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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein rekombinantes Fowlpox-Virus (FWPV) sowie einen DNA-Vektor, der
Gensequenzen für
ein solches rekombinantes Fowlpox-Virus enthält. Die Erfindung betrifft
weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das rekombinante
Fowlpox-Virus oder einen DNA-Vektor umfasst, die Verwendung des
rekombinanten Fowlpox-Virus zur Behandlung von Infektionskrankheiten
oder Tumorerkrankungen sowie ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten
Fowlpox-Virus oder DNA-Vektors.
Zuletzt betrifft die vorliegende Erfindung Eukaryontenzellen oder
Prokaryontenzellen, die den rekombinanten DNA-Vektor oder das rekombinante
Fowlpox-Virus enthalten.
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Pockenviren verschiedener Gattungen
wurden bereits als rekombinante Impfstoffvektoren etabliert (Moss,
1996; Paoletti, 1996). Von Vogelpockenviren, einschließlich Geflügelpockenviren
(Fowlpox-Viren bzw. FWPV) als prototypischem Mitglied, ist bekannt,
dass sie sich nur in Vogelzellen replizieren. In Säugerzellen ist
die Virusvermehrung je nach dem Zelltyp zu verschiedenen Zeitpunkten
im Replikationszyklus blockiert, aber es erfolgt eine virus-spezifisch
gesteuerte Genexpression (Taylor et al., 1988; Somogyi et al., 1993).
Diese Eigenschaft wurde ausgenutzt, um rekombinante Kandidaten-Vogelpockenviren
als sichere, nicht replizierende Vektoren für die Impfung von Säugern, einschließlich Menschen,
gegen Infektionskrankheiten und Krebs zu entwickeln (Wang et al.,
1995; Perkus et al., 1995; Roth et al., 1996). Einige dieser Impfstoffe
hat man bereits in klinischen Phase I(Cadoz et al., 1992; Marshall
et al., 1999, Berencsi et al., 2001) oder Phase II-Studien getestet
(Belshe et al., 2001).
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Zukünftige, komplexere Impfstrategien
erfordern wahrscheinlich die gleichzeitige Expression verschiedener
Antigene oder die Expression einer Kombination von Antigenen und
immuncostimulatorischen Molekülen
(Leong et al., 1994; Hodge et al., 1999). Diese Gene können entweder
als einzelne Kassette an einer Stelle des Virusgenoms inseriert
werden oder nacheinander eingefügt
werden, so dass bereits konstruierte Vektorviren kontinuierlich
verbessert werden können.
Im letzteren Fall ist es wünschenswert,
die Wahl unter verschiedenen stabilen Insertionsstellen zu haben
und die Selektionsmarker eliminieren zu können, damit die gleiche Selektionsstrategie
für die
Insertion an verschiedenen Stellen wiederholt werden kann. Das Vorliegen
eines Markergens ist zudem bei einem Impfstoff für den Gebrauch bei Menschen
nicht zu empfehlen. Mittels Shotgun-Insertionsstrategien hat man
mehrere Insertionsstellen im FWPV-Genom identifiziert (Taylor et
al., 1988; Jenkins et al., 1991). Zudem hat man die Fremdgen-Insertion
im Virusgenom in den Bereich der terminalen Inverted Repeats (Boursnell
et al., 1990), zu nicht essentiellen Genen, wie dem Thymidinkinasegen
(Boyle & Coupar,
1988) oder zu Bereichen zwischen kodierenden Gensequenzen (Spehner
et al., 1990) gelenkt.
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Mehrere Strategien zur Erzeugung
von rekombinanten Viren, aus denen das zur Plaqueisolation verwendete
Markergen nach der Verwendung deletiert worden war, wurden beschrieben.
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Die erste Strategie ist das von Falkner
und Moss (1990) beschriebene, häufig
eingesetzte transiente dominante Selektionsverfahren, bei dem der
Selektionsmarker in der Plasmidsequenz außerhalb der Insertionskassette
vorliegt. Rekombinante Viren, die durch ein Einfachcrossover-Ereignis
erzeugt werden und die gesamte Plasmidsequenz enthalten, werden
in Anwesenheit von Selektionsmedium erhalten. Diese rekombinanten
Viren sind aufgrund des Vorliegens der wiederholten Sequenzen der
flankierenden Regionen instabil. In Abwesenheit von Selektionsmedium
wird das zwischen diesen Wiederholungen liegende Markergen nach einer
zweiten Rekombination deletiert, die entweder zur Produktion des
Wildtyp-(wt-) Virus oder eines stabilen rekombinanten Virus führt. Letzteres
muss wieder nach dem Plaqueverfahren isoliert und anschließend durch PCR
oder Southern-Blotting identifiziert werden.
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Ein zweites Verfahren basiert auf
der Beobachtung, dass bei rekombinantem FWPV, das das Zielprotein
und β-Galactodsidase
jeweils unter der Kontrolle des P7.5-Promotors in direkt wiederholter
Orientierung exprimierte, eine homologe Rekombination zwischen den
Promotorwiederholungen erfolgte, wodurch das lacZ-Gen deletiert
wurde (Spehner et al., 1990). Daher wurden weiße Plaques von rekombinanten
Viren gebildet, die das Markergen verloren hatten. Eine ähnliche
Strategie ist entwickelt worden, um rekombinante MVA-Viren unter Verwendung
des regulatorischen Vacciniavirus K1L-Gens als transienten Selektionsmarker herzustellen,
der mittels intragenomischer homologer Rekombination entfernt wird
(Staib et al., 2000).
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FWPV wächst langsamer als das Vacciniavirus.
Die Aufrechterhaltung der vollen Replikationsfähigkeit von rekombinanten Viren
ist für
Erzeugung wie auch Verwendung potentieller FWPV-Impfviren von entscheidender
Bedeutung.
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Gegenüber den bisher existierenden
Vektoren liegen der vorliegenden Erfindung die Aufgaben zu Grunde,
ein rekombinantes Fowlpox-Virus bereitzustellen, das eine erhöhte Vektorstabilität nach Insertion
von Fremd-DNA sowie eine höhere
Sicherheit bei Einsatz als Impfstoffvektor ergibt und dabei die
volle Replikationsfähigkeit
und optimale Effizienz während
der Selektion rekombinanter Viren beibehält.
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Diese Aufgaben werden durch den Gegenstand
der unabhängigen
Ansprüche
gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen
der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
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Die erfindungsgemäße Lösung beruht auf der Identifikation
der FWPV-F11L-Gens als neue Insertionsstelle für Fremd-DNA. F11L-mutierte
Viren replizierten sich nach Infektion von CEF (chicken embryo fibroblasts)
effizient. Die Verwendbarkeit von F11L-Vektorplasmiden, die eine transiente
Expression des Markergens ermöglichen,
wurde durch die schnelle Produktion rekombinanter FWPV-Viren gezeigt,
die das Tumormodellantigen Tyrosinase stabil produzieren.
