KR101702956B1 - 다수의 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2개 이상의 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터와 이 벡터를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 상동성 뉴클레오티드 서열 내의 염기들을 엔코딩된 아미노산 서열을 변형시키지 않는 상이한 염기들로 치환하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 상동성 뉴클레오티드 서열들 간의 분자내 재조합, 특히 포유동물 세포내에서의 상동성 뉴클레오티드 서열들 간의 분자내 재조합을 감소시킨다. 본 발명은 또한 치환된 염기들을 함유하는 뉴클레오티드 서열과 관련이 있다.

Description

다수의 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터{VECTOR COMPRISING MULTIPLE HOMOLOGOUS NUCLEOTIDE SEQUENCES}
본 발명은 재조합 벡터와 이들을 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
핵산의 상동성 재조합 현상은 상동성 서열 내의 핵산 가닥들의 물리적 파열과 십자형 재결합(crosswise rejoining)을 포함한다. 포유동물 세포에서 재조합과 유전자 전환은 적절하게 작제된 바이러스 또는 플라스미드 기질로의 감염 후 선별가능한 유전자의 재구성을 모니터링한 다수의 연구 그룹에 의해 연구되었다. (Chakrabarti et al., Mol. Cell. Biol. 6:2520-2526, 1986). 이러한 실험들의 결과는 세포가 분자내(intra)- 및 분자간(intermolecular) 재조합 및 유전자 전환을 효율적으로 지탱한다는 것을 제시한다. (Id.) 분자간 재조합은 2개의 상이한 핵산 분자 상에 존재하는 상동성 서열들 간의 재조합을 의미하며, 한편 분자내 재조합은 단일 핵산 분자 상에 존재하는 상동성 서열들 간의 재조합을 의미한다.
분자간 재조합은 플라스미드 또는 바이러스 내의 유전자들 간 및 세포 내의 상동성 서열들 간에서 일어날 수 있다. (Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902, 1986.) 이러한 유형의 재조합은 약독화된 바이러스로부터의 감염성 바이러스의 생성을 초래할 수 있다. 풀러 등[Fuller et al.]은 HIV-1 gag 및 HIV-1 pol 유전자의 분리된 서열을 코돈-최적화시켜 포유동물 세포에서의 이의 발현을 증가시켰다. 또한 이러한 최적화는 HIV의 gag-pol 유전자 내에 존재하는 약 200개 염기쌍의 중첩 영역 내의 뉴클레오티드의 동일성을 감소시켰으며, 이것은 또한 2개의 독립된 플라스미드 상에 위치한 gag 및 pol 개방해독틀과 재조합 레트로바이러스 벡터 내에 포함된 트렁케이션(truncation)된 gag 유전자 사이의 분자간 재조합 수준을 감소시키는 결과를 초래하였다. (Fuller et al., Hum. Gene Ther. 12:2081-2093, 2001.)
분자내 재조합은 유전자의 중복된 영역 또는 유전자 단편이 개입(intervening) 서열에 의해 이격된 직접 반복부(direct repeats)로서 존재하는 벡터를 이용하여 일어날 수 있다. 이러한 유형의 재조합은 일반적으로 개입 서열 및 반복된 서열의 한 복제물의 결실을 야기시킨다. 분자내 재조합의 빈도는 일반적으로 분자간 재조합보다 훨씬 더 높다.
플라스미드 벡터 내의 분자내 재조합의 수준이 포유동물 세포에서 정량되었다. (Rubnitz and Subrami, Mol. Cell. Biol. 4:2253-2258, 1984.) 상동성 영역의 크기에 따라, 형질감염된 플라스미드 DNA 내부의 분자내 재조합 빈도는 0.306% 내지 0.002% 사이에서 달라진다. (Id.) 낮은 재조합 효율은 상동성이 14개 염기 정도로 작을 때 확인되었다. (Id.)
또한 상동성 서열들 간의 분자내 재조합이 피코르나바이러스, 인플루엔자바이러스, 아데노바이러스, 및 폭스바이러스를 포함하는 다수의 동물 바이러스에서 보고되었다. (Gritz et al., J. Virol. 64:5948-5957, 1990). 백시니아 바이러스에서, 앞뒤 나란히(tandemly) 중복된 서열은 유전적으로 불안정한 것으로 드러났다. (Id.) 바이러스에서, 분자내 재조합 수준은 플라스미드 벡터에서 확인된 수준 보다 훨씬 더 높다는 것이 드러났다.
예를 들어, 레트로바이러스에서, 동일 RNA 분자 내의 2개의 동일한 서열들 시이의 재조합 빈도는 약 62%인 것으로 확인되었다. (Zhang et al., J. Virol. 75:6348-6358, 2001). 이러한 재조합의 99%는, 분자간(2개의 RNA 분자들 간) 재조합이 아니라, 분자내(한 RNA 분자 상의 2개의 서열들 간) 재조합이었다. (Id.) 아데노-부속 바이러스로, 분자내 재조합은 또한 분자간 재조합보다 훨씬 더 효율적인 것으로 밝혀졌다. (Choi et al., J. Virol. 79:6801-6807, 2005). 단순포진바이러스 타입 1은 또한 높은 수준의 재조합을 나타내는 것으로 드러났다. (Dutch et al., J. Virol. 66:277-285.) 폭스바이러스에서, 높은 빈도의 상동성 재조합이 확인되었다. 실험실 시스템을 사용하여 1.5 kb의 DNA의 2개의 직접 반복부들 사이에 티미딘 키나아제(tk) 유전자를 위치시킴으로써 백시니아 바이러스에서 재조합을 측정하였다. (Ball, J. Virol. 61:1788-1795, 1987.) 비-선택적(non-selective) 조건 하에서 첫 번째 8회 계대배양의 각각을 진행하는 동안, 40%의 tk + 백시니아 바이러스 입자가 이들의 tk + 표현형을 잃었다. (Id.) 비-선택적 조건 하에서, tk - 바이러스는 총 바이러스 집단의 99.73%의 풍부도(abundance)로 증가되었다. (Id.) 선택적 조건하에서, 대부분의 감염성 바이러스가 tk 유전자의 뒤이은 소실과 함께 재조합을 이미 겪은 DNA를 함유한 단일 플라크로부터 분리될 수 있는 그러한 높은 빈도로 재조합이 일어났다. (Id.) VV p7.5-프로모터로부터 발현되는, 3개의 이종성(heterologous) 유전자를 발현하도록 설계된 재조합 백시니아 바이러스를 사용하여, 하울리 등[Howley et al., Gene 172:233-237, 1996]은 반복된 프로모터 서열들 사이의 재조합을 입증하였다. 스트렙토코쿠스 피로게네스(Streptococcus pyogenes)의 M 단백질로부터의 C-반복부(C-repeat region, CRR)를 함유하도록 설계된 백시니아 바이러스 재조합체는 상기 CRR의 1 내지 20개 이상의 복제물을 함유하는 변이체들의 복잡한 혼합물을 포함하였다. (Hruby et al., P.N.A.S. 88:3190-3194, 1991.)
MVA의 상이한 삽입 부위들로 삽입된 약 60-75%의 상동성을 지니는 다수의 유전자들이 결과적으로 안정한 다수의 재조합 바이러스를 야기시키는 것으로 밝혀졌으나(WO 03/097846호), 예를 들어, 바이러스 벡터와 같은 벡터 내부의 분자내 재조합 수준을 감소시켜 더 긴 동일한 스트레치(stretches)를 포함하는 다수의 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안정한 벡터의 생성을 가능케 하는, 그러한 조성물 및 방법에 대한 당해 기술 분야의 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 재조합 벡터와 이들을 제조하는 방법 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 각각의 뉴클레오티드 서열이 100개의 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 포함하는데, 여기서 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩되는 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니고, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 뉴클레오티드 서열과 상이한 75개 이상의 뉴클레오티드를 가지며, 상기 상이한 뉴클레오티드는 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산을 변경시키지 아니한다.
놀랍게도, 본 발명에 따라, 예를 들어, 벡터와 같은 한 핵산 분자 내부의 2개 이상의 유사하거나 동일한 뉴클레오티드 서열 내의 동의 코돈(synonymous codons)을 전체적으로 대체하여, 그에 따라 2개 이상의 유사하거나 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 안정한 벡터의 생성을 야기시킴으로써, 분자내 재조합의 위험이 유의하게 감소될 뿐만 아니라, 심지어 회피될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 사용된 전략을 3개 이상의 유사한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터에도 적용할 수 있다는 것이 예상치 못하게 발견되었다.
본 발명에서 획득한 결과는, 벡터 내부의 분자내 재조합을 감소시키기 위해 뉴클레오티드 서열 내의 많은 수의 뉴클레오티드를 대체하는 것이 가능하며, 한편, 놀랍게도, 이와 동시에, 엔코딩되는 단백질의 발현은 그대로 유지된다는 것을 제시한다: 본 발명에 따라 실행된 것과 같이 긴 스트레치의 뉴클레오티드 서열 내로 많은 수의 뉴클레오티드 변이체를 도입한 경우, 당업자는 상기 서열 또는 유전자의 발현이 더 이상 적절하게 작동할 수 없을 것임을 예상할 것인데, 즉, 변경된 뉴클레오티드 서열이 효율적인 발현을 위해 적합한 상태로 유지될 수 없다는 것이 예상되었다. 본원에 채용된 전략은 300개 뉴클레오티드의 짧은 뉴클레오티드 서열 스트레치뿐만 아니라, 예를 들어, 물론 청구된 것과 같은 300개 뉴클레오티드의 스트레치를 포함하는, 전장 유전자와 같은 훨씬 더 긴 스트레치에도 적용가능하다. 본 발명에 따른 결과는 다수의 상이한 유전자 벡터 및 바이러스에 적용가능하고, 예를 들어, 다가 백신의 개발과 같은, 백신 개발에 크게 기여할 수 있고, 또한, 예를 들어, 단백질의 발현과 같은, 다른 기술 또는 재조합 세포주의 제조에 기여할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 또한 바이러스 및 벡터의 생성을 위한 방법, 및 분자내 재조합을 감소시키기 위한 방법을 포함한다.
본 발명은 상기한 벡터를 생성시키기 위한 방법을 포함하는데, 상기 방법은 a) 100개 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 제 1 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; b) 100개 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 제 2 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; 및 c) 상기 2개의 별개의(divergent) 뉴클레오티드 서열을 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩된 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니고, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 뉴클레오티드 서열과 상이한 75개 이상의 뉴클레오티드를 지니며, 상기 상이한 뉴클레오티드는 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코되되는 동일한 아미노산을 변경시키지 않는다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 각각의 뉴클레오티드 서열이 100개 아미노산을 코딩하는, 300개 뉴클레오티드 크기의 2개의 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터 내부에서 분자내 재조합을 감소시키기 위한 방법을 포함하는데, 여기서 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩되는 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니며, 상기 방법이 하나 또는 두개의 뉴클레오티드 서열(들) 내의 뉴클레오티드를 치환하여 75개 이상의 뉴클레오티드에서 차이를 나타내는 별개의(divergent) 서열을 생성시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 상이한 뉴클레오티드는 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산 서열을 변경시키지 아니한다.
바이러스 벡터를 사용하는 경우, 본 발명의 방법은 각 세대의 바이러스 증폭이 진행되는 동안 분자내 재조합 수준을 감소시킨다. 바람직하게는, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 세대 당 자손(progeny) 바이러스의 20%, 15%, 10%, 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 미만으로 재조합한다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 바이러스, 바람직하게는 폭스바이러스를 생성시키는 방법을 포함하는데, 상기 방법은 a) 100개 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스를 제공하는 단계; b) 상기 바이러스 내로 100개의 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 제 2 뉴클레오티드 서열을 삽입하는 단계를 포함하며; 여기서 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩되는 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니고, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 뉴클레오티드 서열과 상이한 75개 이상의 뉴클레오티드를 지니며, 상기 상이한 뉴클레오티드는 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산을 변경시키지 않는다.
