JP2002544236A - 組換えパラポックスウイルスに基づくとりわけ肝の慢性ウイルス感染症ならびに炎症性、変性性および増殖性疾患ならびに癌のための器官、組織および細胞特異的免疫治療薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、とりわけ肝の慢性ウイルス感染症および炎症性、変性性、増殖性疾患の治療ならびに癌の治療のための病原体および器官特異的である標的を定められた免疫治療薬としての器官、組織および／もしくは細胞特異的な組換えヒツジパラポックスウイルスの製造および使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、とりわけ肝のウイルス感染症ならびに炎症性、変性性および増殖性
疾患ならびに癌の器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異的に標的を
定められた免疫療法のための組換えパラポックスウイルスの製造法および使用に
関する。それはさらに医薬を製造するためのターゲティング特性を備える組換え
パラポックスウイルスの使用に関する。

【０００２】 ヒトおよび動物双方における皮膚およびその付属器、内部器官、目を包含する
中枢神経系およびその付属器の疾患、ならびにまた癌もまた前述のパラポックス
ウイルスの応用の領域内に入る。

【０００３】 潜伏性のおよび慢性に持続するウイルス感染症は免疫抑制により活性化もしく
は再活性化される可能性があること、または、逆に、免疫系が潜伏性であるウイ
ルスにより誘発される可能性のある急性疾患を抑制する（例えば、潜伏性のヘル
ペスウイルス感染症は免疫抑制とともに再発する、すなわち、ストレスもしくは
コルチゾン投与に伴う口唇の疱疹）ことが既知である。慢性に持続するおよび潜
伏性のウイルス感染症は、低分子量化合物に基づく慣習的抗ウイルス性物質で治
療することが困難であるか、もしくは全く治療することができないことがさらに
既知である。

【０００４】 この理由は、こうした感染症がウイルス酵素の活性の欠如（例えば、その後ヌ
クレオシド阻害剤が例えばウイルスＤＮＡ中で鎖の切断をもたらすことができる
ようにこの阻害剤をまず最初にウイルス核酸中に組込まなくてはならないウイル
スポリメラーゼ活性の欠如；例えば、例えば抗ウイルス性化合物が活性になるこ
とができるようにこの化合物をまず最初にリン酸化しなければならないウイルス
チミジンキナーゼ活性の欠如）を伴うこと、でなければ宿主の免疫系が感染した
細胞もしくはウイルス抗原を認識することに失敗することであることができる。

【０００５】 慢性に持続するウイルス感染症の場合、別のウイルスへの重複感染が、慢性に
持続するウイルスに対して向けられる抗ウイルス効果につながる可能性があるこ
とが同様に既知である¹⁾。この著者らは、この効果がＴ細胞、ナチュラルキラー
細胞およびマクロファージにより分泌されるインターフェロン（とりわけＩＦＮ
−γ）およびＴＮＦ−αに依存することを立証することが可能であった。

【０００６】 これらの著者により得られた結果は、クラスＩに限定された細胞傷害性Ｔ細胞
がＨＢＶトランスジェニックマウス中で肝細胞のＨＢＶ遺伝子の発現を阻害する
ことが可能であったこと、この過程が肝細胞が破壊されることなく起こったこと
、ならびに、該過程がＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γにより導き出されたことを示
した、別のより早期の研究を確認した²⁾。

【０００７】 「準特異的免疫（ｐａｒａｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）」を誘導す
るための生成物、すなわち準免疫誘導物質と称されるものが、比較的長期間、獣
医学の実務で治療的、ならびに後予防的（ｍｅｔａｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａ
ｌｌｙ）および予防的にの双方で使用されている。これらの準免疫誘導物質は、
例えば化学的に不活性化されたヒツジパラポックスウイルスより成る。ベイパミ
ュン［ＢＡＹＰＡＭＵＮ］（商標）（独国特許第３５０４９４０号明細書）は、
このウイルス（ヒツジパラポックスウイルス株Ｄ １７０１）に基づいて製造さ
れる製品である。

