MXPA04010713A - Regiones intergeneticas, como sitios de introduccion en el genoma del virus de la vacuna de ankara modificada (mva). - Google Patents

Regiones intergeneticas, como sitios de introduccion en el genoma del virus de la vacuna de ankara modificada (mva).

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MXPA04010713A
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Abstract

La presente invencion se refiere a la introduccion novedosa en sitios utiles, para la integracion de secuencias exogenas en el genoma del virus de la Vacuna de Ankara Modificada (MVA). la presente invencion ofrece nuevos vectores plasmidos para introducir ADN exogeno en el genoma de la MVA. Ademas, la presente invencion proporciona un MVA recombinante que incluye una secuencia introducida de ADN exogeno en el nuevo sitio de insercion, para emplearse como medicina o vacuna.

Description

REGIONES INTERGÉNICAS COMO SITIOS DE INTRODUCCIÓN EN EL GENOMA DEL VIRUS DE LA VACUNA DE ANKARA MODIFICADA (MVA) La presente invención se refiere a nuevos sitios de introducción útiles para la integración de secuencias exócenas de ADN en el genoma del MVA.
Entorno de la invención. El Virus de la vacuna de Ankara modificada (MVA) es un miembro de la familia Ortopoxvirus , y fue generado por cerca de 570 pasos seriales en fibroblastos de embrión de pollo de la cepa Ankara del Virus de vacuna (CVA) (para revisión, ver Mayr, A., et al.
[1975], Infection 3, 6-14). Como una consecuencia de estos pasos, el virus MVA ' resultante contiene 31 kilobases menos de información genética comparado con el CVA, y está altamente restringido para alojar células (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038
[1991]). El MVA se caracteriza por su atenuación extrema, a saber, por una virulencia o capacidad de infeccionar disminuida, pero aún con una excelente capacidad de inmunización. Cuando se probó en una variedad de modelos animales, el MVA probó ser avirulento aún en los individuos inmunosuprimidos . Más importante, las excelentes propiedades de la cepa MVA . se han demostrado en ensayos clínicos extensivos (Mayr et al., Zbl . Bakt . Hyg. I, ¾bt .
Org. B 167, 375-390
[1987]). Durante estos estudios en más de 120,000 humanos, incluyendo pacientes de alto riesgo, no se vieron efectos colaterales (Stickl et al., Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392
[1974]).
Además se ha encontrado que el MVA se bloquea en la última etapa del cicló de replicación del virus en las células de mamíferos (Sutter, G. y Moss, B.
[1992] Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89, 10847-10851). De acuerdo con ello, el MVA replica por completo se ADN, sintetiza más pronto, intermedia y retrasa los productos de gene, pero no es capaz de ensamblar viriones infecciosos maduros, que podrían ser liberados de una célula infectada. Por esta razón, es decir, por ser restringido a la replicación, el -'MVA se propuso como un vector de expresión genética.
Más recientemente, el MVA se usó para generar vacunas recombinantes , expresando las secuencias antigénicas insertas ya sea en el sitio del gen de la timidina-quinasa (tk) (Patente US 5,185,146) o en el sitio de una eliminación ocurrida en forma natural dentro del genoma del MVA ( PCT/EP/96/02926 ) .
Aunque el locus de introducción de , la tk es ampliamente usada para la generación de virus de viruela recombinantes, particularmente para la generación de virus de vacuna recombinantes (Mackett, et al.
[1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419), esta tecnología no fue aplicable para el MVA. Scheiflinger et al. demostró que el MVA es mucho más sensitivo a las modificaciones del genoma comparado con otros virus de viruela, que pueden ser usados para la generación de virus de vi'ruela recombinantes. Scheiflinger et al. demostró, en particular, que uno de los sitios más comúnmente usados para la integración de ADN heterólogo dentro de genomas de virus de viruela, a saber, el locus del gen de la timidina quinasa (tk) , no puede usarse para generar MVA recombinante . Cualquier MVA recombinante que resulte tk(-) probó ser altamente inestable, y en la purificación borró de inmediato el ADN insertado con partes ' del ADN genómico del MVA (Scheiflinger et al.
[1996], Arch Virol 141: pp 663-669).
La inestabilidad y, por lo tanto, la alta probabilidad de la recombinación genómica, es un problema conocido dentro de la virología de la viruela. De hecho, el MVA se estableció durante pasos de larga duración, explotando el hecho de que el genoma viral del CVA es inestable cuando se propaga in vitro, en células de tejido cultivadas. Varios miles de nucleótidos (31 kb) se han borrado del genoma del MVA, que por lo tanto se caracteriza por 6 eliminaciones mayores y numerosas pequeñas, en comparación con el genoma original del CVA.
La organización genómica del genoma del MVA ha sido recientemente descrita (Antoine et al.
[1998], Virology 244, 365-396) . El genoma de 178 kb del MVA está empacado densamente y comprende 193 marcos de lectura abiertos individuales (ORF's), que codifican para las proteínas de al menos 63 aminoácidos de longitud. En comparación con el virus Varióla altamente infeccioso, y también con el prototipo del virus de vacuna, a saber, la cepa Copenhage, la mayoría de. los ORF's del MVA están fragmentados o truncados (Antoine et al.
[1998], Virology 244, 365-396) . Sin embargo, con muy pocas excepciones todos ''los ORF's, incluyendo los ORF's fragmentados y truncados, son transcritos y trasladados a proteínas. En lo que sigue, se usa la nomenclatura de Antoine et al. y -donde resulta apropiado- también se indica la nomenclatura basada en la restricción HInd III de- ordenamiento de enzimas.
Hasta ahora, sólo la introducción del ADN exógeno en los sitios de eliminación de ocurrencia natural del genoma del MVA condujo a MVa' s recombinantes estables (PCT/EP96/02926) . Desafortunadamente, sólo hay un número restringido de sitios de eliminación de ocurrencia natural en el genoma del MVA. Adicionalmente , se mostró que otros sitios de introducción, tales como, p. ej . , el locus del gen tk, son sumamente útiles para la generación de MVA recombinante ( Scheiflinger et al.
[1996], Arch Virol 141: pp 663-669).
Objetivo de la invención. Un objetivo de la invención es el identificar más sitios de introducción del genoma del MVA, y proporcionar vectores de introducción, que dirijan la introducción de las secuencias del ADN exógeno dentro de esos nuevos sitios de introducción del genoma del MVA que se identifiquen.
Otro objetivo de la presente invención es el ' proporcionar un MVA recombinante, que comprenda las secuencias de ADN exógeno integradas de manera estable dentro de nuevos sitios de introducción del genoma del MVA.
Descripción detallada de la invención. Los inventores de la presente invención identificaron nuevos sitios para la introducción de las secuencias de ADN exógeno dentro del genoma del virus de la vacuna de ankara modificada (MVA) . Los nuevos sitios de introducción están localizados en las regiones intergénicas (IGR's, siglas en inglés} del genoma viral, donde estas IGR' s están, a su vez, localizados entre, o flaqueados por, dos marcos de lectura abiertos adyacentes (ORF' s, siqlas en inglés) del genoma del MVA.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención se refiere a un MVA recombinante que comprende una secuencia heteróloga del ' adn, insertada dentro de un IGR del genoma viral. De acuerdo con la presente invención, pueden insertarse una o más secuencias de ADN exógeno dentro de una o más IGR's.
Sorpresivamente, se encontró que las secuencias de ADN exógeno permanecen de hecho estables insertadas en las IGR's del genoma del MVA: como ya se indicó arriba, el J genoma del MVA se considera como bastante inestable. Parece que los genes o las secuencias de ADN no esenciales para la propagación del virus, se eliminan o se fragmentan. Aunque, también en forma sorprendente, se encontró que los MVA' s recombinantes estables se obtenían cuando las secuencias de ADN heterólogo se insertaban en ios sitios de eliminación de ocurrencia natural del genoma del MVA, por otra parte se encontró que los genes con rango de huésped como, p. ej . , el locus tk ampliamente usada para la generación de otros virus de viruela recombinantes, no eran ¦ sitios de introducción adecuados en el MVA. El hecho de que el Vero-MVA tiene una eliminación genómica extra (PCT/EP01/02703) , también sugiere que el genoma es dinámico en el sentido de que elimina fácilmente los genes que no son requeridos para la propagación. Por lo tanto podría concluirse que, al insertar en los espacios entre los ORF' s secuencias de ADN heterólogo no esenciales para la propagación viral, también fueran eliminadas por el virus.
Mientras que la secuencia nucleótida de un ORF codifica una secuencia de aminoácido que forma un péptido, un polipéptido o una proteína, las IGR' s entre dos ORF' s no tienen capacidad de codificación, pero pueden comprender elementos reguladores, sitios de aglutinamiento, secuencias promotoras y/o de incremento esenciales para, o involucradas con, el control de transcripción de la expresión del gen viral. Por lo tanto, la IGR puede estar involucrada en el control regulatorio del ciclo de vida viral. Sin embargo, los inventores de la presente invención también han mostrado que los nuevos sitios de introducción tienen la ventaja inesperada de que las secuencias de ADN exógeno pueden ser insertadas de manera estable dentro del genoma del MVA, sin influenciar ni cambiar las características típicas ni la expresión del gen del MVA. Los nuevos sitios de introducción son especialmente útiles, dado que no se altera ningún ORF ni secuencia de codificación del MVA.
Además, se encontró con sorpresa que el nivel de expresión de un gen extraño insertado dentro de una IGR es mayor que el nivel de expresión de un gen extraño insertado dentro de un sitio de eliminación del genorna del MVA (ver también el Ejemplo 1).
La secuencia nucleótida de un ORF inicia regularmente con un codón y termina con un codón de alto. Dependiendo de la orientación de los dos ORF' s adyacentes, la IGR, la región en medio de estos ORF's, está flanqueada ya sea por los dos codones de alto de los dos ORF' s adyacentes, o por los dos codones de inicio de los dos J* ORF' s adyacentes, o por el codón de alto del primer ORF y el codón de inicio del segundo ORF, o por el codón de inicio del primer ORF y el codón de alto del segundo ORF.
De acuerdo con ello, el - sitio de introducción para la secuencia del ADN exógeno dentro de la IGR puede estar corriente abajo o a.3' del codón de alto de un primer ORF. En el caso de que el ORF adyacente, también llamado segundo ORF, tenga la misma orientación que el primer ORF, este sitio de introducción corriente abajo del codón de alto del primer ORF cae corriente arriba, o a 5' del codón de inicio del segundo ORF.
En el caso de que el segundo ORF tenga una orientación relativa al primer ORF, lo que significa que la orientación de los dos ORF' s adyacentes apunta de uno al otro, entonces el sitio de introducción cae corriente abajo de los codones de alto de' ambos ORF's.
Como una tercera alternativa, en el caso de que dos ORF's adyacentes lean en dirección opuesta, pero que la orientación de los dos ORF's adyacentes apunte lejos uno del otro, que es sinónimo de un posicionamiento que se caracteriza en que los codones de inicio de los dos ORF' s son adyacentes uno con el otro, entonces el ADN exógeno se ' inserta corriente arriba en relación con ambos codones de inicio.
Los ORF's en el genoma del MVA ocurren en dos direcciones de codificación. Consecuentemente, la actividad de la polimerasa ocurre de izquierda a derecha, p. ej . , en dirección hacia adelante y, en forma correspondiente, de derecha a izquierda (dirección opuesta). Es práctica común en la virología de la viruela, y se convirtió en una clasificación estándar para los virus de vacunas, el identificar a los ORF's por su orientación y su posición en los diferentes fragmentos de ordenamiento de restricción HindIII del genoma . Para la nomenclatura, los diferentes fragmentos HindIII se nombran a través de letras mayúsculas descendentes que corresponden con su tamaño descendente. Los ORF se numeran de izquierda a derecha en cada fragmento HindIII, y la orientación del ORF se indica con una letra L mayúscula (que significa la transcripción de derecha a izquierda ("Left", en inglés), o R (que significa la transcripción de izquierda a derecha ("Right", en inglés). Adicionalmente, hay una publicación más reciente de la estructura del genoma del MVA que usa una nomenclatura diferente, simplemente numerando los ORF del extremo izquierdo hacia el derecho del genoma, y que indica su orientación con una letra L o R mayúscula (Antoine et al. ·'
[1998], Virology 244, 365-369). Como un ejemplo, el ORF 14L de acuerdo con la antigua nomenclatura, corresponde al ORF 064L de acuerdo con Antoine et al. Si no se indica de forma diferente, la presente invención usa la nomenclatura de acuerdo con Antoine et al.
