JP2000516471A - Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーであるマイコバクテリアに対して特異的である核酸のフラグメント、及びｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーの検出及び示差診断のためへのそれらの適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、配列番号１の配列、配列番号２の配列、それらの相補的配列、又は高い緊縮条件下で前記配列の１つとハイブリダイズすることができる核酸配列間から選択されたヌクレオチド鎖を含んで成る、核酸のＭ．ツベルキュロシス複合体特異的フラグメントに関する。本発明はまた、Ｍ．ツベルキュロシス複合体のマイコバクテリアメンバーの検出及び示差診断、特に前記複合体の他のメンバーのBCG示差診断のためへの前記配列の使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーであるマイコバクテリアに対して特異的 である核酸のフラグメント、及びＭ．ツベルキュロシス複合体のメンバーの検出 及び示差診断のためへのそれらの適用 本発明は、Ｍ．ツベルキュロシス(M．tuberculosis)複合体に属するマイコバ クテリア（mycobacteria）の核酸の配列に関する。 本発明は同様に、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリアの株 のインビトロ検出方法、及びＭ．ツベルキュロシス複合体の株の示差診断、特に サンプルにおける前記複合体の他のメンバーの存在とBCGの存在とを区別するた めの方法に関する。 約17億の人々又は世界人口の１／３が、Ｍ．ツベキュロシスにより感染されて いる(Sudreなど.，1992)。1990年、結核の見積もられた患者数は８百万人であり 、そのうち2.9百万人が死亡している(Sudreなど.，1992)。それらの過去数年、 アメリカ合衆国及びヨーロッパにおける結核の患者数は、主に、高い危険性での 集団、たとえばAIDSを有する患者、慢性アルコール依存症、ホームレス、及び薬 物常習者において、１年当たり３〜６％上昇している(Barnesなど.，1991)。 マイコバクテリアによる感染と戦うことにおける困難性を考えると、それらの 感染の診断を可能にする特異的且つ感受性の急速な方法を有する緊急な必要性が ある。また、臨床サンプルにおけるＭ．ツベルキュロシスの初期検出は、感染さ れた感者の臨床学的処理及び危険な状態での暴露された個人の同定のために結核 の制御においてますます重要なっている。 マイコバクテリアの種の特定DNAのPCR(ポリメラーゼ鎖反応)に よる検出はたぶん、急速で、特異的で且つ敏感な診断のための最とも有望な新規 アプローチの１つである(Saikiなど.，1985:Brisson-Noelなど.，1989;Consins など.，1992;Eisenachなど.，1990;Forbesなど.，1993;Friesなど.，1991;Herma sなど.，1990;Jonasなど.，1993;Kolkなど.，1992;Pierreなど.，1991;Saboorな ど.，1992;Shankarなど.，1991;Sjobringなど.，1990)。しかしながら、今日ま で実施されて来た種々の研究は、特異性及び感度に関して、異なった結果を導び いて来た。この相違点についての理由の中で、サンプルの調製、すなわちPCR生 成物の増幅又は検出方法のためのプロトコールに関する方法論的な差異を注目す ることが特に可能である。 それらの研究のいくつかは、標的物DNA IS6110(Clarridgeなど.，1993;Eisena chなど.，1990;Forbesなど.，1993;Noordhoeckなど.，1994)、65kDaの抗原をコ ードする遺伝子(Brisson-Noelなど.，1991;Telentiなど.，1993)、38kDaの抗原 をコードする遺伝子(Folgueiraなど.，1993;Sjobringなど.，1990)、又はリボソ ーム16S RNA(Koxなど.，1995)から出発してＭ．ツベルキュロシス複合体のPCRに よる検出に関する。しかしながら、それらのすべての診断試験は、Ｍ．ツベキュ ロシス複合体をその全体として同定する。 Ｍ．ツベキュロシス複合体は、Ｍ．ツベキュロシス、Ｍ．ボビス（M．bovis） 、Ｍ．ミクロチ（M．microti）及びＭ．アフリカナム（M．afrianum）を包含す る。それらの４つの種は、それらのDNAにおいて強い相同性を有し(85〜100％)(I meada，1985)、そしていくつかの完全に同一の遺伝子を有する。この相同性は、 菌株を区別するためへのDNA配列の使用を制限する。それにもかかわらず、Calme tte-Guerin（BCG）バシラスＭ．ボビスの株からＭ．ツベルキュ ロシスの株を区別することができることは特に興味の対象であり、ここで前者は 結核に対する免疫保護のための生存ワクチンとしてしばしば使用されている。明 白には、従って、たぶん病原性マイコバクテリアと予防接種用BCG株との区別に 興味がある。この区別は、免疫欠損個人、たとえばHIVにより感染される患者の 場合に特に重要である。 IS6110要素の挿入に基づく制限フラグメント長さ多形現象（RFLP）分析が、Ｍ ．ツベルキュロシスの異なった株を区別するために使用されて来た。この挿入要 素は、その位置、及び異なった株のゲノムに存在するコピーの数における変動性 を考慮して、株の特異的RFLPプロフィールの獲得を可能にする。IS6110が、Ｍ． ツベルキュロシス及びＭ．ボビスにおいて示されているが、しかし試験される他 のマイコバクテリアにおいては示されていない（Caveなど.，1991）。一般的に 、この挿入要素のいくつかのコピーがＭ．ツベルキュロシスに示され得るが、但 し、単一のコピーがＭ．ボビスBCGに見出される(Caveなど.，1991)。しかしなが ら、Ｍ．ツベルキュロシスの一定株がIS6110を欠いており(van Soolingenなど. ，1994)、そして有意な数のコピーを有するＭ．ボビスの株がいくつかの集団に おいて共通する(van Soolingenなど.，1994)。IS611OからのＭ．ツベルキュロシ スの株の同定はサザンブロット分析を必要とし、そして通常のPCR法によっては 容易には実施され得ない事実が、それらの制限に付加される。 本発明者は、酵素的増幅のための新規標的DNA配列を示した。この配列は、Ｍ ．レプラエ(M．leprae)、及びＭ．ツベルキュロシス複合体のメンバーである細 菌の特定の二成分調節システムをコードするオペロンの一部である。前記二成分 システムは、大きなファミリーに属し、遺伝子発現のレベルの修飾により外部シ グナルの翻訳 において協力する２種のタンパク質を包含する調節システムである（Parkinson and Kofoid，1992）。提案された一般的なモデルによれば、膜に位置する１つの 成分は、環境変化のセンサーとして作用し、そして細胞質における応答の調節成 分に情報を伝達することができ、これが標的遺伝子の転写を調節することができ る。２つの成分間の伝達は一般的に、リン酸化のカスケードにより実施される。 本発明者は、二成分マイコバクテリアシステムを現在、クローン化し、そして 特徴づけた。このシステムは、Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバー及びＭ． レプラエに対して特異的であるように思われる。意外には、他の二成分システム に関しては、このマイコバクテリアシステムの遺伝子は、Ｍ．ツベルキュロシス 複合体のマイコバクテリアの株間に、及びＭ．レプラエにおいて独得に存在する DNA配列（シストロン間配列又は反復配列）により分離される。 本発明者は、Ｍ．