본원에 사용된, "벡터"는 숙주 세포 또는 피검체 내에서 핵산 분자를 전달하고 발현할 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 따라서, 벡터는 세포내로 도입되고/되거나 세포 유전체에 통합되는 PCR 생성물 또는 임의의 핵산 조각일 수 있거나; 삽입된 세그먼트의 복제를 야기시키기 위해 또 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있는, 레플리콘(replicon), 예컨대, 플라스미드, 파아지, 또는 코스미드일 수 있다. 일반적으로, 벡터는 적합한 조절 엘리먼트와 결합된 경우, 복제될 수 있다. 본 발명에 사용하는데 적합한 벡터 백본은, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스, 인공 염색체, BACs, YACs, 또는 PACs 또는 심지어 박테리아 및 진핵 세포와 같은 재조합 세포와 같은 당업계에서 관용적으로 사용되는 그러한 것들을 포함한다. 용어 "벡터"는 클로닝 및 발현 벡터뿐만 아니라, 바이러스 벡터 및 통합 벡터를 포함한다. "발현 벡터"는 조절 영역을 포함하는 벡터이다. 본 발명에 사용하는데 적합한 발현 벡터는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 플라스미드 및 예를 들어, 식물 바이러스, 박테리오파아지, 배큘로바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 레트로바이러스, 및 폭스바이러스에서 유래된, 바이러스 벡터를 포함한다. 적합한 비바이러스 벡터는 플라스미드, 예컨대, pREP4, pCEP4(Invitrogene), pCI(Promega), pCDM8(Seed, 1987, Nature 329, 840), pVAX 및 pgWiz(Gene Therapy System Inc; Himoudi et al, 2002, J. Virol. 76, 12735-12746)를 포함한다. 다수의 벡터 및 발현 시스템은 Novagen(Madison, Wis.), Clontech(Palo Alto, Calif.), Stratagene(La Jolla, Calif.), 및 Invitrogen/Life Technologies(Carlsbad, Calif.)와 같은 회사로부터 구입가능하다.
백신 개발에 있어서, 재조합 바이러스는 유전 물질을 세포로 전달하기 위한 비히클 또는 백신 벡터로서 사용될 수 있다. 일단 세포내에서, 유전 정보가 전사되고 특정 질병에 대해 타깃팅된 삽입 항원을 포함하는, 단백질로 번역된다. 벡터에 의해 세포내로 전달된 항원이, 질병을 예방하는, 항원에 대한 신체의 면역 반응을 유발하면 치료는 성공적이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다.
바이러스 벡터는 약독화된 바이러스에 기반할 수 있는데, 상기 약독화된 바이러스는 숙주에서 복제할 수 없지만, 감염된 세포에서 외래 유전자를 도입시키고 이를 발현시킬 수 있다. 바이러스 또는 재조합 바이러스는 그에 따라 단백질을 만들 수 있고 이것을 숙주의 면역 시스템에 제시할 수 있다. 바이러스 벡터의 일부 중요한 특징은 이들이 체액성(humoral)(B-세포) 및/또는 세포-매개(T-세포) 면역 반응을 개시시킬 수 있다는 것이다.
바이러스 벡터는 다양한 상이한 바이러스로부터 획득할 수 있다. 일 구체예에서, 바이러스는 동물 바이러스이다. 벡터는 특히 레트로바이러스, 피코르나바이러스, 인플루엔자바이러스, 아데노바이러스, 아데노-부속 바이러스(AAV), 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSV-1), 홍역 바이러스 및 포미(foamy) 바이러스로 구성된 군에서 선택된 바이러스로부터 획득될 수 있다.
바이러스 벡터는 감염성 질환 및 암의 예방 및 치료를 위한 백신을 개발하려는 연구자들에 의해 흔히 사용된다. 물론, 폭스바이러스(카나리 폭스, 백시니아, 및 파울 폭스를 포함)는 가장 흔한 벡터 백신 후보체 그룹에 속한다. 폭스바이러스는 바이러스 유전체 내로 서열의 삽입을 위한 비교적 큰 용량 때문에, 또한, 핵 대신 감염된 세포의 세포질에서 이들의 유전체를 복제하고 전사를 수행하여, 그 결과로, 다른 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터에서 확인된 것과 같은 숙주 세포의 유전체 내로의 유전 물질을 삽입시킴으로써 삽입 돌연변이유발의 위험을 최소화시키는 이들의 능력 때문에, 새로운 숙주 내로의 유전 물질의 전달을 위해 선택이 선호된다. 폭스바이러스 비리온은 대부분의 다른 동물 바이러스와 비교할 때, 거대하다(상세한 내용에 관해서는 하기 문헌 참조 바람: Fields et al., eds., Virology, 3rd Edition, Volume 2, Chapter 83, pages 2637 ff).
본 발명의 바람직한 구체예에서, 바이러스 벡터는 폭스바이러스에서 유래된다(예를 들어, 하기 문헌을 참조바람: Cox et al. in "Viruses in Human Gene Therapy" Ed J. M. Hos, Carolina Academic Press). 이것은 폭스비리대(poxviridae)의 임의의 일원에서 획득될 수 있고, 특히, 아비폭스바이러스 또는 오르쏘폭스바이러스일 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적합한 아비폭스바이러스의 일예는, 파울폭스바이러스(Fowlpox virus), 카나리폭스바이러스(Canaryfox virus), 운코폭스바이러스(Uncopoxvirus), 마이나폭스바이러스(Mynahpoxvirus), 피전폭스바이러스(Pigenopoxvirus), 프시타신폭스바이러스(Psittacinepoxvirus), 쿠아일폭스바이러스(Quailpoxvirus), 피칵폭스바이러스(Peacockpoxvirus), 펭귄폭스바이러스(Penguinpoxvirus), 스패로우폭스바이러스(Sparrowpoxvirus), 스타링폭스바이러스(Stalingpoxvirus) 및 터키폭스바이러스(Turkeypoxvirus)와 같은 임의의 아비폭스바이러스를 포함한다. 바람직한 아비폭스바이러스는 카나리폭스바이러스와 파울폭스바이러스이다.
아비폭스바이러스는 천연적으로 숙주-제한적이고, 조류 종 및 세포에서만 생산적으로 복제한다(Taylor et al., Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombination, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13:539-549, 1995). 인간 세포가 아비폭스바이러스로 감염되면, 이종성 유전자는 바이러스 유전체로부터 발현된다. 그러나, 아비폭스바이러스는 인간 세포에서 완전히 복제하지 못하고, 그리하여, 인간은 생산적 바이러스 복제에 의해 해를 입게 되는 위험이 없다. 예를 들어, 렌티바이러스 유전자 생성물(US 5,766, 598호), 사이토카인 및/또는 종양-관련 항원(US 5,833,975호) 또는 광견병 G 당단백질(Taylor et al., Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species, Vaccine 13:539-549, 1995)을 발현하는 다양한 재조합 아비폭스바이러스가 작제되었다. 4개의 HIV 유전자 gag, pol, env 및 nef을 발현하는 재조합 카나리폭스 바이러스는 이미 임상 시험에 사용되었다(Peters, B. S., The basis for HIV immunotherapeutic vaccines, Vaccine 20: 688-705, 2001).
아비폭스바이러스가 조류 세포에서만 생산적으로 복제하기 때문에, 이러한 세포가 바이러스의 증폭 및 재조합 바이러스의 생성에 사용되어야 한다.
카나리폭스 바이러스의 일예는 렌트슐러(Rentschler) 균주이다. ALVAC(US 5,766,598호)로 명명된 플라크 정제 카나리폭스 균주는 부다페스트 조약의 조항에 의거하여 ATCC(American Type Culture Collection)에 수탁번호 VR-2547로 수탁되어 있다. 또 다른 카나리폭스 균주는 Institute Merieux, Inc.로부터 입수가능한, LF2 CEP 524 24 10 75로 지정된 상업 카나리폭스 백신 균주이다.
파울폭스 바이러스의 일예는 FP-1, FP-5 및 TROVAC(US 5,766,598호) 균주이다. FP-1은 1일령 닭에서 백신으로 사용되도록 변형된 듀벳(Duvette) 균주이다. 이 균주는 1980년 10월에 DCEP 25/CEP67/2309로 지정된 상업 파울폭스 바이러스 백신 균주이고 Institute Merieux, Inc.로부터 입수가능하다. FP-5는 American Scientific Laboratories(위스콘신, 메디슨 소재, 쉐링 사(Schering Corp.)의 자회사(Division)로부터, 미국 수의과 면허 번호 165, 일련번호 30321로 입수가능한 닭 배아 기원의 상업적 파울폭스 바이러스 백신 균주이다.
폭스바이러스 중에, 백시니아 및 바리올라 2종은 가장 잘 알려져 있다. 바리올라바이러스는 천연두의 원인이다. 바리올라바이러스와는 반대로, 백시니아 바이러스는 보통 면역-적격(immune-competent) 개체에서 전신성 질환을 야기시키지 않고, 그리하여 천연두에 대해 면역화시키기 위해 생 백신으로서 사용되었다. 백시니아 바이러스로의 성공적인 전세계적 백신접종(vaccination)은 1980년대에 자연 질병으로서의 천연두의 박멸로 종결되었다(The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication; History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980). 그때 이후로, 폭스바이러스 감염의 높은 위험에 처한 사람(예를 들어, 실험실 근무자)을 제외하고, 백신접종은 수년 동안 중단되어 왔다. 그러나, 예를 들어, 천연두를 유발하는 바리올라가 생물-테러 무기로 사용될 수 있다는 두려움이 증가하고 있다. 더욱이, 다른 폭스바이러스, 예컨대, 카우폭스, 카멜폭스, 및 몽키폭스가 선택적 기작을 통해 잠재적으로 돌연변이를 일으키고, 바리올라와 유사한 표현형을 획득하게 될 위험이 존재한다. 그리하여, 몇몇 정부들은 추정되거나 실제적인 천연두 공격의 사전-노출(바리올라바이러스와 조우하기 이전) 또는 사후-노출(바리올라바이러스와의 조우한 이후) 시에 사용하기 위한 백시니아-기반 백신의 비축량을 마련중이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 벡터는 백시니아 바이러스 벡터이다.
백시니아 바이러스는 매우 면역-자극성이고, 그 자신의 유전자 생성물 및 백시니아 유전체 내로 삽입된 유전자로부터 발현된 다수의 외래 유전자 생성물 둘 모두에 대하여 강한 B-(체액성) 및 T-세포 매개(세포성) 면역력을 자극시킨다. 그러므로, 백시니아 바이러스는 천연두 및 다른 감염성 질환 및 암에 대한 백신에 관한 재조합 백신의 형태로 이상적인 벡터인 것으로 간주된다. 문헌에 기재된 많은 재조합 백시니아 바이러스는 백시니아 바이러스의 완전한 복제능을 보유한 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주에 기반하고 있다. 그러나, 이 균주는 고 신경병원성(neurovirulence)을 나타내고, 그에 따라, 인간과 동물에서 사용하기 위한 적합성이 떨어지는 것으로 알려져 있다(Morita et al. 1987, Vaccine 5, 65-70).
적합한 백시니아 바이러스는 코펜하겐(Copenhagen) 균주(Goebel et al., 1990, Virol. 179, 247-266 및 517-563; Johnson et al., 1993, Virol. 196, 381- 401), 와이어쓰(Wyeth) 균주, NYVAC(하기 문헌 참조: WO92/15672호 및 Tartaglia et al., 1992, Virology 188, 217-232) 및 고도로 약독화된 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 균주(Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16)로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
적합한 백시니아 바이러스의 바람직한 일예는 고도로 약독화된 백시니아 바이러스 균주 NYVAC인데, 이것은 바이러스 유전체의 18개 ORFs의 결실에 의해 코펜하겐 백신 균주의 플라크-클로닝된 동정체에서 유래되었다(Tartaglia et al., NYVAC: A highly attenuated strain of vaccinia viurs, Virology 188, 217-232, 1992). NYVAC는 다양한 인간 조직 배양 세포에서 복제하는 능력이 급격하게 감소되어 있으나, 외래(extrinsic) 항원에 대한 강한 면역 반응을 유도하는 능력은 보유하는 것을 특징으로 한다.
상기한 바이러스 모두가 동등하게 본 발명에 사용하기 적합하다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 바이러스는 백신접종시 현저하게 안정한 것으로 알려져 있는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA)이다.
