JP2005525119A - 組換え鶏痘ウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）および１つのこうした組換え鶏痘ウイルスの遺伝子配列を含有するＤＮＡベクターに関する。本発明はまた、前記組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターを含有する薬剤組成物、感染性疾患または腫瘍疾患の治療のための前記組換え鶏痘ウイルスの使用、および前記組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターの産生法にも関する。本発明は、さらに、組換えＤＮＡベクターまたは組換え鶏痘ウイルスを含有する真核細胞または原核細胞に関する。本発明は外来ＤＮＡの新規挿入部位としてのＦＷＰＶ−Ｆ１１Ｌ遺伝子の同定に基づく。

Description

本発明は、組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）とともに、こうした組換え鶏痘ウイルスの遺伝子配列を含有するＤＮＡベクターに関する。さらに、本発明は、組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターを含んでなる薬剤組成物、感染性疾患または腫瘍疾患の治療のための組換え鶏痘ウイルスの使用、さらに組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターの調製法に関する。本発明は、最終的に、組換えＤＮＡベクターまたは組換え鶏痘ウイルスを含有する真核細胞または原核細胞に関する。

異なる属のポックスウイルスが既に組換えワクチンベクターとして確立されてきている（Ｍｏｓｓ、１９９６；Ｐａｏｌｅｔｔｉ、１９９６）。原型メンバーとして鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）を含む鳥ポックスウイルスから、これらが鳥細胞においてのみ複製することが知られている。哺乳動物細胞において、ウイルス増殖は、細胞種に応じて、複製周期の異なる時点で遮断されるが、ウイルス特異的に調節される遺伝子発現がある（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８；Ｓｏｍｏｇｙｉら、１９９３）。この特性を利用して、感染性疾患および癌に対する、ヒトを含む哺乳動物のワクチン接種用の安全で複製されないベクターとして、組換え候補鳥ポックスウイルスが開発された（Ｗａｎｇら、１９９５；Ｐｅｒｋｕｓら、１９９５；Ｒｏｔｈら、１９９６）。これらのワクチンのうちいくつかは、既に、臨床第１相試験（Ｃａｄｏｚら、１９９２；Ｍａｒｓｈａｌｌら、１９９９、Ｂｅｒｅｎｃｓｉら、２００１）または第２相試験（Ｂｅｌｓｈｅら、２００１）で試験されてきている。

さらに、より複雑なワクチン接種戦略は、おそらく、異なる抗原の同時発現、または抗原および免疫同時刺激分子の組み合わせの発現を必要とするであろう（Ｌｅｏｎｇら、１９９４；Ｈｏｄｇｅら、１９９９）。これらの遺伝子を、ウイルスゲノムの１つの部位に単一カセットの形で挿入してもよいし、または既に構築されているベクターウイルスが引き続き改善されることが可能であるように、連続して挿入してもよい。後者の場合、異なる安定な挿入部位の間で選択の自由があり、そして異なる部位への挿入のため、同じ選択戦略を反復可能であるように、選択可能マーカーを除去可能であることが望ましい。さらに、マーカー遺伝子の存在は、ヒトに使用するワクチンの場合には推奨し得ない。ショットガン挿入戦略によって、ＦＷＰＶゲノムにいくつかの挿入部位が同定されてきている（Ｔａｙｌｏｒら、１９８８；Ｊｅｎｋｉｎｓら、１９９１）。さらに、外来遺伝子の挿入は、ウイルスゲノム中の末端逆方向反復の領域中を（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌら、１９９０）、チミジンキナーゼ遺伝子などの非必須遺伝子を（Ｂｏｙｌｅ ＆ Ｃｏｕｐａｒ、１９８８）、またはコード遺伝子配列間の領域を（Ｓｐｅｈｎｅｒら、１９９０）、標的としてきている。

プラーク単離のために用いたマーカー遺伝子を使用後に欠失させる、組換えウイルスの生成のためのいくつかの戦略が記載されてきている。
第一の戦略は、ＦａｌｋｎｅｒおよびＭｏｓｓ（１９９０）に記載され、広く用いられている優性選択法であり、該方法において、選択可能マーカーは、プラスミド配列内の挿入カセットの外部に存在する。選択培地の存在下で、単一クロスオーバー事象によって生成され、そして全長プラスミド配列を含有する、組換えウイルスが得られる。隣接領域に反復配列が存在するため、これらの組換えウイルスは不安定である。選択培地の非存在下では、これらの反復間に位置するマーカー遺伝子は、第二の組換え後に欠失され、野生型（ｗｔ）ウイルスまたは安定な組換えウイルスいずれかの産生を生じる。後者は、プラーク法にしたがって再び単離され、そして続いてＰＣＲまたはサザンブロッティングによって同定されなければならない。

第二の方法は、各々直接反復方向のＰ７．５プロモーターの調節下で、標的タンパク質およびβ−ガラクトシダーゼを発現する組換えウイルスＦＷＰＶにおいて、プロモーター反復間で相同組換えが起こり、ｌａｃＺ遺伝子の欠失が導かれたことの観察に基づく（Ｓｐｅｈｎｅｒら、１９９０）。このため、マーカー遺伝子を失った組換えウイルスによって、白色プラークが形成された。ゲノム内相同組換えによって除去される一過性の選択可能マーカーとして、制御ワクシニアウイルスＫ１Ｌ遺伝子を用いて、組換えＭＶＡウイルスを産生する、同様の戦略が開発されてきている（Ｓｔａｉｂら、２０００）。

ＦＷＰＶは、ワクシニアウイルスよりゆっくりと増殖する。組換えウイルスの完全な複製能力を維持することは、潜在的なＦＷＰＶワクチン接種ウイルスの生成とともに使用のために非常に重要である。

現在までに存在しているベクターとは対照的に、本発明は、外来ＤＮＡの挿入後に増加したベクター安定性を生じるとともに、ワクチンベクターとして使用する際に、より高い安全性を生じ、そして同時に、組換えウイルスの選択中、完全な複製能力および最適な効率を維持する、組換え鶏痘ウイルスを提供する目的に基づく。

これらの目的は、独立請求項の主題によって達成されている。本発明の好ましい態様は、従属請求項に記載されている。
本発明にしたがった解決法は、外来ＤＮＡのための新規挿入部位としてのＦＷＰＶ−Ｆ１１Ｌ遺伝子の同定に基づく。Ｆ１１Ｌが突然変異したウイルスは、ＣＥＦ（ニワトリ胚線維芽細胞）感染後、効率的に複製する。マーカー遺伝子の一過性発現を可能にするＦ１１Ｌベクタープラスミドの有用性は、腫瘍モデル抗原、チロシナーゼを安定に産生する組換えＦＷＰＶウイルスの迅速な産生によって、示されてきている。

ＦＷＰＶのＦ１１Ｌ遺伝子は、それ自体既に知られており、そして正確に同定されてきている。Ａｆｏｎｓｏら、２０００の刊行物において、Ｆ１１Ｌ遺伝子相同体が、ゲノム１３１．３８７〜１３２．７３９位のＯＲＦ ＦＰＶ１１０として、正確に同定されてきている。しかし、Ａｆｏｎｓｏらは外来ＤＮＡの組込み部位としてのＦ１１Ｌ遺伝子の特性を開示していない。

外来ＤＮＡの組込み部位としてのＦ１１Ｌ遺伝子の使用は、いくつかの予期されぬ利点を提供する：まず、驚くべきことに、Ｆ１１Ｌ遺伝子内に外来ＤＮＡの１以上の挿入を含有する組換え鶏痘ウイルスが、慣用的なベクターと比較して、増加したベクター安定性を有することが見出されてきている。さらに、本発明の組換えＦＷＰＶが、ワクチンベクターとしてｉｎ ｖｉｖｏで使用するのに非常に安全であることが立証されてきている。本発明のＦ１１Ｌ遺伝子への挿入の別の利点は、この挿入を該遺伝子のいかなる部位で行ってもよいことである。

