PL216760B1 - Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania - Google Patents
Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowaniaInfo
- Publication number
- PL216760B1 PL216760B1 PL372093A PL37209303A PL216760B1 PL 216760 B1 PL216760 B1 PL 216760B1 PL 372093 A PL372093 A PL 372093A PL 37209303 A PL37209303 A PL 37209303A PL 216760 B1 PL216760 B1 PL 216760B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mva
- seqid
- igr
- sequence
- dna sequence
- Prior art date
Links
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 title claims description 243
- 238000003780 insertion Methods 0.000 title claims description 114
- 230000037431 insertion Effects 0.000 title claims description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 claims description 161
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 109
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 88
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 86
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 69
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 46
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 28
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 26
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 24
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 22
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 19
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 17
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 16
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 14
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 claims description 13
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 13
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 claims description 12
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 10
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 9
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 claims description 8
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 101150033828 NS1 gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150064860 PRM gene Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 4
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 claims description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 claims description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 66
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 63
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 51
- 206010072219 Mevalonic aciduria Diseases 0.000 description 34
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 31
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 12
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 101150049281 PRM1 gene Proteins 0.000 description 11
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 11
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 9
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 8
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 8
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 7
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 6
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 6
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 6
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical group C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N micophenolic acid Natural products OC1=C(CC=C(C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000951 mycophenolic acid Drugs 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 4
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 101150111412 npt gene Proteins 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 2
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 101150106093 gpt gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- -1 phosphoribosyl Chemical group 0.000 description 2
- 230000006825 purine synthesis Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 4-chloronaphthalen-1-ol Chemical compound C1=CC=C2C(O)=CC=C(Cl)C2=C1 LVSPDZAGCBEQAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101150076749 C10L gene Proteins 0.000 description 1
- 101000584877 Clostridium pasteurianum Putative peroxiredoxin in rubredoxin operon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101000618323 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 7.3 kDa protein in mobB-Gp55 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 101001056912 Saccharopolyspora erythraea 6-deoxyerythronolide-B synthase EryA1, modules 1 and 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001056914 Saccharopolyspora erythraea 6-deoxyerythronolide-B synthase EryA3, modules 5 and 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000819251 Staphylococcus aureus Uncharacterized protein in ileS 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 102000006995 beta-Glucosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010047754 beta-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012409 standard PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
- C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Niniejszy wynalazek dotyczy nowych miejsc insercji, użytecznych do włączania egzogennych sekwencji DNA do genomu MVA.
Tło wynalazku
Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) należy do rodziny Orthopoxvirus. MVA otrzymano w wyniku około 570 pasaży szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) w fibroblastach embrionów kurcząt (praca przeglądowa Mayr, A. i wsp., Infection 3, 6-14 (1975)). W następstwie wspomnianych pasaży, uzyskany wirus MVA zawierał 31 kilozasad informacji genomowej mniej, w porównaniu z CVA, i stał się silnie specyficzny wobec komórek gospodarza (Meyer, H. i wsp., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). MVA charakteryzuje się wysokim stopniem atenuacji, przejawianej poprzez zmniejszoną zjadliwość lub zakaźność, przy utrzymaniu silnej immunogenności. Na podstawie testów prowadzonych na różnych modelach zwierzęcych wykazano, że otrzymany MVA był silnie awirulentny nawet w przypadku osobników o obniżonej odporności. Co istotne, doskonałe właściwości szczepu MVA zostały potwierdzone w szczegółowych próbach klinicznych (Mayr i wsp., Zbl.Bakt.Hyg. I, Abt.Org. B 167, 375-390 (1987)). Podczas wspomnianych badań, przeprowadzonych w grupie 120,000 osób, włączając pacjentów wysokiego ryzyka, nie odnotowano żadnych efektów ubocznych (Stickl i wsp., Dtsch.med.Wschr.99, 2386-2392 (1974).
W kolejnych badaniach odkryto, że rozwój MVA jest blokowany w późnym etapie cyklu replikacyjnego wirusa w komórkach ssaczych (Sutter, G. i Moss, B. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89, 10847-10851). Zgodnie z powyższym, MVA w pełni replikuje swoje DNA, syntetyzuje wczesne, opóźnione i późne produkty genów, lecz nie jest zdolny do złożenia dojrzałych infekcyjnych wirionów, które mogą być uwalniane z zainfekowanej komórki. Powyższe ograniczenie replikacji tego wirusa sprawiło, że zaproponowano użycie MVA jako wektora ekspresji genu.
W późniejszym etapie, MVA zastosowano do otrzymywania rekombinowanych szczepionek, ekspresjonujących sekwencje antygenowe wstawione w miejscu genu kinazy tymidynowej (tk) (US 5,185,146) lub w miejscu naturalnie występujących delecji w genomie MVA (PCT/EP96/02926).
Mimo że locus insercji tk jest szeroko stosowane do otrzymywania rekombinowanych wirusów ospy, szczególnie do uzyskiwania rekombinowanych wirusów krowianki (Mackett i wsp. (1982) P.N.A.S. USA 79, 7415-7419, technologia ta nie była odpowiednia w przypadku MVA. Scheiflinger i wsp. wykazał, że MVA jest dużo bardziej wrażliwy na modyfikacje genomu w porównaniu z innymi wirusami ospy, co może okazać się użyteczne w procesie otrzymywania rekombinowanych wirusów ospy. W szczególności, Scheiflinger i wsp. stwierdził, że jedno z najpowszechniej stosowanych miejsc do włączania heterologicznego DNA do genomu wirusa ospy, mianowicie locus genu kinazy tymidynowej (tk), nie może być wykorzystane do otrzymywania rekombinowanego MVA. Wszystkie otrzymane rekombinowane MVA tk(-) okazały się silnie niestabilne i podczas oczyszczania bardzo szybko traciły wstawiony DNA wraz z częścią genomowego DNA wirusa MVA (Scheiflinger i wsp. (1996), Arch Virol 141: str. 663-669).
Niestabilność, a przez to, wysokie prawdopodobieństwo zajścia rekombinacji genomowej jest znanym problemem w dziedzinie wirusologii wirusów ospy. W istocie, MVA uzyskany został w wyniku długotrwałych pasaży i wykorzystania faktu, że genom wirusowy CVA, namnażany in vitro w tkankowej hodowli komórkowej jest silnie niestabilny. Kilka tysięcy nukleotydów (31 kb) z genomu MVA uległo delecji, co spowodowało, że otrzymany wirus, w porównaniu z wyjściowym genomem CVA, charakteryzuje się 6 dużymi i licznymi małymi delecjami.
Ostatnio została opisana organizacja genomu MVA (Antoine i wsp. (1998), Virology 244, 365396). 178 kz genom MVA jest gęsto upakowany i zawiera 193 pojedynczych otwartych ramek odczytu (ORF), kodujących białka o długości przynajmniej 63 aminokwasów. W porównaniu z wysoko infekcyjnym wirusem Variola, a także prototypem wirusa krowianki, a mianowicie szczepem Copenhagen, większość ORF w MVA jest fragmentaryczna lub ulegała skróceniu (Antoine i wsp. (1998), Virology 244, 365-396). Jednakże, z kilkoma nielicznymi wyjątkami, wszystkie ORF, włączając fragmentaryczne i skrócone ORF, ulegają transkrypcji i translacji do białek. Poniżej wykorzystano nazewnictwo stosowane przez Antoine i wsp., w razie potrzeby, posłużono się również nomenklaturą opartą na miejscach trawienia enzymu restrykcyjnego Hind III.
Dotychczas, otrzymanie stabilnego, rekombinowanego MVA możliwe było jedynie poprzez insercję egzogennego DNA w naturalnie występujących miejscach delecji genomu MVA (PCT/EP96/02926). Niestety, ilość naturalnie występujących miejsc delecji w genomie MVA jest ograPL 216 760 B1 niczona. Ponadto, wykazano, że inne miejsca restrykcyjne, takie jak, np., Iocus genu tk, są mało użyteczne w otrzymywaniu rekombinowanego MVA (Scheiflinger i wsp. 1996), Arch Virol 141: str. 663-669).
Cel wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest identyfikacja innych miejsc insercji w genomie MVA i uzyskanie wektorów insercyjnych, które ukierunkują insercję egzogennych sekwencji DNA do wspomnianych nowych, zidentyfikowanych miejsc insercyjnych w genomie MVA.
Kolejnym celem wynalazku jest zapewnienie rekombinowanego MVA, zawierającego egzogenne sekwencje DNA, stabilnie zintegrowane w miejscach insercji genomu MVA.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) charakteryzujący się tym, że zawiera egzogenną sekwencję heterologicznego DNA wstawioną w międzygenowym obszarze (IGR) genomu wirusa.
Korzystnie, egzogenna sekwencja heterologicznego DNA wstawiona jest w międzygenowym obszarze (IGR) między dwiema sąsiadującymi otwartymi ramkami odczytu (ORF), wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA zawiera przynajmniej jedną sekwencję kodującą, korzystnie pod kontrolą transkrypcyjną pokswirusowego elementu kontrolującego transkrypcję.
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA koduje jedno lub więcej białek, polipeptydów, peptydów, obcych antygenów lub epitopów antygenowych.
Korzystnie, heterologicznego DNA pochodzi z wirusa Dengue, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa zapalenia wątroby B, wirusa zapalenia wątroby C i/albo wirusów niedoboru odporności, korzystnie z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA pochodząca z wirusa Dengue wybrana jest z grupy obejmującej NS1 i PrM.
Korzystnie, gen NS1 został wstawiony do IGR pomiędzy ORF 064L-065L.
Korzystnie, gen PrM pochodzi z jednego lub więcej z 4 serotypów wirusa Dengue.
Korzystnie, gen PrM został wstawiony do IGR pomiędzy ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z wirusa niedoboru odporności i koduje env HIV.
Korzystnie, gen env HIV został wstawiony do IGR między ORF 007R-008L.
Korzystnie, wirus według wynalazku jest MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem dostępu V00083008.
Korzystnie wirus według wynalazku służy do stosowania jako lek i/lub szczepionka.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie MVA według wynalazku, do otrzymywania leku i/lub szczepionki do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom wirusowym i/lub chorobom proliferacyjnym, korzystnie do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem Dengue lub infekcji wirusem niedoboru odporności, korzystnie infekcji HIV.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca MVA według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera MVA według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik, adiuwant i/lub dodatek.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka, polipeptydu, peptydu, antygenu lub epitopu in vitro, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
- infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA według wynalazku,
- hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach,
- izolację i/lub wzbogacenie polipeptydu, białka, peptydu, antygenu, epitopu i/lub wirusa produkowanego przez wspomnianą komórkę gospodarza.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzania sekwencji DNA do komórki in vitro, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA jest homologiczna i/lub heterologiczna z genomem wspomnianej komórki, przy czym komórka ta jest infekowana MVA według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka in vitro lub ex vivo zawierająca MVA według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor plazmidowy charakteryzujący się tym, że zawiera
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
PL 216 760 B1
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną oraz
- korzystnie, kasetę genu selekcyjnego i/albo reporterowego.
Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR znajdującego się między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, IGR pochodna sekwencja zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiadujących ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, wspomnianym wirusem jest MVA zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania MVA według wynalazku charakteryzujący się tym, że in vitro obejmuje następujące etapy:
- transfekcję komórki wektorem plazmidowym według wynalazku;
- infekcję transfekowanej komórki MVA;
- identyfikację, izolację i ewentualnie oczyszczenie MVA według wynalazku.
Korzystnie, komórka jest zainfekowana MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest DNA charakteryzujący się tym, że zawiera:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną.
Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranych z grupy zawierającej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
PL 216 760 B1
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencja DNA ukierunkowuje wstawienie sekwencji heterologicznej do IGR genomu MVA zdeponowanego w ECACC pod numerem V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora plazmidowego obejmującego:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, oraz
- miejsce klonowania wstawione we wspomnianej sekwencji IGR do insercji wspomnianej sekwencji heterologicznej, oraz
- korzystnie, kasetę genu reporterowego i/lub selekcyjnego do otrzymywania oraz/albo produkowania rekombinowanego MVA według wynalazku. Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, wspomniany wirus MVA jest MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie DNA zawierającego sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
PL 216 760 B1
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, do otrzymania i/lub produkcji wektora plazmidowego według wynalazku i/lub otrzymania i/lub produkcji rekombinowanego MVA według wynalazku.
Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydowe
-nr 527- 608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L. Korzystnie, flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, wirusem MVA jest wirus MVA zdeponowany w ECACC pod numerem V00083008.
Szczegółowy opis wynalazku
Twórcy niniejszego wynalazku zidentyfikowali nowe miejsca w genomie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), służące do wstawiania egzogennych sekwencji DNA. Nowe miejsca insercji położone są w obszarze międzygenowym (IGR) genomu wirusa, przy czym wspomniane IGR są, z kolei zlokalizowane między lub są flankowane przez dwie sąsiadujące otwarte ramki odczytu (ORF) genomu MVA.
Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanych MVA zawierających heterologiczne sekwencje DNA wstawione do IGR genomu wirusa. Zgodnie z wynalazkiem, jedna lub więcej z egzogennych sekwencji może być wstawiona do jednego lub więcej miejsc IGR.
Nieoczekiwanie, odkryto, że egzogenne sekwencje DNA, po wstawieniu do IGR, pozostają istotnie stabilnie wstawione w genomie MVA: jak już wskazano genom MVA uważany jest za wysoko niestabilny. Wydaje się, że geny lub sekwencje DNA nieistotne dla rozmnażania wirusa ulegają delecji lub rozpadają się na fragmenty. Jednak, również zaskakująco, odkryto, że stabilne, rekombinowane MVA uzyskiwane są, gdy sekwencje heterologicznego DNA wstawiane są w naturalnie występujących miejscach delecji genomu MVA (PCT/EP96/02926). Z drugiej strony, stwierdzono, że wiele genów gospodarzy, jak np. Iocus tk - szeroko stosowanych do otrzymywania innych rekombinowanych wirusów ospy, nie stanowi odpowiednich miejsc dla insercji w MVA. Fakt, że Vero-MVA posiada jedną dodatkową delecję genomową (PCT/EP01/02703) również wskazuje, że genom ten ma charakter dynamiczny, to znaczy fragmenty niewymagane do propagacji wirusa ulegają delecji. Zatem, można oczekiwać, że sekwencje heterologicznego DNA, nieistotne dla namnażania wirusa, wstawione w przestrzeni między ORF wirusa również ulegną delecji.
Podczas gdy sekwencja nukleotydowa ORF koduje sekwencję aminokwasową tworzącą peptyd, polipeptyd lub białko, sekwencje IGR znajdujące się między dwoma ORF nie posiadają zdolności kodowania, lecz mogą obejmować elementy regulatorowe, miejsca wiążące, promotor i/lub sekwencje wzmacniające, istotne lub włączone w proces kontroli transkrypcyjnej ekspresji genu wirusowego. Zatem, IGR może uczestniczyć w kontrolnej regulacji cyklu życia wirusa. Jednakże, twórcy niniejszego wynalazku wykazali również, że nowe miejsca insercji zapewniają nieoczekiwane korzyści, płynące z faktu, że sekwencje egzogennego DNA mogą być stabilnie wstawiane do genomu MVA, bez wpływu
PL 216 760 B1 lub zmiany typowych właściwości i ekspresji genu MVA. Nowe miejsca insercji są szczególnie użyteczne, ze względu na to, że ani ORF ani sekwencja kodująca MVA, nie ulegają zmianie.
