JP4693092B2 - ポックスウイルスゲノムに挿入された相同遺伝子を発現させる組換えポックスウイルス - Google Patents

ポックスウイルスゲノムに挿入された相同遺伝子を発現させる組換えポックスウイルス Download PDF

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Description

本発明は、２つ以上の相同な外来遺伝子を発現させる能力を有する組換えポックスウイルスに関する。上記の遺伝子は、ウイルスゲノムにとっては非相同であるが、互いに比較した場合には相同である。これらの遺伝子は、特に、ある微生物の近縁変異体またはサブタイプに由来する。さらに本発明は、そのような組換えポックスウイルスを作製する方法、およびそのような組換えポックスウイルスの医薬またはワクチンとしての使用に関する。また、ヒトを含む生きている動物において、免疫応答に影響を及ぼす方法、好ましくは免疫応答を誘発する方法も提供する。
あらゆる生体は、細菌、ウイルス、真菌または寄生虫などの感染性因子または病原性因子の攻撃を絶えず受けている。いわゆる免疫系は、当該生物が、そのような因子によって引き起こされる持続的な感染、疾患または中毒に陥るのを防いでいる。
哺乳動物の免疫系は特異的部分と非特異的部分とに分類することができる。ただし両者の間には密接な相互関係がある。非特異的免疫応答は、多種多様な病原性物質または感染性因子に対する即時防御を可能にする。特異的免疫応答は、生物がある物質による攻撃を初めて受けた場合には、誘導期間を経てから生じる。この特異的免疫応答は、主として、抗原特異的な抗体の産生と、マクロファージおよびリンパ球、例えば細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生成とに基づいている。特異的免疫応答は、ある特定の感染から回復した個体はその特定の感染からは保護されるが、他の感染性疾患には依然として罹りやすいという事実の原因である。一般に、同じ感染性因子または極めて似ている感染性因子による２回目の感染では、症状がはるかに軽いか、または症状が全く現れない。このいわゆる免疫は長期間持続し、場合によっては一生涯続くことさえある。その基礎をなしている効果はしばしば免疫記憶と呼ばれ、これを予防接種に利用することができる。
予防接種という用語は、ある個体を、無害な部分型または不活化型の感染性因子にばく露して、その個体における免疫応答に影響を及ぼす（好ましくは免疫応答を誘発する）ことにより、その特定感染性因子に対して（一生涯ではないとしても）長期間持続する免疫を生じさせる方法を表す。
ヒト痘瘡疾患は天然痘ウイルスによって起こる。天然痘ウイルスはポックスウイルス科に属する。ポックスウイルス科は、脊椎動物細胞および無脊椎動物細胞の細胞質中で複製する複雑なＤＮＡウイルスからなる大きな一科である。
ポックスウイルス科は、脊椎動物宿主域および昆虫宿主域に基づいて２つの亜科、すなわちチョルドポックスウイルス亜科とエントモポックスウイルス科とに分類することができる。チョルドポックスウイルス亜科には、とりわけ、オルトポックスウイルス属およびアビポックスウイルス属が含まれている（非特許文献1）。
オルトポックスウイルス属には、ヒト痘瘡の原因因子である天然痘ウイルスが含まれると共に、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、羊痘ウイルス、ヤギ痘ウイルス、サル痘ウイルスおよびワクシニアウイルスなどの経済的に重要な他のウイルスも含まれる。この属のメンバーはすべて遺伝的に類縁関係にあり、よく似た形態または宿主域を有するている。制限エンドヌクレアーゼ地図も、オルトポックスウイルス属の異なるメンバー間で、９０％に達する高い配列一致度を示している（非特許文献２）。
ワクシニアウイルス（ＶＶ）とは、少なくとも過去１００年間にわたって痘瘡の予防接種に使用された因子に与えられた名称である。ＶＶが、長期間にわたる連続継代により、牛痘ウイルスから派生した新種であるのか、今では絶滅したウイルスの生きた代表例である天然痘ウイルスから派生した新種であるのかは分かっていない。あるいは、ＶＶは、遺伝子組み換えの産物なのかもしれない。また、ＶＶの歴史の中で、多くのワクシニア株が生じた。これらのさまざまな株はさまざまな免疫原性を示し、潜在的合併症（その最も重篤なものは種痘後脳炎である）とさまざまな程度に関係づけられている。しかし、これらの株の多くは、痘瘡の予防接種に使用された。例えばＮＹＣＢＯＨ株、ウェスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）株またはワイエス（Ｗｙｅｔｈ）株は主に米国で使用され、アンカラ（Ａｎｋａｒａ）株、ベルン（Ｂｅｒｎ）株、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）株、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）株およびＭＶＡは主に欧州での予防接種に使用された。これらさまざまＶＶ株による世界的な予防接種計画の結果、１９８０年に、ＷＨＯはついに、天然痘ウイルスの根絶の成功を宣言した。
現在、ＶＶは主に実験株として使用されているが、それ以外に、今でもオルトポックスウイルス属の原型であるとみなされている。これは、ＶＶが最も詳細に特徴づけられたウイルスの一つになった理由でもある（非特許文献３）。ＶＶは、そしてまた最近では他のポックスウイルスも、外来遺伝子を挿入し発現させるために使用されてきた。生きている感染性ポックスウイルスに外来遺伝子を挿入するための基礎技術では、ドナープラスミド中の外来遺伝要素に隣接するポックスＤＮＡ配列と、レスキューポックスウイルス（ｒｅｓｃｕｉｎｇ ｐｏｘｖｉｒｕｓ）中に存在する相同な配列との間で、組換えが行われる。遺伝子組換えとは、一般に、２本のＤＮＡ鎖間で起こる相同なＤＮＡ区間の交換である。ウイルスによっては、ＲＮＡがＤＮＡの代わりをする場合もある。相同な核酸区間とは、同じヌクレオチド塩基配列を有するている核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の区間である。遺伝子組換えは、感染した宿主細胞内での新しいウイルスゲノムの複製または産生中に自然に起こりうる。したがって、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２種類以上のウイルスまたは他の遺伝子コンストラクトに同時感染した宿主細胞内で起こるウイルス複製サイクル中に起こりうる。第１のゲノムに由来するＤＮＡ区間は、第２の同時感染ウイルスのゲノムのうち、そのＤＮＡが第１ウイルスゲノムのＤＮＡと相同である区間を構築する際に、互換的に使用される。
挿入されたＤＮＡ遺伝子配列を改変感染性ウイルスによってうまく発現させるには、２つの条件が必要である。第１に、改変ウイルスが依然として生存可能であるように、挿入はウイルスの非必須領域になされるべきである。挿入されたＤＮＡを発現させるための第２の条件は、挿入されたＤＮＡに対して適切な関係にあるプロモーターが存在することである。通例、プロモーターは、発現させるべきＤＮＡ配列の上流に配置する。
例えばＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＩｎｆＨＡ）または二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）スポロゾイト抗原などを発現させる組換えＶＶの、感染性疾患予防用の生ワクチンとしての有用性は、実証されており、それに関する総説もある（非特許文献４）。
ＶＶのもう一つの利点は、１つのＶＶゲノム内に複数の外来配列、外来遺伝子または外来抗原を取り込む能力を有するていることである（非特許文献５）。また、１回の多価ワクチン接種で多くの非相同な感染性疾患に対する免疫を誘発することができると報告されている（非特許文献６）。
単一のＶＶによってさまざまな抗原を発現させる例の一つが、Ｂｒａｙらによって記載されている。デングウイルス血清型４の３種類の構造タンパク質、すなわちキャプシド（Ｃ）タンパク質、前駆膜（ｐｒｅ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ｐｒＭ）タンパク質、エンベロープ（Ｅ）タンパク質と、デングウイルス血清型４の２つの非構造タンパク質、すなわちＮＳ１およびＮＳ２ａとを発現させることができる組換えＶＶは、相同なデングウイルス血清型４の攻撃からマウスを保護する能力を有することが示された（非特許文献７）。
デングウイルス血清型１（Ｄｅｎ−１）からデングウイルス血清型４（Ｄｅｎ−４）まで４つの血清型を有するデングウイルスは、ヒトの感染に関して、フラビウイルス属の重要な一メンバーである。デングウイルス感染は、インフルエンザ様の症状から重篤なまたは致死的な病気、すなわちショック症候群（ＤＳＳ）を伴うデング出血熱（ＤＨＦ）に及ぶ疾患をもたらす。デングの突発は、媒介動物である蚊が多い熱帯地方および亜熱帯地方の人口密集地域では、依然として公衆衛生上の大きな問題である。
デング感染および蚊媒介性フラビウイルスが誘発する他の疾患が、世界の多くの地域で蔓延することを懸念して、デング熱（ＤＦ）とデング出血熱（ＤＨＦ）の両方を防止することができるデングワクチンの開発に向けた努力が盛んに行われるようになり、予防接種を受けた個体を蚊媒介性フラビウイルスの一部または全部によって誘発される感染症から保護するのに役立つワクチンがもたらされている。
大半のＤＦ症例が４つの血清型のいずれかによる最初の感染後に顕在化するのに対して、ＤＨＦ症例は、かなりの部分が、最初に感染したデングウイルスの血清型とは異なる血清型による２回目の感染を受けた患者に起こる。これらの知見から、一定数の症例では、あるデングウイルス血清型に対する抗体を有する個体が適当な間隔を置いて異なるウイルス血清型に逐次的に感染することによってＤＨＦが起こるという仮説がもたらされる。
したがって、１つの血清型に対する予防接種は、デングウイルス感染からの完全な保護をもたらすのではなく、同じデングウイルス株による感染からの保護をもたらすにすぎない。さらに重要なことに、１つの血清型に対する予防接種を受けた人では、その人が血清型の異なるデングウイルス株に感染した場合にデング出血熱などの重篤な合併症を発症する危険性が増大している。
したがって、４つのデングウイルス血清型のすべてに由来する抗原を有する多価ワクチンが望ましい。
これまでは、各ＶＶが異なるウイルスの配列をコードしている一群の組換えＶＶを混合することによって、多価ワクチンを製造することが提案されていた（非特許文献８）。しかし、そのような多価ワクチンにはいくつかの欠点がある。第１に、いくつかの独立した組換えＶＶを作製するのは面倒である。個別の製造プロセスだけでなく、品質管理と品質保証にも、著しく時間がかかる。第２に、異なる配列を発現させる組換えウイルスの混合物による感染には、感染事象があまりバランスよく起こらないという危険が常に伴う。主な危険は、多価ワクチンに含まれるすべての異なる組換え体が標的細胞に感染するわけではなく、個々の組換え体による標的細胞の感染しか起こらないというものである。理由の１つとして、組換えウイルスの不均等な分布が考えられる。もう一つの理由として、単一の細胞に感染する際に異なる組換えウイルス間で起こる干渉が考えられる。そのような干渉は重感染現象として知られている。この場合、最終的に感染細胞から発現され、その結果、患者の免疫系に提示されるのは、多価ワクチンの異なる抗原のすべてではなく、一部の抗原だけになる。その結果、多価ワクチンが提示するまたは提示することのできるさまざまな抗原に対する完全な免疫保護は到底もたらされず、一部の抗原に対する免疫保護しか得られないことになる。