De acuerdo con la presente invención, las secuencias de ADN heterólogo pueden insertarse en una o más IGR' s en medio de dos ORF' s adyacentes seleccionados entre el grupo que comprende: 001L-002L, 002L-003L, 005R-006R 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L 019L-020L, 020L-021L, 023L-024L, C¿4L-025L, 025L-026L 02SR-029L, 030L-031L, O31L-032L, 032L-033L, 035L-036L 036L-037L, 037L-038L,, 039D-040L, 043L-044L, 044L-045L 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R 053R-054R, 054R-055R, O55R-056L, 061L-062L, 064L-065L 065L-066L, 066L-067L, O77L-078R, 078R-079R,' 080R-081R 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L 109L-110L, llOL-lllL, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L. 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L. 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, .154R-155R. 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-1S1R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R. 186R-187R, 187R-1S8R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R De acuerdo con la antigua nomenclatura, el ORF 006L corresponde al C6L, el 020L al N1L, el 021L al N2L , el 023L al K2L, el 028R al KTR, el 029L al F1L, el 037L al F8L, el 045L al F15L, el 050L al E3L, el 052R al E5R, el 054R al E7R, el 055R al E8R, el 056L al E9L, el 062L al I1L, el 064L al I4L, el 065L al I5L, el 081R al L2R, el 082L al L3L, el 086 R al J2R, el 088R al J4R, el 089L al J5L, el 029R al H2R, el 095R al H5R, el 107R al DIOR, el 108L al D11L, el 122R al A11R, el 123L al A12L, el 125L al A14L, el 126L al A15L, el 135R al A24R, el 136L al A25L, el 137L al A26L, el 141L al A30L, el 148 R al A37R, el 149L al A38L, el 152R al A40R, el'l53L al A41L, el 154R al A42R, el 157L al A44L, el 159R al A46R, el 160L al A47L, el 165R al A56R, el 166R al A57R, el 167R al B1R, el 170R al B3R, el 176 R al B8R, el 180R al B12R, el 184R al B16R, el 185L al B17L, y el 187R al B19R.
Preferiblemente, la secuencia heteróloga se inserta dentro de un IGR flanqueado por dos ORF' s -'adyacentes seleccionados entre el grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Las secuencias de ADN heterólogo o exógeno son secuencias que, en la naturaleza, no se encuentran normalmente asociadas con los virus de viruela como se usan de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con otra representación de la presente invención, la secuencia de ADN exógeno comprende al menos una secuencia de codificación. La secuencia de codificación esté enlazada operativamente con un elemento de control de transcripción, preferiblemente con un elemento de control de transcripción viral de viruela. Adicionalmente , también las combinaciones entre el elemento de control de transcripción viral de la viruela y, p. e . , también pueden usarse los sitios de entrada ribosomal interna.
De acuerdo con otra representación, la secuencia del ADN exógeno también puede comprender dos o más secuencias de codificación enlazadas con uno o varios elementos de control de transcripción. Preferiblemente, la secuencia de codificación codifica uno o más proteínas, polipéptidos , péptidos, antigenos extraños o epítopes antigénicos, especialmente aquellos de genes ' terapéuticamente interesantes .
Los genes terapéuticamente interesantes de acuerdo con la presente invención, pueden ser genes derivados de, u homólogos de, genes de microorganismos patógenos o infecciosos que provocan enfermedades. De acuerdo con ello, en el contexto de la presente invención esos genes terapéuticamente interesantes se presentan al sistema inmune de un organismo para afectar, -preferiblemente para inducir, una respuesta inmune específica y, por lo tanto, vacunar o proteger profilácticamente ai organismo contra una infección con el microorganismo. En las representaciones más preferibles de la presente invención, los genes terapéuticamente interesantes se seleccionan entre los genes de virus infecciosos, p. e . , -pero sin limitarse a ellos- el virus del dengue, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la hepatitis B o C, o virus de inmunodeficiencia como el VIH.
Los genes derivados del virus del dengue son preferiblemente genes NS1 y PrM, donde estos genes pueden ser derivados de uno, dos, tres, o todos los 4 serotipos de virus del dengue. El gen NS1 se deriva preferiblemente del serotipo 2 del virus del dengue, y se inserta 'preferiblemente dentro de la IGR entre los ORF' s 064L-065L (I4L-I5L). Los genes PrM, derivados preferiblemente de todos los 4 serotipos de virus del dengue, se insertan preferiblemente dentro de las IGR' s entre los ORF' s seleccionados entre los 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L. Más preferiblemente, el gen PrM derivado del serotipo 1 del virus del dengue ( PrM 1), se inserta dentro de la IGR de los 148R-149L, el Pr 2 en la IGR de 007R-008L, el PrM 3 en la IGR de los ORF' s 044L-045L, y el PrM 4 en la IGR de los 136L-137L.
De acuerdo con otra representación preferible de la presente invención, la secuencia del ADN heterólogo se deriva del VIH y codifica el VIH env, donde el gen VIH env se inserta preferiblemente dentro de la IGR entre los ORF' s 007R-008L.
Además, los genes terapéuticamente interesantes de acuerdo con la presente invención también comprenden los genes relacionados con la enfermedad, que tienen un efecto terapéutico en las enfermedades de desorden proliferativo, cáncer o metabólicas. Por ejemplo, un gen terapéuticamente interesante relativo al cáncer podría ser un antígeno del cáncer que tenga la capacidad de inducir una reacción inmune anticáncer especifica.
De acuerdo con una representación adicional de la presente invención, la secuencia de codificación comprende al menos un gen marcador o de selección.
Los genes de selección trasaucen una resistencia particular a una célula, por lo que se hace posible un cierto método de selección. El practicante experimentado está familiarizado con una variedad de genes de selección, que pueden ser usados en un sistema viral de la viruela. Entre estos estén, p. ej . , el gen de resistencia a la neomicina ( TP) o el gen de la fosforibosil transferasa (gpt) .
Los genes marcadores inducen una reacción de color en las células transducidas , que puede ser usada para identificar a las células transducidas. El practicante experimentado está familiarizado con una variedad de genes marcadores, que pueden ser usados en un sistema viral de la viruela. Entre estos están el gen codificador, p. ej . , la ß-Galactosidasa (ß-gal), la ß-Glucosidasa (ß-glu), la proteína de Fluorescencia Verde (EGFP, siglas en inglés) o la Proteína de Fluorescencia azul.
De acuerdo con otra representación más de la Aprésente invención, la secuencia de ADN exógeno comprende una secuencia espaciadora, que separa el elemento de control de la transcripción viral de la viruela y/o la secuencia de codificación en la secuencia del ADN exógeno, del codón de detención y/o del codón de inicio de los ORF' s adyacentes. Esta secuencia espaciadora entre el codón de detención/inicio del ORF adyacente y la secuencia codificadora introducida en el ADN exógeno tiene la ventaja de estabilizar al ADN exógeno y, por lo tanto, a cualquier virus recombinante resultante. El tamaño de la secuencia espaciadora es variable, tanto como la secuencia no tenga u propia función codificadora o reguladora.
De acuerdo con otra representación, la secuencia espadadora que separa al elemento de control "de la transcripción viral de la viruela y/o a la secuencia de codificación en la secuencia del ADN exógeno del codón de detención del ORF adyacente, es al menos del tamaño de un nucleótido.
De acuerdo con otra representación de la presente invención, la secuencia espadadora que separa al elemento de control de la transcripción viral de la viruela y/o a la secuencia de codificación en la secuencia del ADN exógeno del codón de inicio del ORF adyacente, es de al menos 3G -'nucieótidos. Particularmente, en los casos en los que un elemento promotor de un virus de vacuna típico se identifica corriente arriba de un codón de inicio, la inserción del ADN exógeno puede no separar el elemento promotor del codón de inicio del ORF adyacente. Un elemento promotor de vacuna típico puede identificarse rastreando por ej . la secuencia "TAAA'T" para los promotores tardíos (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) y un dominio A/T rico para los promotores tempranos. Una secuencia espaciadora de cerca de 30 nucieótidos, es la distancia preferible para asegurar que no se influencia a un promotor viral de la viruela, ubicado corriente arriba del codón de inicio del ORF. Adicionalmente , de acuerdo con otra representación preferible, la distancia entre el ADN exógeno introducido y el codón de inicio del ORF adyacente es de alrededor de 50 nucleótidos, y más preferiblemente de alrededor de 100 nucleótidos.
De acuerdo con otra representación preferible de la presenta invención, la secuencia espadadora comprende un elemento de control adicional de la transcripción viral de la viruela, que es capaz de controlar la transcripción del ORF adyacente.
Una cepa de MVA típica que puede ser usada de "'acuerdo con la presente invención, para generar un MVA recombinante, es la MVA-575, que ha sido depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales, bajo el número de depósito ECACC V00120707.
Otra cepa preferible de MVA es la MVA-vero o un derivado de la misma. Las cepas MVA-Vero han sido depositadas en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales, bajo los números de depósito ECACC V99101431 y 01021411. La seguridad de la MVA-Vero se refleja por las características biológicas, químicas y físicas que se describen en la Solicitud de Patente PCT/EPOi/02703. En comparación con otras cepas de MVA, la Vero-MVA incluye una eliminación genómica adicional.
Otra cepa de MVA más preferible es la VA-BN. La MVA-BN ha sido depositada en la Colección Europea de Cultivos de Células Animales, con el número de depósito ECACC V00083008. El virus MVA-BN es un virus extremadamente atenuado, que también se deriva del virus de la vacuna de Ankara Modificada (ver también la PCT/EP01/13628) .
El término "derivados" de un virus, de acuerdo con la presente invención, se refiere a los virus de la progenie que muestran las mismas representaciones ''características que el virus padre, pero que muestran diferencias en una o más partes de su genoma . El término "derivado del MVA" describe a un virus que tiene las mismas características funcionales, comparado con el MVA. Por ejemplo, un derivado del MVA-BN tiene las representaciones características del MVA-BN. Una de estas características del MVA-BN o de sus derivados es la atenuación y la falta de replicación en las células HaCat humanas. El MVA recombinante de acuerdo con la presente invención es útil como medicamento o vacuna. De acuerdo con otra representación, se usa para la introducción de la secuencia de codificación exógena dentro de una célula meta, siendo esta secuencia ya sea homologa o heteróloga del genoma de la célula meta.
La introducción de una secuencia de codificación exógena dentro de una célula meta puede hacerse in vi tro para producir proteínas, 'polipépt idos , péptidos, antígenos o epítopes antigénicos. Este método comprende la infección de una célula huésped con el MVA recombinante de acuerdo con la invención, el cultivo de la célula meta infectada bajo las condiciones adecuadas, y el aislamiento y/o el enriquecimiento del polipéptido, péptido, proteína, antígeno, epítope y/o virus producido por esa célula huésped.
Además, el método para la introducción de una o más secuencias homologas o de una o más heterólogas dentro de las células, puede aplicarse para la terapia in vitro e in vivo. Para la terapia in vitro, las células aisladas que han sido previamente (ex vivo) infectadas con el MVA reombinante de acuerdo con la invención, se administran al cuerpo animal vivo para afectar, preferiblemente para inducir, una respuesta inmune. Para la terapia in vivo, el virus de viruela recombinante de acuerdo con la invención se aaministra directamente al cuerpo animal vivo, para afectar, preferiblemente para inducir, una respuesta inmune. En este caso, las células que rodean al sitio de inoculación, pero también las células en las que el virus se transporta por vía, p. ej . , sanguínea, son infectadas directamente in vivo por el MVA recombinante de acuerdo con la invención. Después de la infección, estas células sintetizan las proteínas*, los péptidos o los epítopes antigénicos de los genes terapéuticos, que son codificados por las secuencias de codificación exógenas y subsecuentemente los presentan, o a parte de los mismos, en la superficie celular. Las células especializadas del sistema inmune reconocen la presentación de esos proteínas, péptidos o epítopes heterólogos, y lanzan una respuesta inmune específica.
Dado que el MVA está altamente restringido en su crecimiento y, por lo tanto, altamente atenuado, es útil para el tratamiento de un amplio rango de mamíferos, incluyendo a los humanos, e incluyendo a los animales o a los humanos inmuno-comprometidos. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas para inducir una respuesta inmune en un cuerpo animal vivo, incluyendo a un humano.
La composición farm céu ica puede incluir generalmente uno o más portadores, aditivos, antibióticos, conservadores, adyuvantes, diluyentes y/o estabilizadores farmacéuticamente aceptables y/o aprobados. Estas sustancias auxiliares pueden ser agua, salina glicerol, etanol, agentes humectantes o emulsificantes, sustancias reguladoras del pH, o similares. Los portadores adecuados son típicamente moléculas grandes, metaboli zadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, cop limeros de aminoácido, agregados lípidos, o similares.
Para la preparación de las vacunas, el virus de viruela recorabinante de acuerdo con la invención es ' convertido en una forma fisiológicamente aceptable. Esto puede hacerse con base en la experiencia en la preparación de vacunas de virus de viruela usadas para la vacunación contra las viruelas (como se describe en Stickl, H. et al.
[1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392) . Por ejemplo, el virus purificado se almacena a -8G°C con una dosis de 5xlOE8 de TCID5f/mi, formulada en cerca de 10 nM de Tris, 140 mM de NaCl pK 7.4. Para la preparación . de las inyecciones de la vacuna, p. ej . , 10E2-10E8 partículas del virus se iiofilizan en salina regulada con fosfato (PBS) en presencia de 2¾ de peptona y II de albúmina humana en ur:¿¿ ampolleta, preferiblemente una ampolleta de vidrio. Alternativamente, las inyecciones de la vacuna pueden producirse a través del paso de secado congelado conveniente del virus en una formulación. Esta formulación puede contener aditivos adicionales, tales como manitol, dextrano, azúcar, glicina, lactosa o polivinilpirrolidona, u otros auxiliares tales ' como antioxidantes o gas inerte, estabilizadores o proteínas recombinantes (p. ej . , albúmina de suero humano), adecuados para la administración in vivo. Entonces se sella la ampolleta de vidrio y puede almacenarse. entre los 4°C y la temperatura ambiente durante varios meses. Sin embargo, en tanto no exista la necesidad, la ampolleta se almacena preferiblemente a temperaturas abajo de los -20°C.