변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 바이러스는 폭스비리대(Poxviridae) 과의 오르쏘폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속의 일원인, 백시니아 바이러스와 관련이 있다. MVA는 피부(dermal) 백시니아 균주 앙카라(장뇨막(Chorioallantois) 백시니아 바이러스 앙카라(CVA)를 닭 배아 섬유아세포에서 516회 계대 배양함으로써 생성되었다(검토를 위해 하기 문헌을 참조바람: Mayr, A., et al., Passage History: Abstammung, Eigenschaften und Verwendung des attenuierten Vaccinia-Stammes MVA, Infection 3, 6-14, 1975). 이러한 장기간 계대배양의 결과로, 그 결과 얻어진 MVA 바이러스는 이의 유전체 서열의 약 31 킬로베이스(kilobases)가 결실되었고, 그에 따라, 숙주 세포가 조류 세포에 극히 제한되는 것으로 소개되었다(Meyer, H. et al., Mapping of deletions in the genome of the highly attenuated vaccinia virus MVA and their influence on virulence, J. GeN. Virol. 72, 1031-1038, 1991; (Meisinger-Henschel et al., Genomic sequence of chorioallantois vaccinia virus Ankara, the ancestor of modified vaccinia virus Ankara, J. Gen. Virol. 88, 3249-3259, 2007). 결과적으로 얻어진 MVA가 유의하게 비병원성이었음은 다양한 동물 모델에서 밝혀졌다(Mayr, A. & Danner, K. Vaccination against pox diseases under immunosuppressive conditions, Dev. Biol. Stand. 41: 225-34, 1978). 또한, 이 MVA 균주는 인간 천연두 질환에 대해 면역화시키기 위한 백신으로서 임상 시험에서 시험되었다(Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., MVA vaccination against smallpox: clinical tests with an attenuated live vaccinia virus strain (MVA) (author's transl), Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392, 1974). 이러한 연구는 고위험 환자를 포함하는, 120,000명을 넘는 인간을 포함하였고, 백시니아 기반 백신과 비교하여, MVA가 우수한 면역력(immunogenicity)을 유지하면서 감소된 병원성 또는 감염성을 지녔다는 것을 입증하였다.
본 발명은 임의의 그리고 모든 MVA 바이러스로 생성된 재조합 MVA 바이러스를 포함한다. MVA 균주에 대한 일예는 미국, VA 20108, 머내서스 소재, ATCC에 수탁된, 수탁체 VR-1508이다. 또 다른 구체예에서, MVA-Vero 균주 또는 이의 유도체가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. MVA-Vero 균주는 ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 수탁 번호 ECACC V99101431와 ECACC 01021411로 수탁되어 있다. 본 발명에 따라 사용되는 MVA 바이러스 균주에 대한 추가 일예는 Salisbury (UK) 소재, ECACC(European Collection of Animal Cell Cultures)에 각각 ECACC V94012707과 ECACC V00120707로 기탁된 MVA 572 및 575 균주이다. 특히 바람직한 MVA 바이러스는, 예를 들어, ECACC에 수탁번호 V00083008로 수탁된, MVA 변이체 균주 MVA-BN®와 이 MVA-BN®와 동일한 특성을 갖는 유도체들이다.
MVA-BN®은 독보적인(stand-alone) 제 3 세대 천연두 백신의 제조에 사용되는 바이러스이다. MVA-BN®은 MVA 균주 571/572로부터 추가 계대배양으로 개발되었다. 현재까지, 아토피 피부염(atopic dermatitis, AD) 및 HIV 감염을 지니는 환자를 포함하는 1500명 이상의 환자가 MVA-BN® 기반 백신으로 임상 시험에서 백신접종되었다.
MVA-BN®의 기탁 균주와 동일한 특성을 갖는 유도체들은 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 시험관내에서 재생산적 복제 능력을 갖지만, MVA 575 또는 MVA 572가 재생산적으로 복제할 수 있는 인간 세포에서는 재생산적 복제 능력을 갖지 않는다. 더 바람직하게는, MVA는 인간 세포주 HaCaT, 인간 배아 신장세포주 293, 인간 골육종 세포주 143B, 및 인간 자궁경부 선암 세포주 HeLa에서 재생산적 복제 능력을 갖지 않는다.
용어 "재생산적 복제 불가능한"은, 각각, WO 02/42480호 및 미국 제6,761,893호에 정의된 것과 같이 본원에서 사용된다. 따라서, 상기 용어는, 본원에 참조를 위해 통합되는, 미국 특허 제6,761,893호에 기재된 검정법을 사용하여 감염 후 4일 경과시 1 미만의 바이러스 증폭비를 갖는 바이러스에 적용된다. 바이러스의 "증폭비(amplification ratio)"는 첫 번째 위치에서 세포를 감염시키는데 처음에 사용된 양(Input)에 대한 감염된 세포로부터 생산된 바이러스(Output)의 비이다. Output과 Input 사이의 "1"의 비는 감염된 세포로부터 생산된 바이러스의 양이 당해 세포를 감염시키기 위해 처음에 사용된 양과 동일한, 증폭 상태를 의미한다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 MVA 균주는 상기한 MVA-BN® 또는 이의 유도체이다. MVA-BN®의 특징, MVA 균주가 MVA-BN® 또는 이의 유도체인지 여부를 평가하기 위한 생물학적 검정법에 대한 설명 및 MVA-BN® 또는 MVA-BN®의 특성을 지니는 MVA를 획득하기 위한 방법은 WO 02/42480호에 소개되어 있다. 상기 출원의 내용은 참조를 위해 본원에 포함된다. 고도로 약독화된 MVA-BN® 바이러스는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA), 예컨대, MVA-572 또는 MVA-575의 추가 계대배양, 및 임의로, 플라크 또는 클론 정제로 유래될 수 있다. MVA-BN®은 조상 CVA 바이러스와 비교하여 유전체의 대략 13%(6개의 주 결실 부위 및 다수의 부 결실 부위로부터 26.5 kb)가 결여되어 있다. 결실은 A-타입 봉입 단백질(A-type inclusion protein, ATI)를 코딩하는 유전자 및 A-타입 봉입체 내로 성숙한 바이러스 입자를 이끄는 구조 단백질을 코딩하는 유전자의 거대한 단편을 비롯한, 다수의 병원성 및 숙주 범위 유전자에 영향을 미친다.
특히, WO 02/42480호에 기재된 것과 같은 본 발명에 따른 MVA의 특성, 예컨대, MVA-BN®의 특성에 대한 정의, 및 MVA-BN®의 유도체들의 특성 및 정의가 참조된다. 또한 상기 참조문헌은 어떻게 MVA와 다른 백시니아 바이러스가 증식될 수 있는지에 대해 개시하고 있다. 요약하면, 진핵 세포가 상기 바이러스로 감염된다. 진핵 세포는 각각의 폭스바이러스로의 감염에 민감할 수 있고 감염성 바이러스의 복제와 생산이 가능한 세포이다. MVA의 경우, 이러한 유형의 세포에 대한 일예는 닭 배아 섬유아세포(CEF) 및 BHK 세포(Drexler et al., Highly attenuated modified vaccinia Ankara replicates in baby hamster kidney cells, a potential host for virus propagation, but not in various human transformed and primary cell, J. Gen. Virol. 79, 347-352, 1998)이다. CEF 세포는 당업계의 통상의 기술자에게 알려진 조건하에서 배양될 수 있다. 바람직하게는, CEF 세포는 고정 플라스크 또는 롤러 보틀에 담긴 무혈청 배지에서 배양된다. 인큐베이션은, 바람직하게는, 37℃에서 48 내지 96 시간 진행한다. 감염을 위해, MVA는, 바람직하게는, 0.05 내지 1 TCID50의 다중감염도(multiplicity of infection, MOI)로 사용되며, 인큐베이션은, 바람직하게는, 37℃에서 48 내지 72 시간 진행한다.
본 발명에 따라 사용되는 바이러스는 다양한 세포 배양물, 특히, 동물 세포 배양물에서 증식될 수 있다. 바이러스는 민감한 세포 배양물에 감염되고 재생산적으로 복제한다. 자손 바이러스는 당업계의 관용 기술에 의해 수집된다.
예를 들어, MVA 바이러스와 다른 백시니아 바이러스와 함께, 혈청-함유 또는 무혈청 배지 중의 닭 배아 섬유아세포(CEFs)가 바이러스로 감염될 수 있다. 바이러스의 재생산적 복제가 가능하게 된 후, 자손 바이러스가 수집된다.
또한 본 발명은, 2개 이상의 상동성 뉴클레오티드 서열, 특히 코딩 서열을 발현시킬 수 있는, 재조합 폭스바이러스, 바람직하게는 백시니아 바이러스, 특히 MVA와 관련이 있다. 바이러스는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 상동성 뉴클레오티드 코딩 서열을 함유할 수 있다.
본 발명의 벡터는 300개 뉴클레오티드 크기의 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 벡터는 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 상기 서열들은 청구된 것과 같은 2개의 뉴클레오티드 서열도 물론 포함한다. 300개 뉴클레오티드는 물론 더 긴 뉴클레오티드 서열의 일부일 수도 있다.
또한, 다양한 구체예에서, 2개 이상의 뉴클레오티드 서열은 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개, 또는 3000개 또는 심지어 그 이상의 뉴클레오티드 크기인데, 상기 뉴클레오티드 모두가 더 긴 뉴클레오티드 서열의 일부일 수 있고, 상기 뉴클레오티드 모두가 청구된 것과 같은 300개의 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된, 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열"은 교체가능하게 사용되며, 폴리데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 폴리리보뉴클레오티드(RNA) 분자 또는 이들의 임의의 조합물의 중합체를 정의한다. 이 정의는 단일 가닥 또는 이중 가닥, 선형 또는 원형, 천연 생성 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 뉴클레오티드 서열은, 각각, 코딩 서열일 수 있고, 완전한 유전자를 함유할 수 있다. 본원에 사용된, 용어 "코딩 서열"은, 특정 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 유전자의 비-코딩 서열은 인트론 및 조절 영역, 예컨대, 프로모터, 오퍼레이터, 터미네이터를 포함한다.
또한, 뉴클레오티드 서열은 유전자 단편을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 합성 서열, 예컨대, 아미노산 링커 서열 또는 에피토프를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 유전자, 유전자 단편, 및 합성 서열의 혼합물로 구성될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 또한 유사체, 예컨대, 뉴클레오티드 유사체, 포스페이트 에스테르 유사체 및/또는 펜토오스 당 유사체를 포함할 수 있다. 또한 뉴클레오티드 유사체의 정의 내에는 포스페이트 에스테르 및/또는 당 포스페이트 에스테르 연결이 다른 유형의 연결, 예컨대, N-(2-아미노에틸)-글리신 아미드 및 다른 아미드(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Nielsen et al., 1991, Science 254: 1497-1500; WO 92/20702호; 미국 특허 제5,719,262호; 미국 특허 제5,698,685호); 몰포리노(morpholinos)(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: 미국 특허 제5,698,685호; 미국 특허 제5,378,841호; 미국 특허 제5,185,144호); 카바메이트(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Stirchak & Summerton, 1987, J. Org. Chem. 52: 4202); 메틸렌(메틸리노)(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Vasseur et al., 1992, J. Am. Chem. Soc. 114: 4006); 3'-티오포름아세탈(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Jones et al., 1993, J. Org. CheM. 58: 2983); 술파메이트(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: 미국 특허 제5,470,967호); 흔히 PNA로 지칭되는, 2-아미노에틸글리신(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Buchardt, WO 92/20702; Nielsen (1991) Science 254:1497-1500); 및 기타(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: 미국 특허 제5,817,781호; Frier & Altman, 1997, Nucl. Acids Res. 25:4429 및 상기 문헌 내에서 인용된 참조문헌)로 대체된 뉴클레오티드가 포함된다. 포스페이트 에스테르 유사체는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, (i) C1-C4 알킬포스포네이트, 예를 들어, 메틸포스포네이트; (ii) 포스포르아미데이트; (iii) C1-C6 알킬-포스포트리에스테르; (iv) 포스포로티오에이트; 및 (v) 포스포로디티오에이트를 포함한다.
추가의 변형은 핵산의 생체내 안정성을 증가시키기 위해, 핵산의 전달을 향상시키기 위해, 또는 숙주 피검체로부터 제거율(clearance rate)을 감소시키기 위한 화학적 변형(예를 들어, 다음 문헌 참조: WO 92/03568호; 미국 특허 제5,118,672호)를 포함한다.
더욱이, 일 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 융합 유전자, 인공 유전자 및 폴리에피토프를 함유할 수 있다.
본원에 명시된, 융합 유전자는 2개의 미리 분리된 유전자, 유전자 단편 또는 인공 DNA 또는 에피토프로부터 형성된 하이브리드 유전자이다. 이것은, 전좌, 간질성(interstitial) 결실, 또는 역위의 결과로서 생길 수 있다.
융합 유전자는 2개 이상의 DNA 단편들을 연결시킴으로써 작제될 수 있는데, 여기서 상기 DNA 단편들은 동일하거나 상이한 아미노산 서열을 엔코딩한다.
