PL216760B1 - Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania - Google Patents

Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania

Info

Publication number
PL216760B1
PL216760B1 PL372093A PL37209303A PL216760B1 PL 216760 B1 PL216760 B1 PL 216760B1 PL 372093 A PL372093 A PL 372093A PL 37209303 A PL37209303 A PL 37209303A PL 216760 B1 PL216760 B1 PL 216760B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
mva
seqid
igr
sequence
dna sequence
Prior art date
Application number
PL372093A
Other languages
English (en)
Other versions
PL372093A1 (pl
Inventor
Paul Howley
Sonja Leyrer
Original Assignee
Bavarian Nordic As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bavarian Nordic As filed Critical Bavarian Nordic As
Publication of PL372093A1 publication Critical patent/PL372093A1/pl
Publication of PL216760B1 publication Critical patent/PL216760B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C12N15/863—Poxviral vectors, e.g. entomopoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy nowych miejsc insercji, użytecznych do włączania egzogennych sekwencji DNA do genomu MVA.
Tło wynalazku
Zmodyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) należy do rodziny Orthopoxvirus. MVA otrzymano w wyniku około 570 pasaży szczepu Ankara wirusa krowianki (CVA) w fibroblastach embrionów kurcząt (praca przeglądowa Mayr, A. i wsp., Infection 3, 6-14 (1975)). W następstwie wspomnianych pasaży, uzyskany wirus MVA zawierał 31 kilozasad informacji genomowej mniej, w porównaniu z CVA, i stał się silnie specyficzny wobec komórek gospodarza (Meyer, H. i wsp., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 (1991)). MVA charakteryzuje się wysokim stopniem atenuacji, przejawianej poprzez zmniejszoną zjadliwość lub zakaźność, przy utrzymaniu silnej immunogenności. Na podstawie testów prowadzonych na różnych modelach zwierzęcych wykazano, że otrzymany MVA był silnie awirulentny nawet w przypadku osobników o obniżonej odporności. Co istotne, doskonałe właściwości szczepu MVA zostały potwierdzone w szczegółowych próbach klinicznych (Mayr i wsp., Zbl.Bakt.Hyg. I, Abt.Org. B 167, 375-390 (1987)). Podczas wspomnianych badań, przeprowadzonych w grupie 120,000 osób, włączając pacjentów wysokiego ryzyka, nie odnotowano żadnych efektów ubocznych (Stickl i wsp., Dtsch.med.Wschr.99, 2386-2392 (1974).
W kolejnych badaniach odkryto, że rozwój MVA jest blokowany w późnym etapie cyklu replikacyjnego wirusa w komórkach ssaczych (Sutter, G. i Moss, B. (1992) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89, 10847-10851). Zgodnie z powyższym, MVA w pełni replikuje swoje DNA, syntetyzuje wczesne, opóźnione i późne produkty genów, lecz nie jest zdolny do złożenia dojrzałych infekcyjnych wirionów, które mogą być uwalniane z zainfekowanej komórki. Powyższe ograniczenie replikacji tego wirusa sprawiło, że zaproponowano użycie MVA jako wektora ekspresji genu.
W późniejszym etapie, MVA zastosowano do otrzymywania rekombinowanych szczepionek, ekspresjonujących sekwencje antygenowe wstawione w miejscu genu kinazy tymidynowej (tk) (US 5,185,146) lub w miejscu naturalnie występujących delecji w genomie MVA (PCT/EP96/02926).
Mimo że locus insercji tk jest szeroko stosowane do otrzymywania rekombinowanych wirusów ospy, szczególnie do uzyskiwania rekombinowanych wirusów krowianki (Mackett i wsp. (1982) P.N.A.S. USA 79, 7415-7419, technologia ta nie była odpowiednia w przypadku MVA. Scheiflinger i wsp. wykazał, że MVA jest dużo bardziej wrażliwy na modyfikacje genomu w porównaniu z innymi wirusami ospy, co może okazać się użyteczne w procesie otrzymywania rekombinowanych wirusów ospy. W szczególności, Scheiflinger i wsp. stwierdził, że jedno z najpowszechniej stosowanych miejsc do włączania heterologicznego DNA do genomu wirusa ospy, mianowicie locus genu kinazy tymidynowej (tk), nie może być wykorzystane do otrzymywania rekombinowanego MVA. Wszystkie otrzymane rekombinowane MVA tk(-) okazały się silnie niestabilne i podczas oczyszczania bardzo szybko traciły wstawiony DNA wraz z częścią genomowego DNA wirusa MVA (Scheiflinger i wsp. (1996), Arch Virol 141: str. 663-669).
Niestabilność, a przez to, wysokie prawdopodobieństwo zajścia rekombinacji genomowej jest znanym problemem w dziedzinie wirusologii wirusów ospy. W istocie, MVA uzyskany został w wyniku długotrwałych pasaży i wykorzystania faktu, że genom wirusowy CVA, namnażany in vitro w tkankowej hodowli komórkowej jest silnie niestabilny. Kilka tysięcy nukleotydów (31 kb) z genomu MVA uległo delecji, co spowodowało, że otrzymany wirus, w porównaniu z wyjściowym genomem CVA, charakteryzuje się 6 dużymi i licznymi małymi delecjami.
Ostatnio została opisana organizacja genomu MVA (Antoine i wsp. (1998), Virology 244, 365396). 178 kz genom MVA jest gęsto upakowany i zawiera 193 pojedynczych otwartych ramek odczytu (ORF), kodujących białka o długości przynajmniej 63 aminokwasów. W porównaniu z wysoko infekcyjnym wirusem Variola, a także prototypem wirusa krowianki, a mianowicie szczepem Copenhagen, większość ORF w MVA jest fragmentaryczna lub ulegała skróceniu (Antoine i wsp. (1998), Virology 244, 365-396). Jednakże, z kilkoma nielicznymi wyjątkami, wszystkie ORF, włączając fragmentaryczne i skrócone ORF, ulegają transkrypcji i translacji do białek. Poniżej wykorzystano nazewnictwo stosowane przez Antoine i wsp., w razie potrzeby, posłużono się również nomenklaturą opartą na miejscach trawienia enzymu restrykcyjnego Hind III.
Dotychczas, otrzymanie stabilnego, rekombinowanego MVA możliwe było jedynie poprzez insercję egzogennego DNA w naturalnie występujących miejscach delecji genomu MVA (PCT/EP96/02926). Niestety, ilość naturalnie występujących miejsc delecji w genomie MVA jest ograPL 216 760 B1 niczona. Ponadto, wykazano, że inne miejsca restrykcyjne, takie jak, np., Iocus genu tk, są mało użyteczne w otrzymywaniu rekombinowanego MVA (Scheiflinger i wsp. 1996), Arch Virol 141: str. 663-669).
Cel wynalazku
Celem niniejszego wynalazku jest identyfikacja innych miejsc insercji w genomie MVA i uzyskanie wektorów insercyjnych, które ukierunkują insercję egzogennych sekwencji DNA do wspomnianych nowych, zidentyfikowanych miejsc insercyjnych w genomie MVA.
Kolejnym celem wynalazku jest zapewnienie rekombinowanego MVA, zawierającego egzogenne sekwencje DNA, stabilnie zintegrowane w miejscach insercji genomu MVA.
Istota wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA) charakteryzujący się tym, że zawiera egzogenną sekwencję heterologicznego DNA wstawioną w międzygenowym obszarze (IGR) genomu wirusa.
Korzystnie, egzogenna sekwencja heterologicznego DNA wstawiona jest w międzygenowym obszarze (IGR) między dwiema sąsiadującymi otwartymi ramkami odczytu (ORF), wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA zawiera przynajmniej jedną sekwencję kodującą, korzystnie pod kontrolą transkrypcyjną pokswirusowego elementu kontrolującego transkrypcję.
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA koduje jedno lub więcej białek, polipeptydów, peptydów, obcych antygenów lub epitopów antygenowych.
Korzystnie, heterologicznego DNA pochodzi z wirusa Dengue, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa zapalenia wątroby B, wirusa zapalenia wątroby C i/albo wirusów niedoboru odporności, korzystnie z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA pochodząca z wirusa Dengue wybrana jest z grupy obejmującej NS1 i PrM.
Korzystnie, gen NS1 został wstawiony do IGR pomiędzy ORF 064L-065L.
Korzystnie, gen PrM pochodzi z jednego lub więcej z 4 serotypów wirusa Dengue.
Korzystnie, gen PrM został wstawiony do IGR pomiędzy ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z wirusa niedoboru odporności i koduje env HIV.
Korzystnie, gen env HIV został wstawiony do IGR między ORF 007R-008L.
Korzystnie, wirus według wynalazku jest MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem dostępu V00083008.
Korzystnie wirus według wynalazku służy do stosowania jako lek i/lub szczepionka.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie MVA według wynalazku, do otrzymywania leku i/lub szczepionki do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom wirusowym i/lub chorobom proliferacyjnym, korzystnie do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem Dengue lub infekcji wirusem niedoboru odporności, korzystnie infekcji HIV.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca MVA według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera MVA według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik, adiuwant i/lub dodatek.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka, polipeptydu, peptydu, antygenu lub epitopu in vitro, charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
- infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA według wynalazku,
- hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach,
- izolację i/lub wzbogacenie polipeptydu, białka, peptydu, antygenu, epitopu i/lub wirusa produkowanego przez wspomnianą komórkę gospodarza.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wprowadzania sekwencji DNA do komórki in vitro, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA jest homologiczna i/lub heterologiczna z genomem wspomnianej komórki, przy czym komórka ta jest infekowana MVA według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka in vitro lub ex vivo zawierająca MVA według wynalazku.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor plazmidowy charakteryzujący się tym, że zawiera
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
PL 216 760 B1
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną oraz
- korzystnie, kasetę genu selekcyjnego i/albo reporterowego.
Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR znajdującego się między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, IGR pochodna sekwencja zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiadujących ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, wspomnianym wirusem jest MVA zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania MVA według wynalazku charakteryzujący się tym, że in vitro obejmuje następujące etapy:
- transfekcję komórki wektorem plazmidowym według wynalazku;
- infekcję transfekowanej komórki MVA;
- identyfikację, izolację i ewentualnie oczyszczenie MVA według wynalazku.
Korzystnie, komórka jest zainfekowana MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest DNA charakteryzujący się tym, że zawiera:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną.
Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranych z grupy zawierającej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
PL 216 760 B1
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencja DNA ukierunkowuje wstawienie sekwencji heterologicznej do IGR genomu MVA zdeponowanego w ECACC pod numerem V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora plazmidowego obejmującego:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, oraz
- miejsce klonowania wstawione we wspomnianej sekwencji IGR do insercji wspomnianej sekwencji heterologicznej, oraz
- korzystnie, kasetę genu reporterowego i/lub selekcyjnego do otrzymywania oraz/albo produkowania rekombinowanego MVA według wynalazku. Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, wspomniany wirus MVA jest MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie DNA zawierającego sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
PL 216 760 B1
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, do otrzymania i/lub produkcji wektora plazmidowego według wynalazku i/lub otrzymania i/lub produkcji rekombinowanego MVA według wynalazku.
Korzystnie, sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Korzystnie, sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydowe
-nr 527- 608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L. Korzystnie, flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Korzystnie, wirusem MVA jest wirus MVA zdeponowany w ECACC pod numerem V00083008.
Szczegółowy opis wynalazku
Twórcy niniejszego wynalazku zidentyfikowali nowe miejsca w genomie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA), służące do wstawiania egzogennych sekwencji DNA. Nowe miejsca insercji położone są w obszarze międzygenowym (IGR) genomu wirusa, przy czym wspomniane IGR są, z kolei zlokalizowane między lub są flankowane przez dwie sąsiadujące otwarte ramki odczytu (ORF) genomu MVA.
Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek dotyczy rekombinowanych MVA zawierających heterologiczne sekwencje DNA wstawione do IGR genomu wirusa. Zgodnie z wynalazkiem, jedna lub więcej z egzogennych sekwencji może być wstawiona do jednego lub więcej miejsc IGR.
Nieoczekiwanie, odkryto, że egzogenne sekwencje DNA, po wstawieniu do IGR, pozostają istotnie stabilnie wstawione w genomie MVA: jak już wskazano genom MVA uważany jest za wysoko niestabilny. Wydaje się, że geny lub sekwencje DNA nieistotne dla rozmnażania wirusa ulegają delecji lub rozpadają się na fragmenty. Jednak, również zaskakująco, odkryto, że stabilne, rekombinowane MVA uzyskiwane są, gdy sekwencje heterologicznego DNA wstawiane są w naturalnie występujących miejscach delecji genomu MVA (PCT/EP96/02926). Z drugiej strony, stwierdzono, że wiele genów gospodarzy, jak np. Iocus tk - szeroko stosowanych do otrzymywania innych rekombinowanych wirusów ospy, nie stanowi odpowiednich miejsc dla insercji w MVA. Fakt, że Vero-MVA posiada jedną dodatkową delecję genomową (PCT/EP01/02703) również wskazuje, że genom ten ma charakter dynamiczny, to znaczy fragmenty niewymagane do propagacji wirusa ulegają delecji. Zatem, można oczekiwać, że sekwencje heterologicznego DNA, nieistotne dla namnażania wirusa, wstawione w przestrzeni między ORF wirusa również ulegną delecji.
Podczas gdy sekwencja nukleotydowa ORF koduje sekwencję aminokwasową tworzącą peptyd, polipeptyd lub białko, sekwencje IGR znajdujące się między dwoma ORF nie posiadają zdolności kodowania, lecz mogą obejmować elementy regulatorowe, miejsca wiążące, promotor i/lub sekwencje wzmacniające, istotne lub włączone w proces kontroli transkrypcyjnej ekspresji genu wirusowego. Zatem, IGR może uczestniczyć w kontrolnej regulacji cyklu życia wirusa. Jednakże, twórcy niniejszego wynalazku wykazali również, że nowe miejsca insercji zapewniają nieoczekiwane korzyści, płynące z faktu, że sekwencje egzogennego DNA mogą być stabilnie wstawiane do genomu MVA, bez wpływu
PL 216 760 B1 lub zmiany typowych właściwości i ekspresji genu MVA. Nowe miejsca insercji są szczególnie użyteczne, ze względu na to, że ani ORF ani sekwencja kodująca MVA, nie ulegają zmianie.
Ponadto, zaskakująco odkryto, że poziom ekspresji obcego genu wstawionego do IGR jest wyższy, niż poziom ekspresji obcego genu wstawionego w miejscu delecji genomu MVA (patrz również Przykład 1).
Sekwencja nukleotydowa ORF posiada regularną strukturę: zaczyna się kodonem startu i kończy kodonem stopu. Zależnie od położenia dwóch sąsiednich ORF, IGR - obszar pomiędzy tymi ORF, jest flankowany przez dwa kodony stopu dwóch sąsiadujących ORF lub przez dwa kodony startu dwóch sąsiadujących ORF, lub też przez kodon stopu pierwszej ORF i kodon startu drugiej ORF, lub kodon startu pierwszej ORF i kodon stopu drugiej ORF.
Zgodnie z powyższym, miejsce insercji dla egzogennej sekwencji DNA w IGR może znajdować się poniżej lub w kierunku 3' końca kodonu stopu pierwszej ORF. W przypadku, gdy sąsiednia ORF, zwana również drugą ORF, posiada taką samą orientację, jak pierwsza ORF, miejsce insercji poniżej kodonu stopu pierwszej ORF leży powyżej lub w kierunku końca 5' kodonu stopu drugiej ORF.