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Das F11L-Gen von FWPV ist an sich
bereits bekannt und genau identifiziert. In der Publikation von Afonso
et al. 2000 ist das F11L-Gen-Homolog präzise als ORF FPV110 mit der
Genomposition 131.387-132.739 identifiziert. Afonso et al. offenbaren
jedoch nicht die Eigenschaft des F11L-Gens als Integrationsort für Fremd-DNA.
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Die Verwendung des F11L-Gens als
Integrationsort für
Fremd-DNA bietet einige unerwartete Vorteile: zunächst hat
sich überraschenderweise
herausgestellt, dass die rekombinanten Fowlpox-Viren, die eine oder mehrere
Insertionen von Fremd-DNA im F11L-Gen enthalten, eine gegenüber herkömmlichen
Vektoren erhöhte
Vektorstabilität
aufweisen. Zudem haben sich die erfindungsgemäßen rekombinanten FWPV als
in der in vivo Anwendung als Impfstoffvektoren sehr sicher herausgestellt.
Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Insertion in das F11L-Gen
ist darin zu sehen, dass die Insertion an einer beliebigen Stelle
des Gens vorgenommen werden kann.
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Gemäß eines Grundgedankens stellt
die vorliegende Erfindung folglich ein rekombinantes Fowlpox-Virus
(FWPV) bereit, das zumindest eine Insertion einer Fremd-DNA im F11L-Gen enthält. Die
Insertion erfolgt, wie bereits oben angesprochen, in Position 131.387-132.739 des FWPV-Genoms.
Obwohl die Insertion grundsätzlich
an jeder beliebigen Stelle des F11L-Gens erfolgen kann, wird eine
Insertion in dem durch die Nukleotidpositionen 131.860-131.870 im
Fowlpoxvirusgenom definierten Genomabschnitt bevorzugt.
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Als Fremd-DNA wird im Kontext der
vorliegenden Erfindung generell jegliche DNA bezeichnet, die mit Hilfe
gentechnologischer Methoden in die DNA eines Organismus, einer Zelle
oder eines Virus etc. eingebracht wird, aus der/dem sie nicht stammt.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
die Fremd-DNA zumindest ein Fremdgen, wahlweise in Kombination mit
einer Sequenz zur Regulation der Expression des Fremdgens.
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Das im erfindungsgemäßen rekombinanten
Fowlpox-Virus (FWPV) enthaltene Fremdgen kodiert für ein Polypeptid,
das bevorzugt therapeutisch einsetzbar ist und/oder kodiert für einen
nachweisbaren Marker und/oder ist ein Selektionsgen.
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Unter einem Reportergen, wie hierin
verwendet, werden Gene bezeichnet, deren Genprodukte sich mit Hilfe
einfacher biochemischer oder histochemischer Methoden nachweisen
lassen. Synonyme für
den Begriff Reportergen sind Indikatorgen sowie Markergen.
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Unter einem Selektionsgen bzw. Selektionsmarker
werden im Kontext der vorliegenden Erfindung Gene bezeichnet, die
Viren bzw. Zellen, in denen die entsprechende Genprodukte gebildet
werden, einen Wachstumsvorteil bzw. Überlebensvorteil gegenüber anderen
Viren bzw. Zellen verschaffen, die das entsprechende Genprodukt
nicht synthetisieren. Vorzugsweise verwendete Selektionsmarker sind
die Gene für
E. coli Guanin-Phosphoribosyltransferase,
E. coli Hygromycin-Resistenz und Neomycin-Resistenz.
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Die Fremd-DNA-Sequenz kann ein Gen
sein, das beispielsweise für
ein pathogenes Mittel bzw. für
einen Bestandteil eines pathogenen Mittels kodiert. Unter pathogenen
Mitteln sind Viren, Bakterien und Parasiten zu verstehen, die eine
Krankheit verursachen können,
ebenso wie Tumorzellen, die sich unkontrolliert in einem Organismus
vermehren und somit zu einem pathologischen Wachstum führen können. Beispiele
derartiger pathogener Mittel sind in Davis, B.D. et al., (Microbiology,
3. Ausgabe, Harper International Edition) beschrieben. Bevorzugte
pathogene Mittel sind Bestandteile von Influenza-Viren oder Masern
und von Respiratory-Syncytial-Viren, von Dengue-Viren, von humanen
Immundefizienzviren, beispielsweise HIV I und HIV II, von humanen
Hepatitis-Viren, beispielsweise HCV und HBV, von Herpes-Viren, von
Papilloma-Viren, vom Malariaparasiten Plasmodium falciparum und
von den Tuberkulose verursachenden Mykobakterien.
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Spezielle Beispiele von Bestandteilen
pathogener Mittel sind zB. Hüllproteine
von Viren (HIV-Env, HCV-E1/E2, Influenzavirus-HA-NA, RSV-F-G), regulatorische
Virusproteine (HIV-Tat-Rev-Nef, HCV-NS3-NS4-NSS), das Protective
Antigen Protein von Bacillus anthracis, Merozoite Surface Antigen
und Circumsporozoite Protein von Plasmodium falciparum, das Tyrosinase-Protein
als Melanomantigen, bzw. das HER-2/neu Protein als Antigen von Adenokarzinomen
des Menschen, zu nennen.
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Bevorzugte Gene, die Tumor-assoziierte
Antigene kodieren, sind die, die für Melanomassoziierte Differenzierungs-Antigene,
beispielsweise Tyrosinase, Tyrosinase-verwandte Proteine 1 und 2,
von Cancer-Testes-Antigenen bzw. Tumor-Hoden-Antigenen, beispielsweise
MAGE-1, -2, -3 und BAGE, für
nicht mutierte Shared Antigene bzw. Antigene, die von mehreren Tumortypen
geteilt werden, die auf Tumoren überexprimiert werden,
beispielsweise Her-2/neu, MUC-1 und p53, kodiert werden.
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Besonders geeignet sind Polypeptide,
die ein Bestandteil von HIV, Mykobakterium spp. oder Plasmodium
falciparum oder Bestandteil einer Melanomzelle sind.
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Als Bestandteile sind allgemein Bestandteile
des Vorgenannten zu verstehen, die immunogene Eigenschaften aufweisen,
dass heißt
dazu in der Lage sind, bei Säugern,
insbesondere Menschen, eine Immunreaktion hervorzurufen (z.B. Oberflächenantigene).
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Damit die Fremd-DNA-Sequenz oder
das Gen exprimiert werden kann ist es notwendig, daß Regulatorsequenzen,
die zur Transkription des Gens erforderlich sind, auf der DNA vorliegen.
