EA012160B1 - Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение - Google Patents

Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение Download PDF

Info

Publication number
EA012160B1
EA012160B1 EA200401506A EA200401506A EA012160B1 EA 012160 B1 EA012160 B1 EA 012160B1 EA 200401506 A EA200401506 A EA 200401506A EA 200401506 A EA200401506 A EA 200401506A EA 012160 B1 EA012160 B1 EA 012160B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
genes
recombinant poxvirus
poxvirus
recombinant
virus
Prior art date
Application number
EA200401506A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200401506A1 (ru
Inventor
Пол Хаули
Соня Лейрер
Original Assignee
Бавариан Нордик А/С
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Бавариан Нордик А/С filed Critical Бавариан Нордик А/С
Publication of EA200401506A1 publication Critical patent/EA200401506A1/ru
Publication of EA012160B1 publication Critical patent/EA012160B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Данное изобретение относится к рекомбинантному поксвирусному вектору, способному экспрессировать две или более гомологичных чужеродных последовательности, которые получены из разных вариантов микроорганизма и которые имеют гомологию 50% или выше. Изобретение, кроме того, относится к способу получения такого рекомбинантного поксвируса и применению указанного рекомбинантного поксвируса в качестве лекарственного средства или вакцины. Кроме того, предлагается способ воздействия, предпочтительно индуцирования иммунного ответа в существующем животном, включая человека.