W przypadku, gdy druga ORF posiada przeciwną orientację względem pierwszej ORF, to znaczy położenie dwóch sąsiednich punktów ORF wobec siebie, wtedy egzogenny DNA wstawiany jest powyżej obu kodonów startu.
ORF w genomie MVA występuje w dwóch kierunkach kodowania. W konsekwencji, aktywność polimerazy przejawia się z lewej do prawej, tj., w kierunku do przodu, i odpowiednio, z prawej do lewej (w kierunku do tyłu). Fakt ten jest powszechnie wykorzystywany w wirusologii wirusów ospy i stał się podstawą standardowej klasyfikacji wirusów krowianki. Służy identyfikowaniu ORF na bazie ich orientacji i pozycji w różnych fragmentach trawienia restrykcyjnego HindIII. Do celów nomenklatury, różne fragmenty HindIII określane są za pomocą drukowanych liter w porządku malejącym, odpowiadających malejącej wielkości poszczególnych fragmentów. W każdym fragmencie Hindlll, ORF numerowane są z lewej do prawej a położenie ORF wskazywane jest przez drukowane L (oznaczające transkrypcję z prawej do lewej) lub R (oznaczające transkrypcję z lewej do prawej). Ponadto, istnieje nowsza publikacja struktury genomu MVA, w której zastosowano inne nazewnictwo, po prostu numerację ORF z lewego do prawego końca genomu i wskazanie ich orientacji drukowanymi L Iub R (Antoine i wsp. (1998), Virology 244, 365-396). Dla przykładu, I4L ORF, zgodnie ze starą nomenklaturą, odpowiada 064L ORF według Antoine i wsp. W niniejszym wynalazku, jeśli nie wskazano inaczej, zastosowano nazewnictwo według Antoine i wsp.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, sekwencje heterologicznego DNA mogą być wstawiane do jednego lub więcej IGR pomiędzy dwoma sąsiednimi ORF, wybranymi z grupy obejmującej: 001L002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L-019L, 019L020L, 020L-021L, 023L-024L, 024L-025L, 25L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R- 086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R- 098R, 101R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
Zgodnie z wcześniejszą nomenklaturą, ORF 006L odpowiada C10L, 019 L odpowiada C6L, 020L-N1L, 021L-N2L, 023L-K2L, 028R-K7R, 029L-F1L, 037L-F8L, 045L-F15L, 050L-E3L, 052R-E5R, 054R-E7R, 055R-E8R, 056L-E9L, 062I1L, 064L-I4L, 065L-I5L, 081R-L2R, 082L-L3L, 086R-J2R, 088R-J4R, 089L-J5L, 092R-H2R, 095R-H5R, 107R-D10R, 108L-D11L, 122R-A11R, 123L-A12L, 125L-A14L, 126L-A15L, 135R-A24R, 136L-A25L, 137L-A26L, 141L-A30L, 148R-A37R, 149L-A38L, 152R-A40R, 153L-A41L, 154R-A42R, 157L-A44L, 159R-A46R, 160L-A47L, 165R-A56R, 166R-A57R, 167R-BIR, 170R-B3R, 176R-B8R, 180R-B12R, 184R-B16R, 185L-B17L oraz 187R-B19R.
Korzystnie, sekwencja heterologiczna wstawiona jest do IGR flankowanego przez dwie sąsiadujące ORF, wybrane z grupy obejmującej 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
PL 216 760 B1
Heterologiczne lub egzogenne sekwencje DNA są sekwencjami, które, w naturze, nie występują normalnie związane z wirusami ospy według niniejszego wynalazku. Zgodnie z kolejną realizacją wynalazku, egzogenna sekwencja DNA zawiera przynajmniej jedną sekwencję kodującą. Sekwencja kodująca jest operatywnie związana z elementem kontroli transkrypcji, korzystnie z elementem kontroli transkrypcji wirusa ospy. Ponadto, mogą być zastosowane również kombinacje między elementem kontroli transkrypcji wirusa ospy a, np., wewnętrznymi miejscami wiązania rybosomu.
Zgodnie z kolejną realizacją, sekwencja egzogennego DNA może również zawierać dwa lub więcej z sekwencji kodujących, powiązanych z jednym lub kilkoma elementami kontroli transkrypcji. Korzystnie, sekwencja kodująca koduje jedno lub więcej białek, polipeptydów, peptydów, obcych antygenów lub epitopów antygenowych, szczególnie produkty genów interesujących ze względów terapeutycznych.
Geny interesujące ze względów terapeutycznych według niniejszego wynalazku mogą być genami pochodzącymi lub homologicznymi z genami mikroorganizmów patogennych lub zakaźnych, wywołujących choroby zakaźne. Zgodnie z powyższym, w kontekście niniejszego wynalazku, tego typu interesujące ze względów terapeutycznych geny prezentowane są układowi immunologicznemu organizmu w celu wywołania, korzystnie indukowania, swoistej odpowiedzi immunologicznej oraz, tym samym w celu zaszczepienia lub ochrony profilaktycznej organizmu przed infekcją danym mikroorganizmem. W kolejnych korzystnych realizacjach niniejszego wynalazku, interesujące ze względów terapeutycznych geny wybrane są spośród genów wirusów zakaźnych, np., lecz nie ograniczając do, wirusa Dengue, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa zapalenia wątroby B lub C lub wirusów niedoboru odporności, takich jak HIV.
Geny pochodzące z wirusa Dengue są korzystnie genami NS1 i PrM, przy czym wspomniane geny mogą pochodzić z jednego, dwóch, trzech lub wszystkich z 4 serotypów wirusa Dengue. Gen NS1 pochodzi korzystnie z serotypu 2 wirusa Dengue i jest korzystnie wstawiany do IGR pomiędzy ORF 064L-065L (I4L-I5L). Geny PrM, pochodzące korzystnie ze wszystkich 4 serotypów wirusa Dengue, są korzystnie wstawiane do IGR między ORF wybranymi z 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L. Korzystniej, gen PrM pochodzący z serotypu 1 wirusa Dengue (prM 1) wstawiany jest do IGR w pozycji 148R-149L, PrM 2 do IGR w 007R-008L, PrM 3 do IGR w pozycji ORF 044L-045L oraz PrM 4 do IGR 136L-137L.
Zgodnie z kolejną korzystną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z HIV i koduje env HIV, przy czym gen env HIV jest korzystnie wstawiony w IGR między ORF 007R-008L. Ponadto, geny interesujące ze względów terapeutycznych według wynalazku obejmują również geny związane z chorobami. Geny te wywierają efekt terapeutyczny na zaburzenia proliferacyjne, raka lub choroby metaboliczne. Na przykład, gen interesujący ze względów terapeutycznych w przypadku raka może być antygenem rakowym o zdolności indukowania swoistej, skierowanej przeciwko rakowi, reakcji immunologicznej.
Zgodnie z następną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja kodująca obejmuje przynajmniej jeden gen markerowy lub gen selekcyjny.
Geny selekcyjne wywołują szczególną odporność komórki, dzięki czemu możliwe są do zastosowania pewne metody selekcji. Specjaliści w dziedzinie dysponują wiedzą na temat różnorodnych genów selekcyjnych, które mogą zostać wykorzystane w systemie wirusów ospy. Między innymi należą tu, np., gen oporności na neomycynę (NPT) lub gen transferazy fosforybozylowej (gpt).
Geny markerowe indukują reakcję barwną w transdukowanych komórkach, co może być wykorzystane do identyfikacji komórek, które uległy transdukcji. Specjalistom w dziedzinie znane są różnorodne geny markerowe, które mogą zostać zastosowane w systemie wirusa ospy. Do grupy tej należą geny kodujące, np., β-galaktozydazę (β-gal), β-glukozydazę (β-glu), zielone białko fluorescencyjne (EGFP) lub niebieskie białko fluorescencyjne.
Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja egzogennego DNA zawiera sekwencję rozdzielającą, która oddziela element kontroli transkrypcyjnej wirusa ospy i/lub sekwencję kodującą w sekwencji egzogennego DNA od kodonu stopu i/lub kodonu startu sąsiadujących ORF.
Wspomniana sekwencja rozdzielająca, znajdująca się między kodonem stop/start sąsiadującej ORF a wstawioną sekwencją kodującą egzogennego DNA, jest korzystna, ponieważ stabilizuje wstawiony egzogenny DNA, a przez to, jakikolwiek otrzymany w ten sposób rekombinowany wirus. Wielkość sekwencji rozdzielającej jest zmienna, dopóki sekwencja nie posiada własnego kodowania lub funkcji regulatorowej.
PL 216 760 B1
Zgodnie z następną realizacją wynalazku, sekwencja rozdzielająca element kontroli transkrypcyjnej wirusa ospy i/lub sekwencję kodującą w sekwencji egzogennego DNA od kodonu stop sąsiedniej ORF, ma długość przynajmniej jednego nukleotydu.
Zgodnie z kolejną realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja rozdzielająca element kontroli transkrypcyjnej wirusa ospy i/lub sekwencję kodującą w sekwencji egzogennego DNA od kodonu start sąsiedniej ORF, ma długość przynajmniej 30 nukleotydów. Szczególnie, w przypadku, gdy typowy element kontroli transkrypcyjnej wirusa krowianki znajduje się powyżej kodonu startu, insercja egzogennego DNA może nie rozdzielać elementu promotorowego od kodonu startu sąsiedniej ORF. Typowy element promotorowy wirusa krowianki może być zidentyfikowany poprzez analizę pod kątem np., sekwencji „TAAAT” dla późnych promotorów (Davison & Moss, J. Mol. Biol. 1989; 210: 771-784) oraz domeny bogatej w A/T dla wczesnych promotorów. Sekwencja rozdzielająca długości około 30 nukleotydów znajduje się w korzystnej odległości, zapewniającej, brak oddziaływania na promotor wirusa ospy położony powyżej kodonu startu ORF. Ponadto, zgodnie z kolejną korzystną realizacją odległość między wstawionym egzogennym DNA a kodonem startu sąsiedniej ORF, wynosi około 50 nukleotydów i korzystniej, około 100 nukleotydów.
Zgodnie z dalszą realizacją niniejszego wynalazku, sekwencja rozdzielająca zawiera dodatkowy element kontroli transkrypcji wirusa ospy, który jest zdolny do kontroli transkrypcji sąsiedniej ORF.
Typowym szczepem MVA, który może być zastosowany według niniejszego wynalazku do otrzymywania rekombinowanego MVA, jest MVA-575, zdeponowany w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych pod numerem depozytu ECACC V00120707.
Innym korzystnym szczepem MVA jest MVA-Vero lub jego pochodne. Szczepy MVA-Vero zdeponowano w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych pod numerem depozytu ECACC V99101431 oraz 01021411. Bezpieczeństwo MVA-Vero odzwierciedlają jego biologiczne, chemiczne i fizyczne właściwości, opisane w Międzynarodowym Zgłoszeniu Patentowym PCT/EP01/02703. W porównaniu z innymi szczepami MVA, genom Vero-MVA obejmuje jedną dodatkową delecję.
Jeszcze innym, bardziej korzystnym szczepem MVA jest MVA-BN. MVA-BN zdeponowano w Europejskiej Kolekcji Zwierzęcych Kultur Komórkowych pod numerem depozytu ECACC V00083008. Wirus MVA-BN jest silnie atenuowanym wirusem, również pochodzącym od zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (patrz również PCT/EP01/13628).
Termin „pochodne” wirusa według niniejszego wynalazku dotyczy potomstwa wirusa wykazującego takie same właściwości jak wirus rodzicielski, lecz przejawiającego różnice w jednej lub więcej części genomu.
Termin „pochodne MVA” odnosi się do wirusa, który, w porównaniu z MVA, ma takie same właściwości funkcjonalne. Na przykład, pochodna MVA-BN posiada takie same cechy charakterystyczne jak MVA-BN. Jedną z tych właściwości MVA-BN lub jego pochodnych jest jego atenuacja i brak replikacji w komórkach ludzkich HaCat.
Rekombinowany MVA według niniejszego wynalazku jest użyteczny jako lek lub szczepionka. Mianowicie, zgodnie z kolejną realizacją, stosowany do wprowadzenia egzogennej sekwencji kodującej do komórki docelowej, przy czym wspomniana komórka jest homologiczna lub heterologiczna względem genomu komórki docelowej.
Wprowadzenie egzogennej sekwencji kodującej do komórki docelowej może być dokonane in vitro w celu otrzymywania białek, polipeptydów, peptydów, antygenów lub epitopów antygenowych. Sposób ten obejmuje infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA według wynalazku, hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach i izolację i/albo wzbogacenie polipeptydu, peptydu, białka, antygenu, epitopu i/lub wirusa wyprodukowanego przez wspomnianą komórkę gospodarza.
Ponadto, sposób wprowadzenia jednej lub więcej homologicznych lub jednej lub więcej heterologicznych sekwencji do komórek może być zastosowany w terapii in vitro i in vivo. W terapii in vitro, wyizolowane komórki, które były wcześniej (ex vivo) zainfekowane rekombinowanym MVA według wynalazku podawane są do żywego organizmu zwierzęcego w celu wywołania, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej. W terapii in vivo, rekombinowany wirus ospy według wynalazku, jest bezpośrednio podawany do żywego organizmu zwierzęcego w celu wywołania, korzystnie indukowania, odpowiedzi immunologicznej. W tym przypadku, komórki otaczające miejsce szczepienia, lecz również komórki, przez które wirus jest transportowany, np., strumienia krwi, są bezpośrednio zainfekowane in vivo przez rekombinowany MVA według wynalazku. Po infekcji, komórki te syntetyzują proteiny, peptydy lub epitopy antygenowe genów terapeutycznych, które są kodowane przez egzo10
PL 216 760 B1 genne sekwencje kodujące, a następnie, prezentują je lub ich fragmenty na powierzchni komórki. wyspecjalizowane komórki układu immunologicznego rozpoznają prezentację takich heterologicznych białek, peptydów lub epitopów i uruchamiają swoistą odpowiedź immunologiczną.
Ze względu na to, że MVA charakteryzuje się silnie ograniczonym wzrostem, a zatem, jest silnie atenuowany, jest on użyteczny w leczeniu szerokiego zakresu ssaków, włączając ludzi, w tym włączając zwierzęta i ludzi z niedoborem odporności. Niniejszy wynalazek związany jest również z kompozycją farmaceutyczną i szczepionkami służącymi do indukcji odpowiedzi immunologicznej w żywym organizmie zwierzęcym, włączając ludzi.
Kompozycja farmaceutyczna może ogólnie obejmować jeden lub więcej z dopuszczalnych farmaceutycznie i/lub akceptowanych nośników, dodatków, antybiotyków, konserwantów, adiuwantów, rozcieńczalników i/lub środków stabilizujących. Takie substancje pomocnicze mogą być wodą, roztworem soli fizjologicznej, glicerolem, etanolem, czynnikami nawilżającymi lub emulsyfikującymi, substancjami buforującymi pH itp. Odpowiednie nośniki są zazwyczaj rozległymi, wolno metabolizowanymi cząsteczkami, takimi jak białka, polisacharydy, kwasy polimlekowe, kwasy poliglikolowe, polimerowe aminokwasy, kopolimery aminokwasowe, agregaty lipidowe itp.