Derartige Regulatorsequenzen (als Promotoren bezeichnet) sind dem
Fachmann bekannt, beispielsweise kann ein Pockenvirus-spezifischer
Promoter eingesetzt werden.
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Vorzugsweise ist der nachweisbare
Marker eine beta-Galactosidase, beta-Glucoronidase, eine Luziferase
oder ein Grün-Fluoreszierendes-Protein.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
ist das Markergen und/oder Selektionsgen eliminierbar. Wie bereits
eingangs ausgeführt,
ist diese Eigenschaft von großem
Vorteil, weil damit die gleiche Selektionsstrategie für die Insertion
an verschiedenen Stellen wiederholt werden kann. Das Vorliegen eines
Markergens ist zudem bei einem Impfstoff für den Gebrauch bei Menschen
nicht zu empfehlen. Die Deletion dieser Gensequenzen aus dem Genom
der endgueltigen rekombinanten Viren erfolgt quasi "automatisch" durch eine intragenomische
homologe Rekombination zwischen identischen Gensequenzen die die
Marker-Selektionsgen-Expressionskassette flankieren.
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Gemäß einem weiteren Grundgedanken
stellt die vorliegende Erfindung einen DNA-Vektor bereit, der ein erfindungsgemäßes rekombinantes
Fowlpox-Virus oder funktionelle Teile hiervon, die zumindest eine
Insertion einer Fremd-DNA im F11L-Gen enthalten, und weiterhin bevorzugt
ein Replikon zur Replikation des Vektors in einer Pro- oder Eukaryontenzelle
und ein in Pro- oder Eukaryontenzellen selektierbares Selektionsgen
oder Markergen, enthält.
Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit
prokaryontischen und eukaryontischen Wirten sind in Sambrook, et
al., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition,
Cold Spring Harbor, New York (1989), beschrieben.
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Die DNA-Vektoren der vorliegenden
Erfindung spielen die Rolle einer eigenständigen, vermehrungsfähigen Einheit,
die in geeigneten Wirtszellen die Fähigkeit zur DNA-Replikation besitzen.
Die nicht replizierfähige
Fremd-DNA wird somit passiv mitrepliziert und kann sodann zusammen
mit dem Vektor isoliert und gereinigt werden. Neben dem erfindungsgemäßen rekombinanten
Fowlpox-Virusgensequenzen kann der DNA-Vektor noch folgende Sequenzelemente
enthalten: Enhancer zur Verstärkung
der Genexpression, Promotoren, die die Voraussetzung für die Genexpression
darstellen, Replikationsursprünge,
Reportergene, selektierbare Gene, Spleißsignale und Verpackungssignale.
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Der erfindungsgemäße DNA-Vektor dient in erster
Linie als Transfervektor, um in einer virusinfizierten Zelle über homologe
Rekombination die Insertion von Fremdgenen zu ermöglichen.
Er wird in der Regel im Kontext einer Fowlpox-Virusinfektion eingesetzt,
da die Regulationselemente vom Vorhandensein anderer Virusproteine
abhängig
sind.
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Erfindungsgemäß wird das rekombinante Fowlpox-Virus
oder der DNA-Vektor in einer pharmazeutischen Zusammensetzung bereitgestellt,
die diese in Verbindung mit pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoffen und/oder
Trägerstoffen
umfasst. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise eine
Vakzine.
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Um eine Vakzine herzustellen, werden
die gemäß der vorliegenden
Erfindung erzeugten FWPV in eine physiologisch verträgliche Form
umgewandelt. Dies kann auf Grundlage der vieljährigen Erfahrung in der Zubereitung
von Vakzinen, die zur Impfung gegen Pocken verwendet werden, durchgeführt werden
(Kaplan, Br. Med. Bull. 25, 131–135
[ 1969]). Typischerweise werden ungefähr 106–107 Teilchen des rekombinanten FWPV in 100
ml Phosphat gepufferter Salzlösung
(PBS) in Gegenwart von 2 % Pepton und 1 % menschlichen Albumin in
einer Ampulle gefriergetrocknet, vorzugsweise in einer Glasampulle.
Das Lyophilisat kann Füllmittel bzw.
Verdünnungsmittel
(wie beispielsweise Mannitol, Dextran, Zucker, Glycin, Laktose oder
Polyvinylpynolidon) oder andere Hilfsmittel (beispielsweise Antioxidanzien,
Stabilisatoren etc.) enthalten, die zur parenteralen Verabreichung
geeignet sind. Die Glasampulle wird dann verschlossen bzw. versiegelt
und kann vorzugsweise bei Temperaturen unterhalb –20 °C für mehrere
Monate aufbewahrt werden.
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Zur Vakzinierung kann das Lyophilisat
in 0,1 bis 0,2 ml einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise
physiologischer Salzlösung,
gelöst
und parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intradermale
Inokulation. Die erfindungsgemäße Vakzine
wird vorzugsweise intrakutan injiziert. Ein leichtes Anschwellen
und eine Rötung
und manchmal auch ein Juckreiz kann an der Injektionsstelle auftreten.
Der Verabreichungsweg, die Dosis und die Anzahl der Verabreichungen
kann vom Fachmann in einer bekannten Weise optimiert werden. Wo dies
angebracht ist, ist es zweckdienlich, die Vakzine mehrere Male über eine
verlängerte Zeitspanne
hinweg zu verabreichen, um ein hohes Niveau von Immunreaktionen
gegen das Fremdantigen zu erzielen.
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Die vorgenannten erfindungsgemäßen Gegenstände, d.h.
das rekombinante Fowlpox-Virus, der DNA-Vektor oder die pharmazeutische
Zusammensetzung werden vorzugsweise zur Behandlung von Infektionskrankheiten
oder Tumorerkrankungen, wie sie oben definiert sind, eingesetzt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung
eines rekombinanten Fowlpox-Virus oder DNA-Vektors umfasst das Einbringen
von Fremd-DNA in das F11L-Gen eines Fowlpox-Virus durch rekombinante DNA-Techniken.
Vorzugsweise erfolgt das Einbringen durch homologe Rekombination
der Virus-DNA mit der Fremd-DNA, die F11L-spezifische Sequenzen enthält, gefolgt
von einer Vermehrung und Isolierung des rekombinanten Virus oder
des DNA-Vektors.
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Die vorliegende Erfindung stellt
weiterhin Eukaryontenzellen oder Prokaryontenzellen bereit, die
den erfindungsgemäßen rekombinanten
DNA-Vektor oder das rekombinante FWPV enthalten. Als Prokaryontenzelle
findet vorzugsweise eine Bakterienzelle, bevorzugt E. coli-Zelle,
Verwendung. Als Eukaryontenzellen können Vogelzellen, bevorzugt
Hühnerzellen,
oder eine vom Säugetier
stammende Zelle, bevorzugt eine humane Zelle, eingesetzt werden,
wobei humane embryonale Stammzellen sowie humane Keimbahnzellen
ausgenommen sind.