Description

Данное изобретение относится к рекомбинантному поксвирусу, способному экспрессировать два или более гомологичных чужеродных гена. Указанные гены являются гетерологичными по отношению к вирусному геному, но гомологичными при сравнении друг с другом. Гены главным образом получают из близко родственных вариантов или подтипов микроорганизма. Изобретение, кроме того, относится к способу получения такого рекомбинантного поксвируса и к применению такого рекомбинантного поксвируса в качестве лекарственного средства или вакцины. Кроме того, предлагается способ воздействия, предпочтительно индукции иммунного ответа у существующего животного, включая человека.
Предпосылка изобретения
Каждый живой организм постоянно атакуется инфекционными или патогенными агентами, такими как бактерии, вирусы, грибы или паразиты. Так называемая иммунная система оберегает организм от постоянных инфекций, заболеваний или интоксикации, вызванных такими агентами.
Иммунную систему млекопитающего можно разделить на специфическую и неспецифическую части, хотя обе части тесно перекрестно связаны. Неспецифический иммунный ответ создает возможность для немедленной защиты от широкого множества патогенных веществ или инфекционных агентов. Специфический иммунный ответ возникает после лаг-фазы, когда вещество попадает в организм в первый раз. Указанный специфический иммунный ответ главным образом основан на выработке антигенспецифичных антител и образовании макрофагов и лимфоцитов, например цитотоксических Т-клеток (СТЬ). Специфический иммунный ответ ответственен за тот факт, что человек, который выздоравливает от конкретной инфекции, защищен от данной конкретной инфекции, но по-прежнему восприимчив по отношению к другим инфекционным заболеваниям. В общем, повторная инфекция тем же самым или очень сходным инфекционным агентом вызывает намного более легкие симптомы или вообще не вызывает симптомов. Указанный так называемый иммунитет сохраняется в течение длительного времени, в некоторых случаях даже пожизненно. Лежащее в основе действие часто называют иммунной памятью, которую можно использовать в целях вакцинации.
Что касается вакцинации, описан способ, при котором индивидуума заражают безопасной, неполной или инактивированной формой инфекционного агента, чтобы оказать влияние, предпочтительно индуцировать иммунный ответ у указанного индивидуума, который приводит к продолжительному если не пожизненному - иммунитету против конкретного инфекционного агента.
Заболевание оспы человека вызывает вирус Уапо1а: вирус Уапо1а относится к семейству Рохушбае, большому семейству сложных ДНК-вирусов, которые реплицируются в цитоплазме клеток позвоночных и беспозвоночных.
Семейство Рохушбае можно разделить на два подсемейства Сйотборохушпае и ЕЩоторохушпае на основании круга хозяев - позвоночных и насекомых. Сйотборохушпае помимо прочих включают роды Опйоро.хуйикек и Ау|роху|гикек (Е1е1бк У1то1оду, еб. Ьу Е1е1бк В. Ν., Ырршсои-Кауеп РиЬйкйетк, 3гб ебйюп 1996, Ι8ΒΝ: 0-7817-0253-4, Сйар1ет 83).
К роду Ог1йорохут.1кек относится вирус Уапо1а, являющийся агентом, вызывающим натуральную оспу человека, а также другие вирусы, важные с экономической точки зрения, например, вирус оспы верблюдов, коровьей оспы, оспы овец, оспы коз, оспы обезьян и вирус Уасаша. Все представители данного рода генетически близки и имеют сходную морфологию или сходный круг хозяев. Карты рестрикции эндонуклеазами показали высокую идентичность последовательностей, составляющую до 90%, между различными представителями Оййорохуиикек (Маскей апб Атсйатб, [1979], 1. Сеп. У1го1., 45: 683701).
Название вирус Уасс1ша (УУ) дано агенту, который использовали по меньшей мере последние 100 лет для вакцинации против натуральной оспы. Неизвестно, является ли УУ новым видом, полученным из вируса коровьей оспы или вируса натуральной оспы в результате длительных серийных пассажей, живым представителем ныне вымершего вируса или может быть продуктом генетической рекомбинации. Кроме того, на протяжении истории УУ возникли многие штаммы Уасаша. Указанные различные штаммы проявляют разную иммуногенность и в разной степени вовлечены в возможные осложнения, наиболее серьезным из которых является поствакцинационный энцефалит. Однако многие из указанных штаммов использовали для вакцинации против натуральной оспы. Например, штаммы ΝΥΟΒΟΗ ^Уек(егп Кекетуе или \Ауе1й использовали главным образом в США, тогда как штамм Апкага, Вет, Сорепйадеп, Ык1ег и МУА использовали для вакцинации в Европе. В результате программы всемирной вакцинации указанными разными штаммами УУ в 1980 году ВОЗ наконец объявила об успешном искоренении вируса Уапо1а.
В настоящее время УУ главным образом используют в качестве лабораторного штамма, но помимо этого его еще рассматривают как прототип От1йороху1гикек, что также является причиной того, почему УУ стал одним из наиболее интенсивно охарактеризованных вирусов (Е1е1бк УпЫоду, еб. Ьу Е1е1бк В. Ν., Ырртсой-Кауеи РиЬйкйетк, 3гб ебйюи 1996, Ι8ΒΝ: 0-7817-0253-4, Сйар1ет 83 апб 84).
УУ, а в последнее время и другие поксвирусы, использовали для встраивания в чужеродные гены и их экспрессии. Основной способ встраивания чужеродных генов в живой инфекционный поксвирус заключается в рекомбинации между последовательностями ДНК поксвируса, фланкирующими чужеродный генетический элемент в донорной плазмиде, и гомологичными последовательностями, присутст
- 1 012160 вующими в спасающем поксвирусе. Генетическая рекомбинация в общем представляет собой обмен гомологичными участками ДНК между двумя нитями ДНК. В некоторых вирусах ДНК может быть заменена РНК. Гомологичными участками нуклеиновой кислоты являются участки нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), которые имеют одну и ту же последовательность нуклеотидных оснований. Генетическая рекомбинация может происходить естественным образом во время репликации или получения новых вирусных геномов в инфицированных клетках-хозяевах. Таким образом, генетическая рекомбинация между вирусными генами может происходить во время цикла репликации вируса, который имеет место в клетке-хозяине, которую совместно инфицируют двумя или более различными вирусами или другими генетическими конструкциями. Участок ДНК из первого генома посредством взаимного обмена используют для конструирования участка генома второго совместно инфицирующего вируса, в котором ДНК гомологична ДНК первого вирусного генома.
Успешная экспрессия встроенной генетической последовательности ДНК модифицированным инфекционным вирусом требует двух условий. Во-первых, инсерция должна осуществляться в не имеющую важного значения область вируса, для того чтобы указанный модифицированный вирус оставался жизнеспособным. Вторым условием для экспрессии встроенной ДНК является присутствие промотора, правильно взаимосвязанного со встроенной ДНК. В соответствии с требованиями промотор располагают выше последовательности ДНК, которую необходимо экспрессировать.
Применимость рекомбинантного УУ, экспрессирующего, например, поверхностный антиген вируса гепатита В (НВкАд), гемагглютинин вируса гриппа (ΙηίΗΑ) или антиген спорозоита Р1актобшт кпо\\1екг в качестве живых вакцин для профилактики инфекционных заболеваний показана и рассматривается в (διηίΐΐι. е! а1. [1984] Вю1сс1то1оду апб Сспс11с Епщпссппд Всу1с\\ъ 2, 383-407).
Следующим преимуществом УУ является способность принимать множество чужеродных последовательностей, генов или антигенов в один геном УУ (8тйй апб Мокк [1983], Сепе, 25(1): 21-28). Кроме того, сообщалось, что можно вызвать иммунитет к ряду гетерологичных инфекционных заболеваний с помощью одной прививки поливалентной вакцины (Регкик е! а1., [1985], 8с1епсе, Уо1. 229, 981-984).
Один пример экспрессии различных антигенов одним УУ описан Вгау е! а1. Показано, что рекомбинантный УУ, который способен экспрессировать три разных структурных белка серотипа 4 вируса Денге, а именно белок капсида (С), премембранный белок (ргМ), белок оболочки (Е), и два неструктурных белка серотипа 4 вируса Денге, а именно N81 и №2а, обладал способностью защищать мышей от заражения гомологичным вирусом Денге серотипа 4 (Вгау е! а1., [1989], У1го1оду 2853-2856).
Вирус Денге с его четырьмя серотипами, от вируса Денге серотипа 1 Щеп-1) до вируса Денге серотипа 4 (Эеп-4), является одним из важных представителей рода ИауМгик по отношению к инфекциям человека. Инфекция вирусом Денге вызывает заболевания в диапазоне от подобных гриппу симптомов до тяжелой или смертельной болезни, геморрагической лихорадки Денге (ЭНБ) с шоковым синдромом (088). Вспышки Денге остаются основной проблемой для здравоохранения в густонаселенных областях тропических и субтропических районов, где в изобилии имеются переносчики инфекции комары.
Беспокойство по поводу распространения инфекции Денге и других заболеваний, индуцированных флавивирусами, переносимыми комарами, во многих частях света привело к тому, что предпринимается больше усилий для того, чтобы разработать вакцины против Денге, которые могли бы предотвратить как лихорадку Денге (ОБ), так и геморрагическую лихорадку Денге (ЭНБ), и вакцин, применимых для защиты вакцинированного человека от инфекций, индуцированных некоторыми или всеми переносимыми комарами флавивирусами.
Хотя большинство случаев ОБ обнаруживаются после первой инфекции каким-либо их четырех серотипов, большой процент случаев ЭНБ встречается у субъектов, которые инфицированы во второй раз серотипом, который отличается от первого инфицирующего серотипа вируса Денге. Результатом указанных наблюдений явилась гипотеза о том, что последовательная инфекция человека, имеющего антитела против одного серотипа Денге, другим серотипом вируса через соответствующий интервал в ряде случаев может привести к ЭНБ.
Следовательно, вакцинация против одного серотипа не приводит к полной защите от инфекции вирусами Денге, а только против инфекции тем же самым штаммом вируса Денге. Еще более важно то, что для человека, вакцинированного против одного серотипа, существует повышенный риск развития тяжелых осложнений, таких как геморрагическая лихорадка Денге, в том случае, когда указанный человек подвергается инфекции штаммом вируса Денге другого серотипа.
Таким образом, требуется поливалентная вакцина, которая содержит антигены всех четырех серотипов вируса Денге.
До настоящего времени предлагалось получать поливалентные вакцины смешиванием панели рекомбинантных УУ, где каждый УУ кодирует последовательности разных вирусов (Мокк, [1990] 1ттипо1оду, 2, 317-327). Однако такая поливалентная вакцина обладает несколькими недостатками. Вопервых, трудоемким является создание нескольких независимых рекомбинантных УУ. Кроме раздельных процессов получения также много времени занимают контроль качества и проверка качества. Вовторых, инфекция смесью рекомбинантных вирусов, экспрессирующих разные последовательности, всегда определяет риск того, что процесс инфицирования не особенно хорошо сбалансирован. Главный риск
- 2 012160 состоит в том, что только отдельные рекомбинанты, а не все разные рекомбинанты, содержащиеся в поливалентной вакцине, будут инфицировать клетки-мишени. Одной из причин может быть неравномерное распределение рекомбинантных вирусов. Другой причиной могут быть взаимные помехи между разными рекомбинантными вирусами при инфицировании отдельных клеток. Такие взаимные помехи известны как явление суперинфекции. В данном случае только некоторые антигены, а не все разные антигены поливалентной вакцины, в конечном счете будут экспрессированы инфицированными клетками и, следовательно, представлены иммунной системе пациента. Как следствие будет получена иммунная защита только против некоторых антигенов, но это далеко до обеспечения полной иммунной защиты против различных антигенов, которые презентируются или могут быть презентированы поливалентной вакциной.
В контексте вакцины против инфекции вирусом Денге подход на основе поливалентной вакцины имеет недостаток, состоящий в том, что если разные последовательности экспрессируются в разных количествах или непредсказуемым образом, как это показано для белка оболочки вируса Денге 2 (ЭспЫс с1 а1., [1988], 1. νίτοί 65: 2853), то такая вакцинация в высокой степени рискованна для пациента. Неполная вакцинация с использованием панели рекомбинантных вирусов Vасс^и^а будет обеспечивать иммунную защиту только против некоторых, но не против всех серотипов вируса Денге. К сожалению в случае инфекции Денге неполная вакцинация в высшей степени недопустима, так как она увеличивает риск летальных осложнений, таких как геморрагическая лихорадка Денге.
Цель изобретения
Таким образом, целью данного изобретения является предоставление стабильной, эффективной и надежной вакцины против инфекционных болезней, которые могут быть вызваны более чем одним штаммом, кладой, вариантом, подтипом или серотипом микроорганизма, вызывающего указанную инфекционную болезнь.
Следующей целью данного изобретения является предоставление стабильной, эффективной и надежной вакцины против инфекций вирусом Денге, которая обеспечивает надежную вакцинацию против всех серотипов вируса Денге.
Подробное описание изобретения
Данное изобретение основано на идее включения в поксвирус гомологичных генов, полученных из разных штаммов, клад, вариантов, подтипов или серотипов микроорганизма, вызывающего инфекционное заболевание. Как уже упоминалось выше существует, например, 4 группы, подтипа или серотипа вируса Денге, которые все содержат одни и те же типы генов, как например, ген, кодирующий белок капсида (С), ген, кодирующий премембранный белок (РгМ) или белок оболочки (Е). Однако последовательности нуклеиновой кислоты одного и того же типа гена не полностью идентичны и не в полной мере гомологичны соответственно во всех 4 серотипах: например, сравнение последовательностей (с помощью Ьакегдеие 4.05 Мадайди, МасшШкй) между генами РгМ серотипов 1, 2, 3 и 4 вируса Денге (РгМ1-4) выявило идентичность последовательностей на 66,5-72,9%, т.е. гомология составляет примерно 65-75%. Предполагается, что различия и вариации в генах разных подтипов микроорганизмов, вызывающих инфекционное заболевание, соответственно, являются причиной того, почему вакцинация против одного подтипа не дает автоматически защиты против инфекций другими вариантами того же самого микроорганизма. Таким образом возникла идея создать рекомбинантный вирус, содержащий близкородственные или гомологичные гены, полученные из разных штаммов, клад, вариантов, подтипов или серотипов микроорганизма, вызывающего инфекционное; заболевание. Однако, как уже указано выше, в ходе жизненного цикла вируса происходит гомологичная рекомбинация между гомологичными последовательностями, и она происходит даже между участками ДНК, которые не полностью гомологичны. Таким образом ожидалось, что инсерция гомологичных генов в один вирусный геном может привести к гомологичной рекомбинации и соответственно к делециям встроенных гомологичных генов.
Однако при создании рекомбинантного поксвируса, содержащего в своем геноме по меньшей мере два чужеродных гена с гомологией по меньшей мере 60% неожиданно обнаружено, что указанные гомологичные гены остаются стабильно встроенными в вирусный геном.
Даже в том случае, когда гомологичные гены предпочтительно с гомологией по меньшей мере 50% встроены в разные сайты инсерции вирусного генома, гены также остаются стабильно встроенными в вирусный геном. В данном случае предполагалось, что события рекомбинации между указанными гомологичными генами могут кроме того приводить к потере вирусных генов, важных для амплификации вируса и для жизненного цикла вируса, соответственно, т.е. предполагалось, что жизненный цикл вируса мог быть серьезно нарушен. Так как, кроме того, частота рекомбинации пропорциональна расстоянию между двумя связанными генами, предполагалось, что частота событий рекомбинации между двумя или более гомологичными генами, локализованными в разных сайтах инсерции, может быть высокой и следовательно приводить к делециям указанных генов и/или серьезным взаимным помехам. Соответственно особенно неожиданным было то, что события рекомбинации не происходят и что гомологичные гены остаются стабильно встроенными в разные сайты инсерции вирусного генома.
Согласно предшествующему уровню техники известны рекомбинантные поксвирусы, содержащие чужеродную ДНК из флавивируса, такого как вирус японского энцефалита (ΙΕν), вирус желтой лихорад
- 3 012160 ки (УБУ) и вирус Денге (патент США № 5514375). Однако каждый ген, полученный из указанных флавивирусов, встраивали только в разное время и в один и тот же сайт инсерции. Кроме того, сравнение последовательностей с помощью подходящей компьютерной программы (Ьакегдепе 4.05 Медайдп, Масίηίοδίι) выявило гомологию генов, встроенных в поксвирусный геном, и полученных из 1ЕУ - 20,2-29,6%, из УЕУ - 29,2-45,3% и из вируса Денге 22,8-29,5%.
Сходное сообщение касается заявки на выдачу патента \УО98/13500. описывающей инсерцию антигенов вируса Денге в один и тот же сайт инсерции модифицированного вируса вакцинии Апкага (МУА), главным образом в сайт делеции II.
В патенте США № 5338683 описана инсерция генов гликопротеидов герпесвируса др 13 и 14 в два разных сайта инсерции одного рекомбинантного поксвируса; однако оба гена имели гомологию, составляющую только 25,2%.
Сравнение последовательностей между геном гемагглютинина и геном нуклеопротеида вируса гриппа, встроенных в один и тот же сайт инсерции (сайт делеции III) модифицированного вируса вакцинии Апкага (МУА), выявило гомологию, составляющую 49,1% (патент США № 5676950; 8ийег е! а1., [1994], Уассте 12: 1032).
В патенте США № 5891442 описан рекомбинантный поксвирус, содержащий кодирующую последовательность полибелка УР2, УР3 и УР4 инфекционного бурсита. Указанные гены сливали и таким образом встраивали в один сайт инсерции, и они имели гомологию 41,9-50,3%.
Наконец в патенте США № 6217882 описан рекомбинантный вектор на основе вируса оспы свиней, содержащий антигены инфекционного бульбарного паралича др50 и др63 с гомологией 52,7%, встроенные в один и тот же сайт инсерции.
В заключение можно констатировать, что согласно предшествующему уровню техники гомологичные гены или последовательности, имеющие гомологию, составляющую по меньшей мере 50%, все встраивали в один и тот же или сразу в один сайт инсерции вирусного генома.
