KR20010043009A - 약독수증 바이러스 오카주의 유전자 62와 이 유전자 62를이용하는 약독생수증 백신용 바이러스주의 동정방법 - Google Patents

Abstract

배열번호1의 염기배열을 가지는 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62:

적어도 이하의(a)∼(d)의 염기치환: (a)2110번 염기 A가 G; (b)3100번 염기 A가 G; (c)3818번 염기 T가 C; 및 (d)4006번 염기 A가 G; 와 약독생수증 백신을 위한 바이러스 균주로서 치환될 수 있는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.

Description

약독수증 바이러스 오카주의 유전자 62와 이 유전자 62를 이용하는 약독생수증 백신용 바이러스주의 동정방법{Gene 62 of oka vaccine virus and method for identifying virus strain for live attenuated vaccine virus using the gene 62}

<110＞ Yasushi HIGASHI;THE RESEARCH FOUNDATION FOR MICROBIAL DISEASES OF OSAKA UNIVERSITY

＜120＞ Gene 62 of Oka Vaccine Virus and Method for Identifying Virus Str ain for Live Attenuated Vaccine Virus Using the Gene 62

＜150＞ PCT/JP99/05476

＜151＞ 1999-10-05

＜160＞ 3

＜170＞ KopatentIn 1.55

＜210＞ 1

＜211＞ 4226

＜212＞ DNA

＜213＞ Varicella-Zoster virus

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (229)..(4158)

＜400＞ 1atactatggt ccatgaactt cccgcctcga gtctcgtcca atcactacat cgtcttatca 60

ttaagaatat ttacacggtg acgacacggg gaggaaatat gcggtcgagg ggggggcaca 120

acacgtttta agtactgttg gaactccctc accaaccgca atcgcaatcc tttgaaggct 180

gcgagagcgt ttggaaaact cgggtacgtc taaattcacc ccagtgcg atg gat acg 237

Met Asp Thr 1

ccg ccg atg cag cgc tct aca ccc caa cgc gcg ggg tcg cct gat act 285

Pro Pro Met Gln Arg Ser Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser Pro Asp Thr

5 10 15

ttg gag tta atg gac ctg ttg gac gcg gcc gcc gcg gcc gcc gaa cac 333

Leu Glu Leu Met Asp Leu Leu Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu His

