JP2012509073A - 複数の相同ヌクレオチド配列を含むベクター - Google Patents
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Abstract
Description
− 内部TATAボックス、カイ(chi)部位、およびリボソーム進入部位、
− ATリッチ配列およびGCリッチ配列区間、
− ARE、INS、およびCRS配列エレメント、
− 反復配列およびRNA二次構造、
− (潜在性)スプライス供与部位と受容部位、および分岐点、ならびに、
− ワクシニア初期転写終結シグナル:(TTTTTNT)。
完全長RSV−Fタンパク質および切断型RSV−F_truncの両方を発現する組換えMVAの作製が望まれた。しかしながら、反復配列を含むMVAおよび他のワクシニアウイルスでの結果に基づいて、分子内組換えが、F遺伝子の2コピー間での組換えをもたらし、結果として、F遺伝子のコピーのうちの1つの欠失を生じるであろうことが予想された。
完全長RSV−F遺伝子をコードするDNAを、MVAの2つの異なる組み込み部位に挿入し、MVA−mBN170BおよびMVA−mBN172Bを作製した(IGR88/89部位において)。置換されたRSV−F_trunc遺伝子をMVAのIGR148/149部位に挿入し、MVA−mBN173Bを作製した。
タンパク質が、置換されたヌクレオチド配列から発現するかどうかを決定するために、完全長RSV−F遺伝子をコードする組換えMVA−BN(登録商標)に基づいたウイルス(MVA−mBN172B)、置換されたRSV−F_trunc遺伝子をコードするウイルス(MVA−mBN173B)、および完全長とRSV−F_trunc遺伝子の両方をコードする二重組換えウイルス(MVA−mBN175B)に感染したヒト細胞株からのタンパク質抽出物についてウェスタンブロット分析を行った。全ての3つのウイルスは、ウェスタンブロット分析により適切なサイズをもったRSV−Fタンパク質の産生を示したが(図3)、MVA−BN(登録商標)対照(空ベクター)は、予想通り、いかなるバンドも示さなかった。したがって、完全長タンパク質、および置換されたコードヌクレオチド配列から発現した切断型Fタンパク質が、ヒト細胞株において、単一組換えMVA−BN(登録商標)から個々に発現したが、両方はまた、1つの二重組換えMVA−BN(登録商標)ウイルス(MVA−mBN175B)からも同時発現した。
完全長F遺伝子および置換されたRSV−F_trunc遺伝子の両方を含む構築物であるMVA−mBN175B、または完全長F遺伝子のみを含む構築物を、ニワトリ胚線維芽細胞に感染させ、最初のウイルス粗製ストックを得た。完全長F遺伝子のみを含むウイルスの力価(1.46×107 TCID50)と比較して、完全長F遺伝子および切断型F遺伝子の両方を含む二重組換えウイルスの類似の力価(1.34×107 TCID50)が見られた。これらの結果は、安定な二重組換えMVAが産生されていること、およびF遺伝子の2つのコピー間での組換えが、配列におけるヌクレオチド塩基を置換することによって制限されていることを示した。
MVA−mBN175BまたはMVA−BN(登録商標)に感染した細胞由来のDNAについて、図4Bおよび図4Cに示された挿入断片(insert)特異的および隣接領域(flank)特異的プライマー対を用いてPCR分析を行った。完全長F遺伝子に特異的であるプライマーA1/A2でのPCR Aにより、予想通り、MVA−mBN175Bに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において663塩基対(bp)のサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、MVA−BN(登録商標)に感染した細胞、または水対照には存在しない(図4A)。置換された切断型F遺伝子に特異的であるプライマーB1/B2でのPCR Bにより、予想通り、MVA−mBN175Bに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において625bpのサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、MVA−BN(登録商標)に感染した細胞、または水対照には存在しない(図4A)。IGR88/89部位への挿入断片を検出するプライマーC1/C2でのPCR Cにより、予想通り、MVA−mBN175Bに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において2047bpのサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、空ベクター対照MVA−BN(登録商標)に感染した細胞には存在せず、代わりに、161bpのバンドがMVA−BN(登録商標)におけるIGR88/89での野生型の状況を示している(図4A)。IGR148/149部位への挿入断片を検出するプライマーD1/D2でのPCR Dにより、予想通り、MVA−mBN175Bに感染した細胞、および特定のプラスミド陽性対照において2062bpのサイズのバンドが検出された。このバンドは、予想通り、空ベクター対照MVA−BN(登録商標)に感染した細胞には存在せず、代わりに、360bpのバンドがMVA−BN(登録商標)におけるIGR88/89での野生型の状況を示している(図4A)。
3つのエボラウイルス(EBOV)糖タンパク質(GP)を発現する組換えMVAの作製が望まれた。本明細書で用いられるEBOV株はEBOV−B(Bundibugyo)、EBOV−S(スーダン)、およびEBOV−Z(ザイール)であり、全て、感染したヒトにおいて高致死性を有するウイルス株に属する。前記3つのGPは、48.5%の全体の同一性を共有し、全ての3つの株においてGPタンパク質のほぼ2つに1つのアミノ酸が同一であることを示しているが、2つの株の組合せの比較における完全長タンパク質配列のパーセント同一性は57.0%〜64.2%である(図7)。
