PT1567653E - Poxvírus recombinante que compreende pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ati - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "POXVÍRUS RECOMBINANTE QUE COMPREENDE PELO MENOS DOIS PROMOTORES DO VÍRUS DA VARÍOLA BOVINA ATI" A invenção refere-se a poxvírus recombinantes que compreendem no genoma virai pelo menos duas cassetes de expressão, cada uma compreendendo o promotor do virus da varíola bovina ATI ou um seu derivado e uma sequência codificante, em que a expressão da sequência codificante é regulada pelo referido promotor ou seu derivado. 0 vírus pode ser útil como uma vacina ou como parte de uma composição farmacêutica.

Antecedentes da invenção

Os poxvírus recombinantes são vastamente utilizados para expressar antigénios estranhos em células infectadas. Para além disso, os poxvírus recombinantes são testados de modo corrente como vacinas muito prometedoras para a indução de resposta imunitária contra antigénios estranhos expressos a partir do vector de poxvírus. Os mais populares são por um lado os avipoxvírus e por outro lado os vírus de vaccinia. Os documentos US 5,736,368 e US 6,051,410 descrevem a estirpe do vírus vaccinia da Wyeth recombinante que expressam antigénios HIV e proteínas. O documento US 5,747,324 descreve uma estirpe do vírus vaccinia recombinante NYCBH que expressa genes de lentivírus. O documento de patente EP 0 243 029 descreve uma estirpe do vírus vaccinia recombinante Western Reserve que expressa genes de retrovírus humano. O vírus da varíola de galinha contém genes HIV no genoma virai que são descritos nos documentos US 5,736,368 e US 6,051,410. 2

De modo a induzir uma resposta imunitária eficaz é desejável que se expresse não apenas uma única proteína de um agente contra o qual deve ser induzida uma resposta imunitária. Em vez disso, é preferível que se expresse o maior número de proteínas e epítopos do referido agente possível para obter uma imunidade vasta e eficaz contra o referido agente. Assim, pode ser vantajoso inserir várias cassetes de expressão diferentes no mesmo genoma poxviral se se pretender utilizar um poxvírus como um vector para vacinação. 0 Documento US 5,736,368 descreve a construcção de um poxvírus recombinante que apresenta as cassetes de expressão para o gene env de HIV-1 e o gene gag pol de HIV-1. Para a expressão das proteínas codificadas pelas diferentes cassetes de expressão de diferentes promotores foram utilizados, nomeadamente o promotor Dl do vírus vaccinia e o promotor 40K. A desvantagem desta estratégia é que as actividades dos diferentes promotores não são idênticas resultando num nível diferente das proteínas expressas a partir das diferentes cassetes de expressão.

Poderia ser obtido um nível de expressão quase idêntico se os promotores nas diferentes cassetes de expressão no genoma de poxvírus fossem idênticos. Contudo, a desvantagem desta estratégia é que existe um risco que os eventos de recombinação não desejada possam ocorrer entre as sequências de promotor homólogas/idênticas. De facto, foi demonstrado por Howley et al. (Gene (1996) 172, 233-237) que pode ser produzido um vírus vaccinia recombinante que compreenda três promotores p7,5 em diferentes localizações no genoma virai; contudo, a recombinação ocorreu entre as sequências de promotor homólogas resultando numa população genómica misturada de poxvírus recombinantes. Tal população genómica misturada e não definida que reflecte a 3 instabilidade do genoma virai não é aceitável se se pretender utilizar um poxvirus recombinante para vacinação, de um modo particular para a vacinação de humanos. Hánggi et al. (EMBO J. (1986) 5:1071-1076) caracterizaram o promotor tardio de 11-kd do vírus de vaccinia através de delecções 5' e 3' e mutagénese direccionada e encontraram um motivo TAAAT.

Objectivo da invenção O objectivo desta invenção foi fornecer poxvirus recombinantes estáveis contendo pelo menos duas cassetes de expressão, de um modo preferido para genes que não fazem naturalmente parte do genoma poxviral, emq ue deve ser possível produzir as proteínas codificadas pelas referidas pelo menos duas cassetes de expressão em quantidades semelhantes.

Descrição detalhada da invenção

Este objectivo foi resolvido pela provisão de poxvirus recombinantes que compreendem no genoma virai pelo menos duas cassetes de expressão, cada uma compreendendo o promotor do vírus da varíola bovina ATI ou um seu drivado e uma sequência codificante, em que a expressão da sequência codificante seja regulada pelo referido promotor ou seu derivado.

Foi demonstrado pelos presentes inventores que os poxvirus que compreendem duas ou mais cópias do promotor API são inesperadamente estáveis; foi demonstrado que não ocorreram eventos de recombinação detectáveis entre as sequências de 4 promotores ATI homólogas ou até mesmo idênticas. Isto está em contraste com os vírus da vaccinia que compreendem dois ou mais promotores p7,5 no genoma virai.

De acordo com a presente invenção o poxvírus pode ser qualquer poxvírus no qual a expressão de genes pode ser regulada pelo promotor ATI ou um seu derivado. Assim, o poxvírus pode ser qualquer vírus da subfamília de Chordopoxvirinae e Entomopoxvirinae (ver Fields Virology 3a edição, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, USA, Capítulo:83, ISBN 0-7817-0253.4). Os vírus da subfamília Chordopoxvirinae são de um modo particularmente preferidos se forem utilizados os vírus poxvírus recombinantes para expressar genes em animais mamíferos, incluindo humanos. Géneros de um modo particularmente preferido que pertencem à subfamília Chordopoxvirinae são os Orthopoxvírus, Parapoxvírus, Avipoxvírus, Capripoxvírus, Leporipoxvírus e Suipoxvírus. Os mais preferidos são os Orthopoxvírus e Avipoxvírus. Exemplos para os avipoxvírus são os vírus de varíola de canário e os vírus da varíola de galinha. Um exemplo de um Orthopoxvírus é virus vaccinia. A estirpe do vírus vaccinia que pode ser utilizada de acordo com a presente invenção pode ser, qualquer estirpe de vírus vaccinia, tal como a estirpe Copenhagen, Temple of Heaven, Wyeth, Western Reserve, Elstree, NYCBH entre outros. A Modified Vaccinia Ankara (MVA) é particularmente preferida. A MVA foi originada por 516 passagens em série em fibroblastos de embrião de galinha da estirpe Ankara do vírus da vaccinia (CVA) (para revisão ver Mayr, A., et al Infection 3, 6-14 [1975]). Como uma consequência destas passagens a longo termo o vírus MVA resultante deletou cerca de 31 kilobases da sua sequência genómica e, desse modo, foi descrito como uma célula altamente hospedeira 5 restringida às células de aves (Meyer, H. et al., J. Gen. Virol. 72, 1031-1038 [1991]). Foi demonstrado, numa variedade de modelos animais que a MVA resultante era de um modo significativo avirulenta (Mayr, A. & Danner, K. [1978] Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). De um modo adicional, esta estirpe de MVA foi testada em ensaios clínicos como uma vacina para imunizar contra a doença de varíola humana (Mayr et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]).