20 25 30 35

agg gcc cgg gtg gtc acc tcg agt cag cct gac gat cta cta ttt gga 381

Arg Ala Arg Val Val Thr Ser Ser Gln Pro Asp Asp Leu Leu Phe Gly

40 45 50

gag aac ggg gtc atg gtg gga cgg gaa cat gag atc gtt tca att ccc 429

Glu Asn Gly Val Met Val Gly Arg Glu His Glu Ile Val Ser Ile Pro

55 60 65

tcc gta tcg gga ctt caa cca gaa ccc aga acg gaa gat gtt ggc gaa 477

Ser Val Ser Gly Leu Gln Pro Glu Pro Arg Thr Glu Asp Val Gly Glu

70 75 80

gag cta aca caa gac gac tac gta tgc gag gac ggt cag gat cta atg 525

Glu Leu Thr Gln Asp Asp Tyr Val Cys Glu Asp Gly Gln Asp Leu Met

85 90 95

ggc tcg cct gta atc ccg ctg gcc gag gtc ttc cac acc cga ttc tcg 573

Gly Ser Pro Val Ile Pro Leu Ala Glu Val Phe His Thr Arg Phe Ser

100 105 110 115

gag gcc ggc gcg cga gaa cca aca gga gcc gat cgc tcc ctc gag aca 621

Glu Ala Gly Ala Arg Glu Pro Thr Gly Ala Asp Arg Ser Leu Glu Thr

120 125 130

gtc tct ctc gga acg aag ctt gct agg tct cca aaa cca ccg atg aac 669

Val Ser Leu Gly Thr Lys Leu Ala Arg Ser Pro Lys Pro Pro Met Asn

135 140 145

gat ggg gaa acg ggc aga ggt acg acc cct ccg ttc ccg cag gcc ttc 717

Asp Gly Glu Thr Gly Arg Gly Thr Thr Pro Pro Phe Pro Gln Ala Phe

150 155 160

tcc cct gta tcc ccc gcg tct cct gtt gga gac gcc gcc ggg aac gat 765

Ser Pro Val Ser Pro Ala Ser Pro Val Gly Asp Ala Ala Gly Asn Asp

165 170 175

caa cgg gaa gac cag cgg tct ata ccc cga caa acg acg aga gga aat 813

Gln Arg Glu Asp Gln Arg Ser Ile Pro Arg Gln Thr Thr Arg Gly Asn

180 185 190 195

tca cca ggt ttg ccg tcg gtg gtc cat cga gac aga caa act cag tcc 861

Ser Pro Gly Leu Pro Ser Val Val His Arg Asp Arg Gln Thr Gln Ser

200 205 210

atc tcg ggt aaa aag ccg ggc gat gag caa gcg ggt cat gcg cat gca 909

Ile Ser Gly Lys Lys Pro Gly Asp Glu Gln Ala Gly His Ala His Ala

215 220 225

tcg ggg gac gga gta gtt ctc cag aaa act caa cgg ccc gct cag gga 957

Ser Gly Asp Gly Val Val Leu Gln Lys Thr Gln Arg Pro Ala Gln Gly

230 235 240

aag agc ccg aag aaa aag act ttg aag gtt aag gtc cca ctc ccg gcg 1005

Lys Ser Pro Lys Lys Lys Thr Leu Lys Val Lys Val Pro Leu Pro Ala

245 250 255

cgg aaa ccc ggt gga cct gta ccc ggc ccg gtt gag caa ttg tac cac 1053

Arg Lys Pro Gly Gly Pro Val Pro Gly Pro Val Glu Gln Leu Tyr His

260 265 270 275

gtc ctt tcg gac agc gtt ccc gct aag ggg gca aag gcg gac ctg ccg 1101

Val Leu Ser Asp Ser Val Pro Ala Lys Gly Ala Lys Ala Asp Leu Pro

280 285 290

ttt gag acc gat gat acc cgc cca agg aaa cat gat gcc cgg ggt ata 1149

Phe Glu Thr Asp Asp Thr Arg Pro Arg Lys His Asp Ala Arg Gly Ile

295 300 305

aca cct cgc gtc cct gga cgt tcg tcg ggg ggc aaa cct aga gcg ttt 1197

Thr Pro Arg Val Pro Gly Arg Ser Ser Gly Gly Lys Pro Arg Ala Phe

310 315 320

ttg gcc ctg ccg gga aga tcc cac gca cca gac ccg att gag gat gac 1245

Leu Ala Leu Pro Gly Arg Ser His Ala Pro Asp Pro Ile Glu Asp Asp

325 330 335

agc cca gtg gag aaa aag cca aag agt cgt gag ttt gtt tcg tct tca 1293

Ser Pro Val Glu Lys Lys Pro Lys Ser Arg Glu Phe Val Ser Ser Ser

340 345 350 355

tcc tct tcc tcg tcg tgg gga tcg tca tcg gag gat gaa gac gat gaa 1341

Ser Ser Ser Ser Ser Trp Gly Ser Ser Ser Glu Asp Glu Asp Asp Glu

360 365 370

ccc cgg cgc gtt tcg gtg gga agt gaa act aca ggc agc agg tcc gga 1389

Pro Arg Arg Val Ser Val Gly Ser Glu Thr Thr Gly Ser Arg Ser Gly

375 380 385

cgc gaa cac gcc cct tcc ccg tca aat tcg gat gat tcg gac tca aat 1437

Arg Glu His Ala Pro Ser Pro Ser Asn Ser Asp Asp Ser Asp Ser Asn

390 395 400

gat ggt ggg tcg acg aaa caa aat atc caa ccg gga tat cga tcc atc 1485

Asp Gly Gly Ser Thr Lys Gln Asn Ile Gln Pro Gly Tyr Arg Ser Ile

405 410 415

agc ggt ccc gat ccg agg att cgt aag acc aaa cgt ctt gcg ggg gaa 1533

Ser Gly Pro Asp Pro Arg Ile Arg Lys Thr Lys Arg Leu Ala Gly Glu

420 425 430 435

ccg ggg cgc cag aga cag aaa tca ttt tcc ctg ccg cga tcc aga acc 1581

Pro Gly Arg Gln Arg Gln Lys Ser Phe Ser Leu Pro Arg Ser Arg Thr

440 445 450

ccg ata att ccc ccg gtg tcg ggg ccg ctc atg atg ccc gac gga agc 1629

Pro Ile Ile Pro Pro Val Ser Gly Pro Leu Met Met Pro Asp Gly Ser

455 460 465

cct tgg ccc gga tcg gcg ccc ctc cca tcc aac agg gtg cgg ttt gga 1677

Pro Trp Pro Gly Ser Ala Pro Leu Pro Ser Asn Arg Val Arg Phe Gly

470 475 480

ccg tcc ggg gag acc aga gag ggt cac tgg gag gat gag gct gtg aga 1725

Pro Ser Gly Glu Thr Arg Glu Gly His Trp Glu Asp Glu Ala Val Arg

485 490 495

gcg gcg cgg gct cgt tac gag gcc tca act gaa ccc gtg ccg ctt tac 1773

Ala Ala Arg Ala Arg Tyr Glu Ala Ser Thr Glu Pro Val Pro Leu Tyr

500 505 510 515

gtg ccg gag ttg gga gat ccg gct aga cag tac cgc gcg ctg att aac 1821

Val Pro Glu Leu Gly Asp Pro Ala Arg Gln Tyr Arg Ala Leu Ile Asn

520 525 530

ctg atc tac tgt cca gac aga gac cct ata gca tgg ctc cag aac ccc 1869

Leu Ile Tyr Cys Pro Asp Arg Asp Pro Ile Ala Trp Leu Gln Asn Pro

535 540 545

aag ctg acc ggt gtc aac tcg gcc ctg aac cag ttc tac caa aag ctg 1917

Lys Leu Thr Gly Val Asn Ser Ala Leu Asn Gln Phe Tyr Gln Lys Leu

550 555 560

ttg cca ccg gga cgg gcg ggt acc gcc gtt acg ggg agc gta gcg tct 1965

Leu Pro Pro Gly Arg Ala Gly Thr Ala Val Thr Gly Ser Val Ala Ser

565 570 575

ccc gtt ccg cat gta ggc gaa gcc atg gcc acg ggg gag gcc ctc tgg 2013

Pro Val Pro His Val Gly Glu Ala Met Ala Thr Gly Glu Ala Leu Trp

580 585 590 595

gct ctc ccc cac gcg gcc gcg gcc gtg gct atg agc cgt cgg tac gac 2061

Ala Leu Pro His Ala Ala Ala Ala Val Ala Met Ser Arg Arg Tyr Asp

600 605 610

cgg gcc caa aaa cac ttt atc cta cag agt ctc cgc aga gcc ttt gcc 2109

Arg Ala Gln Lys His Phe Ile Leu Gln Ser Leu Arg Arg Ala Phe Ala

615 620 625

agc atg gca tac ccc gag gca acg ggc tcc agt ccg gcg gcg cgg atc 2157

Ser Met Ala Tyr Pro Glu Ala Thr Gly Ser Ser Pro Ala Ala Arg Ile

630 635 640

tcc cgc ggt cac cct tct cca aca acc ccg gcc aca cag act ccc gac 2205

Ser Arg Gly His Pro Ser Pro Thr Thr Pro Ala Thr Gln Thr Pro Asp

645 650 655

cct cag ccg tcg gcc gcc gca cgc tct ctt tct gtg tgt cca ccg gat 2253

Pro Gln Pro Ser Ala Ala Ala Arg Ser Leu Ser Val Cys Pro Pro Asp

660 665 670 675

gat cgt tta cga act ccg cgc aag cgc aag tcc cag cca gtc gag agc 2301

Asp Arg Leu Arg Thr Pro Arg Lys Arg Lys Ser Gln Pro Val Glu Ser

680 685 690

aga agc ctc ctc gac aag att agg gag aca ccc gtc gcg gac gcc cgg 2349

Arg Ser Leu Leu Asp Lys Ile Arg Glu Thr Pro Val Ala Asp Ala Arg

695 700 705

gtt gca gac gat cat gtg gtt tcc aag gcc aag agg cgg gta tcc gag 2397

Val Ala Asp Asp His Val Val Ser Lys Ala Lys Arg Arg Val Ser Glu

710 715 720

ccc gtg acc atc acc tcg ggc cct gtg gtg gat ccc ccc gcc gta ata 2445