【０００８】 動物においては、不活性化されたウイルスは非常に広範な病原体による感染症
に対する非特異的保護を誘導する。動物の内在性の防禦系が、多様な機構を経由
してこの保護を媒介すると想定されている。

【０００９】 これらの機構は：インターフェロンの誘導、ナチュラルキラー細胞の活性化、
「コロニー刺激活性」（ＣＳＡ）の誘導およびリンパ球増殖の刺激を包含する。
作用機序についてのより早期の検討は、インターロイキン２およびインターフェ
ロン−γによる刺激を立証した³⁾。

【００１０】 パラポックスウイルスは、ベクターとして、対応するタンパク質を発現しそし
て従ってドナーの病原体に対する予防的免疫保護（ワクチン接種）を生じさせる
ことが可能であるために、他の病原体からの遺伝子を提供されることができるこ
とが同様に既知である⁴⁾。

【００１１】 組換えのいわゆる「偽分類された（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）」ウイルスは、
それが元は感染させることが可能でなかった標的の細胞、組織、器官および／も
しくは宿主を感染させることが可能であることがさらに既知である⁵⁾。

【００１２】 これらの知見に基づく標的を定められた遺伝子治療におけるベクターの使用の
可能性は既に論考されている⁶⁾。

【００１３】 薬理学においては、特定の器官（ここで挙げられる例の場合には肝）を、器官
特異的受容体（ここで挙げられる例の場合には肝のアシアロ糖タンパク質受容体
）との相互作用に基づくこれらの分子での治療に選択的に利用できるようにする
ために、アシアロフェツインもしくはポリ−Ｌ−リシンのような天然および合成
の分子を利用する⁷⁾。

【００１４】 従って、この背景に対し、ヒツジパラポックスウイルスの上述された一般化さ
れた準特異的免疫原性を、病んでいる器官（系）および原因病原体に向かって、
標的を定められた様式で向けることができるような該パラポックスウイルスの顕
著な免疫原性効果の治療上の利用性をさらに改良するという目的が生じる。

【００１５】 この方法で焦点を合わせることは、より少ない副作用を伴うことができかつ作
用部位でより強力かつより持続的に表されることができる治療効果を期待するこ
とを可能にすることができる。

【００１６】 従って、本発明の目的は、標的を定められた様式でパラポックスウイルスの免
疫学的効果を生じさせることであった。該目的は、器官特異的、組織特異的およ
び／もしくは細胞特異的受容体分子と相互作用することが可能である、適する外
来のペプチドもしくはタンパク質をそれぞれウイルスに結合もしくはウイルス中
に導入することにより達成される。

【００１７】 この方法で、われわれは免疫反応に強力に焦点を合わせることが可能であった
。これは、それにより、それが必要とされる部位に免疫系の複雑な能力を集中さ
せるのにヒツジパラポックスウイルスを使用することを最初に可能にする。

【００１８】 これから起こる利点は、それが必要とされる部位での免疫学的効果の付随する
強化を伴う組織特異性、器官特異性もしくは細胞特異性、および副作用の減少に
存する。

【００１９】 一方で、一般的性質の望ましくない副作用が期待されなくてはならず、そして
／もしくは、他方、既に知られた方法／生成物を全身に適用する場合に作用部位
での有効成分の不十分な濃度のみが達成されるため、ここで記述される新規の型
のヒツジパラポックスウイルスを使用してより標的特異的かつより有効である治
療を達成することが可能である。

【００２０】 標的を定められた器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異的免疫療
法のために組換えヒツジパラポックスウイルスを調製するために、改変されない
もしくは改変された、または延長もしくは短縮されたかのいずれかであることが
できる既知のウイルスタンパク質／ペプチドを使用することが可能である。この
点について、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の大型のエンベロープタンパク質
は、例えば肝に達するのにとりわけ適することが判明している。