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Beispielsweise kann der erfindungsgemäße DNA-Vektor
in die Zellen durch Transfektion, beispielsweise mittels einer Kalziumphosphat-Ausfällung (Graham
et al., Virol. 52, 456–467
[1973]; Wigler et al., Cell 777–785
[1979] mittels Elektroporation (Neumann et al., EMBO J. 1, 841–845 [1982]),
durch Mikroinjektion (Graessmann et al., Meth. Enzymology 101, 482–492 (1983)),
mittels Liposomen (Straubinger et al., Methods in Enzymology 101,
512–527
(1983)), mittels Sphäroblasten
(Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163–2167 (1980)) oder durch andere
Verfahren eingebracht werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Transfektion
mittels einer Kalziumphosphat-Ausfällung wird vorzugsweise angewendet.
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Die vorliegende Erfindung wird nun
durch Beispiele und die begleitenden Abbildungen veranschaulicht,
die Folgendes zeigen:
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1:
(A) Primer Walking-Sequenzierstrategie für die Sequenzierung von FWPV-F11L.
Die Länge
jeder Sequenzreaktion ist dargestellt. (B) Schematische Darstellung
des FWPV-Genoms,
die die invertierten terminalen Repeats (ITR) und die zentrale Lage
des F11L-Gens zeigt,
sowie eine Darstellung der Herstellung von F11L-Gensequenzen, die
als flankierende Sequenzen für
die homologe Rekombination verwendet wurden. Es sind die Positionen
entlang des F11L-ORFs für
die Primer F1 und F2, die zur Amplifizierung von Flank 1 verwendet
wurden, sowie die Primer F3 und F4, die zur Amplifizierung von Flank
2 verwendet wurden, gezeigt.
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2:
Schematische Karten des Insertionsplasmids pLGF11, das zur Herstellung
F11L-mutierter Viren
verwendet wurde, des Vektorplasmids pLGFV7.5 und von pLGFV7.5-mTyr, das zur Herstellung
von FWPV-Tyrosinase-Rekombinanten verwendet wurde. Die von FWPV-F11L
stammenden Sequenzen Flank 1 und Flank 2, als schwarze Kästen dargestellt,
dirigieren die homologe Rekombination zwischen dem Plasmid und der
viralen genomischen DNA. Die E. coli-lacZ- und -gpt-Gene dienen
als Selektionsmarker (als schattierte Kästen dargestellt). P7.5 und
P11 sind gut charakterisierte Vacciniavirusspezifische Promotoren,
deren Transkriptionsrichtung durch Pfeile dargestellt ist. Eine
einzigartige Pmel-Restriktionsstelle in pLGFV7.5 kann zur Insertion
von Fremdgenen, die unter die Transkriptionskontrolle von P7.5 gebracht
werden, verwendet werden. Das Tyrosinase kodierende Gen (mTyr) aus
der Maus diente als erstes rekombinantes Modellgen.
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3:
PCR-Analyse viraler DNA aus F11L-mutierten Viren, die nach Transfektion
mit ungespaltener (A) oder linearisierter pLGF11-Plasmid-DNA (B)
erzeugt wurden. Die oberen Bilder zeigen das Ergebnis der PCR-Reaktionen
unter Verwendung der Primer F1 und F4, die entweder eine Bande mit
hohem MG für
die rekombinanten Viren (rec.) oder eine Bande mit niedrigem MG
für das
wt-Virus (wt) ergeben. Die unteren Bilder zeigen die Kontroll-(cntr.)
PCR-Reaktionen unter Verwendung der Primer F1 und F2, die die jeweilige
Menge Virus-DNA in jeder Probe zeigen. Die Anzahl der Plaquereinigungen
für jedes
Isolat ist beginnend mit 0, was dem anfänglich gepickten Plaqueisolat
entspricht, angegeben. pLGF11 wird als Kontroll-Matrizen-DNA eingesetzt;
FP9 steht für
die wt-Virus-DNA-Kontrolle
und UC ist Kontroll-DNA aus nicht infizierten Zellen.
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4:
Mehrschritt-Wachstumskurven-Experiment. CEF wurden in Dreifachansätzen entweder
mit FP9-Virus oder mit dem F11L-Knockout-Virus in einer moi von
0,05 pfu/Zelle angeimpft. Die Dreifachansätze wurden jeweils zu unterschiedlichen
Zeiten nach der Infektion geerntet und unter Agar titriert. Die
Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen zwischen den Dreifachproben.
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5:
PCR-Analyse von genomischer DNA aus dem rekombinanten FWPV-Tyrosinase-Virus MT31. Die anfängliche
Plaqueisolation (Spur 0) und die ersten 2 folgenden Plaquereinigungsrunden
(Spuren 1 und 2) erfolgten in Anwesenheit von Selektionsmedium (MXH),
wohingegen die letzten 3 Plaquereinigungsschritte (Spuren 3 bis
6) in Abwesenheit von MXH erfolgten. pLGFV7.5-mTyr-DNA wurde als
Kontroll-Matrizen-DNA eingesetzt, FP9 ist die wt-Virus-Kontroll-DNA
und UC die nicht infizierte Kontroll-DNA. (A) Kontroll-PCR (F1-F2),
die die relative Menge an Virus-DNA zeigt. (B) PCR F1-F4: Die 984
bp-Bande entspricht dem erwarteten DNA-Fragment, das aus wt-Virus-DNA
(wt) amplifiziert wird, die 7282 bp-Bande entspricht dem Amplifizierungsprodukt,
das das Tyrosinasegen und die lacZ-gpt-Subkassette enthält, die
im intermediären
rekombinanten Virus (interm.) enthalten sind, die 2880 bp-Bande
entspricht dem Produkt, das nur das Amplifizierungsprodukt der Tyrosinasegen-Expressionskassette
(rec.) darstellt. (C) PCR PR43-44, die das Vorliegen der lacZ-Sequenz
zeigt. (D) Expression der Tyrosinase aus Maus, die über die
Produktion von Melanin in CEF nachgewiesen wird. CEF-Zellen in Petrischalen
mit 6 cm Durchmesser wurden mit einer moi von 0,1 pfu/Zelle infiziert.
Sechs Tage nach der Infektion wurden die Zellen geerntet, in eine
U-Boden-Mikrotiterplatte ü berführt und
in PBS gewaschen. Spuren 1–5:
Mit fünf
verschiedenen rekombinanten Viren infizierte Zellen; Spur 6: nicht
infizierte Zellen; Spur 7: mit wt-Virus infizierte Zellen.
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Materialien und Methoden
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Die Konzretationsangaben "M und μM" beziehen sich auf
Molle und μMolle.