デングウイルス感染に対するワクチンの場合、多価ワクチンによるアプローチには、デングウイルス２のエンベロープタンパク質に関して報告例（非特許文献９）があるように、異なる配列が異なる量で発現されたり、予測不可能な形で発現されたりすると、その予防接種は患者にとって著しく危険であるという欠点がある。一群の組換えワクシニアウイルスを使った不完全な予防接種では、デングウイルスのすべての血清型に対する免疫保護ではなく、その一部に対する免疫保護しか得られない。残念なことにデング感染の場合、不完全な予防接種は、それによってデングウイルス出血熱などの致死的合併症の危険が増大するため、全く受け入れがたい。
Ｆｉｅｌｄｓ Ｂ．Ｎ．編「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，第３版，１９９６年，ＩＳＢＮ：０−７８１７−０２５３−４，第８３章 ＭａｃｋｅｔｔおよびＡｒｃｈａｒｄ［１９７９年］Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，４５：６８３−７０１ Ｆｉｅｌｄｓ Ｂ．Ｎ．編「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，第３版，１９９６年，ＩＳＢＮ：０−７８１７−０２５３−４，第８３章および第８４章 Ｓｍｉｔｈ等［１９８４年］Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２，３８３−４０７ ＳｍｉｔｈおよびＭｏｓｓ［１９８３年］Ｇｅｎｅ，２５（１）：２１−２８ Ｐｅｒｋｕｓら［１９８５年］Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２９，９８１−９８４ Ｂｒａｙ等［１９８９年］Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２８５３−２８５６ Ｍｏｓｓ［１９９０年］Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２，３１７−３２７ Ｄｅｕｂｌｅら［１９８８年］Ｊ． Ｖｉｒｏｌ ６５：２８５３
したがって、ある感染性疾患原因微生物の２つ以上の株、クレード、変異体、サブタイプまたは血清型によって起こりうる感染性疾患に対する安定で有効で信頼できるワクチンを提供することが、本発明の目的である。
また、すべてのデングウイルス血清型に対する信頼できる予防接種を可能にする、デングウイルス感染に対する安定で有効で信頼できるワクチンを提供することが、本発明のもう一つの目的である。
本発明は、ある感染性疾患原因微生物の異なる株、クレード、変異体、サブタイプまたは血清型に由来する相同な遺伝子を１つのポックスウイルスに含めるという着想に基づいている。上述のように、例えばデングウイルスには４つのグループ、サブタイプまたは血清型が存在し、それらはいずれも同じタイプの遺伝子を、例えばキャプシド（Ｃ）タンパク質をコードする遺伝子、前駆膜（ＰｒＭ）タンパク質またはエンベロープタンパク質をコードする遺伝子などとして含んでいる。しかし、同じタイプの遺伝子の核酸配列は、４つの血清型のすべてで完全に同じわけではなく、完全に相同なわけでもない。例えば、デングウイルス血清型１、２、３および４のＰｒＭ遺伝子（ＰｒＭ１〜４）間で配列を比較したところ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ４．０５ Ｍａｇａｌｉｇｎ，Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）、６６．５〜７２．９％の配列一致度、すなわち約６５〜７５％の相同性が明らかになった。感染性疾患原因微生物の異なるサブタイプの遺伝子に見られる相違とばらつきは、それぞれ、１つのサブタイプに対して予防接種しても、同じ微生物の他の変異体による感染に対する保護が自動的にはもたらされないことの理由であると考えられる。そこで、ある感染性疾患原因微生物の異なる株、クレード、変異体、サブタイプまたは血清型に由来する近縁遺伝子または相同遺伝子を含んでいる組換えウイルスを作製することを着想した。しかし、上述したように、相同配列間の相同組換えはウイルスの生活環中に起こり、完全には相同ではないＤＮＡ区間の間でさえ起こる。したがって、単一のウイルスゲノムに相同な遺伝子を挿入すると相同組換えが起こり、その結果、挿入した相同遺伝子の欠失が起こると予想された。
しかし、少なくとも６０％の相同性を有する少なくとも２つの外来遺伝子をゲノム内に含む組換えポックスウイルスを作製したところ、意外にも、前記相同遺伝子はウイルスゲノム中に安定に挿入されたままであることを見い出した。
相同な遺伝子（好ましくは少なくとも５０％の相同性を有するもの）をウイルスゲノムの異なる挿入部位に挿入した場合でも、それらの遺伝子はウイルスゲノムに安定に挿入されたままである。この場合、前記相同遺伝子間の組換え事象は、ウイルスの増幅やウイルスの生活環にとって重要なウイルス遺伝子の喪失をもたらすと予想された。すなわち、ウイルスの生活環は重大な損傷を受けるだろうと予想された。また、組換え頻度は２つの連鎖遺伝子間の距離に比例するので、異なる挿入部位に位置する２つ以上の相同遺伝子間で起こる組換え事象の頻度は高く、したがって当該遺伝子の欠失及び(又は)著しい干渉が起こるだろうと予想された。したがって、組換え事象が起こらず、相同な遺伝子がウイルスゲノムの異なる挿入部位に安定に挿入されたままであることは、極めて驚くべきことであった。
先行技術によれば、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）およびデングウイルスなどのフラビウイルスに由来する外来ＤＮＡを含む組換えポックスウイルスが知られている（米国特許第５，５１４，３７５号）。しかし、前記フラビウイルス由来の各遺伝子は、同じ挿入部位に１回挿入されているだけである。また、適当なコンピュータソフトウェア（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ４．０５ Ｍｅｇａｌｉｎｅ，Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）で配列比較を行ったところ、ポックスウイルスゲノムに挿入された遺伝子の相同性は、ＪＥＶ由来の遺伝子の場合は２０．２％〜２９．６％、ＹＦＶ由来の遺伝子の場合は２９．２％〜４５．３％、デングウイルス由来の遺伝子の場合は２２．８％〜２９．５％であることが明らかになった。
変異ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）の同じ挿入部位（特に欠失部位ＩＩ）にデングウイルス抗原を挿入することが記載されている国際公開第９８／１３５００号にも、同様のことが言える。
米国特許第５，３３８，６８３号には、ｇｐ１３およびｇｐ１４ヘルペスウイルス糖タンパク質遺伝子を、単一の組換えポックスウイルスの２つの異なる挿入部位に挿入することが記載されている。しかし両遺伝子は２５．２％の相同性しか持っていない。
変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）の同じ挿入部位（欠失部位ＩＩＩ）に挿入されたインフルエンザウイルスの赤血球凝集素遺伝子と核タンパク質遺伝子とを配列比較したところ、４９．１％の相同性がみとめられた（米国特許第５，６７６，９５０号、Ｓｕｔｔｅｒら［１９９４年］Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３２）。
米国特許第５，８９１，４４２号には、伝染性ファブリキウス嚢病（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｕｒｓａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）ウイルスのポリタンパク質ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４のコード配列を有する組換えポックスウイルスが開示されている。これらの遺伝子は４１．９％〜５０．３％の相同性を持ち、融合されて単一の挿入部位に挿入された。
最後に、米国特許第６，２１７，８８２号には、５２．７％の相同性を有する仮性狂犬病ウイルス抗原ｇｐ５０およびｇｐ６３が同じ部位に挿入されている組換え豚痘ウイルスベクターが記載されている。
要約すると、先行技術では、少なくとも５０％の相同性を有する相同な遺伝子または配列はすべて、ウイルスゲノム内の同じ挿入部位または単一の挿入部位に挿入されているということができる。
本発明によれば、相同な遺伝子または配列は、少なくとも５０％の相同性、すなわち５０％〜１００％の相同性、すなわち少なくとも５０％の同一ヌクレオチド塩基を有する。５０％未満の相同性を有する遺伝子または配列は非相同であるとみなすことができる。本発明では、「相同」または「相同性」という用語を、遺伝子または配列を互いに比較する場合に使用するのに対して、「外来」遺伝子、または「外因性」もしくは「非相同」配列という用語は、遺伝子または配列をポックスウイルスゲノムと比較する場合に使用する。すなわち、本発明で使用する場合、これらの用語は、自然界では通常はポックスウイルスに付随して見いだされないＤＮＡ配列を表す。したがって本発明は、ウイルスゲノムと比較すると非相同であるが、互いには相同である少なくとも２つの遺伝子を含んでいる組換えポックスウイルスに関する。「遺伝子」という用語は、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原などをコードするコード配列を表す。相同な遺伝子から翻訳されるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、同じ役割を果たし、同じ機能的特性を示す。相同な遺伝子は通例、異なってはいるが関連のある供給源または微生物に由来する。本発明の一実施形態によれば、コード配列における相同性は、好ましくは７０％〜８０％、より好ましくは８０％〜９０％、または９０％〜１００％である。６５％〜７５％の相同性は最も好ましい。
本発明の組換えポックスウイルスは、関連する遺伝情報を、１つの単一感染ユニットまたは１つのウイルス粒子だけに含んでいるので、不均等な感染および異なる相同配列の不均衡な発現が起こる危険性はない。したがって、近縁の遺伝子、さらには最近縁の遺伝子、またはほとんど同一な配列を含み、１つの感染細胞中でそれらを発現させる能力を有する本発明の組換えポックスウイルスは、多価ワクチンの作製にとってとりわけ有利である。
この利点は、例えばデングウイルスのような、あるウイルスのいくつかの近縁株または血清型が引き起こしうる疾患に対するワクチンの開発にとっては、とりわけ興味深い。異なるデングウイルス血清型の相同遺伝子を含んでいる組換えポックスウイルスを、実施例に記載する。
本発明の相同な遺伝子または配列は、例えばベクターウイルスを除く任意のウイルス、任意の細菌、任意の真菌または寄生虫など、任意の微生物に由来することができる。相同な遺伝子または配列は、好ましくは、ある感染性微生物または病原性微生物に由来し、最も好ましくはその微生物の異なる株もしくはクレード、変異体、サブタイプまたは血清型に由来する。
「株」または「クレード」という用語は、当業者には周知の技術用語であり、微生物の分類法を表す。この分類体系では、今までに特徴づけられたすべての微生物を、科、属、種、株という階層的序列に分類する（Ｆｉｅｌｄｓ Ｂ．Ｎ．編「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，第４版，２００１）。科のメンバーに関する判定基準が系統学的関係であるのに対して、属は共通する特徴を有する全てのメンバーを含み、種は複製系統を構成して特定の生態的地位を占める多形質群と定義される。「株」または「クレード」という用語は、基本的形態やゲノム構造およびゲノム構成などの共通する特徴を有するが、宿主域、組織向性、地理的分布、弱毒化または病原性などの生物学的特性が異なっている微生物、すなわちウイルスを表す。「変異体」または「血清型」という用語は、軽微なゲノム変異に起因して個別の感染スペクトルまたは抗原特性を示す同じ株（サブタイプともいう）のメンバーを、さらに区別するものである。
