JP4895505B2 - 変異ワクシニアウイルスアンカラ(mva)ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域 - Google Patents
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Description
MVAゲノムの新たな挿入部位を同定すること、およびその新たに同定されたMVAゲノムの挿入部位への外因性DNA配列の挿入を指示する挿入ベクターを提供することが、本発明の目的である。
本発明者らは、変異ワクシニアアンカラ(MVA)ウイルスのゲノムに外因性DNA配列を挿入するための新しい部位を同定した。これらの新規挿入部位はウイルスゲノムの遺伝子間領域(intergenic region:IGR)に位置し、そのIGRは、MVAゲノムの隣り合う2つのオープンリーディングフレーム(ORF)間に位置しているか、またはMVAゲノムの隣り合う2つのオープンリーディングフレームに隣接している。
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190R、192R−193R
を含む群から選択される、隣り合う2つのORFの間にある1種以上のIGRに、異種DNA配列を挿入することができる。
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190R、192R−193R
を含む群より選択されるIGRおよびORFから、それぞれ選択される。
・SEQ ID NO:32の527〜608番目、
・SEQ ID NO:33の299〜883番目、
・SEQ ID NO:34の339〜852番目、
・SEQ ID NO:35の376〜647番目、
・SEQ ID NO:36の597〜855番目、
・SEQ ID NO:37の400〜607番目。
・SEQ ID NO:32の1〜525番目および609〜1190番目、
・SEQ ID NO:33の101〜298番目および884〜1198番目、
・SEQ ID NO:34の1〜338番目および853〜1200番目、
・SEQ ID NO:35の1〜375番目および648〜1200番目、
・SEQ ID NO:36の1〜596番目および856〜1200番目、
・SEQ ID NO:37の1〜399番目および608〜1081番目。
・J.Sambrook、E.F.FritschおよびT.Maniatis著「Molecular Cloning, A laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989。この文献には、例えばDNAのクローニング、RNA単離、ウェスタンブロット解析、RT−PCRおよびPCR増幅技術などの標準的な分子生物学技術に関する技術およびノウハウが記載されている。
・Brian WJ MahyおよびHillar O Kangro編「Virology Methods Manual」,Academic Press,1996。この文献には、ウイルスの取り扱いと操作に関する技術が記載されている。
・AJ DavisonおよびRM Elliott編「Molecular Virology:A Practical Approach」(The Practical Approach Series),IRL Press at Oxford University Press、オックスフォード、1993の第9章「Expression of genes by Vaccinia virus vectors(ワクシニアウイルスベクターの発現)」。
・「Current Protocols in Molecular Biology」、出版社:John Wiley and Son Inc.,1998の第16章、IV節「Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral vector(ワクシニアウイルスベクターを使った哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現)」。この文献には、MVAの取り扱い、操作および遺伝子工学に関する技術とノウハウが記載されている。
図1:図1は、I4L ORF後の挿入部位に隣接する約600bpのMVA配列を含むベクターコンストラクトpBNX39(図1a)、pBNX70(図1b)およびpBN84(図1c)の制限酵素地図である。これらのプラスミドは、隣接配列Flank1(F1 I4L−I5L)とFlank2(F2 I4L−I5L)の間に、ポックスウイルスプロモーター(P)の転写制御を受ける外因性DNA(それぞれEcogptおよびhBFP)も含んでいる。F1rptは、得られた組換えウイルスからレポーターカセットを欠失させることができるようにするためのFlank1の反復配列を意味する。pBN84(図1c)はデングウイルスNS1タンパク質(NS1 DEN)もコードしている。その他の略号:AmpR=アンピシリン耐性遺伝子、bps=塩基対。
MVAの065L ORFに隣り合う遺伝子間領域に外因性配列を挿入するために(挿入部位はゲノム位置56760にある)、その挿入部位に隣り合う約1200bpの隣接配列を含むベクターを構築した。これらの隣接配列は2つの隣接部分に分離され、一方の隣接部分には065L ORF(別名:I4L ORF)の約610bpが含まれ、他方の部分には065L ORFに続く遺伝子間領域とその直後のORFの一部との約580bpが含まれる。これらの隣接配列の間には、それぞれEcogpt遺伝子(gptは大腸菌から単離されるホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する)、およびBFP(青色蛍光タンパク質)が、ポックスウイルスプロモーターの転写制御下に置かれている。また、I4L ORFに続く遺伝子間領域に追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も、少なくとも1つは存在する。典型的な本発明のベクターコンストラクトを図1aおよび図1bに示す(pBNX39、pBNX70)。ベクターpBN84(図1c)では、デングウイルスNS1のコード領域が、pBNX70(図1b)のクローニング部位に挿入されている。