【００２１】 加えて、肝の標的を定められた治療に非ウイルス性タンパク質／ペプチド、と
りわけアシアロ糖タンパク質を使用することが可能である。

【００２２】 当業者が知悉している技術を使用して、例えばファージライブラリーからその
配列を同定することができる新規の合成タンパク質／ペプチドを使用することも
また可能である⁸⁾。

【００２３】 挙げられたペプチドもしくはタンパク質に加え、例えばＢ型肝炎ウイルスもし
くは他のウイルス、または腫瘍関連抗原から選択された免疫調節エピトープをパ
ラポックスウイルスにクローン化することもまた可能である。

【００２４】 この方法で、病原体もしくは腫瘍に対し強力かつ特異的に向けられている免疫
刺激特性を、パラポックスウイルス中に導入する。

【００２５】 適するエピトープは、当業者が知悉している既知の技術、例えばフローサイト
メトリーを使用して同定する⁹⁾。

【００２６】 上述された特性を備える新規組換えウイルスは、例えば下述されるとおり調製
かつ特徴づけることができる： その遺伝子産物もしくはその部分が免疫調節効果もしくはウイルス複製に必要
とされない配列を欠く組換えウイルスの調製。

【００２７】 組換えヒツジパラポックスウイルスのクローニングの一例は、その出発点とし
て、ワクシニアの１１Ｋ遺伝子もしくは別の適する配列の制御下に１つのマーカ
ー遺伝子（例えばＬａｃＺ遺伝子）、および相応して適するプロモーターの制御
下に別の選択マーカー遺伝子（例えばｇｐｔ遺伝子（酵素キサンチン−グアニン
ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＸＧＰＲＴをコードする））を発現する二
重選択カセットの構築を利用する。その後、ウイルスの配列を、例えば下述され
るとおり欠失させることができる： ウイルス複製もしくは免疫調節効果のいずれにも不可欠でないヒツジパラポッ
クスウイルスの一領域（例えば適するエンベロープタンパク質遺伝子、構造タン
パク質をコードする別の遺伝子（今後適する遺伝子と称される）もしくは別の遺
伝子（例えばＶＥＧＦ遺伝子））中の唯一の制限切断部位を、エンドヌクレアー
ゼＢａｌ３１の影響下で配列の二方向欠失をもたらすための出発点として使用す
る。

【００２８】 これのために、対応するプラスミド（例えばヒツジパラポックスウイルスの核
酸配列を含有する適する構造タンパク質遺伝子）を、適する制限酵素を使用して
ＶＥＧＦ遺伝子中で開裂させ、そして今や直線状にされたプラスミドをＢａｌ３
１とともにインキュベートする。適する欠失プラスミドを埋め（ｆｉｌｌｅｄ
ｉｎ）、そしてそれに対し相補的でありかつ新たな唯一の切断部位（例えばＳｍ
ａＩ、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲＶ制限切断部位）を構成するオリゴヌクレオチド
を、平滑端を提供されているＢａｌ３１生成物に連結する。

【００２９】 細菌の形質転換後、プラスミドＤＮＡを単離し、そして対応するヒツジパラポ
ックスウイルスのＤＮＡフラグメントの配列中に認識部位を含有しない酵素で切
断することができる。対応する制限酵素で切断されているＬａｃＺ／ｇｐｔ選択
カセットを適する遺伝子中の欠失部位に挿入した後、配列決定により、それぞれ
の生じる組換えプラスミドＤＮＡ中で生じられた欠失の正確な大きさを決定する
ことができる。