De acordo com a presente invenção qualquer estirpe de MVA pode ser utilizada. Exemplos para estirpes de vírus MVA utilizados de acordo com a presente invenção e depositados em cumprimento com os requisitos do Tratado de Budapeste são estirpes MVA 572 e MVA 575 depositadas na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Salisbury (UK) com os números de depósito ECACC V94012707 e ECACC V00120707, respectivamente e MVA BN com o número de depósito ECACC V00083008. A estirpe MVA mais preferida é a MVA-BN ou um seu derivado. As características de MVA-BN, a descrição de ensaios biológicos que permitem avaliar se uma estirpe MVA é MVA-BN ou um seu derivado e métodos para obter MVA-BN ou um seu derivado são descritos na WO 02/42480. O conteúdo desta aplicação é incluído na presente aplicação por referência.

Em termos gerais é preferido utilizar vírus que não sejam prejudiciais para o animal incluindo um humano, se o vírus for utilizado para vacinar ou para tratar o animal incluindo um humano. Para os humanos em particular, os poxvírus seguros são as diferentes estirpes de vírus 6 vaccinia, tais como MVA e avipoxvírus tais como vírus da varíola de galinha e canripoxvírus.

De modo a propagar poxvírus, são infectadas células eucarióticas com o vírus. As células eucariótica são células que são susceptíveis à infecção pelo respectivo poxvírus e permitem a replicação e produção de vírus infecciosos. Tais células são conhecidas pelos especialistas na técnica para todas as espécies de poxvírus. Para o MVA um exemplo para este tipo de células é fibroblastos de embrião de galinha (CEF) e células BHK (Drexler I., Heller K., Wahren B., Erfle V. e Sutter G., J. Gen. Virol. (1998), 79, 347-352). As células CEF podem ser cultivadas sob condições conhecidas pelos especialistas na técnica. De um modo preferido as células CEF são cultivadas em meio livre de soro em recipientes estacionários ou garrafas de fundo redondo. A incubação ocorre de um modo preferido 48 a 96 horas a 37° C ± 2o C. Para a infecção é utilizada MVA de um modo preferido numa multiplicidade de infecções (MOI) de 0,05 a 1 TCID50 e a incubação ocorre de um modo preferido 48 a 72 horas a 37° C ± 2o C. A sequência do promotor do gene que codifica a proteína de inclusão do tipo A do vírus do vírus da varíola bovina (promotor ATI) é conhecida pelos especialistas na técnica, Neste contexto é feita referência ao número de acesso D00319 da base de dados Genebank. Uma sequência preferida do promotor ATI é apresentada como SEQ ID.: N°1 e é a seguinte: 5' GTTTT GAATA AAATT TTTTT ATAAT AAAT 3' 7

De acordo com a presente invenção é possível utilizar o promotor ATI como especificado na SEQ. ID.: N° 1 ou utilizar um derivado do promotor ATI, o qual pode ser uma subsequência da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1. 0 termo "subsequência da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° refere-se a fragmentos mais curtos da sequência da SEQ. ID.: N° 1 que permanecem activos como um promotor, de um modo particular como um promotor tardio do vírus vaccinia. Um fragmento típico da sequência da SEQ. ID.: tem um comprimento de pelo menos 10 nucleótidos, de um modo mais preferido de pelo menos 15 nucleótidos, de um modo ainda mais preferido pelo menos 20 nucleótidos, de um modo muito mais preferido de pelo menos 25 nucleótidos da sequência de SEQ.: ID N° 1. a subsequência compreende pelo menos nucleótidos 22 ao 29 de SEQ. ID.: N°l, i.e. a sequência 5'-TAATAAAT-3 localizada na extremidade 3'da SEQ. ID.: N° 1. O promotor pode ser inserido a montante de uma squência codificante de tal forma que os nucleótidos 28 a 29 da SEQ. ID. : N° 1 (sublinhados na sequência acima) são parte do codão de iniciação da tradução 5'ATG 3'. De um modo alternativo, o promotor pode ser separado por vários nucleótidos a partir do codão de iniciação da tradução. O espaçamento entre a extremidade 3' do promotor de acordo com a SEQ. ID.: N°1 e a A do codão de iniciação 5'ATG 3' é de um modo preferido menos de 100 nucleótidos, de um modo mais preferido menos de 50 nucleótido e de um modo ainda mais preferido menos de 25 nucleótidos. Contudo, o espaçamento pode até ser maior desde que o promotor permaneça capaz de controlar a expressão da sequência codificante localizada a jusante do promotor. 8 0 derivado do promotor ATI pode também ser uma sequência que não tem mais de 6 substituições, delecções e/ou inserções de nucleótidos no que respeita à sequência de SEQ. ID.: N° 1 ou suas subsequências, em que os referidos derivados permanecem activos como promotores, de um modo particular como o promotor tardio do virus vaccinia. Uma sequência com não mais de 6 substituições de nucleótidos é uma sequência na qual não mais de 6 nucleótidos da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1 estão substituídos por diferentes nucleótidos. Uma sequência com não mais de 6 inserções de nucleótidos é uma sequência na qual não mais de 6 nucleótidos estão inseridos numa ou mais posições da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1. Uma sequência com não mais de 6 delecções de nucleótidos é uma sequência na qual um ou mais nucleótidos da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1 estão deletados numa ou mais posições. Nos derivados da SEQ. ID.: N° 1 as delecções, substituições e inserções podem ser combinadas numa sequência. De um modo preferido o derivado tem uma homologia de pelo menos 80 %, de modo mais preferido 90 % quando comparado com a sequência de SEQ. ID.: N°l. De acordo com a invenção reivindicada, no derivado não mais de 6 nucleótidos, de um modo ainda mais preferido não mais de 3 nucleótidos são substituídos, deletados e/ou inseridos na sequência de SEQ. ID.: N° 1.