(相同組換えによる組換えMVAの作製)
外来遺伝子は相同組換えによってMVAゲノム中に挿入することができる。この目的のために、興味ある外来遺伝子を、上述のプラスミドベクターにクローニングする。このベクターをMVA感染細胞にトランスフェクトする。組換えは、感染し、かつトランスフェクトした細胞の細胞質で起こる。同じく挿入ベクターに含まれている選択及び(又は)レポーターカセットを利用して、組換えウイルスを含む細胞を同定し、単離する。
(MVAのI4L挿入部位へのEcogptの挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、レポーター遺伝子としてEcogpt遺伝子(Ecogpt(略してgpt)はホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する)を含んでいる挿入ベクターpBNX39(図1a)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの添加によるホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で、プラーク精製を3回行うことによって精製した。ミコフェノール酸(MPA)はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、大半の細胞株でプリン合成の遮断およびウイルス複製の阻害をもたらす。この遮断は、構成的プロモーターからEcogptを発現させると共に、基質キサンチンおよびヒポキサンチンを与えることによって、克服することができる。
(MVAのIGR 064L−065L(I4L−I5L)挿入部位へのNS1の挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、選択用のEcogpt遺伝子とレポーター遺伝子としてのBFP(青色蛍光タンパク質)を含んでいる挿入ベクターpBN84(図1c)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの添加によるホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で、プラーク精製を7回行うことによって精製した。ミコフェノール酸(MPA)はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、大半の細胞株でプリン合成の遮断およびウイルス複製の阻害をもたらす。この遮断は、構成的プロモーターからEcogptを発現させると共に、基質キサンチンおよびヒポキサンチンを与えることによって、克服することができる。
(NS1を含むrecMVA(MVA−BN22)のインビトロでの試験)
BHK細胞の約80%コンフルエントな単層が形成されているT25フラスコに、1%FCSを含むMEMαで1×107に希釈したウイルスストック100μlを接種し、室温で30分間振とうした。3%FCSを含むMEMα 5mlを各フラスコに加え、CO2培養器中、30℃で培養した。そのフラスコを48時間後に採取した。上清をフラスコから取り出し、4℃にて260gで10分間遠心分離した。上清を小分けして−80℃で保存した。ペレットを5mlの1×PBSで2回洗浄した後、1%TX100を含む低張ホモジナイズ緩衝液(hypotonic douncing buffer)1mlに再懸濁した。細胞溶解物を採取し、16,000gで5分間遠心分離し、上清を微量遠心管に入れて−80℃で保存した。
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なPCR増幅を行うことにより、ORF 136Lと137Lの間の新しい挿入部位(ゲノム位置129940)に隣り合うMVA配列を単離した:Flank1の単離にはoBN543(TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT;SEQ ID NO:3)およびoBN544(TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT;SEQ ID NO:4);Flank2の単離にはoBN578(CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC;SEQ ID NO:5)およびoBN579(CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG;SEQ ID NO:6)。
(相同組換えによる組換えMVAの作製)
ベクターpBNX67(図2b)は、上述のプロトコールを使った組換えMVAの作製に使用することができる。例えば、pBN27(図2c)を使って相同組換えを行うと、隣り合う2つのORFの間にある遺伝子間領域にデングウイルスPrM4を持つ組換えMVAが得られる。
(MVAのIGR136−137挿入部位へのPrM4の挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、選択用のNPT遺伝子とレポーター遺伝子としてのEGFP(強化緑色蛍光タンパク質)を含んでいる挿入ベクターpBN27(図2c)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、G418選択下でプラーク精製を4回行うことによって精製した。