Para la vacunación o la terapia, el liofilizado puede disolverse en 0.1 a 0.5 mi de una solución acuosa, preferiblemente salina fisiológica o regulador Tris, y administrarse ya sea en forma sistérnica o local, p. ej . , por vía parenteral, subcutánea, intramuscular, por escarificación o por cualquier otra vía de administración conocida por el practicante experimentado. El modo de administración, la dosis y el número de administraciones, pueden ser optimizados por aquellos, experimentados en la técnica, de una manera conocida. Sin embargo, rc.ás comúnmente un paciente es vacunado con una segunda inyección cerca de un mes a seis semanas después de la primera inyección de vacunación.
La presente invención se refriere además a los vectores plásmidos, que pueden ser usados para generar el MVA recombinante de acuerdo con la presente invención, y también se refiere a ciertas secuencias de ADN : Regularmente, el IGR localizado entre, o flanqueado por, dos ORF' s adyacentes, comprende secuencias de nucleótido en las que puede insertarse la secuencia del ADN exógeno de interés. De acuerdo con ello, el vector plásmido de acuerdo con la presente invención comprende una ''secuencia de ADN derivada de, u homologa al, genoma del MVA, donde esa secuencia de ADN comprende un fragmento completo o parcial de una secuencia IGR localizada entre,, o flanqueada por, dos ORF' s adyacentes del genoma viral. Preferiblemente, el vector plásmido comprende, introducida dentro de esa secuencia derivada del IGR, al menos un sitio de clonado para la inserción de una secuencia del ADN exógeno de interés y, preferiblemente, para la inserción de un elemento de control de la transcripción viral de la viruela operativamente ligado con esa secuencia de ADN heteróioga. CpcioiiaInerte, el vector plásmido comprende u cartucho de gen reportero y/o de selección. El vector plásmido preferiblemente comprende también las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean ese fragmento completo o parcial de la secuencias del IGR.
Se han identificado algunos IGR' s que no incluyen secuencias nucleótidas. En estos casos, el vector plásmido comprende las secuencias del ADN de las secuencias que flanquean al IGR, p. e . , las secuencias del ADN de los dos ORF' s adyacentes. Preferiblemente, el sitio de clonación para la inserción de la secuencia del ADN heterólogo, se introduce en el IGR. El ADN de las secuencias que flanquean- ai IGR se usa para dirigir la inserción de las secuencias del ADN exógeno dentro del IGR correspondiente del genorna J* del MVA . Este vector plásmido puede incluir adicionalmente un fragmento completo o parcial de una secuencia de IGR que comprenda el sitio de clonación para la inserción de la secuencia del ADN heterólogo y, opcionalmente, del cartucho del gen reportero y/o de selección.
Las secuencias de ADN del IGR, asi como Jas secuencias de les dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR, se seleccionan preferiblemente de los IGR' s y los ORF's, respectivamente, seleccionados entre el grupo que comprende: 001L--002L, 002L--003L-, 0O5R--006R, 006L- 007R, 007R- 008L, OOSL--Q09L, 017L--018L, 018L--019L, 019L- 020L, 020L-021L, 023L--024L, 024L--025L, 025L--026L, 028R--029L, 030L- 031L, 031L--032L, 032L--033L, 035L--Q36L, 036L-•037L, 037L-038L, 039L-040L-, 043L-044L, 044L- 045L, 046L-047R, 049L- 050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R- 053R, 053R- 054R, 05 R- 055R, 055R-056L, 061L- 062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L- Q67L, 077L-078R, 078R-079R, 080R- 081R, 081R- 082L, 082L- 083R, 085R-086R, 0S6R-087R, 088R- 089L, 089L-090R, 092R- 093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R- 134R, 134R- 135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L- 144.R, 144R- 145R, 145R-146R, 146R- 147R, 147R-148R, 148R- 149L, 152R- 153L, 153L- 154R, 154R- 155R, 156R-157L, 157L- 158R, 159R--160L, 160L- 161R, 162R--163R, 163R- 164R, 164R- 165R, 165R--166R, 166R- 167R, 167R- 168R, 170R- 171R, 173R- 174R, 175R--176R, 176R--177R, 178R--179R,. 179R- 18DR, 180R- 181R, 183R--134R, 18 R--185L, 185L--186R, 186R- 187R, 187R--188R, 188R--189R, 189R--190R, 192R--193R.
Más preferibieraente, las secuencias se eligen entre ios IGR' s y ios ORF's, respectivamente, seleccionados entre el grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148L-149L. Las secuencias derivadas del IGR son seleccionadas, preferiblemente, de entre el grupo que comprende las secuencias ucleótida: - no . 527- 608 de la SeqID No. 32; - no . 299- 883 de la SeqID No. 33; - no . 339- 852 de la SeqID No. 34; - no . 376- 647 de la SeqID No. 35; - no . 597- 855 de la SeqID No. 36; - no . 400- 607 de la SeqID ' o . '37.
Las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende las secuencias nucleó idas: - no. 1-525 y 609-1190 de la SeqID No. 32; - no. 101-298 y 884-1198 de la SeqID No. 33; - no. 1-338 y 853-1200 de la SeqID No. 34 · - no. 1-375 y 648-1200 de la SeqID No. 35, - no. 1-596 y 856-1200 de la SeqID No. 3< - no. 1-399 y 608-1081 de la SeqID No. 37.
Las secuencias de ADN se derivan preferiblemente de, o son homologas al, genoma del MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008.
Para generar un vector plásmido de acuerdo con la presente invención, las secuencias se aislan y se clonan dentro de un vector de clonación estándar, tal como el pBluescript ( Stratagene) , donde estos flanquean al ADN exógeno que va a insertarse dentro del genoma del MVA. Opcionalmente , este vector plásmido comprende un cartucho de gen de selección o reportero, que puede ser eliminado del virus recombinante final, debido a la secuencia repetitiva incluida dentro de ese cartucho.
Los métodos para introducir las secuencias de ADN exógeno a través de un vector plásmido dentro de un genoma de MVA, y los métodos para obtener el MVA recombinante, son muy conocidos por la persona experimentada en la técnica y, adicionalmente , pueden deducirse a partir de Las referencias siguientes: ' - Molecular Cloning, Un Manual de Laboratorio.
Segunda Edición. Por J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: describe las técnicas y el conocimientoi para las técnicas estándar de biología molecular, tales como la clonación del ADN, el aislamiento del ARN, el análisis de la mancha de Western, las técnicas de amplificación RT-PCR y PCR; - Viroloqy Methods Manual. Editado por Brian WJ Mahy y Hillar O angro. Academis Press. 1996: describe . las técnicas para el manejo y la manipulación de virus; - Molecular Virology Un acercamiento Práctico. Editado por AJ Davison y RM Elliot. The Practical Approach Series, IRL Press en Oxford University Press. Oxford 1993. Capítulo 9: Expresiones de los genes a través de vectores de virus de vacuna; - Current Protocole in Molecular Biology. Editor: John Wiley and Son Inc. 1998. Capítulo 16, sección IV: Expresión de las proteínas en las células de los mamíferos usando el vector viral de la vacuna: describe las técnicas y el conocimiento para el manejo, la manipulación y la ingeniería genética del MVA.
El MVA de acuerdo con la presente invención, preferiblemente el MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008, puede producirse transíectando una célula con un vector plásmido de acuerdo con la presente invención, infectando la célula transfectada con un MVA y, subsecuentemente, identificando, aislando y, cpcionalmente, purificando el MVA de acuerdo con la invención.
Las secuencias de ADN de acuerdo con la invención pueden usarse para identificar o aislar el MVA o sus derivados de acuerdo con la invención, y las células o los individuos infectados con un MVA de acuerdo con la presente invención. Las secuencias de ADN se usan, p. ej . , para generar primeros PCR, sondas de hibridación, o se usan en tecnologías de diseño.
Breve descripción de las Figuras . Figura 1 : Mapa de restricción del vecto construye pBNX39 (Figura la), pBNX70 (Figura Ib) y pBN84 (Figura le), que comprende cerca de 600bp de secuencias de MVA que flanquean el sitio de inserción después del ORF 14L. Los plásmidos comprenden adicionalmente ADN e^ógeno (Ecogpt y hBFP, respectivamente) bajo el control transcripcional de un promotor P) de virus de viruela entre las secuencias que flanquean: Flanco 1 (Fl 14L-15L) y Flanco 2 ( F2 14L-15L) . Flrpt significa una secuencia repetitiva del Flanco 1, para permitir la eliminación del cartucho reportero de un virus recombinante resultante. pBN84 ( Fiqyra le) I !¡ I ! ¡BEtilijJJIIIEII* (Figura 2c), que comprende cerca de 600bp de las secuencias del MVA que flanquean al sitio de la inserción después del ORF 137L (Flanco 1: F1136-137, corresponde a la posición 129340 - 129930 del genoma del MVA; Flanco 2: F2136-137, corresponde a la posición 129931 - 130540 del genoma del MVA). Adicionalmente, el vector pBNX67 (Figura 2b) comprende AD exógeno (gen NPT II = resistencia a la Neomicina) bajo el control transcripcional de un promotor P) de un virus de viruela entre las secuencias que flanquean. F2rpt significa una secuencia repetitiva del Flanco 2 para permitir la eliminación del cartucho reportero de un virus recombinante resultante. ,pBN27 (Figura 2c) codifica adicionalmente al virus PrM4 del Dengue bajo el control de un promotor de virus de viruela. Otras abreviaturas: AmpR = gen de resistencia a la Ampicilina; bps = pares de base; IRES = posición de entrada ribosomal interna; EGFP = gen para la proteina verde fluorescente estimulada.
Figura 3: Mapa ,de restricción del vector que construye pBNX79 (Figura 3a), pBNX86 (Figura 3b), pBNX88 (Figura 3c), pBN34 (Figura 3d) y pBN56 (Figura 3e) , que comprende cerca de 600 bps de secuencias de MVA que flanquean el sitio de la inserción entre el ORF G07R y el 008L (Flanco 1: Fl IGR 07-08 inicia en la posición 12200 del genoma del MVA; Flanco 2: F2 IGR 07-08, se detiene en la posición 13400 del genoma del MVA) . F2rpt significa una secuencia repetitiva del Flanco 2 para permitir la eliminación del cartucho reportero de un virus recombinante resultante. Adicionalmente, el vector pBNX88 (Figura 3c) y el pBNX86 {Figura 3b) comprenden ADN exógeno (BFP + gpt y NPT II + EGFP, respectivamente) bajo el control transcripcional de un promotor P) de virus de viruela entre las secuencias que flanquean. F2rpt significa una secuencia repetitiva del Flanco 2, para permitir la eliminación del cartucho reportero de un virus recombinante resultante.- el PBN56 (Figura 3e) codifica adicionalmente para la pro/teína VIH-1 env, y el pBM34 (Figura 3d> contiene la secuencia de codificación PrM2 del virus del dengue, bajo el control de un promotor del virus de la viruela. Otras abreviaturas: AmpR = gen de resistencia a la Ampicilina; bps = pares de base.
Figura 4: Mapa de restricción del vector que construye pBNX80 (Figura 4a), pBNX87 (Figura 4b), y pBN47 (Figura 4c), que comprende cerca de · 600/640 bps de secuencias de MVA que flanquean el sitio de la inserción entre el ORF 044L y el 045L (Flanco 1: Fl IGR 44-45 inicia en la posición 36730 del genoma del MVA; Flanco 2: F2 IGR 44-45, se detiene en la posición 37970 del genoma del MVA).
Adicionalmente, el vector pBNX87 (Figura 4b) comprende ADN exógeno (gen NPT II + EGFP) bajo el control transcripcional de un promotor P) del virus de la viruela, entre las secuencias que flanquean. F2rpt significa una secuencia repetitiva del Flanco 2 para permitir la eliminación del cartucho reportero de un virus recombinante resultante. Adicionalmente, el vector pBN47 (Figura 4c) codifica para el PrM3 del virus del dengue, bajo el control de un promotor del virus de la viruela. Otras abreviaturas: AmpR = gen de resistencia a la Ampicilina ; bps = pares de base.
Figura 5: Mapa de restricción del vector/ que construye pB X90 (Figura 5a), y pBM54 (Figura 5c), que comprende cerca de 596/604 bps de secuencias de MVA que flanquean el sitio de la inserción entre el ORF 148R y el 149L (Flanco I: Fl IGR 148-149 inicia en la posición 136900 del genoma del MVA; Flanco 2: F2 IGR 148-149, se detiene en la posición 138100 del genoma del MVA) . Adicionalmente, el vector pBNX92 (Figura 5b) comprende ADN exógeno (gpt + BFP) bajo el control transcripcional de un promotor P) del virus de la viruela, entre las secuencias que flanquean. Adicionalmente, el vector pBN54 (Figura 5c) codifica para el PrMl del virus del dengue. F2rpt significa una secuencia repetitiva del Flanco 2 para permitir la eliminación del cartucho reportero de un virus recombinante resultante.