W celu otrzymania szczepionki, rekombinowany wirus ospy według wynalazku doprowadzany jest do dopuszczalnej fizjologicznie postaci. Może być to dokonane w oparciu o doświadczenie w przygotowywaniu szczepionek wirusów ospy stosowanych do szczepienia przeciwko ospie (według opisu Stickl, H. i wsp. (1974) Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Na przykład, oczyszczony wirus przechowywany jest w -80°C, o mianie 5x10E8 TCID50/ml, w formulacji w około 10 mM Tris, 140 mM NaCl o pH 7.4. W celu przygotowania zastrzyków szczepionki, np., 10E2-10E8 cząsteczek wirusa liofilizowanych jest 100 ml roztworu fizjologicznego buforowanego fosforanem (PBS), w obecności 2% peptonu i 1% ludzkiej albuminy, w ampułce, korzystnie szklanej ampułce. Alternatywnie, zastrzyki szczepionki mogą być otrzymane w wyniku stopniowego suszenia sublimacyjnego wirusa w formulacji. Formulacja ta może zawierać dodatkowe substancje, takie jak mannitol, dekstran, cukier, glicyna, laktoza lub poliwinylopirolidon lub inne kwasy, takie jak przeciwutleniacze lub gazy obojętne, stabilizatory lub rekombinowane białka (np., albumina surowicy ludzkiej), odpowiednie do podawania in vivo. Szklana ampułka jest następnie szczelnie zamykana i może być przechowywana między 4°C a temperaturą pokojową przez kilka miesięcy. Jednakże, dopóki nie istnieje taka potrzeba, ampułka przechowywana jest korzystnie w temperaturze poniżej -20°C.
W celu szczepienia lub terapii, liofilizat może zostać rozpuszczony w 0.1 do 0.5 ml wodnego roztworu, korzystnie roztworu soli fizjologicznej lub buforze Tris i podawany układowo lub miejscowo, tj., pozajelitowo, podskórnie, domięśniowo, przez skaryfikację lub w jakikolwiek inny sposób podawania znany specjalistom w dziedzinie. Droga podawania, dawka i ilość podań może zostać w znany specjalistom w dziedzinie sposób zoptymalizowana. Jednakże, często, pacjent zaszczepiany jest drugim zastrzykiem około miesiąc do sześciu tygodni po pierwszym szczepieniu.
Niniejszy wynalazek związany jest ponadto z wektorami plazmidowymi, które mogą być zastosowane do otrzymywania rekombinowanego MVA według wynalazku, i również z pewnymi sekwencjami DNA.
Prawidłowo, pożądana egzogenna sekwencja DNA może być wstawiona w IGR zlokalizowanym między lub flankowanym przez dwie sekwencje nukleotydowe zawierające sąsiadujące ORF. Zgodnie z powyższym, wektor plazmidowy według wynalazku, zawiera sekwencję DNA pochodzące z lub homologiczną z genomem MVA, przy czym wspomniana sekwencja DNA zawiera pełen lub częściowy fragment sekwencji IGR, zlokalizowany między lub flankowany przez dwie sąsiadujące ORF genomu wirusa. Korzystnie, wektor plazmidowy zawiera, wstawione we wspomnianej sekwencji IGR-pochodnej przynajmniej jedno miejsce klonowania, do insercji pożądanej, egzogennej sekwencji DNA i, korzystnie, do insercji elementu kontroli transkrypcji wirusa ospy, operatywnie połączonego ze wspomnianą sekwencją heterologicznego DNA. Dowolnie, wektor plazmidowy zawiera kasetę genu reporterowego i/lub selekcji. Wektor plazmidowy, korzystnie, zawiera także sekwencje dwóch sąsiednich ORF, flankujących wspomniany pełny lub częściowy fragment sekwencji IGR.
Zidentyfikowano pewne IGR, które nie obejmują sekwencji nukleotydowych. W tych przypadkach, wektor plazmidowy zawiera sekwencje DNA z sekwencji flankujących IGR, tj., sekwencje DNA z dwóch sąsiadujących ORF. Korzystnie, miejsce klonowania dla insercji sekwencji heterologicznego DNA jest wstawione w IGR. DNA z sekwencji flankujących IGR stosowany jest do ukierunkowania insercji egzogennej sekwencji DNA do odpowiednich IGR w genomie MVA. Taki wektor plazmidowy może dodatkowo obejmować pełen lub częściowy fragment sekwencji IGR, która zawiera miejsce
PL 216 760 B1 klonowania dla insercji sekwencji heterologicznego DNA i, dowolnie, kasety genu reporterowego i/albo selekcyjnego.
Sekwencje IGR-DNA, jak również sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiednich ORF są korzystnie wybrane z odpowiednio, IGR i ORF, z grupy obejmującej:
001L-002L, 002L-003L, 005R-006R, 006L-007R, 007R-008L, 008L-009L, 017L-018L, 018L019L, 019L-020L, 020L-021L,023L-024L, 024L-025L, 25L-026L, 028R-029L, 030L-031L, 031L-032L, 032L-033L, 035L-036L, 036L-037L, 037L-038L, 039L-040L, 043L-044L, 044L-045L, 046L-047R, 049L-050L, 050L-051L, 051L-052R, 052R-053R, 053R-054R, 054R-055R, 055R-056L, 061L-062L, 064L-065L, 065L-066L, 066L-067L, 077L-078R, 078R-079R, 080R-081R, 081R-082L, 082L-083R, 085R-086R, 086R-087R, 088R-089L, 089L-090R, 092R-093L, 094L-095R, 096R-097R, 097R-098R, 10R-102R, 103R-104R, 105L-106R, 107R-108L, 108L-109L, 109L-110L, 110L-111L, 113L-114L, 114L-115L, 115L-116R, 117L-118L, 118L-119R, 122R-123L, 123L-124L, 124L-125L, 125L-126L, 133R-134R, 134R-135R, 136L-137L, 137L-138L, 141L-142R, 143L-144R, 144R-145R, 145R-146R, 146R-147R, 147R-148R, 148R-149L, 152R-153L, 153L-154R, 154R-155R, 156R-157L, 157L-158R, 159R-160L, 160L-161R, 162R-163R, 163R-164R, 164R-165R, 165R-166R, 166R-167R, 167R-168R, 170R-171R, 173R-174R, 175R-176R, 176R-177R, 178R-179R, 179R-180R, 180R-181R, 183R-184R, 184R-185L, 185L-186R, 186R-187R, 187R-188R, 188R-189R, 189R-190R, 192R-193R.
Sekwencje są, korzystniej, wybrane z odpowiednio IGR i ORF, z grupy obejmującej 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
Sekwencje pochodzące z IGR są, korzystnie, wybrane z grupy zawierającej sekwencje nukleotydowe:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr-376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
Sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiadujących ORF są korzystnie, wybrane z grupy obejmującej sekwencje nukleotydowe:
- nr 1-525 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
Sekwencje DNA korzystnie pochodzą z lub są homologiczne z genomem wirusa MVA zdeponowanego w ECACC pod numerem depozytu V00083008.
W celu otrzymania wektora plazmidowego według wynalazku, sekwencje są izolowane i klonowane do standardowego wektora klonowania, takiego jak pBluescript (Stratagene), w którym flankują one egzogenny DNA mający być wstawiany do genomu MVA. Dowolnie, taki wektor plazmidowy zawiera kasetę genu selekcji lub reporterowego, która może ulec delecji z ostatecznego rekombinowanego wirusa, z powodu obecności sekwencji powtórzeniowej włączonej do wspomnianej kasety.
Sposoby wprowadzania sekwencji egzogennego DNA poprzez wektor plazmidowy do genomu MVA i sposoby otrzymania rekombinowanego MVA są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, dodatkowo, mogą zostać wywnioskowane na podstawie następujących pozycji, podanych tytułem referencji:
- Molecular Cloning, A laboratory Manual. Wydanie drugie. Według J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989: opisano techniki i wiedzę dotyczącą standardowych technik biologii molekularnej, takich jak klonowanie DNA, izolacja RNA, technika western blotting, techniki amplifikacji RT-PCR i PCR;
- Virology Methods Manual. Według Brian WJ Mahy i Hillar O Kangro. Academic Press. 1996: opisano techniki operowania i manipulowania wirusami;
- Molecular Virology: A Practical Approach. Według AJ DAvison i RM Elliott. The Practical Approach Series. IRL Press at Oxford University Press. Oxford 1993. Rozdział 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors;
PL 216 760 B1
- Current Protocols in Molecular Biology. Wyd.: John Wiley i Son Inc. 1998. Rozdział 16, część IV: Expression of proteins in mammalian cells using Vaccinia viral: vector; opisano techniki i wiedzę operowania, manipulowania i inżynierii genetycznej MVA.
MVA według niniejszego wynalazku, korzystnie MVA zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008, może być otrzymany poprzez transfekcję komórki wektorem plazmidowym według niniejszego wynalazku, infekcję transfekowanej komórki MVA, a następnie, identyfikację, izolację i, dowolnie, oczyszczenie MVA według wynalazku.
Sekwencje DNA według wynalazku mogą być zastosowane do identyfikowania lub izolowania MVA lub jego pochodnych według wynalazku, natomiast komórki lub organizmy zainfekowane MVA według wynalazku. Sekwencje DNA są, np., stosowane do otrzymania starterów PCR, sond hybryd yzacyjnych lub są wykorzystywane w technikach szeregowania sekwencji.
Krótki opis figur
Figura 1: Mapa restrykcyjna wektora pBNX39 (Figura 1a), pBNX70 (Figura 1b) i pBN84 (Figura 1c), obejmującego około 600 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji następujące po 14L ORF. Plazmidy zawierają dodatkowo egzogenny DNA (odpowiednio, Ecogpt i hBFP) pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy P), między sekwencjami flankującymi: Flank 1 (F1 I4L-I5L) Flank 2 (F2 I4L-I5L). F1rpt oznacza sekwencję powtórzeniową Flank 1, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z otrzymanego rekombinowanego wirusa. pBN84 (Figura 1c) koduje dodatkowo białko wirusa Dengue NS1 (NS1 DEN). Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 2: Mapa restrykcyjna wektora pBNX51 (Figura 2a), pBNX67 (Figura 2b) i pBN27 (Figura 2c), obejmującego około 600 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji występujące po ORF 137L (Flank 1; F1136-137 odpowiada pozycji 129340 - 129930 genomu MVA; Flank 2; F2136-137 odpowiada pozycji 129931 - 130540 genomu MVA). Dodatkowo, wektor pBNX67 (Figura 2b) zawiera, między sekwencjami flankującymi, egzogenny DNA (gen NPT II - oporności na neomycynę) pod transkrypcyjną kontrolą promotora P) wirusa ospy. F2rpt określa sekwencję powtórzeniową z Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego wirusa. pBN27 (Figura 2c) koduje dodatkowo PrM4 z wirusa Dengue pod kontrolą promotora wirusa ospy. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad; IRES = wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu; EGFP = gen wzmacniający zielone białko fluorescencyjne.
Figura 3: Mapa restrykcyjna wektora pBNX79 (Figura 3a), pBNX86 (Figura 3b), pBNX88 (Figura 3c), pBN34 (Figura 3d) i pBN56 (Figura 3e), obejmującego około 600 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji między ORF 007R a 008R Flank 1; F1 IGR 07-08, rozpoczynająca się w pozycji 12200 genomu MVA; Flank 2: F2 IGR 07-08 kończąca się w pozycji 13400 genomu MVA). F2rpt określa sekwencję powtórzeniową Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. Ponadto, wektor pBNX88 (Figura 3c) i pBNX86 (Figura 3b) zawiera, między sekwencjami flankującymi, egzogenny DNA (odpowiednio, BFP + gpt i NPT II + EGFP) pod transkrypcyjną kontrolą promotora wirusa ospy P). F2rpt określa sekwencję powtórzeniową Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. pBN56 (Figura 3e) koduje dodatkowo białko env HIV-1, a pBN34 (Figura 3d) zawiera sekwencję kodującą PrM2 z wirusa Dengue pod kontrolą promotora wirusa ospy. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 4: Mapa restrykcyjna wektora pBNX80 (Figura 4a), pBNX87 (Figura 4b) i pBN47 (Figura 4c), obejmującego około 600/640 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji między ORF 044L a 045L (Flank 1: F1 IGR 44-45 rozpoczynająca się w pozycji 36730 genomu MVA; Flank 2: F2 IGR 44-45 kończąca się w pozycji 37970 genomu MVA). Ponadto, wektor pBNX87 (Figura 4b) zawiera, między sekwencjami flankującymi, IpF egzogenny DNA (gen NPT II + EGFP) pod transkrypcyjną kontrolą promotora wirusa ospy P), F2rpt określa sekwencję powtórzeniową Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. pBN47 (Figura 4c) koduje dodatkowo PrM3 z wirusa Dengue pod kontrolą promotora wirusa ospy. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 5: Mapa restrykcyjna wektora pBNX90 (Figura 5a), pBNX92 (Figura 5b) i pBN54 (Figura 5c), obejmującego około 596/604 pz sekwencji MVA flankujących miejsce insercji między ORF 148R a 149L (Flank 1: F1 IGR 148-149 rozpoczynająca się w pozycji 136900 genomu MVA; Flank 2: F2 IGR 148-149 kończąca się w pozycji 138100 genomu MVA). Ponadto, wektor pBNX92 (Figura 5b) zawiera między sekwencjami flankującymi egzogenny DNA (gpt + BFP) pod transkrypcyjną kontrolą promotora wirusa ospy P). pBN54 (Figura 5c) koduje dodatkowo PrM1 z wirusa Dengue. F2rpt określa
PL 216 760 B1 sekwencję powtórzeniową z Flank 2, umożliwiającą delecję kasety reporterowej z ostatecznie otrzymanego rekombinowanego wirusa. Inne skróty: AmpR = gen oporności na ampicylinę; bps (pz) - pary zasad.
Figura 6: Schemat międzygenowych miejsc insercji w MVA (Genbank Ac. U94848).
Figura 7: Analiza PCR sekwencji IGR I4L-I5L w rekombinowanym MVA z wstawionym NS1 z wirusa Dengue w IGR I4L-I5L. Linia „BN” odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego N1 MVA wykrywalny jest większy fragment (1, 2, 3, 4: różne stężenia DNA). M = wagowy marker molekularny, H2O = wodna kontrola negatywna.
Figura 8: Figura 8a: Analiza PCR sekwencji IGR 136-137 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM4 z wirusa Dengue w IGR 136-137. Linia „BN” odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM4 MVA wykrywalny jest większy fragment (mBN23, 1/10, 1/100: różne stężenia DNA). M = wagowy marker molekularny, H2O = wodna kontrola negatywna; pBN27 = plazmidowa kontrola pozytywna.
Figura 8b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wektora ze wstawionym PrM4 w IGR 136-137 MVA (MVA-mBN23).
Figura 9: Figura 9a: Analiza PCR sekwencji IGR 07-08 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM2 z wirusa Dengue w IGR 07-08. Linia 3 odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM2 MVA wykrywalny jest większy fragment (2 linia). M = wagowy marker molekularny, 1 linia = wodna kontrola negatywna.
Figura 9b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wirusa ze wstawionym PrM2w IGR 07-08 MVA (MVA-mBN25).