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なPCR増幅を行うことにより、ORF 007Rと008Lの間の新しい挿入部位(ゲノム位置12800)に隣り合うMVA配列を単離した:Flank1の単離にはIGR 07/08 F1up(CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC;SEQ ID NO:11)およびIGR 07/08 F1end(AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT;SEQ ID NO:12);Flank2の単離にはIGR 07/08 F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC;SEQ ID NO:13)およびIGR 07/08 F2end(CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG;SEQ ID NO:14)。
(相同組換えによる組換えMVAの作製)
ベクターpBNX86(図3b)およびpBNX88(図3c)は、それぞれ上述のプロトコールを使った組換えMVAの作製に使用することができる。pBN34(図3d)を使って相同組換えを行うと、隣り合う2つのORF間にある遺伝子間領域にデングウイルスPrM2を持つ組換えMVAが得られる。pBN56(図3e)とMVA−BNゲノムとの組換えは、対応するIGR中にHIV env遺伝子を持つ組換えMVAをもたらす。
(MVAのIGR07−08挿入部位へのPrM2の挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、選択用のgpt遺伝子とレポーター遺伝子としてのBFPを含んでいる挿入ベクターpBN34(図3d)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、実施例1で述べたようにミコフェノール酸による選択下で、プラーク精製を3回行うことによって精製した。
(MVAのIGR07−08挿入部位へのHIV envの挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、選択用のNPT遺伝子とレポーター遺伝子としてのEGFPを含んでいる挿入ベクターpBN56(図3e)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、G418選択下でプラーク精製を6回行うことによって精製した。
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なPCR増幅を行うことにより、ORF 044Lと045Lの間の新しい挿入部位(ゲノム位置37330)に隣り合うMVA配列を単離した:Flank1の単離にはIGR44/45F1up(CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA;SEQ ID NO:18)およびIGR44/45F1end(AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG;SEQ ID NO:19);Flank2の単離にはIGR44/45F2up(CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT;SEQ ID NO:20)およびIGR44/45F2end(CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT;SEQ ID NO:21)。
(MVAのIGR44−45挿入部位へのPrM3の挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、選択用のNPT遺伝子とレポーター遺伝子としてのEGFPを含んでいる挿入ベクターpBN47(図4c)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、G418選択下でプラーク精製を3回行うことによって精製した。
以下のプライマーを使って、興味ある配列の標準的なPCR増幅を行うことにより、ORF 148Rと149Lの間の新しい挿入部位(ゲノム位置137496)に隣り合うMVA配列を単離した:Flank1の単離にはIGR148/149F1up(TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG;SEQ ID NO:25)およびIGR148/149F1end(CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC;SEQ ID NO:26);Flank2の単離にはIGR148/149F2up(CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC;SEQ ID NO:27)およびIGR148/149F2end(TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG;SEQ ID NO:28)。
(MVAのIGR148−149挿入部位へのPrM1の挿入)
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVAに感染させ、さらに、選択用のgpt遺伝子とレポーター遺伝子としてのBFPを含んでいる挿入ベクターpBN54(図5c)でトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸による選択下で、プラーク精製を3回行うことによって精製した。
Claims (51)
- ウイルスゲノムの遺伝子間領域(IGR)に挿入された異種DNA配列を含む組換え変異ワクシニアアンカラウイルス(MVA)。
- ウイルスゲノムの遺伝子間領域(IGR)に挿入された異種DNA配列を含み、IGRが以下のIGR:
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190Rおよび192R−193R、
からなる群から選択される、組換え変異ワクシニアアンカラウイルス(MVA)。 - 異種DNA配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群より選択される隣り合う2つのオープンリーディングフレーム(ORF)間にあるIGRに挿入される、請求項1記載のMVA。
