z4-Zl -Zl-Tyr (lita) ,et
Leu-Z1-Thr-Gly-Phe-Z3-Pro-Phe (IIIa), dans lesquelles:
Z1, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Phe, ou
Met; Z2, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Gly, Ser, Thr, Tyr, Gys, Asn, ou Glu ;
Z3, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, GIn, Ala,
Asp, ou Glu; et
Z4, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Lys,
Arg, ou His.

Les polypeptides de l'invention peuvent posséder un nombre quelconque d'acides aminés, supérieur ou égal à 6. Les polypeptides de l'invention sont notamment les polypeptides ayant les formules I à III, en particulier les polypeptides ayant les formules Ia à ma, ainsi que les protéines ou polypeptides purifiés contenant au moins la séquence peptidique représenteée à la figure 3, 5 ou 6. L'invention concerne en particulier un polypeptide ayant au moins 40 % d'homologie avec le polypeptide représenté à la figure 3, 5 ou 6, ainsi qu'un polypeptide ayant au moins 20% d'identité, et notamment au moins 30% d'identité, avec l'un des polypeptides des figures 3, 5 et 6.

L'invention s'étend également à des conjugués peptide-protéine, dans lesquels un polypeptide tel que défini ci-dessus est lié à une protéine antigénique, soit directement par une liaison peptidique, soit par l'intermédiaire d'un bras espaceur. Le couplage à l'aide d'un bras espaceur est réalisé selon les méthodes connues. De tels conjugués peuuvent être utilisés dans la préparation d'anticorps spécifiques dirigés contre un polypeptide ou une protéine contenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences polypeptidiques définies ci-dessus, y compris celles de formules I à III (ou Ila et IIIa).

Par administration de tels conjuqués à un hôte (mamifère ou oiseau) il est possible d'obtenir des anticorps polyclonaux capables de reconnaître des séquences peptidiques définies ci-dessus, choisies par exemple parmi celles de formules I à III, et de préparer également selon les méthodes connues des anticorps monoclonaux spécifiques de ces séquences peptidiques.

De tels anticorps, qui font également partie de l'invention, permettent notamment de détecter les protéines bactériennes ayant une activité de PYRase. Pour cette détection, on utilise les anticorps selon les techniques classiques des essais immunologiques. En particulier, en utilisant deux anticorps monoclonaux reconnaissant chacun un peptide différent choisi notamment dans les séquences peptidiques de formules I à m, il est possible d'effectuer un test immunologique de détection d'une protéine ayant une activité PYRase selon la technique sandwich en une seule étape.

L'invention a encore pour objet un polynucléotide (fragment d'acide nucléique) purifié codant pour un polypeptide tel que défini ci-dessus, y compris un polynucléotide codant pour un fragment peptidique choisi dans la séquence des peptides de formules I à III (notamment Ia à IIIa), ainsi qu'un polynucléotide codant pour un fragment d'au moins 6 acides aminés choisi dans la séquence peptidique de la figure 3, 5 ou 6. L'invention concerne aussi un fragment d'un polynucléotide purifié, tel que défini ci-dessus, ce fragment ayant au moins 10 nucléotides. L'invention s'étend en outre aux polynucléotides ou fragments complémentaires des polynucléotides ou fragments qui viennent d'être obtenus.

L'invention concerne en particulier un tel polynucléotide, choisi parmi les séquences nucléotidiques, représentées aux figures 3, 5 et 6, codant respectivement pour la PYRase de
S.pyogenes, de B.subtilis et de S.fluorescens.

L'invention s'étend à tous gènes, natifs ou recombinants, codant pour une enzyme possédant une activité PYRase dont l'homologie protéique est d'au moins 40 % et/ou l'identité d'au moins 20% avec la PYRase de S.pyogenes, de S.fluorescens ou de B.subtilis.

L'invention a également pour objet un vecteur recombinant de clonage ou d'expression contenant un polynucléotide tel que défini ci-dessus, et une cellule vivante transformée contenant ledit vecteur recombinant, en particulier une cellule pouvant être cultivée in vitro, par exemple une cellule bactérienne.

La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'un fragment d'acide nucléique (polynucléotide) codant pour une enzyme à activité pyrrolidone carboxylyl peptidase possédant l'une au moins des séquences peptidiques I à III (ou lla et IIIa), pour la surproduction de cette enzyme selon les techniques génétiques, à l'aide de tout vecteur d'expression recombinant approprié, notamment un plasmide, inséré dans une cellule-hôte, par culture de la cellule-hôte ainsi transformée, ou encore pour toute construction génétique, telle que la construction d'un gène "reporter", dans quelque vecteur de clonage que ce soit, en utilisant au moins une partie du fragment d'acide nucléique codant pour cette enzyme.

L'invention concerne également une sonde nucléique ADN ou ARN caractérisée par le fait qu'elle contient une séquence d'au moins 10 nucléotides (ou d'au moins 12 ou d'au moins 15 nucléotides) appartenant à un polynucléotide selon l'invention, tel qu'il vient d'étre défini, ou une séquence complémentaire de ladite séquence. On peut citer en particulier les oligonucléotides mentionnés dans la partie expérimentale ci-après.De telles sondes peuvent être utilisées comme sondes de capture (par exemple fixées sur un support solide de façon connue, notamment par adsorption ou par covalence, ou à l'aide d'un agent de couplage), ou peuvent cotre liées à un marqueur (ou agent traceur), de façon connue, pour constituer une sonde de détection, selon les techniques classiques d'hybridation. En particulier, les sondes contenant des séquences nucléotidiques choisies parmi celles représentées aux figures 3, 5 et 6 constituent des sondes de détection spécifiques de S.pyogenes, de B.subtilis et de
S fluorescens, respectivement.

Ces sondes nucléiques sont utilisées, de façon connue, dans la détection, l'identification ou l'épidémiologie bactérienne.

L'invention a également pour objet une méthode de détection d'un gène codant pour une pyrrolidone carboxylyl peptidase dans un microorganisme, à l'aide d'au moins une sonde nucléique telle que définie précédemment. Une telle méthode peut être mise en oeuvre selon les techniques classiques, par exemple par hybridation sandwich. Une sonde nucléique fixée sur un support peut être utilisée comme sonde de capture, et une sonde marquée peut être utilisée comme conde de détection.

Comme indiqué ci-dessus, le clonage d'un gène pcp codant pour une PYRase présente donc notamment l'intérêt de permettre toute forme de surproduction de cette enzyme, et l'exportation dans le milieu de culture de ladite enzyme à laquelle, par exemple, une séquence signal Propice à l'excrétion protéique a été greffée par génie génétique, de façon connue. Le recours à la production d'enzymes clonées permet ainsi de diminuer de manière très importante les coûts d'exploitation des procédés de purification de l'enzyme d'intérêt
L'invention permet donc de cloner et de séquencer des gènes pcp de divers organismes bactériens, notamment afin de pouvoir surproduitre une PYRase.On peut par exemple réaliser ce clonage sur les organismes pour lesquels la demanderesse a mis en évidence une activité
PYRase, à savoir:
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans, Enterococcus avium,
Enterococcus gallinarum, Enterococcus malodoratus, Enterococcus suis, Enterococcus sp.,
Lactococcus lactis, Lactococcus sp., Streptococcus equisimilis, Streptococcus sanguis,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus porcins, Streptococcus salivarius, Streptococcus ubens, Streptococcus acidominimus, Streptococcus bovis,
Streptococcus sp., Aerococcus viridans, Aerococcus sp., Micrococcus kristinae, Micrococcus luteus, Micrococcus lylae, Micrococcus varians, Micrococcus sp., Stomatococcus mucilaginosus, Stomatococcus sp., Gemella haemolysans, Gemella morbillorum, Gemella sp.,
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas sp., Citrobacter freundii, Citrobacter sp.,
Enterobacter cloacae, Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter liquefaciens, Enterobacter sp., Klebsiella aerogenes, Kiebsiella pneumoniae, Kiebsiella edwardsii, Klebsiella ozaenae, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella oxytoca, Kiebsiella cloacae, Klebsiella sp., Serratia marcescens, Serratia grimesii, Serratia sp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus capitis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus gallinarum,
Staphylococcus epidermis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus lentus, Ståphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus warnen,
Staphylococcus xylosus Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus simulans,
Staphylococcus intermedius, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus caprae,
Staphylococcus carnosus , Staphylococcus cohnii, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus sp., Neisseria mucosa, Neisseria sp., Bacillus megatenm, Bacillus subtilis, Bacillus cereus,
Bacillus sp., Corynebacterium aquaticum, Corynebacterium bovis, Corynebacterium groupe
A, Corynebacterium groupe ANF, Corynebacterium groupe B, Corynebacterium groupe G1,
Corynebacterium groupe G2, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium kutscken,
Corynebacterium minutissimum, Corynebacterium pseudodiphteriticum, Corynebacterium striatum, Corynebacterium xernsis, Actinomyces pyogènes, Arcanobacterium haemolyticum,
Brevibacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Gardnerella vaginalis, Oerskovia spp.,
Rhodococcus equi.