Figura 10: Figura 8a: Analiza PCR sekwencji IGR 07-08 w rekombinowanym MVA z wstawionym env HIV w IGR 07-08. Linia BN odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM2 MVA wykrywalny jest większy fragment (1, 2, 3 linia). M = wagowy marker molekularny, - = wodna kontrola negatywna; + = plazmidowa kontrola pozytywna.
Figura 11: Figura 11a: Analiza PCR sekwencji IGR 44-45 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM3 z wirusa Dengue, w miejscu IGR 44-45. Linia BN odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM3 MVA wykrywalny jest większy fragment (linia 1-4: różne stężenia DNA). M = wagowy marker molekularny, - = wodna kontrola negatywna.
Figura 11b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wektora ze wstawionym PrM3 w IGR 44-45 MVA (MVA-mBN28).
Figura 12: Figura 12a: Analiza PCR sekwencji IGR 148-149 w rekombinowanym MVA z wstawionym PrM1 z wirusa Dengue w miejscu IGR 148-149. Linia BN odpowiada produktowi PCR otrzymanemu z użyciem pustego wektora MVA-BN. Przy zastosowaniu rekombinowanego PrM1 MVA wykrywalny jest większy fragment (linia 1). M = wagowy marker molekularny, - = wodna kontrola negatywna; + = plazmidowa kontrola pozytywna.
Figura 12b: Krzywe wzrostu dla pustego wektora MVA-BN i rekombinowanego wektora ze wstawionym PrM1 w miejscu IGR 44-45 MVA (MVA-mBN33).
Niniejszy wynalazek ilustrują zamieszczone poniżej przykłady. Dla specjalistów w dziedzinie pozostaje jasne, że przytoczone tu przykłady w żaden sposób nie wpływają na ograniczenie niniejszego wynalazku do zaprezentowanych poniżej realizacji. Cel wynalazku jest ograniczony jedynie pełnym zakresem załączonych zastrzeżeń.
P r z y k ł a d 1
Wektory insercji pBNX39, pBNX70 i pBN84
W celu uzyskania insercji egzogennych sekwencji w między genowym obszarze sąsiadującym z 065L ORF (miejsce insercji w pozycji 56760 genomu) MVA, otrzymano wektor zawierający około 1200 pz sekwencji flankujących, sąsiadujących z miejscem insercji. Wspomniane sekwencje flankujące są rozdzielone na dwa fragmenty zawierające po jednej stronie około 610 pz z 065L ORF (nazewnictwo alternatywne: I4L ORF) a na drugiej stronie około 580 pz z międzygenowego obszaru znajdującego się za 065L ORF, jak również części najbliższej ORF. Między tymi sekwencjami flankującymi, zlokalizowany jest odpowiednio, gen Ecogpt (gpt oznacza gen fosforybozylotransferazy wyizolowany z E.coli) i BFP (niebieskie białko fluorescencyjne), pod kontrolą transkrypcyjną promotora wirusa ospy. Ponadto, istnieje przynajmniej jedno miejsce klonowania odpowiednie dla wstawienia dodatkowych
PL 216 760 B1 genów lub sekwencji wstawianych do międzygenowego obszaru znajdującego się za I4L ORF. Przykładową strukturę wektora według wynalazku ujawniono na Figurze 1a) oraz b) (pBNX39, pBNX70). W wektorze pBN84 (Figura 1c) region kodujący białko NS1 z wirusa Dengue wstawiony jest w miejscu klonowania pBNX70 (Figura 1b).
Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej
Obce geny mogą być wstawiane do genomu MVA poprzez rekombinację homologiczną. W tym celu, pożądany obcy gen jest klonowany do wektora plazmidowego, zgodnie z powyższym opisem. Wektor ten jest transfekowany w zainfekowanych MVA komórkach. Rekombinacja przebiega w cytoplazmie zainfekowanych i transfekowanych komórek. Komórki zawierające rekombinowane wirusy są identyfikowane i izolowane przy użyciu kasety selekcyjnej i/lub reporterowej, również zawartej w strukturze wektora insercji.
W celu uzyskania rekombinacji homologicznej, komórki BHK (komórki nerki młodego chomika) lub CEF (pierwotne fibroblasty embrionu kurcząt) są zaszczepiane na 6 studzienkowych płytkach, przy zastosowaniu podłoża DMEM (Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco BRL) + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) lub VP-SFM (Gibco BRL) + 4 mmol/1 L-glutaminy w przypadku produkcji bez surowicy.
Konieczne jest uzyskanie komórek pozostających w fazie wzrostu, a zatem powinny one osiągnąć 60-80% konfluencji w dniu transfekcji. W celu dokonania infekcji, komórki zliczano przed zaszczepieniem, ponieważ liczba komórek powinna być znana dla określenia poziomu multiplikacji infekcji (moi).
W celu infekcji, roztwór wyjściowy MVA rozcieńczano w DMEM/FCS lub VP-SFM/L-glutaminie, tak by uzyskać 500 μΐ rozcieńczenia, zawierającego odpowiednią ilość wirusa, dającego 0.1 - 1.0 moi. Komórki gromadzono, po czym dzielono po zaszczepieniu. Rozdzielano podłoże od komórek, które infekowano 500 μΐ rozcieńczonego wirusa, wytrząsając przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuwano inokulum i przemywano komórki DMEM/VP-SFM. Podczas reakcji transfekcji zainfekowane komórki pozostawiano w 1.6 ml, odpowiednio, DMEM/FCS i VP-SFM/L-glutaminie (zestaw Qiagen Effectene Kit).
W celu dokonania transfekcji, zastosowano zestaw do transfekcji „Effectene” (Qiagen). Otrzymano mieszaninę transfekcyjną zawierającą 1-2 μg zlinearyzowanego wektora insercji (całkowita ilość dla wielokrotnej transfekcji) w buforze EC o końcowym stężeniu 100 μΙ. Dodano 3.2 μl Enhancera, wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie, po wymieszaniu zawartości probówki z roztworem wyjściowym dodano do 10 μl Effectene i wymieszano gruntownie roztwór wstrząsając i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 10 min. Dodano, odpowiednio, 600 μl DMEM/FCS i VP-SFM/L-glutaminy, wymieszano, a następnie pełną mieszaninę transfekcyjną przeniesiono do komórek, pokrytych już podłożem. Delikatnie poruszano płytką, W celu wymieszania mieszaniny reakcyjnej. Całonocna inkubacja przebiegała w 37°C, w atmosferze 5% C02. Następnego dnia podłoże usuwano, zastępowano świeżym DMEM/FCS lub VP-SFM/L-glutaminą. Inkubację kontynuowano do 3 dnia. W celu zebrania komórek, komórki zeskrobywano do podłoża, następnie przenoszono zawiesinę komórkową do odpowiedniej probówki i zamrażano w -20°C dla krótkoterminowego przechowywania lub w -80°C w przypadku długiego okresu przechowywania.
Wstawienie Ecogpt w miejscu insercyjnym I4L w MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBNX39 (Figura 1a), zawierającym gen Ecogpt (Ecogpt, lub skrócony do gpt, dla określenia genu fosforybozylotransferazy), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 3 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek” w podłożu selekcyjnym dla metabolizmu fosforybozylotransferazy, poprzez dodanie kwasu mykofenolowego, ksantyny i hipoksantyny. Kwas mykofenolowy (MPA) inhibituje dehydrogenazę monofosforanu inozyny, powodując blokadę syntezy puryn, a przez to zatrzymując replikację wirusa w większości linii komórkowych. Blokada ta może zostać ominięta poprzez ekspresję Ecogpt pod kontrolą konstytutywnego promotora i dostarczenie substratów, ksantyny i hipoksantyny.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji I4L, BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1) oraz BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynoPL 216 760 B1 siła 328 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany MVA, z wbudowanym egzogennym DNA w miejscu insercji I4L, fragment był odpowiednio dłuższy.
Wstawienie NS1 w miejscu insercji IGR064L-065L (I4L-I5L) wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo, transfekowano wektorem insercji pBN84 (Figura 1 c), zawierającym gen Ecogpt do selekcji i BFP (niebieskie białko fluorescencyjne), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 7 cykli oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym dla metabolizmu fosforybozylotransferazy, poprzez dodanie kwasu mykofenolowego, ksantyny i hipoksantyny. Kwas mykofenolowy (MPA) inhibituje dehydrogenazę monofosforanu inozyny, powodując blokadę syntezy puryn oraz zatrzymanie replikacji wirusa w większości linii komórkowych. Blokada ta może zostać ominięta poprzez ekspresję Ecogpt pod kontrolą konstytutywnego promotora i dostarczenie substratów ksantyny i hipoksantyny.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji I4L, BN499 (CAA CTC TCT TCT TGA TTA CC, SEQ ID NO.: 1) oraz BN500 (CGA TCA AAG TCA ATC TAT G, SEQ ID NO.: 2). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 328 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany genem NS1 wirus MVA, z wbudowanym regionem kodującym NS1 z wirusa Dengue w miejscu insercji I4L, oczekiwany fragment był długości 1683 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 7, wskazują jasno na stabilną insercję NS1 w miejscu insercji I4L po 17 cyklach amplifikacji wirusa.
Testowanie in vitro recMVA zawierającego NS1 (MVA-BN22)
Kolbę T25 z około 80% konfluencją pojedynczej warstwy komórek BHK inkubowano z 100 μΐ roztworu wirusa rozcieńczonego do 1x107 w ΜΕΜα z 1% FCS i mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Do każdej kolby dodano 5 ml MEMα z 3% FCS i inkubowano w 30°C, w atmosferze CO2. Kolby wyjmowano po 48 godzinach. Usuwano supernatant i wirowano przy 260 g przez 10 minut w 4°C. Supernatanty przechowywano w porcjach w -80°C. Osad przemywano dwukrotnie 5 ml 1xPBS, a następnie zawieszano ponownie w 1 ml hipotonicznego buforu z 1% TX100. Gromadzono supernatanty lizaty komórkowe i wirowano przez 5 minut przy 16,000 g, płyny znad osadu przechowywano w probówkach do wirowania w -80°C.
Kolby zaszczepiano MVA zawierającym GFP, MVA zawierającym gen NS1 w miejscu delecji (MVA-BN07), w ten sam sposób postąpiono w przypadku próbnie infekowanych kolb.
Lizat komórkowo/wirusowy i płyn znad osadu dodawano do nieredukującego/redukującego buforu do próbek w warunkach nieogrzewania/ogrzewania. Białka rozdzielano w 10% SDS PAGE i przenoszono na membrany nitrocelulozowe. Do blotów dodawano sondy i pozostawiano na noc wraz z surowicą pobraną od rekonwalescentów (PPCS), w rozcieńczeniu 1:500. Po trzykrotnym przemyciu 1xPBS, bioty inkubowano wraz z przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG-HRP (DAKO) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po przemyciu blotów jak wyżej, rozwijano reakcję barwną stosując 4-chloro-1-naftol.
Wyniki uzyskane z techniki western-blot wskazują, że NS1 w MVA-BN22 ulega ekspresji w dużych ilościach. NS1 było ekspresjonowane w prawidłowej konformacji, jako dimer w warunkach nieogrzewania i jako monomer w warunkach ogrzewania.
Porównywano poziom ekspresji NS1 zarówno w MVA-BN22, jak i w MVA-BN07. Komórki BHK zaszczepiano taką samą ilością pfu i zbierano po 48 godzinach. Na podstawie wyników stwierdzono, że ekspresja NS1 była znacznie wyższa w BN22 niż w BN07. Rezultaty otrzymane z western blot wskazują również, że więcej NS1 jest wydzielanego w supernatancie z BN22, w porównaniu z BN07.
Wyniki świadczą również o tym, że NS1 ekspresjonowane w komórkach infekowanych BN22 jest antygenne i rozpoznawane przez surowicę pobraną od rekonwalescentów.
Podsumowując, NS1 ulega ekspresji w dużych ilościach i w prawidłowej konformacji w komórkach BHK zainfekowanych BN22. Zarówno dimer, jak i monomer, są antygenne i rozpoznawane przez surowicę z próbek pobranych od rekonwalescentów.
P r z y k ł a d 2
Wektor insercyjny pBNX67 i pBN27.
Sekwencje sąsiadujące z nowym miejscem insercji MVA (pozycja 129940 w genomie) między ORF 136L a 137L wyizolowano stosując standardową technikę amplifikacji pożądanych sekwencji PCR z użyciem następujących starterów: oBN543 (TCCCCGCGGAGAGGCGTAAAAGTTAAATTA16
PL 216 760 B1
GAT; SEQ ID NO.: 3) oraz BN544 (TGATCTAGAATCGCTCGTAAAAACTGCGGAGGT; SEQ ID NO.: 4) do wyizolowania Flank 1; oBN578 (CCGCTCGAGTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 5) oraz oBN579 (CGGGGGCCCTATTTTGTATAATATCTGGTAAG; SEQ ID NO.: 6) do wyizolowania Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddawano działaniu enzymów restrykcyjnych Sacll i Xbal i ligowano w trawionym Sac ll/Xba l i defosforylowanym wektorze podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
Tak otrzymany plazmid trawiono Xhol/Apal, defosforylowano i ligowano do trawionego Xhol/Apal fragmentu PCR, zawierającego Flank 2.
Dowolnie, wstawiano w miejscu Hindll/Pstl otrzymanego wektora sekwencję powtórzeniową z Flank 2, wyizolowaną przy zastosowaniu PCR i użyciu starterów oBN545 (CGGCTGCAGGGTACCTTCACGTTCAGCCTTCATGC; SEQ ID NO.: 7) oraz oBN546 (CGGAAGCTTTATATGGTTTAGGATATTCTGTTTT; SEQ ID NO.: 8), i trawioną HindIII/PstI Figurze 2a) przedstawiono wektor (pBNX51).
Kasetę reporterową zawierającą syntetyczny promotor, gen NPT II (oporności na neomycynę), gen regionu poli-A, IRES, EGFP (Ps-NPTIII-poliA-IRES-EGFP), trawiono EcII/36II/Xhol i wstawiano do miejsca HindllI/Xhol wektora insercji, przy czym miejsce HindIII było wyrównane przy użyciu polimerazy T4 DNA (Roche). Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według opisanego przykładu ujawniono na Figurze 2b) (pBNX67).
W celu otrzymania pBN27 (Fig. 2c), wstawiano serotyp 4 PrM z wirusa Dengue w pojedynczym miejscu PacI w pBNX67.
Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej
Do uzyskania rekombinowanego MVA można zastosować wektor pBNX67 (Figura 2b) przy użyciu opisanego wyżej protokołu - np., użycie pBN27 (Fig. 2c) do rekombinacji homologicznej pozwala na uzyskanie rekombinowanego MVA zawierającego PrM4 z wirusa Dengue w obszarze międzygenowym, między dwiema sąsiednimi ORF.
Wstawienie PrM4 w miejscu insercji IGR136-137 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN27 (Figura 2c), zawierającym gen NPT do selekcji i EGFP (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne), jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 4 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym G418.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR 136-137, BN900 (cgttcgcatgggttacctcc, SEQ ID NO.: 9) oraz BN901 (gacgcatgaaggctgaac, SEQ ID NO.: 10). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 88 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany PrM4 MVA, z wbudowanym regionem kodującym PrM4 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGRl136-137 oczekiwany fragment był długości 880 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 8a, wskazują jasno na stabilną insercję PrM4 w miejscu insercji IGRl36-137 po 22 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA nadal wykazywał takie same właściwości wzrostu jak MVA-BN. Ulegał on replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórki CEF) i wzrastał atenuowany w komórkach ssaczych (Fig. 8b).
