JP2011004755A - ポックスウイルスゲノムに挿入された相同遺伝子を発現させる組換えポックスウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ある微生物の異なる変異体に由来し50%以上の相同性を有する2つ以上の相同な外来配列を発現させる能力を有する組換えポックスウイルスに関する。さらに本発明は、そのような組換えポックスウイルスを作製する方法、およびそのような組換えポックスウイルスの医薬またはワクチンとしての使用に関する。また、ヒトを含む生きている動物において、免疫応答に影響を及ぼす方法、好ましくは免疫応答を誘発する方法も提供する。
【選択図】なし
Description
図1:図1は、実施例1に記載のMVAゲノム中の4つのPrM(=前駆膜)遺伝子(血清型1〜4)の挿入部位を表す概略図である。
図2〜9及び図12〜17:図2〜9および図12〜17は、挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す図であり、ベクター名、そのサイズ、および以下に示すような興味ある配列の位置が記載されている:AmpR=アンピシリン耐性遺伝子、bfp=青色蛍光タンパク質遺伝子、dA=欠失部位A、dE=欠失部位E、d2=欠失部位2、Ecogpt=大腸菌グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、EGFP=強化緑色蛍光タンパク質遺伝子、F1=隣接配列1、F2=隣接配列2、I4L=遺伝子間領域I4L、IGR=遺伝子間領域、NPT II=ネオマイシン耐性遺伝子、P=ポックスウイルスプロモーター、pr7.5=ワクシニアプロモーター7.5、PrM=デングウイルスの前駆膜遺伝子、数字はそれが4つの血清型のうちのどれに由来するかを示している、rpt=隣接配列の反復である。
欠失部位A用の挿入ベクター
ゲノム位置7608〜7609に相当するMVAゲノムのいわゆる欠失部位Aまたは欠失部位1に外因性配列を挿入するために、欠失部位Aに隣り合う約600bpの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。MVA−BNゲノムDNAからこの隣接配列を単離するために、適当なコンピュータソフトウェア(DNAsis、日立ソフトウェアエンジニアリング、米国サンブルーノ)を使って適切なPCRプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるNPT II遺伝子(ネオマイシン耐性)などの選択遺伝子カセットを導入する。また、欠失部位Aに挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図2に示す(pBNX10)。
ゲノム位置170480〜170481に相当するMVAゲノムのいわゆる欠失部位Eまたは欠失部位4に外因性配列を挿入するために、欠失部位Eに隣り合う約600bpの隣接配列を含むベクターを構築した。このベクターは上述したように設計し、構築される。隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるEGFP遺伝子(緑色蛍光タンパク質、Clonetech)を配置する。また、欠失部位Aに挿入しようとする追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図3に示す(pBNX32)。
ゲノム位置20718〜20719に相当するMVAゲノムのいわゆる欠失部位2に外因性配列を挿入するために、欠失部位2に隣り合う約600bpの隣接配列を含むベクターを構築した。このベクターは上述したように設計し、構築される。隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるhbfp遺伝子(humanized blue fluorescing protein:ヒト化青色蛍光タンパク質、Pavalkis GNら)を配置する。また、欠失部位2に挿入しようとする追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図4に示す(pBNX36)。
ゲノム位置56760に相当するORF I3LとI4Lの間の遺伝子間領域に外因性配列を挿入するために、I4L遺伝子座の遺伝子間領域に隣り合う約600bpの隣接配列を含むベクターを構築した。このベクターは上述したように設計し、構築される。隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるEcogpt遺伝子(またはgpt、これは大腸菌から単離されるホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する)を配置する。また、I4L ORF後の遺伝子間領域に挿入しようとする追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図5に示す(pBNX39)。
挿入ベクター
デングウイルスの4つの血清型に由来する4つのPrM遺伝子をMVAゲノムに挿入するために、4つの独立した組換えベクターを使用した。
クローニング戦略を検証するために、PCRアッセイを行った。これらのPCRアッセイの場合、選択したプライマー対は、挿入部位に関して特異的な隣接配列に特異的に結合するプライマーと、高度に相同なデングウイルスPrM遺伝子の1つに特異的に結合する第2プライマーとの組合せである。
1)変性:4分 94℃
2)30サイクル:
変性:30秒 94℃
アニーリング:30秒 55℃
伸長:1〜3分 72℃
3)伸長:7分 72℃
4)保存 4℃。
組換えMVAによって外来遺伝子を発現させるには、これらの遺伝子を、相同組換えと呼ばれる過程によって、ウイルスゲノム中に挿入する必要がある。そのために、興味ある外来遺伝子を、上述のように、挿入ベクター中にクローニングしておいた。細胞をMVA−BNに感染させた後に、このベクターをトランスフェクトする必要がある。感染とトランスフェクションとを受けた細胞の細胞質では、組換えが起こるだろう。やはり挿入ベクターに含まれている選択及び(又は)レポーターカセットを利用して、組換えウイルスを含む細胞を同定し、単離する。