On donne ci-après quelques définitions de termes utilisés dans la présente demande:
PYRase a pour signification une protéine native ou recombinante possédant une activité Pyrrolidone Carboxylyl Peptidase qui est exprimée avant ou après modifications post-traductionnelles ; Gène(s) pcp signifie gène natif ou recombinant codant pour la
Pyrrolidone Carboxylyl Peptidase (PYRase) provenant d'organismes bactériens;
Gène "reporter" correspond à une unité codante dont le produit d'expression est
facilement dosable ou délectable.L'expression d'un gène reporter permet notamment d'étudier
la fonction ou le contenu d'une ": séquence nucléique placée dans un vecteur d'expression en
amont de celui-ci, par exemple ceux d'un promoteur ou opérateur;
Séquence consensus correspond à la séquence idéale dans laquelle chaque position
représente la base la plus souvent rencontrée lors de la comparaison de plusieurs séquences;
Les bases soulignées sont les bases qui correspondent aux consensus;
Promoteur canonique désigne la séquence consensus du promoteur;
Les transcripts sont les produits de la transcription de l'ADN;
Fragment d'acide nucléique signifie fragment d'ADN ou d'ARN;
Homologie se rapporte aux acides aminés homologues, c'est-à-dire des acides
aminés qui ont les mémes caractéristiques chimiques telles que polarité et/ou hydrophobicité
et/ou basicité et/ou acidité et/ou neutralité.On considère également qu'un acide aminé est
homologue à un autre si leurs codons respectifs pour l'acide aminé ne différent que par une
base, dite dégénérée;
Identité fait référence à des acides aminés strictement identiques;
Cosmides fait référence à des plasmides dans lesquelles les sites Cos du phage lambda ont été insérés ; 1'ADN plasmidique résultant peut étre encapsidé in vitro dans des particules de phage;
Plasmide signifie ADN circulaire extra-chromosomique capable de se répliquer de façon autonome;Phagemide signifie plasmide dans lequel une origine de réplication d'un phage a été insérée; 1'ADN résultant peut étre encapsidé in vivo dans des particules phagiques;
Résultats d'inclusivité a pour signification l'ensemble des souches bactériennes conduisant à l'obtention d'un produit d'amplification par PCR à l'aide des oligonucléotides utilisés, ou d'un signal d'hybridation avec la sonde pcp de S.pyogenes;
Résultats d'exclusivité signifie l'ensemble des souches bactériennes ne consuidant pas à l'obtention d'un produit d'amplification par PCR à l'aide des oligonucléotides utilisés, ou d'un signal d'hydridation avec la sonde pcp de S.pyrogenes.

Selon l'invention, les vecteurs de clonage peuvent étre des plasmides tels que: pBR322, pUC18/pUC19, pUCl18/pUCl19, pSP64/pSP65, pGEM-3/pGEM-4, pGEM-37, AN 3, pBluescript M13 ou analogues. Les vecteurs de clonage selon la présente invention peuvent aussi étre choisis parmi les cosmides tels que pJB8, c2RB, pCoslEMbl, pHC79, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, pWEl5, Charomid9 ou analogues. Les vecteurs de clonage de la présente invention peuvent encore étre des vecteurs d'expression procaryotes, tels que des vecteurs d'expression de bactéries, ou des vecteurs d'expression de levures, ou des vecteurs d'expression d'eucaryotes, tels que des vecteurs d'expression de mammifères. Les cellules hôtes peuvent étre des cellules eucaryotes ou procaryotes.De préférence, les cellules hôtes sont des cellules procaryotes; telles que des bactéries. Avantageusement on choisit des cellules hôtes bactériennes qui n'expriment pas l'activité PYRase, telles que des cellules de E. coli, mais on peut aussi utiliser des cellules hôtes bactériennes possédant à l'origine une activité
PYRase, après avoir réalisé une mutagenèse ayant pour conséquence la disparition de 1' activité PYRase chez ces bactéries. Il est ainsi possible de cloner la PYRase de Pseudomonas fluorescens dans un mutant de cette bactérie dépourvu d'activité PYRase. De préférence, selon l'invention, on utilise E. coli comme cellule hôte.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faisant référence aux figures annexées, dans lesquelles la figure 1 illustre schématiquement les principales étapes de sous-clonage du gène pcp de Streptococcus pyogènes. Dans cette figure, les cartes de restriction partielle du plasmide pPC10 et de ses dérivés sont représentées. La flèche indique la localisation et le sens de transcription du gène pcp, déterminé par l'expression des produits du fragment Bgl II-Hpa I de 1,6 kb de pPC20 dans le système spécifique promoteur/polymérase du phage T7. Les symboles + signifient la présence d'activité PYRase et les symboles - l'absence d'activité;
La figure 2 illustre schématiquement l'approche expérimentale utilisée pour le séquençage, l'hybridation et l'analyse des transcrits du gène pcp.Chaque flèche située au dessous de la carte de restriction indique le sens et la longueur d'une détermination continue de séquence pour l'obtention de la séquence nucléotidique complète du fragment d'ADN Hpa
I-Spe I de pPC36 telle que représentée à la figure 1. La phase ouverte de lecture identifiée et la sonde ADN de pcp synthétisée par Réaction de polymérisation en Chaîne avec les oligonucléotides YR2 (a) et YU5 (b) sont respectivement représentées par la zone hachurée et les traits en caractères gras. La localisation de l'oligonucléotide YM1 (c) utilisé pour l'expérience d'extension d'amorce et de la sonde ADN pour la cartographie à la nucléase S1 est représentée plus en détails à la figure 3;
La figure 3 représente la séquence nucléotidique du gène pcp de Streptococcus pyogènes et de ses régions flanquantes.Les nucléotides sont numérotés depuis l'extrémité 5' du brin antisens (non transcrit). La séquence d'acides aminés déduite est indiquée au-dessus de la séquence d'ADN par le code à trois lettres. Les codons d'initiation et de terminaison de transcription sont encadrés. Les sites de restriction d'intérêt et les oligonucléotides mentionnés dans le texte sont représentés. Les régions -10 et -35 des deux promoteurs (Pa et Pb), ainsi que le site présumé de fixation des ribosomes (SD) sont surlignés. Les séquences répétées inversées sont matérialisées par des flèches convergentes et la structure tige-boucle correspondant au terminateur de transcription proposée est surlignée en caractères gras. +1 indique les extrémités 5' (démarrage) de 1' ARNm déterminées par les expériences d'extension d'amorce.Les extrémités 3' (arrêt) détectés par cartographie à la nucléase SI sont représentés par des astérisques en-dessous de la séquence;
La figure 4 représente l'analyse par électrophorèse sur gel de saccharose et hybridation selon la méthode de Southern du génome de Streptococcus pyogènes, d'Enteroccus faecalis et de Bacillus subtilis. A correspond à la séparation électrophorétique des fragments d'ADN sur gel d'agarose 0,7 %. Le plasmide pPC20 tel que représenté à la figure 1 est digéré par les endonucléases de restriction Bgl II et Hpa I (piste 1). L'ADN génomique (approximativement 50 Rglpiste) de S. pyogènes a été digéré par Hpa I (piste 2) et
Bgl II (piste 3). L'ADN de E. faecalis (piste 4) et de B. subtilis (piste 5) sont respectivement digérés par Hind III et Rsa I. L'échelle de poids moléculaire (M) est constituée par le Raoul II (Appligene) (marque de commerce). B correspond à l'autoradiographie du transfert de
Southern hybridé avec la sonde du gène pcp synthétisée par PCR comme représenté à la figure 2. Le signal du fragment de restriction à 1,6 kb (piste 1) constitue le témoin d'homologie stricte avec la sonde en conditions d'hybridation drastiques. Un signal d'hybridation est observé dans le seul cas de S. pyogènes;
La figure 5 représente la séquence nucléotidique de la partie codante du gène pcp de
Bacillus subtilis. Les nucléotides sont numérotés depuis l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' du
brin antisens (non transcrit).La séquence d'acides aminés déduite de la séquence nucléique est
indiquée au-dessous de la séquence d'ADN;
La figure 6 représente la séquence nucléotidique de la partie codante du gène pcp de Pseudomonas fluorescens. Les nucléotides sont numérotés depuis l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' du brin antisens (non transcrit). La séquence peptidique est indiquée au dessous de la séquence d'ADN selon le code à trois lettres;
La figure 7 correspond à une analyse comparée de l'homologie des gènes pcp de
Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis et Pseudomonas fluorescens (figure 7B) et des protéines correspondantes (figure 7A) par l'établissement de matrices de comparaison. La numérotation indique respectivement les résidus nucléotidiques ou acides aminés.Les données ont été établies par le logiciel d'analyse de séquence MacVector (IBI) (marque de commerce) à l'aide des paramètres suivants : (1) comparaison nucléique : fenêtre d'analyse = 30 résidus, score minimum d'homologie = 65%, valeur de rejet = 6 résidus. (2) comparaison protéique : fenêtre d'analyse = 8 résidus, score minimum d'homologie =50il, valeur de rejet = 2 résidus;
La figure 8 représente la comparaison des séquences d'acides aminés des protéines codées par le gène pcp de Streptococcus pyogenes (séquence inférieure) et celui de Bacillus subtilis (séquence supérieure).Dans cette figure, les acides aminés sont indiqués par le code à trois lettres et les symboles d'alignement suivants sont utilisés : (I) correspond à des acides aminés identiques, (:) correspond à des acides aminés fortement homologues, (.) correspond à des acides aminés présentant une faible homologie, les acides aminés n'étant pas relies par un
symbole correspondant aux acides aminés hétérologues. Les discontinuités de séquence imposées par l'alignement optimal sont représentés par des tirets (-);
La figure 9 représente l'alignement optimal des séquences d'acides aminés des protéines codées par les gènes pcp de Streptococcus pyogenes (séquence supérieure), Pseudomonas fluorescens (séquence médiane) et Bacillus subtilis (séquence inférieure).Dans cette figure, les acides aminés sont indiqués par le code à trois lettres et les symboles et la numérotation correspond aux résidus acides aminés de la protéine de Streptocccus pyogenes. Dans cette figure, les acides aminés sont indiqués par le code à trois lettres et les motifs peptidiques conservés sont encadrés (grisés). Le consensus commun aux trois séquences peptidiques est indiqué en caractère gras au dessous des régions conservées, la lettre "X" signifiant l'absence d'identité des acides aminés. Les discontinuités de séquence imposées pour la réalisation de l'alignement optimal sont représentés par des tirets (-); et
La figure 10 représente une analyse des produits d'expression de l'ADN codant pour
l'activité PYRase par le système promoteur/polymérase du phage T7.