本発明の別の実施形態では、相同な遺伝子または配列がウイルスから選択され、好ましくはフラビウイルス属に属するウイルス（例えば、好ましくはデングウイルス、ウエストナイルウイルスまたは日本脳炎ウイルスであるが、これらに限らない）、レトロウイルス属に属するウイルス（例えば、好ましくはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であるが、これに限らない）、エンテロウイルス属に属するウイルス（例えば、好ましくは手足口病ウイルス、ＥＶ７１であるが、これらに限らない）、ロタウイルス属に属するウイルス、またはオルトミクソウイルス属に属するウイルス（例えば、好ましくはインフルエンザウイルスであるが、これに限らない）から選択される。フラビウイルスに由来する相同な遺伝子は最も好ましい。
別の好ましい実施形態では、相同な遺伝子がデングウイルス遺伝子から選択され、好ましくはＣ、ＮＳ１及び(又は)ＮＳ２、あるいは好ましくはＥ、より好ましくはＰｒＭである。このウイルスの異なる血清型に由来する相同な遺伝子は最も好ましく、それらの遺伝子は、４つのデングウイルス血清型の１つ、２つ、３つまたは全部に由来することができる。
さらに別の実施形態では、相同な遺伝子が異なるＨＩＶ株またはＨＩＶクレードから選択される。相同な遺伝子は、好ましくは、ｇａｇ／ｐｏｌコード配列から選択され、より好ましくはｅｎｖコード配列から選択され、さらに好ましくは構造及び(又は)調節ＨＩＶコード配列の組合せから選択される。
本発明に適したベクターウイルスは、選択した宿主細胞（例えば鳥類宿主細胞）中で容易に培養することができるが、ヒトまたはヒト細胞中では、著しく複製欠損性であるか、または実際に複製しないポックスウイルス群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明のポックスウイルスは、カナリア痘ウイルス（Ｐｌｏｔｋｉｎら［１９９５年］Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ Ｓｔａｎｄ． ｖｏｌ ８４：１６５−１７０、Ｔａｙｌｏｒら［１９９５年］Ｖａｃｃｉｎｅ，Ｖｏｌ １３．Ｎｏ．６：５３９−５４９）、鶏痘ウイルス（Ａｆｏｎｓｏら［２０００年］，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，３８１５−３８３１、Ｆｉｅｌｄｓ Ｂ．Ｎ．編「Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，第４版，２００１，第８５章，２９１６頁）、ペンギン痘ウイルス（Ｓｔａｎｎａｒｄら［１９９８年］Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ，７９，１６３７−１６４９）またはそれらの誘導体を含む群から選択される。これらのウイルスはアビポックスウイルス属に属するので、鳥類細胞中で容易に培養し、増幅することができる。しかし、哺乳類細胞またはヒト細胞では複製欠損性であるため、感染性子孫ウイルスは基本的に産生されないか、ほとんど産生されない。
本発明の別の実施形態では、２つ以上の相同な遺伝子を含む組換えポックスウイルスの作製に、ワクシニアウイルス、好ましくは弱毒化ワクシニアウイルスを使用する。
ワクシニアウイルス（ＶＶ）は短い相同配列の相同組換えを起こすことによって、相同な配列を欠失させうることが知られているが（Ｈｏｗｌｅｙら［１９９６年］，Ｇｅｎｅ １７２：２３３−２３７）、本発明者らは相同な配列または相同な遺伝子がゲノム中に安定に挿入されている組換えワクシニアウイルスを提供する。これは極めて意外な発見である。というのも、Ｈｏｗｅｌｙらによれば、３００塩基対（ｂｐ）までの短い配列でも、ワクシニアウイルスにおけるゲノムの再編成および相同な配列の欠失を誘発するには十分だったからである。したがって当業者であれば、さらに長い配列ではさらに高い確率で組換え事象が誘発されると予想するだろう。しかし、本発明によれば、完全な相同遺伝子を含む配列でさえ、ワクシニアウイルスのゲノム中に安定に挿入することができる。
ワクシニアウイルスの一例は（これに限るわけではないが）、著しく弱毒化され宿主域が制限されたワクシニア株、すなわち変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）である（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ら［１９９４年］Ｖａｃｃｉｎｅ １２：１０３２−４０）。ＭＶＡは、ワクシニアウイルスのアンカラ株（ＣＶＡ）をニワトリ胚線維芽細胞で約５７０代にわたって連続継代することによって作出された（概要についてはＭａｙｒ，Ａ．ら［１９７５年］Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ３，６−１４を参照されたい）。長期間にわたるこれらの継代の結果、ＣＶＡはそのゲノム配列のうちの約３１キロ塩基を欠失させた。得られたウイルス株ＭＶＡは、宿主細胞が著しく制限されているとの記載がある（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ら，Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７２，１０３１−１０３８［１９９１年］）。典型的なＭＶＡ株は、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に受託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ００１２０７０７として寄託されているＭＶＡ５７５である。
別の実施形態として、本発明ではＭＶＡ−Ｖｅｒｏ株またはその誘導体を使用することができる。ＭＶＡ−Ｖｅｒｏ株はヨーロピアン・コレクション・オブ -アニマル・セル・カルチャーズに、受託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ９９１０１４３１およびＥＣＡＣＣ ０１０２１４１１として寄託されている。ＭＶＡ−Ｖｅｒｏの安全性は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ０１／０２７０３号に記載の生物学的、化学的および物理的特徴に反映されている。通常のＭＶＡと比較すると、ＭＶＡ−Ｖｅｒｏはゲノム欠失を１つ余分に持っている。
本発明ウイルスの「誘導体」という用語は、親ウイルスと同じ特徴を示すがそのゲノムの１つ以上の部分に相違を示す子孫ウイルスを表す。
本発明のさらに別の実施形態ではＭＶＡ−ＢＮを使用する。ＭＶＡ−ＢＮはヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズに受託番号ＥＣＡＣＣ Ｖ０００８３００８として寄託されている。ＭＶＡ−ＢＮウイルスベクターは変異ワクシニアアンカラに由来する著しく弱毒化されたウイルスであることが明らかにされているので、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を使用することにより、特に安全なウイルスワクチンが作製される。したがって、最も好ましい実施形態では、本発明に従って２つ以上の相同な遺伝子を含むＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を、ウイルスベクターとして使用する。「ＭＶＡ−ＢＮの誘導体」という用語は、ＭＶＡ−ＢＮと比較して同じ機能的特徴を有するウイルスを表す。ＭＶＡ−ＢＮの特徴、あるＭＶＡがＭＶＡ−ＢＮおよびその誘導体であるかどうかを調べることを可能にする生物学的アッセイの説明、ならびにＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体の作製を可能にする方法は、国際公開第０２／４２４８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体の機能的特徴を調べる簡単な方法の一つは、ヒトＨａＣａｔ細胞におけるその弱毒化および複製の欠如である。
本発明の組換えポックスウイルスでは、好ましくは、ポックスウイルス転写制御要素によって、より好ましくはＭＶＡ、カナリア痘、鶏痘またはペンギン痘転写制御要素によって、最も好ましくはワクシニアウイルスプロモーターによって、外因性配列の発現を制御する。本発明のポックスウイルス転写制御要素には、他にも、ポックスウイルス系で機能するあらゆる転写制御要素が含まれる。
本発明における外因性配列の挿入は、好ましくは、ウイルスゲノムの非必須領域に対して行われる。非必須領域は、例えば、ポックスウイルスの生活環にとって必須でないポックスウイルス遺伝子の遺伝子座またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）である。２つのＯＲＦに挟まれた区間を表す遺伝子間領域も、本発明では非必須領域と見なされる。本発明の別の実施形態では、ＭＶＡゲノムの天然の欠失部位（参照により本明細書に組み込まれる第ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６号に開示されているもの）に、外因性配列を挿入する。
挿入されるＤＮＡの向きは、本発明の組換えウイルスの機能性または安定性には影響しない。
本発明の組換えポックスウイルスは増殖が著しく制限され、その結果、著しく弱毒化されているので、ヒトを含む広範な哺乳動物の処置にとって、さらには免疫不全状態のヒトの処置にとっても、理想的な候補である。したがって本発明は、ヒトを含む動物の生体内で免疫応答を誘発するための薬学的調合物およびワクチンも提供する。
本薬学的調合物は、一般に、１つ以上の薬学的に許容し得るそして／または承認された担体、添加剤、抗生物質、保存剤、アジュバント、希釈剤及び(又は)安定剤を含みうる。そのような補助物質としては、水、食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などを挙げることができる。適切な担体は通例、大きくてゆっくり代謝される分子、例えばタンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、脂質集合体などである。
ワクチンを製造するには、本発明の組換えポックスウイルスを生理学的に許容できる形態に変換する。これは、天然痘の予防接種に用いられるポックスウイルスワクチンの製造に関する経験（Ｓｔｉｃｋｌ，Ｈ．ら［１９７４年］Ｄｔｓｃｈ． ｍｅｄ． Ｗｓｃｈｒ． ９９，２３８６−２３９２に記載されているもの）に基づいて行うことができる。例えば、精製ウイルスは、５×１０８ ＴＣＩＤ５０／ｍｌの力価で、約１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）および１４０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．４）中に製剤化して、−８０℃で保存される。ワクチン注射剤を製造するには、例えば２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下で、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１００ｍｌ中のウイルス粒子１０２〜１０８個を、アンプル（好ましくはガラスアンプル）内で凍結乾燥する。もう一つの選択肢として、ワクチン注射剤は、製剤中のウイルスを段階的に凍結乾燥することによっても製造できる。この製剤は、さらに、例えばマンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンなどの添加剤、または、インビボ投与に適した酸化防止剤もしくは不活性ガス、安定剤もしくは組換えタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）などの他の助剤も含むことができる。次に、ガラスアンプルを密封して、４℃〜室温で数ヶ月間保存することができる。ただし、必要がない限り、アンプルは−２０℃未満の温度で保存することが好ましい。