Otras abreviaturas: AmpR = gen de resistencia a la Ampicilina; bps = pares de base.
Figura 6: Presentación esquemática de las posiciones de inserción intergénicas del MVA (Genbank Ac . U94848) .
Figura 7: Análisis PCR del IGR 14L-15L en el MVA recombinante , con el NS1 del virus del dengue introducido en el IGR 14L-15L. La ruta XBN" muestra el producto del PCR usando el vector vacio MVA-BN. Usando el MVA recombinante del NS1, es detectable un fragmento de mayor tamaño 2 , 3, 4: diferentes concentraciones de AD ) . M = Marcador de peso molecular, O = agua de control negativo.
Figura 8: Figura 8a: análisis PCR del IGR 136-137 en el MVA recombinante, con el PrM4 del virus del dengue introducido en el IGR 136-137. La ruta "BN" muestra el producto de PCR usando el vector vacio MVA_B . Usando el MVA recombinante PrM4, se ,detecta un fragmento de rna or tamaño (mBN23, 1/10, 1/100: diferentes concentraciones de ADN) . M = Marcador de peso molecular, ??0 = agua de control negativo, pBN27 = control plásmido positivo.
Figura 8b: curva de crecimiento de pasos múltiples para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con el PrM4 introducido en el IGR 136-137 ( MVA-mBN23 ) .
Figura 9: Figura 9a: Análisis PCR del IGR 07-08 en el7 MVA recombinante con el PrM2 del virus del dengue introducido en el IGR 07-08. La ruta a muestra el producto PCR usando el vector vacío MVA-BN. Usando el ¡VIVA recombinante del PrM2, es detectable un fragmento de mayor tamaño (ruta 2) . M = Marcador de peso molecular, ruta 1 = agua de control negativo.
Figura- 9b: curva de crecimiento de .pasos múltiples para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con el PrM2 introducido en el IGR 07-08 (MVA-mBN25 ) .
Figura 10: Análisis PCR del IGR 07-08 en el MVA recombinante con el VIH env introducido en el IGR 07-08. La ruta BN muestra el producto PCR usando el vector vacío MVA-BN. Usando el MVA recombinante del PrM2, es detectable un fragmento de mayor tamaño (rutas 1, 2, 3) . M = Marcador de peso molecular, - = agua de control negativo, + = control plásmido positivo.
Figura 11: Figura lia: Análisis PCR del IGR 44-45 en el MVA recombinante con el PrM3 del virus del dengue introducido en el IGR 44-45. La ruta BN muestra el producto PCR usando el vector vacío MVA-B.N. Usando el MVA recombinante del PrM3, es detectable un fragmento de mayor tamaño (rutas 1-4, diferentes concentraciones de ADN) . M == Marcador de peso molecular, - = agua de control negativo.
Figura 11b: curva de crecimiento de pasos múltiples para el vector vacío MVA-BN y el MVA recombinante con el PrM3 introducido en el IGR 44- 5 (MVA-mB 28) .
Figura 12: Figura 12a: Análisis PCR del IGR 1-48-149 en el MVA recombinante con el PrMl del virus del den<3ue introducido en el IGR 148-149. La ruta BN muestra el producto PCR usando el vector vacío MVA-BN. Usando el MVA recombinante del PrMl, es detectable un fragmento de mayor tamaño (ruta 1) . M = Marcador de peso molecular, - = agua de control negativo, + = control plásmido positivo.
Figura 12b: curva de crecimiento de pasos múltiples para el vector vacio MVA-BN y el MVA recombinante con el PrMl introducido en el IGR 44-45 ( MVA-mB 33 ) .
Los siguientes ejemplos ilustrarán mejor la presente invención. Cualquier persona experimentada en la técnica entenderá que los ejemplos que se proporcionar: i ninguna manera deben ser interpretados de una forma que limite la presente invención a esos ejemplos. La competencia de la invención sólo estará limitada por la total competencia de las reivindicaciones adjuntas.
E emplo 1. Vectores de inserción pBNX39, pBNX70 y pBN84 Para la inserción de secuencias exógenas dentro de la región intergénica adyacente al ORF 065L (el sitio de inserción está en la posición 56760 del genoma) del MVA, se construyó un vector que comprende cerca de 1200 bp de -las secuencias adyacentes que flanquean al sitio d,e la inserción. Estas secuencias que flanquean están separadas en dos flancos que comprenden, en un flanco, cerca de 610bp del ORF 065L (nomenclatura alternativa: 14L ORF), y por la otra parte cerca de 580 bp de la región intergénica de detrás del ORF 065, asi como partes del ORF próximo. En medio de estas secuencias de flanqueo se localizan, respectivamente, un gen Ecogpt {gpt significa gen de la fos foribosiltransferasa ais.lado de E. coli) y un BFP (proteína de fluorescencia azul), bajo el control transcripcional de un promotor del virus de la viruela. Adicionalmente, hay al menos un sitio de clonación de genes o de secuencias adicionales que van a introducirse dentro de la región intergénica detrás del ORF 141. Las construcciones de ejemplo de los vectores de acuerdo con la presente invención se describen en las Figuras l a) y b) (pBNX39, pBNX70) . En el vector pBN84 (Figura le) , la región de codificación para el NS1 del virus del dengue se introduce en el sitio de clonación del pBNX70 (Figura Ib).
Generación del MVA recombinante a través de la recombinación homologa. Los genes extraños pueden ser introducidos en el genoma del MVA a través de la recombinación homologa'. Para este propósito, el gen extraño de interés se clona den-tro de un vector plásmido, como se describe arriba. Este v.ector es transfectado en las células infectadas con el MVA. La recombinación tiene lugar en el citoplasma de las células infectadas y transíectadas . Con la ayuda del cartucho de selección y/o reportero, que también está contenido en el vector de inserción, se identifican y se aislan las células que comprenden virus recombinantes .
Para la recombinación homologa, se siembran células BHK (riñon de hámster bebé) o células CEF (fibroblastos primarios de embrión de polio) en charolas de 6 platinas usando DMEM (Modified Eagles Médium, de Dulbecco Gibco BRL) ÷ 10% de suero fetal de becerro (FCS) o de VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/1 de L-Glutamina, para un proceso de producción libre de suero.
Las células deben permanecer en la fase de crecimiento, y por lo tanto deberían alcanzar de 60-80% de confluencia a lo largo del día de la transíección . Las células se contaron antes de la siembra, ya que debe conocerse el número de células para determinar la multiplicidad de la infección (moi) para la infección.
Para la infección, el material de VA se diluye en DMEM/FCS o en VP-SFM/L-Glutamina , a modo de que 500- µ] de la dilución contengan una cantidad apropiada de v/irus, que darán un moi de 0.1-1.0. Se asume que las células se dividieron una vez después de la siembra." Se remueve el medio de las células, y las células se infectan con 500 µ.1 de virus diluidos durante 1 hora, agitando a temperatura ambiente. Se remueve el inoculum y se lavan las células con DMEM/VP-SFM. Las células infectadas se dejan en 1.6 mi de DMEM/FCS y de VP-SFM/L-Glutamina, respectivamente, mientras se establece la reacción de ¦ transíección (Equipo Effectene de Qiagen ) .
Para la transfección se usa el equipo de transfección lEffectene" (de Quiagen) . Se prepara una mezcla de transfección de 1-2 ug del vector de inserclór-linearizado (cantidad total para la transfección múltiple) con regulador EC, para dar un volumen total de 100 µ?. Se añaden 3.2 µ? de Intensificador , se agita vorticealmente y se incuba a temperatura ambiente por 5 min. Luego, se añaden 10 µ? de Effecteno después de agitar 'vorticealmente el tubo de material, y la solución se mezcla vigorosamente por agitación vorticeal y se incuba a temperatura ambiente durante 10 min. Se añaden 600 µ? de DMEM/FCS y de VP-SFM/L-Glutamina, respectivamente, se mezcla y, subsecuentemente, toda la mezcla de transfección se añade a las células, que ya están cubiertas con el me'dio. La charola se ag-ita suavemente, para mezclar la reacción de transfeccxón . La incubación tiene lugar a 37 °C con 5% de C02, durante la noche. Al siguiente día se remueve el medio y se reemplaza con DMEM/FCS o con VP-SFM/L-Glutamina frescos. La incubación se continúa hasta el día 3.
Para cosechar, las células se raspan en el medio, y luego la suspensión de las células se transfiere a un tubo adecuado y se congela .a -2' °C para almacenamiento de corto plazo, o a -80°C para almacenamiento de largo plazo.
Inserción del Ecogpt en el sitio de inserción 14L del MVA . En una primera vuelta, las células se infectaron con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y fueron adicionalmente transíectadas con el vector de inserción pBNX39 (Figura la) que contenia el gen Ecogpt [Ecogpt, o su abreviatura gpt, significan gen de la fosforibosiltransferasa) como gen reportero. Los virus recombinantes resultantes se purificaron con 3 vueltas de purificación de la placa bajo selección de metabolismo de la fosforibosiltransferasa , con la. adición de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. El ácido micofenólico (MPA) inhibe la dehidrogenasa de monofosfato de inosina y da como resultado un bloqueo de la síntesis de purina y- la inhibición de la repiicación viral en la mayoría de las líneas celulares. Este bloqueo puede superarse a través de la expresión del Ecogpt de un promotor constitutivo, y proporconando ios substratos xantina e hipoxantina.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos de PCR estándar, usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el par primario del lado 14L de la inserción, se usaron el BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID No.: 1) y el ??50 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ No. : 2) . En caso de que el ADN del vector vacío del virus MVA se amplifique, el fragmento PCR esperado es de 328 nucleótidos (nt) de longitud; en el caso de que se amplifique un MVA recombinante , que ha incorporado el ADN exógeno en el sitio de inserción 14L, el fragmento se alarga de forma correspondiente.
Inserción de NS1 en el sitio de inserción IGR064L-065L del MVA. En una primera vuelta, las células se infectaron con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y adicíonalmente fueron transíectadas con el vector de inserción pBN84 (Figura le) que contenía el gen Ecogpt para la selección, y la BFP (proteína de fluorescencia azul) como gen reportero. Los virus recombinantes resultantes se purificaron con 7 vueltas de purificación de la placa, bajo selección de metabolismo de la fosforibosil-transferasa con la adición de ácido micofenólico, xantina e hipoxantina. El ácido micofenólico (MPA) inhibe la dehidrogenasa de monofosfato de inosina y da como resultado un bloqueo de la síntesis de purina y la inhibición de la replicación viral en la mayoría de las líneas celulares. Este bloqueo puede superarse a través de la< expresión del Ecogpt de un promotor constitutivo, y proporcionando los substratos xantina e hipoxantina.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos de PC estándar, usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio de inserción esperado. Para amplificar el par primario del lado 14L de la inserción, se usaron el BN499 ( CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ I D No.: 1) y el BNSOO (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ No. : 2) . En caso de que el ADN del vector vacío del virus MVA se amplifique, el fragmento PCR esperado es de 328 nucleótidos (nt) de longitud; en el caso de que se amplifique un MVA recombinante para NS1, que ha incorporado la región de codificación NS1 del virus del dengue el sitie de inserción 14L, se espera que el fragmento sea de 1683 bp. Los resultados del PCR en - la Figura 7, muestran claramente la inserción estable de,l NS1 en el sitio de inserción 14L después de 17 vueltas de amplificación del virus.
Prueba in vitro del recMVA que incluye el NS1 (MVA-BN22) . Un frasco T25, con cerca de 80% de monocapas confluentes de células BHK, se inoculó con 100 µ? del material del virus diluido ,hasta 1x10' en MEMa con 1% de FCS, y se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, a cada frasco se añadieron 5 mi de EMa y se incubaron a 30 °C en un incubador de C02. El frasco se cosechó después de 48 horas. Se removió el flotante del frasco y se hizo girar a 260g durante 10 minutos, a 4°C. El flotante se almacenó en alícuotas a ~80°C. La pildora se lavó dos veces con 5 mi de lxPBS y luego se resuspendió en 1 mi de regulador douncing hipotónico con 1% de TX100. Se cosecharon los lisatos de las células y se hicieron girar durante 5 minutos a 16,000g, y se almacenaron los flotantes en tubos microcentrífugos a -80°C.
Los frascos inoculados con el MVA que incluía GFP, el MVA que incluía el gen NS1 en un sitio de eliminación (MVA-BN07), y los frascos infectados artificialmente también se trataron de la misma forma que se describió arriba. ,' El lisato célula/viral y el flotante se trat ron en un regulador no reductor/reductor bajo condiciones de no calentamiento/calentamiento. Se separaron las proteínas en 10% de SDS PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa . Se sondearon las manchas durante la noche con sueros recolectados de pacientes convalecientes (PPCS) a una dilución de 1:500. Después de lavar 3 veces con lxPBS, las manchas se incubaron con IgG-HRP anti-humano (DAKO) durante 2 horas, a temperatura ambiente. Después de que las manchas se lavaron como se describió anteriormente, se desarrolló el color usando 4 cloro-l-naftol .