ツベルキュロシス複合体の株において、このシストロン間領 域が、株間で変化することができる77個の塩基対の配列（配列番号１）の正確な 又は減じられた数の反復に対応することをさらに示した。切断された配列（配列 番号２）は、53個の塩基対から構成され、そしてGAGコドンにより置換される、 ヌクレオチド番号40〜66の短い同相内部欠失を含む。 本発明者は同様に、驚くべきことには、その切断された配列（配列番号２）が BCGとは異なる、Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーの特徴を有することを 示した。 Ｍ．ラプラエにおいては、その対応するシストロン間領域は、すでに記載され た52塩基対の変異体により形成され、としてその配列は下記に示される： ５’atg aca ccc gcg cag gcg atg atg cag agc gaa gtg acg aga ggg aat gtg a３’。 それらの特徴を考慮すれば、それらの反復される配列は、酵素的増幅技法、た とえばPCR又は他の類似する方法によりＭ．ツベルキュロシス複合体の株間を同 定し、そして区別するために特に興味あるものである。より特定には、それらは 、生物学的サンプルにおけるBCGの存在と前記複合体の他のメンバーの存在との 間の示差診断の確立を可能にする。原理は、配列番号２の配列の特異的欠失に基 づかれているこの示差診断は、本発明の好ましい観点を形成する。それは、免疫 欠損個人、たとえば特に、HIVにより感染された対象における、BCGによる感染と 前記複合体の他のビルレントメンバーによる感染とを区別するために都合良く使 用される。 従って、本発明は、配列番号１の配列、配列番号２の配列、それらの相補的配 列、又は高い緊縮性の条件下で前記配列の１つとハイブリダイズすることができ る核酸の配列間から選択されたヌクレオチドの配列を含んで成る、Ｍ．ツベルキ ュロシス複合体に属するマイコバクテリアの核酸の特異的フラグメントに関する 。 Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリアのインビトロ検出のた めのヌクレオチドプローブ、及びＭ．ツベルキュロシス複合体のメンバーである 株の特異的配列の酵素的増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの生成のた めへの前記配列の使用が同様に目的とされる。 本発明は同様に、Ｍ．ツベルキュロシス複合体の株のお互いからの区別を可能 にし、特にBCGとこの複合体の病原性マイコバクテリアとの区別を可能にするた めの方法に関する。 それは同様に、Ｍ．ツベルキュロシス複合体を形成する株間のサブグループを 区別するための手段を提供する。 さらに、それは、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属する種及び株のＭ．レプレ アエの生物学的サンプルにおける区別を可能にする。 本発明においては、ヌクレオチド配列がハイブリダイズできる“高い緊縮性” の条件とは、Sambrookなど.，1989により定義される条件、すなわち（Tm−５℃ ）と（Tm−30℃）との間の温度条件、及びさらに好ましくは、（Tm−５℃）と(T m−10℃)(高い緊縮性)との間の温度条件であると思われ、ここでTmとは、対合さ れた株の50％が分離する温度であるものとして定義される。好ましくは、使用さ れる高い緊縮性の条件は、68℃のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼ ーション及び洗浄温度に対応し、そしてプレハイブリダイゼーション及びハイブ リダイゼーション緩衝液は５×SSCに基づかれる(Boehringer Mannheimにより推 薦されるプロトコール)。 本発明は、senX3-regX3システムのシストロン間領域に位置するＭ．ツベルキ ュロシス複合体のマイコバクテリアの核酸の特異的フラグメントに関する。 例において説明されるであろうように、配列番号１の配列は、研究されるマイ コバクテリアの株に従って、77個の反復塩基対及び異なった数のコピーに対応す る。この反復配列は、25個のアミノ酸のペプチドをコードすることができる読み 取り枠(ORF)を有する。 従って、本発明は、配列番号１の配列、その相補的配列、又は高い緊縮条件下 で前記配列の１つとハイブリダイズすることができる核酸の配列から選択された ヌクレオチドの配列を含んで成る、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に対して特異的 な核酸のフラグメントを目的とする。 もう１つの観点によれば、本発明は、配列番号２の配列、その相補的配列、又 は高い緊縮条件下で前記配列の１つとハイブリダイズすることができる核酸の配 列間から選択されたヌクレオチドの配列を含んで成る、BCG、特にビルラント種 Ｍ．ツベルキュロシス、Ｍ ．アフリカナム又はＭ．ボビスとは異なるＭ．ツベルキュロシス複合体のメンバ ーの核酸の特異的フラグメントを目的とする。 例により実際的に示されるように、BCGは、BCGにおけるsenX3-regX3遺伝子間 領域（表３、グループ４，６，８を参照のこと）における配列番号１の配列の不 在のために、Ｍ．ツベルキュロシス複合体の他のすべての株から区別され得る。 本発明の異なったヌクレオチド配列は、人工的起源又は非人工的起源のもので あり得る。それらはDNA又はRNA配列であり得る。 それらは、たとえば化学的合成、又は他方では；配列番号１又は２の配列に基 づいて製造されたプローブにより、配列ライブラリーをスクリーニングすること によって得られる配列の化学的又は酵素的修飾を包含する混合された方法により 調製され得る。そのようなライブラリーは、当業者に知られている分子生物学の 従来の技法により調製され得る。 本発明のヌクレオチド配列は、高い緊宿条件下で、それらと、それらの対応す るRNA配列と又はその対応する遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができ るプローブ又はヌクレオチドプライマーの生成を可能にする。そのようなプロー ブは同様に、本発明の一部である。それらは、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属 するマイコバクテリアの特異的核酸配列の、ハイブリダイゼーション実験による 検出のためのインビトロ診断道具として使用され得る。 好ましくは、本発明のプローブは、少なくとも24個の連続したヌクレオチドを 有するが、但しより短いプローブも同等に適切である。最大で、それらはＭ．ツ ベルキュロシスの完全なsenX3-regX3遺伝子間領域(IPL)、すなわち配列番号１の 配列、続く配列番号２の配列の２つの連続した配列を有する。このDNAフラグメ ントは、218個の塩基対を含む。 Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーの特定の好ましいヌクレオチドプロー ブ間には、全体として配列番号１の配列又はその相補的配列が特に現われる。 もう１つの観点によれば、本発明は、BCG、特にビルラント種Ｍ．ツベルキュ ロシス、Ｍ．アフリカナム又はＭ．ボビスとは異なるＭ．ツベルキュロシス複合 体のメンバーに対して特異的な核酸の配列の検出及び表示のための、及びＭ．ツ ベルキュロシス複合体のマイコバクテリアを含む生物学的サンプルにおけるBCG の存在の示差診断のためのヌクレオチドプローブを目的とする。 そのようなヌクレオチドプローブは、位置40−42におけるGAGコドンを取り囲 む配列番号２の配列、又はその相補的鎖の領域から得られる。好ましくは、この 領域は、21個の長さの塩基対を有し、そして配列番号２の配列の特異的GAGコド ンの上流及び下流に９個のヌクレオチドを含む。 好都合には、それらのプローブは、全体として配列番号２の配列又はその相補 的配列を含んで成る。 