Согласно данному изобретению гомологичные гены или последовательности имеют гомологию по меньшей мере 50%, т.е. гомологию, составляющую 50-100%, т.е. по меньшей мере 50% идентичных оснований нуклеотидов. Гены или последовательности, имеющие гомологию меньше 50%, можно считать гетерологичными. В контексте данного изобретения термин «гомологичные» или «гомология» используют в том случае, когда гены или последовательности сравнивают друг с другом, тогда как термины «чужеродный» ген, «экзогенная или «гетерологичная» последовательность используют в том случае, когда гены или последовательности сравнивают с поксвирусным геномом; т.е. указанные термины относятся к последовательности ДНК, которая в природе обычно не встречается ассоциированной с поксвирусом, который используется согласно изобретению. Таким образом, данное изобретение относится к рекомбинантному поксвирусу, содержащему по меньшей мере два гена, которые являются гетерологичными по сравнению с вирусным геномом, но которые являются гомологичными между собой. Термин «гены» относится к кодирующим последовательностям, которые кодируют, например, белки, полипептиды, пептиды, антигены и тому подобное. Белки, полипептиды или пептиды, транслируемые с гомологичных генов, осуществляют одни и те же задачи и проявляют одни и те же функциональные свойства. Гомологичные гены, как правило, получают из разных, но родственных источников или организмов. Согласно одному варианту данного изобретения гомология кодирующих последовательностей составляет предпочтительно от 70 до 80%, более предпочтительно от 80 до 90% или от 90 до 100%. Наиболее предпочтительна гомология от 65 до 75%.
Так как рекомбинантный поксвирус согласно данному изобретению содержит соответствующую генетическую информацию в одной единственной инфекционной единице или только в одной вирусной частице, не существует риска неравномерной инфекции и несбалансированной экспрессии разных гомологичных последовательностей. Таким образом, рекомбинантный поксвирус согласно данному изобретению, содержащий и способный экспрессировать несколько близких или даже наиболее близких или почти идентичных последовательностей в одной инфицированной клетке, является особенно предпочтительным для создания поливалентных вакцин.
Указанное преимущество представляет особый интерес для разработки вакцин против заболеваний, которые могут быть вызваны несколькими близко родственными штаммами или серотипами вируса, подобного, например, вирусу Денге. Рекомбинантные поксвирусы, содержащие гомологичные гены разных серотипов вируса Денге, описаны в примерах.
Гомологичные гены или последовательности согласно данному изобретению можно получить из любого микроорганизма, такого как любой вирус, за исключением векторного вируса, любая бактерия, любой гриб или паразит. Предпочтительно гомологичные гены или последовательности получают из инфекционного или патогенного микроорганизма и наиболее предпочтительно из разных штаммов или клад, вариантов, подтипов или серотипов указанного микроорганизма.
Термины «штамм» или «клада» являются техническими терминами, хорошо известными специалистам, относящимися к таксономии микроорганизмов. Таксономическая система классифицирует все охарактеризованные до настоящего времени микроорганизмы в иерархическом порядке в семейства, роды, виды, штаммы (Р1е1Й8 Упо1оду, ей. Ьу Р1е1Й8 Β.Ν., Ырршсой-К-ауеп РиЫщйега, 4'1' еййюп 2001). В то время
- 4 012160 как критерием для представителей семейства является их филогенетическая взаимосвязь, род включает в себя всех представителей, которые проявляют общие свойства, и вид определяют как класс, основанный на сравнении нескольких признаков, который составляет воспроизводящую линию и занимает конкретную экологическую нишу. Термин «штамм» или «клада» описывает микроорганизмам, т.е. вирусам, которые проявляют общие признаки, подобные основной морфологии или структуре и организации генома, но отличаются по биологическим свойствам, подобным кругу хозяев, тканевому тропизму, географическому распространению, аттенюации или патогенности. Термин «варианты» или «серотипы» дополнительно дифференцируют представителей одного и того же штамма, также называемых подтипами, которые проявляют индивидуальный спектр инфекции или антигенные свойства вследствие минорных вариаций генома.
Согласно следующему варианту данного изобретения гомологичные гены или последовательности выбраны из вирусов, предпочтительно вирусов, которые относятся к роду флавивирусов, таких как предпочтительно - но не ограничивая указанным - вирус Денге, вирус Западного Нила или вирус японского энцефалита; которые относятся к роду ретровирусов, таких как предпочтительно - но не ограничивая указанным - вирус иммунодефицита человека (ВИЧ); которые относятся к роду энтеровирусов, таких как предпочтительно - но не ограничивая указанным - вирус ящура, ЕУ71; которые относятся к роду ротавирусов или которые относятся к роду ортомиксовирусов, таких как предпочтительно - но не огранивая указанным - вирус гриппа. Наиболее предпочтительно гомологичные гены получают из флавивируса.
Согласно следующему предпочтительному варианту гомологичные гены выбраны генов вируса Денге, предпочтительно С, N81 и/или N82, или предпочтительно Е, более предпочтительно РгМ. Наиболее предпочтительными являются гомологичные гены, полученные из разных серотипов вируса, при этом указанные гены могут быть получены из одного, двух, трех или из всех 4 серотипов вируса Денге.
Согласно еще одному варианту гомологичные гены выбраны из разных штаммов или клад ВИЧ. Предпочтительно гомологичные гены выбраны из кодирующей последовательности дад/ροΐ, более предпочтительно из кодирующей последовательности епу или еще более предпочтительно из комбинации структурных и/или регуляторных кодирующих последовательностей ВИЧ.
Векторный вирус, подходящий для данного изобретения, выбран из группы поксвирусов, которые можно легко культивировать в выбранных клетках-хозяевах, таких как, например, клетки-хозяева птиц, но которые в высокой степени дефицитны го репликации или фактически не реплицируются у человека или в клетках человека.
Согласно некоторым предпочтительным вариантам поксвирус согласно данному изобретению выбран из группы, состоящей из вирусов оспы канареек (ΡΙοίΕίη е! а1. [1995] Эеу. ΒίοΙ. 81апй. Уо1. 84: рр. 165-170. Тау1ог е! а1. [1995] Уассше, Уо1. 13. № 6: рр 539-549), вирусов оспы домашних птиц (Άίοηκο е! а1. [2000] 1. νίτο1., рр. 3815-3831. Ие1Й8 Укладу, ей. Ьу Ие1Й8 Β. Ν., ^^рр^ηсοй-Κаνеη РиЬШкега, 4!Ь еййюп 2001, Скар!ет 85: раде 2916), вирусов оспы пингвинов (8!аппагй е! а1. [1998] 1. Сеп. νίτο1., 79, рр. 16371649) или их производных. Так как указанные вирусы относятся к роду Аν^рοxν^^и8е8, их можно легко культивировать и амплифицировать в клетках птиц. Однако в клетках млекопитающих или человека они дефектны по репликации, что означает, что по существу не продуцируется или почти не продуцируется инфекционное вирусное потомство.
Согласно следующему варианту данного изобретения используют вирус Уасаша, предпочтительно аттенюированный вирус Уасаша, для создания рекомбинантных поксвирусов, содержащих два или более гомологичных гена.
Хотя известно, что вирусы Уасаша (УУ) могут подвергаться гомологичной рекомбинации коротких гомологичных последовательностей и поэтому могут происходить делеции гомологичных последовательностей (Ηο\νΕν е! а1., [1996], Сепе 172: 233-237), авторы данного изобретения предлагают рекомбинантный вирус Уасаша, содержащий гомологичные последовательности или гены, стабильно встроенные в его геном. Указанное открытие особенно неожиданно, так как согласно Ηο\\ΐ1ν е! а1. даже короткие последовательности длиной до 300 пар оснований (п.о.) достаточны для того, чтобы индуцировать перестройки генома и делецию гомологичных последовательностей в вирусе Уасаша. Таким образом, специалист может ожидать, что более длинные последовательности могут индуцировать события рекомбинации с еще более высокой вероятностью. Однако согласно данному изобретению даже последовательности, содержащие полностью гомологичные гены, могут быть стабильно встроены в геном вируса Уасаша.
Одним не ограничивающим примером вируса Уасаша является в значительной степени аттенюированный штамм Уасаша с ограниченным кругом хозяев, модифицированный вирус вакцинии Апкага (МУА) (8ийет, С. е! а1. [1994], Уассше 12: 1032-40). МУА был создан примерно при проведении 570 серийных пассажей на фибробластах эмбрионов цыплят штамма Апкага вируса Уасаша (СУА) (для обзора см. Мауг, А., е! а1. [1975], Iηίесйοη 3, 6-14). Вследствие указанных длительных пассажей в СУА делетированы примерно 31 тысяча оснований в его геномной последовательности. Полученный в результате вирусный штамм МУА описан как штамм очень ограниченным кругом клеток хозяев (Меуег, Η. е! а1., 1. Сеп. Уио1. 72, 1031-1038 [1991]). Типичным штаммом МУА является штамм МУА 575, который был депонирован в Европейской коллекции культур клеток животных с номером депозита ЕСАСС У00120707.
- 5 012160
В другом варианте согласно данному изобретению можно использовать штамм МУА-Уего или его производный. Штамм МУА-Уего депонирован в Европейской коллекции культур клеток животных с номером депозита ЕСАСС У99101431 и ЕСАСС01021411. Безопасность МУА-Уего отображена биологическими, химическими и физическими характеристиками, которые описаны в международной заявке на выдачу патента РСТ/ЕР01/02703. По сравнению с нормальным МУА МУА-Уего имеет одну дополнительную делецию в геноме.
Термин «производные» вируса согласно данному изобретению относится к потомству вирусов, проявляющему такие же характерные признаки, как и родительский вирус, но в котором обнаруживаются различия в одной или нескольких частях генома.
В еще одном варианте согласно данному изобретению используют МУА-ΒΝ. МУА-ΒΝ депонирован в Европейской коллекции культур клеток животных с номером депозита ЕСАСС У00083008. Используя МУА-ΒΝ или его производное, создают особенно безопасную вирусную вакцину, так как было показано, что вирус МУА-ΒΝ является очень сильно аттенюированным вирусом, полученным из модифицированного вируса вакцинии Апкага. Таким образом, в наиболее предпочтительном варианте в качестве вирусного вектора используют МУА-ΒΝ или его производные, содержащие два или более гомологичных генов согласно данному изобретению. Термин «производное МУА-ΒΝ» описывает вирус, который имеет такие же функциональные характеристики, сравнимые с МУА-ΒΝ. Признаки МУА-ΒΝ, описание биологических анализов, позволяющих оценивать является ли МУА вирусом МУА-ΒΝ и его производным, и способы, позволяющие создавать МУА-ΒΝ или его производные, описаны в АО 02/42480 (включена в данное описание в виде ссылки). Одним из простых путей оценки функциональной характеристики МУА-ΒΝ и его производных является оценка его аттенюации и отсутствия репликации в клетках НаСа( человека.
В рекомбинантном поксвирусе согласно данному изобретению экспрессия экзогенных последовательностей предпочтительно контролируется элементом регуляции транскрипции поксвируса, более предпочтительно элементом регуляции транскрипции МУА, оспы канареек, оспы домашних птиц или оспы пингвинов или наиболее предпочтительно промотором вируса Уасшша. Поксвирусные элементы регуляции транскрипции согласно данному изобретению, кроме того, включают все элементы регуляции транскрипции, функциональные в поксвирусной системе.
Инсерция экзогенных последовательностей согласно данному изобретению предпочтительно направлена в несущественную область вирусного генома. Несущественными областями являются, например, локусы или открытые рамки считывания (ОКБ) поксвирусных генов, которые не являются необходимыми для жизненного цикла поксвируса. Также в качестве несущественных областей согласно данному изобретению рассматриваются межгенные области, которыми характеризуют пространство между двумя ОКБ. В другом варианте изобретения экзогенные последовательности встраивают во встречающийся в природе сайт делеции в геноме МУА (описан в РСТ/ЕР96/02926, которая включена в данное описание в виде ссылки).
Ориентация встроенной ДНК не оказывает влияния на функциональность или стабильность рекомбинантного вируса согласно данному изобретению.
Так как рекомбинантный поксвирус согласно изобретению является сильно ограниченным в отношении роста и следовательно сильно аттенюированным, он является идеальным кандидатом для лечения широкого круга млекопитающих, включая человека и даже людей с нарушенной иммунологической реактивностью. Поэтому в данном изобретении также предлагается фармацевтическая композиция, а также вакцина для индукции иммунного ответа в живом организме животного, включая человека.
Фармацевтическая композиция, как правило, может включать в себя один или несколько фармацевтически приемлемых и/или разрешенных к применению носителей, добавок, антибиотиков, консервантов, адъювантов, разбавителей и/или стабилизаторов. Такими вспомогательными веществами могут быть вода, физиологический раствор, глицерин, этанол, увлажняющие или эмульгирующие агенты, вещества для рН-буферов или тому подобное. Подходящими носителями обычно являются крупные медленно метаболизируемые молекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, агрегаты липидов или тому подобное.
Для получения вакцин рекомбинантный поксвирус согласно изобретению превращают в физиологически приемлемую форму. Это можно осуществить на основе опыта приготовления поксвирусных вакцин, используемых для вакцинации против натуральной оспы (как описано 8йск1, Н. е( а1. [1974] Όίκοΐι. шей. Аксйг. 99, 2386-2392). Например, очищенный вирус хранят при -80°С с титром 5х10Е8 ТЦИД50/мл, приготовленным примерно в 10 мМ трис, 140 мМ №С1, рН 7,4. Для приготовления небольших доз вакцины, например, 10Е2-10Е8 частиц вируса, лифилизуют в 100 мл фосфатно-солевого буфера (ΡΒ8) в присутствии 2% пептона и 1% альбумина человека в ампуле, предпочтительно стеклянной ампуле. Альтернативно небольшие дозы вакцины можно получить ступенчатой сушкой вымораживанием вируса в композиции. Указанная композиция может содержать дополнительные добавки, такие как маннит, декстран, сахар, глицин, лактозу или поливинилпирролидон или другие вспомогательные вещества, такие как антиоксиданты или инертный газ, стабилизаторы или рекомбинантные белки (например, сывороточный альбумин человека), подходящие для введения ίη у1уо. Затем стеклянную ампулу герметично
- 6 012160 запаивают, и ее можно хранить от 4°С до комнатной температуры в течение нескольких месяцев. Однако, если в этом нет необходимости, ампулу предпочтительно хранят при температуре ниже -20°С.
Для вакцинации или терапии лиофилизат можно растворять в 0,1-0,5 мл водного раствора, предпочтительно физиологического раствора соли или трис-буфера, и вводить либо системно, либо локально, т.е. парентерально, подкожно, внутривенно, внутримышечно, скарификацией или любым другим путем введения, известным специалисту. Способ введения, доза и число введений могут быть оптимизированы специалистами в данной области известным способом. Однако в большинстве случаев пациента вакцинируют второй дозой спустя период времени примерно от одного месяца до шести недель после первой дозы вакцинации.
Рекомбинантный вирус согласно данному изобретению используют для введения экзогенных кодирующих последовательностей в клетку-мишень. Введение экзогенной кодирующей последовательности в клетку-мишень можно использовать для получения ίη νίίτο белков, полипептидов, пептидов, антигенов и эпитопов, соответственно. Кроме того, способ введения гомологичной или гетерологичной последовательности в клетки можно применять для терапии ίη νίίτο и ίη νίνο. В случае терапии ίη νίίτο выделенные клетки, которые предварительно (ех νίνο) были инфицированы рекомбинантным поксвирусом согласно изобретению, вводят в живой организм животного для индукции иммунного ответа. В случае терапии ίη νίνο рекомбинантный поксвирус согласно изобретению непосредственно вводят в живой организм животного для индукции иммунного ответа. В данном случае клетки, окружающие место инокуляции непосредственно инфицируются ίη νίνο вирусом или его рекомбинантом согласно изобретению. После инфекции клетки синтезируют белки, полипептиды, пептиды или антигены, которые кодируются экзогенными кодирующими последовательностями, и затем презентируют их или их части на клеточной поверхности. Специализированные клетки иммунной системы узнают презентацию таких чужеродных белков, полипептидов, пептидов, антигенов и эпитопов и запускают специфичный иммунный ответ.
Способы получения рекомбинантных поксвирусов или инсерции экзогенных кодирующих последовательностей в поксвирусный геном хорошо известны специалисту в данной области. Кроме того, способ описан в примерах, а также его можно найти и дополнить, используя следующие публикации:
ΜοΚαιΕπ Οοηίη§. Α ΙαόοπιΙοίΎ Μαηυαί. 5№οηά Εάίίίοη. Ву 1. ΞαιηόΐΌοΚ. Ε. Ε. ΕτίίκοΗ анб Τ. ΜαηίαΙίδ. Οοΐά 8ргтд ΗαώοΓ ΡαόοπιίοΐΎ Ргекк. 1989: описаны методики и специальные приемы стандартных методик молекулярной биологии, таких как методики клонирования ДНК, выделения ДНК и РНК, Вестернблот-анализа, ОТ-ПЦР и ПЦР-амплификации.
νίΓοΙοβ}' Мебюбк МаииаР Еббеб Ьу Впал ^. 1. МаЬу аиб НШаг О. Каидго. Асабет1с Ргекк. 1996: описаны методики обращения и манипулирования вирусами.
ΜοΚαιΕπ νίΐΌΐοβλ': А Ргасйса1 АрргоасЬ. Еббеб Ьу А. 1. ^аν^кοи апб В. Μ. Εΐΐίοίί. ТЬе Ргасйса1 АрргоасЬ 8епек. 1ВЬ Ргекк аί Охйгб ишуегкйу Ргекк. Охйгб 1993. СЬаρίе^ 9: Ехргеккюг! οί деиек Ьу νη^ίΟη у|гик хесЮгк. СштегД РюЮ^Е ίη ΜοΚαιΕπ Βίο1ο§.ν. РиЬЬкйег: ίοΐιη ХУбеу алб 8οη 1ис. 1998. СЬаρίе^ 16, кеию!! IV: Ехргеккюн οί ргсИетк ίη татта1^ал се11к икшд νη^ίηίη νίτηΐ уесЮг: описаны методики и специальные приемы обращения, манипулирования и генетического конструирования ΜνΑ.
Для создания рекомбинантных поксвирусов согласно данному изобретению могут быть использованы различные способы. Последовательность, которую необходимо встроить в вирус, может быть помещена в конструкцию плазмиды Е. той, в которую была встроена ДНК, гомологичная участку ДНК поксвируса. Последовательность ДНК, которую необходимо встроить, отдельно лигируют с промотором. Соединение промотор-ген располагают в плазмидной конструкции так, чтобы соединение промотор-ген было фланкировано с обоих концов ДНК, гомологичной последовательности ДНК, фланкирующей область ДНК поксвируса, содержащую несущественный локус. Полученную в результате плазмидную конструкцию амплифицируют выращиванием в бактериях Е. отЬ и выделяют. Выделенную плазмиду, содержащую последовательность ДНК встраиваемого гена, трансфицируют в культуру клеток, например фибробласты куриных эмбрионов (СЕЕ), вместе с поксвирусом. Рекомбинация между гомологичной ДНК поксвируса в плазмиде и вирусным геномом, соответственно, дает поксвирус, модифицированный благодаря присутствию чужеродных последовательностей ДНК.
Согласно более предпочтительному варианту клетку подходящей культуры клеток, например клеток СЕЕ, инфицируют поксвирусом. Затем инфицированную клетку трансфицируют первым плазмидным вектором, содержащим чужеродный ген предпочтительно под транскрипционным контролем элемента регуляции экспрессии поксвируса. Как указано в объяснении выше, плазмидный вектор также содержит последовательности, способные направлять инсерцию экзогенной последовательности в выбранную часть поксвирусного генома. Необязательно плазмидный вектор также содержит кассету, содержащую маркерный и/или селектируемый ген, оперативно связанный с поксвирусным промотором. Подходящими маркерными или селектируемыми генами являются например гены, кодирующие зеленый флуоресцентный белок, 6-галактозидазу, неомицин, фосфорибозилтрансферазу или другие маркеры. Использование кассет для селекции или маркерных кассет упрощает идентификацию и выделение созданного рекомбинантного поксвируса. Однако рекомбинантный поксвирус также можно идентифицировать с помощью методики ПЦР. Затем следующую клетку инфицируют рекомбинантным поксвирусом, полу