De um modo particular, os nucleótidos 25 a 29 da SEQ. ID.: N° 1, i.e. a sequência 5'-TAAAT-3 são mantidos no promotor para tentar obter a actividade máxima do promotor. De acordo com a invenção reivindicada os nucleótidos 22 a 29 da SEQ. ID.: N° 1, i.e. a sequência 5' -TAATAAAT-3 são mantidos no promotor. 9

Os comentários acima respeitantes à localização do promotor ATI ou suas subsequências também se aplicam às sequências acima definidas contendo uma ou mais substituições, delecções e/ou inserções nucleotídicas no que respeita à sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1 ou no que respeita a suas subsequências.

Uma boa parte dos documentos da técnica primária permite o especialista na técnica previr quais derivados da SEQ. ID.: N° 1 ainda têm a actividade biológica de ser activos como um promotor do vírus poxvírus, de um modo particular como um promotor tardio do vírus vaccinia. Neste contexto é feita referência a Chakrarbati et al., Biotechniques (1997) 23, 1094-1097 e Davidson e Moss, J. Mol. Biol. (1989) 210, 771-784. Adicionalmente, pode ser facilmente confirmado se um fragmento continua activo como um promotor de poxvírus de um modo particular um promotor tardio do vírus vaccinia por um especialista na técnica. De um modo particular o derivado da sequência pode ser clonado a montante de um gene repórter num construto de plasmídeo. O referido construto pode ser transfectado numa célula eucariótica ou linha celular, tal como células CEF ou BHK que tenham sido infectadas com um poxvírus. O poxvírus utilizado para a infecção é de um modo preferido um poxvírus do mesmo género e de um modo ainda mais preferido o mesmo poxvírus que o poxvírus no genoma do qual o promotor deve ser inserido. A expressão do gene repórter é então determinada e comparada com a expresão do gene repórter controlado pelo promotor de acordo com a SEQ. ID.: N° 1. Um derivado de acordo com a presente invenção é de um modo preferido um derivado tendo uma actividade de promotor no referido sistema teste de pelo menos 10%, de modo preferido pelo menos 30%, de modo mais preferido pelo menos 50%, de um modo ainda mais 10 preferido pelo menos 70%, de um modo muito mais preferido a 90% comparada com a actividade da sequência do promotor da SEQ. ID.: N° 1. Também aqueles derivados da SEQ. ID.: N° 1 que têm uma actividade promotora maior que a SEQ. ID.: N° 1 se encontram no alcance da presente invenção presente invenção.

De acordo com a presente invenção o poxvírus recombinante compreende pelo menos duas cassetes de expressão, cada uma compreendendo um promotor ATI ou um seu derivado. Noutras palavras o genoma do poxvírus recombinante pode compreender dois ou mais promotores ATI ou seus derivados. Os promotores ATI no genoma virai podem ser iguais ou diferentes. Assim, pode acontecer todos os promotores ATI terem a sequência de acordo com a SEQ. ID. : N° 1. Pode também acontecer que todos os promotores ATI sejam o mesmo derivado da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1. De um modo alternativo, um ou mais dos promotores ATI podem ter a sequência de SEQ. ID.: N° 1 e um ou mais dos promotores ATI no mesmo genoma poxviral podem ser derivados da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1. Se tal genoma poxviral compreender dois ou mais derivados do promotor ATI, estes derivados podem ser os mesmos ou diferentes. De acordo com um alternativa adicional todos os promotores ATI no genoma poxviral podem ser derivados diferentes da sequência de acordo com a SEQ. ID.: N° 1.

Em termos gerais a invenção refere-se a poxvírus recombinantes que compreendem pelo menos dois promotores ATI ou seus derivados no genoma poxviral. Assim, o genoma virai pode compreender e.g. dois, três, quatro, cinco, seis ou mais promotores ATI ou seus derivados no genoma virai. 11

Os promotores ATI ou seus derivados são de modo usual parte de cassetes de expressão, cada uma compreendendo um promotor do vírus da varíola bovina ATI ou seu derivado e uma sequência codificante, a expressão da qual é regulada pelos referidos promotores. As sequências codificantes podem ser quaisquer sequências, a expressão das quais poderia ser controlada pelo promotor ATI ou seu derivado.

De acordo com uma alternativa pelo menos um dos promotores ATI no genoma poxviral pode ser utilizado para expressar um gene que já é parte do genoma poxviral. Tal gene pode ser um gene que é de um modo natural parte do genoma virai ou um gene estranho que já foi inserido no genoma poxviral. Nestes casos o promotor ATI é inserido a montante do gene no genoma poxviral, a expressão do qual deve ser controlada pelo promotor ATI.

De um modo alternativo ou de um modo adicional pelo menos um dos promotores ATI ou seus derivados pode ser parte de uma cassete de expressão que é introduzida no genoma poxviral. As cassetes de expressão que compreendem um promotor ATI ou seu derivado e uma sequência codificante podem ser inseridos numa localização adequada no genoma virai. Sem estar ligado aos seguintes exemplos, os locais adequados de inserção podem ser seleccionados a partir de: (i) genes não-esseneciais tais como o gene-TK, (ii) genes que são necessários para a replicação do vírus se a função do referido gene for suplementada pela célula que é utilizada para a propagação do vírus; (iii) regiões intergénicas do genoma poxviral, em que o termo "região intergénica" refere-se de um modo preferido àquelas partes do genoma virai localizadas entre dois genes adjacentes que não compreendem sequências codificantes; (iv) locais de 12 ocorrência natural de delecção do genoma poxviral. Um exemplo de um genoma virai contendo um local de ocorrência natural de delecção é o genoma de MVA, no qual certas regiões estão deletadas no que respeita ao genoma da estirpe Copenhagen do virus vaccinia.