本発明のプローブは、当業者により通常使用される温度及びイオン強度の条件 に対応する適切なハイブリダイゼーション条件に従ってハイブリダイズする。 好ましくは、本発明のプローブは、それらの使用の前、ラベルされる。このた めには、いくつかの技法が、当業者のかっこに使用される（螢光、放射性、化学 発光、酵素、等でのラベリング）。 好ましい態様によれば、前記プローブはジゴキシゲニンによりラベルされる。 ジゴキシゲニン(DIG)は、プローブとして使用されるDNAをラベルするためにdUTP に結合されるステロイドハプテンである。この技法は、Boehringer Mannheimに より市販されている。プローブとのハイブリダイゼーション及び洗浄の後、検出 は、基質二 ナトリウム３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキエタン−３， ２’−（ ５’−クロロ）トリシクロデカン）−４−イル｝フェニルホスフェート（CSPD） により化学発光シグナルの発光に従って実施される。 本発明のヌクレオチド配列は同様に、配列決定反応又は酵素的増幅のためのオ リゴヌクレオチドプライマーの生成及び使用のためにも有用である。 酵素的増幅技法は、主としてPCRにより例示される。しかしながら、他の類似 する方法、たとえばLCR(リガーゼ鎖反応)、NASBA(核酸配列に基づく増幅)、Ｑ− βレプリカーゼ、SDA(鎖置換増幅)、及び当業者の技術的知識に包含されるいづ れか他の変法が使用され得る。それらの核酸増幅技法は、標的配列の延長反応を 開始するためにオリゴヌクレオチドプライマー分子を使用する。それらのプライ マーの正確な長さは、情況に従って変化することができるであろう。たとえば、 マトリックスの配列の複雑さの機能としては、ポリヌクレオチドプライマーは典 型的には、15〜25個又はそれ以上のヌクレオチドを含む。しかしながら、ある場 合、それはそれ以下のヌクレオチドを含むことができる。 好ましくは、本発明のヌクレオチドプライマーは、少なくとも19個のヌクレオ チドを含んで成る。それらは、senX3の３’側及びｒegX3の５’側領域において 、senX3-regX3遺伝子間領域に隣接する配列から選択されるプライマーにより形 成される。 好ましい変法によれば、Ｃ５及びＣ３として言及されるプライマーの対、すな わちsenX3遺伝子の３’末端及びregX3遺伝子の５’末端にそれぞれ対応する５’ GCGCGAGAGCCCGAACTGC３’及び５’GCGCAGCAGAAACGTCAGC３’が使用される。それ らのプライマーはそれぞれ、シストロン間領域の上流の56個の塩基対及び前記領 域の下流 の62個の塩基対とハイブリダイズする。 前記ヌクレオチド配列及びそれに起因するプローブは、特に制限酵素及び特異 的切断部位の使用を包含する分子生物学の従来の技法に従って、クローニング及 び／又は発現ベクターでクローン化され得る。 本発明の好ましいクローニングベクターは、その構成が下記例において詳細に 記載されている、I-1766としてCNCMに寄託されているプラスミドpRegXMt1により 示される。 本発明のもう１つのクローニングベクターは、I-1765としてCNCMに寄託される プラスミドpRegX3Bc1により示される。それらのプラスミドはＥ．コリXL1-blue 中にそれぞれ導入されている。 ベクターI-1765及びI-1766は、完全なsenX3-regX3遺伝子、及びそれぞれBCG及 びＭ．ツベルキュロシスのシストロン間領域を個々に含む。 本発明のヌクレオチド配列はさらに、その対応するペプチドの生成、及びその 生物学的活性の研究のために、適切なシステムにおいて発現され得る。この場合 、それらは、細胞宿主におけるそれらの発現を可能にするシグナルの制御下に配 置されるであろう。 タンパク質又は組換えペプチドの生成の効果的なシステムは、たとえばプラス ミド又はウィルス起源のベクター、及び適合できる宿主細胞を有することを必要 とする。 細胞宿主は、原核システム、たとえば細菌、又は真核システム、たとえば酵母 、昆虫細胞、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞、又は都合良く入手できる いづれか他のシステムから選択され得る。 前記ベクターは、プロモーター、翻訳開始及び停止／シグナル、及び転写調節 の適切な領域を含むべきである。それは細胞において 安定して維持されることができるべきであり、としてたぶん、翻訳されたタンパ ク質の分泌を指定する特定のシグナルを有することができる。 それらの異なった制御シグナルは、使用される細胞宿主の機能として選択され る。このためには、本発明のヌクレオチド配列は、選択された宿主における自律 複製ベクター、又は選択された宿主のインテグレイティブベクター中に挿入され 得る。そのようなベクターは、当業者により現在使用されている方法に従って調 製され、そしてそれから得られるクローンは、標準の方法、たとえばエレクトロ ポレーションにより適切な宿主中に導入され得る。 本発明の配列から得られたヌクレオチドプローブが使用されるインビトロ診断 又は検出方法は同様に、本発明の一部である。 より特定には、本発明は、次の段階を含んで成る生物学的サンプルにおける、 Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリアの株の検出方法を目的と する： （ｉ）生物学的サンプルと一対のプライマーとの、Ｍ．ツベルキュロシス複合 体に属するマイコバクテリアの株に対して特異的な核酸に対する前記プライマー のハイブリダイゼーションを可能にする条件下ででの接触； （ii）前記核酸の増幅； （iii）本発明のヌクレオチドプローブと前記生物学的サンプルとの、前記プ ローブと増幅された核酸配列との間でのハイブリダイゼーション複合体の形成を 可能にする条件下での接触； （iv）形成されるハイブリダイゼーション複合体の検出。 第１の変法によれば、本発明の方法は、生物学的サンプルにおけるＭ．ツベル キュロシス複合体のいづれかのメンバーの存在の検出を可能にする。この場合、 上記段階（iii）の複合体は、配列番号１ の配列又はその相補的鎖の特異的ヌクレオチドプローブにより形成される。 第２の好ましい変法によれば、本発明の方法は、BCG以外のＭ．ツベルキュロ シス複合体のメンバーの存在の特異的な検出を可能にする。この変法によれば、 検出される段階（iii）の複合体は、配列番号２の配列の特定位置40〜42でGAGコ ドンを形成する２倍の９個の塩基対から構成される短い配列から成る、配列番号 ２の配列又はその相補的鎖に対して特異的なヌクレオチドプローブにより形成さ れる。 第３の特に好ましい変法によれば、本発明の方法は、BCG及び複合体の他のメ ンバーの示差診断を可能にする。この場合、前記方法は、まず、配列番号１の配 列又はその相補的鎖の第１の特定ヌクレオチドプローブにより形成されるハイブ リダイゼーション複合体の段階（iv）に従っての検出により、Ｍ．ツベルキュロ シス複合体のすべてのメンバーに対して特異的な核酸を示し、次に、配列番号２ の配列又はその相補的鎖の第２の特定ヌクレオチドプローブにより同様に複合体 を形成することができる前記第１のプローブ複合体と複合体を形成することがで きる増幅された核酸間で見出ことから成る。 前記第１のプローブとユニークにハイブリダイズする増幅された核酸配列は、 BCGの特定の核酸配列に対応するが、ところが、前記２つのプローブの個々とハ イブリダイズする配列はＭ．ツベルキュロシス複合体の他のメンバーの配列に対 応する。 この示差診断方法は、従来の検出方法よりも明らかに興味あるものである。な ぜならば、それは、Ｍ．ツベルキュロシス複合体のビルレントマイコバクテリア （Ｍ．ツベルキュロシス、Ｍ．ボビス、又はＭ．アフリカナム、及びたぶんＭ． ミクロチ）による感染とBC G(たぶん予防接種からの)による感染との区別を可能にするからである。この区 別は、免疫欠損の個人、特にHIVにより感染された対象において特に重要である 。 もう１つの好ましい態様によれば、本発明はＭ．