- 7 012160 ченным как описано выше, и трансфицируют вторым вектором, содержащим ген, который является гомологичным гену, включенному в первый вектор. В том случае, если данный ген должен быть включен в другой сайт инсерции поксвирусного генома, второй вектор также отличается по последовательности, направляющей интеграцию гомологичного гена в геном поксвируса. После того как произойдет гомологичная рекомбинация, можно выделить рекомбинантный вирус, содержащий два гомологичных гена. Для введения более двух гомологичных генов в рекомбинантный вирус стадии инфекции и трансфекции повторяют, используя для инфекции рекомбинартный вирус, выделенный на предыдущей стадии, и используя для трансфекции следующий вектор, содержащий следующий гомологичный ген.
Альтернативно, стадии инфекции и трансфекции, которые описаны выше, являются взаимно переставляемыми, т.е. подходящую клетку сначала можно трансфицировать плазмидным вектором, содержащим чужеродный ген, а затем инфицировать поксвирусом.
В качестве следующей альтернативы также можно вводить каждый гомологичный ген в разные вирусы, клетку совместно инфицировать всеми полученными рекомбинантными вирусами и проводить скрининг в отношении рекомбинанта, в который включены все гомологичные гены.
В изобретении, кроме того, предлагается набор, содержащий две или более плазмидных векторных конструкций, способных направлять интеграцию экспрессируемых гомологичных генов в геном поксвируса. Кроме подходящего сайта клонирования, такие плазмидные векторы содержат последовательности, способные направлять инсерцию экзогенной последовательности в выбранные части генома поксвируса. Необязательно такие векторы содержат кассеты для селектируемых или маркерных генов. Набор, кроме того, содержит средства и инструкции для селекции вирусов, которые являются рекомбинантами в отношении одного или нескольких гомологичных генов, и необязательно селектируемого или маркерного гена, встраиваемого посредством указанных векторных конструкций.
Согласно еще одному варианту в изобретение включены последовательности ДНК или их части, полученные из рекомбинантного поксвируса или гомологичные рекомбинантному поксвирусу согласно данному изобретению. Такие последовательности содержат по меньшей мере часть экзогенной последовательности, содержащей, по меньшей мере, фрагмент одного из гомологичных генов согласно данному изобретению, и, по меньшей мере, фрагмент последовательности генома поксвируса согласно данному изобретению, при этом указанные последовательности генома поксвируса предпочтительно фланкируют экзогенную последовательность.
Такие последовательности ДНК можно использовать для идентификации и выделения вируса или его производных, например, используя их для создания ПЦР-праймеров, зондов для гибридизации или в способах на основе матриц.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - схематичное представление сайтов инсерции четырех генов РгМ (= премембранных) (серотипы 1-4) в геноме МУА согласно примеру 1.
Фиг. 2-9 и 12-17 - конструкции инсерционных плазмидных векторов с указанием названия вектора, его размера и положения представляющих интерес последовательностей, таких как АтрК = ген резистентности к ампициллину, Ыр = ген белка с голубой флуоресценцией, 6А = делеция А, 6Е = делеция Е, 62 = делеция 2, Есодр! = ген гуанозинфосфорибозилтрансферазы Е. со11, ЕСЕР = ген белка с усиленной зеленой флуоресценцией, Е1 = фланкирующая последовательность 1, Е2 = фланкирующая последовательностье 2, 14Ь = межгенная область 14Ь, 1СК = межгенная область, ΝΡΤ II = ген резистентности к неомицину, Р = промотор поксвируса, рг7.5 = промотор Уасаша 7.5, РгМ = ген премембранного белка вируса Денге, при этом номер указывает из какого из четырех серотипов он получен, гр! = повторение фланкирующей последовательности.
Фиг. 10 - подтверждение с помощью ПЦР методик векторного клонирования четырех разных инсерционных векторов (рВ№9. рВ№0. рВШО. рВН39). Каждую из плазмид тестировали с 4 разными комбинациями ПЦР-праймеров. Каждая комбинация является специфичной для одной отдельной последовательности РгМ, интегрированной в один отдельный сайт инсерции.
Фиг. 11 - проверка с помощью ПЦР рекомбинантного поксвируса, содержащего четыре гомологичных гена РгМ вируса Денге (пример 1). В то время как в верхней части геля показаны результаты различных ПЦР рекомбинантного вируса, в нижней части представлены результаты тех же самых реакций ПЦР для контрольных плазмид, которые указаны. Плазмиды, содержащие гомологичные последовательности, названы рВН39, рВШ9 или рВ№0. РгМ означает встроенные гены премембранных белков вируса Денге, где номера указывают из какого из четырех серотипов он получен. 6А = делеция А, 6Е = делеция Е, 62 = делеция 2, 14Ь = межгекная область 14Ь, изображает сайт инсерции экзогенной ДНК.
Фиг. 18 - схематичное представление сайтов инсерции трех генов РгМ (серотипы 2-4) в геноме МУА согласно примеру 2.
Фиг. 19 - проверка с помощью ПЦР рекомбинантного поксвируса, содержащего три гомологичных гена РгМ вируса Денге, встроенные в межгенные области (пример 2). На верхней панели показаны результаты реакций ПЦР, специфичных в отношении РгМ2; на средней панели показаны результаты реакций ПЦР, специфичных для РгМ3, и на нижней панели показаны результаты реакций ПЦР, специфичных для РгМ4. На дорожке 8 показаны такие же реакции ПЦР для контрольных плазмид. На дорожке 2 пока
- 8 012160 зан пустой контрольный вектор МУЛ. РгМ означает встроенные гены премембранных белков вируса Денге, где номера указывают из какого из четырех серотипов он получен. М = маркер молекулярной массы.
Следующие примеры будут дополнительно иллюстрировать данное изобретение. Специалисту в данной области будет хорошо понятно, что предложенные примеры ни коим образом не могут быть интерпретированы как способ ограничения применимости методики, предлагаемой в данном изобретении, указанными примерами.
Пример 1. Инсерционные векторы.
Инсерционный вектор для делеции А.
Для инсерции экзогенных последовательностей в геном МУА в так называемый сайт делеции А или делеции 1, соответственно, соответствующий положению в геноме 7608-7609, конструировали плазмидный вектор, который содержит примерно 600 п.о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к сайту делеции А. Чтобы выделить фланкирующие последовательности из геномной ДНК МУА-ΒΝ конструировали подходящие ПЦР-праймеры с помощью подходящей компьютерной программы (ΌΝΑδίδ, НйакЫ кой^атс спдспссгшд, 8ап Вгипо, И8А). Такие праймеры содержат удлинения с сайтами для ферментов рестрикции, которые будут использованы для клонирования фланкирующих последовательностей в векторной плазмиде. Между указанными фланкирующими последовательностями вводят кассету селектируемого гена, например, гена ΝΡΤ II (резистентности к неомицину), под транскрипционным контролем промотора поксвируса. Кроме того, имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или экзогенных последовательностей, которые необходимо встроить в сайт делеции А. Одна из таких конструкций вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 2 (ρΒΝΧ10).
Инсерционный вектор для делеции Е.
Для инсерции экзогенных последовательностей в геном МУА в так называемый сайт делеции Е или делеции 4, соответственно, соответствующий положению в геноме 170480-170481, конструировали вектор, который содержит примерно 600 п.о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к сайту делеции Е. Вектор разрабатывают и конструируют подобно тому, как описано выше. Между фланкирующими последовательностями располагают ген ЕОРР (белок с зеленой флуоресценцией, С1опс1сс11) под транскрипционным контролем промотора поксвируса. Кроме того, имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или последовательностей, которые необходимо встроить в сайт делеции А. Одна такая конструкция вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 3 (ρΒΝΧ32).
Инсерционный вектор для делеции 2.
Для инсерции экзогенных последовательностей в геном МУА в так называемый сайт делеции 2, соответствующий положению в геноме 20718-20719, конструировали вектор, который содержит примерно 600 п.о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к сайту делеции 2. Вектор разрабатывают и конструируют подобно тому, как описано выше. Между фланкирующими последовательностями располагают ген НЫГр (гуманизированный белок с зеленой флуоресценцией, Рауа1кщ Ο.Ν. с! а1.) под транскрипционным контролем промотора поксвируса. Кроме того, имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или последовательностей, которые необходимо встроить в сайт делеции 2. Одна такая конструкция вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 4 (ρΒΝΧ36).
Инсерционный вектор для межгенной области 14Ь.
Для инсерции экзогенных последовательностей в межгенную область между ОКЕ 13Ь и 14Ь, соответствующую положению в геноме 56760, конструировали вектор, который содержит примерно 600 п.о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к межгенной области у локуса 14Ь. Вектор разрабатывают и конструируют подобно тому, как описано выше. Между фланкирующими последовательностями располагают ген Есодр! (или др!, означающий ген фосфорибозилтрансферазы, выделенный из Е. сой) под транскрипционным контролем промотора поксвируса. Кроме того, имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или последовательностей, которые необходимо встроить в межгенную область после ОКЕ 14Ь. Одна такая конструкция вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 5 (ρΒΝΧ39).
Конструирование рекомбинантного поксвируса, содержащего несколько гомологичных генов, интегрированных в его геном.
Инсериионные векторы.
Для инсерции четырех генов РгМ четырех серотипов вируса Денге в геном МУА использовали четыре независимых рекомбинантных вектора.
Указанные векторы содержат - как подробно описано выше - последовательности, гомологичные геному МУА для целенаправленной инсерции путем гомологичной рекомбинации. Кроме того, каждый вектор содержит кассету селектируемого или репортерного гена.
Последовательности РгМ четырех серотипов вируса Денге получали синтетически путем отжига олигонуклеотидов и ПЦР-амплификацли. Последовательности РгМ клонировали ниже промоторных элементов поксвируса, чтобы образовать экспрессируемую кассету. Затем данную экспрессируемую кассету клонировали в сайте клонирования соответствующих конструкций инсерционных векторов.
- 9 012160
В результате конструкция инсерционного вектора для делеции А содержала ген РгМ серотипа 2 вируса Денге (фиг. 6 - ρΒΝ39). Конструкция инсерционного вектора для делеции 2 содержала ген РгМ серотипа 1 вируса Денге (фиг. 7 - ρΒΝ49). Конструкция инсерционного вектора для межгенной области 14Ь содержала ген РгМ серотипа 3 вируса Денге (фиг. 8 - ρΒΝ50). Конструкция инсерционного вектора для делеции Е содержала ген РгМ серотипа 4 вируса Денге (фиг. 9 - ρΒΝ40).
Проверка инсерционных векторов с помощью ПЦР.
Для проверки методики клонирования осуществляли ПЦР-анализы. Для указанных ПЦР-анализов выбранная пара праймеров представляет собой комбинацию праймера, специфично связывающегося с конкретной фланкирующей последовательностью, родственной сайту инсерции, и второго праймера, специфично связывающегося с одним из высоко гомологичных генов РгМ вируса Денге.
Скрининг инсерционного вектора для делеции А, содержащего ген РгМ серотипа 2 вируса Денге, проводили с использованием праймеров оΒN93 (СССССАТССАТССТСААСАТСТТСААСАССАСАСССАСА. 8ЕО ΙΌ N0: 1) и ΟΒΝ477 (САТСАТААСАСАТТСТАТСАС. 8ЕО ГО N0: 2).
Скрининг инсерционного вектора для делеции 2, содержащего ген РгМ серотипа 1 вируса Денге, проводили с использованием праймеров оΒN194 (АТСТТСААСАТААТСААСАССАССААААСАТСТ СТСАССАТССТССТСАТССТССТССССАСАССССТССССТТССАТСТ. 8Ер ГО Ν0: 3) и оΒN476 (САТТТТССТАТТСАСТССАСТССАТС. 8ЕО ГО Ν0: 4).
Скрининг инсерционного вектора для межгенной области 14Ь, содержащего ген РгМ серотипа 3 вируса Денге, проводили, используя праймеры оΒN255 (ССТТААТССААТТСТСАТСТСАТССАТ ССССТААССА ССАТТААТАСТ. 8Ер ГО Ν0: 5) и оΒN479 (ССТСССАТТСААТТСАСАТТСС. 8ЕО ГО Ν0: 6).
Скрининг инсерционного вектора для делеции Е, содержащего ген РгМ серотипа 4 вируса Денге, проводили с использованием праймеров οΒΝ210 (АТСССАТТССТСААТСТССТСТТАААССТАСТС АССССТТСТСТ ССТСТСССТТСТССССТСТСССТССАТСТСССАТАС. 8ЕО ГО Ν0: 7) и оΒN478 (СТАСАТССАТСАТАТАСАТАТС. 8ЕС ГО Ν0: 8).
Эксперименты ПЦР осуществляли в термоциклере СеηеАтρ 9700 (Регкт Е1тег), используя набор с ДНК-полимеразой Тад, содержащий 10хПЦР-буфер, МдС12-буфер и ДНК-полимеразу Тад (Воске, № в каталоге 201205) или эквивалент. В общем, реакции ПЦР готовили в общем объеме реакции 50 мкл, содержащем 45 мкл основной смеси, образец ДНК и άάΗ20 до нужного объема. Основную смесь необходимо приготовить с использованием 30,75 мкл ΌάΗ20, 5 мкл 10хбуфера, 1 мкл смести бПГР (10 мМ каждого), 2,5 мкл каждого праймера (5 пмоль/мкл), 3 мкл МдС12 (25 мМ) и 0,25 мкл Тад-полимеразы (5и/мкл).
Амплификацию осуществляли, используя следующую программу:
1) Денатурация: 4 мин 94 °С
2) 30 циклов:
Денатурация: 30 сек 94°С
Отжиг: 30 сек 55°С
Элонгация: 1-3 мин 72°С
3) Элонгация: 7 мин 72°С
4) Хранение: 4°С
На основании размера встраиваемого гена время элонгации должно составлять по меньшей мере 1 мин/т. о.
Результаты ПЦР, показанные на фиг. 10, свидетельствуют о специфичности комбинаций праймеров, используемых для отдельных инсерций.
Комбинация праймеров οΒΝ194/οΒΝ476 специфична для делеции 2 и РгМ1 в качестве вставки. Ожидаемый фрагмент ПЦР плазмиды ρΒΝ49 имеет размер 678 п.о. (показан на дорожке 3, верхняя часть геля).
Комбинация праймеров οΒΝ255/οΒΝ479 специфична для межгенной области 14Ь и РгМ3 в качестве вставки. Ожидаемый фрагмент ПЦР плазмиды ρΒΝ50 имеет размер 825 п.о. (показан на дорожке 9, верхняя часть геля).
Комбинация праймеров οΒΝ210/οΒΝ478 специфична для делеции Е и РгМ4 в качестве вставки. Ожидаемый фрагмент ПЦР плазмиды ρΒΝ40 имеет размер 607 п.о. (показан на дорожке 5, нижняя часть геля).
Комбинация праймеров οΒΝ93/οΒΝ477 специфичная для делеции А и РгМ2 в качестве вставки. Ожидаемый фрагмент ПЦР плазмиды ρΒΝ39 имеет размер 636 п. о. (показан на дорожке 11, нижняя часть геля).
Образование рекомбинанта МУА посредством гомологичной рекомбинации.
Для экспрессии чужеродных генов рекомбинантным МУА указанные гены должны быть встроены в вирусный геном посредством процесса, называемого гомологичной рекомбинацией. С этой целью представляющий интерес чужеродный ген клонировали в инсерционном векторе как описано выше. Ука
- 10 012160 занный вектор должен быть трансфицирован после инфекции клеток ΜνΑ-ΒΝ. Рекомбинация будет происходить в клеточной цитоплазме инфицированных и трансфицированных клеток. С помощью селектируемой и/или репортерной кассеты, которая также находится в инсерциэнном векторе, идентифицируют и выделяют клетки, содержащие рекомбинантные вирусы.
Гомологичная рекомбинация.
Для гомологичной рекомбинации клетки ВНК (клетки почки сирийского хомячка) или клетки СЕР (первичные фибробласты куриных эмбрионов) высевают в 6-луночные планшеты, используя ΌΜΕΜ (модифицированная Дюльбекко среда Игла, С1Ьсо ВНЬ) + 10% фетальной сыворотки теленка (РС8) или νΡ-δΡΜ (С1Ьсо ВНЬ) + 4 ммоль/1 л Ь-глутамина в случае способа получения без сыворотки.
Клетки должны быть все еще в фазе роста и поэтому должны достигать 60-80% слияния в день трансфекции. Клетки перед посевом подсчитывали, так как для инфекции необходимо знать количество клеток для определения множественности инфекции (шо1).
Для инфекции исходную культуру ΜνΑ разбавляют в ^ΜΕΜ/ΡСδ или νΡ-δΡΜ/Ь-глутамин так, чтобы 500 мкл разбавления содержали соответствующее количество вируса, которое даст шо1, равное 0,01. Предполагается, что клетки делятся один раз после посева. Среду удаляют из клеток и клетки инфицируют 500 мкл разбавленного вируса в течение 1 ч на качалке при комнатной температуре. Инокулят удаляют и клетки промывают ΌΜΕΜ/νΡ-8ΡΜ. Инфицированные клетки оставляют в 1,6 мл ^ΜΕΜ/ΡСδ и νΡ-δΡΜ/Ε-глутамин, соответственно, пока готовят реакцию трансфекции (набор 01адеп Ейес1епе).
Для трансфекции используют набор для трансфекции «Ейес1епе» (01адеп). Смесь для трансфекции готовят из 1-5 мкг линеаризованного инсерционного вектора (общее количество для множественной трансфекции) с буфером ЕС, получая конечный объем 150 мкл. Добавляют 8,0 мкл усилителя на мкг ДНК, встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем после встряхивания пробирки с исходной культурой добавляют 25 мкл Ейес1епе на мкг ДНК и раствор тщательно перемешивают с помощью встряхивания и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавляют 600 мкл ^ΜΕΜ/ΡСδ и νΡ-δΡΜ/Ь-глутамин, соответственно, смешивают и затем полную смесь для трансфекции добавляют к клеткам, которые уже покрыты средой. Чашку осторожно встряхивают, чтобы перемешать реакционную смесь для трансфекции. Инкубация происходит при 37°С с 5% СО2 в течение ночи. На следующий день среду удаляют и заменяют свежей ^ΜΕΜ/ΡСδ или νΡ-δΡΜ/Ь-глутамин. Инкубацию продолжают вплоть до 3 дня.
Для сбора клетки соскабливают в среду, затем суспензию клеток переносят в подходящую пробирку и замораживают при -20°С для кратковременного хранения или при -80°С для длительного хранения.
Инсерция ΡτΜ4 в ΜνΑ.
В первом раунде клетки инфицировали ΜνΑ-ΒΝ согласно описанному выше протоколу и кроме того трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ40, содержащим ген ΡτΜ вируса Денге серотипа 4 и в качестве репортерного гена ген ΕСΡΡ. Так как трансфицированный вектор содержит репортерный ген ΕСΡΡ, в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, может быть зарегистрирован синтезированный белок самое позднее на третий день. Полученные в результате рекомбинантные вирусы необходимо очистить с помощью очистки бляшек.
Для очистки бляшек инфицированные клетки (флуоресцирующие или окрашенные) выделяют кончиком пипетки, ресуспендируют и отсасывают в 200 мкл ΡΒδ или среды. Затем свежую культуру в чашке, содержащей примерно 10Е6 клеток, инфицируют 100 мкл ресуспендированных бляшек. Через 48 ч клетки собирают в 300 мкл ΡΒδ. Из суспензии экстрагируют ДНК и проводят скрининг с помощью ПЦРанализа. Отбирают клон, в котором наблюдаются ожидаемые полосы, и свежие, 6-луночные планшеты инфицируют разными количествами данного вируса. Покрывание лунок 1% агарозой предотвращает дальнейшее распространение вируса. Через 48 ч выделяют инфицированные клетки, содержащие рекомбинантный вирусный клон.
Указанную процедуру повторяют вплоть до того момента, когда невозможно обнаружить ΜνΑ-ΒΝ дикого типа в анализе ПЦР.