よって、基本的な考え方にしたがって、本発明は、Ｆ１１Ｌ遺伝子への外来遺伝子の１以上の挿入を含有する組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）を提供する。既に上述したように、ＦＷＰＶゲノムの１３１．３８７〜１３２．７３９位で挿入を行う。基本的には、Ｆ１１Ｌ遺伝子のどの位で挿入してもよいが、鶏痘ウイルスゲノムのヌクレオチド１３１．３８７〜１３２．７３９位に定義されるゲノム領域への挿入が好ましい。

本発明との関係において、外来ＤＮＡとしては、一般的に、そのＤＮＡが由来しない生物、細胞、またはウイルスなどのＤＮＡへ、遺伝子操作によって導入される、ＤＮＡいずれかを意味する。

好ましい態様にしたがって、外来ＤＮＡは、少なくとも１つの外来遺伝子を、所望によって該外来遺伝子の発現制御のための配列と組み合わせて含有する。
本発明の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）に含有される外来遺伝子は、好ましくは療法的に有用であるポリペプチドをコードし、そして／または検出可能なマーカーをコードし、そして／または選択可能遺伝子である。

本明細書において、レポーター遺伝子は、単純な生化学的方法または組織化学的方法によって検出可能な遺伝子産物の遺伝子を指す。用語、レポーター遺伝子と同義なのは、指標遺伝子またはマーカー遺伝子である。

本発明との関係において、選択可能遺伝子または選択可能マーカーは、それぞれ、ウイルスまたは細胞のために提供する遺伝子を指し、ここで、それぞれの遺伝子産物は、それぞれの遺伝子産物を合成しない、それぞれ、他のウイルスまたは細胞に勝った、それぞれ、増殖上の利点または生存上の利点を生じる。好ましくは、用いられる選択可能マーカーは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、大腸菌ハイグロマイシン耐性およびネオマイシン耐性のための遺伝子である。

外来ＤＮＡ配列は、それぞれ、例えば病原体または病原体の構成要素をコードする遺伝子でもよい。病原体は、疾患を引き起こすことも可能なウイルス、細菌および寄生虫、並びに、生物内で制御不能な増殖を示し、そしてしたがって病的増殖を導きうる腫瘍細胞を指す。こうした病原体の例は、Ｄａｖｉｓ， Ｂ．Ｄ．ら（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， 第３版， Ｈａｒｐｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ）に記載される。好ましい病原体は、インフルエンザウイルスまたははしか若しくは呼吸器合胞体ウイルス、デング熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、例えばＨＩＶ ＩおよびＨＩＶ ＩＩ、ヒト肝炎ウイルス、例えばＨＣＶおよびＨＢＶ、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、マラリア、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、および結核を引き起こすミコバクテリウムの構成要素である。

病原体の構成要素の具体的な例として、例えば言及したウイルスのエンベロープタンパク質（ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２、インフルエンザウイルスＨＡ−ＮＡ、ＲＳＶ Ｆ−Ｇ）、制御ウイルスタンパク質（ＨＩＶ Ｔａｔ−Ｒｅｖ−Ｎｅｆ、ＨＣＶ ＮＳ３−ＮＳ４−ＮＳ５）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の防御抗原タンパク質、熱帯熱マラリア原虫のメロゾイト表面抗原およびスポロゾイト周囲タンパク質、メラノーマ抗原としてのチロシナーゼタンパク質、またはヒトの腺癌抗原としてのＨＥＲ−２／ｎｅｕタンパク質がありうる。

腫瘍関連抗原をコードする好ましい遺伝子は、メラノーマ関連抗原、例えばチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１および２、それぞれ癌試験抗原または腫瘍試験抗原、例えばＭＡＧＥ−１、−２、−３、およびＢＡＧＥ、腫瘍上に過剰発現される、それぞれ非突然変異共有抗原またはいくつかの腫瘍種に共有される抗原、例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１およびｐ５３をコードするものである。

特に好ましいのは、ＨＩＶ、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の種または熱帯熱マラリア原虫の構成要素であるか、あるいはメラノーマ細胞の構成要素である、ポリペプチドである。

構成要素は、一般的に、免疫学的特性を示す、すなわち哺乳動物、特にヒトにおいて、免疫反応を誘導可能である、上に引用したものの構成要素を指す（例えば表面抗原）。
外来ＤＮＡ配列または遺伝子が発現されることが可能であるためには、遺伝子の転写に必要な制御配列がＤＮＡ上に存在していることが必要である。こうした制御配列（プロモーターと称される）は、当業者に知られており、例えばポックスウイルス特異的プロモーターが使用可能である。

好ましくは、検出可能マーカーは、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質である。
好ましい態様にしたがって、マーカー遺伝子および／または選択可能遺伝子は、除去可能である。冒頭に既に詳述したように、この特性は、異なる部位での挿入のため、同じ選択戦略を反復可能であるため、非常に大きな利点を提供する。さらに、マーカー遺伝子の存在は、ヒトに使用するワクチンの場合には推奨されるものではない。最終組換えウイルスゲノムからのこれらの遺伝子配列の欠失は、マーカー選択可能遺伝子発現カセットに隣接する同一遺伝子配列間のゲノム内相同組換えによって、外見上「自動的に」行われる。

別の基本的な考え方にしたがって、本発明は、Ｆ１１Ｌ遺伝子への外来ＤＮＡの少なくとも１つの挿入、並びに、さらに好ましくは原核細胞または真核細胞内のベクター複製のためのレプリコン、および原核細胞または真核細胞において選択可能な選択可能遺伝子またはマーカー遺伝子を含有する、本発明の組換え鶏痘ウイルスまたはその機能する部分を含有するＤＮＡベクターを提供する。原核宿主および真核宿主で使用する、有用なクローニングおよび発現ベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ニューヨーク（１９８９）に記載される。

本発明のＤＮＡベクターは、適切な宿主細胞において、ＤＮＡ複製能力を有する、複製可能な独立単位中で、役割を果たす。したがって、複製不能な外来ＤＮＡもまた、受動的に複製され、そしてその後、ベクターとともに単離および精製されることも可能である。本発明の組換え鶏痘ウイルス遺伝子配列に加えて、ＤＮＡベクターはまた、以下の配列要素も含んでもよい：遺伝子発現を増進させるエンハンサー、遺伝子発現の必須条件であるプロモーター、複製起点、レポーター遺伝子、選択可能遺伝子、スプライシングシグナル、およびパッケージングシグナル。

本発明のＤＮＡベクターは主に、ウイルスに感染した細胞において、相同組換えを介して、外来遺伝子の挿入を可能にするトランスファーベクターとして働く。一般的に、該ベクターは、制御要素が他のウイルスタンパク質の存在に依存するため、鶏痘ウイルス感染の背景において用いられる。

本発明にしたがって、組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターは、薬学的に許容しうる補助剤および／またはキャリアーと組み合わせてこれらを含んでなる、薬剤組成物中で提供される。薬剤組成物は、好ましくは、ワクチンである。

ワクチンを調製するため、本発明にしたがって生成されるＦＷＰＶを、生理学的に許容しうる型に変換する。これは、天然痘（ｐｏｃｋｓ）に対するワクチン接種に用いるワクチン調製における、長年の経験に基づいて行うことも可能である（Ｋａｐｌａｎ， Ｂｒ． Ｍｅｄ． Ｂｕｌｌ． ２５， １３１−１３５［１９６９］）。典型的には、約１０^６〜１０^７粒子の組換えＦＷＰＶを、バイアル中、好ましくはガラスバイアル中、２％ペプトンおよび１％ヒト・アルブミンの存在下、１００ｍｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥する。凍結乾燥物は、それぞれ、非経口投与に適した充填剤または希釈剤（例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドン）あるいは他の補助剤（例えば酸化防止剤、安定化剤など）を含有してもよい。次いで、ガラスバイアルをそれぞれ閉じるかまたは封印し、そして好ましくは−２０℃未満の温度で数ヶ月間保存することも可能である。