予防接種または治療を行うには、上記の凍結乾燥物を０．１〜０．５ｍｌの水性溶液、好ましくは生理食塩水またはトリス緩衝液に溶解し、それを全身的または局所的に、すなわち非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、乱切法、または当業者に知られる他の任意の投与経路によって、投与することができる。当業者であれば、投与様式、投与量および投与回数を、既知の方法で最適化することができる。ただし、最も一般的には、１回目の予防接種注射の約１ヶ月〜６週間後に２回目の注射を行うことによって、患者を予防接種する。
本発明の組換えウイルスは、標的細胞への外因性コード配列の導入に使用される。標的細胞への外因性コード配列の導入は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原およびエピトープをそれぞれインビトロで製造するために使用することができる。また、細胞に相同配列または非相同配列を導入する方法は、インビトロ治療およびインビボ治療にも応用することができる。インビトロ治療の場合は、免疫応答を誘発するために、前もって（エクスビボで）本発明の組換えポックスウイルスに感染させておいた単離細胞を、動物の生体に投与する。インビボ治療の場合は、免疫応答を誘発するために、本発明の組換えポックスウイルスを動物の生体に直接投与する。この場合、接種部位を取り巻く細胞は、本発明のウイルスまたはその組換え体に、インビボで直接感染する。感染後、それらの細胞は、外因性コード配列にコードされているタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは抗原を合成し、次いでそれらを、またはそれらの一部を、細胞表面に提示する。免疫系の専門化した細胞は、そのような外来のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗原およびエピトープの提示を認識して、特異的免疫応答を開始する。
組換えポックスウイルスを取得する方法またはポックスウイルスゲノムに外因性コード配列を挿入する方法は、当業者にはよく知られている。また、それらの方法は実施例でも説明するし、以下の文献から演繹し、または完遂することもできる。
-Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９年。この文献には、例えばＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウェスタンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅技術などの標準的な分子生物学技術に関する技術とノウハウが記載されている。
-Ｂｒｉａｎ ＷＪ ＭａｈｙおよびＨｉｌｌａｒ Ｏ Ｋａｎｇｒｏ編「Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６年。この文献には、ウイルスの取り扱いと操作に関する技術が記載されている。
-ＡＪ ＤａｖｉｓｏｎおよびＲＭ Ｅｌｌｉｏｔｔ編「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード，１９９３年の第９章「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｂｙ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒｓ（ワクシニアウイルスベクターによる遺伝子の発現）」。
-「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，出版社：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ Ｉｎｃ． １９９８年の第１６章、第ＩＶ節「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ（ワクシニアウイルスベクターを使った哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現）」。この文献には、ＭＶＡの取り扱い、操作および遺伝子工学に関する技術とノウハウが記載されている。
本発明の組換えポックスウイルスの作製には、さまざまな方法を応用することができる。ウイルスに挿入すべきＤＮＡ配列は、ポックスウイルスの一ＤＮＡ区間に相同なＤＮＡが挿入されている大腸菌プラスミドコンストラクトに、入れることができる。別途、挿入すべきＤＮＡ配列をプロモーターに連結する。このプロモーター−遺伝子連鎖は、非必須遺伝子座を含むポックスＤＮＡの一領域に隣接するＤＮＡ配列に相同なＤＮＡがそのプロモーター−遺伝子連鎖の両隣に隣接するように、プラスミドコンストラクト中に配置される。得られたプラスミドコンストラクトを、大腸菌内での増殖によって増幅し、単離する。挿入すべきＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドを、例えばニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）などの細胞培養に、ポックスウイルスと共にトランスフェクトする。それぞれプラスミド中およびウイルスゲノム中にある相同なポックスＤＮＡ間で相同組換えが起こることにより、外来ＤＮＡ配列が存在するように改変されたポックスウイルスが得られる。
より好ましい実施形態では、適当な細胞培養の細胞、例えばＣＥＦ細胞にポックスウイルスを感染させる。次に、その感染細胞に、外来遺伝子（好ましくはポックスウイルス発現制御要素の転写制御を受けるもの）を含む第１プラスミドベクターをトランスフェクトする。上で説明したように、このプラスミドベクターは、ポックスウイルスゲノムの選択した部分への外因性配列の挿入を指示する能力を有する配列も含んでいる。場合により、このプラスミドベクターは、ポックスウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子及び(又は)選択遺伝子を含んでいるカセットも含有する。好適なマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン、ホスホリボシルトランスフェラーゼまたは他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットを使用することにより、産生した組換えポックスウイルスの同定と単離が簡単になる。しかし、組換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によって同定することもできる。次に、新たな細胞を、上述のようにして得られた組換えポックスウイルスに感染させ、第１ベクターに含まれる遺伝子と相同な遺伝子を含む第２ベクターをトランスフェクトする。この遺伝子がポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に含まれることになっている場合、第２ベクターは、ポックスウイルスのゲノムへの相同遺伝子の組込みを指示する配列も相違する。相同組換えが起こった後に、２つの相同な遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。組換えウイルス中に３つ以上の相同な遺伝子を導入するには、先の工程で単離された組換えウイルスを感染に使用し、さらにもう一つの相同遺伝子を含むもう一つのベクターをトランスフェクションに使用することによって、感染工程とトランスフェクション工程とを繰り返す。
もう一つの選択肢として、上述の感染工程とトランスフェクション工程とは互いに交換することができる。すなわち、適当な細胞を、まず、外来遺伝子を含むプラスミドベクターでトランスフェクトしてから、ポックスウイルスに感染させることもできる。
さらにもう一つの選択肢として、各相同遺伝子を異なるウイルスに導入し、ある細胞を、得られた組換えウイルスのすべてに同時感染させ、すべての相同遺伝子を含む組換え体を選別することもできる。
さらに本発明は、ポックスウイルスゲノムへの発現可能な相同遺伝子の組込みを指示する２つ以上のプラスミドベクターコンストラクトを含むキットも提供する。そのようなプラスミドベクターは、適当なクローニング部位の他に、ポックスウイルスゲノム中の選択した部分への外因性配列の挿入を指示する能力を有する配列も含んでいる。これらのベクターは、場合により、選択遺伝子カセットまたはマーカー遺伝子カセットも含む。本キットはさらに、１個または数個の相同遺伝子と、場合により選択遺伝子またはマーカー遺伝子とが、上記のベクターコンストラクトによって挿入されている点で組換え型であるウイルスを選択するための手段と説明書も含む。
さらに別の実施形態として、本発明は、本発明の組換えポックスウイルスに由来するＤＮＡ配列もしくはその一部、または本発明の組換えポックスウイルスに相同なＤＮＡ配列もしくはその一部を包含する。そのような配列は、本発明の相同遺伝子の１つの少なくとも断片を含む外因性配列の少なくとも一部と、本発明のポックスウイルスゲノム配列の少なくとも断片とを含み、前記ポックスウイルスゲノム断片は、好ましくは、前記外因性配列に隣接している。
そのようなＤＮＡ配列は、例えばＰＣＲプライマーやハイブリダイゼーションプローブを作製するためにそれらを使用したり、アレイ技術にそれらを使用したりすることにより、本ウイルスまたはその誘導体を同定しまたは単離するために使用することができる。
図面の簡単な説明
図１：図１は、実施例１に記載のＭＶＡゲノム中の４つのＰｒＭ（＝前駆膜）遺伝子（血清型１〜４）の挿入部位を表す概略図である。
図２〜９及び図１２〜１７：図２〜９および図１２〜１７は、挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す図であり、ベクター名、そのサイズ、および以下に示すような興味ある配列の位置が記載されている：ＡｍｐＲ＝アンピシリン耐性遺伝子、ｂｆｐ＝青色蛍光タンパク質遺伝子、ｄＡ＝欠失部位Ａ、ｄＥ＝欠失部位Ｅ、ｄ２＝欠失部位２、Ｅｃｏｇｐｔ＝大腸菌グアノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＥＧＦＰ＝強化緑色蛍光タンパク質遺伝子、Ｆ１＝隣接配列１、Ｆ２＝隣接配列２、Ｉ４Ｌ＝遺伝子間領域Ｉ４Ｌ、ＩＧＲ＝遺伝子間領域、ＮＰＴ ＩＩ＝ネオマイシン耐性遺伝子、Ｐ＝ポックスウイルスプロモーター、ｐｒ７．５＝ワクシニアプロモーター７．５、ＰｒＭ＝デングウイルスの前駆膜遺伝子、数字はそれが４つの血清型のうちのどれに由来するかを示している、ｒｐｔ＝隣接配列の反復である。
図１０：図１０は、４種類の挿入ベクター（ｐＢＮ４９、ｐＢＮ５０、ｐＢＮ４０、ｐＢＮ３９）のベクタークローニング戦略のＰＣＲ検証を示す。各プラスミドを４種類のＰＣＲプライマーの組合せで試験した。各組合せは、それぞれ、別個の一挿入部位に組み込まれた別個の一ＰｒＭ配列に特異的である。
図１１：図１１は、４つの相同なデングウイルスＰｒＭ遺伝子を含む組換えポックスウイルスのＰＣＲ検証（実施例１）を示す。ゲルの上側には、組換えウイルスのさまざまなＰＣＲ結果を示し、下側には、表記の対照プラスミドの同じＰＣＲ反応の結果を示す。相同な配列を含むプラスミドをｐＢＮ３９、ｐＢＮ４９またはｐＢＮ５０と呼ぶ。ＰｒＭは、挿入されたデングウイルス前駆膜遺伝子を意味し、数字はそれが４つの血清型のどれに由来するかを示している。ｄＡ＝欠失部位Ａ、ｄＥ＝欠失部位Ｅ、ｄ２＝欠失部位２、Ｉ４Ｌ＝遺伝子間領域Ｉ４Ｌは、外因性ＤＮＡの挿入部位を表す。
図１８：図１８は、実施例２に記載のＭＶＡゲノム中の３つのＰｒＭ遺伝子（血清型２〜４）の挿入部位を表す概略図である。