【００３０】 そうして対応する遺伝子産物もしくはその一部分を欠くウイルスは、例えば以
下のとおり調製することができる： コンフルエントまで成長したウシ腎細胞のような適する細胞を、およそ０．１
感染多重度（ｍｏｉ）の感染用量に感染させる。約２時間後、例えば当業者が知
悉しておりかつ商業的に入手可能であるトランスフェクション系を使用して、上
述されたとおり調製した欠失プラスミド（例えば１０μｇ）を用いて、感染した
細胞をトランスフェクションする。その後、これらの細胞培養物を、細胞変性効
果（ｃｐｅ）もしくはプラーク形成が目に見えるまで、適する選択培地を用いて
（例えばＨＡＴ培地［ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン］、ＭＰＡ［
ミコフェノール酸］を用いて）、およそ３７℃で３ないし６日間、およびおよそ
５％ ＣＯ₂雰囲気中でインキュベートする。その後細胞を溶解し、その後細胞
ライセートから希釈系列を調製し、そして適する細胞でプラーク試験を実施する
。プラーク試験のためには、例えばＬａｃＺを発現するＭＰＡ抵抗性の組換えウ
イルスを含有する青色プラークを同定するために、例えば１ｍｌあたりおよそ０
．３ｍｇのブルオガル（Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ）（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））を含有す
ることができるアガロース培地混合物を添加する。この方法で得られた組換えウ
イルスを、ウシ腎細胞のような適する細胞を感染させるために使用し、そして可
能な限り均質でありかつ最も有利には＞９９．９％均質である組換えウイルス集
団が得られるまで、最低２回のさらなるプラーク力価測定にかける。

【００３１】 その遺伝子産物もしくはその部分が器官特異的、組織特異的もしくは細胞特異
的なターゲッティングに必要とされる配列を含有する組換えウイルスの調製。

【００３２】 ターゲティング配列を含有する組換えウイルスの調製のため、類似の一アプロ
ーチを使用する。上述されたとおり変えられたウイルスを出発ウイルスとして使
用する。あるいは、これがウイルス複製および／もしくは免疫調節効果に対し負
の影響を有しない場合には、遺伝子的に変えられていないウイルスに、ターゲテ
ィング配列を組込むことができる。ヒツジパラポックスウイルスの欠失もしくは
短縮された配列を含有するプラスミドの代わりに、変えられていないもしくは適
する様式で変えられかつ不活性化されない形態もしくは不活性化された形態の組
換えウイルスの標的を器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異的様式
で定めることを可能にするタンパク質もしくはペプチドをコードするＤＮＡ配列
を含有する対応するプラスミドを利用する。例えば肝に該組換えウイルスを導入
することが望ましい場合は、この配列は例えばヒトＢ型肝炎ウイルスの大型のエ
ンベロープタンパク質の配列もしくは別の適する配列であることができる。ター
ゲティング配列が、構造タンパク質をコードしない遺伝子中に組込まれる場合に
は、それがウイルスエンベロープに組込まれることを可能にするために、該ター
ゲティング配列を適切な膜アンカーに結合することができる。

【００３３】 既に存在する選択マーカーの妨害が存在しないかもしくは適する妨害のみが存
在するような調製に関連する選択マーカーの選択が行われるべきである。

【００３４】 加えて、類似の様式で、免疫学的に活性のエピトープをコードする配列を挿入
することが可能である。これらのエピトープは当業者に既知である方法を使用し
て選択することができる⁹⁾。

【００３５】 組換えウイルスのターゲティング特性の検出。

【００３６】 一方で、このウイルスの場合、選択マーカーの使用および／もしくはウェスタ
ンブロッティングによっての新たなタンパク質／ペプチドの検出のような当業者
に既知である適する方法を使用して、組換えウイルスの新たな特性を検出し；他
方、機能の検出を実施することが可能である。この後者は、標的にされている細
胞で実施する。アシアロ糖タンパク質もしくはその適切な部分を含有する組換え
ウイルスを用いて肝が標的にされている場合、この機能の検出は、アシアロ糖タ
ンパク質の受容体を発現している細胞への組換えウイルスの結合を検出すること
により実施することができる。これらの細胞は、その中でアシアロ糖タンパク質
および組換えウイルスを使用して競争的結合研究を実施することが可能である、
ヒト肝細胞もしくは肝癌細胞（例えばＨｅｐＧ２）であることができる。