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Zellen und
Viren
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Primäre Hühnerembryofibroblasten (chicken
embryo fibroblasts, CEF) wurden unter Verwendung 11 Tage alter bebrüteter Eier
hergestellt und in MEM (Gibco) mit 10% Lactalbumin (Gibco) und 5%
Basalmediumsupplement (BMS-Seromed) gezüchtet. HeLa-Zellen und Vero-Zellen wurden in DMEM
(Gibco), das mit 10% fötalem
Kälberserum
(FCS) (Gibco) angereichert war, gezüchtet. FWPV-FP9, ein gut charakterisiertes
Plaqueisolat des abgeschwächten
Stammes HP1-438 (Boulanger et al., 1998), wurde in Anwesenheit von
MEM, das mit 2% FCS angereichert war, auf CEF gezüchtet..
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Sequenzierung
von genomischer FWPV-DNA
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Auf CEF gezüchtete FWPV-FP9 wurden nach
einem Gefrier-Auftau-Zyklus geerntet. Das Virus wurde durch Ultrazentrifugation
konzentriert und durch ein 25% (Gew./Gew.) Saccharosekissen, wie
zuvor beschrieben (Boulanger et al., 1998), semi-gereinigt. Das
Sediment wurde in 0,05 M Tris, pH 8, mit 1 % SDS, 100 μM β-Mercaptoethanol
und 500 μg/ml
Proteinase K resuspendiert und 1 Std. bei 50°C inkubiert. Die DNA wurde nach
Phenol/Chloroform-Extraktion isoliert, mit Ethanol gefällt und
in H2O resuspendiert. Die Sequenzierung erfolgte
mittels Primer-Walking auf der Virus-DNA. Der erste Primer (PR30)
wurde anhand der partiellen Sequenz des Taubenpocken-F11L-Gens gestaltet,
die von Ogawa et al. (1993) unter der Zugangsnummer M88588 veröffentlicht
wurde. Die zur Sequenzierung verwendeten Primer waren: PR30: 5'-CTCGTACCTTTAGTCGGATG-3', PR31: 5'-GGTAGCTTTGATTACATAGCCG-3', PR32: 5'-GATGGTCGTCTGTTATCGACTC-3' und PR33: 5'-GTCTGATAGTGTATTAGCAGATGTAAAAC-3'.
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Plasmidkonstruktionen
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- (a) pBSLG. Eine 4,2 by große lacZ-gpt-Kassette, die der
im von Sutter & Moss
(1992) beschriebenen Plasmid pIIILZgpt enthaltenen Kassette entspricht
und das E. coli-lacZ-Gen unter der Kontrolle des späten Vacciniavirus-Promotors
P11 und das E. coli-gpt-Gen unter der Kontrolle des frühen/späten Vacciniavirus-Promotors
P7.5 enthält,
wurde direkt in die multiple Klonierungsstelle des pBluescript II
SK+–plasmids
(Stratagene) eingesetzt, wobei Plasmid pBSLG erhalten wurde.
- (b) pLGF 11. Die Primer PRF1(5'-GGCCGCGGCCGCCACTAGATGAACATGACACCGG-3') und PRF2(5'-GGCCCCCCGGGGCATTACGTGTTGTTTGTTGC-3'), die eine NotI-
bzw. eine Smal-Restriktionsstelle
enthalten (unterstrichen), wurden zur Amplifizierung der 471 Basenpaare
(bp) langen Flank 1-Sequenz aus der genomischen Virus-DNA mittels
PCR als Matrize verwendet. Dieses Fragment wurde in zuvor mit den
gleichen Enzymen gespaltenen pBSLG eingesetzt, wobei pBSLGF11 erhalten
wurde. Flank 2 (534 bp) wurde unter Verwendung der Primer PRF3(5'-GGCCCCTGCAGGCAACAAACAACACGTAATGC-3') und PRF4(5'-CGCCCGTCGACCTTCTTTAGAGGAAATCGCTGC-3'), die eine PstI-bzw. SalI-Restriktionsstelle
enthalten (unterstrichen), amplifiziert. Dieses Fragment wurde in
zuvor mit beiden Enzymen gespaltenes pBSLGF11 eingesetzt, wobei
pLGF11 erhalten wurde.
- (c) pIIIV7.5F11Rep und pLGFV7.5. Die Primer PRFS(5'-GGCCCTACGTAGCAACAAACAACACGTAATGC-3') und PRF6(5'-GGCCGCGGCCGCCTCTATGTTTTTGTAGATATCTTTTTCC-3'), die eine Sna BI- bzw. eine NotI-Restriktionsstelle
(unterstrichen) enthalten, wurden zur Amplifizierung der 263 by langen
Sequenz, die einem Repeat am 5'-Ende
von Flank 2 entspricht, mittels PCR verwendet. Dieses Fragment wurde
stromaufwärts
der Vacciniavirus-P7.5-Promotorsequenz
in das Plasmid pIIIdhrP7.5 (Staib et al., 2000), das zuvor mit den
gleichen Restriktionsenzymen gespalten wurde, eingesetzt. Die Flank 2-Wiederholung-P7.5- Promotor-Kassette
wurde dann aus dem erhaltenen Plasmid mittels PstI-Spaltung ausgeschnitten,
mit Klenow-Polymerase behandelt und in die SmaI-Stelle von pLGF
11 eingesetzt, wobei das Insertionsplasmid pLGFV7.5 erhalten wurde.
- (d) pLGFV7.5-mTyr. Eine einzelne PmeI-Stelle stromabwärts der
Vacciniavirus-P7.5-Promotorsequenz
im Plasmid pLGFV7.5 wurde verwendet, um in dieses Plasmid das für die Tyrosinase
aus der Maus kodierende Gen einzusetzen. Das Plasmid pZeoSV2+/muTy
(Drexler et al., unveröffentlichte
Ergebnisse) wurde mit NheI und NotI gespalten. Das gewünschte Fragment
wurde mit Klenow-Polymerase behandelt und in die Pmel-Restriktionsstelle
mit glatten Enden in pLGFV7.5 eingesetzt, wobei das Plasmid pLGFV7.5-mTyr
erhalten wurde.
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Herstellung
von mutiertem FWPV-Virus
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Mit FWPV FP9 infizierte CEF wurden
mit dem Plasmid pLGF11 unter Verwendung von Lipofectin (Gibco) transfiziert.
Die Virusnachkommenschaft wurde geerntet und unter Agar, der Mycophenolsäure, Xanthin und
Hypoxanthin enthielt (MHX-Medium), ausplattiert. Viren, die β-Galactosidase-positive
Plaques bildeten, wurden mit einem Xgal-Überzug
sichtbar gemacht und die Plaques zweimal in Anwesenheit von Selektionsmedium
gereinigt. LacZ/gpt+-Viren wurden ohne Selektionsmedium weiter aufgereinigt,
bis 100% blaue Plaques erhalten wurden.