ワクチン接種のため、凍結乾燥物を０．１〜０．２ｍｌの水性溶液、好ましくは生理学的食塩水に溶解し、そして非経口経路によって、例えば皮内接種によって、投与してもよい。本発明のワクチンは、好ましくは、皮内経路によって注射される。注射部位で、わずかな腫脹および発疹、並びにときにはまた過敏症状も起こりうる。投与経路、用量、および投与回数は、既知の方式で、当業者によって最適化することも可能である。適用可能な場合、全体に渡って延長された期間に数回ワクチンを投与して、外来抗原に対して高レベルの免疫反応を達成することが好適である。

上述の主題、すなわち組換え鶏痘ウイルス、ＤＮＡベクターまたは薬剤組成物は、好ましくは、上に定義されるように、感染性疾患または腫瘍疾患の治療に用いられる。
本発明の鶏痘ウイルス、ＤＮＡベクターまたは薬剤組成物を、単独で（例えばワクチンとして）、またはいわゆる初回抗原刺激・追加免疫（ｐｒｉｍｅ ｂｏｏｓｔ）アプローチの背景において、予防的方式または療法的方式で用いることも可能である。言い換えると、本発明にしたがって鶏痘ウイルスのワクチン接種用量を反復投与することによって、鶏痘ウイルスワクチンに対する免疫反応をさらに増進させることも可能である。

本発明の鶏痘ウイルスを他のウイルスベクター、例えばＭＶＡと組み合わせることが特に有益である。
併用ワクチンの枠内で、上述のように、例えば、ＭＶＡまたはオルトポックスウイルス属に属する他のワクシニアウイルスを用いてもよい。ワクシニアウイルスの特定の株、例えば英国Ｌｉｓｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのエルスツリー株が、水痘に対する免疫のための生ワクチンとして長年使用されてきていることが知られている。ワクシニアウイルスはまた、外来抗原の生成および搬送のためのベクターとしてもしばしば用いられてきている（Ｓｍｉｔｈら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２， ３８３−４０７［１９８４］）。ワクシニアウイルスは、最もよく調べられている生ベクターの中の１つであり、そして例えば組換えワクチンとしての使用を支持する特別な特徴を示す：これらは非常に安定であり、費用効率が高い様式で調製可能であり、容易に投与可能であり、そして多量の外来ＤＮＡを取り込むことが可能である。ワクシニアウイルスは、抗体および細胞傷害性反応を両方誘導し、そしてより自然な方式で免疫系に抗原を提示することが可能であり、そして感染性疾患に対して防御するためのベクターワクチンとして成功裡に使用されているという利点を有する。

しかし、ワクシニアウイルスは、ヒトに感染性であり、そして実験室における発現ベクターとしての使用は、安全性の懸念および規制によって制限されている。文献に記載される組換えワクシニアウイルスの大部分は、ワクシニアウイルスのウェスタンリザーブ（ＷＲ）株に基づく。しかし、この株は高レベルの神経毒性を示すことが知られており、そしてしたがって、ヒトにおける使用には不十分にしか適用されない（Ｍｏｒｉｔａら， Ｖａｃｃｉｎｅ ５， ６５−７０（１９８７））。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの限定された増殖能およびｉｎ ｖｉｖｏでの無発病性によって特徴付けられる、非常に弱毒化されたウイルス株からワクシニアベクターを開発することによって、ＶＶの標準的な株に関する安全性の懸念に対して、取り組みがなされてきた。こうして、アンカラ株に基づいて、いわゆる修飾ワクシニアウイルス・アンカラ（ＭＶＡ）が培養されてきている。ＭＶＡウイルスは、ブダペスト条約の要件にしたがって、ＣＮＣＭに、寄託番号Ｉ−７２１で、１９８７年１２月１５日に寄託された。

しかし、同様の特性を持つ他の無発病性ワクシニアウイルスおよびポックスウイルスベクター、例えばワクシニアウイルスの組換え型、ＮＹＶＡＣ、ＣＶ−Ｉ−７８、ＬＣ１６ｍ０、およびＬＣ１６ｍ８、並びに、組換えパラポックスウイルス、例えば弱毒化ＯｒｆウイルスＤ１７０１もまた、上述のワクチン接種スケジュールに使用可能である。ポックスウイルスに加えて、アデノウイルス（特にヒトアデノウイルス５）、オルトミクソウイルス（特にインフルエンザウイルス）、ヘルペスウイルス（特にそれぞれヒトまたはウマ・ヘルペスウイルス）、またはアルファウイルス（特にセムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、およびウマ脳炎ウイルス（−ＶＥＥ））も、他のウイルスベクターとして使用可能である。

初回抗原刺激−追加免疫アプローチの枠内で、本発明の鶏痘ベクターは、好ましくは、最初の免疫、すなわち初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）において、投与される。
例えば感染性疾患または腫瘍疾患に対する防御ワクチン接種の枠内で、あるいはまた該疾患の治療においても用いてもよい、本発明のワクチン接種スケジュールは、以下のように行われる：
動物、好ましくはヒトの免疫のため、本発明の方法は、好ましくは以下の工程：
ａ）療法的に有効な量の本発明の鶏痘ウイルス、本発明のＤＮＡベクターまたは薬剤組成物で、動物を初回抗原刺激し（ｐｒｉｍｉｎｇ）、
ｂ）所望によって、１週間〜８ヶ月の間の後、１〜３回の間で、前記工程ａ）を反復し；そして
ｃ）本発明の鶏痘ベクターと同一の外来ＤＮＡを含有する、療法的に有効な量の別のウイルスベクターで、動物を追加免疫する
工程を含んでなる。

好ましくは、初回抗原刺激工程（ｔｈｅ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｔｅｐ）を、追加免疫工程前に２回行い、そして特に好ましくは、初回抗原刺激工程を治療開始時、および免疫第３週〜第５週、好ましくは第４週に行い、追加免疫工程を免疫第１１週〜第１３週、好ましくは第１２週に行う。

これに関連して、本発明はまた、ワクチン接種用の上述した個々の構成要素を連続して使用するための併用調製にも関する。こうした併用調製は、以下の構成要素からなる：
ａ）所望によって薬学的に許容しうるキャリアーを含有する、本発明の組換え鶏痘ウイルスまたは本発明のＤＮＡベクター、
ｂ）ａ）記載の鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターと同一の外来抗原をコードする別のウイルスベクター。

上述の初回抗原刺激−追加免疫プロトコルは、本発明の鶏痘ウイルスまたはＭＶＡなどの別のベクターいずれかの単独でのワクチン接種より優れた免疫反応を提供する。
組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターの調製のための本発明の方法は、組換えＤＮＡ技術による、鶏痘ウイルスのＦ１１Ｌ遺伝子への外来ＤＮＡの導入を含んでなる。好ましくは、Ｆ１１Ｌ特異的配列を含有する外来ＤＮＡとウイルスＤＮＡの相同組換えによって導入を行い、その後、組換えウイルスまたはＤＮＡベクターの増殖および単離を行う。

さらに、本発明は、本発明の組換えＤＮＡベクターまたは組換えＦＷＰＶを含有する真核細胞または原核細胞を提供する。原核細胞として、好ましくは細菌細胞、好ましくは大腸菌細胞を用いる。真核細胞として、鳥細胞、好ましくはニワトリ細胞、または哺乳動物由来の細胞、好ましくはヒト細胞であって、ヒト胚幹細胞及びヒト生殖細胞を除外したヒト細胞が使用可能である。