융합 단백질은 단백질의 발현 및/또는 정제를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(GST) 융합 단백질로서 생성될 수 있다. 그러한 GST 융합 단백질은 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 간편하게 하는데, 예컨대, 글루타치온-유도체화된 매트릭스의 사용을 통해, 사용될 수 있다(예를 들어, 다음 문헌을 참조하라: Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). 또 다른 구체예에서, 정제 리더 서열, 예컨대, 재조합 단백질의 요망되는 부분의 N-말단에 폴리-(His)/엔테로키나아제 절단 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2+ 금속 레진을 사용하는 친화력 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 가능케 할 수 있다. 이후 정제 리더 서열은 정제된 단백질을 제공하기 위해 엔테로키나아제로 처리함으로써 후속적으로 제거될 수 있다(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411 : 177; 및 Janknecht et al., PNAS USA 88:8972). 폴리펩티드에 융합되어 이의 검출, 분리, 가용해화(solubilization) 및/또는 안정화를 가능케 하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 추가의 이종성 서열은, 폴리His 태그(tag), myc, HA, 단백질 A, 단백질 G, 칼모듈린-결합 펩티드, 티오레독신, 말토오즈-결합 단백질, 폴리아르기닌, 폴리 His-Asp, FLAG, 면역글로불린 단백질의 일부분, 및 트랜스사이토시스(transcytosis) 펩티드를 포함한다.
융합 유전자를 만드는 기술은 잘 알려져 있다. 본질적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 다양한 DNA 단편들을 연결시키는 것이 관용 기술에 따라 수행되는데, 상기 관용 기술은 라이게이션을 위한 평활-말단(blunt-endedtermini) 또는 스태거-말단(stagger-ended termini), 적절한 말단을 제공하기 위한 제한 효소 분해, 필요에 따라 코헤시브 말단(cohesive ends)의 채움, 바람직하지 않은 결합을 회피하기 위한 알칼린 포스파타아제 처리, 및 효소 라이게이션을 이용한다. 또 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 관용 기술로 합성될 수 있다. 달리, 유전자 단편의 PCR 증폭은 2개의 연속된 유전자 단편들 사이의 상보적인 돌출(complementary overhangs)을 야기시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있는데, 상기 유전자 단편들은 후속하여 어닐링되어 키메라 유전자 서열을 생성시킬 수 있으며(예를 들어, 하기 문헌을 참조하라: Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992), 그리고 유전자 단편의 PCR 증폭은 융합 PCR에 의해 수행될 수 있는데, 여기서, 2개 이상의 폴리뉴클레오티드는 스트레치의 동일성을 공유하며, PCR 반응은 결과적으로 융합된 폴리뉴클레오티드 서열을 야기시킬 수 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 폴리에피토프를 엔코딩한다. 폴리에피토프는 하나 이상의 단백질/항원, 바람직하게는, 하나 이상의 단백질/항원으로부터의 분리된 에피토프를 포함하는 키메라 단백질이다.
상기 에피토프는 "분리된" 것이거나 "생물학적으로 순수한" 것일 수 있다. 용어 "분리된"은 이의 천연 발생 환경에서 발견되는 것과 같이 정상적으로 동반되는 성분들이 실질적으로 결여되어 있는 물질을 의미한다. "분리된" 에피토프는 에피토프가 유래된 항원 또는 단백질의 전체 서열의 이웃한(neighbouring) 아미노산을 포함하지 않는 에피토프를 의미한다.
특정 아미노산 서열과 관련하여, "에피토프"는 특정 면역글로불린에 의한 인식에 관여하는 아미노산 잔기들의 세트, 또는 T 세포와 관련하여, T 세포 수용체 단백질 및/또는 주조직적합성복합체(Major Histocompatibility Complex, MHC) 분자에 의한 인식에 필요한 그러한 잔기들이다. 용어 "펩티드"는, 전형적으로, 인접 아미노산의 아미노와 카르보닐 기들 간의 펩티드 결합에 의해, 서로 연결된, 일련의 아미노산들을 지칭한다.
에피토프는 특정 길이이고, 면역 시스템에서 기능을 발휘하는 분자, 바람직하게는, HLA 클래스 I 및 T-세포 수용체에 결합한다. 폴리에피토프 작제물에서 에피토프는 HLA 클래스 I 에피토프 및 임의로 HLA 클래스 II 에피토프일 수 있다. HLA 클래스 I 에피토프는 CTL 에피토프로 지칭되고, HLA 클래스 II 에피토프는 HTL 에피토프로 지칭된다. 일부 폴리에피토프 작제물은 한 서브세트의 HLA 클래스 I 에피토프와 또 다른 서브세트의 HLA 클래스 II 에피토프를 지닐 수 있다. CTL 에피토프는 일반적으로 13개 이하의 아미노산 길이의 잔기들, 12개 이하의 아미노산 길이의 잔기들, 또는 11개 이하의 아미노산 길이의 잔기들, 또는 바람직하게는 8 내지 13개 아미노산 길이의 잔기들, 가장 바람직하게는 8 내지 11개 아미노산 길이의 잔기들(즉, 8, 9, 10, 또는 11개)로 구성될 수 있다. HTL 에피토프는 50개 이하의 아미노산 길이의 잔기들, 일반적으로 6 내지 30개 잔기들, 더 일반적으로 12 내지 25개 잔기들로 구성되며, 바람직하게는 15 내지 20개(즉, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개) 아미노산 길이의 잔기들로 구성된다. 본 발명의 폴리에피토프 작제물은 바람직하게는 2개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 13개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 또는 25개 이상의 CTL 에피토프를 포함한다. 더 구체적으로, 폴리에피토프 작제물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60개 이상의 CTL 에피토프를 포함한다.
본 발명에 따른 상동성 뉴클레오티드 서열은 임의의 유기체(organism), 미생물, 예컨대, 임의의 바이러스, 임의의 박테리아, 임의의 진균 또는 기생충에서 유래될 수 있다. 상동성 뉴클레오티드 서열은 벡터의 서열과 이종성일 수 있거나, 상기 벡터의 서열과 상동성일 수도 있다: 예를 들어, 바이러스가 벡터로 사용되는 경우, 바이러스 자신의 뉴클레오티드 서열이, 예를 들어, 향상된 면역 반응성 또는 안정성을 얻기 위한 바이러스의 단백질을 과발현시키기 위해, 본 발명에 따라 증식될 수 있다. 바람직하게는, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 감염성 또는 병원성 미생물, 가장 바람직하게는 상이한 균주 또는 상기 미생물의 클레이드, 변이체, 아형 또는 혈청형으로부터 유래된다. 용어 "균주" 또는 "클레이드"는, 미생물 분류학을 참조할 때, 당업자에게 잘 알려져 있는 기술 용어이다. 분류학 체계는 지금까지 규명된 모든 미생물을 과, 속, 종, 균주의 순서 체계로 분류한다(Fields Virology, ed. by Fields B. N., Lippincott-Raven Publishers, 4th edition 2001). 과의 일원에 대한 기준이 이들의 계통발생학적 관계이지만, 속은 공통적인 특성들을 공유하는 모든 일원들을 포함하고, 종은 복제 혈통을 구성하고 특정 생태학적 소재(niche)를 점유하는 복합적(polythetic) 클래스로서 정의된다. 용어 "균주" 또는 "클레이드"는 기본적 형태 또는 유전체 구조 및 조직화(organisation)와 같은, 공통적 특징들을 공유하나, 숙주 범위, 조직 향성(tropism), 지리학적 분포, 약화(attenuation) 또는 병원성과 같은, 생물학적 특성들에서 차이가 있는 미생물, 즉, 바이러스를 지칭한다. 용어 "변이체(variants)" 또는 "혈청형(serotypes)"은 아형으로도 불리우는, 동일 균주의 일원들을 추가로 구별짓는데, 사소한 유전체적 변이로 인해 개개의 감염 스펙트럼 또는 항원적 특성을 나타낸다.
본 발명의 추가 구체예에 따라서, 상동성 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 바이러스로부터 선택된다. 바이러스의 대표적 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, HIV(HIV-I 또는 HIV-2), 헤르페스 바이러스(예를 들어, HSVI 또는 HSV2), 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 간염 바이러스(예를 들어, A형 간염 바이러스(HAV), HBV, HCV 및 E형 간염 바이러스), 플라비바이러스(예를 들어, 황열 바이러스), 바리셀라-조스터 바이러스(VZV), 파라믹소바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV), 파라인플루엔자바이러스, 홍역 바이러스, 인플루엔자바이러스, 및 파필로마바이러스를 포함한다.
또 다른 구체예에 따라, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 뎅기 바이러스 유전자로부터 선택된다. 상기 바이러스의 상이한 혈청형들로부터 유래된 상동성 유전자가 가장 바람직한데, 여기서 상기 유전자는 4종의 뎅기 바이러스 혈청형들 중 1종, 2종, 3종 또는 모두로부터 유래될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열은 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 유전자를 엔코딩한다. 바람직한 구체예에서, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 RSV-F 및/또는 RSV-G 단백질을 엔코딩한다. 바람직하게는, RSV 유전자 중 하나는 전장 길이이고 다른 하나는 트렁케이션되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 2개, 바람직하게는, 3개의 상동성 뉴클레오티드 서열은 에볼라바이러스(EBOV) 단백질을 엔코딩한다. 또한 에볼라바이러스(EBOV) 단백질을 엔코딩하는 3개의 상동성 뉴클레오티드 서열은, 물론 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열을 커버한다. 바람직한 구체예에서, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 EBOV 당단백질(GP)을 엔코딩한다. 바람직한 특정 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 EBOV 균주 EBOV-B(Bundibugyo), EBOV-S(수단 에볼라바이러스 균주 Gulu) 및 EBOV-Z(자이르 에볼라바이러스 균주 Mayinga)로부터의 당단백질 전구체 단백질을 엔코딩한다.
또 다른 구체예에서, 상기 상동성 뉴클레오티드 서열은 박테리아 중에서 선택된다. 적합한 박테리아의 대표적 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 나이세리아(Neisseria)(예를 들어, N. 고노레아(N. gonorrhea) 및 N. 메닌지티디스(N. meningitidis)); 보르데텔라(Bordetella)(예를 들어, B. 퍼투시스(B. pertussis), B. 파라퍼투시스(B. parapertussis) 및 B. 브론치셉티카(B. bronchiseptica)), 미코박테리아(Mycobacteria)(예를 들어, M. 튜버쿨로시스(M. tuberculosis), M. 보비스(M. bovis), M. 렙래(M. leprae), M. 아비움(M. avium), M. 파라튜버쿨로시스(M. paratuberculosis), M. 스메그마티스(M. smegmatis)); 레지오넬라(Legionella)(예를 들어, L. 뉴모필라(L. pneumophila)); 에스체리키아(Escherichia)(예를 들어, 장내독성(enterotoxic) E. 콜리(E. coli), 장출혈성(enterohemorragic) E. 콜리(E. coli), 장내병원성(enteropathogenic) E. 콜리(E. coli)); 시겔라(Shigella)(예를 들어, S. 손네이(S. sonnei), S. 디스엔테리애(S. dysenteriae), S. 플렉스네리(S. flexnerii)); 살모넬라(Salmonella)(예를 들어, S. 티피(S. typhi), S. 파라티피(S. paratyphi), S. 콜레라에수이스(S. choleraesuis), S. 엔테리티디스(S. enteritidis)); 리스테리아(Listeria)(예를 들어, L. 모노사이토제네스(L. monocytogenes)); 헬리코박터(Helicobacter)(예를 들어, H. 파일로리(H. pylori)); 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들어, P. 애루기노사(P. aeruginosa)); 스태필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들어, S. 아우레우스(S. aureus), S. 에피더미디스(S. epidermidis)); 엔테로코쿠스(Enterococcus)(예를 들어, E. 패칼리스(E. faecalis), E. 패시움(E. faecium)); 바실러스(Bacillus)(예를 들어, B. 안트라시스(B. anthracis)); 코리네박테리움(Corynebacterium)(예를 들어, C. 디프테리아(C. diphtheriae)), 및 클라미디아(Chlamydia)(예를 들어, C. 트라코마티스(C. trachomatis), C. 뉴모니애(C. pneumoniae), C. 프시타시(C. psittaci))를 포함한다. 기생충의 대표적 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 플라스모디움(Plasmodium)(예를 들어, P. 팔시파룸(P. falciparum)); 톡소플라스마(Toxoplasma)(예를 들어, T. 곤디(T. gondii)); 레스마니아(Leshmania)(예를 들어, L. 메이저(L. major)); 뉴모시스티스(Pneumocystis)(예를 들어, P. 카리니(P. carinii)); 및 쉬소스토마(Schisostoma)(예를 들어, S. 만소니(S. mansoni))를 포함한다. 진균의 대표적 일예는, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 칸디다(Candida)(예를 들어, C. 알비칸스(C. albicans)) 및 야스퍼질러스(Aspergillus)를 포함한다.