Ponadto, zaskakująco odkryto, że poziom ekspresji obcego genu wstawionego do IGR jest wyższy, niż poziom ekspresji obcego genu wstawionego w miejscu delecji genomu MVA (patrz również Przykład 1).
Sekwencja nukleotydowa ORF posiada regularną strukturę: zaczyna się kodonem startu i kończy kodonem stopu. Zależnie od położenia dwóch sąsiednich ORF, IGR - obszar pomiędzy tymi ORF, jest flankowany przez dwa kodony stopu dwóch sąsiadujących ORF lub przez dwa kodony startu dwóch sąsiadujących ORF, lub też przez kodon stopu pierwszej ORF i kodon startu drugiej ORF, lub kodon startu pierwszej ORF i kodon stopu drugiej ORF.
Zgodnie z powyższym, miejsce insercji dla egzogennej sekwencji DNA w IGR może znajdować się poniżej lub w kierunku 3' końca kodonu stopu pierwszej ORF. W przypadku, gdy sąsiednia ORF, zwana również drugą ORF, posiada taką samą orientację, jak pierwsza ORF, miejsce insercji poniżej kodonu stopu pierwszej ORF leży powyżej lub w kierunku końca 5' kodonu stopu drugiej ORF.
W przypadku, gdy druga ORF posiada przeciwną orientację względem pierwszej ORF, to znaczy położenie dwóch sąsiednich punktów ORF wobec siebie, wtedy egzogenny DNA wstawiany jest powyżej obu kodonów startu.
ORF w genomie MVA występuje w dwóch kierunkach kodowania. W konsekwencji, aktywność polimerazy przejawia się z lewej do prawej, tj., w kierunku do przodu, i odpowiednio, z prawej do lewej (w kierunku do tyłu). Fakt ten jest powszechnie wykorzystywany w wirusologii wirusów ospy i stał się podstawą standardowej klasyfikacji wirusów krowianki. Służy identyfikowaniu ORF na bazie ich orientacji i pozycji w różnych fragmentach trawienia restrykcyjnego HindIII. Do celów nomenklatury, różne fragmenty HindIII określane są za pomocą drukowanych liter w porządku malejącym, odpowiadających malejącej wielkości poszczególnych fragmentów. W każdym fragmencie Hindlll, ORF numerowane są z lewej do prawej a położenie ORF wskazywane jest przez drukowane L (oznaczające transkrypcję z prawej do lewej) lub R (oznaczające transkrypcję z lewej do prawej). Ponadto, istnieje nowsza publikacja struktury genomu MVA, w której zastosowano inne nazewnictwo, po prostu numerację ORF z lewego do prawego końca genomu i wskazanie ich orientacji drukowanymi L Iub R (Antoine i wsp. (1998), Virology 244, 365-396). Dla przykładu, I4L ORF, zgodnie ze starą nomenklaturą, odpowiada 064L ORF według Antoine i wsp. W niniejszym wynalazku, jeśli nie wskazano inaczej, zastosowano nazewnictwo według Antoine i wsp.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sekwencje heterologicznego DNA mogą być wstawiane do jednego lub więcej IGR pomiędzy dwoma sąsiednimi ORF, wybranymi z grupy obejmującej: 001L002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L020L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 25L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R- 086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R- 098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
Zgodnie z wcześniejszą nomenklaturą, ORF 006L odpowiada C10L, 019 L odpowiada C6L, 020L-N1L, 021L-N2L, 023L-K2L, 028R-K7R, 029L-F1L, 037L-F8L, 045L-F15L, 050L-E3L, 052R-E5R, 054R-E7R, 055R-E8R, 056L-E9L, 062I1L, 064L-I4L, 065L-I5L, 081R-L2R, 082L-L3L, 086R-J2R, 088R-J4R, 089L-J5L, 092R-H2R, 095R-H5R, 107R-D10R, 108L-D11L, 122R-A11R, 123L-A12L, 125L-A14L, 126L-A15L, 135R-A24R, 136L-A25L, 137L-A26L, 141L-A30L, 148R-A37R, 149L-A38L, 152R-A40R, 153L-A41L, 154R-A42R, 157L-A44L, 159R-A46R, 160L-A47L, 165R-A56R, 166R-A57R, 167R-BIR, 170R-B3R, 176R-B8R, 180R-B12R, 184R-B16R, 185L-B17L oraz 187R-B19R.
Korzystnie, sekwencja heterologiczna wstawiona jest do IGR flankowanego przez dwie sąsiadujące ORF, wybrane z grupy obejmującej 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
PL 216 760 B1
Heterologiczne lub egzogenne sekwencje DNA są sekwencjami, które, w naturze, nie występują normalnie związane z wirusami ospy według niniejszego wynalazku. Zgodnie z kolejną realizacją wynalazku, egzogenna sekwencja DNA zawiera przynajmniej jedną sekwencję kodującą. Sekwencja kodująca jest operatywnie związana z elementem kontroli transkrypcji, korzystnie z elementem kontroli transkrypcji wirusa ospy. Ponadto, mogą być zastosowane również kombinacje między elementem kontroli transkrypcji wirusa ospy a, np., wewnętrznymi miejscami wiązania rybosomu.
Zgodnie z kolejną realizacją, sekwencja egzogennego DNA może również zawierać dwa lub więcej z sekwencji kodujących, powiązanych z jednym lub kilkoma elementami kontroli transkrypcji. Korzystnie, sekwencja kodująca koduje jedno lub więcej białek, polipeptydów, peptydów, obcych antygenów lub epitopów antygenowych, szczególnie produkty genów interesujących ze względów terapeutycznych.
Geny interesujące ze względów terapeutycznych według niniejszego wynalazku mogą być genami pochodzącymi lub homologicznymi z genami mikroorganizmów patogennych lub zakaźnych, wywołujących choroby zakaźne. Zgodnie z powyższym, w kontekście niniejszego wynalazku, tego typu interesujące ze względów terapeutycznych geny prezentowane są układowi immunologicznemu organizmu w celu wywołania, korzystnie indukowania, swoistej odpowiedzi immunologicznej oraz, tym samym w celu zaszczepienia lub ochrony profilaktycznej organizmu przed infekcją danym mikroorganizmem. W kolejnych korzystnych realizacjach niniejszego wynalazku, interesujące ze względów terapeutycznych geny wybrane są spośród genów wirusów zakaźnych, np., lecz nie ograniczając do, wirusa Dengue, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa zapalenia wątroby B lub C lub wirusów niedoboru odporności, takich jak HIV.
Geny pochodzące z wirusa Dengue są korzystnie genami NS1 i PrM, przy czym wspomniane geny mogą pochodzić z jednego, dwóch, trzech lub wszystkich z 4 serotypów wirusa Dengue. Gen NS1 pochodzi korzystnie z serotypu 2 wirusa Dengue i jest korzystnie wstawiany do IGR pomiędzy ORF 064L-065L (I4L-I5L). Geny PrM, pochodzące korzystnie ze wszystkich 4 serotypów wirusa Dengue, są korzystnie wstawiane do IGR między ORF wybranymi z 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L. Korzystniej, gen PrM pochodzący z serotypu 1 wirusa Dengue (prM 1) wstawiany jest do IGR w pozycji 148R-149L, PrM 2 do IGR w 007R-008L, PrM 3 do IGR w pozycji ORF 044L-045L oraz PrM 4 do IGR 136L-137L.
Zgodnie z kolejną korzystną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z HIV i koduje env HIV, przy czym gen env HIV jest korzystnie wstawiony w IGR między ORF 007R-008L. Ponadto, geny interesujące ze względów terapeutycznych według wynalazku obejmują również geny związane z chorobami. Geny te wywierają efekt terapeutyczny na zaburzenia proliferacyjne, raka lub choroby metaboliczne. Na przykład, gen interesujący ze względów terapeutycznych w przypadku raka może być antygenem rakowym o zdolności indukowania swoistej, skierowanej przeciwko rakowi, reakcji immunologicznej.
Zgodnie z następną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja kodująca obejmuje przynajmniej jeden gen markerowy lub gen selekcyjny.
Geny selekcyjne wywołują szczególną odporność komórki, dzięki czemu możliwe są do zastosowania pewne metody selekcji. Specjaliści w dziedzinie dysponują wiedzą na temat różnorodnych genów selekcyjnych, które mogą zostać wykorzystane w systemie wirusów ospy. Między innymi należą tu, np., gen oporności na neomycynę (NPT) lub gen transferazy fosforybozylowej (gpt).
Geny markerowe indukują reakcję barwną w transdukowanych komórkach, co może być wykorzystane do identyfikacji komórek, które uległy transdukcji. Specjalistom w dziedzinie znane są różnorodne geny markerowe, które mogą zostać zastosowane w systemie wirusa ospy. Do grupy tej należą geny kodujące, np., β-galaktozydazę (β-gal), β-glukozydazę (β-glu), zielone białko fluorescencyjne (EGFP) lub niebieskie białko fluorescencyjne.
Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja egzogennego DNA zawiera sekwencję rozdzielającą, która oddziela element kontroli transkrypcyjnej wirusa ospy i/lub sekwencję kodującą w sekwencji egzogennego DNA od kodonu stopu i/lub kodonu startu sąsiadujących ORF.
Wspomniana sekwencja rozdzielająca, znajdująca się między kodonem stop/start sąsiadującej ORF a wstawioną sekwencją kodującą egzogennego DNA, jest korzystna, ponieważ stabilizuje wstawiony egzogenny DNA, a przez to, jakikolwiek otrzymany w ten sposób rekombinowany wirus. Wielkość sekwencji rozdzielającej jest zmienna, dopóki sekwencja nie posiada własnego kodowania lub funkcji regulatorowej.
PL 216 760 B1
Zgodnie z następną realizacją wynalazku, sekwencja rozdzielająca element kontroli transkrypcyjnej wirusa ospy i/lub sekwencję kodującą w sekwencji egzogennego DNA od kodonu stop sąsiedniej ORF, ma długość przynajmniej jednego nukleotydu.
Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja rozdzielająca element kontroli transkrypcyjnej wirusa ospy i/lub sekwencję kodującą w sekwencji egzogennego DNA od kodonu start sąsiedniej ORF, ma długość przynajmniej 30 nukleotydów. Szczególnie, w przypadku, gdy typowy element kontroli transkrypcyjnej wirusa krowianki znajduje się powyżej kodonu startu, insercja egzogennego DNA może nie rozdzielać elementu promotorowego od kodonu startu sąsiedniej ORF. Typowy element promotorowy wirusa krowianki może być zidentyfikowany poprzez analizę pod kątem np., sekwencji „TAAAT” dla późnych promotorów (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) oraz domeny bogatej w A/T dla wczesnych promotorów. Sekwencja rozdzielająca długości około 30 nukleotydów znajduje się w korzystnej odległości, zapewniającej, brak oddziaływania na promotor wirusa ospy położony powyżej kodonu startu ORF. Ponadto, zgodnie z kolejną korzystną realizacją odległość między wstawionym egzogennym DNA a kodonem startu sąsiedniej ORF, wynosi około 50 nukleotydów i korzystniej, około 100 nukleotydów.
Zgodnie z dalszą realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja rozdzielająca zawiera dodatkowy element kontroli transkrypcji wirusa ospy, który jest zdolny do kontroli transkrypcji sąsiedniej ORF.
Typowym szczepem MVA, który może być zastosowany według niniejszego wynalazku do otrzymywania rekombinowanego MVA, jest MVA-575, zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych pod numerem depozytu ECACC V00120707.
Innym korzystnym szczepem MVA jest MVA-Vero lub jego pochodne. Szczepy MVA-Vero zdeponowano w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych pod numerem depozytu ECACC V99101431 oraz 01021411. Bezpieczeństwo MVA-Vero odzwierciedlają jego biologiczne, chemiczne i fizyczne właściwości, opisane w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym PCT/EP01/02703. W porównaniu z innymi szczepami MVA, genom Vero-MVA obejmuje jedną dodatkową delecję.
Jeszcze innym, bardziej korzystnym szczepem MVA jest MVA-BN. MVA-BN zdeponowano w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych pod numerem depozytu ECACC V00083008. Wirus MVA-BN jest silnie atenuowanym wirusem, również pochodzącym od zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (patrz również PCT/EP01/13628).
Termin „pochodne” wirusa według niniejszego wynalazku dotyczy potomstwa wirusa wykazującego takie same właściwości jak wirus rodzicielski, lecz przejawiającego różnice w jednej lub więcej części genomu.
Termin „pochodne MVA” odnosi się do wirusa, który, w porównaniu z MVA, ma takie same właściwości funkcjonalne. Na przykład, pochodna MVA-BN posiada takie same cechy charakterystyczne jak MVA-BN. Jedną z tych właściwości MVA-BN lub jego pochodnych jest jego atenuacja i brak replikacji w komórkach ludzkich HaCat.
Rekombinowany MVA według niniejszego wynalazku jest użyteczny jako lek lub szczepionka. Mianowicie, zgodnie z kolejną realizacją, stosowany do wprowadzenia egzogennej sekwencji kodującej do komórki docelowej, przy czym wspomniana komórka jest homologiczna lub heterologiczna względem genomu komórki docelowej.
Wprowadzenie egzogennej sekwencji kodującej do komórki docelowej może być dokonane in vitro w celu otrzymywania białek, polipeptydów, peptydów, antygenów lub epitopów antygenowych. Sposób ten obejmuje infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA według wynalazku, hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach i izolację i/albo wzbogacenie polipeptydu, peptydu, białka, antygenu, epitopu i/lub wirusa wyprodukowanego przez wspomnianą komórkę gospodarza.
Ponadto, sposób wprowadzenia jednej lub więcej homologicznych lub jednej lub więcej heterologicznych sekwencji do komórek może być zastosowany w terapii in vitro i in vivo. W terapii in vitro, wyizolowane komórki, które były wcześniej (ex vivo) zainfekowane rekombinowanym MVA według wynalazku podawane są do żywego organizmu zwierzęcego w celu wywołania, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej. W terapii in vivo, rekombinowany wirus ospy według wynalazku, jest bezpośrednio podawany do żywego organizmu zwierzęcego w celu wywołania, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej. W tym przypadku, komórki otaczające miejsce szczepienia, lecz również komórki, przez które wirus jest transportowany, np., strumienia krwi, są bezpośrednio zainfekowane in vivo przez rekombinowany MVA według wynalazku. Po infekcji, komórki te syntetyzują proteiny, peptydy lub epitopy antygenowe genów terapeutycznych, które są kodowane przez egzo10
PL 216 760 B1 genne sekwencje kodujące, a następnie, prezentują je lub ich fragmenty na powierzchni komórki. wyspecjalizowane komórki układu immunologicznego rozpoznają prezentację takich heterologicznych białek, peptydów lub epitopów i uruchamiają swoistą odpowiedź immunologiczną.