Через 4 раунда очистки бляшек рекомбинантные вирусы, ΜνΑ-ΡτΜ4, идентифицировали ПЦРанализом, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих ожидаемую инсерцию ^ΒΝ210 и оΒN478, которые описаны выше) и в качестве контроля пару праймеров, специфично узнающих место инсерции делецию Е (θΒΝ453 : 6ΤΤ6ΑΑ66ΑΤΤСΑСΤΤСС6Τ66Α, δΙΓ) ΙΌ ΝΟ: 9 и оΒN454: 6СΑΤΤСΑСΑСΑΤΤСΤΑΤΤСΤСΑСΤС, δΙΓ) ΙΌ ΝΟ: 10).
Инсерция ΡτΜ2 в ΜνΑ-ΡτΜ4.
Клетки, инфицированные ΜνΑ-ΡτΜ4 согласно описанному выше протоколу, кроме того трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ39, содержащим ген ΡτΜ вируса Денге серотипа 2 и в качестве селектируемого гена ΝΡΤ II, ген резистентности к неомицину. Для очистки рекомбинантного ΜνΑ, экспрессирующего ген резистентности к антибиотику, рекомендованы три раунда амплификации вируса в условиях селекции перед очисткой бляшек. Для селекции в отношении неомицинфосфотрансферазы в среду добавляют С418. С418 является производным неомицина и ингибирует биосинтез белка, препятствуя действию рибосом. Активность гена ΝΡΤ инактивирует С418 посредством фосфорилирования.
- 11 012160
После 16 раундов очистки бляшек в условиях селекции неомицином идентифицировали рекомбинантные вирусы, МУА-РгМ4/РгМ2, с помощью ПЦР-анализов, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих ожидаемую инсерцию (οΒΝ93 и ΟΒΝ477, которые описаны выше) и в качестве контроля пару праймеров, специфично узнающих место инсерции делецию А (οΒΝ477: который описан выше) и оВ№52: СТТТСАТСАСАААТСАСТССАТСААА, 5ЕО ГО N0: 11). Кроме того, также подтверждают инсерцию РгМ4 в делецию Е с помощью пар праймеров: оВ№10-оВШ78 и οΒΝ453-οΒΝ454.
Инсерция РгМ1 в МУА.
В первом раунде клетки инфицировали МУА-ΒΝ согласно описанному выше протоколу и, кроме того, трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ49, содержащим ген РгМ вируса Денге серотипа 1 и в качестве репортерного гена йЫр, ген гуманизированного белка с голубой флуоресценцией.
Синтезированный белок ЙЫр выявляется на третий день в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом. Полученные в результате рекомбинантные вирусы очищали с помощью очистки бляшек.
После 10 раундов очистки бляшек рекомбинантные вирусы МУА-РгМ1 идентифицировали с помощью ПЦР-анализов, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих ожидаемую инсерцию (οΒΝ194 и οΒΝ476, которые описаны выше), и в качестве контроля пару праймеров, специфично узнающих место инсерции делецию 2 (οΒΝ54: СССССТАССССАССААСААССААСТСТАССАСАСССАТС, 5ЕО ГО Ν0: 12 и оΒN56: ААСТССАСТТСТТССТАТСТСАТАААТТСТТТААТТАТ, 5ЕО ГО Ν0: 13).
Инсерция РгМЗ в МУА.
В первом раунде клетки инфицировали МУА-ΒΝ согласно описанному выше протоколу и кроме того трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ50, содержащим ген РгМ вируса Денге серотипа 3 и в качестве репортерного гена ген Е^др! (Е^др! или укороченно др! означает ген фосфорибозилтрансферазы). Полученные в результате рекомбинантные вирусы очищали 3 раундами очистки бляшек в условиях селекции в отношении метаболизма с участием фосфорибозилтрансферазы путем добавления микофенольной кислоты, ксантина и гипоксантина. Микофенольная кислота (МРА) ингибирует инозинмонофосфатдегидрогеназу и приводит к блокированию синтеза пуринов и ингибированию репликации вирусов в большинстве клеточных линий. Указанное блокирование может быть преодолено в результате экспрессии Еотдр! с конститутивного промотора и обеспечения субстратами, ксантином и гипоксантином.
Полученные в результате рекомбинантные вирусы МУА-РгМ3 идентифицировали с помощью ПЦРанализов, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих ожидаемую инсерцию (οΒΝ255 и 0ΒΝ479, которые описаны выше), и в качестве контроля пару праймеров, специфично узнающих место инсерции 14Ь (οΒΝ4 99: СААСТСТСТТСТТСАТТАСС, 5ЕС ГО Ν0: 14 и οΒΝ500: ССАТСАААСТ СААТСТАТС, 5ЕЕ) ГО Ν0: 15).
Совместная инфекция МУА-РгМ1 и МУА-РгМ3.
Клетки инфицировали равными количествами МУА-РгМ1 и МУА-РгМ3 согласно описанному выше протоколу. После 3 раундов очистки бляшек в условиях селекции в отношении метаболизма с участием фосфорибозилтрансферазы клоны рекомбинантных вирусов с голубой флуоресценцией анализировали с помощью ПЦР, используя пары праймеров ^ΒΝ255 и οΒΝ479, οΒΝ499 и оΒN500, οΒΝ194 и оΒN476, οΒΝ54 и 0ΒΝ56, которые описаны выше). Полученные в результате рекомбинантные вирусы названы МУА-РгМ1/РгМ3.
Совместная инфекция МУА-РгМ1/РгМ3 и МУА-РгМ2/РгМ4.
Клетки инфицировали равными количествами МУА-РгМ1/РгМ3 и МУА-РгМ2/РгМ4 согласно описанному выше протоколу. Очистку бляшек осуществляли в условиях селекции в отношении метаболизма с участием фосфорибозилтрансферазы и селекции неомицином. Выделяли рекомбинантные вирусы, индуцирующие зеленую и голубую флуоресценцию, и анализировали с помощью ПЦР, используя пары праймеров (οΒΝ255 и οΒΝ479, оΒN499 и οΒΝ500, оΒN194 и οΒΝ476, оΒN54 и оΒN56, оΒN93 и оΒN477, оΒN477 и оΒN452, оΒN210 и оΒN478, оΒN453 и оΒN454, которые описаны выше).
ПЦР-анализ рекомбинантного вируса (клон 20), содержащего все четыре гена РгМ, показан на фиг. 11. В то время как в верхней части геля показаны результаты разных ПЦР рекомбинантного вируса, в нижней части представлены результаты тех же самых реакций ПЦР контрольных плазмид (которые указаны). На дорожках 1, 10 и 11 показаны молекулярные маркеры 1 т.п.о. и 100 п.о.
Комбинация праймеров οΒΝ210/οΒΝ478 специфична для делеции Е и РгМ4 в качестве вставки. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса и плазмиды ρΒΝ40 имеет размер 607 п. о. (показан на дорожке 2).
Комбинация праймеров οΒΝ453/οΒΝ454 специфична для делеции Е. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса составляет 2,7 т.п.о, ожидаемая полоса вируса дикого типа составляет 2,3 т.п.о. (показано на дорожке 3). Также в верхней части геля можно идентифицировать полосу, специфичную для вируса дикого типа. Это означает, что препарат рекомбинантного вируса еще не полностью освобожден от вируса дикого типа. Необходима дальнейшая очистка бляшек.
Комбинация праймеров οΒΝ93/οΒΝ477 специфична для делеции А и РгМ2 в качестве вставки. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса и плазмиды ρΒΝ39 имеет размер 636 п. о. (показан на дорожке 4).
Комбинация праймеров οΒΝ477/οΒΝ452 специфична для делеции А. Ожидаемый ПЦР-фрагмент
- 12 012160 рекомбинантного вируса составляет 4,1 т.п.о., ожидаемая полоса вируса дикого типа - 2,7 т.п.о. (показано на дорожке 5). В верхней части геля может быть идентифицирована полоса вируса дикого типа.
Комбинация праймеров οΒΝ255/οΒΝ479 специфична для межгенной области 14Ь и РгМ3 в качестве вставки. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса и плазмиды ρΒΝ50 имеет размер 82 5 п.о. (показан на дорожке 6).
Комбинация праймеров οΒΝ499/οΒΝ500 специфична для межгенной области 14Ь. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса составляет 1,0 т.п.о., ожидаемая полоса вируса дикого типа - 0,3 т.п.о. (показано на дорожке 7).
Комбинация праймеров οΒΝ194/οΒΝ476 специфична для делеции 2 и РгМ1 в качестве вставки. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса и плазмиды ρΒΝ49 имеет размер 678 п. о. (показан на дорожке 8).
Комбинация праймеров οΒΝ54/οΒΝ56 специфична для делеции 2. Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса составляет 1,6 т.п.о., ожидаемая полоса вируса дикого типа - 0,9 т.п.о. (показаны на дорожке 9). В верхней части геля может быть идентифицирована полоса, специфичная для вируса дикого типа.
Альтернативно можно получить 4 разных вируса, клетки инфицировать совместно всеми четырьмя вирусами и провести скрининг в отношении рекомбинанта.
Усовершенствования могут быть достигнуты с помощью рекомбинантных векторов, которые содержат дополнительные маркеры для селекции или маркеры резистентности.
Пример 2. Инсерционные векторы.
Рекомбинантный вектор для межгенной области 136-137 (ЮК 136-137).
Для инсерции экзогенных последовательностей в геном МУА в так называемую межгенную область (ЮК) 136-137, соответствующую положению генома 129.940, конструировали плазмидный вектор, который содержит примерно 600 п. о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к сайту инсерции. Чтобы выделить фланкирующие последовательности из геномной ДНК МУА-ΒΝ могут быть разработаны подходящие праймеры ПЦР. Такие праймеры содержат удлинения с соответствующими сайтами для ферментов рестрикции, которые будут использованы для клонирования фланкирующих последовательностей в векторной плазмиде. Между указанными фланкирующими последовательностями вводят кассету селектируемого гена, например, гена ΝΡΤ II (резистентности к неомицину), под транскрипционным контролем промотора поксвируса (Р). Кроме того имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или экзогенных последовательностей, которые необходимо встроить в ЮК 136-137 (Рай). Одна из таких конструкций вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 12 (ρΒΝΧ67).
Рекомбинантный вектор для межгенной области 07-08 (ЮК 07-08).
Для инсерции экзогенных последовательностей в геном МУ7А в межгенную область (ЮК) 07-08, соответствующую положению генома 12.800, конструировали плазмидный вектор, который содержит примерно 600 п. о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к сайту инсерции. Чтобы выделить фланкирующие последовательности из геномной ДНК МУА-ΒΝ можно сконструировать подходящие ПЦР-праймеры. Такие праймеры содержат удлинения с сайтами для ферментов рестрикции, которые будут использованы для клонирования фланкирующих последовательностей в векторной плазмиде. Между указанными фланкирующими последовательностями вводят кассету селектируемого гена, например, гена ΕοοβρΙ (гуанинфосфорибозилтрансфераза), под транскрипционным контролем промотора поксвируса (Р). Кроме того имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или экзогенных последовательностей, которые необходимо встроить в ЮК 07-08 (Рай). Одна из таких конструкций вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 13 (ρΒΝΧ88).
Рекомбинантный вектор для межгенной области 44-45 (ЮК 44-45).
Для инсерции экзогенных последовательностей в геном МУА в межгенную область (ЮК) 44-45, соответствующую положению генома 37.330, конструировали плазмидный вектор, который содержит примерно 600 п.о. фланкирующих последовательностей, прилежащих к сайту инсерции. Чтобы выделить фланкирующие последовательности из геномной ДНК МУА-ΒΝ могут быть разработаны подходящие праймеры ПЦР. Такие праймеры содержат удлинения с соответствующими сайтами для ферментов рестрикции, которые будут использованы для клонирования фланкирующих последовательностей в векторной плазмиде. Между указанными фланкирующими последовательностями вводят кассету селектируемого гена, например, гена Ν₽Τ II (резистентности к неомицину), под транскрипционным контролем промотора поксвируса (Р). Кроме того имеется сайт клонирования для встраивания дополнительных генов или экзогенных последовательностей, которые необходимо встроить в ЮК 44-45 (Рай). Одна из таких конструкций вектора согласно данному изобретению изображена на фиг. 14 (ρΒΝΧ87).
Конструирование рекомбинантного поксвируса, содержащего несколько гомологичных генов, интегрированных в его геном.
Инсерционные векторы.
Для инсерции трех генов РгМ серотипа 2, 3 и 4 вируса Денге в геном МУА использовали три независимых рекомбинантных вектора.
- 13 012160
Указанные векторы содержат - как подробно описано выше - последовательности, гомологичные геному МVΑ, для целенаправленного встраивания посредством гомологичной рекомбинацил. Кроме того каждый вектор содержит кассету селектируемого или репортерного гена.
Последовательности РгМ трех серотипов вируса Денге получали путем синтеза как описано в примере 1.
В результате конструкция инсерционного вектора для ЮК 136-137 содержала РгМ серотипа 4 вируса Денге 4 (фиг. 15 -ρΒΝ27). Конструкция инсерционного вектора для ЮК 07-08 содержала РгМ серотипа 2 вируса Денге (фиг. 16 - ρΒΝ34) и конструкция инсерционного вектора для ЮК 4 4-45 содержала РгМ серотипа 3 вируса Денге (фиг. 17 - ρΒΝ47).
Образование рекомбинантного МVΑ посредством гомологичной рекомбинации.
Образование рекомбинантного МVΑ посредством гомологичной рекомбинации осуществляли как описано в примере 1. Сайты инсерции для РгМ4, РгМ3 и РгМ 2 в геноме МVΑ изображены на фиг. 18.
Инсерция РгМ 4 в МVΑ.
В первом раунде клетки инфицировали МVΑ-ΒN согласно описанному выше протоколу и, кроме того, трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ27, содержащим ген РгМ вируса Денге серотипа 4 и в качестве репортерного гена ген ЕСРЕ. Так как трансфицированный вектор содержит репортерный ген ЕСРР, в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, может быть зарегистрирован синтезированный белок самое позднее на третий день. Полученные в результате рекомбинантные вирусы должны быть очищены с помощью очистки бляшек, как описано в примере 1. После 4 раундов очистки бляшек рекомбинантные вирусы, МVΑ-Р^М4, идентифицировали ПЦР-анализом, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих сайт инсерции ЮК136-137 ^ΒΝ1008: да!ассда!сасдйс1а. 8ЕО ΙΌ N0: 16; и оВМ1009 дда1а!дайа!д1адад. 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 17).
Инсерция РгМ 2 в МVΑ.
Клетки инфицировали МVΑ-Р^М4 согласно описанному выше протоколу и кроме того трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ34, содержащим ген РгМ серотипа 2 вируса Денге и в качестве репортерного гена ген ΒΕР. Так как трансфицированный вектор содержит репортерный ген ΒΕР, в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, может быть зарегистрирован синтезированный белок самое позднее на третий день. Полученные в результате рекомбинантные вирусы должны быть очищены с помощью очистки бляшек, как описано в примере 1. После шести раундов очистки бляшек рекомбинантный вирус, МVΑ-Р^М4+Р^М2, далее пересевали и амплифицировали и готовили неочищенную культуру. Рекомбинант идентифицировали ПЦР-анализами, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих сайт инсерции ЮК07-08 (οΒΝ 903: с!дда1ааа1асдаддасд!д. 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 18; и оΒN904: дасаайа!ссдасдсассд; 8Е0 ΙΌ Ν0: 19).
Инсерция РгМ3 в МVΑ
Клетки инфицировали МVΑ-Р^М2+4 согласно описанному выше протоколу и кроме того трансфицировали инсерционным вектором ρΒΝ47, содержащим ген РгМ серотипа 3 вируса Денге и в качестве репортерного гена ген ЕСЕР. Так как трансфицированный вектор содержит рэпортерный ген ЕСЕР, в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, может быть зарегистрирован синтезированный белок самое позднее на третий день. Полученные в результате рекомбинантные вирусы должны быть очищены с помощью очистки бляшек, как описано в примере 1. После трех раундов очлстки бляшек рекомбинантный вирус, МVΑ-Р^М4+3+2 идентифицировали ПЦР-анализами, используя пару праймеров, избирательно амплифицирующих сайт инсерции 1СК44-45 (οΒΝ904: сдйадасаасасассдасда!дд. 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 20; и οΒΝ905 сдда!даааааШйддаад. 8ЕЦ ΙΌ Ν0: 21).
ПЦР-анализ рекомбинантного вируса, содержащего три гена РгМ вируса Денге, показан на фиг. 19. Эксперименты ПЦР осуществляли как описано в примере 1. Комбинация праймеров оΒN1008 и 0ΒΝ1009 специфична для ЮК136-137, которая содержит инсерцию РгМ4 (фиг. 19, нижняя панель). Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса имеет размер 1 т.п.о. (показан на дорожках 4, 5 и 6) так же как позитивного плазмидного контроля (дорожка 8). Контроль пустого вектора, не имеющего РгМ4, показывает ожидаемый фрагмент 190 п.о. (дорожка 2). На дорожке М показан маркер молекулярной массы, а дорожки 1, 3 и 7 являются пустыми. Комбинация праймеров оΒN902 и оΒN903 специфична для ЮК07-08, которая содержит инсерцию РгМ2 (фиг. 19, верхняя панель). Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса имеет размер 960 п. о. (показан на дорожках 4-6) так же как позитивного плазмидного контроля (дорожка 8). Контроль пустого вектора, не имеющего РгМ, показывает ожидаемый фрагмент 190 п.о. (дорожка 2). Комбинация праймеров οΒΝ904 и оΒN905 специфична для ЮК44-45, который содержит инсерцию РгМ3 (фиг. 19, средняя панель). Ожидаемый ПЦР-фрагмент рекомбинантного вируса имеет размер 932 п.о. (показан на дорожках 4-6), так же как позитивного плазмидного контроля (дорожка 8). Контроль пустого вектора, не содержащего РгМ 2, показывает ожидаемый фрагмент 185 п.о. (дорожка 2).
- 14 012160
Список последовательностей <110> Вауапап Ыогсйс А/3 <12О> Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном <130> ΒΝ 46 РСТ <160> 21 <170 Патент, версия 3.1 <210 1 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Праймер <400 1 сдсдда!сса 1дс(дааса1 сйдаасадд адасдсада 39 <210>2 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер
О са1да!аада дайд(аНса д 21 <210> 3 <211>80 <212> ДНК <213> Искусственная <220* <223> Праймер <400> 3 а!дйдааса 1аа(даасад даддаааада 1с1д1дасса 1дс1сс1са1 дс(дс!дссс 60 асадссс(дд сдйсса1с180 <210> 4 <211>26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400>4 даййдс1а йсад!ддас 1дда1д 26 <210>5 <211> 48 <212>ДНК <213> Искусственная
- 15 012160 <220 <223> Праймер <400 5 ссйаа1сда а11с1са1д1 са1дда1ддд д1аассадса Каа(ад1 48 <210>6 <211>22 <212>ДНК <213> Искусственная <220 <223> Праймер <400> 6 дйсссайс аайсасай дд 22 <210 7 <211 >80 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400>7 а1сссаНсс 1даа1д1дд1 дНааадс!а йдадсдсй с1с1сд1с1с сдйс1ссдс 60
1с(ддд1дса (д(ссса(ас 80 <210 8 <211>22 <212> ДНК <213> Искусственная <220 <223> Праймер <400> 8 д(аса(дда1 да(а1ада1а 1д 22 <210> 9 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 9 дЕдаадда! (сасйссдг дда 23 <210> 10 <211 >25 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 10 дсайсасад айс(айд1 дад(с 25
- 16 012160 <210> 11 <211 >26 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 11 дЖсаШад ааа!дас1сс а1дааа 26 <210> 12 <211 >39 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 12 сдддд(ассс дасдаасаад даас1д(ад! ададдса1с 39 <210> 13 <211 >38 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 13 аас1дсадН дПсд1а(д1 са1аааНс1 МааНа1 38 <210> 14 <211 >20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 14 саас!с(сН сПдаПасс 20 <210> 15 <211> 19 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 15 сда1сааад1 саа1с1а1д 19 <210> 16 <211> 18 <212>ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер
- 17 012160 <400> 16 да!ассда!с асдНс!а 18 <210> 17 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 17 дда(а!дай а(д!адад 18 <210> 18 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 18 с!дда!ааа! асдаддасд! д 21 <210> 19 <211 >20 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 19 дасаайа!с сдасдсассд 20 <210> 20 <211 >24 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 20 сдйадасаа сасассдасд а1дд 24 <210> 21 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<223> Праймер <400> 21 сдда!даааа айШддаа д 21
- 18 012160