Pro Val Thr Ile Thr Ser Gly Pro Val Val Asp Pro Pro Ala Val Ile

725 730 735

acg atg cca ctt gac gga ccg gcc cca aac ggg gga ttt cgg cgt att 2493

Thr Met Pro Leu Asp Gly Pro Ala Pro Asn Gly Gly Phe Arg Arg Ile

740 745 750 755

ccc cgg ggg gcc ctg cat acc ccg gtc ccg tcg gac cag gct cgc aag 2541

Pro Arg Gly Ala Leu His Thr Pro Val Pro Ser Asp Gln Ala Arg Lys

760 765 770

gcg tac tgt acc ccc gaa acc atc gcc cgt ctg gtc gac gac cca ttg 2589

Ala Tyr Cys Thr Pro Glu Thr Ile Ala Arg Leu Val Asp Asp Pro Leu

775 780 785

ttt ccc acg gcc tgg cgc cct gcg cta agc ttt gat ccc ggc gcc ttg 2637

Phe Pro Thr Ala Trp Arg Pro Ala Leu Ser Phe Asp Pro Gly Ala Leu

790 795 800

gcg gaa atc gcc gct cgg cgt ccg ggc gga gga gac cga cgg ttt ggt 2685

Ala Glu Ile Ala Ala Arg Arg Pro Gly Gly Gly Asp Arg Arg Phe Gly

805 810 815

cca ccc agc gga gtg gag gcg ctg cga cgg agg tgc gcc tgg atg cgg 2733

Pro Pro Ser Gly Val Glu Ala Leu Arg Arg Arg Cys Ala Trp Met Arg

820 825 830 835

cag atc cca gac ccg gag gat gtg agg ctt ctg atc atc tac gat ccg 2781

Gln Ile Pro Asp Pro Glu Asp Val Arg Leu Leu Ile Ile Tyr Asp Pro

840 845 850

ttg ccc gga gag gac atc aac ggc ccc ctc gag agc acc ctc gcg aca 2829

Leu Pro Gly Glu Asp Ile Asn Gly Pro Leu Glu Ser Thr Leu Ala Thr

855 860 865

gat ccg gga ccg tca tgg agt cca tcc cga ggg gga ctg tct gtg gtc 2877

Asp Pro Gly Pro Ser Trp Ser Pro Ser Arg Gly Gly Leu Ser Val Val

870 875 880

ctg gca gcc ctg agt aac cgg ttg tgc ctg ccg agc act cat gcc tgg 2925

Leu Ala Ala Leu Ser Asn Arg Leu Cys Leu Pro Ser Thr His Ala Trp

885 890 895

gcc ggg aac tgg acc ggc ccg ccg gac gtg tcc gct ttg aac gcc cgg 2973

Ala Gly Asn Trp Thr Gly Pro Pro Asp Val Ser Ala Leu Asn Ala Arg

900 905 910 915

ggc gtt tta tta ctg tcg acc cga gac ctg gcc ttt gcc ggg gcc gtc 3021

Gly Val Leu Leu Leu Ser Thr Arg Asp Leu Ala Phe Ala Gly Ala Val

920 925 930

gag tat cta ggc tcg cgg ttg gcc tct gcc cgg cgc cgg ttg ctg gtg 3069

Glu Tyr Leu Gly Ser Arg Leu Ala Ser Ala Arg Arg Arg Leu Leu Val

935 940 945

ttg gac gcg gtg gcc ctc gag agg tgg ccc agg gat gga ccc gct ttg 3117

Leu Asp Ala Val Ala Leu Glu Arg Trp Pro Arg Asp Gly Pro Ala Leu

950 955 960

tct cag tat cac gtg tac gtc cgg gcc ccg gcg cga ccg gac gcc cag 3165

Ser Gln Tyr His Val Tyr Val Arg Ala Pro Ala Arg Pro Asp Ala Gln

965 970 975

gcc gtc gtc cga tgg cca gac tcg gcg gtc aca gaa gga ctc gcc cgg 3213

Ala Val Val Arg Trp Pro Asp Ser Ala Val Thr Glu Gly Leu Ala Arg

980 985 990 995

gcc gtg ttt gca tcg tcg cgc acc ttt ggg cca gcg agt ttt gct cgt 3261

Ala Val Phe Ala Ser Ser Arg Thr Phe Gly Pro Ala Ser Phe Ala Arg

1000 1005 1010

atc gag act gcg ttt gcc aac ctg tac ccg ggc gaa caa ccc ctg tgt 3309

Ile Glu Thr Ala Phe Ala Asn Leu Tyr Pro Gly Glu Gln Pro Leu Cys

1015 1020 1025

ttg tgc cgc ggt ggg aac gtc gca tac acc gtg tgt acc cgc gcg ggc 3357

Leu Cys Arg Gly Gly Asn Val Ala Tyr Thr Val Cys Thr Arg Ala Gly

1030 1035 1040

ccc aag acc cgc gtc ccc ctg tcg ccc cgt gaa tac cgg cag tac gtg 3405

Pro Lys Thr Arg Val Pro Leu Ser Pro Arg Glu Tyr Arg Gln Tyr Val

1045 1050 1055

ctg ccg ggt ttt gac ggt tgc aag gac ctc gcg cga cag tct cgg ggt 3453

Leu Pro Gly Phe Asp Gly Cys Lys Asp Leu Ala Arg Gln Ser Arg Gly

1060 1065 1070 1075

ctg ggg ctc ggg gca gcc gac ttt gtg gac gag gcg gca cat agc cac 3501

Leu Gly Leu Gly Ala Ala Asp Phe Val Asp Glu Ala Ala His Ser His

1080 1085 1090

cgc gca gca aac cga tgg ggc ctg ggt gcc gcg ctt cga ccc gtc ttc 3549

Arg Ala Ala Asn Arg Trp Gly Leu Gly Ala Ala Leu Arg Pro Val Phe

1095 1100 1105

ctt ccc gag gga cgg aga ccg ggg gcc gcc ggg ccg gag gcc ggc gac 3597

Leu Pro Glu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Ala Gly Pro Glu Ala Gly Asp

1110 1115 1120

gta ccc acc tgg gcg agg gtg ttt tgc cgc cac gcc ctg ctg gaa ccc 3645

Val Pro Thr Trp Ala Arg Val Phe Cys Arg His Ala Leu Leu Glu Pro

1125 1130 1135

gac cct gcc gca gaa cca ctc gtg ctt cca ccc gtg gcc ggt cgg tcg 3693

Asp Pro Ala Ala Glu Pro Leu Val Leu Pro Pro Val Ala Gly Arg Ser

1140 1145 1150 1155

gtg gcg ctg tat gcg tcg gcg gac gag gct cgg aat gcc ctc ccc ccg 3741

Val Ala Leu Tyr Ala Ser Ala Asp Glu Ala Arg Asn Ala Leu Pro Pro

1160 1165 1170

att ccc aga gta atg tgg ccg ccc ggt ttt ggg gcc gcg gag acg gtg 3789

Ile Pro Arg Val Met Trp Pro Pro Gly Phe Gly Ala Ala Glu Thr Val

1175 1180 1185

ttg gag ggg agc gac gga aca cgg ttc gtg ttc gga cac cac ggg ggc 3837

Leu Glu Gly Ser Asp Gly Thr Arg Phe Val Phe Gly His His Gly Gly

1190 1195 1200

tcg gaa cgg ccg gca gaa acc cag gcg ggg cga cag cgg cgc acc gca 3885

Ser Glu Arg Pro Ala Glu Thr Gln Ala Gly Arg Gln Arg Arg Thr Ala 1205

1210 1215

gac gac aga gaa cac gct ttg gag ccg gac gat tgg gag gtg ggg tgt 3933

Asp Asp Arg Glu His Ala Leu Glu Pro Asp Asp Trp Glu Val Gly Cys

1220 1225 1230 1235

gaa gac gcg tgg gac agc gag gag ggg ggc ggg gac gac ggg gac gca 3981

Glu Asp Ala Trp Asp Ser Glu Glu Gly Gly Gly Asp Asp Gly Asp Ala

1240 1245 1250

ccg ggg tca tcc ttt ggg gtg agc atc gtg tcg gtg gcc ccg ggt gtg 4029

Pro Gly Ser Ser Phe Gly Val Ser Ile Val Ser Val Ala Pro Gly Val

1255 1260 1265

ctg cga gac cgc cgg gtg ggc ttg cgc ccg gcg gtc aag gtg gag ctg 4077

Leu Arg Asp Arg Arg Val Gly Leu Arg Pro Ala Val Lys Val Glu Leu

1270 1275 1280

ttg tcc tcg tcc tcg tcc tcc gag gac gag gac gat gtg tgg gga ggg 4125

Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Glu Asp Glu Asp Asp Val Trp Gly Gly

1285 1290 1295

cgc ggg ggg agg agc ccc ccg cag agt cgg ggg tg acggagtccc 4170

Arg Gly Gly Arg Ser Pro Pro Gln Ser Arg Gly

1300 1305 1310

ctccttttct cgtgagcgcc actggcgcgc ggactgtttg ttgtttgtta ataaaa 4226

＜210＞ 2

＜211＞ 18

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Artificial Sequence

＜400＞ 2gatcaaagct tagcgcag 18

＜210＞ 3

＜211＞ 18

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ Artificial Sequence

＜400＞ 3cctatagcat ggctccag 18

수증·대상포진 바이러스(Varicella-Zoster virus; VZV. 이하 「수증 바이러스」 또는 「VZV」라 기재한다)는, 인간수증 및 대상포진의 원인바이러스이고, 그 약독주인 「약독수증 바이러스 오카주」(특공소 53-41202호 공보: Lancet 2: 1288-1290, 1974)유래의 바이러스를 유일한 시드(seed)로서 생 백신이 제조되고, 세계 각국으로 널리 사용되고 있다[Requirements for Varicella vaccine(Live) Adopted 1984: WHO Technical Report Series, No.725, pp.102-124, 1985].

이 약독생수증 백신의 안전성 및 유효성은, 현재, 제조승인 된 수증 시드 바이러스의 계대수의 제한(seed lot system)에 의해서 확보되어 있다. 즉, 시드 바이러스를 연속 계대 함으로써 약독 바이러스가 유전적으로 변화하여 병원성을 회복하는 것의 위험성을 회피하기 때문에, 시드 승인시의 계대수를 0대로 하고, 거기에서 총계대수 10대 이내의 바이러스를 백신으로서 이용하는 것이 의무로 되어 있다. 환언하면, 약독생수증 백신의 품질관리 및 품질보증은, 각 백신 제조자에 의한 시드 랏트 시스템의 준수에 의존하고 있다.