Ze względu na to, że MVA charakteryzuje się silnie ograniczonym wzrostem, a zatem, jest silnie atenuowany, jest on użyteczny w leczeniu szerokiego zakresu ssaków, włączając ludzi, w tym włączając zwierzęta i ludzi z niedoborem odporności. Niniejszy wynalazek związany jest również z kompozycją farmaceutyczną i szczepionkami służącymi do indukcji odpowiedzi immunologicznej w żywym organizmie zwierzęcym, włączając ludzi.
Kompozycja farmaceutyczna może ogólnie obejmować jeden lub więcej z dopuszczalnych farmaceutycznie i/lub akceptowanych nośników, dodatków, antybiotyków, konserwantów, adiuwantów, rozcieńczalników i/lub środków stabilizujących. Takie substancje pomocnicze mogą być wodą, roztworem soli fizjologicznej, glicerolem, etanolem, czynnikami nawilżającymi lub emulsyfikującymi, substancjami buforującymi pH itp. Odpowiednie nośniki są zazwyczaj rozległymi, wolno metabolizowanymi cząsteczkami, takimi jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, agregaty lipidowe itp.
W celu otrzymania szczepionki, rekombinowany wirus ospy według wynalazku doprowadzany jest do dopuszczalnej fizjologicznie postaci. Może być to dokonane w oparciu o doświadczenie w przygotowywaniu szczepionek wirusów ospy stosowanych do szczepienia przeciwko ospie (według opisu Stickl, H. i wsp. (1974) Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Na przykład, oczyszczony wirus przechowywany jest w -80°C, o mianie 5x10E8 TCID50/ml, w formulacji w około 10 mM Tris, 140 mM NaCl o pH 7.4. W celu przygotowania zastrzyków szczepionki, np., 10E2-10E8 cząsteczek wirusa liofilizowanych jest 100 ml roztworu fizjologicznego buforowanego fosforanem (PBS), w obecności 2% peptonu i 1% ludzkiej albuminy, w ampułce, korzystnie szklanej ampułce. Alternatywnie, zastrzyki szczepionki mogą być otrzymane w wyniku stopniowego suszenia sublimacyjnego wirusa w formulacji. Formulacja ta może zawierać dodatkowe substancje, takie jak mannitol, dekstran, cukier, glicyna, laktoza lub poliwinylopirolidon lub inne kwasy, takie jak przeciwutleniacze lub gazy obojętne, stabilizatory lub rekombinowane białka (np., albumina surowicy ludzkiej), odpowiednie do podawania in vivo. Szklana ampułka jest następnie szczelnie zamykana i może być przechowywana między 4°C a temperaturą pokojową przez kilka miesięcy. Jednakże, dopóki nie istnieje taka potrzeba, ampułka przechowywana jest korzystnie w temperaturze poniżej -20°C.
W celu szczepienia lub terapii, liofilizat może zostać rozpuszczony w 0.1 do 0.5 ml wodnego roztworu, korzystnie roztworu soli fizjologicznej lub buforze Tris i podawany układowo lub miejscowo, tj., pozajelitowo, podskórnie, domięśniowo, przez skaryfikację lub w jakikolwiek inny sposób podawania znany specjalistom w dziedzinie. Droga podawania, dawka i ilość podań może zostać w znany specjalistom w dziedzinie sposób zoptymalizowana. Jednakże, często, pacjent zaszczepiany jest drugim zastrzykiem około miesiąc do sześciu tygodni po pierwszym szczepieniu.
Niniejszy wynalazek związany jest ponadto z wektorami plazmidowymi, które mogą być zastosowane do otrzymywania rekombinowanego MVA według wynalazku, i również z pewnymi sekwencjami DNA.
Prawidłowo, pożądana egzogenna sekwencja DNA może być wstawiona w IGR zlokalizowanym między lub flankowanym przez dwie sekwencje nukleotydowe zawierające sąsiadujące ORF. Zgodnie z powyższym, wektor plazmidowy według wynalazku, zawiera sekwencję DNA pochodzące z lub homologiczną z genomem MVA, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera pełen lub częściowy fragment sekwencji IGR, zlokalizowany między lub flankowany przez dwie sąsiadujące ORF genomu wirusa. Korzystnie, wektor plazmidowy zawiera, wstawione we wspomnianej sekwencji IGR-pochodnej przynajmniej jedno miejsce klonowania, do insercji pożądanej, egzogennej sekwencji DNA i, korzystnie, do insercji elementu kontroli transkrypcji wirusa ospy, operatywnie połączonego ze wspomnianą sekwencją heterologicznego DNA. Dowolnie, wektor plazmidowy zawiera kasetę genu reporterowego i/lub selekcji. Wektor plazmidowy, korzystnie, zawiera także sekwencje dwóch sąsiednich ORF, flankujących wspomniany pełny lub częściowy fragment sekwencji IGR.
Zidentyfikowano pewne IGR, które nie obejmują sekwencji nukleotydowych. W tych przypadkach, wektor plazmidowy zawiera sekwencje DNA z sekwencji flankujących IGR, tj., sekwencje DNA z dwóch sąsiadujących ORF. Korzystnie, miejsce klonowania dla insercji sekwencji heterologicznego DNA jest wstawione w IGR. DNA z sekwencji flankujących IGR stosowany jest do ukierunkowania insercji egzogennej sekwencji DNA do odpowiednich IGR w genomie MVA. Taki wektor plazmidowy może dodatkowo obejmować pełen lub częściowy fragment sekwencji IGR, która zawiera miejsce
PL 216 760 B1 klonowania dla insercji sekwencji heterologicznego DNA i, dowolnie, kasety genu reporterowego i/albo selekcyjnego.
Sekwencje IGR-DNA, jak również sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiednich ORF są korzystnie wybrane z odpowiednio, IGR i ORF, z grupy obejmującej:
001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L019L, 019L-020L, 020L-021L,023L-024L, 024L-025L, 25L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 10R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
Sekwencje są, korzystniej, wybrane z odpowiednio IGR i ORF, z grupy obejmującej 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Sekwencje pochodzące z IGR są, korzystnie, wybrane z grupy zawierającej sekwencje nukleotydowe:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr-376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiadujących ORF są korzystnie, wybrane z grupy obejmującej sekwencje nukleotydowe:
- nr 1-525 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Sekwencje DNA korzystnie pochodzą z lub są homologiczne z genomem wirusa MVA zdeponowanego w ECACC pod numerem depozytu V00083008.
W celu otrzymania wektora plazmidowego według wynalazku, sekwencje są izolowane i klonowane do standardowego wektora klonowania, takiego jak pBluescript (Stratagene), w którym flankują one egzogenny DNA mający być wstawiany do genomu MVA. Dowolnie, taki wektor plazmidowy zawiera kasetę genu selekcji lub reporterowego, która może ulec delecji z ostatecznego rekombinowanego wirusa, z powodu obecności sekwencji powtórzeniowej włączonej do wspomnianej kasety.
Sposoby wprowadzania sekwencji egzogennego DNA poprzez wektor plazmidowy do genomu MVA i sposoby otrzymania rekombinowanego MVA są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, dodatkowo, mogą zostać wywnioskowane na podstawie następujących pozycji, podanych tytułem referencji:
- Molecular Cloning, A laboratory Manual. Wydanie drugie. Według J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: opisano techniki i wiedzę dotyczącą standardowych technik biologii molekularnej, takich jak klonowanie DNA, izolacja RNA, technika western blotting, techniki amplifikacji RT-PCR i PCR;
- Virology Methods Manual. Według Brian WJ Mahy i Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: opisano techniki operowania i manipulowania wirusami;
- Molecular Virology: A Practical Approach. Według AJ DAvison i RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Rozdział 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors;
PL 216 760 B1
- Current Protocols in Molecular Biology. Wyd.: John Wiley i Son Inc. 1998. Rozdział 16, część IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral: vector; opisano techniki i wiedzę operowania, manipulowania i inżynierii genetycznej MVA.
MVA według niniejszego wynalazku, korzystnie MVA zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008, może być otrzymany poprzez transfekcję komórki wektorem plazmidowym według niniejszego wynalazku, infekcję transfekowanej komórki MVA, a następnie, identyfikację, izolację i, dowolnie, oczyszczenie MVA według wynalazku.
Sekwencje DNA według wynalazku mogą być zastosowane do identyfikowania lub izolowania MVA lub jego pochodnych według wynalazku, natomiast komórki lub organizmy zainfekowane MVA według wynalazku. Sekwencje DNA są, np., stosowane do otrzymania starterów PCR, sond hybryd yzacyjnych lub są wykorzystywane w technikach szeregowania sekwencji.
Krótki opis figur
Figura 1: Mapa restrykcyjna wektora pBNX39 (Figura 1a), pBNX70 (Figura 1b) i pBN84 (Figura 1c), obejmującego około 600 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji następujące po 14L ORF. Plazmidy zawierają dodatkowo egzogenny DNA (odpowiednio, Ecogpt i hBFP) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy P), między sekwencjami flankującymi: Flank 1 (F1 I4L-I5L) Flank 2 (F2 I4L-I5L). F1rpt oznacza sekwencję powtórzeniową Flank 1, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z otrzymanego rekombinowanego wirusa. pBN84 (Figura 1c) koduje dodatkowo białko wirusa Dengue NS1 (NS1 DEN). Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 2: Mapa restrykcyjna wektora pBNX51 (Figura 2a), pBNX67 (Figura 2b) i pBN27 (Figura 2c), obejmującego około 600 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji występujące po ORF 137L (Flank 1; F1136-137 odpowiada pozycji 129340 - 129930 genomu MVA; Flank 2; F2136-137 odpowiada pozycji 129931 - 130540 genomu MVA). Dodatkowo, wektor pBNX67 (Figura 2b) zawiera, między sekwencjami flankującymi, egzogenny DNA (gen NPT II - oporności na neomycynę) pod transkrypcyjną kontrolą promotora P) wirusa ospy. F2rpt określa sekwencję powtórzeniową z Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego wirusa. pBN27 (Figura 2c) koduje dodatkowo PrM4 z wirusa Dengue pod kontrolą promotora wirusa ospy. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad; IRES = wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu; EGFP = gen wzmacniający zielone białko fluorescencyjne.
Figura 3: Mapa restrykcyjna wektora pBNX79 (Figura 3a), pBNX86 (Figura 3b), pBNX88 (Figura 3c), pBN34 (Figura 3d) i pBN56 (Figura 3e), obejmującego około 600 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji między ORF 007R a 008R Flank 1; F1 IGR 07-08, rozpoczynająca się w pozycji 12200 genomu MVA; Flank 2: F2 IGR 07-08 kończąca się w pozycji 13400 genomu MVA). F2rpt określa sekwencję powtórzeniową Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. Ponadto, wektor pBNX88 (Figura 3c) i pBNX86 (Figura 3b) zawiera, między sekwencjami flankującymi, egzogenny DNA (odpowiednio, BFP + gpt i NPT II + EGFP) pod transkrypcyjną kontrolą promotora wirusa ospy P). F2rpt określa sekwencję powtórzeniową Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. pBN56 (Figura 3e) koduje dodatkowo białko env HIV-1, a pBN34 (Figura 3d) zawiera sekwencję kodującą PrM2 z wirusa Dengue pod kontrolą promotora wirusa ospy. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 4: Mapa restrykcyjna wektora pBNX80 (Figura 4a), pBNX87 (Figura 4b) i pBN47 (Figura 4c), obejmującego około 600/640 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji między ORF 044L a 045L (Flank 1: F1 IGR 44-45 rozpoczynająca się w pozycji 36730 genomu MVA; Flank 2: F2 IGR 44-45 kończąca się w pozycji 37970 genomu MVA). Ponadto, wektor pBNX87 (Figura 4b) zawiera, między sekwencjami flankującymi, IpF egzogenny DNA (gen NPT II + EGFP) pod transkrypcyjną kontrolą promotora wirusa ospy P), F2rpt określa sekwencję powtórzeniową Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. pBN47 (Figura 4c) koduje dodatkowo PrM3 z wirusa Dengue pod kontrolą promotora wirusa ospy. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 5: Mapa restrykcyjna wektora pBNX90 (Figura 5a), pBNX92 (Figura 5b) i pBN54 (Figura 5c), obejmującego około 596/604 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji między ORF 148R a 149L (Flank 1: F1 IGR 148-149 rozpoczynająca się w pozycji 136900 genomu MVA; Flank 2: F2 IGR 148-149 kończąca się w pozycji 138100 genomu MVA). Ponadto, wektor pBNX92 (Figura 5b) zawiera między sekwencjami flankującymi egzogenny DNA (gpt + BFP) pod transkrypcyjną kontrolą promotora wirusa ospy P). pBN54 (Figura 5c) koduje dodatkowo PrM1 z wirusa Dengue. F2rpt określa
PL 216 760 B1 sekwencję powtórzeniową z Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 6: Schemat międzygenowych miejsc insercji w MVA (Genbank Ac. U94848).
Figura 7: Analiza PCR sekwencji IGR I4L-I5L w rekombinowanym MVA z wstawionym NS1 z wirusa Dengue w IGR I4L-I5L. Linia „BN” odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego N1 MVA wykrywalny jest większy fragment (1, 2, 3, 4: różne stężenia DNA). M = wagowy marker molekularny, H2O = wodna kontrola negatywna.
Figura 8: Figura 8a: Analiza PCR sekwencji IGR 136-137 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM4 z wirusa Dengue w IGR 136-137. Linia „BN” odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM4 MVA wykrywalny jest większy fragment (mBN23, 1/10, 1/100: różne stężenia DNA). M = wagowy marker molekularny, H2O = wodna kontrola negatywna; pBN27 = plazmidowa kontrola pozytywna.
Figura 8b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wektora ze wstawionym PrM4 w IGR 136-137 MVA (MVA-mBN23).
Figura 9: Figura 9a: Analiza PCR sekwencji IGR 07-08 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM2 z wirusa Dengue w IGR 07-08. Linia 3 odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM2 MVA wykrywalny jest większy fragment (2 linia). M = wagowy marker molekularny, 1 linia = wodna kontrola negatywna.
Figura 9b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wirusa ze wstawionym PrM2w IGR 07-08 MVA (MVA-mBN25).
Figura 10: Figura 8a: Analiza PCR sekwencji IGR 07-08 w rekombinowanym MVA z wstawionym env HIV w IGR 07-08. Linia BN odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM2 MVA wykrywalny jest większy fragment (1, 2, 3 linia). M = wagowy marker molekularny, - = wodna kontrola negatywna; + = plazmidowa kontrola pozytywna.