2개 이상의 뉴클레오티드 서열은 동일한 크기이거나 상이한 크기일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 것에 비해 트렁케이션되어 있다. 트렁케이션은 5' 또는 3' 말단에 존재할 수 있다.
다양한 구체예에서, 2개의 뉴클레오티드 서열의 300개 뉴클레오티드는 100개의 아미노산을 엔코딩하며, 상기 아미노산은 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 아미노산 동일성을 지닌다. 바람직한 구체예에서, 상기 아미노산 동일성은 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000개 이상의 연속된 아미노산의 스트레치 내에 존재한다.
바람직한 특정 구체예에서, 아미노산은 150개 또는 200개 이상의 연속된 아미노산의 스트레치 내에서 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 아미노산 동일성을 갖는다.
다른 바람직한 구체예에서, 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 단백질은 300개 또는 500개의 연속된 아미노산의 스트레치 내에서 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 아미노산 동일성을 갖는다. 다른 바람직한 구체예에서, 2개 이상의뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 단백질은 쌍별 비교(pairwise comparison)로 100, 200, 400, 600, 또는 800개의 연속된 아미노산의 스트레치 내에서 85%-100%, 특히 100% 아미노산 동일성을 갖는다.
본원에 사용된, "서열 동일성 퍼센트", 예컨대 "아미노산 동일성"을 설명하는 임의의 용어는 임의의 주어진 문제 서열과 대상 서열 사이의 동일성의 정도를 설명한다.
구체적으로, 하기 용어들은 2개 이상의 핵산, 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 서열 관계를 설명하기 위해 사용된다: "참조 서열", "비교창", "서열 동일성", "서열 동일성의 비율", 및 "실질적 동일성". "참조 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로서 사용되는 정의된 서열이다; 참조 서열은 더 큰 서열의 서브세트일 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여, 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 비교창에서 비교되고 최대 일치를 위해 정렬된 경우, 동일하거나 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 퍼센트(예를 들어, 쌍방 비교로 75% 동일성, 80% 동일성, 85% 동일성, 90% 동일성, 99%, 또는 100% 동일성)를 지니는 2개 이상의 서열 또는 하위서열(subsequences), 또는 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 수동 정렬과 육안 검사에 의해 측정된 지정된 영역을 지칭한다. 퍼센트는 동일한 핵산염기 또는 아미노산 잔기가 두 서열 내에 존재하여 매칭된 위치의 개수를 양산하는 위치의 개수를 결정하고, 비교창 내의 총 위치 개수로 상기 매칭된 위치의 개수를 나누고, 그 결과에 100을 곱함으로써 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여, 어구 "실질적으로 동일한"은, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 육안 검사에 의해 측정할 때, 최대 일치를 위해 쌍으로 정렬하고 비교할 때, 약 85% 이상, 약 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 100% 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 예시적인 구체예에서, 실질적 동일성은 약 50개 이상의 잔기 길이인 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 또 다른 예시적 구체예에서, 실질적 동일성은 약 100개 이상의 잔기 길이인 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 여전히 또 다른 예시적 구체예에서, 실질적 동일성은 약 150개 이상의 잔기 길이인 서열의 영역에 걸쳐 존재한다. 한 예시적 구체예에서, 서열은 핵산 또는 단백질 서열의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 한 서열이 참조 서열로 역할하고, 시험 서열이 이와 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터에 입력되고, 필요하다면, 하위서열 좌표가 고안되며, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터들이 고안된다. 디폴트 프로그램 파라미터들이 사용될 수 있거나, 다른 파라미터들이 설계될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 이후, 프로그램 파라미터들에 근거하여, 참조 서열 대비 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다.
본원에 사용된, "비교창"은 20 내지 600개, 일반적으로 20 내지 50개, 약 50 내지 약 100개, 약 100 내지 약 200개, 더 일반적으로 약 100 내지 약 150개, 또는 약 20, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 3000개 이상으로 구성된 군에서 선택된 연속된 위치들의 개수 중 어느 하나의 부분에 대한 참조를 포함하는데, 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 서열은 동일한 개수의 연속된 위치들의 참조 서열과 비교될 수 있다.
퍼센트 동일성은 셀러(Sellers)(SIAM J. of Applied Math 26; 787-793 (1974))와 동등한 것으로 밝혀진 니들(Needleman)과 분쉬(Wunsch)(J. Mol. BioL. 48; 443-453 (1970))의 정렬 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 퍼센트 동일성은, 예를 들어, 데버레욱스 등의 문헌[Devereux et al., Nucl. Acids Res. 12:387, 1984)에 소개된 GAP 컴퓨터 프로그램, 버전 6.0을 사용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있으며, 이러한 정렬 방법을 이용하는, 상기 프로그램은 UWGCG(University of Wisconsin Genetics Computer Group)으로부터 입수가능하다. GAP 프로그램을 위한 바람직한 디폴트 파라미터들은 하기한 것들을 포함한다: (1) 뉴클레오티드에 대한 1진수 비교 매트릭스(동일의 경구 1의 값 및 비동일의 경우 0의 값을 포함), 및 문헌[(Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979)]에 소개된 것과 같은, 그리브스코브와 부그제스(Gribskov and Burgess, Nucl Acids ReS. 14:6745, 1986)의 가중 비교 매트릭스; (2) 각 갭에 대한 3.0의 패널티와 각 갭 내의 각각의 심볼에 대한 추가 0.10 패널티; 및 (3) 말단 갭에 대한 노 패널티. 다른 적합한 도구는 VectorNTI Advance 프로그램(INVITROGEN)으로부터의 ContigExpress, 예를 들어, 2007년 출시된 버전 10.3.1을 사용하는 것이다.
본 발명에 따라서, 유전자 코드의 축퇴성은 분자내 재조합을 방지하기 위해 상동적이거나 동일한 뉴클레오티드 서열을 덜 상동적이게 만드는데 사용된다. 상기 차이는 천연적으로 뉴클레오티드 서열 내에 이미 포함되어 있을 수 있고/있거나 치환에 의해 인공적으로 포함된다. 다양한 구체예에서, 천연 또는 인공 치환에서 유래되는 상이한 뉴클레오티드들의 개수는 75개 이상, 80개 이상, 85개 이상, 90개 이상, 95개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상 또는 500개 이상이다. 바람직하게는, 상이한 염기의 개수는 75개 이상, 200개 이상 또는 450개 이상이다. 물론, 차이가 나는 개수는 실제로 달라지며, 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드의 개수에 따라, 각각, 증가된다.
바람직한 구체예에서, 75개 이상, 80개 이상, 85개 이상, 90개 이상, 95개 이상, 100개 이상, 125개 이상, 150개 이상, 175개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 450개 이상, 또는 500개 이상의 뉴클레오티드가 치환된다. 상기 치환은, 예를 들어, 침묵 돌연변이에 의해 포함된 이미 존재하는 상이한 뉴클레오티드의 개수와 독립적으로 인공적으로 도입된다.
다양한 구체예에서, 치환 후 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 또는 4개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치를 지니는 2개의 뉴클레오티드 서열이 바람직하다. 2개 이상의 뉴클레오티드 서열의 경우, 치환 후 20개 이하, 19개 이하, 18개 이하, 17개 이하, 16개 이하, 15개 이하, 14개 이하, 13개 이하, 12개 이하, 11개 이하, 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하 또는 4개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치가 바람직하다.
또 다른 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 300개, 400개, 500개, 600개, 700개, 800개, 900개, 100개, 1100개, 1200개, 1300개, 1400개, 1500개, 또는 1600개 이상의 뉴클레오티드로부터 치환된 75개 이상, 100개 이상, 150개 이상, 200개 이상, 250개 이상, 300개 이상, 350개 이상, 400개 이상, 또는 450개 이상의 뉴클레오티드를 지닐 수 있다.
본 발명의 정황에서, 상이한 뉴클레오티드로의 뉴클레오티드의 치환은 다른 뉴클레오티드에 의한 뉴클레오티드의 기술적 또는 인공적 대체를 의미한다. 바람직하게는, 치환된 뉴클레오티드는 엔코딩된 아미노산 서열을 변경시키지 않는다. 치환은 동일한 아미노산을 엔코딩하는 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열 내의 코돈을 식별하고, 상기 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열 중 한 서열 내의 코돈을 변경하여, 상기 코돈이 여전히 동일한 아미노산을 엔코딩하도록 함으로써 실행될 수 있다. 변형은 상기 상동성 뉴클레오티드 서열 중 하나, 둘, 또는 모두에서 이루어질 수 있다.
예를 들어, 아미노산 프롤린은 코돈 CCA, CCC, CCG 및 CCU에 의해 엔코딩된다(DNA 수준에서 U는 T로 치환됨). 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열 내에서 처음에 2개의 프롤린을 엔코딩하는 간단한 뉴클레오티드 서열인 CCCCCC는 상기 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열 중 한 서열에서, 2개의 프롤린을 엔코딩하는 CCACCG로 변경될 수 있다. 달리, 프롤린-프롤린을 엔코딩하는 서열 중 하나는 CCCCCG로 변경되고, 다른 하나는 CCACCC로 변경된다.
더 복잡한 일예는 아미노산 세린인데, 이것은 UCA, UCC, UCG, UCU, AGC 및 AGU에 의해 엔코딩된다. 유사하게, 처음에 2개의 상이한 세린을 엔코딩하는 UCAUCA는 다수의 상동 서열에서 AGCAGC(UCAUCA와 공통되는 뉴클레오티드를 공유하지 않음)와 UCGAGU(UCAUCA와 단지 한 위치 또는 AGCAGC와 2개 위치를 공유함) 등으로 변경될 수 있다. 이것은 세린-세린을 엔코딩하는 2개 이상의 뉴클레오티드 서열 내로 상이한 뉴클레오티드 변이체를 도입하여 더 높은 유동성을 가져온다.
바람직하게는, 본 발명에 소개된 코돈 최적화는 희귀 코돈들이 엔코딩된 단백질의 발현을 차단하거나 감소시키기 때문에 바람직한 숙주에 대한 희귀 코돈의 사용을 회피한다. 또한, 바람직한 숙주에 대하여 핵산 시그널을 도입할 수 있는 치환이 회피되는 것이 바람직하다. 그러한 시그널은, 이로만 국한되는 것은 아니지만, 스플라이싱 시그널, 종결 시그널, 및 개시 시그널을 포함한다. 바람직하게는, 하기 서열 모티프가 사용되는 벡터의 유형에 따라 회피될 수 있다.
예를 들어, 폭스바이러스 벡터에 존재하지 않는, 백시니아 바이러스 초기 전사 종결 시그널은 다수의 다른 벡터에서 회피될 필요가 없다:
- 내부 TATA-박스, chi-부위, 및 리보좀 진입 부위;
- AT-풍부 및 GC-풍부 서열 스트레치;
- ARE, INS, 및 CRS 서열 엘리먼트;
- 반복 서열 및 RNA 2차 구조;
- (낭성(cryptic)) 스플라이싱 도너 및 억셉터 부위, 및 분기점; 및
- 백시니아 초기 전자 종결 시그널: (TTTTTNT).
도면의 간단한 설명
본 발명은 도면을 참조하여 더 완전하게 이해된다:
도 1은 치환되고, 트렁케이션된 RSV-F_trunc (Fjrunc) 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드와 전장 RSV-F(F) 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 도시한다. 동일한 서열은 검은색으로 강조되어 있고, 치환된 뉴클레오티드는 비강조된 상태로 존재한다. 프라이머 A1과 B2의 위치가 표기되어 있다.
도 2는 트렁케이션된 RSV-FJrunc (Fjrunc) 단백질과 전장 길이 RSV-F (F) 단백질의 정렬을 도시한다. RSV-F의 전장 길이 서열은 50개 aa까지 트렁케이션되어 결과적으로 트렁케이션된 RSV-F_trunc 단백질을 초래한다. RSV-F_trunc 단백질은 전장 길이 단백질의 대략 91%를 커버한다.