【００３７】 これらの研究は、対照として、アシアロ糖タンパク質受容体を発現しない細胞
（例えば線維芽細胞）でもまた実施する。ターゲティング特性は、不活性化され
た組換えウイルスおよび不活性化されない組換えウイルス双方に存在する。しか
しながら、治療の目的上、そのターゲティング特性が治療の目的に対応すること
が立証されている組換えウイルスのみを利用する。

【００３８】 免疫調節特性の検出 組換えウイルスの免疫調節特性は例えばマウスで実験的に検出することができ
る。これのためには、不活性化されたかもしくは不活性化されない形態の組換え
ウイルスを、マウス（例えばＢａｌｂ／ｃマウス）に例えば体腔中に、例えば腹
腔内にもしくは皮下に、筋肉内にもしくは静脈内に注入する。確立されるはずで
あるスケジュールに従って（例えば投与６、１２および２４時間後）、動物を殺
し、そして器官および／もしくは細胞（例えば腹腔洗浄により得られる細胞）を
取り出す。ＲＮＡのような遺伝物質を器官／細胞から単離し、そして適する方法
を使用して（例えば半定量的もしくは定量的ＰＣＲによって）サイトカインの発
現を測定する。

【００３９】 特定の治療のためには、その場合には、治療効果が期待されるはずであること
をその免疫調節特性（Ｔｈ１免疫応答の誘導）が示唆する組換えウイルスを利用
する。

【００４０】 潜伏性のおよび慢性に持続するウイルス感染症に対するＴｈ１免疫応答の影響
の既知の情況¹⁰,¹¹⁾、ならびに組換えヒツジパラポックスウイルスの免疫調節特
性（その特性は非組換えのヒツジパラポックスウイルスのものと類似もしくはそ
れより優れている）に基づき、ヒトおよび動物において、器官特異的、組織特異
的および／もしくは細胞特異的組換えヒツジパラポックスウイルスを単独療法と
して、または生物学的に活性な（例えば抗ウイルス性）低分子量の化合物もしく
は生物学的に活性のタンパク質との組み合わせ剤で使用することが可能であり、
この使用は、主としてＢ型肝炎ウイルスへの慢性感染症、または内部器官（とり
わけ肝）の他のウイルス感染症（ここで、例としてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
もしくは肝炎を引き起こすウイルスの群からの全部の他の病原体¹²⁾を挙げるこ
とができる）、ならびに、また他の疾患により付随される場合には多様な型の単
純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、多様な型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒ
ト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）へ
の感染症、ならびにまた動物における対応するウイルス性疾患の抗ウイルス治療
のため治療的価値のあるものである。

【００４１】 さらに、示された作用機序に基づけば、とりわけ成功を達成するなんらかの見
込みをもつ以下の予防もしくは治療的治療を実施するために、該組換えパラポッ
クスウイルスを使用することが可能である： ヘルペスウイルス感染症に関連した再発の予防、および後予防、すなわち患者
が曝露直後に該作用物質で治療される場合のウイルス感染症（例えばＨＩＶ）の
確立の予防¹³⁾。作用機序に基づけば、癌を治療することが同様に可能である¹⁴, ¹⁵⁾ 。器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異的な組換えヒツジパラ
ポックスウイルス株を、単独療法として、もしくは前記適応症で同様に生物学的
に有効な低分子量化合物との適切な組み合わせ剤で使用することが可能である。

【００４２】 肝硬変および／もしくは肝線維症のような、肝の炎症性および非炎症性の変性
性および増殖性疾患を治療するのに組換えヒツジパラポックスウイルスを使用す
ることが同様に可能である。器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異
的組換えヒツジパラポックスウイルス株を、単独療法として、もしくはこれらの
前記適応症に同様に関連して生物学的に有効な低分子量化合物との適切な組み合
わせ剤で使用することが可能である。