3つのEBOV GP遺伝子がGeneArt(Regensburg、Germany)によって合成され、組換えベクターにクローニングされ、MVA−BN(登録商標)への組み込みが可能になった。3つの異なるEBOV株由来の3つの最適化相同GP遺伝子配列を含む組換えウイルスを作製した。3つの挿入されたGPコード配列の転写は、異なる個々の初期−後期プロモーターによって調節される。
実施例1〜5に用いられ、図1に示されたRSV−F遺伝子の2つのバージョンを、標準的なクローニング技術を用いて、1つのプラスミドにクローニングし、大腸菌(E.coli)TZ101(Trenzyme GmbH、Konstanz、Germany)中に維持した。プラスミド(図10のプラスミドマップを参照)を単離し、制限酵素Ale I、Dra III、およびSpe Iで消化し、1%のTAEアガロースゲル上で分離した(図10参照)。完全長RSV−Fタンパク質およびRSV−F_truncタンパク質をコードするpMISC210(レーン1)、ならびにRSV−F_truncタンパク質のみをコードする対照プラスミドpMISC209(レーン2)についてのバンドパターンを、プラスミドの電子データ配列の分析の結果から予想されるパターンと比較した。pMISC210についてのバンドの予想されるサイズは404bp、573bp、809bp、1923bp、および4874bpであり、一方、pMISC209については、573bp、661bp、809bp、および4874bpのサイズを有するバンドのパターンが予想された。実験により、全ての予想されたバンドが見出され、追加のバンドは見出されなかった。pMISC210中でRSV−F変異体間の組換えが起こった場合には、組換え部位に応じてより小さな断片の1つまたは複数が喪失されるであろう。これは、本実施例において明らかに見出されなかった。したがって、結果は、大腸菌における、2つのRSV−F遺伝子(RSV−FおよびRSV−F_trunc)を有するプラスミドpMISC210の安定性を示している。
Claims (8)
- それぞれが100アミノ酸をコードする、サイズが300ヌクレオチドの2つのヌクレオチド配列を含むベクターであって、
2つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる100アミノ酸が少なくとも75%のアミノ酸同一性を有し、
2つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも75ヌクレオチドを有し、
異なるヌクレオチドが前記2つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、ベクター。 - a)100アミノ酸をコードするサイズが300ヌクレオチドの第1のヌクレオチド配列を供給する段階、
b)100アミノ酸をコードするサイズが300ヌクレオチドの第2のヌクレオチド配列を供給する段階、
但し、2つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる100アミノ酸が少なくとも75%のアミノ酸同一性を有し、2つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも75ヌクレオチドを有し、異なるヌクレオチドが前記2つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、
c)2つの異なるヌクレオチド配列をベクターに挿入する段階
を含む、請求項1に記載のベクターを産生するための方法。 - それぞれが100アミノ酸をコードする、サイズが300ヌクレオチドの2つのヌクレオチド配列を含むベクター内での分子内組換えを低減させるための方法であって、2つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる100アミノ酸が少なくとも75%のアミノ酸同一性を有し、一方または両方のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドを置換して少なくとも75ヌクレオチドにおいて相違を示す2つの相違する配列を産生する段階を含み、異なるヌクレオチドが前記2つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、方法。
- ベクターがウイルスベクター、好ましくはポックスウイルスベクターである、請求項1に記載のベクター、または請求項2もしくは3に記載の方法。
- a)100アミノ酸をコードする、サイズが300ヌクレオチドのヌクレオチド配列を含むウイルスを供給する段階と、
b)100アミノ酸をコードする、サイズが300ヌクレオチドの第2のヌクレオチド配列を前記ウイルスへ挿入する段階と
を含み、2つのヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされる100アミノ酸が少なくとも75%のアミノ酸同一性を有し、かつ、
2つのヌクレオチド配列の一方が他方のヌクレオチド配列と異なる少なくとも75ヌクレオチドを有し、
異なるヌクレオチドが前記2つのヌクレオチド配列によってコードされる同一のアミノ酸を変化させない、
2つの相同ヌクレオチド配列を含むウイルス、好ましくはポックスウイルスを産生するための方法。 - ポックスウイルスがワクシニアウイルス、好ましくは、改変ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスである、請求項4または5に記載のベクターまたは方法。
- 少なくとも75の異なるヌクレオチドが置換されている、請求項1〜6のいずれか一項に記載のベクターまたは方法。
- 2つのヌクレオチド配列が2つの呼吸器合胞体ウイルス(RSV)遺伝子、特にRSV−Fおよび/もしくはRSV−G遺伝子、または2つの、好ましくは3つのフィロウイルス遺伝子、特にフィロウイルス糖タンパク質(GP)遺伝子である、請求項1〜7のいずれか一項に記載のベクターまたは方法。
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