A représente la séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide dénaturant des protéines synthétisées in vivo par E.col K38/pGP1-2 possédant le plasmide pT7-5 (piste 1), pPC39 (piste 2), pT7-6 (piste 3) et pPC 40(piste 4). La coloration des protéines est réalisée par le bleu de Coomassie; la flèche indique le produit d'expression d'environ 25 kDa par rapport aux marqueurs de poids moléculaire (M) (Bethesda Research Laboratories) (marque de commerce). B représente I'autoradiographie correspondante du gel. Le marquage exclusif de la protéine d'intérêt surexprimée de pPC39 confirme le sens de transcription du gène pcp représenté à la figure 1.

A moins qu'elles ne soient spécifiées, toutes les méthodes relatives aux expériences qui sont présentées ci-après ont été réalisées selon Sambrook et al. (Molecular cloning. A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).

Exemple 1 : clonage du gène pcp codant pour la PYRase de Streptococcus pyogenes
Une banque de gènes de la souche Streptococcus pyogenes D471 (groupe A de
Lancefield, protéine M de type 6) (Scott et Fischetti, Science, 1983, 221, 758-760), qui possède une activité PYRase, a été construite dans la souche Escherîchia coli C600NR (ici857) (Scott et Fischetti, Science, 1983, 221, 758-760). L'ADN chromosomique de S.

pyogenes, extrait selon la méthode de Chassy (Biochem. Biophys. Res. Comm., 1976, 68, 603-608) a été partiellement digéré par l'enzyme de restriction Mbo I afin d'obtenir une série aléatoire de fragments allant de 30 à 50 kilobases (kb). Ceux-ci ont été insérés dans le cosmide pJB8 (Ish-Horowicz et Burke, Nucl. Acids Res., 1981, 9, 2989-2998), linéarisé par digestion totale à l'aide de l'endonucléase Bam HI. Ces vecteurs recombinants ont été introduits in vitro à l'intérieur de capsides du phage X (Hohn and Collins, Gene, 1980, 11, 291-298) à l'aide d'un kit Gigapack plus (Stratagene, marque de commerce).Les phages résultants ont été utilisés pour transduire la souche C600NR et les colonies bactériennes possédant la resistance à l'ampicilline conférée par le cosmide ont été sélectionnées à 30"C.

Ces colonies bactériennes ont été criblées in situ sur milieu gélosé à l'aide du test de la pyrrolidone carboxylyl peptidase (Mulczyk et Szewczuk, J. Gen. Microb., 1970, 61, 9-13).

L'extraction des plasmides recombinants à partir des clones d'Escherichia coli possédant une activité PYRase a permis d'isoler le plasmide pPC10 comme représenté à la figure 1, contenant un fragment de 5 kb d'ADN chromosomique de S. pyogenes. L'introduction de pPC10 dans des bactéries E. coli JM83 (Yannish-Perron et al., Gene, 1985, 33, 103-109) a conduit à l'obtention de transformants possédant systématiquement une activité PYRase, confirmant que le segment d'ADN isolé code effectivement pour cette enzyme (Cleuziat et ai., Mol. Microbiol., 1992, 6, 2051-2063).

Exemple 2 : sous-clonage du gène pcp codant pour la PYRase de Streptococcus pyogenes
Différentes endonucléases Ont été utilisées pour établir une carte de restriction du fragment d'ADN d'intérêt contenu dans pPC10 (fig. 1). Ceci a permis de localiser plus précisément la région d'ADN codant pour la PYRase. Les princiales étapes de ce sousclonage sont résumées dans la figure 1. L'isolement et l'insertion du fragment Eco Rl-Ava I de pPC10 dans les sites Eco RI-Sal I du vecteur pBluescript KS (marque du commerce,
Stratagene), conduisant au plasmide pPC20, permet la détection de l'activité PYRase chez la souche E coli NM522 (Gough and Murray, J. Mol. Biol., 1983, 166, 1-19) transformée par ce plasmide.Conformément au schéma de la figure 1, on a préparé et étudié successivement les plasmides pPC20.01, pPC20.02, pPC20.03, pPC30 et pPC36. La plus petite région d'ADN conférant une activité PYRase consiste en un fragment de restriction Spe I-Hpa I de 1,3 kb (pPC36) dont la carte de restriction est détaillée dans la figure 2.

Exemple 3 : séquençage du fragment de restriction Spe I - Hpa I de pPC36
La séquence nucléotidique complète des deux brins complémentaires du fragment
Spe I - Hpa I du plasmide pPC36 a été déterminée par la méthode de termination de chaîne (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467) selon la stratégie décrite à la figure 2, sur des matrices d'ADN double brin. Cette séquence, décrite dans la figure 3, révèle la présence d'une phase ouverte de lecture unique de 645 nucléotides. Cette phase ouverte, dont le départ se situe au codon d'initiation ATG en position 285 et se terminant au codon stop TAA localisé à la position 930, code pour une protéine de 23135 Da composée de 215 acides aminés et possédant un point isolélectrique statistique de 7,3.

Exemple 4 : analyse de la séquence nucléotidique
Ce gène codant pour la Pyrrolidone Carboxylyl Peptidase a été nommé pcp. Il est précédé par un site de fixation des ribosomes (AAAGGA) dont la localisation et la séquence sont comparables à celles décrites chez d'autres organismes Gram-positifs (Moran et aL, Mol.

Gen. Genet, 1982, 186, 339-386). Deux promoteurs (Pa et Pb) précédant la phase codante de pcp (fig. 3) ont été identifiés (Cleuziat, Thèse Doctorat es Sciences : Institut National des
Sciences Appliquées de Lyon, 1992, 157 p).

Exemple 5: analyse des transcrits ARN
La réalisation d'expériences d'extension d'amorce a permis de localiser l'extrémité 5' du transcrit de pcp, correspondant au site de démarrage de transcription de ce gène chez la souche recombinante E. coli NM522/pPC30. Dans ce but, l'ARN total de cette bactérie a été extrait selon une méthode décrite par Shimotsu et al. (J. BacterioL, 1986, 166, 466-471).

L'oligonucléotide YM 1 (SdAATAGC rTCGCCGCCAAAGGGATCAAAGCC3), complémentaire aux nucleotides 303 à 332 (fig. 3), a été marqué à son extrémité 5' avec du [y-32P]-ATP (6000
Ci/mmol) par la T4 polynucleotide kinase et hybridé dans des conditions drastiques avec 1'ARN total. Son extension par la transcriptase inverse (fig. 2) a permis de mettre en évidence deux ADNc différant l'un de l'autre par un seul nucléotide et correspondant à un démarrage de transcription situé sur le G en position 257 ou le T en position 258 (fig. 3). La première position s'avère davantage en accord avec le fait que la transcription démarre généralement sur une base purique (A,G) et occasionnellement sur une base pyrimidique (C,T) (Rosenberg et Court, Ann. Rev. Genet., 1979, 13, 319-353).

Deux séquences répétées inversées ont été identifiées sur la séquence nucléotidique (fig.3). La plus courte, située à l'intérieur de la région riche en AIT et recouvrant partiellement les séquences promotrices, constitue un site de fixation potentiel d'une protéine régulatrice (Gicquel-Sanzey et Cossart, EMBO J., 1982, 1, 591-595). La plus longue, située 25 bases en aval du codon stop TGA de pcp, est impliquée dans la terminaison de la transcription de pcp (Rosenberg et Court, Ann. Rev. Genet., 1979, 13, 319-353). La détermination de l'extrémité 3' du transcrit de pcp par la technique de cartographie à la nucléase S1 a permis d'identifier la structure tige-boucle responsable de la terminaison de transcription à l'intérieur de cette séquence répétée inversée.Un fragment de restriction Afi III-Ssp I du plasmide pPC36 (fig. 2) a été marqué à son extrémité 3' à l'aide de [a-32PJ- dCTP (3000 Ci/mmol) par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I d'Escherichia coli.