本発明のＤＮＡベクターを、トランスフェクションによって、例えばリン酸カルシウム沈殿によって（Ｇｒａｈａｍら， Ｖｉｒｏｌ． ５２， ４５６−４６７［１９７３］；Ｗｉｇｌｅｒら， Ｃｅｌｌ ７７７−７８５［１９７５］）、エレクトロポレーションによって（Ｎｅｕｍａｎｎら， ＥＭＢＯ Ｊ． １， ８４１−８４５［１９８２］）、マイクロインジェクションによって（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１， ４８２−４９２（１９８３））、リポソームによって（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １０１， ５１２−５２７（１９８３））、スフェロブラストによって（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７， ２１６３−２１６７（１９８０））、または当業者に知られる他の方法によって、細胞に導入してもよい。好ましくは、リン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクションを用いる。

以下で、本発明は実施例および付随する図によって例示されるであろう。

（実施例）
材料および方法
細胞およびウイルス
１１日齢の同腹の卵を用いて、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を調製し、そして１０％ラクトアルブミン（Ｇｉｂｃｏ）および５％基本培地補充剤（ＢＭＳ−Ｓｅｒｏｍｅｄ）を含むＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。弱毒化株ＨＰ１−４３８のよく性質決定されたプラーク単離体、ＦＷＰＶ−ＦＰ９（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、１９９８）を、ＣＥＦ上、２％ＦＣＳを補充したＭＥＭの存在下で培養した。

ゲノムＦＷＰＶ ＤＮＡの配列決定
ＣＥＦ上で培養したＦＷＰＶ−ＦＰ９を凍結融解周期後に採取した。先に記載されたように（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、１９９８）、超遠心によってウイルスを濃縮し、そして２５％（ｗ／ｗ）スクロース・クッションを介して半精製した。１％ＳＤＳ、１００μＭ β−メルカプトエタノールおよび５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８にペレットを再懸濁し、そして５０℃で１時間インキュベーションした。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡを単離し、エタノールで沈殿させ、そしてＨ_２Ｏに再懸濁した。ウイルスＤＮＡ上のプライマーウォーキングによって、配列決定を行った。寄託番号Ｍ８８５８８で、Ｏｇａｗａら（１９９３）に公表されたハト（ｄｏｖｅ）ポックスＦ１１Ｌ遺伝子の部分配列に関連して、第一のプライマー（ＰＲ３０）を設計した。配列決定に用いたプライマーは以下のとおりであった：ＰＲ３０：５’−ＣＴＣＧＴＡＣＣＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＴＧ−３’、ＰＲ３１：５’−ＧＧＴＡＧＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＧＣＣＧ−３’、ＰＲ３２：５’−ＧＡＴＧＧＴＣＧＴＣＴＧＴＴＡＴＣＧＡＣＴＣ−３’、およびＰＲ３３：５’−ＧＴＣＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＡＴＧＴＡＡＡＡＣ−３’。

プラスミド構築
（ａ）ｐＢＳＬＧ。Ｓｕｔｔｅｒ ＆ Ｍｏｓｓ（１９９２）に記載されるプラスミドｐＩＩＩＬＺｇｐｔに含有されるカセットに対応し、そして後期ワクシニアウイルスプロモーターＰ１１の調節下にある大腸菌ｌａｃＺ遺伝子および初期／後期ワクシニアウイルスプロモーターＰ７．５の調節下にある大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含有する、４．２ｂｐのｌａｃＺ ｇｐｔカセットを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のマルチクローニングサイトに直接挿入して、プラスミドｐＢＳＬＧを得た。

（ｂ）ｐＬＧＦ１１。ＰＣＲによって、ゲノムウイルスＤＮＡの長い隣接１配列４７１塩基対（ｂｐ）を増幅するテンプレートとして、それぞれＮｏｔＩおよびＳｍａＩ制限部位（下線部）を含有するプライマーＰＲＦ１（５’−ＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＡＣＣＧＧ−３’）およびＰＲＦ２（５’−ＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＴＴＡＣＧＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧＣ−３’）を用いた。この断片を、あらかじめ同じ酵素で切断しておいたｐＢＳＬＧに挿入して、ｐＢＳＬＧＦ１１を得た。それぞれＰｓｔＩおよびＳａｌＩ制限部位（下線部）を含有するプライマーＰＲＦ３（５’−ＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＴＧＣ−３’）およびＰＲＦ４（５’−ＣＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＴＣＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＴＣＧＣＴＧＣ−３’）を用いることによって、隣接２（５３４ｂｐ）を増幅した。この断片を、あらかじめこの２つの酵素で切断しておいたｐＢＳＬＧＦ１１に挿入して、ｐＬＧＦ１１を得た。

（ｃ）ｐＩＩＩＶ７．５Ｆ１１ＲｅｐおよびｐＬＧＦＶ７．５。ＰＣＲによって、隣接２の５’端の反復に相当する長さ２６３ｂｐの配列を増幅するため、それぞれＳｎａＢＩおよびＮｏｔＩ制限部位（下線部）を含有するプライマーＰＲＦ５（５’−ＧＧＣＣＣＴＡＣＧＴＡＧＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＣＧＴＡＡＴＧＣ−３’）およびＰＲＦ６（５’−ＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＣ−３’）を用いた。この断片を、あらかじめ同じ制限酵素で消化しておいたプラスミドｐＩＩＩｄｈｒＰ７．５（Ｓｔａｉｂら、２０００）のワクシニアウイルスＰ７．５プロモーター配列の上流に挿入した。次いで、こうして得たプラスミドから、ＰｓｔＩでの消化によって隣接２−反復−Ｐ７．５−プロモーターカセットを切除し、クレノウポリメラーゼで処理し、そしてｐＬＧＦ１１のＳｍａＩ部位に挿入して、挿入プラスミドｐＬＧＦＶ７．５を得た。

（ｄ）ｐＬＧＦＶ７．５−ｍＴｙｒ。プラスミドｐＬＧＦＶ７．５中のワクシニアウイルスＰ７．５プロモーター配列下流のユニークなＰｍｅＩ部位を用いて、マウスのチロシナーゼをコードする遺伝子をこのプラスミドに挿入した。プラスミドｐＺｅｏＳＶ２＋／ｍｕＴｙ（Ｄｒｅｘｌｅｒら、未公表の結果）をＮｈｅＩおよびＮｏｔＩで消化した。望ましい断片をクレノウポリメラーゼで処理し、そしてｐＬＧＦ７．５の平滑端ＰｍｅＩ制限部位に挿入して、プラスミドｐＬＧＦＶ７．５−ｍＴｙｒを得た。

突然変異体ＦＷＰＶウイルスの調製
リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、ＦＷＰＶ ＦＰ９に感染させたＣＥＦにプラスミドｐＬＧＦ１１をトランスフェクションした。ウイルスを採取し、そしてミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンを含有する寒天（ＭＨＸ−培地）に蒔いた。Ｘｇａｌコートを用いて、β−ガラクトシダーゼ陽性プラークを形成するウイルスを視覚化し、そして選択培地の存在下で、プラークを２回精製した。青いプラークが１００％得られるまで、選択培地なしに、ｌａｃＺ／ｇｐｔ＋ウイルスをさらに精製した。

ウイルスＤＮＡのＰＣＲ解析
先に記載されるように（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、１９９８）、選択された、異なるウイルス単離体に感染させたＣＥＦをプロテイナーゼＫで処理した後、総ＤＮＡを単離し、そしてプライマーＰＲＦ１およびＰＲＦ４を用いたＰＣＲによって解析して、ｗｔ配列の存在に関して試験するとともに、プライマーＰＲＦ１およびＰＲＦ２を用いたＰＣＲによって解析して、ＤＮＡの存在に関して試験した。