Claims (27)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Рекомбинантный поксвирус, используемый для воздействия на иммунный ответ, предпочтительно на его индуцирование у животного, включая человека, содержащий по меньшей мере два гомологичных чужеродных гена с гомологией, составляющей по меньшей мере 50%, в котором каждый из указанных генов встроен в отдельный сайт инсерции вирусного генома.
  2. 2. Рекомбинантный поксвирус по п.1, в котором указанные гены имеют гомологию, составляющую по меньшей мере 60%.
  3. 3. Рекомбинантный поксвирус по п.2, в котором указанные гены имеют гомологию 65-75%.
  4. 4. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-3, в котором указанные гены получены из флавивируса.
  5. 5. Рекомбинантный поксвирус по п.4, где флавивирусом является вирус Денге.
  6. 6. Рекомбинантный поксвирус по п.4 или 5, в котором указанные гены получены по меньшей мере из двух разных серотипов вируса.
  7. 7. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.4-6, в котором указанные гены представляют собой по меньшей мере два гена РгМ.
  8. 8. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.4-7, в котором указанные гены представляют собой четыре гена РгМ.
  9. 9. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-8, полученный на основе вируса осповакцины.
  10. 10. Рекомбинантный поксвирус по п.9, где вирус осповакцины представляет собой модифицированный вирус осповакцины Анкара (МУА).
  11. 11. Рекомбинантный поксвирус по п.10, где модифицированный вирус осповакцины Анкара представляет собой вирус МУА-ΒΝ ЕСАСС У00083008.
  12. 12. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-11, который является дефицитным или некомпетентным по репликации в клетках млекопитающих, включая клетки человека.
  13. 13. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-12, в котором указанные гены встроены в природный сайт делеции и/или в межгенную область поксвирусного генома.
  14. 14. Рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-13, представляющий собой соответствующее лекарственное средство или вакцину.
  15. 15. Вакцина для воздействия на иммунный ответ, предпочтительно на его индуцирование у животного, включая человека, содержащая рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-13.
  16. 16. Фармацевтическая композиция для воздействия на иммунный ответ, предпочтительно на его индуцирование у животного, включая человека, содержащая рекомбинантный поксвирус по любому из пп.1-13 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, адъювант и/или добавку.
  17. 17. Применение рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13 для приготовления лекарственного средства для воздействия на иммунный ответ, предпочтительно на его индуцирование у животного, включая человека.
  18. 18. Способ воздействия на иммунный ответ, предпочтительно на его индуцирование у животного, включая человека, предусматривающий введение терапевтически эффективного количества рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13, вакцины по п.15 или композиции по п.16 животному или человеку, подлежащему лечению.
  19. 19. Эукариотическая клетка, содержащая рекомбинантный поксвирус по пп.1-13.
  20. 20. Способ получения рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13, предусматривающий стадии инфицирования клетки поксвирусом;
    трансфекции инфицированной клетки первой векторной конструкцией, содержащей ген, являющийся гетерологичным по отношению к поксвирусному геному, и геномную последовательность поксвируса, способную направлять интеграцию гетерологичного гена в сайт инсерции поксвирусного генома;
    идентификации, выделения и необязательно очистки образованного рекомбинантного поксвируса;
    повторения указанных выше стадий с использованием рекомбинантного поксвируса, полученного на предыдущих стадиях, для инфекции клетки и дополнительной конструкции вектора, содержащей следующий ген, являющийся гетерологичным по отношению к поксвирусному геному и гомологичным по отношению к гену первой конструкции вектора.
  21. 21. Набор для получения рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13, содержащий две или более векторных конструкций, причем каждая конструкция содержит ген под транскрипционным контролем элемента регуляции экспрессии поксвируса, где гены, включенные в разные векторы, являются гомологичными генами с гомологией, составляющей по меньшей мере 50%, и где каждый ген фланкирован последовательностью ДНК поксвируса, способной направлять интеграцию гена в один поксвирусный геном, и средства для идентификации и/или селекции рекомбинантных поксвирусов, которые включили указанные гомологичные гены в свой геном.
    - 19 012160
  22. 22. Набор по п.21, где каждый гомологичный ген фланкирован последовательностью ДНК поксвируса, способной направлять интеграцию указанного гомологичного гена каждой конструкции вектора в особый сайт инсерции поксвирусного генома.
  23. 23. Последовательность ДНК генома рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13 или последовательность ДНК, гомологичная ей.
  24. 24. Способ выявления клетки, инфицированной рекомбинантным поксвирусом по любому из пп.113, причем указанный способ предусматривает стадии:
    а) контактирования клетки с ДНК-праймерами, селективно амплифицирующими чужеродные гены;
    Ы) определения того, произошла ли гибридизация между ДНК-праймером и ДНК рекомбинантного поксвируса, находящегося в клетке; и
    с) определения присутствия рекомбинантного поксвируса в клетке на основании информации, полученной на стадии Ы).
  25. 25. Способ по п.24, в котором обеспечивают контактирование клетки в дополнение или в качестве альтернативы стадии а) с ДНК-праймерами, селективно связывающимися с фланкирующими последовательностями по отношению к сайтам инсерции чужеродных генов.
  26. 26. Способ идентификации рекомбинантного поксвируса по любому из пп.1-13 в образце, причем указанный способ предусматривает стадии:
    а) контактирования образца с ДНК-праймерами, селективно амплифицирующими чужеродные гены;
    Ы) определения того, произошла ли гибридизация между ДНК-праймером и ДНК в рекомбинантном поксвирусе в образце; и
    с) определения присутствия рекомбинантного поксвируса в образце на основании информации, полученной на стадии Ы).
  27. 27. Способ по п.26, в котором обеспечивают контактирование образца в дополнение или в качестве альтернативы стадии а) с ДНК-праймерами, селективно связывающимися с фланкирующими последовательностями по отношению к сайтам инсерции чужеродных генов.
EA200401506A 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение EA012160B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200752 2002-05-16
DKPA200200753 2002-05-16
PCT/EP2003/005047 WO2003097846A1 (en) 2002-05-16 2003-05-14 Recombinant poxvirus expressing homologous genes inserted into the poxviral genome