P r z y k ł a d 3
Wektor insercyjny pBNX79, pBNX86, pBNX88, pBN34 i pBN56
Sekwencje sąsiadujące z nowym miejscem insercji MVA (pozycja 12800 w genomie) między ORF 007R a 008L wyizolowano stosując standardową technikę amplifikacji pożądanych sekwencji PCR z użyciem następujących starterów: IGR 07/08 F1up (CGCGAGCTCAATAAAAAAAAGTTTTAC; SEQ ID NO.: 11) oraz IGR 07/08 Flend (AGGCCGCGGATGCATGTTATGCAAAATAT; SEQ ID NO.: 12) do wyizolowania Flank 1; IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) oraz IGR 07/08 F2end (CAGGGCCCTCTCATCGCTTTCATG; SEQ ID NO.: 14) do wyizolowania Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddawano działaniu enzymów restrykcyjnych SacII i Sacl i ligowano w trawionym Sac ll/Sacl i defosforylowanym wektorze podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
PL 216 760 B1
Tak otrzymany plazmid trawiono XhoI/Apal, defosforylowano i ligowano do trawionego XhoIApal fragmentu PCR, zawierającego Flank 2.
Dowolnie, wstawiano w miejscu BamHI/Pstl otrzymanego wektora sekwencję powtórzeniową z Flank 2, wyizolowaną przy zastosowaniu PCR i użyciu starterów IGR 07/08 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCCAATATATGGCATAGAAC; SEQ ID NO.: 13) oraz IGR 07/08 F2mid (TTTCTGCAGTGATATTTATCCAATACTA; SEQ ID NO.: 15), i trawioną BamHI/Pstl.
Jakakolwiek kaseta zawierająca gen reporterowy lub terapeutyczny, posiadająca np., promotor wirusa ospy, gen markerowy, region poli-A i dowolnie element IRES, inny gen, np., ekspresjonujący substancję o aktywności terapeutycznej lub produkt genu, może być wyrównana na końcach przy użyciu polimerazy T4 DNA (Roche) po trawieniu restrykcyjnym, po czym wstawiona w odpowiednim miejscu klonowania wektora plazmidowego. Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według opisanego przykładu ujawniono na Figurze 3b) (pBNX79). Odpowiednio, insercja kasety selekcyjnej NPT/EGFP daje w wyniku wektor pBNX86 (Fig. 3b), insercja kasety selekcyjnej gpt/BFP daje w wyniku wektor pBNX88 (Fig. 3c). Przyjmując za jednostkę ekspresji gen terapeutyczny, włączając gen terapeutyczny i operacyjnie związany promotor, taka jednostka ekspresji wstawiana jest w miejscu Pad. W celu otrzymania pBN34 (Fig. 3d) PrM2 z wirusa Dengue klonowany jest w pBNX88 (Fig. 3c) a dla syntezy pBN56 (Fig. 3e) region kodujący env HIV klonowany jest w Pacl w wektorze pBNX86 (Fig. 3b).
Otrzymywanie rekombinowanego MVA drogą rekombinacji homologicznej
Do uzyskania rekombinowanego MVA można zastosować wektor pBNX86 (Fig. 3b) i wektor pBNX88 (Fig. 3c) przy użyciu opisanego wyżej protokołu. Zastosowanie pBN34 (Fig. 3d) do rekombinacji homologicznej pozwala na uzyskanie rekombinowanego MVA zawierającego PrM2 z wirusa Dengue w obszarze międzygenowym, między dwiema sąsiednimi ORF. Rekombinacja pBN56 (Figura 3e) z genomem MVA-BN daje w wyniku rekombinowany MVA, zawierający gen env HIV w odpowiednim IGR.
Wstawienie PrM2 w miejscu insercji IGR07-08 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN34 (Fig. 3d), zawierającym gen gpt do selekcji i BFP, jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 3 cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym kwasu mykofenolowego, jak opisano w Przykładzie 1.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR07-08, BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) oraz BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 190 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany PrM2 MVA, z wbudowanym regionem kodującym PrM2 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGR07-08 oczekiwany fragment był długości 950 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 9a), wskazują jasno na stabilną insercję PrM2 w miejscu insercji IGR07-08 po 20 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA nadal wykazywał takie same właściwości wzrostu jak MVA-BN. Ulegał on replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórki CEF) i wzrastał atenuowany w komórkach ssaczych (Fig. 9b).
Wstawienie env HIV w miejscu insercji IGR07-08 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN56 (Fig. 3e), zawierającym gen NPT do selekcji i EGFP, jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano w 6 cyklach oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym G418.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR07-08, BN902 (ctggataaatacgaggacgtg, SEQ ID NO.: 16) oraz BN903 (gacaattatccgacgcaccg, SEQ ID NO.: 17). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 190 nukleotydów (nt), gdy amplifikowano rekombinowany env MVA, z wbudowanym regionem kodującym env HIV w miejscu insercji IGR07-08, oczekiwany fragment był długości 2.6 kz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 10, wskazują jasno na stabilną insercję env w miejscu insercji IGR07-08 po 20 cyklach amplifikacji wirusa.
PL 216 760 B1
P r z y k ł a d 4
Wektor insercyjny pBNX80, pBNX87 i pBN47
Sekwencje sąsiadujące z nowym miejscem insercji MVA (pozycja 37330 w genomie) między ORF 044L a 045L wyizolowano stosując standardową technikę amplifikacji pożądanych sekwencji PCR z użyciem następujących starterów:
IGR 44/45 F1up (CGCGAGCTCATTTCTTAGCTAGAGTGATA; SEQ ID NO.: 18) oraz IGR 44/45 Flend (AGGCCGCGGAGTGAAAGCTAGAGAGGG; SEQ ID NO.: 19) do wyizolowania Flank 1; IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID NO.: 20) oraz IGR 44/45 F2end (CAGGGCCCCTAAATGCGCTTCTCAAT; SEQ ID NO.: 21) do wyizolowania Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddawano działaniu enzymów restrykcyjnych Sacll i Sacl i ligowano w trawionym Sac Il/Sac l i defosforylowanym wektorze podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
Tak otrzymany plazmid trawiono XhoI/Apal, defosforylowano i ligowano do trawionego XhoI/Apal fragmentu PCR, zawierającego Flank 2.
Dowolnie, wstawiano w miejscu BamHI/Pstl otrzymanego wektora sekwencję powtórzeniową z Flank 2, wyizolowaną przy zastosowaniu PCR i użyciu starterów IGR 44/45 F2up (CCGCTCGAGCGCGGATCCTAAACTGTATCGATTATT; SEQ ID NO.: 20) oraz IGR 44/45 F2mid (TTTCTGCAGCCTTCCTGGGTTTGTATTAACG; SEQ ID NO.: 22), i trawioną BamHl/PstI
Jakakolwiek kaseta zawierająca gen reporterowy lub terapeutyczny, posiadająca np., promotor wirusa ospy, gen markerowy, region poli-A i dowolnie element IRES, inny gen, np., ekspresjonujący substancję o aktywności terapeutycznej lub produkt genu, może być wyrównana na końcach przy użyciu polimerazy T4 DNA (Roche) po trawieniu restrykcyjnym, po czym wstawiana w odpowiednim miejscu klonowania wektora plazmidowego. Rozważając położenie kasety genu reporterowego, korzystnym miejscem klonowania jest miejsce enzymu restrykcyjnego Pstl, EcoRl, EcoRV, Hindlll, Aval lub Xhol, między Flank 2 a powtórzeniem Flank 2. W celu otrzymania pBNX87 (Fig. 4b), kaseta selekcyjna NPT/EGFP wstawiona została w pBNX80 (Fig. 4a). Przyjmując za 9 jednostkę ekspresji gen terapeutyczny, włączając gen terapeutyczny i operacyjnie związany promotor, taka jednostka ekspresji wstawiana jest w miejscu PacI.
Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według opisanego przykładu ujawniono na Figurze 4a) i b) (pBNX80, pBNX87).
Wektor może być zastosowany do otrzymania rekombinowanego MVA - w następstwie powyższego protokołu - przenoszącego egzogenną sekwencję w międzygenowym obszarze między dwiema sąsiednimi ORF. W celu otrzymania pBN47 (Fig. 4c) PrM serotyp 3 z wirusa Dengue klonowany był w pBNX87 (Fig. 4b).
Wstawienie PrM3 w miejscu insercji IGR44-45 wirusa MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według wyżej opisanego protokołu, i dodatkowo transfekowano wektorem insercji pBN47 (Fig. 4c), zawierającym gen NPT do selekcji i EGFP, jako gen reporterowy. Tak uzyskane rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez 3 cykle oczyszczania na płytkach metodą „łysinek”, w podłożu selekcyjnym G418.
Otrzymane rekombinowane wirusy identyfikowano przy użyciu standardowych technik PCR, przy zastosowaniu pary starterów powodujących wybiórczą amplifikację oczekiwanego miejsca insercji. Do amplifikacji zastosowano parę starterów miejsca insercji IGR44-45, BN904 (cgttagacaacacaccgacgatgg, SEQ ID NO.: 23) oraz BN905 (cggatgaaaaatttttggaag, SEQ ID NO.: 24). W przypadku powielania DNA pustego wektora wirusowego MVA, długość oczekiwanego fragmentu PCR wynosiła 185 nukleotydów gdy amplifikowano rekombinowany MVA dla PrM3, z wbudowanym regionem kodującym PrM3 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGR44-45, oczekiwana długość fragmentu wynosiła 850 pz. Wyniki PCR, przedstawione na Fig. 11 a) jasno wskazują na stabilną insercję PrM3 w miejscu insercji IGR44-45 po 19 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA wciąż wykazuje te same właściwości wzrostu jak MVA-BN. Ulega replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórkach CEF) i wzrasta atenuowany w komórkach ssaków (Fig. 11b).
P r z y k ł a d 5
Wektor insercji pBNX90, pBNX92 i pBN54
Sekwencje w MVA sąsiadujące z nowym miejscem insercji (w pozycji 137496 genomu) pomiędzy ORF 148R a 149L, wyizolowano stosując standardową amplifikację PCR pożądanej sekwencji, przy użyciu następujących starterów:
PL 216 760 B1
IGR148/149F1up (TCCCCGCGGGGACTCATAGATTATCGACG; SEQ ID NO.: 25) oraz IGR148/149Flend (CTAGTCTAGACTAGTCTATTAATCCACAGAAATAC; SEQ ID NO.: 26) dla izolacji Flank 1;
IGR 148/149F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) oraz IGR148/149F2end (TAGGGCCCGTTATTGCCATGATAGAG; SEQ ID NO.: 28) dla izolacji Flank 2.
Fragment PCR zawierający Flank 1 poddano działaniu enzymów restrykcyjnych SacII/ Xbal oraz ligacji z trawionym SacII/Xbal i defosforylowanym wektorem podstawowym, takim jak pBluescript (Stratagene).
Uzyskany plazmid trawiono Hindlll/Apal, defosforylowano i ligowano z trawionym HindIII/Apal fragmentem PCR zawierającym Flank 2.
Dowolnie, sekwencje powtórzeniowe Flank 2, wyizolowane poprzez PCR z użyciem starterów IGR148/149 F2up (CCCAAGCTTGGGCGGGATCCCGTTTCTAGTATGGGGATC; SEQ ID NO.: 27) oraz IGR148/149F2mid (TTTCTGCAGTGTATAATACCACGAGC; SEQ ID NO.: 29) i trawione BamHI/Pstl, wstawiano w miejscu BamHI/Pstl otrzymanego wektora.
Jakakolwiek kaseta obejmująca gen reporterowy lub terapeutyczny, posiadająca np. promotor wirusa ospy, gen markerowy, region poli-A oraz dowolnie element IRES, dodatkowy gen, np., ekspresjonujący aktywną terapeutycznie substancję lub produkt genu, może być strawiona na końcach wyrównana przy użyciu Polimerazy T4 DNA (Roche) po trawieniu restrykcyjnym, a następnie wstawiona do stabilnego miejsca klonowania wektora plazmidowego. W celu otrzymania pBNX92 (Fig. 5b), w miejscu klonowania wstawiono kasetę ekspresyjną gpt/BFP. Biorąc pod uwagę kasetę genu reporterowego, korzystnym miejscem klonowania jest miejsce enzymów restrykcyjnych PstI, EcoRl, EcoRV i Hindlll między Flank 2 a Flank-2 powtórzeniem. Biorąc pod uwagę jednostkę ekspresji dla genu 9 terapeutycznego, obejmującą gen terapeutyczny wraz z połączonym operacyjnie promotorem, taka jednostka ekspresji wstawiana jest w miejscu PacI. W celu otrzymania pBN54 (Fig. 5c), PrM1 z wirusa Dengue wstawiano w tym miejscu PacI.
Mapę restrykcyjną przykładowego wektora według niniejszego Przykładu zamieszczono na Figurze 5a) i b) (pBNX90, pBNX92).
Wektor może być użyty do otrzymywania rekombinowanego MVA - w następstwie wyżej opisanego protokołu - przenosząc egzogenne sekwencje w międzygenowym obszarze pomiędzy dwiema sąsiadującymi ORF. W celu uzyskania rekombinowanego MVA zastosowano do rekombinacji homologicznej ekspresjonujący PrM1 z wirusa Dengue pBN54 (Fig. 5c).
Insercja PrM1 w miejscu insercyjnym IGR148-149 w MVA
W pierwszym etapie, komórki infekowano MVA według opisanego wyżej protokołu oraz dodatkowo transfekowano wektorem insercyjnym pBN54 (Fig. 5c), zawierającym gen gpt do selekcji oraz BFP jako gen reporterowy. Uzyskane w ten sposób rekombinowane wirusy oczyszczano poprzez trzy cykle oczyszczania na płytkach, metodą „łysinek” w warunkach selekcji kwasem mykofenolowym.
Tak otrzymane wirusy identyfikowano stosując standardową analizę PCR z użyciem pary starterów selektywnie amplifikujących oczekiwane miejsce insercji. Do amplifikacji miejsca insercji IGR148149, zastosowano parę starterów BN960 (ctgtataggtatgtcctctgcc, SEQ ID NO.: 30) oraz BN961 (gctagtagacgtggaaga, SEQ ID NO.: 31). W przypadku, gdy DNA pustego wektora wirusowego MVA ulega amplifikacji, oczekiwany fragment PCR jest długości 450 nukleotydów (nt), w przypadku. Gdy rekombinowany PrM1 MVA ulega amplifikacji posiadający wbudowany region kodujący PrM1 z wirusa Dengue w miejscu insercji IGR148-149, oczekiwany fragment obejmuje 1200 pz. Wyniki PCR przedstawione na Fig, 12a wskazują jasno na stabilną insercję PrM1 w miejscu insercyjnym IGR148-149 po 23 cyklach amplifikacji wirusa. Rekombinowany MVA wykazuje wciąż te same właściwości wzrostu, co MVA-BN. Ulega replikacji w fibroblastach embrionów kurcząt (komórki CEF) i wzrasta atenuowany w komórkach ssaczych (Fig. 12b).