Cette sonde de 353 nucléotides, recouvrant la région codante sur une zone de 21 bases (fig. 3) a été hybridée à l'ARN total extrait de la bactérie E. coli recombinante obtenue par transformation à l'aide du plasmide pPC30. L'ensemble a ensuite été soumis à l'action de la nucléase S1 selon des conditions définies (Brakhage et al., Biochimie, 1990, 72, 725-734) afin de digérer tout fragment d'ADN monocaténaire n'étant pas protégé par hybridation à l'ARNm. La détermination de la taille des fragments obtenus consécutivement dans ces conditions a permis de démontrer que la transcription s'arrête entre les nucléotides 981 à 986 inclus de la séquence nucléotidique (fig. 3).

Exemple 6 : Détermination du nombre de copies du gène pcp au sein du génome de
Streptococcus pyogenes
Les expériences d'hybridation selon la méthode de Southern ont montré que Ie génome de S. pyogenes ne comprend qu'une seule copie du gène pcp. Pour ce faire, 1'ADN de cet organisme, extrait selon la méthode de Chassy (Biophys. Res. Comm., 1976, 68, 603-608), a été digéré par les endonucléases de restriction Hpa I et Bgl II, ne coupant pas le gène pcp, et soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Le transfert du matériel génétique a été réalisé par capillarité sur membrane de nylon avant d'être hybridé avec une sonde ADN double brin, synthétisée par Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR), comprenant la majeure partie de la région codante du gène pcp. La PCR a été réalisée comme décrit par Saiki et al.

(Science, 1988, 239, 487-491) sur une matrice d'ADN plasmidique double brin (pPC30) à l'aide d'Amp[iTaq (Perkin Elmer Cetus, marque de commerce), en utilisant les oligonucléotides YR2 (5dACAGGCTTTGATCCCTTTGG3 ) et YU5 correspondant aux positions 300 à 319 et complémentaire à 759 à 778 de la séquence, respectivement (fig. 3). Ce fragment de 479 paires de bases a été purifié sur gel d'agarose et marqué radioactivement avec du [a- 32P]-dCTP (3000 Ci/mmol), à l'aide du kit "random priming" (Boehringer, marque de commerce). Les conditions d'hybridation et de lavage, dites drastiques, ont été réalisées de façon connue, afin de ne permettre une hybridation de la sonde de pcp que sur une cible d'ADN parfaitement homologue.Dans ce but, un témoin a été constitué par la double digestion du plasmide pPC20 par les endonucléases Hpa I et Bgl 11. La figure 4 montre qu'un signal d'hybidation positif a été obtenu pour le fragment de 1,6 kb contenant le gène pcp, tandis que le fragment de 4 kb correspondant au vecteur de clonage et aux régions d'ADN de
S. pyogènes encadrant pcp n'ont révélé aucun signal. La présence d'un signal d'hybridation unique dans le cas de chaque digestion d'ADN confirme que pcp est un gène à copie unique dans le génome de S. pyogenes. La taille des bandes observées (6,8 kb et 4,1 kb) est en parfait accord avec la carte de restriction de la région d'ADN codant pour la PYRase.

Le gène pcp n'a révélé aucune homologie avec les séquences nucléotidiques et protéiques présentes dans les banques de données (Genbank, version N"68 du 15 juin 1991).

Exemple 7 : analyse et comparaison de gènes pcp provenant de différentes espèces bactériennes
Le travail effectué sur le gène pcp de Streptococcus pyogenes a été transposé à d'autres organismes bactériens possédant une activité PYRase.

A partir d'une banque de gènes de Bacillus subtilis construite chez Escherichia coli dans le plasmide pMK4 (Débarbouillé et ai., FEMS Microbiol. Lett. 1987, 41, 137-140), le clonage et la caractérisation moléculaire du gène pcp de Bacillus subtilis ont été réalisés selon les techniques décrites ci-dessus pour S. pyogenes. La séquence de la partie codante de ce gène ainsi que celle de la protéine pour laquelle il code sont indiquées dans la figure 5. Le gène pcp de B. subtilis possède une longueur de 645 nucléotides et code pour une protéine de 215 acides aminés de poids moléculaire théorique égal à 23777 Da (Awadé et al., FEBS Lett., 1992, 305, 67-73).

Aucune homologie de séquence nucléotidique ou protéique n'a pu être déterminée par comparaison avec les banques de données de séquences existantes. De même, il existe très peu d'homologie entre le gène pcp de S. pyogenes et celui de B. subtiles, bien que ces gènes soient tous deux composés d'exactement 645 nucléotides. La figure7 montre qu'en dépit d'une absence totale d'homologie sur le plan nucléotidique (B), les protéines correspondantes sont extrèmement conservées (A). La structure primaire des PYRases de S. pyogenes et de B.

subtilis ont été comparée (fig. 8) - l'alignement de ces deux protéines est basé sur le programme "BestFit" (Université de Wisconsin) utilisant l'algorithme de Devereux et al.

(Nucl. Acid Res., 1984, 12, 387-395). Les deux protéines contiennent le même nombre d'acides aminés (215 résidus). Leurs séquences totales possèdent une identité de 47,5% et une homologie supérieure à 66 %, indiquant un très fort taux de conservation de ces protéines.

Certaines zones peuvent avoir jusqu'à 80% d'identité et une homologie supérieure à 87%, comme c'est le cas pour le motif de 41 acides aminés Gln-Pro-Asp-Ala-Val-Leu-Cys-Ile-Gly- Gln-Ala-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Leu-Thr-Pro-Glu-Arg-Val-Ala-Ile-Asn-Gln-Asp-Asp-Ala-
Arg-Ile-Pro-Asp-Asn-Glu-Gly-Asn-Gln-Pro-Ile-Asp (résidus 59 à 99 inclus) de la PYRase de
S. pyogenes.Les régions situées aux environs des résidus cystéines (S. pyogenes Cys 65, Cys 141 et Cys 156) sont également très conservées, notamment les motifs Gly-Leu-Pro-Ala-Ser Val-S er-Asn-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn-His-Leu-Met-Tyr (résidus 129 à 146 inclus) (75% d'identité, 85% d'homologie) et Cys-Pro-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Phe-Met-His-fle-Pro-
Phe-Met (résidus 156 à 169 inclus) (42in d'identité et 93% d'homologie). D'autres régions plus courtes possèdent de fortes homologies : les fragments de Il acides aminés Lys-Ile-Leu
Val-Thr-Gly-Phe-Asp-Pro-Phe-Gly et Glu-Val-Pro-Thr-Val-Phe (résidus 2 à 12 inclus) (72% d'identité, 100% d'homologie) et de 6 acides aminés (résidus 39 à 44 inclus) (66% d'identité,
100% d'homologie).

D'autre part, suite à la construction d'une banque de gènes de la souche Pseudomonas fluorescens A32 (Gügi et al., J. Bacteriol., 1991, 173, 3814-3820) chez l'hôte Escherichia coli DH5cc dans le plasmide pUCl9, le clonage et la caractérisation moléculaire du gène pcp de
Pseudomonas fluorescens ont également été réalisés selon les techniques décrites ci-dessus pour S. pyogenes. La séquence de la partie codante de ce gène ainsi que celle de la protéine pour laquelle il code sont indiquées dans la figure 6. Le gène pcp de Pseudomonas fluorescens possède une longueur de 639 nucléotides et code pour une protéine de 213 acides
aminés de 22436 Da.

Aucune homologie de séquence nucléotidique ou protéique nta pu être déterminée par comparaison avec les banques de données de séquences existantes. De même, il existe très peu d'homologie entre le gène pcp de Pseudomonasfluorescens et ceux de S. pyogenes et B.

subtilis, bien que ces gènes soient composés d'un nombre de nucléotides presque identiques.

La figure 7 montre qu'en dépit d'une absence totale d'homologie sur le plan nucléotidique (B),
les protéines correspondantes sont extrèmement homologues (A). La PYRase de
P. fluorescens possède globalement 47% d'identité et 66% d'homologie avec celle de
B. subtilis et 39% d'identité et 62% dthomologie avec celle de S. pyogenes. La structure des
PYRases bactériennes apparait donc très conservée sur le plan peptidique, bien que les
séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides correspondant soient très divergentes.

La détermination de l'alignement optimal à l'aide du programme précédemment cité à partir des trois PYRases caractérisées permet de dégager les motifs peptidiques majeurs de ces enzymes (figure 9). Trois motifs hautement conservés, inclus dans ceux précédemment déterminés entre B. subtilis et S. pyogenes (fig. 8), apparaissent clairement (fig. 9), dont on peut déduire le consensus d'identité (caractère gras). Par rapport à la numérotation de la
PYRase de S. pyogenes, il s'agit des motifs Leu-Val-Thr-Gly-Phe-Asp-Pro-Phe (résidus 4 à
11 inclus) (75% d'identité et 100% d'homologie), Glu-Arg-Val-Ala-Ile-Asn-Gln-Asp-Asp
Ala-ArgIle-Pro-Asp-Asn-Glu-Gly-Asn-Gln-Pro-Ile-Asp (résidus 78 à 99 inclus) (82% d'identité et 86% d'homologie), Val-Ser-Asn-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn (résidus 132 à 142 inclus) (91% d'identité et 100% d'homologie). Ce motif, le plus fortement conservé de tous, contient le résidu cystéine commun aux trois PYRases (Streptococcus pyogenes Cys
141). Il est vraisemblablement celui impliqué dans le site catalytique de cette famille d'enzymes.