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200401506A1 EA200401506A1 (ru) 2005-04-28
EA012160B1 true EA012160B1 (ru) 2009-08-28

Family

ID=29551228

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401507A EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
EA200900180A EA020230B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение
EA200401506A EA012160B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200401507A EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
EA200900180A EA020230B1 (ru) 2002-05-16 2003-05-14 Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины анкара (mva), экспрессирующий гомологичные последовательности, встроенные в поксвирусный геном, и его применение

Country Status (23)

Country Link
US (14) US7338662B2 (ru)
EP (3) EP1407033B1 (ru)
JP (4) JP4895505B2 (ru)
KR (4) KR101005630B1 (ru)
CN (6) CN102703393A (ru)
AT (1) ATE315660T1 (ru)
AU (4) AU2003236646B2 (ru)
BR (2) BR0310051A (ru)
CA (3) CA2481521C (ru)
DE (1) DE60303218T2 (ru)
DK (2) DK1506301T3 (ru)
EA (3) EA007811B1 (ru)
ES (1) ES2256776T3 (ru)
HK (2) HK1076642A1 (ru)
IL (4) IL164172A0 (ru)
MX (2) MXPA04011194A (ru)
NO (3) NO334273B1 (ru)
NZ (2) NZ536502A (ru)
PL (2) PL218318B1 (ru)
PT (1) PT1407033E (ru)
SI (1) SI1407033T1 (ru)
UA (1) UA82479C2 (ru)
WO (2) WO2003097845A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2662927C2 (ru) * 2013-03-15 2018-07-31 Симентис Лимитед Иммунная модуляция