PL 216 760 B1
LISTA SEKWENCJI <110> Bavarian Nordic A/S <120> Międzygenowe obszary jako miejsca insercji w genomie zmodyfikowanego wirusa krowianki Ankara (MVA)
<130> BN45PCT
<150> DK PA 2002 00752
<151> 2002-05-16
<160> 37
<170> wersją 3.1 Patentl·
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> primer
<400> 1 caactctctt cttgattacc
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> primer
<400> 2 cgatcaaagt caatctarg
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> primer
PL 216 760 B1
<400> 3 tccccgcgga gaggcgtaaa agttaaatta gat 33
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> primer
<400> 4 tgatctagaa tcgctcgtaa aaactgcgga ggt 33
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> primer
<400> 5 ccgctcgagt tcacgttcag ccttcatgc 29
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> primer
<400> 6 cgggggccct attttgtata atatctggta ag 32
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> primer
<400> 7 cggctgcagg gtaccttcac gttcagcctt catgc 35
<210> 8 <211> 34 <212> DNA <213>- primer
PL 216 760 B1 <400> 8 cggaagcttt atatggttta ggatattctg tttt 34 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 9 cgttcgcatg ggttacctcc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 10 gacgcatgaa ggctgaac 1° <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 11 cgcgagctca ataaaaaaaa gttttac <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 12 aggccgcgga tgcatgttat gcaaaatat 4.
<210> 13 <211> 36 <212> DNA
PL 216 760 B1 <213> primer <400> 13 ccgctcgagc gcggatccca atatatggca tagaac <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> primer <400> 14 cagggccctc tcatcgcttt catg 24 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> primer <400>
<400> 15 tttctgcagt gatatttatc caatacta <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 16 ctggataaat acgaggacgt g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> primer <400> 17 gacaattatc cgacgcaccg 20 <210> 18 <211> 29
PL 216 760 B1 <212>
DNA <213>
primer <400> 18 cgcgagctca tttcttagct agagtgata <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> primer <400> 19 aggccgcgga gtgaaagcta gagaggg 27 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> primer <400> 20 ccgctcgagc gcggatccta aactgtatcg attatt <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 21 cagggcccct aaatgcgctt ctcaat 26 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> primer <400> 22 tttctgcagc cttcctgggt ttgtattaac g <210> 23
PL 216 760 B1 <211>
<212>
DNA <2Χ3>
primer <400> 23 cgttagacaa cacaccgacg atgg <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> primer <400> 24 cggatgaaaa atttttggaa g 21 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> primer <400> 25 tccccgcggg gactcataga ttatcgacg <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> primer <400> 26 ctagtctaga ctagtctatt aatccacaga aatac 35 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> primer <400> 27 cccaagcttg ggcgggatcc cgtttctagt atggggatc
PL 216 760 B1
<210> .28
<211> 26
<212> DNA
<213> primer
<400> 28
tagggcccgt tattgccatg atagag <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> primer <400> 29 tttctgcagt gtataatacc acgagc <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> primer <400> 30 ctgtataggt atgtcctctg cc <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> primer <400> 31 gctagtagac gtggaaga <210> 32 <211> 1192 <212> DNA <213> wirus krowianki <22O>
PL 216 760 B1 <221> Fragment ORF C 64L <222> Cl)..<526) <223>
<220>
<221> IGR 64-65 <222> (527).,(608) <223>
<22O>
<221> Fragment ORF C 65L <222> (609)..(1190) <223>
<400> 32 caccttctat agatctgaga atggatgatt ctccagtcga aacatattct accatggatc 60
cgtttaattt gttgatgaag atggattcat ccttaaatgt tttctctgta atagtttcca 120
ccgaaagact atgcaaagaa tttggaatgc gttccttgtg cttaatgttt ccatagacgg 180
cttctagaag ttgatacaac ataggactag ccgcggtaac ttttattttt agaaagtatc 240
catcgcttct atcttgttta gatttatttt tataaagttt agtctctcct tccaacataa 300
taaaagtgga agtcatttga ctagataaac tatcagtaag ttttatagag atagacgaac 360
aattagcgta ttgagaagca tttagtgtaa cgtattcgat acattttgca ttagatttac 420
taatcgattt tgcatactct ataacacccg cacaagtctg tagagaatcg ctagatgcag 480
taggtcttgg tgaagtttca actctcttct tgattacctt actcatgatt aaacctaaat 540
aattgtactt tgtaatataa tgatatatat tttcacttta tctcatttga gaataaaaat 600
gtttttgttt aaccactgca tgatgtacag atttcggaat cgcaaaccac cagtggtttt 660
attttatcct tgtccaatgt gaattgaatg ggagcggatg cgggtttcgt acgtagatag 720
tacattcccg tttttagacc gagactccat ccgtaaaaat gcatactcgt tagtttggaa 780
taactcggat ctgctatatg gatattcata gattgacttt gatcgatgaa ggctcccctg 840
tctgcagcca tttttatgat cgtcttttgt ggaatttccc aaatagtttt ataaactcgc 900
ttaatatctt ctggaaggtt tgtattctga atggatccac catctgccat aatcctattc 960
ttgatctcat cattccataa ttttctctcg gttaaaactc taaggagatg cggattaact 1020
acttgaaatt ctccagacaa tactctccga gtgtaaatat tactggtata cggttccacc 1080
gactcattat ttcccaaaat ttgagcagtt gatgcagtcg gcataggtgc caccaataaa 1140
PL 216 760 B1 ctatttctaa gaccgtatgt tctgatttta tcttttagag gttcccaatt cc 1192 <210> 33 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <22O>
<22ł> Fragment ORF 135r <222> (1) .. (96) <223>
<22O>
<221> ORF C 136L <222> (101)..(298) <223>
<220>
<221> IGR 136-137 <222> (299)..(883) <223>
<220>
<221> Fragment ORF c 137L <222> (884)..(1198) <223>
<400> 33 agaggcgtaa aagttaaatt agatttcgaa cgaaggcctc cttcgtttta taaaccatta 60 gataaagttg atctcaaacc gtcttttctg gtgtaatatt ctagtttggt agtagataca 120 tatcaatatc atcaaattcg agatccgaat tataaaatgg gcgtggattg ttaactatag 180 aatcggacgt ctgatattcg aaaatctgtg gagttttagg ttttggtgga ggtgtaactg 240 ctacttggga tactgaagtc tgatattcag aaagctgggg gatgttctgg ttcgacatcc 300 accgatggtg tcacatcact aatcggttcg gtaacgtctg tggacgatgg aggcaccact 360 tctacaggtt ctggttcttt atcctcagtc atcaacggag ctacttcaat gcgaggaaat 420
PL 216 760 B1 gtataatttg gtaatggttt ctcatgtgga tctgaagaag aggtaagata tctactagaa 480 agataccgat cacgttctag ttctcttttg tagaacttaa ctttttcttt ctccgcatct 540 agttgatatt ccaacctctt cacgttcgca tgggttacct ccgcagtttt tacgagcgat 600 ttcacgttca gccttcatgc gtcttatagc atgaattcgc ttatcgttat cgggtttagc 660 ttctgtcacc ttagcaattc cttttttatt aaactctaca taatcatatc catttctatt 720 gtttgttcta atataaacga gtatagcatc attgctaaat ttttcaatag tatcgaaaac 780 agaatatcct aaaccatata atatatattc aggaacactc aaactaaatg tccaggattc 840 tcctaaatac gtaaacttta atagtgcgaa atcattcaaa aatctaccac ttatagatag 900 atagatagta cataaatgcg tatagtagtc tacctatctc tttattatga aaaccggcat 960 tacgatcata tatgtcgtga tatacctgtg atccgtttac gttaaaccat aaatacatgg 1020 gtgatcctat aaacatgaat ttatttctaa ttctcagagc tatagttaat tgaccgtgta 1080 atatttgctt acatgcatac ttgatacgat cattaataag atttttatca rtgctcgtta 1140 tttcagaatc gtatatataa ggagtaccat cgtgattctt accagatatt atacaaaata 1200 <210> 34 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment ORF 07r <222> (1)..(338) <223>
<220>
<221> IGR 07-08 <222> (339)..(852) <223>
<220>
<221> Fragment orf c 08L <222> (853)..(1200) <223>
<400> 34
PL 216 760 B1
aataaaaaaa agttttacta atttaaaatt atttacattt ttttcactgt ttagtcgcgg 60
atatggaatt cgatcctgcc aaaatcaata catcatctat agatcatgta acaatattac 120
aatacataga tgaaccaaat gatataagac taacagtatg cattateaca aaaataaatc 180
cacatttggc taatcaattt cgggcttgga aaaaacgtat cgccggaagg gactatatga 240
ctaacttatc tagagataca ggaatacaac aatcaaaact tactgaaact gtcaaaaaaa 300
tagaaacata tatggtctat atatacacta caatttagtt attaattgga taaccgatgt 360
gattatcaat caatattaag aaggttggta aattggtaca tagctaataa tacctataca 420
cccaataata caacaaccat ttctgagttg gatatcatca aaatactgga taaatacgag 480
gacgtgtata gagtaagtaa agaaaaagaa tgtgaaattt gctatgaagt tgtttactca 540
aaacgataga tactttggtt tattggattc gtgtaatcat atattttgca taacatgcat 600
caatatatgg catagaacac gaagagaaac cggtgcgtcg gataattgtc ctatatgtcg 660
tacccgtttt agaaacataa caatgagcaa gttaactaat aaataaaaag tttaatttgt 720
tgacgacgta tgtcgttatt ttttctcgta taaaagatta atttgattct aatataatct 780
ttagtattgg ataaatatca attcaaatta attccattag attatatcat aaataaaaat 840
agtagcacgc actacttcag ccaaatattc ttttttgaaa cgccatctat cgtagtgagg 900
acacaagtga acctataatg agcaaattta ttagtatcgg ttacatgaag gactttacgt 960
agagtggtga ttccactatc tgtggtacga acggtttcat cttctttgat gccatcaccc 1020
agatgttcta taaacttggt atcctttgcc aaccaataca tatagctaaa ctcaggcata 1080
tgttccacac atcctgaaca atgaaattct ccagaagatg ttacaatgtc tagatttgga 1140
catttggttt caaccgcgtt aacatatgag tgaacacacc catacatgaa agcgatgaga 1200
<210> 35 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment ORF c 44L <222> (1),.(375) <223>
<22 0>
<221> IGR 44-45 <222> (376)..(647) <223>
PL 216 760 B1 <220>
<221> Fragment ORF c 45L <222> ¢648)..¢1200) <223>
<400> 35
atttcttagc tagagtgata atttcgttaa aacattcaaa tgttgttaaa tgatcggatc 60
taaaatccat attttctggt agtgtttcta ccagcctaca ttttgctccc gcaggtaccg 120
gtgcaaatgg ccacatttag ttaacataaa aacttataca tcctgttcta tcaacgattc 180
tagaatatca tcggctatat cgctaaaatt ttcatcaaag tcgacatcac aacctaactc 240
agtcaatata ttaagaagtt ccatgatgtc atcttcgtct atttctatat ccgtatccat 300
tgtagattgt tgaccgatta tcgagtttaa atcattacta atactcaatc cttcagaata 360
caatctgtgt ttcattgtaa atttataggc ggtgtattta agttggtaga ttttcaatta 420
tgtatcaata tagcaacagt agttcttgct cctccttgat tctagcatcc tcttcattat 480
tttcttctac gtacataaac atgtccaata cgttagacaa cacaccgacg atggcggccg 540
ccacagacac gaatatgact aaaccgatga ccatttaaaa acccctctct agctttcact 600
taaactgtat cgattattct tttagaacat gtataatata aaaacattat tctatttcga 660
atttaggctt ccaaaaattt ttcatccgta aaccgataat aatatatata gacttgttaa 720
tagtcggaat aaatagatta atgcttaaac tatcatcatc tccacgatta gagatacaat 780
atttacattt tttttgctgt ttcgaaactt tatcaataca cgttaataca aacccaggaa 840
ggagatattg aaactgaggc tgttgaaaat gaaacggtga atacaataat tcagataatg 900
taaaatcatg attccgtatt ctgatgatat tagaactgct aatggatgtc gatggtatgt 960
atctaggagt atctatttta acaaagcatc gatttgctaa tatacaatta tcattttgat 1020
taattgttat tttattcata ttcttaaaag gtttcatatt tatcaattct tctacattaa 1080
aaatttccat ttttaattta tgtagccccg caatactcct cattacgttt cattttttgt 1140
ctataatatc cattttgttc atctcggtac atagattatc caattgagaa gcgcatttag 1200
<210> 36 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment ORF 148R
PL 216 760 B1 <222> (1)..¢596) <223>
<220>
<221> IGR 148-149 <222> ¢597)..(855) <223>
<220>
<221> Fragment ORF C 149L <222> ¢856)..¢1200) <223>
<400> 36 ctcatagatt atcgacgatt atactctgta ttagttctgt cggaggatgt gttatctcta 60
tagataatga cgtcaatggc aaaaatattc taacctttcc cattgatcat gctgtaatca 120
tatccccact gagtaaatgt gtcgtagtta gcaagggtcc tacaaccata ttggttgtta 180
aagcggatat acctagcaaa cgattggtaa catcgtttac aaacgacata ctgtatgtaa 240
acaatctatc actgattaat tattcgccgt tgtctgtatt cattattaga cgagttaccg 300
actatttgga tagacacata tgcgatcaga tatttgcgaa taataagtgg tattccatta 360
taaccatcga caataagcag tttcctattc catcaaactg tataggtatg tcctctgcca 420
agtacataaa ttctagcatc gagcaagata ctttaataca tgtttgtaac ctcgagcatc 480
cattcgactt agtatacaaa aaaatgcagt cgtacaattc tgtacctatc aaggaacaaa 540
tattgtacgg tagaattgat aatataaata tgagcattag tatttctgtg gattaataga 600
tttctagtat ggggatcatt aatcatctct aatctctaaa tacctcataa aacgaaaaaa 660
aagctattat caaatactgt acggaatgga ttcattctct tctcttttta tgaaactctg 720
ttgtatatct actgataaaa ctggaagcaa aaaatctgat aaaaagaata agaataagat 780
caaggattat tataaaataa caatagttcc tggttcctct tccacgtcta ctagctcgtg 840
gtattataca catgcctagt aatagtctct ttgcgttgac ggaaagcaga ctagaaataa 900
caggctaaaa tgttcagaca ccataatagt tcccaaccca gataataaca gagtaccatc 960
aacacattcc tttaaactca atcccaaacc caaaaccgtt aaaatgtatc cggccaattg 1020
atagtagata atgaggtgta cagcgcatga tgatttacac agtaaccaaa atgaaaatac 1080
tttagtaatt ataagaaata tagatggtaa cgtcatcatc aacaatccaa taatatgccg 1140
gagagtaaac attgacggat aaaacaaaaa tgctccgcat aactctatca tggcaataac 1200
PL 216 760 B1 <210> 37 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment orf 018l <222> (1) ..(399) <223>
<220>
<22Ι> IGR 018L-019L <222> (400)..(607) <223>
<220>
<221> Fragment ORF c 019L <222> (608)..(1081) <223>
<220>
<221> obszar niekoduj ący <222> (1082)..(1200) <223>
<400> 37 ggatgagtag ttttcttctt taactttata ctttttacta atcatattta gactgatgta 60 tgggtaatag tgtttaaaga gttcgttctc atcatcagaa taaatcaata tctctgtttt 120 tttgttatac agatgtatta cagcctcata tattacgtaa tagaacgtgt catctacctt 180 attaactttc accgcatagt tgtttgcaaa tacggttaat cctttgacct cgtcgatttc 240 cgaccaatct gggcgtataa tgaatctaaa ctttaatttc ttgtaatcat tcgaaataat 300 ttttagtttg catccgtagt tatccccttt atgtaactgt aaatttctca acgcgatatc 360 tccattaata atgatgtcga attcgtgctg tatacccata ctgaatggat gaacgaatac 420 cgacggcgtt aatagtaatt tactttttca tctttacata ttgggtacta gttttactat 480
PL 216 760 B1 <210> 37 <211> 1200 <212> DNA <213> wirus krowianki <220>
<221> Fragment orf 018l <222> (1)..(399) <223>
<220>
<221> IGR 018L-019L <222> (400)..(607) <223>
<220>
<221> Fragment ORF c 019L <222> (608)..(1081) <223>
<220>
<221> obszar niekoduj ący <222> (1082)..(1200) <223>
<400> 37 ggatgagtag ttttcttctt taactttata ctttttacta atcatattta gactgatgta 60 tgggtaatag tgtttaaaga gttcgttctc atcatcagaa taaatcaata tctctgtttt 120 tttgttatac agatgtatta cagcctcata tattacgtaa tagaacgtgt catctacctt 180 attaactttc accgcatagt tgtttgcaaa tacggttaat cctttgacct cgtcgatttc 240 cgaccaatct gggcgtataa tgaatctaaa ctttaatttc ttgtaatcat tcgaaataat 300 ttttagtttg catccgtagt tatccccttt atgtaactgt aaatttctca acgcgatatc 360 tccattaata atgatgtcga attcgtgctg tatacccata ctgaatggat gaacgaatac 420 cgacggcgtt aatagtaatt tactttttca tctttacata ttgggtacta gttttactat 480
PL 216 760 B1 cataagttta taaattccac aagctactat ggaataagcc aaccatctta gtataacaca 540 catgtcttaa agtttattaa ttaattacat gttgttttat atatcgctac gaatttaaac 600 agagaaatca gtttaggaaa aaaaaatatc tatctacatc atcacgtctc tgtattctac 660 gatagagtgc tactttaaga tgagacatat ccgtgtcatc aaaaatatac tccattaaaa 720 tgattattcc ggcagcgaac ttgatattgg atatatcaca acctttgtta atatctacga 780 caatagacag cagtcccatg gttccataaa cagtgagttt atctttcttt gaagagatat 840 tttgtagaga tcttataaaa ctgtcgaatg acatcgcatt tatatcttta gctaaatcgt 900 atatgttacc atcgtaatat ctaaccgcgt ctatcttaaa cgtttccatc gctttaaaga 960 cgtttccgat agatggtctc atttcatcag tcatactgag ccaacaaata taatcgtgta 1020 taacatcttt gatagaatca gactctaaag aaaacgaatc ggctttatta tacgcattca 1080 tgataaactt aatgaaaaat gtttttcgtt gtttaagttg gatgaatagt atgtcttaat 1140 aattgttatt atttcattaa ttaatattta gtaacgagta cactctataa aaacgagaat 1200

Claims (46)

1. Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara (MVA), znamienny tym, że zawiera egzogenną sekwencję heterologicznego DNA wstawioną w międzygenowym obszarze (IGR) genomu wirusa.