Los resultados de la mancha de western mostraron que el NS1 en el MVA-BN22 se expresa en grandes cantidades. El MSI se expresó en la confirmación correcta, como un regulador bajo condiciones de no calentamiento, y corno un monómero bajo condiciones de calentamiento.
La expresión del NS1 se comparó tanto en el MVA-BN22 como en el MVA-BN07. Las células BHK se inocularon con el mismo pfu y se cosecharon después de 48 horas. Los resultados mostraron que la expresión del NS1 fue mucho más alta en el B 22 que en el BN07. Los resultados de las manchas de western también mostraron que hay más' S1 secretado en el flotante con la construcción BN22, en comparación con el BN07.
Los resultados también mostraron que el NS1 expresado en las células infectadas con BN22 es antigénico, y se reconoce a través de los sueros recolectados de pacientes convalecientes .
En conclusión, el NS1 se expresa en grandes cantidades y en la confirmación correcta en las células BHK infectadas con B 22. Tanto el regulador como el mor»ómero son antigénicos, y se reconocen a través de los sueros recolectados de pacientes convalecientes.
Ejemplo 2. Vectores de inserción pBNX67 y pBN27. Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (e la posición 129940 del genoma) entre el ORF 136L y el- 137L, se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés, usando los siguientes primarios: ??? 5 43 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTAGAT; SEQ ID No.: 3) y O BN 5 4 4 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT; SEQ ID No.: 4 ) , para aislar el Flanco 1; oBN.578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID No.: 5 ) y ? ?? 5 7 9 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG ; SEQ ID NO.: 6), para aislar el Flanco 2.
El fragmento PCR que comprendía al Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y Xbal, y se ligó a un vector básico SacII/Xbal digerido y defosforilado, tal como el pBluescript ( Stratagene ) .
El plásmido resultante fue Xhol/Apal digerido, defosforilado y ligado al fragmento Xhol/Apal de PCR digerido que comprendía al Flanco 2.
• Opcionalmente , una secuencia repetitiva del Flanco 2 que había sido aislada por PCR usando ios primarios ???545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 7) y oBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTTCTGTTTT; SEQ ID NO.: 8), y que se convirtió en HindIII/PstI digerido, se insertó dentro del sitio HindIII/PstI del vector resultante. La Figura 2 a) muestra el vector (pBNX51) .
Un cartucho reportero que comprendía un promotor sintético, el gen NPT II (resistencia a la neomicina) , · la polirregión A, IRES y el gen EGFP ( Ps-NPTII-poliA -IRES-EGFP) fue digerido con Ecll36lI/XhoI e insertado dentro del sitio KindIII/Xhol del vector de inserción, donde el sitio HindIII fue despuntado en los extremos con Polimerasa T4 de ADN (Roche) . En la Figura 2 b) se describe un mapa de restricción de una construcción del vector de ejemplo de acuerdo con este ejemplo (pBNX67) .
Para la construcción del pBN27 (Figura 2c), el PrM serotipo 4 del virus del dengue se insertó en el sitio Pací del pBNX67.
Generación MVA recombinante via la recombinación homologa .
El vector pBNX67 (Figura 2b) puede usarse para generar un MVA recombinante , usando el protocolo arriba mencionado - p. ej . , usando el pBN27 (Figura 2c) para que la recombinación homologa dé como resultado un MV7A recombinante que porte al PrK4 del virus del dengue en la región intergénica entre dos ORF' s adyacentes.
Inserción del PrM4 en el sitio de inserción IGR136-137 del MVA. En una primera vuelta, se infectaron las células con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y adicionalmente se transfectaron con el vector de inserción pBN27 (Figura 2c) que contenia el gen NPT para la selección y EGFP (proteina de fluorescencia verde estimulada) como gen reportero. Los virus recombinantes resultantes se purificaron con 4 vueltas de purificación de la placa, bajo la selección G418.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos - PCR estándar usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio de la inserción. Para amplificar el par primario del sitio de inserción IGR136-137, se usaron BNS0O (cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID NO. : 9) y BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEQ ID NO. : 10) . Er. el caso de que se ampiifique el vector vacio del virus MVA, el fragmento PCR esperado es de 88 nucieótidos (nt) de largo; en' el caso de que se amplifique un MVA recombinante para el PrM4 , que ha incorporado la región · de codificación PrM4 del virus del dengue en el sitio de inserción, se espera que el fragmento sea de 880bp. Los resultados del PCR (en la Figura 8a) muestran claramente la inserción estable del PrM4 en el sitio de inserción IGR136-137 después de 22 vueltas de amplificación del virus. El MVA recombinante aún muestra las mismas características de crecimiento que el MVA-B . Se replica en los fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en las células de los mamíferos (Figura 8b) .
Ejemplo 3. Vectores de inserción pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN3 y pBN56. Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 12800 del genoma) entre el ORF 007R y el 088L, se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés, usando los siguientes primarios : IGR 07/08 Flup (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ ID NO . : 11) e IGR 07/08 Fler.d í AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEQ ID ?.?. ; para aislar el Flanco IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC SEQ ID NO.: 13) e IGR 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCT TCATG; SEQ ID NO.: 14), para aislar el Flanco 2.
El fragmento de PCR que comprendía al Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y SacI, y se ligó a un vector básico SacII/SacI digerido y defosforilado, tal como el pBluescript (Stratagerie) .
El plásmido resultante fue Xhol/Apal digerido, defosforilado y ligado al fragmento Xhol/Apal digerido del. PCR que comprendía ai Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del Flanco 2, que había sido aislada por PCR usando ios' primarios: IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) e IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA SEQ ID NO. : 15), y que es digerida por Bam.HI/Pstl , se insertó dentro del sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier . e o— ¿sj teraoé ti ,:c contenga un cartucho, que tenga p. ej . un promotor viral, un gen marcador, una polirregión A, y opcionalmente un elemento IRES, un gen adicional que exprese p. ej . una sustancia terapéuticamente activa o un producto de gen, puede ser truncado en los extremos con Polimerasa T4 de ADN (Roche) después de una digestión de restricción, y ser insertado dentro de un sitio de clonación adecuado del vector plásrnidc. En la Figura 3 a) se describe un mapa de restricción de una construcción de ejemplo del vector de acuerdo con este ejemplo (pB X79) . La inserción del cartucho de selección NPT/EGFP dio como resultados/ el vector pBNX86 (Figura 3b) y la inserción del cartuoho de selección gpt/3FP en el vector pBNX88 (Figura 3c) , respectivamente. Considerando una unidad de expresión para un gen terapéutico, que comprenda un gen terapéutico y un promotor enlazado de manera operable, esta unidad de expresión se inserta en el sitio Pací. Para la construcción del pBN34 (Figura 3d) se clonó el PrM2 del virus del dengue en el pBNX88 (Figura 3c), y para la síntesis del pBN56 (Figura 3e) la región de codificación del VIH env se clonó con Pací en el pBNX86 (Figura 3b) .
Generación del MVA recombinante via la recombinación homologa. Les vectores p3NX86 (Figura 3b) y pBKT 39 'Fi . 3c) , respectivamente, pueden usarse para generar MVA recombinante usando el protocolo arriba mencionado. El usar pBN34 (Figura 3d) para la recombinación homologa, da como resultado un MVA recombinante que porta el PrM2 del virus del dengue en la región intergénica entre dos ORF' s adyacentes. La recombinación del pBM56 (Figura 3e) con el genoma del MVA-BN da como resultado un MVA recombinante, que contiene el gen VIH env en el IGR correspondiente.
Inserción del PrM2 en el sitio de inserción IGR07-08 del MVA. En una primera vuelta, se infectaron las células con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y adicionalmente se transíectaron con' el vector de inserción pBN34 (Figura 3d) que contenia el gen gpt para la selección y BFP como gen reportero. Los virus recombinantes resultantes se purificaron con 3 vueltas de purificación de la placa, bajo selección por ácido micofenólico, como se describió en el ejemplo 1.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar, usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio esperado de inserción. Para amplificar el par primario del sitio de inserción IGR07-08, se usaren BN902 ( ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO. : 16) y BN903 ¡gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO. : 17) . En el caso de que el ADN del vector vacio del virus MVA se amplifique, el fragmento PCR esperado es de 190 nucleótidos de largo; -en el caso de que se amplifique un MVA re-combinante para PrM2, que ha. incorporado la región de codificación PrM2 del virus del dengue en el sitio de inserción IGR07-08, se espera que el fragmento sea de 950 bp. Los resultados del PCR en la Figura 9a), muestran claramente la inserción estable del PrM2 en el sitio de inserción IGR07-08, después de 20 vueltas de amplificación del virus. El MVA recombinante muestra todavía las mismas características de crecimiento que el MVA-BN. Se replica en los fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en las células de los mamíferos (Figura 9b) .
Inserción del VIH env en el sitio de inserción IGR07-08 del MVA. En una primera vuelta, se infectaron las células con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y adicionalmente se transfectaron con el vector de inserción pBN56 (Figura 3e) que contenía el gen NPT para la selección y EGFP como gen reportero. Los virus recombínantes resultantes se purificaron con 6 vueltas de purificación de la placa, bajo selección por G413.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar, usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio esperado de inserción. Para- amplificar el par primario del sitio de inserción IR07-08," se usaron BN902 ( ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) y BN903 ( gacaattatccgacgcaccg , SEQ ID NO.: 17) . En el caso de que el ADN del vector vacio del virus MVA se amplifique, el fragmento PCR esperado es de 190 nucleótidos (nt) de largo; en el caso de que se amplifique un MVA recombmante para env, que ha incorporado la región de codificación VIH env del virus del dengue en el sitio' de inserción IGR07-08, se espera que el fragmento sea dé 2.6 kb. Los resultados del PCR en la Figura 10, muestran claramente la inserción estable del env en el sitio de inserción IGR07-08, después de 20 vueltas de amplificación del virus.
Ejemplo 4. Vectores de inserción pBNX80, pBNX87 y pBN47. Las secuencias de , MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 37330 del genoma), entre el ORF 044L y el 045L, se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés, usando los siguientes primarios : IGR44/45Flup (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ ID NO.: 18) e IGR44/45Ílend /AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG ; SEQ ID NO.: 19), para aislar el Flanco 1; IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGAT ATT; SEQ ID NO . : 20) , e IGR4.4/45F2end (CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT; SEQ ID NO.: 21), para aislar el Flanco 2.
El fragmento de PCR que comprendía el Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y SacI, y- se ligó con un vector básico SacII/SacI digerido y defosforilado, tal como el pBluescript (Stratagene) .
El plásmido resultante fue digerido por Xhol/Apal, defosforilado y ligado al fragmento del PCR Xhol/Apal digerido, que comprendía al Flanco 2.
Opcionalmente, una secuencia repetitiva del Flanco 2, que se había aislado por PCR usando los primarios IGR44/45F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT ; SEQ ID NO . : 20), e IGR 4 /45F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG; SEQ ID NO.: 22), y que se convirtió en BamHI/PstI digerido, se insertó en el sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier gen reportero o terapéutico que contenga un cartucho, que tenga p. ej . un promotor viral de la viruela, un gen marcador, una polirregión A, y opcionalmente un elemento IRES, un gen adicional que exprese p. ej . una sustancia terapéuticamente activa o un producto de gen, puede ser truncado en los extremos con Polimerasa T4 de ADN (Roche) después de una digestión de restricción, y ser insertado dentro de un sitio de clonación adecuado del vector plásmido. Considerando un cartucho de gen reportero a PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII, Aval o Xhol, el sitio de la enzima de restricción entre- el Flanco 2 y la repetición del Flanco 2 es el preferible/ como sitio de clonación. Para la construcción del pBNX87 (Figura 4b) , se insertó el cartucho de selección NPT/EGFP en el pBNX80 (Figura 4a).
Considerando como una unidad de expresión para un gen terapéutico, el que comprenda un gen terapéutico y un promotor enlazado de forma operable, esta unidad de expresión se inserta en el sitio Pací.
En las Figuras 4a) y b) se describe un mapa de restricción de la construcción del vector de ejemplo de acuerdo con este ejemplo (pBNXSO, pBNX87) .
El vector puede usarse para generar un MVA recorabinante -siguiendo ei protocolo arriba mencionado- que porte una secuencia exógena en la región intergénica entre dos ORF' s adyacentes. Para la construcción del pBN47 (Figura 4c), se clonó el PrM del serotipo 3 del virus del dengur dentro del pBNX87 (Figura 4b) .
Inserción del PrM3 en el sitio de inserción IGR44-45 del MVA. En una primera vuelta, se infectaron las células con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y adicionalmente se transfectaron con el vector de inse.-rción pBN47 (Figura 4c) que contenia el gen NPT para la selección y EGFP como gen reportero. Los virus combinantes resultantes se purificaron con 3 vueltas de purificación de la placa, bajo la selección G418.