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4101327C1 (ru) * 1991-01-18 1991-10-24 Mercedes-Benz Aktiengesellschaft, 7000 Stuttgart, De
WO2004022729A1 (en) * 2002-09-05 2004-03-18 Bavarian Nordic A/S Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions
EE05680B1 (et) * 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
AU2003239805B2 (en) * 2002-04-19 2009-09-10 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
JP4895505B2 (ja) * 2002-05-16 2012-03-14 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
AU2004291024B2 (en) * 2003-02-20 2009-09-17 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Novel insertion sites in pox vectors
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
WO2006052826A2 (en) * 2004-11-05 2006-05-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Methods for preparing cells and viruses
AU2006218115B2 (en) * 2005-02-23 2012-08-02 Bavarian Nordic A/S Use of a modified poxvirus for the rapid induction of immunity against a poxvirus or other infectious agents
JP5424871B2 (ja) * 2006-05-19 2014-02-26 グライコフィ， インコーポレイテッド 組換えベクター
CN106148288A (zh) * 2006-08-25 2016-11-23 美国国有健康与人类服务部(马里兰州) 重组修饰的安卡拉痘苗病毒及其应用、质粒载体及其应用
US8052968B2 (en) 2006-10-16 2011-11-08 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in diagnostic and therapeutic methods
US8440202B2 (en) * 2006-11-09 2013-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
US8241638B2 (en) * 2006-11-09 2012-08-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
CN101617052A (zh) * 2007-01-30 2009-12-30 特兰斯吉恩股份有限公司 用于免疫的乳头瘤病毒e2多肽
US8268327B2 (en) 2007-04-27 2012-09-18 Bavarian Nordic A/S Immediate protection against pathogens via MVA
JP5474767B2 (ja) * 2007-05-15 2014-04-16 トランジェーヌ、ソシエテ、アノニム 多重遺伝子発現のためのベクター
TW200907058A (en) * 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
WO2008150404A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Wyeth Raccoon poxvirus expressing genes of feline antigens
NZ601827A (en) * 2007-10-18 2014-01-31 Bavarian Nordic Inc Use of mva to treat prostate cancer
EP2303322A1 (en) * 2008-06-20 2011-04-06 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
KR100894430B1 (ko) * 2008-11-11 2009-04-22 시스템디엔디(주) 초음파, 음향 및 온도변화를 이용한 밸브의 유체누설 측정장치 및 이를 이용한 유체누설 측정방법
CA2742247C (en) * 2008-11-21 2017-07-04 Bavarian Nordic A/S Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences
AU2010305030A1 (en) 2009-10-08 2012-05-10 Bavarian Nordic A/S Generation of a broad T-cell response in humans against HIV
CA2777744C (en) 2009-10-16 2019-09-24 Bernard Moss Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites
US20110159031A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Baxter International Inc. Vaccine to Influenza A Virus
EP2552490A4 (en) * 2010-03-26 2013-12-18 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc INFLUENZA MATRIX 2 PROTEIN ECKTOMOMAS, EXPRESSION SYSTEM THEREFOR AND USES THEREOF
CA2802430C (en) 2010-07-20 2021-07-20 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting poxvirus
US20120328649A1 (en) * 2010-09-23 2012-12-27 Baxter Healthcare S.A. Recombinant Viral Vectors and Methods for Inducing an Immune Response to Yellow Fever Virus
JP5933565B2 (ja) * 2010-10-15 2016-06-15 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラインフルエンザワクチン
EA201301173A1 (ru) 2011-04-15 2015-08-31 Дженелюкс Корпорейшн Клональные штаммы аттенуированных вакцинирующих вирусов и способы их использования
WO2013083254A1 (en) 2011-12-09 2013-06-13 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
CA2875683A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 The Australian National University Vaccination with interleukin-4 antagonists
EP3656396A1 (en) 2012-08-01 2020-05-27 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
US20140140959A1 (en) 2012-10-05 2014-05-22 Aladar A. Szalay Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes
CA2888367A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
WO2015103438A2 (en) 2014-01-02 2015-07-09 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
KR101623498B1 (ko) 2014-10-16 2016-05-24 대한민국 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３
KR101645642B1 (ko) 2014-10-16 2016-08-11 대한민국 Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스
EP3261669B1 (en) 2015-02-25 2022-08-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Use of inactivated nonreplicating modified vaccinia virus ankara (mva)as monoimmunotherapy or in combination with immune checkpoint blocking agents for solid tumors
US10548930B2 (en) 2015-04-17 2020-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Use of MVA or MVAΔE3L as immunotherapeutic agents against solid tumors
KR20160140075A (ko) * 2015-05-29 2016-12-07 코오롱생명과학 주식회사 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터
AU2016278806A1 (en) * 2015-06-15 2017-12-14 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) foot and mouth disease virus (FMDV) vaccine
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用
AU2017206102C1 (en) 2016-01-08 2022-02-10 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
WO2017129765A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) equine encephalitis virus vaccine
WO2017136419A1 (en) * 2016-02-03 2017-08-10 Geovax Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus
SG11201807051VA (en) 2016-02-25 2018-09-27 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Replication competent attenuated vaccinia viruses with deletion of thymidine kinase with and without the expression of human flt3l or gm-csf for cancer immunotherapy
CN109152827B (zh) 2016-02-25 2023-07-21 纪念斯隆凯特琳癌症中心 重组mva或表达人flt3l的mvaδe3l及其作为抗固体肿瘤的免疫治疗剂的用途
AU2017259259B2 (en) 2016-05-02 2020-11-19 Bavarian Nordic A/S Therapeutic HPV vaccine combinations
TWI728173B (zh) * 2016-08-19 2021-05-21 澳大利亞商賽門堤斯有限公司 病毒疫苗
WO2018064516A1 (en) * 2016-09-30 2018-04-05 Monsanto Technology Llc Method for selecting target sites for site-specific genome modification in plants
US11242509B2 (en) 2017-05-12 2022-02-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
JP7272965B2 (ja) * 2017-06-15 2023-05-12 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー Ｈｉｖ抗原をコードするポックスウイルスベクターおよびその使用方法
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
JP2021535730A (ja) * 2018-05-11 2021-12-23 シティ・オブ・ホープCity of Hope 複数の部位メガロウイルス（ｃｍｖ）抗原の発現のためのｍｖａベクター及びその使用
CN111979204B (zh) * 2019-05-24 2023-10-13 杭州功楚生物科技有限公司 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途
AU2020384323A1 (en) 2019-11-14 2022-06-02 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
US20210299245A1 (en) * 2020-03-31 2021-09-30 Sementis Limited Attenuated poxvirus vector based vaccine for protection against covid-19
US20240033347A1 (en) 2022-07-08 2024-02-01 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5494807A (en) * 1991-03-07 1996-02-27 Virogenetics Corporation NYVAC vaccinia virus recombinants comprising heterologous inserts
WO1998013500A2 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
WO2002018585A2 (en) * 2000-08-29 2002-03-07 Wyeth Holdings Corporation Packaging of positive-strand rna virus replicon particles

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0795956B2 (ja) * 1986-09-22 1995-10-18 京都大学長 ポックスウイルス由来発現制御領域
US5093258A (en) * 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
US5225336A (en) * 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
US5651972A (en) 1989-04-21 1997-07-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
US5514375A (en) 1990-08-15 1996-05-07 Virogenetics Corporation Flavivirus recombinant poxvirus vaccine
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US6893845B1 (en) * 1990-09-28 2005-05-17 Applied Molecular Evolution, Inc. Surface expression libraries of heteromeric receptors
BE1004877A3 (fr) * 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
FR2679249B1 (fr) * 1991-07-15 1993-11-26 Centre Nal Recherc Scientifique Souches de levure avec integration stable de genes heterologues.
JPH06509235A (ja) 1991-07-26 1994-10-20 ヴァイロジェネティクス　コーポレイション 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス組換えポックスウイルスワクチン
EP1380651A2 (en) * 1991-08-26 2004-01-14 Baxter Healthcare S.A. Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene
ATE181108T1 (de) * 1991-08-26 1999-06-15 Immuno Ag Direkt molekuläre klonierung eines modifizierten genoms eines chordopocken-virus
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
EP0753581A1 (en) * 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
DE19629828A1 (de) * 1996-07-24 1998-01-29 Bayer Ag Carbanilide
AUPP380598A0 (en) * 1998-05-29 1998-06-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genetically manipulated entomopoxvirus
US6252871B1 (en) 1998-07-01 2001-06-26 Powerwave Technologies, Inc. Switchable combiner/splitter
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
DK1180155T3 (da) * 1999-05-28 2009-02-16 Helmholtz Zentrum Muenchen Vektor til integration af heterologe sekvenser i poxvirale genomer
US6682743B2 (en) * 2000-03-14 2004-01-27 Bavarian Nordic A/S Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (MVA)
CA2341356C (en) * 2000-04-14 2011-10-11 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity
EE05680B1 (et) * 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
US7501127B2 (en) * 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
JP4895505B2 (ja) 2002-05-16 2012-03-14 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 変異ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）ゲノム中の挿入部位としての遺伝子間領域
ES2288634T3 (es) * 2002-11-25 2008-01-16 Bavarian Nordic A/S Poxvirus recombinante que comprende al menos dos promotores ati de la viruela de las vacas.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
US5494807A (en) * 1991-03-07 1996-02-27 Virogenetics Corporation NYVAC vaccinia virus recombinants comprising heterologous inserts
WO1998013500A2 (en) * 1996-09-24 1998-04-02 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
WO2002018585A2 (en) * 2000-08-29 2002-03-07 Wyeth Holdings Corporation Packaging of positive-strand rna virus replicon particles

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOWLEY P.M. ET AL.: "A functional measles virus replication and transcription machinery encoded by the vaccinia virus genome", JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS. NETHERLANDS APR 1999, vol. 79, no. 1, April 1999 (1999-04), pages 65-74, XP002257129, ISSN: 0166-0934, page 66, left-hand column, paragraph 1 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2662927C2 (ru) * 2013-03-15 2018-07-31 Симентис Лимитед Иммунная модуляция

Also Published As

Publication number Publication date
JP4693092B2 (ja) 2011-06-01
AU2009200380B2 (en) 2009-10-01
US8309326B2 (en) 2012-11-13
BRPI0311178B8 (pt) 2021-05-25
US7338662B2 (en) 2008-03-04
US7964374B2 (en) 2011-06-21
DK1506301T3 (da) 2014-07-21
BR0311178A (pt) 2005-03-29
CA2481799A1 (en) 2003-11-27
BRPI0311178B1 (pt) 2020-11-17
WO2003097845A1 (en) 2003-11-27
US20120135501A1 (en) 2012-05-31
CN1653183B (zh) 2012-07-25
EP1407033A1 (en) 2004-04-14
CA2812019A1 (en) 2003-11-27
EP1506301A1 (en) 2005-02-16
US9109233B2 (en) 2015-08-18
US20090311746A1 (en) 2009-12-17
CN1653184A (zh) 2005-08-10
EP1407033B1 (en) 2006-01-11
IL164172A0 (en) 2005-12-18
AU2003236646B2 (en) 2009-01-15
US20120082696A1 (en) 2012-04-05
JP2005525822A (ja) 2005-09-02
CN102199628A (zh) 2011-09-28
EP1506301B1 (en) 2014-04-30
CN101831411A (zh) 2010-09-15
PT1407033E (pt) 2006-05-31
KR101005630B1 (ko) 2011-01-05
AU2009200380C1 (en) 2010-03-11
IL193087A0 (en) 2009-02-11
EA200401507A1 (ru) 2005-06-30
ES2256776T3 (es) 2006-07-16
KR101138067B1 (ko) 2012-04-24
KR20040108809A (ko) 2004-12-24
NO334273B1 (no) 2014-01-27
AU2003242540A1 (en) 2003-12-02
JP4895505B2 (ja) 2012-03-14
HK1076836A1 (en) 2006-01-27
IL193088A0 (en) 2009-02-11
NO20045480L (no) 2004-12-16
AU2008255213B2 (en) 2011-10-06
UA82479C2 (ru) 2008-04-25
DK1407033T3 (da) 2006-05-22
NO20111324A1 (no) 2011-09-29
US20060165727A1 (en) 2006-07-27
CN1653183A (zh) 2005-08-10
IL193087A (en) 2012-10-31
CN100494388C (zh) 2009-06-03
JP5777199B2 (ja) 2015-09-09
DE60303218D1 (de) 2006-04-06
US20110053259A1 (en) 2011-03-03
US8288125B2 (en) 2012-10-16
SI1407033T1 (sl) 2006-06-30
HK1076642A1 (en) 2006-01-20
NO20044940L (no) 2004-11-12
PL216760B1 (pl) 2014-05-30
MXPA04010713A (es) 2005-03-07
AU2008255213A1 (en) 2009-01-08
US8034354B2 (en) 2011-10-11
US20130243813A1 (en) 2013-09-19
CN102703393A (zh) 2012-10-03
JP2011004755A (ja) 2011-01-13
EA020230B1 (ru) 2014-09-30
ATE315660T1 (de) 2006-02-15
CN102719408A (zh) 2012-10-10
IL193088A (en) 2015-02-26
KR20040108798A (ko) 2004-12-24
KR20120002627A (ko) 2012-01-06
DE60303218T2 (de) 2006-09-14
MXPA04011194A (es) 2005-02-14
IL164177A0 (en) 2005-12-18
PL372088A1 (en) 2005-07-11
WO2003097846A1 (en) 2003-11-27
US20120039936A1 (en) 2012-02-16
NZ536501A (en) 2006-08-31
EP2253709A1 (en) 2010-11-24
US8414900B2 (en) 2013-04-09
US20100173388A1 (en) 2010-07-08
US7550147B2 (en) 2009-06-23
US20110250693A1 (en) 2011-10-13
EA200900180A1 (ru) 2009-08-28
US20100303856A1 (en) 2010-12-02
NZ536502A (en) 2005-10-28
CA2481521A1 (en) 2003-11-27
US8741308B2 (en) 2014-06-03
KR20100110901A (ko) 2010-10-13
CA2481799C (en) 2014-01-28
US8435543B2 (en) 2013-05-07
AU2003236646A1 (en) 2003-12-02
US20050244428A1 (en) 2005-11-03
AU2009200380A1 (en) 2009-02-19
CA2481521C (en) 2012-04-17
US20110053260A1 (en) 2011-03-03
BR0310051A (pt) 2005-02-15
US20110244574A1 (en) 2011-10-06
US20120178157A1 (en) 2012-07-12
JP2010259446A (ja) 2010-11-18
PL218318B1 (pl) 2014-11-28
EP2253709B1 (en) 2018-04-11
PL372093A1 (en) 2005-07-11
EA200401506A1 (ru) 2005-04-28
JP2005525823A (ja) 2005-09-02
NO336489B1 (no) 2015-09-07
KR101041691B1 (ko) 2011-06-14
EA007811B1 (ru) 2007-02-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA012160B1 (ru) Рекомбинантный поксвирус, экспрессирующий гомологичные гены, встроенные в поксвирусный геном, и его применение
JP7113924B2 (ja) 組み換え改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）フィロウイルスワクチン
US5741492A (en) Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses
US7189536B2 (en) Modified vaccinia ankara virus variant
US20200071724A1 (en) Intergenic Sites Between Conserved Genes in the Genome of Modified Vaccinia Ankara (MVA) Vaccinia Virus
US9879231B2 (en) Recombinant modified vaccinia ankara (MVA) vaccinia virus containing restructured insertion sites
EA012723B1 (ru) Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение
EA009525B1 (ru) Рекомбинантный модифицированный вирус осповакцины ankara, содержащий ati-промотор вируса коровьей оспы, и способы применения вируса и промотора
US6942864B2 (en) Leporipox-based vector vaccines
JPH05244940A (ja) 組み換えアビポックスウィルス及びそれから成るワクチン
JPH07255488A (ja) 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG MD TJ TM