ツベルキュロシス複合体に属 するマイコバクテリアのグループの同定方法を提供し、ここで前記方法は、 −上記に上記されたような一対のプライマーにより前もって抽出された前記株 のDNAが、前記プライマーの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下 で、前記株のDNA上のそれらの対応する配列と接触せしめられ、そして増幅生成 物が得られ、そして −その得られる増幅生成物の長さがアガロースゲル電気泳動により測定される ことを特徴とする。 好都合には、プライマー５’GCGCGAGAGCCCGAACTGC３’及び５’GCGCAGCAGAAAC GTCAGC３’がこの方法に使用される。 本発明は同様に、生物学的サンプルにおける、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に 属するマイコバクテリアの株のインビトロ同定のためのキットに関し、ここで前 記キットは、 −上記で定義されるような、本発明の一対のプライマー； −前記プライマーの助けを伴って、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属する核酸 の特定配列の増幅を可能にするために必要な試薬； −前記増幅されたフラグメント、好ましくは本発明のヌクレオチドプローブを 示すための可能な手段を含んで成る。 本発明の他の特徴及び利点が続く例により、及び添付される図により示される 。 図１：BCG（IPP）のDNAの“サザンブロット”分析。Ａ)．regX3遺伝子の一部 を含んで成る259個の塩基対のフラグメントが、BCG（IPP）の染色体DNAにおける 異なった制限フラグメントにおける遺 伝子を検出するためにプローブとして使用される。使用される制限酵素は図の上 部に示されている。Ｂ)．BCG(IPP)のsenX3及びregX3遺伝子の遺伝子座の部分制 限地図。制限部位は、senX3及びregX3遺伝子、及び使用されるプローブに対して 示されている。 図２：BCG（IPP）のsenX3及びregX3遺伝子のヌクレオチド配列及びそれに由来 するタンパク質配列。矢印は、パリンドローム配列を示す。推定上のShin-Dalga rno配列は、点により下線を引かれている（SD）。senX3の予測されるトランスメ ンブラン配列は二重に下線が引かれている。他のセンサーに保存されるsenX3の 領域は下線が引かれており、そして次のように注釈される：Ｈ、修飾されたヒス チジンを含む領域；Ｎ、アスパラギンに富んでいる領域；Ｆ、フェニルアラニン に富んでいる領域；Ｇ１及びＧ２、グリシンに富んでいる領域。小さな垂直の矢 印はリン酸化されることが予測される残基を示す。注釈される配列PgmYは、ホス ホグリセリン酸ムターゼをコードする遺伝子の末端を示す。 図３：SenX3の疎水性プロフィール。陽性の値は、疎水性領域を示し、そして 陰性の値は親水性領域を示す。矢印は、可能な開始コドンを示し、そして２つの 水平線は予測されるトランスメンブラン領域を示す。図の上部での数字は、アミ ノ酸の数を示す。 図４：BCG（IPP）とＭ．ツベルキュロシス(IPL)との間のシストロン間領域の 比較。senX3及びregX3遺伝子は矢印により示される。ヌクレオチド配列及び推定 されるタンパク質配列が示される。 図５：Ｍ．ツベルキュロシス及びBCGのDNAのサザンブロット分析。Ｍ．ツベル キュロシス(IPL)(右側)及びBCG(IPP)(左側)の染色体DNAが、PstＩにより消化さ れ、アガロース上での電気泳動にゆだねられ、そしてＭ．ツベルキュロシス(IPL )のsenX3-regX3遺伝子間プローブによるハイブリダイゼーションにより分析され た。 図６：異なったマイコバクテリア株に対して実施されたPCRにより得られた生 成物のアガロース(2.5％)上での電気泳動による分析。レーン１〜３：グループ １、それぞれＭ．ミクロチ、Ｍ．ツベルキュロシスV808、Ｍ．ツベルキュロシス V761；レーン４及び５、グループ２、それぞれＭ．ツベルキュロシスV729、Ｍ． ボビス60；レーン６〜８、グループ３、それぞれＭ．ボビス63、Ｍ．ボビス78及 びＭ．ボビスAN５；レーン９及び10、グループ４、それぞれＭ．ツベルキュロシ スH37Ra（IPL）及びＭ．ツベルキュロシスH37Rv（IPP）；レーン11及び12、グル ープ５、それぞれＭ．ツベルキュロシス（IPL）、Ｍ．ボビス76；レーン13及び1 4、グループ６、それぞれＭ．ボビス(BCGite 29)及びＭ．ボビスBCG（IPP）；レ ーン15、グループ７、Ｍ．ツベルキュロシスNo.19。 図７：図６で得られたフラグメントのサザンブロット分析。使用されるプロー ブは、Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のsenX3-regX3シストロン間領域である。 例 例１：二成分マイコバクテリアシステムをコードする、Ｍ．ボビスBCG（IPP） のsenX3-regX3遺伝子のゲノム地図及びクローニング。 Wrenなど．(1992)は、regX3と呼ばれるＭ．ツベルキュロシス(IPL)の遺伝子か ら259個の塩基対のフラグメントを増幅した。 本発明者は、次の合成オリゴヌクレオチド：５’−CGAGGAGTCGCTGGCCGATCCGC −３’及び５’−AGCGCCCCAGCTCCAGCCGACC−３’を用いて、Ｍ．ボビスBCG（WHO Collection of Stockholm，Swedenで得られるワクチン株1173P2）からその対応 する配列を増幅した。増幅を、それらのプライマー及びDeep Ventポリメラーゼ( New England Biolabs)を用いることによって実施した。次に、得られる259個 の塩基対の増幅生成物を、アガロースゲル上での電気泳動により精製し、そして 標準のプロトコール(Sambrookなど.，1989)に従って、pBluescript KS+ベクター （Stratagene）のSmaＩ部位でサブクローン化した。次に、この挿入体を組換え プラスミドから、BamHＩ及びEcoRＩによる消化により除去し、そして次に、製造 業者により推薦される条件に従って、Boehringerにより市販されている“ランダ ムプライミング”キットを用いて、“ランダムプライミング”（ランダムラベリ ング）によりdCTP〔α-³²P〕によりラベルした。組織の静置培養のためのフラス コにおいて37℃でSauton培地（Sauton，1912）において培養されたＭ．ボビスBC G（IPP）のゲノムDNAを、前に記載したようにして（Kremerなど.，1995a）、抽 出し、そして異なった制限酵素により消化した。次に、このDNAを、標準方法(Sa mbrookなど.，1989)に従って、アガロースゲル上での電気泳動及びサザンブロッ ト分析にゆだねた。〔³²Ｐ〕−ラベルされたDNAによるブロットの試験は、KpnＩ 及びBamHＩ，EcoRＩ又はPstＩのいづれかによる消化がハイブリダイズするバン ドの対を生成することを示し、そして１つのバンドが前記対の個々において他の バンドよりもより強くラベルされた（図１ａ）。それらのバンドは、プローブの ユニーク非対称KpnＩ部位のそれぞれの５’及び３’配列に帰する。これは、Bam HＩ，EcoRＩ、及びPstＩ，KpnＩ部位の５’及び３’部位の配置を可能にした（ 図１ｂ）。PstＩのみによる消化は単一のハイブリダイゼーションバンドを付与 した。予測されるように、KpnＩによる消化は２つのバンドを付与し、そしてBam HＩ及びEcoRＩによる消化は、約3.5kbの単一のバンドの獲得を導びいた。 BCGのゲノムDNAをBamHＩ及びEcoRＩにより消化し、そして３〜４kbのDNAフラ グメントを、アガロースゲル上での電気泳動の後、 単離した。それらのフラグメントを、BamHＩ及びEcoRＩにより制限されたpBlues cript SK（Stratagene）中に挿入した。