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayos PCR estándar usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio esperado de inserción. Para amplificar el par primario del lado de inserción IGR44-45, se usaron BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID NO. : 23) y BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID NO.: 24). En el caso de que se amclifique ei ADN del vector vacio del virus MVA, ei fragmento PCR esperado es de 185 nucleótidos (nt) de largo; en el caso de que se amplifique un MVA recombinante para el PrM3, que ha incorporado la región de codificación PrM3 del virus del dengue en el sitio de inserción IGR44-45, se espera que el fragmento sea de 850 bp. Los resultados del PCR en la Figura lia) muestran claramente la inserción estable del PrM3 en el sitio de inserción IGR44-45 después de 19 vueltas de amplificación del virus. El MVA recombinante aún muestra las mismas características de crecimiento que el MVA-BN. Se replica en los fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en las células de los mamíferos (Figura 11b). ,·- Vectores de inserción pBNX90, pBNX92 y pBN54. Las secuencias de MVA adyacentes al nuevo sitio de inserción (en la posición 137496 del genoma) , entre el ORF 148R y el 149L, se aislaron por amplificación PCR estándar de la secuencia de interés, usando los siguientes primarios: IGR148/149Flup ,( TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG ; SEQ ID NO.: 25) e IGR148/149Flend (CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID NO. : 26), para aislar el Flanco 1; IGR148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC ; SEQ ID NO . : 27) e IGR148/149F2end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEQ ID NO. : 28), para aislar el Flanco 2.
? El fragmento PCR que comprendía al Flanco 1 se trató con las enzimas de restricción SacII y Xbal, y se ligó a un vector básico SacII/Xbal digerido y defosforilado, tal como el pBluescript ( Stratagene ) .
El plásmido resultante fue HindIII/Apal digerido, defosforilado y ligado al fragmento HindIII/Apal de -PCR digerido que comprendía al Flanco 2. ¦ Opciona Imente , una secuencia repetitiva del Flanco 2 que había sido aislada por PCR usando los primarios: IGP.148/149F2up • (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) e IGR148/149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID NO. : 29), y que se convirtió en J3amHI/PstI digerido, se insertó dentro del sitio BamHI/PstI del vector resultante.
Cualquier gen reportero o terapéutico que contenga un cartucho, que tenga p. ej . un promotor viral de la viruela, un gen marcador, una poiirregiór. A, y opcionalmente un elemento IRES, un gen adicional que exprese p. ej . una sustancia terapéuticamente activa o un producto de gen, puede ser truncado en los extremos con Polimerasa T4 de ADN (Roche) después de una digestión de restricción, y ser insertado dentro de un sitio de clonación adecuado del vector plásmido. Para la construcción del pBNX92 (Figura 5b), el cartucho de expresión gpt/BFP se insertó en este sitio de clonación. Considerando un cartucho de gen reportero a PstI, EcoRI, EcoRV y HindIII, el sitio de la enzima de restricción entre el Flanco 2 y la repetición del Flanco 2 es el preferible como sitio de clonación. Considerando una unidad de expresión para un gen terapéutico, que comprenda un gen terapéutico y un promotor enlazado de manera operable, esta unidad de expresión se inserta en el sitio Pací. Para la construcción del pBN54 (Figura 5c) se insertó el PrMl del virus del dengue en este sitio Pací.
En las Figuras 5a) y b) se describe un mapa de restricción de la construcción de un vector de ejemplo de acuerdo con este ejemplo (pBNX90, pBNX92) .
El vector puede usarse para generar un MVA recombinante -siguiendo el protocolo arriba mencionado- que porte una secuencia exógena en la región intergénica entre dos ORF' s adyacentes. Para la generación de un MVA recombinante que expresara el PrMl del virus del dengue (Figura 5c), se usó el pBN54 para una recombinación homologa .
Inserción de PrMl en el sitio de inserción IGR148-149 del MVA. En una. primera vuelta, se infectaron las células con el MVA de acuerdo con el protocolo arriba descrito, y adicionalmente se transíectaron con el vector de inserción pBN54 (Figura 5c) que contenia el gen gpt para la selección y BFP como gen reportero. Los virus recombin,antes resultantes se purificaron con 3 vueltas de purificación de la placa, bajo selección con ácido micofenólico .
Los virus recombinantes resultantes se identificaron por ensayes PCR estándar, usando un par primario y amplificando selectivamente el sitio esperado de inserción. Para amplificar el par primario del lado de inserción IGR148-149, : se usaron B 960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID NO.: 30) y B 96I 8gctagtagacgtggaaga , SEQ ID NO.: 31). En el caso de que el ADM del vector vacio del virus MVA se amplifique, el fragmento PCR esperado es de 450 nucleónidos (nt) de largo; en el caso de que se amplifique un >JVA recombinante para PrMl, que ha incorporado la región de codificación PrMl del virus del dengue en el sitio de inserción IGR148-149, se espera que el fragmento sea de 1200 bp . Los resultados del PCR en la Figura 12 a), muestran claramente la inserción estable del PrMl en el sitio de inserción IGR148-149, después de 23 vueltas de amplificación del virus. El MVA recombinante muestra todavía las mismas características de crecimiento que el MVA-BN. Se replica en los fibroblastos de embrión de pollo (células CEF) y crece atenuado en las células de los mamíferos (Figura 12b).
Número de referencia del Solicitud Internacional No. solicitante o el agente BN 45 PCT-II INDICACIONES RELATIVAS A UN MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regla 13 bis PCT) A. Las indicaciones hechas abajo se refieren a los microorganismos mencionados en la descripción en la página 12 . línea 29 B. IDENTIFICACIÓN DEL DEPÓSITO Los depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional Nombre de la institución depositaría: ECACC Colección Europea de Cultivos Celulares Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) Centro de Microbiología Aplicada & Investigación Salisbury Wiltshire SP4 OJG Reino Unido Fecha del depósito Número de acceso Diciembre 7, 2000 00120707 C. INDICACIONES ADICIONALES (déjese en blanco si no aplica) Esta información continúa en una hoja adicional Para todos los Estados designados para los que esta acción es posible, y hasta el punto en que esté legalmente permitido por la ley del Estado designado, se solicita que una muestra del microorganismo depositado se haga disponible sólo por la emisión del mismo a un experto independiente, de acuerdo con la legislación de patentes relevante. P. ej., la Regla 28(4) EPC; las Reglas de Patentes de UK 1995, Apéndice 2, Párrafo 3; la Regulación Australiana 3.25(3) las Actas de Patentes Danesas Secciones 22 y 33(3) y generalmente las previsiones mutatis mutandis para cualquier otro Estado designado; D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN LAS INDICACIONES (si las indicaciones no se hacen para todos ios Estados designados) E. PROVISION SEPARADA DE INDICACIONES (déjese en blanco si no aplica) Las indicaciones abajo listadas serán enviadas después a la Oficina Internacional especifique la naturaleza general de las indicaciones, p. ej., "Número de Acceso del Depósito") Forma PCT/RO/134 (Julio 1992) APENDICE 3 Página 14 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE Para (nombre y dirección del depositante): BAVARIAN NORDIC RESEARCH INSTTTUTE GMBH FRAUNHOFERSTRASSE 18B FORMATO INTERNACIONAL D-82152 MA TINSRIED ALEMANIA I. IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO Referencia de identificación otorgada por el depositante: Número de acceso otorgado por la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL: MVA-575 V00120707 II. DESCRIPCION CIENTIFICA Y/O DESIGNACION TAXONOMICA PROPUESTA, El microorganismo identificado bajo el número I de arriba se acompañó de (marque con una 'X' donde aplique): X Una descripción científica Una designación taxonómica propuesta III. RECEPCIÓN Y ACEPTACIÓN Esta Autoridad Depositaría Internacional acepta el microorganismo identificado bajo el número I de arriba, que fue recibido el 7 de Diciembre de 2000 (Fecha del depósito original) (Donde aplique la Regla 6.4(d), esta fecha es la fecn3 en la que se adquirió el estado de autoridad depositarla internacional) IV. RECEPCIÓN DE PETICIÓN PARA LA CONVERSIÓN El microorganismo identificado bajo el número I de arriba fue recibido por esta Autoridad Depositaría Internacional el (fecha del depósito original) y esta Autoridad recibió una petición para convertir el depósito original en un depósito bajo en Tratado de Budapest el (fecha de recepción de la petición para la conversión).
V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P J Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR Portón Down Salisbury SP4 OJG Fecha: Forma BP/4 (página única) APÉNDICE 3 Página 24 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE II. DECLARACI N DE VIABILIDAD La viabilidad del microorganismo identificado bajo el número II de arriba se probó el 2. En esa fecha, el microorganismo: Era viable Ya no era viable3 1 Indica la fecha del depósito original o, cuando se ha hecho un nuevo depósito o transferencia, la fecha más relevante (fecha del nuevo depósito o de la transferencia). 2 En los casos a los que se refiere la Regla 10.2(a)(ii) y (iii), se refiere a la prueba de viabilidad más reciente 3 Marque con una "X" lo que aplique Forma BP/4 (primera página) APÉNDICE 3 Página 25 IV. CONDICIONES BAJO LAS QUE SE HA REALIZADO LA PRUEBA DE VIABILIDAD4 VA-575 - V00120707 ESTE VIRUS FUE DOSIFICADO EN CÉLULAS BHK TC1D50 = 106 5 V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P J Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR Portón Down (FIRMA ILEGIBLE} Salisbury SP4 OJG Fecha: 23/3/01 (casi ilegible) Llene el recuadro si la información se ha solicitado y si los resultados de la prueba fueron negativos.
CERTIFICADO DE ANALISIS Descripción del producto: MVA-575 Número de acceso: 00120707 Autorizado por: (FIRMA ILEGIBLE) ECACC. Director de Calidad FECHA (ILEGIBLE) Página 1 de 1 CERTIFICADO DE ANALISIS Descripción del producto: MVA-575 Número de acceso: 00120707 Descripción de la prueba: Detección del Micoplasma usando una línea celular Vero indicadora y el sistema de detección fluorescente 33258 de Hoecnst Las células Vero en el control negativo se ven claramente como núcleos de fluorescencia sin fluorescencia citoplásmica. El control positivo (M. Orale) debe mostrar evidencia de Criterio/ Especificación/ Criterios micoplasma como núcleos fluorescentes más la fluorescencia extranuclear del ADN del de Aceptación: micoplasma. Los resultados de la prueba positiva aparecen como fluorescencia extranuclear del AON del micoplasma. Los resultados negativos no muestran fluorescencia citoplásmica.
Número de la prueba: 21702 Fecha: 12/02/01 Resultado: Control positivo: POSmvO Control negativo: NEGATIVO Resultado de la prueba: NEGATIVO Resultado general: PASA Descripción de la prueba: La detección de bacterias y hongos por aislamiento en Caldo de Soya Triptona (TSB) y en Medio de Tioglicolato Fluido (FTGM). SOP QC/BF/01/02 Criterio/Especificación de la Todos los controles positivos (Bad/fís subtilus, Clostridium sporogenes y Candida albicans) Aceptación: muestran evidencia de crecimiento microbiano (turbiedad) y los controles negativos no muestran evidencia de crecimiento microbiano (claros). El criterio para una prueba positiva es la turbiedad en cualquiera de los caldos de prueba. Todos los caldos deberían ser claros para lograr un resultado negativo. Prueba Número: 21702 Fecha: 12/02/01 Resultado: Control positivo: POSITIVO Control negativo: NEGATIVO Resultado de la prueba: NEGATIVO Resultado general: PASA Autorizado por: (FIRMA ILEGIBLE) ECACC, Director de Calidad FECHA (ILEGIBLE) Número de referencia del Solicitud Internacional No. solicitante o el agente BN 45 PCT-II INDICACIONES RELATIVAS A UN MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regla 13 b/s PCT) A. Las indicaciones hechas abajo se refieren a los microorganismos mencionados en la descripción en la página 13 , línea 1 B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Los depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional Nombre de la institución depositaría: ECACC Colección Europea de Cultivos Celulares Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) Centro de Microbiología Aplicada & Investigación Salisbury Wiltshire SP4 O G Reino Unido Para todos los Estados designados para los que esta acción es posible, y hasta el punto en que esté legalmente permitido por la ley del Estado designado, se solicita que una muestra del microorganismo depositado se haga disponible sólo por la emisión del mismo a un experto independiente, de acuerdo con la legislación de patentes relevante. P. ej., la Regla 28(4) EPC; las Reglas de Patentes de UK 1995, Apéndice 2, Párrafo 3; la Regulación Australiana 3.25(3) las Actas de Patentes Danesas Secciones 22 y 33(3) y generalmente las previsiones mutatis mutandis para cualquier otro Estado designado; D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN LAS INDICACIONES (si las indicaciones no se hacen para todos los Estados designados) E. PROVISION SEPARADA DE INDICACIONES (déjese en blanco si no aplica) Las indicaciones abajo listadas serán enviadas después a la Oficina Internacional especifique la naturaleza general de las indicaciones, p. ej, "Número de Acceso del Depósito") Sólo para el uso de la Oficina Receptora Sólo para el uso de la Oficina Internacional Esta hoja se recibió con la solicitud X Esta hoja fue recibida por la Oficina Internacional el: internacional 30 de Junio de 2003 Oficial autorizado: Oficial autorizado: EKO Forma PCÍ/RO/134 (Julio 1992) APENDICE 3 Página 14 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE I. IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO Referencia de identificación otorgada por el depositante: Número de acceso otorgado por la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL: VERO- MVA- 200 01021411 II. DESCRIPCION CIENTIFICA Y/O DESIGNACION TAXONOMICA PROPUESTA El microorganismo identificado bajo el número I de arriba se acompañó de (marque con una 'X' donde aplique): X Una descripción científica Una designación taxonómica propuesta III. RECEPCIÓN Y ACEPTACIÓN Esta Autoridad Depositaría Internacional acepta el microorganismo identificado bajo el número I de arriba, que fue recibido el 14 de Febrero de 2001 (Fecha del depósito original) (Donde aplique la Regla 6.4(d), esta fecha es la fecha en la que se adquirió el estado de autoridad depositaría internacional) IV. RECEPCIÓN DE PETICIÓN PARA LA CONVERSIÓN El microorganismo identificado bajo el número I de arriba fue recibido por esta Autoridad Depositaría Internacional el (fecha del depósito original) y esta Autoridad recibió una petición para convertir el depósito original en un depósito bajo en Tratado de Budapest el (fecha de recepción de la petición para la conversión).