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PCR-Analyse
der Viren-DNA
-
Aus CEF, die mit unterschiedlichen
selektierten Virusisolaten infiziert worden waren, wurde nach Proteinase
K-Behandlung die Gesamt-DNA isoliert, wie zuvor beschrieben extrahiert
(Boulanger et al., 1998) und mittels PCR analysiert, wobei die Primer
PRF1 und PRF4 verwendet wurden, um die Abwesenheit der wt-Sequenz
zu überprüfen, sowie
die Primer PRF1 und PRF2, um das Vorliegen von DNA zu überprüfen.
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Analyse des
Viruswachstums
-
Konfluente CEF wurden in Dreifachansätzen mit
dem wt-Virus oder mit der F11L-Mutante mit einer Infektionsmultiplizität (moi)
von 0,05 pfu/Zelle infiziert. Das Impfgut wurde 1 Std. später entfernt
und durch frisches Medium ersetzt. Zu verschiedenen Zeiten nach
der Infektion wurden die Kolben aus dem Brutschrank entnommen und
bei –80°C aufbewahrt.
Der Titer wurde nach Klärung
der Virussuspension bei niedriger Geschwindigkeit mittels Plaquetest
bestimmt.
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Herstellung
von rekombinantem Virus
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Mit FWPV FP9 infizierte CEF wurden
mit linearisierter pLGFV7.5-mTyr-Plasmid-DNA transfiziert (2). Rekombinante Viren wurden
dreimal in Anwesenheit von Selektionsmedium gereinigt. Damit zwischen
Flank 2 und der Flank 2-Wiederholung eine erneute Rekombination
erfolgen konnte, die zum Verlust der lacZ-gpt-Subkassette führt, wurden
blaue Plaqueisolate, die einmal auf CEF vermehrt worden waren, in
Abwesenheit von Selektionsmedium weiter gereinigt. Viren, die weiße Plaques
bildeten, wurden anschließend Plaque-gereinigt.
Die erhaltenen Klone wurden dann wie zuvor beschrieben mittels PCR
getestet, wobei zusätzlich
eine PCR unter Verwendung von 2 für die lacZ-Sequenz spezifischen
Primern (PR43: 5'-GACTACACAAATCAGCGATTTCC-3' und PR44: 5'-CTTCTGACCTGCGGTCG-3') durchgeführt wurde, sodass die Anwesenheit
der Selektionskassette untersucht werden konnte.
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Sequenzanalyse des F11L-Gens
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Das FWPV-F11L-Gen befindet sich im
zentralen Bereich des Virusgenoms (1B).
Da der entsprechende offene Leserahmen im Genom des CEF-adaptierten
Vacciniavirus-Stamms
MVA fragmentiert ist (Antoine et al., 1998), spekulieren wir, dass
das Gen möglicherweise
für die
FWPV-Replikation nicht essentiell ist. Die partielle Sequenz des
C-Terminus des orthologen
F11L-Gens aus Taubenpockenvirus sowie das vollständige, für das F12L-Taubenpockenvirus-Ortholog
kodierende Gen und eine partielle Sequenz für das F13L-Ortholog waren bekannt
(Ogawa et al., 1993; Zugangsnummer M88588). Diese veröffentlichte
Sequenz überlappte
eine FWPV-Sequenz, die das gesamte F13L-Ortholog und fast das gesamte
F12L-Ortholog umfasste (Calvert et al., 1992; Zugangsnummer M88587).
Die beiden Sequenzen überlappen
sich um 2598 by und zeigen 100% Nucleotididentität. Unter der Annahme, dass
das F11L-Ortholog ebenfalls zwischen Taubenpocken- und Geflügelpockenviren
hochkonserviert ist, wurde der erste zur Sequenzierung des FWPV-Gens
verwendete Primer (PR30) anhand der partiellen Taubenpocken-F11L-Sequenz
(453 bp) gestaltet (1A).
Die unter Verwendung dieses Primers erhaltene Sequenz (488 bp) zeigte
100% Nucleotididentität
mit dem Ende der veröffentlichten
Taubenpocken-Sequenz. Die folgenden Primer (PR31 bis 33) wurden
anhand der neuen Sequenzen gestaltet, um Überlappungen zu erzeugen, die
zweimal die F11L-Gensequenz abdeckten (1A). Eine Sequenzierung wurde für die letzten
1254 by des FWPV F11L-ORF erhalten (1A).
Der Vergleich mit der veröffentlichten
vollständigen
Genomsequenz von FWPV (Afonso et al., 2000) zeigte, dass diese Sequenz identisch
mit der veröffentlichten
Sequenz des ORF FPV110, des orthologen FWPV-FI1L-Gens, ist.
-
Leserasterverschiebungsmutationen
der kodierenden F11L-Sequenz in Vacciniavirus-MVA deuteten darauf
hin, dass F11L möglicherweise
ein nicht essentielles Gen ist, das eventuell als Insertionsstelle
verwendet werden kann. Unsere Analyse des FWPV-F11L-Proteins (451
Aminosäuren)
unter Verwendung des GeneStream Align-Programms zeigte jedoch nur
18,6% Aminosäureidentität mit dem
Ortholog (354 Aminosäuren)
des Vacciniavirus-Stamms
Kopenhagen, was auf unterschiedliche Eigenschaften in beiden Viren
hindeuten könnte.
Beim Screening nach möglicherweise
essentiellen F11L-Genfunktionen fanden wir mittels BLAST-Suche keine
signifikanten weiteren Homologien. Weder im FWPV- noch im Vacciniavirus-Protein
wurden Signalsequenzen oder Transmembrandomänen vorhergesagt.
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Herstellung lebensfähiger F11L-mutierter
FWPV-Viren
-
Um zu bestimmen, ob FWPV-F11L als
neue Insertionsstelle verwendet werden kann, konstruierten wir mutierte
Viren mittels Insertionsdisruption der kodierenden F11L-Sequenz.
Das Plasmid pLGF11, das die lacZ-Kassette, flankiert von 2 Sequenzen
aus dem FWPV-F11L-ORF,
enthielt (1B und 2), wurde zur Herstellung
rekombinanter Viren verwendet, die aufgrund ihres Wachstums in Anwesenheit
von Mycophenolsäure unter
einem XGal-Überzug
selektiert wurden. Die Rekombinanten können entweder aus einem Doppelrekombinationsereignis
sowohl in Flank 1 als auch Flank 2 erhalten werden, was stabile
rekombinante Viren ergibt, oder durch ein einfaches Rekombinationsereignis
in einer der flankierenden Gensequenzen, was zu instabilen intermediären rekombinanten
Genomen führt.