【００４３】 組換えウイルスは、臨床上の問題（例えばヒトにおける慢性Ｂ型肝炎ウイルス
疾患）に依存して、器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異的な治療
のため調製する。

【００４４】 その手順は、細胞に媒介される免疫応答を誘導するのに必要とされない遺伝子
を欠失もしくは突然変異させることである。その場合、標的の細胞、組織もしく
は器官上の１個もしくはそれ以上の受容体との特異的相互作用を確実にするエピ
トープ（ペプチド／タンパク質）をコードする遺伝子配列を、これらの遺伝子も
しくは遊離の遺伝子セグメント中に挿入する。あるいは、これがウイルスの複製
もしくは成熟および／またはウイルスの免疫調節特性に対しいかなる負の影響も
有しない場合には、対応するエピトープをコードする遺伝子配列を、遺伝子的に
変えられていないパラポックスウイルス中に挿入することが可能である。

【００４５】 加えて、病原体に対する細胞に媒介される免疫応答を特異的に強化するために
、適する免疫学的な有効なエピトープ（例えばＨＢＶエピトープ）を使用するこ
とが可能である。

【００４６】 このためには、器官特異的、組織特異的および／もしくは細胞特異的に相互作
用／結合する組換えヒツジパラポックスウイルスに、１種もしくはそれ以上の病
原体に対し向けられかつ免疫応答を増強する特異的エピトープを付加的に提供し
、そしてその後適切な適応症で使用する（例えば、ヒトにおける慢性Ｂ型肝炎疾
患のような前述のウイルス性疾患の１種もしくはそれ以上に対して）。あるいは
、これがウイルスの複製もしくは成熟および／またはその免疫調節特性に対しい
かなる負の影響も有しない場合には、適切なエピトープをコードする遺伝子配列
を、遺伝子的に変えられていないパラポックスウイルス中に挿入することができ
る。

【００４７】 組換えヒツジパラポックスウイルスは、臨床上の問題および／もしくは病因論
的に関与するウイルスに依存して、不活性化されたかもしくは不活性化されない
形態で、全身に（例えば、筋肉内に、皮下に、腹腔内にもしくは静脈内に）また
は局所で（例えば関連する器官中に）投与する。

【００４８】 この点について、組換えパラポックスウイルスは、凍結乾燥された形態で存在
しそしてその後投与直前に適する溶媒に懸濁するか、でなければ別の適する製剤
中に存在するかのいずれかである。

【００４９】 この点について、臨床上の問題の要件に対応するスケジュールに従って、連続
的注入までかつそれを包含する数回の投与を与えることが必要であるかもしれな
い。

【００５０】 適応症および／もしくは臨床上の問題に依存して、器官特異的、組織特異的お
よび／もしくは細胞特異的なヒツジパラポックスウイルス株を、単独療法として
、もしくは生物学的に活性の低分子量化合物との組み合わせ剤でのいずれかで使
用することができる。