Exemple 8 : détection de la pyrrolidone carboxylyl peptidase par anticorps
Des anticorps polyclonaux spécifiquement dirigés contre l'un des peptides Gln-Pro Asp-Ala-Val-Leu-Cys-Ile-Gly-Gln-Ala-Gly-Gly-Arg-Thr-Gly-Leu-Thr-Pro-Glu-Arg-Val- AIa-Ile-Asn-Gln-Asp-Asp-Ala-Arg-Ile-Pro-Asp-Asn-Glu-Gly-Asn-Gln-Pro-Ile-Asp, Gly Leu-Pro-Ala-Ser-Val-Ser-Asn-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn-His-Leu-Met-Tyr, Cys Pro-Asn-Ala-Lys-Ala-Gly-Phe-Met-His-Ile-Pro-Phe-Met, Lys-Ile-Leu-Val-Thr-Gly-Phe-Asp
Pro-Phe-Gly et Glu-Val-Pro-Thr-Val-Phe précédemment décrits dans l'exemple 7 ont été réalisés.Pour ce faire, ces peptides, préalablement synthétisés et purifiés, ont été séparément greffés à Ia protéine KLH (molécule immunogène de haut poids moléculaire) : 5 mg de protéine et 5 mg de peptide sont mis en présence dans un volume de 2 ml de tampon phosphate 50 mM pH 7,5 et le couplage est réalisé par adjonction de 1 ml de gIutaraldéhyde 20 mM. Les conjugués obtenus ont été dialysés pendant une nuit contre du tampon PBS. Des lapins ont ensuite été immunisés par injection intramusculaire de 1 ml de la solution obtenue précédemment, ajoutée à 1 ml d'adjuvant de Freund complet. Un rappeI a été effectué un mois après l'injection initiale, et un volume de sang de 20 ml a été prélevé une semaine après ce dernier.Après coagulation, la fraction sérique est filtrée et les immunoglobulines sont purifiés sur colonne d'affinité Sépharose-protéine A (Pharmacia, marque de commerce) selon le protocole recommandé par le fournisseur. La spécificité des anticorps obtenus a été testée par les méthodes de détection immunologique classiques (ELISA). Pour ce faire, chaque peptide précédemment décrit, la molécule immunogène KLH et l'Albumine de Sérum Bovin (BSA) ont été individuellement adsorbés sur les puits de plaques de microtitration (Nunc, marque de commerce). La mise en présence de chaque catégorie d'anticorps polyclonaux purifié et la détection de ces derniers par des anticorps de chèvre anti-lapin couplés à la péroxydase (Sigma, marque de commerce) a montré que les anticorps obtenus reconnaissent spécifiquement et uniquement les peptides avec lesquels l'immunisation a été effectuée.

Aucune réaction croisée n'a été observée entre, d'une part, chaque catégorie d'anticorps, et d'autre part, les autres peptides par le biais desquels ils n'ont pas été obtenus. Les anticorps obtenus ont également permis la détection de la pyrrolidone carboxylyl peptidase chez Streptococcles pyogenes, Bacillus subtilis ainsi que d'autres bactéries présentant une telle activité enzymatique. Cette enzyme étant localisée dans le compartiment intracellulaire, sa détection chez les microorganismes impliquait au préalable la lyse des cellules par des moyens physiques ou chimiques. Dans ce cas, celle-ci a été réalisée par désintégration des membranes cellulaires sous l'action des ultrasons (sonication).La reprise et le lavage du sonicat dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,5 a permis de déterminer la présence de l'enzyme par la méthode immunologique décrite précédemment. Aucune réaction positive n'a pu être observée à partir d'organismes ne présentant pas d'activité enzymatique, confirmant la spécificité des anticorps purifiés. Ces résultats confirment donc la conservation et la spécificité des motifs peptidiques étudiés au sein des pyrrolidone carboxylyl peptidases (PYRases) issues de microorganismes.

Exemple 9 : détection de Streptococcus pyogenes (streptocoques ss-hémolytiques du groupe A)
La détection de Streptococcus pyogenes est d'une très grande importance en bactériologie clinique puisque cet organisme est à l'origine de pathologies nombreuses et vanées,chez l'homme. Les streptocoque B-hémolytique du groupe A, qui correspondent à l'espèce Streptococcus pyogenesr peuvent être responsable de nombreuses affections telles que pharyngites, angines, sinusites, ostéomyélites, cellulites et affections cutanées diverses, endocardites, méningites... Ils sont surtout connus pour être responsables de la scarlatine dont les deux principales manifestations secondaires sont le rhumatisme articulaire aigu (RAA) et la glomérulonéphrite aiguë (GNA) (Delmas et Freney, Lyon Pharmaceutique, 1989, 40, 353369).Certaines de ces pathologies peuvent être létales (Bartter et al., Arch. Intern. Med., 1987, 148, 1421-1424).

Actuellement, l'identification des streptocoques du groupe A en microbiologie médicale implique l'étude de l'hémolyse sur gélose au sang, la recherche d'un antigène du groupe A de
Lancefield ou de caractères physiologiques et biochimiques (gaIerie d'identification API 20
STREP, commercialisée par la socité bioMérieux). La nécessité d'identifier rapidement les streptocoques responsables d'infections aiguës a entraîné le développement de techniques d'agglutination (Malbrunot et al., Pathologie Biologie, 1990, 35, 665-668) permettant la reconnaissance directe des antigènes du groupe A (Slidex-strepto kit, BioMérieux) à partir des colonies de primoculture. Ces méthodes peuvent néanmoins imposer des étapes d'enrichissement et d'isolement nécessitant parfois jusqu'à 48 heures et présentent des limites sur le plan de la sensibilité.

L'emploi de sondes ADN diminue le temps nécessaire à l'établissement du diagnostic par la détection directe et sensible de germes à partir des prélèvements biologiques. En effet, des sondes ADN peuvent être utilisées pour la détection d'organismes particuliers dans des échantillons biologiques comme décrit dans le brevet US N 4 358 535 au nom de Falkow et al. Des sondes des sreptocoques du groupe A ont déjà été proposées, telles que des oligonucléotides du gène de la protéine M de type 1 de Streptococcus pyogenes (Podbielski et al., Med. Microbiol. Immunol. 1990, 179, 255-262) ou le gène de l'exotoxine de type A (Yu et Ferretti, Infect. Immun., 1989, 57, 3715-3719). Ces sondes sont cependant spécifiques de cibles qui définissent plusieurs sous-groupes à l'intérieur des Streptocoques du groupe A, et ne permettent donc pas de détecter ltensemble de l'espèce; il n'existe donc pas à ce jour de sonde ADN pour la détection de Streptococcus pyogenes.

La faisabilité et la spécificité de détection ou d'identification des streptocoques du groupe A a été démontrée ci-après à l'aide d'un protocole expérimental faisant appel à la PCR ou à l'hybridation de Southern.

a) étude par PCR
Différents couples d'amorces couvrant la région du gène pcp ont été testés quant à la spécificité d'obtention d'un fragment amplifié à partir d'ADN génomique de diverses bactéries. Ces couples de primers sont représentés dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1: Couples d'oligonucléotides utilisés en PCR
Couple a Nom Position b Taille du produitc
1:ACAGGCTTTGATCCCTTTGG YR2 300-319
2: TTCTGGCGTTAGTCCAGTCC YU3 499-518 219
1: ACAGGCTTTGATCCC'ITTGG YR2 300-319
2: TATCAGGAATGCGAGCATCG YU8 539-558 259
1: ACAGCCTTTGATCCC'ITTG G YR2 300-319
2: TGCATAAACCCAGCTTTGGC YU5 759-778 479
1:TTGCCAGCAACCATTCATGG YR4 360-379
2: AGAAACAGAAGCAGGAAGCC YU9 664-683 324
1:TTGCCAGCAACCATTCATGG YR4 360-379
2: TGCATAAACCCAGCTTTGGC YU5 759-778 419
1:AAAATCTGCCGATGTGCTCC YR5 419-438
2: AGAAACAGAAGCAGGAAGCC YU9 664-683 265
1:AAAATCTGCCGATGTGCTCC YR5 419438
2: TGCATAAACCCAGCTTTGGC YU5 759-778 360
1: CTTTGTATTGGGCAAGCTGG YR6 474493
2:AGAAACAGAAGCAGGAAGCC Yu9 664-683 210
1:CTTTGTATTGGGCAAGCTGG YR6 474-493
2: TACTGGCAACTATACCCGC YU4 1075-1094 621
1:TGCTCGCATTCCTGATAACG YR7 542-561
2: TGCATAAACCCAGCTTTGGC YU5 759-778 237
1: TGcTCGCATTCCTGATAACG YR7 542-561
2:TACTGGCAAACTATACCCGC YU4 1075-1094 553
1:ATCAAAGCGATGGTTGCTGC YR8 630-649
2: TACTGGCAAACTATACCCGC YU4 1075-1094 465
1:ATCAAAGCGATGGTTGCTGC YR8 630-649
2: CCCTATCTCAATGCTTAACG Yul 1297-1316 687
1:TCAAAAATCTGCCGATGTGC YF1 416-435
2: AGGAAGCCCAGCCTGATGAA YF2 652-671 256 a 1: oligonucléoude sens (correspondanL à la séquence); 2: oligonucleotide antisens (inverse et compl émentaire de la séquence).La séquence nucléotidique esl indiquée de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3'
b la numérotation correspond à celle de la séquence décrite dans la figure 3.

c la taille du produit d'amplification est indiquée en paires de bases.