또, 건상아(健常兒;건강한 평균 아동)로서는 이 약독생수증 백신의 접종에 의해서 임상반응을 나타내는 것은 없지만, 피접종자가 면역기능에 장애가 있는 사람의 경우에는, 드물게 수증이나 대상포진을 발증하는 것이 있다. 그렇지만, 그와 같은 임상반응이, 백신접종에 의한 것인가, 혹은 야생형 수증 바이러스의 자연 감염에 의한 것인가는 특정 불능하였다. 따라서, 약독생수증 백신의 시드 바이러스인 약독수증 바이러스 오카주와 다른 야생형 VZV와의 상위를 분석하는 것이 역학적으로 중요하게 되고, 그 때문에 방법이 몇가지 제안되어 왔다. 즉, VZV 지놈유전자의 구조가 보고(Joumal of General Virology, 67: 1759-1816, 986)되어 있고, 예컨대, VZV주 사이의 DNA 염기배열의 차이(Joumal of Virology, 59: 660-668, 1986), 제한효소 PstI 사이트(site)의 유무(Japanese Joumal of Experimental Medicine, 59: 233-237, 1989), PCR(Polimerase chain reaction)을 이용하는 RFLP(restriction fragment length polymorphism)에 근거하는 판정(Joumal of Virology, 66: 1016-1020, 1992), 상기 PstI 사이트의 유무와 PCR 산물의 RFLP와의 조합(Joumal of Clinical Microbiolgy, 33: 658-660, 1995) 등에 근거하는 방법이 보고되어 왔다. 그렇지만, 이들 방법은 어느 것이나 각각 단독으로는 신뢰성이 낮아, 약독수증 바이러스 오카주와 다른 야생주를 정확히 구별하는 것은 곤란하였다.

이것에 대하여, 본 출원의 출원인은, 약독수증 바이러스 오카주와 다른 수증 바이러스주(예컨대, 공지의 야생주 및 자연감염의 수증환자로부터 분리한 신선한 야생주 등)에 관해서 광범한 유전자 해석을 하고, 양자 구별할 수 있는 8개의 요건을 특정함과 함께, 미지의 수증 바이러스가 이들 8요건 모두를 만족하는 경우에만,그것이 생수증 백신용의 약독수증 바이러스 오카주로서 허용할 수 있는 것을 찾아내고, 이미 특허출원하였다(WO97/43420호 공보. 이하, 선원발명으로 기재한다).

본 출원인들에 의한 선원발명의 방법은, 약독수증 바이러스 오카주와 다른 수증 바이러스주를 구별하는 것은 가능하지만, 약독수증 바이러스 오카주와 그 친주를 구별하는 것은 불가능했다. 또한 8개의 지표에 관해서 모두를 검사해야만 한기 때문에, 판정까지 많은 시간과 시간을 요한다는 문제도 존재했다.

본 출원의 발명자들은, 약독수증 바이러스 오카주와 그 친주를 구별할 수 있는 방법에 대해서 예의 연구를 거듭한 결과, 수증 바이러스의 유전자62의 변이를 검출함으로써, 약독수증 바이러스 오카주와, 그 친주 및 다른 야생형 수증 바이러스주를 간편하고 또한 확실히 구별할 수 있는 것을 찾아내었다.

본 출원의 발명은, 이러한 신규한 알아냄에 따라서 행해진 것으로서, 약독수증 바이러스 오카주에 특징적인 유전자62를 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

또한 본 발명은, 상기 유전자62가 코드(code)하는 단백질과 그 펩티드, 이들을 항원으로서 이용함에 의해 얻어지는 항체 및 세포상해성 T 임파구(CTL: cytotoxic T lymphocyte), 및 상기 유전자62를 갖는 약독수증 바이러스주를 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

더욱이 본 발명은, 유전자62의 변이의 유무를 지표로 하는 약독수증 바이러스주의 동정방법, 이 방법에 의해서 동정된 약독 바이러스주를 시드 바이러스로 하는 약독생수증 백신을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.

본 출원은, 약독수증(弱毒水痘) 바이러스 오카주(岡株;OKA strain)의 유전자62와, 이 유전자를 이용하는 약독생수증(弱毒生水痘) 백신(vaccine)용 바이러스주(이하, 「약독수증 바이러스주」라 기재함)의 동정방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는, 본 출원은 약독수증 생 백신의 유효성분으로서 사용되고 있는 약독수증 바이러스 오카주 및 그 유효성분으로서 허용 할 수 있는 약독수증 바이러스주를, 그 야생형 수증(水痘) 바이러스 오카주(이하, 「약독친주」 또는 「친주」라고 한다)나 다른 야생형 수증 바이러스주와 구별할 수 있는 유전자62와, 이 유전자62의 염기배열 등에 근거하는 약독수증 바이러스의 동정방법 등에 관한 것이다.

도 1의 상단은, 수증 바이러스 유전자62의 구성을 도시한 모식도이고, 하단은 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62로부터 얻은 9 클론(clone) 및 약독친주 유전자62의 배열분석 결과의 요약이다.

도 2는, 다음 각 수증 바이러스 유전자62 PCR 산물에 대한 RFLP 분석의 결과를 도시하는 아가로스 겔 전기영동 도이다. 레인 1:약독수증 바이러스 오카주, 레인 2:강독친주, 레인 3:하구주, 레인 4∼8:야생형 수증 바이러스, 레인9∼13:야생형 대상포진 바이러스. 또, 양측의 레인은 규격 마커(size marker)이다.

도 3은 약독수증 바이러스 오카주와 그 강독친주 각각의 유전자62 산물(IE62)에 의한 VZV 각 유전자 프로모터(promotor)의 활성화를 시험한 결과이다. A는 IE4를 코드하는 유전자4의 프로모터의 이펙터-플러스미드량 의존적인 활성을 도시하는 그래프이다. CV1 세포는, 일정량(0.25㎍)의 pCAT-IE4 및 다양한 량의 pVac-G62(□)또는 pPar-G62(●)를 코드런스펙트되어 있다. 이하. B는 IE62을 코드하는 유전자62, C는 DNA 폴리머라제를 코드하는 유전자28, D는 주요 DNA 조합 단백질 C(major DNA binding protein : MDBP)를 코드하는 유전자29, E는 당 단백질 C(glycoprotein C : gC)를 코드하는 유전자14, F는 gE를 코드하는 유전자68 각각의 프로모터 활성을 도시하는 그래프이다.

＜발명을 실시하기 위한 최선의 형태＞

수증 바이러스의 유전자62는 트랜스엑티베이션기능(전사를 트랜스로 활성화하는 기능)을 담당하는 유전자로서, 수증 바이러스 지놈의 전배열(Journal of General Virology, 67: 1759-1816, 1986)중의 염기번호 105142-109242의 영역에 존재하는 유전자이다. 이 유전자62는, 도 1상단에 도시한 바와 같이, 전사개시부위(transcription start site)부터 화살표 방향으로 전사가 진행하기 때문에, 지놈 전배열의 염기번호 109242-105142가 "+"스트랜드로 된다. 따라서, 배열번호1의 제1번 염기 "A"는 이 +스트랜드의 5'말단염기(지놈 전배열의 109242번 염기)에 해당한다. 또, 이하의 설명에 있어서는 지놈 전배열의 염기번호를 가리키는 경우가 있지만, 이 지놈 전배열로 가리켜지는 유전자62의 배열은 "-"스트랜드이기 때문에, 배열번호1로 나타내는 염기와는 상보적이다.

본 발명의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62는, 배열번호1의 염기배열에 있어서, 표 1에 나타낸 (a)∼(d)의 염기치환을 갖는 유전자이다. 또한, 이 약독수증 바이러스 균주 유전자62는, 상기 (a)∼(d)의 염기치환에 더하여, 표 1의 (e)∼(g)의 적어도 1이상의 염기치환을 갖는 유전자, 게다가 표 1의 (h)∼(o)의 적어도 1이상의 염기치환을 갖는 유전자이다.