【００５１】 ヒツジパラポックスウイルスを生物学的に活性の低分子量化合物との組み合わ
せ剤で使用する場合、投与は同時に起こるか、でなければちょうどよい時にずら
すかのいずれかであることができる。従って、例えば、最初に低分子量化合物（
例えばヌクレオチド類似物もしくは他の化合物）を使用してウイルス複製を減少
もしくは予防し、そしてその後組換えヒツジパラポックスウイルスを使用してウ
イルスの一掃をもたらすことが可能である。例えば急性のウイルス感染症の場合
にはこうした併用療法を使用することもまた可能である。 実施例 ヘルペスウイルス進入媒介物質のためのターゲティング突然変異体を調製かつ
試験するために ウシヘルペスウイルス１（ＢＨＶ−１）の糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）は、その標
的細胞へのウイルスの結合および該標的細胞へのウイルスの浸透（ｐｅｎｅｔｒ
ａｔｉｏｎ）の原因であり、この点について他のウイルス糖タンパク質もまた関
与している（Ｌｉａｎｇら １９９１）。ｇＤ特異的抗体の中和は、ウイルスの
浸透（ウイルスの吸着後の段階である）を妨害することによりそれらの機能を発
揮する（Ｏｋａｚａｋｉら １９８６）。ｇＤは、結果として、ヘルペスウイル
ス進入媒介物質（ＨＶＥＭ）を結合するためのウイルス部位として作用する（Ｍ
ｏｎｔｇｏｍｅｒｙら １９９６）。このヘルペスウイルス進入媒介物質を所有
しない細胞は、多様なヘルペスウイルス、例えばヒトヘルペスウイルス１［ＨＳ
Ｖ−１］もしくはＢＨＶ−１への感染症に抵抗性である。ｇＤを発現するその能
力が変化している異なるＢＨＶ−１株は、細胞に浸透するそれらの能力において
もまた変化しており、この能力はｇＤの含量と正に相関する（Ｆｅｈｌｅｒ、１
９９１）。

【００５２】 その表面上にｇＤを担持する組換えヒツジパラポックスウイルスを、ＨＶＥＭ
を発現する細胞（例えばＭＤＢＫ細胞）上のこれらのＨＶＥＭ結合部位にターゲ
ティングのに使用することができる。これらの細胞が、ＢＨＶ−１、ｇＤを発現
する組換えパラポックスウイルス、もしくは野性型パラポックスウイルスに感染
する場合には、ＨＶＥＭのターゲッティングを浸透速度として測定することが可
能であるはずである。この点について、ｇＤ組換えパラポックスウイルスはＢＨ
Ｖ−１とほぼ同じくらい迅速に、そしていずれかの場合には野性型ヒツジパラポ
ックスウイルス（ＭＤＢＫ細胞を感染させることもまた可能である）よりも迅速
に、細胞に浸透することができる。

【００５３】 ＬａｃＺ突然変異体の調製： ゲノム中に二重で存在するｖｅｇｆ遺伝子を、ヒツジパラポックスウイルス（
株Ｄ １７０１）から事実上完全に欠失させ、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の
ｌａｃＺ−ｘｇｐｔ発現カセットを各場合で該部位に挿入した（Ｒｚｉｈａら
１９９９）。

【００５４】 相同的組換えのためのトランスフェクションプラスミドの調製： そのシグナル配列および膜アンカーを包含するＢＨＶ１ ｇＤ遺伝子（Ｔｉｋ
ｏｏら １９９０）をＰＣＲにより増幅し、そしてベクターｐＤＶＲｅｃ（Ｒｚ
ｉｈａら １９９９）のＥｃｏＲＶ部位に平滑端クローン化した。元の配列をも
つｐＤＶＲｅｃ中のｇＤ配列の一致を、配列決定（ＭＷＧ バイオテック（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ））により確認した。

【００５５】 トランスフェクション： パラポックスウイルスのｌａｃＺ突然変異体（Ｄ１７０１−ＲＶ）を、単離さ
れたプラスミドｐＤＶＲｅｃ／ｇＤおよびＢＫＫＬ３Ａ細胞を使用してトランス
フェクションした。細胞の７０ないし８０％単層を使用してトランスフェクショ
ンを実施した（６穴プレート：ウェルあたりおよそ４×１０⁵個の細胞数）。使
用されたトランスフェクション試薬はリポソームトランスフェクション試薬ＤＯ
ＳＰＥＲであった。細胞を、０．１のＭＯＩでパラポックスウイルスのｌａｃＺ
突然変異体に感染させた。２μｇのプラスミドＤＮＡを１：３および１：４の比
でＤＯＳＰＥＲと混合し、そしてウイルスでの感染後、細胞に添加した。