Les bactéries étudiées (souches de collections internationales et souches d'origine clinique). Elles ont été isolées et cultivées sur milieu gélosé approprié.

Une ampoule de 5 ml de bouillon coeur-cervelle est ensemencé par un clône bactérien issu d'une culture de 12 heures sur milieu gélosé et incubée à 37"C dans les conditions propres à chaque organisme. La concentration des bactéries en phase exponentielle de croissance est déterminée par mesure de la Densité Optique à 590 nm et un volume correspondant à une quantité de 108 bactéries (environ 100 1) est centrifugé pendant 5 minutes à 14000 tours par minute dans un microtube stérile. Le culot bactérien est lavé par 200 I de sérum physiologique (NaCl 0,9%), centrifugé de nouveau et resuspendu dans 100 1 de tampon
Tween 20 (0,45 % dans H20 distillée stérile).L'échantillon est alors chauffé à 100eC pendant 5 minutes) afin de Iyser les bactéries puis refroidi sur glace ou congelé pour une utilisation ultérieure. 10 1 de lysat bactérien, équivalant à l'ADN issu d'environ 107 bactéries, sont utilisés par essai de PCR.

La composition du mélange réactionnel utilisé pour la PCR est strictement celle décrite par Saiki et al. (Science, 1988, 239, 487-491). La réaction a été réalisée à l'aide d'AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus, marque de commerce) sur un appareil Thermal Reactor (Hybaid, marque de commerce), selon le cycle de température suivant:
(92"C, 5 min.)
[(60 C, 30 sec.), (75"C, 30 sec.), (95"C, 15 sec.)] 40 fois
(60"C, 30 sec.)
(75"C, 10 min.)
1/10 eme du produit d'amplification (10 1) est analysé par électrophorèse en gel d'agarose 2% par rapport à des marqueurs de poids moléculaire.

Aucune différence n'a pu êrre observée quant à la spécificité des couples d'oligonucléotides utilisés pour l'amplification d'un fragment d'ADN à partir du génome bactérien : les résultats de spécificité obtenus pour chaque souche bactérienne étudiée furent les mêmes quels que soient les couples utilisés.

Les résultats quantitatifs varient néanmoins légèrement selon les couples étudiés. Le couple d'oligonucléotides YF1-YF2 est celui ayant permis l'obtention des meilleurs rendements d'amplification. Ces oligonucléotides s'avèrent particulièrement intéressants sur le plan de la sensibilité de détection des microorganismes par les techniques d'hybridation moléculaire. Les résultats qualitatifs décrits pour YF1-YF2 dans les tableaux 2 et 3 ci-après, regroupant respectivement les espèces bactériennes ayant ou n'ayant pas donné de signal positif d'amplification, sont totalement transposables aux autres couples d'oligonucléotides.

Tableau 2: Résultats d'inclusivité * Résultats d'hybridation obtenus à l'aide de la sonde ADN double brin correspondant à la phase codante du gènepcp de Streptococcus pyogenes ** Résultats d'amplification par PCR à l'aide du couple d'amorces YFl-YF2 *** Résultats d'activité enzymatique (phosphatase alcaline) suite à la capture et à la détection des produits d'amplification

<tb> Collection <SEP> I.R.A.<SEP> Collection <SEP> Espéce <SEP> bactérienne <SEP> Activité <SEP> Hybridation <SEP> Amplification <SEP> Détection
<tb> <SEP> internationale <SEP> PY <SEP> Rase <SEP> sonde <SEP> pcp* <SEP> PCR <SEP> ** <SEP> VIDAS <SEP> ***
<tb> <SEP> JRS4 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> M6 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 2306
<tb> <SEP> 77-01-085 <SEP> NCTC <SEP> 8191 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> A <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 693
<tb> <SEP> 84-05-026 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> A <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 519
<tb> <SEP> 7701083 <SEP> NCTC <SEP> 10879 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 981
<tb> <SEP> 89-11-070 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 704
<tb> <SEP> 89-11-071 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 3153
<tb> <SEP> 83-02-114 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> A <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 5707
<tb> <SEP> 89-11-070 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> A <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 6287
<tb> <SEP> 78-06-155 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 2682
<tb> <SEP> 89-11-071 <SEP> ATCC <SEP> 12202 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 1929
<tb> <SEP> 77-01-028 <SEP> ATCC <SEP> 12203 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 2013
<tb> <SEP> 77-01-029 <SEP> NCTC <SEP> 10085 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 2527
<tb> <SEP> 77-01-030 <SEP> NCTC <SEP> 10085 <SEP> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 1991
<tb>
Tableau 3:Résultats d'exclusivité * Résultats d'hybridation obtenus à l'aide de la sonde ADN double bnn correspondant à la phase codant du gènepcp de Streptococcus pyogenes ** Résultats d'amplification par PCR à l'aide du couple d'amorces YF1-YF2 *** Résultats d'activité enzymatique (phosphatase alcaline) suite à la capture et à la détection des produits d'amplification

<tb> Collection <SEP> L.R.A.<SEP> Collection <SEP> Espéce <SEP> baceterienne <SEP> Activité <SEP> Hybridation <SEP> Amplification <SEP> Détection
<tb> <SEP> Internationale <SEP> PY <SEP> Rase <SEP> sonde <SEP> pcp* <SEP> PCR <SEP> ** <SEP> VIDAS <SEP> ***
<tb> <SEP> CG110 <SEP> Entenococcus <SEP> faecalis <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb> <SEP> 83-10-064 <SEP> Entenococcus <SEP> faecalis <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb> <SEP> 89-10-032 <SEP> Entenococcus <SEP> faecium <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 4
<tb> <SEP> 84-07-114 <SEP> Entenococcus <SEP> durans <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> <SEP> 89-10-033 <SEP> Entenococcus <SEP> avium <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> <SEP> 87-12-068 <SEP> Entenococcus <SEP> gallinarum <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> <SEP> 84-10-087 <SEP> Entenococcus <SEP> malodoratus <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> 89-09-060 <SEP> Enterococcus <SEP> suis <SEP> I <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6 <SEP>
<tb> <SEP> 90-02-014 <SEP> Streptococcus <SEP> uberis <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> <SEP> 86-03-031 <SEP> Streptococcus <SEP> equisimilis <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb> <SEP> 76-11-006 <SEP> ATCC <SEP> 35666 <SEP> Streptococcus <SEP> equisimilis <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb> <SEP> 89-04-053 <SEP> ATCC <SEP> 12401 <SEP> Streptococcus <SEP> agalactiae <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> 78-11-148 <SEP> NCTC <SEP> 10234 <SEP> Streptococcus <SEP> suis <SEP> II <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> <SEP> 80-02-036 <SEP> NCTC <SEP> 7864 <SEP> Streptococcus <SEP> sanguis <SEP> II <SEP> + <SEP> - <SEP> <SEP> S <SEP>
<tb> <SEP> 77-01-036 <SEP> NCTC <SEP> 6177 <SEP> Streptococcus <SEP> zooepidemicus <SEP> - <SEP> <SEP> - <SEP> - <SEP> s <SEP>
<tb> <SEP> 84-11-031 <SEP> Streptococcus <SEP> salivarius <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb> <SEP> 85-10-113 <SEP> Streptocuccus <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> 78-04-060 <SEP> NCTC <SEP> 7465 <SEP> T <SEP> Streptococcus <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb> <SEP> 89-04-053 <SEP> Streptococcus <SEP> groupe <SEP> B <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> <SEP> 77-01-032 <SEP> NCTC <SEP> 9829 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> B <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 5
<tb> <SEP> 77-09-006 <SEP> NCTC <SEP> 10228 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> E <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> <SEP> 86-12-029 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> G <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb> 77-01-039 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> G <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> 77-01-038 <SEP> NCTC <SEP> 9603 <SEP> Streptocoque <SEP> groupe <SEP> G <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> Aerococcus <SEP> viridans <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb> <SEP> 89-10-001 <SEP> Aerococcus <SEP> viridans <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 11
<tb> <SEP> 78-11-159 <SEP> Aerococcus <SEP> viridans <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> 75-15-060 <SEP> ATCC <SEP> 25571 <SEP> Micrococcus <SEP> kristine <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> <SEP> 89-08-091 <SEP> Lactococus <SEP> lactis <SEP> ssp. <SEP> cremoris <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 12
<tb> <SEP> 89-09-022 <SEP> Lactococcus <SEP> lactis <SEP> ssp. <SEP> lactis <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> <SEP> 89-06-176 <SEP> Stomatococcus <SEP> mucilaginosus <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> <SEP> 89-01-032 <SEP> Listeria <SEP> sp.<SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 15
<tb> <SEP> C304 <SEP> Corynebacterium <SEP> glutamicum <SEP> - <SEP> - <SEP>
<tb> <SEP> 89-04-074 <SEP> Pseudomonas <SEP> fluorescens <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> <SEP> 89-06-024 <SEP> Pseudomonas <SEP> fluorescens <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> <SEP> 89-06-025 <SEP> Pseudomonas <SEP> fluorescens <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb>