900個の組換えクローンを、“コロニー ブロットハイブリダイゼーション”(Sambrookなど.，1989)の前記標準技法を用 いて、〔³²Ｐ〕−ラベルされたプローブによりスクリーンした。それらの３個は 陽性であり、そして制限分析により3.2kbの同じBamHＩ／EcoRＩ DNA挿入体を含 むことがわかった。ハイブリダイズするクローンを後での研究のために単離し、 そしてpRegX3Bc1(I-1765)と命名した。 例２：二成分システムをコードするＭ．ボビスBCG（IPP）の遺伝子の配列 1.0，1.5及び0.7kbのSalＩフラグメントを、pRegX3Bc1(I-1765)の3.2kb挿入体 から単離し、そしてpBluescript SK^-にサブクローン化した。その3.2kの挿入体 の配列、及びサブクローンSalＩの配列を、“プライマーウォーキング(primer w alking)”の方法によりその二本鎖に基づいて決定した。Ｍ．ボビスBCG（IPP） の3208bpのヌクレオチド配列（図２）は、マイコバクテリアのＣ＋Ｇ特徴の頻度 を示した（66.6％）。regX3及びsenX3により示された２つの主要読み取り枠(ORF )は同一であった（図１ｂ及び２）。regX3は1679位置でATGトリプレットにより 開始し、そして2360位置でTAGトリプレットにより終わる。それは³²Ｐ−ラベル されたプローブの配列を含み、そしてその推定されるアミノ酸配列が24,881Daの 計算された分子質量のために227個の残基であるタンパク質をコードする。senX3 ORFの上流の限界は確かでない。なぜならば、５つの同相の潜在開始コドン(ATG 又はGTG)が短い距離(296〜446)に見出されたからである（図２及び３）。しかし ながら、位置296でのGTGのみが、Ｅ．コリのShine-Dalgarno配列に対して相同の 配列により、９個のヌクレオチド上流で先行されている（６個の残基のうち４個 のAGGAGGに対して同一である）。従って、このGTGコドンは、位置1526でTGA停止 コドンにより終結するsenX3 ORFの５’における限界である。従って、このORFは 、410個のアミノ酸残基から構成される、44,769Daのタンパク質をコードするこ とが仮定される。senX3遺伝子は、ホスホグリセリン酸ムターゼの相同体をコー ドする0RFの３’部分により、273個のヌクレオチド上流で先行される。ヘアーピ ン構造を形成できる配列は、位置178と194との間に位置する。この配列は、ORF 上流の末端転写配列として機能することができる。 MycDBデータベースに基づく研究は、senX3及びregX3遺伝子がまた、Ｍ．レプ レアエにも存在することを示した。それらがコードする生成物は、それぞれ、Ｍ ．ボビス(IPP)のタンパク質senX3及びregX3に対して82.7％及び94.9％類似する 。Ｍ．レプラエのsenX3 ORFは、GTGコドンにより開始されることがわかっており 、そしてＭ．ボビスBCG（IPP）に見出される相同体に類似する、ホスホグリセリ ン酸ムターゼの相同体をコードするORFにより先行される。 例３：Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のsenX3-regX3遺伝子のクローニング及び配 列決定 Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のsenX3及びregX3遺伝子を、Ｍ．ツベルキュロシ ス22962067、すなわちInstitut Pasteur de Lilleのマイコバクテリアの収集物 からの臨床学的単離物の染色体DNAからのPCRによりクローン化した。Ｍ．ツベル キュロシス(IPL)のDNAを、BCGの染色体DNAの抽出について上記に記載される方法 （Kremerなど.，1995a）により抽出した。Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のsenX3及 びregX3遺伝子を含む2.2kbのフラグメントを、Ｍ．ボビスBCG（IPP）のsenX3及 びregX3遺伝子の隣接する配列に対して相同の次のプライマーを用いてPCRにより 増幅した：５’−TGGCGT AGTGTGTGACTTGTC−３’及び５’−GACCAGACAGTCGCCAAGGTT−３’。増幅されたフ ラグメントを、pBluescript SK^-（バージョンII）のSamＩ部位にクローン化し、 pRegX3Mt1(I-1766)と称するプラスミドを生成した。次に、2.2kbの全フラグメン トを、BCG（IPP）のsenX3及びregX3遺伝子について例２に記載される方法と同じ 方法を用いて配列決定した。Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のsenX3及びregX3 ORF のDNA配列、及びsenX3の上流の５’領域及びregX3の下流の３’領域は、BCG（IP P）のものと同一であった。しかしながら、senX3とregX3との間のシストロン間 領域は、下記例において研究される興味ある差異を示した。 例４：senX3-regX3シストロン間領域の分析 senX3とregX3との間のシストロン間領域は、BCG（IPP）においてタンデムでの 77個の塩基対の完全な重複を含む（図４）。個々の反復された配列は、25個のア ミノ酸のペプチドをコードする能力を有する短いORFを含む。第１の反復から推 定され得るATG開始コドンは、senX3のTGA停止コドンをオーバラップする。この 反復された配列は、次の反復から推定されるATG開始コドンをオーバラップする ２つの停止コドンにより終結する。第２の反復のORFはまた、regX3のATG開始コ ドンをオーバラップする二重TGA停止コドンにより終結する。 Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のシストロン間領域は長く、そして完全ではない 第３の反復された配列を含む。それは、GAGにより置換されるヌクレオチド40〜6 6の短い同相内部欠失を含む。この第３の反復のORFはまた、regX3のATGコドンを オーバラップする二重停止コドンにより終結する。 Ｍ．レプラエのシストロン間領域の配列は、BCG（IPP）の配列よりも短い。そ れは52個の塩基対を含む。 senX3-regX3シストロン間領域における反復でのそれらの構造体の存在は、そ れがＭ．ツベルキュロシス(IPL)の他の領域に又はＭ．ボビスBCG（IPP）の染色 体に存在するかどうかを、サザンブロット分析による発見を発明者に導びいた。 Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のsenX3-regX3シストロン間領域を、EcoRＩ及びBamH ＩによるpRegX3Mt2の酵素消化により得た。次に、491個の塩基対のその得られる DNAフラグメントをBsrＩ−AluＩにより消化し、Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)のse nX3-regX3遺伝子間フラグメントに対応する218個の塩基対のDNAフラグメントを 生成した。次に、このDNAフラグメントを、製造業者(Boehringer Mannheim)の推 薦に従って、ジゴキシゲニン−dUTP(キットカタログ番号1093657)によりランダ ムにラベルした。pRegX3Mt2を、次のオリゴヌクレオチドを用いて、Ｍ．ツベル キュロシス22962067(IPL)の471個の塩基対の染色体DNAのフラグメントのPCRによ る第１の増幅により生成し：５’AAACACGTCGCGGCTAATCA３’及び５’CCTCAAAGCC CCTCCTTGCGC３’、そして次に、その得られる増幅されたフラグメントを、pBlue scriptKS^-のSmaＩ部位にクローン化した。 