Im letzteren Fall sind weitere Passagen in Abwesenheit von Selektionsmedium,
die das Sichtbarmachen von wt-Virus als weiße Plaques ermöglichen,
nötig,
bis ein stabiles rekombinantes Virus erhalten wird, das nur blaue
Plaques hervorbringt. Der Genotyp aufeinanderfolgender Virusisolate
wurde mittels PCR unter Verwendung der externen Primer charakterisiert,
die zur Erzeugung der Flanken verwendet worden waren (PRF 1 und
PRF4). Die Anwesenheit kontaminierender wt-Viren wurde durch bevorzugte
Amplifizierung der genomischen wt-Sequenz anhand des kürzeren PCR-Produktes überwacht,
wodurch der Test sehr sensitiv war. Der Virusklon F2 (3A) hatte nach 4 Plaquereinigungen
die wt-Gensequenz
verloren (Klon F2.1.2.1.1). Der Virusklon F15, der nach 3 Plaquereinigungen
nur blaue Plaques erzeugte (F15.1.1.1), enthielt immer noch die
wt-Sequenz, wie durch PCR gezeigt wurde (3A). Nach der Amplifizierung dieses Virusklons
(F15.1.1.1.1) durch drei aufeinanderfolgende Passagen in CEF ergab
die eingeschränkte
Verdünnung
zudem die Anwesenheit von Viren, die weiße Plaques erzeugten.
-
Bei einem Versuch, die Isolation
rekombinanter Viren zu beschleunigen, testeten wir die Transfektion mit
linearisierter Plasmid-DNA, eine Strategie, die von Kerr & Smith (1991)
empfohlen wurde, um das Auftreten von Einfachcrossoverereignissen
und das Erhaltenbleiben von Plasmiden zu reduzieren, die aus der
Auflösung
instabiler Einfachcrossover-Zwischenprodukte
in Viren während
der Vacciniavirus-Mutagenese stammten. Die Her stellung rekombinanter
Viren unter Verwendung von linerarisiertem Plasmid sollte nur aufgrund
eines Doppelrekombinationsereignisses zustande kommen und in der
Folge direkt zu stabilen rekombinanten Genomen führen. Tatsächlich zeigten die Virusklone
F9, F10 und F16, die durch linearisiertes Plasmid hergestellt wurden,
sogar nach der ersten Plaquereinigungsrunde keine nachweisbaren
wt-Gensequenzen mehr (3B).
Der Virusklon F8 benötigte
nur eine weitere Plaquereinigung, um offensichtlich von wt-Virus
frei zu sein (3B). Zudem
zeigte die Plaquetitration von Virusklon F9.1.1.1.1 nach drei Vermehrungszyklen
in CEF keine Anwesenheit von kontaminierendem wt-Virus.
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Effiziente
in vitro-Züchtung
des F11L-mutierten Virus
-
Die erfolgreiche Erzeugung lebensfähiger F11L-mutierter
Viren legte nahe, dass die F11L-Gensequenz
vernachlässigbar
ist. Um zu bestimmen, ob die Inaktivierung das Viruswachstum stören kann,
wurde der mutierte Virusklon F9.1.1.1 vermehrt und im Vergleich
mit wt-FWPV bezüglich
des Mehrschrittwachstums in CEF (4)
getestet. Beide Viren zeigten fast identische Replikationskinetiken
und erzeugten gleiche Mengen an infektiöser Nachkommenschaft.
-
F11L als Insertionsziel
ermöglicht
die stabile Expression rekombinanter Gene
-
Da festgestellt wurde, dass das F11L-Gen
nicht essentiell ist und die Disruption des Gens das Viruswachstum
nicht beeinträchtigt,
wurde der F11L-Genlocus als geeignete Insertionsstelle betrachtet.
Das Plasmid pLGF11 wurde zur Konstruktion eines Plasmidvektors (pLGFV7.5)
verwendet, damit in das FWPV-Genom fremde Gene zusammen mit der
lacZ-gpt-Selektionssubkassette
unter der Kontrolle des Vacciniavirus-P7.5-Promotors eingesetzt
werden konnten (2).
Das Plasmid enthielt außerdem
eine Wiederholung der Flank-2-Sequenz
(2), damit die Subkassette
anschließend
aus den rekombinanten Viren entfernt werden konnte. Als erstes von
pLGFV7.5 erhaltenes Fremdgen wurde die DNA-Sequenz inseriert, die für das Enzym
Tyrosinase kodiert, das als Antigen für eine experimentelle Impfung
gegen Melanome von Interesse ist (Drexler et al., 1999). Tyrosinase
ist am Biosyntheseweg zur Herstellung von Melanin beteiligt. Zellen,
die dieses Enzym exprimieren, akkumulieren Melanin und werden dunkel.
Diese Eigenschaft liefert ein einfaches Verfahren für das Screening
bezüglich
der Expression von Tyrosinase und ihrer funktionellen Unversehrtheit. Nach
der Transfektion mit pLGFV7.5-mTyr wurden fünf rekombinante Virusklone
für weitere
Analysen selektiert. Die Linearisierung der Plasmid-DNA, die sich während der
Produktion der F11L-mutierten Viren als sehr effizient herausgestellt
hatte, wurde auch zur Herstellung rekombinanter Viren verwendet.
Die Virusklone MT22 (Daten nicht gezeigt) und MT31 (5) zeigten nach nur einer Plaquereinigung
in Anwesenheit von Selektionsmedium keine nachweisbare wt-Virussequenz
(MT31.1, Spur 1, 5B).
Auf dieser Stufe zeigte die genomische DNA-Präparation beider Virusklone
bereits das Vorliegen rekombinanter Virusgenome, die keine nachweisbaren
Markergensequenzen mehr enthielten (2880 bp-Genprodukt in 5B) und gleichzeitig den selektierten
lacZ-gpt-positiven Genotyp (7282 bp), der durch diese PCR-Reaktion
kaum nachweisbar ist (siehe Klon 31.1.1, 5B, dritte Spur), aber mit der PR43-44-PCR
nachgewiesen wird (5C).
Von viraler DNA der vierten Plaquereinigung beider Klone, d.h. nach
nur einer Plaquereinigung in Abwesenheit von Selektionsmedium konnte
keine Markersequenz mehr amplifiziert werden (5C). Alle fünf rekombinanten Viren produzierten
nach CEF-Infektion
funktionelle Tyrosinase (5D).
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Es wurde auch die spezifische Synthese
von Melanin in infizierten HeLa- und Vero-Zellen demonstriert, die
beide für
FWPV nicht permissiv sind. Die in diesen Säugerzellen hergestellte Menge
an Melanin schien verglichen mit der CEF-Infektion kleiner zu sein.