<tb> 88-06-067 <SEP> Shigella <SEP> sp.<SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> <SEP> P4X <SEP> Escherichia <SEP> coli <SEP> K-12 <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> 83-09-123 <SEP> Escherichia <SEP> vulneris <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 73-08-010 <SEP> ATCC <SEP> 8090 <SEP> Citrobacter <SEP> freundii <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 4
<tb> 76-03-117 <SEP> Citrobacter <SEP> freundii <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> 73-08-013 <SEP> ATCC <SEP> 13047 <SEP> Enterobacter <SEP> cloacae <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> 75-08-036 <SEP> ATCC <SEP> 13048 <SEP> Enterobacter <SEP> aerogenes <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> 89-09-015 <SEP> Enterobacter <SEP> aerogenes <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> 81-09-011 <SEP> ATCC <SEP> 33072 <SEP> Enterobacter <SEP> amnigenus <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> 85-05-027 <SEP> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> 75-01-109 <SEP> Klebsiella <SEP> oxytoca <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 75-09-007 <SEP> ATCC <SEP> 810 <SEP> Serratia <SEP> marcesens <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 85-01-018 <SEP> ATCC <SEP> 29909 <SEP> Serratia <SEP> grimesii <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 75-09-008 <SEP> ATCC <SEP> 25923 <SEP> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb> 87-12-083 <SEP> ATCC <SEP> 43809 <SEP> Staphylococcus <SEP> lugdunensis <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 7
<tb> 75-15-313 <SEP> ATCC <SEP> 27848 <SEP> Staphylococcus <SEP> simulans <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> 82-02-100 <SEP> ATCC <SEP> 29663 <SEP> Staphylococcus <SEP> intermedius <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 9
<tb> 75-15-306 <SEP> ATCC <SEP> 29970 <SEP> Staphylococcus <SEP> haemolyticus <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 90-04-012 <SEP> ATCC <SEP> 13102 <SEP> Neisseria <SEP> meningitidis <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> 76-11-014 <SEP> Neisseria <SEP> mucosa <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 86-06-009 <SEP> ATCC <SEP> 19695 <SEP> Neisseria <SEP> mucosa <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 10
<tb> 87-12-074 <SEP> Bacillus <SEP> megaterium <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 8
<tb> 78-02-084 <SEP> NCTC <SEP> 10400 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 6
<tb> 78-02-085 <SEP> NCTC <SEP> 10320 <SEP> Bacillus <SEP> cereus <SEP> + <SEP> - <SEP> - <SEP> 15
<tb>
Les tableaux 2 et 3 donnant respectivement les résultats d'inclusivité et d'exclusivité montrent que les oligonucléotides proposés détectent systématiquement et exclusivement les streptocoques du groupe A (Streptococcus pyogenes).La diversité et la localisation des oligonucléotides sur la partie codante du gène et sur ses régions flanquantes prouvent que la région du gène pcp est une région du génome très spécifique de cette espèce bactérienne et donc propice au développement de sondes ADN pour sa détection dans les échantillons biologiques.

Ces tableaux mettent en évidence que la présence d'un signal d'hybridation est indépendante de celle d'un phénotype PYRase, puisque des bactéries autres que S. pyogenes possédant cette activité n'interfèrent pas lors de la détection de ce germe.

Le produit d'amplification de 256 paires de bases obtenu à l'aide du couple d'oligonucléotides YFl-YF2 peut être révélé de manière extrêmement rapide et sensible par un système automatisé de détection non radioactive basé sur l'hybridation en sandwich (Dunn et Hassel, Cell, 1977, 12, 23-36). Ce système utilise deux oligonucléotides non chevauchants qui correspondent au même brin d'ADN du fragment amplifié; le premier, fixé sur une phase solide, est une sonde de capture du produit d'amplification et le second, lié à la phosphatase alcaline, sert de sonde de détection (Jablonski et al., Nucl. Acids Res., 1986, 14, 6115-6128).

Après dénaturation, hybridation et lavage, la détection est réalisée par fluorescence à l'aide du substrat umbelliferyl phosphate. Les tableaux 2 et 3 présentent les résultats de mesure d'activité enzymatique relative obtenus à l'aide du couple d'oligonucléotides YF3 (5dCAGClTAltITlTCAACClTCCC3) et YF4 (5dCAAAGCGATGGlTG-CTGCCA3) correspondant aux positions 607 à 628 et 632 à 651 de la séquence de pcp (fig. 3) utilisés respectivement comme sonde de détection et de capture, sur l'automate de laboratoire VIDAS (marque déposée, commercialisé par la société bioMérieux). Toute activité inférieure ou égale à 50 unités correspond à un résultat négatif, comparable au bruit de fond d'un essai témoin ne comportant pas d'ADN amplifié, tandis qu'une activité supérieure à 500 unités signifie la présence du produit d'amplification recherché.Les chiffres observés corroborent les résultats qualitatifs de recherche du produit d'amplification après séparation électrophorétique d'une fraction du milieu réactionnel et confirment la spécificité de détection des streptocoques du groupe A par ces sondes (Cleuziat et al., Proceedings of the Conference on Taxonomy and
Automated Identification of Bacteria, Prague, 1992, 70-73).

b) étude par hybridation sur ADN génomique
L'ADN génomique des bactéries précédemment étudiées (souches de collections internationales et souches d'origine clinique) et répertoriées dans les tableaux 2 et 3 a été extrait selon la méthode de Chassy prédemment citée, suite à leur culture en milieu liquide approprié. Chaque ADN (quantité équivalant à environ 1012 bactéries) a été déposé sur membrane de nylon à l'aide d'un appareil de filtration sous vide, puis dénaturé et fixé sur membrane comme décrit par Sambrook et al. (Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).Ces ADN ont ensuite été hybridés avec une sonde ADN double brin correspondant exactement à la phase codante du gène pcp de Streptococcus pyogenes dans des conditions ne permettant son hybridation qu'à une séquence cible parfaitement homologue, comme précédemment décrit. Cette sonde a été synthétisée par PCR comme précédemment décrit à l'aide des amorces oligonucléotidiques S dATGAeAAAITClTGTAACAGGC3 correspondant aux positions 285 à 305 et 5,dGTGAGTAGCGCCCCCTAC3, complémentaire des positions 912 à 929 de la séquence du gène pcp de Streptococcus pyogenes (fig. 3). Les résultats d'hybridation sont indiqués dans les tableaux 2 et 3.Ils mettent en évidence que la sonde constituée de la totalité du gène pcp de
Streptococcus pyogenes permet la détection spécifique et exclusive de l'ensemble des souches de Streptococcus pyogenes (streptocoques B-hémolytiques du groupe A). Aucune réaction croisée non spécifique n'est observée avec l'ensemble des autres espèces bactériennes, notamment celles possédant une activité PYRase, ce qui démontre que l'ensemble du gène pcp de Streptococcus pyogenes est un marqueur génétique très spécifique de cette espèce.

Toute ou partie de la séquence du gène pcp de Streptococcus pyogenes constitue donc une sonde de détection spécifique de cette espèce.

c) étude par hybridation de Southern
L'ADN génomique des bactéries S. pyogenes JRS4 (mutant spontané de D471 resistant à la streptomycine), E. faecalîs CG110 (Gawron-Burke et Clewell, Nature, 1982, 300, 281284) et B. subtils 168 (Lepesant et al., Mol. Gen. Genet., 1972, 118, 135-160) est extrait selon la méthode Chassy précédemment citée. Ces ADNs sont respectivement soumis a une digestion totale par les endonucléases de restriction Hpa I ou Bgl II, Hind III et Rsa I. Les fragments résultants sont séparés par électrophorèse en gel d'agarose et transférés sur membrane de nylon selon la méthode de Southern.Cette membrane est ensuite hybridée avec la sonde PCR couvrant la majeure partie du gène pcp, dans des conditions ne permettant son hybridation qu'à une séquence cible parfaitement homologue, comme précédemment décrit
Aucun signal d'hybridation n'est observé (fig. 4) avec le génome des bactéries
Enterococcus faecalis et Bacillus subtîlis, contrairement à Streptococcus pyogenes qui révèle la présence d'une bande d'hybridation unique dont la taille confirme la carte de restriction établie de la région d'ADN codant pour la PYRase. Ce résultat montre donc que l'intégralité du gène pcp peut être utilisée comme sonde ADN pour la détection spécifique des streptocoques du groupe A et que toute séquence nucléotidique d'une longueur suffisante et de localisation quelconque provenant de ce gène peut également être utilisée dans ce but.