V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P J Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR Portón Down Salisbury SP4 OJG Fecha: 13/7/2001 (casi ¡legible) Forma BP/4 (página única) APÉNDICE 3 Página 24 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE Forma BP/4 (primera página) Página 25 IV. CONDICIONES BAJO LAS QUE SE HA REALIZADO LA PRUEBA DE VIABILIDAD4 EL VERO-MVA-200 SE DOSIFICÓ EN CÉLULAS VERO PARA CONFIRMAR LA VIABILIDAD V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P 3 Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) pficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): *' CAMR Portón Down (FIRMA ILEGIBLE) Salisbury SP4 OJG Fecha. 13/07/2001 (casi ¡legible) Llene el recuadro si la información se ha solicitado y si los resultados de la prueba fueron negativos.
Número de referencia del Solicitud Internacional No. solicitante o el agente BN 45 PCT-II INDICACIONES RELATIVAS A UN MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regla 13 bfs PCT) A. Las indicaciones hechas abajo se refieren a los microorganismos mencionados en la descripción B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO _Los depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional Nombre de la institución depositaría: ECACC Colección Europea de Cultivos Celulares Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) Centro de Microbiología Aplicada & Investigación Salisbury Wiltshire SP4 OJG Reino Unido Fecha del depósito Número de acceso Octubre 14, 1999 99101431 C. INDICACIONES ADICIONALES (déjese en blanco si no aplica) Esta información continúa en una hoja adicional Para todos los Estados designados para los que esta acción es posible, y hasta el punto en que esté legalmente permitido por la ley del Estado designado, se solicita que una muestra del microorganismo depositado se haga disponible sólo por la emisión del mismo a un experto independiente, de acuerdo con la legislación de patentes relevante. P. ej., la Regla 28(4) EPC; las Reglas de Patentes de UK 1995, Apéndice 2, Párrafo 3; la Regulación Australiana 3.25(3) las Actas de Patentes Danesas Secciones 22 y 33(3) y generalmente las previsiones mutatis mutandis para cualquier otro Estado designado; D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN LAS INDICACIONES (si las indicaciones no se hacen para todos los Estados designados) E. PROVISION SEPARADA DE INDICACIONES (déjese en blanco sino aplica) Las indicaciones abajo listadas serán enviadas después a la Oficina Internacional especifique la naturaleza general de las indicaciones, p. ej., "Número de Acceso del Depósito") Sólo para el uso de la Oficina Receptora Sólo para el uso de la Oficina Internacional Esta hoja se recibió con la solicitud X Esta hoja fue recibida por la Oficina Internacional el: internacional 30 de Junio de 2003 Oficial autorizado: Oficial autorizado: EKO Forma PCT/RO/134 (Julio 1992) APÉNDICE 3 Página 14 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE I. IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO Referencia de identificación otorgada por el depositante: Número de acceso otorgado por la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL: VERO-MVA V99101431 II. DESCRIPCION CIENTIFICA Y/O DESIGNACION TAXONOMICA PROPUESTA . El microorganismo identificado bajo el número I de arriba se acompañó de (marque con una X donde aplique): X Una descripción científica Una designación taxonómica propuesta III. RECEPCIÓN Y ACEPTACIÓN Esta Autoridad Depositaría Internacional acepta el microorganismo identificado bajo el número I de arriba, que fue j recibido el 14 de Octubre de 1999 (Fecha del depósito original) (Donde aplique la Regla j 6.4(d), esta fecha es la fecha en la que se adquirió el estado de autoridad depositaria internacional) j IV. RECEPCIÓN DE PETICIÓN PARA LA CONVERSIÓN j El microorganismo identificado bajo el número I de arriba fue recibido por esta Autoridad Depositaria Internacional el j (fecha del depósito original) y esta Autoridad recibió una petición para convertir el depósito original en un depósito bajo en Tratado de Budapest el (fecha de recepción de la petición para la conversión).
V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P J Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficíal(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR Portón Down Salisbury SP4 OJG Fecha: 08/03/01 (casi ¡legible) Forma 8P/4 (página única) APÉNDICE 3 Página 24 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE Forma BP/4 (primera página) APÉNDICE 3 Página 25 IV. CONDICIONES BAJO LAS QUE SE HA REALIZADO LA PRUEBA DE VIABILIDAD4 VERO-MVA - 99101431 EL VIRUS SE HIZO CRECER EN CÉLULAS VERO DE ACUERDO CON LAS INSTRUCCIONES DE LOS DEPOSITANTES. EL VIRUS FUE VIABLE, PRODUCIENDO EFECTO CrTOPÁTICO DESPUÉS DE 48 HORAS. SE OBTUVO UN LITRO DE 6X106 UNIDADES FORMADORAS DE PLACA/ML V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P J Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR Portón Down (FIRMA ILEGIBLE) Salisbury SP4 OJG Fecha: 08/03/01 (casi ilegible) Llene el recuadro si la información se ha solicitado y si los resultados de la prueba fueron negativos.
Numero de referencia del Solicitud Internacional No. solicitante o el agente BN 45 PCT-II INDICACIONES RELATIVAS A UN MICROORGANISMO DEPOSITADO (Regla 13 ¿vs PCT) A. Las indicaciones hechas abajo se refieren a los microorganismos mencionados en la descripción B. IDENTIFICACION DEL DEPOSITO Los depósitos adicionales se identifican en una hoja adicional Nombre de la institución depositaría: ECACC Colección Europea de Cultivos Celulares Dirección de la institución depositaría (incluyendo código postal y país) Centro de Microbiología Aplicada & Investigación Salisbury Wiltshire SP4 OJG Reino Unido Fecha del depósito Número de acceso Agosto 30, 2000 00083008 C. INDICACIONES ADICIONALES (déjese blanco si no aplica) Esta información continúa en una hoja adicional Para todos los Estados designados para los que esta acción es posible, y hasta el punto en que esté legalmente permitido por la ley del Estado designado, se solicita que una muestra del microorganismo depositado se haga disponible sólo por la emisión del mismo a un experto independíente, de acuerdo con la legislación de patentes relevante. P. ej., la Regla 28(4) EPC; las Reglas de Patentes de UK 1995, Apéndice 2, Párrafo 3; la Regulación Australiana 3.25(3) las Actas de Patentes Danesas Secciones 22 y 33(3) y generalmente las previsiones mutatis mutandis para cualquier otro Estado designado; D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES SE HACEN LAS INDICACIONES (si las indicaciones no se hacen para todos los Estados designados) E. PROVISION SEPARADA DE INDICACIONES (déjese en blanco si no aplica) Las indicaciones abajo listadas serán enviadas después a la Oficina Internacional especifíque la naturaleza general de las indicaciones, p. ej., "Número de Acceso del Depósito") Sólo para el uso de la Oficina Receptora Sólo para el uso de la Oficina Internacional Esta hoja se recibió con la solicitud X Esta hoja fue recibida por la Oficina Internacional el: internacional 30 de Junio de 2003 Oficial autorizado: Oficial autorizado: EKO Forma PCT/RO/134 (Julio 1992) APENDICE 3 Página 14 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE Para (nombre y dirección del depositante): BAVARIAN NORDIC RESEARCH INSTITUTE GMBH FORMATO INTERNACIONAL FRAUNHOFERSTRASSE 18B D-82152 MARTINSRIED ALEMANIA I. IDENTIFICACION DEL MICROORGANISMO Referencia de identificación otorgada por el depositante: Número de acceso otorgado por la AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL: MVA-BN V00083008 II. DESCRIPCION CIENTIFICA Y/O DESIGNACION TAXONOMICA PROPUESTA . El microorganismo identificado bajo el número I de arriba se acompañó de (marque con una 'X' donde aplique): X Una descripción científica Una designación taxonómica propuesta III. RECEPCION Y ACEPTACION Esta Autoridad Depositaría Internacional acepta el microorganismo identificado bajo el número I de arriba, que fue recibido el 30 de Agosto de 2000 (Fecha del depósito original) (Donde aplique la Regla 6.4(d), esta fecha es la fecha en la que se adquirió el estado de autoridad depositarla internacional) IV. RECEPCION DE PETICION PARA LA CONVERSION El microorganismo identificado bajo el número I de arriba fue recibido por esta Autoridad Depositaría Internacional el (fecha del depósito original) y esta Autoridad recibió una petición para convertir el depósito original en un depósito bajo en Tratado de Budapest el (fecha de recepción de la petición para la conversión).
V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P J Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR (FIRMA ILEGIBLE) Portón Down Salisbury SP4 OJG Fecha: 14/12/?? (casi ¡legible) Forma BP/4 (página única) APÉNDICE 3 Página 24 TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA EL PROPÓSITO DE PROCEDIMIENTOS DE PATENTE Forma BP/4 (primera página) APÉNOICE 3 Página 25 IV. CONDICIONES BAJO LAS QUE SE HA REALIZADO LA PRUEBA DE VIABILIDAD4 V000830Ó8 - MVA-BN LA VIABILIDAD DEL MVA-BN SE PROBÓ HACIENDO CRECER EL VIRUS EN CÉLULAS BHK, Y CALCULANDO EL TCD50.
V. AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nombre: Dr. P 1 Packer Firma(s) de la (s) persona(s) que tienen el poder para representar a la Autoridad Depositaría Internacional, o del (los) oficial(es) Dirección: ECACC autorizado(s): CAMR Portón Down (FIRMA ILEGIBLE) Salisbury SP4 OJG Fecha: 14/12/00 (casi ilegible) Llene el recuadro si la información se ha solicitado y si los resultados de la prueba fueron negativos.
CERTIFICADO DE ANÁLISIS Descripción del producto: MVA-BN Número de acceso: 00083008 Autorizado por: (FIRMA ILEGIBLE) ECACC, Director de Calidad FECHA 04/12/00 Página 1 de 2 CERTIFICADO DE ANÁLISIS _ ~ ~ Descripción del producto: MVA-BN Número de acceso: 00083008 Detección de bacterias y hongos por aislamiento en Caldo de Soya Triptona (TSB) y en Descripción de la prueba: Medio de Tioglicolato Fluido (FTGM). SOP QC/BF/01/02 Todos los controles positivos (Bacillis subfílus, Clostrídium sporoger.es y Candida albicans) muestran evidencia de crecimiento microbiano (turbiedad) y los controles negativos no Criterio/ Especificación/ Criterios muestran evidencia de crecimiento microbiano (claros). de Aceptación: El criterio para una prueba positiva es la turbiedad en cualquiera de los caldos de prueba. Todos los caldos deberían ser claros para lograr un resultado negativo. Prueba Número: 21487 Fecha: 27/11/00 Resultado: Control positivo: POSITIVO Control negativo: NEGATIVO Resultado de la prueba: NEGATIVO Resultado general: PASA Descripción de la prueba: Determinación del TCIDso de dosificación del virus citopático (SOP ECACC/055) Célula Criterio/ Especificación de la Los controles negativos no deberían mostrar signos de efectos citopáticos. La muestra de la Aceptación: prueba se diluyó serialmente dentro de 4 platinas de líneas de células indicadores para cada dilución. Los efectos citopáticos indican que el virus está presente. La dosis del virus se calculó usando la ecuación de abajo, en donde x es el valor obtenido a partir de la Tabla TCID estándar, como un resultado de la distribución de las platinas que mostraban menos de 4 platinas positivas por dilución, y y es el valor de la dilución más alta, en la que todas las 4 fueron positivas: 1 TCDso = X101" y Fecha: 12/02/01 Resultado: Línea celular indicadora: BHK 21 (CLON 13) Control negativo: NO CPE Muestra de prueba: CPE Distribución de menos de 4 platinas positivas: 4,4,4,3,0 X: , 1.25 Y: 10"3 TciD50 = 1/10-7 X 10liQ1 25 = 10525 Resultado general: virus presente ***F¡n del Certificado*** FECHA 04/12/02 Autorizado por: (FIRMA ILEGIBLE) ECACC, Director de Calidad Página 2 de 2

Claims (42)

REIVINDICACIONES
1. Un virus recombinante de la Vacuna de Ankara Modificada que comprende una secuencia heteróloga de ADN insertada en una región intergénica (IGR) del genoraa viral.