次に、Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)の染色体DNAを、PstＩにより完全に消化し 、そしてアガロスゲル上での電気泳動にゆだね、そして通常の方法(Sambrookな ど.，1989)に従ってサザンブロットにより分析した。次に、ラベルされたプロー ブを、下記に示されるようにハイブリダイゼーションのために使用した。 プローブを最初に、５分間、煮沸することによって変性し、そして膜を、68℃ で２時間のプレハイブリダイゼーションの後、68℃で一晩プローブと共にインキ ュベートした。プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションのため に使用される緩衝液は、５×SSC(Sambrookなど.，1989)；0.1％のＮ−ラウリル サルコシン（ ｗ／ｖ）；0.02％のSDS(ｗ／ｖ)；１％のブロッキング試薬(Boehringer Mannhei m)であった。次に、膜を、２×SSC(Sambrookなど.，1989)及び0.1％SDSにより周 囲温度で５分間２度、及び0.1×SSC、0.1％SDSにより68℃で15分間２度、洗浄し た。ハイブリダイズされたプローブを、アルカリホスファターゼ及び化学発光CS PD基質(Boehringer Mannheim)に接合されるアンチジゴキシゲニンFabフラグメン トにより免疫学的に検出した 図５に見られるように、senX3-regX3シストロン間領域の異なったコピーが、 Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)及びＭ．ボビスBCG（IPP）に存在した。 例５：マイクロバクテリアの異なった株のsenX3-regX3シストロン間領域のPCR による増幅 senX3及びregX3遺伝子を分離するシストロン間領域がＭ．ボビスBCG（IPP） 、Ｍ．ツベルキュロシス(IPL)及びＭ．レプラエ間で長さにおける変動を有する 場合、本発明者は、Ｍ．ボビス（非−BCG株を包含する）及びＭ．ツベルキュロ シスの他株におけるその対応する領域を分析した。本発明者は同様に、マイコバ クテリアの次の他の種を分析した：（ｉ）Ｍ．ツベルキュロシス複合体の他のメ ンバー：Ｍ．アフリカナム及びＭ．ミクロチ、及び（ii）Ｍ．ツベルキュロシス 複合体のマイコバクテリア以外のマイコバクテリア。 分析される株は表１及び２に示される。それらの染色体DNAを下記のようにし て調製した。マイコバクテリアを、100mlの培養物から出発して、遠心分離(300 回転／分；30分)により回収し、そして10mlのリン酸緩衝液(0.4Ｍのスクロース 、10mMのEDTA、トリス−HCl(pH８)10mM、４mg／mlのリゾチーム)において37℃で １時間インキュベートした。得られるプロトプラストを、遠心分離（3000回転／ 分；20分）により回収し、そして次に、それらを、６mlのＬ緩衝 液（10mMのNaCl、SDS６％、10mMのトリス−HCl(pH８)、500μｇ／mlのプロティ ナーゼＫ）において60℃で１時間、インキュベートすることによって溶解した。 ５ＭのNaCl 1.5mlの添加の後、その混合物を遠心分離した（14,000回転／分；20 分）。上清液を、フェノール−クロロホルムによる抽出にゆだね、そしてDNAを イソプロパノールにより沈殿せしめた。次に、再懸濁されたペレットをRNアーゼ により処理し、フェノール−クロロホルム及び、クロロホルムにより抽出し、そ して次に、エタノールにより沈殿せしめた。次に、ペレットを空気中で乾燥せし め、そして100μｌのTE緩衝液（10mMのトリス−HCl、１mMのEDTA、pH7.6）に再 懸濁した。 PCR分析のためのプライマーを、Ｍ．ボビスBCG（IPP）及びＭ．ツベルキュロ シス(IPL)のsenX3及びregX3遺伝子のDNA配列から選択した。プライマー（Ｃ５） は、senX3遺伝子の３’末端にハイブリダイズし、そして次の５’−３’配列を 有した：５’GCGCGAGAGCCCGAACTGC３’。他のプライマー（Ｃ３）はregX3遺伝子 の５’末端にハイブリダイズし、そして次の５’−３’配列を有した：５’−GC GCAGCAGAAACGTCAGC−３’。それらの２種のプライマーにより、PCR生成物は、遺 伝子間領域の５’末端で56個の追加の塩基対、及びシストロン間領域に関してそ の３’末端で62個の追加の塩基対を含む。そのPCR生成物は、Ｍ．ツベルキュロ シス22962067(IPL)のための369個の長さの塩基対、及びＭ．ボビスBCG（IPP）の ための276個の塩基対を有する。 PCR増幅を、次の反応混合物と共に１μｌの染色体DNAをインキュベートする ことによりサーモサイクラー（Perkin Elmer）において実施した：Ｃ５及びＣ３ オリゴヌクレオチド（それぞれ１μｇ／μｌ）、dTNP（２μｌ）25mM、TMACl(テ トラメチルアンモニウクロリド)(２μｌ)５mM、10×酵素緩衝液（10μｌ）、Ven t DNAポリメ ラーゼ（１Ｕ／0.5μｌ）、水（82μｌ）。増幅を、94℃で１分間、65℃で１分 間、及び72℃で１分間30サイクルにわたって実施した。次に、10μｌのPCR生成 物を、2.5％のアガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして臭化エチジウム により可視化した。DNAマトリックスを除くすべてのPCR試薬を含む負の対照を、 サンプルと共に平行して処理した。PCR生成物の長さを、１kbのDNA尺度との比較 により評価した。 PCR生成物は、試験された非結核マイコバクテリアの11の株に関しては検出さ れなかった（表２を参照のこと）。ストレプトミセス（Streptmyces）の３種の 株（Ｓ．カカオイ(S．cacaoi)、S．R61、及びS．R39）及びＥ．コリTG１は同様 に、PCRにおいて負の結果を付与した。他方では、PCR生成物が、Ｍ．ツベルキュ ロシス複合体のすべてのメンバーから得られた。PCR生成物の特異性を、例４に 記載のようにして、ジゴキシゲニンによりラベルされたＭ．ツベルキュロシス(I PL)のsenX3-regX3遺伝子間領域をプローブとして用いて、サザンブロット分析に よりすべての場合において確かめた。 増幅されたフラグメントの長さは表３に示される。異なったアンプリコン長さ を有する８種の異なったグループが得られた。試験されたＭ．ツベルキュロシス の35の臨床学的単離物のうち、34の単離物が、Ｍ．ツベルキュロシス22962067(I PL)（グループ５）の対照株により得られるフラグメントとは区別され得なかっ た329個の塩基対のPCRフラグメントを付与した。Ｍ．ツベルキュロシスの１つの 株（No.19）は、254個の塩基対のPCR生成物を付与した（グループ８）。Ｍ．ツ ベルキュロシスS200はまた、グループ５に属する。 ベトナム人からで、そしてIS6110配列を含まないＭ．ツベルキュロシスの株(V .808，V.761及びV.729)は、主要Ｍ．ツベルキュロシスグループ（グループ５） とは異なった。それらのPCR生成物の長 さは、500個の塩基対を越えた（＋／−500個の塩基対の１つの生成物、及び560 個の塩基対の２つの生成物）。Ｍ．ツベルキュロシスH37Ra及びH37Rvの実験用株 は、Ｍ．ツベルキュロシスの株のグループ５において得られた生成物よりもわず かに長いPCR生成物を有し、そしてそれらの２種の株はグループ４間で分類され る。それらの２種の株は、H37Rvに関する不確かな病原性及びH37Raの病原性の損 失が関係される限り、特殊である。さらに、Ｍ．ツベルキュロシスの臨床学的症 例はグループ４，６，８に存在せず；従って、それらの３種のグループは非ビル ラント株に対して特異的である。 BCG株(BCGitesの臨床学的症例のワクチン株及び単離物)は３種のグループ（N o.４，６及び８）に分けられた。それらの株から得られるPCR生成物は、それぞ れ長さ353個、276個及び199個の塩基対を有した。 PCRフラグメントの長さのレベルでの最とも重要な変動性は、Ｍ．ボビスの非 BCG株に関して遭遇した。対照株AN５を包含する、それらのうち３種の株は、406 個の塩基対のPCR生成物を付与した（グループ３）。３種の他の株は、それぞれ5 00、及び329又は254個の塩基対のPCRフラグメントに対応する、グループ２，５ 及び７にグループ分けられた。表１ ：Ｍ．ツベルキュロシス複合体 ⁺ Institut Pasteur de Lille⁺⁺ Institut Pasteur de Paris 表２：典型的でないマイコバクテリア表３：senX3-regX3遺伝子間領域のPCRによる増幅、及び配列決定 増幅されたDNAフラグメントは、senX3-regX3シストロン間領域、及びこの上流 の56個の塩基対及び下流の62個の塩基対を含んで成る。矢印77及び53は、個々の グループに見出される反復された要素 を示す。シストロン間領域が配列決定されている株は下線が引かれている。