또한, 본 발명의 약독수증 바이러스의 단백질은, 상기의 유전자62가 코드하는 단백질로서, 배열번호1의 아미노산 배열에 있어서 표 1에 나타내는 (A)∼(D)의 아미노산 치환을 갖는 단백질이다. 또한, 이 단백질은, 상기 (A)∼(D)의 아미노산 치환에 더하여, 표 1에 나타내는 (E)∼(H)의 적어도 1이상의 아미노산 치환을 갖는 단백질이다.

표 1

염기치환 아미노산 치환

(a) 2110번 A→B (A) 661번 Ser→Gly(b) 3110번 A→G (B) 958번 Arg→Gly(c) 3818번 T→C (C) 1197번 Val→Ala(d) 4006번 A→G (D) 1260번 Ile→Val(e) 1251번 A→G(f) 2226번 A→G(g) 3657번 A→G(h) 162번 T→C(i) 225번 T→C(j) 523번 T→C (E) 99번 Met→Thr(k) 1565번 T→C (F) 446번 Leu→Pro(l) 1763번 T→C (G) 512번 Val→Ala(m) 2652번 T→C(n) 4052번 T→C (H) 1275번 Leu→Ser(o) 4193번 T→C

이러한 아미노산 치환을 가지게 하는 염기치환을 갖는 유전자62를 보유하는 수증 바이러스 오카주는, 트랜스엑티베이터기능의 결손 혹은 감약(減弱)에 의해서 바이러스입자 형성에 필요한 단백질의 발현이 전체로서 저하하는 결과, 약독성으로 된다고 생각된다.

이러한 약독수증 바이러스 오카주 유전자62는, 예컨대 공지의 약독수증 바이러스 오카주(BIKEN Lot-65: (財)阪大微生物病硏究會, 또는 ATCC VR-795)로부터 정법에 의해 단리 할 수도 있다. 혹은, 후기의 방법에 의해서 동정된 약독수증 바이러스주로부터 단리할 수 있다.

본 발명의 DNA 단편은, 상기의 유전자62를 코드하는 DNA의 단편으로서, 염기치환부분을 포함하는 10염기대 이상의 DNA 단편이다. 이 DNA 단편은, 약독수증 바이러스 오카주 또는 본 발명의 방법에 의해서 새로이 동정된 약독수증 바이러스주의 지놈 DNA를 적당한 제한효소에 의해서 절단하는 등 방법에 의해 얻을 수 있다. 이 DNA 단편은, 예컨대, 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주를 강독친주나 다른 야생형 수증 바이러스주와 구별하기 위한 DNA 프로브(probe) 등으로서 이용할 수가 있다.

또한, 본 발명의 단백질은, 상기의 유전자62를, 예컨대 대장균이나 효모 등의 미생물로 발현시키는 것에 따라 얻을 수 있다. 즉, 미생물중에서 복제가능한 오리진(origin), 프로모터(promotor), 리보솜 결합부위, DNA 배열 클로닝부위, 터미네이터(terminator)등을 갖는 발현벡터에, 상기 유전자62의 코드영역을 포함하는 DNA 단편을 삽입 결합하여 발현벡터를 작성하고, 이 발현벡터로 숙주세포를 형질전환 한 후, 얻어진 형질전환체를 배양하면, 유전자62가 코드하고 있는 단백질을 미생물 내에서 대량생산할 수가 있다. 혹은, 다른 단백질과의 융합단백질로서 발현시킬 수도 있다. 얻어진 융합단백질을 적당한 프로테아제로 절단함으로써, 목적으로 하는 단백질부분만을 취득할 수도 있다.

이들 단백질은, 예컨대 항체나 CTL작성을 위한 항원으로서 쓸 수 있다.

본 발명의 펩티드는, 상기 단백질의 아미노산 배열에 있어서, 그 아미노산 치환부분을 포함하는 5아미노산 잔기 이상의 배열이다. 이들 펩티드도 또 항체나 CTL을 제작하기 위한 항원 등으로서 쓸 수 있다.

본 발명의 항체는, 상기 단백질 그 자체, 또는 그 부분 펩티드를 항원으로서, 공지방법에 의해, 폴리클로날항체 또는 모노크로날항체로서 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 CTL도, 상기의 단백질 그 자체, 또는 그 부분 펩티드를 항원으로서 공지방법에 의해 얻을 수 있다. 이들 항체 및 CTL은, 새롭게 분리된 약독수증 바이러스주의 동정방법에 쓸 수 있다.

본 발명의 약독수증 바이러스주는, 그 유전자62가, 상기의 약독수증 바이러스 오카주 유전자62와 같은 염기치환을 갖는 수증 바이러스주로서, 약독생수증 백신용 바이러스주로서 허용할 수 있는 바이러스주이다. 이러한 새로운 약독수증 바이러스주는, 상기 염기치환을 갖는 유전자62를 보유하는 수증 바이러스를 선택함에 의해 동정할 수가 있다. 구체적으로는, 예컨대 상기 DNA 단편 또는 항체 혹은 CTL을 쓴 방법에 의해, 야생형 수증 바이러스주로부터 감별할 수가 있다.

또한, 본 출원에 의해서 제공되는 방법, 즉, 배열번호1의 염기배열에 있어 적어도 2107번 염기로부터 2229번 염기까지의 DNA 배열을 제한효소 NaeI 및 BssHⅡ로 절단하고, 이 DNA 배열이 2또는 3단편화되는 수증 바이러스를 선택하는 방법에 의해서 동정할 수가 있다. 상기와 같이, 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62는, 2110번 염기 A가 G로 치환되어 있다. 또한, 2226번 염기 A가 G로 치환되어 있는 경우도 있다. 그 결과, 2110번 염기 A→G의 치환에 의해서 배열번호1의 2107-2112번 염기배열에는 제한효소 NaeI 인식부위 (GCCGGC)가 형성되고, 2226번 염기 A→G의 치환에 의해서 배열번호1의 2224-2229배열에 BssHⅡ 인식부위(GCGCGC)가 형성된다. 따라서, 적어도 배열번호1의 2107-2229번 염기까지의 DNA 배열을 상기 2종의 제한효소로 절단하면, 그 DNA 배열은, 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스 유래라면, 2또는 3으로 단편화된다. 한편, 야생형 수증 바이러스나, 약독수증 바이러스 오카주의 강독친주에서 유래하는 DNA 배열의 경우에는, 상기와 같은 염기치환이 없기 때문에, 상기 2종의 제한효소로 절단되지 않고 1단편대로 있다. 또, 제한효소로 절단하는 DNA 배열은, 예컨대 배열번호 2의 염기배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와 배열번호3의 염기배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 각각 프라이머로 하고, 동정대상으로 하는 수증 바이러스 유전자62를 주형으로 하는 PCR 법에 의해서 조제할 수가 있다.

본 발명의 약독생수증 백신은, 상기의 방법에 의해서 동정된 새로운 약독수증 바이러스주를 시드 바이러스로서 쓰는 것에 의해 제조된 백신이다. 이러한 생백신은, 약독수증 바이러스 오카주를 시드 바이러스로서 쓰는 기존의 약독생수증 백신과 같이 하여 제조할 수가 있다.

본 출원은, 상기 과제를 해결하는 발명으로서, 이하의 각 발명을 제공한다.

(1) 배열번호1의 염기배열에 있어서, 적어도 이하의 (a)∼(d)의 염기치환:

(a) 2110번 염기A가 G;

(b) 3100번 염기A가 G;

(c) 3818번 염기T가 C; 및

(d) 4006번 염기A가 G

를 갖는 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62.