図１９：図１９は、３つの相同なデングウイルスＰｒＭ遺伝子が遺伝子間領域に挿入されている組換えポックスウイルスのＰＣＲ検証（実施例２）を示す。上図は、ＰｒＭ２に特異的なＰＣＲ反応の結果を表し、中図はＰｒＭ３に特異的なＰＣＲ反応の結果を表し、下図はＰｒＭ４に特異的なＰＣＲ反応の結果を表す。レーン８は、対照プラスミドの同じＰＣＲ反応を表す。レーン２は空ベクター対照ＭＶＡを表す。ＰｒＭは、挿入されたデングウイルス前駆膜遺伝子を意味し、数字はそれが４つの血清型のどれに由来するかを示している。Ｍ＝分子量マーカー。
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。しかしながら当業者は、これらの実施例が、決して本発明によって提供される技術の適用範囲を限定するものではないことを十分に理解している。
挿入ベクター
欠失部位Ａ用の挿入ベクター
ゲノム位置７６０８〜７６０９に相当するＭＶＡゲノムのいわゆる欠失部位Ａまたは欠失部位１に外因性配列を挿入するために、欠失部位Ａに隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。ＭＶＡ−ＢＮゲノムＤＮＡからこの隣接配列を単離するために、適当なコンピュータソフトウェア（ＤＮＡｓｉｓ、日立ソフトウェアエンジニアリング、米国サンブルーノ）を使って適切なＰＣＲプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるＮＰＴ ＩＩ遺伝子（ネオマイシン耐性）などの選択遺伝子カセットを導入する。また、欠失部位Ａに挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図２に示す（ｐＢＮＸ１０）。
欠失部位Ｅ用の挿入ベクター
ゲノム位置１７０４８０〜１７０４８１に相当するＭＶＡゲノムのいわゆる欠失部位Ｅまたは欠失部位４に外因性配列を挿入するために、欠失部位Ｅに隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むベクターを構築した。このベクターは上述したように設計し、構築される。隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるＥＧＦＰ遺伝子（緑色蛍光タンパク質、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を配置する。また、欠失部位Ａに挿入しようとする追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図３に示す（ｐＢＮＸ３２）。
欠失部位２用の挿入ベクター
ゲノム位置２０７１８〜２０７１９に相当するＭＶＡゲノムのいわゆる欠失部位２に外因性配列を挿入するために、欠失部位２に隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むベクターを構築した。このベクターは上述したように設計し、構築される。隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるｈｂｆｐ遺伝子（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｂｌｕｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：ヒト化青色蛍光タンパク質、Ｐａｖａｌｋｉｓ ＧＮら）を配置する。また、欠失部位２に挿入しようとする追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図４に示す（ｐＢＮＸ３６）。
遺伝子間領域Ｉ４Ｌ用の挿入ベクター
ゲノム位置５６７６０に相当するＯＲＦ Ｉ３ＬとＩ４Ｌの間の遺伝子間領域に外因性配列を挿入するために、Ｉ４Ｌ遺伝子座の遺伝子間領域に隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むベクターを構築した。このベクターは上述したように設計し、構築される。隣接配列の間に、ポックスウイルスプロモーターの転写制御を受けるＥｃｏｇｐｔ遺伝子（またはｇｐｔ、これは大腸菌から単離されるホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する）を配置する。また、Ｉ４Ｌ ＯＲＦ後の遺伝子間領域に挿入しようとする追加の遺伝子または配列を挿入するためのクローニング部位も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図５に示す（ｐＢＮＸ３９）。
数個の相同な遺伝子がゲノム内に組み込まれている組換えポックスウイルスの構築
挿入ベクター
デングウイルスの４つの血清型に由来する４つのＰｒＭ遺伝子をＭＶＡゲノムに挿入するために、４つの独立した組換えベクターを使用した。
これらのベクターは、上に詳述したように、相同組換えによる挿入をターゲティングするために、ＭＶＡゲノムに相同な配列を有するている。また、各ベクターは選択遺伝子カセットまたはレポーター遺伝子カセットも持っている。
４つのデングウイルス血清型のＰｒＭ配列を、オリゴアニーリングとＰＣＲ増幅とによって、合成的に作製した。それらのＰｒＭ配列をポックスウイルスプロモーター要素の下流にクローニングして、発現カセットを形成させた。次にこの発現カセットを、適切な挿入ベクターコンストラクトのクローニング部位にクローニングした。
結果として、欠失部位Ａ用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型２のＰｒＭ遺伝子を含有した（図６−ｐＢＮ３９）。欠失部位２用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型１のＰｒＭ遺伝子を含有した（図７−ｐＢＮ４９）。遺伝子間領域Ｉ４Ｌ用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型３のＰｒＭ遺伝子を含有した（図８−ｐＢＮ５０）。欠失部位Ｅ用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型４のＰｒＭ遺伝子を含有した（図９−ｐＢＮ４０）。
挿入ベクターのＰＣＲ検証
クローニング戦略を検証するために、ＰＣＲアッセイを行った。これらのＰＣＲアッセイの場合、選択したプライマー対は、挿入部位に関して特異的な隣接配列に特異的に結合するプライマーと、高度に相同なデングウイルスＰｒＭ遺伝子の１つに特異的に結合する第２プライマーとの組合せである。
デングウイルス血清型２のＰｒＭ遺伝子を含有する欠失部位Ａ用の挿入ベクターは、プライマーｏＢＮ９３（ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＧＣＡＧＡ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびｏＢＮ４７７（ＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＧＡＴＴＧＴＡＴＣＡＧ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を使って選別した。
デングウイルス血清型１のＰｒＭ遺伝子を含有する欠失部位２用の挿入ベクターは、プライマーｏＢＮ１９４（ＡＴＧＴＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＣＴＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＡＧＣＣＣＴＧＧＣＧＴＴＣＣＡＴＣＴ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）およびｏＢＮ４７６（ＧＡＴＴＴＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＧＡＴＧ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）を使って選別した。
デングウイルス血清型３のＰｒＭ遺伝子を含有する遺伝子間領域Ｉ４Ｌ用の挿入ベクターは、プライマーｏＢＮ２５５（ＣＣＴＴＡＡＴＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＣＡＴＧＧＡＴＧＧＧＧＴＡＡＣＣＡＧＣＡＴＴＡＡＴＡＧＴ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）およびｏＢＮ４７９（ＧＣＴＣＣＣＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＴＧＧ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）を使って選別した。
デングウイルス血清型４のＰｒＭ遺伝子を含有する欠失部位Ｅ用の挿入ベクターは、プライマーｏＢＮ２１０（ＡＴＣＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＧＣＴＡＣＴＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＣＴＣＧＴＣＴＣＣＧＴＴＣＴＣＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＡＴＧＴＣＣＣＡＴＡＣ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびｏＢＮ４７８（ＧＴＡＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＴＡＴＧ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を使って選別した。
ＰＣＲ実験は、１０×ＰＣＲ緩衝液、ＭｇＣｌ２緩衝液およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを含むＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼキット（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号２０１２０５）またはこれと等価な試薬類を使って、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で行う。一般に、ＰＣＲ反応は、４５μｌの主混合物、試料ＤＮＡおよび必要に応じてｄｄＨ２Ｏを含む５０μｌの総反応液量を使って調製した。主混合物は、３０．７５μｌのｄｄＨ２Ｏ、５μｌの１０×緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ）、２．５μｌの各プライマー（５ｐｍｏｌ／ｍｌ）、３μｌのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）および０．２５μｌのＴａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を使って調製すべきである。
増幅は以下のプログラムを使って行った。
１）変性：４分 ９４℃
２）３０サイクル：
変性：３０秒 ９４℃
アニーリング：３０秒 ５５℃
伸長：１〜３分 ７２℃
３）伸長：７分 ７２℃
４）保存 ４℃。
挿入される遺伝子のサイズに基づいて、伸長時間は少なくとも１分／ｋｂにするべきである。
図１０に示すＰＣＲ結果は、上記の単独挿入物に使用したプライマーの組合せの特異性を実証している。
プライマーの組合せｏＢＮ１９４／ｏＢＮ４７６は、欠失部位２およびインサートとしてのＰｒＭ１に特異的である。プラスミドｐＢＮ４９の予想ＰＣＲ断片は６７８ｂｐのサイズを有する（ゲルの上側、レーン３に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ２５５／ｏＢＮ４７９は、遺伝子間領域Ｉ４ＬおよびインサートとしてのＰｒＭ３に特異的である。プラスミドｐＢＮ５０の予想ＰＣＲ断片は８２５ｂｐのサイズを有する（ゲルの上側、レーン９に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ２１０／ｏＢＮ４７８は、欠失部位ＥおよびインサートとしてのＰｒＭ４に特異的である。プラスミドｐＢＮ４０の予想ＰＣＲ断片は６０７ｂｐのサイズを有する（ゲルの下側、レーン５に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ９３／ｏＢＮ４７７は、欠失部位ＡおよびインサートとしてのＰｒＭ２に特異的である。プラスミドｐＢＮ３９の予想ＰＣＲ断片は６３６ｂｐのサイズを有する（ゲルの下側、レーン１１に示す）。