Como indicado acima, os locais de inserção não estão restringidos a estes locais de inserção preferidos uma vez que se encontra dentro do alcançe da presente invenção que a cassete de expressão pode ser inserida em qualquer local do genoma virai desde que seja possivel obter recombinantes que possam ser amplificados e propagados em pelo menos um sistema de cultura celular, tal como Chicken Ernbryo Fibroblasts (células CEF) no caso de MVA e outros poxvirus tais como os virus de vaccinia de um modo geral e avipoxvirus.

As diferentes cassetes de espressão/promotores ATI ou seus derivados podem ser inseridos em diferentes locais de inserção no genoma poxviral.

Por várias razões pode ser preferível inserir duas ou mais cassetes de expressão no mesmo local de inserção do genoma do poxvirus. Contudo, em tais casos tem que ser excluida a ocorrência de recombinação homóloga entre as diferentes cassetes de expressão. A recombinação homóloga levaria à formação de virus recombinantes nos quais partes das cassetes de expressão estão deletadas. Uma vez que não estão deletadas partes significantes do genoma do vector do poxvirus os recombinantes resultantes continuam viáveis. Assim, não existe selecção para virus que mantiveram duas ou mais cassetes de expressão no mesmo local de inserção. Para evitar tais eventos de recombinação indesejados foi 13 estado da técnica utilizar diferentes promotores se duas ou mais cassetes de expressão estão inseridas no mesmo local de inserção. De acordo com a presente invenção é agora possível inserir duas ou mais cassetes de expressão, cada uma compreendendo um promotor ATI ou um seu derivado no mesmo local de inserção uma vez que não ocorre recombinação homóloga entre os promotores das cassetes de expressão.

Assim, de acordo com uma forma de realização preferida pelo menos duas, se não todas as cassetes de expressão são inseridas no mesmo local de inserção do genoma poxviral. Neste caso as diferentes cassetes de expressão não estão directamente adjacentes a sequências poxvirais entre as diferentes cassetes de expressão ou pelo menos apenas com sequências poxvirais curtas entre as diferentes cassetes de expressão.

Os métodos necessários para construir poxvírus recombinantes são conhecidos pelos especialistas na técnica. Por exemplo, a cassete de expressão e/ou o promotor ATI ou seu derivado pode ser inserido no genoma poxviral por recombinação homóloga. Para este fim é transfectado um ácido núcleico numa linha celular permissiva, em que o ácido núcleico compreende a cassete de expressão e/ou o promotor ATI ou seu derivado flanqueado por porções poxvirais que são homólogos da região do genoma poxviral no qual a cassete de expressão e/ou o promotor ATI ou seu derivado deve ser inserido. Para MVA as células permissivas são células CEF e células BHK. As células estão infectadas com o poxvírus e nas células infectadas ocorre recombinação homóloga entre o ácido núcleico e o genoma virai. De um modo alternativo, é também possível infectar primeiro as células com o poxvírus e depois transfectar o 14 ácido nucleico em células infectadas. Mais uma vez ocorre recombinação nas células. 0 poxvirus recombinante é então seleccionado através de métodos conhecidos na técnica primária. A construção de poxvirus recombinantes não é restringida a este método particular. Em vez disso, qualquer método adequado conhecido pelo especialista na técnica pode ser utilizado para este fim. 0 promotor ATI nos poxvirus recombinantes pode ser utilizado para controlar a expressão de qualquer sequência (s) codificantes. A sequência codificante pode de um modo preferido codificar para pelo menos um epitopo antigénico ou antigénio. Neste caso o poxvirus recombinante pode ser utilizado para expressar o referido antigénio após a infecção de células no organismo, e.g. um animal mamífero incluindo um humano. A apresentação do referido antigénio/epítopo pode induzir uma resposta imunitária no organismo que pode levar à vacinação do organismo contra o agente a partir do qual o antigénio/epítopo é derivado. De um modo mais específico o epítopo/antigénio pode ser parte de uma sequência de aminoácidos maior tal como um poliepítopo, péptido ou proteína. Exemplos para tais poliepítopso, péptidos ou proteínas derivados a partir de (i) vírus, tais como HIV, HTLV, Herpesvírus, vírus de Dengue, Poliovírus, vírus do sarampo, vírus da papeira, vírus da rubéola, vírus da hepatite entre outros, (ii) bactérias, (iii) fungos.

As proteínas, péptidos ou epítopos expressos a partir das diferentes cassetes de expressão podem ser derivados do mesmo agente, tal como vírus, bactéria ou fungos. Por exemplo todos os produtos expressos a partir das cassetes de expressão podem ser proteínas HIV. Se todos os produtos 15 são derivados do mesmo agente é possível induzir uma resposta imunitária muito abrangente contra o referido agente. De um modo alternativo é também possível que as proteínas, péptidos ou epítopos expressos a partir das diferentes cassetes de expressão sejam derivados de agentes diferentes. Por exemplo, os produtos derivados das cassetes de expressão num genoma poxviral são derivados de diferentes vírus, tais como papeira, sarampo e vírus da rubéola. De acordo com esta forma de realização é possível utilizar um poxvírus recombinante para induzir uma resposta imunitária contra vários agentes.