相同組換えを行うために、DMEM(ダルベッコ変法イーグル培地,Gibco BRL)+10%ウシ胎仔血清(FCS)またはVP−SFM(Gibco BRL)+4mmol/l L−グルタミン(無血清製造法の場合)を使って、BHK(ベビーハムスター腎)細胞またはCEF(初代ニワトリ胚線維芽細胞)を6穴プレートに播種する。
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVA−BNに感染させ、さらに、デングウイルス血清型4のPrM遺伝子と、レポーター遺伝子としてEGPF遺伝子とを含んでいる挿入ベクターpBN40をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子EGFPを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも3日目には検出することができる。得られた組換えウイルスはプラーク精製によって精製する必要がある。
上記のプロトコールに従って細胞をMVA−PrM4に感染させ、さらに、デングウイルス血清型2のPrM遺伝子と、選択遺伝子としてNPT II(ネオマイシン耐性遺伝子)とを含んでいる挿入ベクターpBN39をトランスフェクトした。抗生物質耐性遺伝子を発現させる組換えMVAを精製するには、プラーク精製前に選択条件下でウイルス増幅を3回行うことが推奨される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択を行うために、G418を培地に加える。G418はネオマイシンの誘導体であり、リボソームの作用を妨害することにより、タンパク質生合成を阻害する。NPT遺伝子活性はG418をリン酸化によって失活させる。
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVA−BNに感染させ、さらに、デングウイルス血清型1のPrM遺伝子と、レポーター遺伝子としてhbfp(ヒト化青色蛍光タンパク質の遺伝子)とを含んでいる挿入ベクターpBN49をトランスフェクトした。合成されたhbfpタンパク質は、3日目に、組換えウイルスに感染した細胞中に検出することができる。得られた組換えウイルスをプラーク精製によって精製した。10回のプラーク精製後に、予想される挿入物を選択的に増幅するプライマー対(上述のoBN194およびoBN476)と、対照として挿入部位である欠失部位2を特異的に認識するプライマー対(oBN54:CGGGGTACCCGACGAACAAGGAACTGTAGCAGAGGCATC,SEQ ID NO:12およびoBN56:AACTGCAGTTGTTCGTATGTCATAAATTCTTTAATTAT,SEQ ID NO:13)とを使って、PCRアッセイにより、組換えウイルスMVA−PrM1を同定した。
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVA−BNに感染させ、さらに、デングウイルス血清型3のPrM遺伝子と、レポーター遺伝子としてEcogpt遺伝子(Ecogpt、略してgptは、ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する)とを含んでいる挿入ベクターpBN50をトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの添加により、ホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で、プラーク精製を3回行うことによって精製した。ミコフェノール酸(MPA)はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、大半の細胞株でプリン合成の遮断およびウイルス複製の阻害をもたらす。この遮断は、構成的プロモーターからEcogptを発現させると共に、基質キサンチンおよびヒポキサンチンを与えることによって、克服することができる。
上記のプロトコールに従って、細胞を、等量のMVA−PrM1とMVA−PrM3に感染させた。青色蛍光クローンをホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で3回プラーク精製した後、上記のプライマー対(上記のoBN255およびoBN479、oBN499およびoBN500、oBN194およびoBN476、oBN54およびoBN56)を使ったPCRによって、組換えウイルスを分析した。得られた組換えウイルスをMVA−PrM1/PrM3と名付けた。
上記のプロトコールに従って、細胞を、等量のMVA−PrM1/PrM3とMVA−PrM2/PrM4に感染させた。ホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択およびネオマイシン選択下で、プラーク精製を行った。緑色および青色の蛍光を惹起する組換えウイルスを単離し、上記プライマー対(上記のoBN255およびoBN479、oBN499およびoBN500、oBN194およびoBN476、oBN54およびoBN56、oBN93およびoBN477、oBN477およびoBN452、oBN210およびoBN478、oBN453およびoBN454))を使ったPCRによって分析した。
遺伝子間領域136−137(IGR 136−137)用の組換えベクター