2. MVA według zastrz. 1, znamienny tym, że egzogenna sekwencja heterologicznego DNA wstawiona jest w międzygenowym obszarze (IGR) między dwiema sąsiadującymi otwartymi ramkami odczytu (ORF), wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
3. MVA według zastrz. 1, albo 2, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA zawiera przynajmniej jedną sekwencję kodującą, korzystnie pod kontrolą transkrypcyjną pokswirusowego elementu kontrolującego transkrypcję.
4. MVA według zastrz. 1, do 3, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA koduje jedno lub więcej białek, polipeptydów, peptydów, obcych antygenów lub epitopów antygenowych.
5. MVA według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z wirusa Dengue, wirusa japońskiego zapalenia mózgu, wirusa zapalenia wątroby B, wirusa zapalenia wątroby C i/albo wirusów niedoboru odporności, korzystnie z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).
6. MVA według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA pochodząca z wirusa Dengue wybrana jest z grupy obejmującej NS1 i PrM.
7. MVA według zastrz. 6, znamienny tym, że gen NS1 został wstawiony do IGR pomiędzy ORF 064L-065L.
8. MVA według zastrz. 6 lub 7, znamienny tym, że gen PrM pochodzi z jednego lub więcej z 4 serotypów wirusa Dengue.
9. MVA według zastrz. 6 do 8, znamienny tym, że gen PrM został wstawiony do IGR pomiędzy ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 044L-045L, 136L-137L, 148R-149L.
10. MVA według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja heterologicznego DNA pochodzi z wirusa niedoboru odporności i koduje env HIV.
11. MVA według zastrz. 10, znamienny tym, że gen env HIV został wstawiony do IGR między ORF 007R-008L.
12. MVA według zastrz. 1, do 11, znamienny tym, że jest to MVA zdeponowany w ECACC pod numerem dostępu V00083008.
13. MVA według zastrz. 1 do 12, znamienny tym, że służy do stosowania jako lek i/lub szczepionka.
14. Zastosowanie MVA według zastrz. 1, do 13, do otrzymywania leku i/lub szczepionki do leczenia i/lub zapobiegania infekcjom wirusowym i/lub chorobom proliferacyjnym.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, do leczenia lub zapobiegania infekcji wirusem Dengue lub infekcji wirusem niedoboru odporności, korzystnie infekcji HIV.
16. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera MVA według zastrz. od 1 do 13.
17. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera MVA według zastrz. od 1 do 13 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, rozcieńczalnik, adiuwant i/lub dodatek.
18. Sposób otrzymywania białka, polipeptydu, peptydu, antygenu lub epitopu in vitro, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
- infekcję komórki gospodarza rekombinowanym MVA według zastrz. od 1 do 13,
- hodowlę zainfekowanych komórek gospodarza w odpowiednich warunkach,
- izolację i/lub wzbogacenie polipeptydu, białka, peptydu, antygenu, epitopu i/lub wirusa produkowanego przez wspomnianą komórkę gospodarza.
19. Sposób wprowadzania sekwencji DNA do komórki in vitro, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA jest homologiczna i/lub heterologiczna z genomem wspomnianej komórki, przy czym komórka ta jest infekowana MVA według zastrz. od 1 do 13
20. Komórka in vitro lub ex vivo zawierająca MVA według zastrz. od 1 do 13.
21. Wektor plazmidowy, znamienny tym, że zawiera - sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej;
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
PL 216 760 B1
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna'') drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną oraz
- korzystnie, kasetę genu selekcyjnego i/albo reporterowego.
22. Wektor plazmidowy według zastrz. 21, znamienny tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR znajdującego się między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
23. Wektor plazmidowy według zastrz. 21 lub 22, znamienny tym, że IGR pochodna sekwencja zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqlD Nr 34;
- nr 376-647 z SeqlD Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
24. Wektor plazmidowy według zastrz. 21 do 23, znamienny tym, że sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
25. Wektor plazmidowy według zastrz. 21 do 24, znamienny tym, że sekwencje flankujące IGR z dwóch sąsiadujących ORF zawierają sekwencję wybraną są z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
26. Wektor plazmidowy według zastrz. 24 do 30, znamienny tym, że wspomnianym wirusem jest MVA zdeponowany w ECACC pod numerem depozytu V00083008.
27. Sposób otrzymywania MVA według zastrz. 1, do 13, znamienny tym, że in vitro obejmuje następujące etapy:
- transfekcję komórki wektorem plazmidowym według zastrz. 21 do 26;
- infekcję transfekowanej komórki MVA;
- identyfikację, izolację i ewentualnie oczyszczenie MVA według zastrz. 1 do 13.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że komórka jest zainfekowana MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
29. DNA, znamienny tym, że zawiera:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna”) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA,
- sekwencję heterologiczną.
30. Sekwencja DNA według zastrz. 29, znamienna tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranych z grupy zawierającej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L137L, 148R-149L.
31. Sekwencja DNA według zastrz. 29 lub 30, znamienna tym, że sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
PL 216 760 B1
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
32. Sekwencja DNA według zastrz. 29 do 31, znamienna tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L- 045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
33. Sekwencja DNA według zastrz. 29 do 32, znamienna tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
34. Sekwencja DNA według zastrz. 34 do 40, znamienna tym, że sekwencja DNA ukierunkowuje wstawienie sekwencji heterologicznej do IGR genomu MVA zdeponowanego w ECACC pod numerem V00083008.
35. Zastosowanie wektora plazmidowego obejmującego:
- sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, oraz
- miejsce klonowania wstawione we wspomnianej sekwencji IGR do insercji wspomnianej sekwencji heterologicznej, oraz
- korzystnie, kasetę genu reporterowego i/lub selekcyjnego do otrzymywania oraz/albo produkowania rekombinowanego MVA według zastrz. 1 do 13.
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
37. Zastosowanie według zastrz. 35 albo 36, znamienne tym, że sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
38. Zastosowanie według zastrz. od 35 do 37, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L- 045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
39. Zastosowanie według zastrz. od 35 do 38, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
PL 216 760 B1
40. Zastosowanie według zastrz. 35 albo 39, znamienne tym, że wspomniany wirus MVA jest MVA zdeponowanym w ECACC pod numerem V00083008.
41. Zastosowanie DNA zawierającego sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej:
a) sekwencję DNA zawierającą sekwencję IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF z wirusowego genomu MVA, i/lub
b) sekwencję DNA zawierającą sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF z wirusowego genomu MVA;
c) sekwencję DNA homologiczną do sekwencji DNA a) i/lub b), przy czym wspomniana sekwencja homologiczna ukierunkowuje wstawienie sekwencji DNA heterologicznej wobec genomu wirusa MVA („sekwencja heterologiczna) drogą rekombinacji homologicznej do IGR położonego między dwiema sąsiednimi ORF genomu MVA, do otrzymania i/łub produkcji wektora plazmidowego według zastrz. od 21 do 26 i/lub otrzymania i/lub produkcji rekombinowanego MVA według zastrz. 1, do 13.
42. Zastosowanie według zastrz. 41, znamienne tym, że sekwencja IGR pochodzi z IGR między ORF wybranymi z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L-045L, 064L-065L, 136L-137L, 148R-149L.
43. Zastosowanie według zastrz. 41 albo 42, znamienne tym, że sekwencja pochodna IGR zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydowe:
- nr 527-608 z SeqID Nr 32;
- nr 299-883 z SeqID Nr 33;
- nr 339-852 z SeqID Nr 34;
- nr 376-647 z SeqID Nr 35;
- nr 597-855 z SeqID Nr 36;
- nr 400-607 z SeqID Nr 37.
44. Zastosowanie według zastrz. od 41 do 43, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF wybrane są z grupy obejmującej: 007R-008L, 018L-019L, 044L- 045L, 064L065L, 136L-137L, 148R-149L.
45. Zastosowanie według zastrz. od 41 do 44, znamienne tym, że sekwencje flankujące IGR dwóch sąsiednich ORF zawierają sekwencję wybraną z grupy obejmującej sekwencje nukleotydów:
- nr 1-526 oraz 609-1190 z SeqID Nr 32;
- nr 101-298 oraz 884-1198 z SeqID Nr 33;
- nr 1-338 oraz 853-1200 z SeqID Nr 34;
- nr 1-375 oraz 648-1200 z SeqID Nr 35;
- nr 1-596 oraz 856-1200 z SeqID Nr 36;
- nr 1-399 oraz 608-1081 z SeqID Nr 37.
46. Zastosowanie według zastrz. 41 do 46, znamienne tym, że wirusem MVA jest wirus MVA zdeponowany w ECACC pod numerem V00083008.
PL372093A 2002-05-16 2003-05-14 Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania PL216760B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200200753 2002-05-16
DKPA200200752 2002-05-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL372093A1 PL372093A1 (pl) 2005-07-11
PL216760B1 true PL216760B1 (pl) 2014-05-30

Family

ID=29551228

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372088A PL218318B1 (pl) 2002-05-16 2003-05-14 Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych
PL372093A PL216760B1 (pl) 2002-05-16 2003-05-14 Rekombinowany modyfikowany wirus krowianki Ankara oraz sposób jego otrzymywania i zastosowania

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL372088A PL218318B1 (pl) 2002-05-16 2003-05-14 Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych

Country Status (23)

Country Link
US (14) US7550147B2 (pl)
EP (3) EP2253709B1 (pl)
JP (4) JP4693092B2 (pl)
KR (4) KR101138067B1 (pl)
CN (6) CN1653183B (pl)
AT (1) ATE315660T1 (pl)
AU (4) AU2003242540A1 (pl)
BR (2) BRPI0311178B8 (pl)
CA (3) CA2481521C (pl)
DE (1) DE60303218T2 (pl)
DK (2) DK1407033T3 (pl)
EA (3) EA007811B1 (pl)
ES (1) ES2256776T3 (pl)
HK (2) HK1076642A1 (pl)
IL (4) IL164177A0 (pl)
MX (2) MXPA04011194A (pl)
NO (3) NO334273B1 (pl)
NZ (2) NZ536501A (pl)
PL (2) PL218318B1 (pl)
PT (1) PT1407033E (pl)
SI (1) SI1407033T1 (pl)
UA (1) UA82479C2 (pl)
WO (2) WO2003097846A1 (pl)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4101327C1 (pl) * 1991-01-18 1991-10-24 Mercedes-Benz Aktiengesellschaft, 7000 Stuttgart, De
NZ524661A (en) * 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
EP1839672A3 (en) * 2002-04-19 2007-11-21 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus Ankara for the vaccination of neonates
EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
KR101044538B1 (ko) * 2002-09-05 2011-06-27 버베리안 노딕 에이/에스 무혈청 조건하에서 일차세포의 배양 및 바이러스의 증식방법
JP5052893B2 (ja) * 2003-02-20 2012-10-17 アメリカ合衆国 ポックスベクターにおける新規の挿入部位
GB2402391A (en) * 2003-06-04 2004-12-08 Oxxon Pharmaccines Ltd Fowlpox recombinant genome
US7951576B2 (en) * 2004-11-05 2011-05-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods for preparing cells and viruses
BRPI0608310A2 (pt) 2005-02-23 2009-12-08 Bavarian Nordic As uso de um poxvìrus modificado para a indução rápida de imunidade contra um poxvìrus ou outros agentes infecciosos
EP2027271A4 (en) * 2006-05-19 2010-06-09 Glycofi Inc RECOMBINANT VECTORS
WO2008142479A2 (en) * 2006-08-25 2008-11-27 The Government Of The United States Of Amercia, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Intergenic sites between conserved genes in the genome of modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus
EP2426142A3 (en) 2006-10-16 2012-06-13 Genelux Corporation Modified vaccinia virus strains for use in a diagnostic and therapeutic method
EP2086526B1 (en) * 2006-11-09 2014-07-23 The United States Of America As Represented By The Secretary of the Navy Induction of an immune response against Dengue virus using prime-boost approach
US8440202B2 (en) * 2006-11-09 2013-05-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Induction of an immune response against dengue virus using the prime-boost approach
EP2390340A3 (en) * 2007-01-30 2012-02-22 Transgene SA vector encoding Papillomavirus E1 and E2 polypeptides with reduced percentage of identity
US8268327B2 (en) 2007-04-27 2012-09-18 Bavarian Nordic A/S Immediate protection against pathogens via MVA
MX2009012272A (es) * 2007-05-15 2009-12-01 Transgene Sa Vectores para la expresion de genes multiples.