Der Grund dafür
könnte
entweder fehlende Virusreplikation oder eine verringerte Expression
des Tyrosinasegens oder ein weniger effizienter Melaninsyntheseweg in
diesen Zelllinien sein (Daten nicht gezeigt). Zur Untersuchung der
genetischen Stabilität
der Tyrosinase-Insertion
wurden alle fünf
rekombinanten Virusisolate in vier aufeinanderfolgenden Mehrschritt-Wachstumspassagen
auf CEF amplifiziert und die Virusnachkommen mittels Plaquetitration
unter Agar analysiert. Von jedem rekombinanten Virus wurden zehn
verschiedene Plaqueisolate auf ihre Tyrosinaseexpression untersucht.
In allen Proben wurde Melaninsynthese nachgewiesen, was zeigt, dass
jedes Virus noch funktionelles rekombinantes Enzym bildete (Tabelle
1). Der gleiche Test wurde nach sechs Passagen durchgeführt. Nur
ein Plaqueisolat von einem der fünf
rekombinanten Viren konnte keine funktionelle Tyrosinase produzieren
(Tabelle 1). Die PCR-Analyse der Virus-DNA zeigte, dass das Genom
dieses Virusklons anscheinend noch die rekombinanten Volllängen-Gensequenzen
enthielt. Das legt nahe, dass die Tyrosinasegenexpression höchstwahrscheinlich
durch (eine) Punktmutationen) inaktiviert wurde (Daten nicht gezeigt).
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Der Vacciniavirus-F11L-ORF kodiert
potentiell ein Protein, das keine Homologie oder kein charakteristisches
Motiv aufweist, das eine spezifische Funktion vorhersagen könnte. Daher
ist das F11L-Ortholog von FWPV möglicherweise
nicht essentiell. In der vorliegenden Erfindung wurde diese Hypothese
durch Insertion einer Selektionskassette in das FWPV-Gen untersucht,
die ein Markergen (lacZ und eine Selektionsgen (gpt) enthielt. Die
Erzeugung rekombinanter Viren, die diese Kassette und keine wt-Gensequenzen
mehr enthielten, zeigte, dass das orthologe Volllängen-FWPV-Gen
für das
Wachstum von FWPV nicht essentiell ist. Das mutierte Virus wuchs
genauso effizient wie das wt-Virus (4),
was nahelegt, dass der F11L-Genlocus als geeignete Insertionsstelle
für rekombinante
Gene betrachtet werden kann. Folglich verwendeten wir diese Stelle, um
erfolgreich rekombinante FWPV-Viren zu erzeugen, die das Melanom-Modellantigen
Tyrosinase stabil exprimierten.
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Die stabile Expression von Marker-
oder Selektionsgenen in rekombinanten Viren kann bei einer Verwendung
als Vektorimpfstoff oder für
weitere Gentechnik ungeeignet sein. In unserem FWPV-Plasmidvektor war
die Selektionssubkassette von Wiederholgungssequenzen flankiert,
damit sie anschließend
eliminiert werden konnte. Die Herstellung einer solchen Rekombinante
erfordert zunächst
die Isolation eines rekombinanten Virus, das noch die Selektionssubkassette,
aber keine wt-Sequenz mehr enthält,
und anschließend
die Isolation der stabilen Rekombinante, die die Selektionssubkassette
verloren hat. Die Effizienz der Isolationsstrategie ist daher entscheidend,
damit endgültige
Rekombinanten in einem vernünftigen
Zeitraum erhalten werden. Ähnlich
wie frühere
Untersuchungen (Leong et al., 1994; Sutter & Moss, 1992) fanden wir, dass die
Kombination eines Reportergens und ei nes Selektionsgens ein einfaches
und sehr effizientes Selektionsverfahren ist. Diese Strategie wurde
weiter verbessert, indem mit linearisierter Plasmid-DNA transfiziert
wurde. Die Rekombination zwischen der Plasmid-DNA und dem Virusgenom
kann entweder mittels Einfachcrossover, was zur Integration der
gesamten Plasmidsequenz im Virusgenom führt (Spyropoulos et al., 1988;
Falkner & Moss, 1990;
Nazarian & Dhawale,
1991), oder durch doppelte Rekombination erfolgen. Laut Spyropoulos
et al. (1988) ist die Häufigkeit
für beide
Ereignisse ähnlich.
In unseren Händen
war die Anzahl der Plaquereinigungen, die zur Eliminierung jeglicher
wt-Sequenz nötig
war, unter Verwendung von linearisierter Plasmid-DNA tatsächlich stark
verringert (3 und 5). Diese Technik erlaubte
nicht nur eine Zeitersparnis, sondern reduzierte zudem das Risiko,
zufällige
Mutationen im Virusgenom zu integrieren, die während zahlreicher Passagen
unvermeidbar auftreten. Wie Nazarian & Dhawale (1991) nahelegen, könnte die
Gesamteffizienz der Rekombination nach der Transfektion mit linearisiertem
Plasmid niedriger sein als bei Verwendung von zirkulärem Plasmid.
In unseren Händen
verringerte jedoch die Verwendung von linearisiertem Plasmid die
Effizienz der Rekombination nicht, da wir bei der Herstellung F11L-mutierter
Viren ein Verhältnis
von einem blauen Plaque nach Transfektion mit zirkulärem Plasmid
zu fünf
blauen Plaques nach der Transfektion mit linearisiertem Plasmid
erhielten. Wir erhielten zudem Verhältnisse zwischen 1 und 10 bei
der Herstellung anderer rekombinanter Viren (unveröffentlicht).
Daher bestätigen
unsere Ergebnisse frühere
Daten (Spyropoulos et al., 1982), die nahelegen, dass die Gesamthäufigkeit
der Rekombination im Vacciniavirus sich nicht merklich ändert, wenn man
die Bildung von Einfachcrossover-Rekombinanten
durch Linearisierung des Plasmids in nicht homologen Abschnitten
verhindert.
-
Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung
geeigneter Virusvektorimpfstoffe ist die Stabilität der rekombinanten
Viren, die von der angestrebten Insertionsstelle entscheidend bestimmt
werden kann. Der Locus des viralen Thymidinkinasegens scheint sich
zur Herstellung rekombinanter Vogelpockenviren nicht zu eignen,
obwohl er die Standard-Insertionsstelle
zur Herstellung von rekombinantem Vacciniavirus ist (Scheiflinger
et al., 1997; Amano et al., 1999). Die Stabilität von Tyrosinase-rekombinanten
FWPV-Viren, die durch Verwendung von F 11 L als Ziel erhalten werden,
kann leicht durch die Untersuchung der Melaninsynthese überwacht
werden, wobei einfach die Farbe der Zellsedimente untersucht wird
(5D und Tabelle 1).
Nach sechs Passagen auf CEF exprimierte nur ein Plaqueisolat von
50 kein funktionelles rekombinantes Gen, was ein hohes Maß an genomischer
Stabilität
anzeigt.
-
Tabelle
1: Stabilität
der murinen Expression von Tyrosinase in 5 rekombinanten Viren
-
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