도 3은 인간 세포주에서 재조합 MVA-BN® 바이러스로부터의 RSV-F 및 RSV-F_trunc의 발현을 도시한다. 상이한 MVA-BN® 기반 바이러스를 10의 MOI로 감염시키고, 감염 후 24시간 경과시 용해된, 감염된 인간 세포로부터의 추출물의 웨스턴 블랏. MVA-BN®(공 벡터 대조군; 레인 1), MVA-mBN172B(전장 길이 RSV-F를 지니는 재조합 MVA-BN®; 레인 2), MVA-mBN173B(트렁케이션된 RSV-F_trunc를 지니는 재조합 MVA-BN®; 레인 3) 및 레인 4: MVA-mBN175B(RSV-F 및 RSV-F_trunc를 지니는 재조합 MVA-BN®). 단백질의 계산된 분자량은 다음과 같다: RSV-F (61.6 kDa) 및 RSV-FJrunc (56.1 kDa).
도 4a-c는 MVA-mBN175B의 PCR 분석을 도시한다. RSV-F(F)와 RSV-F_trunc(Fjrunc)가 도시되어 있다. a. 다양한 프라이머 쌍을 이용한 PCR 결과. M = 마커(1 kb-래더, New England Biolabs). 레인 1은 MVA-mBN175B임. 레인 2는 양성 대조군 플라스미드(pBN345)임. 레인 3은 MVA-mBN®임. 레인 4는 물(water) 대조군임. 레인 5는 양성 대조군 플라스미드(pBN343)임. b. 도 4a에 도시된 PCRs에 사용된 프라이머의 위치를 보여주는 MVA-mBN 175B의 개략도. c. 프라이머들의 위치를 보여주는 야생형 MVA-mBN®의 개략도.
도 5a-c는 이중 재조합 MVA 내의 전장 길이 RSV-F 유전자(F)와 트렁케이션된 F 유전자(Ftrunc) 사이의 이론적 재조합 F/Ftrunc와 재조합 및 비-재조합 바이러스 및 대조군 플라스미드 내의 PCR 프라이머들의 위치를 도시한다. a. MVA-mBN175B. b. pMISC173. c. pMISC172.
도 6은 MVA-mBN 175B로 감염시킨 세포에서 분리된 DNA에 대한 PCR 분석을 도시한다. 레인 1 및 7은 마커 레인임. 레인 2는 MVA-mBN 175B임. 레인 3은 F 유전자에 관한 플라스미드 대조군(pBN343)임. 레인 4는 트렁케이션된 F 유전자에 관한 플라스미드 대조군(pBN345)임. 레인 5는 MVA-BN®임. 레인 6는 물 대조군임. MVA-mBN175B 내에서 RSV-F 유전자와 트렁케이션된 F 유전자 RSV-F_trunc 사이의 이론적 재조합으로부터 예상되는 PCR 생성물을 613개 염기쌍이다.
도 7은 3개의 EBOV(에볼라바이러스) GP(당단백질) 단백질 서열의 정렬을 도시한다. 에볼라바이러스 균주 EBOV-B, EBOV-S 및 EBOV-Z의 3개의 GP 단백질의 아미노산 서열이 정렬되어 있다. 갭은 정렬에서 허용되지 않았다. 3개의 단백질 서열 모두에서 전체적인 동일성은 48.5%이다. 회색 백그라운드: 3개의 단백질 서열 모두에서 동일함. 검은색 백그라운드: 2개의 단백질에서 동일함.
도 8a 및 8b는 재조합 MVA-BN® 기반 작제물에서 사용된 3개의 EBOV GP 코딩 서열의 정렬을 도시한다. 3종의 EBOV 균주 EBOV-B, -S 및 -Z에서 유래된 GP 유전자에 대한 코딩 서열은 최적화 이전(non-opt; 도 8a 참조) 및 이후(opt; 도 8b 참조)에 정렬되었다. 갭은 정렬에서 허용되지 않았다. 회색 백그라운드: 3개의 코딩 서열 모두에서 동일한 뉴클레오티드 위치. 검은색 백그라운드: 2개의 코딩 서열에서 동일한 뉴클레오티드 위치. 최적화 이전에(non-opt) 3개의 유전자의 뉴클레오티드 위치에서 동일성은 45.3%이고, 한편 최적화 이후(opt) 동일성은 44.6%이다.
도 9는 재조합 MVA-BN® 기반 작제물에서 사용된 3개의 EBOV GP 코딩 서열의 쌍대 정렬을 도시한다. 3종의 EBOV 균주 EBOV-B, -S 및 -Z에서 유래된 GP 유전자의 코딩 서열은 최적화 이전(non-opt; 도 9A 참조) 및 이후(opt; 도 9B 참조)에 정렬되었다. 갭은 정렬에서 허용되지 않았다. 회색 백그라운드: 코딩 서열에서 동일한 뉴클레오티드 위치. 최적화 이전에(non-opt) 및 이후(opt)에 3개의 유전자의 뉴클레오티드 위치에서 동일성은 표 C에 정리되어 있다.
도 10은 전장 길이(RSV-F) 및 트렁케이션된(RSV-F_trunc) 단백질을 포함하는 플라스미드 pMISC210의 제한 효소 절단 및 플라스미드 지도를 도시한다. 레인 1: RSV-F 및 RSV-F_trunc를 포함하는 플라스미드 pMISC210; 레인 2: RSV-F_trunc만 포함하는 대조군 플라스미드 pMISC209; 레인 3: 분자량 마커. 염기쌍(bp)에서 마커-밴드의 크기가 도시되어 있다.
실시예
실시예 1
치환되고, 트렁케이션된 F 유전자의 제조
전장 길이 RSV-F 단백질과 트렁케이션된 버전 RSV-F_trunc 둘 모두를 발현하는 재조합 MVA의 생성을 원하였다. 그러나, 반복 서열을 함유하는 MVA와 다른 백시니아 바이러스에 따른 결과에 근거하여, 분자내 재조합이 F 유전자의 2개 복제물들 사이의 재조합을 일으켜, 결과적으로 상기 F 유전자의 복제물 중 하나의 결실이 초래될 것으로 예상되었다.
2개의 F 유전자들 사이의 동일한 뉴클레오티드의 긴 스트레치의 존재를 최소화시키기 위해, F 유전자의 아미노산 서열을 유지시키면서, RSV-F_trunc 유전자를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 코돈을 치환하였다. 포유동물과 닭의 희귀 코돈의 사용을 회피하였다. 또한, 핵산 시그널을 도입할 수 있는 치환을 회피하였다. 그러한 시그널을 내부 TATA-박스, chi-부위, 및 리보좀 진입 부위; AT-풍부 및 GC-풍부 서열 스트레치; ARE, INS, 및 CRS 서열 엘리먼트; 반복 서열 및 RNA 2차 구조; (낭성) 스플라이싱 도너 및 억셉터 부위, 및 분기점; 및 백시니아 종결 시그널(TTTTTNT)을 포함하였다. 치환된 뉴클레오티드 서열은, 전장 길이 RSV-F 단백질에 대한 코딩 서열과 비교하여, 도 1에 도시되어 있다. 유의한 동일성이 2개의 코딩 서열 전체에 걸쳐 그대로 유지되지만, 2개의 코딩 서열 내의 9개를 초과하는 연속된 뉴클레오티드의 동일한 큰 스트레치는 남아 있지 않는다. 2개의 코딩 서열에 의해 엔코딩되는 단백질은 도 2에 정렬되어 있다. 2개의 단백질은 첫번째 524개의 아미노산에 걸쳐 100% 동일성을 갖는다(치환된 F 단백질은 카르복시 말단에서 트렁케이션되어 있다). 따라서, 이러한 2개의 코딩 뉴클레오티드 서열이 동일한 아미노산의 스트레치를 엔코딩하지만, 서열들 중 하나는 다른 서열과 대비하여 치환되었다.
실시예 2
RSV -F 유전자를 포함하는 재조합 바이러스의 제조
전장 길이 RSV-F 유전자를 엔코딩하는 DNA를 2개의 상이한 통합 부위에서 MVA 내로 삽입하여 MVA-mBN170B와 MVA-mBN172B(IGR88/89 부위 내)를 생성시켰다. 치환된, RSV-F_trunc 유전자를 IGR148/149 부위에서 MVA 내로 삽입하여 MVA-mBN173B를 생성시켰다.
이후 IGR88/89 부위에서 MVA 내로 삽입된 전장 길이 RSV-F 유전자 및 IGR148/149에서 동일한 MVA에 삽입된 치환된 RSV-FJrunc 유전자를 포함하는 이중 재조합 MVA를 생성시켰다. 이중 재조합 바이러스를 MVA-mBN175B로 명명하였다. 이 바이러스의 개략도는 도 4b에 도시되어 있다.
실시예 3
재조합 바이러스로부터 단백질의 발현 단백질이 치환된 뉴클레오티드 서열에서 발현되는지 여부를 결정하기 위해, 웨스턴 블랏 분석을 전장 길이 RSV-F 유전자를 엔코딩하는 재조합 MVA-BN®-기반 바이러스(MVA-mBN172B), 치환된 RSV-F_trunc 유전자를 엔코딩하는 바이러스(MVA-mBN173B), 및 전장 길이 및 RSV-F_trunc 유전자 둘 모두를 엔코딩하는 이중 재조합 바이러스(MVA-mBN175B)를 감염시킨 인간 세포주로부터의 단백질 추출물에 대해 수행하였다. 3종의 바이러스 모두가 웨스턴 블랏 분석에 의해 적절한 크기의 RSV-F 단백질의 생산을 나타내었고(도 3), 반면, MVA-BN® 대조군(공 벡터)은, 예상한 것과 같이, 임의의 밴드를 나타내지 않았다. 따라서, 치환된 코딩 뉴클레오티드 서열에서 발현된 전장 길이 및 트렁케이션된 F 단백질은 단일 재조합 MVA-BN®로부터 개별적으로 발현되었으나, 또한 둘 모두가 인간 세포주에서 하나의 이중 재조합 MVA-BN® 바이러스(MVA-mBN175B)에서 동시-발현되었다.
실시예 4
재조합 바이러스의 성장
닭 배아 섬유아세포를 MVA-mBN175B, 전장 길이 F 유전자와 치환된 RSV-F_trunc 유전자 둘 모두를 포함하는 작제물, 또는 오직 전장 길이 F 유전자만 포함하는 작제물로 감염시켜 첫 번째 바이러스 미정제 원액을 수득하였다. 오직 전장 길이 F 유전자만을 포함하는 바이러스의 역가(1.46 x 107 TCID50)와 비교하여, 전장 길이 F 및 트렁케이션된 F 유전자 둘 모두를 포함하는 이중 재조합 바이러스는 유사한 역가(1.34 x 107 TCID50)를 나타내었다. 이러한 결과는 안정한 이중 재조합 MVA가 생산되었으며, F 유전자의 2개의 복제물들 사이의 재조합이 서열 내의 뉴클레오티드 염기들을 치환함으로써 제한되었음을 제시한다.
실시예 5
재조합 바이러스의 PCR 분석
PCR 분석을 도 4b와 c에 도시된 삽입-특이적(insert-specific) 및 플랑크-특이적(flank-specific) 프라이머를 사용하여 MVA-mBN175B 또는 MVA-BN®를 감염시킨 세포로부터의 DNA에 대해 실시하였다. 전장 길이 F 유전자에 특이적인, 프라이머 A1/A2를 사용한 PCR A로, 예상한 것과 같은, MVA-mBN175B를 감염시킨 세포에서 그리고 특이적 플라스미드 양성 대조군에서 663개 염기쌍(bp) 크기를 지니는 밴드를 검출하였다. 예상한 것과 같이, 이 밴드는 MVA-BN®을 감염시킨 세포 또는 물 대조군에 비존재한다(도 4a). 치환되고 트렁케이션된 F 유전자에 특이적인, 프라이머 B1/B2를 사용한 PCR B로, 예상한 것과 같이, MVA-mBN175B를 감염시킨 세포에서, 그리고 특이적 플라스미드 양성 대조군에서 625개 염기쌍(bp) 크기를 지니는 밴드를 검출하였다. 예상한 것과 같이, 이 밴드는 MVA-BN®를 감염시킨 세포 또는 물 대조군에 존재하지 않는다(도 4a). IGR88/89 부위 내로의 삽입물을 검출하는, 프라이머 C1/C2를 사용한 PCR C로 예상한 것과 같이, MVA-mBN175B를 감염시킨 세포에서 그리고 특이적 플라스미드 양성 대조군에서 2047개 bp 크기를 지니는 밴드를 검출하였다. 예상한 것과 같이, 이 밴드는 공 벡터 대조군 MVA-BN®를 감염시킨 세포에 비존재하며, 대신 161 bp의 밴드가 MVA-BN® 내의 IGR88/89에서 야생형 상황을 나타낸다(도 4a). IGR148/149 부위 내로의 삽입물을 검출하는, 프라이머 D1/D2를 사용한 PCR D로 예상한 것과 같이, MVA-mBN175B를 감염시킨 세포에서 그리고 특이적 플라스미드 양성 대조군에서 2062개 bp 크기를 지니는 밴드를 검출하였다. 예상한 것과 같이, 이 밴드는 공 벡터 대조군 MVA-BN®를 감염시킨 세포에 비존재하며, 대신 360 bp의 밴드가 MVA-BN® 내의 IGR88/89에서 야생형 상황을 나타낸다(도 4a).