Figura 11: Figura 11a: Analiza PCR sekwencji IGR 44-45 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM3 z wirusa Dengue, w miejscu IGR 44-45. Linia BN odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM3 MVA wykrywalny jest większy fragment (linia 1-4: różne stężenia DNA). M = wagowy marker molekularny, - = wodna kontrola negatywna.
Figura 11b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wektora ze wstawionym PrM3 w IGR 44-45 MVA (MVA-mBN28).
Figura 12: Figura 12a: Analiza PCR sekwencji IGR 148-149 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM1 z wirusa Dengue w miejscu IGR 148-149. Linia BN odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM1 MVA wykrywalny jest większy fragment (linia 1). M = wagowy marker molekularny, - = wodna kontrola negatywna; + = plazmidowa kontrola pozytywna.
Figura 12b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wektora ze wstawionym PrM1 w miejscu IGR 44-45 MVA (MVA-mBN33).
Niniejszy wynalazek ilustrują zamieszczone poniżej przykłady. Dla specjalistów w dziedzinie pozostaje jasne, że przytoczone tu przykłady w żaden sposób nie wpływają na ograniczenie niniejszego wynalazku do zaprezentowanych poniżej realizacji. Cel wynalazku jest ograniczony jedynie pełnym zakresem załączonych zastrzeżeń.
P r z y k ł a d 1
Wektory insercji pBNX39, pBNX70 i pBN84
W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji w między genowym obszarze sąsiadującym z 065L ORF (miejsce insercji w pozycji 56760 genomu) MVA, otrzymano wektor zawierający około 1200 pz sekwencji flankujących, sąsiadujących z miejscem insercji. Wspomniane sekwencje flankujące są rozdzielone na dwa fragmenty zawierające po jednej stronie około 610 pz z 065L ORF (nazewnictwo alternatywne: I4L ORF) a na drugiej stronie około 580 pz z międzygenowego obszaru znajdującego się za 065L ORF, jak również części najbliższej ORF. Między tymi sekwencjami flankującymi, zlokalizowany jest odpowiednio, gen Ecogpt (gpt oznacza gen fosforybozylotransferazy wyizolowany z E.coli) i BFP (niebieskie białko fluorescencyjne), pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy. Ponadto, istnieje przynajmniej jedno miejsce klonowania odpowiednie dla wstawienia dodatkowych
PL 216 760 B1 genów lub sekwencji wstawianych do międzygenowego obszaru znajdującego się za I4L ORF. Przykładową strukturę wektora według wynalazku ujawniono na Figurze 1a) oraz b) (pBNX39, pBNX70). W wektorze pBN84 (Figura 1c) region kodujący białko NS1 z wirusa Dengue wstawiony jest w miejscu klonowania pBNX70 (Figura 1b).
Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej
Obce geny mogą być wstawiane do genomu MVA poprzez rekombinację homologiczną. W tym celu, pożądany obcy gen jest klonowany do wektora plazmidowego, zgodnie z powyższym opisem. Wektor ten jest transfekowany w zainfekowanych MVA komórkach. Rekombinacja przebiega w cytoplazmie zainfekowanych i transfekowanych komórek. Komórki zawierające rekombinowane wirusy są identyfikowane i izolowane przy użyciu kasety selekcyjnej i/lub reporterowej, również zawartej w strukturze wektora insercji.
W celu uzyskania rekombinacji homologicznej, komórki BHK (komórki nerki młodego chomika) lub CEF (pierwotne fibroblasty embrionu kurcząt) są zaszczepiane na 6 studzienkowych płytkach, przy zastosowaniu podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco BRL) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) lub VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/1 L-glutaminy w przypadku produkcji bez surowicy.
Konieczne jest uzyskanie komórek pozostających w fazie wzrostu, a zatem powinny one osiągnąć 60-80% konfluencji w dniu transfekcji. W celu dokonania infekcji, komórki zliczano przed zaszczepieniem, ponieważ liczba komórek powinna być znana dla określenia poziomu multiplikacji infekcji (moi).
W celu infekcji, roztwór wyjściowy MVA rozcieńczano w DMEM/FCS lub VP-SFM/L-glutaminie, tak by uzyskać 500 μΐ rozcieńczenia, zawierającego odpowiednią ilość wirusa, dającego 0.1 - 1.0 moi. Komórki gromadzono, po czym dzielono po zaszczepieniu. Rozdzielano podłoże od komórek, które infekowano 500 μΐ rozcieńczonego wirusa, wytrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuwano inokulum i przemywano komórki DMEM/VP-SFM. Podczas reakcji transfekcji zainfekowane komórki pozostawiano w 1.6 ml, odpowiednio, DMEM/FCS i VP-SFM/L-glutaminie (zestaw Qiagen Effectene Kit).
W celu dokonania transfekcji, zastosowano zestaw do transfekcji „Effectene” (Qiagen). Otrzymano mieszaninę transfekcyjną zawierającą 1-2 μg zlinearyzowanego wektora insercji (całkowita ilość dla wielokrotnej transfekcji) w buforze EC o końcowym stężeniu 100 μΙ. Dodano 3.2 μl Enhancera, wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie, po wymieszaniu zawartości probówki z roztworem wyjściowym dodano do 10 μl Effectene i wymieszano gruntownie roztwór wstrząsając i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Dodano, odpowiednio, 600 μl DMEM/FCS i VP-SFM/L-glutaminy, wymieszano, a następnie pełną mieszaninę transfekcyjną przeniesiono do komórek, pokrytych już podłożem. Delikatnie poruszano płytką, W celu wymieszania mieszaniny reakcyjnej. Całonocna inkubacja przebiegała w 37°C, w atmosferze 5% C02. Następnego dnia podłoże usuwano, zastępowano świeżym DMEM/FCS lub VP-SFM/L-glutaminą. Inkubację kontynuowano do 3 dnia. W celu zebrania komórek, komórki zeskrobywano do podłoża, następnie przenoszono zawiesinę komórkową do odpowiedniej probówki i zamrażano w -20°C dla krótkoterminowego przechowywania lub w -80°C w przypadku długiego okresu przechowywania.
Wstawienie Ecogpt w miejscu insercyjnym I4L w MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBNX39 (Figura 1a), zawierającym gen Ecogpt (Ecogpt, lub skrócony do gpt, dla określenia genu fosforybozylotransferazy), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 3 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek” w podłożu selekcyjnym dla metabolizmu fosforybozylotransferazy, poprzez dodanie kwasu mykofenolowego, ksantyny i hipoksantyny. Kwas mykofenolowy (MPA) inhibituje dehydrogenazę monofosforanu inozyny, powodując blokadę syntezy puryn, a przez to zatrzymując replikację wirusa w większości linii komórkowych. Blokada ta może zostać ominięta poprzez ekspresję Ecogpt pod kontrolą konstytutywnego promotora i dostarczenie substratów, ksantyny i hipoksantyny.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji I4L, BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1) oraz BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynoPL 216 760 B1 siła 328 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany MVA, z wbudowanym egzogennym DNA w miejscu insercji I4L, fragment był odpowiednio dłuższy.
Wstawienie NS1 w miejscu insercji IGR064L-065L (I4L-I5L) wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo, transfekowano wektorem insercji pBN84 (Figura 1 c), zawierającym gen Ecogpt do selekcji i BFP (niebieskie białko fluorescencyjne), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 7 cykli oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym dla metabolizmu fosforybozylotransferazy, poprzez dodanie kwasu mykofenolowego, ksantyny i hipoksantyny. Kwas mykofenolowy (MPA) inhibituje dehydrogenazę monofosforanu inozyny, powodując blokadę syntezy puryn oraz zatrzymanie replikacji wirusa w większości linii komórkowych. Blokada ta może zostać ominięta poprzez ekspresję Ecogpt pod kontrolą konstytutywnego promotora i dostarczenie substratów ksantyny i hipoksantyny.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji I4L, BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1) oraz BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 328 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany genem NS1 wirus MVA, z wbudowanym regionem kodującym NS1 z wirusa Dengue w miejscu insercji I4L, oczekiwany fragment był długości 1683 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 7, wskazują jasno na stabilną insercję NS1 w miejscu insercji I4L po 17 cyklach amplifikacji wirusa.
Testowanie in vitro recMVA zawierającego NS1 (MVA-BN22)
Kolbę T25 z około 80% konfluencją pojedynczej warstwy komórek BHK inkubowano z 100 μΐ roztworu wirusa rozcieńczonego do 1x107 w ΜΕΜα z 1% FCS i mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do każdej kolby dodano 5 ml MEMα z 3% FCS i inkubowano w 30°C, w atmosferze CO2. Kolby wyjmowano po 48 godzinach. Usuwano supernatant i wirowano przy 260 g przez 10 minut w 4°C. Supernatanty przechowywano w porcjach w -80°C. Osad przemywano dwukrotnie 5 ml 1xPBS, a następnie zawieszano ponownie w 1 ml hipotonicznego buforu z 1% TX100. Gromadzono supernatanty lizaty komórkowe i wirowano przez 5 minut przy 16,000 g, płyny znad osadu przechowywano w probówkach do wirowania w -80°C.
Kolby zaszczepiano MVA zawierającym GFP, MVA zawierającym gen NS1 w miejscu delecji (MVA-BN07), w ten sam sposób postąpiono w przypadku próbnie infekowanych kolb.
Lizat komórkowo/wirusowy i płyn znad osadu dodawano do nieredukującego/redukującego buforu do próbek w warunkach nieogrzewania/ogrzewania. Białka rozdzielano w 10% SDS PAGE i przenoszono na membrany nitrocelulozowe. Do blotów dodawano sondy i pozostawiano na noc wraz z surowicą pobraną od rekonwalescentów (PPCS), w rozcieńczeniu 1:500. Po trzykrotnym przemyciu 1xPBS, bioty inkubowano wraz z przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG-HRP (DAKO) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po przemyciu blotów jak wyżej, rozwijano reakcję barwną stosując 4-chloro-1-naftol.
Wyniki uzyskane z techniki western-blot wskazują, że NS1 w MVA-BN22 ulega ekspresji w dużych ilościach. NS1 było ekspresjonowane w prawidłowej konformacji, jako dimer w warunkach nieogrzewania i jako monomer w warunkach ogrzewania.
Porównywano poziom ekspresji NS1 zarówno w MVA-BN22, jak i w MVA-BN07. Komórki BHK zaszczepiano taką samą ilością pfu i zbierano po 48 godzinach. Na podstawie wyników stwierdzono, że ekspresja NS1 była znacznie wyższa w BN22 niż w BN07. Rezultaty otrzymane z western blot wskazują również, że więcej NS1 jest wydzielanego w supernatancie z BN22, w porównaniu z BN07.
Wyniki świadczą również o tym, że NS1 ekspresjonowane w komórkach infekowanych BN22 jest antygenne i rozpoznawane przez surowicę pobraną od rekonwalescentów.
Podsumowując, NS1 ulega ekspresji w dużych ilościach i w prawidłowej konformacji w komórkach BHK zainfekowanych BN22. Zarówno dimer, jak i monomer, są antygenne i rozpoznawane przez surowicę z próbek pobranych od rekonwalescentów.
P r z y k ł a d 2
Wektor insercyjny pBNX67 i pBN27.
Sekwencje sąsiadujące z nowym miejscem insercji MVA (pozycja 129940 w genomie) między ORF 136L a 137L wyizolowano stosując standardową technikę amplifikacji pożądanych sekwencji PCR z użyciem następujących starterów: oBN543 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTA16
PL 216 760 B1
GAT; SEQ ID NO.: 3) oraz BN544 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT; SEQ ID NO.: 4) do wyizolowania Flank 1; oBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 5) oraz oBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID NO.: 6) do wyizolowania Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddawano działaniu enzymów restrykcyjnych Sacll i Xbal i ligowano w trawionym Sac ll/Xba l i defosforylowanym wektorze podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
Tak otrzymany plazmid trawiono Xhol/Apal, defosforylowano i ligowano do trawionego Xhol/Apal fragmentu PCR, zawierającego Flank 2.
Dowolnie, wstawiano w miejscu Hindll/Pstl otrzymanego wektora sekwencję powtórzeniową z Flank 2, wyizolowaną przy zastosowaniu PCR i użyciu starterów oBN545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 7) oraz oBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID NO.: 8), i trawioną HindIII/PstI Figurze 2a) przedstawiono wektor (pBNX51).
Kasetę reporterową zawierającą syntetyczny promotor, gen NPT II (oporności na neomycynę), gen regionu poli-A, IRES, EGFP (Ps-NPTIII-poliA-IRES-EGFP), trawiono EcII/36II/Xhol i wstawiano do miejsca HindllI/Xhol wektora insercji, przy czym miejsce HindIII było wyrównane przy użyciu polimerazy T4 DNA (Roche). Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według opisanego przykładu ujawniono na Figurze 2b) (pBNX67).
W celu otrzymania pBN27 (Fig. 2c), wstawiano serotyp 4 PrM z wirusa Dengue w pojedynczym miejscu PacI w pBNX67.
Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej
Do uzyskania rekombinowanego MVA można zastosować wektor pBNX67 (Figura 2b) przy użyciu opisanego wyżej protokołu - np., użycie pBN27 (Fig. 2c) do rekombinacji homologicznej pozwala na uzyskanie rekombinowanego MVA zawierającego PrM4 z wirusa Dengue w obszarze międzygenowym, między dwiema sąsiednimi ORF.
Wstawienie PrM4 w miejscu insercji IGR136-137 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN27 (Figura 2c), zawierającym gen NPT do selekcji i EGFP (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 4 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym G418.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR 136-137, BN900 (cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID NO.: 9) oraz BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEQ ID NO.: 10). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 88 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany PrM4 MVA, z wbudowanym regionem kodującym PrM4 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGRl136-137 oczekiwany fragment był długości 880 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 8a, wskazują jasno na stabilną insercję PrM4 w miejscu insercji IGRl36-137 po 22 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA nadal wykazywał takie same właściwości wzrostu jak MVA-BN. Ulegał on replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórki CEF) i wzrastał atenuowany w komórkach ssaczych (Fig. 8b).
P r z y k ł a d 3
Wektor insercyjny pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 i pBN56
Sekwencje sąsiadujące z nowym miejscem insercji MVA (pozycja 12800 w genomie) między ORF 007R a 008L wyizolowano stosując standardową technikę amplifikacji pożądanych sekwencji PCR z użyciem następujących starterów: IGR 07/08 F1up (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ ID NO.: 11) oraz IGR 07/08 Flend (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEQ ID NO.: 12) do wyizolowania Flank 1; IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) oraz IGR 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID NO.: 14) do wyizolowania Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddawano działaniu enzymów restrykcyjnych SacII i Sacl i ligowano w trawionym Sac ll/Sacl i defosforylowanym wektorze podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
PL 216 760 B1
Tak otrzymany plazmid trawiono XhoI/Apal, defosforylowano i ligowano do trawionego XhoIApal fragmentu PCR, zawierającego Flank 2.