De um modo alternativo, pelo menos uma das sequências codificantes pode codificar um composto terapêutico tal como interleucinas, interferões, ribozimas, enzimas entre outros. 0 poxvírus recombinante de acordo com a presente invenção pode ser administrado ao corpo do animal ou humano de acordo com o conhecimento do especialista na técnica. Assim, o poxvírus recombinante de acordo com a presente invenção pode ser útil como um medicamento (i.e. composição farmacêutica) ou vacina. A composição farmacêutica ou a vacina podem se um modo geral incluir um ou mais transportadores, aditivos, antibióticos, preservantes, adjuvantes, diluentes e/ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis e/ou aprovados em adição ao poxvírus recombinante. Tais substâncias auxiliares podem ser água, solução salina, glicerol, etanol, agentes humidificantes ou emulsificantes, substâncias tampão de pH ou semelhantes. Transportadores adequados são de um modo típico moléculas grandes, 16 lentamente metabolizadas tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, aminoácidos co-polímeros, agregados de lípidos ou semelhantes.

Para a preparação de composições farmacêuticas ou vacinas, o poxvírus recombinante é convertido numa forma fisiologicamente aceitável. Isto pode ser feito baseado na experiência na preparação de vacinas de poxvírus utilizadas na vacinação contra a varíola (como descrito por Stickl, H. et al [1974] Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392). Por exemplo, se o poxvírus é MVA o vírus purificado pode ser armazenado a -80° C com uma titulação de 5 x 108 TCID5o/ml formulada em 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7,4. Para a preparação de doses de vacina, e.g., 101-109 partículas do vírus recombinante de acordo com a presente invenção são liofilizados em solução salina tamponada de fosfato (PBS) na presença de peptona a 2% e albumina humana a 1% numa ampola, de um modo preferido uma ampola de vidro. De um modo alternativo, as doses de vacina podem ser produzidas passo-a-passo por criosecagem do vírus numa formulação. Esta formulação pode conter aditivos adicionais tais como manitol, dextrano, açúcar, glicina, lactose ou polivinilpirrolidina ou outros aditivos tais como antioxidantes ou gás inerte, estabilizadores ou proteínas recombinantes (e.g. soro de albumina humana) adequadas para uma administração in vivo. Uma formulação típica adequada para a criosecagem dos MVA recombinantes compreende de tampão Tris a 10 mM, NaCl 140 mM, Dextrano 18,9 g/1 (PM 36000 - 40000) , Sacarose 45 g/1, sal de monopotássio monhidratado de ácido L-glutâmico 0,108 g/1 pH 7,4. A ampola de vidro é então selada e pode ser armazenada entre 4o C e a temperatura ambiente durante vários meses. 17

Contudo, enquanto não existir necessidade a ampola é armazenada de um modo preferido a temperaturas abaixo dos -20° C.

Para vacinação ou terapia o liofilizado pode ser dissolvido em 0,1 a 0,5 ml de uma solução aquosa, de um modo preferido água, solução fisiológica ou tampão Tris, e administrada tanto a nivel sistémico ou local, i.e. por via de administração parenteral, intramuscular ou qualquer outra conhecida pelo praticante especialista. O modo de administração, a dose e o número de administrações pode ser optimizado pelos especialistas na técnica de uma maneira conhecida.

Assim, de acordo com uma forma de realização referida a invenção refere-se a um método para afectar, de um modo preferido induzindo uma resposta imunológica num corpo animal vivo incluindo um humano compreendendo a administração do virus, a composição ou a vacina de acordo com a presente invenção ao animal ou humano a ser tratado. Se o poxvirus recombinante for um MVA recombinante a dose de vacina compreende de um mod típico pelo menos 102, de um modo preferido pelo menos 104, de um modo mais preferido pelo menos 106, e de um modo ainda mais preferido 108 a 109 TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecidos) do vírus. A invenção refere-se adicionalmente a um método para a introdução de pelo menos duas sequências codificantes em células-alvo compreendendo a infecção das células-alvo com o vírus de acordo com a presente invenção. A célula-alvo pode ser um cálula na qual o vírus é capaz de se replicar ou uma cálula que possa ser infectada pelo vírus recombinante, na qual o vírus, contudo, não se replica, tal 18 como todos os tipos de células humanas no caso de MVA recombinante. A invenção refere-se adicionalmente a um método para a produção de um péptido, proteína e/ou vírus compreendendo a infecção de uma célula hospedeira com um vírus recombinante de acordo com a presente invenção, seguida da cultura da célula hospedeira infectada sob condições adequadas, e adicionalmente seguida pelo isolamento e/ou enriquecimento do péptido e/ou proteína e/ou vírus produzidos pela referida célula hospedeira. Se for pretendido produzir, i.e. amplificar o vírus de acordo com a presente invenção a célula tem que ser uma célula na qual o vírus é capaz de se replicar tais como as células CEF ou BHK no caso de MVA recombinante. Se for pretendido produzir um péptido/proteína codificado pelo vírus, de um modo preferido uma proteína/péptido codificado por uma sequência codificante, a expressão da qual é controlada pelo promotor ATI ou um seu derivado, a célula pode ser qualquer célula que possa ser infectada pelo vírus recombinante e que permita a expressão das proteínas/péptidos que codificam o poxvírus. A invenção refere-se adicionalmente a células infectadas com o vírus de acordo com a presente invenção.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 e figura 2: Apresentação esquemática dos vectores recombinantes pBN70 (figura 1) e pBN71 (figura 2) F1A137L = Flanco 1 da região de inserção; F2A137L = Flanco 2 da região de inserção; F2rpt = repetição do flanco 2; prATI = promotor ATI; pr7,5 = promotor p7,5; GUS = região 19 codificante GUS; NS1 = região codificante NS1; NPTII = resistência à neomicina; IRES = local de entrada ribossomal interna; EGFP = região amplificada codificante da proteína de fluorescência verde. AmpR = Gene de resistência à ampicilina.