ウイルス増殖の解析
集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）ＣＥＦを、０．０５ｐｆｕ／細胞の感染効率（ｍｏｉ）でｗｔウイルスまたはＦ１１Ｌ突然変異体に三つ組で感染させた。１時間後に接種物を除去して、そして新鮮な培地と交換した。感染後、異なる時点で、インキュベーターからフラスコを取り除いて、そして−８０℃で保存した。低速でウイルス懸濁物を清浄化した後、プラーク試験によって力価を決定した。

組換えウイルスの調製
ＦＷＰＶ ＦＰ９に感染させたＣＥＦに、直線化ｐＬＧＦＶ７．５−ｍＴｙｒプラスミドＤＮＡ（図２）をトランスフェクションした。選択培地の存在下で組換えウイルスを３回精製した。隣接２および隣接２反復間で新たな組換えを起こして、ｌａｃＺ ｇｐｔサブカセットの欠失を導くため、ＣＥＦ上で一度増殖させた青いプラーク単離体を、選択培地の非存在下でさらに精製した。続いて、白いプラークを形成するウイルスをプラーク精製した。次いで、選択カセットの存在にアクセス可能であるように、ｌａｃＺ配列に特異的な２つのプライマー（ＰＲ４３：５’−ＧＡＣＴＡＣＡＣＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＣＣ−３’およびＰＲ４４：５’−ＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＧＴＣＧ−３’）を用いてさらにＰＣＲを行う、前述のようなＰＣＲによって、こうして得たクローンを試験した。

Ｆ１１Ｌ遺伝子の配列解析
ＦＷＰＶ−Ｆ１１Ｌ遺伝子は、ウイルスゲノムの中央領域に位置する（図１Ｂ）。ＣＥＦに適応させたワクシニアウイルス株ＭＶＡのゲノムにおいて、それぞれのオープンリーディングフレームは断片化されている（Ａｎｔｏｉｎｅら、１９９８）ため、我々は、該遺伝子は、ＦＷＰＶ複製にはおそらく必須ではないと推測した。ハト・ポックスウイルスのオルソロガスなＦ１１Ｌ遺伝子のＣ末端部分配列、並びに、Ｆ１２Ｌハト・ポックスウイルス・オルソログをコードする全長遺伝子およびＦ１３Ｌオルソログの部分配列が既に知られている（Ｏｇａｗａら、１９９３；寄託番号Ｍ８８５８８）。この公表された配列は、全長Ｆ１３Ｌオルソログおよびほぼ完全なＦ１２Ｌオルソログを含んでなるＦＷＰＶ配列と重複する（Ｃａｌｖｅｒｔら、１９９２；寄託番号Ｍ８８５８７）。２つの配列は２５９８ｂｐ重複し、そして１００％ヌクレオチド同一性を示す。Ｆ１１Ｌオルソログもまた、ハト・ポックスウイルスおよび鶏痘ウイルス間で非常に保存されていると仮定して、部分的ハト・ポックスＦ１１Ｌ配列（４５３ｂｐ）を用い、ＦＷＰＶ遺伝子の配列決定に用いる第一のプライマー（ＰＲ３０）を設計した（図１Ａ）。このプライマーを用いることによって得られる配列（４８８ｂｐ）は、公表されたハト・ポックス配列の端と１００％のヌクレオチド同一性を示した。新規配列を用いて、Ｆ１１Ｌ遺伝子配列を２回カバーする重複を生成する、続くプライマー（ＰＲ３１〜３３）を設計した（図１Ａ）。ＦＷＰＶ Ｆ１１Ｌ ＯＲＦの最後の１２５４ｂｐに関して配列決定を行った（図１Ａ）。ＦＷＰＶの公表された全長ゲノム配列（Ａｆｏｎｓｏら、２０００）と比較することによって、この配列が、オルソロガスなＦＷＰＶ Ｆ１１Ｌ遺伝子の、ＯＲＦ ＦＰＶ１１０の公表された配列と同一であることが明らかになった。

ワクシニアウイルスＭＶＡのＦ１１Ｌコード配列のリーディングフレームシフトによって、Ｆ１１Ｌがおそらく、挿入部位として使用可能な非必須遺伝子であろうことが示唆される。しかし、ＧｅｎｅＳｔｒｅａｍ並列プログラムを用いて、ＦＷＰＶ Ｆ１１Ｌタンパク質（４５１アミノ酸）を解析すると、ワクシニアウイルス株コペンハーゲンのオルソログ（３５４アミノ酸）とは１８．６％のアミノ酸同一性しかないことが明らかになり、該遺伝子が、両ウイルスにおいて、異なる特性を持つことを示す可能性もある。ありうる必須のＦ１１Ｌ遺伝子機能に関してスクリーニングする際、我々はＢＬＡＳＴによって、他の重要な相同性がまったくないことを見出した。ＦＷＰＶタンパク質またはワクシニアウイルスタンパク質いずれにも、いかなるシグナル配列または膜貫通ドメインも予測されなかった。

突然変異体Ｆ１１Ｌを含む生存可能ＦＷＰＶウイルスの調製
ＦＷＰＶ−Ｆ１１Ｌを新規挿入部位として使用可能であるかどうか決定するため、Ｆ１１Ｌコード配列の挿入破壊によって、突然変異体ウイルスを構築した。組換えウイルス調製のため、ＦＷＰＶ Ｆ１１Ｌ ＯＲＦの２つの配列が隣接するｌａｃＺカセットを含有するプラスミドｐＬＧＦ１１（図１Ｂおよび２）を用い、これをＸｇａｌコート下、ミコフェノール酸の存在下での増殖によって選択した。隣接１および隣接２両方における二重組換え事象を形成して安定な組換えウイルスを得るか、または隣接遺伝子配列の１つにおける単一組換え事象によって不安定中間体組換えゲノムを得るか、いずれかで、組換え体を得ることも可能である。後者の場合、青いプラークのみを生じる安定な組換えウイルスが得られるまで、白いプラークとしてｗｔウイルスの視覚化を可能にする、選択培地の非存在下でのさらなる継代が必要である。隣接の生成に用いた外部プライマー（ＰＲＦ１およびＰＲＦ４）を用いたＰＣＲによって、代々のウイルス単離体の遺伝子型を性質決定した。試験を非常に感受性にする、より短いＰＣＲ産物に関して、ゲノムｗｔ配列の好ましい増幅によって、混入するｗｔウイルスの存在を監視した。ウイルスクローンＦ２（図３Ａ）は、４回のプラーク精製後、ｗｔ遺伝子配列を失った（クローンＦ２．１．２．１．１）。青いプラークのみを生成するウイルスクローンＦ１５（Ｆ１５．１．１．１）は、３回のプラーク精製後、ＰＣＲによって立証されるように、なおｗｔ配列を含有した（図３Ａ）。３回の連続する継代による、このウイルスクローン（Ｆ１５．１．１．１．１）の増幅後、ＣＥＦ限界希釈もまた、白いプラークを生じさせるウイルスの存在を生じた。

組換えウイルスの単離を加速させる試みの中で、我々は、ワクシニアウイルス突然変異誘発中、ウイルスにおいて、単一のクロスオーバー事象の発生並びに不安定な単一クロスオーバー中間体の分解（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）由来のプラスミドの維持を減少させるため、Ｋｅｒｒ ＆ Ｓｍｉｔｈ（１９９１）に推奨される戦略である、直線化されたプラスミドＤＮＡのトランスフェクションを試験した。直線化プラスミドを用いた組換えウイルスの調製はまた、二重組換え事象からも得られるはずであり、そして続いて、安定な組換えゲノムを導くはずである。実際、直線化プラスミドから調製されたウイルスクローンＦ９、Ｆ１０、およびＦ１６は、第一のプラーク精製周期後であっても、検出可能なｗｔ遺伝子配列を示さなかった（図３Ｂ）。ウイルスクローンＦ８は、ｗｔウイルスを明らかに含まなくなるために、あと１回のプラーク精製しか必要としなかった（図３Ｂ）。さらに、ＣＥＦにおける３回の増殖周期後、Ｆ９．１．１．１．１のプラークを力価決定すると、混入するｗｔウイルスの存在はもはや示されなかった。