【手続補正書】 【提出日】平成１１年３月１８日（１９９９．３．１８） 【補正内容】 請求の範囲 １．配列番号１の配列もしくは配列番号２の配列、又はそれらの相補的配列、 あるいは高い緊縮条件下で前記配列の１つとハイブリダイズすることができる配 列から選択されたヌクレオチドの配列を有する、Ｍ．ツベルキュロシス複合体（ Micobacterium tuberculosis complex）に属するマイコバクテリアに対して特異 的な核酸。 ２．配列番号１の配列もしくはその相補的配列、又は高い緊縮条件下で前記配 列の１つとハイブリダイズすることができる配列から選択されたヌクレオチドの 配列を有する、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に対して特異的な核酸。 ３．配列番号２の配列もしくはその相補的配列、又は高い緊縮条件下で前記配 列の１つとハイブリダイズすることができる配列から選択されたヌクレオチド配 列を有する、BCGとは異なる、Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーに対して 特異的な核酸。 ４．請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項記載の核酸の配列を含むクロー ニング及び／又は発現ベクター。 ５．それぞれ、番号I-1765又はI-1766としてCNCMに寄託されたプラスミドpReg X3Bc1又はpRegX3Mt1である請求の範囲第４項記載のベクター。 ６．請求の範囲第１項記載の配列のいづれか１つと特異的にハイブリダイズす るヌクレオチドプローブ又はヌクレオチドプライマー。 ７．請求の範囲第１項記載の配列から選択された24個の連続するヌクレオチド を含んで成る請求の範囲第６項記載のヌクレオチドプローブ。 ８．配列番号１の配列又はその相補的鎖を含んで成る請求の範囲第６項記載の ヌクレオチドプローブ。 ９．配列番号１の配列、続いて配列番号２の配列の２つの連続した配列を含ん で成る請求の範囲第６項記載のヌクレオチドプローブ。 10．位置40〜42でのGAGコドンを取り囲む配列番号２の配列、又はその相補的 鎖の領域に対応する配列を有する、BCGとは異なる、Ｍ．ツベルキュロシス複合 体のメンバーの核酸の特異的配列の検出のためのヌクレオチドプローブ。 11．配列番号２の配列の特異的位置40〜42でのGAGコドンの上流の９個の塩基 対及びその下流の９個の塩基対から構成される配列を有する請求の範囲第10項記 載のヌクレオチドプローブ。 12．配列番号２の配列又はその相補的鎖を有する請求の範囲第10項記載のヌク レオチドプローブ。 13．ジオキシゲニンによりラベルされる請求の範囲第６項記載のヌクレオチド プローブ。 14．senX3の３’側領域及びregX3の５’側領域におけるsenX3-regX3遺伝子間 領域に隣接する配列に対応するヌクレオチド配列を含んで成る、Ｍ．ツベルキュ ロシス複合体に属するマイコバクテリアの特異的ヌクレオチド配列の増幅のため のヌクレオチドプライマー。 15．19個のヌクレオチドを含んで成る請求の範囲第14項記載のプライマー。 16．配列：５’GCGCGAGAGCCCGAACTGC３’及び５’GCGCAGCAGAAACGTCAGC３’を 有する請求の範囲第14項記載のプライマー。 17．診断ヌクレオチドプローブ、又は酵素的増幅方法に使用され得るヌクレオ チドプライマーの生成のためへの請求の範囲第１項記載の配列の使用。 18．Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリアの株の検出又は診 断のためのインビトロの道具としての請求の範囲第６〜13のいづれか１項記載の プローブの使用。 19．生物学的サンプルにおけるＭ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバ クテリアの株の検出方法であって、下記段階： （ｉ）前記生物的サンプルと、請求の範囲第６，14〜16のいづれか１項記載の 一対のプライマーとを、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリア の株の特異的核酸に対して前記プライマーのハイブリダイゼーションを可能にす る条件下での接触せしめ； （ii）前記核酸を増幅し； （iii）請求の範囲第６〜13のいづれか１項記載のヌクレオチドブローブと前 記生物学的サンプルとを、前記プローブと前記増幅された核酸配列との間でのハ イブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下での接触せしめ；そして （iv）形成されるハイブリダイゼーション複合体を検出する； ことを含んで成る方法。 20．前記段階（iii）を請求の範囲第８項記載のヌクレオチドプローブにより 実施する請求の範囲第19項記載の方法。 21．請求の範囲第19項記載の生物学的サンプル中のBCG以外のＭ．ツベルトキ ュロシス複合体のメンバーの存在の検出方法であって、前記段階（iii）を請求 の範囲第10項記載のヌクレオチドプローブにより実施することを特徴とする方法 。 22．生物学的サンプル中のBCG及びＭ．ツベルキュロシス複合体の他のメンバ ーの検出及び分別の方法であって、請求の範囲第20項記載の検出方法を実施する こと、並びにハイブリダイゼーション複合体を形成できる増幅された核酸間で、 請求の範囲第10項記載のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション複合体 を同様に形成できる核酸を見出すために調査を実施すること、を特徴とする方法 。 23．免疫欠損対象においてＭ．ツベルキュロシス複合体のビルレントマイコバ クテリウムによる感染とBCGによる感染とを識別するための請求の範囲第21又は2 2項記載の方法。 24．前記免疫欠損対象がHIVにより感染されている対象である請求の範囲第23 項記載の方法。 25．Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリウムのグループの同 定方法であって、 （１）請求の範囲第６，14〜16のいづれか１項記載の一対のプライマーにより 前もって抽出された前記株のDNAと、請求の範囲第１項記載の配列の１つとを、 プライマーとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触せしめ 、そして幅幅生成物を獲得し、そして （２）前記得られる増幅生成物の長さを測定する； ことを特徴とする方法。 26．請求の範囲第16項記載の一対のプライマーを使用する請求の範囲第25項記 載の方法。 27．生物学的サンプル中のＭ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテ リウムの株のインビトロ同定のためのキットであって、 （１）請求の範囲第６，14〜16のいづれか１項記載の一対のプライマー；及び （２）核酸の配列の増幅を可能にするために必要な試薬； を含んで成るキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マグダレーナ，ジュアーナ フランス国，エフ―59000 リール，ブー ルバール デュ マル バイラン，16 (72)発明者 スプリー，フィリップ ベルギー国，ベー―7500 トゥールネ，リ ュ ドゥ ノール，76 (72)発明者 ロシュ，キャミーユ フランス国，エフ―59830 ワンネエン, リュ ドゥ ベール プレ，１ (54)【発明の名称】 Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーであるマイコバクテリアに対して特異的である核酸のフ ラグメント、及びＭ．ツベルキュロシス複合体のメンバーの検出及び示差診断のためへのそれら の適用