MVAゲノムのゲノム位置129,940に相当するいわゆる遺伝子間領域(IGR)136−137に外因性配列を挿入するために、この挿入部位に隣り合う約600bpの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。MVA−BNゲノムDNAからこの隣接配列を単離するために、適切なPCRプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーター(P)の転写制御を受けるNPT II遺伝子(ネオマイシン耐性)などの選択遺伝子カセットを導入する。また、IGR 136−137に挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位(PacI)も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図12に示す(pBNX67)。
MVAゲノムのゲノム位置12,800に相当する遺伝子間領域(IGR)07−08に外因性配列を挿入するために、この挿入部位に隣り合う約600bpの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。MVA−BNゲノムDNAからこの隣接配列を単離するために、適切なPCRプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーター(P)の転写制御を受けるEcogpt遺伝子(グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)などの選択遺伝子カセットを導入する。また、IGR 07−08に挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位(PacI)も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図13に示す(pBNX88)。
MVAゲノムのゲノム位置37,330に相当する遺伝子間領域(IGR)44−45に外因性配列を挿入するために、この挿入部位に隣り合う約600bpの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。MVA−BNゲノムDNAからこの隣接配列を単離するために、適切なPCRプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーター(P)の転写制御を受けるNPT II遺伝子(ネオマイシン耐性)などの選択遺伝子カセットを導入する。また、IGR 44−45に挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位(PacI)も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図14に示す(pBNX87)。
挿入ベクター
デングウイルスの血清型2、3および4に由来する3つのPrM遺伝子をMVAゲノムに挿入するために、3つの独立した組換えベクターを使用した。
相同組換えによる組換えMVAの作製を、実施例1で説明したように行った。MVAゲノムにおけるPrM4、PrM3およびPrM2の挿入部位を、図18に示す。
1回目は、上述のプロトコールに従って細胞をMVA−BNに感染させ、さらに、デングウイルス血清型4のPrM遺伝子と、レポーター遺伝子としてEGFP遺伝子とを含んでいる挿入ベクターpBN27をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子EGFPを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも3日目には検出することができる。得られた組換えウイルスは実施例1で説明したようにプラーク精製によって精製する必要がある。4回のプラーク精製後に、挿入部位IGR136−137を選択的に増幅するプライマー対(oBN1008:gataccgatcacgttcta,SEQ ID NO:16およびoBN1009:ggatatgattatgtagag,SEQ ID NO:17)を使って、PCRアッセイにより、組換えウイルスMVA−PrM4を同定した。
上記のプロトコールに従って細胞をMVA−PrM4に感染させ、さらに、デングウイルス血清型2のPrM遺伝子と、レポーター遺伝子としてBFP遺伝子とを含んでいる挿入ベクターpBN34をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子BFPを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも3日目には検出することができる。得られた組換えウイルスは実施例1で説明したようにプラーク精製によって精製する必要がある。6回のプラーク精製後に、組換えウイルスMVA−PrM4+PrM2をさらに継代し、増幅させて、粗製ストックを調製した。挿入部位IGR07−08を選択的に増幅するプライマー対(oBN 903:ctggataaatacgaggacgtg,SEQ ID NO:18およびoBN904:gacaattatccgacgcaccg,SEQ ID NO:19)を使って、PCRアッセイにより、組換え体を同定した。
Claims (27)
- 少なくとも2つの相同な外来遺伝子を含み、当該遺伝子のそれぞれがウイルスゲノムの異なる挿入部位に挿入されている、組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子が少なくとも50%の相同性を有する、請求項1記載の組換えポックスウイルス。