突然変異体Ｆ１１Ｌを含むウイルスの効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ培養
突然変異体Ｆ１１Ｌを含むウイルスの生成に成功したことから、Ｆ１１Ｌ遺伝子配列がなくても困らないものであることが示唆される。不活性化がウイルス増殖に干渉しうるかどうかを決定するため、突然変異体ウイルスクローンＦ９．１．１．１を増殖させ、そしてｗｔ ＦＷＰＶと比較して、ＣＥＦにおける多段階増殖に関して試験した（図４）。どちらのウイルスも、ほぼ同一の複製動力学を示し、そして等量の感染性子孫を生じた。

挿入の標的としてのＦ１１Ｌは、組換え遺伝子の安定な発現を可能にする
Ｆ１１Ｌが必須でなく、そしてこの遺伝子の破壊がウイルス増殖に干渉しないことが確証されたため、Ｆ１１Ｌ遺伝子座を適切な挿入部位とみなした。ワクシニアウイルスＰ７．５プロモーターの調節下、ｌａｃＺ ｇｐｔ選択サブカセットとともに、外来遺伝子をＦＷＰＶゲノムに挿入することを可能にするため、プラスミドベクター（ｐＬＧＦＶ７．５）の構築にプラスミドｐＬＧＦ１１を用いた（図２）。続いてサブカセットを組換えウイルスから除去可能であるように、該プラスミドはさらに、隣接２配列の反復を含有した（図２）。ｐＬＧＦＶ７．５が得る第一の外来遺伝子として、メラノーマに対する実験ワクチン接種の抗原として興味が持たれる酵素チロシナーゼをコードするＤＮＡ配列を挿入した（Ｄｒｅｘｌｅｒら、１９９９）。チロシナーゼはメラニンの生合成経路に関与する。この酵素を発現する細胞は、メラニンを集積し、そして黒くなる。この特性は、チロシナーゼの発現およびその機能が完全であることに関する単純なスクリーニング法を提供する。ｐＬＧＦＶ７．５−ｍＴｙｒのトランスフェクション後、さらなる解析のため、５つの組換えウイルスクローンを選択した。突然変異Ｆ１１Ｌを含むウイルスの産生中、非常に効率的であることが立証された、プラスミドＤＮＡの直線化を、組換えウイルスの調製にもまた用いた。ウイルスクローンＭＴ２２（データ未提示）およびＭＴ３１（図５）は、選択培地の存在下、１回のみのプラーク精製後、検出可能なｗｔウイルス配列をまったく示さなかった（ＭＴ３１．１、Ｓｐｕｒ１、図５Ｂ）。この段階で、既に、両方のウイルスクローンのゲノムＤＮＡ調製は、もはや検出可能なマーカー遺伝子配列（図５Ｂの２８８０ｂｐ遺伝子産物）を含有せず、そして同時にこのＰＣＲ反応によってはほとんど検出不能である（クローン３１．１．１、図５Ｂの第三のレーンを参照されたい）が、ＰＲ４３−４４−ＰＣＲによって検出される（図５Ｃ）、選択されたｌａｃＺ ｇｐｔ陽性遺伝子型（７２８２ｂｐ）を含有する、組換えウイルスゲノムの存在を明らかにした。両方のクローンの４回目のプラーク精製のウイルスＤＮＡから、すなわち、選択培地の非存在下でのわずか１回のプラーク精製後、マーカー配列はまったく増幅不能であった（図５Ｃ）。ＣＥＦ感染後、５つの組換えウイルスはすべて、機能するチロシナーゼを生じる（図５Ｄ）。

さらに、どちらもＦＷＰＶに非許容性である、感染ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるメラニンの特異的合成もまた、立証された。これらの哺乳動物細胞で産生されるメラニンの量は、ＣＥＦ感染に比較して少ないようであった。これは、ウイルス複製が欠如しているか、またはチロシナーゼ遺伝子の発現が減少しているか、またはこれらの細胞においてメラニン合成経路がより効率的でないか、いずれかによる可能性もある（データ未提示）。チロシナーゼ挿入の遺伝的安定性を評価するため、５つの組換えウイルス単離体すべてを、ＣＥＦ上、４回の連続する多段階増殖継代で増幅し、そして寒天でのプラーク力価決定によって、ウイルス子孫を解析した。組換えウイルス各々のうち、１０の異なるプラーク単離体を、チロシナーゼ発現に関して調べた。メラニン合成はすべての試料で検出され、各ウイルスがなお機能する組換え酵素を生成することが示された（表１）。６回の継代後、同じ試験を行った。５つの組換えウイルスのうち１つのただ１つのプラーク単離体のみが、もはや機能するチロシナーゼを産生不能であった（表１）。ウイルスＤＮＡのＰＣＲ解析によって、このウイルスクローンのゲノムが、おそらく、組換え体全長遺伝子配列をなお含有したことが立証される。これによって、チロシナーゼ遺伝子発現が（単数または複数の）点突然変異によって不活性化された可能性が高いと示唆される（データ未提示）。

ワクシニアウイルスＦ１１Ｌ ＯＲＦは、特定の機能を予測可能な相同性または特徴的なモチーフをまったく持たないタンパク質を、潜在的にコードする。したがって、ＦＷＰＶのＦ１１Ｌオルソログは、必須でない可能性がある。本発明において、マーカー遺伝子（ｌａｃＺ）および選択可能遺伝子（ｇｐｔ）を含有する選択カセットをＦＷＰＶ−Ｇｅｎに挿入することによって、この仮説を試験した。このカセットを含有し、そしてもはやｗｔ遺伝子配列を含有しない組換えウイルスを生成することによって、オルソロガスな全長ＦＷＰＶ遺伝子は、ＦＷＰＶの増殖に必須ではないことが立証された。突然変異体ウイルスは、ｗｔウイルスと同程度に効率的に増殖し（図４）、このことから、Ｆ１１Ｌ遺伝子座を組換え遺伝子の適切な挿入部位とみなしうることが示唆された。その結果、我々はこの部位を用いて、メラノーマモデル抗原チロシナーゼを安定に発現するＦＷＰＶウイルスを生成するのに成功した。

組換えウイルス中のマーカー遺伝子または選択遺伝子の安定な発現は、ベクターワクチンとしての使用の場合、またはさらなる遺伝子操作のためには、不適切である可能性もある。我々のＦＷＰＶプラスミドベクターでは、選択サブカセットには、以後除去可能であるように、反復配列が隣接した。こうした組換え体の調製には、まず、選択サブカセットのみを含有するが、もはやｗｔ配列を含有しない組換えウイルスを単離し、そしてその後、選択サブカセットが欠失している安定組換え体を単離することが必要である。したがって、単離戦略の効率は、妥当な期間内で、最終組換え体を回収するために重要である。初期の研究同様（Ｌｅｏｎｇら、１９９４；Ｓｕｔｔｅｒ ＆ Ｍｏｓｓ、１９９２）、我々は、レポーター遺伝子および選択可能遺伝子の組み合わせは単純で、そして非常に効率的な選択法であることを見出した。この戦略は、直線化プラスミドＤＮＡをトランスフェクションすることによって、さらに改善された。プラスミドＤＮＡおよびウイルスゲノム間の組換えは、ウイルスゲノムへの全長プラスミド配列の組込みを導く単一クロスオーバーによっても起こりうるし（Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９８８；Ｆａｌｋｎｅｒ ＆ Ｍｏｓｓ、１９９０；Ｎａｚａｒｉａｎ ＆ Ｄｈａｗａｌｅ、１９９１）、または二重組換えによっても起こりうる。Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓら（１９８８）によると、どちらの事象の頻度も同程度である。我々の実験では、あらゆるｗｔ配列を除去するのに必要なプラーク精製回数は、直線化プラスミドＤＮＡを用いた場合、実際に非常に減少した（図３および５）。この技術は、時間の節約を可能にするだけでなく、数回の継代中に回避できずに起こる、ウイルスゲノムへの無作為突然変異の組込みリスクも低下させた。Ｎａｚａｒｉａｎ ＆ Ｄｈａｗａｌｅ（１９９１）に示唆されるように、直線化プラスミドのトランスフェクション後の総組換え効率は、環状プラスミドを用いた場合より低い可能性もある。しかし、我々の実験では、突然変異体Ｆ１１Ｌを含むウイルスの調製中、直線化プラスミドのトランスフェクション後、５つの青いプラークが生じるのに対して、環状プラスミドのトランスフェクション後、１つの青いプラークが生じるという比であったため、直線化プラスミドを使用しても、組換え効率は減少しなかった。さらに、他の組換えウイルスの調製において、我々は、１〜１０の間の比を得た（未公表）。したがって、我々の結果によって、ワクシニアウイルスにおける総組換え頻度は、単一クロスオーバー組換え体の形成が、非相同領域におけるプラスミドの直線化によって妨げられたとしても、著しくは変化しないことを示唆する、先のデータ（Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９８２）が確認される。