F 유전자들 사이의 재조합은 야생형 F 유전자의 일부 및 트렁케이션된 F 유전자의 일부를 지니는 하이브리드 F 유전자를 생성시킬 것이다. (도 5a.) 임의의 그러한 재조합의 존재를 검출하기 위해, PCR 분석을, 재조합 F 유전자에 특이적인, 613개 염기쌍 생성물을 생성시켜야 하는, 프라이머 쌍 A1/B2를 사용하여 MVA-mBN175B 또는 MVA-BN®를 감염시킨 세포로부터의 DNA에 대해 실행하였다(도 5b). 이 PCR의 결과는 검출가능한 재조합을 나타내지 않았다. (도 6) 이러한 결과는 안정한 이중 재조합 MVA가 생산되었으며, F 유전자들의 2개의 복제물들 사이의 재조합이 제한되었음을 제시한다.
실시예 6
3종의 상이한 에볼라바이러스( EBOV ) 균주의 재조합 당단백질( GP ) 유전자의 제조
3종의 에볼라바이러스(EBOV) 당단백질(GP)을 발현하는 재조합 MVA의 생성이 요망되었다. 여기서 사용한 EBOV 균주는 EBOV-B(Bundibugyo), EBOV-S(Sudan) 및 EBOV-Z(Zaire)인데, 모두 감염된 인간에서 높은 치사력을 나타내는 바이러스 균주에 속한다. 상기 3종의 GP는 48.5%의 전반적인 동일성을 공유하는데, 이것은 GP 단백질 중의 거의 모든 두 번째 아미노산이 3종의 균주 모두에서 동일하다는 것을 나타내며, 한편 2종의 균주의 조합물과 비교하여 전장 길이 단백질 서열에 걸친 퍼센트 동일성은 57.0 %와 64.2%이다(도 7).
3종의 EBOV GP 유전자 내부의 동일한 뉴클레오티드의 긴 스트레치의 존재를 최소화시키기 위해, 상기 3개의 GP 유전자의 엔코딩된 아미노산 서열을 유지하면서, 상기 3개의 뉴클레오티드 서열내의 코돈을 치환하였다. 포유동물과 닭의 희귀 코돈의 사용을 비롯한, 핵산 시그널을 도입시킬 수 있는 치환을 회피하였다. 그러한 시그널은 내부 TATA-박스, chi-부위, 및 리보좀 진입 부위; AT-풍부 및 GC-풍부 서열 스트레치; ARE, INS, 및 CRS 서열 엘리먼트; 반복 서열 및 RNA 2차 구조; (낭성) 스플라이싱 도너 및 억셉터 부위, 및 분기점; 및 백시니아 종결 시그널(TTTTTNT)을 포함하였다. ATG 개시 코돈 다음의 G는 고 발현을 가능케하고, 3종의 EBOV GP 유전자 모두의 본래의 코딩 서열 내에 존재하며, 유지되었다.
3개의 최적화된 EBOV GP 코딩 서열 각각에서 뉴클레오티드의 23.3 내지 24.9%가 교체되었으나(표 A 참조), 전반적인 동일성은 3종의 GP 코딩 서열 사이에서 급격하게 변경되지 않았다(표 B). 2가지 경우에서, 쌍대 비교는, 하기 표 B에 제시된 것과 같이, 심지어 코딩 서열의 최적화 이후에 미미하게 더 높은 동일성을 나타내었다.
표 A: 3개의 최적화된 EBOV GP 유전자에서의 뉴클레오티드 교체. 하기 표는 뉴클레오티드의 총 개수에 기초하여 상이한 EBOV 균주의 비최적화된(non-opt) 서열과 비교하여 최적화된 GP 코딩 서열(opt)내의 상응하는 위치에서의 변경된 뉴클레오티드의 개수를 [%]로 보여준다. nt의 총 개수는 1147개 이다.
Figure 112011046573911-pct00001
표 B: 3개의 EBOV GP 코딩 서열의 동일한 뉴클레오티드 위치. 하기 표는 뉴클레오티드의 총 개수에 기초하여 상이한 EBOV 균주의 2개의 GP 코딩 서열 내의 상응하는 위치에서 동일한 뉴클레오티드의 개수를 [%]로 보여준다.
Figure 112011046573911-pct00002
Figure 112011046573911-pct00003
3종의 EBOV 균주 EBOV-B, -S 및 -Z의 GP 코딩 서열의 쌍대 정렬은 뉴클레오티드 위치에서의 동일성과 동일성의 분포를 나타내었다(도 9). 결과적으로, 본 발명의 방법은 EBOV GP-서열 내의 동일한 뉴클레오티드의 더 짧은 스트레치를 야기시켰다. 동일한 연속 뉴클레오티드의 긴 스트레치를 고려할 때, 그러한 동일한 스트레치의 중단(interruption) 또는 단축은 특정 정도의 뉴클레오티드 동일성을 공유하는 서열들 사이의 재조합을 회피하기 위한 전략의 중요한 일부분이 된다는 것이 명백하다. 표 C에서(아래 참조), GP 코딩 서열의 쌍대 비교로부터의 동일한 연속 뉴클레오티드의 스트레치의 개수가 제시되어 있다. 최적화에 앞서, 최대 23 bp 길이의 스트레치가 존재하고, 요약하면, 10개 이상의 동일한 뉴클레오티드의 41개 스트레치가 존재한다. GP 유전자의 최적화된 버전에서, 단지 하나의 13 bp의 스트레치가 확인되고, 10개 이상의 동일한 뉴클레오티드의 7개 스트레치가 확인될 수 있다.
표 C: 동일한 연속 뉴클레오티드의 긴 스트레치. 이 표는 최적화 이전(non-opt) 및 이후(opt) EBOV GP 코딩 서열의 쌍대 비교시 특정 길이의 동일한 연속 뉴클레오티드의 스트레치의 개수를 보여준다. 쌍대 비교의 개수가 '취합된 개수' 컬럼에 요약되어 있다. 비최적화된 비교에서 가장 긴 스트레치는 23개의 연속된 동일한 뉴클레오티드이고, 한편, 최적화된 유전자에서, 이것은 최대 13개 뉴클레오티드로 감소된다. 10개 이상의 뉴클레오티드의 스트레치만 나열되어 있다.
Figure 112011046573911-pct00004
실시예 7
EBOV 균주의 GP 유전자를 지니는 재조합 MVA - BN ® 바이러스의 제조.
3개의 EBOV GP 유전자를 GeneArt(Regensburg, Germany)를 통해 합성하고, 이것을 재조합 벡터 내로 클로닝하여 MVA-BN® 내로 통합되게 하였다. 3종의 상이한 EBOV 균주로부터의 3개의 최적화된 상동 GP 유전자 서열을 포함하는 재조합 바이러스를 생성시켰다. 상기 3개의 삽입된 GP 코딩 서열의 전사는 상이한 개개의 초기-후기 프로모터에 의해 조절된다.
3개의 최적화된 EBOV-GP 서열에 대한 특이적 PCR 반응은 재조합 MVA-BN®에서 3개의 개개의 유전자의 존재를 나타내었다.
실시예 8
RSV -F 유전자를 포함하는 플라스미드의 제조
실시예1 내지 5에서 사용하였고 도 1에 도시된 RSV-F 유전자의 2개 버전을 한 플라스미드 내로 클로닝하고 표준 클로닝 기술을 사용하여 E. coli TZ101(Trenzyme GmbH, Konstanz, Germany)에서 유지하였다. 플라스미드(도 10의 플라스미드 지도 참조)를 분리하고, 제한 효소 AleI, DraIII 및 SpeI로 절단하고, 1 % TAE 아가로스 젤 상에서 분리하였다(도 10 참조). 전장 길이 RSV-F 단백질과 RSV-F_trunc 단백질을 엔코딩하는 pMISC210(레인 1)을 비롯한 RSV-F_trunc 단백질만을 엔코딩하는 대조군 플라스미드 pMISC209(레인 2)에 대한 밴드 패턴을 플라스미드의 전자 서열의 분석 결과로부터 예상되는 패턴과 비교하였다. pMISC210에 대한 예상된 밴드 크기는 404, 573, 809, 1923 및 4874 bp이었고, 한편 pMISC209의 경우, 573, 661, 809 및 4874 bp의 크기를 지니는 밴드 패턴이 예상되었다. 예상된 모든 밴드가 실험적으로 확인되었고, 추가 밴드는 실험적으로 발견되지 않았다. pMISC210에서 RSV-F 변이체들 간에 재조합이 일어난 경우, 하나 이상의 더 작은 단편들이 재조합 부위에 따라서 소실될 수 있다. 이것은 본 실시예에서 명확하게 확인되지 않았다. 따라서, 결과는 E. coli에서 2개의 RSV-F 유전자 (RSV-F 및 RSV-F_trunc)를 지니는 플라스미드 PMISC210의 안정성을 제시한다.