(2) (a)∼(d)의 염기치환에 더하여, 이하의 {e}∼(g)의 적어도 1이상의 염기치환:

(e) 1251번 염기A가 G;

(f) 2226번 염기A가 G; 및

(g) 3657번 염기A가 G

를 갖는 상기 (1)의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62.

(3) (a)∼(d)의 염기치환, 및 (e)∼(g)의 적어도 1이상의 염기치환에 더하여, 이하의 (h)∼(o)의 적어도 1이상의 염기치환:

(h) 162번 염기 T가 C;

(i) 225번 염기 T가 C;

(j) 523번 염기 T가 C;

(k) 1565번 염기 T가 C;

(l) 1763번 염기 T가 C;

(m) 2652번 염기 T가 C;

(n) 4052번 염기 T가 C; 및

(o) 4193번 염기 T가 C

를 갖는 상기 (2)의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62.

(4) 상기 (1)부터 (3)의 어느 한 유전자62를 코드하는 DNA의 단편으로서, 염기치환부분을 포함하는 10염기대 이상의 배열로 이루어지는 DNA 단편.

(5) 상기 (1)의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자 62가 코드하는 단백질으로서, 배열번호1의 아미노산 배열에 있어서, 적어도 이하의 (A)∼(D)의 아미노산 치환:

(A) 628번 아미노산 잔기 Ser가 Gly;

(B) 958번 아미노산 잔기 Arg가 Gly;

(C) 1197번 아미노산 잔기 Val가 Ala; 및

(D) 1260번 아미노산 잔기 Ile가 Val

을 갖는 단백질.

(6) (A)∼(D)의 아미노산 치환에 더하여, 이하의 (E)∼(H)의 적어도 1이상의 아미노산 치환:

(E) 99번 아미노산 잔기 Met가 Thr;

(F) 446번 아미노산 잔기 Leu가 Pro;

(G) 512번 아미노산 잔기 Val이 Ala; 및

(H) 1275번 아미노산 잔기 Leu가 Ser

을 갖는 상기 (5)의 단백질.

(7) 상기 (5) 또는 (6)의 단백질의 일부이고, 그 아미노산 치환부분을 함유하는 5 아미노산 잔기 이상의 배열로 이루어지는 펩티드.

(8) 상기 (5) 또는 (6)의 단백질, 또는 상기 (7)의 펩티드를 항원으로서 이용함에 의해 얻어진 항체 또는 CTL.

(9) 바이러스 지놈의 유전자62가 상기 (1)부터 (3)의 어느 것인가 유전자62인 약독수증 바이러스주.

(10) 상기 (1)부터 (3)의 어느 것인가 유전자62의 염기치환과 동일한 염기치환을 갖는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.

(11) 상기 (4)의 DNA 단편이 하이브리다이즈(hybridize)하는 지놈 DNA를 보유하는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.

(12) 상기 (8)의 항체 또는 CTL에 의해 인식된 항원을 생산하는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.

(13) 배열번호1의 염기배열에서 적어도 2107번 염기부터 2229번 염기까지의 DNA 배열을 제한효소 NaeⅠ 및 BssHⅡ로 절단하고, 이 DNA 배열이 2또는 3단편화되는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.

(14) DNA 배열이, 배열번호2의 염기배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와 배열번호3의 염기배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 각각 프라이머(primer)로 하고, 수증 바이러스의 유전자62를 주형으로 하는 PCR 법에 의해서 조제된 DNA 배열인 상기(13)의 동정방법.

(15) 상기 (10)부터 (14)중 어느 한 방법에 의해서 동정된 약독수증 바이러스주.

(16) 상기 (9) 또는(15)의 약독수증 바이러스주를 시드 바이러스로 하는 약독수증 백신.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하고 또한 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이하의 예에 한정되는 것이 아니다.

실시예 1

약독수증 바이러스 오카주의 유전자62 및 그 강독친주의 유전자62의 염기배열을 결정했다. 약독수증 바이러스 오카주(생 백신주)는, BIKEN Lot-65[(財)阪大微生物病硏究會]를 사용했다. 강독친주(야생형 수증 바이러스 오카주)는, MRC-5세포로 계대증식시킨 것을 사용했다.

구체적으로는, 선원발명(WO97/43420호 공보)의 실시예 1에 기재한 방법에 따라서, 약독수증 바이러스 오카주 및 강독친주로부터 DNA를 추출하고, 더머스(Dumas) 주의 염기배열(J. Gen. Virol., 67: 1759∼1816, 1986)에 따라서 디자인한 프라이머를 써 각 유전자를 PCR법에 의해 증폭했다. 유전자62의 전장은, 3조의 프라이머(표 2에 나타내는 sense primer G62N1, G62N2, G62N3, 및 anti-sense primer G62R1, G62R2, G62R 3)를 이용하여, 각각 중복하는 3단편으로서 증폭했다. 또, 각 센스 프라이머는 그 5'말단에 M13 포워드(forward) (-38) 배열 (G62N1-3의 1-19번 염기)을 접속하고 있다. 또한 안티센스 프라이머는 그 5'말단에 M13 리버스(reverse)배열 (G62R1-3의 1-20번 염기)을 접속하고 있다.

표 2

프라이머 배 열 게이머 위치

G62N 5'-CCGAGCTCGAATT/CTAGATTCATAAAAACCGTTCCGC-3' 105103-105139XbaⅠ 절단부위G62N1 5'-TTTCCCAGTCACGACGTTGTTCATAAAAACCGTTCCGC-3' 105121-105139G62N2 5'-TTTCCCAGTCACGACGTTGCAGGCACAACCGGTTACTCAG-3' 106455-106475G62N3 5'-TTTCCCAGTCACGACGTTGTTTGGTCTTACGAATCCTCGG-3' 107844-107864G62R 5'-ACCTGATCAGAATTCTGCA/GAGCGGTCTCTCCTTAAACGC-3' 109381-109362PstⅠ 절단부위G62R1 5'-GGATAACAATTTCACACAGGTTCTGATCATCTACGATCCG-3' 106600-106581G62R2 5'-GGATAACAATTTCACACAGGCAAATTCGGATGATTCGGAC-3' 107950-107931G62R3 5'-GGATAACAATTTCACACAGGAGCGGTCTCTCCTTAAACGC-3' 109381-109362

PCR반응용액은, 각 데옥시 뉴클레오티드 3인산 200mM, 각 프라이머 0.3μM, 극미량의 주형 DNA, 2.5U의 Ex Taq(다까라주조사제)를 포함하는 50μL의 Ex Taq 버퍼(buffer)를 이용했다. 또한, 배열번호3 및 8의 프라이머를 쓰는 경우에는, 상기의 조성에 6% DMSO를 가했다. 증폭은, PCR 자동화장치(미국 Perkin-Elmer 사제)를 쓰고, 변성(94℃ : 1분간), 어닐링(Annealing; 55℃ : 1.5분간), 신장(72℃ : 2분간)을 30c사이클 했다.

다음에, PCR 정제 키트(독일 QIAGEN GmbH 사제)를 써 PCR 증폭산물과 프라이머를 분리하고, 정제 PCR 산물을 시크엔싱킷트(영국 Amersham 사제)를 써 배열결정하고, DNA 시퀀서(sequencer) 모델 4000L(미국 LI-COR 사제)로 분석했다. 또, 배열결정의 때는, 형광색소 IRO-40으로 표지한 M13 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머를 썼다.

또한, 같은 방법에 의해, 약독수증 바이러스 오카주 및 약독친주의 유전자 4, 14, 61의 배열결정도 행했다.

그 결과, 유전자 4, 14 및 61에 있어서는, 약독수증 바이러스 오카주와 강독친주와의 사이에서 염기배열의 다름은 인식되지 않았다. 한편, 표 3에 나타내는 바와 같이, 유전자62에 있어서는, 약독수증 바이러스 오카주는 15염기가 강독친주와 달랐다. 이들 염기치환은 T-C 또는 A-G이고, 8개소의 염기치환은 다른 아미노산 잔기를 코드하도록 두 가지의 염기가 혼재하고 있었다(표 3의 R). 또한, 약독수증 바이러스 오카주와 강독친주 유전자62는, 더머스주의 유전자62와는 9염기가 달랐다.