適切なウイルスベクターワクチンの開発の重要な側面は、挿入部位の探索によって基本的に決定可能な組換えウイルスの安定性である。ウイルス・チロシンキナーゼ遺伝子の遺伝子座は、組換えワクシニアウイルスの調製のための標準的な挿入部位であるが、組換え鳥ポックスウイルスの調製には不適切なようである（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、１９９７；Ａｍａｎｏら、１９９９）。標的としてＦ１１Ｌを用いて得ることが可能な、チロシナーゼ組換えＦＷＰＶウイルスの安定性は、単純に細胞ペレットの色を調べる、メラニン合成の検査によって、容易に監視可能である（図５Ｄおよび表１）。ＣＥＦ上の６回の継代後、５０のうち１つのプラーク単離体のみが、機能する組換え遺伝子を発現せず、高レベルのゲノム安定性が示された。

表１：５つの組換えウイルスにおけるネズミ・チロシナーゼ発現の安定性

^＊ｎ＝低感染効率でのＣＥＦにおける継代数
参考文献

（Ａ）ＦＷＰＶ−Ｆ１１Ｌの配列決定のためのプライマーウォーキング配列決定戦略。各配列決定反応の長さを示す。（Ｂ）Ｆ１１Ｌ遺伝子の逆方向末端反復（ＩＴＲ）および中央位置を示すＦＷＰＶゲノムの概略図とともに、相同組換え用の隣接配列として用いたＦ１１Ｌ遺伝子配列の調製の説明。隣接１の増幅に用いるプライマーＦ１およびＦ２とともに、隣接２の増幅に用いるプライマーＦ３およびＦ４のＦ１１Ｌ ＯＲＦに沿った位置を示す。 突然変異体Ｆ１１Ｌを含むウイルスの調製に用いる挿入プラスミドｐＬＧＦ１１、ベクタープラスミドｐＬＧＦＶ７．５、およびＦＷＰＶ−チロシナーゼ組換え体の調製に用いるｐＬＧＦＶ７．５−ｍＴｙｒの概略マップ。黒いボックスとして示すＦＷＰＶ−Ｆ１１Ｌ由来の配列、隣接１および隣接２は、プラスミドおよびウイルスゲノムＤＮＡ間の相同組換えを導く。大腸菌ｌａｃＺおよびｇｐｔ遺伝子は、選択可能マーカーとして働く（灰色のボックスとして示す）。Ｐ７．５およびＰ１１は、よく性質決定されたワクシニアウイルス特異的プロモーターであり、その転写方向を矢印で示す。ｐＬＧＦＶ７．５中のユニークなＰｍｅＩ制限部位を、外来遺伝子の挿入に用いてもよく、該外来遺伝子はＰ７．５の調節下に置かれる。マウス由来のチロシナーゼ（ｍＴｙｒ）をコードする遺伝子は、第一の組換えモデル遺伝子として働く。 未消化（Ａ）または直線化ｐＬＧＦ１１プラスミドＤＮＡ（Ｂ）をトランスフェクションした後に生成された突然変異体Ｆ１１Ｌを含むウイルス由来のウイルスＤＮＡのＰＣＲ解析。上部パネルは、高ＭＧの組換えウイルス（組換え体）のバンドまたは低ＭＧのｗｔウイルス（ｗｔ）のバンドいずれかを生じる、プライマーＦ１およびＦ４を用いたＰＣＲ反応の結果を示す。下部のパネルは、各試料中のウイルスＤＮＡのそれぞれの量を示す、プライマーＦ１およびＦ２を用いた、対照（対照）ＰＣＲ反応を示す。最初に摘み取ったプラーク単離体に対応する０から始めて、各単離体のプラーク精製数を示す。ｐＬＧＦ１１を対照マトリックスＤＮＡとして用い；ＦＰ９はｗｔウイルスＤＮＡ対照を示し、そしてＵＣは未感染細胞由来の対照ＤＮＡである。 多段階増殖曲線実験。ＣＥＦに、０．０５ｐｆｕ／細胞の感染効率のＦＰ９ウイルスまたはＦ１１Ｌノックアウトウイルスいずれかを、三つ組試料で接種した。三つ組試料を各々、感染後の異なる時点で採取し、そして寒天で力価決定した。エラーバーは三つ組試料間の標準偏差を示す。 組換えＦＷＰＶチロシナーゼウイルスＭＴ３１のゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析。最初のプラーク単離（レーン０）および初めの２回の続くプラーク精製周期（レーン１および２）を、選択培地（ＭＸＨ）の存在下で行い、一方、後の３回のプラーク精製工程（レーン３〜６）を、ＭＸＨの非存在下で行った。ｐＬＧＦＶ７．５−ｍＴｙｒ−ＤＮＡを対照マトリックスＤＮＡとして用い、ＦＰ９はｗｔウイルス対照ＤＮＡを示し、そしてＵＣは未感染対照ＤＮＡである。（Ａ）ウイルスＤＮＡの相対量を示す対照ＰＣＲ（Ｆ１−Ｆ２）。（Ｂ）ＰＣＲ Ｆ１−Ｆ４：９８４ｂｐバンドは、ｗｔウイルスＤＮＡから増幅されると期待されるＤＮＡ断片に相当し（ｗｔ）、７２８２ｂｐバンドは、中間体組換えウイルスに含有されるチロシナーゼ遺伝子およびｌａｃＺ ｇｐｔサブカセットを含有する増幅産物に相当し（中間体）、２８８０ｂｐバンドは、チロシナーゼ遺伝子発現カセットの増幅産物にのみ相当する産物に相当する（組換え体）。（Ｃ）ｌａｃＺ配列の存在を示すＰＣＲ ＰＲ４３−４４。（Ｄ）ＣＥＦ中のメラニンの産生によって検出されるマウス・チロシナーゼの発現。直径６ｃｍのペトリ皿中のＣＥＦ細胞を感染効率０．１ｐｆｕ／細胞で感染させた。感染６日後、細胞を採取し、Ｕ底マイクロタイタープレートに移し、そしてＰＢＳ中で洗浄した。レーン１〜５：５つの異なる組換えウイルスに感染させた細胞；レーン６：未感染細胞；レーン７：ｗｔウイルスに感染させた細胞。 初回抗原刺激−追加免疫法において、ＦＷＰＶチロシナーゼおよびＭＶＡチロシナーゼワクチンを用いた併用ワクチン接種の利点。群あたり２匹のマウスを、各々、４週間間隔で２回、腹腔内投与によって、ウイルスワクチン１０^８感染単位で免疫した。ワクチン接種群は以下のとおりであった： ＦＦ群：ＦＷＰＶチロシナーゼで初回抗原刺激、およびＦＷＰＶチロシナーゼで追加免疫。