- 異種DNA配列が少なくとも1つのコード配列を含む、請求項1〜3のいずれか1つに記載のMVA。
- 異種DNA配列が、1種以上のポリペプチド、ペプチド、外来抗原または抗原エピトープをコードする、請求項1〜4のいずれか1つに記載のMVA。
- 異種DNA配列が、以下:
デングウイルス、日本脳炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス又は免疫不全ウイルスのうちの1種または2種以上のウイルスに由来する、請求項1〜5のいずれか1つに記載のMVA。 - デングウイルスに由来する異種DNA配列が、NS1およびPrMを含む群から選択される、請求項6記載のMVA。
- NS1遺伝子がORF 064L−065L間のIGRに挿入される、請求項7記載のMVA。
- PrM遺伝子が4つのデングウイルス血清型の1種以上に由来する、請求項7または8記載のMVA。
- PrM遺伝子が、007R−008L、044L−045L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択されるORF間のIGRに挿入される、請求項7〜9のいずれか1つに記載のMVA。
- 免疫不全ウイルスに由来する異種DNA配列がHIV envをコードする、請求項6記載のMVA。
- HIV env遺伝子がORF 007R−008L間のIGRに挿入される、請求項11記載のMVA。
- ECACCに受託番号V00083008として寄託されているMVAである、請求項1〜12のいずれか1つに記載のMVA。
- 医薬品又はワクチンとして使用される請求項1〜13のいずれか1つに記載のMVA。
- ウイルス感染又は増殖性疾患を処置又は予防するための医薬品又はワクチンの製造を目的とする、請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAの使用。
- デングウイルス感染または免疫不全ウイルス感染を処置または予防するための請求項15記載の使用。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAを含むワクチン。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAと、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、アジュバント及び添加剤からなる群から選択される1種または2種以上の成分とを含む、薬学的調合物。
- 宿主細胞を請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えMVAに感染させる工程と、
感染した宿主細胞を適切な条件下で培養する工程と、
ポリペプチド、ペプチド、抗原、エピトープおよびウイルスからなる群から選択される1種または2種以上の成分を単離又は濃縮する工程と、
を含む、
ポリペプチド、ペプチド、抗原、エピトープおよびウイルスからなる群から選択される1種または2種以上の成分をインビトロで製造する方法。 - 細胞を請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAに感染させる、ある細胞にその細胞のゲノムにとって相同又は異種であるDNA配列をインビトロで導入する方法。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAを含む、細胞。
- 以下:
a)MVAウイルスゲノムの隣り合う2つのORF間に位置するIGR配列を含むDNA配列、
b)MVAウイルスゲノムの隣り合う2つのORFのIGR隣接配列を含むDNA配列、および
c)ウイルスゲノムのIGRへの、MVAウイルスのゲノムにとって異種であるDNA配列(「異種配列」)の、相同組換えによる挿入を指示する、前記DNA配列a)またはb)と相同なDNA配列、
からなる群から選択される1種または2種以上のDNA配列と、
前記IGR内に挿入された前記異種配列と、を含む、プラスミドベクター。 - IGRおよびIGR隣接配列が以下:
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190Rおよび192R−193R、
からなる群から選択される、請求項22記載のプラスミドベクター。 - IGR配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択されるORF間のIGRに由来する、請求項22記載のプラスミドベクター。
- IGR由来配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の527〜608番目と、
SEQ ID NO:33の299〜883番目と、
SEQ ID NO:34の339〜852番目と、
SEQ ID NO:35の376〜647番目と、
SEQ ID NO:36の597〜855番目と、
SEQ ID NO:37の400〜607番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項22〜24のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。 - 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択される、請求項22〜25のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
- 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の1〜526番目および609〜1190番目と、
SEQ ID NO:33の101〜298番目および884〜1198番目と、
SEQ ID NO:34の1〜338番目および853〜1200番目と、
SEQ ID NO:35の1〜375番目および648〜1200番目と、