이상의 결과로부터, 약독수증 바이러스 오카주와 강독친주와는, 각각의 유전자62의 배열의 상위에 의해서 구별할 수 있음이 확인되었다.

표 3

지놈위치 백신주 친주 더머스주

105169 R(noncoding) A(noncoding) A105310 R(Ser/Leu) A(Leu) A105356 C(Val) T(Ile) T105451 G G A105512 C C A105544 G(Ala) A(Ala) A105705 C(Ala) T(Ala) T106262 C(Gly) T(Arg) T106710 R(Ala) A(Ala) A107316 C(Ala) T(Ala) T107165 T T C107252 C(Gly) T(Ser) T107303 C C T107599 R(Ala/Val) A(Val) A107607 A A C107715 C C T107797 R(Pro/Leu) A(Leu) A108111 C(Pro) T(Pro) T108747 G G A108838 R(Thr/Met) A(Met) A108951 A A G109044 G G C109137 R(silent) A(silent) A109200 R(silent) A(silent) A

실시예 2

약독수증 바이러스 오카주의 유전자62 및 그 강독친주의 유전자62의 각각 전장배열을 PCR법에 의해 증폭하고, 클로닝했다.

프라이머로서 표 1의 G62N 및 G62R의 올리고뉴클레오티드를 이용하고, 반응용액중에 6% DMSO를 더하고, 신장반응을 6분간으로 한 이외는 실시예 1과 동일한 방법에 의해 유전자62의 전장을 PCR법에 의해 증폭했다.

프라이머는, 각각 제한효소 XbaI 및 PstI 인식부위를 갖고 있기 때문에, 정제 PCR 산물을 이들 제한효소로 절단한 후, 동일효소로 미리 계열(開列)한 pUC19로 클로닝 했다. 이어서, 이들을 E. coli JM109에 도입한 후, 약독수증 바이러스 오카주 및 강독친주의 각각에 관해서 9개의 플러스미드를 각 형질전환체로부터 추출하고, 인서트(insert)의 배열을 결정했다.

결과는 도 1에 나타내는 바와 같다. 이 도 1로부터 명백하듯이, 약독수증 바이러스 오카주의 9 클론(clone)은, 15개소의 염기중 어느 복수가 강독친주와는 달랐다. 특히, 염기번호 1251, 2110, 2226, 3100, 3667, 3818 및 4006의 8염기는 전 클론에 있어서 달랐다. 한편, 강독친주의 9 클론에서는 상기 15개소를 포함해서, 모두 동일한 배열이었다.

실시예 3

여러가지의 수증 바이러스주의 유전자62의 부분배열의 RFLP분석을 했다.

약독수증 바이러스 오카주 및 강독친주는 실시예 1과 같은 것을 사용했다. 기타, 수증 바이러스 야생주인 카와구찌주(河口株; kawaguchi strain), 백신 미접종의 수증환자 5예 및 대상포진환자 5예 각각의 수포액으로부터 분리한 신선한 야생형 바이러스주 10검체를 사용했다. 또, 하구주 및 환자로부터 분리한 야생형 수증 바이러스주는 인간 HEL세포 또는 MRC-5세포로 2-3 대 계대의 후, 사용했다.

각 수증 바이러스의 유전자62는, 배열번호2 및 3의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하는 PCR법에 의해 증폭했다. 배열번호2의 올리고뉴클레오티드는, 수증 바이러스 유전자62(배열번호1)의 1846-1863번 염기에 대응하는 리버스 프라이머이고, 배열번호3의 올리고 뉴클레오티드는 2609-2620번 염기에 해당하는 포워드 프라이머이다. PCR 조건은, 신장시간을 1분간으로 한 이외는 실시예 1과 마찬가지로 했다. 얻어진 각 PCR 산물 3μL를, 4U의 NeaI(다까라주조사제)를 37℃, 1.5시간 반응시켜 절단하고, 이어서 4U의 BssHⅡ(다까라주조사제)를 50℃, 1.5시간 반응시켜 절단했다. 절단한 DNA단편은, 4% 아가로스 겔(NuSieve 3:1, FMC BioProducts 사제)로 전기영동하고, 에티듐 브로마이드 염색하여 분석했다.

결과는 도 2에 나타내는 바와 같다. 이 도 2에서 명백하듯이, 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62 유래의 PCR 산물(레인1)은, Nael 및 BssHⅡ에 의해서 3ro의 단편(402bp, 264bp, 116bp)로 절단되었다. 한편, 강독친주 및 환자로부터 분리한 신선한 야생형 바이러스주의 PCR 산물(레인2-13)은 이들 제한효소로서는 절단되지 않고, 1단편대로 있었다.

이상의 결과로부터, 수증 바이러스유전자62의 적어도 2107번 염기로부터 2229번 염기까지의 DNA배열을, 제한효소 NaeI 및 BssHⅡ에 의해서 절단하고, 이 DNA배열이 2 또는 3단편화되는 수증 바이러스를, 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스로서 허용되는 바이러스주로서 동정할 수 있는 것이 확인되었다.

실시예 4

유전자62 발현산물에서 8개소의 아미노산 변이와 그 트랜스엑티베이션 활성의 관계를 분석하기 위해서, VZV의 각 유전자의 프로모터 배열과 클로람페니콜 트랜스퍼라아제(CAT) 유전자를 갖는 리포터프라스미드와, 약독수증 바이러스 오카주 또는 강독친주의 유전자62를 보유하는 이펙터프라스미드를 코트랜스펙션한 세포에 있어서 CAT 어셈블리를 했다.

1.재료와 방법

1.1 프라스미드

유전자 4, 14, 28, 29, 62 및 68의 각 프로모터영역개시 코돈의 약 750염기상류의 배열을 포함하는 리포터프라스미드 pIE4-CAT, pgC­CAT, pPol-CAT, pMDBP-CAT, pIE62-CAT 및 pgE­CAT을 구축했다. 각 프로모터영역의 배열은, 5'끝에 NheI 또는 BglⅡ 부위를 갖는 프라이머를 쓴 PCR 법에 의해 약독 오카주 지놈으로부터 증폭했다. PCR 조건은, 신장시간을 1분간으로 한 이외는 실시예 1과 마찬가지로 했다. 증폭산물을 NheI 및 BglⅡ로 절단하고, pCAT3-베직프라스미드(Basicplasmid; 미국 Promega 사제)의 CAT 유전자의 상류에 삽입 결합했다.

이펙터프라스미드 pPar-G62는 강독친주의 유전자62 클론을 이용하여 구축했다. 또한 약독오카주의 유전자62로부터 얻은 9개의 클론으로부터, 도 1의 클론9(13염기치환과 8아미노산치환을 갖는 클론)를 선택하고, 이펙터프라스미드 pVac-G62를 구축했다.

1-2. 트랜스펙션

CV1세포를, 35-mm 플라스틱 접시에 10⁵세포/접시 의 비율로 배양하고, 이 세포에 슈퍼펙트(SuperFect; QIAGEN GmbH)를 이용한 리포펙션에 의해 각 프라스미드를 트랜스펙션했다. 트랜스펙션용의 각 반응용액에는, 0.25㎍의 리포터프라스미드와, 여러가지 량(0~1㎍)의 이펙터프라스미드를 포함시켰다. 또한, 각 트랜스펙션에 있어서는, 벡터 pUC19의 첨가에 의해서 DNA의 전량을 2.5㎍으로 일정하도록 했다. 모든 실험은, 각 DNA 트랜스펙션에 대하여 적어도 3회 행했다.