- 少なくとも2つの相同な外来遺伝子を含み、それらの遺伝子が少なくとも60%の相同性を有する、組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子が65〜75%の相同性を有する、請求項2又は3記載の組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子がフラビウイルスに由来する、請求項1〜4のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 上記フラビウイルスがデングウイルスである、請求項5記載の組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子が、上記ウイルスの少なくとも2種類の異なる血清型に由来する少なくとも2つの相同な遺伝子である、請求項5又は6記載の組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子が少なくとも2つのPrM遺伝子である、請求項5〜7のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子が4つのPrM遺伝子である、請求項5〜8のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 上記ポックスウイルスがワクシニアウイルスである、請求項1〜9のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 上記ワクシニアウイルスが変異ワクシニアアンカラ(Modified Vaccinia Ankara)(MVA)ウイルスである、請求項10記載の組換えポックスウイルス。
- 上記MVAが、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ(European Collection of Animal Cell Cultures)(ECACC)に番号V00083008として寄託されているMVA−BNである、請求項11記載の組換えポックスウイルス。
- 上記ポックスウイルスが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞中で、複製欠損性または複製不能である、請求項1〜12のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 当該遺伝子が、ポックスウイルスゲノムの天然の欠失部位及び/又は遺伝子間領域に挿入されている、請求項1〜13のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 医薬またはワクチンとしての請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを含むワクチン。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスと、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、アジュバント及び/又は添加剤とを含む医薬組成物。
- ヒトを含む生きている動物の免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘発するための、請求項1から14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス、請求項16に記載のワクチン、または請求項17記載の調合物。
- 医薬を製造するために、請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを使用する方法。
- ヒトを含む生きている動物において、免疫応答に影響を与える、好ましくは免疫応答を誘発する方法であって、請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルス、請求項16記載のワクチン、または請求項17記載の調合物の治療上有効な量を、処置すべき動物またはヒトに投与することを含む、上記方法。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを含む細胞。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスを製造する方法であって、
-細胞にポックスウイルスを感染させる工程、
-ポックスウイルスゲノムに対して異種遺伝子及びポックスウイルスゲノム配列(これはポックスウイルスゲノムの挿入部位への前記異種遺伝子の組込みを指示する能力を有する)を含む第1ベクターコンストラクトを、上記感染細胞にトランスフェクトする工程、
-産生した組換えポックスウイルスを同定し、単離し、場合により精製する工程、
-先の工程で得られた組換えポックスウイルスを細胞の感染に使用すると共に、ポックスウイルスゲノムに対して異種でありかつ第1ベクターコンストラクトの遺伝子に対して相同であるもう一つの遺伝子を含む追加のベクターコンストラクトを使用することによって、上記の工程を繰り返す工程、
を含む、上記方法。 - -各コンストラクトがポックスウイルス発現制御要素の転写制御を受ける遺伝子を含む2つ以上のベクターコンストラクトであって、異なるベクターに含まれる遺伝子が相同な遺伝子であり、しかも各遺伝子には、ポックスウイルスゲノムへの当該遺伝子の組込みを指示する能力を有するポックスウイルスDNA配列が隣接している、上記ベクターコンストラクト、および
-前記相同遺伝子がゲノムに組み込まれている組換えポックスウイルスを同定するか、及び/又は選択するための手段、
を含むキット。 - 各相同遺伝子には、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位への各ベクターコンストラクトの前記相同遺伝子の組込みを指示する能力を有するポックスウイルスDNA配列が隣接している、請求項23記載のキット。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスの組換えポックスウイルスゲノムに由来するかまたは同組換えポックスウイルスゲノムに相同なDNA配列であって、少なくとも2つの相同な遺伝子と、ポックスウイルスゲノムの配列の少なくとも一部とを含むDNA配列。
- 請求項1〜14のいずれか1つに記載の組換えポックスウイルスに感染した細胞を検出する方法であって、請求項25記載のDNA配列を前記細胞に投与することを含む、上記方法。
- 請求項1〜14記載の組換えポックスウイルスを同定する方法であって、請求項25記載のDNA配列を前記ウイルスに投与することを含む、上記方法。
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