Dowolnie, wstawiano w miejscu BamHI/Pstl otrzymanego wektora sekwencję powtórzeniową z Flank 2, wyizolowaną przy zastosowaniu PCR i użyciu starterów IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) oraz IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA; SEQ ID NO.: 15), i trawioną BamHI/Pstl.
Jakakolwiek kaseta zawierająca gen reporterowy lub terapeutyczny, posiadająca np., promotor wirusa ospy, gen markerowy, region poli-A i dowolnie element IRES, inny gen, np., ekspresjonujący substancję o aktywności terapeutycznej lub produkt genu, może być wyrównana na końcach przy użyciu polimerazy T4 DNA (Roche) po trawieniu restrykcyjnym, po czym wstawiona w odpowiednim miejscu klonowania wektora plazmidowego. Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według opisanego przykładu ujawniono na Figurze 3b) (pBNX79). Odpowiednio, insercja kasety selekcyjnej NPT/EGFP daje w wyniku wektor pBNX86 (Fig. 3b), insercja kasety selekcyjnej gpt/BFP daje w wyniku wektor pBNX88 (Fig. 3c). Przyjmując za jednostkę ekspresji gen terapeutyczny, włączając gen terapeutyczny i operacyjnie związany promotor, taka jednostka ekspresji wstawiana jest w miejscu Pad. W celu otrzymania pBN34 (Fig. 3d) PrM2 z wirusa Dengue klonowany jest w pBNX88 (Fig. 3c) a dla syntezy pBN56 (Fig. 3e) region kodujący env HIV klonowany jest w Pacl w wektorze pBNX86 (Fig. 3b).
Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej
Do uzyskania rekombinowanego MVA można zastosować wektor pBNX86 (Fig. 3b) i wektor pBNX88 (Fig. 3c) przy użyciu opisanego wyżej protokołu. Zastosowanie pBN34 (Fig. 3d) do rekombinacji homologicznej pozwala na uzyskanie rekombinowanego MVA zawierającego PrM2 z wirusa Dengue w obszarze międzygenowym, między dwiema sąsiednimi ORF. Rekombinacja pBN56 (Figura 3e) z genomem MVA-BN daje w wyniku rekombinowany MVA, zawierający gen env HIV w odpowiednim IGR.
Wstawienie PrM2 w miejscu insercji IGR07-08 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN34 (Fig. 3d), zawierającym gen gpt do selekcji i BFP, jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 3 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym kwasu mykofenolowego, jak opisano w Przykładzie 1.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR07-08, BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) oraz BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 190 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany PrM2 MVA, z wbudowanym regionem kodującym PrM2 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGR07-08 oczekiwany fragment był długości 950 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 9a), wskazują jasno na stabilną insercję PrM2 w miejscu insercji IGR07-08 po 20 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA nadal wykazywał takie same właściwości wzrostu jak MVA-BN. Ulegał on replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórki CEF) i wzrastał atenuowany w komórkach ssaczych (Fig. 9b).
Wstawienie env HIV w miejscu insercji IGR07-08 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN56 (Fig. 3e), zawierającym gen NPT do selekcji i EGFP, jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano w 6 cyklach oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym G418.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR07-08, BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) oraz BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 190 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany env MVA, z wbudowanym regionem kodującym env HIV w miejscu insercji IGR07-08, oczekiwany fragment był długości 2.6 kz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 10, wskazują jasno na stabilną insercję env w miejscu insercji IGR07-08 po 20 cyklach amplifikacji wirusa.
PL 216 760 B1
P r z y k ł a d 4
Wektor insercyjny pBNX80, pBNX87 i pBN47
Sekwencje sąsiadujące z nowym miejscem insercji MVA (pozycja 37330 w genomie) między ORF 044L a 045L wyizolowano stosując standardową technikę amplifikacji pożądanych sekwencji PCR z użyciem następujących starterów:
IGR 44/45 F1up (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ ID NO.: 18) oraz IGR 44/45 Flend (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEQ ID NO.: 19) do wyizolowania Flank 1; IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID NO.: 20) oraz IGR 44/45 F2end (CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT; SEQ ID NO.: 21) do wyizolowania Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddawano działaniu enzymów restrykcyjnych Sacll i Sacl i ligowano w trawionym Sac Il/Sac l i defosforylowanym wektorze podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
Tak otrzymany plazmid trawiono XhoI/Apal, defosforylowano i ligowano do trawionego XhoI/Apal fragmentu PCR, zawierającego Flank 2.
Dowolnie, wstawiano w miejscu BamHI/Pstl otrzymanego wektora sekwencję powtórzeniową z Flank 2, wyizolowaną przy zastosowaniu PCR i użyciu starterów IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID NO.: 20) oraz IGR 44/45 F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG; SEQ ID NO.: 22), i trawioną BamHl/PstI
Jakakolwiek kaseta zawierająca gen reporterowy lub terapeutyczny, posiadająca np., promotor wirusa ospy, gen markerowy, region poli-A i dowolnie element IRES, inny gen, np., ekspresjonujący substancję o aktywności terapeutycznej lub produkt genu, może być wyrównana na końcach przy użyciu polimerazy T4 DNA (Roche) po trawieniu restrykcyjnym, po czym wstawiana w odpowiednim miejscu klonowania wektora plazmidowego. Rozważając położenie kasety genu reporterowego, korzystnym miejscem klonowania jest miejsce enzymu restrykcyjnego Pstl, EcoRl, EcoRV, Hindlll, Aval lub Xhol, między Flank 2 a powtórzeniem Flank 2. W celu otrzymania pBNX87 (Fig. 4b), kaseta selekcyjna NPT/EGFP wstawiona została w pBNX80 (Fig. 4a). Przyjmując za 9 jednostkę ekspresji gen terapeutyczny, włączając gen terapeutyczny i operacyjnie związany promotor, taka jednostka ekspresji wstawiana jest w miejscu PacI.
Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według opisanego przykładu ujawniono na Figurze 4a) i b) (pBNX80, pBNX87).
Wektor może być zastosowany do otrzymania rekombinowanego MVA - w następstwie powyższego protokołu - przenoszącego egzogenną sekwencję w międzygenowym obszarze między dwiema sąsiednimi ORF. W celu otrzymania pBN47 (Fig. 4c) PrM serotyp 3 z wirusa Dengue klonowany był w pBNX87 (Fig. 4b).
Wstawienie PrM3 w miejscu insercji IGR44-45 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN47 (Fig. 4c), zawierającym gen NPT do selekcji i EGFP, jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 3 cykle oczyszczania na płytkach metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym G418.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR44-45, BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID NO.: 23) oraz BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID NO.: 24). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 185 nukleotydów gdy amplifikowano rekombinowany MVA dla PrM3, z wbudowanym regionem kodującym PrM3 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGR44-45, oczekiwana długość fragmentu wynosiła 850 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 11 a) jasno wskazują na stabilną insercję PrM3 w miejscu insercji IGR44-45 po 19 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA wciąż wykazuje te same właściwości wzrostu jak MVA-BN. Ulega replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórkach CEF) i wzrasta atenuowany w komórkach ssaków (Fig. 11b).
P r z y k ł a d 5
Wektor insercji pBNX90, pBNX92 i pBN54
Sekwencje w MVA sąsiadujące z nowym miejscem insercji (w pozycji 137496 genomu) pomiędzy ORF 148R a 149L, wyizolowano stosując standardową amplifikację PCR pożądanej sekwencji, przy użyciu następujących starterów:
PL 216 760 B1
IGR148/149F1up (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG; SEQ ID NO.: 25) oraz IGR148/149Flend (CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID NO.: 26) dla izolacji Flank 1;
IGR 148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) oraz IGR148/149F2end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEQ ID NO.: 28) dla izolacji Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddano działaniu enzymów restrykcyjnych SacII/ Xbal oraz ligacji z trawionym SacII/Xbal i defosforylowanym wektorem podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
Uzyskany plazmid trawiono Hindlll/Apal, defosforylowano i ligowano z trawionym HindIII/Apal fragmentem PCR zawierającym Flank 2.
Dowolnie, sekwencje powtórzeniowe Flank 2, wyizolowane poprzez PCR z użyciem starterów IGR148/149 F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) oraz IGR148/149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID NO.: 29) i trawione BamHI/Pstl, wstawiano w miejscu BamHI/Pstl otrzymanego wektora.
Jakakolwiek kaseta obejmująca gen reporterowy lub terapeutyczny, posiadająca np. promotor wirusa ospy, gen markerowy, region poli-A oraz dowolnie element IRES, dodatkowy gen, np., ekspresjonujący aktywną terapeutycznie substancję lub produkt genu, może być strawiona na końcach wyrównana przy użyciu Polimerazy T4 DNA (Roche) po trawieniu restrykcyjnym, a następnie wstawiona do stabilnego miejsca klonowania wektora plazmidowego. W celu otrzymania pBNX92 (Fig. 5b), w miejscu klonowania wstawiono kasetę ekspresyjną gpt/BFP. Biorąc pod uwagę kasetę genu reporterowego, korzystnym miejscem klonowania jest miejsce enzymów restrykcyjnych PstI, EcoRl, EcoRV i Hindlll między Flank 2 a Flank-2 powtórzeniem. Biorąc pod uwagę jednostkę ekspresji dla genu 9 terapeutycznego, obejmującą gen terapeutyczny wraz z połączonym operacyjnie promotorem, taka jednostka ekspresji wstawiana jest w miejscu PacI. W celu otrzymania pBN54 (Fig. 5c), PrM1 z wirusa Dengue wstawiano w tym miejscu PacI.
Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według niniejszego Przykładu zamieszczono na Figurze 5a) i b) (pBNX90, pBNX92).
Wektor może być użyty do otrzymywania rekombinowanego MVA - w następstwie wyżej opisanego protokołu - przenosząc egzogenne sekwencje w międzygenowym obszarze pomiędzy dwiema sąsiadującymi ORF. W celu uzyskania rekombinowanego MVA zastosowano do rekombinacji homologicznej ekspresjonujący PrM1 z wirusa Dengue pBN54 (Fig. 5c).
Insercja PrM1 w miejscu insercyjnym IGR148-149 w MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według opisanego wyżej protokołu oraz dodatkowo transfekowano wektorem insercyjnym pBN54 (Fig. 5c), zawierającym gen gpt do selekcji oraz BFP jako gen reporterowy. Uzyskane w ten sposób rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez trzy cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek” w warunkach selekcji kwasem mykofenolowym.
Tak otrzymane wirusy identyfikowano stosując standardową analizę PCR z użyciem pary starterów selektywnie amplifikujących oczekiwane miejsce insercji. Do amplifikacji miejsca insercji IGR148149, zastosowano parę starterów BN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID NO.: 30) oraz BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEQ ID NO.: 31). W przypadku, gdy DNA pustego wektora wirusowego MVA ulega amplifikacji, oczekiwany fragment PCR jest długości 450 nukleotydów (nt), w przypadku. Gdy rekombinowany PrM1 MVA ulega amplifikacji posiadający wbudowany region kodujący PrM1 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGR148-149, oczekiwany fragment obejmuje 1200 pz. Wyniki PCR przedstawione na Fig, 12a wskazują jasno na stabilną insercję PrM1 w miejscu insercyjnym IGR148-149 po 23 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA wykazuje wciąż te same właściwości wzrostu, co MVA-BN. Ulega replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórki CEF) i wzrasta atenuowany w komórkach ssaczych (Fig. 12b).
PL 216 760 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Bavarian Nordic A/S <120> Międzygenowe obszary jako miejsca insercji w genomie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA)
| <130> | BN45PCT |
| <150> | DK PA 2002 00752 |
| <151> | 2002-05-16 |
| <160> | 37 |
| <170> | wersją 3.1 Patentl· |
| <210> | 1 |
| <211> | 20 |
| <212> | DNA |
| <213> | primer |
| <400> 1 caactctctt cttgattacc | |
| <210> | 2 |
| <211> | 19 |
| <212> | DNA |
| <213> | primer |
| <400> 2 cgatcaaagt caatctarg | |
| <210> | 3 |
| <211> | 33 |
| <212> | DNA |
| <213> | primer |
PL 216 760 B1
| <400> 3 tccccgcgga gaggcgtaaa | agttaaatta | gat | 33 | |
| <210> | 4 | |||
| <211> | 33 | |||
| <212> | DNA | |||
| <213> | primer | |||
| <400> 4 tgatctagaa tcgctcgtaa | aaactgcgga | ggt | 33 | |
| <210> | 5 | |||
| <211> | 29 | |||
| <212> | DNA | |||
| <213> | primer | |||
| <400> 5 ccgctcgagt tcacgttcag | ccttcatgc | 29 | ||
| <210> | 6 | |||
| <211> | 32 | |||
| <212> | DNA | |||
| <213> | primer | |||
| <400> 6 cgggggccct attttgtata | atatctggta | ag | 32 | |
| <210> | 7 | |||
| <211> | 35 | |||
| <212> | DNA | |||
| <213> | primer | |||
| <400> 7 cggctgcagg gtaccttcac | gttcagcctt | catgc | 35 |
<210> 8 <211> 34 <212> DNA <213>- primer
PL 216 760 B1 <400> 8 cggaagcttt atatggttta ggatattctg tttt 34 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 9 cgttcgcatg ggttacctcc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 10 gacgcatgaa ggctgaac 1° <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 11 cgcgagctca ataaaaaaaa gttttac <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 12 aggccgcgga tgcatgttat gcaaaatat 4.