ＦＭ群：ＦＷＰＶチロシナーゼで初回抗原刺激、およびＭＶＡチロシナーゼで追加免疫。
ＭＭ群：ＭＶＡチロシナーゼで初回抗原刺激、およびＭＶＡチロシナーゼで追加免疫。

ＭＦ群：ＭＶＡチロシナーゼで初回抗原刺激、およびＦＷＰＶチロシナーゼで追加免疫。
第二の免疫（追加免疫）３週間後、チロシナーゼ特異的Ｔ細胞応答を比較して調べた。この目的のため、動物の脾臓からＴ細胞を調製し、７日間に渡って培養し、そして次いで、染色体放出試験において、チロシナーゼ特異的標的細胞の細胞傷害能に関して試験した。標的細胞の特異的溶解各々に関して得られた値を示す（３０：１のエフェクター／標的比での％）。ＦＭ群の併用ワクチン接種を受けた動物のＴ細胞が、明らかに最高の反応性を示すことが観察された。対照的に、ワクチンに関して均質の免疫を受けたＦＦ群およびＭＭ群のマウスでは、中程度の細胞傷害応答しか測定し得なかった。ＭＶＡチロシナーゼをまずワクチン接種し、そして次いでＦＷＰＶチロシナーゼをワクチン接種したＭＦ群のＴ細胞試験で、最低の細胞傷害性が明らかになった。

これらの結果は、ベクターワクチン各々を単独で用いるワクチン接種に比較した際、ＦＷＰＶチロシナーゼベクターおよびＭＶＡチロシナーゼベクターを用いた併用ワクチン接種の優位性を明らかに支持する。これに関連して、ＦＷＰＶベクターワクチンを一次ワクチンとして用いることが特に重要であるようである。

【配列表】

Claims (25)

1. Ｆ１１Ｌ遺伝子中、外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）ＤＮＡの少なくとも１つの挿入を含有する、組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
2. 前記の外来ＤＮＡが、少なくとも１つの外来遺伝子を、所望によって該外来遺伝子の発現制御のための配列と組み合わせて有する、請求項１記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
3. 前記外来ＤＮＡが、制御配列、好ましくはポックスウイルス特異的プロモーターを含む、請求項１または２記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
4. 前記外来遺伝子が、好ましくは療法的に有用であるポリペプチドをコードし、そして／または検出可能なマーカーをコードし、そして／または選択可能遺伝子である、先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
5. 前記の療法的に有用なポリペプチドが、ウイルス病原体、細菌病原体、または寄生虫病原体、あるいは腫瘍細胞の構成要素である、請求項４記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
6. 前記の療法的に有用なポリペプチドが、ＨＩＶ、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種または熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の構成要素である、請求項５記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
7. 前記の療法的に有用なポリペプチドが、メラノーマ細胞の構成要素である、請求項５記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
8. 前記検出可能マーカーが、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、グアニンリボシルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質である、先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
9. 前記マーカー遺伝子および／または選択可能遺伝子を除去することも可能である、請求項８記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
10. 鶏痘ウイルスゲノム中、ヌクレオチド１３１．８６０〜１３１．８７０位によって定義されるゲノム領域が、Ｆ１１Ｌ遺伝子相同体中の好ましい組込み部位である、先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）。
11. Ｆ１１Ｌ遺伝子への外来ＤＮＡの少なくとも１つの挿入、さらに、好ましくは原核細胞または真核細胞におけるベクター複製のためのレプリコン、および原核細胞または真核細胞において選択可能な選択遺伝子またはマーカー遺伝子を含有する、先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）またはその機能する部分を含有するＤＮＡベクター。
12. 薬学的に許容しうる補助剤および／またはキャリアーと組み合わせた、先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルス（ＦＷＰＶ）または請求項１１記載のＤＮＡベクターを含有する薬剤組成物。
13. ワクチンの形の請求項１２記載の薬剤組成物。
14. 感染性疾患または腫瘍疾患の治療のための、先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルス、ＤＮＡベクター、または薬剤組成物の使用。
15. 先行する請求項の１以上に記載の組換え鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターの調製法であって、組換えＤＮＡ技術によって、外来ＤＮＡを鶏痘ウイルスのＦ１１Ｌ遺伝子に導入する、前記調製法。
16. Ｆ１１Ｌ特異的配列を含有する外来ＤＮＡとウイルスＤＮＡの相同組換えによって導入を行い、その後、組換えウイルスまたはＤＮＡベクターの増殖および単離を行う、請求項１５記載の方法。
17. 先行する請求項の１以上に記載の組換えＤＮＡベクターまたは組換えウイルスを含有する、真核細胞または原核細胞。
18. 細菌細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞である、請求項１７記載の原核細胞。
19. 酵母細胞、鳥細胞、好ましくはニワトリ細胞、または哺乳動物由来の細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項１８記載の真核細胞。
20. 哺乳動物、好ましくはヒトの免疫法であって、以下の工程：
    ａ）療法的に有効な量の請求項１〜１０のいずれかに記載の鶏痘ウイルス、請求項１１記載のＤＮＡベクター、あるいは請求項１２または１３記載の薬剤組成物で、哺乳動物を初回抗原刺激し（ｐｒｉｍｉｎｇ）、
    ｂ）所望によって、１週間〜８ヶ月の間の後、１〜３回の間で、前記工程ａ）を反復し；そして
    ｃ）ａ）の鶏痘ウイルス、ＤＮＡベクターまたは薬剤組成物と同一の外来ＤＮＡを含有する、療法的に有効な量の別のウイルスベクターで、哺乳動物を追加免疫する（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）
    工程を含んでなる、前記方法。
21. 初回抗原刺激工程を、追加免疫前に２回行う、請求項２０記載の方法。
22. 初回抗原刺激工程を治療開始時、および免疫第３週〜第５週、好ましくは第４週に行い、追加免疫工程を免疫第１１週〜第１３週、好ましくは第１２週に行う、請求項２１記載の方法。
23. 他のウイルスベクターとして、組換えＭＶＡ、他の無発病性ワクシニアウイルスおよびポックスウイルスベクター、好ましくはワクシニアウイルスの組換え型、ＮＹＶＡＣ、ＣＶ−Ｉ−７８、ＬＣ１６ｍ０、またはＬＣ１６ｍ８、組換えパラポックスウイルス、好ましくは弱毒化ＯｒｆウイルスＤ１７０１、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス５、オルトミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、好ましくはヒトまたはウマ・ヘルペスウイルス、またはアルファウイルス、好ましくはセムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはウマ脳炎ウイルス（−ＶＥＥ）を用いる、請求項２０〜２２の１以上に記載の方法。
24. 以下の構成要素：
    ａ）請求項１〜１０のいずれかに記載の鶏痘ウイルス、請求項１１に記載のＤＮＡベクター、あるいは請求項１２または１３記載の薬剤組成物、および
    ｂ）ａ）の鶏痘ウイルスまたはＤＮＡベクターと同一の外来ＤＮＡを含有する、別のウイルスベクター
    を含んでなる、併用調製。
25. 他のウイルスベクターとして、組換えＭＶＡ、他の無発病性ワクシニアウイルスおよびポックスウイルスベクター、好ましくはワクシニアウイルスの組換え型、ＮＹＶＡＣ、ＣＶ−Ｉ−７８、ＬＣ１６ｍ０、またはＬＣ１６ｍ８、組換えパラポックスウイルス、好ましくは弱毒化ＯｒｆウイルスＤ１７０１、アデノウイルス、好ましくはヒトアデノウイルス５、オルトミクソウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、好ましくはヒトまたはウマ・ヘルペスウイルス、またはアルファウイルス、好ましくはセムリキ森林ウイルス、シンドビスウイルス、またはウマ脳炎ウイルス（−ＶＥＥ）を用いる、請求項２４記載の併用調製。

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