Figura 3: Ensaio de RT-PCT para determinar a expressão do gene NSl em células infectadas com MVA-mBN30 (figura 3A) ou MVA-mBN31 (figura 3B) . Em todos os casos nos quais foi feita uma PCR o primer foi específico para o gene NSl. A) M: marcador de peso molecular; poço 1: ensaio com o plasmídeo pBN70 (controlo positivo); poço 2: ensaio sem a adição de ácidos núcleicos (controlo negativo); poço 3: PCR com ARN isolado a partir de MVA-mBN30 infectado com células BHK sem a adição de transcriptase reversa; poço 4: RT-PCR com ARN isolado a partir de MVA-mBN30 infectado com células BHK; poço 5: PCR com ARN isolado a partir de MVA-BN infectado com células BHK sem a adição de transcriptase reversa; poço 6: RT-PCR com ARN isolado a partir de MVA-BN infectado com células BHK. B) M: marcador de peso molecular; poço 1: RT-PCR com ARN a partir de células infectadas com mBN31; poço 2: RT-PCR com ARN a partir de células infectadas com um recombinante MVA diferente que compreende o gene NSl no genoma; poço 3: RT-PCR com ARN a partir de células infectadas com MVA-BN; poço 4: PCR com ARN a partir de células infectadas com mBN31 (sem adição de transcriptase reversa); poço 5: PCR com ARN a partir de células infectadas 20 com um recombinante de MVA diferente compreendendo o gene NS1 no genoma (sem adição de transcriptase reversa); poço 6: PCR com ARN a partir de células infectadas com MVA-BN (sem adição de transcriptase reversa); poço 7: ensaio com o plasmideo pBN71 (controlo positivo); poço 8: ensaio sem a adição de ácidos núcleicos (controlo negativo);

Exemplo O seguinte exemplo irá adicionalmente ilustrar a presente invenção. Será bem entendido pelo especialista na técnica que o exemplo fornecido não pode em qualquer circunstância ser interpretado de um modo que limite a aplicabilidade da tecnologia fornecida pela presente invenção a este exemplo.

Inserção Estável de dois genes estranhos regulados pelo promotor do virus da varíola bovina ATI num único local do genoma MVA O objectivo deste exemplo foi demonstrar que uma inserção de dois genes estranhos ambos regulados pelo promotor ATI é estável.

Sumário: O exemplo seguinte demonstra a estabilidade de MVA recombinante compreendendo duas cópias do promotor ATI no genoma virai. Para este fim o promotor de cowpox ATI foi fundido com o gene GUS (E. coli β-Glucuronidase) e com o gene não-estrutural (NS) 1 do vírus Dengue, respectivamente. Para comparação o gene GUS foi também fundido com o promotor de ocorrência natural pr7,5 do vírus 21 vaccinia. A cassete de expressão do gene do promotor-NSl ATI e tanto a cassete de expressão do gene do promotor-GUS ATI como a cassete de expressão do gene do promotor-GUS p7,5 foram inseridos num vector recombinante compreendendo sequências homólogas ao genoma de MVA. (Fig. 1 e 2) . Nos plasmideos resultantes pBN70 (cassete de expressão do gene do promotor-NSl ATI e cassete de expressão do gene do promotor-GUS ATI) e pBN71 (cassete de expressão do gene do promotor-NSl ATI e cassete de expressão do gene do promotor-GUS p7,5) as cassetes de expressão foram flanqueadas por sequências homólogas às sequências no genoma MVA no qual se deveria inserir a cassete de expressão. As sequências homólogas dirigem a inserção das cassetes de expressão na região intergénica (IGR) 136-137 do genoma MVA. As células CEF foram infectadas com MVA-BN e transfectadas com pBN70 e pBN71, respectivamente. Nas células ocorreu recombinação homóloga entre o genoma MVA e os plasmideos recombinantes resultando em genomas MVA recombinantes. Os recombinantes foram sujeitos a vários ciclos de purificação de placas e foram transferidos em células CEF (número total de passagens incluindo as purificações das placas: 20). Os recombinantes foram testados para a estabilidade, expressão de genes inseridos e sequência de construtos MVA recombinantes contendo duas combinações diferentes dos dois promotores. A análise da sequência, PCR e testes funcionais mostraram que os fragmentos recombinantes estavam inseridos correctamente e que as inserções - até quando o promotor ATI foi inserido duas vezes no genoma - são estáveis e funcionais. 22

Materiais e Equipamento: Células CEF primárias; MVA-BN com uma titulação de 108 TCID50/ml; kit de transfecção Effectene (Qiagen); meio de cultura célula VP-SFM (Gibco BRL); G418 (Gibco BRL); Kit ADN Nucleospin Blood Quick Pure (Macherey Nagel); ADN polimerase Triple Master (Eppendorf); Oligos (MWG); Kit de Sequenciação DCTS Quickstart kit (Beckman Coulter). Métodos:

Os vectores recombinantes pBN70 e pBN71 (Fig. 1 e 2) foram clonados de acordo com os protocolos padrão conhecidos pelos especialistas na técnica.

As células 5 x 105 CEF foram cultivadas por reacção de transfecção numa placa de 6 poços e mantidas em VP-SFM durante a noite a 37° C e 5% de CO2. As células foram infectadas com MVA-BN (moi 1,0) em 0,5 ml de VP-SFM por poço e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente num agitador. A transfecção de pBN70 e 71 linearizados foi levada a cabo como descrito no protocolo do produtor (Qiagen) .

Os vírus recombinantes resultantes foram transferidos várias vezes sob condições selectivas (G418, 300 pg/ml) e foram isoladas placas únicas, amplificadas e analisadas até serem originados clones purificados. O vírus analisado foi finalmente transferido 20 vezes.

Resultados: 1.

Construção de vírus recombinantes 23

Foram criados dois recombinantes MVA expressando sequências NS1 e GUS sob o controlo de duas combinações de promotores diferentes (ATI-NS1/ATI-GUS ou ATI-NSl/p7,5-GUS). Estas sequências juntamente com a cassete de seleção IRES/EGFP (local de entrada do ribossoma interno/proteina de fluorescência verde aumentada) foram inseridas no local 136-137 IGR (região intergénica entre a ORF A136L e A137L do genoma MVA) do genoma MVA de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Os vírus foram purificados e transferidos 20 vezes sob condições selectivas. Ambos os recombinantes MVA foram amplificados à escala do produto existente (garrafa 1 x 175 cm2) . A sequência do promotor ATI neste exemplo corresponde à sequência de SEQ ID.: N°l.