<210> 13 <211> 36 <212> DNA
PL 216 760 B1 <213> primer <400> 13 ccgctcgagc gcggatccca atatatggca tagaac <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 14 cagggccctc tcatcgcttt catg 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400>
<400> 15 tttctgcagt gatatttatc caatacta <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 16 ctggataaat acgaggacgt g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 17 gacaattatc cgacgcaccg 20 <210> 18 <211> 29
PL 216 760 B1 <212>
DNA <213>
primer <400> 18 cgcgagctca tttcttagct agagtgata <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 19 aggccgcgga gtgaaagcta gagaggg 27 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> primer <400> 20 ccgctcgagc gcggatccta aactgtatcg attatt <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 21 cagggcccct aaatgcgctt ctcaat 26 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 22 tttctgcagc cttcctgggt ttgtattaac g <210> 23
PL 216 760 B1 <211>
<212>
DNA <2Χ3>
primer <400> 23 cgttagacaa cacaccgacg atgg <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 24 cggatgaaaa atttttggaa g 21 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 25 tccccgcggg gactcataga ttatcgacg <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 26 ctagtctaga ctagtctatt aatccacaga aatac 35 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> primer <400> 27 cccaagcttg ggcgggatcc cgtttctagt atggggatc
PL 216 760 B1
| <210> | .28 |
| <211> | 26 |
| <212> | DNA |
| <213> | primer |
| <400> | 28 |
tagggcccgt tattgccatg atagag <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 29 tttctgcagt gtataatacc acgagc <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 30 ctgtataggt atgtcctctg cc <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 31 gctagtagac gtggaaga <210> 32 <211> 1192 <212> DNA <213> wirus krowianki <22O>
PL 216 760 B1 <221> Fragment ORF C 64L <222> Cl)..<526) <223>
<220>
<221> IGR 64-65 <222> (527).,(608) <223>
<22O>
<221> Fragment ORF C 65L <222> (609)..(1190) <223>
| <400> 32 caccttctat | agatctgaga | atggatgatt | ctccagtcga | aacatattct | accatggatc | 60 |
| cgtttaattt | gttgatgaag | atggattcat | ccttaaatgt | tttctctgta | atagtttcca | 120 |
| ccgaaagact | atgcaaagaa | tttggaatgc | gttccttgtg | cttaatgttt | ccatagacgg | 180 |
| cttctagaag | ttgatacaac | ataggactag | ccgcggtaac | ttttattttt | agaaagtatc | 240 |
| catcgcttct | atcttgttta | gatttatttt | tataaagttt | agtctctcct | tccaacataa | 300 |
| taaaagtgga | agtcatttga | ctagataaac | tatcagtaag | ttttatagag | atagacgaac | 360 |
| aattagcgta | ttgagaagca | tttagtgtaa | cgtattcgat | acattttgca | ttagatttac | 420 |
| taatcgattt | tgcatactct | ataacacccg | cacaagtctg | tagagaatcg | ctagatgcag | 480 |
| taggtcttgg | tgaagtttca | actctcttct | tgattacctt | actcatgatt | aaacctaaat | 540 |
| aattgtactt | tgtaatataa | tgatatatat | tttcacttta | tctcatttga | gaataaaaat | 600 |
| gtttttgttt | aaccactgca | tgatgtacag | atttcggaat | cgcaaaccac | cagtggtttt | 660 |
| attttatcct | tgtccaatgt | gaattgaatg | ggagcggatg | cgggtttcgt | acgtagatag | 720 |
| tacattcccg | tttttagacc | gagactccat | ccgtaaaaat | gcatactcgt | tagtttggaa | 780 |
| taactcggat | ctgctatatg | gatattcata | gattgacttt | gatcgatgaa | ggctcccctg | 840 |
| tctgcagcca | tttttatgat | cgtcttttgt | ggaatttccc | aaatagtttt | ataaactcgc | 900 |
| ttaatatctt | ctggaaggtt | tgtattctga | atggatccac | catctgccat | aatcctattc | 960 |
| ttgatctcat | cattccataa | ttttctctcg | gttaaaactc | taaggagatg | cggattaact | 1020 |
| acttgaaatt | ctccagacaa | tactctccga | gtgtaaatat | tactggtata | cggttccacc | 1080 |
| gactcattat | ttcccaaaat | ttgagcagtt | gatgcagtcg | gcataggtgc | caccaataaa | 1140 |
PL 216 760 B1 ctatttctaa gaccgtatgt tctgatttta tcttttagag gttcccaatt cc 1192 <210> 33 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <22O>
<22ł> Fragment ORF 135r <222> (1) .. (96) <223>
<22O>
<221> ORF C 136L <222> (101)..(298) <223>
<220>
<221> IGR 136-137 <222> (299)..(883) <223>
<220>
<221> Fragment ORF c 137L <222> (884)..(1198) <223>
<400> 33 agaggcgtaa aagttaaatt agatttcgaa cgaaggcctc cttcgtttta taaaccatta 60 gataaagttg atctcaaacc gtcttttctg gtgtaatatt ctagtttggt agtagataca 120 tatcaatatc atcaaattcg agatccgaat tataaaatgg gcgtggattg ttaactatag 180 aatcggacgt ctgatattcg aaaatctgtg gagttttagg ttttggtgga ggtgtaactg 240 ctacttggga tactgaagtc tgatattcag aaagctgggg gatgttctgg ttcgacatcc 300 accgatggtg tcacatcact aatcggttcg gtaacgtctg tggacgatgg aggcaccact 360 tctacaggtt ctggttcttt atcctcagtc atcaacggag ctacttcaat gcgaggaaat 420
PL 216 760 B1 gtataatttg gtaatggttt ctcatgtgga tctgaagaag aggtaagata tctactagaa 480 agataccgat cacgttctag ttctcttttg tagaacttaa ctttttcttt ctccgcatct 540 agttgatatt ccaacctctt cacgttcgca tgggttacct ccgcagtttt tacgagcgat 600 ttcacgttca gccttcatgc gtcttatagc atgaattcgc ttatcgttat cgggtttagc 660 ttctgtcacc ttagcaattc cttttttatt aaactctaca taatcatatc catttctatt 720 gtttgttcta atataaacga gtatagcatc attgctaaat ttttcaatag tatcgaaaac 780 agaatatcct aaaccatata atatatattc aggaacactc aaactaaatg tccaggattc 840 tcctaaatac gtaaacttta atagtgcgaa atcattcaaa aatctaccac ttatagatag 900 atagatagta cataaatgcg tatagtagtc tacctatctc tttattatga aaaccggcat 960 tacgatcata tatgtcgtga tatacctgtg atccgtttac gttaaaccat aaatacatgg 1020 gtgatcctat aaacatgaat ttatttctaa ttctcagagc tatagttaat tgaccgtgta 1080 atatttgctt acatgcatac ttgatacgat cattaataag atttttatca rtgctcgtta 1140 tttcagaatc gtatatataa ggagtaccat cgtgattctt accagatatt atacaaaata 1200 <210> 34 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment ORF 07r <222> (1)..(338) <223>
<220>
<221> IGR 07-08 <222> (339)..(852) <223>
<220>
<221> Fragment orf c 08L <222> (853)..(1200) <223>
<400> 34
PL 216 760 B1
| aataaaaaaa | agttttacta | atttaaaatt | atttacattt | ttttcactgt | ttagtcgcgg | 60 |
| atatggaatt | cgatcctgcc | aaaatcaata | catcatctat | agatcatgta | acaatattac | 120 |
| aatacataga | tgaaccaaat | gatataagac | taacagtatg | cattateaca | aaaataaatc | 180 |
| cacatttggc | taatcaattt | cgggcttgga | aaaaacgtat | cgccggaagg | gactatatga | 240 |
| ctaacttatc | tagagataca | ggaatacaac | aatcaaaact | tactgaaact | gtcaaaaaaa | 300 |
| tagaaacata | tatggtctat | atatacacta | caatttagtt | attaattgga | taaccgatgt | 360 |
| gattatcaat | caatattaag | aaggttggta | aattggtaca | tagctaataa | tacctataca | 420 |
| cccaataata | caacaaccat | ttctgagttg | gatatcatca | aaatactgga | taaatacgag | 480 |
| gacgtgtata | gagtaagtaa | agaaaaagaa | tgtgaaattt | gctatgaagt | tgtttactca | 540 |
| aaacgataga | tactttggtt | tattggattc | gtgtaatcat | atattttgca | taacatgcat | 600 |
| caatatatgg | catagaacac | gaagagaaac | cggtgcgtcg | gataattgtc | ctatatgtcg | 660 |
| tacccgtttt | agaaacataa | caatgagcaa | gttaactaat | aaataaaaag | tttaatttgt | 720 |
| tgacgacgta | tgtcgttatt | ttttctcgta | taaaagatta | atttgattct | aatataatct | 780 |
| ttagtattgg | ataaatatca | attcaaatta | attccattag | attatatcat | aaataaaaat | 840 |
| agtagcacgc | actacttcag | ccaaatattc | ttttttgaaa | cgccatctat | cgtagtgagg | 900 |
| acacaagtga | acctataatg | agcaaattta ttagtatcgg | ttacatgaag | gactttacgt | 960 | |
| agagtggtga | ttccactatc | tgtggtacga | acggtttcat | cttctttgat | gccatcaccc | 1020 |
| agatgttcta | taaacttggt | atcctttgcc | aaccaataca | tatagctaaa | ctcaggcata | 1080 |
| tgttccacac | atcctgaaca | atgaaattct | ccagaagatg | ttacaatgtc | tagatttgga | 1140 |
| catttggttt | caaccgcgtt | aacatatgag | tgaacacacc | catacatgaa | agcgatgaga | 1200 |
<210> 35 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment ORF c 44L <222> (1),.(375) <223>
<22 0>
<221> IGR 44-45 <222> (376)..(647) <223>
PL 216 760 B1 <220>
<221> Fragment ORF c 45L <222> ¢648)..¢1200) <223>
<400> 35
| atttcttagc | tagagtgata | atttcgttaa | aacattcaaa | tgttgttaaa | tgatcggatc | 60 |
| taaaatccat | attttctggt | agtgtttcta | ccagcctaca | ttttgctccc | gcaggtaccg | 120 |
| gtgcaaatgg | ccacatttag | ttaacataaa | aacttataca | tcctgttcta | tcaacgattc | 180 |
| tagaatatca | tcggctatat | cgctaaaatt | ttcatcaaag | tcgacatcac | aacctaactc | 240 |
| agtcaatata | ttaagaagtt | ccatgatgtc | atcttcgtct | atttctatat | ccgtatccat | 300 |
| tgtagattgt | tgaccgatta | tcgagtttaa | atcattacta | atactcaatc | cttcagaata | 360 |
| caatctgtgt | ttcattgtaa | atttataggc | ggtgtattta | agttggtaga | ttttcaatta | 420 |
| tgtatcaata | tagcaacagt | agttcttgct | cctccttgat | tctagcatcc | tcttcattat | 480 |
| tttcttctac | gtacataaac | atgtccaata | cgttagacaa | cacaccgacg | atggcggccg | 540 |
| ccacagacac | gaatatgact | aaaccgatga | ccatttaaaa | acccctctct | agctttcact | 600 |
| taaactgtat | cgattattct | tttagaacat | gtataatata | aaaacattat | tctatttcga | 660 |
| atttaggctt | ccaaaaattt | ttcatccgta | aaccgataat | aatatatata | gacttgttaa | 720 |
| tagtcggaat | aaatagatta | atgcttaaac | tatcatcatc | tccacgatta | gagatacaat | 780 |
| atttacattt | tttttgctgt | ttcgaaactt | tatcaataca | cgttaataca | aacccaggaa | 840 |
| ggagatattg | aaactgaggc | tgttgaaaat | gaaacggtga | atacaataat | tcagataatg | 900 |
| taaaatcatg | attccgtatt | ctgatgatat | tagaactgct | aatggatgtc | gatggtatgt | 960 |
| atctaggagt | atctatttta | acaaagcatc | gatttgctaa | tatacaatta | tcattttgat | 1020 |
| taattgttat | tttattcata | ttcttaaaag | gtttcatatt | tatcaattct | tctacattaa | 1080 |
| aaatttccat | ttttaattta | tgtagccccg | caatactcct | cattacgttt | cattttttgt | 1140 |
| ctataatatc | cattttgttc | atctcggtac | atagattatc | caattgagaa | gcgcatttag | 1200 |
<210> 36 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment ORF 148R
PL 216 760 B1 <222> (1)..¢596) <223>
<220>
<221> IGR 148-149 <222> ¢597)..(855) <223>
<220>
<221> Fragment ORF C 149L <222> ¢856)..¢1200) <223>
| <400> 36 ctcatagatt | atcgacgatt | atactctgta | ttagttctgt | cggaggatgt | gttatctcta | 60 |
| tagataatga | cgtcaatggc | aaaaatattc | taacctttcc | cattgatcat | gctgtaatca | 120 |
| tatccccact | gagtaaatgt | gtcgtagtta | gcaagggtcc | tacaaccata | ttggttgtta | 180 |
| aagcggatat | acctagcaaa | cgattggtaa | catcgtttac | aaacgacata | ctgtatgtaa | 240 |
| acaatctatc | actgattaat | tattcgccgt | tgtctgtatt | cattattaga | cgagttaccg | 300 |
| actatttgga | tagacacata | tgcgatcaga | tatttgcgaa | taataagtgg | tattccatta | 360 |
| taaccatcga | caataagcag | tttcctattc | catcaaactg | tataggtatg | tcctctgcca | 420 |
| agtacataaa | ttctagcatc | gagcaagata | ctttaataca | tgtttgtaac | ctcgagcatc | 480 |
| cattcgactt | agtatacaaa | aaaatgcagt | cgtacaattc | tgtacctatc | aaggaacaaa | 540 |
| tattgtacgg | tagaattgat | aatataaata | tgagcattag | tatttctgtg | gattaataga | 600 |
| tttctagtat | ggggatcatt | aatcatctct | aatctctaaa | tacctcataa | aacgaaaaaa | 660 |
| aagctattat | caaatactgt | acggaatgga | ttcattctct | tctcttttta | tgaaactctg | 720 |
| ttgtatatct | actgataaaa | ctggaagcaa | aaaatctgat | aaaaagaata | agaataagat | 780 |
| caaggattat | tataaaataa | caatagttcc | tggttcctct | tccacgtcta | ctagctcgtg | 840 |
| gtattataca | catgcctagt | aatagtctct | ttgcgttgac | ggaaagcaga | ctagaaataa | 900 |
| caggctaaaa | tgttcagaca | ccataatagt | tcccaaccca | gataataaca | gagtaccatc | 960 |
| aacacattcc | tttaaactca | atcccaaacc | caaaaccgtt | aaaatgtatc | cggccaattg | 1020 |
| atagtagata | atgaggtgta | cagcgcatga | tgatttacac | agtaaccaaa | atgaaaatac | 1080 |
| tttagtaatt | ataagaaata | tagatggtaa | cgtcatcatc | aacaatccaa | taatatgccg | 1140 |
| gagagtaaac | attgacggat | aaaacaaaaa | tgctccgcat | aactctatca | tggcaataac | 1200 |
PL 216 760 B1 <210> 37 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment orf 018l <222> (1) ..(399) <223>
<220>
<22Ι> IGR 018L-019L <222> (400)..(607) <223>
<220>
<221> Fragment ORF c 019L <222> (608)..(1081) <223>
<220>
<221> obszar niekoduj ący <222> (1082)..(1200) <223>
<400> 37 ggatgagtag ttttcttctt taactttata ctttttacta atcatattta gactgatgta 60 tgggtaatag tgtttaaaga gttcgttctc atcatcagaa taaatcaata tctctgtttt 120 tttgttatac agatgtatta cagcctcata tattacgtaa tagaacgtgt catctacctt 180 attaactttc accgcatagt tgtttgcaaa tacggttaat cctttgacct cgtcgatttc 240 cgaccaatct gggcgtataa tgaatctaaa ctttaatttc ttgtaatcat tcgaaataat 300 ttttagtttg catccgtagt tatccccttt atgtaactgt aaatttctca acgcgatatc 360 tccattaata atgatgtcga attcgtgctg tatacccata ctgaatggat gaacgaatac 420 cgacggcgtt aatagtaatt tactttttca tctttacata ttgggtacta gttttactat 480
PL 216 760 B1 <210> 37 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment orf 018l <222> (1)..(399) <223>
<220>
<221> IGR 018L-019L <222> (400)..(607) <223>
<220>
<221> Fragment ORF c 019L <222> (608)..(1081) <223>
<220>
<221> obszar niekoduj ący <222> (1082)..(1200) <223>
<400> 37 ggatgagtag ttttcttctt taactttata ctttttacta atcatattta gactgatgta 60 tgggtaatag tgtttaaaga gttcgttctc atcatcagaa taaatcaata tctctgtttt 120 tttgttatac agatgtatta cagcctcata tattacgtaa tagaacgtgt catctacctt 180 attaactttc accgcatagt tgtttgcaaa tacggttaat cctttgacct cgtcgatttc 240 cgaccaatct gggcgtataa tgaatctaaa ctttaatttc ttgtaatcat tcgaaataat 300 ttttagtttg catccgtagt tatccccttt atgtaactgt aaatttctca acgcgatatc 360 tccattaata atgatgtcga attcgtgctg tatacccata ctgaatggat gaacgaatac 420 cgacggcgtt aatagtaatt tactttttca tctttacata ttgggtacta gttttactat 480
PL 216 760 B1 cataagttta taaattccac aagctactat ggaataagcc aaccatctta gtataacaca 540 catgtcttaa agtttattaa ttaattacat gttgttttat atatcgctac gaatttaaac 600 agagaaatca gtttaggaaa aaaaaatatc tatctacatc atcacgtctc tgtattctac 660 gatagagtgc tactttaaga tgagacatat ccgtgtcatc aaaaatatac tccattaaaa 720 tgattattcc ggcagcgaac ttgatattgg atatatcaca acctttgtta atatctacga 780 caatagacag cagtcccatg gttccataaa cagtgagttt atctttcttt gaagagatat 840 tttgtagaga tcttataaaa ctgtcgaatg acatcgcatt tatatcttta gctaaatcgt 900 atatgttacc atcgtaatat ctaaccgcgt ctatcttaaa cgtttccatc gctttaaaga 960 cgtttccgat agatggtctc atttcatcag tcatactgag ccaacaaata taatcgtgta 1020 taacatcttt gatagaatca gactctaaag aaaacgaatc ggctttatta tacgcattca 1080 tgataaactt aatgaaaaat gtttttcgtt gtttaagttg gatgaatagt atgtcttaat 1140 aattgttatt atttcattaa ttaatattta gtaacgagta cactctataa aaacgagaat 1200
Claims (46)
1. Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA), znamienny tym, że zawiera egzogenną sekwencję heterologicznego DNA wstawioną w międzygenowym obszarze (IGR) genomu wirusa.