【００５６】 トランスフェクションの４ないし７日後に、細胞はウイルス特異的な細胞変性
効果を表し、そしてウイルスを３回凍結および融解することにより収穫した。

【００５７】 プラーク精製： ＢＫＫＬ３Ａ細胞を、１０倍の段階（１０^-2ないし１０^-6）で希釈した組換え
ウイルスに感染させた。数日後におよそ１０ないし３０の発生期のウイルスプラ
ークを見ることが可能であったウェルに、３００μｇ／ｍｌのアガロースブルオ
ガル（Ｂｌｕｏ−Ｇａｌ）（ギブコ（ＧＩＢＣＯ））をかぶせた。プレートを３
７℃で２４から４８時間までインキュベートした後（５％ ＣＯ₂）、それから
、白色プラークを拾った。抜き取られたアガロースブロックからのウイルス材料
を一夜培地中に溶出させ、そしてもう一度ウイルスを繁殖させた（第一のプラー
ク精製）。第一のプラーク精製後、クローンをドットブロット中でＰ³²標識され
たｇＤ ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。陽性の組換え体を最低３回の
プラーク精製段階によって精製した。

【００５８】 浸透アッセイ： ウシ腎細胞（ＭＤＢＫ、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２２）は、ＡＴＣＣの説明書に
従って培養し、そして実験の開始時にコンフルエントであった。細胞を４℃で５
分間前インキュベートした。その後、培地を吸引分離し、かつ前冷却された（４
℃）ａ）ＢＨＶ−１、ｂ）ｇＤ組換えパラポックスウイルス、もしくはｃ）野性
型ヒツジパラポックスウイルスを細胞に添加した（ＭＯＩ、０．０１）。その後
、細胞を４℃で１５分間インキュベートし、その後培地を吸引分離し、そして細
胞を冷（４℃）ＰＢＳで１回洗浄した。その後、細胞のインキュベーションを、
インキュベーター中３７℃の温度で温培地中で継続した。

【００５９】 １０、２０、３０、６０および１２０分後、各場合で１個のウェルをおよそ４
５秒間クエン酸緩衝液で洗浄した一方、各場合で１個の対照ウェルをＰＢＳで洗
浄した。これは、それにより、その時点までに細胞中に浸透していなかったウイ
ルスを不活性化した。これは浸透の速度論を与えた。酸処理後、細胞に培地（０
．５％メチルセルロースを含有した）をかぶせた。３日後、細胞を固定しかつ染
色し、そして０から＋＋＋＋までの尺度を使用して、プラークをプラークビュー
ワーで測定した。

【００６０】 結果： ＢＨＶ−１およびｇＤ組換えヒツジパラポックスウイルス（ｇＤＰＰＶＯ）の
場合はわずかおよそ７分後にウイルスの半分以上が細胞質膜を浸透していた一方
、野性型ヒツジパラポックスウイルス（ｗｔ ＰＰＶＯ）はこれを達成するのに
およそ２０分を必要としたことが見出された。これらの差異は有意である（事後
的比較と一緒の分散分析）。これは、それにより、ａ）ヒツジパラポックスウイ
ルスの表面上でタンパク質を発現することが可能であること、ならびにｂ）この
タンパク質は特異的受容体にターゲティングために使用することができ、その受
容体はまた、特定の細胞および／もしくは特定の組織上で発現されることを立証
した。

【００６１】

【表１】

【００６２】

【表２】

【００６３】

【表３】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/22 Ａ６１Ｐ 31/22 35/00 35/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シユラツプ，トビアス ドイツ・デー−51061ケルン・ゲルステン カンプ10 Ｆターム(参考） 4C084 AA13 CA01 CA53 NA14 ZA752 ZB112 ZB262 ZB332 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA75 ZB11 ZB26 ZB33

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 医薬を製造するための、ターゲティング特性を備える組換え
   パラポックスウイルスの使用。
2. 【請求項２】 ターゲティング特性を備える組換えパラポックスウイルスを
   含んで成る医薬。