Les résultats d'hybridation corroborent ceux obtenus par amplification. L'ADN extrait des bactéries E. faecalis et B. subtilis ne donne pas lieu à des phénomènes d'hybridation croisée, bien que ces organismes possèdent tous deux une activité PYRase. Ceci démontre qu'il n'existe pas d'homologie entre le gène codant pour la PYRase de ces bactéries et le gène pcp de S. pyogènes.

Exemple 10 : surproduction de la PYRase
L'intérêt de la PYRase est capital dans le domaine de la chimie et de la biochimie. Son activité permet en effet de libérer les groupements NH2-terminaux qui sont bloqués par un résidu pyroglutamique, permettant ainsi de poursuivre la procédure de séquençage des peptides par la méthode de dégradation séquentielle d'Edman (Acta Chem. Scan, 1950, 4, 283-293).

Le fragment Hpa I-Bgl II de 1,6 kb issu du plasmide pPC20 (fig. 1) a été inséré dans les vecteurs d'expression pT7-5 et pT7-6 (Tabor and Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 1074-1078), qui diffèrent l'un de l'autre par l'orientation du site de clonage multiple situé en aval du promoteur du bactériophage T7. Les plasmides résultants, respectivement pPC39 et pPC40, ont été introduits dans la souche E. coli K38 (Russel et Model, J. Bacteriol., 1985, 159, 1034-1039) contenant le plasmide compatible pGP1-2 (Tabor and Richardson,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 1074-1078).Après croissance des bactéries à 30"C en milieu sélectif, la synthèse de l'ARN polymérase du phage T7 à partir de pGP1-2 est induite par choc thermique à 42"C pendant 20 min. L'ARN polymérase bactérienne est ensuite inhibée par adjonction de rifampicine (200 g/ml), conduisant à la transcription exclusive du gène pcp placé en aval du promoteur du phage T7. Le produit résultant de la traduction de 1'ARN spécifiquement transcrit est visualisé grace à l'incorporation in vivo de L-[35S]méthionine (1000 Ci/mmol) ajoutée extemporanément. Les cellules sont par la suite lysées et leur contenu protéique est analysé sur gel de polyacrylamide 12,5% dénaturant (fig. 10).

L'expression du gène pcp sous son propre promoteur à partir des plasmides pPC39 et pPC40 permet, en raison du nombre important de copies de ces plasmides par bactéries, l'obtention d'une quantité significative de PYRase, dont le poids moléculaire apparent est estimé à 26 kDa. L'enzyme exprimée s'avère être largement majoritaire parmi les protéines totales cellulaires (fig. 10). L'expression d'une protéine marquée de 26 kDa correspondant à la
PYRase à partir de pPC39 montre que l'insertion du gène pcp dans le sens de transcription imposé par le promoteur du phage T7 permet de surproduire spécifiquement le produit de ce gène. Cette surproduction autorise la purification à homogénéité d'une grande quantité de
PYRase par unité de poids sec bactérien, par le biais d'un procédé chromatographique n'impliquant qu'une seule étape (Awadé et al., FEBS Lett., 1992, 308, 70-74). De la même façon, il a été possible de surexprimer le gène pcp de Bacillus subtîlis qui a été caractérisé, afin de surproduire la PYRase de cet organisme chez E. coli à l'aide du système promoteur/polymérase du phage T7 précédemment décrit. Cette approche également d'obtenir la protéine pure par un procédé de purification d'une seule étape de chromatographie (Gonzales et Awadé, J. Chromatogr., 1992, 584, sous presse).

Claims (28)

REVENDICATIONS

1. Polypeptide purifié contenant des séquences caractéristiques de pyrrolidone carboxylyl peptidase, caractérisé par le fait qu'il contient au moins une séquence peptidique d'au moins six acides aminés choisie dans la séquence peptidique représentée à la figure 3, 5 ou 6, ou par le fait qu'il présente au moins 40 % d'homologie avec la séquence peptidique représentée à la figure 3, 5 ou 6.

2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il présente au moins 20 % d'identité avec la séquence peptidique représentée à la figure 3, 5 ou 6.

3. Polypeptide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé par le fait qu'il contient au moins une séquence peptidique d'au moins six acides aminés choisie parmi les séquences suivantes: Glu-Arg-Val-Ala-Ile-Asn-X-X-Asp-Ala-Arg-Ile-Pro-Asp-Asn-X-Gly-X- GIn-Pro

Ile-Asp (I) Gly-X-X-Ala-X-Val-Ser-X-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn-X-X-X-

Tyr (Il);

Leu-X-Thr-Gly-Phe-X-Pro-Phe (llI); dans lesquelles X est un acide aminé.

4. Polypeptide selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que lesdites séquences II et III sont choisies respectivement parmi les séquences:

Gly-Z1-Z1-Ala-X-Val-Ser-Z2-Thr-Ala-Gly-Thr-Phe-Val-Cys-Asn-Z4-Z1-Tyr (IIa), et

Leu-Z1-Thr-Gly-Phe-Z3-Pro-Phe (III3), dans lesquelles:

Z1, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Trp, Phe, ou Met Z2 > chacun indépendamment l'un de l'autre représente Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, ou Glu;

Z3, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Ala,

Asp, ou Glu ; et

Z4, chacun indépendamment l'un de l'autre représente Gly, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Lys,

Arg, ou His.

5. Polypeptide selon la revendication 1 caractérisé par le fait qu'iI présente au moins 40% d'homologie avec le polypeptide de la revendication 3 ou de la revendication 4.

6. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'il présente au moins 20% d'identité avec le polypeptide de la revendication 3 ou de la revendication 4.

7. Anticorps caractérisés par le fait qu'ils sont capables de reconnaître des séquences peptidiques choisies parmi celles qui sont définies dans l'une quelconque des revendications 1 à6.

8. Polynucléotide purifié, caractérisé par le fait qu'il contient une séquence nucléique codant pour un polypeptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou qu'il contient au moins une partie, ayant au moins 10 nucléotides, d'une telle séquence, ou d'une séquence complémentaire de ladite séquence.

9. Polynucléotide selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite séquence nucléique est telle que définie dans la revendication 3 ou la revendication 4.

10. Polynucléotide selon la revendication précédente, caractérisé par le fait que ladite séquence nucléique est la séquence nucléique codante de la figure 3, 5 ou 6.

11. Utilisation d'un polynucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 10, dans la préparation d'un vecteur recombinant, ou d'une cellule transformée à l'aide d'un tel vecteur, ou dans la surproduction, par culture d'une telle cellule transformée, d'un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications I à 6.

12. Vecteur de clonage ou d'expression recombinant caractérisé par le fait qu'il contient un polynucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 10.

13. Cellule transformée caractérisée par le fait qu'elle contient un vecteur recombinant tel que défini dans la revendication précédente.

14. Sonde nucléique, caractérisée par le fait qu'elle contient une séquence d'au moins 10 nucléotides d'un polynucléotide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 8 à 10, ou une séquence complémentaire de ladite séquence.

15. Sonde nucléique selon la revendication précédente, caractérisée par le fait qu'elle contient une séquence appartenant de la séquence codante de la figure 3, ou à sa séquence complémentaire.

16. Sonde nucléique selon la revendication 14, caractérisée par le fait qu'elle contient une séquence appartenant à la séquence codante de la figure 5, ou à sa séquence complémentaire.

17. Sonde nucléique selon la revendication 14, caractérisée par le fait qu'elle contient une séquence appartenant à la séquence codante de la figure 6, ou appartenant à sa séquence complémentaire.

18. Sonde nucléique selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée par le fait qu'elle est fixée sur un support solide.

19. Sonde nucléique selon la revendications précédente, caractérisée par le fait qu'elle est fixée par adsorption ou par covalence.

20. Sonde nucléique selon la revendication 18, caractérisée par le fait qu'elle est fixée par l'intermédiaire d'un agent de couplage.

21. Sonde nucléique selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée par le fait qu'elle est marquée à l'aide d'un agent traceur.

22. Utilisation d'une sonde nucléique telle que définie dans la revendication 14, comme moyen de détection d'un gène codant pour une pyrrolidone carboxylyl peptidase dans un microorganisme.

23. Utilisation d'une sonde nucléique telle que définie dans la revendication 15 comme sonde de capture ou de détection de Streptococcus pyogenes.

24. Utilisation d'une sonde nucléique telle que définie dans la révendication 16 comme sonde de capture ou de détection de Bacillus subtillis.

25. Utilisation d'une sonde nucléique telle que définie dans la revendication 17, comme sonde de capture ou de détection de Streptococcus fluorescens.

26. Méthode de détection d'un gène codant pour une pyrrolidone, carboxylyl peptidase dans un microorganisme à l'aide d'au moins une sonde nucléique, caractérisée par le fait que ladite sonde nucléique est telle que définie dans l'une quelconque des revendications 14à20.

27. Méthode de détection selon la revendication précédente, caractérisée par le fait que ladite sonde est définie comme dans l'une quelconque des revendications 18 à 20 et est utilisée comme sonde de capture.

28. Méthode de détection selon l'une quelconque des revendications 26 et 27, caractérisée par le fait que ladite sonde est définie comme dans la revendication 21 et est utilisée comme sonde de détection.