2. Expressão da região codificante EGFP

De forma a determinar a funcionalidade do gene teste inserido na IGR 136-137 foi observada a fluorescência durante a transferência. Se o gene inserido não estivesse funcional neste local, não deveria ser detectável nenhuma EGFP. As BHK infectadas com MVA-mBN30 e MVA-mBN31 apresentaram claramente que o gene inserido na IGR 136-137 foi transcrito. 3. Análise por PCR da IGR 136-137 de MVA-mBN30 e MVA-mBN31

Para excluir possíveis contaminações de vectores vazios na região IGR 136-137 e para verificar se o genoma virai compreende insertos do tamanho esperado foi efectuada uma análise por PCR. Para este fim foram utilizados oligonucleótidos iniciadores que se ligam às regiões que flanqueiam o local da inserção. As bandas de PCR esperadas 24 para os oligonucleótidos que se ligam ao flanco 1 e 2 são (i) 3,4 Kb para o recombinante MVA-mBN30, (ii) 3,5 Kb parao recombinante MVA-mBN31 e (iii) 212 pb para o vector vazio MVA-BN. Foram encontradas bandas do tamanho esperado para MVA-mBN30 e MVA-mBN31, indicando que os recombinantes tinham a estrutura genómica esperada. Não foi encontrado o vírus selvagem em qualquer uma das preparações de ADN MVA-mBN30 ou MVA-mBN31. De um modo adicional, o vector controlo vazio MVA-BN (vector vazio) resultou no produto esperado de 212 pb em ambos os MVA's recombinantes. Nos controlos negativos não foi detectado sinal. Assim, é obtida uma selecção eficaz e separação dos vectores recombinantes a partir do vector vazio MVA-BN por pressão de selecção. 4. Sequenciação da região 136-137

Os resultados de sequenciação mostraram que para os promotores de mBN31 e mBN30 e GUS foram inseridos sem alterações nos pares de bases no local IGR 136-137. Para o NS1 em mBN30 também não foram encontradas diferenças na sequência de pares de bases. Em mBN31 NS1 havia quatro mutações pontuais na sequência de pares de bases (posição 1315: C em vez de G, posição 1582: G em vez de A, posição 1961: A em vez de C e posição 1963: G em vez de T) . Duas delas (nas posições 1582 e 1963) não resultaram em troca de aminoácidos. Independentemente de destes desvios menores da sequência torna-se claro a partir dos resultados da sequenciação que ambos os recombinantes, mBN31 e mBN30, compreendem as sequências inteiras NS1. Além disso, pode ser concluído a partir dos dados de sequenciação que o gene NSl é compreendido de um modo estável no recombinante mBN30 que contém os dois promotores ATI. As experiências demonstram a estabilidade do recombinante apesar de serem 25 incluídas duas sequências de promotor idênticas no genoma virai. 5. Análise da expressão do gene NS1 e do gene GUS em recombinantes mBN30 e mBN31.

Os dados de PCR e sequenciação acima descritos revelaram que o gene NSl e o gene GUS estão compreendidos nos genoma dos recombinantes MVA-mBN30 e 31. Para testar se estes genes são expressos a partir do genoma virai foram feitas uma RT-PCR da região NSl e um teste funcional e uma quantificação das proteínas GUS produzidas. 5.1 RT-PCR da região NSl

Esta experiência foi feita para demonstrar que os recombinantes MVA-mBN30 e mBN31, os quais compreendem ambos o gene NSl inserido no local IGR 136-137 expressam de um modo funcional NSl como mARN. As células BHK foram infectadas com os vírus MVA-mBN30 e mBN31, respectivamente. 0 ARN foi isolado a partir destas células e foi utilizado para um ensaio de RT-PCR. Os resultados demonstram claramente que NSl é expresso a partir de ambos os vírus em células BHK infectadas. A contaminação por ADN virai pode ser excluída uma vez que não foi detectado qualquer sinal por PCR quando o passo da transcriptase reversa foi omitido. 0 controlo da água foi negativo e para o controlo positivo do plasmídeo de ambos os vírus podia claramente ser encontrada uma banda de PCR (figura 3). 26

5.2 Medição da actividade de GUS

De modo a demonstrar a expressão de GUS inserido em MVA-mBN30 e mBN31 após 20 ciclos de transferência foi determinada quantitativamente a actividade de GUS. A tabela 1 mostra claramente que GUS foi expresso em ambos os vírus recombinantes, enquanto não pode ser medida expressão de GUS em MVA-BN sem inserção.

Tabela 1: Medição da actividade de GUS em MVA-mBN30, MVA-mBN31 e MVA-BN após 20 passagens. MVA-mBN30 e MVA-mBN31 foram transferidos 20 vezes no total. As células foram infectadas com ambos os vírus recombinantes e recolhidas após 24 horas em tampão de lise. A actividade de GUS foi medida de acordo com métodos conhecidos pelos especialistas na técnica. Os valores de actividade foram medidos por absorção a 415 nm. Os valores < 0,05 e > 2,0 encontram-se fora do intervalo.

Diluição 1:2 1:10 1:100 mBN 30 0, 968 0,224 0,022 mBN 31 0, 414 0,089 0,012 BN 0, 007 0,007 0,007

Critérios de Inclusão:

Análise por PCR de IGR 136-137 Não devem ser observadas bandas nos poços dos controlos negativos, e apenas uma banda do tamanho esperado deve ser observada no controlo positivo. Para MVA-BN é esperado um fragmento de 212 pb. 27

Sequenciação e PCR da região 136-137 A amplificação por PCR do ADN virai alvo com os oligonucleótidos iniciadores deveria revelar um único fragmento do tamanho esperado. A sobreposição das sequências deveria resultar uma sequência contígua representando um fragmento de ADN de cadeia dupla do tamanho esperado. São aceites fragmentos curtos de cadeia simples se não tiver ocorrido nenhuma mutação nesta região. De um modo adicional as extremidades da sequência contígua são permitidas ser apenas de cadeia simples devido à natureza heterogénea dos produtos de amplificação por PCR. A sequência da amostra teste deveria mostrar uma homologia >/= 97% com a sequência de referência ou a respectiva sequência da base de dados. RT-PCR de NS1 Não se deveriam observar bandas nos poços dos controlos negativos, e apenas uma banda do tamanho esperado deveria ser observada no controlo positivo. Para o pBN71 é esperado um fragmento de 909 pb e para o pBN70 um fragmento de 907 pb.