2. MVA według zastrz. 1, znamienny tym, że egzogenna sekwencja heterologicznego DNA wstawiona jest w międzygenowym obszarze (IGR) między dwiema sąsiadującymi otwartymi ramkami odczytu (ORF), wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
3. MVA według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA zawiera przynajmniej jedną sekwencję kodującą, korzystnie pod kontrolą transkrypcyjną pokswirusowego elementu kontrolującego transkrypcję.
4. MVA według zastrz. 1, do 3, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA koduje jedno lub więcej białek, polipeptydów, peptydów, obcych antygenów lub epitopów antygenowych.
5. MVA według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z wirusa Dengue, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa zapalenia wątroby B, wirusa zapalenia wątroby C i/albo wirusów niedoboru odporności, korzystnie z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
6. MVA według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA pochodząca z wirusa Dengue wybrana jest z grupy obejmującej NS1 i PrM.
7. MVA według zastrz. 6, znamienny tym, że gen NS1 został wstawiony do IGR pomiędzy ORF 064L-065L.
8. MVA według zastrz. 6 lub 7, znamienny tym, że gen PrM pochodzi z jednego lub więcej z 4 serotypów wirusa Dengue.
9. MVA według zastrz. 6 do 8, znamienny tym, że gen PrM został wstawiony do IGR pomiędzy ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
10. MVA według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z wirusa niedoboru odporności i koduje env HIV.
11. MVA według zastrz. 10, znamienny tym, że gen env HIV został wstawiony do IGR między ORF 007R-008L.
12. MVA według zastrz. 1, do 11, znamienny tym, że jest to MVA zdeponowany w ECACC pod numerem dostępu V00083008.
13. MVA według zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że służy do stosowania jako lek i/lub szczepionka.
14. Zastosowanie MVA według zastrz. 1, do 13, do otrzymywania leku i/lub szczepionki do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom wirusowym i/lub chorobom proliferacyjnym.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem Dengue lub infekcji wirusem niedoboru odporności, korzystnie infekcji HIV.
16. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera MVA według zastrz. od 1 do 13.
17. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera MVA według zastrz. od 1 do 13 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik, adiuwant i/lub dodatek.
18. Sposób otrzymywania białka, polipeptydu, peptydu, antygenu lub epitopu in vitro, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
- infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA według zastrz. od 1 do 13,
- hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach,
- izolację i/lub wzbogacenie polipeptydu, białka, peptydu, antygenu, epitopu i/lub wirusa produkowanego przez wspomnianą komórkę gospodarza.
19. Sposób wprowadzania sekwencji DNA do komórki in vitro, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA jest homologiczna i/lub heterologiczna z genomem wspomnianej komórki, przy czym komórka ta jest infekowana MVA według zastrz. od 1 do 13
20. Komórka in vitro lub ex vivo zawierająca MVA według zastrz. od 1 do 13.
21. Wektor plazmidowy, znamienny tym, że zawiera - sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej;
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
PL 216 760 B1
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna'') drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną oraz
- korzystnie, kasetę genu selekcyjnego i/albo reporterowego.
22. Wektor plazmidowy według zastrz. 21, znamienny tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR znajdującego się między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
23. Wektor plazmidowy według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że IGR pochodna sekwencja zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqlD Nr 34;
- nr 376-647 z SeqlD Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
24. Wektor plazmidowy według zastrz. 21 do 23, znamienny tym, że sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
25. Wektor plazmidowy według zastrz. 21 do 24, znamienny tym, że sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiadujących ORF zawierają sekwencję wybraną są z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
26. Wektor plazmidowy według zastrz. 24 do 30, znamienny tym, że wspomnianym wirusem jest MVA zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008.
27. Sposób otrzymywania MVA według zastrz. 1, do 13, znamienny tym, że in vitro obejmuje następujące etapy:
- transfekcję komórki wektorem plazmidowym według zastrz. 21 do 26;
- infekcję transfekowanej komórki MVA;
- identyfikację, izolację i ewentualnie oczyszczenie MVA według zastrz. 1 do 13.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że komórka jest zainfekowana MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
29. DNA, znamienny tym, że zawiera:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną.
30. Sekwencja DNA według zastrz. 29, znamienna tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranych z grupy zawierającej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L137L, 148R-149L.
31. Sekwencja DNA według zastrz. 29 lub 30, znamienna tym, że sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
PL 216 760 B1
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
32. Sekwencja DNA według zastrz. 29 do 31, znamienna tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L- 045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
33. Sekwencja DNA według zastrz. 29 do 32, znamienna tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
34. Sekwencja DNA według zastrz. 34 do 40, znamienna tym, że sekwencja DNA ukierunkowuje wstawienie sekwencji heterologicznej do IGR genomu MVA zdeponowanego w ECACC pod numerem V00083008.
35. Zastosowanie wektora plazmidowego obejmującego:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, oraz
- miejsce klonowania wstawione we wspomnianej sekwencji IGR do insercji wspomnianej sekwencji heterologicznej, oraz
- korzystnie, kasetę genu reporterowego i/lub selekcyjnego do otrzymywania oraz/albo produkowania rekombinowanego MVA według zastrz. 1 do 13.
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
37. Zastosowanie według zastrz. 35 albo 36, znamienne tym, że sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
38. Zastosowanie według zastrz. od 35 do 37, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L- 045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
39. Zastosowanie według zastrz. od 35 do 38, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
PL 216 760 B1
40. Zastosowanie według zastrz. 35 albo 39, znamienne tym, że wspomniany wirus MVA jest MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
41. Zastosowanie DNA zawierającego sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, do otrzymania i/łub produkcji wektora plazmidowego według zastrz. od 21 do 26 i/lub otrzymania i/lub produkcji rekombinowanego MVA według zastrz. 1, do 13.
42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
43. Zastosowanie według zastrz. 41 albo 42, znamienne tym, że sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydowe:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
44. Zastosowanie według zastrz. od 41 do 43, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L- 045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
45. Zastosowanie według zastrz. od 41 do 44, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
46. Zastosowanie według zastrz. 41 do 46, znamienne tym, że wirusem MVA jest wirus MVA zdeponowany w ECACC pod numerem V00083008.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200200752 | 2002-05-16 | ||
| DKPA200200753 | 2002-05-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL372093A1 PL372093A1 (pl) | 2005-07-11 |
| PL216760B1 true PL216760B1 (pl) | 2014-05-30 |
Family
ID=29551228
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL372088A PL218318B1 (pl) | 2002-05-16 | 2003-05-14 | Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych |
| PL372093A PL216760B1 (pl) | 2002-05-16 | 2003-05-14 | Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL372088A PL218318B1 (pl) | 2002-05-16 | 2003-05-14 | Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (14) | US7338662B2 (pl) |
| EP (3) | EP1506301B1 (pl) |
| JP (4) | JP4895505B2 (pl) |
| KR (4) | KR101041691B1 (pl) |
| CN (6) | CN102719408A (pl) |
| AT (1) | ATE315660T1 (pl) |
| AU (4) | AU2003236646B2 (pl) |
| BR (2) | BR0310051A (pl) |
| CA (3) | CA2481799C (pl) |
| DE (1) | DE60303218T2 (pl) |
| DK (2) | DK1506301T3 (pl) |
| EA (3) | EA020230B1 (pl) |
| ES (1) | ES2256776T3 (pl) |
| IL (4) | IL164172A0 (pl) |
| MX (2) | MXPA04011194A (pl) |
| NO (3) | NO334273B1 (pl) |
| NZ (2) | NZ536502A (pl) |
| PL (2) | PL218318B1 (pl) |
| PT (1) | PT1407033E (pl) |
| SI (1) | SI1407033T1 (pl) |
| UA (1) | UA82479C2 (pl) |
| WO (2) | WO2003097845A1 (pl) |
Families Citing this family (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4101327C1 (pl) * | 1991-01-18 | 1991-10-24 | Mercedes-Benz Aktiengesellschaft, 7000 Stuttgart, De | |
| HU230198B1 (hu) * | 2000-11-23 | 2015-10-28 | Bavarian Nordic A/S | Módosított Vacciniavírus Ankara-variáns |
| WO2004022729A1 (en) * | 2002-09-05 | 2004-03-18 | Bavarian Nordic A/S | Method for the cultivation of primary cells and for the amplification of viruses under serum free conditions |
| EP2204180A3 (en) * | 2002-04-19 | 2010-12-22 | Bavarian Nordic A/S | Modified Vaccinia Virus Ankara for the vaccination of neonates |
| PL218318B1 (pl) | 2002-05-16 | 2014-11-28 | Bavarian Nordic As | Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych |
| US7501127B2 (en) | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| EP1601333B1 (en) * | 2003-02-20 | 2013-01-23 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Novel insertion sites in pox vectors |
| GB2402391A (en) * | 2003-06-04 | 2004-12-08 | Oxxon Pharmaccines Ltd | Fowlpox recombinant genome |
| WO2006052826A2 (en) * | 2004-11-05 | 2006-05-18 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary | Methods for preparing cells and viruses |
| HUE030037T2 (en) | 2005-02-23 | 2017-04-28 | Bavarian Nordic As | Use of modified anemic virus for rapid induction of immunity against gluten virus or other agents |
| WO2007136865A2 (en) * | 2006-05-19 | 2007-11-29 | Glycofi, Inc | Recombinant vectors |
| WO2008142479A2 (en) * | 2006-08-25 | 2008-11-27 | The Government Of The United States Of Amercia, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Intergenic sites between conserved genes in the genome of modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus |
| US20090098529A1 (en) * | 2006-10-16 | 2009-04-16 | Nanhai Chen | Methods for attenuating virus strains for diagnostic and therapeutic uses |
| EP2086526B1 (en) * | 2006-11-09 | 2014-07-23 | The United States Of America As Represented By The Secretary of the Navy | Induction of an immune response against Dengue virus using prime-boost approach |
| US8440202B2 (en) * | 2006-11-09 | 2013-05-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach |
| CA2675355C (en) * | 2007-01-30 | 2015-04-28 | Transgene S.A. | Papillomavirus vaccine |
| US8268327B2 (en) | 2007-04-27 | 2012-09-18 | Bavarian Nordic A/S | Immediate protection against pathogens via MVA |
| CN101688223B (zh) * | 2007-05-15 | 2013-07-31 | 特兰斯吉恩股份有限公司 | 用于多基因表达的载体 |
| MX2009013030A (es) * | 2007-05-30 | 2010-03-25 | Wyeth Llc | Poxvirus de mapache que expresa genes de antigenos felinos. |
| TW200907058A (en) * | 2007-05-30 | 2009-02-16 | Wyeth Corp | Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins |
| ES2608604T3 (es) | 2007-10-18 | 2017-04-12 | Bavarian Nordic A/S | Uso de MVA para tratar el cáncer de próstata |
| WO2009152969A1 (en) * | 2008-06-20 | 2009-12-23 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine |
| KR100894430B1 (ko) * | 2008-11-11 | 2009-04-22 | 시스템디엔디(주) | 초음파, 음향 및 온도변화를 이용한 밸브의 유체누설 측정장치 및 이를 이용한 유체누설 측정방법 |
| CA2742247C (en) * | 2008-11-21 | 2017-07-04 | Bavarian Nordic A/S | Vector comprising multiple homologous nucleotide sequences |
| US8580276B2 (en) | 2009-06-05 | 2013-11-12 | City Of Hope | Genetically stable recombinant modified vaccinia ankara (rMVA) vaccines and methods of preparation thereof |
| EA201270108A1 (ru) | 2009-10-08 | 2012-08-30 | Бавариан Нордик А/С | Формирование полиспецифического t-клеточного ответа против вич у человека |
| EP2488649B1 (en) | 2009-10-16 | 2019-04-03 | The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services | Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites |
| WO2011087839A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Baxter International Inc. | Vaccine to influenza a virus |
| WO2011120045A1 (en) * | 2010-03-26 | 2011-09-29 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Ectodomains of influenza matrix 2 protein, expression system, and uses thereof |
| CA2802430C (en) | 2010-07-20 | 2021-07-20 | Bavarian Nordic A/S | Method for harvesting poxvirus |
| WO2012040474A2 (en) * | 2010-09-23 | 2012-03-29 | Baxter International Inc. | Recombinant viral vectors and methods for inducing an immune response to yellow fever virus |
| WO2012048817A2 (en) | 2010-10-15 | 2012-04-19 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara influenza vaccine |
| ES2733211T3 (es) | 2011-04-15 | 2019-11-28 | Genelux Corp | Cepas clonales de virus vaccinia atenuados y métodos de uso de las mismas |
| EP2788021B1 (en) | 2011-12-09 | 2017-01-18 | Bavarian Nordic A/S | Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c |
| EP2620446A1 (en) | 2012-01-27 | 2013-07-31 | Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. | Immunogens for HIV vaccination |
| KR20150021088A (ko) | 2012-06-05 | 2015-02-27 | 디 오스트레일리언 내셔널 유니버시티 | 인터루킨-4 길항제를 이용한 백신접종 |
| SI2879702T1 (sl) | 2012-08-01 | 2020-02-28 | Bavarian Nordic A/S | Cepivo na osnovi rekombinantnega modificiranega virusa vakcinacije Ankara (MVA) proti respiratornemu sincitialnemu virusu (RSV) |
| WO2014043535A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Compositions for the treatment of cancer |
| US20140140959A1 (en) | 2012-10-05 | 2014-05-22 | Aladar A. Szalay | Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes |
| EP2908851A1 (en) | 2012-10-19 | 2015-08-26 | Bavarian Nordic Inc. | Methods and compositions for the treatment of cancer |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| WO2014139587A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Okairòs Ag | Improved poxviral vaccines |
| MY193724A (en) * | 2013-03-15 | 2022-10-27 | Sementis Ltd | Immune modulation |
| US10238700B2 (en) | 2014-01-02 | 2019-03-26 | Genelux Corporation | Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity |
| KR101645642B1 (ko) | 2014-10-16 | 2016-08-11 | 대한민국 | Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스 |
| KR101623498B1 (ko) | 2014-10-16 | 2016-05-24 | 대한민국 | 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３ |
| JP2018510143A (ja) | 2015-02-25 | 2018-04-12 | メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター | 不活化非複製改変ワクシニアウイルスアンカラ（ｍｖａ）の固形腫瘍のための単独療法又は免疫チェックポイント遮断剤併用における使用 |
| CN107847534B (zh) | 2015-04-17 | 2022-10-04 | 纪念斯隆凯特琳癌症中心 | Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用 |
| KR20160140075A (ko) * | 2015-05-29 | 2016-12-07 | 코오롱생명과학 주식회사 | 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터 |
| WO2016202828A1 (en) * | 2015-06-15 | 2016-12-22 | Bavarian Nordic A/S | Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) foot and mouth disease virus (fmdv) vaccine |
| FR3042121A1 (fr) | 2015-10-08 | 2017-04-14 | Jean-Marc Limacher | Composition anti-tumorale |
| CN106591361A (zh) * | 2015-10-20 | 2017-04-26 | 钱文斌 | 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用 |
| AU2017206102C1 (en) | 2016-01-08 | 2022-02-10 | Geovax Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen |
| PL3407910T3 (pl) | 2016-01-29 | 2022-08-16 | Bavarian Nordic A/S | Rekombinowana zmodyfikowana szczepionka przeciwko wirusowi krowianki ankara (mva) przeciwko wirusowi zapalenia mózgu koni |
| US20190030157A1 (en) * | 2016-02-03 | 2019-01-31 | Geovax Inc. | Compositions and Methods for Generating an Immune Response to a Flavivirus |
| BR112018016948A2 (pt) | 2016-02-25 | 2019-01-08 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | mva recombinante ou mva¿e3l que expressa flt3l humano e uso do mesmo como agente imunoterapêutico contra tumores sólidos |
| EP3419648A4 (en) | 2016-02-25 | 2019-09-11 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | REPLICATING COMPETENTES WEAKENED VACCINIA VIRUSES WITH DELETION OF THYMIDINE KINASE WITH AND WITHOUT EXPRESSION OF HUMAN FLT3L OR GM-CSF FOR CANCER IMMUNOTHERAPY |
| CA3021341A1 (en) | 2016-05-02 | 2017-11-09 | Janssen Vaccine & Prevention B.V. | Therapeutic hpv vaccine combinations |
| AR110624A1 (es) * | 2016-08-19 | 2019-04-17 | Sementis Ltd | Vacunas virales |
| WO2018064516A1 (en) * | 2016-09-30 | 2018-04-05 | Monsanto Technology Llc | Method for selecting target sites for site-specific genome modification in plants |
| US11242509B2 (en) | 2017-05-12 | 2022-02-08 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy |
| KR20200015759A (ko) * | 2017-06-15 | 2020-02-12 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Hiv 항원을 인코딩하는 폭스바이러스 벡터, 및 그 사용 방법 |
| US11311612B2 (en) | 2017-09-19 | 2022-04-26 | Geovax, Inc. | Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria |
| WO2019216929A1 (en) * | 2018-05-11 | 2019-11-14 | City Of Hope | Mva vectors for expressing multiple cytomegalovirus (cmv) antigens and use thereof |
| CN112512568A (zh) | 2018-05-11 | 2021-03-16 | 希望之城 | 遗传修饰的重组痘苗安卡拉(rmva)疫苗改善的稳定性及其制备方法 |
| US12252702B2 (en) | 2018-09-15 | 2025-03-18 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Recombinant poxviruses for cancer immunotherapy |
| CN111979204B (zh) * | 2019-05-24 | 2023-10-13 | 杭州功楚生物科技有限公司 | 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途 |
| AU2020384323A1 (en) | 2019-11-14 | 2022-06-02 | Aelix Therapeutics, S.L. | Dosage regimens for vaccines |
| EP3842065A1 (en) * | 2019-12-23 | 2021-06-30 | Transgene | Process for designing a recombinant poxvirus for a therapeutic vaccine |
| TW202203966A (zh) * | 2020-03-31 | 2022-02-01 | 澳大利亞商賽門蒂斯公司 | 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗 |
| AU2022215566A1 (en) | 2021-02-02 | 2023-08-17 | Geovax, Inc. | Viral constructs for use in enhancing t-cell priming during vaccination |
| EP4551240A1 (en) | 2022-07-08 | 2025-05-14 | Viromissile, Inc. | Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof |
| FR3160186A1 (fr) | 2024-03-13 | 2025-09-19 | Odimma Therapeutics | Vecteur non-viral pour transcription augmentee |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5338683A (en) * | 1981-12-24 | 1994-08-16 | Health Research Incorporated | Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins |
| JPH0795956B2 (ja) * | 1986-09-22 | 1995-10-18 | 京都大学長 | ポックスウイルス由来発現制御領域 |
| US5093258A (en) * | 1988-08-26 | 1992-03-03 | Therion Biologics Corporation | Recombinant fowlpox virus and recombination vector |
| US5225336A (en) * | 1989-03-08 | 1993-07-06 | Health Research Incorporated | Recombinant poxvirus host range selection system |
| US5651972A (en) | 1989-04-21 | 1997-07-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector |
| MY109299A (en) * | 1990-08-15 | 1996-12-31 | Virogenetics Corp | Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins |
| US5514375A (en) | 1990-08-15 | 1996-05-07 | Virogenetics Corporation | Flavivirus recombinant poxvirus vaccine |
| US6893845B1 (en) * | 1990-09-28 | 2005-05-17 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Surface expression libraries of heteromeric receptors |
| AU672359B2 (en) * | 1991-03-07 | 1996-10-03 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| BE1004877A3 (fr) * | 1991-05-27 | 1993-02-16 | Solvay | Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus. |
| FR2679249B1 (fr) * | 1991-07-15 | 1993-11-26 | Centre Nal Recherc Scientifique | Souches de levure avec integration stable de genes heterologues. |
| JPH06509235A (ja) | 1991-07-26 | 1994-10-20 | ヴァイロジェネティクス コーポレイション | 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス組換えポックスウイルスワクチン |
| EP0561034B1 (en) * | 1991-08-26 | 1999-06-09 | IMMUNO Aktiengesellschaft | Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome |
| DK0538496T3 (da) * | 1991-08-26 | 2004-02-23 | Baxter Healthcare Sa | Rekombinant fjerkrækoppevirus med intakt FPV tk-gen |
| US5676950A (en) | 1994-10-28 | 1997-10-14 | University Of Florida | Enterically administered recombinant poxvirus vaccines |
| UA68327C2 (en) * | 1995-07-04 | 2004-08-16 | Gsf Forschungszentrum Fur Unwe | A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals |
| EP0753581A1 (en) * | 1995-07-10 | 1997-01-15 | Immuno Ag | Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines |
| DE19629828A1 (de) * | 1996-07-24 | 1998-01-29 | Bayer Ag | Carbanilide |
| MY150893A (en) * | 1996-09-24 | 2014-03-14 | Bavarian Nordic As | Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| AUPP380598A0 (en) * | 1998-05-29 | 1998-06-25 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Genetically manipulated entomopoxvirus |
| US6252871B1 (en) | 1998-07-01 | 2001-06-26 | Powerwave Technologies, Inc. | Switchable combiner/splitter |
| US20040265324A1 (en) * | 1999-03-23 | 2004-12-30 | Cardosa Mary Jane | Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines |
| DK1180155T3 (da) * | 1999-05-28 | 2009-02-16 | Helmholtz Zentrum Muenchen | Vektor til integration af heterologe sekvenser i poxvirale genomer |
| EE05633B1 (et) * | 2000-03-14 | 2013-02-15 | Mayr Anton | Muundatud vaktsiiniaviirus Ankara (MVA), sellega nakatatud peremeesrakk ning seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon, MVA valmistamine ja raviotstarbeline kasutamine |
| CA2341356C (en) * | 2000-04-14 | 2011-10-11 | Transgene S.A. | Poxvirus with targeted infection specificity |
| DE60130569D1 (de) * | 2000-08-29 | 2007-10-31 | Wyeth Corp | Verpackung von replikon-partikeln eines positiv-strängigen rna-virus |
| HU230198B1 (hu) * | 2000-11-23 | 2015-10-28 | Bavarian Nordic A/S | Módosított Vacciniavírus Ankara-variáns |
| PL218318B1 (pl) | 2002-05-16 | 2014-11-28 | Bavarian Nordic As | Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych |
| US7501127B2 (en) * | 2002-05-16 | 2009-03-10 | Bavarian Nordic A/S | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara |
| EA012723B1 (ru) * | 2002-11-25 | 2009-12-30 | Бавариан Нордик А/С | Рекомбинантный поксвирус, содержащий по меньшей мере два промотора ati вируса коровьей оспы, и его применение |
-
2003
- 2003-05-14 PL PL372088A patent/PL218318B1/pl unknown
- 2003-05-14 BR BR0310051A patent/BR0310051A/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 CN CN2012101926963A patent/CN102719408A/zh active Pending
- 2003-05-14 IL IL16417203A patent/IL164172A0/xx unknown
- 2003-05-14 CN CNB038111225A patent/CN100494388C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CN CN200910208520A patent/CN101831411A/zh active Pending
- 2003-05-14 PL PL372093A patent/PL216760B1/pl unknown
- 2003-05-14 AT AT03752741T patent/ATE315660T1/de active
- 2003-05-14 MX MXPA04011194A patent/MXPA04011194A/es active IP Right Grant
- 2003-05-14 PT PT03752741T patent/PT1407033E/pt unknown
- 2003-05-14 DK DK03735384T patent/DK1506301T3/da active
- 2003-05-14 CN CN2012101928085A patent/CN102703393A/zh active Pending
- 2003-05-14 EP EP20030735384 patent/EP1506301B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 US US10/510,189 patent/US7338662B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 WO PCT/EP2003/005045 patent/WO2003097845A1/en not_active Ceased
- 2003-05-14 CA CA2481799A patent/CA2481799C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 SI SI200330215T patent/SI1407033T1/sl unknown
- 2003-05-14 DE DE2003603218 patent/DE60303218T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 KR KR1020047018165A patent/KR101041691B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 KR KR1020117031095A patent/KR20120002627A/ko not_active Withdrawn
- 2003-05-14 AU AU2003236646A patent/AU2003236646B2/en not_active Expired
- 2003-05-14 JP JP2004506500A patent/JP4895505B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 BR BRPI0311178A patent/BRPI0311178B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 US US10/514,761 patent/US7550147B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 WO PCT/EP2003/005047 patent/WO2003097846A1/en not_active Ceased
- 2003-05-14 EA EA200900180A patent/EA020230B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 MX MXPA04010713A patent/MXPA04010713A/es active IP Right Grant
- 2003-05-14 AU AU2003242540A patent/AU2003242540A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-14 UA UA20041109409A patent/UA82479C2/uk unknown
- 2003-05-14 EP EP10008120.7A patent/EP2253709B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 NZ NZ536502A patent/NZ536502A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 CA CA 2812019 patent/CA2812019A1/en not_active Abandoned
- 2003-05-14 NZ NZ536501A patent/NZ536501A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 EA EA200401506A patent/EA012160B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 CN CN038111063A patent/CN1653183B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CA CA2481521A patent/CA2481521C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 JP JP2004506501A patent/JP4693092B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 CN CN2011100588236A patent/CN102199628A/zh active Pending
- 2003-05-14 EA EA200401507A patent/EA007811B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-05-14 KR KR1020047018293A patent/KR101005630B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 IL IL16417703A patent/IL164177A0/xx active IP Right Grant
- 2003-05-14 ES ES03752741T patent/ES2256776T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 EP EP20030752741 patent/EP1407033B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 KR KR1020107021891A patent/KR101138067B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2003-05-14 DK DK03752741T patent/DK1407033T3/da active
-
2004
- 2004-11-12 NO NO20044940A patent/NO334273B1/no not_active IP Right Cessation
- 2004-12-16 NO NO20045480A patent/NO336489B1/no not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-11-15 US US11/985,510 patent/US9109233B2/en active Active
-
2008
- 2008-07-28 IL IL193087A patent/IL193087A/en active IP Right Grant
- 2008-07-28 IL IL19308808A patent/IL193088A/en active IP Right Grant
- 2008-12-09 AU AU2008255213A patent/AU2008255213B2/en not_active Expired
- 2008-12-19 US US12/339,743 patent/US20100173388A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-02-03 AU AU2009200380A patent/AU2009200380C1/en not_active Expired
- 2009-05-19 US US12/468,127 patent/US8034354B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2009-05-19 US US12/468,120 patent/US7964374B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2010
- 2010-08-05 JP JP2010176511A patent/JP2011004755A/ja active Pending
- 2010-08-05 JP JP2010176512A patent/JP5777199B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2010-09-30 US US12/894,589 patent/US20110053260A1/en not_active Abandoned
- 2010-09-30 US US12/894,550 patent/US20110053259A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-04-15 US US13/087,715 patent/US8288125B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-04-15 US US13/087,649 patent/US8309326B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-15 US US13/233,329 patent/US8414900B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-16 US US13/234,230 patent/US8435543B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2011-09-29 NO NO20111324A patent/NO20111324A1/no not_active Application Discontinuation
-
2012
- 2012-02-13 US US13/371,580 patent/US20120178157A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-05-02 US US13/886,093 patent/US8741308B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL216760B1 (pl) | Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania | |
| US8309098B2 (en) | Recombinant modified vaccinia ankara (MVA) virus containing heterologous DNA inserts encoding human immunodeficiency virus (HIV) antigens inserted into one or more intergenic regions (IGRs) | |
| AU2007200016B2 (en) | Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of modified vaccinia virus ankara | |
| HK1076836B (en) | Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (mva) |