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号１の配列、配列番号２の配列、それらの相補的配列、又は高い緊 縮条件下で前記配列の１つとハイブリダイズすることができる核酸の配列から選 択されたヌクレオチドの配列を含んで成る、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属す るマイコバクテリアに対して特異的な核酸のフラグメント。 ２．配列番号１の配列、その相補的配列、又は高い緊縮条件下で前記配列の１ つとハイブリダイズすることができる核酸の配列から選択されたヌクレオチドの 配列を含んで成る、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に対して特異的な核酸のフラグ メント。 ３．配列番号２の配列、その相補的配列、又は高い緊縮条件下で前記配列の１ つとハイブリダイズすることができる核酸の配列から選択されたヌクレオチドの 配列を含んで成る、BCGとは異なる、Ｍ．ツベルキュロシス複合体のメンバーに 対して特異的な核酸のフラグメント。 ４．請求の範囲第１項記載の核酸の配列を含むクローニング及び／又は発現ベ クター。 ５．それぞれ、番号I-1765及びI-1766としてCNCMに寄託されたプラスミドpReg X3Bc1又はpRegX3Mt1であることを特徴とする請求の範囲第４項記載のベクター。 ６．請求の範囲第１項記載の配列、その対応するRNA配列、又はその対応する 遺伝子のいづれか１つと特異的にハイブリダイズすることを特徴とするヌクレオ チドプローブ又はヌクレオチドプライマー。 ７．請求の範囲第１項記載の核酸の配列から選択された24個の連続したヌクレ オチドを含んで成る請求の範囲第６項記載のヌクレオ チドプローブ。 ８．配列番号１の配列又はその相補的鎖を含んで成ることを特徴とする請求の 範囲第６項記載のヌクレオチドプローブ。 ９．配列番号１の配列、続いて配列番号２の配列の２つの連続した配列を含ん で成ることを特徴とする請求の範囲第６項記載のヌクレオチドプローブ。 10．位置40〜42でのGAGコドンを取り囲む配列番号２の配列、又はその相補的 鎖の領域に対応する配列であることを特徴とする、BCGとは異なる、Ｍ．ツベル キュロシス複合体のメンバーの核酸の特異的配列の検出のためのヌクレオチドプ ローブ。 11．配列番号２の配列の特異的位置40〜42でのGAGコドンの上流の９個の塩基 対及びその下流の９個の塩基対から構成される配列であることを特徴とする請求 の範囲第10項記載のヌクレオチドプローブ。 12．配列番号２の配列又はその相補的鎖であることを特徴とする請求の範囲第 10項記載のヌクレオチドプローブ。 13．ジオキシゲニンによりラベルされることを特徴とする請求の範囲第６項記 載のヌクレオチドプローブ。 14．senX3の３’側領域及びregX3の５’側領域におけるsenX3-regX3遺伝子間 領域に隣接する配列に対応するヌクレオチド配列を含んで成る、Ｍ．ツベルキュ ロシス複合体に属するマイコバクテリアの特異的ヌクレオチド配列の増幅のため のヌクレオチドプライマー。 15．19個のヌクレオチドを含んで成ることを特徴とする請求の範囲第14項記載 のプライマー。 16．プライマー：５’GCGCGAGAGCCCGAACTGC３’及び５’GCGCAGCAGAAACGTCAGC ３’の対であることを特徴とする請求の範囲第14項 記載のプライマー。 17．診断ヌクレオチドプローブ、又は酵素的増幅方法に使用され得るヌクレオ チドプライマーの生成のためへの請求の範囲第１項記載の配列の使用。 18．Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリアの株の検出又は診 断のためのインビトロ道具としての請求の範囲第６〜13のいづれか１項記載のプ ローブの使用。 19．生物学的サンプルにおけるＭ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバ クテリアの株の検出方法であって、下記段階： （ｉ）前記生物的サンプルと、請求の範囲第６，14〜16のいづれか１項記載の 一対のプライマーとの、Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリア の株の特異的核酸に対して前記プライマーのハイブリダイゼーションを可能にす る条件下での接触； （ii）前記核酸の増幅； （iii）請求の範囲第６〜13のいづれか１項記載のヌクレオチドブローブと前 記生物学的サンプルとの、前記プローブと核酸の増幅された配列との間でのハイ ブリダイゼーション複合体の形成を可能にする条件下での接触； （iv）形成されるハイブリダイゼーション複合体の検出を含んで成る方法。 20．前記段階（iii）が請求の範囲第８項記載のヌクレオチドプローブにより 実施されることを特徴とする請求の範囲第19項記載の方法。 21．請求の範囲第19項記載の生物学的サンプルにおけるBCG以外のＭ．ツベル トキュロシス複合体のメンバーの存在の検出方法であって、前記段階（iii）が 請求の範囲第10項記載のヌクレオチドプローブにより実施されることを特徴とす る方法。 22．生物学的サンプルにおけるBCG及びＭ．ツベルキュロシス複合体の他のメ ンバーの検出及び示差診断方法であって、請求の範囲第20項記載の検出方法が実 施され、そして調査が、ハイブリダイゼーション複合体を形成できる増幅された 核酸間で、請求の範囲第10項記載のヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーシ ョン複合体を同様に形成できる核酸を見出すために実施されることを特徴とする 方法。 23．免疫欠損対象においてＭ．ツベルキュロシス複合体のビルレントマイコバ クテリアによる感染とBCGによる感染とを識別するための請求の範囲第21又は22 項記載の方法。 24．前記免疫欠損対象がHIVにより感染されている対象であることを特徴とす る請求の範囲第23項記載の方法。 25．Ｍ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバクテリアのグループの同定 方法であって、 −請求の範囲第６，14〜16のいづれか１項記載の一対のプライマーにより前も って抽出された前記株のDNAが、請求の範囲第１項記載の配列の１つと前記プラ イマーとの特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触せしめ、そ して幅幅生成物を獲得し、そして −前記得られる増幅生成物の長さが測定されることを特徴とする方法。 26．請求の範囲第16項記載の一対のプライマーが使用されることを特徴とする 請求の範囲第25項記載の方法。 27．生物学的サンプルにおけるＭ．ツベルキュロシス複合体に属するマイコバ クテリアの株のインビトロ同定のためのキットであって、 −請求の範囲第６，14〜16のいづれか１項記載の一対のプライマ ー； −核酸の配列の増幅を可能にするために必要な試薬を含んで成るキット。