WO2008150404A1 (en) * 2007-05-30 2008-12-11 Wyeth Raccoon poxvirus expressing genes of feline antigens
TW200907058A (en) * 2007-05-30 2009-02-16 Wyeth Corp Raccoon poxvirus expressing rabies glycoproteins
EP2207564B1 (en) 2007-10-18 2016-10-05 Bavarian Nordic A/S Use of mva to treat prostate cancer
US20110052627A1 (en) * 2008-06-20 2011-03-03 Paul Chaplin Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
KR100894430B1 (ko) * 2008-11-11 2009-04-22 시스템디엔디(주) 초음파, 음향 및 온도변화를 이용한 밸브의 유체누설 측정장치 및 이를 이용한 유체누설 측정방법
JP2012509073A (ja) * 2008-11-21 2012-04-19 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ 複数の相同ヌクレオチド配列を含むベクター
EA201270108A1 (ru) 2009-10-08 2012-08-30 Бавариан Нордик А/С Формирование полиспецифического t-клеточного ответа против вич у человека
EP2488649B1 (en) 2009-10-16 2019-04-03 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Recombinant modified vaccinia ankara (mva) vaccinia virus containing restructured insertion sites
US20110159031A1 (en) * 2009-12-22 2011-06-30 Baxter International Inc. Vaccine to Influenza A Virus
EP2552490A4 (en) * 2010-03-26 2013-12-18 Emergent Product Dev Gaithersburg Inc INFLUENZA MATRIX 2 PROTEIN ECKTOMOMAS, EXPRESSION SYSTEM THEREFOR AND USES THEREOF
US10087423B2 (en) 2010-07-20 2018-10-02 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
CN103200962A (zh) * 2010-09-23 2013-07-10 巴克斯特国际公司 重组病毒载体及用于诱导对黄热病毒的免疫反应的方法
US9173933B2 (en) 2010-10-15 2015-11-03 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus Ankara influenza vaccine
JP6415977B2 (ja) 2011-04-15 2018-10-31 ジェネラックス・コーポレイションＧｅｎｅｌｕｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 弱毒化ワクシニアウイルスのクローン株およびその使用方法
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
AU2013271338B2 (en) 2012-06-05 2018-05-24 The Australian National University Vaccination with interleukin-4 antagonists
EA201891945A3 (ru) 2012-08-01 2019-05-31 Бавариан Нордик А/С Вакцина рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva) респираторно-синцитиального вируса (rsv)
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
US20140140959A1 (en) 2012-10-05 2014-05-22 Aladar A. Szalay Energy Absorbing-Based Diagnostic and Therapeutic Methods Employing Nucleic Acid Molecules Encoding Chromophore-Producing Enzymes
US20150283220A1 (en) 2012-10-19 2015-10-08 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
MY193724A (en) * 2013-03-15 2022-10-27 Sementis Ltd Immune modulation
WO2014139587A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Okairòs Ag Improved poxviral vaccines
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
US10238700B2 (en) 2014-01-02 2019-03-26 Genelux Corporation Oncolytic virus adjunct therapy with agents that increase virus infectivity
KR101645642B1 (ko) 2014-10-16 2016-08-11 대한민국 Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스
KR101623498B1 (ko) 2014-10-16 2016-05-24 대한민국 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３
CA2977660A1 (en) 2015-02-25 2016-09-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Use of inactivated nonreplicating modified vaccinia virus ankara (mva) as monoimmunotherapy or in combination with immune checkpoint blocking agents for solid tumors
CA2982896A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Use of modified vaccinia ankara virus (mva) or mva with a deletion of virulence factor e8 as immunotherapeutic agent against solid tumors
KR20160140075A (ko) * 2015-05-29 2016-12-07 코오롱생명과학 주식회사 폭스바이러스 유래 프로모터 및 이를 포함하는 벡터
CN107709554A (zh) * 2015-06-15 2018-02-16 巴法里安诺迪克有限公司 重组经修饰痘苗病毒安卡拉(mva)口蹄疫病毒(fmdv)疫苗
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用
EP3402802B1 (en) 2016-01-08 2023-04-12 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to a tumor associated antigen
PL3407910T3 (pl) 2016-01-29 2022-08-16 Bavarian Nordic A/S Rekombinowana zmodyfikowana szczepionka przeciwko wirusowi krowianki ankara (mva) przeciwko wirusowi zapalenia mózgu koni
BR112018015696A2 (pt) * 2016-02-03 2018-12-26 Geovax Inc composições e métodos para gerar uma resposta imune para um flavivírus
MX2018010231A (es) 2016-02-25 2019-06-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Mva recombinante o mvadele3l que expresa el flt3l humano y uso de los mismos como agentes inmunoterapéuticos contra tumores sólidos.
MX2018010204A (es) 2016-02-25 2019-05-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Virus de la vaccinia atenuada competentes para replicacion con la supresion de timidina quinasa con y sin la expresion del flt3l o gm-csf humanos para inmunoterapia del cancer.
EP3452087A1 (en) 2016-05-02 2019-03-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
MX2019001919A (es) * 2016-08-19 2019-09-04 Sementis Ltd Vacunas virales.
EP3518656A4 (en) * 2016-09-30 2020-09-30 Monsanto Technology LLC METHOD OF SELECTING TARGETS FOR SITE-SPECIFIC GENOME MODIFICATION IN PLANTS
CN111107872A (zh) 2017-05-12 2020-05-05 纪念斯隆-凯特林癌症中心 有用于癌症免疫疗法的牛痘病毒突变体
MA49397A (fr) * 2017-06-15 2020-04-22 Bavarian Nordic As Vecteurs à poxvirus codant pour des antigènes du vih, et leurs procédés d'utilisation
US11311612B2 (en) 2017-09-19 2022-04-26 Geovax, Inc. Compositions and methods for generating an immune response to treat or prevent malaria
WO2019216929A1 (en) * 2018-05-11 2019-11-14 City Of Hope Mva vectors for expressing multiple cytomegalovirus (cmv) antigens and use thereof
CN111979204B (zh) * 2019-05-24 2023-10-13 杭州功楚生物科技有限公司 携带海绵凝集素基因的溶瘤痘苗病毒、构建方法及用途
CA3161633A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
TW202203966A (zh) * 2020-03-31 2022-02-01 澳大利亞商賽門蒂斯公司 用於防範ｃｏｖｉｄ－１９之以減毒的痘病毒載體為底質之疫苗
WO2024011250A1 (en) 2022-07-08 2024-01-11 Viromissile, Inc. Oncolytic vaccinia viruses and recombinant viruses and methods of use thereof

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338683A (en) * 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
JPH0795956B2 (ja) * 1986-09-22 1995-10-18 京都大学長 ポックスウイルス由来発現制御領域
US5093258A (en) * 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
US5225336A (en) * 1989-03-08 1993-07-06 Health Research Incorporated Recombinant poxvirus host range selection system
US5651972A (en) 1989-04-21 1997-07-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector
MY109299A (en) * 1990-08-15 1996-12-31 Virogenetics Corp Recombinant pox virus encoding flaviviral structural proteins
US5514375A (en) 1990-08-15 1996-05-07 Virogenetics Corporation Flavivirus recombinant poxvirus vaccine
US6893845B1 (en) * 1990-09-28 2005-05-17 Applied Molecular Evolution, Inc. Surface expression libraries of heteromeric receptors
EP0575491B1 (en) * 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
BE1004877A3 (fr) * 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
FR2679249B1 (fr) * 1991-07-15 1993-11-26 Centre Nal Recherc Scientifique Souches de levure avec integration stable de genes heterologues.
EP0597016A4 (en) 1991-07-26 1996-04-24 Virogenetics Corp Infectious bursal disease virus recombinant poxvirus vaccine.
EP0538496B1 (en) * 1991-08-26 2003-10-29 Baxter Healthcare S.A. Recombinant fowlpox virus with intact FPV-tk-gene
EP0561034B1 (en) * 1991-08-26 1999-06-09 IMMUNO Aktiengesellschaft Direct molecular cloning of a modified chordopox virus genome
US5676950A (en) 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
UA68327C2 (en) * 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
EP0753581A1 (en) * 1995-07-10 1997-01-15 Immuno Ag Improved recombinant eukaryotic cytoplasmic viruses, method for their production and their use as vaccines
DE19629828A1 (de) * 1996-07-24 1998-01-29 Bayer Ag Carbanilide
AU4556597A (en) * 1996-09-24 1998-04-17 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
AUPP380598A0 (en) * 1998-05-29 1998-06-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Genetically manipulated entomopoxvirus
US6252871B1 (en) 1998-07-01 2001-06-26 Powerwave Technologies, Inc. Switchable combiner/splitter
US20040265324A1 (en) * 1999-03-23 2004-12-30 Cardosa Mary Jane Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
US6682742B1 (en) * 1999-05-28 2004-01-27 Gsf Forschungszentrum Fur Unwelt Und Gesundheit Gmbh Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes
WO2001068820A1 (en) * 2000-03-14 2001-09-20 Anton Mayr Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva)
CA2341356C (en) 2000-04-14 2011-10-11 Transgene S.A. Poxvirus with targeted infection specificity
US7034141B2 (en) 2000-08-29 2006-04-25 Wyeth Holdings Corporation Packaging of positive-strand RNA virus replicon particles
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
EA007811B1 (ru) 2002-05-16 2007-02-27 Бавариан Нордик А/С Межгенные области, используемые в качестве инсерционных сайтов в геноме модифицированного вируса коровьей оспы анкара (mva)
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
PT1567653E (pt) * 2002-11-25 2007-10-01 Bavarian Nordic As Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati

Also Published As

Publication number Publication date
EP2253709B1 (en) 2018-04-11
EA020230B1 (ru) 2014-09-30
HK1076642A1 (en) 2006-01-20
KR101138067B1 (ko) 2012-04-24
BR0310051A (pt) 2005-02-15
ATE315660T1 (de) 2006-02-15
CA2481799C (en) 2014-01-28
JP2005525823A (ja) 2005-09-02
AU2003242540A1 (en) 2003-12-02
JP4895505B2 (ja) 2012-03-14
PL372088A1 (pl) 2005-07-11
PL372093A1 (pl) 2005-07-11
CN102199628A (zh) 2011-09-28
KR101005630B1 (ko) 2011-01-05
PT1407033E (pt) 2006-05-31
KR20040108798A (ko) 2004-12-24
US7550147B2 (en) 2009-06-23
US20110053260A1 (en) 2011-03-03
EA007811B1 (ru) 2007-02-27
AU2008255213A1 (en) 2009-01-08
HK1076836A1 (en) 2006-01-27
EP2253709A1 (en) 2010-11-24
CN100494388C (zh) 2009-06-03
US20090311746A1 (en) 2009-12-17
CN1653183A (zh) 2005-08-10
EA200401507A1 (ru) 2005-06-30
ES2256776T3 (es) 2006-07-16
EA012160B1 (ru) 2009-08-28
IL193087A (en) 2012-10-31
EP1506301A1 (en) 2005-02-16
CN1653183B (zh) 2012-07-25
IL193087A0 (en) 2009-02-11
US20120178157A1 (en) 2012-07-12
KR101041691B1 (ko) 2011-06-14
AU2009200380A1 (en) 2009-02-19
US20120039936A1 (en) 2012-02-16
DK1506301T3 (da) 2014-07-21
CA2481521A1 (en) 2003-11-27
US9109233B2 (en) 2015-08-18
CN1653184A (zh) 2005-08-10
US20110244574A1 (en) 2011-10-06
NO334273B1 (no) 2014-01-27
IL164177A0 (en) 2005-12-18
IL193088A (en) 2015-02-26
KR20040108809A (ko) 2004-12-24
UA82479C2 (uk) 2008-04-25
MXPA04010713A (es) 2005-03-07
AU2009200380B2 (en) 2009-10-01
NO20044940L (no) 2004-11-12
CA2481521C (en) 2012-04-17
NO20111324A1 (no) 2011-09-29
JP5777199B2 (ja) 2015-09-09
US8741308B2 (en) 2014-06-03
NO336489B1 (no) 2015-09-07
NZ536502A (en) 2005-10-28
US8288125B2 (en) 2012-10-16
US20130243813A1 (en) 2013-09-19
US20100173388A1 (en) 2010-07-08
US20120135501A1 (en) 2012-05-31
US8309326B2 (en) 2012-11-13
US20100303856A1 (en) 2010-12-02
US20060165727A1 (en) 2006-07-27
EP1407033A1 (en) 2004-04-14
JP2010259446A (ja) 2010-11-18
JP2011004755A (ja) 2011-01-13
BRPI0311178B1 (pt) 2020-11-17
JP4693092B2 (ja) 2011-06-01
AU2003236646B2 (en) 2009-01-15
US20050244428A1 (en) 2005-11-03
WO2003097845A1 (en) 2003-11-27
CA2812019A1 (en) 2003-11-27
US7964374B2 (en) 2011-06-21
EA200900180A1 (ru) 2009-08-28
EA200401506A1 (ru) 2005-04-28
KR20120002627A (ko) 2012-01-06
MXPA04011194A (es) 2005-02-14
AU2003236646A1 (en) 2003-12-02
DK1407033T3 (da) 2006-05-22
US7338662B2 (en) 2008-03-04
US20110053259A1 (en) 2011-03-03
JP2005525822A (ja) 2005-09-02
PL218318B1 (pl) 2014-11-28
CN102703393A (zh) 2012-10-03
US20110250693A1 (en) 2011-10-13
US8414900B2 (en) 2013-04-09
US8034354B2 (en) 2011-10-11
DE60303218T2 (de) 2006-09-14
DE60303218D1 (de) 2006-04-06
US8435543B2 (en) 2013-05-07
EP1506301B1 (en) 2014-04-30
AU2009200380C1 (en) 2010-03-11
SI1407033T1 (sl) 2006-06-30
IL193088A0 (en) 2009-02-11
CN101831411A (zh) 2010-09-15
BR0311178A (pt) 2005-03-29
IL164172A0 (en) 2005-12-18
NO20045480L (no) 2004-12-16
WO2003097846A1 (en) 2003-11-27
US20120082696A1 (en) 2012-04-05
EP1407033B1 (en) 2006-01-11
CA2481799A1 (en) 2003-11-27
CN102719408A (zh) 2012-10-10
BRPI0311178B8 (pt) 2021-05-25
NZ536501A (en) 2006-08-31
AU2008255213B2 (en) 2011-10-06
KR20100110901A (ko) 2010-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8741308B2 (en) Intergenic regions as insertion sites in the genome of modified vaccinia virus ankara (MVA)
US8309098B2 (en) Recombinant modified vaccinia ankara (MVA) virus containing heterologous DNA inserts encoding human immunodeficiency virus (HIV) antigens inserted into one or more intergenic regions (IGRs)
US20110014242A1 (en) Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara
AU2007200016B2 (en) Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of modified vaccinia virus ankara