相同組換えによる組換えＭＶＡの作製
組換えＭＶＡによって外来遺伝子を発現させるには、これらの遺伝子を、相同組換えと呼ばれる過程によって、ウイルスゲノム中に挿入する必要がある。そのために、興味ある外来遺伝子を、上述のように、挿入ベクター中にクローニングしておいた。細胞をＭＶＡ−ＢＮに感染させた後に、このベクターをトランスフェクトする必要がある。感染とトランスフェクションとを受けた細胞の細胞質では、組換えが起こるだろう。やはり挿入ベクターに含まれている選択及び(又は)レポーターカセットを利用して、組換えウイルスを含む細胞を同定し、単離する。
相同組換え
相同組換えを行うために、ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）またはＶＰ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）＋４ｍｍｏｌ／ｌ Ｌ−グルタミン（無血清製造法の場合）を使って、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎）細胞またはＣＥＦ（初代ニワトリ胚線維芽細胞）を６穴プレートに播種する。
細胞はまだ増殖期にある必要があるので、トランスフェクションの日に６０〜８０％コンフルエントに達するべきである。感染に用いる感染多重度（ｍｏｉ）を決定するには細胞数を知っておく必要があるので、播種前に細胞数を数えた。
感染を行うために、５００μｌの希釈液が０．０１のｍｏｉを与える適当なウイルス量を含むように、ＭＶＡストックをＤＭＥＭ／ＦＣＳまたはＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミンに希釈する。細胞は、播種後に１回分裂すると仮定する。細胞から培地を取り除き、細胞を５００μｌの希釈ウイルスに、室温で振とうしながら１時間感染させる。接種物を除去し、細胞をＤＭＥＭ／ＶＰ−ＳＦＭで洗浄する。感染細胞を、それぞれ１．６ｍｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳおよびＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミン中に入れておき、その間に、トランスフェクション反応（キアゲン・エフェクテン・キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ Ｋｉｔ））の準備をする。
トランスフェクションには、「エフェクテン（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ）」トランスフェクションキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。線状化した挿入ベクター１〜５μｇ（多重トランスフェクションの場合は総量）と緩衝液ＥＣとのトランスフェクション混合物を、最終体積が１５０μｌになるように調製する。ＤＮＡ １μｌにつき８．０μｌのエンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）を加え、ボルテックスし、室温で５分間インキュベートする。次に、ＤＮＡ １μｇにつき２５μｌのエフェクテンを、原液のチューブをボルテックスしてから加え、その溶液をボルテックスによって十分に混合し、室温で１０分間インキュベートする。それぞれ６００μｌのＤＭＥＭ／ＦＣＳおよびＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミンを加え、混合した後、そのトランスフェクション混合物全体を、既に培地で覆われている細胞に加える。培養皿を穏やかに振とうしてトランスフェクション反応液を混合する。３７℃、５％ＣＯ２で、一晩インキュベートする。翌日、培地を除去し、新鮮なＤＭＥＭ／ＦＣＳまたはＶＰ−ＳＦＭ／Ｌ−グルタミンと置き換える。インキュベーションを３日目まで続ける。
収集するために、細胞を培地中にこすり取り、得られた細胞懸濁液を適当なチューブに移して、短期保存の場合は−２０℃で凍結し、長期保存の場合は−８０℃で凍結する。
ＭＶＡへのＰｒＭ４の挿入
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＢＮに感染させ、さらに、デングウイルス血清型４のＰｒＭ遺伝子と、レポーター遺伝子としてＥＧＰＦ遺伝子とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ４０をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子ＥＧＦＰを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも３日目には検出することができる。得られた組換えウイルスはプラーク精製によって精製する必要がある。
プラーク精製を行うには、感染細胞（蛍光細胞または染色細胞）をピペットチップで単離し、２００μｌのＰＢＳまたは培地に再懸濁し、吸引する。次に、約１０６個の細胞が入っている新しい培養皿を、再懸濁したプラーク１００μｌに感染させる。４８時間後に、細胞を３００μｌのＰＢＳにとりだす。懸濁液からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ分析によって選別する。予想されるバンドを示すクローンを選択し、新しい６穴プレートをさまざまな量のこのウイルスに感染させる。ウェルに１％アガロースを重層することにより、ウイルスのさらなる伝播を避ける。４８時間後に、組換えウイルスクローンを含む感染細胞を単離する。
この操作を、ＰＣＲ分析で野生型ＭＶＡ−ＢＮを検出することができなくなるまで繰り返す。
４回のプラーク精製後に、予想される挿入物を選択的に増幅するプライマー対（上述のｏＢＮ２１０およびｏＢＮ４７８）と、対照として挿入部位である欠失部位Ｅを特異的に認識するプライマー対（ｏＢＮ４５３：ＧＴＴＧＡＡＧＧＡＴＴＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＧＡ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９およびｏＢＮ４５４：ＧＣＡＴＴＣＡＣＡＧＡＴＴＣＴＡＴＴＧＴＧＡＧＴＣ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）とを使って、ＰＣＲアッセイにより、組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ４を同定した。
ＭＶＡ−ＰｒＭ４へのＰｒＭ２の挿入
上記のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＰｒＭ４に感染させ、さらに、デングウイルス血清型２のＰｒＭ遺伝子と、選択遺伝子としてＮＰＴ ＩＩ（ネオマイシン耐性遺伝子）とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ３９をトランスフェクトした。抗生物質耐性遺伝子を発現させる組換えＭＶＡを精製するには、プラーク精製前に選択条件下でウイルス増幅を３回行うことが推奨される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ選択を行うために、Ｇ４１８を培地に加える。Ｇ４１８はネオマイシンの誘導体であり、リボソームの作用を妨害することにより、タンパク質生合成を阻害する。ＮＰＴ遺伝子活性はＧ４１８をリン酸化によって失活させる。
ネオマイシン選択下で１６回のプラーク精製後に、予想される挿入物を選択的に増幅するプライマー対（上記のｏＢＮ９３およびｏＢＮ４７７）と、対照として挿入部位である欠失部位Ａを特異的に認識するプライマー対（上記のｏＢＮ４７７およびｏＢＮ４５２：ＧＴＴＴＣＡＴＣＡＧＡＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＴＧＡＡＡ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）とを使って、ＰＣＲアッセイにより、組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ４／ＰｒＭ２を同定した。さらに、欠失部位ＥへのＰｒＭ４の挿入も、プライマー対ｏＢＮ２１０−ｏＢＮ４７８およびｏＢＮ４５３−ｏＢＮ４５４を使って確認する。
ＭＶＡへのＰｒＭ１の挿入
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＢＮに感染させ、さらに、デングウイルス血清型１のＰｒＭ遺伝子と、レポーター遺伝子としてｈｂｆｐ（ヒト化青色蛍光タンパク質の遺伝子）とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ４９をトランスフェクトした。合成されたｈｂｆｐタンパク質は、３日目に、組換えウイルスに感染した細胞中に検出することができる。得られた組換えウイルスをプラーク精製によって精製した。１０回のプラーク精製後に、予想される挿入物を選択的に増幅するプライマー対（上述のｏＢＮ１９４およびｏＢＮ４７６）と、対照として挿入部位である欠失部位２を特異的に認識するプライマー対（ｏＢＮ５４：ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＡＣＧＡＡＣＡＡＧＧＡＡＣＴＧＴＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２およびｏＢＮ５６：ＡＡＣＴＧＣＡＧＴＴＧＴＴＣＧＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＡＴＴＣＴＴＴＡＡＴＴＡＴ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３）とを使って、ＰＣＲアッセイにより、組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ１を同定した。
ＭＶＡへのＰｒＭ３の挿入
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＢＮに感染させ、さらに、デングウイルス血清型３のＰｒＭ遺伝子と、レポーター遺伝子としてＥｃｏｇｐｔ遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ、略してｇｐｔは、ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を意味する）とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ５０をトランスフェクトした。得られた組換えウイルスを、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの添加により、ホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で、プラーク精製を３回行うことによって精製した。ミコフェノール酸（ＭＰＡ）はイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼを阻害し、大半の細胞株でプリン合成の遮断およびウイルス複製の阻害をもたらす。この遮断は、構成的プロモーターからＥｃｏｇｐｔを発現させると共に、基質キサンチンおよびヒポキサンチンを与えることによって、克服することができる。