SEQUENCE LISTING <110> Bavarian Nordic A/S <120> Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences <130> BN65PCT <140> PCT/EP2009/008275 <141> 2009-11-20 <150> US 61/116,672 <151> 2008-11-21 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1725 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 1 atggatttgc caatcctcaa aacaaatgca attaccacaa tctttgctgc agtcacactc 60 tgtttcgctt ccagtcaaaa catcactgta gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 120 agcaaaggct atcttagtgc tttaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa 180 ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagacg ctaaggtaaa attgataaaa 240 caagaattag ataaatataa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 300 ccagcagcca acaatcgggc cagaagagaa ctaccaaggt ttatgaatta tacactcaac 360 aataccaaaa ataacaatgt aacattaagc aagaaaagga aaagaagatt tcttggcttc 420 ttgttaggtg ttggatctgc aatcgccagt ggcattgctg tatctaaagt cctgcaccta 480 gaaggggaag tgaacaaaat caaaagtgct ttactatcca caaacaaggc tgtagtcagc 540 ttatcaaatg gagttagtgt cttaaccagc aaagtgttag acctcaaaaa ctatatagat 600 aaacaattgt tacccattgt gaacaagcaa agctgcagca tatcaaacat tgaaactgtg 660 atagaattcc aacaaaagag caacagacta ctagagatta ccagggaatt tagtgttaat 720 gcaggtgtaa ctacacctgt aagcacttat atgttaacaa atagtgaatt attatcatta 780 atcaatgata tgcctataac aaatgatcag aaaaagttaa tgtccaacaa tgttcaaata 840 gttagacagc aaagttactc tatcatgtcc ataataaagg aggaagtctt agcatatgta 900 gtacaattac cactatatgg tgtaatagat acaccttgtt ggaaactaca cacatcccct 960 ctatgcacaa ccaacacaaa ggaagggtcc aacatctgtt taacaagaac cgacagagga 1020 tggtactgtg acaatgcagg atcagtgtct ttcttcccac aagctgaaac atgcaaagtt 1080 caatcgaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat 1140 ctctgcaaca ttgacatatt caaccctaaa tatgattgca aaattatgac ttcaaaaaca 1200 gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 1260 aaatgtacag catccaataa aaatcgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgtgat 1320 tatgtatcaa acaagggggt ggacactgta tctgtaggta atacgttata ttatgtaaat 1380 aagcaagaag gaaaaagtct ctatgtaaaa ggtgaaccaa taataaattt ctatgaccca 1440 ttagtgttcc cttctgatga atttgatgca tcaatatctc aagtcaatga gaagattaac 1500 cagagcctag catttattcg taaatccgat gaattattac ataatgtaaa tgttggtaaa 1560 tccaccacaa atatcatgat aactactata attatagtga ttatagtaat attgttatta 1620 ttaattgcag ttgggctgtt cctatactgc aaggccagaa gcacaccagt cacactaagc 1680 aaggatcaac tgagtggtat aaataatatt gcatttagta actga 1725 <210> 2 <211> 1575 <212> DNA <213> respiratory syncytial virus <400> 2 atggatctcc ccattctcaa gaccaacgcc atcaccacca tcttcgccgc cgtgaccctg 60 tgtttcgcca gcagccagaa catcaccgtg gagttctacc agagcacctg cagcgccgtg 120 agcaagggct acctgagcgc cctgaggacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180 ctgtccaaca tcaaagaaaa caagtgcaac ggcaccgacg ccaaagtgaa gctgatcaag 240 caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc 300 cctgccgcca acaacagagc caggcgcgag ctgccccggt tcatgaacta caccctgaac 360 aacaccaaga acaacaacgt gaccctgagc aagaagcgga agcggcggtt cctgggcttt 420 ctgctgggcg tgggcagcgc cattgccagc ggcattgccg tgtctaaggt cctgcatctg 480 gaaggcgagg tcaacaagat taagagcgcc ctgctgtcca ccaacaaggc cgtggtgtcc 540 ctgagcaacg gcgtgagcgt gctgaccagc aaggtgctgg atctgaagaa ctacatcgac 600 aagcagctgc tgcccatcgt gaataagcag tcctgcagca tcagcaacat cgagacagtg 660 atcgagttcc agcagaagag caaccggctg ctggaaatca cccgggagtt cagcgtgaat 720 gccggcgtga ccacccccgt gtccacctac atgctgacca acagcgagct gctgtccctg 780 atcaatgaca tgcccatcac caacgaccaa aagaaactga tgagcaacaa cgtgcagatc 840 gtgcggcagc agagctacag catcatgagc atcatcaaag aagaggtgct ggcctacgtg 900 gtgcagctgc ccctgtacgg cgtgatcgac accccctgct ggaagctgca caccagcccc 960 ctgtgcacca ccaacaccaa agagggcagc aacatctgcc tgacccggac cgataggggc 1020 tggtactgcg acaacgccgg cagcgtgtcc ttctttcccc aagccgagac ttgcaaggtg 1080 cagagcaaca gggtgttctg cgacaccatg aacagcctga ccctgcccag cgaagtgaac 1140 ctgtgcaaca tcgacatctt taaccccaag tacgactgca agatcatgac ctccaagacc 1200 gacgtgtcca gctccgtgat taccagcctg ggcgccatcg tgtcctgcta cggcaagacc 1260 aagtgcaccg ccagcaacaa gaaccggggc atcatcaaga ccttcagcaa cggctgcgac 1320 tacgtgtcca ataagggcgt ggacaccgtg tccgtgggca acacactgta ctacgtgaac 1380 aagcaggaag gcaagagcct gtacgtgaag ggcgagccca tcatcaactt ctacgacccc 1440 ctggtgttcc ccagcgacga gttcgacgcc agcatcagcc aagtgaacga gaagatcaat 1500 cagtccctgg ccttcatcag gaagagcgac gagctgctgc acaatgtgaa cgtgggcaag 1560 tccaccacca actga 1575 <210> 3 <211> 574 <212> PRT <213> respiratory syncytial virus <400> 3 Met Asp Leu Pro Ile Leu Lys Thr Asn Ala Ile Thr Thr Ile Phe Ala 1 5 10 15 Ala Val Thr Leu Cys Phe Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Val Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Thr Lys Asn Asn Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 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tcaagcggac ctcctttttc 60 ctctgggtca tcattctgtt tcagcggacc ttctccatcc ctctgggcgt gatccacaat 120 agcaccctcc aggtgtccga cgtggacaag ctcgtgtgcc gggacaagct gtcctccacc 180 aaccagctga gaagcgtggg gctgaatctc gagggcaatg gcgtggccac agacgtgccc 240 tccgccacaa agcgctgggg ctttcggagc ggcgtccctc ctaaagtcgt gaactacgag 300 gcaggggaat gggctgaaaa ttgttacaat ctcgagatca aaaaaccaga tggctctgag 360 tgcctgcctg ccgcaccaga cggcatcagg ggcttcccta gatgccgcta tgtgcacaag 420 gtgagtggta caggcccttg tgccggcgat tttgcctttc acaaagaggg ggctttcttt 480 ctgtacgaca ggctcgccag tacagtgata taccgaggta ctaccttcgc cgaaggcgtg 540 gtggcctttc tgattctgcc ccaggccaag aaggacttct tcagcagcca ccccctgaga 600 gaacccgtga acgccacaga ggaccccagc agcggctact acagcaccac aatcagatac 660 caggccacag gcttcggcac caatgagaca gagtacctgt tcgaggtgga caacctgacc 720 tacgtgcagc tggaaagccg gtttacccct cagttcctcc tgcagctcaa cgagacaatc 780 tacacctccg gcaagcggag caacacaaca ggcaagctca tctggaaagt gaaccccgag 840 atcgatacca ctatagggga gtgggctttc tgggaaacta agaagaacct cacccggaag 900 atcagatccg aggaactgtc cttcaccgtg gtgtccaacg gcgccaagaa catttcagga 960 cagagccccg ccagaacaag cagcgacccc ggcaccaaca ccacaaccga ggaccacaag 1020 atcatggcca gcgagaactc cagcgccatg gtgcaggtcc acagccaggg aagagaagcc 1080 gccgtgagcc acctgaccac actggccacc atcagcacca gcccccagag cctgaccacc 1140 aagcctggcc ccgacaacag cacacacaac acccccgtgt acaagctgga catcagcgag 1200 gccacccagg tggagcagca ccacagacgg accgacaacg acagcaccgc cagcgatacc 1260 ccttctgcca ccacagccgc cggaccccct aaggccgaga ataccaacac cagcaagagc 1320 accgactttc tggatccagc caccaccacc agtccacaga accacagcga aaccgccggc 1380 aacaacaata cccaccacca ggacaccggc gaggaaagcg ccagctctgg caagctgggc 1440 ctgattacca acacaatcgc cggcgtggcc ggactgatca ccggcggcag acggaccaga 1500 cgggaggcca tcgtgaacgc ccagcccaaa tgtaatccta atctccacta ttggaccaca 1560 caggacgagg gcgctgccat cggactggca tggattcctt acttcggacc agccgctgaa 1620 gggatctata tcgaggggct catgcataac caggatggtc tgatttgtgg tctccggcag 1680 ctggctaatg agacaacaca ggctctccag ctgtttctga gagccacaac agagctgaga 1740 accttcagca ttctcaaccg caaggctatt gacttcctgc tccaacgatg gggaggcaca 1800 tgccacatcc tggggcctga ttgttgtatc gaacctcacg attggacaaa gaacattaca 1860 gataagatcg atcagattat ccatgacttt gtggacaaga ccctgcccga tcagggcgac 1920 aacgataatt ggtggacagg gtggagacag tggattccag ccgggattgg cgtgaccggc 1980 gtgattatcg ccgtgatcgc cctgttctgc atctgcaagt tcgtgttctg a 2031

Claims (25)

  1. 300개 뉴클레오티드 크기의 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 백시니아 안카라(modified vaccinia Ankara, MVA) 바이러스 벡터로서, 상기 뉴클레오티드 서열 각각이 100개의 아미노산을 코딩하며, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩된 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니고; 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 뉴클레오티드 서열과 상이한 75개 이상의 뉴클레오티드를 지니며, 상기 상이한 뉴클레오티드는 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산을 변경시키지 않고, 상기 2개의 별개의(divergent) 서열은 10개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치(stretch)를 공유하는, 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 벡터.
  2. 제 1항에 따른 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 벡터를 제조하는 방법으로서,
    a) 100개의 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 제 1 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    b) 100개의 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 제 2 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계; 및
    c) 상기 2개의 별개의 뉴클레오티드 서열을 벡터 내로 삽입하는 단계를 포함하며,
    여기서 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩된 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니고,
    상기 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 뉴클레오티드 서열과 상이한 75개 이상의 뉴클레오티드를 지니며,
    상기 75개 이상의 상이한 뉴클레오티드는 치환되고,
    상기 상이한 뉴클레오티드들은 상기 2개의 뉴클레오티드 서열들에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산을 변경시키지 않고,
    상기 2개의 별개의 서열은 10개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치(stretch)를 공유하는, 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 벡터의 제조 방법.
  3. 300개 뉴클레오티드 크기의 2개의 뉴클레오티드 서열들을 포함하는 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 벡터 내부에서 분자내 재조합(intramolecular recombination)을 감소시키는 방법으로서,
    상기 뉴클레오티드 서열 각각이 100개 아미노산을 코딩하고, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩된 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니며,
    상기 방법이 하나 또는 둘 모두의 뉴클레오티드 서열(들) 내의 뉴클레오티드들을 치환하여 75개 이상의 뉴클레오티드들에서 차이를 나타내는 2개의 별개의(divergent) 서열들을 생성시키는 단계로서, 상기 치환된 뉴클레오티드들이 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산을 변경시키지 않는 단계를 포함하고, 상기 2개의 별개의 서열은 10개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치를 공유하는,
    변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스 벡터 내부에서 분자내 재조합을 감소시키는 방법.
  4. a) 100개의 아미노산을 코딩하는 300개의 뉴클레오티드 크기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 바이러스를 제공하는 단계; 및
    b) 100개의 아미노산을 코딩하는 300개 뉴클레오티드 크기의 제 2 뉴클레오티드 서열을 상기 바이러스로 삽입하는 단계를 포함하며,
    여기서 상기 2개의 뉴클레오티드 서열 각각에 의해 엔코딩된 상기 100개의 아미노산들은 75% 이상의 아미노산 동일성을 지니고,
    상기 2개의 뉴클레오티드 서열 중 하나는 다른 뉴클레오티드 서열과 상이한 75개 이상의 뉴클레오티드들을 지니며,
    상기 75개 이상의 상이한 뉴클레오티드는 치환되고,
    상기 상이한 뉴클레오티드들은 상기 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩되는 동일한 아미노산을 변경시키지 않고, 상기 2개의 별개의 서열은 10개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치(stretch)를 공유하는, 2개의 상동성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 백시니아 안카라(MVA) 바이러스를 생성시키는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열이 2개의 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 유전자, 또는 2개의 필로바이러스(Filovirus) 유전자인, 벡터.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 2개의 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 유전자가 RSV-F 유전자; RSV-G 유전자; 또는 RSV-F 및 RSV-G 유전자인, 벡터.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열은 전장 및 트렁케이션된 RSV-F 단백질을 엔코딩하고, 상기 2개의 별개의 서열은 9개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치를 공유하는, 벡터.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 2개의 필로바이러스(Filovirus) 유전자가 수단 에볼라바이러스 (Ebola virus Sudan) 및 자이르 에볼라 바이러스 (Ebola virus Zaire) 당단백질을 엔코딩하는, 벡터.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 2개의 별개의 서열은 SEQ ID NO:1 및 SEQ ID NO: 2, 또는 SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO: 13을 포함하는, 벡터.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열이 2개의 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 유전자, 또는 2개의 필로바이러스(Filovirus) 유전자인, 방법.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열은 전장 및 트렁케이션된 RSV-F 단백질을 엔코딩하고, 상기 2개의 별개의 서열은 9개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치를 공유하는, 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 상기 2개의 필로바이러스(Filovirus) 유전자가 수단 에볼라바이러스 (Ebola virus Sudan) 및 자이르 에볼라 바이러스 (Ebola virus Zaire) 당단백질을 엔코딩하는, 방법.
  13. 제 3항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열이 2개의 호흡기세포융합바이러스(respiratory syncytial virus, RSV) 유전자, 또는 2개의 필로바이러스(Filovirus) 유전자인, 방법.
  14. 제 3항에 있어서, 상기 2개의 뉴클레오티드 서열은 전장 및 트렁케이션된 RSV-F 단백질을 엔코딩하고, 상기 2개의 별개의 서열은 9개 이하의 연속된 뉴클레오티드의 동일한 스트레치를 공유하는, 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 2개의 필로바이러스(Filovirus) 유전자가 수단 에볼라바이러스 (Ebola virus Sudan) 및 자이르 에볼라 바이러스 (Ebola virus Zaire) 당단백질을 엔코딩하는, 방법.
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