2. El MVA de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia heteróloga de ADN está insertada dentro de un IGR entre dos marcos de lectura abiertos adyacentes (ORF's) seleccionados entre el grupo que comprende: 007-R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R--149L.
3. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en' el que la secuencia heteróloga de ADN comprende al menoé una secuencia de codificación, preferiblemente bajo el control transcripcional de un elemento de control de transcripción viral de la viruela.
4. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en el que .la secuencia heteróloga de ADN codifica una o más proteínas, polipéptidos , péptidos, antígenos extraños o epítopes antigénicos.
5. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia heteróloga de ADN se deriva del virus del dengue, del virus de la encefalitis japonesa, del virus de la hepatitis B, del virus de la hepatitis C y/o de virus de inmunodeficiencia, preferiblemente del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) .
6. El MVA de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la secuencia heteróloga de ADN derivada del virus del dengue se selecciona entre el grupo que comprende NSl y PrM.
7. El MVA de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el gen NSl se inserta dentro del IGR entre los ORF' s 064-L- 065L.
8. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 6 ó 7, en el que el gen PrM se deriva de uno o más de los 4 serotipos de virus del dengue.
9. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 6 a 8, en el que el gen PrM se inserta en el IGR en.tre los ORF' s seleccionados entre el grupo que comprende; 007R-.008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
10. El MVA de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la secuencia heteróloga de ADN derivada del virus de inmunodeficiencia codifica para VIH env.
11. El MVA de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el gen VIH env se inserta en el IGR entre los ORF' s 007R-008L.
12. El MVA de acuerdo con- las reivindicaciones 1 a 11, siendo el MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008.
13. El MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 12, para usarse como un medicamento y/o vacuna.
14. El uso del xvA de acuerde cor. las reivindicaciones 1 a 13, para la preparación de un medicamento y/o vacuna para el tratamiento y/o la profilaxis de una infección viral y/o una enfermedad proliferante.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14, para el tratamiento o la profilaxis de la infección del virus del dengue o la infección del virus de la inmunodeficiencia, preferiblemente la infección de VIH.
16. Una vacuna que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
17. Una composición farmacéutica que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13 y un portador, diluyente, adyuvante y/o aditivo farmacéuticamente aceptable.
18. Un método para afectar, preferiblemente para inducir, una respuesta inmunológica en un cuerpo animal vivo, incluyendo un humano, que comprende la administración al animal, incluyendo a un humano, que lo necesite, del MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, la vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, y/o la composición de acuerdo con la reivindicación 17.
19. Un método para producir una proteina, un polipéptido, un péptido, un antigeno o un epitope in vitro, que comprende los pasos de: la infección de una célula huésped con el MVA reconbinar.te de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, el cultivo bajo condiciones adecuadas de la célula huésped infectada, - el aislamiento y/o el enriquecimiento del polipéptido, proteína, péptido, antígeno, epítope y/o virus producido por esa célula huésped.
20. Un método para introducir una secuencia de ADN en una célula in vitro, siendo esa secuencia de ADN homologa y/o heteróloga al genoma de esa célula, en el que la célula es infectada con el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
21. Un método para introducir una secuencia de ADN en una célula ex vivo, siendo esa secuencia de ADN homologó y/o heteróloga al genoma de la célula, en el que la célula es infectada con el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, y en el que la célula infectada es subsecuentemente administrada a un cuerpo animal vivo, incluyendo a un humano .
22. Un método para introducir una secuencia de ADN dentro de un cuerpo animal vivo, incluyendo a un humano, siendo esa secuencia de ADN homologa o heteróloga al gencma del cuerpo animal vivo, a través de la administración al animal, incluyendo a un humano, del MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13, las vacunas de acuerdo con la reivindicación 16, y/o la composición de acuerdo con la reivindicación 17.
23. Una célula que comprende el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
24. Un vector plásmido que comprende: una secuencia de ADN que dirige la inserción de una secuencia de ADN que sea heteróloga al genoma de un virus MVA ("secuencia heteróloga"), vía la recombinación homologa, dentro de un IGR ubicado entre dos ORF' s adyacentes del genoma del MVA, - esa secuencia heteróloga, y - opcionalmente , un cartucho de gen reportero y/o de selección.
25. El vector plásmido de acuerdo con la reivindicació-h 24, en el que esa secuencia de ADN comprende ufragmento completo o parcial de la secuencia del IGR.
26. El vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 ó 25, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR.
27. El vector plásmido de acuerdo con las rei indicaciones 24 a 26, en el que la secuencia del IGR se deriva de un IGR entre los ORF' s seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, C64L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
28. El vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 27, en el que la secuencia derivada del IGR co.tjprer.de una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias nucleótidas: - no. 527-608 de la SeqID No. 32; - no. 299-883 de la SeqID No. 33; - no. 339-852 de la SeqID No. 34; - no. 376-647 de la SeqID No. 35; - no. 597-855 de la SeqID No. 36; - no. 400-607 de la SeqID No. 37.
29. El vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 28, en el que las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR se seleccionan entre.' el grupo que comprende: 007-R-008L, 018L-019L, 044L-<045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
30. El vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 29, en el que las secuencias de los dos ORF's adyacentes que flanquean al IGR se seleccionan entre el grupo que comprende las secuencias nucleótidas: - no. 1-526 y 609-1190 de la SeqID No. 32; - no. 101-298 y 884-1198 de la SeqID No. 33; - no. 1-338 y 853-1200 de la' SeqID No. 34; - no. 1-375 y 648-1200 de la SeqID No. 35; - no. 1-596 y 856-1200 de la SeqID No. 36; - no. 1-399 y 608-1081 de la SeqID No. 37.
31. El vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 30, en el que la secuencia de ADN dirige la inserción de la secuencia heteróloga dentro de un IGR del genoma del MVA depositado en ia ECACC bajo el número de depósito V00083008.
32. Un método para producir el MVA de acuerdo on las reivindicaciones 1 a 13, que comprende los pasos de: - transfectar una célula con un vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 31; - infectar la célula transfectada con un MVA; - identificar, aislar y, opcionalmente, purificar el MVA de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13.
33. El método de acuerdo con la reivindicación 32, en' el que la célula es infectada con el MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008.
34. Un ADN que comprende: - una secuencia de ADN que dirige la inserción de una secuencia de ADN que es heteróloga al genoma de un virus MVA ("secuencia heteróloga"), vía la recombinación homologa dentro de un IGR localizado entre dos ORF' s adyacentes del genoma del MVA, y - esa secuencia heteróloga. ·
35. La secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 34, en la cual ia secuencia de ADN que dirige la inserción de la secuencia heteróloga en el IGR del genoma del MVA, comprende un fragmento completo o parcial de la secuencia del IGR.
36. La secuencia de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 34 ó 35, en la que la secuencia de ADN que dirige la inserción de la secuencia heteróloga dentro del IGR del genoraa del MVA, comprende las secuencias que flanquean al IGR de dos ORF' s adyacentes .
37. La secuencia de ADN de acuerdo con las rei indicaciones 34 a 36, en la que la secuencia del IGR se deriva de un IGR entre los ORF' s seleccionados del grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
38. La secuencia de ADN de acuerdo con las reivindicaciones. 34 a 37, en la cual la secuencia derivada del IGR comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias de nucleótidos : - no. 527-608 de la SeqID No. 32; - no. 299-883 de la SeqID No. 33; - no. 339-852 de la SeqID No. 34; - no. 376-647 de la SeqID No. 35; - no. 597-855 de la SeqID No. 36; - no. 400-607 de la SeqID No-. 37.
39. La secuencia de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 34 a 38, en la cual las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR se seleccionan entre el grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
40. La secuencia de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 34 a 39, en la cual las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR comprenden una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias nucleótidas: - no. 1-526 y 609-1190 de la SeqID No. 32; - no. 101-298 y 884-1198 de la SeqID No. 33; - no. 1-338 y 853-1200 de la SeqID No. 34; - no. 1-375 y 648-1200 de la SeqID No. 35; - no. 1-596 y 856-1200. de la SeqID No. 36; - no. 1-399 y 608-1081 de la SeqID No. 37.
41. La secuencia de ADN de acuerdo con las reivindicao'iones 34 a 40, en la cual la secuencia de ADN dirige la inserción de la secuencia heteróloga dentro de un IGR del genoma del MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V-00083008.
42. El uso de un vector plásmido que comprende: - una secuencia de ADN que dirige la inserción de una secuencia de ADN que es heteróloga al genoma de un virus MVA ("secuencia heteróloga")-, vía la recombinación homologa dentro de un IGR localizado entre dos ORF' s adyacentes del genoma del MVA, e - insertar dentro de esa secuencia del IGR un sitio de clonación para la inserción de la secuencia heteróloga, y - opcionaimence , un cartucho de un ger. reportero y/o de selección , para generar y/o producir un MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13. 43.. El uso de acuerdo con la reivindicación 42, en el que la secuencia de ADN comprende un fragmento completo o parcial de la secuencia del IGR. 44. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 42 ó 43, en el que la secuencia de ADN comprende las secuencias de dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR. 45. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 42 a 44, en el que la secuencia de IGR se deriva de un IGR entre /ios ORF' s seleccionados entre el grupo que comprende: .007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L. 46. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 42 a 45, en el que la secuencia derivada del IGR comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias de nucleóidos: - no . 527- 608 de la SeqID No . 32; - no. 299- 883 de la SeqID No*. 33; - no . 339- 852 de la SeqID No. 34 ; - no . 376- 647 de la SeqID No. 35; - no . 597- 855 de la SeqID No. 36; - no . 400- 607 de la SeqID No. 37. 47. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 42 a 46, en el cual las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR se seleccionan entre el grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L. 48. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 42 a 47, en el cual las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR comprenden una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias nucleótidas: - no. 1-526 y 609-1190 de la SeqID No. 32; - no. 101-298 y 884-1198 de la SeqID No. 33; - no. 1-338 y 853-1200 de la SeqID No. 34; - no. 1-375 y 648-1200 de la SeqID No. 35; - no. 1-596 y 856-1200 de la SeqID No. 36; - no. 1-399 y 608-1081 de la SeqID No. 37. 49. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 42 a 48, en el que la secuencia de ADM dirige la inserción de la secuencia heteróloga en un IGR del genoma del MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V00083008. 50. El uso de un ADN que dirige la inserción de una secuencia de ADN que sea heteróloga al genoma de un virus MVA ("secuencia heteróloga"), vía la recombinación homologa, dentro de un IGR ubicado entre dos ORF' s adyacentes del genoma del MVA, para generar y/o producir un vector plásmido de acuerdo con las reivindicaciones 24 a 31, y/o para generar y/o producir un MVA recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 13. 51. El uso de acuerdo con la reivindicación 50, en el que la secuencia de ADN que dirige la inserción de la secuencia heteróloga en el IGR del genoma del MVA, comprende un fragmento completo o parcial de la secuencia del IGR. 52. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 50 ó 51, en el que la secuencia de ADN que dirige la inserción de la secuencia heteróloga en el IGR del genoma del MVA, compréndelas secuencias que flanquean al IGR, de los dos ORF' s adyacentes. 53. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 50 a 5·2 , en el que la secuencia de IGR se deriva de un IGR entre los ORF' s seleccionados entre el grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L. 54. El uso de acuerdo con las rei indicaciones 50 a 53, en el que la secuencia derivada del IGR comprende una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias nucleótidas: - no. 527-608 de la SeqID No. 32; - no. 299-883 de la SeqID No. 33; - no. 339-852 de la SeqID No. 34; - no. 376-647 de la SeqID No. 35; - no. 597-855 de la SeqID No. 36; - no. 400-607 de la SeqID No. 37. 55. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 50 a 54, en el cual las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean- al IGR se seleccionan entre el grupo que comprende: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L. 56. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 50 a 55, en el cual las secuencias de los dos ORF' s adyacentes que flanquean al IGR comprenden una secuencia seleccionada entre el grupo que comprende las secuencias nucleótidas: - no. 1-526 y 609-1190 de la SeqID No. 32; - no. 101-298 y 884-1198 de la SeqID No. 33; - no. 1-338 y 853-1200 de la SeqID No. 34; - no. 1-375 y 648-1200 de la SeqID No. 35; - no. 1-596 y 856-1200 de la SeqID No. 36; - no. 1-399 y 608-1081 de la SeqID No. 37. 57. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 50 a 56, en el que la secuencia de ADN dirige la inserción de la secuencia heteróloga dentro de un IGR del genoma del MVA depositado en la ECACC bajo el número de depósito V-00083008. RE SUMEN La presente invención se refiere a la introducción novedosa en sitios útiles, para la integración de secuencias exógenas en el genoma del virus de la Vacuna de Ankara Modificada (MVA) . La presente invención ofrece nuevos vectores plásmidos para introducir ADN exógeno en el genoma de la MVA. Además, la presente invención proporciona un MVA recombinante que incluye una secuencia introducida de ADN exógeno en el nuevo sitio de inserción, para emplearse como medicina o vacuna.
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