SEQ ID NO:36の1〜596番目および856〜1200番目と、
SEQ ID NO:37の1〜399番目および608〜1081番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項22〜26のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。 - 前記MVAウイルスがECACCに受託番号V00083008として寄託されているMVAである、請求項22〜27のいずれか1つに記載のプラスミドベクター。
- 請求項22〜28のいずれか1つに記載のプラスミドベクターを細胞にトランスフェクトする工程と、
トランスフェクトされた細胞をMVAに感染させる工程と、
請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAを同定し、単離する工程と、
を含む、請求項1〜14のいずれか1つに記載のMVAを製造する方法。 - ECACCに受託番号V00083008として寄託されているMVAに細胞を感染させる、請求項29記載の方法。
- 以下:
a)MVAのゲノムの隣り合う2つのORF間に位置するIGR配列を含むDNA配列、
b)MVAのゲノムの隣り合う2つのORFのIGR隣接配列を含むDNA配列、および
c)ウイルスゲノムのIGRへの、MVAウイルスのゲノムにとって異種であるDNA配列(「異種配列」)の、相同組換えによる挿入を指示する、前記DNA配列a)またはb)と相同なDNA配列、
からなる群から選択される1種または2種以上のDNA配列と、
前記IGR内に挿入された前記異種配列と、を含む、DNA。 - IGRおよびIGR隣接配列が以下:
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190Rおよび192R−193R、からなる群から選択される、請求項31記載のDNA。 - IGR配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択されるORF間のIGRに由来する、請求項31記載のDNA。
- IGR由来配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の527〜608番目と、
SEQ ID NO:33の299〜883番目と、
SEQ ID NO:34の339〜852番目と、
SEQ ID NO:35の376〜647番目と、
SEQ ID NO:36の597〜855番目と、
SEQ ID NO:37の400〜607番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項31〜33のいずれか1つに記載のDNA。 - 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択される、請求項31〜34のいずれか1つに記載のDNA。
- 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の1〜526番目および609〜1190番目と、
SEQ ID NO:33の101〜298番目および884〜1198番目と、
SEQ ID NO:34の1〜338番目および853〜1200番目と、
SEQ ID NO:35の1〜375番目および648〜1200番目と、
SEQ ID NO:36の1〜596番目および856〜1200番目と、
SEQ ID NO:37の1〜399番目および608〜1081番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項31〜35のいずれか1つに記載のDNA。 - 前記MVAウイルスがECACCに受託番号V00083008として寄託されているMVAである、請求項31〜36のいずれか1つに記載のDNA。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えMVAを作製又は製造することを目的とする、
以下:
a)MVAのゲノムの隣り合う2つのORF間に位置するIGR配列を含むDNA配列、
b)MVAのゲノムの隣り合う2つのORFのIGR隣接配列を含むDNA配列、および
c)ウイルスゲノムのIGRへの、MVAウイルスのゲノムにとって異種であるDNA配列(「異種配列」)の、相同組換えによる挿入を指示する、前記DNA配列a)またはb)と相同なDNA配列、
からなる群から選択される1種または2種以上のDNA配列と、
前記IGR配列に挿入された、前記異種配列を挿入するためのクローニング部位と、
を含む、プラスミドベクターの使用。 - IGRおよびIGR隣接配列が以下:
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190Rおよび192R−193R、
からなる群から選択される、請求項38記載の使用。 - IGR配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択されるORF間のIGRに由来する、請求項38記載の使用。
- IGR由来配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の527〜608番目と、
SEQ ID NO:33の299〜883番目と、
SEQ ID NO:34の339〜852番目と、
SEQ ID NO:35の376〜647番目と、
SEQ ID NO:36の597〜855番目と、
SEQ ID NO:37の400〜607番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項38〜40のいずれか1つに記載の使用。 - 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択される、請求項38〜41のいずれか1つに記載の使用。
- 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の1〜526番目および609〜1190番目と、