1-3. CAT어셈블리

트란스펙션으로부터 44시간후, 세포의 모든 단백질과 CAT 량을 측정했다. 세포를 인산완충 생리식염수로 3회 세정하고, 용해 버퍼(독일 Boehringer Mannheim Corporation 사제)로 용해했다. 각 용출물의 CAT 농도는, CAT 엘리사 키트(CAT ELISA Kit; 독일 Boehringer Mannheim Corporation 사제)로 결정하고, Bio-Rad 단백질시약(미국 Bio-Rad 사제)에 의해 결정한 단백질량에 대하여 표준화했다.

2. 결과

시험한 VZV 유전자의 모든 프로모터는, 대개 배경활성을 나타내었다. 즉, 이펙터프라스미드를 트랜스펙션하지 않은 경우에는, CAT의 발현은 거의 관찰되지 않았다.

약독오카주 유래의 유전자 4 프로모터는, 강독친주 및 약독오카주 각각의 유전자62 발현산물(IE62)에 의해서 트랜스엑티베이트 되었다(도 3A). 단, 이펙터프라스미드가 저량의 경우에는, 강독친주의 IE62가 약독오카주의 IE62보다도 강한 전사활성을 나타냈다. 즉, 이펙터프라스미드가 가장 저량(0.25㎍)의 경우에는, 강독친주 IE62의 전사활성은 약독오카주 IE62의 7.8배이고, 이펙터프라스미드량이 증가함에 따라서 양자의 배율은 작아졌다.

한편, 리포터프라스미드 pCAT-IE62를 트랜스펙션한 세포로부터는, CAT 활성은 거의 검출되지 않았다(도 3B).

더욱이, VZV 유전자 28 및 29 각각의 프로모터영역을 갖는 pCAT-Pol 및 pCAT-MDBP(도 3C 및 3D), 및 유전자 68의 프로모터배열을 갖는 pCAT-gE(도 3E)는, 강독친주 및 약독오카주의 IE62에 의해서 활성화되었다. 이들 CAT 활성의 양 의존곡선은 pCAT-IE4의 경우와 유사하고, 더구나, 약독오카주 IE62에 비교하여 강독친주 IE62의 쪽이 강한 활성을 나타냈다. 특히 이펙터프라스미드가 가장 저량의 경우, 강독친주 IE62의 활성은, 약독친주 IE62보다도, 각각, 7.6배, 5.6배 및 1.8배였다. 그러나, 유전자 14의 플로모터영역을 가지는 pCAT-gC를 트랜스펙션한 세포로서는 CAT 활성은 검출되지 않았다(도 3F).

이상의 결과로부터, VZV 유전자62의 발견산물(IE62)은, 앞 초기의 유전자4(ORF4), 초기의 유전자28(DNA 폴리머라아제; Pol) 및 유전자29(주요 DNA 결합 단백질: MDBP), 및 후기의 유전자68(당단백질 E: gE)의 프로모터를 활성화하는 것이 확인되었다. 더구나 보다 중요한 점은, 약독오카주 IE62의 전사활성은 항상 강독친주 IE62보다도 낮다고 하는 것이다. 즉, 약독오카주의 유전자62에 있어서의 변이가 바이러스복제에 영향하고, 이것이 VZV의 약독을 생기게 하고 있다고 생각된다.

본 출원의 발명에 의해서, 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스로서 허용되는 수증 바이러스주와, 다른 야생형 수증 바이러스 및 약독수증 바이러스 오카주의 강독친주를 간편하고 또한 정확히 구별하는 것이 가능해진다. 또한, 본 출원의 발명에 의해서, 생 백신용의 약독수증 바이러스항원을 대량 제조하는 것이 가능해진다. 이들 발명에 의해서, 백신제조 및 백신접종의 안전성 및 유효성이 더한층 확실한 것으로 된다.

Claims (16)

1. 배열번호1의 염기배열에 있어서, 적어도 이하의(a)∼(d)의 염기치환:

   (a)2110번 염기 A가 G;

   (b)3100번 염기 A가 G;

   (c)3818번 염기 T가 C; 및

   (d)4006번 염기 A가 G

   를 갖는 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62.
2. (a)∼(d)의 염기치환에 더하여, 이하의(e)∼(g)의 적어도 1이상의 염기치환:

   (e)1251번 염기 A가 G;

   (f)2226번 염기 A가 G; 및

   (g)3657번 염기 A가 G

   를 갖는 청구항 1의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62.
3. (a)∼(d)의 염기치환, 및(e)∼(g)의 적어도 1이상의 염기치환에 더하여, 이하의(h)∼(o)의 적어도 1이상의 염기치환:

   (h)162번 염기 T가 C;

   (i)225번 염기 T가 C;

   (j)523번 염기 T가 C;

   (k)1565번 염기 T가 C;

   (l)1763번 염기 T가 C;

   (m)2652번 염기 T가 C;

   (n)4052번 염기 T가 C; 및

   (o)4193번 염기 T가 C

   를 갖는 청구항 2의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62.
4. 청구항 1에서 3중 어느 하나의 유전자62를 코드하는 DNA의 단편으로서, 염기치환부분를 포함하는 10염기대 이상의 배열로 이루어지는 DNA 단편.
5. 청구항 1의 약독수증 바이러스 오카주의 유전자62가 코드하는 단백질로서, 배열번호1의 아미노산 배열에 있어서, 적어도 이하의(A)∼(D)의 아미노산치환:

   (A)628번 아미노산잔기 Ser가 Gly;

   (B)958번 아미노산잔기 Arg가 Gly;

   (C)1197번 아미노산잔기 Val이 Ala; 및

   (D)1260번 아미노산잔기 IIe가 Val

   을 갖는 단백질.
6. (A)∼(D)의 아미노산치환에 더하여, 이하의(E)∼(H)의 적어도 1이상의 아미노산 치환:

   (E)99번 아미노산 잔기 Met가 Thr;

   (F)446번 아미노산 잔기 Leu가 Pro;

   (G)512번 아미노산 잔기 Val이 Ala; 및

   (H)1275번 아미노산 잔기 Leu가 Ser

   을 갖는 청구항 5의 단백질.
7. 청구항 5 또는 6의 단백질의 일부이고, 그 아미노산 치환부분을 포함하는 5아미노산 잔기 이상의 배열로 이루어지는 펩티드.
8. 청구항 5 또는 6의 단백질, 또는 청구항 7의 펩티드를 항원으로서 이용하는 것에 의해 얻어진 항체 또는 세포상해성 T 임파구.
9. 바이러스 지놈의 유전자62가 청구항 1에서 3중 어느 하나의 유전자62인 약독수증 바이러스주.
10. 청구항 1에서 3중 어느 하나의 유전자62의 염기치환과 동일한 염기치환을 갖는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.
11. 청구항 4의 DNA 단편이 하이브리다이즈하는 지놈 DNA를 보유하는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.
12. 청구항 8의 항체 또는 세포상해성 T 임파구에 의해서 인식되는 항원을 생산하는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.
13. 배열번호1의 염기배열에서 적어도 2107번 염기에서 2229번 염기까지의 DNA 배열을 제한효소 NaeI 및 BssHⅡ로 절단하고, 이 DNA 배열이 2또는 3단편화되는 수증 바이러스를 선택하는 것을 특징으로 하는 약독수증 바이러스 오카주 또는 약독수증 바이러스주의 동정방법.
14. DNA 배열이, 배열번호2의 염기배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드와 배열번호3의 염기배열로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 각각 프라이머로 하고, 수증 바이러스의 유전자62를 주형으로 하는 PCR 법에 의해서 조제된 DNA 배열인 청구항 13의 동정방법.
15. 청구항 10에서 14중 어느 한 방법에 의해서 동정된 약독수증 바이러스주.
16. 청구항 9 또는 15의 약독수증 바이러스주를 시드 바이러스로 하는 약독생수증 백신.