予想される挿入物を選択的に増幅するプライマー対（上述のｏＢＮ２５５およびｏＢＮ４７９）と、対照として挿入部位Ｉ４Ｌを特異的に認識するプライマー対（ｏＢＮ４９９：ＣＡＡＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴＧＡＴＴＡＣＣ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４およびｏＢＮ５００：ＣＧＡＴＣＡＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＴＧ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）とを使って、ＰＣＲアッセイにより、生成した組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ３を同定した。
ＭＶＡ−ＰｒＭ１とＭＶＡ−ＰｒＭ３の同時感染
上記のプロトコールに従って、細胞を、等量のＭＶＡ−ＰｒＭ１とＭＶＡ−ＰｒＭ３に感染させた。青色蛍光クローンをホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択下で３回プラーク精製した後、上記のプライマー対（上記のｏＢＮ２５５およびｏＢＮ４７９、ｏＢＮ４９９およびｏＢＮ５００、ｏＢＮ１９４およびｏＢＮ４７６、ｏＢＮ５４およびｏＢＮ５６）を使ったＰＣＲによって、組換えウイルスを分析した。得られた組換えウイルスをＭＶＡ−ＰｒＭ１／ＰｒＭ３と名付けた。
ＭＶＡ−ＰｒＭ１／ＰｒＭ３とＭＶＡ−ＰｒＭ２／ＰｒＭ４の同時感染
上記のプロトコールに従って、細胞を、等量のＭＶＡ−ＰｒＭ１／ＰｒＭ３とＭＶＡ−ＰｒＭ２／ＰｒＭ４に感染させた。ホスホリボシルトランスフェラーゼ代謝選択およびネオマイシン選択下で、プラーク精製を行った。緑色および青色の蛍光を惹起する組換えウイルスを単離し、上記プライマー対（上記のｏＢＮ２５５およびｏＢＮ４７９、ｏＢＮ４９９およびｏＢＮ５００、ｏＢＮ１９４およびｏＢＮ４７６、ｏＢＮ５４およびｏＢＮ５６、ｏＢＮ９３およびｏＢＮ４７７、ｏＢＮ４７７およびｏＢＮ４５２、ｏＢＮ２１０およびｏＢＮ４７８、ｏＢＮ４５３およびｏＢＮ４５４））を使ったＰＣＲによって分析した。
４つのＰｒＭ遺伝子をすべて含んでいる組換えウイルス（クローン２０）のＰＣＲ分析を図１１に示す。ゲルの上側は、この組換えウイルスのさまざまなＰＣＲ結果を示し、下側は、対照プラスミド（表示のもの）に関する同じＰＣＲ反応の結果を示す。レーン１、１０および１１は１ｋｂおよび１００ｂｐの分子マーカーを表す。
プライマーの組合せｏＢＮ２１０／ｏＢＮ４７８は、欠失部位ＥおよびインサートとしてのＰｒＭ４に特異的である。組換えウイルスおよびプラスミドｐＢＮ４０の予想ＰＣＲ断片は６０７ｂｐのサイズを有する（レーン２に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ４５３／ｏＢＮ４５４は、欠失部位Ｅに特異的である。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は２．７ｋｂであり、野生型ウイルスの予想バンドは２．３ｋｂである（レーン３に示す）。ゲルの上側でも、野生型ウイルスに特異的なバンドを同定することができる。これは、野生型ウイルスがまだ完全にはこの組換えウイルス調製物から除去されていないことを意味する。さらなるプラーク精製が必要である。
プライマーの組合せｏＢＮ９３／ｏＢＮ４７７は、欠失部位ＡおよびインサートとしてのＰｒＭ２に特異的である。組換えウイルスとプラスミドｐＢＮ３９の予想ＰＣＲ断片は６３６ｂｐのサイズを有する（レーン４に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ４７７／ｏＢＮ４５２は、欠失部位Ａに特異的である。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は４．１ｋｂであり、野生型ウイルスの予想バンドは２．７ｋｂである（レーン５に示す）。野生型ウイルスに特異的なバンドをゲルの上側で同定することができる。
プライマーの組合せｏＢＮ２５５／ｏＢＮ４７９は、遺伝子間領域Ｉ４ＬおよびインサートとしてのＰｒＭ３に特異的である。組換えウイルスとプラスミドｐＢＮ５０の予想ＰＣＲ断片は８２５ｂｐのサイズを有する（レーン６に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ４９９／ｏＢＮ５００は、Ｉ４Ｌの遺伝子間領域に特異的である。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は１．０ｋｂであり、野生型ウイルスの予想バンドは０．３ｋｂである（レーン７に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ１９４／ｏＢＮ４７６は、欠失部位２およびインサートとしてのＰｒＭ１に特異的である。組換えウイルスとプラスミドｐＢＮ４９の予想ＰＣＲ断片は６７８ｂｐのサイズを有する（レーン８に示す）。
プライマーの組合せｏＢＮ５４／ｏＢＮ５６は、欠失部位２に特異的である。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は１．６ｋｂであり、野生型ウイルスの予想バンドは０．９ｋｂである（レーン９に示す）。野生型ウイルスに特異的なバンドをゲルの上側で同定することができる。
もう一つの選択肢として、４種類のウイルスを作製し、細胞を４種類のウイルスのすべてに同時感染させ、組換え体を選別することもできる。
さらなる選択マーカーまたは耐性マーカーを含む組換えベクターを使って、改良を行うこともできる。
挿入ベクター
遺伝子間領域１３６−１３７（ＩＧＲ １３６−１３７）用の組換えベクター
ＭＶＡゲノムのゲノム位置１２９，９４０に相当するいわゆる遺伝子間領域（ＩＧＲ）１３６−１３７に外因性配列を挿入するために、この挿入部位に隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。ＭＶＡ−ＢＮゲノムＤＮＡからこの隣接配列を単離するために、適切なＰＣＲプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受けるＮＰＴ ＩＩ遺伝子（ネオマイシン耐性）などの選択遺伝子カセットを導入する。また、ＩＧＲ １３６−１３７に挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位（ＰａｃＩ）も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図１２に示す（ｐＢＮＸ６７）。
遺伝子間領域０７−０８（ＩＧＲ ０７−０８）用の組換えベクター
ＭＶＡゲノムのゲノム位置１２，８００に相当する遺伝子間領域（ＩＧＲ）０７−０８に外因性配列を挿入するために、この挿入部位に隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。ＭＶＡ−ＢＮゲノムＤＮＡからこの隣接配列を単離するために、適切なＰＣＲプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受けるＥｃｏｇｐｔ遺伝子（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）などの選択遺伝子カセットを導入する。また、ＩＧＲ ０７−０８に挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位（ＰａｃＩ）も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図１３に示す（ｐＢＮＸ８８）。
遺伝子間領域４４−４５（ＩＧＲ ４４−４５）用の組換えベクター
ＭＶＡゲノムのゲノム位置３７，３３０に相当する遺伝子間領域（ＩＧＲ）４４−４５に外因性配列を挿入するために、この挿入部位に隣り合う約６００ｂｐの隣接配列を含むプラスミドベクターを構築した。ＭＶＡ−ＢＮゲノムＤＮＡからこの隣接配列を単離するために、適切なＰＣＲプライマーを設計することができる。そのようなプライマーは、制限酵素部位を有する伸長部分を含み、その部分を使って、隣接配列をベクタープラスミドにクローニングすることができる。これらの隣接配列の間に、例えばポックスウイルスプロモーター（Ｐ）の転写制御を受けるＮＰＴ ＩＩ遺伝子（ネオマイシン耐性）などの選択遺伝子カセットを導入する。また、ＩＧＲ ４４−４５に挿入しようとする追加の遺伝子または外因性配列を挿入するためのクローニング部位（ＰａｃＩ）も存在する。そのような本発明のベクターコンストラクトの一つを図１４に示す（ｐＢＮＸ８７）。
数個の相同な遺伝子がゲノム内に組み込まれている組換えポックスウイルスの構築
挿入ベクター
デングウイルスの血清型２、３および４に由来する３つのＰｒＭ遺伝子をＭＶＡゲノムに挿入するために、３つの独立した組換えベクターを使用した。
これらのベクターは、上に詳述したように、相同組換えによる挿入をターゲティングするために、ＭＶＡゲノムに相同な配列を有するている。また、各ベクターは選択およびレポーター遺伝子カセットも持っている。
３つのデングウイルス血清型のＰｒＭ配列を、実施例１で説明したように、合成的に作製した。
結果として、ＩＧＲ１３６−１３７用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型４のＰｒＭ遺伝子を含有した（図１５−ｐＢＮ２７）。ＩＧＲ ０７−０８用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型２のＰｒＭ遺伝子を含有し（図１６−ｐＢＮ３４）、ＩＧＲ ４４−４５用の挿入ベクターコンストラクトは、デングウイルス血清型３のＰｒＭ遺伝子を含有した（図１７−ｐＢＮ４７）。
相同組換えによる組換えＭＶＡの作製
相同組換えによる組換えＭＶＡの作製を、実施例１で説明したように行った。ＭＶＡゲノムにおけるＰｒＭ４、ＰｒＭ３およびＰｒＭ２の挿入部位を、図１８に示す。
ＭＶＡへのＰｒＭ４の挿入
１回目は、上述のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＢＮに感染させ、さらに、デングウイルス血清型４のＰｒＭ遺伝子と、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ２７をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子ＥＧＦＰを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも３日目には検出することができる。得られた組換えウイルスは実施例１で説明したようにプラーク精製によって精製する必要がある。４回のプラーク精製後に、挿入部位ＩＧＲ１３６−１３７を選択的に増幅するプライマー対（ｏＢＮ１００８：ｇａｔａｃｃｇａｔｃａｃｇｔｔｃｔａ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６およびｏＢＮ１００９：ｇｇａｔａｔｇａｔｔａｔｇｔａｇａｇ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を使って、ＰＣＲアッセイにより、組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ４を同定した。
ＭＶＡへのＰｒＭ２の挿入