SEQ ID NO:33の101〜298番目および884〜1198番目と、
SEQ ID NO:34の1〜338番目および853〜1200番目と、
SEQ ID NO:35の1〜375番目および648〜1200番目と、
SEQ ID NO:36の1〜596番目および856〜1200番目と、
SEQ ID NO:37の1〜399番目および608〜1081番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項38〜42のいずれか1つに記載の使用。 - 前記MVAウイルスがECACCに受託番号V00083008として寄託されているMVAである、請求項38〜43のいずれか1つに記載の使用。
- 請求項22〜28のいずれか1つに記載のプラスミドベクター又は請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えMVAを作製又は製造することことを目的とする、
以下:
a)MVAのゲノムの隣り合う2つのORF間に位置するIGR配列を含むDNA配列、b)MVAのゲノムの隣り合う2つのORFのIGR隣接配列を含むDNA配列、およびc)ウイルスゲノムのIGRへの、MVAウイルスのゲノムにとって異種であるDNA配列(「異種配列」)の、相同組換えによる挿入を指示する、前記DNA配列a)またはb)と相同なDNA配列、
からなる群から選択される1種または2種以上のDNA配列を含む、DNAの使用。 - IGRおよびIGR隣接配列が以下:
001L−002L、002L−003L、005R−006R、006L−007R、007R−008L、008L−009L、017L−018L、018L−019L、019L−020L、020L−021L、023L−024L、024L−025L、025L−026L、028R−029L、030L−031L、031L−032L、032L−033L、035L−036L、036L−037L、037L−038L、039L−040L、043L−044L、044L−045L、046L−047R、049L−050L、050L−051L、051L−052R、052R−053R、053R−054R、054R−055R、055R−056L、061L−062L、064L−065L、065L−066L、066L−067L、077L−078R、078R−079R、080R−081R、081R−082L、082L−083R、085R−086R、086R−087R、088R−089L、089L−090R、092R−093L、094L−095R、096R−097R、097R−098R、101R−102R、103R−104R、105L−106R、107R−108L、108L−109L、109L−110L、110L−111L、113L−114L、114L−115L、115L−116R、117L−118L、118L−119R、122R−123L、123L−124L、124L−125L、125L−126L、133R−134R、134R−135R、136L−137L、137L−138L、141L−142R、143L−144R、144R−145R、145R−146R、146R−147R、147R−148R、148R−149L、152R−153L、153L−154R、154R−155R、156R−157L、157L−158R、159R−160L、160L−161R、162R−163R、163R−164R、164R−165R、165R−166R、166R−167R、167R−168R、170R−171R、173R−174R、175R−176R、176R−177R、178R−179R、179R−180R、180R−181R、183R−184R、184R−185L、185L−186R、186R−187R、187R−188R、188R−189R、189R−190Rおよび192R−193R、
からなる群から選択される、請求項45記載の使用。 - IGR配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択されるORF間のIGRに由来する、請求項45記載の使用。
- IGR由来配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の527〜608番目と、
SEQ ID NO:33の299〜883番目と、
SEQ ID NO:34の339〜852番目と、
SEQ ID NO:35の376〜647番目と、
SEQ ID NO:36の597〜855番目と、
SEQ ID NO:37の400〜607番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項45〜47のいずれか1つに記載の使用。 - 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、007R−008L、018L−019L、044L−045L、064L−065L、136L−137L、148R−149Lを含む群から選択される、請求項45〜48のいずれか1つに記載の使用。
- 隣り合う2つのORFのIGR隣接配列が、ヌクレオチド配列
SEQ ID NO:32の1〜526番目および609〜1190番目と、
SEQ ID NO:33の101〜298番目および884〜1198番目と、
SEQ ID NO:34の1〜338番目および853〜1200番目と、
SEQ ID NO:35の1〜375番目および648〜1200番目と、
SEQ ID NO:36の1〜596番目および856〜1200番目と、
SEQ ID NO:37の1〜399番目および608〜1081番目と、
を含む群から選択される配列を含む、請求項45〜49のいずれか1つに記載の使用。 - 前記MVAウイルスがECACCに受託番号V00083008として寄託されているMVAである、請求項45〜50のいずれか1つに記載の使用。
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