Conclusão:

Após 20 passagenssob condições selectivas, a análise por PCR da IGR 136-137 mostrou não haver contaminação com vector vazio para MVA-mBN31 (ATI-NSl/p7,5-GUS) ou MVA-mBN30 (ATI-NS1/ATI-GUS). Para MVA-mBN30 a PCR revelou que não ocorreu recombinação homóloga no local ATI. Os MVA-mBN30 e mBN31 foram testados por (1) PCR final para demonstrar, que o material inicial está livre de vector vazio e que ambos 28 os genes continuam inseridos mesmo quando ambos estão sob o mesmo promotor no mesmo local IGR (para mBN30), (2) a sequenciação da região para demonstrar a sequência de bases inalterada e (3) expressão funcional de GUS por um ensaio de GUS quantitativo e uma RT-PCR para NS1. Os resultados do estudo mostram que a dupla inserção de dois genes diferentes na mesma IGR sob o controlo do mesmo promotor resulta em nenhum evento de recombinação no local do promotor mesmo após um alto número de passagens. Demonstrou-se que ambos os genes inseridos são expressos.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

<110> Nórdico Bávaro A/S

<120> Poxvirus recombinante compreendendo pelo menos dois promotores do vírus da varíola bovina ATI <130> BN52PCT <150> DK PA 2002 01814 <151> 2002-11-25 <160> 1 <170> versão de patente 3.1

<210> 1 <211> 29 <212> ADN <213> Vírus do vírus da varíola bovina <220> <221> promotor <222> (1)..(29) <223> <4 Ο 0> 1 gttttgaata aaattttttt ataataaat

Lisboa, 17 de Setembro de 2007

Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Poxvírus recombinante que compreende no genoma virai pelo menos duas cassetes de expressão, cada uma compreendendo o promotor do vírus da varíola bovina ATI de acordo com a SEQ. ID.: N° 1, um seu derivado ou uma subsequência do promotor ATI, e uma sequência codificante, em que a expressão da sequência codificante é regulada pelo referido promotor, derivado ou subsequência e em que o derivado do promotor do vírus da varíola bovina ATI é uma sequência na qual não estão substituídos, dletados e/ou inseridos mais de 6 nucleótidos na sequência de SEQ. ID.: N° 1, em que a subsequência do promotor ATI tem um comprimento de pelo menos 10 nucleótidos da sequência de SEQ. ID.: N° 1 e em que o promotor, derivado ou a subsequência compreende os nucleótidos 22 a 29 da SEQ. ID.: N° 1 e em que o promotor, derivado ou a subsequência tem a actividade biológica de ser activo enquanto um promotor.

2. Poxvírus recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor, derivado ou subsequência tem a actividade biológica de ser activo enquanto um promotor tardio do vírus Vaccinia.

3. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que os promotores, derivados ou subsequências no poxvírus recombinante são os mesmos.

4. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que pelo menos duas cassetes de expressão são inseridas no mesmo local de inserção no genoma do poxvírus. 2

5. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o promotor tem a sequência de SEQ. ID.: N°1 em pelo menos uma das cassetes de expressão.

6. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o promotor é um derivado do promotor ATI ou uma subsequência do promotor ATI ou um seu derivado em pelo menos uma das cassetes de expressão.

7. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o poxvírus é seleccionado a partir do qrupo que consiste em orthopoxvírus e avipoxvírus.

8. Poxvírus recombinante de acordo com a reivindicação 7, em que o orthopoxvírus é um vírus de vaccinia e em que o avipoxvírus é seleccionado a partir de vírus de varíola de canário e vírus da varíola de galinha.

9. Poxvírus recombinante de acordo com a reivindicação 8, em que o vírus vaccinia é a estirpe Ankara (MVA) do vírus da vaccinia modificada, em particular MVA. BN e MVA 575, depositadas sob os números V00083008 e V00120707, respectivamente, na European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC).

10. Poxvírus recombinante de acordo com a reivindicação 9, em que pelo menos uma das cassetes de expressão está inserida num local de ocorreência natural de delecção do genoma de MVA no que respeita ao genoma da estirpe Copenhagen do vírus vaccinia. 3

11. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que pelo menos uma das cassetes de expressão está inserida numa região intergénica do genoma do poxvírus.

12. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que pelo menos uma das sequências codificantes codifica para pelo menos um antigénio, epítopo antigénico e/ou um composto terapêutico.

13. Poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 como uma vacina ou medicamento.

14. Vacina ou composição farmacêutica que compreende um poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

15. Utilização do poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 para a preparação de uma vacina ou medicamento.

16. Método para a introdução das sequências codificantes em células alvo compreendendo a infecção das células alvo com o vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que a célula alvo não é uma célula no corpo humano e/ou animal.

17. Método para a produção de um péptido, proteína e/ou vírus que compreende a) infecção de uma célula hospedeira com o poxvírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, 4 b) cultura das células hospedeiras infectadas sob condições adequadas, e c) isolamento e/ou enriquecimento do péptido e/ou proteína e/ou vírus produzidos pela referida célula hospedeira.

18. Utilização de um vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 para a preparação de uma vacina ou uma composição farmacêutica para afectar, de um modo preferido induzir uma resposta imunolóqica num corpo animal vivo incluindo um humano.

19. Utilização de acordo com a reivindicação 18, em queé administrada pelo menos 102 TCID50 (dose infecciosa de cultura de tecido) do vírus.

20. Célula contendo o vírus de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

21. Método para a produção de um vírus recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 compreendendo o passo de inserção de pelo menos duas cassetes de expressão no genoma do poxvírus. Lisboa, 17 de Setembro de 2007