上記のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＰｒＭ４に感染させ、さらに、デングウイルス血清型２のＰｒＭ遺伝子と、選択遺伝子としてＢＦＰ遺伝子とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ３４をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子ＢＦＰを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも３日目には検出することができる。得られた組換えウイルスは実施例１で説明したようにプラーク精製によって精製する必要がある。６回のプラーク精製後に、組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ４＋ＰｒＭ２をさらに継代し、増幅させて、粗製ストックを調製した。挿入部位ＩＧＲ０７−０８を選択的に増幅するプライマー対（ｏＢＮ ９０３：ｃｔｇｇａｔａａａｔａｃｇａｇｇａｃｇｔｇ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８およびｏＢＮ９０４：ｇａｃａａｔｔａｔｃｃｇａｃｇｃａｃｃｇ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）を使って、ＰＣＲアッセイにより、組換え体を同定した。
ＭＶＡへのＰｒＭ３の挿入。
上記のプロトコールに従って細胞をＭＶＡ−ＰｒＭ２＋４に感染させ、さらに、デングウイルス血清型３のＰｒＭ遺伝子と、選択遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子とを含んでいる挿入ベクターｐＢＮ４７をトランスフェクトした。トランスフェクトしたベクターはレポーター遺伝子ＥＧＦＰを含んでいるので、組換えウイルスに感染した細胞には、合成されたタンパク質を、遅くとも３日目には検出することができる。得られた組換えウイルスは実施例１で説明したようにプラーク精製によって精製する必要がある。３回のプラーク精製後に、挿入部位ＩＧＲ４４−４５を選択的に増幅するプライマー対（ｏＢＮ９０４：ｃｇｔｔａｇａｃａａｃａｃａｃｃｇａｃｇａｔｇｇ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０およびｏＢＮ９０５：ｃｇｇａｔｇａａａａａｔｔｔｔｔｇｇａａｇ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）を使って、ＰＣＲアッセイにより、組換えウイルスＭＶＡ−ＰｒＭ４＋３＋２を同定した。
３つのデングウイルスＰｒＭ遺伝子を含む組換えウイルスのＰＣＲ分析を図１９に示す。ＰＣＲ実験は実施例１で説明したように行う。プライマーの組合せｏＢＮ１００８およびｏＢＮ１００９は、ＰｒＭ４挿入物を含むＩＧＲ１３６−１３７に特異的である（図１９、下図）。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は、プラスミド陽性対照（レーン８）と同様に、１ｋｂのサイズを有する（レーン４、５および６に示す）。ＰｒＭ４を持たない空ベクター対照は、１９０ｂｐの予想断片を示す（レーン２）。レーンＭは分子量マーカーを表し、レーン１、３および７は空である。プライマーの組合せｏＢＮ９０２およびｏＢＮ９０３は、ＰｒＭ２挿入物を含むＩＧＲ０７−０８に特異的である（図１９、上図）。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は、プラスミド陽性対照（レーン８）と同様に、９６０ｂｐのサイズを有する（レーン４〜６に示す）。ＰｒＭ２を持たない空ベクター対照は、１９０ｂｐの予想断片を示す（レーン２）。プライマーの組合せｏＢＮ９０４およびｏＢＮ９０５は、ＰｒＭ３挿入物を含むＩＧＲ４４−４５に特異的である（図１９、中図）。組換えウイルスの予想ＰＣＲ断片は、プラスミド陽性対照（レーン８）と同様に、９３２ｂｐのサイズを有する（レーン４〜６に示す）。ＰｒＭ２を持たない空ベクター対照は、１８５ｂｐの予想断片を示す（レーン２）。
実施例１に記載のＭＶＡゲノム中の４つのＰｒＭ（＝前駆膜）遺伝子（血清型１〜４）の挿入部位を表す概略図である。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 ４種類の挿入ベクター（ｐＢＮ４９、ｐＢＮ５０、ｐＢＮ４０、ｐＢＮ３９）のベクタークローニング戦略のＰＣＲ検証を示す。 ４つの相同なデングウイルスＰｒＭ遺伝子を含む組換えポックスウイルスのＰＣＲ検証（実施例１）を示す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 挿入プラスミドベクターコンストラクトを表す。 実施例２に記載のＭＶＡゲノム中の３つのＰｒＭ遺伝子（血清型２〜４）の挿入部位を表す概略図である。 ３つの相同なデングウイルスＰｒＭ遺伝子が遺伝子間領域に挿入されている組換えポックスウイルスのＰＣＲ検証（実施例２）を示す。
配列表

Claims (29)

  1. 少なくとも５０％の同一性を有する、少なくとも２つの相同な配列を含み、当該配列のそれぞれがウイルスゲノムの異なる挿入部位に挿入されている、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮと同じ特性を有する組換え変異ワクシニアアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）ウイルス。
  2. 少なくとも６０％の同一性を有する少なくとも２つの相同な配列を含む、組換えＭＶＡウイルス。
  3. 当該配列が６５〜７５％の同一性を有する、請求項１又は２記載の組換えＭＶＡウイルス。
  4. 当該配列が相同遺伝子である、請求項１〜３のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  5. 上記相同遺伝子がフラビウイルスに由来する、請求項４記載の組換えＭＶＡウイルス。
  6. 上記フラビウイルスがデングウイルスである、請求項５記載の組換えＭＶＡウイルス。
  7. 当該遺伝子が、上記ウイルスの少なくとも２種類の異なる血清型に由来する少なくとも２つの相同な遺伝子である、請求項４又は５記載の組換えＭＶＡウイルス。
  8. 当該遺伝子が少なくとも２つのＰｒＭ遺伝子である、請求項４〜６のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  9. 当該遺伝子が４つのＰｒＭ遺伝子である、請求項４〜７のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  10. 上記相同遺伝子がそれぞれ、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐ７．５の転写制御下にある、請求項４〜８のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  11. 上記ＭＶＡが、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞中で、複製欠損性または複製不能である、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  12. 当該配列が、ポックスウイルスゲノムの天然の欠失部位及び(又は)遺伝子間領域に挿入されている、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  13. 医薬またはワクチンとしての請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  14. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスを含むワクチン。
  15. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスと、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、アジュバント及び(又は)添加剤とを含む薬学的調合物。
  16. ヒトを含む生きている動物の免疫応答に影響を与えるための、請求項１から１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルス。
  17. ヒトを含む生きている動物の免疫応答に影響を与えるための、請求項１４記載のワクチン。
  18. ヒトを含む生きている動物の免疫応答に影響を与えるための、請求項１５記載の調合物。
  19. 医薬を製造するために、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスを使用する方法。
  20. ヒトを含む生きている動物において免疫応答に影響を与えるための薬剤の製造のための、請求項１９記載の使用方法。
  21. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスを含む細胞。
  22. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスを製造する方法であって、
    - 細胞にＭＶＡウイルスを感染させる工程、
    - ＭＶＡウイルスのゲノムに導入すべき配列、およびＭＶＡウイルスゲノムの挿入部位へ挿入すべき配列の組込みを指示する能力を有するＭＶＡウイルスのゲノム配列を含む第１ベクターコンストラクトを、上記感染細胞にトランスフェクトする工程、
    - 産生した組換えポックスウイルスを同定し、単離し、場合により精製する工程、
    - 先の工程で得られたＭＶＡウイルスを細胞の感染に使用すると共に、ＭＶＡウイルスゲノムに導入すべき別の配列であって、第１ベクターコンストラクトの配列に対して相同である前記配列を含む追加のベクターコンストラクトを使用することによって、上記の工程を繰り返す工程、
    を含む、上記方法。
  23. - 各コンストラクトが配列を含む２つ以上のベクターコンストラクトであって、異なるベクターに含まれる当該配列は少なくとも５０％の同一性を有する相同な配列であり、しかも各配列には、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８として寄託されているＭＶＡ−ＢＮと同じ特性を有するＭＶＡのＭＶＡウイルスＤＮＡ配列であって、ＭＶＡゲノムへの当該相同配列の組込みを指示する能力を有する配列が隣接している、上記ベクターコンストラクト、および
    - 前記相同配列がゲノムに組み込まれている組換えＭＶＡウイルスを同定するか、及び(又は)選択するための手段、
    を含むキット。
  24. 各相同配列には、ＭＶＡウイルスゲノムの異なる挿入部位への各ベクターコンストラクトの前記相同配列の組込みを指示する能力を有するＭＶＡウイルスＤＮＡ配列が隣接している、請求項２３記載のキット。
  25. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスの組換えＭＶＡウイルスゲノムに由来するかまたは同組換えＭＶＡウイルスゲノムに相同なポリヌクレオチドであって、少なくとも２つの相同な配列と、ＭＶＡウイルスゲノムの配列の少なくとも一部とを含むポリヌクレオチド。
  26. 請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスに感染した細胞を検出する方法であって、請求項２５記載のポリヌクレオチドを前記細胞に投与することを含む、上記方法。
  27. 請求項１〜１２記載の組換えＭＶＡウイルスを同定する方法であって、請求項２５記載のポリヌクレオチドを前記ウイルスに投与することを含む、上記方法。
  28. 請求項４〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスに感染した細胞を検出する方法であって、細胞を、相同遺伝子および／または当該遺伝子の挿入部位に関連する隣接配列を選択的に増幅するＤＮＡプライマーと接触させることを含む、上記方法。
  29. 請求項４〜１２のいずれか１つに記載の組換えＭＶＡウイルスを同定する方法であって、細胞を、相同遺伝子および／または当該遺伝子の挿入部位に関連する隣接配列を選択的に増幅するＤＮＡプライマーと接触させることを含む、上記方法。
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